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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-07
(54)【発明の名称】組換えエンドペプチダーゼを含む酵素組成物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20220930BHJP
C12N 9/52 20060101ALI20220930BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20220930BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220930BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220930BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20220930BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20220930BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220930BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220930BHJP
【ＦＩ】
C12N15/57
C12N9/52 ZNA
C12P21/00 C
C12N15/63 Z
C12N1/21
A23L33/18
A61K38/48
A61P1/00
A61P37/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503449
(86)(22)【出願日】2020-07-08
(85)【翻訳文提出日】2022-03-11
(86)【国際出願番号】 EP2020069297
(87)【国際公開番号】W WO2021013553
(87)【国際公開日】2021-01-28
(31)【優先権主張番号】102019000012942
(32)【優先日】2019-07-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(31)【優先権主張番号】62/878,369
(32)【優先日】2019-07-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522021848
【氏名又は名称】ネミシス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】タラベラ，アンナ
(72)【発明者】
【氏名】カレンジ，ジャコモ
(72)【発明者】
【氏名】シグルタ，アレッサンドロ
(72)【発明者】
【氏名】カヴァレッティ，リンダ
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4B064
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB10
4B018MD49
4B018MD90
4B018ME07
4B018MF12
4B050CC07
4B050DD02
4B050EE01
4B050KK18
4B050LL01
4B050LL02
4B064AG01
4B064CA19
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA01Y
4B065AA50X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA24
4B065CA41
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA44
4C084CA04
4C084DC02
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZA66
4C084ZB07
(57)【要約】
本発明は、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む、ヒトの使用に適した酵素調製物の、高収率で得られる製造方法に関する。本発明はさらに、目的の組換えエンドペプチダーゼを発現するための組換え発現ベクター、及び前記ベクターを含むＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞に関する。さらに本発明は、前記方法によって得られる酵素調製物、その調合物、及びその臨床用途に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物の製造方法であって、組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼが、好ましくはその成熟型であり、好ましくは以下からなる群から選択され：配列番号１を含む配列のエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）；Ｅ４０の生物活性断片；天然由来のＥ４０の対立遺伝子変異体；及び、配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼ、
以下の工程を順番に含む方法：
ａ）組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞、好ましくはＴＫ２４株を、発酵条件下の培養液中で培養する工程であって、
組換え宿主細胞が、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの異種発現のための組換え発現ベクターを含み、
組換え発現ベクターが、組換え宿主細胞における少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの発現を指示できる調節配列に作動可能に連結した、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、
培養液が、少なくとも３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む工程；
ｂ）少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む培養液の上清を回収する工程；及び、
ｃ）上清から、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物を精製する工程であって、
精製酵素調製物が、好ましくは、配列番号１を含む、又は配列番号１からなる配列のＥ４０の成熟型を含み、より好ましくは、配列番号２を含む、又は配列番号２からなる配列のヒスチジンタグ付きＥ４０を含み、
酵素調製物が、好ましくは、粉末形態である工程。
【請求項2】
発酵条件が、組換え宿主細胞を２８℃から３０℃の間、好ましくは約３０℃の温度で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
工程ｂ）において、発酵条件下の培養が、少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
組換え発現ベクターが、配列番号１を含む配列のＥ４０をコードするポリヌクレオチド、好ましくは配列番号３又は配列番号４からなる配列のＥ４０をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、配列番号５もしくは配列番号６の配列のもの、又は配列番号５もしくは配列番号６に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％の同一性を有する配列のものであり、より好ましくは、ポリヌクレオチドが、配列番号２を含む配列のヒスチジンタグ付きＥ４０をコードする配列番号６の配列のものであり、
より好ましくは、培養液の上清から精製された酵素調製物が、ヒスチジンタグ付きＥ４０の成熟型を含み、
成熟型が、配列番号２の配列を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
組換え発現ベクターが、組換えｐＩＪ８６であり、好ましくは組換え発現ベクターが配列番号８の配列のものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法によって得られる酵素調製物。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法のステップｃ）で回収された培養液の上清から単離された、又は請求項５の酵素調製物から単離された、グルテナーゼ活性を有する単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼであって、好ましくは、以下からなる群から選択される単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ：配列番号１を含む配列のエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）；Ｅ４０の生物活性断片；天然由来のＥ４０の対立遺伝子変異体；及び、配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼ。
【請求項8】
配列番号５又は配列番号６を含む配列を有するポリペプチドを含む組換えｐＩＪ８６発現ベクター、好ましくは、配列番号８の配列を有する組換えｐＩＪ８６発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の組換え発現ベクターを含む、好ましくはＴＫ２４株の組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞、好ましくは、ＤＳＭ ３３２０７株の組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞。
【請求項10】
請求項６に記載の酵素調製物、又は請求項７に記載の単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをタンパク質分解活性成分として含む調合物であって、好ましくは、調合物が、食品もしくは食品サプリメント、又は医薬製剤であり、
より好ましくは、調合物が、食品サプリメント、又は請求項６に記載の酵素調製物もしくは請求項７に記載の単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼと接触させた小麦粉である、調合物。
【請求項11】
セリアック病もしくはセリアック病に関連する障害、又は非セリアックグルテン過敏症の治療及び／又は予防において使用するための、請求項６に記載の酵素調製物、又は請求項７に記載の単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ、又は請求項１０に記載の調合物であって、好ましくは、配列番号６の配列のグリアジンペプチドに対する不耐性を伴う任意の障害の治療及び／又は予防において使用するための、あるいは、ナッツ及び／又はピーナッツに対するアレルギーもしくは不耐性の治療及び／又は予防において使用するための、酵素調製物、又は単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ、又は調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
セリアック病（ＣＤ）は、グルテンが引き金となる慢性自己免疫性腸疾患である（１；非特許文献１）。グルテンは、小麦、ライ麦、大麦に含まれるグリアジン及びグルテニンからなる不溶性タンパク質の不均質な混合物である（２；非特許文献２）。グルテンタンパク質は、消化管のヒトプロテアーゼにはほとんどアクセスできないため、プロリン／グルタミンを多く含む大きなペプチドが小腸に達し、ＣＤ患者の体液性及びＴ細胞媒介適応免疫反応の引き金となることがある。
【0002】
現在までに、消化管内消化に耐性のあるいくつかのＴ細胞刺激ペプチドが、グリアジンタンパク質及びグルテニンタンパク質のいずれかで同定されている。これらのうち、配列ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ（配列番号：１２）を有するα－グリアジン由来の３３－ｍｅｒペプチドが、ＣＤの患者において免疫原性のエピトープの複数のコピーを有するため、現在最も免疫原性の高いペプチドと考えられている（５；非特許文献３）。
【0003】
生涯にわたる厳格なグルテンフリー食（ＧＦＤ）の順守が、現在のＣＤ患者に対する治療法である（６；非特許文献４）。しかし、グルテンを完全に避けることは現実的に不可能であり、新しい治療法が集中的に研究され（７；非特許文献５）、消化管環境中のグルテンやグルテンの毒性断片を消化できる「グルテナーゼ」と呼ばれる新しい酵素の開発に至った。
【0004】
特許文献１は、本発明者らが好酸性放線菌Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８において特定した新規グルテナーゼ群、すなわちグルテナーゼ活性を有するエンドペプチダーゼを開示している。前記Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、グルテンペプチドを非毒性ペプチドに分解する際に非常に迅速かつ効率的であり、胃及び腸環境の全ｐＨ範囲において活性であり（酵素活性はｐＨ３～６の範囲で見られ、最適はｐＨ５である）、さらに消化管内酵素による分解に耐性を示す。
【0005】
このため、これらの新規なＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、ＣＤ及びＣＤ関連疾患の治療及び／又は予防での使用に非常に適している。特許文献１に開示された前記Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼのうち、エンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）が特に注目されていると認められる。Ｅ４０の天然タンパク質は３９８個のアミノ酸残基からなり（配列番号：３参照）、セリンカルボキシルペプチダーゼＳ５３ファミリーに属し、１５６、１６０及び３２９位にそれぞれアスパラギン酸、グルタミン酸及びセリンによって触媒三残基が形成されている。
【0006】
Ｎ末端のシグナルペプチドはｓｉｇｎａｌＰ ４．１サーバー解析により２７位と２８位の間に同定されており、成熟型は７４位から始まると予測され、予測通り３２．５ｋＤａの成熟酵素が得られる結果となった。天然Ｅ４０の成熟型は、配列番号１のポリペプチドである。
【0007】
グルテナーゼ活性を有する前記Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ、特に配列番号１を含む、又は配列番号１からなる配列のＥ４０を効率的かつ安価に製造する方法の開発に強い関心が持たれている。
【0008】
以下、Ｅ４０は、配列番号１を含む配列のエンドペプチダーゼ（すなわち、配列番号１からなる配列のエンドペプチダーゼ、又は配列番号１を含む配列を有するその誘導体）を特定するために用いられる。Ｅ４０の典型的な誘導体はタグ付きＥ４０、例えば配列番号２を含む、又は配列番号２からなる配列を有するエンドペプチダーゼである。
【0009】
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術は、目的のポリペプチドを、比較的安価な方法で、制御してスケーラブルに生産するための非常に強力な技術基盤を提供するものである。組換えタンパク質は今日、大腸菌、出芽酵母、昆虫、ハムスター、及び哺乳類の細胞で得られる。
【0010】
しかし、大量の組換えタンパク質の生産を改善することが求められている。さらに、タンパク質がヒトの使用のために生産されるとき、例えば、食品サプリメントとして、及び／又はヒトの病気の予防及び／又は治療における医薬品として使用するために満たされるべき非常に厳しい要件がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】ＷＯ２０１３／０８３３３８
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Ａｂａｄｉｅ，Ｖ．，Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｂａｒｒｅｉｒｏ，Ｌ．Ｂ．，Ｊａｂｒｉ，Ｂ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，４９３－５２５（２０１１）．
【非特許文献2】Ｗｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４，１１５－９（２００７）．
【非特許文献3】Ｓｈａｎ，Ｌ．，Ｍｏｌｂｅｒｇ，Ｏ．，Ｐａｒｒｏｔ，Ｉ．，Ｈａｕｓｃｈ，Ｆ．，Ｆｉｌｉｚ，Ｆ．，Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｇｌｕｔｅｎ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，２２７５－２２７９（２００２）．
【非特許文献4】Ｋｕｐｐｅｒ，Ｃ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８，Ｓ１２１－７（２００５）．
【非特許文献5】Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｎｕｎｅｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｑｕｉｊａｎｏ，Ｍ．，Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｒａｎｌａｒｄ，Ｇ．，Ｉｇｒｅｊａｓ，Ｇ．Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｅ ｇｌｕｔｅｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，５６－７１（２０１８）．
【発明の概要】
【0013】
したがって、本発明は、ＷＯ２０１３／０８３３３８に開示されたＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの少なくとも１つを組換えタンパク質として含む酵素調製物の効率的かつ安価な改善された製造方法を提供することを目的とする。前記酵素調製物はヒトの使用に適し、必要に応じて、さらに適切な調合物とする。
【0014】
放線菌は、ヒトの食物用途のタンパク質の安全な供給源と見なされている。ストレプトマイセス種から供給される食品酵素の２つの例は、フルクトースシロップの生産に使用されるグルコースイソメラーゼ（１２）と、加工肉や魚肉製品、乳製品、及び焼成食品などの最終製品の食感や全体の品質を向上させる特性のために食品業界で使用されるＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来の広く利用されているトランスグルタミナーゼ（１３）である。
【0015】
本発明者らは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓが、本発明の改善された方法に採用するのに特に有利な宿主細胞であることを見いだした。
【0016】
したがって、本発明は、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞における、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物の製造方法を提供する。当該方法は、目的の組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを発現する前記宿主細胞を発酵条件下で培養する段階と、その後の産生した組換えエンドペプチダーゼを含む宿主細胞の培養液の上清を回収する段階を特徴とする。好ましくは、前記回収の段階の後に、前記上清から、目的のグルテナーゼ活性を有する組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む最終酵素調製物を精製する段階が続く。
【0017】
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞は、前記細胞で発現させた組換えタンパク質を直接分泌し、培養液中に放出することができるため、組換えタンパク質の産生に効率の良い宿主細胞であることが知られている。しかし、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓでは、様々なタンパク質が非常に様々な収率で得られ、この結果は予測不可能である（１２）。さらに、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ細胞は二次代謝産物、特に抗生物質を大量に産生するため（１２）、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓを生理的消化酵素の補充を目的とした酵素調製物の製造に適切な細胞工場として確立する可能性を危うくする。
【0018】
本発明の方法は、目的とする組換えグルテナーゼを多量に含む酵素調製物を得る。驚くべきことに、発酵条件下で宿主細胞を培養したにもかかわらず、本発明の方法によって得られた酵素調製物は、食品、食品サプリメント又は医薬製剤中のヒト摂取に対して規制上許容できないであろうＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓから放出される潜在的な有害二次代謝産物（例えば抗生物質など）を実質的に含まない。本発明の方法によって得られた酵素調製物はヒトの使用に適している（必要に応じて、さらに適切なその調合物とする）。
【0019】
［発明の簡単な説明］
本発明は、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物の製造方法に関し、組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを発現し得るＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞のバッチを、少なくとも３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む培養液で、発酵条件下で培養し、次に宿主細胞培養物の上清から酵素調製物を回収及び精製することを特徴とする。
本発明は、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物の製造方法に関し、組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを発現し得るＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞のバッチを、少なくとも３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む培養液で、発酵条件下で培養し、次に宿主細胞培養物の上清から酵素調製物を回収及び精製することを特徴とする。
【0020】
酵素調製物は、本発明の方法によって高収率で得られ、抗生物質を実質的に含まないため、ヒトの使用に適している。抗生物質を「実質的に含まない」という用語は、微生物学的及び定量的ＨＰＬＣアッセイのいずれにおいても、酵素調製物中に抗生物質が検出されないことを意味する。
【0021】
本発明はさらに、前記方法によって得られた前記酵素調製物、ヒトの使用に適した前記酵素調製物の調合物、目的の組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをコードする核酸を有する組換え発現ベクター、及び前記組換え発現ベクターを含み前記組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを安定して発現するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞に関する。
【0022】
さらに本発明は、本発明の酵素調製物及びその調合物の臨床用途にも関する。好ましくは、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの目的のＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、配列番号１を含む配列を有する、Ｅ４０又はその誘導体である。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】天然Ｅ４０を含むＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８培養物の上清画分の活性。Ａ：様々なｐＨ値における基質ｓｕｃＡｌａＡｌａＰｒｏＰｈｅ－ＡＭＣ（ｓｕｃＡＡＰＦ－ＡＭＣ）に対する相対活性（最適値－１００％活性－はｐＨ５）。Ｂ：３７℃、ｐＨ３で２時間インキュベートした後のグリアジン消化。ゲルはクマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した；レーン１：グリアジン単独、レーン２：グリアジン＋Ｅ４０含有上清画分。
【図2】Ｅ４０コーディング遺伝子搭載ベクターｐＩＪ８６（ｐＩＪ８６／ｅ４０組換え発現ベクター）のマップ。
【図3】Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０の液中発酵により、フラスコスケールで得られた（パネルＡ～Ｃ）、又は１５Ｌバイオリアクターの後、精製して得られた（パネルＤ～Ｅ）組換えＥ４０（配列番号：２）。Ａ：産生性Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／Ｅ４０（Ｅ４０、実線）から様々な発酵時間（発酵時間：◆７２、▲９６、●１６８、■１９２）に採取した上清サンプルのｐＨ５での基質ｓｕｃＡＡＰＦ－ＡＭＣに対する活性と、ｐＩＪ８６－空対照株（ｃｔｒ、破線）から採取した上清サンプルの非活性の比較。活性は、時間（Ｘ軸）で生じた相対蛍光単位（ｒｆｕ、Ｙ軸）で示す。Ｂ：発酵１６８時間のＥ４０上清サンプルが示す様々なｐＨでの相対活性（％）：最適（１００％活性）はｐＨ５である。Ｃ：１６８時間Ｅ４０上清サンプルのｐＨ５でのザイモグラフィ。パネルＡと同じ基質を用い、ＵＶ光下で可視化した。Ｄ：１５Ｌ発酵から精製した組換えＥ４０を含む酵素調製物のプロファイル。レーン１：クマシーで染色した組換えＥ４０を含む最終酵素調製物（矢印が組換えＥ４０を示す）。レーン２：Ｃと同様のザイモグラフィ。レーン３：３７℃、ｐＨ５で２時間消化した後のゼラチン加水分解のバンド。ゼラチン基質のクマシー染色後に可視化した。Ｅ：精製した酵素調製物中の組換えＥ４０の様々なｐＨ値（２～８）での相対活性（％）。基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡで評価した。
【図4】組換えＥ４０の活性は、消化プロテアーゼであるペプシン（Ｐ）の存在下又は非存在下、ｐＨ４、４．５、５（パネルＡ～Ｃ）、及びトリプシン（Ｔ）の存在下又は非存在下、ｐＨ６、７（パネルＤ～Ｅ、Ｅ’）において評価した。Ｅ４０酵素単独（〇で囲われた１の線）、酵素とＰ（〇で囲われた２の線）、酵素とＴ（〇で囲われた４の線）、及びＰ又はＴ単独（それぞれ、〇で囲われた３、〇で囲われた５の線）を含む酵素調製物のサンプルに、基質を添加して反応を開始した。各反応条件は二重試験で行い、エラーバーは標準偏差を表す。パネルＥ’はＥの拡大図である。Ｘ軸：インキュベーション時間（分）、Ｙ軸：４１０ｎｍで読み取った吸光度の単位。（Ｒ２値は、Ｅ４０単独では０．９９４８，０．９９７６，０．９９７８，０．９６３９，０．９９９４。Ｅ４０＋Ｐ／ＴではｐＨ４、４．５、５、６及び７で、それぞれ、０．９９３，０．９９７５，０．９９８２：０．９６６１，０．９９９４）であった。
【図5】３３－ｍｅｒペプチドを組換えＥ４０で消化した際のＬＣ／ＭＳプロファイル（ｐＨ５、３７℃、Ｅ４０の３３－ｍｅｒペプチドに対するモル比は１：４８）。Ａ：完全なペプチド単独（三重荷電イオン［（Ｍ＋３Ｈ＋）３＋＝１３０４．６８］）；ａ＝１４．７５；１３０４．６３。Ｂ－Ｅ：Ｅ４０活性による３３－ｍｅｒ切断の時間経過。ｂ＝１３．０７，１０１０．２７；ｃ＝１４．８４，１３０４．４６；ｄ＝１４．９９，１３０４．５０；ｅ＝１５．１３，１３０４．１４；ｆ＝７．８０，８４２．１１；ｇ＝８．０２，８４２．３４；ｈ＝８．２４，８４２．３６；ｉ＝１１．６２，２４４．１６；ｌ＝１１．８４，１０８６．３８；ｍ＝１２．３８，７４５．１３；ｎ＝１３．１７，９５６．２３；ｏ＝７．５２，８４２．３８；ｐ＝１１．５９，１０８６．５１；ｑ＝１２．１２，７４５．２２；ｒ＝６．６６，８４２．３７；ｓ＝１１．４５，１０８６．４８；ｔ＝１１．９３，７４５．２３．消化中に形成されたペプチド断片を矢印で示す。Ｆ：最終的に残存じたペプチドから推定されるＥ４０切断部位の模式的可視化。
【図6】組換えＥ４０とインキュベートしたグリアジンの様々なインキュベーション時間（最大２４０分）におけるＨＰＬＣ分析。０時点では、グリアジンはω－、α－、γ－グリアジンの疎水性に応じて溶出する。
【図7A】Ａ：５名の異なるセリアック病患者の空腸生検から得たグリアジン反応性Ｔ細胞株におけるＥ４０処理グリアジンの認識（サンプルＡ～Ｈ）。陽性対照：未処理のグリアジン消化物（サンプルＩとＬ）及びフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）。各パネルは、各Ｔ細胞株について３回行われたものからの代表的実験である。Ｂ：Ｅ４０で消化した後の、６倍体コムギから精製したグリアジンのヒト腸管Ｔ細胞に対する免疫賦活活性（表１に規定した条件において、Ｅ４０単独（サンプルＡ～Ｂ）、又は消化管プロテアーゼ存在下のＥ４０（サンプルＣ～Ｈ）で処理したグリアジン消化物に対するＴ細胞応答のパーセントを、Ｅ４０未処理のグリアジン消化物（サンプルＩ）を基準に算出して示す。）グリアジンの酵素消化物をｔＴＧ処理により脱アミド化し、腸管Ｔ細胞への刺激性を評価した。Ｔ細胞の活性化は、ＩＦＮ－γ産生の測定によって決定した。すべてのグリアジン消化物は、５０及び１００μｇ／ｍｌで評価した。データは、５名の異なるＣＤ患者由来のＴ細胞株の反応の平均である。統計的な有意性を評価するために、独立スチューデントｔ検定を使用した。＊＝ｐ＜０．０５
【図7B】Ａ：５名の異なるセリアック病患者の空腸生検から得たグリアジン反応性Ｔ細胞株におけるＥ４０処理グリアジンの認識（サンプルＡ～Ｈ）。陽性対照：未処理のグリアジン消化物（サンプルＩとＬ）及びフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）。各パネルは、各Ｔ細胞株について３回行われたものからの代表的実験である。Ｂ：Ｅ４０で消化した後の、６倍体コムギから精製したグリアジンのヒト腸管Ｔ細胞に対する免疫賦活活性（表１に規定した条件において、Ｅ４０単独（サンプルＡ～Ｂ）、又は消化管プロテアーゼ存在下のＥ４０（サンプルＣ～Ｈ）で処理したグリアジン消化物に対するＴ細胞応答のパーセントを、Ｅ４０未処理のグリアジン消化物（サンプルＩ）を基準に算出して示す。）グリアジンの酵素消化物をｔＴＧ処理により脱アミド化し、腸管Ｔ細胞への刺激性を評価した。Ｔ細胞の活性化は、ＩＦＮ－γ産生の測定によって決定した。すべてのグリアジン消化物は、５０及び１００μｇ／ｍｌで評価した。データは、５名の異なるＣＤ患者由来のＴ細胞株の反応の平均である。統計的な有意性を評価するために、独立スチューデントｔ検定を使用した。＊＝ｐ＜０．０５
【図8】組換えＥ４０を含む酵素調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。番号を付したバンドは切断し、プロテオーム解析した。
【図9A】Ａ：組換えＥ４０によるピーナッツタンパク質の分解を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ。Ｂ：１２０分までの様々なインキュベーション時間で組換えＥ４０とインキュベートした（酵素：基質＝１：２０、ｅ：ｓ）ピーナッツタンパク質のＨＰＬＣ分析；各時点で未処理サンプルのＨＰＬＣを上部パネルに、Ｅ４０処理サンプルのＨＰＬＣを下部パネルに示す。
【図9B】Ａ：組換えＥ４０によるピーナッツタンパク質の分解を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥ。Ｂ：１２０分までの様々なインキュベーション時間で組換えＥ４０とインキュベートした（酵素：基質＝１：２０、ｅ：ｓ）ピーナッツタンパク質のＨＰＬＣ分析；各時点で未処理サンプルのＨＰＬＣを上部パネルに、Ｅ４０処理サンプルのＨＰＬＣを下部パネルに示す。
【図10】スクロースの存在下／非存在下におけるＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓのＥ４０産生。スクロース無添加（◆、Ｓｕｃ０）、又は１７％（■、Ｓｕｃ１７）もしくは３４％スクロース添加（▲、Ｓｕｃ３４）の培養液Ｐで増殖させたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／Ｅ４０培養物の上清で評価したタンパク質分解活性。サンプルは様々な発酵時間で採取する（Ａ：１２０ｈ；Ｂ：１４４ｈ；Ｃ：１６８ｈ）。活性は、時間（分、Ｘ軸）内に生成された相対蛍光単位（ｒｆｕ、Ｙ軸）として示す。
【図11】Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＥ４０産生。Ｅ４０発現誘導から５０時間又は９６時間後の組換えＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養物の上清で評価したタンパク質分解活性。活性は、時間（Ｘ軸；分）内の吸光度（Ｙ軸；ミリ吸光度単位、ｍａｕ）の増加として示す。ＡとＣ：それぞれｐＨ６でスクロースなし又は３４％スクロースありで増殖させた培養液からのサンプル；ＢとＤ：それぞれｐＨ７でスクロースなし又は３４％スクロースありで増殖させた培養液からのサンプル。
【図12】大腸菌のＥ４０産生。Ｅ４０を発現するように形質転換した大腸菌細胞から得られた粗抽出物において評価したタンパク質分解活性。本発明に従って増殖させたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／Ｅ４０培養物の上清のタンパク質分解活性を、比較のためにグラフで報告する。活性は、時間（分、Ｘ軸）内に生成された相対蛍光単位（ｒｆｕ、Ｙ軸）として示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
［発明の詳細な説明］
本発明は、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの成熟型を含む酵素調製物を製造する方法であって、以下を順番に含む方法に関する：組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞、好ましくはＴＫ２４株を、発酵条件下の培養液中で培養すること（前記組換え宿主細胞は、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの異種発現のための組換え発現ベクターを含む。前記組換え発現ベクターは、前記組換え宿主細胞における前記少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの発現を指示できる調節配列に作動可能に連結した、前記少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。）；培養液の上清を回収し、前記上清から、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの成熟型を含む酵素調製物を精製すること。
本発明は、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの成熟型を含む酵素調製物を製造する方法であって、以下を順番に含む方法に関する：組換えＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞、好ましくはＴＫ２４株を、発酵条件下の培養液中で培養すること（前記組換え宿主細胞は、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの異種発現のための組換え発現ベクターを含む。前記組換え発現ベクターは、前記組換え宿主細胞における前記少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの発現を指示できる調節配列に作動可能に連結した、前記少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。）；培養液の上清を回収し、前記上清から、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの成熟型を含む酵素調製物を精製すること。
【0025】
本発明の方法によって得られる酵素調製物中の少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、好ましくは以下からなる群から選択される：配列番号１を含む配列のエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）；Ｅ４０の生物活性断片；天然由来のＥ４０の対立遺伝子変異体；及び、配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼ。
【0026】
本明細書で使用される「酵素（又は酵素の）調製物」という用語は、本発明の方法の最後に得られる、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む（に富む）生成物を指す。前記生成物は、他の成分をさらに含む組成物であってもよい。
【0027】
「生物活性断片」という用語は、特定のグルテナーゼ活性を維持する本発明のエンドペプチダーゼの部分を指す。
【0028】
本発明によるエンドペプチダーゼの「生物活性断片」は、例えば、以下の通り同定できる：配列番号３又は４のエンドペプチダーゼ断片をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号５又は６のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド部分）を単離する；コードされたエンドペプチダーゼ断片を発現させ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換え発現による）、前記エンドペプチダーゼ断片がエンドペプチダーゼと同じグルテナーゼ活性を有するかを適切なアッセイによって確認する。適切なアッセイは例えば本実施例で開示した任意の酵素活性アッセイである。
【0029】
また本発明の方法は、遺伝暗号の縮重のために配列番号５又は６の配列のポリヌクレオチドによってコードされるのと同じエンドペプチダーゼをコードする、核酸配列の配列番号５又は６とは異なる配列を有するポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞内に導入することによって、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを含む酵素調製物を得ることを含む。
【0030】
本発明の方法によって得られるエンドペプチダーゼは、エンドペプチダーゼの生物活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含む配列を有することができる。「生物学的活性」とは、本明細書では、配列番号３の配列の天然Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの天然又は通常の機能であり、例えば、グルテンタンパク質を分解する能力である。
【0031】
本発明の方法は、配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列の少なくとも１つの組換えエンドペプチダーゼを含む酵素調製物を得ることを含む。ヌクレオチド又はアミノ酸配列に言及する場合の「同一性」及び「相同性」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が、比較する特定の領域において残基ごとに同一又は相同である度合いを示す。
【0032】
配列比較及び同一性又は相同性のパーセントは、当技術分野で公知の任意の適切なソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，１９８７，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０，Ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ ７．７．１）に記載のものである。
【0033】
好ましいプログラムとしては、ＧＣＧ Ｐｉｌｅｕｐ ｐｒｏｇｒａｍ、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｒ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８，８５，２４４４－２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｗ．，Ｌｉｐｍａｎ Ｄ．Ｊ．“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０）を挙げることができる。
【0034】
「対立遺伝子変異体」という用語は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の変化した形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は突然変異によって自然に発生し、集団内で表現型多型をもたらすことがある。遺伝子の変異は、サイレント（コードされたポリペプチドに変化がない）の場合もあれば、アミノ酸配列が変化したポリペプチドをコードする場合もある。対立遺伝子変異体という用語は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質も指す。
【0035】
本発明の方法によって得られる酵素調製物の少なくとも１つのエンドペプチダーゼは、別のポリペプチド、例えばタグと作動的に融合することもできる。好ましくは、本発明の方法によって得られる酵素調製物の少なくとも１つのエンドペプチダーゼはタグ付きエンドペプチダーゼ、より好ましくはヒスチジンタグ付きエンドペプチダーゼ、最も好ましくはタンパク質のＣ末端にタグが付いた、配列番号２を含む、又は配列番号２からなる配列のエンドペプチダーゼなどである。
【0036】
本発明の方法によって得られる酵素調製物の少なくとも１つのＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、ストレプトマイセス宿主細胞が発現したエンドペプチダーゼをプロセシングし、培養液中に成熟型で分泌することができるため、成熟型であることが注記される。例えば、天然Ｅ４０は配列番号３を有し、その成熟型は配列番号１を有する。
【0037】
本発明の方法に従ってＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞で産生される組換えエンドペプチダーゼとして、全コード配列（配列番号：３）を宿主細胞に導入したにもかかわらず、Ｅ４０は、配列番号１を含む、又は配列番号１からなる配列の成熟Ｅ４０として培養液中に分泌される。
【0038】
本発明の酵素調製物は、前記少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼに富むことが好ましく、より好ましくは、酵素調製物は、少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ以外のエンドペプチダーゼを含まない。例えば、酵素調製物は、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のエンドペプチダーゼを含まないことが好ましい。
【0039】
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞は、発酵条件下で、適切な培養液中で培養される。「発酵条件」とは、細胞株が増殖し、目的化合物（組換えエンドペプチダーゼ）を産生するのに適した宿主細胞株の培養条件（培養液組成、撹拌パラメータ、通気、及び温度）を意味する。
【0040】
特に、本発明の方法の発酵条件の培養液は、非動物由来の適切な栄養素、炭素源、窒素源及び無機塩を含み、少なくとも３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロース（すなわち、培養液１００ｍｌ当たり少なくとも３０ｇのスクロース）、好ましくは約３４％のスクロース（ｗｔ／ｖｏｌ）を含むことを特徴とする。
【0041】
本発明による発酵条件は、したがって、少なくとも３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）のスクロースを含む適切な培養液中で組換え宿主細胞を培養することを含む。組換え宿主細胞の発酵は、２５℃から３０℃、好ましくは２８℃から３０℃、より好ましくは約３０℃の温度で行われる。発酵は、好ましくは、培養液のｐＨが７超となるまで、及び／又は培養液中のグルコースが完全に消費されるまで、及び／又は培養液中に分泌された組換えタンパク質が、本明細書の実施例５に記載のように測定した上清１ｍＬ当たり８ａｕ／分より大きい活性を有するまで継続される。好ましくは、発酵は、次に続く精製のために培養液の上清を回収する前に、少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間継続される。
【0042】
好ましくは、培養液は、さらに酵母エキス及び大豆ペプトンを含む。本発明の方法に用いられる特に好ましい培養液は、スクロース（約３４０ｇ／Ｌ）、グルコース（約２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（約３ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（約５ｇ／Ｌ）、麦芽エキス（約３ｇ／Ｌ）を含み、ｐＨが約６．７の培養液Ｐである。
【0043】
好ましくは、本発明の方法は、組換え宿主細胞を発酵条件下で培養する工程の前に、グルコース、酵母エキス及び大豆ペプトンを含む第１培養液中で組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞の胞子懸濁液を約３０℃で３～７日間、好ましくは約４日間培養する第１工程を含む。より好ましくは、前記第１培養液は、グルコース（約２０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（約５ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（約１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（約１ｇ／Ｌ）を含む、ｐＨが約６．７の培養液Ｖである。
【0044】
好ましくは、組換え宿主細胞の選択のための培養液に適切な量の抗生物質を添加、好ましくはアプラマイシンを添加、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌを添加する。任意に、前記抗生物質は、宿主細胞を培養する第１段階の培養液にのみ添加し、発酵工程の培養液には添加しない。
【0045】
宿主細胞は、実験室又は工業用発酵槽で、小規模又は大規模な発酵により培養することができる。
【0046】
組換えエンドペプチダーゼは、培養液中に分泌されるため、培養液から直接回収することができる。組換えエンドペプチダーゼを含む培養液の上清は、例えば収集した培養液をさらに遠心分離するなどの当技術分野で公知の方法によって回収することができる。
【0047】
上清の回収に加え、本発明の方法は、好ましくは、前記上清から酵素調製物を精製する１以上の工程を含む。培養液は、例えば、微生物体を分離するために濾過し、次に、いくつかの手順（例えば、限外濾過、減圧下濃縮、塩析、有機溶媒による沈殿、透析、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、焦点電気泳動、及び凍結乾燥）の１つ以上の手段により濾液を処理し、組換えエンドペプチダーゼを回収することができる。
【0048】
好ましくは、本発明の方法の精製工程は、回収された上清からアフィニティクロマトグラフィーによって酵素調製物を精製する工程を少なくとも含む；より好ましくは、限外濾過の工程も含む；最も好ましくは、培養液の上清からの酵素調製物の精製は、以下の工程を連続して含む：上清を濾過すること（好ましくはペーパーフィルターを通して、及び／又は孔径公称値１．０μｍ～０．３μｍのカプセルフィルターを通して、目的の組換えエンドペプチダーゼを含む清澄化液を得る）；限外濾過によって清澄化液を濃縮すること；限外濾過した清澄化液のアフィニティクロマトグラフィー、好ましくは固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって酵素調製物を精製し、目的の組換えエンドペプチダーゼを含む（に富む）最終酵素調製物を得ること。
【0049】
好ましい実施形態では、精製はさらに以下を含む：アフィニティクロマトグラフィー溶出画分の色素除去（好ましくはＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーによる）、色素除去したサンプルの濃縮及び脱塩（好ましくは限外濾過による）により、目的の組換えエンドペプチダーゼを含む（に富む）最終酵素調製物を得ること。
【0050】
本発明による組換えエンドペプチダーゼの好ましい製造方法の代表的な例を、後述する実施例２～４及び１５に示す。
【0051】
好ましくは、目的のエンドペプチダーゼを発現させるために宿主細胞に導入される組換え発現ベクターは、配列番号１の配列のＥ４０又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは配列番号５又は配列番号６（それぞれ、配列番号３からなる配列を有するＥ４０、又は配列番号４からなる配列を有するＣ末端ヒスチジンタグ付きＥ４０をコードする）の配列のものである。またポリヌクレオチドは、配列番号５又は配列番号６に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列のものであってもよい。
【0052】
前記発現ベクターを含む組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞は、目的とするエンドペプチダーゼを産生し、その成熟型を培養液中に分泌することができる。例えば、配列番号３の配列のＥ４０の成熟型は、配列番号１の配列のエンドペプチダーゼであり、配列番号４のヒスチジンタグ付きＥ４０の成熟型は、配列番号２の配列のエンドペプチダーゼである。
【0053】
本発明の方法によるヒスチジンタグ付きエンドペプチダーゼ、例えばヒスチジンタグ付きＥ４０を含む酵素調製物の製造は、特に興味深い。したがって、好ましい実施形態においては、本発明は、組換え発現ベクターが、配列番号２を含む配列のヒスチジンタグ付きＥ４０をコードするポリヌクレオチド（好ましくは、ポリヌクレオチドが配列番号６の配列のもの）を含み、培養液の上清から精製した酵素調製物が、配列番号４の配列のヒスチジンタグ付きＥ４０の成熟型を含む、請求項１に係る方法に関する。
【0054】
好ましくは、本発明の方法で使用される組換え発現ベクターは、組換えｐＩＪ８６発現ベクターである。したがって、本発明は、配列番号５又は配列番号６を含む配列を有するポリペプチドを含む組換えｐＩＪ８６発現ベクターにも関し、好ましくは、配列番号８の配列を有する組換えｐＩＪ８６発現ベクターに関する。
【0055】
さらに本発明は、前記組換え発現ベクターを含む、組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞、好ましくはＴＫ２４株に関し、より好ましくは、前記宿主細胞は、本発明に従った本明細書に記載の通りに得られ、ブダペスト条約の規定に基づいて、ライプニッツ研究所ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ ７Ｂ ３８１２４、ドイツ、ブラウンシュワイク）に２０１９年７月１７日に寄託されたＤＳＭ ３３２０７株に関する。
【0056】
また、本発明は、本発明の方法によって得られる、グルテナーゼ活性を有する少なくとも１つの組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼの成熟型を含む酵素調製物に関する。
【0057】
好ましい実施形態では、酵素調製物は粉末状である。
好ましい実施形態では、酵素調製物に含まれる組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、培養液の上清から、又は培養液を精製した後に得られた酵素調製物から単離されたものである。次に本発明は、本発明の方法において組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞の培養液から回収された上清から、又は本発明の方法に従って精製工程後に得られた最終酵素調製物から得られた、単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼにも関する。
好ましい実施形態では、酵素調製物に含まれる組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、培養液の上清から、又は培養液を精製した後に得られた酵素調製物から単離されたものである。次に本発明は、本発明の方法において組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞の培養液から回収された上清から、又は本発明の方法に従って精製工程後に得られた最終酵素調製物から得られた、単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼにも関する。
【0058】
好ましくは、単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓは、以下からなる群から選択される：配列番号１を含む配列の組換えエンドペプチダーゼ４０（Ｅ４０）；Ｅ４０の生物活性断片；天然由来のＥ４０の対立遺伝子変異体；及び、配列番号１に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼ。より好ましくは、それは、配列番号１又は２からなる配列のエンドペプチダーゼであるか、又は配列番号１又は２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の同一性を有する配列のエンドペプチダーゼである。
【0059】
任意に、本発明の方法によって得られた酵素調製物は、精製後に、それを必要とする対象に直接経口投与することができる。好ましくは、酵素調製物又は単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、ヒトの使用に適した医薬製剤に処方される。
【0060】
したがって、本発明は、本発明の方法によって得られた酵素調製物又は単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをタンパク質分解活性成分として含む医薬製剤にも関する。
【0061】
好ましい医薬製剤は、その意図された投与経路に適合するものであり、本発明によれば、好ましくは、経口投与である。したがって、本発明の医薬製剤は、好ましくは、経口医薬製剤である。本発明による医薬製剤は、例えば溶液、エマルション等の液状製剤、又は錠剤、カプセル、半固体又は粉末等の固形製剤を作り出すために、適切な成分で調製することができる。本発明の酵素調製物の医薬製剤は、特に食材との混和に適したものを含め、様々な方法で投与することができる。
【0062】
医薬製剤中に存在するグルテナーゼ活性を有する組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、摂取前又は摂取中に活性化することができ、例えば適切なカプセル化によって、活性化のタイミングを制御するように処理することができる。
【0063】
本発明による適切な医薬製剤を調製するために、照射もしくは温度調節に基づくもの、又はそれらの組み合わせを含む、当該技術分野で知られている化学物質又は生物学的物質の安定化のための任意の方法を使用することができる。
【0064】
本発明の医薬製剤は、より好ましくは、胃液中に有効成分を放出するように製剤化される。この種の製剤は、例えば本発明の酵素調製物を、それを必要とする対象の胃内で放出することにより、適切な場所で最適な活性を提供することができる。
【0065】
また、本発明は、本発明の方法により得られた酵素調製物又は単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼをタンパク質分解活性成分として含有する食品又は食品サプリメントを含む。
【0066】
また、本発明の方法によって得られた酵素調製物又は単離された組換えエンドペプチダーゼは、本発明の分野に関する他の先行文献（ＷＯ２０１１／０７７３５９、ＷＯ２００３／０６８１７０、ＷＯ２００５１０７７８６）に記載の通り、食品添加物として調合し、調製、供給及び販売することが可能である。
【0067】
一例として、本発明の食品サプリメントは、食品成分と容易に混合することができる顆粒状の酵素コーティング又はアンコーティング製品であってもよい。あるいは、本発明の食品サプリメントはプレミックス成分を形成することができる。あるいは、本発明の食品サプリメントは、安定化液体、水性又は油性スラリーであってもよい。
【0068】
本発明の医薬組成物又は食品サプリメントは、本発明の酵素組成物のエンドプロテアーゼが、上部消化管の内腔で放出又は活性化され、エンドプロテアーゼが胃及び膵臓の酵素を補完して摂取されたグルテンを解毒し、有害ペプチドが腸細胞層を通過するのを防ぐために、食事前、食事の直前、食事中、又は食事の直後に提供することが可能である。
【0069】
酵素調製物は、食品として調合することもできる。好ましい実施形態では、前記食品は、グルテンを分解することができる、前記酵素調製物又は前記単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼと接触させた小麦粉である。
【0070】
あるいは、本発明の酵素調製物及び単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、食品及び／又は飲料用のタンパク質加水分解物の製造にも使用することができる。
【0071】
好ましくは、本発明の酵素調製物、単離された組換えＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ、医薬製剤、食品又は食品サプリメントは、セリアック病もしくはセリアック病に関連する障害、又は非セリアックグルテン過敏症、好ましくは配列番号６の配列のグリアジンペプチドに対する不耐性を伴う任意の障害の治療及び／又は予防において使用される。
【0072】
セリアック病に関連する疾患としては、以下が挙げられる：脂肪便症、疱疹状皮膚炎、セリアック病粘膜損傷、セリアック病粘膜損傷に起因する疾患（鉄欠乏性貧血、骨粗鬆症、１型糖尿病、自己免疫性甲状腺炎、及び腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫など）。
【0073】
さらに、グルテナーゼ活性を有するＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼは、ナッツ及び／又はピーナッツに対するアレルギー及び／又は不耐性を予防及び／又は治療することも可能である。したがって、本発明は、さらに前記用途に関する。
【0074】
セリアック病、セリアック病に関連する障害、非セリアックグルテン過敏症、及びナッツ及び／又はピーナッツに対するアレルギー又は不耐性からなる群から選択される障害は、したがって、任意に本発明の医薬製剤、食品又は食品サプリメントとして調合された、有効量の酵素調製物、又は単離されたＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼを、それを必要としている対象に投与することにより、より好ましくは経口投与により予防及び／又は治療することが可能である。
【0075】
したがって、さらに本発明は、セリアック病、セリアック病に関連する障害、非セリアックグルテン過敏症、及びナッツ及び／又はピーナッツに対するアレルギー又は不耐性からなる群から選択される障害を、それを必要とする対象に、本発明の酵素調製物もしくは本発明の単離Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓエンドペプチダーゼ、又は本発明の医薬製剤、食品もしくは食品サプリメントの有効量を投与することにより治療及び／又は予防する方法に関する。
【0076】
治療する患者や状態、及び投与経路に応じて、活性の量は、１日当たり体重１ｋｇ当たり組換えエンドペプチダーゼの０．０１ｍｇ～０．５ｍｇ（例えば、平均的なヒトでは２０ｍｇ／日程度）に相当する量とすることができる。
【0077】
患者におけるグルテナーゼの典型的な用量は、少なくとも約１ｍｇ／成人、一般的には、少なくとも約１０ｍｇ、そして好ましくは少なくとも約５０ｍｇである。通常、約５ｇ未満、一般的には、約１ｇ未満、そして好ましくは約５００ｍｇ未満となる。投与量は、小児用製剤として適切に調整される。小児の場合、有効量はより低いであろう。例えば、少なくとも約０．１ｍｇ、又は０．５ｍｇである。当業者であれば、用量レベルは、特定の酵素、重症度、及び副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に理解するであろう。
【実施例】
【0078】
実施例で使用した試薬
放線菌Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８株は、「Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｎｓｕｂｒｉｃｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃａ ｐｅｒ ｌａ Ｖｉｔａ」所蔵のものを使用した。Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）、及びＮ－スクシニル－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－７－アミノメチルクマリン（ｓｕｃ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣ）は、Ｂａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス）からのものである；ペプシン、トリプシン、ナリジクス酸、及びアプラミシンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミラノ、イタリア）からのものである；マンニトールは、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ（Ｃｏｒｎａｉｒｅｄｏ、イタリア）からのものである；大豆粉は、Ｃａｒｇｉｌｌ（パドバ、イタリア）からのものである；寒天と大豆ペプトンは、Ｃｏｎｄａ（マドリッド、スペイン）からのものである；スクロースとグルコースは、ＶＷＲ（ルーバン、ベルギー）からのものである；酵母とモルト抽出物は、それぞれＢＤ（フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）とＣｏｓｔａｎｔｉｎｏ（ファヴリア、ＴＯ、イタリア）からのものである；３３－ｍｅｒ ａ－グリアジンペプチドは、Ｂｉｏｔｅｍ（アプユー、フランス）が合成したものである；菌株Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４及び発現ベクターｐＩＪ８６は、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ノリッジ、ＵＫ）からのものである、出芽酵母型株Ｘ４００４－３Ａ（アクセッション番号：ＫＲ３４８９１４）は、Ｌ．Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ教授から提供されたものである。
放線菌Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８株は、「Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｉｎｓｕｂｒｉｃｏ ｄｉ Ｒｉｃｅｒｃａ ｐｅｒ ｌａ Ｖｉｔａ」所蔵のものを使用した。Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ ｐ－ニトロアニリド（ｓｕｃ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）、及びＮ－スクシニル－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－７－アミノメチルクマリン（ｓｕｃ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣ）は、Ｂａｃｈｅｍ（ブーベンドルフ、スイス）からのものである；ペプシン、トリプシン、ナリジクス酸、及びアプラミシンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミラノ、イタリア）からのものである；マンニトールは、Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ（Ｃｏｒｎａｉｒｅｄｏ、イタリア）からのものである；大豆粉は、Ｃａｒｇｉｌｌ（パドバ、イタリア）からのものである；寒天と大豆ペプトンは、Ｃｏｎｄａ（マドリッド、スペイン）からのものである；スクロースとグルコースは、ＶＷＲ（ルーバン、ベルギー）からのものである；酵母とモルト抽出物は、それぞれＢＤ（フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）とＣｏｓｔａｎｔｉｎｏ（ファヴリア、ＴＯ、イタリア）からのものである；３３－ｍｅｒ ａ－グリアジンペプチドは、Ｂｉｏｔｅｍ（アプユー、フランス）が合成したものである；菌株Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４及び発現ベクターｐＩＪ８６は、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ノリッジ、ＵＫ）からのものである、出芽酵母型株Ｘ４００４－３Ａ（アクセッション番号：ＫＲ３４８９１４）は、Ｌ．Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ教授から提供されたものである。
【0079】
実施例１：天然Ｅ４０の活性
ＷＯ２０１３／０８３３３８に記載の通り、土壌から単離したＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８培養物の上清画分から、配列番号３の配列の天然Ｅ４０を精製した（天然Ｅ４０）。天然Ｅ４０は、ｐＨ３～６の環境条件で顕著なグルテナーゼ活性を示し、最適はｐＨ５である（図１、パネルＡ）。この条件下では、グリアジンタンパク質は完全に消化される（図１、パネルＢ）。
ＷＯ２０１３／０８３３３８に記載の通り、土壌から単離したＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８培養物の上清画分から、配列番号３の配列の天然Ｅ４０を精製した（天然Ｅ４０）。天然Ｅ４０は、ｐＨ３～６の環境条件で顕著なグルテナーゼ活性を示し、最適はｐＨ５である（図１、パネルＡ）。この条件下では、グリアジンタンパク質は完全に消化される（図１、パネルＢ）。
【0080】
実施例２：ｐＩＪ８６発現ベクターでのＥ４０コーディング遺伝子のクローニング、及びＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４宿主細胞への導入
ヒスチジンタグ付きＥ４０をコードする配列番号６の配列のポリヌクレオチドを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ローダノ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）と０．５μＭのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９及び１０）を用いて、Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８ ゲノムＤＮＡから増幅させ、ポリヌクレオチド配列の５’及び３’末端に、ＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトを導入し、エンドペプチダーゼのＣ－末端に１つのグリシンと６つのヒスチジン残基を導入した。
ヒスチジンタグ付きＥ４０をコードする配列番号６の配列のポリヌクレオチドを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ローダノ、ＭＩ、Ｉｔａｌｙ）と０．５μＭのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：９及び１０）を用いて、Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８ ゲノムＤＮＡから増幅させ、ポリヌクレオチド配列の５’及び３’末端に、ＢｃｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトを導入し、エンドペプチダーゼのＣ－末端に１つのグリシンと６つのヒスチジン残基を導入した。
【0081】
ＰＣＲサイクル条件は以下の通りである：９８℃で３分、次いで９８℃で１０秒、６７℃で２０秒、７２℃で５０秒を１０サイクル、９８℃で１０秒、７２℃で７０秒を２０サイクル、最終伸長は７２℃で５分である。ＰＣＲ産物（配列番号：１１）をアガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｃｌＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＩＪ８６空ベクター（配列番号：７）中にライゲートして配列番号８の配列の組換えベクターｐＩＪ８６／ｅ４０を生成した（図２）。
【0082】
組換えベクターにＰＣＲで生じた変異がないことを、ＤＮＡシークエンスで評価した。強力なｅｒｍＥ構成的プロモーターの制御下で、配列番号６の配列のｅ４０を有するｐＩＪ８６／ｅ４０ベクターを、大腸菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２の形質転換に使用した。大腸菌ＥＴ１２５６７をドナー、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４（１７）をレシピエントとして用いて、Ｆｌｅｔｔら（１４）に従ってコンジュゲーションを行い、こうしてＥ４０コーディング遺伝子を有する組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４宿主細胞（Ｔ２４／ｐＩＪ８６／ｅ４０宿主細胞）を得た。
【0083】
この接合混合物（ｍａｔｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅ）を１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む複数のマンニトール大豆粉寒天プレート（マンニトール８ｇ／Ｌ、大豆粉８ｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、ＭＳ）に広げ、２８℃でインキュベートした。１６～２０時間後、５０μｇ／ｍｌナリジクス酸と３０μｇ／ｍｌアプラマイシンを含む蒸留水１ｍｌを各プレート表面に加え、ガラス棒を用いて広げ、さらに２８℃で接合完了体のコロニーが出現するまでインキュベートした。
【0084】
接合完了体を、ナリジクス酸とアプラマイシンを含むＭＳ寒天培地に繰り返しプレーティングした。Ｋｉｅｓｅｒら（１５）に従って調製した最終胞子懸濁液を２０％グリセロール中に－８０℃で保存した。
【0085】
実施例３：組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４によるＥ４０の発現
実施例２の組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０宿主細胞を、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを加えた培養液Ｖ（上記定義通り）２０ｍｌを含む三角フラスコ（５０ｍｌ）に接種し、３０℃で、回転シェーカー（２００ｒｐｍ）でインキュベートした。５日間培養した後、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した培養液Ｐ（上記の定義通り）１００ｍｌを含む１本の三角フラスコ（５００ｍｌ）に培養物を接種し、同じ条件で８日間培養した。
実施例２の組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０宿主細胞を、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを加えた培養液Ｖ（上記定義通り）２０ｍｌを含む三角フラスコ（５０ｍｌ）に接種し、３０℃で、回転シェーカー（２００ｒｐｍ）でインキュベートした。５日間培養した後、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した培養液Ｐ（上記の定義通り）１００ｍｌを含む１本の三角フラスコ（５００ｍｌ）に培養物を接種し、同じ条件で８日間培養した。
【0086】
あるいは、１５Ｌスケールの発酵のために、培養液Ｖで増殖させた５日間の培養物を、まず、培養液Ｖを１００ｍｌ含む５００ｍｌの三角フラスコ３本に接種し、同じ条件でインキュベートした。次に、７２時間後、フラスコ培養物を収集し、プールして、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを加えた培養液Ｐを１５Ｌ含む発酵槽（Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、ゲッティンゲン、ドイツ）に接種するために使用した。
【0087】
発酵は３０℃で４５０ｒｐｍの攪拌条件下で行い、１１０００ｇで６分間遠心分離後に得られた培養物の上清の酵素活性を測定することにより、組換えＥ４０の産生を経時的にモニターした。発酵は９４時間後、酵素活性が上清１ｍｌ当たり１４３０Ｕに達した時点で停止した（ここで用いた酵素活性アッセイについては実施例５を参照）。
【0088】
実施例４：Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０培養液の上清からの酵素調製物の精製
収集した実施例３のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０培養物を４１２０ｇで９０分間遠心分離し、回収した上清を集めて、Ｒａｐｉｄａ Ａ紙（Ｅｎｒｉｃｏ Ｂｒｕｎｏ、トリノ、イタリア）で濾過し、さらにポリエーテルスルホン オプティキャップカプセル（孔径公称値：１．０μｍ及び０．５μｍ）（Ｍｅｒｃｋ、ヴィモドローネ、イタリア）で２回清澄化した。
収集した実施例３のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０培養物を４１２０ｇで９０分間遠心分離し、回収した上清を集めて、Ｒａｐｉｄａ Ａ紙（Ｅｎｒｉｃｏ Ｂｒｕｎｏ、トリノ、イタリア）で濾過し、さらにポリエーテルスルホン オプティキャップカプセル（孔径公称値：１．０μｍ及び０．５μｍ）（Ｍｅｒｃｋ、ヴィモドローネ、イタリア）で２回清澄化した。
【0089】
次に、清澄化液をＰｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＴＦＦセルロースカセット（カットオフＭＷ公称値：１０ｋＤ）を用いた限外濾過システム（ＴＦＦ１）で１０倍に濃縮し、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ７．２に添加した。Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ミラノ、イタリア）を用いた固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により酵素を精製した。
【0090】
ＩＭＡＣカラムを５体積のリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、５体積の２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、溶出画分（３３０ｍｌ）をギ酸でｐＨ６．３に調整してＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で色素除去を行った。色素除去したサンプルは限外濾過システム（ＴＦＦ２、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ、カットオフＭＷ公称値：１０ｋＤ）により濃縮及び脱塩を行った。凍結乾燥前に、晶析プロセスを改善するために、サンプルにマンニトール及びトレハロース（それぞれ１５及び５ｍｇ／ｍｌ）を添加した（１６）。
【0091】
精製サンプルのタンパク質含量は６％（ＢＣＡアッセイで測定）、４１０００Ｕ／タンパク質（ｍｇ）、培養物の上清のタンパク質約８ｍｇ／ｍｌに相当した。
【0092】
精製プロセスの効率性は、組換えＥ４０が約４０ｋＤａのメインバンドに移動するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示された（図３、パネルＤ、レーン１、矢印）。４０ｋＤａのＳＤＳ－ＰＡＧＥバンドのＮ末端配列解析から、組換えＥ４０の予測される成熟型を確認した。
【0093】
実施例５：酵素調製物の酵素活性
酵素活性アッセイは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、メンネドルフ、ＣＨ）を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（透明、平底）中で行った。濃度範囲１０～５０ｎＭのＥ４０を含むサンプル２０マイクロリットルを３７℃で５分間プレインキュベートし、次いで、クエン酸リン酸緩衝液（０．１Ｍ クエン酸、０．２Ｍ リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ５）中の２２０μＭ ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ １８０μｌに添加した。サンプルは３７℃で２０分間インキュベートした。ｐＮＡは４１０ｎｍで検出し、５分間隔で読み取った。
酵素活性アッセイは、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、メンネドルフ、ＣＨ）を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（透明、平底）中で行った。濃度範囲１０～５０ｎＭのＥ４０を含むサンプル２０マイクロリットルを３７℃で５分間プレインキュベートし、次いで、クエン酸リン酸緩衝液（０．１Ｍ クエン酸、０．２Ｍ リン酸水素二ナトリウム、ｐＨ５）中の２２０μＭ ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ １８０μｌに添加した。サンプルは３７℃で２０分間インキュベートした。ｐＮＡは４１０ｎｍで検出し、５分間隔で読み取った。
【0094】
酵素活性は、時間内の吸光度の直線的な増加によって決定する。１活性単位（ＡＵ）は、１分間に任意の１吸光単位（ａａｕ）を放出できる酵素の量と定義され、「１分間に生成する任意の吸光単位」（ａａｕ／ｍ）として測定する：
【0095】
【数1】
【0096】
通常、５～１５’間隔で計算する（それぞれ、Ｔ１＝５分、及びＴ２＝１５分）。
【0097】
Ｅ４０の産生量を正しく評価するため、全てのサンプルは、時間とともに吸光度が直線的に増加するように希釈する必要がある。現行で使用するＥ４０産生株からの上清サンプルは１：４０で希釈している。
Ｅ４０の産生量は、上清のＡＵ／ｍＬとして表示される。
Ｅ４０の産生量は、上清のＡＵ／ｍＬとして表示される。
【0098】
下流のプロセスの全工程で得られたサンプルには同じＥ４０定量化を使用し、液体サンプル又は固体サンプルについてはそれぞれＡＵ／ｍＬ又はＡＵ／ｍｇで表示する。
【0099】
１Ｕｎｉｔ（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌｅのｐＮＡを放出する酵素量と定義される。本発明の評価条件：１μｍｏｌｅ当りのａｕ ｐＮＡ＝０．００６；１Ｕ＝ＡＵ／０．００６。サンプル活性は、１ｍｌ当りの酵素単位（上清サンプルの場合）又は固形物１ｍｇ当りの酵素単位（組換えＥ４０を含む最終粉末酵素調製物の場合）として表示した。
【0100】
最適ｐＨは、０．２Ｍクエン酸アンモニウムでｐＨ２に、又はクエン酸リン酸緩衝液でｐＨ３～８に調製した同じ基質をそれぞれ用いて決定した。
【0101】
ザイモグラフィ解析のために、Ｅ４０を含むサンプルをＴｅｔｒａ－ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ミラノ、イタリア）を用いて、１００Ｖで非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（１２％ ポリアクリルアミド）にかけた。ゲルはクエン酸－リン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で２回洗浄し、次いで、１００μＭのｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣを含む同じ緩衝液でインキュベートした。Ｅ４０の活性はＵＶ光で露光したゲル中で可視化した。
【0102】
またＥ４０のタンパク質分解活性は、ゼラチンを基質として用いて評価した。電気泳動後、ゲルをクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．０で洗浄し、そして同じ緩衝液で１０分間平衡化したザイモグラム１０％ゼラチンゲル（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に重ね合わせた。重ね合わせた２つのゲルを３７℃で２時間インキュベートした後、ゼラチンゲルをクマシーブリリアントＲ２５０で染色した。ゼラチン消化は、ゲル脱塩後、ＰＡゲルからザイモグラムゲルに拡散したプロテアーゼのタンパク質分解作用により、明確な溶解バンドとして可視化された。
【0103】
実施例３のフラスコで増殖させた培養物の上清の酵素活性のモニタリングにより、８日間の発酵まで、組換えＥ４０の安定的かつ継続的な産生が示された（図３、パネルＡ）。天然Ｅ４０と同様に、組換えＥ４０もｐＨ３～６の範囲で活性があり、ｐＨ５が最適であった（図３、パネルＢ）。ｐＨ５で行ったザイモグラフィ分析により、培養物の上清中、組換えＥ４０が唯一の活性タンパク質であることが示された（図３、パネルＣ）。
【0104】
また、組換えＥ４０は、実施例４で得られた精製した酵素調製物において、発色基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣ（図３、パネルＤ、レーン２）に対しても、またゼラチンなどの一般的なタンパク質基質（図３、パネルＤ、レーン３）に対しても、活性のある唯一のタンパク質である。すなわち、最終の精製した酵素調製物では、組換えＥ４０以外のあらゆるエンドプロテアーゼの存在が除外されている。
【0105】
組換えＥ４０酵素調製物を含む精製した酵素調製物の様々なｐＨ値における活性を、基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡを用いて、ｐＨ範囲２～８で評価した（図３、パネルＥ）。その結果、ｐＨ５で最大の活性を示し、ｐＨ３で有意な残存活性（約４０％）が維持された。これらの結果より、食後の胃の環境において１時間以上ｐＨが３を超えたとき、最適な作用が予測される（８、９）。
【0106】
興味深いことに、組換えＥ４０はｐＨ６でも有意に活性を維持しており（約５０％）、食後、ｐＨが６以下である十二指腸の領域で長時間作用することも示唆された（９）。概して、これらの結果は、Ｅ４０の天然型と組換え型が完全に類似していることを裏付けている。本発明による方法によって実施例４で得られた組換えＥ４０を含む精製した酵素調製物は、実際、Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ株から単離された天然Ｅ４０と同等の化学的／物理的性質及び生物活性を有する。
【0107】
実施例６：組換えＥ４０は消化プロテアーゼに耐性を示す。
本発明の方法で得られた組換えＥ４０の、胃（ペプシン）及び十二指腸（トリプシン）消化プロテアーゼのタンパク質分解活性に対する耐性を、ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡを基質として用いてさらに評価した（図４）。
本発明の方法で得られた組換えＥ４０の、胃（ペプシン）及び十二指腸（トリプシン）消化プロテアーゼのタンパク質分解活性に対する耐性を、ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡを基質として用いてさらに評価した（図４）。
【0108】
Ｅ４０酵素の水溶液［単独、又はペプシン及び／又はトリプシンと組み合わせたもの（０．２ｍｇ／ｍｌ Ｅ４０、０．１ｍｇ／ｍｌ ペプシン又はトリプシン）］を、ペプシンはｐＨ４、４．５、及び５、トリプシンはｐＨ６及び７で、ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡを含むクエン酸－リン酸緩衝液で希釈した。反応混合物の最終濃度：基質２００μＭ、ｐＨ４～５でのインキュベーションのＥ４０ １～４ｎＭ、ｐＨ６又は７でのインキュベーションのＥ４０ それぞれ４ｎＭと７ｎＭ（Ｅ４０濃度は最適ｐＨに応じて調整した）。消化プロテアーゼ対Ｅ４０は、１：２（ｗ／ｗ）の比率を維持した。
【0109】
反応（９６ウェルの平底マイクロタイタープレートに２００μｌ量）は、３７℃で１１０分間持続した。１０分ごとに吸光度を測定し、酵素活性を測定した。Ｅ４０を含まないペプシン及びトリプシンは、同じ方法で処理し、参照対照として同じ条件で試験した。各分析は二重に実施した。
【0110】
注目すべきことは、ペプシン（図４、パネルＡ～Ｃ）及びトリプシン（図４、パネルＤ～Ｅ、Ｅ’）のいずれも、発色基質を加水分解しないことである。特に、Ｅ４０切断活性は、ペプシン／トリプシン添加、又は酸性ｐＨの影響を受けなかった。それに対し、ペプシン存在下では、わずかに強化されたＥ４０活性が観察された（図４、パネルＡ～Ｃ）。おそらく、ペプシンによるＥ４０触媒部位の暴露が原因である。概して、これらの発見により、生理的条件下での、ヒトの主要な消化プロテアーゼに対するＥ４０の耐性が確認された。
【0111】
実施例７：Ｅ４０による免疫優性３３－ｍｅｒグリアジンペプチドの消化
３３－ｍｅｒグリアジンペプチドの分解を、組換えＥ４０による消化前（図５、パネルＡ）及び消化後（図５、パネルＢ～Ｅ）について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニターした。消化はＵ底９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。３３－ｍｅｒをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５）で５ｍｇ／ｍｌに希釈し、同じ緩衝液で希釈した組換えＥ４０を含む酵素調製物と混合し（酵素対基質のモル比１：４８）、３７℃にてインキュベートした。０分、１５分、３０分、及び６０分の時点でアリコート（１０μｌ）を採取し、３分間煮沸して反応を停止させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
３３－ｍｅｒグリアジンペプチドの分解を、組換えＥ４０による消化前（図５、パネルＡ）及び消化後（図５、パネルＢ～Ｅ）について、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによりモニターした。消化はＵ底９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。３３－ｍｅｒをクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５）で５ｍｇ／ｍｌに希釈し、同じ緩衝液で希釈した組換えＥ４０を含む酵素調製物と混合し（酵素対基質のモル比１：４８）、３７℃にてインキュベートした。０分、１５分、３０分、及び６０分の時点でアリコート（１０μｌ）を採取し、３分間煮沸して反応を停止させた後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
【0112】
サンプルは、ＵＶ検出器及びＬＴＱ－ＸＬイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンノゼ、ＣＡ）の両方と連結したＨＰＬＣシステムＡｃｃｅｌａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分析した。注目すべきことに、インキュベーションを開始するとすぐに３３－ｍｅｒのわずかな加水分解が観察された（図５、パネルＢ、０分）。天然３３－ｍｅｒペプチドのシグナルはわずか１５分後に完全に消滅した（図５、パネルＣ）。
【0113】
より具体的には、ＭＳ／ＭＳスペクトル解析は、Ｅ４０活性が３３ｍｅｒの免疫毒性配列をすべて分解したことを示した。Ｅ４０の切断部位はグリアジンのＦ－Ｐ残基とＱ－Ｌ残基の間に現れ、Ｔ細胞刺激能を持たない短いペプチドを導き出す（図５、Ｆ）（３）。この発見は、Ｅ４０をさらに希釈した濃度（１：９６、モル比）でも観察され、その場合、３３－ｍｅｒの完全な分解には３０分かかった（図示していない）。
【0114】
実施例８：Ｅ４０による全グリアジンの消化
全グリアジンタンパク質中の有害ペプチドを加水分解するＥ４０の能力を、ＨＰＬＣ分析によって評価した（図６）。グリアジンは、Ｍａｍｏｎｅら（４）に従って、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（サジッタリオ栽培品種）の全粒粉から抽出した。グリアジン（１ｍｇ）を、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）に溶解し、３７℃で、Ｅ４０酵素と共に（酵素：基質、１：２０）、様々な時間（０、１５、３０、６０、１２０、２４０分）インキュベートした。
全グリアジンタンパク質中の有害ペプチドを加水分解するＥ４０の能力を、ＨＰＬＣ分析によって評価した（図６）。グリアジンは、Ｍａｍｏｎｅら（４）に従って、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（サジッタリオ栽培品種）の全粒粉から抽出した。グリアジン（１ｍｇ）を、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）に溶解し、３７℃で、Ｅ４０酵素と共に（酵素：基質、１：２０）、様々な時間（０、１５、３０、６０、１２０、２４０分）インキュベートした。
【0115】
酵素的加水分解は、サンプルを５分間煮沸することで停止した。サンプルを凍結乾燥し、さらなる化学分析まで－４０℃で保存した。
【0116】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥはＴｅｔｒａ－ｃｅｌｌ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ミラノ、イタリア）を用いて実施した。消化したグリアジンサンプルをＬａｅｍｍｌｉ（レムリ）緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー）に溶解し、プレキャスト１２％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードした。電気泳動は、レムリ緩衝液中で、β－メルカプトエタノールを省いて、非還元条件下で実施した。
【0117】
タンパク質のバンドはシルバーブルー（クマシーブリリアントブルー Ｇ－２５０）で可視化し、ＬＡＢＳｃａｎスキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いてデジタル化した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、ＨＰ１１００ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ モジュラーシステム（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたＲＰ－ＨＰＬＣで実施した。消化したグリアジンサンプルを、０．１％ＴＦＡに懸濁し、Ｃ１８カラム（Ａｅｒｉｓ ＰＥＰＴＩＤＥ、３．６μｍ、２５０×２．１０ｍｍ ｉ．ｄ．、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トランス、ＣＡ、ＵＳＡ）で分離した。
【0118】
溶離液Ａは、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）のＭｉｌｌｉ－Ｑ水、溶離液Ｂは、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）のアセトニトリルとした。カラムを５％のＢで平衡化し、０．２ｍＬ／分の流速で９０分かけて５～７０％のＢの線形勾配を適用し、ペプチドを分離した。クロマトグラフ分離は、恒温カラムホルダーを用いて３７℃で行った。カラム溶出液を、ＵＶ－Ｖｉｓ検出器を用いて２２０ｎｍと２８０ｎｍでモニターした。
【0119】
全グリアジンが複合混合物であるため、組換えＥ４０を含む酵素調製物（１：４８、モル比）を用いた消化は、２４０分のインキュベーションまで延長した（図６、パネルＢ～Ｇ）。未消化のグリアジンサンプルを参照対照とした（図６、パネルＡ）。
【0120】
予想通り、α－、β－、及びγ－グリアジンのピークは、３０分後に著しく下がり（図６、パネルＣ）、Ｅ４０消化の６０分～１２０分の間に消失した（図６、パネルＤ及びＥ）ので、クロマトグラフプロファイルは大幅に変化した。１８０分と２４０分の消化物のプロファイル（図６、パネルＦとＧ）は類似しており、さらなる分解は生じないことを示す。
【0121】
実施例９：体液性及びＴ細胞性グルテンエピトープのＥ４０タンパク質分解
次に、組換えＥ４０酵素活性が、ｉ）グルテンタンパク質のＧ１２抗体結合能、及びｉｉ）ＩＦＮ－γ放出によって測定されるＴ細胞媒介免疫応答の刺激、を効果的に中和するかを評価した。この目的のために、グリアジンタンパク質を１ｍｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウムに懸濁し、Ｅ４０単独、又はＥ４０と消化管プロテアーゼであるペプシン及びトリプシン／キモトリプシンをコインキュベートして、様々なｐＨ及び時間で消化した。表１に詳細を示す。
次に、組換えＥ４０酵素活性が、ｉ）グルテンタンパク質のＧ１２抗体結合能、及びｉｉ）ＩＦＮ－γ放出によって測定されるＴ細胞媒介免疫応答の刺激、を効果的に中和するかを評価した。この目的のために、グリアジンタンパク質を１ｍｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウムに懸濁し、Ｅ４０単独、又はＥ４０と消化管プロテアーゼであるペプシン及びトリプシン／キモトリプシンをコインキュベートして、様々なｐＨ及び時間で消化した。表１に詳細を示す。
【0122】
【表1】
【0123】
すべての酵素を１：２０（酵素：タンパク質）の比率（ｗ／ｗ）で添加し、表示されたｐＨとインキュベーション時間で、３７℃でインキュベートした。Ｅ４０／ペプシン／キモトリプシン消化グリアジンを、上記の通りｔＴＧａｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で脱アミド化した（４）。簡単に説明すると、グリアジン酵素消化物（５００μｇ／ｍｌ）を、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中で、３７℃で２時間、２ＵのモルモットｔＴＧ（Ｔ－５３９８、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）と共にインキュベートした。
【0124】
小麦の免疫学的可能性に対するＥ４０消化の影響を推定するため、サンプルＡ～Ｌのグルテン含有量を、ＱＰＱＬＰＹ配列に特異的なモノクローナル抗体によって測定した（Ｅｌｉｓａ－Ｇ１２）（１０）。
【0125】
未処理のグリアジンサンプル（サンプルＩ及びＬ）と比較して、Ｅ４０消化サンプル（サンプルＡ～Ｈ）は、グルテン含量が２０ｐｐｍをはるかに下回り、大幅な減少を示した（表２）。
【0126】
【表2】
【0127】
Ｔ細胞応答を活性化するグリアジン調製物の能力を評価するために、ｔＴＧ処理によって脱アミド化した様々なグリアジン酵素消化物（図７Ａ及び７ＢのサンプルＡ～Ｌ）を、ＣＤ患者の腸生検から以前に確立したＣＤ４＋ Ｔ細胞系で評価した（１１）（表３）。
【0128】
【表3】
【0129】
簡単に説明すると、腸管単核細胞を、照射した自家末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と６倍体コムギから抽出した脱アミド化ペプシン－チモトリプシン消化グリアジンで刺激した。増殖したＴ細胞は、異種照射したＰＢＭＣとＰＨＡ、及び増殖因子としてのＩＬ－２で繰り返し刺激することにより培養を継続した。ＴＣＬのペプチド特異性は、免疫原性グルテンペプチドのパネルに対する反応性を試験することによって評価され、ペプチド認識の大きなレパトアが明らかになった。
【0130】
機能評価では、グリアジン酵素消化物（サンプルＡ～Ｌ、表１及び図７Ａ、Ｂ）に対するＴＣＬの免疫反応を、ＩＦＮ－γ産生の検出により評価した。Ｔ細胞（３×１０４）を、Ｕ底９６ウェルプレート中の２００μＬの完全培地（５％ヒト血清及びペニシリン－ストレプトマイシン抗生物質を添加したＸ－Ｖｉｖｏ１５；試薬はすべてＬｏｎｚａ－ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（ベルビエ、ベルギー）から供給された）中で、照射した自家ＥＢＶトランスフォーム、Ｂリンパ芽球様細胞株（Ｂ－ＬＣＬ、１×１０５）とコインキュベートした。
【0131】
４８時間培養後、細胞上清（５０μＬ）を回収し、ＩＦＮ－γを測定した。各抗原調製物は、各Ｔ細胞株について重複して評価され、少なくとも３つの独立した実験において、評価された。ＩＦＮ－γは、Ｍａｂｔｅｃｈ（Ｎａｃｋａ Ｓｔｒａｎｄ、スウェーデン）から購入したビオチン結合した精製抗ＩＦＮ－γ抗体を用いて、古典的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。このアッセイの感度は３２ｐｇ／ｍｌであった。
【0132】
予想された通り、ペプシン－キモトリプシン／トリプシン消化グリアジンに暴露すると、全てのＴ細胞株が高いレベルのＩＦＮ－を産生した（表１のサンプルＩ及びＬ、図７Ａ及び図７Ｂ）。反対に、実験したすべての実験条件において、Ｅ４０消化グリアジンに曝露したＴ細胞では、検出可能なＩＦＮ－産生は測定されなかった（表１のサンプルＡ～Ｈ、図７Ａ及び図７Ｂ）。
【0133】
実施例１０：グルテンベースの食品（パン）のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
患者のグルテン摂取を止めるための経口サプリメントとしてのＥ４０酵素の有効性を評価するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ経口胃消化モデルを適用した。パン（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）の消化工程は、口腔内咀嚼及び胃の消化酵素の存在を含む生理学的条件をシミュレートして実施された。
患者のグルテン摂取を止めるための経口サプリメントとしてのＥ４０酵素の有効性を評価するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ経口胃消化モデルを適用した。パン（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）の消化工程は、口腔内咀嚼及び胃の消化酵素の存在を含む生理学的条件をシミュレートして実施された。
【0134】
消化時間は、胃の区画における消化粥の平均通過時間に従って選択した。Ｅ４０酵素調製物は、シミュレートした胃の段階の開始時に添加した。Ｔ細胞エピトープと毒性ペプチドの破壊は、モノクローナル抗体（競争的Ｅｌｉｓａ－Ｒ５）を用いて、メーカー及びＡＯＡＣのガイドラインに従って試験した。
【0135】
Ｅ４０未処理のサンプルと比較して、Ｅ４０を含む消化されたパンのサンプルは、グルテン含量が２０ｐｐｍ未満をはるかに下回り、大幅な減少を示した（表４）。
【0136】
【表4】
【0137】
実施例１１：組換えＥ４０とインキュベートしたピーナッツタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ消化（１：２０、ｅ：ｓ）。
組換えＥ４０の存在下でインキュベートしたピーナッツタンパク質の分解を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析によって評価した。結果を図９に示す（Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｂ：ＨＰＬＣ分析）。
組換えＥ４０の存在下でインキュベートしたピーナッツタンパク質の分解を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析によって評価した。結果を図９に示す（Ａ：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｂ：ＨＰＬＣ分析）。
【0138】
実施例１２－組換えＥ４０のプロテオーム解析
本発明の方法に従ってＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓで得られた酵素調製物の詳細なプロテオーム解析も行った。酵素調製物のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ（図８）、その後、レーンを切り出し、トリプシンで消化し、そのペプチド混合物をＬＳ－ＭＳ／ＭＳで分析した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてマススペクトルを処理し、各ゲルのバンド内のタンパク質を同定した（表５）。
本発明の方法に従ってＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓで得られた酵素調製物の詳細なプロテオーム解析も行った。酵素調製物のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ（図８）、その後、レーンを切り出し、トリプシンで消化し、そのペプチド混合物をＬＳ－ＭＳ／ＭＳで分析した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてマススペクトルを処理し、各ゲルのバンド内のタンパク質を同定した（表５）。
【0139】
【表5】
【0140】
プロテオミクス解析により、組換えＥ４０タンパク質は約４５ｋＤａのメインバンドに移動することが確認された（図８、バンド４）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、強度は低いが、さらなるバンドの存在も明らかになった。これらのバンドは、精製過程で完全に除去されなかったＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓタンパク質に割り当てられた。これらの混入物の一部はプロテアーゼであるが、いずれもグルテナーゼの性質を有していないので、組換えＥ４０が最終酵素調製物中のグルテンに対して活性を持つ唯一のタンパク質であることが確認された。
【0141】
実施例１３：発酵及び下流のプロセス工程における、酵素調製物粉末の微生物学的アッセイ
周知のように、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４は、特に発酵条件下で増殖させた場合、アクチノロージン（ＡＣＴ）、ウンデシルプロジギオシン（ＵＤＰ）、及びカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）を産生する可能性がある。次に、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）により標準化された微量液体希釈法のアッセイを使用して、本発明の方法によって得られた酵素調製物からのサンプル中の抗生物質の存在を評価した。抗菌活性は、抗生物質耐性を示さないことが知られている下記の試験用微生物（試験用ｍｏ）に対して試験した：黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ６５３８（グラム＋の代表例）；大腸菌 Ｌ４７（Ｌｅｐｅｔｉｔコレクション；グラム－の代表例）；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ｌ１４５（Ｌｅｐｅｔｉｔコレクション；酵母の代表例）。
周知のように、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４は、特に発酵条件下で増殖させた場合、アクチノロージン（ＡＣＴ）、ウンデシルプロジギオシン（ＵＤＰ）、及びカルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）を産生する可能性がある。次に、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）により標準化された微量液体希釈法のアッセイを使用して、本発明の方法によって得られた酵素調製物からのサンプル中の抗生物質の存在を評価した。抗菌活性は、抗生物質耐性を示さないことが知られている下記の試験用微生物（試験用ｍｏ）に対して試験した：黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ６５３８（グラム＋の代表例）；大腸菌 Ｌ４７（Ｌｅｐｅｔｉｔコレクション；グラム－の代表例）；Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ Ｌ１４５（Ｌｅｐｅｔｉｔコレクション；酵母の代表例）。
【0142】
滅菌済み９６ウェルマイクロプレートに被検サンプルを２倍連続希釈し、次いで、それぞれの培養液に試験用ｍｏを接種した（最終量：１００μｌ／ウェル）。各測定は３連で行った。その後、接種したマイクロプレートを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓについて、それぞれ１８時間、２０時間、２４時間、３５℃でインキュベートした。「抗菌」濃度が不明のサンプルの抗菌活性は、終点、すなわち試験菌株の増殖を阻害する最高希釈度として測定した。それは、拡大鏡を活用してマイクロプレートを目視検査することによって決定した。
【0143】
アッセイ対照標準化合物を使用した：シプロフロキサシン（Ｇ＋とＧ－に対する活性）；ダプトマイシン（Ｇｒａｍ＋のみ）；アムホテリシンＢ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのみ）。さらに、発酵プロセスで使用するためアプラマイシン（Ｇ＋とＧ－）と、ニッケル樹脂からのＥ４０の溶出に使用できるイミダゾールも試験した。
【0144】
標準化合物は、０．３５ｍＭ～２５０ｍＭの濃度範囲で使用したイミダゾールを除き、１２８～０．１２５μｇ／ｍｌの濃度範囲で試験した。ＭＩＣ（最小阻止濃度）で表したこれらの抗菌活性を下記表６に示す。
【0145】
【表6】
【0146】
次に、３つのＥ４０酵素調製物粉末バッチ（Ｆ３０、Ｆ３４、及びＦ３５）の活性を検証した。分析した３つのバッチはすべて、試験した最高濃度（サンプル希釈度１：４、粉末最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに相当）では抗菌活性を示さず、酵素調製物中に抗生物質は存在しないことが示された。接種していない培養液（つまり、試験用ｍｏを含まない）中のＥ４０粉末サンプルを含む対照ウェルでは、微生物の増殖は見られなかった。
【0147】
本発明による１５ＬスケールのＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐＩＪ８６／ｅ４０の発酵を行って得られたサンプルの抗菌活性を、その後の精製工程を経てさらに試験した（表７～９）。
【0148】
【表7】
【0149】
【表8】
【0150】
【表9】
【0151】
収集（ＨＶ）培養物の上清（１７６６４ｇ、３０分間の遠心分離により得られた）は、大腸菌及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対してわずかな活性を示した。これは、その既知の活性パターンから予想されるように、ＵＤＰ（ウンデシルプロジギオシン）の存在と関連している可能性がある。ＩＭＡＣ溶出液のＥ１及びＤＥＡＥフロースルーが示した抗カンジダ活性は、確実にイミダゾールによるものである。ＩＭＡＣ溶出液の大腸菌に対する低い活性は、なお残留するＵＤＰの存在によると思われる。
【0152】
最終的な透析濾過したＴＦＦ２サンプルは、検出可能な抗菌活性がないという結果となった。アプラマイシンに関しては、産生培地に５０μｇ／ｍｌ添加し、そのＭＩＣ結果は黄色ブドウ球菌と大腸菌の両方に対して８μｇ／ｍｌであったが、培養物の収集時にはその存在は強調されていない。これは、おそらく酵素の作用による分解及び／又は変質によるものである。
【0153】
実施例１４：Ｅ４０酵素調製物及び下流の中間体中の二次代謝産物の存在試験
安全性評価のために、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４が産生する二次代謝産物の探索が極めて重要である。そのため、発酵上清及び製剤中の同定可能な分子を投与する必要がある。定量を目的として、ＡＣＴ、ＵＤＰ、ダプトマイシン（ＤＡＰ、ＣＤＡクラスに属する）の存在を評価する最適な手法としてＨＰＬＣ／ＭＳが選択された。固相（ＳＰＥ）技術による抗生物質の抽出は、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂を使用して適用され、より優れた定量分析が可能となった。
安全性評価のために、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４が産生する二次代謝産物の探索が極めて重要である。そのため、発酵上清及び製剤中の同定可能な分子を投与する必要がある。定量を目的として、ＡＣＴ、ＵＤＰ、ダプトマイシン（ＤＡＰ、ＣＤＡクラスに属する）の存在を評価する最適な手法としてＨＰＬＣ／ＭＳが選択された。固相（ＳＰＥ）技術による抗生物質の抽出は、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂を使用して適用され、より優れた定量分析が可能となった。
【0154】
Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ－２０は、通常、二次代謝産物、色素などの低分子を幅広い極性範囲で抽出するために使用される。典型的には、樹脂を水溶液と１：２０（ｖ／ｖ）の比率で２時間接触させた後、カラムに移し、洗浄し、水中メタノールの増加勾配で溶出する。溶出した抽出液は乾燥し、その後、ＨＰＬＣ／ＭＳで分析する。低分子化合物及び代謝物により適したカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、５μｍ、２．１ｘ２５０ｍｍ）を使用した。
【0155】
Ｅ１（５０％メタノール）、Ｅ２（１００％メタノール）、及びＥ３（メタノール／イソプロパノール ９０：１０）画分を回収する。Ｅ１とＥ２にはダプトマイシンが溶出され、一方、Ｅ２とＥ３にはウンデシルプロジギオシン（ＵＤＰ）が溶出される。ダプトマイシンの回収は定量であるが、ＵＤＰは樹脂、フィルター、及び膜に強固に結合する傾向があるため、回収は一部分（２０～２５％）であった。
【0156】
アプラマイシンはＨＰ－２０に結合しないため、アプラマイシンには、別の抽出方法を適用した。ＮＨ４型の弱陽イオン樹脂アンバーライトＩＲＣ５０を試験し、１回のカラム通過工程で、アプラマイシンが定量的に結合することが示された。その後、０．１Ｍ水酸化アンモニウムで溶出することにより、完全に回収した。
【0157】
Ｌｕｎａ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラムを初期設定として抽出サンプルに使用し、Ｂ相の勾配は３０分間で５から９０％、流速を１．０ｍｌ／分とした。
５０ｍｇの粉末のＥ４０酵素調製物（バッチＦ－３０、Ｆ－３４、Ｆ－３５）を用いた最終試験を完了し、以下の結果を得た（表１０）。
５０ｍｇの粉末のＥ４０酵素調製物（バッチＦ－３０、Ｆ－３４、Ｆ－３５）を用いた最終試験を完了し、以下の結果を得た（表１０）。
【0158】
【表10】
【0159】
これらのデータから、３つのＥ４０酵素調製物バッチ粉末のいずれにも、分析した抗生物質が測定可能な量では見つからないことが確認された。
【0160】
この方法論を適用して、発酵培養とその後の下流の精製工程における同じ抗生物質の検出をモニターした。Ｆ－４６と名付けた発酵培養物をこの目的のために設定した。発酵培養物は、本発明の方法の好ましい実施形態に従って、以下の精製工程を経た：
【0161】
１．ＨＶ－上清サンプルを回収するための遠心分離（１７６６４ｇ、３０’）
２．清澄化（オプティキャップＰＥＳカプセル；公称サイズ：１．０及び０．５ミクロン）
３．ＴＦＦ１濃縮（１０ｋＤカットオフ再生セルロースカセットを使用）
４．ＩＭＡＣ Ｎｉベースのアフィニティクロマトグラフィー
５．ＤＥＡＥ樹脂を用いたイオン交換による色素除去
６．ＴＦＦ２濃縮及び透析濾過（１０ｋＤカットオフ）
７．賦形剤添加後、凍結乾燥し、最終粉末を得る。
２．清澄化（オプティキャップＰＥＳカプセル；公称サイズ：１．０及び０．５ミクロン）
３．ＴＦＦ１濃縮（１０ｋＤカットオフ再生セルロースカセットを使用）
４．ＩＭＡＣ Ｎｉベースのアフィニティクロマトグラフィー
５．ＤＥＡＥ樹脂を用いたイオン交換による色素除去
６．ＴＦＦ２濃縮及び透析濾過（１０ｋＤカットオフ）
７．賦形剤添加後、凍結乾燥し、最終粉末を得る。
【0162】
各工程のサンプルをＨＰＬＣ－ＭＳで分析し、分子量で上記の抗生物質を調査した。少量を注入した（１２．５μｌ）。ＵＤＰのみが測定可能な量で検出された。他のものの痕跡は検出されなかった。
【0163】
ウンデシルプロジギオシン（ＵＤＰ）については、各工程での濃度をＨＰＬＣ－ＭＳで定量した（表１１）。予想通り、ＵＤＰは下流工程でうまく除去されている。
【0164】
【表11】
【0165】
結論として、本発明による方法によって得られた、Ｅ４０を含む酵素調製物粉末は、測定可能な量の抗生物質を含まない。
【0166】
実施例１５
本発明に従って、新たに２つの１５Ｌの発酵を行った。約４２時間インキュベートしたフラスコ内の種培養から開始した。Ｆ４７及びＦ４８と名付けた２つの培養物を、発酵条件下での９９時間及び９４時間後にそれぞれ収集した。収集した培養物を遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｊ－２－２１；ローター ＪＡ－１０；１００００ｒｐｍ／１７７００ｇ；１５分）と、紙による濾過にかけ、その後、上清を３段階（１μｍ濾過から開始し、０．３μｍ濾過まで）でミクロ濾過（清澄化工程）した。
本発明に従って、新たに２つの１５Ｌの発酵を行った。約４２時間インキュベートしたフラスコ内の種培養から開始した。Ｆ４７及びＦ４８と名付けた２つの培養物を、発酵条件下での９９時間及び９４時間後にそれぞれ収集した。収集した培養物を遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｊ－２－２１；ローター ＪＡ－１０；１００００ｒｐｍ／１７７００ｇ；１５分）と、紙による濾過にかけ、その後、上清を３段階（１μｍ濾過から開始し、０．３μｍ濾過まで）でミクロ濾過（清澄化工程）した。
【0167】
次いで、清澄化液の限外濾過（ＴＦＦ１）を行い、続いて限外濾過透過液のＩＭＡＣ－ニッケルアフィニティクロマトグラフィーを、上記のＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂を用いて実施した。その後、任意の工程のＤＥＡＥ陰イオン交換色素除去クロマトグラフィーを行い、以下の工程を続けた：ＩＭＡＣからの溶出画分をギ酸でｐＨ６．３に調整し、２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ６．３）で平衡化したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂカラムに移し、重量分析により回収した。少量用の限外濾過システム（ＴＦＦ２－透析濾過）を設定し（限界ＭＷ公称値：１０ｋＤ）、ＤＥＡＥからの溶出画分を限外濾過し、次に、ギ酸アンモニウム１０ｍＭ（ｐＨ６．３）で調製した脱塩溶液を分注し、残存したイミダゾールを除去した。
【0168】
溶液が濁り、遠心分離して沈殿を廃棄する必要がある場合がある。除去された固体は組換えＥ４０を含まない。これは、この工程で溶液をさらに希釈しておくことで回避できる。得られた最終的なＴＦＦ２溶液に、ＡＵ当り８マイクログラムの総量の糖に相当する３：１のマンニトール及びトレハロース溶液を添加し、凍結乾燥した。
【0169】
最終的な粉末の収量は１４３７ｍｇであった。最終粉末のサンプルを２０％ＥｔＯＨ水溶液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、酵素活性とタンパク質含有量を確認した後、ＳＤＳ－ｐａｇｅにかけた。
ＢＣＡ総タンパク質含有量アッセイでは、最終粉末のバッチで約１４％（添加した糖類を除くと１００％）である。
Ｅ４０の産生量は、上清で約２５ｍｇ／Ｌ（発酵量約２０ｍｇ／Ｌ）である。
ＢＣＡ総タンパク質含有量アッセイでは、最終粉末のバッチで約１４％（添加した糖類を除くと１００％）である。
Ｅ４０の産生量は、上清で約２５ｍｇ／Ｌ（発酵量約２０ｍｇ／Ｌ）である。
【0170】
上記調製物の微生物学的活性を、５ｍｇ／ｍｌの高濃度（ｄＨ２０中１０ｍｇ／ｍｌの原液）で、及び２倍連続希釈後に試験した。Ｆ４７／Ｆ４８（生成した粉末）の活性を表１２に示す：分析した試験用ｍｏのいずれに対しても、試験した最高濃度では活性を示さなかった。
【0171】
【表12】
【0172】
この結果から、最終的なＥ４０調製物には、検出可能な抗生物質が含まれないことが確認された。
【0173】
実施例１６
実施例２の組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０宿主細胞を、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した培養液Ｖ（上記）を１００ｍｌ含む三角フラスコ（５００ｍｌ）内に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで、回転シェーカー上でインキュベートした。４日間培養後、この培養物を用いて、スクロースを３４０ｇ／Ｌ（ｓｕｃ ３４）もしくは１７０ｇ／Ｌ（ｓｕｃ １７）含む、又はスクロースを含まない（ｓｕｃ ０）上記の培養液Ｐを１００ｍｌ含む３つの三角フラスコ（５００ｍｌ）にそれぞれ接種した。
実施例２の組換えＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４／ｐｌＪ８６／ｅ４０宿主細胞を、アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加した培養液Ｖ（上記）を１００ｍｌ含む三角フラスコ（５００ｍｌ）内に接種し、３０℃、２００ｒｐｍで、回転シェーカー上でインキュベートした。４日間培養後、この培養物を用いて、スクロースを３４０ｇ／Ｌ（ｓｕｃ ３４）もしくは１７０ｇ／Ｌ（ｓｕｃ １７）含む、又はスクロースを含まない（ｓｕｃ ０）上記の培養液Ｐを１００ｍｌ含む３つの三角フラスコ（５００ｍｌ）にそれぞれ接種した。
【0174】
すべてのフラスコにアプラマイシン５０ｍｇ／Ｌを添加し、回転シェーカーで、２００ｒｐｍ、３０℃で、最大７日間インキュベートした。Ｅ４０の産生は、１６，０００ｇで６分間の遠心分離により得られた培養物の上清の酵素活性を測定することにより、１２０時間の発酵後に１日１回モニターした。
【0175】
試験の直前にアッセイ緩衝液で１：８１に希釈した上清サンプルのタンパク質分解活性を、クエン酸０．１Ｍ－リン酸０．２Ｍ反応緩衝液（ｐＨ５）中の蛍光基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ－１４６５；２００μＭ）に対して、マイクロタイターウェルで評価した（総反応量２００μＬ中にサンプル２０μＬ）。インキュベーションは３７℃で３０分間行った。放出されたＡＭＣは、Ｆｕｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｔａｌｉａ ＳｐＡ、モンツァ、イタリア）を用いて、励起波長３６０ｎｍ、及び発光波長４６０ｎｍで測定した。タンパク質分解活性は、０～１５分の間隔で経時的に生成される相対蛍光単位の直線的な増加（ｒｆｕ／分）として決定した。結果を図１０に示す。
【0176】
Ｅ４０の産生への重大な影響は、図１０のパネルＡ～Ｃに示すように、発酵に使用した培養液中のスクロースの存在によってもたらされる。タンパク質分解活性は、３４％のスクロースを含む培養液Ｐで増殖させた培養物について明らかであるが、一方、スクロースを含まない培養液では実質的に存在しない。１７％のスクロースの存在下では、１６８時間の発酵後でさえ低い活性が示される。各サンプルについて結果を表１３に報告する（相対蛍光単位は、インキュベーション間隔０～１５分における１ｍＬ上清による１分当たり（ｒｆｕ／分／ｍＬ）で表す）。
【0177】
【表13】
【0178】
実施例１７
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）型株Ｘ４００４－３ＡをＥ４０の異種発現のための宿主として使用した。プロ酵素をコードする配列の有無が相違する２つの異なる合成Ｅ４０遺伝子を設計した。両方の遺伝子において、Ｅ４０の天然の分泌シグナル配列が、改変されたα－因子プレプロリーダー配列に置換された（２０）。
出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）型株Ｘ４００４－３ＡをＥ４０の異種発現のための宿主として使用した。プロ酵素をコードする配列の有無が相違する２つの異なる合成Ｅ４０遺伝子を設計した。両方の遺伝子において、Ｅ４０の天然の分泌シグナル配列が、改変されたα－因子プレプロリーダー配列に置換された（２０）。
【0179】
さらに、両方の合成遺伝子において、コドン最適化ツールのソフトウェアを使用して、コドン使用頻度を出芽酵母のものに準じて最適化した。また両遺伝子とも、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に対応する配列を追加した。得られた遺伝子［一方は不活性前駆体をコードし（ｐｒｏＥ４０、配列番号：１３）、もう一方は成熟酵素をコードする（ｍａｔＥ４０、配列番号：１４）］は、誘導型ｐＥＭＢＬ及び構成型ｐＶＴ－Ｕ発現プラスミドのいずれかにクローン化した。両者とも出芽酵母の栄養要求性選択のためにＵＲＡ３遺伝子を有しており（１９、２１）、エレクトロポレーション法によってＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ大腸菌細胞に導入された。
【0180】
形質転換体は、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地プレート（１００μｇ／ｍＬ）で、３７℃で一晩インキュベートして選択した。コンストラクトの正しさはシークエンシングで確認した。形質転換体は、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地プレート（１００μｇ／ｍＬ）で、３７℃で一晩インキュベートして選択した。ｐＥＭＢＬ／Ｅ４０及びｐＶＴ－Ｕ／Ｅ４０プラスミドは、酢酸リチウム法（Ｅｌｂｌｅ、１９９２）を使用して、宿主の出芽酵母株Ｘ４００４－３Ａに転移した。細胞を選択プレート（ウリジンを欠く培地）上にプレーティングし、３０℃で５～６日間インキュベートした。
【0181】
Ｅ４０遺伝子を含む出芽酵母クローンからの単一コロニーを選択プレートから選び、１００ｍｌの最小培地（０．６８％酵母窒素塩基、ＹＮＢ、２％グルコース、５０ｍｇ／Ｌのアミノ酸Ｌ－Ｌｙｓ－Ｌ－Ｍｅｔ－Ｌ－Ｔｒｐ、６７ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０）に接種した（３０℃、３日間）。
【0182】
アリコートの細胞を取り出し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．２５から開始する５００ｍＬフラスコ内の最小培地の最終体積５０ｍＬに接種した。ＯＤ６００ｎｍが０．５の値になるまで培養を行い（６時間）、次に８ｍＬを７２ｍＬの発現培地（ｐＶＴ－Ｕ／Ｅ４０プラスミドの場合は、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン、２％グルコース、又は、ｐＥＭＢＬ／Ｅ４０誘導型発現プラスミドの場合は、２％ガラクトース）を含む５００ｍＬフラスコ内に接種した（１０日間）。タンパク質発現試験では、細胞は３０℃で増殖させて、様々な時間に収集した。
【0183】
組換えＥ４０の発現は、合成基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡを使用する活性評価によって培養物の上清で確認した。ｐＨ５、３７℃でのインキュベーションの経過中、４１０ｎｍの吸光度を追跡した。酵素活性は、１ｍｌ当り１分間の吸光度単位（ａｕ）で表した。最大活性はプラスミドｐＶＴ－Ｕ／ｍａｔＥ４０で形質転換し、６日間増殖させた細胞の上清で検出された：０．９ａｕ／分／ｍＬの値が示された。
【0184】
４つのコンストラクトで形質転換した出芽酵母の並行した発酵試験を行ったところ、同様の発現レベル（０．７３ ΔＡｂｓ ｍｉｎ－１ｍＬ－１）となった。これらの結果に基づいて、様々な時間に採取したプラスミドｐＶＴ－Ｕ／ｍａｔＥ４０及びｐＥＭＢＬ／ｍａｔＥ４０で形質転換した細胞の上清についてウェスタンブロット分析を行った。
【0185】
ウェスタンブロット分析は、ｐＥＭＢＬ－ｍａｔＥ４０プラスミドを使用した場合、増殖６日後にタンパク質が発現し、ｐＶＴ－Ｕ／ｍａｔＥ４０プラスミドでは、３日後にタンパク質の発現が認められたことを示した。
【0186】
このように、出芽酵母は組換えＥ４０の産生株として使用することができる。しかし、得られた組換えＥ４０の発現量はあまり多くない（上清１ｍｌ当たり１ｍｇ未満のＥ４０）ため、現在、この産生システムは工業的利用には適していない。
【0187】
結論として、本発明の方法に従って組換えＥ４０をＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主細胞で発現させると、活性のあるＥ４０が分泌される。天然Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｍｕｒｕｓ Ａ８型のすべての化学的物理的特性及び生物学的特性（例えば、食後の胃のｐＨにおける安定性及び活性；ペプシン消化に対する耐性；Ｐｒｏ－Ｇｌｎに富む３３－ｍｅｒペプチド（配列番号：１２）などのα－グリアジンの最も免疫原性の高いペプチド、及び全グリアジンタンパク質の広範囲に及ぶ分解における高い効率性）は、組換えグルテナーゼによって維持される。
【0188】
このように、本発明の方法によって得られる酵素調製物は、大量の活性のある組換えＥ４０を提供し、さらにそれは抗生物質を実質的に含まない。したがって、ヒトの利用に適し、好ましくは、医薬製剤又は食品サプリメント等の適切な調合物とされた後、使用に適するものである。
【0189】
実施例１８
酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌を成功させるために、天然の成熟型（ｍａｔＥ４０、配列番号：１４）のＥ４０をコードする合成遺伝子を、発現ベクターにクローン化した。これは、メタノール誘導発現のためのＡＯＸ１プロモーター変異体（ｍｕｔＳ）と、出芽酵母由来のα－接合因子のＧｌｕ－Ａｌａ（ＥＡＥＡ）反復を含まないプレプロ配列（培養液中の分泌を誘導するためのもの）を有する。また、選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子もベクター内に存在した。
酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌を成功させるために、天然の成熟型（ｍａｔＥ４０、配列番号：１４）のＥ４０をコードする合成遺伝子を、発現ベクターにクローン化した。これは、メタノール誘導発現のためのＡＯＸ１プロモーター変異体（ｍｕｔＳ）と、出芽酵母由来のα－接合因子のＧｌｕ－Ａｌａ（ＥＡＥＡ）反復を含まないプレプロ配列（培養液中の分泌を誘導するためのもの）を有する。また、選択マーカーとしてゼオシン耐性遺伝子もベクター内に存在した。
【0190】
発現ベクターへの目的遺伝子の正しい導入は、制限パターン解析により確認し、遺伝子配列の信頼性はシークエンシングにより確認した（ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ベルリン、ドイツ）。
【0191】
約１μｇ／μＬの濃度で精製したプラスミドを用いて、ｍｕｔｓ及びｍｕｔｓ－ＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの過剰産生）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株への形質転換を行った。後者はタンパク質の正しい折り畳みを促進する。株ごとに数個のコロニー（Ｅ４０発現ベクターを有する２ ｍｕｔｓ及び２ ｍｕｔｓ－ＰＤＩ株、並びにそれぞれのｍｕｔｓ及びｍｕｔｓ－ＰＤＩ模倣株（ｍｏｃｋ ｓｔｒａｉｎ））を選び、複合培養液を満たした９６深ウェルプレートの単一ウェルに接種した。産生性評価は、メタノール誘導可能な条件下で、４つの異なる条件により行った：
【0192】
－ 複合培養液（ｐＨ６．０）
－ スクロース添加（最終濃度３４％）複合培養液（ｐＨ６．０）
－ 複合培養液（ｐＨ７．０）
－ スクロース添加（最終濃度３４％）複合培養液（ｐＨ７．０）
－ スクロース添加（最終濃度３４％）複合培養液（ｐＨ６．０）
－ 複合培養液（ｐＨ７．０）
－ スクロース添加（最終濃度３４％）複合培養液（ｐＨ７．０）
【0193】
バイオマスを生成する初期増殖段階の後、規定された濃度のメタノールを含む最適化された液体混合物を添加することで発現を誘導した。この時、標準物質として精製Ｅ４０を含む対照サンプルを、最終濃度２００ｇ／ｍＬで模倣株を含むいくつかのウェルに加えた。規定された時点で、さらにメタノールによる誘導を行った。
【0194】
サンプリングは、メタノール誘導時点から５０時間後及び９６時間後（工程終了）に行った。遠心分離後に得られた上清サンプルは、すぐに２０％ＥｔＯＨを含むように調整した。５０時間後のサンプルは、直接検査した９６時間後のサンプルと共に活性評価に供するために冷凍保存した。
【0195】
上清は不希釈のまま活性評価に供した。一方、Ｅ４０標準物質を加えた模倣株の上清の対照サンプルは、活性測定を行う前にアッセイ緩衝液で１：２０に希釈した。
【0196】
クエン酸０．１Ｍ－リン酸０．２Ｍ反応緩衝液（ｐＨ５）中の発色基質ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ Ｌ－１４００；２００μＭ）を用いて、マイクロタイタープレートで活性を評価した（総反応量２００μＬ中に、サンプル２０μＬ）。インキュベーションは３７℃で３０分間行った。タンパク質分解活性は、時間内の吸光度（波長４１０ｎｍで読み取り）の直線的な増加として決定し、１分当たりのミリ吸光単位（ｍａｕ／分）で表した。結果を図１１に示す。
【0197】
対照サンプル（図１１の５０ＣＴＲ及び９６ＣＴＲ）は、すべての条件及びバックグラウンドにおいて著しいタンパク質分解活性を示す（Ｅ４０濃度が８．３ｍｇ／Ｌの試験サンプルについて、５．３～６．０ミリ吸光単位／分）。一方、Ｅ４０濃度が≦０．１ｍｇ／Ｌに相当する他の培養物のいずれの上清サンプルでも吸光度は増加しない（＜０．０７ｍａｕ／分）。結果を表１４に報告する。
【0198】
【表14】
【0199】
実施例１９
大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）宿主細胞を、ＷＯ２０１３／０８３３３８に報告された通り、Ｅ４０配列を有する組換えｐＥＴ２８ｂ発現プラスミドで形質転換した。０．２μＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（Ｓｉｇｍａ）の添加により、形質転換細胞によるＥ４０の産生を誘導し、所望のタンパク質の発現を得た（ＷＯ２０１３／０８３３３８の図４参照）。
大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）宿主細胞を、ＷＯ２０１３／０８３３３８に報告された通り、Ｅ４０配列を有する組換えｐＥＴ２８ｂ発現プラスミドで形質転換した。０．２μＭイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（Ｓｉｇｍａ）の添加により、形質転換細胞によるＥ４０の産生を誘導し、所望のタンパク質の発現を得た（ＷＯ２０１３／０８３３３８の図４参照）。
【0200】
ＷＯ２０１３／０８３３３８に記載されているリゾチーム活性に基づく、自然の溶解のためのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコルに従って、組換えＥ４０を発現する大腸菌培養物５０ｍＬを溶解に供した。５０ｍＬの培養物からの全ペレットを８ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁した。基質 スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ＡＭＣに対するタンパク質分解活性（酢酸アンモニウム緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ；３７℃）について、溶解後に得られた粗抽出物を試験した。
【0201】
活性は、Ｅ４０産生大腸菌培養物１ｍＬが１分間に産生するｒｆｕとして表され、図１２に報告する。大腸菌で産生されたＥ４０の活性は、本発明による条件下でＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓで産生されたＥ４０について得られたものと比較して、非常に低い（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓでの「＞５３００ｒｆｕ／分／ｍＬ」と比較して、大腸菌では「５４ｒｆｕ／分／ｍＬ」である；図１２を参照）。
【0202】
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１１． Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｑｉａｏ，Ｓ．Ｗ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．，Ｋｏｎｉｎｇ，Ｆ．Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｇｌｕｔｅｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－ＤＱ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４，４５５－６０（２０１２）．
１２． Ａｎｎｅ，Ｊ．，Ｖｒａｎｃｋｅｎ，Ｋ．，Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ，Ｌ．，Ｖａｎ Ｉｍｐｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎａｅｒｔｓ，Ｋ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１８４３（８），１７５０-１７６１（２０１４）．
１３． Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ．５９，２４１－２５０（２０１３）．
１４． Ｆｌｅｔｔ，Ｆ．，Ｍｅｒｓｉｎｉａｓ，Ｖ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ＤＮＡ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５５，２２３－２２９（１９９７）．
１５． Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，２０００）．
１６． Ｊｅｎａ，Ｓ．，Ｓｕｒｙａｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．，Ａｋｓａｎ，Ａ．ｌ Ｍｕｔｕａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎｎｉｔｏｌ ａｎｄ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ Ｆｒｏｚｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．３３，１４１３－２５（２０１６）．
１７． Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ．“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０．
１８． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，Ａｎｄｒｅａｓ Ａｌｂｅｒｓｍｅｉｅｒ，Ｔｏｂｉａｓ Ｂｕｓｃｈｅ，Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｊａｅｎｉｃｋｅ，Ａｎｉｋａ Ｗｉｎｋｌｅｒ，ｏｌａｆｕｒ Ｈ．Ｆｒｉｔｈｊｏｎｓｓｏｎ，Ｇｕｔｈｍｕｎｄｕｒ Ｏｌｉ Ｈｒｅｇｇｖｉｔｈｓｓｏｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｄａｎｉｅｌ Ｂａｄｃｏｃｋ，Ｋｒｉｓｔｅｌ Ｂｅｒｎａｅｒｔｓ，Ｊｏｚｅｆ Ａｎｎｅ，Ａｎａｓｔａｓｓｉｏｓ Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｊｏｅｒｎ Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５（Ｖｏｌｕｍｅ １９９，Ｐａｇｅｓ ２１－２２）
１９． Ｃｅｓａｒｉｎｉ Ｇ， Ｍｕｒｒａｙ ＪＡＨ．Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｈａｇｅｓ．Ｉｎ：Ｓｅｔｌｏｗ ＪＫ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，ｐｐ．１３５－１５４．
２０． Ｔｏｎｉｎ Ｆ，Ｍｅｌｉｓ Ｒ，Ｃｏｒｄｅｓ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ａｍａｔ Ａ，Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ Ｌ， Ｒｏｓｉｎｉ Ｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌａｃｃａｓｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｕｓｅｓ．Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，３３：３８７－３９８．
２１． Ｖｅｒｎｅｔ Ｔ，Ｄｉｇｎａｒｄ Ｄ，Ｔｈｏｍａｓ ＤＹ．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｆ１ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ．Ｇｅｎｅ，１９８７，５２：２２５－２３３．
１． Ａｂａｄｉｅ，Ｖ．，Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｂａｒｒｅｉｒｏ，Ｌ．Ｂ．，Ｊａｂｒｉ，Ｂ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，４９３－５２５（２０１１）．
２． Ｗｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｇｌｕｔｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４，１１５－９（２００７）．
３． Ｈａｕｓｃｈ，Ｆ．，Ｓｈａｎ，Ｌ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｎ．Ａ．，Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｍ．，Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｌｉａｄｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８３，Ｇ９９６－１００３（２００２）．
４． Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．，Ｃａｍａｒｃａ，Ａ．，Ｍａｚｚａｒｅｌｌａ，Ｇ．，Ｄｉ Ｓｔａｓｉｏ，Ｌ．，Ｇｉａｒｄｕｌｌｏ，Ｎ．，Ｆｅｒｒａｎｔｉ，Ｐ．，Ｐｉｃａｒｉｅｌｌｏ，Ｇ．，Ｒｏｔｏｎｄｉ Ａｕｆｉｅｒｏ，Ｖ．，Ｐｉｃａｓｃｉａ，Ｓ．，Ｔｒｏｎｃｏｎｅ，Ｒ．，Ｐｏｇｎａ，Ｎ．，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ｓ．，Ｍａｍｏｎｅ，Ｇ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ－ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ ｗｈｅａｔ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ．Ｎｕｔｒ．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ．５９，１８４４－５４（２０１５）．
５． Ｓｈａｎ，Ｌ．，Ｍｏｌｂｅｒｇ，Ｏ．，Ｐａｒｒｏｔ，Ｉ．，Ｈａｕｓｃｈ，Ｆ．，Ｆｉｌｉｚ，Ｆ．，Ｇｒａｙ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｇｌｕｔｅｎ ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｓｐｒｕｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，２２７５－２２７９（２００２）．
６． Ｋｕｐｐｅｒ，Ｃ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２８，Ｓ１２１－７（２００５）．
７． Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｎｕｎｅｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｑｕｉｊａｎｏ，Ｍ．，Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｒａｎｌａｒｄ，Ｇ．，Ｉｇｒｅｊａｓ，Ｇ．Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｔｈｅ ｇｌｕｔｅｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，５６－７１（２０１８）．
８． Ｄｒｅｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｂｅｒａｒｄｉ，Ｒ．Ｒ．，Ｄｅｒｍｅｎｔｚｏｇｌｏｕ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｃｈｍａｌｔｚ，Ｓ．Ｐ．，Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｊａｒｖｅｎｐａａ，Ｋ．Ｍ．Ｕｐｐｅｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ（ＧＩ）ｐＨ ｉｎ ｙｏｕｎｇ，ｈｅａｌｔｈｙ ｍｅｎ ａｎｄ ｗｏｍｅｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７，７５６－６１（１９９０）．
９． Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｃｉｏｃｉｏｌａ，Ａ．Ａ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅａｌ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇａｓｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇａｓｔｒｉｃ ａｕｔｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２，４２７－３４（２００２）．
１０． Ｍｏｒｏｎ，Ｂ．，Ｃｅｂｏｌｌａ，Ａ．，Ｍａｎｙａｎｉ，Ｈ．，Ａｌｖａｒｅｚ－Ｍａｑｕｅｄａ，Ｍ．，Ｍｅｇｉａｓ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｍｄｅｌ，Ｃ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｏｕｓａ，Ｃ．Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａ ｍａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．８７，４０５－１４（２００８）．
１１． Ｓｏｌｌｉｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｑｉａｏ，Ｓ．Ｗ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｇｉａｎｆｒａｎｉ，Ｃ．，Ｋｏｎｉｎｇ，Ｆ．Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｇｌｕｔｅｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ－ＤＱ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ６４，４５５－６０（２０１２）．
１２． Ａｎｎｅ，Ｊ．，Ｖｒａｎｃｋｅｎ，Ｋ．，Ｖａｎ Ｍｅｌｌａｅｒｔ，Ｌ．，Ｖａｎ Ｉｍｐｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｂｅｒｎａｅｒｔｓ，Ｋ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１８４３（８），１７５０-１７６１（２０１４）．
１３． Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ，Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ．５９，２４１－２５０（２０１３）．
１４． Ｆｌｅｔｔ，Ｆ．，Ｍｅｒｓｉｎｉａｓ，Ｖ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｍｅｔｈｙｌ ＤＮＡ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５５，２２３－２２９（１９９７）．
１５． Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，２０００）．
１６． Ｊｅｎａ，Ｓ．，Ｓｕｒｙａｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．，Ａｋｓａｎ，Ａ．ｌ Ｍｕｔｕａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎｎｉｔｏｌ ａｎｄ Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ Ｆｒｏｚｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．３３，１４１３－２５（２０１６）．
１７． Ｋｒｉｅｇｌｅｒ Ｍ．“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０．
１８． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，Ａｎｄｒｅａｓ Ａｌｂｅｒｓｍｅｉｅｒ，Ｔｏｂｉａｓ Ｂｕｓｃｈｅ，Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｊａｅｎｉｃｋｅ，Ａｎｉｋａ Ｗｉｎｋｌｅｒ，ｏｌａｆｕｒ Ｈ．Ｆｒｉｔｈｊｏｎｓｓｏｎ，Ｇｕｔｈｍｕｎｄｕｒ Ｏｌｉ Ｈｒｅｇｇｖｉｔｈｓｓｏｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｄａｎｉｅｌ Ｂａｄｃｏｃｋ，Ｋｒｉｓｔｅｌ Ｂｅｒｎａｅｒｔｓ，Ｊｏｚｅｆ Ａｎｎｅ，Ａｎａｓｔａｓｓｉｏｓ Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｊｏｅｒｎ Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２４”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５（Ｖｏｌｕｍｅ １９９，Ｐａｇｅｓ ２１－２２）
１９． Ｃｅｓａｒｉｎｉ Ｇ， Ｍｕｒｒａｙ ＪＡＨ．Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｐｈａｇｅｓ．Ｉｎ：Ｓｅｔｌｏｗ ＪＫ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，ｐｐ．１３５－１５４．
２０． Ｔｏｎｉｎ Ｆ，Ｍｅｌｉｓ Ｒ，Ｃｏｒｄｅｓ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ａｍａｔ Ａ，Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ Ｌ， Ｒｏｓｉｎｉ Ｅ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌａｃｃａｓｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｕｓｅｓ．Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１６，３３：３８７－３９８．
２１． Ｖｅｒｎｅｔ Ｔ，Ｄｉｇｎａｒｄ Ｄ，Ｔｈｏｍａｓ ＤＹ．Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｆ１ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ．Ｇｅｎｅ，１９８７，５２：２２５－２３３．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】