特表 2022-542912 改良型精子受精能獲得用緩衝液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】改良型精子受精能獲得用緩衝液

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/04 20060101AFI20220930BHJP

【ＦＩ】

C12N1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2022505238

(86)(22)【出願日】2020-07-28

(85)【翻訳文提出日】2022-01-24

(86)【国際出願番号】 IB2020057093

(87)【国際公開番号】W WO2021019430

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】102019000013248

(32)【優先日】2019-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522032523

【氏名又は名称】ピピトー、アントニーノ

【氏名又は名称原語表記】ＰＩＰＩＴＯ’， Ａｎｔｏｎｉｎｏ

(71)【出願人】

【識別番号】522032534

【氏名又は名称】カスターニャ、エリザベッタ

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＳＴＡＧＮＡ， Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ

(71)【出願人】

【識別番号】522032545

【氏名又は名称】トッツォ、ステファノ

【氏名又は名称原語表記】ＴＯＺＺＯ， Ｓｔｅｆａｎｏ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ピピトー、アントニーノ

(72)【発明者】

【氏名】カスターニャ、エリザベッタ

(72)【発明者】

【氏名】トッツォ、ステファノ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BD25

4B065BD39

4B065CA44

(57)【要約】

有効成分アスタキサンチンと血清アルブミンからなる緩衝液と、二塩基性リン酸カリウムＫ_２ＨＰＯ_４で緩衝された一塩基性リン酸カリウムＫＨ_２ＰＯ_４を含むリン酸緩衝液からなる精子受精能獲得用緩衝液。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効成分アスタキサンチンと血清アルブミンを含む緩衝液と、二塩基性リン酸カリウムＫ_２ＨＰＯ_４で緩衝された一塩基性リン酸カリウムＫＨ_２ＰＯ_４を含むリン酸緩衝液とからなることを特徴とする、精子受精能獲得用緩衝液。

【請求項2】

０．５～５０μＭのアスタキサンチンと、１～２０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンと、０．１～２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４緩衝液とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項3】

前記リン酸塩溶液は、０．１～２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４と、０．２８～０．４ Ｏｓｍの浸透圧モル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を有するＫ_２ＨＰＯ_４バッファー溶液（ｐＨレンジ７．００～９．００）とからなることを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項4】

３つの立体異性体（３Ｒ，３’Ｒ、３Ｓ，３’Ｓ及び３Ｒ，３’Ｓ）を含む、化学式３，３’－ジヒドロキシ－β，β－カロテン－４，４’－ジオン（３，３’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ－４，４’－ｄｉｏｎｅ）を有する合成アスタキサンチンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項5】

前記立体異性体は、１：１：２の比で存在することを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項6】

天然、モノ－又はジ－エステル化アスタキサンチンを含み、化学式３，３’－ジヒドロキシ－β，β－カロテン－４，４’－ジオン（３，３’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ－４，４’－ｄｉｏｎｅ，）を有することを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項7】

５～５０ｍＭの重炭酸ソーダＮａＨＣＯ_３をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【請求項8】

１４μＭのアスタキサンチン、１ｍＭのＭｇＳＯ_４、２０ｍＭの乳酸カルシウム、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１２ｍＭのリン酸緩衝液、１２ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン、１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３、及び０．２８ Ｏｓｍまでの生理食塩水（ｐＨ７．５）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の緩衝液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、精子の受精能力獲得のための改良された緩衝液に関する。

【背景技術】

【0002】

本発明の分野は、医学的な受精補助技術の分野であり、精子は、その生存率と機能性を保証しなければならない栄養と保護液からなる緩衝液とも呼ばれる培養液に集められる。特に、その最適化特性により、前記緩衝液中では、最も運動性の高い精子が選択され（スイムアップ法により）、とりわけ、それらは「成熟」させられる、すなわち、それなしでは受精能力を得ることができない一連の変化を完了させられるのである。

【0003】

例えば、すでに分析され、市場で最高のものの１つとされている有名な純精液洗浄液（Ｐｕｒｅ Ｓｐｅｒｍ Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）（ニダコン社のＰＳＷ）などの市販のバッファに見られる問題は、主に、精子が受精に十分なレベルの静電容量に達することができないことである（Ａｎｄｒｉｓａｎｉらの「精子生存性及び受精能獲得性に及ぼす種々の市販緩衝液の影響－生殖医療におけるシステム生物学、２０１４年」）。実際、このバッファーを用いても、精子の頂端部（又は、頭部）で細胞膜を再構築し、特定の酵素活性化を行うことからなる精子調製過程は、かなりの割合で卵子の受精に達するのに十分なレベルまで持っていくことができない。

【0004】

さらに、市販のバッファーの欠点は、時間が経つと不安定になることである。つまり、ボトルを開けたらすぐに、とにかくできるだけ短時間でバッファーを使用しなければならない。

【0005】

Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ Ａｎｄｒｉｓａｎｉら、「アスタキサンチンによるリンの変位と活性化の誘導によるヒト精子の生殖能力の改善」，Ｍａｒｉｎｅ Ｄｒｕｇｓ，ｖｏｌ．１３ ｎｏ．９，２５ Ｊａｎ ２０１５，ｐｐ．５５３３－５５５１（以下、Ａ１と呼ぶ）及びＧａｂｒｉｅｌｌａ Ｄｏｎａら、「アスタキサンチンのヒト精子生殖能力に及ぼす影響」，Ｍａｒｉｎｅ Ｄｒｕｇｓ，ｖｏｌ．１１，２０１３年１月１日６日、１９０９～１９１９年頁（以下「Ａ２」という。）による刊行物には、ヒト精子の受精能獲得に対するアスタキサンチンの作用機序に関する試験が記載されている。これらの研究は、精子を含有する培地にインキュベーション時にアスタキサンチンを即時に添加することによって実施され、したがって、最終組成物の不安定性による生成物の変性に関する生化学的パラメータおよび運動性の時間的変化についてのいかなる研究も行わなかった。

【発明の概要】

【0006】

本発明の主な目的は、精子の成熟のための新規な緩衝液を提供することであり、これは、公知の緩衝液とは異なり、成熟過程において精子を補助できる全ての物質を含有する、完全かつバランスのとれた生成物を提供する。

【0007】

さらに、別の提案された目的は、この新たな緩衝液は、医学的に補助された受精技術においてより有効な、より高いパーセンテージの精子によって実証される、受精能獲得プロセスの増強を決定し得ることである。

【0008】

最後に、この新しい緩衝液は、実験の全期間だけでなく、公知の化学式よりもはるかに長い時間、その特性を完全に維持し、保存時間は、無傷のボトル中で９０日を超え、ボトルを開けた後１４日を超える。

【0009】

これらの目的は、請求項１の緩衝液によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、残りの特許請求の範囲から明らかになるのであろう。

【0010】

本発明の緩衝液は、即時添加を全く必要とせずにすぐに使用できるという利点を提供し、改善された受精能力獲得反応の利点を提供し、これは、医学的に補助された受精技術のためのより大きな効率で、より多数の成熟精子が産生されることを可能にし；それはその機能性を完全に維持することにおいて長い安定性を提示し（ボトルが開封された後１４日を超えて）；そして調製されると、それは３ヶ月を超えて密封されたボトル中に保持され得る。

【0011】

特に、本発明は、特に、異常なＲＯＳ生成を有する精子と共に使用される場合、従って、生存及び成熟の低い確率で、精子能力獲得機構を有意に増強する。実際、本発明によれば、リン酸緩衝液及び血清アルブミンと組み合わせたアスタキサンチンの存在は、膜を有意に再構築し、精子能力獲得プロセスを効果的に補助する。さらに、記載された活性成分の組み合わせは、本発明の緩衝溶液に安定性を与える。なぜなら、それは生成物の変性をかなり低減し、成分の自然酸化及び／又は細菌汚染を防止するからである。

【0012】

公知の化学式と比較して、ＥＣＢ緩衝液の化学式は、各単一の手順の開始時の即時調製の必要性を排除する。ＥＣＢ緩衝液の処方は、アスタキサンチンを安定な溶液中に保つことを可能にし、それによって緩衝液自体の使用をかなり単純化する。実際、包装ボトル内に収容された緩衝液は、オペレータによってそのまま使用することができ、これはすべて、結果の信頼性及び再現性に関して大きな利点を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

これら及び他の目的、利点及び特徴は、非限定的な例として以下に記載される、本発明の緩衝液の以下の処方から生じる。

【0014】

ＥＣＢ（増強生殖能力緩衝液）と呼ばれる緩衝液は、好ましくは、ヒト起源の血清アルブミンと組み合わされた活性物質アスタキサンチン、及び二塩基性リン酸カリウムＫ_２ＨＰＯ_４で緩衝された一塩基性リン酸カリウムＫＨ_２ＰＯ_４からなるリン酸緩衝液の存在を特徴とする。

【0015】

上記緩衝液は、好ましくは、０．５～５０μＭのアスタキサンチン、１～２０ｍｇ／ｍｌの血清アルブミン、好ましくは、ヒト血清アルブミン、及び０．１～２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液を含み、次いで、これは、７．００～９．００の間のｐＨを決定するための種々の濃度の化合物から構成される。特に、前記リン酸溶液は、０．１～２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨレンジ７．００～９．００）と、０．２８～０．４ Ｏｓｍの浸透圧モル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を有する。

【0016】

さらにより好ましくは、上記緩衝液は、０．５～１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、５～５０ｍＭの乳酸カルシウム、０．１～２０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５～５０μＭのアスタキサンチン、１～２０ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン及び０．１～２０ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４液を含む。

【0017】

好ましくは、緩衝液はまた、５～５０ｍＭの重炭酸ソーダＮａＨＣＯ_３を含む。

【0018】

本発明の緩衝液に使用されるアスタキサンチンは、一般式３Ｓ，３Ｓ’－ジヒドロキシ－β，β－カロテン－４，４’－ジオン（３Ｓ，３Ｓ’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ－４，４’－ｄｉｏｎｅ）（ＣＡＳ ７５４２－４５－２）として、好ましくは、１：１：２の比率で３つの立体異性体（３Ｒ，３’Ｒ、３Ｓ，３’Ｓ及び３Ｒ，３’Ｓ）を含む合成アスタキサンチンのラセミ混合物からなる。しかし、いくつかの藻類又は真菌中に抗酸化機能を有する天然のモノエステル化又はジエステル化アスタキサンチンを、一般式３Ｓ，３Ｓ’－ジヒドロキシ－β，β－カロテン－４，４’－ジオン（３Ｓ，３Ｓ’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－β，β－ｃａｒｏｔｅｎｅ－４，４’－ｄｉｏｎｅ）と共に使用することもできる。

【0019】

以下は、本発明の緩衝溶液のいくつかの例である：
μＭは、ミクロモル／リットルを表す。
ｍＭは、ミリモル／リットルを表す。
Ｏｓｍは、オスモル／リットルを表す。

【実施例】

【0020】

実施例１
アスタキサンチン ０．５－５０μＭ
リン酸緩衝液 ０．１－２０ｍＭ
ヒト血清アルブミン １－２０ｍｇ／ｍｌ
生理食塩水ｐＨ７．５ 最大０．２８Ｏｓｍ

【0021】

実施例２
アスタキサンチン １４μＭ
ＭｇＳＯ_４ １ｍＭ
乳酸カルシウム ２０ｍＭ
ピルビン酸Ｎａ １０ｍＭ
リン酸緩衝液 １２ｍＭ
ヒト血清アルブミン １２ｍｇ／ｍｌ
ＮａＨＣＯ_３ １０ｍＭ
生理食塩水ｐＨ７．５ 最大０．２８ Ｏｓｍ

【0022】

実施例３
アスタキサンチン １μＭ
ＭｇＳＯ_４ ４ｍＭ
乳酸カルシウム １０ｍＭ
ピルビン酸Ｎａ １５ｍＭ
リン酸緩衝液 １８ｍＭ
ヒト血清アルブミン ５ｍｇ／ｍｌ
ＮａＨＣＯ_３ １０ｍＭ
生理食塩水ｐＨ８．０ 最大０．３０ Ｏｓｍ

【0023】

実施例４
アスタキサンチン １０μＭ
ＭｇＳＯ_４ ９ｍＭ
乳酸カルシウム １０ｍＭ
ピルビン酸Ｎａ １２ｍＭ
リン酸緩衝液 １０ｍＭ
ヒト血清アルブミン ９ｍｇ／ｍｌ
ＮａＨＣＯ １２ｍＭ
生理食塩水ｐＨ７．７ 最大０．４ Ｏｓｍ

【0024】

実施例５

【0025】

【表1】

【0026】

ヒト精子の受精能獲得における緩衝液の有効性は、以下の観点から測定される：精子頭部上のラフト（ｒａｆｔ）のすべりを伴う精子の割合（ＣＴＢ）（Ａｎｄｒｉｓａｎｉら、「精子生存性及び受精能獲得性に及ぼす種々の市販緩衝液の影響－生殖医療におけるシステム生物学、２０１４年」）；頭部上のチロシンリン酸化を有する細胞の割合（ｐ－Ｔｙｒ）；先体反応（ＡＲＣ）を得る細胞の割合；進行性及び非進行性運動性を有する細胞の割合（Ｍ）。これらのパラメーターは、精子の生化学的（ＣＴＢ、ｐ－Ｔｙｒ、ＡＲＣ）及び機械的－物理的（Ｍ）特性を表し、次いで、精子が緩衝液中で産生するＲＯＳフリーラジカルの量によって特徴付けられる。

【0027】

様々な市販緩衝液の有効性を記述するために分析されたパラメータは、受精能獲得過程の基本的パラメータとして参考文献に報告されているものであり（Ｂｏｔｔｏら、「炭酸水素塩は、雄ブタ精子の受精能獲得過程における脂質マイクロドメインにおける膜再編成とＣＢＲ１及びＴＲＰＶ１エンドカンナビノイド受容体の移動を誘導する」、膜生物学ジャーナル、２０１０；Ｄｏｎａら、「内因性活性酸素種含量及び精子受精能獲得過程におけるチロシンリン酸化の調節」：ＲＯＳ、「ヒト精子におけるＴｙｒ－リン酸化及び受精能獲得」、国際アンドロロジージャーナル２０１１ａ；Ｎｉｘｏｎら、「ヒト精子界面活性剤耐性膜のプロテオーム解析及び機能解析」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０１１；Ａｎｄｒｉｓａｎｉら、２０１４）、含まれ：
－ＲＯＳの生成、過酸化脂質を二次的に誘導することで膜の再配列を助けることができるが、膜やＤＮＡの変性を誘導しないように最大値を超えてはならない；ルミノールによる検出によって行われる（Ｄｏｎａら、２０１１ａによる）；
－いわゆる脂質ラフトの滑り、これは、受精の間、膜構造の再編成に関与する；これは、コレラ毒素（ＣＴＢ）のサブユニットＢによる染色によって可視化される（Ｎｉｘｏｎら、２０１１；Ａｎｄｒｉｓａｎｉら、２０１４、によって与えられた表示に従って）。
－精子頭部に位置するタンパク質のチロシンリン酸化（Ｔｙｒ－Ｐ）のレベル、これは、膜に位置するタンパク質および酵素が正しく機能していることを示すものとして、前述のラフトの再編成に続いて増加しなければならない（Ｄｏｎａら、２０１１ｂ）。
－先体反応（ＡＲＣ）に到達した細胞の割合、これは、精子膜と卵子膜の融合の最終ステップを意味する（Ｄｏｎａら，２０１１ａ）。

【0028】

－異なる緩衝液の容量条件で１８０分間インキュベートした後に評価した精子の運動性と運動パラメータ（Ｍ＝進行性及び非進行性運動性の両方を有する精子の割合）。

【0029】

ＰＳＷによって表される既存の緩衝液と比較して、本発明の緩衝液の有効性をより良好に評価するために、ＲＯＳ産生の分析技術は、精液サンプルを、２つの基、すなわち、ＲＯＳの正常な産生を有するサンプル（以下の表中のＮＧ）及びＲＯＳ産生問題を有するサンプル（以下の表１中のＬＰＧ）にそれぞれ分類することを可能にした：

【0030】

【表2】

【0031】

ＲＯＳの内因性産生は、受精能獲得条件下での精子のインキュベーションの間、ルミノールルミネセンスをモニターすることによって検出される。値は、２×１０^６精子についての相対発光単位（ＲＬＵ）／３０秒の移動平均として表される。

【0032】

評価
本発明による試験を実施するために使用される試料は、書面によるインフォームドコンセントを与えた健康なドナー（ｎ＝４８）（年齢群、２８～４５歳、平均年齢３４．６歳）に由来し、世界保健機関（世界保健機関、２０１０年）によって記載されたパラメータに従って正常性の基準を満たした。密度勾配（Ｄｏｎａら．，２０１１ａ）に従って単離及び精製したら、精子をアリコートに分割し、異なる緩衝液で別々に洗浄し、濃度、運動性、生存率及び形態について再分析した。次いで、サンプルを、前述のＲＯＳ産生基準に基づいて、正常群（ＮＧ）又は低性能群（ＬＰＧ）に属するものとして同定した（Ｄｏｎａら、２０１１ａ、２０１１ｂ）。次いで、各サンプルのアリコートを、上記に列挙したパラメーターのための異なる緩衝液中で処理した（Ｄｏｎａら，２０１１ｂ，２０１１ａ；Ａｎｄｒｉｓａｎｉら，２０１４）。

【0033】

以下の表２は、従来技術のＰＳＷ緩衝液と比較した、合成アスタキサンチンを用いた本発明のＥＣＢ緩衝液によって明らかにされた、評価されたパラメーターの各々についての改善パーセンテージを列挙する。

【0034】

【表3】

【0035】

使用される緩衝液は、ＰＳＷ（対照緩衝液）であり、ＥＣＢ緩衝液は、調製後（ＥＣＢ３０、６０、９０）、又はボトルを開けてから２週間後（旧ＥＣＢ）、新鮮に、又は３０、６０もしくは９０日後に使用される。分析したパラメータは、頭部にラフトがすべっている精子の割合（ＣＴＢ）、頭部にチロシンリン酸化を有する細胞の割合（ｐ‐Ｔｙｒ）及び先体反応（ＡＲＣ）を得る細胞の割合である。データは、ＰＳＷ緩衝液（１００％とする）と比較した、種々の条件下でＥＣＢ緩衝液で得られた値の増加パーセンテージとして表される。全ての値は、平均±標準偏差として表される。

【0036】

正常ボランティア（ＮＧ）の群において明らかな改善は、精子の処置のための最適な緩衝液であることが証明されたＰＳＷ緩衝液で得られたものに対して１２～約１９％の範囲で予想される（Ａｎｄｒｉｓａｎｉら、２０１４）。本発明のＥＣＢ緩衝液で処置したＬＰＧ群では、この改善が膜の再配置について４９％であり、先体反応（ＡＲＣ）について５２％もの改善である。さらに、調製後１、２、３ヶ月でさえ、ＥＣＢ緩衝液は、種々のパラメーターの同じパーセンテージの増加を細胞に保証することを示し、したがって、３ヶ月後でさえその最適な特性を維持することを実証する。ＥＣＢ緩衝液の安定性は、開封後１４日目に使用したボトルの効力を評価することによってさらに確認され、これは、逆に、以前の研究で実証されたように、ＰＳＷ緩衝液の明らかな分解を引き起こした条件である。実際、得られたデータは、本発明のＥＣＢ緩衝液がボトルを開封した直後に使用した緩衝液のレベルを維持したことを実証する（表２）。

【0037】

運動性細胞（Ｍ）のパーセンテージについても分析した場合、インキュベーション期間（１８０’）の終わりに、本発明のＥＣＢ緩衝液は、以下の表３に示すように、進行性運動性を誘導及び維持し、運動性細胞のパーセンテージを増加させる際に、ＰＳＷよりも有効であることが証明された。

【0038】

【表4】

【0039】

使用される緩衝液は、ＰＳＷ（対照緩衝液）であり、ＥＣＢ緩衝液は、調製後（ＥＣＢ３０、６０、９０）、又はボトルを開けてから２週間後（旧ＥＣＢ）、新鮮に、又は３０、６０もしくは９０日後に使用される。値は、進行性及び非進行性運動性（Ｍ）を有する細胞の割合を表す。データは、ＰＳＷ緩衝液（１００％とする）と比較した、種々の条件下でＥＣＢ緩衝液で得られた値の増加パーセンテージとして表される。すべての値は、平均±偏差で表す。

【0040】

従って、これらの結果に基づいて、本発明の緩衝液は、試料の容量のパーセンテージを有意に増加させるという点で、精子を調製する際に真に有効であることが証明されたと結論付けることができる。生存能力の保存及び精子運動性の増加におけるその有効性も考慮すると、医学的に支援されたプロクレーション処理、又はＰＭＡの範囲内で受精が成功する確率は、疑いなく莫大に高められる。

【0041】

洗浄緩衝液中の精子の調製は、細胞の正確な生理学的活性を維持する際の非常に重要な工程であり、精子を調製するためにＰＭＡセンターで使用される緩衝液が、先体反応を得るための最適条件を誘導する場合、本発明のＥＣＢ緩衝液は、既に市場で最も有効なもの１つとして示されているＰＳＷ緩衝液との比較から分かるように、他のものよりはるかに優れている。

【0042】

問題／解決基準に関して、対処される技術的問題は、完全培地（その成分が完全にバランスがとれている）を使用することによって精子容量を増加させることであり、これは経時的（９０日間にわたる）、さらにより重要なことには、ボトルが開封されてから１４日後の調製からの安定性を保証する。

【0043】

この問題は、新しく調製されたアスタキサンチンの可能な即時添加による新鮮な緩衝液の特徴を単に分析する前述の文献Ａ１～Ａ２のいずれによっても対処されず、したがって解決されない（Ａ１ｐ．５５３８、表１；Ａ２ｐ．１９１６、ｐａｒ．３．５及び３．６を参照のこと）。

【0044】

さらに、Ａ１ｐ．５５３８間の比較から、表１、ＰＧグループの欄と本件明細書の表２、ＬＰＧの欄の比較から、後者は、フレッシュな緩衝液条件だけでなく、ボトルを開封してから１４日後にも、ｐ－Ｔｙｒ及びＡＲＣの著しい増加をもたらすことが確認できる。

【0045】

したがって、Ａ１を最も関連する技術水準として考慮すると、従来技術文献のいずれも、調製後少なくとも９０日間、及びボトルを開封した後少なくとも１４日間、完全かつ安定な、すぐに使用できる緩衝液中の最適条件下で、精子能力を増加させる目的で、請求項１の緩衝液を特徴付ける活性成分の組み合わせを教示していない。

【0046】

言い換えれば、従来技術のバッファと本発明のバッファとの間の差異を示す少なくとも２つの本質的な要素が存在すると言うことができる：
・安定性、持続性、結果の再現性；
・公知の緩衝剤とは異なり、非独自的であるが構造的な方法でアスタキサンチンを使用すること。

【0047】

文書Ａ１及びＡ２に示された研究は、以下のステップを含むだけであり、使用される緩衝剤の時間的持続性に関するいかなる情報も提供していない。
－選択された市販の緩衝液、例えばＰＳＷ中の精子の懸濁液。
－即時準備された、タイムＴ_０時のアスタキサンチンの追加。
－実験から得られたデータの記録。
－実験の終わり（Ｔ_１８０’）、特殊な実験室廃棄物中に予め調製された即席液（精子を含む）の除去。

【0048】

この手順から、Ａ１、Ａ２ともに、アスタキサンチンの挙動とその作用機構を調べることが目的であり、Ａ１、Ａ２で使用した２つの市販緩衝液の成分とアスタキサンチン自体の潜在的な相乗作用や反作用の時間発展には注意が払われていないことが確認された。

【0049】

したがって、Ａ１およびＡ２の両方において、時間Ｔ_０より前に知られている緩衝液の特性に関するいかなる情報も発見、外挿または再構築することができないことは極めて明白である。

【0050】

同じ理由で、Ａ１及びＡ２の両方において、時間Ｔ_１８０’以降に知られている緩衝液の特性に関するいかなる情報も、発見、推定又は再構築することができないことは、極めて明らかである。

【0051】

即時調製の前後の既知の緩衝液（例えば、ＰＳＷ＋アスタキサンチン）についての情報の完全な欠如は、本発明の緩衝液に関する基本的かつ基本的な相違を表し、この情報の欠如は、当業者に、請求項１の主題を特徴付ける教示を提供しない。

【0052】

さらに、比較の結果から、ＥＣＢ緩衝液（本発明の主題）は、Ａ１及びＡ２で使用される即時緩衝液と比較して、冷蔵庫での貯蔵を必要とせずに少なくとも９０日の貯蔵時間を有し、それは希釈を必要とせず、緩衝液は、そのまま使用され、使用時に物質を添加する必要はなく、アスタキサンチンは緩衝液中に既に存在し、生成物は絶対的に安定であり、制御又はｐＨ調整を必要とせず、緩衝液は瓶を開封した後少なくとも２週間その特性を維持し、瓶を開封した後少なくとも２週間、各瓶の結果の複製可能性が保証されると結論付けることができる。

【国際調査報告】