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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-07
(54)【発明の名称】樹状細胞ベースの癌ワクチン及びその調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/00 20060101AFI20220930BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220930BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220930BHJP
A61K 35/33 20150101ALI20220930BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20220930BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220930BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220930BHJP
【ＦＩ】
C12N5/00
C12N15/09 Z
A61K39/00 H
A61K35/33
A61K35/15 Z
A61P37/04
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570798
(86)(22)【出願日】2019-05-27
(85)【翻訳文提出日】2021-12-27
(86)【国際出願番号】 JP2019020891
(87)【国際公開番号】W WO2020240658
(87)【国際公開日】2020-12-03
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521518172
【氏名又は名称】錦高キャピタル株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 貞俊
(72)【発明者】
【氏名】大薗 美千代
(72)【発明者】
【氏名】石川 太
(72)【発明者】
【氏名】魚住 利樹
(72)【発明者】
【氏名】岡 恵理子
(72)【発明者】
【氏名】村田 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】楊 ▲フイ▼瑜
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB06
4B065AC20
4B065BA08
4B065CA45
4C085AA03
4C085BB01
4C085CC03
4C085DD23
4C085DD63
4C085EE01
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087CA04
4C087MA16
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、樹状細胞ベースの癌ワクチンを調製するために、組換え細胞および融合細胞を調製する方法に関する。ここで、組換え細胞および融合細胞は、癌細胞のＤＮＡを含む。本発明はまた、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを含む融合細胞、ヒト樹状細胞と線維芽細胞を融合する方法、融合細胞を含む医薬組成物、および癌患者に有効量の融合細胞の投与を含む癌を予防する方法に向けられる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップを含む組換え細胞を調製する方法であって、（ａ）哺乳動物の結合組織から線維芽細胞を提供することと、
（ｂ）哺乳動物の腫瘍組織から癌細胞のゲノムＤＮＡを抽出、ここで、ゲノムＤＮＡは、少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、哺乳動物の腫瘍組織は新たに単離される物ではないこと、かつ、
（ｃ）癌細胞のゲノムＤＮＡを線維芽細胞に形質転換することを特徴とする組換え細胞を調製する方法。
【請求項2】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
結合組織が皮膚組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記哺乳動物からの腫瘍組織が新たに単離される物ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記哺乳動物からの腫瘍組織がパラフィンブロックに埋め込まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記皮膚組織が皮膚生検輸送および洗浄培地によって維持および洗浄される、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記線維芽細胞が皮膚生検培養培地中で維持および培養され、皮膚生検培養培地が哺乳動物からの血漿を含む請求項１に記載の方法。
【請求項8】
哺乳動物由来の樹状細胞の集団、および、請求項１の組換え細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含む、樹状細胞および組換え細胞を融合する方法。
【請求項9】
前記樹状細胞および組換え細胞が哺乳動物に対して自己由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞融合が電気融合によって達成される、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
組換え細胞は癌細胞のゲノムＤＮＡを含み、癌細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、ゲノムＤＮＡはパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から単離され、前記組換え細胞は、哺乳動物の皮膚組織からの線維芽細胞であり、癌細胞および線維芽細胞は、哺乳動物に対して自己由来である、組換え細胞。
【請求項12】
前記組換え細胞が請求項１に記載の方法によって調製される、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項13】
融合により得られる融合細胞、（ａ）樹状細胞と
（ｂ）請求項１または請求項１１に記載された組換え細胞と、
ここで、前記樹状細胞および組換え細胞は哺乳動物に対して自己由来であり、前記融合細胞は少なくとも癌に１つ特異的な抗原を含み、ＣＤ８３、ＣＤ１α、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、ＣＤ８０、またはＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを含む、融合細胞。
【請求項14】
前記融合細胞が請求項１０に記載の方法によって調製される、請求項１３に記載の融合細胞。
【請求項15】
請求項１３に記載した融合細胞および有効量のアジュバントまたは担体を含む医薬組成物。
【請求項16】
さらに、体液免疫応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記分子がサイトカインである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、樹状細胞および腫瘍細胞または前癌細胞に由来するゲノムＤＮＡを含む線維芽細胞で形成される融合細胞を含むワクチンを癌患者に投与することにより癌を治療および予防する方法に関するものと樹状細胞と繊維芽細胞で形成する融合細胞である。
【背景技術】
【0002】
ワクチンを含む免疫療法組成物は、ヘルスケア産業が疾患の予防および治療のために利用できる最も費用対効果の高い手段の１つである。しかし、病原体、癌、遺伝的欠陥、その他の免疫系の障害によって引き起こされるものを含み、様々な疾患に対して、安全で効果的な免疫療法戦略とアジュバントを開発することが依然として緊急の必要性が残っている。癌や、ウイルス性疾患や細胞内病原体による疾患を含む多くの感染症の治療には、細胞を介した（細胞性）免疫反応を誘発する免疫療法を提供することが望ましいが、多くのワクチンは主にまたは完全に体液性免疫の誘発に向けられている。実際、多くのサブユニットワクチン、および多くの死滅または弱毒化病原体ワクチンの欠点は、強い体液性免疫応答を刺激するように見えるが、防御細胞性免疫を誘発できないことである。
【0003】
癌は、主に、所与の正常組織に由来する異常細胞の数の増加、これらの異常細胞による隣接組織の浸潤、および局所リンパ節および遠隔部位への悪性細胞のリンパまたは血液媒介性の広がりを特徴とする（転移）。臨床データや分子生物学的研究によると、がんは多段階のプロセスであり、最初は小さな前新生物の変化から始まり、ある条件の下で新生物に進行する可能性がある。したがって、この多段階プロセスの進行中に、前癌細胞は、前癌細胞を正常細胞から区別する少なくとも１つの対立遺伝子を蓄積した。このような遺伝子の違いは、腫瘍特異的な抗原の発現、正常な細胞タンパク質の過剰発現、および／または正常および／または腫瘍特定的な抗原の細胞内分布の変化をもたらす。特定の例では、これらの変化により、変化した細胞表面タンパク質や、一般的に細胞表面に輸送されない正常なタンパク質が細胞表面の発現をもたらす可能性がある。
【0004】
免疫細胞活性および抗腫瘍効果を誘導する能力に関して、同じ抗原を標的とするワクチンプラットフォームを比較する多数の免疫療法研究が報告されている。
【0005】
強力な抗原提示細胞である樹状細胞は、近年、がん免疫療法のアジュバントとして利用されている。Ｇｏｎｇらは、腫瘍細胞と融合した樹状細胞をマウスに接種することで、抗腫瘍免疫が誘導されることを報告した（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｕｐｒａ）。また、樹状細胞と腫瘍細胞の融合による臨床応用の成功も報告されている（Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔ Ｍｅｄ ６，３３２－３３６）。Ｂ細胞や樹状細胞と腫瘍細胞の融合は、動物モデルで抗腫瘍免疫応答を誘発することが以前に実証されている。特に、腫瘍細胞と抗原提示細胞のハイブリッドによる免疫は、さまざまな齧歯類モデルで防御免疫をもたらすことが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｓｕｐｒａ
【非特許文献2】Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｎａｔ Ｍｅｄ ６，３３２－３３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、癌細胞のゲノムＤＮＡを抽出するために生きている腫瘍組織または細胞を入手および培養することは困難であり、費用がかかる。現状、癌に苦しむ患者の治療に費用対効果の高いがんワクチンを開発することは、未だにアンメットニーズである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、前記有効量の融合細胞を必要とする哺乳動物に投与することを含み、癌を予防する方法に関する。ここで、融合細胞は、樹状細胞と線維芽細胞を融合することにより形成され、線維芽細胞は、少なくとも１つ癌に特異的な抗原を表示する。線維芽細胞は癌細胞のゲノムＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡは、癌細胞またはパラフィン包埋腫瘍組織から単離される。樹状細胞と線維芽細胞は哺乳類に対して自己由来である。
【0009】
本発明の方法は、哺乳動物に対する体液性免疫応答または細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を刺激する分子を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この分子はサイトカインまたはインターロイキンである。
【0010】
哺乳動物は癌に罹患する。癌には次が含まれるが、これらに限定されない。腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病；慢性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患。
【0011】
本開示も、樹状細胞の集団および線維芽細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含み、ヒト樹状細胞および線維芽細胞を融合する方法に向けられる。ここで、線維芽細胞が、がん細胞のゲノムＤＮＡを含み、ゲノムＤＮＡが、少なくとも１つがんに特異的な抗原をコードする。線維芽細胞は樹状細胞に対して自己由来である。いくつかの実施形態において、細胞融合は、電気融合によって達成される。
【0012】
本開示はまた、樹状細胞および線維芽細胞を含む融合細胞にも向けられている。ここで、融合細胞は、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを含み、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡは、少なくとも１つ癌に特異的な抗原をコードする。
【0013】
本開示はまた、本発明の融合細胞および免疫学的に有効量のアジュバントまたは担体を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、さらに、体液免疫応答および／または細胞傷害性Ｔ細胞応答からなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む。いくつかの実施形態では、分子はサイトカインまたはインターロイキンである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
本開示は、有効量の融合細胞を哺乳動物に投与することにより癌の予防に関する方法である。ここで、融合細胞は樹状細胞と線維芽細胞を融合することによって形成され、線維芽細胞は、少なくとも１つ癌に特異的な抗原を示す。線維芽細胞にはがん細胞のゲノムＤＮＡが含まれている。
【0016】
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、血液や骨髄、または脾臓、リンパ節、扁桃腺、腸のパイエル板や骨髄などの二次リンパ器官から当技術分野で知られている方法で分離または生成することができる。好ましい実施形態では、樹状細胞は、最終的に分化した樹状細胞である。ある実施形態では、樹状細胞はヒト血液単球から分化する。特定の実施形態において、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して自己由来である。代替の実施形態では、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して同種異系である。
樹状細胞（ＤＣ）は、血液や骨髄、または脾臓、リンパ節、扁桃腺、腸のパイエル板や骨髄などの二次リンパ器官から当技術分野で知られている方法で分離または生成することができる。好ましい実施形態では、樹状細胞は、最終的に分化した樹状細胞である。ある実施形態では、樹状細胞はヒト血液単球から分化する。特定の実施形態において、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して自己由来である。代替の実施形態では、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される対象に対して同種異系である。
【0017】
供給源から得られた免疫細胞は、典型的には、主に分化及び成熟の様々な段階の再循環するリンパ球とマクロファージを含む。樹状細胞調製物は、標準的な技術によって濃縮することができる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ７．３２．１－７．３２．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９７を参照）。一つの実施形態では、例えば、樹状細胞は、Ｔ細胞および付着細胞の減耗、それに続く密度勾配遠心分離によって濃縮され得る。樹状細胞は、オプションで蛍光標識された細胞を選別、またはａｎｔｉ－ＣＤ８３ｍＡｂ磁気ビーズを使用することによって、さらに精製ができる。
【0018】
あるいは、高収量の比較的均質な樹状細胞集団は、血液サンプルまたは骨髄に存在する樹状細胞前駆細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ－４）などのサイトカインで処理することにより得られる。このような条件下では、単球は細胞増殖なしに樹状細胞に分化する。さらに、ＴＮＦαなどであるがこれに限定されない薬剤で処理することにより樹状細胞の最終分化を刺激する。
【0019】
樹状細胞は、標準的な方法に従って血液単球から得られる（例えばＳａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９－１１１８を参照）。健康な献血者からの白血球は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離とプラスチック接着を使用した白血球アフェレーシスパックまたはバフィーコートにより収集される。成熟樹状細胞が望まれる場合、以下のプロトコルを使用し樹状細胞を培養できる。細胞を３７℃で４時間にプラスチック皿に付着させる。非付着細胞を除去、付着した単球を０．１μｇ／ｍＬ顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子及び０．０５μｇ／ｍＬのＩＬ－４を含む培地で７日間培養する。樹状細胞を調製するために、腫瘍壊死因子－αを５日目に添加、細胞を７日目に収集する。
【0020】
樹状細胞は細胞表面マーカーＣＤ８３を発現する。さらに、そのような細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１α、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、およびＣＤ８０と同様に、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ分子を特徴的に発現するが、ＣＤ１４の発現を失う。他の細胞表面マーカーには、特徴的に、Ｔ細胞マーカーＣＤ２およびＣＤ５、Ｂ細胞マーカーＣＤ７および骨髄細胞マーカーＣＤ１３、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）、ＣＤ３３、ＣＤ３６、およびＣＤ６３、ならびに多数の白血球関連抗原が含まれる。
【0021】
必要に応じて、形態学的観察や免疫化学的染色などの標準的な手法を使用、樹状細胞の存在を確認できる。例えば、樹状細胞の純度は、上記の特徴的な細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１α、ＣＤ４０、および／またはＣＤ５４の１つまたは複数に対する蛍光色素標識抗体を使用するフローサイトメトリーにより評価できる。この手法は、未成熟樹状細胞に存在するＣＤ１４に対する蛍光色素標識抗体を使用、成熟分化樹状細胞と未成熟樹状細胞の区別にも使用できる。
【0022】
線維芽細胞
本発明の線維芽細胞は、前癌細胞を区別する少なくとも１つの対立遺伝子を有する任意の線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、線維芽細胞、マクロファージ、および癌患者からの脂肪細胞などの様々な供給源から単離できるが、これらに限定されない。線維芽細胞はまた、融合細胞を調製するために使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者の自己由来、同種移植または同種由来である初代細胞培養からのものであってもよい。
本発明の線維芽細胞は、前癌細胞を区別する少なくとも１つの対立遺伝子を有する任意の線維芽細胞であり得る。線維芽細胞は、線維芽細胞、マクロファージ、および癌患者からの脂肪細胞などの様々な供給源から単離できるが、これらに限定されない。線維芽細胞はまた、融合細胞を調製するために使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者の自己由来、同種移植または同種由来である初代細胞培養からのものであってもよい。
【0023】
線維芽細胞の供給源は、予防される癌によって選択される。好ましくは、線維芽細胞は、治療されている患者に対して自己由来である。標的細胞に少なくとも特異的な１つの抗原を含む細胞であれば、どのような線維芽細胞でも使用可能である。樹状細胞が患者に対して同種異系である一実施形態では、線維芽細胞は、治療される哺乳動物と同じクラスＩＭＨＣハプロタイプである少なくとも１つのＭＨＣＩ対立遺伝子を有していてもよい。樹状細胞が患者に対して自己由来である別の実施形態において、線維芽細胞は、治療を受ける哺乳動物に対して同種異系または自己由来のものであってもよい。
【0024】
一実施形態では、本発明の線維芽細胞は、融合細胞の受容者となる哺乳動物から外科的に除去される皮膚組織から単離される。使用する前に、固体の前癌組織または凝集した前癌細胞を、標準的な技術によって、好ましくは機械的に、単一の細胞懸濁液に分散させるべきである。コラゲナーゼおよびＤＮＡｓｅなどの酵素もまた、癌細胞を分散させるために使用され得るが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の線維芽細胞は、初代細胞培養物、すなわち、身体から得られた元の細胞の培養物から得られる。好ましい一実施形態では、線維芽細胞は、哺乳動物からの血漿で培養された。
【0025】
採取した線維芽細胞の量は、樹状細胞と融合して本発明のワクチンに充分な融合細胞を調製するのに十分な量であるべきである。一実施形態では、５×１０７の線維芽細胞が、融合細胞の形成のための出発物質として使用される。一実施形態では、約１×１０６から１×１０９の線維芽細胞が、融合細胞の形成に使用される。別の実施形態では、５×１０７から２×１０８の線維芽細胞が使用される。さらに別の実施形態では、１×１０７から１×１０１０の線維芽細胞が使用される。融合細胞の調製のために他の量の線維芽細胞の使用は、本発明の範囲内である。
【0026】
癌細胞の抗原性を有する抗原を含む線維芽細胞は、当技術分野で知られている任意の方法で同定および単離することができる。例えば、線維芽細胞は、形態学、酵素アッセイまたは増殖アッセイによって識別できる（図３～５を参照）。目的の抗原の特徴が知られている場合、線維芽細胞はまた、当技術分野で知られている任意の生化学的または免疫学的方法によって同定または単離することができる。例えば、線維芽細胞は、外科手術、内視鏡検査、他の生検技術、アフィニティークロマトグラフィー、および蛍光活性化セルソーティングによって単離することができる。
【0027】
線維芽細胞のクローンまたは均質または精製された集団を使用する必要はない。混合物中の相当数の細胞が標的とされる抗原を含むという条件で、細胞の混合物を使用することができる。特定の実施形態では、線維芽細胞および／または樹状細胞が精製される。
【0028】
腫瘍細胞またはパラフィン包埋腫瘍組織からのゲノムＤＮＡで形質転換された線維芽細胞
線維芽細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞を有する前癌細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムＤＮＡを含んでいた。ゲノムＤＮＡは、技術者に知られている任意な方法により、異なる供給源から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、技術者に知られている任意な方法により、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。
線維芽細胞は、腫瘍細胞または抗原提示細胞を有する前癌細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムＤＮＡを含んでいた。ゲノムＤＮＡは、技術者に知られている任意な方法により、異なる供給源から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、技術者に知られている任意な方法により、非樹状細胞にトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。
【0029】
ゲノムＤＮＡは、腫瘍組織または癌細胞のゲノムＤＮＡを含む任意の腫瘍サンプルから単離または抽出できる。腫瘍組織またはサンプルは、生きている組織／サンプルまたはパラフィンブロックに埋め込まれた組織標本の可能性がある。一つ実施形態では、ゲノムＤＮＡは、パラフィン包埋腫瘍組織から抽出できる。本発明において、ゲノムＤＮＡは、パラフィンブロックに埋め込まれたサンプルから得ることができる。したがって、ゲノムＤＮＡをより簡単かつ費用効果の高い方法で取得できる。
【0030】
本発明の方法において、融合細胞を生成するための皮膚組織からの線維芽細胞は、ゲノムＤＮＡを形質転換またはマイクロインジェクションできる必要があり、且つ樹状細胞と融合できる必要がある。技術者に知られている任意な方法を使用、皮膚組織からの線維芽細胞が本発明の方法に適しているかどうかを決定できる。一面では、皮膚組織からの線維芽細胞は、ゲノムＤＮＡでトランスフェクトまたはマイクロインジェクションできる。別の面において、皮膚組織からの線維芽細胞は、樹状細胞と融合できる。
【0031】
特定の実施形態では、皮膚組織からの細胞は、治療される対象の種とは異なる種に由来する。あるいは、線維芽細胞は、治療される対象の種と同じ種に由来する。特定の実施形態において、線維芽細胞は、治療される対象に対して異種である。他の実施形態では、線維芽細胞は、治療される対象に対して自己由来である。特定の実施形態において、線維芽細胞は、細胞培養において維持および／または増殖される。
【0032】
技術者に知られている任意な方法を使用し、腫瘍、癌、または前癌病変の細胞からゲノムＤＮＡを抽出できる。ゲノムＤＮＡを単離するための例示的な方法は、当技術分野でよく知られている。ゲノムＤＮＡは、技術者に知られている任意な方法を使用し線維芽細胞に導入できる。特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、線維芽細胞にトランスフェクトされる。より具体的な実施形態では、ゲノムＤＮＡは、リポフェクションを使用し線維芽細胞にトランスフェクトされる。
【0033】
線維芽細胞に導入されるゲノムＤＮＡの最適量は、技術者に周知の標準的な技術によって決定することができる。特定の実施形態において、皮膚組織からの線維芽細胞ごとに導入されるゲノムＤＮＡの量は、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－１ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－２ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－３ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－４ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－５ゲノムに相当、少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－６ゲノムに相当、または少なくとも腫瘍細胞または前癌細胞の１０－７ゲノムに相当する。
【0034】
特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡは、マイクロインジェクションを使用して線維芽細胞に導入される。特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡのフラグメントは、ゲノムＤＮＡの増殖のためにベクターにパッケージ化される。このようなベクターには、バクテリオファージ、コスミド、またはＹＡＣが含まれるが、これらに限定されない。技術者に知られている任意な方法を使用し、ゲノムＤＮＡをパッケージングおよび増殖させることができる。
【0035】
ゲノムＤＮＡが皮膚組織由来の線維芽細胞に導入されると、線維芽細胞は、１つまたは複数の抗原を発現し、これらの抗原は、ゲノムＤＮＡが単離される腫瘍細胞、新生物細胞、または前癌細胞に発現される。本発明の特定の実施形態において、線維芽細胞は、腫瘍または前癌病変の抗原性を示す分子が１つ以上を含む。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍または前癌病変を有する対象者の他の組織よりも、腫瘍または前癌病変において少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高いレベルで発現している。
【0036】
図１に示すように、よく知られた標準的な技術によって、皮膚組織からの線維芽細胞などの線維芽細胞が得られる。この線維芽細胞に核酸、好ましくはＤＮＡを形質転換する。癌細胞のゲノムＤＮＡなどのＤＮＡは、パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から抽出される。その後、ＤＮＡを導入した線維芽細胞をマイトマイシンなどの抗生物質で処理し、癌細胞の増殖を抑制してもよい。この線維芽細胞は、続いて詳細に説明する樹状細胞との融合に用いることができる。
【0037】
線維芽細胞および樹状細胞の融合
本開示はまた、樹状細胞と皮膚組織からの線維芽細胞との融合細胞を含む。融合細胞は腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを含み、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコードする。
本開示はまた、樹状細胞と皮膚組織からの線維芽細胞との融合細胞を含む。融合細胞は腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを含み、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコードする。
【0038】
本開示も、樹状細胞の集団および線維芽細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含み、ヒト樹状細胞および線維芽細胞を融合する方法に向けられる。
【0039】
線維芽細胞は、以下のように樹状細胞に融合させることができる。細胞は、癌の予防に哺乳動物への注射に適した融合細胞の混合物をもたらすという条件で、当技術分野の任意な細胞融合技術に従って滅菌洗浄および融合される。好ましくは、電気融合が使用される。電気融合技術は当技術分野で周知である（Ｓｔｕｈｌｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｄｅｎ， １９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３９： ３４２－３４５； ｓｅｅ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９２を参照）。
【0040】
好ましい実施形態では、以下のプロトコルが使用される。最初のステップで、約５×１０７の前癌性非樹状細胞と５×１０７の樹状細胞を０．３Ｍグルコースに懸濁、電気融合キュベットに移す。細胞サンプルを１００Ｖ／ｃｍで５～１０秒間パルスすることにより、サンプルを誘電泳動で整列させて細胞間コンジュゲートを形成する。必要に応じて、エレクトロポレーションキュベットの１つ側面に誘電性ワックスを一滴塗布して電界を「不均一化」し、細胞を最高の電界強度の領域に向けることにより、位置合わせを最適化できる。２番目のステップで、融合パルスが適用される。電気融合には様々なパラメータを使用できる。例えば、一つの実施形態で、融合パルスは、単一パルスから三重パルスまでであり得る。別の実施形態で、電気融合は、約２５μＦで５００から１５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは１２００Ｖ／ｃｍを使用して達成される。
【0041】
好ましい実施形態では、以下のプロトコルが使用される。最初のステップで、非樹状細胞を１００μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣで１０時間処理、細胞の増殖を防ぐ。その後、非樹状細胞をＰＢＳで洗浄、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡで処理する。次に、非樹状細胞と樹状細胞を混合、洗浄、ＰＢＳで遠心分離する。次に、沈殿した細胞に０．５ｍＬの５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加え、３７℃に温めた後、正確に１分間インキュベートする。さらに、沈殿した細胞に無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地７ｍＬを加え、３７℃に温めてＰＥＧを希釈する。必要に応じて、８ｍＬの１０％ＦＣＳ含有のＲＰＭＩ－１６４０培地を希釈のために添加する。最後に、遠心分離によってＰＥＧを除去、沈殿した細胞を、ｒｈ ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈ ＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびｒｈＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した２％不活化自己血漿添加のＡＩＭ－Ｖ培地に懸濁する。
【0042】
好ましい実施形態では、線維芽細胞は、本発明の融合細胞が投与される患者に対して自己由来である。別の好ましい実施形態では、樹状細胞は、本発明の融合細胞が投与される患者に対して自己由来である。さらにより好ましい実施形態において、前癌性非樹状細胞および樹状細胞の両方は、本発明の融合細胞が投与される患者に対して自己由来である。
【0043】
別の実施形態では、樹状細胞および皮膚組織からの細胞は、上記のように融合される。続いて、融合細胞は、ＣＴＬおよび／または体液性免疫応答を刺激する分子をコードする遺伝物質を形質転換またはトランスフェクトされる。好ましい実施形態では、遺伝物質は、ＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡである。好ましいトランスフェクション方法には、カチオン性ポリマーの存在下でのエレクトロポレーションまたは形質転換またはトランスフェクションが含まれる。
【0044】
線維芽細胞および樹状細胞集団内の融合細胞形成の程度は、当技術分野で知られているいくつかの診断技術によって決定できる。一つ実施形態では、例えば、ハイブリッドは、樹状細胞および線維芽細胞をそれぞれ赤および緑の細胞内蛍光色素で標識、両方の色の発光を検出することを特徴とする。
【0045】
免疫細胞活性化分子
本発明は、樹状細胞および皮膚組織からの線維芽細胞を融合した融合細胞を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答および／または体液性応答を刺激或いは誘導できるサイトカインまたは他の分子をさらに含む。好ましい実施形態では、ＣＴＬ刺激分子は、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８である。
本発明は、樹状細胞および皮膚組織からの線維芽細胞を融合した融合細胞を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答および／または体液性応答を刺激或いは誘導できるサイトカインまたは他の分子をさらに含む。好ましい実施形態では、ＣＴＬ刺激分子は、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８である。
【0046】
標的癌
本発明の融合細胞を使用し予防および治療できる癌腫と発癌性疾患、ならびにそれらの癌腫と発癌性疾患の発症につながる前癌性病変には、以下が含まれる。ただしこれらに限定されない：ヒト肉腫および癌腫、例えば、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫。白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病と非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患。
本発明の融合細胞を使用し予防および治療できる癌腫と発癌性疾患、ならびにそれらの癌腫と発癌性疾患の発症につながる前癌性病変には、以下が含まれる。ただしこれらに限定されない：ヒト肉腫および癌腫、例えば、腎細胞癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄質癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫。白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病と非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖疾患。
【0047】
医薬品の調製および投与方法
本開示も、開示された融合細胞を含む医薬組成物に向けられる。
本発明の組成物製剤は、投与される融合細胞の有効な免疫量を含む。本発明の医薬組成物の融合細胞は、樹状細胞や普遍的な抗原提示細胞などの抗原提示細胞と、皮膚組織からの細胞を融合することによって形成できる。ここで、皮膚組織からの細胞は、癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムＤＮＡか、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織に由来する物を含む。特定の実施形態において、本発明の融合細胞は、治療または予防される癌に１つ以上の特異的な抗原を発現する。
本開示も、開示された融合細胞を含む医薬組成物に向けられる。
本発明の組成物製剤は、投与される融合細胞の有効な免疫量を含む。本発明の医薬組成物の融合細胞は、樹状細胞や普遍的な抗原提示細胞などの抗原提示細胞と、皮膚組織からの細胞を融合することによって形成できる。ここで、皮膚組織からの細胞は、癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織から抽出されたゲノムＤＮＡか、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは癌細胞、前癌病変の細胞、またはパラフィン包埋腫瘍組織に由来する物を含む。特定の実施形態において、本発明の融合細胞は、治療または予防される癌に１つ以上の特異的な抗原を発現する。
【0048】
適切な融合細胞の調製物は、好ましくは液体溶液である注射可能な製剤を含む。
【0049】
医薬組成物は、注射可能な液体溶液または懸濁液で調製できる。医薬組成物は、任意に適切な適用様式、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下など、および任意に適切な伝達装置で投与できる。特定の実施形態において、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与用に製剤化されている。経口および鼻腔内投与を含み、他の投与様式に適した医薬組成物も調製できる。
【0050】
医薬組成物は、即時放出または持続放出製剤に製剤できる。さらに、医薬組成物は、免疫原の捕捉および微粒子との同時投与により全身性または局所的な粘膜免疫の誘導に調製できる。そのような伝達システムは、本領域の一般技術者によって容易に決定される。
【0051】
医薬組成物はまた、適切な投薬単位形態で製剤される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．５μｇから約１ｍｇのタウペプチド免疫原構築物を含む。医薬組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるか治療的であるかを含み、多くの異なる要因に応じて変化する。通常、患者はヒトですが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療できる。複数回投与で伝達される場合、医薬組成物は、投与単位形態ごとに適切な量に都合よく分割できる。投与される投与量は、治療分野でよく知られているように、対象の年齢、体重、および一般的な健康状態に依存する。
【0052】
さらに、必要に応じて、組成物調製物はまた、湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／または組成物の有効性を高める化合物などの少量の補助物質を含み得る。補助物質の有効性は、融合細胞に対する抗体の誘導を測定することにより決定できる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ミョウバンゲル、リン酸アルミニウム、或いは油中水型エマルジョンを含むミネラル塩などのアジュバントまたは担体を含む。
【0053】
組成物が投与される哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、ラットを含み、これらに限定されない非ヒト動物でもあり得る。
【0054】
特定の実施形態
（１）組換え細胞を調製する方法が以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物の結合組織から線維芽細胞を提供する。
（ｂ）哺乳動物の腫瘍組織から癌細胞のゲノムＤＮＡを抽出する。ここで、ゲノムＤＮＡは、少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、哺乳動物の腫瘍組織は新たに単離される物ではない。加えて
（ｃ）癌細胞のゲノムＤＮＡを線維芽細胞に形質転換する。
（２）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物がヒトである。
（３）（１）に記載した方法により、ここでの結合組織が皮膚組織である。
（４）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物からの腫瘍組織が新たに単離される物ではない。
（５）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物由来の腫瘍組織がパラフィンブロックに埋め込まれている。
（６）（３）に記載した方法により、ここでの皮膚組織が皮膚生検輸送および洗浄溶液に
よって維持と洗浄される。
（７）（１）に記載した方法により、ここでの線維芽細胞が皮膚生検培養培地中で維持と
培養され、皮膚生検培養培地が哺乳動物からの血漿を含む。
（８）樹状細胞および組換え細胞を融合する方法は、哺乳動物由来の樹状細胞の集団
および（１）の組換え細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含む。
（９）（８）に記載した方法により、ここでの樹状細胞および組換え細胞が哺乳動物に
対して自己由来である。
（１０）（８）に記載した方法により、ここでの細胞融合が電気融合によって達成される。
（１１）組換え細胞は癌細胞のゲノムＤＮＡを含み、癌細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、ゲノムＤＮＡはパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から単離される。ここで組換え細胞は、哺乳動物の皮膚組織からの線維芽細胞であり、癌細胞および線維芽細胞は、哺乳動物に対して自己由来である。
（１２）（１１）に記載した組換え細胞は、組換え細胞が（１）の方法によって調製される。
（１３）融合細胞は融合によって得られる：
（ａ）樹状細胞 と
（ｂ）（１）または（１１）に記載した組換え細胞
ここで、樹状細胞および組換え細胞は哺乳動物に対して自己由来であり、融合細胞は少なくとも癌に１つ特異的な抗原を含み、融合細胞はＣＤ８３， ＣＤ１α， ＣＤ４０， ＣＤ８６， ＣＤ５４， ＣＤ８０またはＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを含む。
（１４）（１３）に記載した融合細胞は、（１０）に記載の方法によって調製される。
（１５）医薬組成物は（１３）に記載した融合細胞および有効量のアジュバントまたは
担体を含む。
（１６）（１５）に記載した医薬組成物は、さらに、体液免疫応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む。（１７）（１６）に記載した医薬組成物には、その分子がサイトカインである。
（１）組換え細胞を調製する方法が以下のステップを含む：
（ａ）哺乳動物の結合組織から線維芽細胞を提供する。
（ｂ）哺乳動物の腫瘍組織から癌細胞のゲノムＤＮＡを抽出する。ここで、ゲノムＤＮＡは、少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、哺乳動物の腫瘍組織は新たに単離される物ではない。加えて
（ｃ）癌細胞のゲノムＤＮＡを線維芽細胞に形質転換する。
（２）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物がヒトである。
（３）（１）に記載した方法により、ここでの結合組織が皮膚組織である。
（４）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物からの腫瘍組織が新たに単離される物ではない。
（５）（１）に記載した方法により、ここでの哺乳動物由来の腫瘍組織がパラフィンブロックに埋め込まれている。
（６）（３）に記載した方法により、ここでの皮膚組織が皮膚生検輸送および洗浄溶液に
よって維持と洗浄される。
（７）（１）に記載した方法により、ここでの線維芽細胞が皮膚生検培養培地中で維持と
培養され、皮膚生検培養培地が哺乳動物からの血漿を含む。
（８）樹状細胞および組換え細胞を融合する方法は、哺乳動物由来の樹状細胞の集団
および（１）の組換え細胞の集団に細胞融合を促進する条件を含む。
（９）（８）に記載した方法により、ここでの樹状細胞および組換え細胞が哺乳動物に
対して自己由来である。
（１０）（８）に記載した方法により、ここでの細胞融合が電気融合によって達成される。
（１１）組換え細胞は癌細胞のゲノムＤＮＡを含み、癌細胞のゲノムＤＮＡは少なくとも癌に１つ特異的な抗原をコード、ゲノムＤＮＡはパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から単離される。ここで組換え細胞は、哺乳動物の皮膚組織からの線維芽細胞であり、癌細胞および線維芽細胞は、哺乳動物に対して自己由来である。
（１２）（１１）に記載した組換え細胞は、組換え細胞が（１）の方法によって調製される。
（１３）融合細胞は融合によって得られる：
（ａ）樹状細胞 と
（ｂ）（１）または（１１）に記載した組換え細胞
ここで、樹状細胞および組換え細胞は哺乳動物に対して自己由来であり、融合細胞は少なくとも癌に１つ特異的な抗原を含み、融合細胞はＣＤ８３， ＣＤ１α， ＣＤ４０， ＣＤ８６， ＣＤ５４， ＣＤ８０またはＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩを含む。
（１４）（１３）に記載した融合細胞は、（１０）に記載の方法によって調製される。
（１５）医薬組成物は（１３）に記載した融合細胞および有効量のアジュバントまたは
担体を含む。
（１６）（１５）に記載した医薬組成物は、さらに、体液免疫応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫応答を刺激する分子を含む。（１７）（１６）に記載した医薬組成物には、その分子がサイトカインである。
【実施例1】
【0055】
ゲノムＤＮＡを含む線維芽細胞の調製
皮膚生検輸送と洗浄培地及び皮膚生検培養培地の調製
「皮膚生検輸送と洗浄培地」および「皮膚生検培養培地」の両方が調製される。皮膚生検培養培地はパーソナライズされる。
皮膚生検輸送と洗浄培地及び皮膚生検培養培地の調製
「皮膚生検輸送と洗浄培地」および「皮膚生検培養培地」の両方が調製される。皮膚生検培養培地はパーソナライズされる。
【0056】
皮膚生検輸送と洗浄培地は以下の成分を含む：ＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清、ペニシリンストレプトマイシン、およびゲンタマイシン溶液。
【0057】
皮膚生検培養培地は以下の成分を含む：ＨＦＤＭ－１（＋）、哺乳動物からの血漿、ペニシリンストレプトマイシン。哺乳類からの血漿は患者に自家である。
【0058】
線維芽細胞の調製
線維芽細胞は皮膚組織から得られた。皮膚組織は、融合細胞の調製に使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者にとって自家、同系、または同種異系であり得る。皮膚組織は、皮膚生検輸送および洗浄培地によって維持および洗浄された。皮膚組織はホモジナイザーによって均質化された。線維芽細胞は、皮膚生検培養培地で維持および培養された。線維芽細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ（注文番号：１３０－１０１－５４０）のＷｈｏｌｅ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト）を使用して分散させる。
線維芽細胞は皮膚組織から得られた。皮膚組織は、融合細胞の調製に使用される樹状細胞の供給源に応じて、患者にとって自家、同系、または同種異系であり得る。皮膚組織は、皮膚生検輸送および洗浄培地によって維持および洗浄された。皮膚組織はホモジナイザーによって均質化された。線維芽細胞は、皮膚生検培養培地で維持および培養された。線維芽細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ（注文番号：１３０－１０１－５４０）のＷｈｏｌｅ Ｓｋｉｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ヒト）を使用して分散させる。
【0059】
線維芽細胞を調製する方法は以下のステップを含む
（ａ）皮膚組織を取得する。
（ｂ）皮膚生検輸送および洗浄培地で皮膚組織を維持および洗浄する。
（ｃ）ホモジナイザーによって皮膚組織を均質化し、線維芽細胞を取得する。
（ｄ）皮膚生検培養培地で線維芽細胞を培養する。
（ｅ）皮膚生検培養培地で線維芽細胞を継代培養する。
（ｆ）線維芽細胞を採取または凍結する。
（ａ）皮膚組織を取得する。
（ｂ）皮膚生検輸送および洗浄培地で皮膚組織を維持および洗浄する。
（ｃ）ホモジナイザーによって皮膚組織を均質化し、線維芽細胞を取得する。
（ｄ）皮膚生検培養培地で線維芽細胞を培養する。
（ｅ）皮膚生検培養培地で線維芽細胞を継代培養する。
（ｆ）線維芽細胞を採取または凍結する。
【0060】
酵素分散法による真皮線維芽細胞の初代培養プロトコル
１．線維芽細胞酵素分散法
１．線維芽細胞酵素分散法
【0061】
【表1】
【0062】
皮膚組織採取容器の準備：２５ｍＬの輸送培地を皮膚組織採取容器に分注、提携医療機関に出荷する。
【0063】
保管、収集した皮膚生検組織を受け取る：受容試験（輸送培地の無菌試験）。
【0064】
【表2】
【0065】
線維芽細胞培養操作：
（１）酵素分散専用容器（Ｃチューブ）で酵素液を調製する。
（２）１ｍＬの組織洗浄液を２５ｍＬのチューブに分注する。クリニックから受け取った皮膚生検を洗う。
（３）皮膚生検をＣチューブに移し、蓋をしっかりと閉める。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでの酵素反応処理（３時間から一晩）（３時間反応の場合、皮膚生検を４つに分ける）。
（１）酵素分散専用容器（Ｃチューブ）で酵素液を調製する。
（２）１ｍＬの組織洗浄液を２５ｍＬのチューブに分注する。クリニックから受け取った皮膚生検を洗う。
（３）皮膚生検をＣチューブに移し、蓋をしっかりと閉める。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでの酵素反応処理（３時間から一晩）（３時間反応の場合、皮膚生検を４つに分ける）。
【0066】
２．線維芽細胞初代培養Ｔ２５フラスコにまく。
【0067】
【表3】
【0068】
【表4】
【0069】
初代培養操作：
（１）１４．５ｍＬの培地を１５ｍＬのチューブに注ぐ。
（２）酵素分散容器（Ｃチューブ）をインキュベーターの１５ｍＬチューブから取り出す。
５００μＬの培地を加え、蓋をしっかりと閉める。
（３）ＣチューブをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（自動組織破壊クラッシャー）に設定、プログラムを開始する。
（４）プログラム終了後、２ｍＬの培地を加える。７０μｍメッシュフィルターで１５ｍＬチューブに収集する。
（５）もう一度２ｍＬの培地を加え、遠心分離（フラッシュ）する。７０μｍメッシュフィルターで１５ｍＬチューブに収集する。
（６）十分に攪拌した後、３０μＬの細胞溶液を採取、計算用１．５ｍＬチューブと混合する。血球計算盤にロードする。
（７）位相差顕微鏡で細胞数を数える。
（８）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）。
（９）上清を吸引した後、１０ｍＬの培地に懸濁、Ｔ２５フラスコに移す。
（１０）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
（１）１４．５ｍＬの培地を１５ｍＬのチューブに注ぐ。
（２）酵素分散容器（Ｃチューブ）をインキュベーターの１５ｍＬチューブから取り出す。
５００μＬの培地を加え、蓋をしっかりと閉める。
（３）ＣチューブをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（自動組織破壊クラッシャー）に設定、プログラムを開始する。
（４）プログラム終了後、２ｍＬの培地を加える。７０μｍメッシュフィルターで１５ｍＬチューブに収集する。
（５）もう一度２ｍＬの培地を加え、遠心分離（フラッシュ）する。７０μｍメッシュフィルターで１５ｍＬチューブに収集する。
（６）十分に攪拌した後、３０μＬの細胞溶液を採取、計算用１．５ｍＬチューブと混合する。血球計算盤にロードする。
（７）位相差顕微鏡で細胞数を数える。
（８）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）。
（９）上清を吸引した後、１０ｍＬの培地に懸濁、Ｔ２５フラスコに移す。
（１０）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養する。
【0070】
３．線維芽細胞Ｔ２５フラスコからＴ２２５フラスコへの継代。
【0071】
【表5】
【0072】
線維芽細胞継代の調製：
培地、ＰＢＳ、トリプシンＥＤＴＡを室温に戻す。
培地、ＰＢＳ、トリプシンＥＤＴＡを室温に戻す。
【0073】
継代操作：
（１）培養上清１０ｍＬをＴ２２５ｃｍ２フラスコに移す。
（２）５ｍＬ ＰＢＳを加えて除去、２ｍＬトリプシンＥＤＴＡを加え、室温で１分間処理してから、除去する。
（３）３０ｍＬの培地をＴ２２５ｃｍ２フラスコにピペットで入れる。
（４）フラスコをはじいて剥がし、５ｍＬの培地を加えます。一部を１５ｍＬチューブに入れる。
（５）染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
（６）細胞溶液全体をＴ２２５ｃｍ２フラスコに移す。
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
（１）培養上清１０ｍＬをＴ２２５ｃｍ２フラスコに移す。
（２）５ｍＬ ＰＢＳを加えて除去、２ｍＬトリプシンＥＤＴＡを加え、室温で１分間処理してから、除去する。
（３）３０ｍＬの培地をＴ２２５ｃｍ２フラスコにピペットで入れる。
（４）フラスコをはじいて剥がし、５ｍＬの培地を加えます。一部を１５ｍＬチューブに入れる。
（５）染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
（６）細胞溶液全体をＴ２２５ｃｍ２フラスコに移す。
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
【0074】
４．線維芽細胞Ｔ２２５フラスコを凍結した。
【0075】
【表6】
【0076】
線維芽細胞凍結の準備：
【0077】
培地、ＰＢＳ、トリプシンＥＤＴＡを室温に戻す。また、血清チューブの凍結管理バーコードラベルを発行する。
【0078】
凍結操作：
（１）培養上清を吸引する。
（２）１５ｍＬのＰＢＳを加えてから取り除き、次に５ｍＬのトリプシンＥＤＴＡを加えた。 室温で１分間保持する。
（３）３フラスコを裏返して剥がし、１１ｍＬの培地を加える。５０ｍＬチューブに移す。
（４）１ｍＬを検体保存チューブに移し、－２０℃で保存する。
（５）染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
（６）凍結保存細胞濃度１ｘ１０６ ｃｅｌｌ／ｍＬ。
（７）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）。
（８）必要な数の血清チューブを準備、バーコードラベルを貼り付け、細胞数を入力する。
（９）上清を吸引した後、１ｍＬの凍結細胞保存液で懸濁、溶液を計算する。必要な量まで一時停止する。
（１０）血清チューブに注ぎ、バイセルに入れます。
（１１）－８０℃の冷凍庫で凍結します。
（１）培養上清を吸引する。
（２）１５ｍＬのＰＢＳを加えてから取り除き、次に５ｍＬのトリプシンＥＤＴＡを加えた。 室温で１分間保持する。
（３）３フラスコを裏返して剥がし、１１ｍＬの培地を加える。５０ｍＬチューブに移す。
（４）１ｍＬを検体保存チューブに移し、－２０℃で保存する。
（５）染色せずに、オートセルカウンターで細胞数を数える。
（６）凍結保存細胞濃度１ｘ１０６ ｃｅｌｌ／ｍＬ。
（７）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分）。
（８）必要な数の血清チューブを準備、バーコードラベルを貼り付け、細胞数を入力する。
（９）上清を吸引した後、１ｍＬの凍結細胞保存液で懸濁、溶液を計算する。必要な量まで一時停止する。
（１０）血清チューブに注ぎ、バイセルに入れます。
（１１）－８０℃の冷凍庫で凍結します。
【0079】
図３～５は、０～１３日目の初代培養における線維芽細胞の細胞形態、および０～９日目の初代培養における線維芽細胞の増殖速度を示している。
【0080】
ゲノムＤＮＡの単離
パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織は、腫瘍サンプルとして医療機関から入手された。腫瘍サンプルはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、腫瘍組織の抗原性を確認するために医師によって決定された。パラフィンブロックはキシレンで脱ロウされた。腫瘍組織をフェノールとエタノールで処理、腫瘍組織のゲノムＤＮＡを抽出および沈殿させた。ゲノムＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅、－２０℃で保存した。
パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織は、腫瘍サンプルとして医療機関から入手された。腫瘍サンプルはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、腫瘍組織の抗原性を確認するために医師によって決定された。パラフィンブロックはキシレンで脱ロウされた。腫瘍組織をフェノールとエタノールで処理、腫瘍組織のゲノムＤＮＡを抽出および沈殿させた。ゲノムＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅、－２０℃で保存した。
【0081】
ゲノムＤＮＡを調製する方法が以下のステップを含む：
（ａ）パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織を取得
（ｂ）パラフィンブロックをヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色、腫瘍組織の抗原性を確認
（ｃ）キシレンによるパラフィンブロックの脱ロウ
（ｄ）フェノールとエタノールによる腫瘍組織のゲノムＤＮＡの抽出と沈殿
（ｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してゲノムＤＮＡを増幅
（ｆ）ゲノムＤＮＡを－２０℃で保存
（ａ）パラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織を取得
（ｂ）パラフィンブロックをヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色、腫瘍組織の抗原性を確認
（ｃ）キシレンによるパラフィンブロックの脱ロウ
（ｄ）フェノールとエタノールによる腫瘍組織のゲノムＤＮＡの抽出と沈殿
（ｅ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してゲノムＤＮＡを増幅
（ｆ）ゲノムＤＮＡを－２０℃で保存
【0082】
図２は、スライドと腫瘍組織のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の結果を示している。
【0083】
以下の表７は、癌患者からのゲノムＤＮＡサンプルのＯ．Ｄ．２６０／２８０検出結果を示す。
【0084】
【表7】
【0085】
腫瘍細胞のゲノムＤＮＡを含む線維芽細胞の調製
皮膚組織は、癌患者から得られた。皮膚組織を皮膚生検輸送と洗浄培地で洗浄、超音波処理を使用して破壊して皮膚線維芽細胞を得た。皮膚線維芽細胞を皮膚生検培養培地で数時間継代培養した。線維芽細胞は、リポフェクションによってパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から得られたゲノムＤＮＡで形質転換された。形質転換された線維芽細胞をトランスフェクション培地で培養、マイトマイシンで処理して癌細胞の増殖を阻害した。
皮膚組織は、癌患者から得られた。皮膚組織を皮膚生検輸送と洗浄培地で洗浄、超音波処理を使用して破壊して皮膚線維芽細胞を得た。皮膚線維芽細胞を皮膚生検培養培地で数時間継代培養した。線維芽細胞は、リポフェクションによってパラフィンブロックに埋め込まれた腫瘍組織から得られたゲノムＤＮＡで形質転換された。形質転換された線維芽細胞をトランスフェクション培地で培養、マイトマイシンで処理して癌細胞の増殖を阻害した。
【0086】
がん抗原（線維芽細胞＋癌ゲノム核酸）を産生するためのプロトコル。
【0087】
１．トランスフェクションのための線維芽細胞の播種
【0088】
【表8】
【0089】
（１）９ｍＬの培地を１５ｍＬのチューブにピペットで入れる。
（２）凍結した細胞を３７℃で速やかに溶解、細胞溶液を１５ｍＬチューブに移す。
（３）染色されていない状態で、自動セルカウンターで細胞数を数える。
（４）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（５）上清を捨て、０．１ｘ１０６細胞／ｍＬと計算された培地量で懸濁する。
（６）６ウェルプレートに各２ｍＬを接種する。（０．２ｘ１０６細胞／２ｍＬ／ウェル）
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
（２）凍結した細胞を３７℃で速やかに溶解、細胞溶液を１５ｍＬチューブに移す。
（３）染色されていない状態で、自動セルカウンターで細胞数を数える。
（４）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（５）上清を捨て、０．１ｘ１０６細胞／ｍＬと計算された培地量で懸濁する。
（６）６ウェルプレートに各２ｍＬを接種する。（０．２ｘ１０６細胞／２ｍＬ／ウェル）
（７）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートする。
【0090】
２．トランスフェクション操作
【0091】
【表9】
【0092】
（１）１２５μＬのオプチ培地を１．５ｍＬチューブ（Ｌ１、Ｔ１）にピペットで入れる。
（２）７．５μＬのリポフェクタミン３０００を１．５ｍＬチューブ（Ｌ１）にピペットで入れる。
（３）４．０μＬのＰ３０００試薬を１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）に注ぐ。
（４）２μｇのＤＮＡを１．５ ｍＬチューブ（Ｔ１）に加える。
（５）総量１．５ｍＬチューブ（Ｌ１）を１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）に加える。１０分間放置する。
（６）細胞板に異常がないかを観察する。
（７）培養上清を捨て、２ｍＬの１０％ＦＢＳ－ｏｐｔｉＭＥＭを加える。
（８）静置後、各抗原である線維芽細胞に全量１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）を加える。
（２）７．５μＬのリポフェクタミン３０００を１．５ｍＬチューブ（Ｌ１）にピペットで入れる。
（３）４．０μＬのＰ３０００試薬を１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）に注ぐ。
（４）２μｇのＤＮＡを１．５ ｍＬチューブ（Ｔ１）に加える。
（５）総量１．５ｍＬチューブ（Ｌ１）を１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）に加える。１０分間放置する。
（６）細胞板に異常がないかを観察する。
（７）培養上清を捨て、２ｍＬの１０％ＦＢＳ－ｏｐｔｉＭＥＭを加える。
（８）静置後、各抗原である線維芽細胞に全量１．５ｍＬチューブ（Ｔ１）を加える。
【0093】
３．マイトマイシン治療（癌細胞の増殖阻害）
【0094】
【表10】
【0095】
（１）細胞板に異常がないかを観察する。
（２）培養上清を取り除き、１ｍＬの１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩを加える。
（３）マイトマイシン２００μＬ（５００μｇ／ｍＬ）（処理濃度１００μｇ／ｍＬ）を加える。
（４）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで少なくとも１０時間に処理する。
（２）培養上清を取り除き、１ｍＬの１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩを加える。
（３）マイトマイシン２００μＬ（５００μｇ／ｍＬ）（処理濃度１００μｇ／ｍＬ）を加える。
（４）３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで少なくとも１０時間に処理する。
【0096】
４．がん抗原細胞の収集および凍結
【0097】
【表11】
【0098】
（１）７ｍＬ１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩを１５ｍＬチューブに分注する。
（２）細胞板に異常がないかを観察する。
（３）培養上清を回収、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した後に細胞を回収する。１ｍＬの０．０５％トリプシンＥＤＴＡを追加、３７℃で５分間放置する。
（４）細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに回収する。
（５）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（６）上清を捨て、２ｍＬのＰＢＳで懸濁する。
（７）位相差顕微鏡で視覚的にカウント（トリパン２倍希釈）した後に、細胞数を計算する。
（８）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（９）上清を捨て、１０００μＬの凍結細胞保存液に懸濁、クライオチューブに加える。分注してバイセルに入れ、－８０℃で凍結する。
（２）細胞板に異常がないかを観察する。
（３）培養上清を回収、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した後に細胞を回収する。１ｍＬの０．０５％トリプシンＥＤＴＡを追加、３７℃で５分間放置する。
（４）細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに回収する。
（５）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（６）上清を捨て、２ｍＬのＰＢＳで懸濁する。
（７）位相差顕微鏡で視覚的にカウント（トリパン２倍希釈）した後に、細胞数を計算する。
（８）遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分、ＲＴ）。
（９）上清を捨て、１０００μＬの凍結細胞保存液に懸濁、クライオチューブに加える。分注してバイセルに入れ、－８０℃で凍結する。
【0099】
線維芽細胞はがん細胞のゲノムＤＮＡを含み、ゲノムＤＮＡは少なくともがんに１つ特異的な抗原をコードする。結果を確認するために、以下の分析方法を用いる。
【0100】
リポフェクションによって線維芽細胞に導入された遺伝子のマイクロアレイによるｍＲＮＡ発現の分析。ランダムプライマーによるゲノムＤＮＡおよび増幅されたゲノムは、リポフェクションによって線維芽細胞にトランスフェクトされます。核酸を導入し、マイクロアレイ（単色法）によりＲＮＡ発現解析を行った。
【0101】
【表12】
【0102】
操作の概要：
－線維芽細胞の播種
－トランスフェクション
－トランスフェクションサンプルの収集と冷凍（－８０℃）
－ＲＮＡ抽出
－マイクロアレイ発現解析
－線維芽細胞の播種
－トランスフェクション
－トランスフェクションサンプルの収集と冷凍（－８０℃）
－ＲＮＡ抽出
－マイクロアレイ発現解析
【0103】
マイクロアレイ分析概要：
－分析業者：タカラバイオ株式会社
－名前：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ
－ラベリング方法：単色法
－ＣＨＩＰタイプ：対象人種
－アレイ名：ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ｖ３８ｘ６０Ｋ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ
－デザインＩＤ：７２３６３
－分析業者：タカラバイオ株式会社
－名前：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ
－ラベリング方法：単色法
－ＣＨＩＰタイプ：対象人種
－アレイ名：ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ｖ３８ｘ６０Ｋ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ
－デザインＩＤ：７２３６３
【0104】
「シャム」は、ＤＮＡを使用せずに導入処理のみを行った線維芽細胞のサンプルである。「ＢｌｏｃｋＰＣＲ」は、肺がんの病理標本から抽出したＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ増幅して導入した線維芽細胞のサンプルである。解析結果は、偽転写物（有効判定０）とＢｌｏｃｋＰＣＲ転写物（有効判定２）の遺伝子発現の違いを示している。ｔ検定の有意差は９５％、またその以上が記載されている（２５７件の結果）。遺伝子の記号と説明を選択的に以下に示す。
【0105】
【表13】
【0106】
「ＢｌｏｃｋＤＮＡ」は、パラフィンブロック内の肺癌病理学的標本から抽出されたＤＮＡを導入した線維芽細胞のサンプルである。解析結果は、偽転写物（有効判定０）とＢｌｏｃｋＤＮＡ転写物（有効判定２）の遺伝子発現の違いを示している。ｔ検定の有意差は９５％、またその以上が記載されている（４１０件の結果）。遺伝子の記号と説明を選択的に以下に示す。
【0107】
【表14】
【0108】
「ＳｌｉｄｅＰＣＲ」は、肺がんの病理生検から抽出されたＤＮＡをＰＣＲで増幅して導入した線維芽細胞からのサンプルである。解析結果は、偽転写物（有効判定０）とＳｌｉｄｅＰＣＲ転写物（有効判定２）の遺伝子発現の違いを示している。ｔ検定の有意差は９５％、またその以上が記載されている（５９件の結果）。遺伝子の記号と説明を選択的に以下に示す。
【0109】
【表15】
【0110】
「ＣｅｌｌｌｉｎｅＤＮＡ」は、細胞株から抽出したＤＮＡを導入した線維芽細胞のサンプルである。解析結果は、偽転写物（有効判定０）と細胞株ＤＮＡ転写物（有効判定２）の遺伝子発現の違いを示している。ｔ検定有意差は９５％、またその以上が記載されている（１０８件）。遺伝子の記号と説明を選択的に以下に示す。
【0111】
【表16】
【0112】
図６は、さまざまなサンプルからのｍＲＮＡ発現のヒートマップを示している。系統樹は変異の差が大きい上位１０００個の遺伝子から作成された。
【0113】
【表17】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】