特表 2022-542889 ドライアイ疾患のためのＴＳＧ６ポリペプチドフラグメント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】ドライアイ疾患のためのＴＳＧ６ポリペプチドフラグメント

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20220930BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 27/04 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 38/13 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 31/4725 20060101ALI20220930BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220930BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47

A61P27/02 ZNA

A61P27/04

A61K38/17

A61K38/13

A61K31/573

A61K31/4725

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022504600

(86)(22)【出願日】2020-06-23

(85)【翻訳文提出日】2022-03-24

(86)【国際出願番号】 EP2020067448

(87)【国際公開番号】W WO2021013452

(87)【国際公開日】2021-01-28

(31)【優先権主張番号】1910645.9

(32)【優先日】2019-07-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．Ｓｐａｎ

(71)【出願人】

【識別番号】505395858

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・マンチェスター

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＡＮＣＨＥＳＴＥＲ

(71)【出願人】

【識別番号】504314133

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】デイ，アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ミルナー，キャロライン

(72)【発明者】

【氏名】オウ，ジュ・ヨン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084MA17

4C084MA58

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC30

4C086DA10

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA58

4C086NA05

4C086ZA33

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、ドライアイ疾患の治療、特に、限定的ではないが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドによるドライアイ疾患の治療に関する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ドライアイ疾患などの眼表面障害の治療または予防における使用のための、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項2】

前記ドライアイ疾患などの眼表面障害の治療または予防が、
角膜上皮欠損の治癒、
涙液産生の増加、
炎症の抑制、および
より多数の結膜杯細胞からなる群から選択される１つ以上の効果を含む、請求項１に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項3】

前記治療が、眼へのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの局所投与を含む、請求項１または２に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項4】

前記治療が、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり２回投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項5】

前記治療が、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり４回未満投与することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項6】

前記ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドが、点眼薬として製剤化される、請求項３に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項7】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））または人工涙液のうちの１つ以上と同時投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項8】

約１０μｇ～２００μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドが、１眼当たりに投与され、好ましくは１２０μｇ～１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドが、１眼当たりに投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項9】

前記炎症の抑制が、角膜または眼窩内涙腺における１つ以上の炎症誘発性サイトカインの産生の減少を含み、前記炎症誘発性サイトカインが、任意選択でＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－１βから選択される、請求項２に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項10】

前記ドライアイ疾患の治療または予防が、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの投与前の前記角膜上皮欠損、涙液産生、炎症または結膜杯細胞の数と比較して、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制または結膜杯細胞の数の増加を含む、請求項２に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項11】

前記ドライアイ疾患の治療または予防が、全長ＴＳＧ－６タンパク質で治療された対照個体と比較した角膜上皮欠損、涙液産生、炎症または結膜杯細胞の数と比較して、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制または結膜杯細胞の数の増加を含む、請求項２に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項12】

治療される前記個体が、シェーグレン症候群を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項13】

前記治療が、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む点眼薬の前記投与を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項14】

前記ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドが、（ｉ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号７もしくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる、先行請求項のいずれか一項に記載の使用のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド。

【請求項15】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含む、点眼製剤。

【請求項16】

２４０μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌ、好ましくは２４００μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌを含む、請求項１５に記載の点眼製剤。

【請求項17】

プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））または人工涙液をさらに含む、請求項１５または１６に記載の点眼製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この出願は、２０１９年７月２５日に提出されたＧＢ１９１０６４５．９からの優先権を主張し、その内容および要素は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、眼表面障害の治療、特に、限定的ではないが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドによるドライアイ疾患の治療に関する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）刺激遺伝子６（ＴＳＧ－６）は、炎症性メディエーターおよび増殖因子に応答して発現する、ＴＮＦ刺激遺伝子－６の約３５ｋＤａ分泌産物である。

【0004】

いくつかの組織で構成的に発現している間、ＴＳＧ－６は、一般に炎症があるところならどこでも上方調節される。ほとんどの場合、ＴＳＧ－６は、抗炎症および組織保護特性を呈するが、例えば、肺の疾患病理に関与することもあるとされている。ＴＳＧ－６は、広範囲の細胞型によって作製されているが、炎症シグナルに応答して間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）によって産生され、免疫調節および修復活性の多くを仲介することがわかり、これは幅広い疾患モデルにわたるこの興味深い分子の治療効果に関する豊富な出版物につながった。

【0005】

ＴＳＧ－６は比較的小さなタンパク質であり、分子量はわずか約３５～３８ｋＤａで、主に２つのモジュールドメインで構成されている。ＴＳＧ－６のサイズを考えると、免疫および間質細胞の機能の調節、ならびに細胞外マトリックスの形成、力学およびリモデリングへの寄与を含む、驚くほど多くの活動がある。それは、マトリックス組織を調節し、マトリックス分子の細胞表面受容体および細胞外シグナル伝達因子（例えば、ケモカイン）との会合を制御するＴＳＧ－６の能力であり、その多様な機能レパートリーの根底にある可能性がある。この点で、ＴＳＧ－６は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、プロテオグリカン（ＰＧ）コアタンパク質および他のマトリックス成分などのリガンドの大きなアレイと相互作用し、複数のケモカインおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）に直接結合する。ＴＳＧ－６の特に珍しい機能の１つは、非硫酸化ＧＡＧヒアルロン酸（ＨＡ）のα－阻害剤間（ＩαＩ）ファミリーのプロテオグリカンからのいわゆる重鎖（ＨＣ）による共有結合修飾を触媒する酵素としての役割である。このプロセスは、ＴＳＧ－６のフラグメントのみを含むＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドではなく、全長ＴＳＧ６タンパク質によって媒介され、ＨＣ・ＨＡ複合体の形成をもたらし、哺乳動物の排卵および受精に不可欠であり、ＨＣ・ＨＡが組織保護を与えるか、または病理学的プロセスに寄与する他の多くの状況（例えば、炎症）にも発生する。

【0006】

ＴＳＧ－６発現の部位および状況、その構造およびリガンド結合特性、ならびにこれらが一緒に分子レベルでの多様な生物学および治療の可能性をどのように支持しているかについては、Ｄａｙ＆Ｍｉｌｎｅｒ（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１９）７８－７９，６０－８３）で概説されている。

【0007】

ＵＳ２０１５／００５７２２９は、軟骨の劣化を抑制することにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の使用について説明している。

【0008】

ドライアイ疾患（乾性角結膜炎としても知られている）は、最も一般的な眼疾患のうちの１つであり、世界中の人口の７％～３３％に発生する。これは、涙液膜および眼表面の多因子状態であり、涙液膜の浸透圧の増加および眼表面の炎症、神経栄養性欠損およびマイボーム腺機能不全を伴う。

【0009】

Ｋｉｍら（２０１６）（Ｃｏｒｎｅａ ３５（４），５３６－５４２）は、ドライアイを治療するために局所的に適用されたＴＳＧ－６、シクロスポリンおよびプレドニゾロンを比較した。１２週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウスに、組換えＴＳＧ－６（０．１％）を１日４回、０．０５％シクロスポリン（Ｒｅｓｔａｓｉｓ）を１日２回、または１％プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ Ｆｏｒｔｅ）を１日４回、１週間にわたって局所投与した。局所ＴＳＧ－６は、シクロスポリン点眼薬と同じくらい炎症を介したドライアイに効果的であることがわかった。しかしながら、彼らは、ＴＳＧ－６の臨床応用は、大規模産生の困難さまたは組換えタンパク質の安定性のばらつきを含む、様々な要因によって制限されていると結論付けている。

【0010】

ＷＯ２０１１／１３９３５７は、眼の傷害および疾患の治療のための成体幹細胞／前駆細胞および幹細胞タンパク質の使用を記載している。彼らは、ラットの角膜への化学熱傷後、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培地の適用が炎症および血行再建を低減したという発見に基づいた療法を提案している。彼らは、間葉系幹細胞によって発現されるＳＴＣ－１およびＴＳＧ－６などの抗アポトーシスおよび抗炎症タンパク質の使用を提案した。角膜表面の炎症は、エタノールの適用ならびに角膜および輪部上皮の機械的創面切除によってラットの眼に生じた。組換え全長ＴＳＧ－６の適用は、ＰＢＳ対照と比較して角膜混濁および血管新生の低減をもたらし、著者らは、傷害シグナルに応答してＭＳＣによって産生されるタンパク質は、角膜上皮前駆体の生存率および増殖を増加させることによって、また角膜表面の炎症を抑制することによって、角膜表面を損傷から保護することができると結論付けている。

【0011】

ＵＳ２０１６／００７５７５０（Ｐｒｏｃｋｏｐら）は、ヒアルロン酸、ヒアルロナンまたはそれらの塩の産生を抑制する少なくとも１つの薬剤を含む無タンパク質培地に懸濁した哺乳動物細胞において、ＴＳＧ－６タンパク質などのタンパク質またはポリペプチドを産生する方法を説明した。

【0012】

本発明は、上記の考察に照らして考案された。

【発明の概要】

【0013】

本開示は、ドライアイ疾患などの眼表面障害またはドライアイ疾患で観察されるものと同様の角膜病変を伴う他の眼表面障害の治療または予防に使用するためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドに関する。本発明者らは、このポリペプチドが、用量依存的に、ドライアイ疾患の徴候および症状を低減または予防することができることを発見した。驚くべきことに、本発明者らは、このポリペプチドが、全長ＴＳＧ－６よりも角膜上皮欠損を低減させるのにより強力であることを発見した。

【0014】

場合によっては、本明細書に記載されるドライアイ疾患の治療または予防は、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制、および結膜杯細胞の数の増加または維持からなる群から選択される１つ以上の効果を含む。炎症の抑制は、角膜、眼窩内涙腺、または角膜および眼窩内涙腺の両方における１つ以上の炎症誘発性サイトカイン、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－６およびＩＬ－１βから任意選択で選択される炎症誘発性サイトカインの産生の減少を含み得る。

【0015】

ドライアイ疾患の治療または予防は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの投与前の角膜上皮欠損、涙液産生、炎症または結膜杯細胞の数と比較して、かつＰＢＳビヒクルの投与と比較して、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制または結膜杯細胞の数の増加もしくは維持を含み得る。

【0016】

ドライアイ疾患の治療または予防は、全長ＴＳＧ－６タンパク質で治療された対照個体における角膜上皮欠損、涙液産生、炎症または結膜杯細胞の数と比較して、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制または結膜杯細胞の数の増加もしくは維持を含み得る。

【0017】

本明細書に記載されるいくつかの態様において、治療は、眼へのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの局所投与を含む。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、点眼薬として製剤化することができる。治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む点眼薬の投与を含み得る。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））、人工涙液、またはそれらの任意の組み合わせとともに製剤化され得るか、または治療が、それらとの同時投与を伴い得る。

【0018】

いくつかの態様において、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり２回投与することを含む。いくつかの態様において、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり２回より多く投与することを含む。場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり４回未満、または１日当たり３回未満投与することを含む。場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり１回投与することを含む。場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり１回よりも少ない頻度で、例えば、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、または２週間ごとに１回投与することを含む。

【0019】

治療は、１眼当たり１０～２００μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６、例えば、１眼当たり１００～２００μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６、１眼当たり１００～１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６、１眼当たり１２０～１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与を伴い得る。好ましくは、治療は、１眼当たり約１２０μｇ～１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド、または１眼当たり約１２～１５μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与を伴う。

【0020】

本明細書に開示されるドライアイ疾患などの眼表面障害の治療または予防は、任意の原因に関連するドライアイ疾患に適用可能である。治療を受けている個体は、シェーグレン症候群、リウマチ性関節炎または糖尿病などのドライアイ疾患の発生率の増加に関連する状態を有する可能性がある。場合によっては、個体は、１型糖尿病または２型糖尿病を有する。個体は、加齢、大気汚染への曝露、および／または視覚デバイス（例えば、スマートフォン、コンピュータ、タブレット）の使用の増加によるドライアイ疾患などの眼表面障害を発症するリスクがある可能性がある。

【0021】

治療は、（ｉ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号７もしくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの投与を伴い得る。

【0022】

ドライアイ疾患などの眼表面障害の治療または予防の方法もまた、本明細書に開示される。この方法は、治療有効量のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を、それを必要とする患者に投与することを伴い得る。眼へのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の局所投与を伴う場合がある。

【0023】

本明細書に開示される別の態様は、ドライアイ疾患などの眼表面障害の治療または予防のための医薬品の製造におけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの使用である。医薬品は、点眼薬などの眼への局所投与のために製剤化することができる。

【0024】

本明細書に開示されるさらなる態様は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含む薬学的組成物である。薬学的組成物は、生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。薬学的組成物は、リン酸緩衝生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、薬学的組成物は、少なくとも２０００μｇ／ｍｌ、２１００μｇ／ｍｌ、２２００μｇ／ｍｌ、２３００μｇ／ｍｌ ２４００μｇ／ｍｌ、２５００μｇ／ｍｌ、２６００μｇ／ｍｌ、２７００μｇ／ｍｌ、２８００μｇ／ｍｌ、２９００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、３１００μｇ／ｍｌ、３２００μｇ／ｍｌ、３３００μｇ／ｍｌまたは３３００μｇ／ｍｌ超のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、１３００μｇ／ｍｌ、１４００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌ、１７００μｇ／ｍｌ、１８００μｇ／ｍｌ １９００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、１３００μｇ／ｍｌ、１４００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌ、１７００μｇ／ｍｌ、１８００μｇ／ｍｌ １９００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。好ましくは、薬学的形成物は、少なくとも２０００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。そのような製剤は、１滴当たり約１２０μｇ～約１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を送達するのに役立つ。

【0025】

薬学的組成物は、点眼製剤であり得る。点眼製剤は、１５００μｇ／ｍｌ～３５００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌ、または２４００μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌを含み得る。好ましくは、点眼製剤は、約２４００μｇ／ｍｌ～約３０００μｇ／ｍｌを含む。場合によっては、点眼製剤は、少なくとも２２００、少なくとも２３００μｇ／ｍｌ、少なくとも２４００μｇ／ｍｌ、少なくとも２５００μｇ／ｍｌ、少なくとも２６００μｇ／ｍｌ、少なくとも２７００μｇ／ｍｌ、少なくとも２８００μｇ／ｍｌ、少なくとも２９００μｇ／ｍｌ、少なくとも３０００μｇ／ｍｌまたは３０００μｇ／ｍｌ超を含む。点眼製剤は、プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））または人工涙液をさらに含み得る。点眼製剤は、薬学的に許容される担体を含み得る。点眼製剤は、生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。点眼製剤は、リン酸緩衝生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。

【0026】

本発明は、そのような組み合わせが明らかに許容されないか、または明示的に回避される場合を除いて、記載された態様および好ましい特徴の組み合わせを含む。

【図面の簡単な説明】

【0027】

ここで、本発明の原理を説明する実施形態および実験について、以下の添付の図面を参照して説明する。

【図1-1】本開示に関連する配列。

【図1-2】本開示に関連する配列。

【図1-3】本開示に関連する配列。

【図1-4】本開示に関連する配列。

【図1-5】本開示に関連する配列。

【図1-6】本開示に関連する配列。

【図1-7】本開示に関連する配列。

【図2A】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ（過ヨウ素酸－シッフ染色）で染色された結膜切片における結膜杯細胞数。ＡおよびＢについて、有意性は、治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定、およびＰＢＳとＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６との比較のためのマン・ホイットニーＵ検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＣおよびＤについて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図2B】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ（過ヨウ素酸－シッフ染色）で染色された結膜切片における結膜杯細胞数。ＡおよびＢについて、有意性は、治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定、およびＰＢＳとＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６との比較のためのマン・ホイットニーＵ検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＣおよびＤについて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図2C】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ（過ヨウ素酸－シッフ染色）で染色された結膜切片における結膜杯細胞数。ＡおよびＢについて、有意性は、治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定、およびＰＢＳとＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６との比較のためのマン・ホイットニーＵ検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＣおよびＤについて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図2D】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ（過ヨウ素酸－シッフ染色）で染色された結膜切片における結膜杯細胞数。ＡおよびＢについて、有意性は、治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定、およびＰＢＳとＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６との比較のためのマン・ホイットニーＵ検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＣおよびＤについて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図3A】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、用量依存的にドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、角膜上皮欠損の低減に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、角膜上皮欠損を有意に改善しなかった。Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、両方とも涙液産生量の増加に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、涙液産生を有意に改善しなかった。Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析による炎症誘発性サイトカインの定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、ＴＮＦ－αの発現を抑制するのに最も効果的であった。ＡおよびＢにおいて、有意性は、ウィルコクソンの対応のある符号順位検定によって決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５。Ｃにおいて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図3B】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、用量依存的にドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、角膜上皮欠損の低減に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、角膜上皮欠損を有意に改善しなかった。Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、両方とも涙液産生量の増加に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、涙液産生を有意に改善しなかった。Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析による炎症誘発性サイトカインの定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、ＴＮＦ－αの発現を抑制するのに最も効果的であった。ＡおよびＢにおいて、有意性は、ウィルコクソンの対応のある符号順位検定によって決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５。Ｃにおいて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図3C】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、用量依存的にドライアイ疾患の徴候を低減する。Ａ．リサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、角膜上皮欠損の低減に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、角膜上皮欠損を有意に改善しなかった。Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、両方とも涙液産生量の増加に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、涙液産生を有意に改善しなかった。Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析による炎症誘発性サイトカインの定量化。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、ＴＮＦ－αの発現を抑制するのに最も効果的であった。ＡおよびＢにおいて、有意性は、ウィルコクソンの対応のある符号順位検定によって決定された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５。Ｃにおいて、有意性は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された。ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図4A】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の用量反応データ。Ａ．眼の染色によるリサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図4B】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の用量反応データ。Ａ．眼の染色によるリサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図4C】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の用量反応データ。Ａ．眼の染色によるリサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図4D】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の用量反応データ。Ａ．眼の染色によるリサミングリーン染色された角膜からの角膜上皮欠損の定量化、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｃ．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定された炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡレベル、Ｄ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図5A】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する上で、全長ヒト組換えＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）よりも効果的である。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．ＣＤ３細胞浸潤を伴う病巣の数によって表される、涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析。それぞれ１、０．１および０．０１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ならびに３．２７、０．３２７および０．０３２７μｇのＦＬ ＴＳＧ－６に対応する等モル用量（９２、９．２および０．９２ｐｍｏｌ）を比較する。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性。＊＝ｐ＜０．０５。

【図5B】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する上で、全長ヒト組換えＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）よりも効果的である。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．ＣＤ３細胞浸潤を伴う病巣の数によって表される、涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析。それぞれ１、０．１および０．０１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ならびに３．２７、０．３２７および０．０３２７μｇのＦＬ ＴＳＧ－６に対応する等モル用量（９２、９．２および０．９２ｐｍｏｌ）を比較する。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性。＊＝ｐ＜０．０５。

【図5C】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する上で、全長ヒト組換えＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）よりも効果的である。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．ＣＤ３細胞浸潤を伴う病巣の数によって表される、涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析。それぞれ１、０．１および０．０１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ならびに３．２７、０．３２７および０．０３２７μｇのＦＬ ＴＳＧ－６に対応する等モル用量（９２、９．２および０．９２ｐｍｏｌ）を比較する。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性。＊＝ｐ＜０．０５。

【図5D】ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ドライアイ疾患の徴候を低減する上で、全長ヒト組換えＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）よりも効果的である。Ａ．リサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．フェノールレッド綿糸試験によって決定された水性涙液産生、Ｃ．ＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．ＣＤ３細胞浸潤を伴う病巣の数によって表される、涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析。それぞれ１、０．１および０．０１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ならびに３．２７、０．３２７および０．０３２７μｇのＦＬ ＴＳＧ－６に対応する等モル用量（９２、９．２および０．９２ｐｍｏｌ）を比較する。一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定によって決定された有意性。＊＝ｐ＜０．０５。

【図6A】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6B】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6C】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6D】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6E】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図6F】乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。Ａ．乾燥傷害の誘発前および治療前の眼の染色、Ｂ．乾燥傷害後および治療後の眼の染色、Ｃ．乾燥傷害の誘発前および治療前の涙液産生、Ｄ．乾燥傷害後および治療後の涙液産生、Ｅ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１細胞、Ｆ．頸部リンパ節の排出におけるＴｈ１７細胞、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【図7A】すでに乾燥したマウスにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価。Ａ．眼の染色、Ｂ．涙液産生、Ｃ．治療後のＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．眼表面でのＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベル、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＡおよびＢ 治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定。ＣおよびＤ 一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図7B】すでに乾燥したマウスにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価。Ａ．眼の染色、Ｂ．涙液産生、Ｃ．治療後のＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．眼表面でのＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベル、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＡおよびＢ 治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定。ＣおよびＤ 一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図7C】すでに乾燥したマウスにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価。Ａ．眼の染色、Ｂ．涙液産生、Ｃ．治療後のＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．眼表面でのＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベル、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＡおよびＢ 治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定。ＣおよびＤ 一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図7D】すでに乾燥したマウスにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の評価。Ａ．眼の染色、Ｂ．涙液産生、Ｃ．治療後のＰＡＳ染色された結膜切片における結膜杯細胞数、Ｄ．眼表面でのＭＭＰ－９ ｍＲＮＡレベル、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。ＡおよびＢ 治療前と治療後との比較のためのウィルコクソンの対応のある符号順位検定。ＣおよびＤ 一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8A】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8B】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8C】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8D】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8E】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【図8F】ドライアイ疾患モデルにおけるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６およびＲｅｓｔａｓｉｓの比較。Ａ．治療前のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｂ．治療後のリサミングリーン染色後の眼の染色スコア、Ｃ．治療前のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｄ．治療後のフェノールレッド綿糸試験による水性涙液産生の定量化、Ｅ．治療後のＰＡＳ染色結膜切片における結膜杯細胞数。Ｆ．涙腺におけるＣＤ３免疫染色の組織学的分析、ｎｓ＝有意ではない、ｐ＞０．０５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定。

【発明を実施するための形態】

【0028】

ここで添付の図面を参照して、本発明の態様および実施形態について説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者に明らかとなるであろう。このテキストで言及されているすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0029】

本発明は、ドライアイ疾患などの眼表面障害を治療または予防するための方法を提供し、この方法は、対象にＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを投与することを含む。本発明者らは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、角膜上皮病変を低減し、ドライアイ疾患などの眼表面障害の徴候または症状を治療または低減することにおいて、組換えヒトＴＳＧ－６よりも強力であることを示した。理論に縛られることを望まないが、これは、組織への浸透の改善（分子のサイズが小さいため）、全長タンパク質と比較した生体内分布の差異、またはＣＵＢ＿Ｃドメインの影響を受けるシグナル伝達もしくは酵素活性の欠如の結果であり得る。この点で、前者の相互作用が協調的であるため（おそらく、ＣＵＢ＿Ｃドメインが関与する）、全長ＴＳＧ－６は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６よりも効果的にＨＡに結合する（Ｂａｒａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６，２５６７５－２５６８６）。ＨＡは、いくつかの抗炎症作用に関与している（Ｄａｙ ａｎｄ Ｍｉｌｎｅｒ ２０１９を参照）。

【0030】

ＴＳＧ－６（腫瘍壊死因子刺激遺伝子－６）
ＴＳＧ－６は、２つのモジュールドメインで構成される分泌タンパク質である。ＴＳＧ－６は通常、成体組織で構成的に発現されるのではなく、炎症性メディエーターに応答して誘発される。炎症の間、ＴＳＧ－６は組織の内因性保護剤である。ＭＳＣの免疫調節および組織保護効果の多くは、ＴＳＧ－６の分泌によって媒介される。

【0031】

組換え全長ＴＳＧ－６タンパク質は、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、肥大性瘢痕、大腸炎、自己免疫性糖尿病、リウマチ性関節炎、外傷性脳傷害または急性肺傷害などの幅広い疾患モデルにおいて、抗炎症および組織保護効果を有することが示されている。

【0032】

全長ＴＳＧ－６は作製が難しく、不溶性であり、凝集しやすい。本明細書に開示されるように、これらの不利な点は、ヒトＴＳＧ－６のＬＩＮＫモジュールを含む短い組換えペプチドであるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６に関連していない。この短いポリペプチドは、全長ＴＳＧ６よりも簡単に作製され、溶解性が高く、溶液中で安定している。

【0033】

本明細書に開示されるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、ヒトまたは哺乳動物のＴＳＧ－６のＬｉｎｋモジュールのみを含む。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ－６ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５によるアミノ酸配列を含むか、または本質的にそれからなる。Ｌｉｎｋモジュールは、配列番号２および５の残基３７～１２８に対応し、配列番号７に示されている。いくつかの好ましい態様において、本発明で有用なＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、Ｎ末端に配列番号２または５の全長ＴＳＧ６配列の残基１～３５の一部または全部を含まない。

【0034】

Ｌｉｎｋモジュールは、ヒアルロナン（ＨＡ）結合活性、コンドロイチン－４－硫酸結合活性、アグリカン結合活性、阻害剤間（ＩａＩ）結合活性、ビクニン結合活性、バーシカン結合活性、デルマタン硫酸結合活性、ペントラキシン－３結合活性、トロンボスポンジン－１結合活性、トロンボスポンジン－２結合活性、フィブロネクチン結合活性、ヘパリン／ヘパラン硫酸塩結合活性、ＴＳＧ－６のＲＡＮＫＬ結合活性、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－２結合活性、ＢＭＰ－４結合活性、ＢＭＰ－５結合活性、ＢＭＰ－６結合活性、ＢＭＰ－７結合活性、ＢＭＰ－１３結合活性、ＢＭＰ－１４結合活性、ＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性またはＣＬ２７結合活性を担っている。。

【0035】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ヒアルロナン（ＨＡ）結合活性、コンドロイチン－４－硫酸結合活性、アグリカン結合活性、阻害剤間（ＩａＩ）結合活性、ビクニン結合活性、バーシカン結合活性、デルマタン硫酸結合活性、ペントラキシン－３結合活性、トロンボスポンジン－１結合活性、トロンボスポンジン－２結合活性、フィブロネクチン結合活性、ヘパリン／ヘパラン硫酸塩結合活性、ＲＡＮＫＬ結合活性、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）－２結合活性、ＢＭＰ－４結合活性、ＢＭＰ－５結合活性、ＢＭＰ－６結合活性、ＢＭＰ－７結合活性、ＢＭＰ－１３結合活性、ＢＭＰ－１４結合活性、ＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性またはＣＬ２７結合活性のうちの１つ以上を呈するＴＳＧ－６のフラグメントであり得る。

【0036】

ＴＳＧ－６のＬＩＮＫドメイン（ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６）は、ＣＵＢ＿ＣドメインのＮ末端にある全長ＴＳＧ－６の領域である可能性がある。そのため、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６タンパク質は、ＣＵＢ＿Ｃドメインの全部または一部を欠いている可能性がある。

【0037】

ＬＩＮＫドメインは、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列を含み得る。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、（ｉ）配列番号７もしくは配列番号９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号７もしくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。

【0038】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、好ましくは、（ｉ）配列番号７もしくは９のアミノ酸配列、または（ｉｉ）配列番号７もしくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるポリペプチドである。

【0039】

したがって、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、以下を含み得る：
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬ結合活性を有するその変異体、あるいは
（ｃ）ＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性もしくはＣＬ２７結合活性を有する（ａ）または（ｂ）のいずれかのフラグメント。

【0040】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、配列番号７に示される配列からなるか、または本質的にそれからなる場合がある。

【0041】

配列番号９は、ＴＳＧ－６のＬｉｎｋモジュール（ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６）を含む組換えポリペプチドを示している。したがって、本発明で使用されるＴＳＧ－６ポリペプチドは、好ましくは以下を含み得る：
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有し、ＲＡＮＫＬ結合活性を有するその変異体、あるいは
（ｃ）ＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性もしくはＣＬ２７結合活性を有する（ａ）または（ｂ）のいずれかのフラグメント。

【0042】

ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、好ましくは配列番号９に示される配列からなるか、または本質的にそれからなる。

【0043】

本明細書に記載されるいくつかの態様において、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、抗体または抗原結合フラグメントなどの活性剤にコンジュゲートされていない。例えば、場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、ＩＬ－１７Ａ抗体またはそのフラグメントにコンジュゲートされていない。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、配列番号７または配列番号９の単一コピーなどのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの単一コピーを含むか、またはそれからなる。言い換えれば、これらの場合、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、配列番号７または配列番号９の複数のコピーなどの複数のＬＩＮＫモジュール配列を含まない。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、６ｘＨＩＳタグなどのＨｉｓタグを含まない。

【0044】

アミノ酸同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性の計算に使用することができる（例えば、デフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２，３８７－３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性または整列配列を計算することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０－３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－１０に記載されているように、同等または対応する配列を（通常はデフォルト設定で）同定する。

【0045】

ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から一般的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと整列したときに、何らかの正の値のしきい値スコアＴとマッチするか、または満たすクエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することによって、最初に高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコアしきい値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。各方向のワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその達成された最大値から数量Ｘだけ低下した場合、１つ以上の負のスコアリング残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の終わりに到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１０９１５－１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方のストランドの比較を使用する。

【0046】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列との比較における最小の合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列は別の配列と類似しているとみなされる。

【0047】

変異型配列は通常、少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上の変異（アミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入であり得る）によって異なる。例えば、１～５０、２～３０、３～２０または５～１０のアミノ酸置換、欠失または挿入を行うことができる。修飾ポリペプチドは、一般に、ＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性またはＣＣＬ２７結合活性を、好ましくは用量依存的に保持し得る。置換は、例えば以下の表により、好ましくは保存的置換である。第２の列の同じブロック、好ましくは第３の列の同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。

【表1】

【0048】

本発明で使用されるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、ＴＳＧ－６のＣＸＣＬ４結合活性、ＣＸＣＬ６結合活性、ＣＸＣＬ８結合活性、ＣＸＣＬ１１結合活性、ＣＸＣＬ１２結合活性、ＣＣＬ２結合活性、ＣＣＬ５結合活性、ＣＣＬ７結合活性、ＣＣＬ１９結合活性、ＣＣＬ２１結合活性またはＣＣＬ２７結合活性を保持する限り、典型的には少なくとも１０、例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０またはそれ以上のアミノ酸長、最大１００、１５０、２００または２５０アミノ酸長である。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号７に示される配列を含む。配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列のフラグメントは、好ましくは、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２２７６４－２２７７１およびＢｌｕｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９２６１－４９２７０においてヒアルロナン結合に必須であることが示される残基を含む。配列番号２または５のアミノ酸配列のフラグメントは、好ましくは、配列番号２または５の残基Ｌｙｓ－４６および／またはＴｙｒ－４７および／またはＴｙｒ－９４および／またはＰｈｅ－１０５および／またはＴｙｒ－１１３を含む。最も好ましくは、配列番号２または５のフラグメントは、配列番号２または５の残基Ｌｙｓ－４６、Ｔｙｒ－４７、Ｔｙｒ－９４、Ｐｈｅ－１０５およびＴｙｒ－１１３の各々を含む。

【0049】

配列番号７のアミノ酸配列のフラグメントを本発明で使用することができる。そのようなフラグメントは、好ましくは、配列番号７の残基Ｌｙｓ－１０および／またはＴｙｒ－１１および／またはＴｙｒ－５８および／またはＰｈｅ－６９および／またはＴｙｒ－７７を含む。最も好ましくは、配列番号７のフラグメントは、配列番号７の残基Ｌｙｓ－１０、Ｔｙｒ－１１、Ｔｙｒ－５８、Ｐｈｅ－６９およびＴｙｒ－７７の各々を含む。

【0050】

配列番号９のアミノ酸配列のフラグメントは、好ましくは、配列番号９の残基Ｌｙｓ－１１および／またはＴｙｒ－１２および／またはＴｙｒ－５９および／またはＰｈｅ－７０および／またはＴｙｒ－７８を含む。最も好ましくは、配列番号９のフラグメントは、配列番号９の残基Ｌｙｓ－１１、Ｔｙｒ－１２、Ｔｙｒ－５９、Ｐｈｅ－７０およびＴｙｒ－７８の各々を含む。

【0051】

本発明で使用されるＴＳＧ－６ポリペプチドは、化学的に修飾され得る、例えば、翻訳後に修飾され得る。例えば、それらは、グリコシル化され得るか、リン酸化され得るか、または修飾アミノ酸残基を含み得る。それらは、それらの精製を助けるためのヒスチジン残基の添加によって、または細胞膜への挿入を促進するための膜貫通配列の添加によって修飾され得る。そのような修飾ポリペプチドは、本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語の範囲内にある。

【0052】

ＴＳＧ－６ポリペプチドがＨＡ、コンドロイチン－４－硫酸塩、アグリカン、阻害剤間（ＩａＩ）、ビクニン、バーシカン、硫酸デルマタン、ペントラキシン－３、トロンボスポンジン－１、ヘパリン／ヘパラン硫酸塩、フィブロネクチンおよびＲＡＮＫＬに結合する能力を決定するための好適なアッセイは、当技術分野でよく知られている（Ｇｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，５１０６８－５１０７６、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，２７０４４－２７０５５、Ｓａｌｕｓｔｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１５７７－１５８６、Ｐａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０，４１３－４１７、Ｐａｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２８，１７１－１７６、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２２７６４－２２７７１、Ｎｅｎｔｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２１１，１５３５４－１５３６２、Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，３０８９９－３０９０８）、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２，２１７７－２１８５、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９１，１２６２７－１２６４０、およびＭａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２８３，２５９５２－２５９６２。

【0053】

本発明で使用するためのＴＳＧ－６ポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの意図された目的を妨害せず、それでも実質的に単離されているとみなされる担体または希釈剤と混合され得ることが理解されるであろう。本発明で使用するためのポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であり得、この場合、それは一般に、調製物中のポリペプチドを含み、調製物中５０重量％超、例えば、８０重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％超のポリペプチドが、本発明のポリペプチドである。

【0054】

本発明で使用するためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、天然または非天然に存在するポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、ＴＳＧ－６ポリペプチドを発現する任意の好適な生物から単離することができる。ＴＳＧ－６ポリペプチドは、ヒトまたは別の好適な哺乳動物、例えば霊長類、ラットもしくはマウスから単離することができる。あるいは、ＴＳＧ－６ポリペプチドは、魚または両生類から単離され得る。本発明で使用するためのポリペプチドはまた、そのような単離されたポリペプチドのフラグメントとして調製され得る。

【0055】

さらに、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドはまた、合成的または組換え的手段によって作製され得る。例えば、組換えＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、培養中の細胞を、好適な対照配列に作動可能に連結されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターでトランスフェクトし、細胞を培養し、細胞によって産生されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを抽出および精製することによって産生され得る。ポリペプチドの組換え産生のための方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３^ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。好ましくは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中で作製される。好ましくは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞または他の哺乳動物細胞では作製されない。当業者によって理解されるように、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌中で作製されたタンパク質およびポリペプチドは、グリコシル化を完全にまたは実質的に欠いているが、グリコシル化は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞で作製されるタンパク質およびポリペプチドの一般的な特徴である。特に、本開示によるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、Ａｓｎ１１８（配列番号２または配列番号５）上のＮ結合型グリコシル化を欠いている場合がある。

【0056】

本発明で使用するためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドのアミノ酸配列は、非天然に存在するアミノ酸を含むように、または化合物の安定性を高めるように修飾され得る。ポリペプチドが合成手段によって産生される場合、そのようなアミノ酸は、産生中に導入され得る。ポリペプチドはまた、合成または組換え産生のいずれかに続いて修飾され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、６Ｈｉｓタグなどのポリヒスチジンタグを含まない。いくつかの態様において、本明細書に記載されるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端にポリヒスチジンタグを含まない。

【0057】

本発明で使用するためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドはまた、Ｄ－アミノ酸を使用して産生され得る。そのような場合、アミノ酸は、ＣからＮの配向で逆の順序で連結される。これは、そのようなポリペプチドを産生するために当技術分野では慣習的である。

【0058】

いくつかの側鎖修飾が当技術分野で知られており、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドの側鎖に加えることができるが、但し、ポリペプチドが角膜欠損治癒活性を保持していることを条件とする。

【0059】

眼表面障害
本開示は、眼表面障害の治療または予防に関する。眼表面障害としては、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、糖尿病性角膜症に関連する持続性角膜上皮障害（非治癒性上皮欠損）、神経栄養性角膜症、露出角膜症または輪部欠損症、コンタクトレンズ／点眼薬により誘発される上皮びらん、眼移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、緑内障患者における眼表面機能不全、緑内障手術に起因する角膜創傷、再発性角膜びらん、表在性点状角膜炎、上輪部角結膜炎が挙げられる。

【0060】

ドライアイ疾患
本開示は、ドライアイ疾患の治療または予防に関する。ドライアイ疾患（ドライアイ症候群、または乾性角結膜炎としても知られている）は、ドライアイを有する状態であり、世界人口の７～３３％に影響を及ぼす。ドライアイ疾患は、涙液が十分に産生されない場合（水が不足しているドライアイ疾患）、または涙液が急速に蒸発する場合（蒸発性ドライアイ疾患）に発生する。原因としては、加齢（涙腺の萎縮および炎症を引き起こすことが知られている）、感染、煙などの環境刺激物への曝露、コンタクトレンズの使用、マイボーム腺機能不全、アレルギー、妊娠、シェーグレン症候群、ビタミンＡ欠乏症、レーザー眼科治療、または抗ヒスタミン薬、血圧薬、ホルモン補充療法、およびいくつかの抗うつ薬などの投薬の結果として、が挙げられる。場合によっては、ドライアイ疾患は、コンピュータモニター、スマートフォンもしくはタブレット、テレビまたは運転などの画面の使用など、まばたき率の低減に関連する活動から発生する。ドライアイ疾患は、眼の表面に小さな擦り傷（すなわち、角膜上皮の欠陥をもたらす可能性がある。ドライアイ疾患は、扁平上皮化生および杯細胞の喪失などの角膜上皮の病理学的変化をもたらす可能性があり、重症の場合、角膜びらん、潰瘍形成、血管新生および瘢痕化、または薄化および穿孔につながる。ドライアイ疾患の診断は、ドライアイ疾患に関連する症状およびそれらの視力への影響を評価するための１２項目スケールである、標準化されたドライアイ質問票（眼表面疾患指数、またはＯＳＤＩ）を伴う場合がある。

【0061】

ドライアイ疾患は、眼表面の乾燥傷害、または涙腺の炎症性損傷から生じる疾患である。それは、化学火傷または化学物質（アルコールなど）への眼表面の直接曝露から生じる外傷、物理的もしくは化学的デブリドマン、眼への鈍的外傷、貫通性眼傷害、または他の眼の創傷などの他の外傷誘発性眼障害とは臨床的に異なるが、これらの外傷によって誘発された眼の状態は、その後のドライアイ疾患の発症をもたらす可能性がある。

【0062】

ドライアイ疾患の徴候および症状としては、刺激、発赤、排出、眼が疲れやすい、かすみ眼が挙げられる。徴候および症状は、軽度で時折から重度で継続的なものまで様々であり、未治療で放置すると角膜の瘢痕化が生じる可能性がある。

【0063】

本明細書に開示されるように、ペプチドＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を使用して、ドライアイ疾患を治療または予防することができる。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与は、角膜上皮欠損の治癒、涙液産生の増加、炎症の抑制、および／または結膜杯細胞の数の増加／維持をもたらす可能性がある。角膜上皮欠損の治癒は、角膜上皮欠損の数または角膜上皮欠損のサイズの低減をもたらす可能性がある。好ましくは、角膜上皮欠損の治癒は、角膜上皮欠損を含む角膜表面の割合の低減をもたらす。

【0064】

角膜上皮欠損は、上皮（最も外側の角膜層）の喪失の領域であり、機械的外傷、角膜の乾燥、神経栄養性角膜、術後の変化、または任意の他の様々な病因に起因する可能性がある。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を使用して、角膜上皮欠損を低減または修復することができる。角膜上皮欠損の有無は、スコアリングによって決定することができる。角膜上皮欠損は、染色によって視覚化することができる。例えば、リサミングリーンまたはフルオレセイン染料の使用による。角膜に染色を施し、上皮欠損の領域を染色することによって、欠損を視覚化することができる。

【0065】

涙液産生の増加は、シルマー試験またはフェノールレッド綿糸試験によって決定することができる。

【0066】

結膜の杯細胞の数は、印象細胞診によって決定することができる。酢酸セルロース濾紙を結膜表面に押し付けて表層を収集し、ＰＡＳ染色を行ってムチン分泌杯細胞を染色する。杯細胞の数は、ＰＡＳ染色されたスライドで計算される。

【0067】

眼表面での炎症の有無または量は、結膜の発赤または結膜上皮欠損の観察によって決定することができる。炎症は、角膜および結膜上皮の破壊を引き起こす可能性がある。

【0068】

炎症性サイトカインのレベルは、患者からの涙液の試料で決定することができる。涙液試料は、シルマー涙液試験ストリップを使用して取得することができる。核酸および／またはタンパク質は、ストリップを重炭酸アンモニウムおよびアセトン中でインキュベートすることによって、涙液ストリップから抽出することができる。炎症性サイトカインのレベルは、ＲＴ－ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡによって定量化または定性化することができる。炎症性サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－６から選択することができる。場合によっては、炎症性サイトカインは、イムノアッセイによって定量化または定性化することができる。場合によっては、ＭＭＰ９のレベルは、ヒトの眼に「ＩｎｆｌａｍｍａＤｒｙ」キットを使用して、半定量的な方法（陽性、微量、または陰性）で決定される。

【0069】

角膜は、虹彩、瞳孔および前房を覆う眼の透明な前部である。

【0070】

前房およびレンズを備えた角膜は、光を屈折させ、角膜は眼の総屈折力のおよそ３分の２を占める。角膜は眼の合焦点力の大部分に寄与するが、その焦点は固定されている。角膜には、接触、温度および化学物質に敏感な無髄の神経末端を有し、角膜に触れると、不随意反射によって眼瞼が閉じる。透明性が最も重要であるため、健康な角膜には中に血管がないか、または必要ない。代わりに、酸素は涙液に溶け、次いで角膜全体に拡散し、角膜を健康に保つ。同様に、栄養素は、涙液から外面を通って拡散することによって輸送され、房水は、内面を通って輸送される。栄養素はまた、角膜の神経によって供給される神経栄養素を介して到来する。ヒトにおいて、角膜の直径は約１１．５ｍｍ、厚さは中心で０．５～０．６ｍｍ、周辺で０．６～０．８ｍｍである。透明性、無血管性、未熟な常在免疫細胞の存在、および免疫学的特権により、角膜は非常に特殊な組織になる。

【0071】

本明細書に開示される方法は、特に角膜上皮およびそれに対する損傷に関する。角膜上皮は、急速に増殖し、再生しやすい細胞の非常に薄い（およそ５０ｐｍ）多細胞上皮組織層（角質化していない重層扁平上皮）であり、涙液で湿った状態に保たれる。角膜上皮は、上皮細胞で構成されており、角膜の前面を覆っている。角膜を保護する最前線のバリアとして機能し、涙液からの液体の自由な流れに抵抗し、細菌が角膜および眼の内側に侵入するのを防ぐ。角膜上皮の不規則性または欠陥は、眼の総屈折力の最も重要な要素である空気／涙液膜界面の滑らかさを乱し、それによって視力を低減させる。それは結膜上皮と連続しており、露出層に絶えず流され、基底層で増殖することによって再生される約６層の細胞で構成されている。ドライアイ疾患では、角膜上皮が損傷することがよくある。

【0072】

いくつかの方法では、涙液産生が増加するか、または眼を覆う涙液膜の厚さが増加する。場合によっては、涙液保持が低下し、それにより涙液が眼からすぐに蒸発する。涙を流すこと（流涙または落涙としても知られる）は、外部または内部の刺激物に反応した涙液の反射分泌である。涙液は体液であり、刺激に反応して眼をきれいにし、潤滑するのに役立つ可能性がある。健康な哺乳動物の眼では、角膜は継続的に湿った状態に保たれ、基礎涙液によって栄養を与えられる。それらは眼を潤滑し、ほこりが入らないようにするのを助ける。涙液には、水、ムチン、脂質、リゾチーム、ラクトフェリン、リポカリン、ラクリチン、免疫グロブリン、グルコース、尿素、ナトリウム、およびカリウムが含まれている。涙液中の物質のうちのいくつか（リゾチームなど）は、免疫系の一部として細菌感染と戦う。リゾチームは、ある特定の細菌のペプチドグリカンと呼ばれる外側のコーティングの層を溶解することによってこれを行う。涙液は、血漿と同様の塩分を含む典型的な体液である。通常、２４時間の間に、０．７５～１．１グラム（０．０３～０．０４オンスの常衡）の涙が分泌され、この速度は年齢とともに遅くなる。さらに、基礎涙液は、アスコルビン酸塩、尿酸塩、システイン、グルタチオン、およびチロシンなどの抗酸化物質で構成されている。アスコルビン酸塩および尿酸塩は、涙液の半分を構成する。

【0073】

第２の種類の涙液は、異物による眼の刺激から、または眼神経のＴＲＰチャネルを誘発する、角膜、結膜、または鼻粘膜を含む眼の環境における玉ねぎの蒸散、香水および他の芳香、催涙ガス、または催涙スプレーなどの刺激物質の存在から生じる。それはまた、明るい光ならびに舌および口への熱い刺激またはコショウのような刺激で発生する可能性がある。また、嘔吐、咳およびあくびにも関連している。これらの反射涙液は、眼に接触した可能性のある刺激物を洗い流そうとする。

【0074】

本明細書に開示される方法は、基礎涙液または反射涙液などの涙液産生の維持または改善に関連し得る。

【0075】

患者の選択
本発明の方法によれば、方法は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含むかまたはそれからなる治療有効量のポリペプチドで治療するための対象を選択するステップを追加として含み得る。

【0076】

この方法は、角膜損傷（例えば、角膜上皮病変の存在）、不十分な涙液産生および炎症（例えば、発赤もしくは腫れ、または炎症誘発性サイトカインＴＮＦα、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γもしくはＩＬ－６およびＭＭＰ９のうちの１つ以上などの炎症の１つ以上の生物学的マーカーの存在）などのドライアイ疾患などの眼表面障害の証拠または感受性について、対象または患者を評価することを含み得る。

【0077】

この方法は、包括的な眼の検査を伴う場合がある。これには、患者の徴候および症状を判断し、ドライアイの問題の原因となる可能性のある任意の全身の健康問題、薬物療法、もしくは環境要因に注意するための病歴の評価、眼瞼の構造および瞬きのダイナミクスを含む、眼の外部検査、明るい光および拡大を使用した眼瞼および角膜の評価、または何らかの異常についての涙液の量および質の測定が含まれ得る。

【0078】

個体は、例えば、リサミングリーン、ローズベンガルまたはフルオレセイン染料で染色することにより、角膜上皮欠損を有すると判断され得る。

【0079】

個体は、例えばフェノールレッド綿糸試験またはシルマー試験を使用することにより、涙液産生が不十分であると判断される場合がある。

【0080】

本明細書に記載されるいくつかの場合において、治療される個体は、ドライアイ疾患などの眼表面障害の発生率の増加に関連する状態を有する。場合によっては、その状態は、自己免疫状態である。自己免疫状態は、シェーグレン症候群である可能性がある。個体は、以前にシェーグレン症候群を有すると診断されていた可能性がある。シェーグレン症候群は、涙腺および眼表面の炎症性破壊を特徴とする、ドライアイ疾患の最も重篤な形態のうちの１つを引き起こす。涙腺および眼表面の炎症は、ドライアイ疾患の重要な特徴であり、ドライアイ疾患およびシェーグレン症候群の病因において重要な役割を果たしている。場合によっては、自己免疫状態は、リウマチ性関節炎または糖尿病である。場合によっては、個体は、１型糖尿病または２型糖尿病を有する。

【0081】

場合によっては、ドライアイ疾患などの眼表面障害は、炎症を伴わない。炎症に関連しないドライアイ疾患は、涙液膜の不安定性および／または急速な涙液蒸発に関連している可能性がある。

【0082】

治療
本明細書に開示されるのは、ドライアイ疾患などの眼表面障害を治療または予防する方法である。この方法は、角膜上皮欠損もしくは病変の低減、涙液産生の増加、杯細胞の数の増加もしくは維持、１つ以上の炎症性サイトカインの発現の低減、または発赤、もしくは灼熱感、疼痛もしくは不快感の低減、または視力喪失もしくは視野のぼやけなどの視覚的徴候および症状の改善などの、ドライアイ疾患などの眼表面障害の１つ以上の視覚的徴候および症状の低減または消滅を伴い得る。

【0083】

この方法は、角膜上皮欠損または病変の治療または予防を伴い得る。この方法は、角膜上皮病変の数および／または程度の減少をもたらす可能性がある。この方法は、治療前の角膜上皮病変の数および／または程度と比較して、角膜上皮病変の数および／または程度の減少をもたらす可能性がある。この方法は、未治療の対照、あるいは配列番号３もしくは配列番号５を含むか、またはそれからなるＴＳＧ－６などの全長ＴＳＧ－６で治療された対照における角膜上皮病変の数および／または程度と比較して、角膜上皮病変の数および／または程度の減少をもたらす可能性がある。角膜上皮病変の程度は、対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも１００％低減し得る。治療により、角膜表面の０％、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満の角膜上皮病変が生じる可能性がある。

【0084】

この方法は、不十分な涙液産生の治療または予防を伴う場合がある。この方法は、涙液産生量の増加など、涙液産生の増加をもたらす可能性がある。この方法は、治療前の涙液の量と比較して、産生される涙液の量の増加をもたらす可能性がある。この方法は、未治療の対照、あるいは配列番号３もしくは配列番号５を含むか、またはそれからなるＴＳＧ－６などの全長ＴＳＧ－６で治療された対照における涙液の量と比較して、産生される涙液の量の増加をもたらす可能性がある。涙液の量は、対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％または１００％超増加し得る。

【0085】

この方法は、杯細胞の数を増加させるか、または維持することを伴い得る。この状況において、杯細胞の数を増加させるか、または維持することは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６による治療後の杯細胞の数が、未治療の対照などの治療なしで観察された減少と同じ程度に減少しないことを意味する。場合によっては、杯細胞の数は、治療前の杯細胞の数と比較して増加するか、または変化しない。

【0086】

この方法は、１つ以上の炎症性サイトカインのレベルの低減を伴う場合がある。例えば、この方法は、１つ以上の炎症性サイトカインに対応する核酸のレベルの低減をもたらす可能性がある。場合によっては、この方法は、炎症性サイトカインタンパク質のレベルの低減をもたらす。炎症性サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－１βから選択することができる。レベルは、治療前のレベルと比較して、または未治療の対照と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％減少する可能性がある。

【0087】

治療は、ドライアイ疾患などの眼表面障害の徴候および症状の完全解消をもたらし得る。

【0088】

予防とは、ドライアイ疾患などの眼表面障害の徴候および症状が現れないことを意味し得るか、またはドライアイ疾患などの眼表面障害の徴候および症状が治療なしの場合よりも発症が少ないことを意味し得る。

【0089】

本明細書に記載される方法は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の局所投与を伴い得る。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、眼に局所的に投与することができ（眼の送達）、好ましくは角膜、例えば角膜の表面に投与することができる。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、点眼薬として投与される。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、点眼薬などの局所用液体製剤として製剤化することができる。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、懸濁液または乳濁液によって製剤化することができる。

【0090】

投与は、好ましくは治療有効量で行われる。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の治療有効量は、様々なパラメーター、特にポリペプチド、治療を受ける患者の年齢、体重および状態、投与経路、ならびに必要なレジメンに従って決定され得る。この場合も、医師は特定の患者に必要な投与経路および投与量を決定することができる。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の治療有効量は、ドライアイ疾患などの眼表面障害の１つ以上の徴候および症状を改善する、例えば、角膜損傷もしくは角膜病変のレベルを低減する、涙腺機能を増加させる、または涙腺の涙液産生を増加させる、または角膜の炎症などの眼の炎症を低減するのに有効な量である。

【0091】

場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、１眼当たり１２μｇ～１５μｇ、例えば１０μｇ～２０μｇ、または１２～１５μｇで投与される。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、１眼当たり約８μｇ、１眼当たり約９μｇ、１眼当たり約１０μｇ、１眼当たり約１１μｇ、１眼当たり約１２μｇ、１眼当たり約１３μｇ、１眼当たり約１４μｇ、または１眼当たり約１５μｇで投与される。

【0092】

場合によっては、より高い用量が望まれる。そのような場合、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、１眼当たり約１２０μｇ～１５０μｇで投与される。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与量は、１眼当たり少なくとも８０μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも１１０μｇ、少なくとも１２０μｇ、少なくとも１３０μｇ、または少なくとも１４０μｇである。場合によっては、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与量は、１眼当たり１７０μｇ未満、１６０μｇ未満、１５０μｇ未満、１４０μｇ未満、１３０μｇ未満、または１２０μｇ未満である。

【0093】

場合によっては、さらに高い用量が望まれる。例えば、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与量は、少なくとも１７０μｇ、少なくとも１８０μｇ、少なくとも１９０μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２１０μｇ、少なくとも２２０μｇ、少なくとも２３０μｇ、少なくとも２４０μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも２６０μｇ、少なくとも２７０μｇ、少なくとも２８０μｇ、少なくとも２９０μｇ、少なくとも３００μｇ、少なくとも３２０μｇ、少なくとも３４０μｇ、少なくとも３６０μｇ、少なくとも３８０μｇ、少なくとも４００μｇ、少なくとも４２０μｇ、少なくとも４４０μｇ、少なくとも４６０μｇ、少なくとも４８０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも５５０μｇ、少なくとも６００μｇ、少なくとも６５０μｇ、少なくとも７００μｇ、少なくとも７５０μｇ、少なくとも８００μｇ、少なくとも９００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１．１ｍｇ、少なくとも１．２ｍｇ、少なくとも１．３ｍｇ、少なくとも１．４ｍｇ、少なくとも１．５ｍｇ、少なくとも１．６ｍｇ、または少なくとも１．７ｍｇであり得る。

【0094】

投与は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、または１日１０回超であり得る。投与は、好ましくは１日２回である。いくつかの好ましい場合において、投与は、１日２回超、例えば１日３回または４回である。いくつかの好ましい場合において、投与は、１日４回未満、または１日３回未満、または１日２回または１日１回である。特に好ましい場合、投与は１日２回である。場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり１回投与することを含む。場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを１日当たり１回よりも少ない頻度で、例えば、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間ごとに１回、または２週間ごとに１回投与することを含む。

【0095】

本発明のポリペプチドの投与の用量、スケジュール、様式または時間経過は、療法への反応に従って修正することができる。例えば、療法への反応が最適でない場合、用量および／または投与の頻度および／または投与の時間経過を増加させることができる。逆に、療法への反応が予想よりも良好である場合、用量および／または投与の頻度および／または投与の時間経過を低減することができる。

【0096】

場合によっては、治療は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の人工涙液、プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））、またはそれらの任意の組み合わせとの同時投与を伴う。投与は、順次または同時であってもよい。好ましくは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６がプレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））または人工涙液のうちの１つ以上と同時投与される場合、投与は同時または実質的に同時である。好ましくは、同時投与される薬剤は、例えば眼への局所投与によって同じ投与経路を介して投与される。

【0097】

ドライアイ疾患などの眼表面障害についての対象の評価は、治療有効量のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与前、投与中、または投与後の任意の時点で発生する可能性がある。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、投与を開始し、上記のように対象を評価し、評価に基づいて、さらなる投与を継続、変更または中止することを含む。いくつかの実施形態において、投与を変更することは、投与の用量および／または頻度および／または時間経過を増加または減少させることを含む。

【0098】

製剤
眼への投与に好適な製剤としては、活性化合物が好適な担体、特に活性化合物の水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼薬が含まれる。好ましい製剤では、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、生理食塩水に可溶化される。いくつかの製剤では、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に可溶化される。本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドが、全長ＴＳＧ６と比較して、生理食塩水に高い溶解性を有することを発見した。本明細書に記載されるのは、高濃度のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む組成物、特に薬学的組成物である。

【0099】

薬学的組成物は、生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。薬学的組成物は、リン酸緩衝生理食塩水に可溶化されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、薬学的組成物は、少なくとも２０００μｇ／ｍｌ、２１００μｇ／ｍｌ、２２００μｇ／ｍｌ、２３００μｇ／ｍｌ ２４００μｇ／ｍｌ、２５００μｇ／ｍｌ、２６００μｇ／ｍｌ、２７００μｇ／ｍｌ、２８００μｇ／ｍｌ、２９００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ、３１００μｇ／ｍｌ、３２００μｇ／ｍｌ、３３００μｇ／ｍｌまたは３３００μｇ／ｍｌ超のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。好ましくは、薬学的形成物は、少なくとも２０００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含む。

【0100】

本明細書に開示される点眼製剤は、防腐剤、抗酸化剤、安定剤、張性調整剤、粘度調整剤または緩衝剤のうちの１つ以上をさらに含み得る。好ましくは、点眼製剤は、無菌の点眼製剤である。場合によっては、点眼製剤は、約２４０μｇ／ｍｌ～約３００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含有する。そのような製剤は、１滴当たり約１２μｇ～約１５μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を送達するのに役立つ。各液滴は、約５０μｌであり得る。点眼製剤は、２００μｇ／ｍｌ～３５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ～３２０μｇ／ｍｌ、２２０μｇ／ｍｌ～３２０μｇ／ｍｌ、または２４０μｇ／ｍｌ～３００μｇ／ｍｌを含み得る。好ましくは、点眼製剤は、約２４０μｇ／ｍｌ～約３００μｇ／ｍｌを含む。点眼製剤は、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２３０μｇ／ｍｌ、少なくとも２４０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２６０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７０μｇ／ｍｌ、少なくとも２８０μｇ／ｍｌ、少なくとも２９０μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３１０μｇ／ｍｌ、少なくとも３２０μｇ／ｍｌ、または３２０μｇ／ｍｌ超のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含有し得る。

【0101】

場合によっては、より高用量の製剤が望まれる。そのような製剤は、２４００～３０００μｇ／ｍｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を含有する場合がある。そのような製剤は、１滴当たり約１２０μｇ～約１５０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を送達するのに役立つ。点眼製剤は、２０００μｇ／ｍｌ～３５００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ～３２００μｇ／ｍｌ、２２００μｇ／ｍｌ～３２００μｇ／ｍｌ、または２４００μｇ／ｍｌ～３０００μｇ／ｍｌを含み得る。好ましくは、点眼製剤は、約２４００μｇ／ｍｌ～約３０００μｇ／ｍｌを含む。点眼製剤は、少なくとも２０００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２３００μｇ／ｍｌ、少なくとも２４００μｇ／ｍｌ、少なくとも２５００μｇ／ｍｌ、少なくとも２６００μｇ／ｍｌ、少なくとも２７００μｇ／ｍｌ、少なくとも２８００μｇ／ｍｌ、少なくとも２９００μｇ／ｍｌ、少なくとも３０００μｇ／ｍｌ、少なくとも３１００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２００μｇ／ｍｌ、または３２００μｇ／ｍｌ超のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドを含有し得る。

【0102】

場合によっては、点眼製剤は、人工涙液をさらに含み得る。人工涙液は、潤滑点眼薬である。人工涙液は、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒアルロン酸、水、塩、およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールなどのポリマーから選択される１つ以上の薬剤を含有し得る。

【0103】

場合によって、点眼製剤は、プレドニゾロン、シクロスポリン、Ｌｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））、またはプレドニゾロンおよびシクロスポリン、プレドニゾロンおよびＬｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））、シクロスポリンおよびＬｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））、またはプレドニゾロン、シクロスポリンおよびＬｉｆｉｔｅｇｒａｓｔ（Ｘｉｉｄｒａ（商標））の組み合わせをさらに含み得る。

【0104】

薬学的組成物は、安全かつ効果的であると考えられる材料から構成される薬学的に許容される「担体」を使用して調製することができる。「薬学的に許容される」とは、「一般に安全とみなされる」、例えば、ヒトに投与した場合、生理学的に許容可能であり、通常は胃の不調、味覚の喪失または変化（味覚障害）などのアレルギー性または同様の有害な反応を生じない分子実体および組成物を指す。いくつかの実施形態において、この用語は、米国連邦食品医薬品化粧品法のセクション２０４（ｓ）および４０９に基づくＧＲＡＳリストとして、米国連邦または州政府の規制当局によって承認された分子実体および組成物を指し、これは市販前のレビューおよびＦＤＡまたは同様のリスト、米国薬局方または動物、およびより具体的にはヒトで使用するための別の一般に認められている薬局方による承認を条件とする。

【0105】

「担体」という用語は、希釈剤、結合剤、潤滑剤、および崩壊剤を指す。当業者は、そのような薬学的担体、およびそのような担体を使用して薬学的組成物を配合する方法に精通している。

【0106】

本明細書で提供される薬学的組成物は、１つ以上の賦形剤、例えば、溶媒、溶解度向上剤、懸濁剤、緩衝剤、等張性剤、抗酸化剤または抗菌防腐剤を含み得る。使用される場合、組成物の賦形剤は、有効成分、すなわち、組成物に使用されるＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の安定性、生物学的利用能、安全性、および／または有効性に悪影響を及ぼさないであろう。したがって、当業者は、剤形の成分のうちのいずれにも非相溶性がない組成物が提供されることを理解するであろう。賦形剤は、緩衝剤、可溶化剤、張性剤、キレート剤、抗酸化剤、抗菌剤、および防腐剤からなる群から選択することができる。軟膏は、通常、活性化合物およびパラフィン系または水混和性の軟膏基剤から調製される。

【0107】

クリームは通常、活性化合物および水中油型クリームベースから調製される。必要に応じて、クリームベースの水相は、例えば、少なくとも約３０％ ｗ／ｗの多価アルコール、すなわち、プロピレングリコール、ブタン－１，３－ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコールなどの２つ以上のヒドロキシル基、ならびにそれらの混合物を有するアルコールを含み得る。局所製剤は、望ましくは、皮膚または他の患部を通る活性化合物の吸収または浸透を増強する化合物を含み得る。そのような皮膚浸透促進剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連する類似体が挙げられる。

【0108】

乳濁液は、通常、活性化合物および油相から調製され、これは任意選択で単に乳化剤（または乳化剤（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として知られる）を含み得るか、または少なくとも１つの乳化剤の、脂肪もしくは油または脂肪および油の両方との混合物を含み得る。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤と一緒に含まれる。油および脂肪の両方を含めることも好ましい。一緒に、乳化剤は、安定剤の有無にかかわらず、いわゆる乳化ワックスを構成し、油および／または脂肪を一緒に含むワックスは、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。

【0109】

好適な乳化剤および乳化安定剤としては、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｓｐａｎ ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。薬学的エマルジョン製剤に使用される可能性が高いほとんどの油への活性化合物の溶解度は非常に低い可能性があるため、製剤化に好適な油または脂肪の選択は、所望の化粧品特性を達成することに基づいている。したがって、クリームは、チューブまたは他の容器からの漏れを避けるために、好適な粘稠度を有する、べたつかず、汚れがなく、かつ洗浄可能な製品であることが好ましい。直鎖または分岐鎖、ジイソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２－エチルヘキシル、またはＣｒｏｄａｍｏｌ ＣＡＰとして知られる分岐鎖エステルのブレンドなどの一塩基または二塩基性アルキルエステルを使用することができ、最後の３つが好ましいエステルである。これらは、必要な特性に応じて、単独でまたは組み合わせて使用することもできる。あるいは、白色軟パラフィンおよび／もしくは流動パラフィンまたは他の鉱油などの高融点脂質を使用することができる。

【0110】

前述の説明において、または以下の特許請求の範囲において、または添付の図面に開示され、それらの特定の形態で、または開示された機能を実行するための手段、または開示された結果を得るための方法もしくはプロセスの観点から適切に表現された特徴は、別々に、またはそのような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態で本発明を実現するために利用することができる。

【0111】

本発明は、上記の例示的な実施形態と併せて説明されてきたが、本開示が与えられた場合、多くの同等の修正および変形が当業者には明らかとなるであろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、例証であり、制限するものではないとみなされる。記載された実施形態に対する様々な変更は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。

【0112】

疑義を避けるために、本明細書で提供される理論的な説明は、読者の理解を向上させる目的で提供されている。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを望まない。

【0113】

本明細書で使用されている任意のセクションの見出しは、組織的な目的のみであり、説明されている主題を制限するものとして解釈されるべきではない。

【0114】

以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解される。

【0115】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は任意選択であり、例えば＋／－１０％を意味する。

【実施例】

【0116】

実施例１：ＬＩＮＫ ＴＳＧ６は全長ＴＳＧ－６よりも溶解性が高い
ＰＢＳにおける全長ＴＳＧ－６およびＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の溶解度および凝集状態を、様々な濃度でＵＶ分光光度法および動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して比較した。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、２ｍｇ／ｍｌで完全に溶解し、０．４、０．８、１．６または３．２ｍｇ／ｍｌでは凝集を示さなかった。全長タンパク質は、はるかに低い溶解度を有し、タンパク質の４０％未満が０．４、０．８、１．６および３．２ｍｇ／ｍｌで溶液中に残っていた。全長タンパク質もまた、０．２、０．４、０．８、１．６および３．２ｍｇ／ｍｌで高度に凝集していた。ＤＬＳ測定値は、１．６および３．２ｍｇ／ｍｌで全長ＴＳＧ－６の範囲外であり、２５００万Ｄａを超える凝集体が形成されていたことを示している。

【0117】

実施例２：ＬＩＮＫ ＴＳＧ６はマウスモデルにおけるドライアイ疾患の徴候および症状を改善する
局所ＴＳＧ－６は、シクロスポリン点眼薬と同様に炎症を介したドライアイ疾患に効果的であることが以前に示されている（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０１６）。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドがこの適応症に有用であるかどうかを試験するために、原発性眼シェーグレン症候群（糖尿病を伴わない自発的ドライアイ疾患）のＮＯＤ．Ｂ１０マウスモデルでその効果を調査した。

【0118】

原発性眼シェーグレン症候群（糖尿病を伴わないドライアイ疾患）のモデルであるＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２^ｂマウス（１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を７日間局所投与して治療した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、自発的なドライアイを発症しないため、陰性対照として使用した。

【0119】

マウスを、１０μｌのＰＢＳ中１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を１日当たり４回（ＱＩＤ）７日間にわたって局所適用することによって治療した。マウスをゾラゼパム－チレタミン（Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）、Ｖｉｒｂａｃ、Ｃａｒｒｏｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の腹腔内注射で麻酔し、１０μｌのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６またはＰＢＳのいずれかをピペットを使用して投与した。マウスを以下のようにランダムに治療群に割り当てた：
１）群１（陰性対照）：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１２週齢（ｎ＝６、１２眼）、未治療
２）群２（陽性対照）：ＮＯＤ．Ｂ１０、１２週齢（ｎ＝６、６眼）＋ＰＢＳ １０μｌ ＱＩＤ
３）群３（実験群）：ＮＯＤ．Ｂ１０、１２週齢（ｎ＝８、８眼）＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇ（１０μｌのＰＢＳ中）ＱＩＤ。

【0120】

ドライアイ疾患に対する治療の効果を評価するために、以下のアッセイを実施した。
１）欠損部位の（リサミングリーンによる）生体染色およびスコアリングによる角膜上皮欠損。マウスの下外側結膜嚢に３％リサミングリーンＢを１滴適用した後、角膜表面の染料染色を、次の眼染色スコアシステムに従って２人の眼科医によって盲検法で等級分けした：点状染色なしの場合はスコア０、角膜表面の３分の１未満が染色された場合はスコア１、３分の２以下が染色された場合はスコア２、および３分の２超が染色された場合はスコア３、
２）フェノールレッド綿糸試験で調べた涙腺の涙液産生、
３）角膜および眼窩内腺におけるリアルタイムＲＴ ＰＣＲによる炎症性サイトカインの発現、ならびに
４）ＰＡＳ染色された結膜円蓋上の結膜杯細胞数。同じ動物の眼の４つの異なる切片で１００ｐｍ当たりのＰＡＳ染色された細胞の数を数え、杯細胞密度として各眼の平均数を決定した。

【0121】

図２Ａに示されるように、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６治療後、角膜上皮欠損は有意に低減した（ｐ＜０．０１）。ＰＢＳおよびＬｉｎｋ＿ＴＳＧ６で治療した群間で角膜上皮欠損に有意な改善が見られた（ｐ＜０．００１）。

【0122】

図２Ｂに示されるように、涙液産生は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６治療によって大幅に増加した（ｐ＜０．０１）。ＰＢＳおよびＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６で治療した群間で涙液産生に有意な改善が見られた（ｐ＜０．００１）。

【0123】

図２Ｃは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６治療により、角膜および眼窩内腺におけるＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βのｍＲＮＡレベルが有意に抑制されたことを示している。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６で治療した眼は、対照のＣ５７ＢＬ／６マウスと同様のサイトカインレベルを有していた。

【0124】

２Ｄは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６治療により、結膜杯細胞の数が大幅に増加したことを示している（これらの細胞は涙液中にムチン成分を産生する）。

【0125】

全体として、これらの結果は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６がＮＯＤ．Ｂ１０ドライアイマウスにおける炎症を有意に抑制し、角膜上皮欠損を低減し、涙液産生を増加させ、結膜杯細胞を増加させたことを証明している。

【0126】

実施例３：ドライアイ疾患に対するＬＩＮＫ ＴＳＧ６の効果は、用量依存的である
実施例１で観察された効果が用量依存的であるかどうかを理解することに関心があった。この目的のために、１、０．１、または０．０１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６（５μｌのＰＢＳ中）を、１２週齢のＮＯＤ．Ｂ１０．Ｈ２ｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）にＱＩＤで７日間にわたって局所的に適用した。

【0127】

マウスを以下の治療群にランダムに割り当てた：
１）群１（陰性対照）：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１２週齢（ｎ＝６、１２眼）未治療
２）群２（陽性対照）：ＮＯＤ．Ｂ１０（ｎ＝８、８眼）＋ＰＢＳ ５μｌ ＱＩＤ
３）群３（実験群）：ＮＯＤ．Ｂ１０（ｎ＝８、８眼）＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇ（５μｌのＰＢＳ中）ＱＩＤ
４）群４（実験群）：ＮＯＤ．Ｂ１０（ｎ＝８、８眼）＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．１μｇ ＱＩＤ
５）群５（実験群）：ＮＯＤ．Ｂ１０（ｎ＝８、８眼）＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇ ＱＩＤ

【0128】

治療の効果を実施例１に従って決定した。

【0129】

図３Ａに示されるように、角膜上皮欠損は、リサミングリーンで染色された角膜で定量化された。ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇは、角膜上皮欠損の低減に効果的であったが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、角膜上皮欠損を有意に改善しなかった。

【0130】

図３Ｂにおいて、フェノールレッド綿糸試験は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび０．１μｇが涙液産生量の増加に効果的であることを示したが、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．０１μｇは、涙液産生量を有意に改善しなかった。

【0131】

図３ＣおよびＤに示されるように、試験されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の最高用量である１μｇが、ＴＮＦ－α発現の抑制に最も効果的であった。

【0132】

全体として、これらの結果は、局所的に適用されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチド（１μｇが最も効果的であり、０．０１μｇが最も効果的でない）によるドライアイパラメーターの用量依存的な改善を証明している。

【0133】

これらの効果は、より高用量のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６でも観察された。図４Ａに示されるように、より高用量（１μｇおよび１０μｇ）のＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、ＰＢＳ治療マウスと比較して、有意に少ない角膜上皮損傷を呈した。最高用量では、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６で治療された眼の多くは、角膜病変がなく（スコア０）、これは未治療の陰性対照Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同じである。これは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が上皮病変の治癒または修復を促進できることを示す。

【0134】

涙液産生（図４Ｂ－最低用量の試験されたＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６でさえも涙液産生に有意な影響を及ぼすことに留意されたい）、炎症（図４Ｃ）および結膜杯細胞数（図４Ｄ）に関しても用量依存的な反応が観察された。

【0135】

実施例４：ドライアイ疾患に対する全長ＴＳＧ－６タンパク質およびＬＩＮＫ ＴＳＧ６の効果の比較
私たちの実験は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ポリペプチドがドライアイ疾患の治療に効果的であることを明らかにした。これが全長（ＦＬ）ＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）とどのように比較されるかを理解することに関心があった。１日当たり２回（ＢＩＤ）投与されたＦＬ ＴＳＧ６およびＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の等モル用量を比較した。

【0136】

１２週齢のＮＯＤ．Ｂ１０マウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを以下のようにランダムに治療群に割り当てた：
１）群１ ＮＯＤ．Ｂ１０＋ＰＢＳ ５μｌをＢＩＤで７日間（陽性対照）、
２）群２ ＮＯＤ．Ｂ１０＋全長ＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）５μｌ（３．２７、０．３２７、０．０３２７μｇ）をＢＩＤで７日間、
３）群３ ＮＯＤ．Ｂ１０＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ５μｌ（１、０．１、０．０１μｇ）をＢＩＤで７日間、および
４）群４ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（陰性対照、ドライアイなし）。

【0137】

実施例２に従って、０．０１、０．１および１．０マイクログラムのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の投与量を選択した。質量分析法を使用して、組換えヒトＴＳＧ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の分子量を３５．７ｋＤａと決定した。この決定に基づいて、全長ＴＳＧ－６（ＦＬ ＴＳＧ６）について、０．０３７、０．３７および３．７マイクログラムの等モル用量を計算した。

【0138】

ドライアイ疾患の徴候および症状は、前の実施例に従って決定された。すなわち、
１）リサミングリーン染色および角膜上皮損傷のスコア。マウスの下外側結膜嚢に３％リサミングリーンＢを１滴適用した後、角膜表面の染料染色を、次の眼染色スコアシステムに従って２人の眼科医によって盲検法で等級分けした：点状染色なしの場合スコア０、微量染色の場合はスコア０．５、角膜表面の３分の１未満が染色された場合はスコア１、３分の２以下が染色された場合はスコア２、および３分の２超が染色された場合はスコア３、
２）涙腺の涙液分泌についてのフェノールレッド綿糸試験
３）組織学（結膜ＰＡＳ染色、涙腺ＣＤ３免疫染色）

【0139】

図５Ａに示されるように、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、等モル濃度の全長ＴＳＧ－６と比較して、角膜上皮病変の有意な低減をもたらした。

【0140】

図５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、試験された最高用量である１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、等モル用量（３．２７μｇ）の全長ＴＳＧ－６と比較して、涙液産生の増加、杯細胞の保存および眼窩内腺のＣＤ３染色炎症巣の数の低減を引き起こしたことを示している。

【0141】

実施例５：乾燥傷害誘発性ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。
原発性眼シェーグレン症候群（糖尿病を伴わない自発的ドライアイ疾患）のＮＯＤ．Ｂ１０マウスモデルでＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の有効性が証明されため、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が普及している環境蒸発性ドライアイ障害を有する個体の治療にも効果的であるかどうかを理解することに関心があった。

【0142】

あまり普及していないシェーグレン症候群のようなドライアイと比較して、より普及している形態のドライアイである蒸発性ドライアイをより良くエミュレートする乾燥モデルを使用する。７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを乾燥チャンバー内で保持し、スコポラミンを１日３回、１０日間にわたって腹腔内注射して、乾燥傷害を誘発した。扇風機からの空気の流れを２４時間スクリーンを通してケージに入れ、湿度をケージ内で３０～３５％に維持した。マウスを以下のように治療群に分けた。
１）乾燥傷害なし（陰性対照、２匹のマウス、４眼）
２）群１（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＰＢＳ ５μｌをＢＩＤで１０日間（陽性対照）
３）群２（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．１μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間
４）群３（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間
５）群４（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １０μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間
６）群５（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋Ｒｅｓｔａｓｉｓ（０．０５％シクロスポリンＡ）５μｌをＢＩＤで１０日間

【0143】

１０日後、ドライアイの徴候および症状を以下のように評価した。
１）フルオレセイン染色および角膜上皮損傷のスコア（Ｃ５７ＢＬ／６マウスは黒色であり、フルオレセイン染色はリサミングリーンよりも視覚化に優れている）
２）涙腺の涙液分泌についてのフェノールレッド綿糸試験
３）組織学（結膜ＰＡＳ染色、涙腺ＣＤ３免疫染色）
４）眼表面および涙腺の分子アッセイ（炎症性サイトカインについてのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ）

【0144】

図６Ａ（乾燥前および治療前、治療のために選択された動物には、研究の開始時に角膜病変がなかったことを示す）および６Ｂ（乾燥後および治療後）に示されるように、乾燥傷害は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて角膜上皮欠損を有意に誘発し（ｐ＜０．０１）、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、乾燥下の角膜上皮欠損を減少させるのに効果的であった（ｐ＜０．００１）。興味深いことに、Ｒｅｓｔａｓｉｓは、このモデルにおいて角膜上皮欠損を有意に低減せず、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、Ｒｅｓｔａｓｉｓよりも角膜上皮欠損の減少に優れていた（ｐ＜０．０５）。

【0145】

図６Ｃ（乾燥前および治療前）および６Ｄ（乾燥後および治療後）に示されるように、乾燥傷害は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの涙液産生を有意に低減した（ｐ＜０．０００１）。原発性眼シェーグレン症候群のマウスモデルと同様に、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇおよび１０μｇは、乾燥下での涙液産生の維持に効果的であり（ｐ＜０．０００１）、０．１μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６でさえも涙液産生を維持した（ｐ＝０．０５５２）。Ｒｅｓｔａｓｉｓは乾燥下での涙液産生の維持に効果的であったが（ｐ＜０．０５）、興味深いことに、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇは、Ｒｅｓｔａｓｉｓよりも涙液産生の維持に優れていた（ｐ＜０．００１）。

【0146】

Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、乾燥ストレス下で頸部リンパ節（ＤＬＮ）を排出する際に増加し、これらの細胞がドライアイの誘発に関与していることはよく知られている。したがって、頸部排出リンパ節でＦＡＣＳ分析を行い、様々な治療に応じたＴｈ１（ＩＦＮ－γ^＋ＣＤ４^＋細胞）およびＴｈ１７細胞（ＩＬ１７Ａ^＋ＣＤ４^＋細胞）のレベルを測定した。図６Ｅおよび６Ｆに示されるように、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、頸部リンパ節のＴｈ１およびＴｈ１７細胞の抑制にも効果的であった。Ｒｅｓｔａｓｉｓにはそのような抑制効果はなかった。

【0147】

したがって、これらのデータは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、普及している環境蒸発性ドライアイを有する患者を含む、ドライアイ疾患の治療にも効果的であることを示している。

【0148】

実施例６：確立された乾燥傷害誘発性ドライアイにおけるＬＩＮＫ ＴＳＧ６の評価
普及している環境蒸発性ドライアイを有する個体を含む、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６がドライアイ疾患の治療に効果的であることが証明されたため、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、確立したドライアイを有する個体の治療にも効果的であるかどうかを理解し、疾患の影響を逆転させることに関心があった。

【0149】

実施例５と同じ乾燥モデルを使用し、今回は、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６による治療前に１週間にわたってドライアイ疾患を確立させた。乾燥傷害が眼表面に及んだ後、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６を眼表面に適用した。次いで、マウスをスコポラミン注射とともに乾燥チャンバー内でさらに１０日間保持し、その間に治療を投与した。

【0150】

７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを乾燥チャンバー内で保持し、スコポラミンを１日３回、７日間にわたって腹腔内注射して、ドライアイを確立した。マウスを以下のように治療群に分けた：
１）乾燥傷害なし（陰性対照、２匹のマウス、４眼）
２）群１（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＰＢＳ ５μｌをＢＩＤで１０日間（陽性対照）
３）群２（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ０．１μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間
４）群３（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間
５）群４（５匹のマウス、１０眼）：乾燥傷害＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ １０μｇ（ＰＢＳ ５μｌ中）をＢＩＤで１０日間。

【0151】

ドライアイ疾患の徴候および症状は、前の実施例に従って決定された。すなわち、
１）フルオレセイン染色および角膜上皮損傷のスコア（Ｂ６マウスは黒色であり、フルオレセイン染色はリサミングリーンよりも視覚化に優れている）、
２）涙腺の涙液分泌についてのフェノールレッド綿糸試験、および
３）組織学（結膜ＰＡＳ染色、涙腺ＣＤ３免疫染色）。

【0152】

図７Ａに示されるように、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、試験したすべての濃度で角膜上皮欠損を減少させるのに効果的であった。図７Ｂに示されるように、試験したすべての濃度で、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、涙液産生を増加させるのに効果的であった。試験した最低濃度でも有意な変化が観察された。

【0153】

図７Ｃは、１μｇおよび１０μｇのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、対照と比較して杯細胞数の増加をもたらし、乾燥がない場合に観察されたレベルに匹敵するレベルに回復したことを示している。

【0154】

さらに、図７Ｄに示されるように、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６による治療は、眼表面のＭＭＰ－９ ｍＲＮＡのレベルを抑制するのに効果的であった。

【0155】

したがって、これらのデータは、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６が、乾燥傷害の重症度を低減することに加えて、確立されたドライアイ疾患の治療に効果的であることを示している。これらのデータは、普及している環境蒸発性ドライアイを有する患者を含む、ドライアイ障害を有する個体の治療のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の使用を支持している。

【0156】

実施例７：ドライアイモデルにおけるＬＩＮＫ ＴＳＧ６の評価およびＲｅｓｔａｓｉｓとの比較。
蒸発性ドライアイの治療においてＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６がＲｅｓｔａｓｉｓよりも優れていることが証明されたため、実施例４で使用した、原発性眼シェーグレン症候群（糖尿病を伴わない自発的ドライアイ疾患）のＮＯＤ．Ｂ１０マウスモデルにおいてＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６をＲｅｓｔａｓｉｓと比較することに関心があった。

【0157】

１２週齢のＮＯＤ．Ｂ１０マウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを以下のようにランダムに治療群に割り当てた：
１）群１ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（陰性対照、ドライアイ／乾燥なし）。
２）群２ ＮＯＤ．Ｂ１０＋ＰＢＳ ５μｌをＢＩＤで７日間（陽性対照）、
３）群３ ＮＯＤ．Ｂ１０＋ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６ ５μｌ（０．１、１、１０μｇ／５μｌ）をＢＩＤで７日間、および
４）群４ ＮＯＤ．Ｂ１０＋Ｒｅｓｔａｓｉｓ ５μｌをＢＩＤで７日間。

【0158】

ドライアイ疾患の徴候および症状は、前の実施例に従って決定された。すなわち、
１）リサミングリーン染色および角膜上皮損傷のスコア。
２）涙腺の涙液分泌についてのフェノールレッド綿糸試験
３）組織学（結膜ＰＡＳ染色、涙腺ＣＤ３免疫染色）

【0159】

図８ＢおよびＤに示されるように、また実施例４の研究と一致して、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、原発性眼シェーグレン症候群のＮＯＤ．Ｂ１０マウスモデルにおいて、角膜上皮病変の有意な低減および涙液産生の増加をもたらした。さらに、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、１μｇ用量および１０μｇ用量の両方でＲｅｓｔａｓｉｓよりも優れた程度で治癒を促進し、Ｒｅｓｔａｓｉｓと比較して、角膜病変の低減、杯細胞数の維持、眼窩内腺のＣＤ３染色炎症巣の数の低減をもたらした。これは、試験された最低用量でさえも、ＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６は、確立された蒸発性ドライアイ疾患の発症の予防または治療において以前に観察されたように、Ｒｅｓｔａｓｉｓよりも原発性眼シェーグレン症候群（糖尿病を伴わない自発的ドライアイ疾患）のＮＯＤ．Ｂ１０マウスモデルにおけるドライアイの治療において優れていた。これらのデータは、ドライアイ障害を有する個体の治療のためのＬＩＮＫ＿ＴＳＧ６の使用をさらに支持する。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【配列表】

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【国際調査報告】