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特表2022-542922バイオエンジニアリング製剤、その調製および実施のためのプロセス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-07
(54)【発明の名称】バイオエンジニアリング製剤、その調製および実施のためのプロセス
(51)【国際特許分類】
A61L 27/44 20060101AFI20220930BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20220930BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20220930BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20220930BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220930BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20220930BHJP
A61L 24/00 20060101ALI20220930BHJP
A61L 27/52 20060101ALI20220930BHJP
A61L 27/58 20060101ALI20220930BHJP
A61L 24/08 20060101ALI20220930BHJP
A61L 24/10 20060101ALI20220930BHJP
A61L 24/04 20060101ALI20220930BHJP
A61L 24/06 20060101ALI20220930BHJP
【ＦＩ】
A61L27/44
A61L27/38 100
A61K47/36
A61K47/38
A61K47/34
A61K47/32
A61L24/00 260
A61L27/52
A61L27/58
A61L24/00 310
A61L24/08
A61L24/10
A61L24/04 200
A61L24/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022505409
(86)(22)【出願日】2020-07-27
(85)【翻訳文提出日】2022-03-15
(86)【国際出願番号】 IN2020050653
(87)【国際公開番号】W WO2021019562
(87)【国際公開日】2021-02-04
(31)【優先権主張番号】201941030371
(32)【優先日】2019-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522033896
【氏名又は名称】パンドラム・テクノロジーズ・プライベイト・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｐａｎｄｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】ボウミック，トゥヒン
(72)【発明者】
【氏名】チャンドル，アルン
(72)【発明者】
【氏名】セルバム，シバラム
(72)【発明者】
【氏名】アグラワル，パリニタ
(72)【発明者】
【氏名】ベン トーマス，ミドゥン
(72)【発明者】
【氏名】エス，カマルナト
(72)【発明者】
【氏名】メノン，ディープト
【テーマコード（参考）】
4C076
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076BB24
4C076CC50
4C076EE06
4C076EE23
4C076EE32
4C076EE36
4C076EE37
4C076FF67
4C076FF68
4C081AB21
4C081BA12
4C081BA16
4C081BB04
4C081CA05
4C081CA18
4C081CC04
4C081CD02
4C081CD04
4C081CD081
4C081CD121
4C081CD34
4C081DA12
4C081EA11
(57)【要約】
本開示は、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤を開示する。本開示はまた、幹細胞、もしくはエクソソーム、またはそれらの組み合わせを含むバイオエンジニアリング製剤を開示する。さらに、バイオエンジニアリング製剤を調製するためのプロセスもまた、そこで開示されている。さらに、ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む、製剤もまた提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤。
【請求項2】
（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤であって、前記バイオエンジニアリング製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、バイオエンジニアリング製剤。
【請求項3】
前記修飾ヒアルロン酸が、１０～４８ｋＤａ、好ましくは１２～３５ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項4】
前記修飾コラーゲンペプチドが、前記製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、前記修飾ヒアルロン酸が、前記バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項5】
前記修飾コラーゲンペプチドが、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項6】
前記修飾ヒアルロン酸が、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項7】
前記製剤が、間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種類の幹細胞をさらに含む、請求項１に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項8】
前記間葉系幹細胞が、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択される、請求項７に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項9】
前記幹細胞が、前記バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する、請求項７に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項10】
前記バイオエンジニアリング製剤が、角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームをさらに含む、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項11】
前記エクソソームが、前記バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有する、請求項１０に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項12】
前記プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームが、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである、請求項１０に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項13】
前記修飾ヒアルロン酸が、メタクリル化ヒアルロン酸であり、前記修飾コラーゲンが、チオール化コラーゲンペプチドである、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項14】
前記製剤が、（ｉ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｉｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、をさらに含む、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項15】
前記製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項16】
前記製剤が、インビトロ条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある、請求項１または２に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項17】
請求項１に記載のバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスであって、前記プロセスが、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する前記修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する前記修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合を得ることと、
（ｂ）前記予混合を光開始剤溶液と接触させて、前記バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む、プロセス。
【請求項18】
前記修飾コラーゲンペプチドが、前記製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、前記修飾ヒアルロン酸が、前記バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項19】
前記光開始剤溶液が、リン酸緩衝生理食塩水中に０．００１～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、前記光開始剤溶液が、前記バイオエンジニアリング製剤に関して０．５×～１×の範囲の量で存在する、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項20】
前記予混合を前記光開始剤溶液と接触させた後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露する、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項21】
対象の角膜欠損を治療するための方法であって、前記方法が、（ａ）請求項１～１６のいずれか一項に記載のバイオエンジニアリング製剤を得ることと、
（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量の前記バイオエンジニアリング製剤を適用することと、
（ｃ）対象の前記角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、前記角膜欠損の前記部位の前記製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、を含む、方法。
【請求項22】
前記方法が、（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｉｉ）適切な量の前記製剤を適用する前または後に、前記角膜欠損の前記部位での臨床的に承認された点眼製剤と、を含む溶液を適用することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む、製剤。
【請求項24】
前記臨床的に承認された点眼製剤が、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、およびアルギン酸からなる群から選択される少なくとも１つのポリマーを含む、請求項２３に記載の製剤。
【請求項25】
対象の角膜欠損を治療するための方法であって、前記方法が、（ａ）（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｉｉ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を得ることと、
（ｂ）対象の前記角膜欠損を治療するために、前記角膜欠損の部位に前記製剤を適用することと、を含む、方法。
【請求項26】
対象の角膜欠損を治療するのに使用するための、請求項１～１６のいずれか一項に記載のバイオエンジニアリング製剤。
【請求項27】
対象の角膜欠損を治療するのに使用するための、請求項２３に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、生物学的ヒドロゲル製剤に関する。特に、本開示は、角膜用途のためのバイオエンジニアリング製剤に関する。本開示はまた、バイオエンジニアリング製剤を調製するためのプロセス、およびその適用を提供する。
【背景技術】
【0002】
角膜失明は世界で４番目に多い失明の原因であり、毎年世界中で推定１５０万人の新しい症例が報告されている。世界で約１，０００万人が両側性角膜失明にかかっており、さらに２，３００万人が片側性角膜失明にかかっている。角膜機能障害の主な原因としては、トラコーマ（角膜の瘢痕および血管新生を含む）、眼球外傷、角膜潰瘍、および単純ヘルペスウイルスによる感染症などが挙げられる（Ｃｏｒｎｅａｌ ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ：ａ ｇｌｏｂａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｗｈｉｔｃｈｅｒ ＪＰ，Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｍ，Ｕｐａｄｈｙａｙ ＭＰ Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．２００１；７９（３）：２１４－２１）。角膜疾患の主要な医学的治療のうちの１つとしては、角膜移植術（角膜移植）が挙げられる。しかしながら、角膜移植に関連する様々な合併症があり、（ｉ）角膜移植術の患者が、器官（角膜）拒絶反応を経験すること、（ｉｉ）眼ヘルペスまたは真菌性角膜炎などの感染症による瘢痕、（ｉｉｉ）緑内障（眼内圧の上昇）、（ｉｖ）角膜形状の不規則な曲線によって引き起こされる視力の問題（視覚の鋭さ）、（ｖ）角膜移植の剥離、（ｖｉ）生体組織の安全な摘出、保管、および輸送を取り巻く高コストおよび不便が挙げられる。
【0003】
角膜移植に関連する限界を見ると、科学者たちによって様々な努力がなされてきた。近年、角膜移植に関連する問題を解決するために、生体材料の使用および組織工学におけるレシピエント自身の細胞の組み込みが最も重要になっている。例えば、組織接着剤は、損傷後または角膜手術中に眼創傷を閉鎖するために広く使用されてきた。角膜手術では、それらは主に、手術後の穿孔を閉鎖するための無縫合の代替物として使用される。眼疾患を治療するために、様々な生体材料が文字通り報告されている。例えば、ＪＰ２０１４／１２９４０８Ａは、処理したキトサン、修飾したキトサン、修飾処理したキトサン、またはそれらの混合物もしくは組み合わせを含む生体材料を開示し、少なくとも１つのキトサンは、処理したキトサン、修飾したキトサン、または修飾処理したキトサンである。生体材料を作製し、それを使用するための方法もまた、文書に開示されている。
【0004】
しかしながら、従来の眼用接着剤は、重合が速く発熱し、生体適合性が低く、透明度が低く表面が粗く、取り扱いが難しく、滞留時間が短く、宿主の眼組織との一体性が低いなどの顕著な欠点に悩まされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、任意の副作用を回避する角膜疾患の治療に役立つ天然の角膜の特徴に一致する、効果的な、生体適合性および生分解性の架橋ヒドロゲル製剤を開発するという当該技術分野での長年の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示の一態様では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0007】
本開示の別の態様では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。
【0008】
本開示の別の態様では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合を得ることと、（ｉｉ）予混合を光開始剤溶液と接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0009】
本開示の別の態様では、対象の角膜欠損を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ａ）本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、を含む。
【0010】
本開示の別の態様では、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤が提供される。
【0011】
本開示の別の態様では、対象の角膜欠損を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ａ）（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｉｉ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を得ることと、（ｂ）対象の角膜欠損を治療するために、角膜欠損の部位に製剤を適用することと、を含む。
【0012】
本主題のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明および添付の特許請求を参照することにより、よりよく理解されるであろう。この要約は、簡略化された形式で概念の選択を紹介するために提供される。この要約は、特許請求される主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図されていない。
【0013】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の態様をさらに説明するために含まれている。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってよりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】（Ａ）圧縮弾性率および（Ｂ）接着強度についての「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ（両方とも置換度（ＤｏＳ）５０％を有する）を含むバイオエンジニアリング製剤のスクリーニング結果のグラフ表示を示す。本開示の一実施形態による棒グラフ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図2】（Ａ）圧縮弾性率および（Ｂ）接着強度についての１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ（両方とも置換度（ＤｏＳ）３０％を有する）を含むバイオエンジニアリング製剤のスクリーニング結果のグラフ表示を示す。本開示の一実施形態による棒グラフ（平均＋／－ＳＤ、ｎ＝３）。
【図3】（Ａ）圧縮弾性率および（Ｂ）接着強度についての５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ（両方とも置換度（ＤｏＳ）５０％を有する）を含むバイオエンジニアリング製剤のスクリーニング結果のグラフ表示を示す。本開示の一実施形態による棒グラフ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図4】Ｇｅｌ－ＭＡとの比較で示される１×ＰＢＳに関する「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤（両方ともＤｏＳ ５０％）に対する可視光透過率ベースのスクリーニングを示す。本開示の一実施形態による棒グラフ（平均＋／－ＳＤ、ｎ＝３）。
【図5】「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨおよびＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｗ、ＤｏＳ＞９５％）製剤に対するエクスビボ破裂圧力試験を示す。棒グラフ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。本開示の一実施形態によれば、目標値は２．５ｋＰａに設定される。
【図6】本開示の一実施形態による、（Ａ）成分が別々に再構成および混合されるバイオエンジニアリング製剤調製プロトコル、（Ｂ）成分が粉末形態で予混合されてから生理食塩水で再構成される予混合バイオエンジニアリング製剤調製プロトコルを示す。
【図7】本開示の一実施形態による、周囲光におけるＤｏＳ ５０％の「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤の架橋反応速度を、（Ａ）貯蔵弾性率Ｇ’および（Ｂ）複素粘度のプロットで示す。
【図8】本開示の一実施形態による、１００ｍＷ／ｃｍ２の白色光での、予混合ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）製剤の架橋反応速度のＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｗ、ＤｏＳ＞９５％）の架橋反応速度との比較を示す。
【図9】本開示の一実施形態による、時間（エラーバーは、ｎ＝３サンプルの標準偏差を表す）に関するＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｗ、ＤｏＳ＞９５％）と比較したＤｏＳ ５０％の「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤の膨潤プロファイルを示す。
【図10】本開示の一実施形態による、時間に関して比較した「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（ＤｏＳ ５０％を含む）の生分解プロファイルを示す。
【図11】本開示の一実施形態による、本開示のバイオエンジニアリング製剤を調製するための最適化されたプロトコルを示す。
【図12】本開示の一実施形態による、インビトロで３日目および１３日目の２Ｄカバースリップ、Ｇｅｌ－ＭＡ（２０％、ＤｏＳ＞９５％）、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）ヒドロゲル表面の初代ヒト角膜上皮細胞による上皮化を示す位相差顕微鏡画像を示す。（スケールバー＝１００μｍ）。
【図13】本開示の一実施形態による、「バイオエンジニアリング角膜」ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル表面（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）およびＧｅｌ－ＭＡ（２０％、ＤｏＳ＞９５％）および２Ｄ培養表面で培養されたＣＬＳＣの細胞生存率研究を示す。（スケールバー＝５００μｍ）。
【図14】本開示のヒドロゲル製剤およびＧｅｌ－ＭＡ（２０％、ＤｏＳ＞９５％）にカプセル化されたＣＬＳＣの細胞生存率研究を示す。カバースリップ上の細胞を表面で培養した。Ａ）およびＢ）は、異なるＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨ製剤（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）、Ｇｅｌ－ＭＡならびに２Ｄ表面で実施された実験を表す。Ｃ）は、４０／１２５（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）ＢＣｖ１．２製剤について１４日目にマークされた領域の拡大画像を示す。Ｄ）は、本開示の一実施形態による、ＢＣｖ１．２ヒドロゲル内の生細胞の均一な分布を示す画像の層ごとの３Ｄ構造物を示す。（スケールバー＝２００μｍ）。
【図15】本開示の一実施形態による、２Ｄ培養表面に関してヒドロゲル製剤にカプセル化されたＣＬＳＣによるＣＤ９０（赤色で表示）およびαＳＭＡ（緑色で表示）の発現を示す免疫蛍光研究を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図16】ウサギモデルのインビボでのヒドロゲル製剤の前臨床試験を示す。本開示の一実施形態による、（Ａ）シアノアクリレート接着剤による治療を受けているウサギの角膜、（Ｂ）は、本開示のヒドロゲル製剤を受けているウサギ角膜を示す。
【図17】本開示の一実施形態による、幹細胞およびエクソソームを含むバイオエンジニアリング製剤を調製するための最適化されたプロトコルを示す。
【図18】本開示の一実施形態による、ＩＦＮγ（Ａ）、ＴＮＦ－α（Ｂ）、ＩＬ－１β（Ｃ）、ＩＬ－６（Ｄ）、ＩＬ－１０（Ｅ）およびＶＥＧＦＡ（Ｆ）について測定されたサイトカイン発現（転写産物）を示す。
【図19】ｈＢＭ－ＭＳＣエクソソームの血管新生活性を示す。抗血管新生アッセイでは、対照（Ａ－Ｂ）とｈＢＭ－ＭＳＣエクソソーム（Ｃ－Ｄ）処理した内皮細胞との間で、管形成に有意差は観察されなかった。本開示の一実施形態によれば、血管新生促進アッセイでは、対照（Ｅ－Ｆ）とｈＢＭ－ＭＳＣエクソソーム（Ｇ－Ｈ）処理した内皮細胞との間で、管形成の有意差は観察されなかった。
【図20】ｈＢＭ－ＭＳＣから単離されたエクソソームの機能的特徴を示す。（Ａ）複数の時点（０、１２、２４、４８、７２時間）にわたって観察された、ヒト角膜上皮細胞の単層上の創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像、（Ｂ）７２時間でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）のパーセンテージの定量化。本開示の一実施形態によれば、画分Ｆ９およびｃａｐｔｏｃｏｒｅ画分Ｆ９－ＣＣ（１μｇ）からのエクソソーム（４×１０８）は、強力な創傷治癒能力を示した。
【図21】本開示のヒドロゲル製剤からのカプセル化されたエクソソームの放出を示す。生体高分子（ＨＡ／ＭＡ＋ＲＣＰ－ＳＨ）でカプセル化されたエクソソームの放出は、ウエスタンブロッティングによって定量化された。ヒドロゲルをエクソソームと混合し、ＰＢＳ中で３７℃、指示された時点でインキュベートした。上清を異なる時点で収集し、エクソソーム特異的マーカーＣＤ６３の発現について分析した。エクソソームの持続放出は、１６日目から２８日目までウエスタンブロットによって検出された。本開示の一実施形態による、Ｋｅｙ：ＣＭのエクソソーム：培養培地のエクソソーム、Ｅｎｃａｐ．：ヒドロゲルカプセル化されたエクソソーム。
【図22】本開示のヒドロゲル製剤中のカプセル化されたＭＳＣの細胞生存率に対するエクソソームの影響を示す。エクソソームの存在下では、カプセル化されたＭＳＣの細胞生存率は、対照としてのみ機能する細胞と比較して、５日目のＨＡ／ＲＣＰ（ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）ヒドロゲルでかなり高かった。Ｇ＋Ｃ：細胞を含むヒドロゲル、ＧＣ Ｅｘ．ＣＭ：培養培地を介してエクソソームを受けている細胞カプセル化ゲル、ＧＣ Ｅｘ．Ｅｎｃ．：細胞およびエクソソームはゲルに一緒にカプセル化されている、ＧｅｌＭＡ：ゼラチンメタクリレート。本開示の一実施形態によれば、データは、ｎ＝３回複製を伴う平均±ＳＥとして表される。
【図23】（Ａ）２Ｄ、（Ｂ）４０／１２５ ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨの表面、および（Ｃ）エクソソーム補足培地を含む４０／１２５ ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨの表面でのヒト皮膚線維芽細胞の培養を示す。本開示の一実施形態によれば、エクソソームは、すべての研究にわたって使用される濃度（４億エクソソーム／ｍｌ）で細胞に対して細胞毒性効果を有するように見えなかった。
【図24】ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞に対するＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来エクソソームの抗炎症効果を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を４×１０８エクソソーム（１μｇ）で処理した後、ＬＰＳで４時間刺激した。本開示の一実施形態によれば、（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＬ－１０、（Ｃ）ＴＮＦ－αおよび（Ｄ）ＩＬ－１βについてＥＬＩＳＡによって分泌されたサイトカインのレベルを定量化した。
【図25】本開示の一実施形態による、ＣＬＳＣ－ＣＭ／セクレトームの血管新生活性を示す。
【図26】ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞に対するＣＬＳＣ－馴化培地／セクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ馴化培地／セクレトームの抗炎症効果を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、５０％の補充（５０万ＢＭＭＳＣから収集）でＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣのいずれかから収集された馴化培地で処理した後、ＬＰＳで４時間刺激した。本開示の一実施形態によれば、（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＬ－１０、（Ｃ）ＴＮＦ－αおよび（Ｄ）ＩＬ－１βについてＥＬＩＳＡによって分泌されたサイトカインのレベルも定量化した。
【図27】ＣＬＳＣ、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ、およびＢＭＭＳＣセクレトームの創傷治癒活性の比較を示す。本開示の一実施形態による、（Ａ）複数の時点（０、１２、２４、４８時間）にわたって観察された、セクレトームの存在下（２０万の供給源ＭＳＣに相当）でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像、（Ｂ）複数の時点（０、１２、２４、４８、７２時間）にわたって観察された、４×１０８エクソソームの存在下（２０万の供給源ＭＳＣに相当）でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像。
【図28】インビトロ神経支配アッセイの結果を示す。ＣＬＳＣ－エクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣエクソソームは、ＰＣ１２細胞の神経支配（神経突起伸長）を４億エクソソーム／ｍｌで促進する。細胞を陽性対照（Ｂ、Ｈ）として２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで処理した。（Ａ－Ｆ）スケールバー：１００μｍ、（Ｇ－Ｌ）スケールバー：５０μｍおよび１００μｍ。黄色の矢印は、本開示の一実施形態による、神経突起伸長を示す。
【図29】本開示の一実施形態による、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣからの（Ａ）エクソソームおよび（Ｂ－Ｃ）セクレトームにおけるＮＧＦの分泌レベルを示す。
【図30】ＣＬＳＣ－エクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたエクソソームの抗線維化効果を示す。ヒト皮膚線維芽細胞を、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間線維化を誘導する前に、示したエクソソーム（４×１０８／ｍｌ）で４時間前処理した。本開示の一実施形態によれば、細胞を抗α－ＳＭＡ抗体（緑色で示される）（線維症のマーカー）およびＤＡＰＩ（核、青色で示される）で染色した。
【図31】本開示の一実施形態による、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームおよびセクレトームの血管新生活性の特徴付け：（Ａ）セクレトーム、（Ｂ）エクソソームのＶＥＧＦタンパク質レベル、および（Ｃ－Ｄ）セクレトーム、（Ｅ）エクソソームのｓＦＬＴ１タンパク質レベルを示す。
【図32】４時間でのヒト角膜上皮細胞による点眼製剤中のＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来エクソソームの細胞取り込みを示す。エクソソームをＰＫＨ２６（赤色で示される）で標識し、４時間ライブイメージングが行われた。本開示の一実施形態によれば、エクソソームの取り込みは、試験されたすべての製剤で観察された。
【図33】４時間でのヒト角膜上皮細胞による点眼製剤中のＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来エクソソームの細胞取り込みを示す。エクソソームをＰＫＨ２６（赤色で示される）で標識し、細胞と４時間インキュベートした。本開示の一実施形態によれば、細胞を固定し、サイトケラチン－３（緑色で示される）およびＤＡＰＩ（青色で示される）で標識した。
【図34】点眼製剤の抗炎症活性を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞を、上記の示された臨床グレードＨＡの濃度（０．１～５％）で再構成されたエクソソーム（２５％のＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ－エクソソーム）（４×１０８エクソソーム／ｍｌ）の存在下または非存在下でＬＰＳで活性化した。上記のように、様々な濃度のＨＡは、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたエクソソームの抗炎症活性に影響を与えず、点眼製剤形式でのエクソソームの治療効果を保証する。本開示の一実施形態によれば、（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＬ－１０、（Ｃ）ＴＮＦ－αおよび（Ｄ）ＩＬ－１βの分泌を、前述のようにＥＬＩＳＡによって定量化した。
【図35】固有粘度を計算するためにレオメータから得られた代表的な生データを示す。本開示の一実施形態によれば、固有粘度は、０に近づく剪断速度での粘度として定義される。
【図36】本開示の一実施形態による、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得られた「３３ｋＤａ」ＨＡ原料のＧＰＣデータを示す。
【図37】本開示の一実施形態による、原料（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に由来し、ＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧ Ｗｏｒｋｓによって誘導体化された「３３ｋＤａ」ＨＡメタクリレートのＧＰＣデータを示す。
【図38】本開示の一実施形態による、「３３ｋＤａ」ＨＡ－ＭＡの代表的なＨ－ＮＭＲデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変更および修正の対象となることに気付くであろう。本開示は、そのようなすべての変更および修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または示されるそのようなすべてのステップ、特徴、組成物、および化合物、ならびにそのようなステップまたは特徴のいずれかまたは複数の任意およびすべての組み合わせを含む。
【0016】
定義
便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、および例がここに描かれている。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上および完全を期すために、特定の用語およびそれらの意味を以下に示す。
便宜上、本開示のさらなる説明の前に、本明細書で使用される特定の用語、および例がここに描かれている。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読み、当業者によって理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、当業者に認識され、知られている意味を有するが、便宜上および完全を期すために、特定の用語およびそれらの意味を以下に示す。
【0017】
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という冠詞は、冠詞の文法的な対象の、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
【0018】
「含む」および「含むこと」という用語は、追加の要素が含まれる場合があることを意味する包括的でオープンな意味で使用される。「のみからなる」と解釈されることを意図するものではない。
【0019】
本明細書全体を通じて、文脈上別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された要素もしくはステップ、または要素もしくはステップの群を含むことを意味するが、任意の他の要素もしくはステップ、または要素もしくはステップの群を除外するものではないことを理解されたい。
【0020】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むがこれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味するために使用される。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含むがこれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」は交換可能に使用される。
【0021】
本文書の目的のために、「バイオエンジニアリング製剤」という用語は、異なる組成のポリマー混合物を指す。本開示では、「バイオエンジニアリング製剤」および「ヒドロゲル製剤」という用語は、交換可能に使用される。架橋プロセスは、光開始剤の添加後に開始するが、本開示に開示されるように、特定の強度の白色光の曝露後にのみ架橋が完了する。当業者は、分子量、置換度、圧縮弾性率、および引張強度などの特定のパラメータの試験は、ヒドロゲルのような架橋生成物でのみ可能であることを理解するであろう。分子量および程度または置換は、生体高分子の特性であり、同じ鎖を含む他の高分子とは異なる。
【0022】
ポリマーの置換度（ＤＯＳ）は、塩基単位（縮合ポリマーの場合）またはモノマー単位（付加ポリマーの場合）ごとに結合した置換基の（平均）数である。
【0023】
本明細書で使用される「コラーゲン」および「コラーゲン配列由来ペプチド」という用語は、上述のポリペプチドおよびタンパク質配列の天然、合成、組換えおよび／または代替バージョンを含むために使用される。
【0024】
「修飾ヒアルロン酸」または「修飾コラーゲンペプチド」または「修飾コラーゲン」または「修飾シルク」または「修飾セルロース」または「ポリエチレングリコール」または「修飾ポリビニルアルコール」または「修飾アルギン酸」という用語は、それぞれの分子において可能な任意の種類の修飾を意味する。行われた特定の修飾は、提示された開示でカバーされている。例えば、修飾セルロースとは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）などの修飾分子を意味することを目的とする。
【0025】
「間葉系幹細胞由来の馴化培地」または「ＭＳＣ－ＣＭ」という用語は、ＭＳＣの増殖後に得られる培地を指す。このようにして得られた馴化培地は、分泌された細胞モジュレータおよび組織再生に重要な複数の因子を含む。このようにして得られた馴化培地はまた、セクレトーム、および治療目的に適用することができる前に馴化培地から精製する必要があるエクソソームを含む。本明細書に記載の拡張ＭＳＣを得るためのプロセスはまた、ＭＳＣ－ＣＭの形成につながり、したがって、単一のプロセスは、拡張ＭＳＣの集団ならびにＭＳＣ－ＣＭの調達につながると言うことができる。「エクソソーム」という用語は、それらを分泌する生物学的細胞の構成物（タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡの観点から）を含有する細胞外小胞のタイプを指す。本明細書に記載の馴化培地から得られたエクソソームは、治療目的で使用される。
【0026】
「角膜実質幹細胞由来の馴化培地」または「ＣＳＳＣ－ＣＭ」という用語は、角膜実質幹細胞（ＣＳＳＣ）が増殖する培地を指す。本明細書に記載のＣＳＳＣ－ＣＭは、当該技術分野で知られている方法でＣＳＳＣを培養することによって、または本明細書に開示される方法に従ってＣＳＳＣを培養することによって得られる。角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）は、以前のＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているように輪部リングから単離される。これらの細胞は、角膜実質幹細胞（ＣＳＳＣ）および輪部上皮幹細胞（ＬＥＳＣ）の２つの亜集団に分けることができる。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３は、ＣＳＳＣ単離の方法を開示し、そこで使用されるプロトコルによるＬＥＳＣを介したＣＳＳＣ集団の濃縮を実証する。しかしながら、ＣＳＳＣ濃縮画分に残されたＬＥＳＣの集団が少ない場合、これらの出願のすべての細胞型をカバーするために、同じものが「ＣＬＳＣ」と呼ばれる。したがって、そのようなＣＳＳＣ濃縮集団に由来する馴化培地は、ＣＳＳＣ由来の馴化培地（ＣＳＳＣ－ＣＭ）として知られている。簡単にするために、ＣＳＳＣ－ＣＭという用語は、ＬＥＳＣの少数の集団も存在する濃縮ＣＳＳＣを培養することによって得られる馴化培地を表すためにも使用されることが理解される。
【0027】
本開示に記載される「ゼノフリー」という用語は、非ヒト動物に由来するいかなる生成物も含まない、本明細書に記載のプロセスを指す。ゼノフリーである方法は、臨床用途の妥当性のために重要な利点である。「スケーラブルな」という用語は、生産量を何倍にも増やす能力を指す。「対象」という用語は、本開示で言及されるような状態に苦しむヒト対象を指す。「治療有効量」という用語は、対象の状態を治療するために必要とされる組成物の量を指す。
【0028】
「培養培地」という用語は、ＭＳＣが培養される培地を指す。培養培地は、ＭＳＣ基本培地を含み、ＭＳＣ基本培地は、培養されているＭＳＣに従って使用される。本開示で言及されるようなＭＳＣ基本培地は、商業的に調達された。本開示の目的のために、ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏゼノフリー培地をＢＭＭＳＣに使用した。
【0029】
「馴化培地」という用語は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、角膜実質細胞成長因子（ＫＧＦ）、および可溶性フォーム様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴ１）、色素上皮由来成長因子（ＰＥＤＦ）、トロンボスポンジンおよびｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－１４５を含む様々な分子を含有するエクソソーム、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ｓＦＬＴ１およびホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホグルコムターゼ、エノラーゼ、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＭＭＰ９などの様々なタンパク質／成長因子などの細胞分泌因子が濃縮された培地を指す。馴化培地の組成物は、治療用途に利用することが意図される。「細胞モジュレータ」という用語は、ＥＣＭ、成長因子、広範囲の小分子および高分子を含有するエクソソームカーゴ、自然界の多くのタンパク質または核酸などの様々な分泌因子を指す。これらのいくつかには、細胞応答を調節することができるマイクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、脂質メディエータが含まれる。「エクソソーム」という用語は、自然界のタンパク質または核酸のカーゴ分子を含有する細胞分泌小胞を指し、抗炎症、抗線維化および再生特性などの臨床的に関心のある分子を伴う２０～２００ｎｍの範囲を指すことが多い。
【0030】
「角膜欠損」または「角膜障害」という用語は、医療介入を必要とする角膜の問題を示すために交換可能に使用されてきた。介入は、本開示に記載されているように、損傷した角膜をバイオプリンティングされたレンチキュール（ｌｅｎｔｉｃｕｌｅ）で置き換える程度まで可能である。
【0031】
比率、濃度、量、およびその他の数値データは、本明細書では範囲形式で提示することができる。このような範囲形式は、単に便宜上および簡潔にするために使用され、範囲の限界として明示的に列挙された数値だけでなく、各数値およびサブ範囲が明示的に記載されているかのように、その範囲内に包含されるすべての個々の数値またはサブ範囲を含むように柔軟に解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【0032】
当該技術分野で直面する問題を克服するために、本開示は、バイオエンジニアリング製剤の適切な架橋を促進し、角膜実質損失の非侵襲的で迅速かつ長期の修復に使用することができるポリマーの組み合わせを含むバイオエンジニアリング製剤を提供する。
【0033】
本開示は、修飾コラーゲンペプチドおよび修飾ヒアルロン酸の組み合わせを含むバイオエンジニアリング製剤を提供する。２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸との組み合わせの使用は、バイオエンジニアリング製剤の物理的および生体力学的特性を改善するのに役立つ。本開示のバイオエンジニアリング製剤は、光の存在下で光開始剤で架橋されて、角膜組織にしっかりと接着する透明な架橋ヒドロゲルを得る。さらに、バイオエンジニアリング製剤は、天然の角膜組織の特性と一致する物理的、機械的、および生物学的特性を備えているため、生体模倣である。例えば、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。さらに、バイオエンジニアリング製剤は、インビトロ条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。さらに、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、ヒト角膜上皮細胞の遊走および増殖を促進し、表面上皮化をサポートし、それによって、生体適合性および角膜模倣特性を確認する。
【0034】
本開示のバイオエンジニアリング製剤は、幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせをさらに含み、バイオエンジニアリング製剤にカプセル化され、抗線維化、抗血管新生、抗炎症および再神経支配促進特性を示す。バイオエンジニアリング製剤にエクソソームを添加すると、免疫原性および腫瘍形成能の低さ、組織特異的なホーミング能力、塞栓形成のリスクの低さを含む、エクソソームの治療上の利点が高いため、様々な角膜損傷およびジストロフィに対処するのに役立つ。本開示のバイオエンジニアリング製剤はまた、角膜欠損の部位での幹細胞、もしくはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの持続放出性をより長期間促進し、製剤の創傷治癒能力を増強するのに役立つ。本開示はまた、角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、のステップを含む角膜欠損または角膜障害を治療する方法を提供する。角膜欠損の部位に透明度の高いバイオエンジニアリング製剤を適用すると、角膜の瘢痕のない創傷治癒を促進するのに役立つ。本開示のバイオエンジニアリング製剤は、上皮および角膜実質の損傷／感染（活性炎症）を伴う前角膜瘢痕、ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）（持続性角膜上皮欠損）、ステージ２ＮＫ（滑らかで丸められたエッジを特徴とする大きな持続性上皮欠損）、ステージ３ＮＫ（深い角膜潰瘍、角膜実質融解、および無菌性前房蓄膿）、モーレン潰瘍、円錐角膜、および角膜穿孔などの角膜潰瘍を含むが、これらに限定されない角膜欠損または角膜疾患を治療するのに役立つ。本開示のバイオエンジニアリング製剤はまた、角膜実質が対象において損傷を受けている、角膜輪部損傷および角膜ジストロフィ（ＣＤ）、例えば格子状ＣＤ１型、顆粒状ＣＤ１型、および先天性角膜実質ＣＤなどを治療するのに役立つ。さらに、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、上皮および角膜実質の両方が損なわれる、シュナイダーＣＤおよび格子状ＣＤ２型の潜在的な治療として機能する。
【0035】
本開示のバイオエンジニアリング製剤の使用に続いて、効率的な再上皮化を増強するだけでなく、損傷によって誘発された線維症および損傷を取り巻く炎症の回復を促進する、幹細胞、もしくはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの一定期間にわたる持続放出を可能にするエクソソーム点眼薬を使用する術後ケアがある（ヒドロゲル適用後）。さらに、本開示は、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を提供する。カプセル化されたエクソソームと臨床的に承認された点眼製剤を組み合わせることで、任意の炎症反応を抑制し、血管新生を伴わずに線維性瘢痕を徐々に治癒させることができる。
【0036】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実践または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0037】
本開示は、例示のみを目的とすることが意図される、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。機能的に同等の生成物、組成物、および方法は、本明細書に記載されているように、明らかに本開示の範囲内にある。
【0038】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。本開示の別の実施形態では、２５～７５ｋＤａの範囲の分子量を有し、２５～７０％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチド。本開示のさらに別の実施形態では、３０～７０ｋＤａの範囲の分子量を有し、３５～６０％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチド。本開示の別の一実施形態では、４０～６０ｋＤａの範囲の分子量を有し、４０～５５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチド。
【0039】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。本開示の別の実施形態では、１５～４５ｋＤａの範囲の分子量を有し、２５～７０％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸。本開示のさらに別の実施形態では、２０～４０ｋＤａの範囲の分子量を有し、３５～６５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸。本開示の別の一実施形態では、２５～３５ｋＤａの範囲の分子量を有し、５０～５５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸。
【0040】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。本開示のさらに別の実施形態では、第１のポリマーは、３０～７０ｋＤａの範囲の分子量を有し、第２のポリマーは、３０～３７ｋＤａの範囲の分子量を有している。
【0041】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、架橋されている。
【0042】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有する。
【0043】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。本開示の別の実施形態では、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して３０～２２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２５～７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。本開示のさらに別の実施形態では、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して４０～２００ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して３０～６０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。本開示の別の一実施形態では、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して５０～１７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して３２～５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。
【0044】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾ヒアルロン酸は、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。
【0045】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択される。本開示の別の実施形態では、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチドである。本開示のさらに別の実施形態では、修飾コラーゲンペプチドは、メタクリル化コラーゲンペプチドである。
【0046】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される。本開示の別の実施形態では、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸である。本開示のさらに別の実施形態では、修飾ヒアルロン酸は、チオール化ヒアルロン酸である。
【0047】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択される。
【0048】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される。
【0049】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される。
【0050】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される。
【0051】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。本開示の別の実施形態では、幹細胞のうちの少なくとも１種類は、間葉系幹細胞である。本開示のさらに別の実施形態では、幹細胞のうちの少なくとも１種類は、角膜実質幹細胞である。本開示の別の一実施形態では、幹細胞のうちの少なくとも１種類は、角膜輪部幹細胞である。
【0052】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、間葉系幹細胞が、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択される、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0053】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0054】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、間葉系幹細胞が、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択される、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0055】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、幹細胞が、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。本開示の別の実施形態では、幹細胞は、４０万～９００万細胞、または５０万～７００万細胞、または１００万～５００万細胞の範囲で存在する。
【0056】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、幹細胞が、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0057】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、間葉系幹細胞が、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、幹細胞が、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0058】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類であって、間葉系幹細胞が、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、幹細胞が、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する、幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0059】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0060】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0061】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、エクソソームが、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有する、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。本開示の別の実施形態では、エクソソームは、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり１０億～２００億エクソソームの範囲の濃度を有する。本開示のさらに別の実施形態では、エクソソームは、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５０億～１５０億エクソソームの範囲の濃度を有する。本開示の別の一実施形態では、エクソソームは、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり７０億～１００億エクソソームの範囲の濃度を有する。
【0062】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームが、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0063】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、エクソソームが、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有し、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームが、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0064】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、エクソソームが、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有する、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0065】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームが、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0066】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームであって、エクソソームが、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有し、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームが、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである、エクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0067】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸が、メタクリル化ヒアルロン酸であり、修飾コラーゲンが、チオール化コラーゲンペプチドである。
【0068】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸であり、修飾コラーゲンは、チオール化コラーゲンペプチドである。
【0069】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｄ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0070】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｄ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0071】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸であって、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある、修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択され、間葉系幹細胞は、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、幹細胞は、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する。
【0072】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、修飾コラーゲンペプチドが、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸が、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドが、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸が、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択される、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択され、間葉系幹細胞は、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、幹細胞は、１０万～１，０００万細胞の範囲で存在する。
【0073】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸であって、修飾コラーゲンペプチドが、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある、修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択され、エクソソームは、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有し、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームは、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである。
【0074】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチド、およびメタクリル化コラーゲンペプチドからなる群から選択され、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸、およびチオール化ヒアルロン酸からなる群から選択され、エクソソームは、バイオエンジニアリング製剤の１ｍｌ当たり５億～２５０億エクソソームの範囲の濃度を有し、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソームは、角膜実質幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞に由来するエクソソームである。
【0075】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。
【0076】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、適切な条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、最大で２％、または６％、または８％、または１５％、または１７％、または２０％、２５、または３０％、３５％、または４０％、または４５％、または４８％に対して耐性があり得る。
【0077】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチドまたは修飾コラーゲンペプチド、コラーゲンまたは修飾コラーゲン、セルロースまたは修飾セルロースからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸または修飾ヒアルロン酸、ポリエチレングリコールまたは修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリビニルアルコール、シルクまたは修飾シルク、ゼラチンまたは修飾ゼラチン、およびアルギン酸または修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。
【0078】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、バイオエンジニアリング製剤は、適切な条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。
【0079】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、少なくとも８７％の透明度を有する。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、８８～１００％、または９０～９８％、または９２～９６％の透明度を有する。
【0080】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、少なくとも２０ｋＰａの接着強度を有する。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、２１～９９ｋＰａの範囲の接着強度を有する。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、２５～９０ｋＰａの範囲の接着強度を有する。本開示のさらに別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、４０～８０ｋＰａの範囲の接着強度を有する。本開示の別の一実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、５０～７０ｋＰａの範囲の接着強度を有する。
【0081】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチドまたは修飾コラーゲンペプチド、コラーゲンまたは修飾コラーゲン、セルロースまたは修飾セルロースからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸または修飾ヒアルロン酸、ポリエチレングリコールまたは修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリビニルアルコール、シルクまたは修飾シルク、ゼラチンまたは修飾ゼラチン、およびアルギン酸または修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、バイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、１００～１３００ｋＰａ、または１００～１０００ｋＰａ、または１００～７００ｋＰａ、または１００～６００ｋＰａ、または１００～３００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。
【0082】
本開示の一実施形態では、コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有し、バイオエンジニアリング製剤は、適切な条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。本開示の別の実施形態では、バイオエンジニアリング製剤は、適切な条件下で、２８日以内に最大４０％、または３０％、または２０％、または１０％の分解に対して耐性がある。
【0083】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～６０ｋＤａの範囲の分子量を有し、４０～６０％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～５０ｋＤａの範囲の分子量を有し、４０～６０％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0084】
本開示の一実施形態では、（ａ）５０ｋＤａの分子量を有し、５０％の置換度を有するチオール化コラーゲンペプチドと、（ｂ）３３ｋＤａの範囲の分子量を有し、５０％の範囲の置換度を有するメタクリル化ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0085】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0086】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、暗条件下でｐＨ７で、３５～４５℃の範囲の温度でバイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含み、修飾コラーゲンペプチドは、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、修飾ヒアルロン酸は、組成物に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する。
【0087】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含み、光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、光開始剤溶液は、バイオエンジニアリング製剤に関して０．５×～１×の範囲の量で存在する。本開示の別の実施形態では、光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０７～０．０９ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、光開始剤溶液は、バイオエンジニアリング製剤に関して０．６×～０．９×の範囲の量で存在する。
【0088】
本開示の一実施形態では、本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合を光開始剤溶液と接触させた後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露して、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0089】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを幹細胞のうちの少なくとも１種類と接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0090】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞のうちの少なくとも１種類と、を含むバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを幹細胞のうちの少なくとも１種類と接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含み、光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、光開始剤溶液は、バイオエンジニアリング製剤に関して０．５×～１×の範囲の量で存在する。
【0091】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、角膜輪部幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選択される少なくとも１種類の幹細胞と、を含むバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを少なくとも１種類の幹細胞と接触させた後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露して、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。本開示の別の実施形態では、予混合Ｂを幹細胞のうちの少なくとも１種類と接触させた後、６０～１２０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１０分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露する。本開示のさらに別の実施形態では、予混合Ｂを幹細胞のうちの少なくとも１種類と接触させた後、８０～１００ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、２～８分間の範囲の期間曝露する。
【0092】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤を調製するためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂをエクソソームと接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0093】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤を調製するためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂをエクソソームと接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含み、光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、光開始剤溶液は、バイオエンジニアリング製剤に関して０．５×～１×の範囲の量で存在する。
【0094】
本開示の一実施形態では、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、（ｃ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤を調製するためのプロセスが提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂをエクソソームと接触させた後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露して、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0095】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｄ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１２～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを幹細胞およびエクソソームと接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0096】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｄ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを幹細胞およびエクソソームと接触させて、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含み、光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．０５～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含み、光開始剤溶液は、バイオエンジニアリング製剤に関して０．５×～１×の範囲の量で存在する。
【0097】
本開示の一実施形態では、（ａ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、（ｃ）間葉系幹細胞、角膜実質幹細胞、および角膜輪部幹細胞からなる群から選択される幹細胞と、（ｄ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、を含むバイオエンジニアリング製剤が提供され、上述のプロセスは、（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドを、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸に接触させて、予混合Ａを得ることと、（ｉｉ）予混合Ａを光開始剤溶液と接触させて、予混合Ｂを得ることと、（ｉｉｉ）予混合Ｂを幹細胞およびエクソソームと接触させた後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の期間曝露して、バイオエンジニアリング製剤を得ることと、を含む。
【0098】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損または角膜障害を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ａ）（ｉ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｉｉ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含むバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、を含む。本開示の別の実施形態では、対象の角膜欠損を治療するために、対象の角膜欠損を治療するために、５～１０分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で７０～１００ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射すること。
【0099】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損または角膜障害を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ａ）（ｉ）コラーゲンペプチド、修飾コラーゲンペプチド、コラーゲン、および修飾コラーゲンからなる群から選択される第１のポリマーと、（ｂ）ヒアルロン酸、修飾ヒアルロン酸、セルロース、修飾セルロース、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、修飾ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、修飾ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、シルク、修飾シルク、ゼラチン、修飾ゼラチン、アルギン酸、および修飾アルギン酸からなる群から選択される第２のポリマーであって、製剤が、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する、第２のポリマーと、を含むバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、を含む。
【0100】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損または角膜障害を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ａ）本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、を含み、上述の方法は、（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｉｉ）適切な量の製剤を適用する前または後に、角膜欠損の部位での臨床的に承認された点眼製剤と、を含む溶液を適用することをさらに含む。
【0101】
本開示の一実施形態では、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤が提供され、点眼製剤は、０．１～０．２５％のヒアルロン酸を含む。本開示の別の実施形態では、点眼製剤は、０．２～０．２２％のヒアルロン酸を含む。
【0102】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損を治療するための方法が提供され、上述の方法は、（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｉｉ）臨床的に承認された点眼製剤であって、点眼製剤が、０．１～０．２５％のヒアルロン酸を含む、臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を得ることと、（ｂ）対象の角膜欠損を治療するために、角膜欠損の部位に製剤を適用することと、を含む。
【0103】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損を治療するのに使用するための、本明細書に記載のバイオエンジニアリング製剤が提供される。
【0104】
本開示の一実施形態では、対象の角膜欠損を治療するのに使用するための、本明細書に記載の製剤が提供される。
【0105】
主題は、特定の実施例およびその実装を参照してかなり詳細に説明されてきたが、他の実装が可能である。
【実施例】
【0106】
ここで、本開示は、本開示の機能を説明することを意図し、本開示の範囲に対する制限を暗示することを限定的にとることを意図しない、実施例を用いて説明される。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を、本開示の方法および組成物において使用することができるが、例示的な方法、デバイスおよび材料が本明細書に記載される。本開示は、特定の方法、および記載された実験条件に限定されず、そのような方法および条件が適用され得ることを理解されたい。
【0107】
材料および方法
幹細胞の供給源
本開示の目的のために、幹細胞の供給源には、ヒト骨髄（ＢＭ）、角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）、臍帯（ＵＣ）、ウォートンゼリー（ＷＪ）、歯髄（ＤＰ）および脂肪組織（ＡＤ）などの供給源からの由来を含み、角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされたＭＳＣ（ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＭＳＣ）は、本明細書に記載の方法および細胞由来製品に使用することができる。幹細胞の種類の選択は、標的の適応および組織特異性による。
幹細胞の供給源
本開示の目的のために、幹細胞の供給源には、ヒト骨髄（ＢＭ）、角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）、臍帯（ＵＣ）、ウォートンゼリー（ＷＪ）、歯髄（ＤＰ）および脂肪組織（ＡＤ）などの供給源からの由来を含み、角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされたＭＳＣ（ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＭＳＣ）は、本明細書に記載の方法および細胞由来製品に使用することができる。幹細胞の種類の選択は、標的の適応および組織特異性による。
【0108】
不死化した成体幹細胞株（非ウイルス性の不死化したＭＳＣ細胞株）の供給源：
１．テロメラーゼ化されたヒト骨髄由来間葉系幹細胞株（ＢＭ－ＭＳＣ／ＴＥＲＴ２７７）は、ｈＴＥＲＴ遺伝子を保有するプラスミドの非ウイルス遺伝子導入により海綿骨（胸骨）から単離された間葉系幹細胞から開発された。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを選択マーカーとして使用し、ジェネテシンサルフェートを添加することにより、陽性にトランスフェクトされた細胞を選択した。細胞株は、成長遅延または複製老化の兆候を示すことなく、２５を超える集団倍加のために継続的に培養された。
２．テロメラーゼ化されたヒトウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞株（ＷＪ－ＭＳＣ／ＴＥＲＴ２７３）は、一次組織の脱凝集からｈＴＥＲＴの非ウイルス導入までのゼノフリー条件下で樹立された。
１．テロメラーゼ化されたヒト骨髄由来間葉系幹細胞株（ＢＭ－ＭＳＣ／ＴＥＲＴ２７７）は、ｈＴＥＲＴ遺伝子を保有するプラスミドの非ウイルス遺伝子導入により海綿骨（胸骨）から単離された間葉系幹細胞から開発された。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを選択マーカーとして使用し、ジェネテシンサルフェートを添加することにより、陽性にトランスフェクトされた細胞を選択した。細胞株は、成長遅延または複製老化の兆候を示すことなく、２５を超える集団倍加のために継続的に培養された。
２．テロメラーゼ化されたヒトウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞株（ＷＪ－ＭＳＣ／ＴＥＲＴ２７３）は、一次組織の脱凝集からｈＴＥＲＴの非ウイルス導入までのゼノフリー条件下で樹立された。
【0109】
細胞株は、細胞型特異的マーカーならびに（ｉ）典型的な間葉形態、（ｉｉ）ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５などの典型的な間葉幹細胞マーカーの発現、（ｉｉｉ）脂肪細胞、軟骨細胞、造骨細胞への分化能、および（ｉｖ）血管新生および抗炎症活性を有する細胞外小胞の産生などの機能の発現を維持しながら、無制限の成長を特徴とした。
【0110】
幹細胞および／または細胞由来生成物の培養方法
本開示は、細胞の産生のために細胞を培養するためのプロセス、ならびに肝臓、肺、膵臓、腎臓、角膜、心臓、および脳などの組織／器官の炎症または線維化を含む様々な疾患の再生治療を含むがこれに限定されない、セクレトーム、エクソソーム、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）および医学的に関心のある他の細胞由来成分などの細胞由来生成物を開示する。
本開示は、細胞の産生のために細胞を培養するためのプロセス、ならびに肝臓、肺、膵臓、腎臓、角膜、心臓、および脳などの組織／器官の炎症または線維化を含む様々な疾患の再生治療を含むがこれに限定されない、セクレトーム、エクソソーム、細胞外マトリックス成分（ＥＣＭ）および医学的に関心のある他の細胞由来成分などの細胞由来生成物を開示する。
【0111】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）またはヒトドナー由来角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）などの様々な供給源からの角膜実質／幹細胞を、３つの異なる方法、すなわち、２次元の２Ｄ、３次元（３Ｄ）ミクロスフェアベースおよび３Ｄスフェロイド培養でゼノフリー条件下で培養した。これらの培養物からの馴化培地は、セクレトームおよびエクソソーム画分について特徴付けられ、治療的に有益な成分が同定された。骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）もしくはヒトドナー由来角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）を培養するか、またはＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＭＳＣを得るための詳細なプロセスは、ゼノフリー条件下でのすなわち２Ｄ、３Ｄミクロスフェアベースおよび３Ｄスフェロイド培養の３つの異なる方法によって、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
【0112】
バイオエンジニアリング製剤に使用される成分の供給源
バイオエンジニアリング製剤であるチオール化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）およびチオール化組換えコラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ）の２つの主要なポリマーを、それぞれＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧ ｗｏｒｋｓ，Ｆｕｊｉｆｉｌｍから調達した。
バイオエンジニアリング製剤であるチオール化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）およびチオール化組換えコラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ）の２つの主要なポリマーを、それぞれＣｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧ ｗｏｒｋｓ，Ｆｕｊｉｆｉｌｍから調達した。
【0113】
実施例１
バイオエンジニアリング製剤
本実施例は、２つの主要な成分－修飾ヒアルロン酸および修飾コラーゲンペプチドを含むバイオエンジニアリング製剤を開示する。特に、本開示において、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）であるのに対して、修飾コラーゲンペプチドは、メタクリレート化組換えコラーゲンペプチド（コラーゲンタイプＩベースのペプチドまたはＲＣＰ）（ＲＣＰ－ＭＡ）、またはチオール化組換えコラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ）である。前述の成分とは別に、バイオエンジニアリング製剤はまた、白色光への短時間曝露で成分を光架橋することができる光開始剤溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液ＰＢＳ溶液中の０．００１～０．１ｍＭのエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミン）を含む。バイオエンジニアリング製剤は、角膜組織にしっかりと接着する固体で透明なヒドロゲルであり、角膜実質欠損の非侵襲的で迅速かつ長期的な修復に使用することができる。
バイオエンジニアリング製剤
本実施例は、２つの主要な成分－修飾ヒアルロン酸および修飾コラーゲンペプチドを含むバイオエンジニアリング製剤を開示する。特に、本開示において、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）であるのに対して、修飾コラーゲンペプチドは、メタクリレート化組換えコラーゲンペプチド（コラーゲンタイプＩベースのペプチドまたはＲＣＰ）（ＲＣＰ－ＭＡ）、またはチオール化組換えコラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ）である。前述の成分とは別に、バイオエンジニアリング製剤はまた、白色光への短時間曝露で成分を光架橋することができる光開始剤溶液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液ＰＢＳ溶液中の０．００１～０．１ｍＭのエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミン）を含む。バイオエンジニアリング製剤は、角膜組織にしっかりと接着する固体で透明なヒドロゲルであり、角膜実質欠損の非侵襲的で迅速かつ長期的な修復に使用することができる。
【0114】
本開示の目的のために、バイオエンジニアリング製剤の物理的特性は、天然の角膜の物理的特性を模倣するように調整された。バイオエンジニアリング製剤の特性が天然の角膜の特性に匹敵することを確認するために、以下の一連のパラメータ：ｉ．１００～３００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率、ｉｉ．接着強度：＞２０ｋＰａ、ｉｉｉ．透明度－目標値：＞８７％、ｉｖ．エクスビボ破裂圧力：＞２．５ｋＰａ（ヒトの眼の公称眼圧）、ｖ．可使時間、ｖｉ．架橋反応速度、ｖｉｉ．膨潤プロファイル：＜３５％、ｖｉｉｉ．生体適合性－インビトロ研究、およびｉｘ．安全性および有効性－ウサギモデルのインビボ研究を分析した。バイオエンジニアリング製剤およびヒドロゲル製剤という用語は、交換可能に使用される。
【0115】
バイオエンジニアリング製剤の物理的特性が評価された前述のパラメータの詳細な分析を以下に提供する。
【0116】
（Ａ）圧縮弾性率および接着強度
ＨＡ－ＭＡ分子量の増減が圧縮弾性率および接着強度に及ぼす影響を確認するために、ＨＡ－ＭＡの分子量を変化させたバイオエンジニアリング製剤をスクリーニングした。ＨＡ－ＭＡの分子量を変化させることによって、３つのバイオエンジニアリング製剤のスクリーニングを行った。ＨＡ－ＭＡの分子量は、本開示のバイオエンジニアリング製剤の物理的、機械的、および他の機能的特性にアクセスするための重要なパラメータのうちの１つである。したがって、３つのバイオエンジニアリング製剤のスクリーニングは、３３ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ、１０ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ、５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨ／ＲＣＰ－ＭＡを使用して行われた。すべての実施例において、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを指し、濃度は、本明細書に記載の実験に従って変化し得る。
ＨＡ－ＭＡ分子量の増減が圧縮弾性率および接着強度に及ぼす影響を確認するために、ＨＡ－ＭＡの分子量を変化させたバイオエンジニアリング製剤をスクリーニングした。ＨＡ－ＭＡの分子量を変化させることによって、３つのバイオエンジニアリング製剤のスクリーニングを行った。ＨＡ－ＭＡの分子量は、本開示のバイオエンジニアリング製剤の物理的、機械的、および他の機能的特性にアクセスするための重要なパラメータのうちの１つである。したがって、３つのバイオエンジニアリング製剤のスクリーニングは、３３ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ、１０ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ、５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨ／ＲＣＰ－ＭＡを使用して行われた。すべての実施例において、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを指し、濃度は、本明細書に記載の実験に従って変化し得る。
【0117】
「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤での実験
スクリーニングの最初のセットは、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＭＡ、およびＲＣＰ－ＳＨ製剤で開始され、置換度は５０％であった。本実施例で使用されるＲＣＰ－ＳＨは、５０ｋＤａの分子量のものである。図１Ａおよび１Ｂに示すように、ＨＡ－ＭＡ １００ｍｇ／ｍｌを使用して（すなわち、ＲＣＰ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨを使用せずに）作製した単一成分ヒドロゲルの圧縮弾性率および接着強度は、２つの成分ヒドロゲルより低いことが見出され、－ＭＡまたは－ＳＨ基の添加により分子間架橋を増加させ、ヒドロゲルの物理的特性に大きな影響を与えることを示唆している。エオシンを光開始剤として使用した場合、ＲＣＰ－ＭＡ（１２５および２５０ｍｇ／ｍｌ）を使用した単一成分溶液（本明細書に記載の単一成分はＨＡ－ＭＡまたはＲＣＰ－ＳＨを含まない）は、白色光への曝露後にゲル化しなかった。同様に、ＲＣＰ－ＳＨ（１２５および２５０ｍｇ／ｍｌ）溶液も、光開始剤としてのリボフラビンの存在下で青色光に曝露してもゲルを形成しなかった。ＲＣＰ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨの濃度を一定（１２５ｍｇ／ｍｌ）に保ち、ＨＡ－ＭＡの濃度を変化させて（１０～１００ｍｇ／ｍｌ）、ＨＡ－ＭＡの濃度の増加に伴い、ヒドロゲルの圧縮弾性率も増加する。１０ｍｇ／ｍｌ ＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、圧縮弾性率の低い値を示したのに対して、５０ｍｇ／ｍｌ以上を含む製剤は、機械的強度の目標値範囲（約３００ｋＰａ）よりも高い圧縮弾性率の値を示した。３５または４０ｍｇ／ｍｌ ＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤の圧縮弾性率は、必要な範囲（１００～３００ｋＰａ）であることが見出された。さらに、圧縮弾性率がＲＣＰ－ＳＨ濃度に正比例することも見出された。ＲＣＰ－ＭＡの圧縮弾性率をＲＣＰ－ＳＨと比較した場合、同じ濃度のＨＡ－ＭＡについて、ＲＣＰ－ＳＨを有するヒドロゲルの圧縮弾性率は、同じ量のＲＣＰ－ＭＡを含むヒドロゲルよりも高いことが見出された。図１Ａから、ヒドロゲル製剤（分子量「３３ｋＤａ」および濃度「４０ｍｇ／ｍｌ」のＨＡならびに「１２５ｍｇ／ｍｌ」のＲＣＰ－ＳＨを含む）の圧縮弾性率がＧｅｌ－ＭＡ（社内）よりも高いこともまた観察することができる。
スクリーニングの最初のセットは、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＭＡ、およびＲＣＰ－ＳＨ製剤で開始され、置換度は５０％であった。本実施例で使用されるＲＣＰ－ＳＨは、５０ｋＤａの分子量のものである。図１Ａおよび１Ｂに示すように、ＨＡ－ＭＡ １００ｍｇ／ｍｌを使用して（すなわち、ＲＣＰ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨを使用せずに）作製した単一成分ヒドロゲルの圧縮弾性率および接着強度は、２つの成分ヒドロゲルより低いことが見出され、－ＭＡまたは－ＳＨ基の添加により分子間架橋を増加させ、ヒドロゲルの物理的特性に大きな影響を与えることを示唆している。エオシンを光開始剤として使用した場合、ＲＣＰ－ＭＡ（１２５および２５０ｍｇ／ｍｌ）を使用した単一成分溶液（本明細書に記載の単一成分はＨＡ－ＭＡまたはＲＣＰ－ＳＨを含まない）は、白色光への曝露後にゲル化しなかった。同様に、ＲＣＰ－ＳＨ（１２５および２５０ｍｇ／ｍｌ）溶液も、光開始剤としてのリボフラビンの存在下で青色光に曝露してもゲルを形成しなかった。ＲＣＰ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨの濃度を一定（１２５ｍｇ／ｍｌ）に保ち、ＨＡ－ＭＡの濃度を変化させて（１０～１００ｍｇ／ｍｌ）、ＨＡ－ＭＡの濃度の増加に伴い、ヒドロゲルの圧縮弾性率も増加する。１０ｍｇ／ｍｌ ＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、圧縮弾性率の低い値を示したのに対して、５０ｍｇ／ｍｌ以上を含む製剤は、機械的強度の目標値範囲（約３００ｋＰａ）よりも高い圧縮弾性率の値を示した。３５または４０ｍｇ／ｍｌ ＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤の圧縮弾性率は、必要な範囲（１００～３００ｋＰａ）であることが見出された。さらに、圧縮弾性率がＲＣＰ－ＳＨ濃度に正比例することも見出された。ＲＣＰ－ＭＡの圧縮弾性率をＲＣＰ－ＳＨと比較した場合、同じ濃度のＨＡ－ＭＡについて、ＲＣＰ－ＳＨを有するヒドロゲルの圧縮弾性率は、同じ量のＲＣＰ－ＭＡを含むヒドロゲルよりも高いことが見出された。図１Ａから、ヒドロゲル製剤（分子量「３３ｋＤａ」および濃度「４０ｍｇ／ｍｌ」のＨＡならびに「１２５ｍｇ／ｍｌ」のＲＣＰ－ＳＨを含む）の圧縮弾性率がＧｅｌ－ＭＡ（社内）よりも高いこともまた観察することができる。
【0118】
図１Ｂを参照すると、ヒドロゲル製剤の接着強度は、ＨＡ－ＭＡ濃度の増加とともに増加した。接着強度に顕著な変化を示さなかったＲＣＰ－ＳＨの増加の効果をさらに評価した。しかしながら、本開示のヒドロゲル製剤の接着強度は、Ｇｅｌ－ＭＡ（社内）と同等であった。
【0119】
上記の観察から、分子量「３３ｋＤａ」および濃度「４０ｍｇ／ｍｌ」のＨＡ－ＭＡならびに１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨを含むヒドロゲル製剤が所望の圧縮弾性率および接着強度値を示したことが推測でき、本開示の実用的製剤を確認するためにさらにスクリーニングされた。
【0120】
「１０ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤での実験
「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ製剤のスクリーニング後、ＨＡ－ＭＡ分子量の増減が圧縮弾性率および接着強度に及ぼす影響を確認することが必要であった。ＨＡ－ＭＡ濃度の変化は接着強度に大きな影響を与えないように思われたため、ＲＣＰ－ＳＨの濃度を変化させてさらにスクリーニングを実施した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、スクリーニング研究は、３０％の置換度を含む「１０ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＭＡ、およびＲＣＰ－ＳＨ製剤を使用して行われた。図２に示すスクリーニング研究では、１０ｋＤａの分子量、ＨＡ－ＭＡの濃度１５０ｍｇ／ｍｌを含むヒドロゲル製剤では、ＲＣＰ－ＳＨ濃度の増加に伴って圧縮弾性率および接着強度が増加することが明らかになる。さらに、ヒドロゲル製剤の圧縮弾性率は、２０％ｗ／ｖのＧｅｌ－ＭＡの報告値よりも４～７．５倍高いことが観察できる（Ｓｈｉｒｚａｅｉ Ｓａｎｉ Ｅ，Ｋｈｅｉｒｋｈａｈ Ａ，Ｒａｎａ Ｄ，Ｓｕｎ Ｚ，Ｆｏｕｌｓｈａｍ Ｗ，Ｓｈｅｉｋｈｉ Ａ，Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉ Ａ，Ｄａｎａ Ｒ，Ａｎｎａｂｉ Ｎ．Ｓｕｔｕｒｅｌｅｓｓ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｊｕｒｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１９ Ｍａｒ ２０；５（３）：ｅａａｖ１２８１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ１２８１）（図２Ａ）。同様に、ヒドロゲルの接着強度は、Ｇｅｌ－ＭＡおよびフィブリン接着剤の報告値よりも＞２．０倍高かった（Ｎａｓｉｍ Ａｎｎａｂｉ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｍ．Ｍｉｔｈｉｅｕｘ，Ｐｉｎａｒ Ｚｏｒｌｕｔｕｎａ，Ｇｕｌｄｅｎ Ｃａｍｃｉ－Ｕｎａｌ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，ａｎｄ Ａｌｉ Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌ－ｌａｄｅｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｅｌａｓｔｏｍｅｒ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３ Ｊｕｌ；３４（２２）：５４９６－５５０５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３．０３．０７６）（図２Ｂ）。１０ｋＤａの製剤で得られた値も、「３３ｋＤａ」の製剤よりも顕著に大きかった。しかしながら、１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡの達成可能な最高濃度のＨＡ－ＭＡは１５０ｍｇ／ｍｌであり、それを超えると溶液は非常に粘稠になり、ピペット／ニードルチップをブロックした。さらに、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＡ－ＭＡの存在は、ヒドロゲル製剤を非常に不安定にし、ＨＡ－ＭＡ溶液の１５０ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液は、光開始剤の有無にかかわらず、周囲光で自己架橋を開始した。したがって、図２Ａおよび２Ｂから、「３３ｋＤａ」の所望の分子量でのＨＡ－ＭＡの存在とともに、ヒドロゲル製剤中のＨＡ－ＭＡの濃度が２０～８０ｍｇ／ｍｌの範囲であることが、本開示の安定で、粘性があり、生体適合性のあるヒドロゲル製剤を得るために非常に重要であることが推測できる。開示された範囲（２０～８０ｍｇ／ｍｌ）からＨＡ－ＭＡの濃度が逸脱すると、ヒドロゲル製剤を非常に粘稠で不安定にする。
「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ製剤のスクリーニング後、ＨＡ－ＭＡ分子量の増減が圧縮弾性率および接着強度に及ぼす影響を確認することが必要であった。ＨＡ－ＭＡ濃度の変化は接着強度に大きな影響を与えないように思われたため、ＲＣＰ－ＳＨの濃度を変化させてさらにスクリーニングを実施した。図２Ａおよび２Ｂに示すように、スクリーニング研究は、３０％の置換度を含む「１０ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＭＡ、およびＲＣＰ－ＳＨ製剤を使用して行われた。図２に示すスクリーニング研究では、１０ｋＤａの分子量、ＨＡ－ＭＡの濃度１５０ｍｇ／ｍｌを含むヒドロゲル製剤では、ＲＣＰ－ＳＨ濃度の増加に伴って圧縮弾性率および接着強度が増加することが明らかになる。さらに、ヒドロゲル製剤の圧縮弾性率は、２０％ｗ／ｖのＧｅｌ－ＭＡの報告値よりも４～７．５倍高いことが観察できる（Ｓｈｉｒｚａｅｉ Ｓａｎｉ Ｅ，Ｋｈｅｉｒｋｈａｈ Ａ，Ｒａｎａ Ｄ，Ｓｕｎ Ｚ，Ｆｏｕｌｓｈａｍ Ｗ，Ｓｈｅｉｋｈｉ Ａ，Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉ Ａ，Ｄａｎａ Ｒ，Ａｎｎａｂｉ Ｎ．Ｓｕｔｕｒｅｌｅｓｓ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｏｒｎｅａｌ ｉｎｊｕｒｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｓｃｉ Ａｄｖ．２０１９ Ｍａｒ ２０；５（３）：ｅａａｖ１２８１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉａｄｖ．ａａｖ１２８１）（図２Ａ）。同様に、ヒドロゲルの接着強度は、Ｇｅｌ－ＭＡおよびフィブリン接着剤の報告値よりも＞２．０倍高かった（Ｎａｓｉｍ Ａｎｎａｂｉ，Ｓｕｚａｎｎｅ Ｍ．Ｍｉｔｈｉｅｕｘ，Ｐｉｎａｒ Ｚｏｒｌｕｔｕｎａ，Ｇｕｌｄｅｎ Ｃａｍｃｉ－Ｕｎａｌ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓ．Ｗｅｉｓｓ，ａｎｄ Ａｌｉ Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌ－ｌａｄｅｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｅｌａｓｔｏｍｅｒ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３ Ｊｕｌ；３４（２２）：５４９６－５５０５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１３．０３．０７６）（図２Ｂ）。１０ｋＤａの製剤で得られた値も、「３３ｋＤａ」の製剤よりも顕著に大きかった。しかしながら、１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡの達成可能な最高濃度のＨＡ－ＭＡは１５０ｍｇ／ｍｌであり、それを超えると溶液は非常に粘稠になり、ピペット／ニードルチップをブロックした。さらに、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＡ－ＭＡの存在は、ヒドロゲル製剤を非常に不安定にし、ＨＡ－ＭＡ溶液の１５０ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液は、光開始剤の有無にかかわらず、周囲光で自己架橋を開始した。したがって、図２Ａおよび２Ｂから、「３３ｋＤａ」の所望の分子量でのＨＡ－ＭＡの存在とともに、ヒドロゲル製剤中のＨＡ－ＭＡの濃度が２０～８０ｍｇ／ｍｌの範囲であることが、本開示の安定で、粘性があり、生体適合性のあるヒドロゲル製剤を得るために非常に重要であることが推測できる。開示された範囲（２０～８０ｍｇ／ｍｌ）からＨＡ－ＭＡの濃度が逸脱すると、ヒドロゲル製剤を非常に粘稠で不安定にする。
【0121】
「５０ｋＤａ」ＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤での実験
分子量、ＨＡ－ＭＡの濃度、およびＲＣＰ－ＳＨの濃度の影響を確立した後、分子量５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤を圧縮性および接着強度についてスクリーニングすることにより、ＨＡ－ＭＡ分子量の増加の影響をさらに試験した。５０ｋＤａのヒドロゲル製剤は、７５ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨで構成された。５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤のスクリーニング結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、１３７９．８ｋＤａの圧縮弾性率（図３Ａ）、および７０ｋＰａの接着強度（図３Ｂ）を示したが、分子量５０ｋＤａの７５ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＣＰ－ＳＨを含有するヒドロゲル製剤は粘度があまりに高いため、成分を均一に混合するためにボルテックスミキサーまたは他の機器を使用する必要があった。したがって、分子量５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、さらにスクリーニングされなかった。
分子量、ＨＡ－ＭＡの濃度、およびＲＣＰ－ＳＨの濃度の影響を確立した後、分子量５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤を圧縮性および接着強度についてスクリーニングすることにより、ＨＡ－ＭＡ分子量の増加の影響をさらに試験した。５０ｋＤａのヒドロゲル製剤は、７５ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨで構成された。５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤のスクリーニング結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、１３７９．８ｋＤａの圧縮弾性率（図３Ａ）、および７０ｋＰａの接着強度（図３Ｂ）を示したが、分子量５０ｋＤａの７５ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＣＰ－ＳＨを含有するヒドロゲル製剤は粘度があまりに高いため、成分を均一に混合するためにボルテックスミキサーまたは他の機器を使用する必要があった。したがって、分子量５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、さらにスクリーニングされなかった。
【0122】
「１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ」、ＲＣＰ－ＳＨ製剤および「５０ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤よりも「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、ＲＣＰ－ＳＨを選択する理由
全体として、図１～３から推測することができるように、１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、１５０ｍｇ／ｍｌの高濃度でも低粘度であったが、それらの不安定性（光開始剤の不在下での自己架橋の傾向）のために、臨床医は、上述の製剤を取り扱うのが困難であると感じるかもしれない。同様に、５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ製剤は非常に粘性が高く、濃度を増加させると取り扱いが難しく、達成可能な最高の弾性率および接着強度における制限につながった。対照的に、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ製剤は、様々な製剤の中で安定性および取り扱いのバランスを提供した。したがって、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤が、破裂圧力および可使時間研究によるさらなる特性評価のために選択された。
全体として、図１～３から推測することができるように、１０ｋＤａのＨＡ－ＭＡを含むヒドロゲル製剤は、１５０ｍｇ／ｍｌの高濃度でも低粘度であったが、それらの不安定性（光開始剤の不在下での自己架橋の傾向）のために、臨床医は、上述の製剤を取り扱うのが困難であると感じるかもしれない。同様に、５０ｋＤａのＨＡ－ＭＡ製剤は非常に粘性が高く、濃度を増加させると取り扱いが難しく、達成可能な最高の弾性率および接着強度における制限につながった。対照的に、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ製剤は、様々な製剤の中で安定性および取り扱いのバランスを提供した。したがって、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤が、破裂圧力および可使時間研究によるさらなる特性評価のために選択された。
【0123】
（Ｂ）透明度
様々な濃度のＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨを含む３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤を、透明度についてスクリーニングした。透過率の値は、生理食塩水をブランクとして使用して、３５０～７５０ｎｍの範囲でサンプルの吸光度を記録することによって得られた。ランベルトベールの法則を使用して、得られた吸光度（Ａ）値を透過率（％Ｔ）に変換した。ランベルトベールの法則による、％Ｔ＝１０（２－吸光度）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，９，３４２１－３４２８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００９６９ｄに記載されているプロトコルによる）
様々な濃度のＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨを含む３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤を、透明度についてスクリーニングした。透過率の値は、生理食塩水をブランクとして使用して、３５０～７５０ｎｍの範囲でサンプルの吸光度を記録することによって得られた。ランベルトベールの法則を使用して、得られた吸光度（Ａ）値を透過率（％Ｔ）に変換した。ランベルトベールの法則による、％Ｔ＝１０（２－吸光度）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４，１５，９，３４２１－３４２８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００９６９ｄに記載されているプロトコルによる）
【0124】
この目的のために、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤の透過率（％）をＧｅｌ－ＭＡ（２０％）と比較した。図４に示すように、成分に関係なく、すべてのヒドロゲル製剤、それらの分子量および比率は、１×ＰＢＳと比較して約８０％の透過率を示した。特に、３５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＨＡ－ＭＡを含む製剤は、光透過率＞８７％を示した。
【0125】
（Ｃ）エクスビボ破裂圧力
図５は、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨおよびＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｖ、ＤｏＳ＞９５％）製剤で試験されたエクスビボ破裂圧力を示す。図５から、製剤中に存在するＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨの濃度の変化に応じてエクスビボ破裂圧力が変化したことを観察することができる。しかしながら、統計的に（α＝０．０５）、値に有意な違いはなかった。それにもかかわらず、バイオエンジニアリング製剤によって維持される破裂圧力は、眼圧（ＩＯＰ）よりも顕著に高かった。図５に示すように、３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨを有するバイオエンジニアリング製剤のＩＯＰ値は、天然角膜のＩＯＰ（約２．５ｋＰａ）の２倍であった。さらに、４０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨを有するバイオエンジニアリング製剤のＩＯＰ値は、天然の角膜のＩＯＰよりも１０～１３倍高かったことを観察することができる。さらに、７５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＨＡ－ＭＡを有するバイオエンジニアリング製剤のエクスビボ破裂圧力値は、市販の接着剤（フィブリン接着剤、２１．７ｋＰａ）または以前に報告された角膜接着剤（Ｇｅｌ－ＭＡ ２０％ｗ／ｖ、ＤｏＳ＞９５％、３０．１ｋＰａ）のエクスビボ破裂圧力値よりも顕著に高かった。
図５は、「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨおよびＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｖ、ＤｏＳ＞９５％）製剤で試験されたエクスビボ破裂圧力を示す。図５から、製剤中に存在するＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨの濃度の変化に応じてエクスビボ破裂圧力が変化したことを観察することができる。しかしながら、統計的に（α＝０．０５）、値に有意な違いはなかった。それにもかかわらず、バイオエンジニアリング製剤によって維持される破裂圧力は、眼圧（ＩＯＰ）よりも顕著に高かった。図５に示すように、３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨを有するバイオエンジニアリング製剤のＩＯＰ値は、天然角膜のＩＯＰ（約２．５ｋＰａ）の２倍であった。さらに、４０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨを有するバイオエンジニアリング製剤のＩＯＰ値は、天然の角膜のＩＯＰよりも１０～１３倍高かったことを観察することができる。さらに、７５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＨＡ－ＭＡを有するバイオエンジニアリング製剤のエクスビボ破裂圧力値は、市販の接着剤（フィブリン接着剤、２１．７ｋＰａ）または以前に報告された角膜接着剤（Ｇｅｌ－ＭＡ ２０％ｗ／ｖ、ＤｏＳ＞９５％、３０．１ｋＰａ）のエクスビボ破裂圧力値よりも顕著に高かった。
【0126】
（Ｄ）可使時間
この実施例は、本開示のヒドロゲル製剤に添加することができる光開始剤の濃度の重要性を強調している。エオシンのような光開始剤の添加により、チオール－エン架橋プロセスが加速された。さらに、エオシンを介した光の開始は、白色光の存在下で活性化された。ヒドロゲル接着剤を２分で架橋するには高強度の白色光が必要であるが、周囲光が架橋プロセスを開始する可能性があるため、角膜欠損に適用するプロセスで臨床医が製剤を取り扱うのを困難にする。
この実施例は、本開示のヒドロゲル製剤に添加することができる光開始剤の濃度の重要性を強調している。エオシンのような光開始剤の添加により、チオール－エン架橋プロセスが加速された。さらに、エオシンを介した光の開始は、白色光の存在下で活性化された。ヒドロゲル接着剤を２分で架橋するには高強度の白色光が必要であるが、周囲光が架橋プロセスを開始する可能性があるため、角膜欠損に適用するプロセスで臨床医が製剤を取り扱うのを困難にする。
【0127】
図６Ａは、成分の溶液（１２５ｍｇ／ｍｌの３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ、１５０ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、および１×光開始剤）を別々に再構成および混合することによって調製されたヒドロゲル製剤を示す。図７Ａから、ヒドロゲル製剤は、周囲光への約５分間の曝露後に、貯蔵弾性率および複素粘度の一定の増加を示したことが観察することができる。対照的に、成分（１２５ｍｇ／ｍｌの３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ、１５０ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、および１×光開始剤）を含む同じヒドロゲル製剤は、図６Ｂに示すように予混合プロトコルを使用して調製し、成分は粉末形態で予混合され、次いで生理食塩水で再構成された。図７Ｂから、ヒドロゲル製剤はｔ＝０でより高い貯蔵弾性率および複素粘度を有していたことを観察することができる。さらに、貯蔵弾性率および複素粘度の値は、周囲光に曝露されてから２分以内に着実に増加し始めた（図７）。
【0128】
さらに、図７Ａを参照すると、使用されるプロトコルに関係なく、０．５倍の濃度の光開始剤で調製されたすべてのヒドロゲル製剤は、最大２０分間、いかなる架橋なしで安定したままであった。全体として、図６および７から、光開始剤の濃度を半分に減らすと、ヒドロゲル製剤の可使時間が顕著に増加したことを推測することができる。ヒドロゲル製剤の可使時間の増加は、臨床医に十分な時間を与え、スタッフが角膜欠損の部位で製剤を調製および適用するのを助けるであろう。
【0129】
（Ｅ）架橋反応速度
図８は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤の架橋反応速度（３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、４０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、５０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、５０％の置換度を有する）の２０％ｗ／ｖのＧｅｌ－ＭＡ製剤の架橋反応速度との比較を示す。図８に示す架橋反応速度データは、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨシステムの架橋反応の完了に直接関係する貯蔵弾性率が５分以内に平衡に達したのに対して、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は１５～３０分後でも平衡に達しなかったことを実証した。さらに、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤は、単一成分のＧｅｌ－ＭＡ製剤と比較して貯蔵弾性率が１００倍増加することを実証した。したがって、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、周知のメタクリレートゼラチン（Ｇｅｌ－ＭＡ）ヒドロゲルよりも好ましい。
図８は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤の架橋反応速度（３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、４０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、５０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡ／１２５ｍｇ／ｍｌのＲＣＰ－ＳＨ、５０％の置換度を有する）の２０％ｗ／ｖのＧｅｌ－ＭＡ製剤の架橋反応速度との比較を示す。図８に示す架橋反応速度データは、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨシステムの架橋反応の完了に直接関係する貯蔵弾性率が５分以内に平衡に達したのに対して、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は１５～３０分後でも平衡に達しなかったことを実証した。さらに、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤は、単一成分のＧｅｌ－ＭＡ製剤と比較して貯蔵弾性率が１００倍増加することを実証した。したがって、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、周知のメタクリレートゼラチン（Ｇｅｌ－ＭＡ）ヒドロゲルよりも好ましい。
【0130】
（Ｆ）膨潤プロファイル
膨潤の研究は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤を１×ＰＢＳで４８時間インキュベートすることによって実施された。図９は、異なるポリマー濃度の３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤の膨潤プロファイルと、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤の膨潤プロファイルとの比較を示す。図９に示す膨潤研究の結果は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤が４時間以内に平衡に達したのに対して、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は２４時間まで平衡に達しなかったことを実証した。さらに、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤は、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤と比較して、非常に制御された膨潤を実証し、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は、最初は高い水分摂取量を示し、次いで７２時間の期間まで水分摂取量が増加し続けた。本開示のヒドロゲル製剤の膨潤速度は、ポリマー濃度の増加とともに減少した。３５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＨＡ－ＭＡを有するヒドロゲル製剤は、他の製剤よりも約５０％少ない膨潤を実証した。したがって、膨潤プロファイルがより少ない本開示のヒドロゲル製剤は、治療用途などにとってより好ましい。
膨潤の研究は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤を１×ＰＢＳで４８時間インキュベートすることによって実施された。図９は、異なるポリマー濃度の３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤の膨潤プロファイルと、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤の膨潤プロファイルとの比較を示す。図９に示す膨潤研究の結果は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤が４時間以内に平衡に達したのに対して、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は２４時間まで平衡に達しなかったことを実証した。さらに、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤は、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤と比較して、非常に制御された膨潤を実証し、Ｇｅｌ－ＭＡ製剤は、最初は高い水分摂取量を示し、次いで７２時間の期間まで水分摂取量が増加し続けた。本開示のヒドロゲル製剤の膨潤速度は、ポリマー濃度の増加とともに減少した。３５ｍｇ／ｍｌ以上の濃度のＨＡ－ＭＡを有するヒドロゲル製剤は、他の製剤よりも約５０％少ない膨潤を実証した。したがって、膨潤プロファイルがより少ない本開示のヒドロゲル製剤は、治療用途などにとってより好ましい。
【0131】
（Ｇ）生分解
一定体積のヒドロゲルを調製し、凍結乾燥し、秤量した（Ｗｉ）。次いで、複製ヒドロゲルをＰＢＳまたは生理食塩水（ｐＨ約７．４）中で３７℃でインキュベートし、オービタルシェーカで振とうする。特定の時点で、ヒドロゲルを取り出し、凍結乾燥し、秤量した（Ｗｄ）。次いで、質量損失は、重量損失または分解（％）＝（Ｗｉ－Ｗｄ）／Ｗｉ×１００として計算した（Ｌｉ ２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６％２Ｆｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５．０７．０１９）。
一定体積のヒドロゲルを調製し、凍結乾燥し、秤量した（Ｗｉ）。次いで、複製ヒドロゲルをＰＢＳまたは生理食塩水（ｐＨ約７．４）中で３７℃でインキュベートし、オービタルシェーカで振とうする。特定の時点で、ヒドロゲルを取り出し、凍結乾燥し、秤量した（Ｗｄ）。次いで、質量損失は、重量損失または分解（％）＝（Ｗｉ－Ｗｄ）／Ｗｉ×１００として計算した（Ｌｉ ２００６，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６％２Ｆｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００５．０７．０１９）。
【0132】
図１０は、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（置換度５０％）の生分解プロファイルを時間に関して比較したことを示す。
【0133】
図１０を参照すると、ヒドロゲル製剤の分解速度は、ＨＡ－ＭＡの濃度の増加とともに増加した。ヒドロゲル製剤の分解速度は、１４日目まで安定していた。しかしながら、１４日後、より高いポリマー内容物のヒドロゲル製剤（すなわち、４０ｍｇ／ｍｌの濃度のＨＡ－ＭＡおよび１５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＣＰ－ＳＨを含むヒドロゲル製剤）は、２８日目に最大５２．８７％および４６．３６％の分解の突然の増加を示した。したがって、図１０から、３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤は、１２時間以内に分解したＧｅｌ－ＭＡと比較して制御された分解を実証したと推測することができる（Ｇｅｌ－ＭＡデータは示さず）。
【0134】
表１は、天然の角膜の物理的特性を模倣するように調整されたバイオエンジニアリング製剤の物理的特性の要約を提供する。
【表1】
【0135】
表１を参照すると、開示された範囲における成分、すなわち、ＨＡ－ＭＡ（修飾ヒアルロン酸）、ＲＣＰ－ＳＨ（修飾コラーゲンペプチド）の存在は、天然の角膜の物理的特性を模倣するように調整することができる所望の物理的特性を示すヒドロゲル製剤を得るために重要であると結論付けることができる。これを考慮すると、製剤８にＲＣＰ－ＳＨが存在しないと、ヒドロゲル製剤は非常に脆くなり、したがって、所望の物理的特性を示さない製剤８は、非作動製剤とみなされる。さらに、開示された濃度範囲（２０～８０ｍｇ／ｍｌ）外である１００ｍｇ／ｍｌの濃度でのＨＡ－ＭＡの存在は、製剤が、好ましくない非常に高い圧縮弾性率を有するため、製剤１５を別の非作動製剤にする。表１から、開示された範囲でのＨＡ－ＭＡおよびＲＣＰ－ＳＨの存在が、望ましい物理的特性のヒドロゲル製剤を得るために重要であることが推測できる。さらに、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、周知のＧｅｌ－ＭＡヒドロゲルよりも良好に機能することも観察することができる。したがって、製剤１～７および９～１４は、本開示の作動製剤であり、製剤８、１５～１８は、非作動製剤である。
【0136】
実施例２
バイオエンジニアリング製剤を調製するプロセス
本実施例は、バイオエンジニアリング製剤を調製するための最適化されたプロセスについて説明する。製剤を調製するためのステップを図１１に示し、以下にも説明する。
（ｉ）凍結乾燥したバイオエンジニアリング角膜粉末を含むバイアルＩ（２～７．５ｍｇの範囲の濃度を有する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５～１５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＲＣＰ－ＳＨの組み合わせを含む）、および光開始剤溶液（１００μｌ）を含むバイアルＩＩを、光から保護された根温（ｒｏｏｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＲＴ）に温めた。
（ｉｉ）針およびシリンジを使用して、バイアルＩＩからの光開始剤溶液を、光から保護されたバイアルＩの内容物に移した。次いで、バイアルＩを穏やかに回転させて、溶解を促進するために内容物が浸漬されていることを確認し、次いで暗条件下で３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｉｉｉ）バイアルＩの成分を完全に溶解して、最終的なプレヒドロゲル製剤が本質的に均質であることを確認した。
（ｉｖ）針およびシリンジを使用して、必要な体積を角膜欠損部位に投与し、プレヒドロゲル製剤を５分間白色光に曝露した。
（ｖ）白色光への曝露後、欠損部位を生理食塩水で洗浄して、架橋ヒドロゲルを水和させた。
バイオエンジニアリング製剤を調製するプロセス
本実施例は、バイオエンジニアリング製剤を調製するための最適化されたプロセスについて説明する。製剤を調製するためのステップを図１１に示し、以下にも説明する。
（ｉ）凍結乾燥したバイオエンジニアリング角膜粉末を含むバイアルＩ（２～７．５ｍｇの範囲の濃度を有する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５～１５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＲＣＰ－ＳＨの組み合わせを含む）、および光開始剤溶液（１００μｌ）を含むバイアルＩＩを、光から保護された根温（ｒｏｏｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＲＴ）に温めた。
（ｉｉ）針およびシリンジを使用して、バイアルＩＩからの光開始剤溶液を、光から保護されたバイアルＩの内容物に移した。次いで、バイアルＩを穏やかに回転させて、溶解を促進するために内容物が浸漬されていることを確認し、次いで暗条件下で３７℃で３０分間インキュベートした。
（ｉｉｉ）バイアルＩの成分を完全に溶解して、最終的なプレヒドロゲル製剤が本質的に均質であることを確認した。
（ｉｖ）針およびシリンジを使用して、必要な体積を角膜欠損部位に投与し、プレヒドロゲル製剤を５分間白色光に曝露した。
（ｖ）白色光への曝露後、欠損部位を生理食塩水で洗浄して、架橋ヒドロゲルを水和させた。
【0137】
バイオエンジニアリング製剤を使用した治療方法
角膜欠損の部位に投与されるバイオエンジニアリング製剤の体積は、角膜瘢痕の体積および臨床医の裁量に依存する。
角膜欠損の部位に投与されるバイオエンジニアリング製剤の体積は、角膜瘢痕の体積および臨床医の裁量に依存する。
【0138】
例えば、一定のサイズの瘢痕に推奨される、１５％のヒドロゲルの膨潤を占める平均体積を以下の表２に示す。
【表2】
【0139】
最終的なバイオエンジニアリング製剤
２０～７５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、分子量「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、および２０～２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する分子量５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ、および０．５Ｘの濃度を有する光開始剤（エオシン）を含むバイオエンジニアリング製剤が、角膜欠損または角膜障害を治療するために臨床医が採用する図１１に提供される最適化されたプロトコルとともに最終製剤として選択された。
２０～７５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、分子量「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ、および２０～２５０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有する分子量５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ、および０．５Ｘの濃度を有する光開始剤（エオシン）を含むバイオエンジニアリング製剤が、角膜欠損または角膜障害を治療するために臨床医が採用する図１１に提供される最適化されたプロトコルとともに最終製剤として選択された。
【0140】
実施例３
バイオエンジニアリング製剤の生体適合性：インビトロ研究
説明されたバイオエンジニアリング製剤は、角膜組織の再生を誘発するためのそれらの適合性について評価された。最初に、ヒドロゲル表面上の輪部または角膜上皮細胞（ＬＥＣまたはＣＥＣ）を使用した再上皮化能力が研究された。第二に、角膜実質再生を実証するために、角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）をヒドロゲル内にカプセル化し、それらの生存率、増殖能力、および表現型をインビトロで研究した。
バイオエンジニアリング製剤の生体適合性：インビトロ研究
説明されたバイオエンジニアリング製剤は、角膜組織の再生を誘発するためのそれらの適合性について評価された。最初に、ヒドロゲル表面上の輪部または角膜上皮細胞（ＬＥＣまたはＣＥＣ）を使用した再上皮化能力が研究された。第二に、角膜実質再生を実証するために、角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）をヒドロゲル内にカプセル化し、それらの生存率、増殖能力、および表現型をインビトロで研究した。
【0141】
（ｉ）再上皮化研究
本開示のヒドロゲル製剤（「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（７５／１２５ｍｇ／ｍｌおよび７５／１５０ｍｇ／ｍｌの濃度での３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを含む）の生体適合性を実証するために、一次ヒトＣＥＣを表面に播種して培養した。図１２に示すように、ヒドロゲルの表面に接着して増殖した上皮細胞は、２週間の終わりまでにコンフルエントな単層を生成した。この観察結果は、陽性対照として使用された２Ｄカバースリップ表面およびＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｖ）ヒドロゲルに匹敵した。図１２から、本開示のヒドロゲル製剤は、インビボでの角膜創傷治癒／再生を促進することができる角膜模倣バイオエンジニアリング材料として作用すると結論付けることができる。
本開示のヒドロゲル製剤（「３３ｋＤａ」のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（７５／１２５ｍｇ／ｍｌおよび７５／１５０ｍｇ／ｍｌの濃度での３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを含む）の生体適合性を実証するために、一次ヒトＣＥＣを表面に播種して培養した。図１２に示すように、ヒドロゲルの表面に接着して増殖した上皮細胞は、２週間の終わりまでにコンフルエントな単層を生成した。この観察結果は、陽性対照として使用された２Ｄカバースリップ表面およびＧｅｌ－ＭＡ（２０％ｗ／ｖ）ヒドロゲルに匹敵した。図１２から、本開示のヒドロゲル製剤は、インビボでの角膜創傷治癒／再生を促進することができる角膜模倣バイオエンジニアリング材料として作用すると結論付けることができる。
【0142】
（ｉｉ）角膜実質再生：ヒドロゲル製剤へのＣＬＳＣのカプセル化
本実施例は、角膜障害を治療するためのヒドロゲル製剤および幹細胞の組み合わせの効果を実証する。この目的のために、ＣＳＳＣなどの幹細胞はヒドロゲル製剤にカプセル化された。ヒドロゲルのＣＬＳＣへの適合性は、最終的にはヒドロゲルの角膜実質再生能力を示し、ヒドロゲル表面でＣＬＳＣを培養した後、カプセル化研究を行うことによって評価された。
本実施例は、角膜障害を治療するためのヒドロゲル製剤および幹細胞の組み合わせの効果を実証する。この目的のために、ＣＳＳＣなどの幹細胞はヒドロゲル製剤にカプセル化された。ヒドロゲルのＣＬＳＣへの適合性は、最終的にはヒドロゲルの角膜実質再生能力を示し、ヒドロゲル表面でＣＬＳＣを培養した後、カプセル化研究を行うことによって評価された。
【0143】
図１３（Ａ－Ｈ）は、ヒドロゲル表面で５日間培養した場合のＣＬＳＣの生存率評価を示す。結果から明らかなように、ＣＬＳＣは急速な増殖を示し、５日以内にヒドロゲル表面を覆った。さらに、緑色に染色された細胞脂肪質によってマークされた生細胞集団は、ヒドロゲル製剤によって提供される培養環境が細胞の増殖に適合していることを示す。全体として、図１３から、ヒドロゲル製剤表面での細胞増殖は、Ｇｅｌ－ＭＡの２０％での細胞増殖よりも高いのに対して（図１３Ｃおよび図１３Ｇ）、陽性対照として使用されたカバースリップ上の細胞と同様である（図１３Ｄおよび図１３Ｈ）ことを観察することができる。
【0144】
ＣＬＳＣの生存率はまた、７５／１２５ｍｇ／ｍｌ、７５／１５０ｍｇ／ｍｌおよび４０／１２５ｍｇ／ｍｌの比率でＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）を含む３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤に細胞をカプセル化することで２週間評価された。図１４に示すように、緑色に見えた細胞（生細胞に取り込まれたカルセイン－ＡＭ染色のため）は、約９５％の細胞生存率を示した生細胞集団を表した。本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されたＣＬＳＣは、培養期間を通して生存可能であり、生存可能な集団は、２Ｄカバースリップに類似しており、Ｇｅｌ－ＭＡよりも高かった（２０％、ＤＯＳ＞９５％）。図１４Ｂは、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨを４０／１２５ｍｇ／ｍｌの比率で含むヒドロゲル製剤の１４日目の拡大画像を示す。図１４Ｃから、細胞の大部分が細長い形態になっていることを観察することができる。同様の種類の細長い形態は、２Ｄ表面で培養された細胞によっても示された。画像の約４０層（最小）の３Ｄ再構成でも、ヒドロゲル製剤内の生細胞の均一な分布が確認された（図１４Ｄ）。
【0145】
欠損部位での完全な組織再生のためには、角膜実質幹細胞がその表現型を維持し、徐々に分化した状態に到達しながら、創傷の瘢痕のない治癒を助けることが最も重要である。インビトロ条件では、この段階的な分化のプロセスは、細胞のライフサイクルの特定の段階に特異的なバイオマーカーの発現を確認することによって評価することができる。ＣＤ９０は角膜実質幹細胞によって発現されるそのようなバイオマーカーの１つであるに対して、細胞によるαＳＭＡの発現は角膜実質細胞または筋線維芽細胞への分化状態を反映する。図１５は、２Ｄ培養表面に関してヒドロゲル製剤にカプセル化されたＣＬＳＣによるＣＤ９０（赤）およびαＳＭＡ（緑）の発現を示す免疫蛍光研究を示す。図１５に示すように、本開示のヒドロゲル製剤（４０／１２５ｍｇ／ｍｌ、および７５／１２５ｍｇ／ｍｌの比率のＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨを含む、ＤｏＳ ５０％）で培養されたＣＬＳＣは、ＣＤ９０の発現が良く、αＳＭＡは発現しなかったことを示した。対照的に、２Ｄ表面で培養された細胞は、αＳＭＡの顕著な発現を示し、それらの分化した表現型を示す。したがって、図１５から、本開示のヒドロゲル製剤は、筋線維芽細胞の分化を抑制し、したがって、角膜組織の瘢痕のない創傷治癒をサポートする可能性があることが推測できる。
【0146】
実施例４
バイオエンジニアリング製剤の生体適合性：インビボ研究
インビボでの本開示のヒドロゲル製剤の安全性および有効性を実証するために、ヒドロゲル製剤（７５／１５０ｍｇ／ｍｌで存在する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ、両方ともＤｏＳ ５０％を含む）を臨床的に関連する角膜損傷のウサギモデルに適用した。手短に言えば、ウサギに麻酔をかけ、角膜実質損傷をトレフィンブレードで導入し、角膜の中央領域に直径７ｍｍおよび平均深さ２５０μｍの創傷を作成した。手術後、ウサギは、角膜穿孔の標準治療に使用される臨床グレードの組織接着剤、シアノアクリレート接着剤、または本開示のヒドロゲル製剤のいずれかを受けた。
バイオエンジニアリング製剤の生体適合性：インビボ研究
インビボでの本開示のヒドロゲル製剤の安全性および有効性を実証するために、ヒドロゲル製剤（７５／１５０ｍｇ／ｍｌで存在する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ、両方ともＤｏＳ ５０％を含む）を臨床的に関連する角膜損傷のウサギモデルに適用した。手短に言えば、ウサギに麻酔をかけ、角膜実質損傷をトレフィンブレードで導入し、角膜の中央領域に直径７ｍｍおよび平均深さ２５０μｍの創傷を作成した。手術後、ウサギは、角膜穿孔の標準治療に使用される臨床グレードの組織接着剤、シアノアクリレート接着剤、または本開示のヒドロゲル製剤のいずれかを受けた。
【0147】
図１６は、インビボでのウサギモデルにおけるヒドロゲル製剤（本開示のバイオエンジニアリング製剤は、図１６ではバイオエンジニアリング角膜ｖ１．０と呼ばれる）の前臨床試験を示す。図１６に示すように、シアノアクリレート接着剤による治療を受けているウサギの角膜は透明な角膜を実証しなかったのに対して、本開示のヒドロゲル製剤を受けているウサギの角膜は、２週間の終わりまでに角膜の透明性を示した。上皮治癒の指標であるフルオレセイン染色、および角膜の透明度を測定するための標準的な臨床評価方法であるデンシトメトリースキャンについても、同様の結果が観察された。シアノアクリレート接着剤治療を受けているウサギの角膜は、瘢痕組織の存在によるフルオレセインの貯留および重度の角膜混濁を実証したのに対して、本開示のヒドロゲル製剤を受けているウサギの角膜は、色素貯留の漸進的な減少を示し、２週間にわたって角膜の透明度および視力の漸進的な改善を実証した。
【0148】
図１６から、ウサギの角膜の創傷にシアノアクリレート接着剤を適用すると（図１６Ａ）、角膜の腐食性の不規則な表面が生じ、不透明になり、血管を引き寄せる（赤い矢印で示される）ことを推測することができる。一方では、本開示のヒドロゲル製剤（図１６Ｂ）の適用は、わずか２週間で、透明度の漸進的な増加、血管新生なし、および滑らかな表面を有する完全に治癒した上皮を示した。累積的に、これらの研究は、本開示のヒドロゲル製剤またはバイオエンジニアリング製剤が、角膜の瘢痕のない創傷治癒のための「バイオインストラクティブ」足場として機能することを実証する。
【0149】
実施例５
バイオエンジニアリング製剤およびエクソソーム／セクレトームの組み合わせ
前の実施例に記載されるようにヒドロゲル製剤は、エクソソーム／生理食塩水の直接適用と比較した場合に、長期間にわたってエクソソームの持続放出を促進するのに役立つカプセル化足場として機能する。ヒドロゲル製剤中のエクソソームの存在は、上皮および角膜実質の損傷／感染（活性炎症）を伴う前角膜瘢痕、ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）（持続性角膜上皮欠損）、ステージ２ＮＫ（滑らかで丸められたエッジを特徴とする大きな持続性上皮欠損）、ステージ３ＮＫ（深い角膜潰瘍、角膜実質融解、および無菌性前房蓄膿）、モーレン潰瘍、円錐角膜、角膜穿孔などの角膜潰瘍などの重度の角膜欠損または角膜疾患を治療するための上述のヒドロゲル製剤の適用範囲を広げる。組み合わせ生成物（ヒドロゲル製剤＋エクソソーム）は、ＭＳＣ由来のエクソソーム／セクレトームおよびｃＧＭＰグレードの幹細胞を添加することで、ヒドロゲル成分の創傷治癒効果を高めるのに役立つ。
バイオエンジニアリング製剤およびエクソソーム／セクレトームの組み合わせ
前の実施例に記載されるようにヒドロゲル製剤は、エクソソーム／生理食塩水の直接適用と比較した場合に、長期間にわたってエクソソームの持続放出を促進するのに役立つカプセル化足場として機能する。ヒドロゲル製剤中のエクソソームの存在は、上皮および角膜実質の損傷／感染（活性炎症）を伴う前角膜瘢痕、ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）（持続性角膜上皮欠損）、ステージ２ＮＫ（滑らかで丸められたエッジを特徴とする大きな持続性上皮欠損）、ステージ３ＮＫ（深い角膜潰瘍、角膜実質融解、および無菌性前房蓄膿）、モーレン潰瘍、円錐角膜、角膜穿孔などの角膜潰瘍などの重度の角膜欠損または角膜疾患を治療するための上述のヒドロゲル製剤の適用範囲を広げる。組み合わせ生成物（ヒドロゲル製剤＋エクソソーム）は、ＭＳＣ由来のエクソソーム／セクレトームおよびｃＧＭＰグレードの幹細胞を添加することで、ヒドロゲル成分の創傷治癒効果を高めるのに役立つ。
【0150】
ＭＳＣの治療効果は、エクソソームを含む細胞から分泌されるパラクリン因子に大部分は起因している。エクソソームは、細胞間のクロストークのメディエータとして機能するナノメートルサイズの膜結合細胞外小胞である。ＭＳＣ由来のエクソソームは、成長因子、サイトカイン、脂質部分、ｍｉＲＮＡおよび他のノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含む核酸などのタンパク質を含有する。エクソソーム関連タンパク質のいくつかは、典型的には、治療用途で知られているが、創傷治癒に重要ないくつかのシグナル伝達経路（Ａｋｔ、ＥＲＫ、およびＳＴＡＴ３）を活性化することが見出されているＭＳＣエクソソームが含まれる。それらはまた、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ１）、神経成長因子（ＮＧＦ）、角膜実質由来成長因子－１（ＳＤＦ１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホグルコムターゼ、エノラーゼ、ｓＦＬＴ１、ならびにｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ１４５、およびｍｉＲ－２０５を含むｍｉＲＮＡを含む、多くの成長因子の発現を誘導する。
【0151】
本開示は、バイオエンジニアリング製剤および幹細胞由来のエクソソームの以下の組み合わせを提供する。
実施例１：バイオエンジニアリング製剤ａ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＢＭＭＳＣ由来エクソソーム／ｍｌ
実施例２：バイオエンジニアリング製剤ｂ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＣＬＳＣ－エクソソーム／ｍｌ
実施例３：バイオエンジニアリング製剤ｃ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ－エクソソーム／ｍｌ。
実施例１：バイオエンジニアリング製剤ａ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＢＭＭＳＣ由来エクソソーム／ｍｌ
実施例２：バイオエンジニアリング製剤ｂ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＣＬＳＣ－エクソソーム／ｍｌ
実施例３：バイオエンジニアリング製剤ｃ：３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ－エクソソーム／ｍｌ。
【0152】
方法論：
（ａ）角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）、ＢＭＭＳＣのゼノフリー単離および培養：
ヒトドナーからのＣＬＳＣ、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣの単離および培養のためのゼノフリープロトコルは、本開示に完全に組み込まれる係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２、およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
（ａ）角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）、ＢＭＭＳＣのゼノフリー単離および培養：
ヒトドナーからのＣＬＳＣ、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣの単離および培養のためのゼノフリープロトコルは、本開示に完全に組み込まれる係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２、およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
【0153】
（ｂ）ＣＬＳＣ－ＣＭまたはＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣを得るプロセス：
プライミングプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
プライミングプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
【0154】
（ｃ）イオジキサノール密度勾配超遠心分離を使用した骨髄間葉系幹細胞ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣからのエクソソームおよびセクレトームの精製のためのプロトコル：
エクソソームおよびセクレトームの精製のためのプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
エクソソームおよびセクレトームの精製のためのプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
【0155】
（ｄ）イオジキサノール密度勾配超遠心分離を使用したＣＬＳＣでプライミングされたＢＭ－ＭＳＣからのエクソソームおよびセクレトームの精製のプロトコル：
イオジキサノール密度勾配超遠心分離を使用したＣＬＳＣでプライミングされたＢＭ－ＭＳＣからのエクソソームおよびセクレトームの精製のためのプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
イオジキサノール密度勾配超遠心分離を使用したＣＬＳＣでプライミングされたＢＭ－ＭＳＣからのエクソソームおよびセクレトームの精製のためのプロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。
【0156】
精製プロトコルの選択は、標的の適応および組織特異的である。例えば、イオジキサノール勾配超遠心分離のＢＭＭＳＣ＋エクソソーム精製プロトコルとそれに続くＣａｐｔｏｃｏｒｅ７００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーとの組み合わせは、エクソソーム調製物に混入する血管新生因子の量が少ないため、角膜などの無血管組織での出願に使用される（係属中の出願ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２号および同第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３号に記載されており、これらは本開示に完全に組み込まれている）。Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００は、リガンドで活性化されるコアおよび不活性シェルで構成されている。不活性シェルは、大きな分子（カットオフ約Ｍｒ７０００００）がシェルの細孔を通ってコアに入るのを排除する。これらの大きな分子はカラムフロースルーに集められ、小さな不純物は内部移行したリガンドに結合する。さらに、樹脂Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ７００は、リットル単位の容量までスケーラブルである。異なる純度のエクソソームは、標的の適応の特異性のために開発される。例えば、イオジキサノール密度勾配超遠心分離または３０％スクロースクッション＋Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ７００の組み合わせは、角膜などの無血管組織への適用に理想的な血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ）による汚染を最小限に抑えて、最高の純度を提供する（係属中の出願ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２号および同第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３号に記載されており、これらは本開示に完全に組み込まれている）。
【0157】
（ｅ）マイクロキャリア上でのＭＳＣおよびＣＬＳＣのスケーラブルな培養：
３Ｄ培養物プロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２号および同第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３号に記載されている。
３Ｄ培養物プロトコルは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２号および同第ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３号に記載されている。
【0158】
ヒト骨髄由来幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、ヒト角膜輪部幹細胞（ＣＬＳＣ）、およびＣＬＳＣ馴化培地（ＣＬＳＣ－ＣＭ）でプライミングされたＢＭ－ＭＳＣ（ＣＬＳＣ－ＣＭ／ＢＭ－ＭＳＣ）からエクソソームを精製するプロセスは、望ましい再生の可能性を有する。ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭセクレトームの詳細な分泌プロファイル、ならびに角膜潰瘍および炎症状態を含む複数の疾患におけるその適用は、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている。ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣにおけるＨＧＦ発現の増加およびＶＥＧＦ発現の減少の機能的重要性（本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に提供されている）が、角膜用途に関して本開示において実証されている。
【0159】
さらに、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているプロセスによって調製されたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームは、血管新生を促進も阻害もしない。この結論をさらに裏付けるために、その全体が本開示の係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３で提供された結果は、エクソソーム精製プロトコル（密度勾配超遠心分離とそれに続くサイズ排除クロマトグラフィー（Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ７００）上述の係属中の出願で提供され、非常に低レベルのＶＥＧＦを含有する。したがって、同じプロトコル（その全体が本開示の係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に完全に記載されているような）を使用して調製されたＣＬＳＣ－に由来するエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣに由来するエクソソームが、血管新生促進活性も阻害しないことが企図され得る。
【0160】
プライミング幹細胞の重要性
ＣＬＳＣ－ＣＭを使用してｈＢＭ－ＭＳＣをプライミングすると、ＢＭ－ＭＳＣの表現型がよりＣＬＳＣ様プロファイルに偏る。これは、調達が困難なヒトドナー角膜から新鮮なＣＬＳＣを単離する必要性を回避し、エクソソームバッチ産生におけるドナー間の変動を最小限に抑えるのに役立つ。さらに、ＢＭ－ＭＳＣの市販の供給源と比較した場合、ＣＬＳＣの収量も非常に低い。したがって、ＣＬＳＣのように振る舞うようにＢＭ－ＭＳＣを再プログラミングするプロセスは、治療用エクソソームの産生に十分な細胞収量を提供する。係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３で提示された結果は、ＣＬＳＣ－ＣＭでＢＭＭＳＣをプライミングすると、ＨＧＦの分泌が増加し、ＢＭＭＳＣのＶＥＧＦおよびＩＬ－６のレベルが低下することを実証する。本開示では、ドナー角膜当たり約０．５～１Ｍの幹細胞（ＣＬＳＣ）が単離され、これは３継代で４～６Ｍに拡張することができる。市販のＢＭＭＳＣは、３継代で１Ｍから８０～１２０Ｍに拡張することができる（ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ Ｉｎｃ．）。ここで注目に値するのは、ＣＬＳＣに対してＢＭＭＳＣを使用することで、約２０～３０倍高い細胞収量が達成されたことである。しかしながら、ＣＬＳＣ（角膜に存在するＭＳＣ）は、ＢＭＭＳＣの使用では模倣できない角膜創傷治癒に非常に効果的であることが示されている。したがって、本開示では、ＢＭＭＳＣは、ＢＭＭＳＣをＣＬＳＣ様幹細胞に再プログラムするために、ＣＬＳＣ馴化培地でプライミングされた。ＣＬＳＣ馴化培地でＢＭＭＳＣをプライミングするプロセスは、ＣＬＳＣ様ＢＭＭＳＣ細胞収量およびエクソソームを２０～６０倍高くするのに役立つ。ＣＬＳＣ－エクソソームを使用すると、眼当たり１～５億エクソソームの用量で８～１０の角膜を治療できるのに対して、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣに由来するエクソソームは、１人のドナー角膜から２０～６０倍、すなわち２００～６００人の患者を治療するのに役立つ。さらに、３Ｄスケーラブルな細胞増殖を採用することにより、細胞およびエクソソームの収量がさらに５～１０倍増幅された。したがって、ＣＬＳＣ－ＣＭプライミングプロセスを３Ｄ増殖法と組み合わせることにより、１００～６００倍高いエクソソーム収量が得られ、それによって、ドナー角膜当たり約１０００～５０００人の患者の治療が可能になる（本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３にも記載されている）。
ＣＬＳＣ－ＣＭを使用してｈＢＭ－ＭＳＣをプライミングすると、ＢＭ－ＭＳＣの表現型がよりＣＬＳＣ様プロファイルに偏る。これは、調達が困難なヒトドナー角膜から新鮮なＣＬＳＣを単離する必要性を回避し、エクソソームバッチ産生におけるドナー間の変動を最小限に抑えるのに役立つ。さらに、ＢＭ－ＭＳＣの市販の供給源と比較した場合、ＣＬＳＣの収量も非常に低い。したがって、ＣＬＳＣのように振る舞うようにＢＭ－ＭＳＣを再プログラミングするプロセスは、治療用エクソソームの産生に十分な細胞収量を提供する。係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３で提示された結果は、ＣＬＳＣ－ＣＭでＢＭＭＳＣをプライミングすると、ＨＧＦの分泌が増加し、ＢＭＭＳＣのＶＥＧＦおよびＩＬ－６のレベルが低下することを実証する。本開示では、ドナー角膜当たり約０．５～１Ｍの幹細胞（ＣＬＳＣ）が単離され、これは３継代で４～６Ｍに拡張することができる。市販のＢＭＭＳＣは、３継代で１Ｍから８０～１２０Ｍに拡張することができる（ＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ Ｉｎｃ．）。ここで注目に値するのは、ＣＬＳＣに対してＢＭＭＳＣを使用することで、約２０～３０倍高い細胞収量が達成されたことである。しかしながら、ＣＬＳＣ（角膜に存在するＭＳＣ）は、ＢＭＭＳＣの使用では模倣できない角膜創傷治癒に非常に効果的であることが示されている。したがって、本開示では、ＢＭＭＳＣは、ＢＭＭＳＣをＣＬＳＣ様幹細胞に再プログラムするために、ＣＬＳＣ馴化培地でプライミングされた。ＣＬＳＣ馴化培地でＢＭＭＳＣをプライミングするプロセスは、ＣＬＳＣ様ＢＭＭＳＣ細胞収量およびエクソソームを２０～６０倍高くするのに役立つ。ＣＬＳＣ－エクソソームを使用すると、眼当たり１～５億エクソソームの用量で８～１０の角膜を治療できるのに対して、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣに由来するエクソソームは、１人のドナー角膜から２０～６０倍、すなわち２００～６００人の患者を治療するのに役立つ。さらに、３Ｄスケーラブルな細胞増殖を採用することにより、細胞およびエクソソームの収量がさらに５～１０倍増幅された。したがって、ＣＬＳＣ－ＣＭプライミングプロセスを３Ｄ増殖法と組み合わせることにより、１００～６００倍高いエクソソーム収量が得られ、それによって、ドナー角膜当たり約１０００～５０００人の患者の治療が可能になる（本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３にも記載されている）。
【0161】
エクソソームおよび幹細胞を含むバイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセス
３３ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）およびエクソソーム（ＣＬＳＣ、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣＳ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣに由来）を含むバイオエンジニアリング製剤またはヒドロゲル製剤を得るためのプロセスを以下に示す。
（ｉ）凍結乾燥したバイオエンジニアリング角膜粉末を含むバイアルＩ（２～７．５ｍｇの範囲の濃度を有する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５～１５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＲＣＰ－ＳＨの組み合わせを含む）、および光開始剤溶液（１００μｌ）を含むバイアルＩＩを、光から保護された根温ＲＴに温めた。
（ｉｉ）針およびシリンジを使用して、バイアルＩＩからの光開始剤溶液を、光から保護されたバイアルＩの内容物に移した。次いで、バイアルＩを穏やかに回転させて、溶解を促進するために内容物が浸漬されていることを確認する。
（ｉｉｉ）バイアルＩの成分が完全に溶解した後、凍結乾燥したエクソソームおよび細胞を最終的なプレヒドロゲル製剤と混合して、均質な溶液を得た。
（ｉｖ）針およびシリンジを使用して、必要な体積を角膜欠損部位に投与し、プレヒドロゲル製剤を５分間白色光に曝露した。
（ｖ）白色光への曝露後、欠損部位を生理食塩水で洗浄して、架橋ヒドロゲルを水和させた。
３３ｋＤＡのＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）およびエクソソーム（ＣＬＳＣ、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣＳ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣに由来）を含むバイオエンジニアリング製剤またはヒドロゲル製剤を得るためのプロセスを以下に示す。
（ｉ）凍結乾燥したバイオエンジニアリング角膜粉末を含むバイアルＩ（２～７．５ｍｇの範囲の濃度を有する３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび５～１５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＲＣＰ－ＳＨの組み合わせを含む）、および光開始剤溶液（１００μｌ）を含むバイアルＩＩを、光から保護された根温ＲＴに温めた。
（ｉｉ）針およびシリンジを使用して、バイアルＩＩからの光開始剤溶液を、光から保護されたバイアルＩの内容物に移した。次いで、バイアルＩを穏やかに回転させて、溶解を促進するために内容物が浸漬されていることを確認する。
（ｉｉｉ）バイアルＩの成分が完全に溶解した後、凍結乾燥したエクソソームおよび細胞を最終的なプレヒドロゲル製剤と混合して、均質な溶液を得た。
（ｉｖ）針およびシリンジを使用して、必要な体積を角膜欠損部位に投与し、プレヒドロゲル製剤を５分間白色光に曝露した。
（ｖ）白色光への曝露後、欠損部位を生理食塩水で洗浄して、架橋ヒドロゲルを水和させた。
【0162】
幹細胞およびエクソソームを含むヒドロゲル製剤を得るためのプロセスの概略図を図１７に示す。
【0163】
結果
エクソソームは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているプロセスに従って精製および特徴付けられた。
エクソソームは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているプロセスに従って精製および特徴付けられた。
【0164】
（Ａ）実施例１：バイオエンジニアリング製剤ａ：ＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＢＭＭＳＣ由来エクソソーム／ｍｌ
エクソソームは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているプロセスに従って精製および特徴付けられた。
エクソソームは、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されているプロセスに従って精製および特徴付けられた。
【0165】
（ｉ）ＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ由来の馴化培地の抗炎症活性の特性評価
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、１２ウェルプレートに播種し、４×１０８エクソソーム（１μｇ）またはＣＬＳＣの馴化培地（２５％、５０％置換）（図１８の灰色で示される）で一晩（１６時間）前処理した後、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激を４時間行った。次いで、細胞を洗浄し、ＲＮＡ抽出および定量化のために溶解した。ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０およびＶＥＧＦＡなどのＬＰＳ誘導性サイトカインの転写レベルを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量的に測定した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）由来のエクソソーム（画分９）およびｃａｐｔｏｃｏｒｅ精製サブ画分Ｆ９－ＣＣ（プールした画分Ｆ９－２および３）は、ＬＰＳ刺激に応答したマクロファージによる炎症反応を有意にブロックした（図１８）。しかしながら、ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームは、ＶＥＧＦＡ転写レベルに顕著な影響を及ぼさなかった。ＣＬＳＣからの馴化培地はまた、用量依存的に炎症性サイトカインの発現を阻害した（完全培地をＣＬＳＣ由来の馴化培地で２５％および５０％置換）。
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、１２ウェルプレートに播種し、４×１０８エクソソーム（１μｇ）またはＣＬＳＣの馴化培地（２５％、５０％置換）（図１８の灰色で示される）で一晩（１６時間）前処理した後、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激を４時間行った。次いで、細胞を洗浄し、ＲＮＡ抽出および定量化のために溶解した。ＩＬ－６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０およびＶＥＧＦＡなどのＬＰＳ誘導性サイトカインの転写レベルを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって定量的に測定した。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭ－ＭＳＣ）由来のエクソソーム（画分９）およびｃａｐｔｏｃｏｒｅ精製サブ画分Ｆ９－ＣＣ（プールした画分Ｆ９－２および３）は、ＬＰＳ刺激に応答したマクロファージによる炎症反応を有意にブロックした（図１８）。しかしながら、ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームは、ＶＥＧＦＡ転写レベルに顕著な影響を及ぼさなかった。ＣＬＳＣからの馴化培地はまた、用量依存的に炎症性サイトカインの発現を阻害した（完全培地をＣＬＳＣ由来の馴化培地で２５％および５０％置換）。
【0166】
サイトカインの分泌タンパク質レベルは、図１８（Ａ－Ｆ）に示す転写産物発現データを補完するために、ＢＭＭＳＣ－エクソソームで処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から収集された上清でも測定された。ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γのタンパク質レベル（それぞれ図１８Ｇ－Ｊに示す）もＢＭＭＳＣエクソソームによって顕著に抑制され、ＢＭＭＳＣエクソソームの阻害効果が転写レベルで起こり、最終的なタンパク質発現にも反映されたことを確認した。
【0167】
図１８から、ヒトＢＭＭＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ由来の馴化培地は、マクロファージにおける炎症性サイトカインの発現を阻害することを推測することができる。
【0168】
（ｉｉ）ＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームの血管新生活性の特性評価
（ａ）ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームの抗血管新生活性：
冠状動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）を、成長因子が減少したマトリゲル上の無血清増殖培地、４×１０８エクソソーム（１μｇ）でのＶＥＧＦ補足培地＋／－のいずれかに、２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図１９に示すように、対照（図１９Ａ－Ｂ）およびｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソーム（図１９Ｃ－Ｄ、）で処理した内皮細胞の間で管形成に有意差は観察されなかった。
（ａ）ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームの抗血管新生活性：
冠状動脈内皮細胞（ＣＡＥＣ）を、成長因子が減少したマトリゲル上の無血清増殖培地、４×１０８エクソソーム（１μｇ）でのＶＥＧＦ補足培地＋／－のいずれかに、２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図１９に示すように、対照（図１９Ａ－Ｂ）およびｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソーム（図１９Ｃ－Ｄ、）で処理した内皮細胞の間で管形成に有意差は観察されなかった。
【0169】
（ｂ）ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームの血管新生促進活性：
ＣＡＥＣを、４×１０８エクソソーム（１μｇ）を含む成長因子が減少したマトリゲル上＋／－上の無血清増殖培地（サプリメントなし）に２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図１９に示すように、対照（図１９Ｅ－Ｆ）およびｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソーム（図１９Ｇ－Ｈ）で処理した内皮細胞の間で管形成に有意差は観察されなかった。
ＣＡＥＣを、４×１０８エクソソーム（１μｇ）を含む成長因子が減少したマトリゲル上＋／－上の無血清増殖培地（サプリメントなし）に２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図１９に示すように、対照（図１９Ｅ－Ｆ）およびｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソーム（図１９Ｇ－Ｈ）で処理した内皮細胞の間で管形成に有意差は観察されなかった。
【0170】
（ｉｉｉ）ｈＢＭ－ＭＳＣ由来のエクソソームの創傷治癒効果
精製されたエクソソームの治療機能は、２Ｄ単層フォーマットのエクソソームの存在下または非存在下で、角膜上皮細胞によって示される創傷治癒の有効性を決定することによって特徴付けられた。細胞を平らな表面に播種し、単層全体にスクラッチ（創傷を模倣）を作成した。
精製されたエクソソームの治療機能は、２Ｄ単層フォーマットのエクソソームの存在下または非存在下で、角膜上皮細胞によって示される創傷治癒の有効性を決定することによって特徴付けられた。細胞を平らな表面に播種し、単層全体にスクラッチ（創傷を模倣）を作成した。
【0171】
図２０は、ｈＢＭ－ＭＳＣから単離されたエクソソームの機能特性評価を示す。図２０Ａは、複数の時点（０、１２、２４、４８、７２時間）にわたって観察された、ヒト角膜上皮細胞の単層上の創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像を表す。図２０Ｂは、７２時間でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）のパーセンテージの定量化を表す。
【0172】
図２０から、Ｆ９およびＦ９－ＣＣのエクソソーム（ｃａｐｔｏｃｏｒｅ精製ステップからのプールしたサブ画分Ｆ９－２および３）は、ビヒクル単独の対照と比較した場合、優れた創傷治癒能力を示したことを観察することができる。
【0173】
（ｉｖ）カプセル化細胞の生存率およびエクソソーム放出アッセイに対するエクソソームの影響の実施例（バイオエンジニアリング製剤（３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ／５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨ（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋幹細胞＋エクソソーム）
ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌを含む）にカプセル化されたＭＳＣの細胞生存率に対するエクソソームの影響を評価するために、ＭＳＣはエクソソームの存在下でカプセル化され、培養培地中に補充するかまたはヒドロゲル内の細胞と一緒にカプセル化されるかのいずれかである。細胞生存率は、特定の時点でＣＣＫ８アッセイを使用して評価された。図２２は、エクソソームの存在下で、ＭＳＣ、馴化培地中のＭＳＣ＋エクソソームの組み合わせ、および本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されたＭＳＣの細胞活性の間の比較を示す。本明細書のエクソソームには、ＣＬＳＣに由来するエクソソーム、またはＣＬＳＣ馴化培地に由来するエクソソーム、またはＣＬＳＣ馴化培地でプライミングされたＭＳＣに由来するエクソソームが含まれるが、これらに限定されないことが企図され得る。
ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（３０ｍｇ／ｍｌのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌを含む）にカプセル化されたＭＳＣの細胞生存率に対するエクソソームの影響を評価するために、ＭＳＣはエクソソームの存在下でカプセル化され、培養培地中に補充するかまたはヒドロゲル内の細胞と一緒にカプセル化されるかのいずれかである。細胞生存率は、特定の時点でＣＣＫ８アッセイを使用して評価された。図２２は、エクソソームの存在下で、ＭＳＣ、馴化培地中のＭＳＣ＋エクソソームの組み合わせ、および本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されたＭＳＣの細胞活性の間の比較を示す。本明細書のエクソソームには、ＣＬＳＣに由来するエクソソーム、またはＣＬＳＣ馴化培地に由来するエクソソーム、またはＣＬＳＣ馴化培地でプライミングされたＭＳＣに由来するエクソソームが含まれるが、これらに限定されないことが企図され得る。
【0174】
図２２から、エクソソームの存在下で、カプセル化されたＭＳＣ（本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化された）の細胞生存率は、ＭＳＣのみ（対照）と比較してかなり高かったことを観察することができる。この結果は、エクソソームがヒドロゲルマトリックス内にカプセル化された細胞の生存率を延長する能力を有することを実証する（図２２）。さらに、図２１から、本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されたエクソソームが着実に周囲の培地に放出され、検出可能なレベルが１６日目以降に定量化されていることを観察することができる。
【0175】
図２２は、ヒドロゲル製剤にカプセル化されたＭＳＣの細胞生存率に対するエクソソームの影響を示す。図２２から、エクソソーム（培養培地に補充した２．８×１０９粒子／ヒドロゲルまたはヒドロゲルにカプセル化）の存在下で、カプセル化されたＭＳＣ（２００００細胞／２０μｌゲル）の細胞生存率が、細胞のみの対照と比較した５日目に、本開示のＨＡ／ＲＣＰ（４０／１２５ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）ヒドロゲル製剤およびＧｅｌ－ＭＡ（１０％ｗ／ｖ、ＤｏＳ ８０％）ヒドロゲルでかなり高いことを確認することができる。Ｇ＋Ｃは細胞を含むヒドロゲルを指し、ＧＣ Ｅｘ．ＣＭは培養培地を介してエクソソームを受け取る細胞カプセル化ゲルを指し、ＧＣ Ｅｘ．Ｅｎｃ．は、ゲルに一緒にカプセル化された細胞およびエクソソームを指す。データは、ｎ＝３回複製で平均±ＳＥとして表される。
【0176】
エクソソームの存在は、本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されたＭＳＣの細胞生存率を高めるのに役立つことが図２２から推測することができる。最高の細胞生存率は、ヒドロゲルに一緒にカプセル化された細胞およびエクソソームを含む本開示のヒドロゲルについて観察することができる。Ｇｅｌ－ＭＡよりもさらに高いことが観察され、前述のように、Ｇｅｌ－ＭＡは他のパラメータに関して望ましい結果を提供しない。
【0177】
（ｖ）エクソソームの存在下でＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ上で培養されたヒト皮膚線維芽細胞
ヒト皮膚線維芽細胞（５×１０５）を、４×１０８ＢＭＭＳＣエクソソームまたはＰＢＳ対照を補充した培養培地のヒドロゲル（４０／１２５）の上に播種した（図２３）。
ヒト皮膚線維芽細胞（５×１０５）を、４×１０８ＢＭＭＳＣエクソソームまたはＰＢＳ対照を補充した培養培地のヒドロゲル（４０／１２５）の上に播種した（図２３）。
【0178】
図２３Ａは、２Ｄ培養におけるヒト皮膚線維芽細胞の培養を示し、図２３Ｂは、ＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨヒドロゲル製剤（４０ｍｇ／ｍｌの３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌの５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを含む）の表面でのヒト皮膚線維芽細胞の培養を示し、図２３Ｃは、エクソソーム補足培地を含むＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨ製剤（４０ｍｇ／ｍｌの３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡおよび１２５ｍｇ／ｍｌの５０ｋＤａのＲＣＰ－ＳＨを含む）の表面でのヒト皮膚線維芽細胞の培養を示す。図２３から、本開示のヒドロゲル製剤中のエクソソームの存在は、すべての研究で使用された濃度（４億エクソソーム／ｍｌ）で細胞に細胞毒性効果を及ぼさないように見えたことを観察することができる。
【0179】
（Ｂ）実施例２および３：バイオエンジニアリング製剤ａ：ＨＡ－ＭＡ（３３ｋＤａ）／ＲＣＰ－ＳＨ（５０ｋＤａ）（２０～７５／２０～２５０、ｍｇ／ｍｌ、ＤｏＳ ５０％）＋５億～２５０億ＣＬＳＣ由来のエクソソーム／ｍｌまたはＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソーム／ｍｌ
（ｉ）ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの抗炎症活性
ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣの炎症プロファイルは、ＢＭＭＳＣとは興味深いことに異なっていた。ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームは、活性化されたＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける炎症性サイトカイン分泌を顕著に抑制した。しかしながら、ＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの効果は、ＣＬＳＣ系統のエクソソームよりも大きかった（図２４）。
（ｉ）ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの抗炎症活性
ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣの炎症プロファイルは、ＢＭＭＳＣとは興味深いことに異なっていた。ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームは、活性化されたＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける炎症性サイトカイン分泌を顕著に抑制した。しかしながら、ＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの効果は、ＣＬＳＣ系統のエクソソームよりも大きかった（図２４）。
【0180】
さらに、ナイーブＢＭＭＳＣと比較した場合、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣにおけるＨＧＦの分泌が増強された（結果は、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている）。さらに、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣは、ＶＥＧＦ分泌の低下も実証し、親ＣＬＳＣに共通する血管新生プロファイルが低下した（結果は、本開示に完全に組み込まれている係属中の出願ＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２２およびＰＣＴ／ＩＮ２０２０／０５０６２３に記載されている）。したがって、抗炎症活性と、ＣＬＳＣ－ＣＭプライムＢＭＭＳＣエクソソームによって維持されるＨＧＦ高／ＶＥＧＦ低プロファイルとの組み合わせは、角膜欠損用にカスタマイズされた本開示のエクソソーム生成物（バイオエンジニアリング製剤＋ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣエクソソーム）につながる。
【0181】
（Ｃ）ＣＬＳＣ馴化培地由来のセクレトーム／エクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ馴化培地由来のセクレトーム／エクソソームの機能的特性評価
（ｉ）ＣＬＳＣ馴化培地／セクレトームの血管新生活性
ＣＡＥＣを、ＣＬＳＣ馴化培地（ＣＭ）の有無にかかわらず、成長因子が減少したマトリゲル上の無血清増殖培地に２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図２５は、ＣＬＳＣ－ＣＭ／セクレトームの血管新生活性を示す。図２５から、用量依存的にのみビヒクル（ＰＢＳ、対照）と比較した場合、ＣＬＳＣ－ＣＭ／セクレトームが内皮細胞の管形成能力を顕著に破壊したことを観察することができる。
（ｉ）ＣＬＳＣ馴化培地／セクレトームの血管新生活性
ＣＡＥＣを、ＣＬＳＣ馴化培地（ＣＭ）の有無にかかわらず、成長因子が減少したマトリゲル上の無血清増殖培地に２４時間播種した。細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色した。図２５は、ＣＬＳＣ－ＣＭ／セクレトームの血管新生活性を示す。図２５から、用量依存的にのみビヒクル（ＰＢＳ、対照）と比較した場合、ＣＬＳＣ－ＣＭ／セクレトームが内皮細胞の管形成能力を顕著に破壊したことを観察することができる。
【0182】
（ｉｉ）ＣＬＳＣ馴化培地由来セクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ馴化培地由来セクレトームの抗炎症活性
ＲＡＷ２６４．７マクロファージは、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣ、またはＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ（１０％および２５％）から収集された馴化培地由来のセクレトームの存在下または非存在下でＬＰＳで活性化された。細胞を５０％馴化培地を補充した増殖培地で一晩維持し、ＬＰＳで４時間活性化した。
ＲＡＷ２６４．７マクロファージは、ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣ、またはＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ（１０％および２５％）から収集された馴化培地由来のセクレトームの存在下または非存在下でＬＰＳで活性化された。細胞を５０％馴化培地を補充した増殖培地で一晩維持し、ＬＰＳで４時間活性化した。
【0183】
図２６は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞に対するＣＬＳＣ－馴化培地由来セクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ馴化培地由来セクレトームの抗炎症効果を示す。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞を、５０％の補充（５０万ＢＭＭＳＣから収集）でＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣのいずれかから収集された馴化培地で処理した後、ＬＰＳで４時間刺激した。（Ａ）ＩＬ－６、（Ｂ）ＩＬ－１０、（Ｃ）ＴＮＦ－αおよび（Ｄ）ＩＬ－１βについてＥＬＩＳＡによって分泌されたサイトカインのレベルも定量化した。
【0184】
図２６から、３つの細胞型すべて（ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣ、またはＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ）のセクレトームが同等の抗炎症活性を示したことを観察することができる。
【0185】
（ｉｉｉ）ＢＭＭＳＣ馴化培地、ＣＬＳＣ馴化培地由来セクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ馴化培地由来セクレトームの創傷治癒活性
ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ（２５％および１０％）から収集されたセクレトームの治療機能は、２Ｄ単層フォーマットのエクソソームの存在下または非存在下で、角膜上皮細胞によって示される創傷治癒の有効性を決定することによって特徴付けられた。細胞を平らな表面に播種し、単層全体にスクラッチ（創傷を模倣）を作成した。
ＢＭＭＳＣ、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ（２５％および１０％）から収集されたセクレトームの治療機能は、２Ｄ単層フォーマットのエクソソームの存在下または非存在下で、角膜上皮細胞によって示される創傷治癒の有効性を決定することによって特徴付けられた。細胞を平らな表面に播種し、単層全体にスクラッチ（創傷を模倣）を作成した。
【0186】
図２７は、ＣＬＳＣ、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ、およびＢＭＭＳＣセクレトームの創傷治癒活性の比較を示す。（Ａ）複数の時点（０、１２、２４、４８時間）にわたって観察された、セクレトームの存在下（２０万の供給源ＭＳＣに相当）でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像、（Ｂ）複数の時点（０、１２、２４、４８、７２時間）にわたって観察された、４×１０８エクソソームの存在下（２０万の供給源ＭＳＣに相当）でのヒト角膜上皮細胞の単層における創傷閉鎖（２Ｄスクラッチアッセイ）の時間経過を示す代表的な画像。
【0187】
図２７は、ＣＬＳＣ由来のセクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のセクレトームが、ＢＭＭＳＣ由来のセクレトームと比較した場合、創傷治癒アッセイでヒト角膜上皮細胞の遊走を促進するのに優れていることを明確に実証する。したがって、ＣＬＳＣ由来のセクレトームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のセクレトームは、ナイーブなＢＭＭＳＣ由来のセクレトームと比較して優れた創傷治癒能力を示すと推測することができる。
【0188】
（ｉｖ）優れた再神経支配活性
ＰＣ１２は、ラット副腎髄質の褐色細胞腫に由来する浮遊細胞株であり、神経堤に胚性起源を有する。これらの細胞は、ＮＧＦで活性化された場合、ニューロンの表現型を獲得するために十分に確立されている。５×１０４／ｍｌ細胞をコラーゲンでコーティングされたウェルに播種し、一晩接着させた。細胞をＮＧＦ（陽性対照）（２０ｎｇ／ｍｌ）または示されたエクソソームサンプル（図の凡例に記載されている用量）で治療し、２４時間でライブイメージングした。図２８は、インビトロ神経支配アッセイの結果を示す。図２８から、インビトロ神経支配アッセイで神経突起伸長が誘導されることによって実証させるように、ＣＳＳＣ由来のエクソソームおよびＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームが神経支配を促進したことを観察することができる（図２８Ｃ－Ｅ）。対照的に、ＰＢＳ（図２８Ａ）およびＢＭＭＳＣエクソソーム処理細胞（それぞれ図２８Ｆ）では神経突起伸長形成は報告されなかった。組換えヒト神経成長因子（ｒｈＮＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）が陽性対照として含まれていた（図２８Ｂ）。ＮＧＦは、神経支配アッセイで一般的に使用される標準的なニューロンの活性化／分化刺激である。
ＰＣ１２は、ラット副腎髄質の褐色細胞腫に由来する浮遊細胞株であり、神経堤に胚性起源を有する。これらの細胞は、ＮＧＦで活性化された場合、ニューロンの表現型を獲得するために十分に確立されている。５×１０４／ｍｌ細胞をコラーゲンでコーティングされたウェルに播種し、一晩接着させた。細胞をＮＧＦ（陽性対照）（２０ｎｇ／ｍｌ）または示されたエクソソームサンプル（図の凡例に記載されている用量）で治療し、２４時間でライブイメージングした。図２８は、インビトロ神経支配アッセイの結果を示す。図２８から、インビトロ神経支配アッセイで神経突起伸長が誘導されることによって実証させるように、ＣＳＳＣ由来のエクソソームおよびＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームが神経支配を促進したことを観察することができる（図２８Ｃ－Ｅ）。対照的に、ＰＢＳ（図２８Ａ）およびＢＭＭＳＣエクソソーム処理細胞（それぞれ図２８Ｆ）では神経突起伸長形成は報告されなかった。組換えヒト神経成長因子（ｒｈＮＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）が陽性対照として含まれていた（図２８Ｂ）。ＮＧＦは、神経支配アッセイで一般的に使用される標準的なニューロンの活性化／分化刺激である。
【0189】
さらに、神経支配アッセイの結果を検証するために、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣによって分泌されたＮＧＦのタンパク質レベルを、セクレトームおよびエクソソームの両方で、ＥＬＩＳＡによって評価した。図２９はＮＧＦの分泌レベルを示す。図２９を参照すると、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣは、ＣＬＳＣよりも低い濃度ではあるが、エクソソーム（図２９Ａ）およびセクレトーム（図２９Ｂ）でＮＧＦを分泌した。ウエスタンブロットによるセクレトームの分析もこの傾向を確認した（図２９Ｃ）。
【0190】
したがって、図２８および図２９から、ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームは、ＰＣ１２細胞の神経支配（神経突起伸長）を４億エクソソーム／ｍｌで促進することを観察することができる。
【0191】
（ｖ）ＣＳＳＣ－およびＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣエクソソームの優れた抗線維化活性
図３０は、ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭプライミングされた由来のエクソソームの抗線維化効果を示す。ヒト皮膚線維芽細胞を、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間線維化を誘導する前に、示したエクソソーム（４×１０８／ｍｌ）で４時間前処理した。細胞を抗α－ＳＭＡ抗体（緑色で示される）（線維症のマーカー）およびＤＡＰＩ（核、青色で示される）で染色した。
図３０は、ＣＬＳＣ由来のエクソソームおよびＣＬＳＣ－ＣＭプライミングされた由来のエクソソームの抗線維化効果を示す。ヒト皮膚線維芽細胞を、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間線維化を誘導する前に、示したエクソソーム（４×１０８／ｍｌ）で４時間前処理した。細胞を抗α－ＳＭＡ抗体（緑色で示される）（線維症のマーカー）およびＤＡＰＩ（核、青色で示される）で染色した。
【0192】
図３０から、ＣＬＳＣ由来のエクソソーム、ＣＳＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソーム、またはＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの存在下で、ＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むヒト皮膚線維芽細胞で線維症（α－ＳＭＡ発現）が誘導されたことを観察することができる。ＣＬＳＣ－およびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームは、ＴＧＦ－βが誘導するα－ＳＭＡの発現を阻害したが（図３０Ｃ－Ｅ）、ＢＭＭＳＣ由来のエクソソーム（ドナー２００）は、α－ＳＭＡの誘導を阻害する効果はほとんどなかった（図３０Ｆ）。１０％ＣＬＳＣ－ＣＭおよび２５％ＣＬＳＣ－ＣＭの両方のプライミングは、用量依存的にヒト皮膚線維芽細胞のα－ＳＭＡ発現を阻害した（図３０Ｄ－Ｅ）。
【0193】
（ｖｉ）ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされた由来のエクソソームおよびセクレトームの血管新生活性の特性評価。
図３１は、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームおよびセクレトームの血管新生活性の特徴付けを示す。図３１Ａおよび３１Ｂから、ＣＬＳＣはＢＭＭＳＣと比較して、セクレトームおよびエクソソームで発現するＶＥＧＦが少ないことを観察することができる。さらに、図３１Ｃ～図３１Ｅから、ＣＬＳＣはＢＭＭＳＣよりもセクレトームおよびエクソソームでより多くのｓＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）を発現していることを観察することができる。ｓＦＬＴ１は、角膜幹細胞から分泌されることが報告されており、角膜の血管系構造に関与していることが示されている。したがって、図３１から、ＣＬＳＣ－ＣＭによるＢＭＭＳＣのプライミングは、ＶＥＧＦ分泌を減少させ、セクレトームおよびエクソソームのｓＦＬＴ１レベルを増加させることにより、ＢＭＭＳＣの血管新生の可能性を減少させる可能性があることを推測することができる。
図３１は、ＣＬＳＣおよびＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームおよびセクレトームの血管新生活性の特徴付けを示す。図３１Ａおよび３１Ｂから、ＣＬＳＣはＢＭＭＳＣと比較して、セクレトームおよびエクソソームで発現するＶＥＧＦが少ないことを観察することができる。さらに、図３１Ｃ～図３１Ｅから、ＣＬＳＣはＢＭＭＳＣよりもセクレトームおよびエクソソームでより多くのｓＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）を発現していることを観察することができる。ｓＦＬＴ１は、角膜幹細胞から分泌されることが報告されており、角膜の血管系構造に関与していることが示されている。したがって、図３１から、ＣＬＳＣ－ＣＭによるＢＭＭＳＣのプライミングは、ＶＥＧＦ分泌を減少させ、セクレトームおよびエクソソームのｓＦＬＴ１レベルを増加させることにより、ＢＭＭＳＣの血管新生の可能性を減少させる可能性があることを推測することができる。
【0194】
上記の結果は、幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせが、本開示のヒドロゲル製剤にカプセル化されている場合にも適用されることが企図され得る。したがって、本開示のヒドロゲル製剤は、生体適合性であり、角膜模倣特性を示す。したがって、２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ／ＲＣＰ－ＭＡ）と、１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）との存在は、天然の角膜の特性を模倣するだけでなく、様々な角膜障害を治療するために角膜欠損の部位に適用することもできる本開示のバイオエンジニアリング製剤またはヒドロゲル製剤に到達するために不可欠である。さらに、本開示のヒドロゲル製剤中の幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの存在は、細胞生存率および細胞増殖を増強するのに役立ち、ヒドロゲル製剤の生体適合性および角膜模倣特性を確認する。図２１および２２に提示されたデータは、ヒドロゲル製剤に存在する場合にエクソソームが良好に機能するという概念実証を示す。したがって、本実施例に示されるようなエクソソームの特性は、エクソソームが本開示のヒドロゲル製剤（バイオエンジニアリング製剤）に存在する場合にも良好に保持されるであろう。
【0195】
本開示で提供される実施例は、分子量「１０ｋＤａ」または「３３ｋＤａ」または「５０ｋＤａ」であり、濃度が３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌの修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－ＭＡ）と、分子量「５０ｋＤａ」であり、濃度が１２５ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌの修飾コラーゲンペプチド（ＲＣＰ－ＳＨ）と、を含むヒドロゲル製剤を提供する。しかしながら、当業者は、異なる分子量、すなわち、２０／３０ｋＤａ、または４０／５５ｋＤａ、または５０／６０ｋＤａ、または８０／７０ｋＤａ、または９０／８０ｋＤａを有し、２０／１２５ｍｇ／ｍｌ、または２５／１２５ｍｇ／ｍｌ、または３０／１２５ｍｇ／ｍｌ、または５０／１２５ｍｇ／ｍｌ、あるいは本開示に記載されている他の任意の開示された範囲の濃度を有するＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨの組み合わせを使用することによって、所望の物理的および機能的特性を示す本開示のヒドロゲル製剤に到達することができることが企図され得る。さらに、前述の濃度または開示された範囲でＨＡ－ＭＡ／ＲＣＰ－ＳＨの異なる組み合わせを有するヒドロゲル製剤に組み込まれた幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせのカプセル化もまた、本明細書に例示されるのと同様の結果をもたらす。
【0196】
実施例６
点眼製剤
本開示はまた、点眼製剤を提供する。点眼製剤は、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む。点眼製剤は、角膜の損傷および潰瘍を治療するのに役立つ。点眼製剤は、本開示のヒドロゲル製剤を受けている患者に対して、単独の治療オプションとして、またはアジュバント治療オプションとして投与される。投与量は、臨床医によって推奨および処方されたとおりになる。本開示のエクソソームの局所適用に使用することができる臨床的に承認された点眼製剤としては、（ａ）Ｔｅａｒｈｙｌ（登録商標）（ヒアルロン酸ナトリウム、０．１～０．３％溶液）、（ｂ）Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｏｐｔｉｖｅ（登録商標）（カルボキシメチルセルロース、０．５％溶液）、（ｃ）Ｓｙｓｔａｎｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）（ポリエチレングリコール、ＭＷ４００、０．４％溶液）、（ｄ）Ｌｅａｄｅｒ（登録商標）人工涙溶液（ポリビニルアルコール、１．４％溶液）、（ｅ）Ｓｙｓｔａｎｅ Ｂａｌａｎｃｅ（登録商標）（プロピレングリコール、０．６％溶液）、および（ｆ）ＭＩＫＥＬＡＮ（登録商標）ＬＡ（アルギン酸ベース）が挙げられる。
点眼製剤
本開示はまた、点眼製剤を提供する。点眼製剤は、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む。点眼製剤は、角膜の損傷および潰瘍を治療するのに役立つ。点眼製剤は、本開示のヒドロゲル製剤を受けている患者に対して、単独の治療オプションとして、またはアジュバント治療オプションとして投与される。投与量は、臨床医によって推奨および処方されたとおりになる。本開示のエクソソームの局所適用に使用することができる臨床的に承認された点眼製剤としては、（ａ）Ｔｅａｒｈｙｌ（登録商標）（ヒアルロン酸ナトリウム、０．１～０．３％溶液）、（ｂ）Ｒｅｆｒｅｓｈ Ｏｐｔｉｖｅ（登録商標）（カルボキシメチルセルロース、０．５％溶液）、（ｃ）Ｓｙｓｔａｎｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）（ポリエチレングリコール、ＭＷ４００、０．４％溶液）、（ｄ）Ｌｅａｄｅｒ（登録商標）人工涙溶液（ポリビニルアルコール、１．４％溶液）、（ｅ）Ｓｙｓｔａｎｅ Ｂａｌａｎｃｅ（登録商標）（プロピレングリコール、０．６％溶液）、および（ｆ）ＭＩＫＥＬＡＮ（登録商標）ＬＡ（アルギン酸ベース）が挙げられる。
【0197】
本開示では、エクソソーム（角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソーム）は、２つの適応症特異的アプローチで投与された。
【0198】
（ｉ）点眼剤製剤：上記の点眼製剤は、選択された標準治療の治療効果を支援／強化するのに役立つ。それらは、以下に列挙された適応症：（ａ）表面的な角膜表面の擦過傷、（ｂ）角膜上皮損傷、（ｃ）ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）：持続性の角膜上皮欠損、（ｄ）ドライアイのために投与される。
【0199】
（ｉｉ）液体角膜ヒドロゲルにカプセル化されたエクソソームとそれに続くエクソソーム点眼薬を使用した術後ケア（ヒドロゲル適用後）：効率的な再上皮化を強化するだけでなく、損傷によって誘発された線維症および損傷を取り巻く炎症の回復を促進する、一定期間にわたるエクソソームの持続放出。カプセル化されたエクソソームとエクソソーム点眼薬を組み合わせることで、任意の炎症反応を抑制し、血管新生を伴わずに線維性瘢痕を徐々に治癒させることができる。それらは、以下に列挙された適応症：（ａ）上皮および角膜実質の損傷／感染（活性炎症）を伴う前角膜瘢痕、（ｂ）ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）（持続性角膜上皮欠損）、（ｃ）ステージ２ＮＫ（滑らかで丸められたエッジを特徴とする大きな持続性上皮欠損）、（ｄ）ステージ３ＮＫ（深い角膜潰瘍、角膜実質融解、および無菌性前房蓄膿）、（ｅ）モーレン潰瘍、（ｆ）円錐角膜、ならびに（ｇ）角膜穿孔のために投与される。
【0200】
実施例：０．１～０．５％の臨床グレードのヒアルロン酸（ＨＡ）＋４億エクソソーム／ｍｌの２５％ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣエクソソームを含有する点眼製剤。
（ｉ）点眼製剤の細胞への取り込み
エクソソームを、メーカーの推奨に従ってＰＫＨ２６で標識した。ＰＢＳ（サンプル体積の５０倍）中で１００，０００ｘｇで２時間超遠心分離を繰り返すことにより、過剰な色素を除去した。０．１～５％ＨＡおよび４×１０８エクソソーム／ｍｌを含む点眼製剤を新たに調製し、ヒト角膜上皮細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をライブで画像化し（図３２）、固定後にサイトケラチン－３／ＤＡＰＩ（緑／ＤＡＰＩ）で免疫染色した（図３３）。図３３に示すように、エクソソーム（赤）は、様々な濃度の臨床グレードＨＡの存在下でも細胞（緑）に取り込まれ、ＨＡとエクソソーム細胞の取り込みとの生体適合性を実証する。エクソソームの取り込みは、試験されたすべての製剤で観察された。しかしながら、ＨＡ１～５％のより高いＨＡ濃度では、エクソソーム取り込みの減少が観察された（図３３Ｅおよび３３Ｆ）。したがって、開示された濃度範囲（０．１～０．５％）よりも高い濃度（１～５％）での臨床グレードＨＡの存在は、非実施例として機能する。したがって、ＨＡとエクソソーム細胞の取り込みとの生体適合性を実証するためには、臨床グレードのＨＡが０．１～０．５％の範囲の濃度で存在することが重要である。
（ｉ）点眼製剤の細胞への取り込み
エクソソームを、メーカーの推奨に従ってＰＫＨ２６で標識した。ＰＢＳ（サンプル体積の５０倍）中で１００，０００ｘｇで２時間超遠心分離を繰り返すことにより、過剰な色素を除去した。０．１～５％ＨＡおよび４×１０８エクソソーム／ｍｌを含む点眼製剤を新たに調製し、ヒト角膜上皮細胞に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をライブで画像化し（図３２）、固定後にサイトケラチン－３／ＤＡＰＩ（緑／ＤＡＰＩ）で免疫染色した（図３３）。図３３に示すように、エクソソーム（赤）は、様々な濃度の臨床グレードＨＡの存在下でも細胞（緑）に取り込まれ、ＨＡとエクソソーム細胞の取り込みとの生体適合性を実証する。エクソソームの取り込みは、試験されたすべての製剤で観察された。しかしながら、ＨＡ１～５％のより高いＨＡ濃度では、エクソソーム取り込みの減少が観察された（図３３Ｅおよび３３Ｆ）。したがって、開示された濃度範囲（０．１～０．５％）よりも高い濃度（１～５％）での臨床グレードＨＡの存在は、非実施例として機能する。したがって、ＨＡとエクソソーム細胞の取り込みとの生体適合性を実証するためには、臨床グレードのＨＡが０．１～０．５％の範囲の濃度で存在することが重要である。
【0201】
（ｉｉ）点眼製剤の抗炎症活性
エクソソーム活性に対するＨＡの効果を評価するために、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの抗炎症活性を定量化した。図３４に示すように、様々な濃度のＨＡの存在下でのエクソソームの抗炎症活性に有意差は観察されなかったため、ＨＡが炎症反応の阻害におけるエクソソーム治療活性に悪影響を及ぼさなかったことを示唆している。さらに、ＨＡ単独ではマクロファージに対する抗炎症効果を誘発しないことも観察され、エクソソームが点眼製剤の重要な治療成分を形成することが確認された。
エクソソーム活性に対するＨＡの効果を評価するために、ＣＬＳＣ－ＣＭでプライミングされたＢＭＭＳＣ由来のエクソソームの抗炎症活性を定量化した。図３４に示すように、様々な濃度のＨＡの存在下でのエクソソームの抗炎症活性に有意差は観察されなかったため、ＨＡが炎症反応の阻害におけるエクソソーム治療活性に悪影響を及ぼさなかったことを示唆している。さらに、ＨＡ単独ではマクロファージに対する抗炎症効果を誘発しないことも観察され、エクソソームが点眼製剤の重要な治療成分を形成することが確認された。
【0202】
実施例７
角膜疾患の治療方法
本開示はまた、角膜障害を治療する方法を提供する。角膜障害を治療する方法は、（ａ）本開示のバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、のステップを含む。バイオエンジニアリング製剤中の幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの存在は、バイオエンジニアリング製剤の創傷治癒能力を増強するのに役立つ。
角膜疾患の治療方法
本開示はまた、角膜障害を治療する方法を提供する。角膜障害を治療する方法は、（ａ）本開示のバイオエンジニアリング製剤を得ることと、（ｂ）角膜欠損の部位に適切な量のバイオエンジニアリング製剤を適用することと、（ｃ）対象の角膜欠損を治療するために、１～１５分、好ましくは２～８分の範囲の期間、角膜欠損の部位の製剤上で５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の強度を有する白色光を照射することと、のステップを含む。バイオエンジニアリング製剤中の幹細胞、またはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの存在は、バイオエンジニアリング製剤の創傷治癒能力を増強するのに役立つ。
【0203】
さらに、本開示はまた、対象における角膜障害を治療する別の方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームが得られる、エクソソームと、（ｉｉ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む点眼製剤と、（ｂ）対象の角膜欠損を治療するために、角膜欠損の部位に製剤を適用することと、のステップを含む。一定期間にわたるエクソソームの持続放出は、効率的な再上皮化を強化するだけでなく、損傷によって誘発された線維症および損傷を取り巻く炎症の回復を促進する。カプセル化されたエクソソームと点眼製剤を組み合わせることで、任意の炎症反応を抑制し、血管新生を伴わずに線維性瘢痕を徐々に治癒させることができる。
【0204】
【0205】
固有粘度は、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋの式（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｉｋｉ．ａｎｔｏｎ－ｐａａｒ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ－ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ／）を使用してモル質量と相関させることができる。
【0206】
Ｉ．Ｖ．＝Ｋ（Ｍ＾ａ）、Ｋ、ａは、Ｍａｒｋ－Ｈｏｕｗｉｎｋ定数である。
【0207】
「３３ｋＤａ」のＨＡ ＭＷの場合、定数Ｋおよびａは、それぞれ０．０３６および０．７８である。（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”ｂｙ Ｊ．Ｗ Ｋｕｏ，Ｐａｇｅ ８３）。
【0208】
これらの値に基づいて、「３３ｋＤａ」ＨＡ－ＭＡのＭＷは約１２ｋＤａと計算される。
【0209】
表３は、様々な手法に基づくＨＡおよびＨＡ－ＭＡ誘導体の分子量推定を示す。
【表3】
【0210】
「３３ｋＤａ」ＨＡ－メタクリレートの定義
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによると、ヒアルロン酸（ＨＡ）原料の分子量は、固有粘度（ｉ．ｖ．）の測定値に基づいて３３ｋＤａ（図３６）であった。しかしながら、社内のＧＰＣデータに基づくと、このＨＡ原材料のＭＷ範囲は４８～１４８ｋＤａであり、ピークＭＷは８９ｋＤａであることが見出された（図３６）。
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによると、ヒアルロン酸（ＨＡ）原料の分子量は、固有粘度（ｉ．ｖ．）の測定値に基づいて３３ｋＤａ（図３６）であった。しかしながら、社内のＧＰＣデータに基づくと、このＨＡ原材料のＭＷ範囲は４８～１４８ｋＤａであり、ピークＭＷは８９ｋＤａであることが見出された（図３６）。
【0211】
「３３ｋＤａ」原料は、ＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧ Ｗｏｒｋｓによってメタクリレート化され、ＨＡ－ＭＡが生成された。社内ＧＰＣによるＭＷ範囲は１１～１００ｋＤａであり、ピークＭＷは４４ｋＤａであることが見出された（図３７）。
【0212】
また、本開示で提供される固有粘度に基づく分子量の計算に基づいて、「３３ｋＤａ」ＨＡ ＭＡのＭＷは、約１２ｋＤａであることが見出された。したがって、「３３ｋＤａのＨＡ－ＭＡ」という用語は、商業的に得られた分子の分子量を指し、研究の一部として、本開示はまた、分子量の計算が約１２ｋＤａであることを開示し、したがって、本開示では範囲が提供されている。当業者は、上記の分子を商業的に調達して実験を実施することができる。
【0213】
Ｈ－ＮＭＲデータからの置換度の計算
図３８に、「３３ｋＤａ」ＨＡ－ＭＡの代表的なＨ－ＮＭＲデータを示す。置換度（ＤｏＳ）は、約５．６および６．１ｐｐｍのプロトンピーク（メタクリレートプロトン）と約１．９ｐｐｍのピーク（ＨＡのＮ－アセチルグルコサミン）の下の面積の比率を比較することによって決定された。（Ｓｅｉｄｌｉｔｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１，３９３０－３９４０（２０１０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１０．０１．１２５））、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｇｌｕｅ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１９，５７，５２２－５３０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｐｏｌａ．２９２９０）。
図３８に、「３３ｋＤａ」ＨＡ－ＭＡの代表的なＨ－ＮＭＲデータを示す。置換度（ＤｏＳ）は、約５．６および６．１ｐｐｍのプロトンピーク（メタクリレートプロトン）と約１．９ｐｐｍのピーク（ＨＡのＮ－アセチルグルコサミン）の下の面積の比率を比較することによって決定された。（Ｓｅｉｄｌｉｔｓ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１，３９３０－３９４０（２０１０）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１０．０１．１２５））、Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒａｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｇｌｕｅ ｗｉｔｈ ｔｕｎａｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ．Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ Ａ：Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２０１９，５７，５２２－５３０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｐｏｌａ．２９２９０）。
【0214】
したがって、ＤｏＳ＝［（（ピーク下面積５．８ｐｐｍ＋ピーク下面積６．２５ｐｐｍ）／２）＊３］／２．０７ｐｐｍのピーク下面積×１００＝［（４．０５７／２）＊３］／３．８０７×１００＝約１６０％。したがって、本開示における置換度（ＤｏＳ）の５０％としての言及は、ベンダーによって提供された情報によるものである。
【0215】
本開示の利点
本開示は、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤を提供する。特に、本開示は、（ａ）３０～６０ｋＤａの範囲の分子量を有し、３５～５５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、３３～５５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤を提供し、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチドが含まれるが、これに限定されず、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化コラーゲンペプチドが含まれるが、これに限定されない。修飾コラーゲンペプチドは、製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。好ましくは、修飾コラーゲンペプチドは、製剤に関して２０～１５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、２０～７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。本開示はまた、バイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスを提供する。上述のプロセスでは、光開始剤溶液をバイオエンジニアリング製剤に添加した後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の白色光強度に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の時間曝露し、架橋ヒドロゲルを得るのに役立つ。光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中の０．００１～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含む。本開示は、幹細胞および／またはエクソソームをさらに含み、幹細胞は、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、エクソソームは、角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択される。表１に示されるように、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。さらに、バイオエンジニアリング製剤は、インビトロ条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。表１の結果は、バイオエンジニアリング製剤の物理的特性が天然の角膜の特徴的な特性と一致することを示し、それによって、バイオエンジニアリング製剤が生体模倣特性を示すことを実証する。さらに、図１６に示すように、インビボ条件下でウサギの角膜創傷にバイオエンジニアリング製剤を適用すると、わずか２週間で透明度が徐々に向上し、血管新生がなく、上皮が完全に治癒し、表面が滑らかになったことを示した。これは、本開示のバイオエンジニアリング製剤が、角膜の瘢痕のない創傷治癒のための「バイオインストラクティブ」足場として機能することを示す。さらに、本開示は、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を提供する。さらに、角膜欠損を治療する方法も本明細書で提供される。また、バイオエンジニアリング製剤の使用、または角膜欠損を治療するための製剤も本明細書で提供される。
本開示は、（ａ）２０～８０ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～１００ｋＤａの範囲の分子量を有し、２０～７５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤を提供する。特に、本開示は、（ａ）３０～６０ｋＤａの範囲の分子量を有し、３５～５５％の範囲の置換度を有する修飾コラーゲンペプチドと、（ｂ）１０～４８ｋＤａの範囲の分子量を有し、３３～５５％の範囲の置換度を有する修飾ヒアルロン酸と、を含む、バイオエンジニアリング製剤を提供し、修飾コラーゲンペプチドは、チオール化コラーゲンペプチドが含まれるが、これに限定されず、修飾ヒアルロン酸は、メタクリル化コラーゲンペプチドが含まれるが、これに限定されない。修飾コラーゲンペプチドは、製剤に関して２０～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、バイオエンジニアリング製剤に関して２０～８０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。好ましくは、修飾コラーゲンペプチドは、製剤に関して２０～１５０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、修飾ヒアルロン酸は、２０～７５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲にある。本開示はまた、バイオエンジニアリング製剤を得るためのプロセスを提供する。上述のプロセスでは、光開始剤溶液をバイオエンジニアリング製剤に添加した後、５０～１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲の白色光強度に、１～１５分、好ましくは、２～８分間の範囲の時間曝露し、架橋ヒドロゲルを得るのに役立つ。光開始剤溶液は、リン酸緩衝生理食塩水中の０．００１～０．１ｍＭエオシンＹおよび０．０３８％ｗ／ｖトリエタノールアミンを含む。本開示は、幹細胞および／またはエクソソームをさらに含み、幹細胞は、ヒト骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、ウォートンゼリー間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞、および角膜輪部幹細胞由来の馴化培地でプライミングされた間葉系幹細胞からなる群から選択され、エクソソームは、角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択される。表１に示されるように、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、１００～１４００ｋＰａ、好ましくは１００～５００ｋＰａの範囲の圧縮弾性率を有する。さらに、バイオエンジニアリング製剤は、インビトロ条件下で２８日以内に最大５０％の分解に対して耐性がある。表１の結果は、バイオエンジニアリング製剤の物理的特性が天然の角膜の特徴的な特性と一致することを示し、それによって、バイオエンジニアリング製剤が生体模倣特性を示すことを実証する。さらに、図１６に示すように、インビボ条件下でウサギの角膜創傷にバイオエンジニアリング製剤を適用すると、わずか２週間で透明度が徐々に向上し、血管新生がなく、上皮が完全に治癒し、表面が滑らかになったことを示した。これは、本開示のバイオエンジニアリング製剤が、角膜の瘢痕のない創傷治癒のための「バイオインストラクティブ」足場として機能することを示す。さらに、本開示は、（ａ）角膜実質幹細胞由来のエクソソーム、プライミングされた間葉系幹細胞由来のエクソソーム、およびナイーブ間葉系幹細胞由来のエクソソームからなる群から選択されるエクソソームと、（ｂ）臨床的に承認された点眼製剤と、を含む製剤を提供する。さらに、角膜欠損を治療する方法も本明細書で提供される。また、バイオエンジニアリング製剤の使用、または角膜欠損を治療するための製剤も本明細書で提供される。
【0216】
全体として、バイオエンジニアリング製剤は、抗線維化、抗血管新生、抗炎症、および再神経支配促進を含む特性を包含する。さらに、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、生体模倣、生体適合性、および生分解性であるという望ましい特徴を有する架橋ヒドロゲルである。本開示はまた、バイオエンジニアリング製剤を調製するための便利で時間効率の良いプロセスを提供する。バイオエンジニアリング製剤はまた、瘢痕のない角膜治癒を促進し、それによって、本開示に記載されるようにバイオエンジニアリング製剤を使用して手順を実行した後、透明な角膜をもたらす。
【0217】
本開示のバイオエンジニアリング製剤は、上皮および角膜実質の損傷／感染（活性炎症）を伴う前角膜瘢痕、ステージ１神経栄養性角膜炎（ＮＫ）（持続性角膜上皮欠損）、ステージ２ＮＫ（滑らかで丸められたエッジを特徴とする大きな持続性上皮欠損）、ステージ３ＮＫ（深い角膜潰瘍、角膜実質融解、および無菌性前房蓄膿）、モーレン潰瘍、円錐角膜、角膜穿孔などの角膜潰瘍を含むが、これらに限定されない角膜欠損または角膜疾患を治療するのに役立つ。本開示のバイオエンジニアリング製剤はまた、角膜実質が対象において損傷を受けている、角膜輪部損傷および角膜ジストロフィ（ＣＤ）、例えば格子状ＣＤ１型、顆粒状ＣＤ１型、および先天性角膜実質ＣＤなどを治療するのに役立つ。さらに、本開示のバイオエンジニアリング製剤は、上皮および角膜実質の両方が損なわれる、シュナイダーＣＤおよび格子状ＣＤ２型の潜在的な治療として機能する。本開示のバイオエンジニアリング製剤の使用に続いて、効率的な再上皮化を増強するだけでなく、損傷によって誘発された線維症および損傷を取り巻く炎症の回復を促進する、幹細胞、もしくはエクソソーム、またはそれらの組み合わせの一定期間にわたる持続放出を可能にするエクソソーム点眼薬を使用する術後ケアがある（ヒドロゲル適用後）。カプセル化されたエクソソームおよび製剤を組み合わせることで、任意の炎症反応を抑制し、血管新生を伴わずに線維性瘢痕を徐々に治癒させることができる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28A-I】
【図28J-L】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【国際調査報告】