特表 2022-542829 改善されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】改善されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20220930BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220930BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220930BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20220930BHJP

   C12N 5/07 20100101ALN20220930BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20220930BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K35/76

A61K48/00

C12N5/077

C12N5/07

C12N15/864 100Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502942

(86)(22)【出願日】2020-03-12

(85)【翻訳文提出日】2022-03-10

(86)【国際出願番号】 US2020022326

(87)【国際公開番号】W WO2021011034

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】16/512,051

(32)【優先日】2019-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502097366

【氏名又は名称】チャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100096943

【氏名又は名称】臼井 伸一

(72)【発明者】

【氏名】ワング，チィツァオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA20

4C084ZC80

4C087AA01

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA20

4C087ZC80

(57)【要約】

本発明は、改良されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物、ならびにそれらの製造および使用のための方法に関する。本発明は、特に、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーを含むシスエレメントを含むようにさらに改変されており、ｒＡＡＶゲノムの複製を調節することができ、ｒＡＡＶ複製を改善する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。好ましくは、このようなシスエレメントは、ｒＡＡＶの５’および／または３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に先行および／または後続するｒＡＡＶのドメイン内に提供される。本発明は、特に、実際のまたは潜在的なＧ四重鎖配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、野生型ＡＡＶ（ｗｔ ＡＡＶ）からのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、および他のウイルスゲノムまたはヒトゲノムからのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメントの存在および使用に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であってそのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’であり、そして
前記シスエレメントの存在は、ｒＡＡＶ産生細胞が、前記シスエレメントを欠く場合に得られるそのようなｒＡＡＶよりも高い産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項2】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ１ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項3】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ２ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項4】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ３ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項5】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ４ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項6】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ１ドメインおよびそのＰ２、Ｐ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項7】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ２ドメインおよびそのＰ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項8】

前記使用されたｒＡＡＶが、そのＰ３ドメインおよびそのＰ４ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項9】

前記付加されたシスエレメントが、前記使用されたｒＡＡＶにおいてＧ四重鎖構造を形成する、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項10】

付加されたシスエレメントが、以下からなる群から選ばれる、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）：
（１）野生型ＡＡＶゲノムの潜在的Ｇ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの潜在的Ｇ四重鎖配列；
（２）野生型ＡＡＶゲノムの実際のＧ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの実際のＧ四重鎖配列；
（３）野生型ＡＡＶ由来のＤＮＡ配列または野生型ＡＡＶ由来の逆向きのＤＮＡ配列；および
（４）別のウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、または別のウイルスゲノム由来の逆向きのＤＮＡ配列。

【請求項11】

前記導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項12】

前記使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項13】

以下を含む薬学的組成物：
（Ａ）請求項１に記載の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）；および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。

【請求項14】

前記使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、請求項１３に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の前記産生力価を増加させる方法であって、前記方法は：
（Ａ）前記産生力価を産生するためのｒＡＡＶとして、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上に付加されたシスエレメントを含むｒＡＡＶを使用することであって：
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’である、使用すること、および
（Ｂ）前記使用されたｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養すること、ただし、前記細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有する、ただし、前記培養は、培養培地中で、ｒＡＡＶの産生を許容するのに十分な条件の下で行われること、
を含み、
前記使用されたｒＡＡＶにおける前記シスエレメントの存在は、前記細胞が、前記使用されたｒＡＡＶが前記シスエレメントを欠失している場合に達成されるのに比べ、増加した産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす、方法。

【請求項16】

前記細胞が、ヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞がＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記細胞がＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記細胞がｓｆ９昆虫細胞である、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改良されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物、ならびにそれらの製造および使用のための方法に関する。本発明は、特に、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー、これらはｒＡＡＶゲノムの複製を調節することができ、ｒＡＡＶ複製を改善する、を含むシスエレメントを含むようにさらに改変されている組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。好ましくは、このようなシスエレメントは、ｒＡＡＶの５’および／または３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に先行および／または後続するｒＡＡＶのドメイン内に提供される。本発明は、特に、実際のまたは潜在的なＧ四重鎖配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、野生型ＡＡＶ（ｗｔ ＡＡＶ）からのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、および他のウイルスゲノムまたはヒトゲノムからのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメントの存在および使用に関する。
配列表の参照

【0002】

本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１以下に従った一以上の配列一覧を含み、この配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：２６５０－０００３ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（２０１９年７月１５日作成、サイズ６３，３０９バイト））に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【背景技術】

【0003】

Ｉ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅのＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する小型の自然発生非病原性ウイルスである（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｚｉｎｎ，Ｅ．他（２０１４）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｆｉｔ Ｔｏ Ｓｅｒｖｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．０：９０－９７）。疾患を引き起こさないにもかかわらず、 ＡＡＶはヒトおよび他の霊長類に感染し、ヒト集団で流行することが知られる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｂ．他（１９７２）“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ Ｐｒｅｐａｒｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９（６）：１０１７－１０２６）。ＡＡＶは広範囲の異なる細胞型（例えば、中枢神経系、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜色素上皮の細胞、または光受容細胞、または骨格筋細胞）に感染する。異なる組織感染能（「トロピズム」）を示すウイルスの１２の血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６など）が同定されている（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＮＳ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”２４：５９－６７）。

【0004】

ＡＡＶは約４，７００ヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を一緒に含む５’ハーフおよび３’ハーフを有するものとして記載することができる。（図１）。ＡＡＶゲノムの５’ハーフはＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含み、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、複数のリーディングフレーム、スタガード開始プロモーター（ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０）、および選択的スプライシングを用いて、ウイルスの転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要な４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、およびＲｅｐ７８）をコードする（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．他（２００２）“Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｐ１９ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ Ｒｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１６）：８２２５－８２３５）。ＡＡＶゲノムの３’ハーフは、ＡＡＶキャプシド遺伝子（ｃａｐ）を含み、ＶＰ１，ＶＰ２，ＶＰ３の３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ）をコードする。３つのキャプシドタンパク質は、単一のプロモーター（ＡＡＶ２の場合はｐ４０）によって制御される単一のｍＲＮＡ転写産物から翻訳される。ＡＡＶゲノムの３’ハーフはまた、ＡＡＰ遺伝子を含み、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。６０個のＶＰモノマー（約５コピーのＶＰ１、５コピーのＶＰ２、および５０コピーのＶＰ３を含む）がＡＡＶゲノムの周囲で自己集合し、成熟ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｋ．Ｍ．他（２００８）Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ：ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｊａｉｎ，Ｋ．Ｋ．（編集），Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４３７：５１－９１）。ＡＡＶ ＡＡＰタンパク質は、新たに産生されたＶＰタンパク質を安定化し、細胞質から細胞核へ輸送するために必要であると考えられている。ＡＡＶゲノムの３’ハーフはまた、ＡＡＶ Ｘ遺伝子を含み、ゲノム複製をサポートするタンパク質をコードすると考えられている（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃａｏ，Ｍ．他（２０１４）“Ｔｈｅ Ｘ Ｇｅｎｅ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ２（ＡＡＶ２） Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９，ｅ１０４５９６：１－１０）。

【0005】

上述のＡＡＶ遺伝子コード配列は、１４５ヌクレオチドの二つのＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４）。

【0006】

ＡＡＶは本質的に欠陥のあるウイルスであり、少なくとも２つの重要な機能を果たす能力を欠いている：すなわち、ウイルス特異的産物の合成を開始する能力と、そのような産物を集めて成熟した感染性ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する能力である。したがって、ＡＡＶゲノムの遺伝子によってコードされていないウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを提供するために、アデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルスまたはヒトパピローマウイルスのような、同時感染する「ヘルパー」ウイルスを必要とする。このようなＶＡ ＲＮＡは翻訳されないが、他のウイルス遺伝子の翻訳を調節する役割を果たす。同様に、ＡＡＶゲノムはＡｄのウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、およびＥ４をコードする遺伝子を含まない；したがって、これらのタンパク質は、また、同時に感染する「ヘルパー」ウイルスによって供給されなければならない。Ｅ１ａタンパク質は増殖性感染中のウイルス遺伝子転写を大きく刺激する。Ｅ１ｂタンパク質はアデノウイルス感染細胞のアポトーシスを阻止し、増殖性感染を進行させる。Ｅ２ａタンパク質は、鋳型をほどいて転写開始を促進することにより、ウイルス鎖置換複製の伸長の段階において役割を果たす。Ｅ４タンパク質は、導入遺伝子の持続性、ベクター毒性、および免疫原性に影響を及ぼすことが示されている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．他（１９９２）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ１Ａ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃ．Ｓｕｒｖ．１２：１６１－１９５；Ｊｏｎｅｓ Ｎ．Ｃ．（１９９０）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１（６）：４２５－４３５；Ｂｅｎ－Ｉｓｒａｅｌ，Ｈ．他（２００２）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１３６９－ｄ１３９５；Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．他（２０１３）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：ａ０１３００３（１－１１ページ）；Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．（２０１３）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．他編集），Ｖｏｌ．２．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７０４－１７３１ページ；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００５）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ４ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｐａｃｔ Ｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：１１０６－１１１７参照のこと）。

【0007】

ＡＡＶウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、環状エピソーム分子として存続するか、または特定の染色体座（アデノ随伴ウイルス組込み部位またはＡＡＶＳ）において宿主細胞のＤＮＡに組み込まれる。（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４）。ＡＡＶの複製と成熟に必要な機能を果たすヘルパーウイルスが存在しない限り、ＡＡＶは感染細胞内に潜伏したままである。
ＩＩ．遺伝子治療におけるｒＡＡＶとその利用

【0008】

ＡＡＶの特性に照らして、組換え改変されたバージョンのＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療用ベクターとして実質的な有用性を見出している（Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１：３１７－３３４；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｕｎａｎｓｗｅｒｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３；Ｂｅｒｒｙ，Ｇ．Ｅ．他（２０１６）“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：５４－６０；Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｄ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｒｅｆｉｎｅｄ Ｔｏｏｌｋｉｔ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”２１：６１－６６；Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２４０：２８７－３０１；Ｓａｌｇａｎｉｋ，Ｍ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｓ Ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．３（４）：１－３２；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＮＳ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｙｋｋｅｎ，Ｅ．Ａ．他（２０１８）“Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ａｎｄ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ ＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｉｓ．１０：１６：１－１０；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．他（１９９８）“Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃａｕｄａｔｅｓ Ｏｆ ＭＰＴＰ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｏｎｋｅｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ．５：８２０－８２７；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９参照のこと）。

【0009】

ｒＡＡＶは、典型的には環状プラスミド（「ｒＡＡＶプラスミドベクター」）を用いて産生される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、典型的には、そのような構築物から欠失され、プロモーター、βグロビンイントロン、選択された治療用遺伝子（導入遺伝子）が挿入されたクローニング部位、およびポリアデニル化（「ｐｏｌｙＡ」）部位で置換される。しかし、ｒＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は保持されるので、ｒＡＡＶプラスミドベクターの導入遺伝子発現カセットはＡＡＶ ＩＴＲ配列によって挟まれる（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５）。したがって、５’から３’方向に、ｒＡＡＶは、５’ＩＴＲ、ｒＡＡＶの導入遺伝子発現カセット、および３’ＩＴＲを含む。

【0010】

ｒＡＡＶは、多数の遺伝性疾患（例えば、遺伝性リポ蛋白リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素欠損症（ＡＡＤＣ）、脈絡膜血症、血友病）のいずれかに罹患している患者に導入遺伝子を送達するために使用されており、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）療法およびＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９などの遺伝子改変戦略などの新しい臨床的方法において有用である（米国特許第８，６９７，３５９号，米国特許第１０，０００，７７２号，米国特許第１０，１１３，１６７号，米国特許第１０，２２７，６１１号；Ｌｉｎｏ，Ｃ．Ａ．他（２０１８）“Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ Ａｎｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，”Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２５（１）：１２３４－１２３７；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｖ．他（２０１４）“Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｔｏ ＡＡＶ－Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｔｈｅ Ｇｌｙｂｅｒａ Ｅｘａｍｐｌｅ Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ Ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ”Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（８２）：１－１５），Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｒａｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｐ．Ｗ．（２０１７）“Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｎｅｕｒｏｌ．１９（１２）：４５；Ｋａｙ，Ｍ．他（２０１７）“Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｆ ｒＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｆｏｒ ＲＮＡｉ，Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８：３６１－３７２）；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｕｎａｎｓｗｅｒｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３）。ｒＡＡＶに関与する１５０以上の臨床試験が開始されている（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．他（２０１６）“Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１６００２：１－７）。このような組換え改変ＡＡＶに最も一般的に使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ２であり、中枢神経系、腎臓、網膜色素上皮および光受容体細胞の細胞に感染することができる。もう１つのＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、筋細胞に感染し、また広く使用される（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５）。ＡＡＶ血清型は以下に記載される：米国特許第１０，３０１，６５０号；米国特許第１０，２６６，８４６号；米国特許第１０，２６５，４１７号；米国特許第１０，２１４，７８５号；米国特許第１０，２１４，５６６号；米国特許第１０，２０２，６５７号；米国特許第１０，０４６，０１６号；米国特許第９，８８４，０７１号；米国特許第９，８５６，５３９号；米国特許第９，７３７，６１８号；米国特許第９，６７７，０８９号；米国特許第９，４５８，５１７号；米国特許第９，４５７，１０３号；米国特許第９，４４１，２４４号；米国特許第９，１９３，９５６号；米国特許第８，８４６，３８９号；米国特許第８，５０７，２６７号；米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，４７９，５５４号；米国特許第７，１８６，５５２号；米国特許第７，１０５，３４５号；米国特許第６，９８４，５１７号；米国特許第６，９６２，８１５号；および，米国特許７３３，７５７号。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶ製造の方法

【0011】

所望の導入遺伝子発現カセットを含むｒＡＡＶは、典型的には、懸濁で増殖させたヒト細胞（ＨＥＫ２９３など）によって産生される。上述したように、ｒＡＡＶは欠陥ウイルスであるため、ｒＡＡＶを複製してパッケージングするためには、さらなる機能が提供されなければならない。

【0012】

典型的には、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶプラスミドベクターおよび第２のプラスミドベクターで細胞を一過性にトランスフェクトすることによって産生され得る。第２のプラスミドベクターはＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む。ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ベクター転写制御および複製に、そしてウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要なＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８遺伝子（Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ６８やｒＡＡＶの産生には必要とされない）、ならびにｒＡＡＶを産生するためにＡＡＶから削除されたｃａｐ遺伝子を提供する。第２のプラスミドベクターは、さらに、ＡＡＶ増殖に必要なウイルス転写因子および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）をコードする非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むことができ、それにより、ｒＡＡＶと協調して、ダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含み得る（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７４５－２７６０；Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０）。

【0013】

しかし、（必要とされるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供する）ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを「ＡＡＶヘルパープラスミド」にクローニングし、（ウイルスの転写因子と翻訳因子をコードする遺伝子を提供する）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを異なるプラスミド（すなわち、「Ａｄヘルパープラスミド」）上にクローニングすることは、ますます一般的になってきており、そのようなプラスミドは、ｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む（図２）。トリプルプラスミドトランスフェクションシステムの使用は、１つのｃａｐ遺伝子を別のｃａｐ遺伝子に容易に切り替えることができ、それによってｒＡＡＶの血清型の変化を容易にするという利点を有する。ヘルパーウイルスではなくヘルパープラスミドを用いることにより、ヘルパーウイルスの粒子をさらに産生することなく、ｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９３８－９４５）。

【0014】

ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにトランス作用ＡＡＤヘルパー遺伝子を含むプラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈によるＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションは、研究室でｒＡＡＶを産生するための標準的な方法となっている（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７４５－２７６０）。しかし、このようなリン酸カルシウムを介したトランスフェクション過程を懸濁培養されたトランスフェクトされた哺乳動物細胞で使用するには、培地交換が必要であり、したがって、治療用量のｒＡＡＶを産生するために必要とされる大規模なｒＡＡＶ産生には理想的ではないと考えられる（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。この理由ため、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が使用され、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて得られたものと類似のウイルスの収率を提供することが見出されている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．他（２００７）“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２ Ｂｙ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ ２９３ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４４：３２－４０）。

【0015】

あるいは、バキュロウイルスベクター（例えば、米国特許第９，８７９，２８２号；米国特許第９，８７９，２７９号；米国特許第８，９４５，９１８号；米国特許第８，１６３，５４３号；米国特許第７，２７１，００２号；米国特許第６，７２３，５５１号を参照のこと）を用いて昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、または、ＨＳＶ感染ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えばＢＨＫ２１）でｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶの産生の方法はＧｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４，ａｎｄ ｉｎ Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０でレビューされる。
ＩＶ．ｒＡＡＶの精製および回収方法

【0016】

産生後、ｒＡＡＶは、典型的には、１回以上、オーバーナイトのＣｓＣｌ勾配遠心分離によって収集および精製され（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．他（１９９９）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｎｄ Ｙｉｅｌｄ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３－９８５）、次いで脱塩によって精製されたｒＡＡＶ産生ストックを形成する。１０^１２～１０^１３の感染性ｒＡＡＶキャプシド／ｍＬの力価が得られる。

【0017】

ｒＡＡＶ感染は細胞変性効果を引き起こさないためｒＡＡＶ製剤の感染力価を測定するために、プラークアッセイは使用できない。したがって、感染力価は典型的には組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）として測定される。この方法では、ＨｅＬａ由来ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびｃａｐ発現細胞株を９６ウェルプレート中で増殖させ、血清型５のアデノウイルスの存在下で、ｒＡＡＶ調製物の複製１０倍連続希釈液で感染させる。感染後、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によりベクターゲノム複製を決定する（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。あるいは、調製ｒＡＡＶの感染力価は、感染中枢アッセイ（ＩＣＡ）を用いて測定することができる。このアッセイは、ＨｅＬａ ｒｅｐ－ｃａｐ細胞およびＡｄを使用するが、インキュベーション後、細胞を膜に移すことを含む。使用される導入遺伝子の一部に相補的な標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションを介して（個々の感染細胞を表す）感染中心を検出する。より広く使用されるが、ＴＣＩＤ５０アッセイは、ＩＣＡよりも高いバックグラウンドを導き、ＩＣＡと比較してベクター感染性を過大評価することが報告されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶを産生および精製する方法は、特に米国特許第１０，２９４，４５２号；米国特許第１０，１６１，０１１号；米国特許第１０，０１７，７４６号；米国特許第９，５９８，７０３号；米国特許第７，６２５，５７０号；米国特許第７，４３９，０６５号；米国特許第７，４１９，８１７号；米国特許第７，２０８，３１５号；米国特許第６，９９５，００６号；米国特許第６，９８９，２６４号；米国特許第６，８４６，６６５号；および米国特許第６，８４１，３５７に記載される。
Ｖ．Ｇ四重鎖配列および構造

【0018】

ＤＮＡは古典的な二重らせん以外にもいくつかの二次構造を形成することができ、近年注目されているひとつがＧ四重鎖構造である。Ｇ四重鎖構造は、３つの平面状の「Ｇ四分子」（「グアニンカルテット」としても知られる）構造の積層から形成される。各Ｇ四分子は、４つのデオキシグアノシン残基を含む水素結合相互作用を介したフーグスティーン塩基対によって形成される。Ｇ四分子の平面構造はカチオン（例えばＮａ^＋）によって安定化され得る。以下に示すＧ四分子構造において、グアニンは「Ｒ」を介してそれぞれのポリヌクレオチド鎖に結合している。

【化1】

G四分子／グアニンカルテット

【0019】

Ｇ四重鎖構造を形成するためのＧ四分子構造の積層は、共にＧ四重鎖配列を構成する１つ、２つまたは４つのポリヌクレオチド鎖のドメインの自発的相互作用および／またはループ形成によって達成される（図３Ａから３Ｄ）。

【0020】

Ｇ四重鎖構造は当技術分野でよく知られる（Ｂｅｄｒａｔ，Ａ．他（２０１６）“Ｒｅ－ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｇ４Ｈｕｎｔｅｒ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（４）：１７４６－１７５９；Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）；Ｓｉｄｄｉｑｕｉ－Ｊａｉｎ，Ａ．他（２００２）“Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｆｏｒ Ａ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｉｎ Ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｏ Ｒｅｐｒｅｓｓ ｃ－ＭＹＣ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９９：１１５９３－１１５９８；Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｍ．他（２００７）“ＲＮＡ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ－Ｂａｓｅｄ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１４：７５７－７６３；Ｍｉｌｌｅｖｏｉ，Ｓ．他（２０１２）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｗｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．Ｒｅｖ．ＲＮＡ ３：４９５－５０７；Ｌｏｐｅｓ，Ｊ．他（２０１１）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄｕｒｉｎｇ Ｌｅａｄｉｎｇ－Ｓｔｒａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ＥＭＢＯ Ｊ．３０：４０３３－４０４６；Ｐａｅｓｃｈｋｅ，Ｋ．他（２０１１）“ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｍｏｔｉｆｓ Ｉｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｐｉｆ１ ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅ，”Ｃｅｌｌ １４５：６７８－６９１；Ｂｅｓｎａｒｄ，Ｅ．他（２０１２）“Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｍｏｔｉｆｓ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：８３７－８４４；および Ｖａｌｔｏｎ，Ａ．Ｌ．他（２０１４）“Ｇ４ Ｍｏｔｉｆｓ Ａｆｆｅｃｔ Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ Ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｉｎ Ｔｗｏ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒｓ，”ＥＭＢＯ Ｊ．３３：７３２－７４６）。

【0021】

Ｇ四重鎖構造を形成することができる配列は、最近、多くのウイルス、例えば、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＥＢＶインフルエンザ、パピローマウイルスおよびカリフラワーモザイクウイルスのゲノム内で同定されている（Ｐｉｅｋｎａ－Ｐｒｚｙｂｙｌｓｋａ，Ｄ．他（２０１４）“Ｕ３ Ｒｅｇｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ ＨＩＶ－１ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｄｏｐｔｓ Ａ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｉｎ Ｉｔｓ ＲＮＡ Ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３（１６）：２５８１－２５９３；Ａｒｔｕｓｉ，Ｓ．他（２０１５）“Ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ－１ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｔａｉｎｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ Ｏｆ Ｒｅｐｅａｔｅｄ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ａ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｌｉｇａｎｄ，”Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｒｅｓ．１１８：１２３－１３１；Ｔｌｕｃｋｏｖａ，Ｋ．他（２０１３）“Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２（４１）：７２０７－７２１６；Ｍｅｔｉｆｉｏｔ，Ｍ．他（２０１４）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（２０）：１２３５２－１２３６６）。

【0022】

ウイルスのＧ四重鎖構造は、ＤＮＡの複製および転写に対する、立体ブロックとして機能することが提唱されている（Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．他（２０１７）“Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ Ｉｎ ＡＡＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌ．５１０：４６－５４）。例えば、ｃ－ＭＹＣ転写の主要な調節因子である野生型ヌクレアーゼ高感受性エレメントＩＩＩ遺伝子（ＮＨＥ ＩＩＩ_１）におけるＧ四重鎖配列の存在は、その遺伝子を突然変異ＮＨＥ ＩＩＩ_１遺伝子のそれよりも低いレベルで発現させる（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ－Ｊａｉｎ，Ａ．他（２００２）“Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｆｏｒ Ａ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｉｎ Ａ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｇｉｏｎ Ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｏ Ｒｅｐｒｅｓｓ ｃ－ＭＹＣ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９９：１１５９３－１１５９８；Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）。

【0023】

高力価ＡＡＶ産生の限界は、ＡＡＶがヘルパーウイルスに依存していること、およびＡＡＶ複製に寄与するウイルス性または細胞性の因子を十分に理解していないことに起因している可能性があると提唱されている（Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．他（２０１７）“Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ Ｉｎ ＡＡＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌ．５１０：４６－５４）。この点に関して、ＡＡＶのライフサイクルの調査は、ＡＡＶヘルパー遺伝子が正常な細胞周期で欠損または不活性化された細胞因子を誘導するように機能することを明らかにした。Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）“Ｕｓｅ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｓ Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９；Ｎｉ，Ｔ．Ｈ．他（１９９８）“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ Ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（４）：２７７７－２７８７）。さらに、細胞のおよびウイルスのＤＮＡ結合タンパク質は、ＡＡＶの二本鎖ＤＮＡの巻き戻し、一本鎖ＤＮＡの切断、核との一本鎖ＤＮＡの会合の促進、および最終的にはウイルスＤＮＡの産生およびタンパク質発現の増強において、ＡＡＶのライフサイクルにおける重要な役割を果たすことが見出されている（Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００６）“Ｔｈｅ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｌｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｉｎ：Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｒ．他（Ｅｄｓ．）ＰＡＲＶＯＶＩＲＵＳＥＳ，Ｈｏｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．他（２０１７）“Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ Ｉｎ ＡＡＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌ．５１０：４６－５４）。

【0024】

例えば、ヌクレオホスミン（ＮＰＭ１）は、一本鎖核酸に結合する能力を介して、ゲノム安定性、ＤＮＡ複製および転写調節などの多くの多様な機能において役割を果たす核小体蛋白質である。ヌクレオホスミンはＡＡＶキャプシドを核小体の内外に動員するシャペロンタンパク質として作用することによりＡＡＶ感染を増強することが報告されている（Ｎａｓｈ，Ｋ．他（２００９）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔ Ｗｉｔｈ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（１）：４５４－４６９；Ｎｉ，Ｔ．Ｈ．他（１９９８）“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ Ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（４）：２７７７－２７８７；Ｎｉｃｏｌａｓ，Ａ．他（２０１２）“Ｆａｃｔｏｒｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ｈｅｌｐｅｒ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３２（１）：１－９）。しかし、ヌクレオホスミンはＧ四重鎖配列に結合することによってＤＮＡ複製を負に調節することも見出されている（Ｇａｌｌｏ，Ａ．他（２０１２）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｔｓ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃ－ＭＹＣ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（３２）：２６５３９－２６５４８）。ヌクレオホスミンのダウンレギュレーションは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ベクター産生の増加をもたらすことが見出されている（Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．他（２０１７）“Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ Ｉｎ ＡＡＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌ．５１０：４６－５４），そして、Ｇ四重鎖配列の破壊または除去は、ＨＩＶおよびＨＳＶのウイルスＤＮＡ複製のＧ四重鎖構造媒介阻害を解除することが見出されている（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ））。このように、Ｇ四重鎖配列の存在は、ＡＡＶベクター産生を阻害することが報告されている（Ｓａｔｋｕｎａｎａｔｈａｎ，Ｓ．他（２０１７）“Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ Ｉｎ ＡＡＶ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｖｉｒｏｌ．５１０：４６－５４）。

【0025】

このようなこれまでのすべての前進にもかかわらず、遺伝子治療へのｒＡＡＶの適用性を現在制限している問題に取り組むことができる方法を開発する必要が残っている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９；Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１：３１７－３３４）。

【0026】

本発明は、ｒＡＡＶゲノムの複製の調節を介してＡＡＶおよびｒＡＡＶパッケージングの効率を増加させるための改善された方法に関する。

【発明の概要】

【0027】

本発明は、改良されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物、ならびにそれらの製造および使用のための方法に関する。本発明は、特に、複製起点、プロモーターおよびエンハンサー、これらはｒＡＡＶゲノムの複製を調節することができ、ｒＡＡＶ複製を改善する、を含むシスエレメントを含むようにさらに改変されている組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。好ましくは、このようなシスエレメントは、ｒＡＡＶの５’および／または３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に先行および／または後続するｒＡＡＶのドメイン内に提供される。本発明は、特に、実際のまたは潜在的なＧ四重鎖配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、野生型ＡＡＶ（ｗｔ ＡＡＶ）からのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、および他のウイルスゲノムまたはヒトゲノムからのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメントの存在および使用に関する。

【0028】

詳細には、本発明は、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ここで
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’であり；そして
前記シスエレメントの存在は、ｒＡＡＶ産生細胞が、前記シスエレメントを欠く場合に得られるそのようなｒＡＡＶよりも高い産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす。

【0029】

また、本発明は以下を含む薬学的組成物を提供する：
（Ａ）組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であってそのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物であって、
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’である、調製物、および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。

【0030】

本発明は組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の前記産生力価を増加させる方法を提供し、前記方法は：
（Ａ）前記産生力価を産生するためのｒＡＡＶとして、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上に付加されたシスエレメントを含むように改変されたｒＡＡＶを使用することであって、：
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’である、使用すること；および
（Ｂ）前記使用されたｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養することであって、前記細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有し、さらに、前記培養は、培養培地中で、ｒＡＡＶの産生を許容するのに十分な条件の下で行われる、培養すること、
を含み、
前記使用されるｒＡＡＶにおける前記シスエレメントの存在は、前記細胞が、前記使用されるｒＡＡＶが前記シスエレメントを欠失している場合に達成されるのに比べ、増加した産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす。

【0031】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ１ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0032】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ２ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0033】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ３ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0034】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ４ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0035】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ１ドメインおよびそのＰ２、Ｐ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0036】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ２ドメインおよびそのＰ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0037】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されるｒＡＡＶは、そのＰ３ドメインおよびそのＰ４ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている。

【0038】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、付加されたシスエレメントは、使用されたｒＡＡＶにおいてＧ四重鎖構造を形成する。

【0039】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、付加されるシスエレメントは以下からなる群から選ばれる：
（１）野生型ＡＡＶゲノムの潜在的Ｇ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの潜在的Ｇ四重鎖配列；
（２）野生型ＡＡＶゲノムの実際のＧ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの実際のＧ四重鎖配列；
（３）野生型ＡＡＶ由来のＤＮＡ配列または野生型ＡＡＶ由来の逆向きのＤＮＡ配列；および
（４）別のウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、または別のウイルスゲノム由来の逆向きのＤＮＡ配列。

【0040】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、導入遺伝子カセットは、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である。

【0041】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、またはこれらの血清型のハイブリッドに属する。

【0042】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、またはｒＡＡＶ９の血清型、またはこれらの血清型のハイブリッドに属する。

【0043】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、細胞は、ヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞、またはｓｆ９昆虫細胞である。

【0044】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、細胞はＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞である。

【0045】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法の実施形態を提供し、ここで、細胞はＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞である。

【0046】

本発明はまた、そのような組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、または薬学的組成物を提供し、ここで、導入遺伝子カセットは、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的であり、遺伝性の疾患または状態を治療のために使用される。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】図１は野生型（Ｗｔ）ＡＡＶゲノムの概略的な遺伝子の地図を提供する。

【図2】図２は、野生型ＡＡＶ２ゲノム（１）、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（２）、補足する「ＡＡＶヘルパープラスミド」（３）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（「Ａｄヘルパープラスミド」）（４）の構造ドメインの概略図を提供する。野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）は、ＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を含む５’ハーフ、およびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含む３’ハーフからなる。ｒＡＡＶ（２）は、野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）のＲｅｐおよびＣａｐをコードする遺伝子を、プロモーター（Ｐｒｏ）、目的の外来性導入遺伝子、およびポリアデニル化部位（ｐＡ）を含む導入遺伝子カセットで置換することによって形成される。ｒＡＡＶ（２）を産生するために、補足する「ＡＡＶヘルパー」プラスミドベクター（３）およびアデノウイルスヘルパープラスミドベクター（Ａｄヘルパープラスミド）（４）が提供される。補足するＡＡＶヘルパープラスミド（３）は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供する。Ａｄヘルパープラスミド（４）は、アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４を提供する。

【図3A】図３Ａは、複数のＧ四分子の積み重ねによって形成される例示的なＧ四重鎖構造を示す。図３Ａは、その頂点がポリヌクレオチド骨格に連結されているＧ四分子を灰色の平面長方形で示す。Ｇ四重鎖構造は、それ自体で自発的にループバックする単一のポリヌクレオチド鎖（図３Ａおよび３Ｂ）、互いにループバックする２本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｃ）、または互いにループバックする４本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｄ）から形成され得る。そのようなポリヌクレオチド鎖がそのようなＧ四分子を形成し、そのようなループを形成する能力は、それらのＧ四重鎖配列の存在に依存する；そのような１、２または４つのポリペプチド鎖は、逆平行様式（例えば、図３Ａ）または平行様式（例えば、図３Ｂ）のいずれかでループを形成し得る（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）を参照のこと）。

【図3B】図３Ｂは、複数のＧ四分子の積み重ねによって形成される例示的なＧ四重鎖構造を示す。図３Ｂは、その頂点がポリヌクレオチド骨格に連結されているＧ四分子を灰色の平面長方形で示す。Ｇ四重鎖構造は、それ自体で自発的にループバックする単一のポリヌクレオチド鎖（図３Ａおよび３Ｂ）、互いにループバックする２本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｃ）、または互いにループバックする４本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｄ）から形成され得る。そのようなポリヌクレオチド鎖がそのようなＧ四分子を形成し、そのようなループを形成する能力は、それらのＧ四重鎖配列の存在に依存する；そのような１、２または４つのポリペプチド鎖は、逆平行様式（例えば、図３Ａ）または平行様式（例えば、図３Ｂ）のいずれかでループを形成し得る（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）を参照のこと）。

【図3C】図３Ｃは、複数のＧ四分子の積み重ねによって形成される例示的なＧ四重鎖構造を示す。図３Ｃは、その頂点がポリヌクレオチド骨格に連結されているＧ四分子を灰色の平面長方形で示す。Ｇ四重鎖構造は、それ自体で自発的にループバックする単一のポリヌクレオチド鎖（図３Ａおよび３Ｂ）、互いにループバックする２本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｃ）、または互いにループバックする４本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｄ）から形成され得る。そのようなポリヌクレオチド鎖がそのようなＧ四分子を形成し、そのようなループを形成する能力は、それらのＧ四重鎖配列の存在に依存する；そのような１、２または４つのポリペプチド鎖は、逆平行様式（例えば、図３Ａ）または平行様式（例えば、図３Ｂ）のいずれかでループを形成し得る（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）を参照のこと）。

【図3D】図３Ｄは、複数のＧ四分子の積み重ねによって形成される例示的なＧ四重鎖構造を示す。図３Ｄは、その頂点がポリヌクレオチド骨格に連結されているＧ四分子を灰色の平面長方形で示す。Ｇ四重鎖構造は、それ自体で自発的にループバックする単一のポリヌクレオチド鎖（図３Ａおよび３Ｂ）、互いにループバックする２本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｃ）、または互いにループバックする４本のポリヌクレオチド鎖（図３Ｄ）から形成され得る。そのようなポリヌクレオチド鎖がそのようなＧ四分子を形成し、そのようなループを形成する能力は、それらのＧ四重鎖配列の存在に依存する；そのような１、２または４つのポリペプチド鎖は、逆平行様式（例えば、図３Ａ）または平行様式（例えば、図３Ｂ）のいずれかでループを形成し得る（Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｍ．他（２０１５）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ：Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｏｕｔｅ Ｔｏ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ？”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１１（２）：ｅ１００４５６２（１－１５ページ）を参照のこと）。

【図4】図４は、ＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の地図を示す。

【図5】図５は、非ＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎの地図を示す。

【図6】図６はｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの地図を示す。

【図7】図７はｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの地図を示す。

【図8】図８は、本明細書に記載される例示的なｒＡＡＶ構築物（ＩＴＲ：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）特異的回文逆末端反復配列；Ｐｒｏ：プロモーター，遺伝子：導入遺伝子；ポリＡ：ポリデオキシアデノシン配列からなるポリヌクレオチド；ＣｉｓＥ：シスエレメントを含むポリヌクレオチド）の開発のために従う全体的な構造およびアプローチを示す。

【図9A】図９Ａは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ２ドメインにシスエレメントを導入することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。図９Ａは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ２ドメインを示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図9B】図９Ｂは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ２ドメインにシスエレメントを導入することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。図９Ｂは、シスエレメントＣｉｓＥ１からＣｉｓＥ２７（表１）のいずれかを含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を、親ｒＡＡＶプラスミドベクターであるｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたものと比較して示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図10A】図１０Ａは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインにシスエレメントを導入（図１０Ａ）することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図10B】図１０Ｂは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインにシスエレメントを導入（図１０Ａ）することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。図１０Ｂは、シスエレメントＣｉｓＥ１、ＣｉｓＥ２０、ＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２７、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ２９、またはＣｉｓＥ３０（表１）のいずれかを含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を、親ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたものと比較して示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図11A】図１１Ａは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインまたはＰ２ドメインにシスエレメントを導入（図１１Ａ）することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図11B】図１１Ｂは、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインまたはＰ２ドメインにシスエレメントを導入（図１１Ａ）することによって得られたｒＡＡＶ産生力価の増加を示す。図１１Ｂは、シスエレメントＣｉｓＥ１、ＣｉｓＥ２０、またはＣｉｓＥ２１（表１）のいずれかを含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を、親ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたものと比較して示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図12A】図１２Ａは、Ｐ１ドメインにｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを挿入したシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメントの配向の効果を示す（図１２Ａ）。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図12B】図１２Ｂは、Ｐ１ドメインにｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを挿入したシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメントの配向の効果を示す（図１２Ａ）。図１２Ｂは、順方向（配列番号４１）（「ＣｉｓＥ２１－Ｆｏｒ－Ｐ１」）または逆方向（配列番号４２）（「ＣｉｓＥ２１－Ｒｅｖ－Ｐ１」）にシスエレメントＣｉｓＥ２１（表１）を含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を、親ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたものと比較して示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図13A】図１３Ａは、ＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインおよびそのようなプラスミドベクターのＰ４ドメインの両方内に挿入されたシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメント配向の効果を示す（図１３Ａ）。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図13B】図１３Ｂは、ＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインおよびそのようなプラスミドベクターのＰ４ドメインの両方内に挿入されたシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメント配向の効果を示す（図１３Ａ）。図１３Ｂは、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ４ドメイン内に同じシスエレメント（ＣｉｓＥ３０－Ｒｅｖ）を維持する一方で、Ｐ１ドメイン内に異なるシスエレメント（シスエレメントＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２２、ＣｉｓＥ２３、ＣｉｓＥ２４、ＣｉｓＥ２５、ＣｉｓＥ２６、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ２９、ＣｉｓＥ３１、ＣｉｓＥ３２、ＣｉｓＥ３３、ＣｉｓＥ３４、またはＣｉｓＥ３５）を含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図13C】図１３Ｃは、ＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインおよびそのようなプラスミドベクターのＰ４ドメインの両方内に挿入されたシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメント配向の効果を示す（図１３Ａ）。図１３Ｃは、そのＰ１ドメイン内の異なるシスエレメント（シスエレメントＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２２、ＣｉｓＥ２３、ＣｉｓＥ２４、ＣｉｓＥ２５、ＣｉｓＥ２７、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ３２、ＣｉｓＥ３３、またはＣｉｓＥ３４）およびそのＰ４ドメイン内のシスエレメントＣｉｓＥ３５－Ｒｅｖを含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【図13D】図１３Ｄは、ＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインおよびそのようなプラスミドベクターのＰ４ドメインの両方内に挿入されたシスエレメントのｒＡＡＶ産生力価の増加を引き起こす能力に対するシスエレメント配向の効果を示す（図１３Ａ）。図１３Ｄは、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内に同じシスエレメント（ＣｉｓＥ２８）を維持する一方で、Ｐ４ドメイン内に異なるシスエレメント（シスエレメントＣｉｓＥ２２－Ｒｅｖ、ＣｉｓＥ２７－Ｒｅｖ、ＣｉｓＥ２９－Ｒｅｖ、またはＣｉｓＥ３５－Ｒｅｖ）を含有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。ｒＡＡＶの産生力価は、親または誘導体のｒＡＡＶプラスミドを用いて、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するヘルパープラスミドおよび必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステムで得た。

【発明を実施するための形態】

【0048】

Ｉ．本発明の方法
本発明は、改良されたパッケージング効率を有する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、そのようなｒＡＡＶを含む薬学的組成物、ならびにそれらの製造および使用のための方法に関する。本発明は、特に、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーを含むシスエレメントを含むようにさらに改変されており、ｒＡＡＶゲノムの複製を調節することができ、ｒＡＡＶ複製を改善する組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に関する。好ましくは、このようなシスエレメントは、ｒＡＡＶの５’および／または３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に先行および／または後続するｒＡＡＶのドメイン内に提供される。本発明は、特に、実際のまたは潜在的なＧ四重鎖配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、野生型ＡＡＶ（ｗｔ ＡＡＶ）からのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメント、および他のウイルスゲノムまたはヒトゲノムからのＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドシスエレメントの存在および使用に関する。

【0049】

本発明は、部分的には、高レベルのＤＮＡ複製が、ｒＡＡＶゲノム粒子の量およびその結果としてのｒＡＡＶパッケージングの効率の両方を増加させ、したがって、ｒＡＡＶストックの高い産生力価をもたらすという認識に基づいている。このような所望される高レベルのＤＮＡ複製は、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどを含むさらなるポリヌクレオチドを含有するようにｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターを改変することによって達成することができる。本発明は、このようなシスエレメントを担持する組換えＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶプラスミドベクター、ならびに高力価のｒＡＡＶ調製物を生成することができる新規な安定な細胞株の産生におけるそれらの使用を包含する。本発明のシスエレメントは、好ましくは、ｒＡＡＶプラスミドベクターに導入される。このような導入は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術の周知の方法を用いて達成される。そのようなポリヌクレオチドは、それらが存在するｒＡＡＶベクターの複製を増加させるように作用するので、本明細書では、それらを「シスエレメント」と呼ぶ。本発明は、このようなシスエレメントを担持する組換えＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶプラスミドベクター、ならびに高力価のｒＡＡＶ調製物を生成することができる新規な安定な細胞株の産生におけるそれらの使用を包含する。本発明のシスエレメントは、好ましくは、ｒＡＡＶプラスミドベクターに導入される。このような導入は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術の周知の方法を用いて達成される。

【0050】

本明細書での使用において、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスを示すことを意図し、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、全ての亜型および自然発生型と組換え体の両方を含む。本明細書での使用において、用語「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶ起源でないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種性のポリヌクレオチド）を含む、ＡＡＶの組換え改変型を示すことを意図する。ｒＡＡＶは一本鎖または二本鎖であり得、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成され得る。

【0051】

本明細書での使用において、「ＡＡＶヘルパー機能」は、ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要なＡＡＶタンパク質（例えば、ＲｅｐとＣａｐ）および／またはＡＡＶのポリヌクレオチドを示す。このようなＡＡＶヘルパー機能は、「ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶヘルパープラスミド、例えばｐＡＡＶ－ＲＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＡＡＶ－ＲＣ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）などは商業的に入手可能である。プラスミドｐＡＡＶ―ＲＣ２（配列番号１；図４）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶヘルパープラスミドである。
プラスミドｐＡＡＶ―ＲＣのコード鎖（配列番号１）：
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ggggagctcg cagggtctcc attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccatgccg gggttttacg agattgtgat taaggtcccc agcgaccttg acgagcatct gcccggcatt tctgacagct ttgtgaactg ggtggccgag aaggaatggg agttgccgcc agattctgac atggatctga atctgattga gcaggcaccc ctgaccgtgg ccgagaagct gcagcgcgac tttctgacgg aatggcgccg tgtgagtaag gccccggagg ctcttttctt tgtgcaattt gagaagggag agagctactt ccacatgcac gtgctcgtgg aaaccaccgg ggtgaaatcc atggttttgg gacgtttcct gagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc gggatcgagc cgactttgcc aaactggttc gcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaatt acttgctccc caaaacccag cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctg tttgaatctc acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag aacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc aggtacatgg agctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg atccaggagg accaggcctc atacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaag attatgagcc 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ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggta

【0052】

配列番号１において、ｐＡＡＶ－ＲＣ２の８５－１９５０残基はＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（４８４－６６３残基はＰ１９プロモーターに相当、１４６４－１６４３残基はＰ４０プロモーターに相当、１６６８－１６７６残基はドナー部位）；１９６７－４１７４残基はキャプシドタンパク質ＶＰ１をコードし；１９９２－２０１６残基はＲｅｐ６８の部分をコードし；４１７５－４２５６残基はポリＡ配列をコードし；４６１０－４６２６残基はＭ１３ Ｒｅｖ配列であり；４６３４－４６５０残基はＬａｃオペレーター配列であり、；４６５８－４６８８はＬａｃプロモーター配列であり；４９５１－５６７５残基はｐＭＢ ｏｒｉ 配列に相当し，５７７１－６６３１残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；そして、６６３２－６７３０残基はｂｌａプロモーター配列である（図４）。

【0053】

本明細書での使用において、「非ＡＡＶヘルパー機能」との用語は、ｒＡＶＶの複製およびパッケージングに必要なＡｄ，ＣＭＶ，ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルス（例えば，Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ２ａ，ＶＡおよびＥ４）のタンパク質、および／またはＡｄ，ＣＭＶ，ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルスのポリヌクレオチドを意味する。これらの非ＡＡＶヘルパー機能は「非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、非ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ベクター、ｐＨｅｌｐｅｒおよびそれらの誘導体（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に利用可能である）は、適切な非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである（例えばＭａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９３８－９４５；Ｓｈａｒｍａ，Ａ．他（２０１０）“Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｏｆ ＡＡＶ ２／６，２／８ Ａｎｄ ２／９ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．８１（２－３）：２７３－２７８を参照のこと）。ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎプラスミド（配列番号２；図５）は非ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得る非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである。
プラスミドｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎのコード鎖（配列番号２）：
ggtacccaac tccatgctta acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccagga acagctctac agcttcctgg agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat taggagcgcc acttcttttt gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctaggagaca ctttcaataa aggcaaatgt ttttatttgt acactctcgg gtgattattt accccccacc cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct atgcgccact ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg cacaaccatc cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa cgcgtttagc aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc gcgcgagttg cgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac gctggccagc acgctcttgt cggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag ggcgaacgga gtcaactttg gtagctgcct tcccaaaaag ggtgcatgcc caggctttga gttgcactcg caccgtagtg gcatcagaag gtgaccgtgc ccggtctggg cgttaggata cagcgcctgc atgaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttg cgccttcaga gaagaacatg ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcatgcac gcagcacctt gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac gatcttggcc ttgctagact gctccttcag cgcgcgctgc ccgttttcgc tcgtcacatc catttcaatc acgtgctcct tatttatcat aatgctcccg tgtagacact taagctcgcc ttcgatctca gcgcagcggt gcagccacaa cgcgcagccc gtgggctcgt ggtgcttgta ggttacctct gcaaacgact gcaggtacgc ctgcaggaat cgccccatca tcgtcacaaa ggtcttgttg ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttta gccaggtctt gcatacggcc gccagagctt ccacttggtc aggcagtagc ttgaagtttg cctttagatc gttatccacg tggtacttgt ccatcaacgc gcgcgcagcc tccatgccct tctcccacgc agacacgatc ggcaggctca gcgggtttat caccgtgctt tcactttccg cttcactgga ctcttccttt tcctcttgcg tccgcatacc ccgcgccact gggtcgtctt cattcagccg ccgcaccgtg cgcttacctc ccttgccgtg cttgattagc accggtgggt tgctgaaacc caccatttgt agcgccacat cttctctttc ttcctcgctg tccacgatca cctctgggga tggcgggcgc tcgggcttgg gagaggggcg cttctttttc tttttggacg caatggccaa atccgccgtc gaggtcgatg gccgcgggct gggtgtgcgc ggcaccagcg catcttgtga cgagtcttct tcgtcctcgg actcgagacg ccgcctcagc cgcttttttg ggggcgcgcg gggaggcggc ggcgacggcg acggggacga cacgtcctcc atggttggtg gacgtcgcgc cgcaccgcgt ccgcgctcgg gggtggtttc gcgctgctcc tcttcccgac tggccatttc cttctcctat aggcagaaaa agatcatgga gtcagtcgag aaggaggaca gcctaaccgc cccctttgag ttcgccacca ccgcctccac cgatgccgcc aacgcgccta ccaccttccc cgtcgaggca cccccgcttg aggaggagga agtgattatc gagcaggacc caggttttgt aagcgaagac gacgaggatc gctcagtacc aacagaggat aaaaagcaag accaggacga cgcagaggca aacgaggaac aagtcgggcg gggggaccaa aggcatggcg actacctaga tgtgggagac gacgtgctgt tgaagcatct gcagcgccag tgcgccatta tctgcgacgc gttgcaagag cgcagcgatg tgcccctcgc catagcggat gtcagccttg cctacgaacg ccacctgttc tcaccgcgcg taccccccaa acgccaagaa aacggcacat gcgagcccaa cccgcgcctc aacttctacc ccgtatttgc cgtgccagag gtgcttgcca cctatcacat ctttttccaa aactgcaaga tacccctatc ctgccgtgcc aaccgcagcc gagcggacaa gcagctggcc ttgcggcagg gcgctgtcat acctgatatc gcctcgctcg acgaagtgcc aaaaatcttt gagggtcttg gacgcgacga gaaacgcgcg gcaaacgctc tgcaacaaga aaacagcgaa aatgaaagtc actgtggagt gctggtggaa cttgagggtg acaacgcgcg cctagccgtg ctgaaacgca gcatcgaggt cacccacttt gcctacccgg cacttaacct accccccaag gttatgagca cagtcatgag cgagctgatc 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gcagcaacag cagcggtcac acagaagcaa aggcgaccgg atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat cgacccgcga gcttagaaat aggatttttc ccactctgta tgctatattt caacaaagca ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa acaggtctct gcgctccctc acccgcagct gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct tcagcaaata ctgcgcgctg actcttaagg actagtttcg cgccctttct caaatttaag cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc accgaaaccg aattctcctc gaacaggcgg ctattaccac cacacctcgt aataacctta atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt accaggaaag tcccgctccc accactgtgg tacttcccag agacgcccag gccgaagttc agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg gcggctttcg tcacagggtg cggtcgcccg ggcgttttag ggcggagtaa cttgcatgta ttgggaattg tagttttttt aaaatgggaa gtgacgtatc gtgggaaaac ggaagtgaag atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt 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ggccagccgg ggagaaagga ctgtgtactc tgtgtgttgg gagggaggtg gcaggttgaa tactagggtt ctgtgagttt gattaaggta cggtgatcaa tataagctat gtggtggtgg ggctatacta ctgaatgaaa aatgacttga aattttctgc aattgaaaaa taaacacgtt gaaacataac atgcaacagg ttcacgattc tttattcctg ggcaatgtag gagaaggtgt aagagttggt agcaaaagtt tcagtggtgt attttccact ttcccaggac catgtaaaag acatagagta agtgcttacc tcgctagttt ctgtggattc actagaatcg atgtaggatg ttgcccctcc tgacgcggta ggagaagggg agggtgccct gcatgtctgc cgctgctctt gctcttgccg ctgctgagga ggggggcgca tctgccgcag caccggatgc atctgggaaa agcaaaaaag gggctcgtcc ctgtttccgg aggaatttgc aagcggggtc ttgcatgacg gggaggcaaa cccccgttcg ccgcagtccg gccggcccga gactcgaacc gggggtcctg cgactcaacc cttggaaaat aaccctccgg ctacagggag cgagccactt aatgctttcg ctttccagcc taaccgctta cgccgcgcgc ggccagtggc caaaaaagct agcgcagcag ccgccgcgcc tggaaggaag ccaaaaggag cgctcccccg ttgtctgacg tcgcacacct gggttcgaca cgcgggcggt aaccgcatgg atcacggcgg acggccggat ccggggttcg aaccccggtc gtccgccatg atacccttgc gaatttatcc accagaccac ggaagagtgc ccgcttacag gctctccttt tgcacggtct agagcgtcaa cgactgcgca cgcctcaccg gccagagcgt cccgaccatg gagcactttt tgccgctgcg caacatctgg aaccgcgtcc gcgactttcc gcgcgcctcc accaccgccg ccggcatcac ctggatgtcc aggtacatct acggattacg tcgacgttta aaccatatga tcagctcact
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gtcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagtaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gatggatcc

【0054】

配列番号２において、ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎの１－５３４３残基はアデノウイルスに由来しＥ２Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド（２５８－１８４７残基）を含み；５３４４－８５３５残基はアデノウイルスに由来し、Ｅ４またはＥ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み；９４２３－１００１１残基はｏｒｉ配列に相当し；１０１８２－１０９７６残基はｂｌａプロモーター配列によって発現されるカナマイシン耐性決定因子（１０９７７－１１０８１残基）をコードし；１１１０７－１１５６１残基はｆ１ ｏｒｉ配列に相当する（図５）。

【0055】

上記で議論されたように、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドと非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは典型的にはｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して使用され、トリプルトランスフェクションシステムを含む。複数の商業的に利用可能なｒＡＡＶプラスミドベクター（例えばｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ，ｐＧＯＩなど（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））は、本発明に従って使用され得る。本発明に従って使用され得る例示的なｒＡＡＶプラスミドベクターは、５’ＩＴＲ，Ｕ６プロモーター，ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター配列、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド（Ｇａｍｂｏｔｔｏ，Ａ．他（２０００）“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）Ｉｎ ＢＡＬＢ／Ｃ Ｍｉｃｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｈ２－Ｋｄ－Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ Ｅｐｉｔｏｐｅ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（２３）：２０３６－２０４０；Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）“Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９－５４４；Ｃｉｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．他（２０００）“Ｔｈｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ Ａ Ｔｏｏｌ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｌｏｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ Ａｔ Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｌｅｖｅｌ，”Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７１（６）：７７１－７７６；Ｃｈｏｐｒａ Ａ．（２００８）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ａｇｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＩＣＡＤ），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ），発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位，ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲを含むｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（配列番号３；図６）である。
プラスミドｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのコード鎖（配列番号３）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg ccctccagtg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccgcacgc gtctagttat taatagtaat cgaattcgtg ttactcataa ctagtaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga cgcgggatcc actggaccag gcagcagcgt cagaagactt ttttggaaaa gcttgactag taatactgta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagagatc cggtaccgag gagatctgcc gccgcgatcg ccggcgcgcc agatctcacg cttaactagc tagcggaccg acgcgtacgc ggccgctcga gatggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta agtcgaggat tataaggatg acgacgataa attcgtcgag caccaccacc accaccacta ataaggttta tccgatccac cggatctaga taagatatcc gatccaccgg atctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacctgccag cgccttagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt

【0056】

配列番号３において、ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの１－１２８残基は５’ＩＴＲに相当し；２０１－４４１残基はＵ６プロモーター配列であり、５６２－８６５残基はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列、８６６－１０６８残基はＣＭＶ最初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列を含み；１１９２－１９１１残基はＥＧＦＰをコードする哺乳動物コドン最適化ポリヌクレオチドを含み；１９１８－１９４１残基はＦＬＡＧタグをコードし；１９５１－１９６８残基は６×Ｈｉｓタグをコードし、２１３９－２２６０残基はＳＶ４０ポリ（Ａ）配列をコードし、２２９３－２４３３残基は３’ＩＴＲに相当し；２５０８－２２９６３残基はＦ１ ｏｒｉ配列に相当し；３３５０－４２１０残基はｂｌａプロモーター配列（３２４５－３３４９残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３３５０－３４１８残基）をコードし；４３８１－４９６９残基はｏｒｉ配列に相当する（図６）。

【0057】

本発明に従って使用され得る第二の例示的なプラスミドベクターは５’ＩＴＲ，甲状腺ホルモン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター，増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド，発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位，ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲを含むｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰ（配列番号４；図７）である。
ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰプラスミドのコード鎖（配列番号４）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct gcggccggtc gcgtctagta ctagtaggtt aatttttaaa aagcagtcaa aagtccaagt ggcccttggc agcatttact ctctctgttt gctctggtta ataatctcag gagcacaaac attccagatc caggttaatt tttaaaaagc agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataa tctcaggagc acaaacattc cagatccggc gcgccagggc tggaagctac ctttgacatc atttcctctg cgaatgcatg tataatttct acagaaccta ttagaaagga tcacccagcc tctgcttttg tacaactttc ccttaaaaaa ctgccaattc cactgctgtt tggcccaata gtgagaactt tttcctgctg cctcttggtg cttttgccta tggcccctat tctgcctgct gaagacactc ttgccagcat ggacttaaac ccctccagct ctgacaatcc tctttctctt ttgttttaca tgaagggtct ggcagccaaa gcaatcactc aaagttcaaa ccttatcatt ttttgctttg ttcctcttgg ccttggtttt gtacatcagc tttgaaaata ccatcccagg gttaatgctg gggttaattt ataactaaga gtgctctagt tttgcaatac aggacatgct ataaaaatgg aaagatgttg ctttctgaga gacaggtacc gaggagatct gccgccgcga tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacttacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtagac gcgtacgcgg ccgctcgagg attataagga tgacgacgat aaattcgtcg agcaccacca ccaccaccac taataaggtt tatccgatcc accggatcta gataagatat ccgatccacc ggatctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taacgcggta accacgtgcg gacccaacgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcacat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacctgcc agcgccttag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt

【0058】

配列番号４において、ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの１－１３０残基は５’ＩＴＲに相当し；１５０－８５４残基は，ＴＢＧを含む４１５－８２４残基と共にＴＢＧプロモーター配列であり；８８６－１６０８残基はＥＧＦＰをコードし；１６３０－１６５３残基はＦＬＡＧタグをコードし；１６６３－１６８０残基は６×Ｈｉｓタグをコードし；１８５１－１９７２残基はポリ（Ａ）配列をコードし；２００５－２１４５残基は３’ＩＴＲに相当し；２２２０－２６７５残基はＦ１ ｏｒｉ配列に相当し；３０６２－３９２２残基はｂｌａプロモーター配列（２９５７－３０６１残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３０６２－３１３０残基）をコードし；４０９３－４６８１残基はｏｒｉ配列に相当する（図７）。

【0059】

特に、本発明は、ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰまたはｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰなどの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含み、
（１）前記Ｐ１ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）前記Ｐ２ドメインは前記ｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）前記Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの前記導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、前記ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）前記ｐ４ドメインは前記ｒＡＡＶの前記３’ＩＴＲに対し３’であり；そして
前記シスエレメントの存在は、ｒＡＡＶ産生細胞が、前記シスエレメントを欠く場合に得られるそのようなｒＡＡＶよりも高い産生力価で該ｒＡＡＶを産生することを引き起こす、ｒＡＡＶを提供する。

【0060】

一実施形態では、シスエレメントは、ｒＡＡＶベクター中に以前は存在しなかった導入されたヌクレオチド配列を含むことが好ましい。他の実施形態では、前記導入されたヌクレオチド配列は、そのようなｒＡＡＶプラスミドベクター中に以前に存在しており、そのような以前に存在したヌクレオチド配列に隣接して、またはすぐ隣に隣接して、組換えによって産生されたｒＡＡＶプラスミドベクター中に位置している。あるいは、そのような導入されたヌクレオチド配列は、そのような以前に存在したヌクレオチド配列に隣接しない部位に配置され得る。

【0061】

図８に示すように、本発明のｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、５’から３’の方向に、以下を有することが想定される：
（１）ｒＡＡＶの５’末端；
（２）ポリヌクレオチド領域（「Ｐ１ドメイン」）；
（３）ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットのコード鎖を構成するポリヌクレオチド鎖の５’末端またはその近傍に位置するＩＴＲである「５’ＩＴＲ」；
（４）ポリヌクレオチド領域（「Ｐ２ドメイン」）；
（５）導入遺伝子カセット（先行する（すなわち５’に位置する）プロモーター（「Ｐｒｏ」）、導入遺伝子コード配列（「Ｇｅｎｅ」）、および次の（すなわち、３’に位置する）ポリ－Ａ配列（「ＰｏｌｙＡ」）を含む）；
（６）ポリヌクレオチド領域（「Ｐ３ドメイン」）；
（７）ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットのコード鎖を構成するポリヌクレオチド鎖の３’末端またはその近傍に位置するＩＴＲである「３’ＩＴＲ」；
（８）ポリヌクレオチド領域（「Ｐ４ドメイン」）；および
（９）ｒＡＡＶの３’末端」。

【0062】

このようなＰ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４ドメインは、いずれかの特定のｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクター中にすべて存在する必要はなく、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、これらのドメインのいずれか１、２、または３を欠失していてもよく、またはこのようなドメインの４つすべてを欠失していてもよい。このようなドメインの境界は、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターの他のドメインによって規定される。したがって、Ｐ１ドメインは、ｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターの５’末端から５’ＩＴＲの５’末端まで広がっている。ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰまたはｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰｃｉＩ部位は、シスエレメントの挿入のためのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内の適切な部位の一例である。Ｐ２ドメインは、５’ＩＴＲの３’末端から導入遺伝子カセットの５’末端まで延びている。Ｐ３ドメインは、導入遺伝子カセットの３’末端から３’ＩＴＲの５’末端まで延びている。ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのＥｃｏＲ１部位またはｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＳｐｅＩ部位は、シスエレメントの挿入のためのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ２ドメイン内の適切な部位の例である。Ｐ３ドメインは、ポリ（Ａ）配列の３’末端からｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターの３’ＩＴＲまで広がっている。ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰまたはｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰｍｌＩ部位は、シスエレメントの挿入のためのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ３ドメイン内の適切な部位の例である。Ｐ４ドメインは、３’ＩＴＲの３’末端からｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターの３’末端まで広がっている。ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰまたはｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＫａｓＩ部位は、シスエレメントの挿入のためのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ４ドメイン内の適切な部位の一例である。特定のＰ１、Ｐ２、Ｐ３、またはＰ４ドメイン内での本発明のシスエレメントの正確な位置は、そのような位置にあるシスエレメントがｒＡＡＶ産生力価の増加を媒介する能力にとって重要ではない。シスエレメントの挿入は、シスエレメントを適当な制限部位に連結することによって、またはそのようなシスエレメントを設置するためのプライマーを使用することによって行うことができる。

【0063】

本発明は、特定のシスエレメントを同定するために、ＣｉｓＥ１、ＣｉｓＥ２などの命名法を用いる。このような指示の後には、シスエレメントが（それぞれ）ｒＡＡＶにその順方向または逆方向に挿入されていることを示すために、「Ｆｏｒ」または「Ｒｅｖ」が続く場合がある。「Ｆｏｒ」または「Ｒｅｖ」が示されていない場合、シスエレメントは順方向でｒＡＡＶに挿入されている。最後に、本発明は、シスエレメントが挿入されたドメインを示すために、命名法Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３またはＰ４ドメインを使用する。したがって、例えば、Ｐ１ドメイン内に、その順方向に本発明のシスエレメントＣｉｓＥ１を含有するｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、本明細書においては、「ＣｉｓＥ１－Ｆｏｒ－Ｐ１」または「ＣｉｓＥ１－Ｐ１」という名称で呼ばれ、Ｐ２ドメイン内に、その順方向に本発明のシスエレメントＣｉｓＥ２１を含有するｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、本明細書においては、「ＣｉｓＥ２１－Ｆｏｒ－Ｐ２」または「ＣｉｓＥ１－Ｐ２」という名称で呼ばれ、Ｐ４ドメイン内に、その逆方向に本発明のシスエレメントＣｉｓＥ３０を含有するｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、本明細書においては、「ＣｉｓＥ３０－Ｒｅｖ－Ｐ４」という名称で呼ばれる。したがって、図８に概略的に示された構成体を参照すると、構成体ＣｉｓＥ－Ｐ１、ＣｉｓＥ－Ｒｅｖ－Ｐ１、ＣｉｓＥ－Ｐ１＆Ｐ４、ＣｉｓＥ－Ｐ１～Ｐ４はすべて、Ｐ１ドメイン内にシスエレメントを含む（ＣｉｓＥ－Ｒｅｖ－Ｐ１のように、シスエレメントの方向が反転する場合がある）；ＣｉｓＥ－Ｐ１＆Ｐ４構築物には、Ｐ１ドメイン内およびＰ４ドメイン内にシスエレメントを含む。構築物ＣｉｓＥ－Ｐ１～Ｐ４には、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４ドメイン内にシスエレメントを含む。

【0064】

一実施形態では、そのようなシスエレメントは、Ｇ四重鎖構造を形成することができる、実際のまたは潜在的な「Ｇ四重鎖配列」である。本発明に特に関連するＧ四重鎖構造は、単一のポリヌクレオチド鎖のみを含み、各々が３個以上のデオキシグアノシン残基からなる４つのシリーズの一般式を有し、第１、第２および第３のそのようなシリーズは、第４のそのようなシリーズから他の１から７のヌクレオチド残基によって分離される。

【0065】

ある場合には、特定のポリヌクレオチドは、Ｇ四重鎖配列を含むことが知られている配列（すなわち、「実際のＧ四重鎖配列」）を含むだろう。他の場合には、特定の配列は、Ｇ四重鎖構造を形成し得るＧ四重鎖配列（すなわち、「潜在的Ｇ四重鎖配列」）を含むことが予測される。
特定のポリヌクレオチドが潜在的なＧ四重鎖配列であるかどうかを決定するための予測アルゴリズムはよく知られており、したがって、特定のポリヌクレオチドが潜在的なＧ四重鎖配列であるかどうかの認識は容易に達成され得る。そのような予測アルゴリズムの例は、Ｇ ４ Ｐ計算機を含む（Ｅｄｄｙ，Ｊ．他（２００６）“Ｇｅｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｇ４ ＤＮＡ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：３８８７－３８９６），ＱｕａｄＰａｒｓｅｒ（Ｈｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．Ｌ．他（２００５）“Ｐｒｅはｌｅｎｃｅ Ｏｆ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：２９０８－２９１６８）ａｎｄ ＧＨｕｎｔｅｒ（Ｂｅｄｒａｔ，Ａ．他（２０１６）“Ｒｅ－ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｇ４Ｈｕｎｔｅｒ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４４（４）：１７４６－１７５９）は可能性のあるＧ四重鎖配列を同定するために開発された（Ｈｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．Ｌ．他（２００７）“Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ Ｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：４０６－４１３；Ｖｅｒｍａ，Ａ．他（２００８）“Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｅｓ Ｒｅｖｅａｌ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ＤＮＡ Ｍｏｔｉｆｓ Ａｓ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｃｉｓ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：５６４１－５６４９）。

【0066】

本発明はさらに、高レベルの組換えウイルスゲノムを複製するように遺伝子操作されたプラスミドのような組成物を包含する。ウイルスゲノムの複製は、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーを含むシスエレメントの使用を介して調節され得る。このようなシスエレメントは、ＡＡＶベクターをパックするように設計された組換えプラスミドに遺伝子操作することができる。さらに、本発明は、シスエレメントをＩＴＲの前または後に配置することができることを包括する。

【0067】

ＡＡＶ産生を増加させる本発明のシスエレメントは特に以下を含む：
（１）野生型ＡＡＶゲノムの潜在的Ｇ四重鎖配列（すなわち，ＣｉｓＥ１-ＣｉｓＥ１６（配列番号：５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３および３５）），または逆方向の潜在的Ｇ四重鎖配列（すなわち、ＣｉｓＥ１－Ｒｅｖ－ＣｉｓＥ１６－Ｒｅｖ（配列番号：６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４および３６））；
（２）実際のＧ四重鎖配列（すなわち、ＣｉｓＥ１７－ＣｉｓＥ２０（配列番号：３７，３９，４１および４３））または逆方向の実際のＧ四重鎖配列（すなわち，ＣｉｓＥ１７－Ｒｅｖ－ＣｉｓＥ２０－Ｒｅｖ（配列番号：３８，４０，４２および４４）；
（３）野生型ＡＡＶからの他のＤＮＡ配列（すなわち、ＣｉｓＥ２１－ＣｉｓＥ２６およびＣｉｓＥ３１－ＣｉｓＥ３５（配列番号：４５，４７，４９，５１，５３，５５，６５，６７，６９，７１および７３））または逆方向の野生型ＡＡＶからの他のＤＮＡ配列（すなわち、ＣｉｓＥ２１－Ｒｅｖ－ＣｉｓＥ２６－ＲｅｖおよびＣｉｓＥ３１－Ｒｅｖ－ＣｉｓＥ３５－Ｒｅｖ（配列番号：４６，４８，５０，５２，５４，５６，６６，６８，７２および７４）；および
（４） 他のウイルスゲノムからのＤＮＡ配列（すなわち、ＣｉｓＥ２７－ＣｉｓＥ３０（配列番号：５７，５９，６１および６３））または逆方向の他のウイルスからのそのようなＤＮＡ配列（すなわち、ＣｉｓＥ２７－Ｒｅｖ－ＣｉｓＥ３０－Ｒｅｖ（配列番号：５８，６０，６２および６４）およびヒトゲノム。

【0068】

表１は、本発明のこのような好ましい例示的シスエレメントの配列、配列の名称、および起源を提供する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【0069】

本発明における１以上のＣｉｓエレメントを含むことはＡＡＶ産生力価を増大する。本明細書での使用において、用語「産生力価」は調製物中の感染性ｒＡＡＶの濃度の量を示すことを意図する。このような量または濃度は、好ましくは、このような調製物中のＡＡＶまたはｒＡＡＶを力価化（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）することによって決定される。本発明のｒＡＡＶ調製物の産生力価は、好ましくは、産生細胞（例えば、ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するＡＡＶヘルパーベクター、および必要なアデノウイルス転写および翻訳因子を提供するＡｄヘルパーベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３）を３回凍結／解凍した後、超音波処理してｒＡＡＶ粒子の放出に供した後、力価化される。次いで、調製物は遠心分離される。使用されるＡＡＶヘルパーベクターは上清に局在する。調製物のアリコートはプロテイナーゼＫで処理され、ＡＡＶゲノムの数が決定される。調製物のアリコートを（ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＣａｐを発現する）ＨｅＬａ－３２ Ｃ２細胞に感染させ、感染力価は感染中心アッセイ（ＩＣＡ）（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）を用いて、またはより好ましくは、組織培養感染用量の中央値（ＴＣＩＤ ５０）として測定される（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。

【0070】

本明細書中において、もし、本発明の方法の使用から得られた産生力価が、追加的に提供されたイオンが提供されなかった同様に実施された産生から得られた力価より、少なくとも１０％大きい、より好ましくは少なくとも２０％大きい，さらに好ましくは少なくとも３０％大きい，より好ましくは少なくとも４０％大きい，より好ましくは少なくとも５０％大きい，より好ましくは少なくとも６０％大きい，より好ましくは少なくとも７０％大きい，より好ましくは少なくとも８０％大きい，より好ましくは少なくとも９０％大きい，より好ましくは少なくとも２倍大きい，より好ましくは少なくとも１１０％大きい，より好ましくは少なくとも１２０％大きい，より好ましくは少なくとも１３０％大きい，より好ましくは少なくとも１４０％大きい，より好ましくは少なくとも２．５倍大きい，より好ましくは少なくとも１６０％大きい，より好ましくは少なくとも１７０％大きい，より好ましくは少なくとも１８０％大きい，より好ましくは少なくとも１９０％大きい，より好ましくは少なくとも３倍大きければ、ｒＡＡＶ産生力価が、本発明の方法によって「増加した」と言われる。

【0071】

本発明の方法を用いて産生力価を増加させることができるｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド粒子内にカプセル化され得るｒＡＡＶプラスミドベクターにｒＡＡＶがパッケージングされることを可能にする任意の導入遺伝子カセットを含むことができる。限定されるものではないが、このような導入遺伝子カセットは、ヒト、霊長類（チンパンジー、テナガザル、ゴリラ、オランウータンなどを含む）、セルコピテクシン（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）（ヒヒ、カニクイザル、ビロードサルなどを含む）、イヌ、グリリン（ｇｌｉｒｉｎｅ）（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなどを含む）、ネコ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ起源であってもよい。

【0072】

好ましい実施形態において、そのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードするか、または遺伝的もしくは遺伝的疾患もしくは状態に関連する転写された核酸を含み、その結果、そのような疾患もしくは状態を治療するための遺伝子治療において使用され得る。

【0073】

本発明の方法は、所望のｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクター、ならびにそのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターによって提供されないタンパク質またはＲＮＡ分子を提供することができる、１以上のウイルスおよび／またはヘルパープラスミドでトランスフェクトされた細胞において、ｒＡＡＶおよびｒＡＡＶプラスミドベクターの産生力価を増加させるために使用することができる。上述のように、このようなタンパク質またはＲＮＡ分子には、ベクターの転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要なＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質をコードする遺伝子、およびｒＡＡＶの場合には、感染性粒子の形成に必要なＶＰキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子が含まれる。このようなタンパク質またはＲＮＡ分子には、ＡＡＶの増殖に必要なウイルス転写因子および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）も含まれる。本発明のｒＡＡＶを産生するための、本発明の一実施形態において、これらの遺伝子およびＲＮＡ分子の全ては、ｒＡＡＶと協働してダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含むように、同一のヘルパーウイルス（より好ましくは、ヘルパーベクター）上に提供される。しかし、より好ましくは、本発明のｒＡＡＶを産生するために、必要なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドによって提供され、ウイルス転写および翻訳因子をコードする遺伝子は、第２のプラスミド上に提供され、そのようなプラスミドは、ｒＡＡＶと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む。

【0074】

本発明の方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０血清型ならびにｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９およびｒＡＡＶ１０血清型を含み、ハイブリッド血清型（例えば、ＡＡＶ２／５およびｒＡＡＶ２／５は、血清型２および５のハイブリッドであり、したがって、このような血清型の両方のトロフィズム（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）を含む、いずれかの血清型に属するｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができる。

【0075】

本発明の方法は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルスまたはパピローマウイルスによって提供される「ヘルパー」ＲＮＡまたはタンパク質を用いて産生されるｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができる。

【0076】

本発明の方法は、接着単層培養または懸濁培養において細胞によって産生されるｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができ、ｒＡＡＶを産生することができる任意の方法とともに使用することができる。しかし、ｒＡＡＶは、好ましくは、組織培養で成長させたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、またはより好ましくは、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を上述されたプラスミドベクターでトランスフェクトすることによって産生される。内因性レトロウイルスを欠くＢＨＫ細胞株ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）は、好ましいＢＨＫ細胞株である。ＨＥＫ細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、およびＨＥＫ２９３ Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６：ＳＶ４０Ｔ抗原に対する温度感受性遺伝子が挿入されたＨＥＫ２９３細胞株の高度にトランスフェクト可能な誘導体）またはＨＥＫ２９３Ｔ／１７（トランスフェクションの容易さのために選択されたＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１１２６８）のような、その誘導体が特に好ましい。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＳＦ細胞株（ＡＴＣＣ ＡＣＳ－４５００）は、無血清培地および懸濁液に適合した２９３Ｔ／１７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）の誘導体であり、希望によって用いることができる。

【0077】

このような細胞を培養するための本発明の好ましい基本培地は、イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣカタログＮｏ．３０－２００３）またはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。ウシ胎児血清（例えばＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を１０％の最終濃度まで添加して完全増殖培地が作製される。イーグル最小必須培地およびダルベッコの改変イーグル培地は、様々な無機塩に加えて、アミノ酸、ビタミン、および必要に応じてグルコースを含有する複合培地である。ダルベッコの改変イーグル培地は、オリジナルのイーグル最小必須培地の約４倍のビタミンとアミノ酸を含み、２～４倍のグルコースを含むという点で培地は異なる。追加的に、それはｐＨ表示用に硫酸第二鉄の形態の鉄とフェノールレッドを含有する（Ｙａｏ，Ｔ他（２０１７）“Ａｎｉｍａｌ－Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ：Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ，”Ｒｅｐｒｏｄｕｃ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：９９－１１７）。

【0078】

このようなトランスフェクションに使用される細胞は、好ましくは、指数増殖期に維持するために週２回継代される。小規模トランスフェクションについては、例えば、マルチウェルプレート上のウェル当たり１×１０^６ ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞、または１５ｃｍディッシュ当たり１．５×１０^７ ＨＥＫ２９３細胞のアリコートを使用することができる。大規模産生のために、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞は、複数のコンフルエントな１５ｃｍプレートから収集され、１リットルの完全な培養培地を含有する２つの１０層細胞スタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に分割され得る。一実施形態において、そのような細胞は、トランスフェクション前にそのような培地中で４日間増殖される。トランスフェクションの前日に、２つの細胞スタックをトリプシン処理し、細胞（例えば、約６×１０^８細胞）を２００ｍｌの培地中に再懸濁させてもよい。好ましくは、細胞をトランスフェクション前に２４時間付着させる。細胞スタックの集密性は、顕微鏡ステージ上に細胞スタックを収容するために、位相コントラストハードウェアが除去された、ダイアポット（Ｄｉａｐｈｏｔ）倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてモニターすることができる。

【0079】

すなわち、特に本発明は組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法を提供し、そのような方法は：
（Ａ）産生力価を産生するためのｒＡＡＶとして、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含むｒＡＡＶを使用することであって、：
（１）Ｐ１ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）Ｐ２ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）Ｐ３ドメインはｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）ｐ４ドメインはｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し３’である、使用すること；および
（Ｂ）使用されたｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養すること、ただし、細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有し、さらに、培養は、培養培地中で、ｒＡＡＶの産生を許容するのに十分な条件の下で行われること、
を含み、
使用されたｒＡＡＶにおけるシスエレメントの存在は、細胞が、使用されたｒＡＡＶがシスエレメントを欠失している場合に達成されるのに比べ、増加した産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす。
ＩＩ．本発明の薬学的組成物

【0080】

本発明は以下を含む薬学的組成物を提供する。
（Ａ）そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物であって、
（１）Ｐ１ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）Ｐ２ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）ｐ４ドメインはｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し３’である、調製物、および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。

【0081】

本発明は、さらに、本発明の方法に従って製造されたｒＡＡＶの薬学的に許容される調製物、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的組成物を含む。そのような薬学的組成物のｒＡＡＶは、タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを含むか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態を治療する、そのような薬学的組成物中に有効な量（「有効量」）で存在する。

【0082】

用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関あるいは米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）または他の一般に認められた薬局方にリストされた規制機関によって、動物、特にヒトにおける使用が承認されたことを意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、賦形剤、または賦形剤を指す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油のような滅菌液体であり得る。薬学的組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、所望すれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な薬学的形剤は、米国特許第８，８５２，６０７号；米国特許第８，１９２，９７５号；米国特許第６，７６４，８４５；米国特許第６，７５９，０５０号および米国特許第７，５９８，０７０号に記載される。

【0083】

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、または活性剤の量を示すバイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器中の水溶液として、単位投与形態で別々に、または一緒に混合されて供給される。この組成物を注入によって投与する場合には、無菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射または生理食塩水のための滅菌水のアンプル、または他の希釈剤を提供して、成分を投与前に混合することができる。

【0084】

本発明はまた、このような薬学的組成物の１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、適宜、薬品または生物由来製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定める様式による通知を関連付けることができる。その通知とは、人の投与のための、製造、使用または販売の機関による承認を反映するものである。

【0085】

このような薬学的組成物のｒＡＡＶは、好ましくは、バイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器内に包装され、分子の量を示し、任意に使用指示書を含む。一実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密閉容器内に供給され、対象への投与のための適切な濃度まで、例えば、水、生理食塩水または他の希釈剤で再構成することができる。凍結乾燥物は、元の容器で２～８°Ｃで保存され、再構成された後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または溶解後１時間以内に投与される。別の実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、密閉容器内の水溶液として供給され、例えば、水、生理食塩水、または他の希釈剤で、被験体への投与のための適切な濃度に希釈され得る。キットは、１つ以上の容器中に、疾患または状態の治療に有用な１つ以上の他の予防および／または治療剤をさらに含むことができる；および／またはキットは、癌に関連する１以上の癌抗原に結合する１以上の細胞傷害性抗体をさらに含むことができる。ある態様において、他の予防または治療剤は化学療法剤である。他の態様において、予防剤または治療剤は、生物学的またはホルモン治療剤である。
ＩＩＩ．本発明の使用

【0086】

本発明の方法は、ｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、特に、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードする導入遺伝子カセットを含むｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、または転写された核酸を含み、それは遺伝子のまたは遺伝性の疾患または状態に関連する、ｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、そのような疾患または状態を治療するための遺伝子治療において使用することができる。そのような疾患および状態の例には、色盲（ＡＣＨＭ）、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症；アルツハイマー病；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）欠損症；脈絡膜血症（ＣＨＭ）；癌；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ジスフェルリン欠損症；ホリスタチン遺伝子欠損症（ＢＭＤＳＩＢＭ）；血友病Ａ；血友病Ｂ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ハンチントン病；特発性パーキンソン病；乳児後期神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ，バッテン病の乳児型）；レーベル先天性黒内障（ＬＣＡ）；レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ（ＬＧＭＤ１Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｃ（ＬＧＭＤ１Ｃ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ａ（ＬＧＭＤ２Ａ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ＬＧＭＤ２Ｉ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）；リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）欠損症；異染性白質ジストロフィー；神経学的障害；神経運動障害；神経骨格障害；パーキンソン病；関節リウマチ；サンフィリッポＡ症候群；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）；αサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｄ）；βサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｅ）；γ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｃ）およびδ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｆ）。
ＩＶ．本発明の実施形態

【0087】

本発明は、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、その使用および組成物に関する。それは特に以下の実施形態Ｅ１からＥ２２に関する：
Ｅ１．組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であってそのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、
（１）Ｐ１ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）Ｐ２ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）Ｐ３ドメインはｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）ｐ４ドメインはｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し３’であり、そして
シスエレメントの存在は、ｒＡＡＶ産生細胞が、シスエレメントを欠く場合に得られるそのようなｒＡＡＶよりも高い産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
Ｅ２．以下を含む学的組成物：
（Ａ）そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上にシスエレメントを含む組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物であって、
（１）Ｐ１ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）Ｐ２ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）Ｐ３ドメインは前記ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）ｐ４ドメインはｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し３’である、調製物、および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。
Ｅ３．組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって：
（Ａ）産生力価を産生するためのｒＡＡＶとして、そのＰ１，Ｐ２，Ｐ３またはＰ４ドメインの１以上に付加されたシスエレメントを含むｒＡＡＶを使用することであって：
（１）Ｐ１ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し５’であり；
（２）Ｐ２ドメインはｒＡＡＶの５’ＩＴＲに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し５’であり；
（３）Ｐ３ドメインはｒＡＡＶの導入遺伝子カセットに対し３’であり、かつ、ｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し５’であり；
（４）ｐ４ドメインはｒＡＡＶの３’ＩＴＲに対し３’である、使用すること、および
（Ｂ）使用されたｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養すること、ただし、細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有し、さらに、培養は、培養培地中で、ｒＡＡＶの産生を許すのに十分な条件の下で行われること、
を含み、
使用されたｒＡＡＶにおける前記シスエレメントの存在は、細胞が、前記使用されたｒＡＡＶが前記シスエレメントを欠失している場合に達成されるのに比べ、増加した産生力価で前記ｒＡＡＶを産生することを引き起こす、方法。
Ｅ４．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ１ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ５．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ２ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ６．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ３ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ７．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ４ドメインに付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ８．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ１ドメインおよびそのＰ２、Ｐ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ９．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ２ドメインおよびそのＰ３またはＰ４ドメインの１つ以上に、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ１０．使用されたｒＡＡＶが、そのＰ３ドメインおよびそのＰ４ドメインに、付加されたシスエレメントを含むように改変されている、Ｅ１の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２の薬学的組成物、またはＥ３の方法。
Ｅ１１．付加されたシスエレメントが使用されたｒＡＡＶにおいてＧ四重鎖構造を形成する、Ｅ１またはＥ４からＥ１０のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２またはＥ４からＥ１０のいずれかの薬学的組成物、またはＥ３からＥ１０のいずれかの方法
Ｅ１２．付加されたシスエレメントが以下からなる群より選ばれる、Ｅ１またはＥ４からＥ１１のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２またはＥ４からＥ１１のいずれかの薬学的組成物、またはＥ３からＥ１１のいずれかの方法：
（１）野生型ＡＡＶゲノムの潜在的Ｇ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの潜在的Ｇ四重鎖配列；
（２）野生型ＡＡＶゲノムの実際のＧ四重鎖配列または野生型ＡＡＶゲノムの逆向きの実際のＧ四重鎖配列；
（３）野生型ＡＡＶ由来のＤＮＡ配列または野生型ＡＡＶ由来の逆向きのＤＮＡ配列；および
（４）別のウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、または別のウイルスゲノム由来の逆向きのＤＮＡ配列。
Ｅ１３．導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、Ｅ１またはＥ４からＥ１２のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２またはＥ４からＥ１２のいずれかの薬学的組成物、またはＥ３からＥ１２のいずれかの方法。
Ｅ１４．使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、またはそれらの血清型のハイブリッドに属する、Ｅ１またはＥ４からＥ１３のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ２またはＥ４からＥ１３のいずれかの薬学的組成物、またはＥ３からＥ１３のいずれかの方法。
Ｅ１５．使用されたｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ９またはそれらの血清型のハイブリッドに属する、Ｅ１４の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、薬学的組成物、または方法。
Ｅ１６．細胞が、ヒト胚性腎細胞である、Ｅ１またはＥ４からＥ１５のいずれかの組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、Ｅ３からＥ１５のいずれかの方法。
Ｅ１７．細胞が、ヒト胚性腎細胞である、Ｅ１６の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、またはＥ１６の方法。
Ｅ１８．細胞がＨＥＫ２９３である、Ｅ１７の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、またはＥ１７の方法。
Ｅ１９．細胞が、ベビーハムスター腎細胞である、Ｅ１６の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、またはＥ１６の方法。
Ｅ２０．細胞がＢＨＫ２１細胞である、Ｅ１９の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、またはＥ１９の方法。
Ｅ２１．細胞が、ｓｆ９昆虫細胞である、Ｅ１６の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、またはＥ１６の方法。
Ｅ２２．導入遺伝子カセットが、タンパク質をコードするか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、Ｅ１４の組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物、またはＥ１５の薬学的組成物。

【実施例】

【0088】

本発明を一般的に説明した後、以下の実施例を参照することにより、同じことがより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、特定されない限り、本発明を限定することを意図しない。
実施例１
ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ２ドメイン内にシスエレメントを有するｒＡＡＶプラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

【0089】

ｒＡＡＶ産生力価を増加させる本発明のシスエレメントの能力を実証するために、親ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを、そのＰ２ドメイン内にシスエレメントを含有するように改変した。

【0090】

プラスミドｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの一連の２７の誘導体を、プラスミドのＰ２ドメイン（図７；図９Ａ）内に位置するプラスミドのＳｐｅＩ部位にシスエレメントＣｉｓＥ１からＣｉｓＥ２７（表１）の１つを挿入することによって構築した。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するＡＡＶヘルパープラスミドｐＲＣ２および必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステム（図２）において、誘導体プラスミドを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を測定し、親ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰプラスミドで得られたものと比較した。

【0091】

調査の結果を図９Ｂに示し、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ２ドメイン内に導入されたシスエレメントの全てが、ｒＡＡＶ産生力価の増加をもたらしたことを示す。ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ２ドメインへのＣｉｓＥ１９の挿入は、産生力価の２．５倍の増加を仲介することが分かった。ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ２ドメインへのＣｉｓＥ２６の挿入は、産生力価の４倍の増加を仲介することが分かった。
実施例２
ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内にシスエレメントを有するｒＡＡＶプラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

【0092】

ｒＡＡＶ産生力価を増加させる本発明のシスエレメントの能力をさらに実証するために、ｒＡＡＶプラスミドベクター、ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを、プラスミドのＰ１ドメイン内にシスエレメントを含有するように改変した。次いで、ｒＡＡＶ力価に対するその改変の効果を上記のように評価した。

【0093】

より具体的には、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの一連の７つの誘導体を、プラスミドのＰ１ドメイン（図７；図１０Ａ）内に位置するプラスミドのＰｃｉＩ部位に、シスエレメントＣｉｓＥ１、ＣｉｓＥ２０、ＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２７、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ２９、またはＣｉｓＥ３０のうちの１つを挿入することによって構築した。ｒＡＡＶの産生力価は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎ）および必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミド（ｐＲＣ２）を有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステム（図２）を用いて、実質的に実施例１に記載のように得た。産生力価を親ｐＡＶ－ＴＢＧ‐ＥＧＦＰプラスミドで得たものと比較した。調査の結果を図１０Ｂに示し、ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメイン内に導入されたシスエレメントの全てが、ｒＡＡＶ産生力価の増加をもたらしたことを示す。ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内へのＣｉｓＥ３０の挿入は、産生力価の３．０倍の増加を仲介することが分かった。
実施例３
ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメインまたはＰ２ドメイン内にシスエレメントを有するｒＡＡＶプラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

【0094】

基本的に上述したように、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメインまたはプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ２ドメイン（図１１Ａ）のいずれかにシスエレメントＣｉｓＥ１、ＣｉｓＥ２０またはＣｉｓＥ２１を導入することによって、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメインまたはこのようなｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ２ドメインのいずれかに同一のシスエレメントを挿入することによるｒＡＡＶ産生力価への影響が調査された。

【0095】

ｒＡＡＶの産生力価は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）および必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミド（ｐＲＣ２）を有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステム（図２）を用いて、実質的に実施例１に記載のように得た。調査の結果を図１１Ｂに示し、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１またはＰ２ドメイン内にシスエレメントを配置すると、ｒＡＡＶ産生力価が増加したことを示す。
実施例４
ｒＡＡＶプラスミドベクター中のシスエレメントの配向がトランスフェクトされた細胞により産生されるｒＡＡＶ収率に及ぼす影響

【0096】

ｒＡＡＶ産生力価に及ぼすｒＡＡＶプラスミドベクター中のシスエレメントの配向の影響が、実質的に上述したように、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰのＰ１ドメイン内に、シスエレメントＣｉｓＥ２１（表１）を、「前方」配向（配列番号：４５）または「逆」配向（配列番号：４６）のいずれかに挿入することによって調査された（図１２Ａ）。

【0097】

ｒＡＡＶの産生力価は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＲＣ２）および必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）を有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステム（図２）を用いて、実質的に実施例１に記載したように得た。調査の結果を図１２Ｂに示し、挿入されたシスエレメントのいずれの配向を有するｒＡＡＶプラスミドベクターを用いても、増加したｒＡＡＶ産生力価が得られたことを示す。
実施例５
ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメインおよびＰ４ドメイン内にシスエレメントを有するｒＡＡＶプラスミドベクターでトランスフェクトした細胞によるｒＡＡＶ産生力価の比較

【0098】

ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ４ドメイン内に同一のシスエレメントを維持しながら、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内に異なるシスエレメントを挿入すること（図１３Ａ）によるｒＡＡＶ産生力価への影響が、このようなｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ４ドメイン内に位置するＫａｓＩ部位に同一のシスエレメントを含有するｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内に異なるシスエレメントを導入することによって調査された。ｒＡＡＶの産生力価は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ機能を提供するＡＡＶヘルパープラスミド、および必要なアデノウイルス機能を提供するＡｄヘルパープラスミドを有するトリプルプラスミドトランスフェクションシステム（図２）を用いて、実質的に実施例１に記載したように得た。

【0099】

調査の結果を図１３Ｂ、図１３Ｃに示す。図１３Ｂは、そのＰ１ドメイン内にシスエレメントＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２２、ＣｉｓＥ２３、ＣｉｓＥ２４、ＣｉｓＥ２５、ＣｉｓＥ２６、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ２９、ＣｉｓＥ３１、ＣｉｓＥ３２、ＣｉｓＥ３３、ＣｉｓＥ３４、またはＣｉｓＥ３５を含有し、そのＰ４ドメイン内にシスエレメントＣｉｓＥ３０－Ｒｅｖを含有するプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。図１３Ｃは、そのＰ１ドメイン内にシスエレメントＣｉｓＥ２１、ＣｉｓＥ２２、ＣｉｓＥ２３、ＣｉｓＥ２４、ＣｉｓＥ２５、ＣｉｓＥ２７、ＣｉｓＥ２８、ＣｉｓＥ３２、ＣｉｓＥ３３、またはＣｉｓＥ３４を含有し、そのＰ４ドメイン内にシスエレメントＣｉｓＥ３５－Ｒｅｖを含有するプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰを用いて得られたｒＡＡＶの産生力価を示す。調査の結果は、ｒＡＡＶプラスミドベクター中の２つのシスエレメントの存在は、単一のシスエレメントのみを用いて得られたものと比較して、産生力価の増加を相乗的に増強することを示した。

【0100】

ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ１ドメイン内に同一のシスエレメントを維持しながら、ｒＡＡＶプラスミドベクターのＰ４ドメイン内に異なるシスエレメントを挿入することによるｒＡＡＶ産生力価への影響が、ｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ‐ＴＢＧ‐ＥＧＦＰのＰ１ドメインにシスエレメントＣｉｓＥ２８を導入することにより調査された。次いで、プラスミドベクターを、そのＰ４ドメイン内にシスエレメントＣｉｓＥ２２－Ｒｅｖ、ＣｉｓＥ２７－Ｒｅｖ、ＣｉｓＥ２９－Ｒｅｖ、またはＣｉｓＥ３５－Ｒｅｖを含有するように、実質的に上述のように、さらに改変した（図１３Ｄ）。Ｐ１ドメイン内にＣｉｓ２８シスエレメントおよびＰ４ドメイン内にＣｉｓＥ３５‐Ｒｅｖシスエレメントを有するｒＡＡＶは、親ｒＡＡＶのそれと比較して２～３倍増加した産生力価を示した。

【0101】

本明細書に記載されているすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許出願がその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、それは更なる修正が可能であることが理解されるであろうし、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った、本開示からの逸脱を含む、本発明が関係する技術分野における公知のまたは慣習的な実施の範囲内で、かつ、先に述べた本質的特徴に適用され得る、本開示からの任意の変形、用途または適合をカバーすることを意図している。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【国際調査報告】