特表 2022-542944 肝損傷予防、改善、または治療用組成物、および肝損傷予防、改善、または治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】肝損傷予防、改善、または治療用組成物、および肝損傷予防、改善、または治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/741 20150101AFI20220930BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20220930BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20220930BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20220930BHJP

【ＦＩ】

A61K35/741 ZNA

A61P1/16

A61P43/00 105

A61P3/10

A61K47/26

A61K47/02

A61K47/18

A23L33/135

C12N1/20 E

C12N1/20 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506047

(86)(22)【出願日】2020-07-30

(85)【翻訳文提出日】2022-01-28

(86)【国際出願番号】 KR2020010097

(87)【国際公開番号】W WO2021020923

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】10-2019-0092689

(32)【優先日】2019-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0087105

(32)【優先日】2020-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0094922

(32)【優先日】2020-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0095361

(32)【優先日】2020-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520106231

【氏名又は名称】コバイオラブス，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コ，クァン ピョ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ヒュン ジュ

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジルジェ

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ボ－ラム

【テーマコード（参考）】

4B018

4B065

4C076

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD85

4B018ME14

4B065AA01X

4B065BB15

4B065BB16

4B065BB20

4B065BB23

4B065BB24

4B065BB26

4B065BB27

4B065BB29

4B065BD12

4B065CA41

4B065CA44

4C076CC16

4C076DD23Q

4C076DD26Q

4C076DD51Q

4C076DD67Q

4C076FF36

4C076GG06

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC55

4C087CA09

4C087NA14

4C087ZA75

4C087ZB21

(57)【要約】

本発明は肝損傷、例えば非アルコール性脂肪肝予防、改善、または治療用組成物に関するものであって、さらに詳しくは、ルミノコッカス属菌株を含む肝損傷予防または治療用組成物に関するものである。
【選択図】図１ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を含む、肝損傷の予防、改善、または治療用薬学的または食品組成物。

【請求項2】

前記肝損傷は下記（１）～（５）のうちの１種以上の特性を有することである、請求項１に記載の組成物：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加する、
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加する、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少する、
（４）線維性遺伝子発現量が増加する、および
（５）体重に対する肝重量比率が増加する。

【請求項3】

前記肝損傷は、脂肪肝、肝炎、肝線維化、および肝硬変からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記非アルコール性脂肪肝は、非肥満性非アルコール性脂肪肝である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記非アルコール性脂肪肝は、肥満性非アルコール性脂肪肝である、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

前記非アルコール性脂肪肝は、糖尿病性非アルコール性脂肪肝である、請求項４に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、下記（１）～（５）のうちの１種以上を特徴とするものである、請求項１に記載の組成物：
（１）血中ＡＬＴ濃度の減少、
（２）血中ＡＳＴ濃度の減少、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度の増加、
（４）線維性遺伝子発現量の減少、および
（５）体重に対する肝重量比率の減少。

【請求項9】

前記二次胆汁酸は、ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＣＡ）、ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＬＣＡ）、およびｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＵＤＣＡ）からなる群より選択された１種以上である、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記線維性遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、およびα－ＳＭＡからなる群より選択された１種以上である、請求項８に記載の組成物。

【請求項11】

前記組成物は、インスリン非依存的に肝損傷を改善または治療するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記組成物は、インスリン抵抗性を有する対象に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物は、インスリン抵抗性を有する対象に投与されて下記（１）～（３）のうちの１種以上を特徴とするものである、請求項１に記載の組成物：
（１）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、血中ＡＬＴ数値減少率、
（２）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、血中ＡＳＴ数値減少率、
（３）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、体重に対する肝重量比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）の減少率。

【請求項14】

前記組成物は、線維症マーカ遺伝子が過発現された対象に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項15】

前記線維症マーカ遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、およびα－ＳＭＡからなる群より選択された１種以上である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ルミノコッカス属菌株は、ルミノコッカスフェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記ルミノコッカス属菌株は、寄託番号ＫＣＴＣ５７５７を有するルミノコッカスフェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項18】

前記菌株は、炭素源の濃度５～３０％（ｗ／ｖ）、窒素源の濃度５０～９０％（ｗ／ｖ）、ミネラルの濃度５～１５％（ｗ／ｖ）、およびアミノ酸の濃度０．１～１０％（ｗ／ｖ）である培養培地で培養８時間以後に成長を持続するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項19】

前記組成物は、凍結乾燥保護剤を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記凍結乾燥保護剤は、ショ糖、リン酸カルシウム、アルギニン、塩化ナトリウム、果糖、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、およびトレハロースからなる群より選択された１種以上を含むものである、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

５～３０％（ｗ／ｖ）濃度の炭素源および５０～９０％（ｗ／ｖ）濃度の窒素源を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養用組成物であって、
前記炭素源は、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、およびガラクトースからなる群より選択された１種以上であり、
前記窒素源は、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、脱脂乳、トリプトン、カザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウ豆ペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、パパイック大豆ペプトン（ｐａｐａｉｃ ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、およびルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）からなる群より選択された１種以上である、培養用組成物。

【請求項22】

前記組成物は、ルミノコッカス属菌株の培養８時間以後の成長を促進するものである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記組成物は、ミネラル、アミノ酸、ビタミン、核酸、および無機塩類からなる群より選択された１種以上を追加的に含むものである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項24】

前記組成物は、ミネラルおよびアミノ酸を追加的に含み、
前記炭素源の濃度は５～３０％（ｗ／ｖ）、
前記窒素源の濃度は５０～９０％（ｗ／ｖ）、
前記ミネラルの濃度は５～１５％（ｗ／ｖ）、および
前記アミノ酸の濃度は０．１～１０％（ｗ／ｖ）である、請求項２１に記載の組成物。

【請求項25】

請求項２１～２４のいずれか一項に記載の培養用組成物に、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を接種して培養する段階を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養方法。

【請求項26】

前記培養方法は、前記菌株接種８時間以後の成長を促進することである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記培養は、静置培養、流加式培養、または回分式培養である、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与する段階を含む、肝損傷予防、改善、または治療方法。

【請求項29】

前記対象は、下記（１）～（５）のうちの１種以上の特性を有するものである、請求項２８に記載の方法：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加した状態、
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加した状態、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少した状態、
（４）線維性マーカ遺伝子が過発現された状態、
（５）体重に対する肝重量比率が増加した状態。

【請求項30】

前記対象は、インスリン抵抗性を有するものである、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記対象は、２型糖尿病を有するものである、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記肝損傷は、下記（１）～（５）のうちの１種以上の特性を有するものである、請求項２８に記載の方法：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加する、
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加する、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少する、
（４）線維性遺伝子発現量が増加する、および
（５）体重に対する肝重量比率が増加する。

【請求項33】

前記肝損傷は、脂肪肝、肝炎、肝線維化、および肝硬変からなる群より選択された１種以上である、請求項２８に記載の方法。

【請求項34】

前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝である、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記非アルコール性脂肪肝は、糖尿病性非アルコール性脂肪肝である、請求項３４に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝損傷予防、改善、または治療用組成物、および肝損傷予防、改善、または治療方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

非アルコール性脂肪肝疾患（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＦＬＤ）は、単純な脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）から、窮極的に進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）線維症および肝硬変につながる攻撃的な組織形態である非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）に至る代謝障害の肝疾患を特徴とする。ＮＡＦＬＤの世界有病率は大部分の疫学研究で２４－３０％と推定され、肥満および代謝症候群と平行に増加している。

【0003】

最近、増加された関心は、多様な代謝性疾患で腸内微生物叢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の特定役割を確認し理解するのに焦点を合わせている。正常微生物叢に比べる腸内微生物叢の非正常的な変化を称する腸内微生物不均衡（Ｇｕｔ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）は、良い短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ、ＳＣＦＡ）生産バクテリアの減少、胆汁酸組成の変化、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）に対する免疫反応の活性化、エタノール生産バクテリアの過増殖によるエタノール生産増加、およびホスファチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）のコリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）およびトリメチルアミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）への転換と関連されている。腸－肝軸（ｇｕｔ－ｌｉｖｅｒ ａｘｉｓ）に影響を与える腸内マイクロバイオーム（ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）の変化は、ＮＡＦＬＤおよび肝硬変のような慢性肝疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）および進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）線維症の進行に寄与すると知られている。しかし、ＮＡＦＬＤ疾病群で増加または減少した状態にある菌株を正常状態に減少または増加させてもＮＡＦＬＤの改善または治療効果が必ずしも示されるのではない。その理由は、疾病群で現れた腸内マイクロバイオームの変化が疾患によって現れる生理学的変化による結果であることもあるためである。

【0004】

したがって、ＮＡＦＬＤの組織学的（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ）重症度如何を決定し、腸内マイクロバイオーム変化をよく規定して効果的なＮＡＦＬＤの予防、治療、および診断方法が要望される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は前記のような問題を解決するためのものであって、肝損傷、例えば非アルコール性脂肪肝疾患の予防、改善または治療用組成物提供することをその目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一例は、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を含む、肝損傷の予防、改善、または治療用組成物に関するものである。

【0007】

本発明のまた他の一例は、炭素源および窒素源を含むルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養用組成物に関するものである。

【0008】

本発明のまた他の一例は、本発明による肝損傷の予防、改善、または治療用組成物をこれを必要とする対象に投与する段階を含む、肝損傷の予防、改善または治療方法に関するものである。

【0009】

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

【0010】

本発明の一例は、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を含む、肝損傷の予防、改善または治療用組成物に関するものである。前記組成物は、薬学的組成物または食品組成物であってもよい。前記組成物は、酪酸（ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を追加的に含むものであってもよい。

【0011】

前記肝損傷は、脂肪肝、肝炎、肝線維化、および肝硬変からなる群より選択された１種以上であり得る。前記肝損傷は非アルコール性肝損傷であり得る。具体的に、前記肝炎は非アルコール性脂肪肝炎であり、前記脂肪肝は非アルコール性脂肪肝であり得る。前記非アルコール性脂肪肝は非肥満性非アルコール性脂肪肝、肥満性非アルコール性脂肪肝、または糖尿性非アルコール性脂肪肝であり得るが、これに制限されるわけではない。前記糖尿性非アルコール性脂肪肝は２型糖尿病に起因したものであり得る。

【0012】

２型糖尿病患者中の４０％の確率で非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を有しており、非アルコール性脂肪肝を有している２型糖尿病患者の場合、２型糖尿病のない非アルコール性脂肪肝患者と比較して非アルコール性脂肪肝炎（８０．２％ｖｓ．６４．４％；ｐ＜０．００１）および肝線維化の（４０．３％ｖｓ．１７．０％；ｐ＜０．００１）有病率が高い。したがって、２型糖尿病のある非アルコール性脂肪肝患者のための治療剤の開発が必要であるのが実情である。２型糖尿病による肝損傷は２型糖尿病を有しない場合より予後が良くないため治療に困難があるが、本発明による組成物は２型糖尿病性肝損傷を治療することができる。

【0013】

前記組成物は、インスリン非依存的に肝損傷を予防、改善、または治療するものであり得る。本願実施形態でインスリン抵抗性を有する動物モデルを用いて本発明による組成物の肝損傷効果を確認してみた結果、肝損傷が顕著に改善され、よって、本発明による組成物はインスリン非依存的に肝損傷を改善および治療することを確認した。

【0014】

本発明による組成物は、肝損傷を有する対象に投与して、顕著に改善された肝損傷の治療効果を示す。前記肝損傷を有する対象は、下記（１）～（５）のうちの１種以上の特徴を有するものであり得る：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加した状態、例えば、正常対照群の血中ＡＬＴ濃度の１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上である状態。
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加した状態、例えば、正常対照群の血中ＡＳＴ濃度の１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、または１０倍以上である状態。
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少した状態、例えば、正常対照群の盲腸内二次胆汁酸濃度の１倍未満、０．９倍以下、０．８倍以下、０．７倍以下、０．６倍以下、０．５倍以下、０．４倍以下、０．３倍以下、０．２倍以下、または０．１倍以下である状態。
（４）線維症マーカ遺伝子発現量が増加した状態、例えば、正常対照群の線維症マーカ遺伝子発現量の１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、９．５倍以上、１０倍以上、１１倍以上、１２倍以上、１３倍以上、１４倍以上、１５倍以上、１６倍以上、１７倍以上、１８倍以上、１９倍以上、または２０倍以上過発現された状態。前記線維症マーカ遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、およびα－ＳＭＡからなる群より選択された１種以上のものであり得る。
（５）体重に対する肝重量比率が増加した状態、例えば、正常対照群の体重に対する肝重量比率の１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、２．６倍以上、２．７倍以上、２．８倍以上、２．９倍以上、または３倍以上である状態。

【0015】

前記正常対照群は、肝損傷を有しない対照群を意味する。

【0016】

また、前記対象の肝損傷は、脂肪肝、肝炎、肝線維化、および肝硬変からなる群より選択された１種以上のものであり得る。前記肝損傷は、非アルコール性肝損傷であり得る。具体的に、前記肝炎は非アルコール性脂肪肝炎であり、前記脂肪肝は非アルコール性脂肪肝であり得る。前記非アルコール性脂肪肝は非肥満性非アルコール性脂肪肝、肥満性非アルコール性脂肪肝、または糖尿性非アルコール性脂肪肝であり得るが、これに制限されるわけではない。

【0017】

本発明による組成物は糖尿病を有する対象に投与されるものであり、特に本発明による組成物はインスリン非依存的に肝損傷を予防、改善、または治療することができるので、２型糖尿病を有する対象に投与されるものであり得る。

【0018】

本願実施形態で２型糖尿病モデルを用いて本発明による組成物の肝損傷、例えば、非アルコール性脂肪肝治療効果を確認した結果、血中ＡＬＴ濃度減少能、血中ＡＳＴ濃度減少能、体重に対する肝の比率減少能などの治療効果が、２型糖尿病を有しないモデルから示された治療効果に比べて顕著に優れており、これは本発明による組成物が２型糖尿病対象で特に優れた治療効果を有することを意味する。

【0019】

特に、２型糖尿病を有する対象での治療効果がさらに優れており、インスリン抵抗性差がルミノコッカスによる肝損傷改善または治療と関連する感受性差に重要な役割を果たした。

【0020】

本発明による組成物は、肝損傷を有する対象に投与されて下記（１）～（５）のうちの１種以上の特徴を発生させるものであり得る：
（１）血中ＡＬＴ濃度の減少、例えば、前記組成物を投与した場合の血中ＡＬＴ濃度が、前記組成物を投与していない対照群の血中ＡＬＴ濃度１００％を基準にして１００％未満、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５９％以下、５８％以下、５０％以下、４５％以下、または４０％以下（一例として、図１ｂで、ＭＣＤとルミノコッカスフェシス菌株を併用投与する場合、ＭＣＤ単独投与した場合に比べて３９．２１％のＡＬＴ数値を示した。）
（２）血中ＡＳＴ濃度の減少、例えば、前記組成物を投与した場合の血中ＡＳＴ濃度が、前記組成物を投与していない対照群の血中ＡＳＴ濃度１００％を基準にして１００％未満、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６５％以下、６４％以下、６３％以下、６２％以下、６１％以下、６０％以下、または５９％以下（一例として、図１ｂで、ＭＣＤとルミノコッカスフェシス菌株を併用投与する場合、ＭＣＤ単独投与した場合に比べて５７．５２％のＡＳＴ数値を示した。）
（３）二次胆汁酸（例えば、盲腸（ｃｅｃａｌ）内二次胆汁酸）濃度の増加、例えば、前記組成物を投与した場合の二次胆汁酸濃度が、前記組成物を投与していない対照群の二次胆汁酸の濃度１００％を基準にして１００％超過、１０５％以上、１１０％以上、１１５％以上、１２０％以上、１２５％以上、１３０％以上、１３５％以上、１４０％以上、１４５％以上、１５０％以上、１６０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、または２００％以上（一例として、図１ｉで、ＭＣＤとルミノコッカスフェシス菌株を併用投与する場合、ＭＣＤ単独投与した場合に比べて２１７．５０％のＬＣＡ濃度、１４３．３７％のＤＣＡ濃度を示した。）
（４）線維性遺伝子発現量の減少、例えば、前記組成物を投与した場合の線維症関連遺伝子、例えば、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、α－ＳＭＡのうちの１種以上の発現量が、前記組成物を投与していない対照群の発現量１００％を基準にして１００％未満、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８０％以下、７８％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、または６０％以下（一例として、図１ｈで、ＭＣＤとルミノコッカスフェシス菌株を併用投与する場合、ＭＣＤ単独投与した場合に比べて９０．６０％のＣｏｌ１ａ１発現量、７７．１７％のα－ＳＭＡ発現量、５８．５０％のＴｉｍｐ１発現量を示した。）
（５）体重に対する肝重量比率の減少、例えば、前記組成物を投与した場合の体重に対する肝重量比率が、前記組成物を投与していない対照群の体重に対する肝重量比率の１００％未満、９９％以下、９８％以下、９７％以下、９６％以下、９５％以下、９４％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８９％以下、８８％以下、または８７％以下（一例として、図１ｇで、ＭＣＤとルミノコッカスフェシス菌株を併用投与する場合、ＭＣＤ単独投与した場合に比べて８６．２７％のｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏを示した。）

【0021】

前記組成物を投与していない対照群は、同一な疾病を有するが、本発明による組成物を投与していない非投与群を意味する。

【0022】

前記二次胆汁酸は、ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＣＡ）、ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＬＣＡ）、およびｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＵＤＣＡ）からなる群より選択された１種以上のものであり得る。

【0023】

前記線維性遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、およびα－ＳＭＡからなる群より選択された１種以上のものであり得る。

【0024】

本発明による組成物は、肝損傷を有しインスリン抵抗性を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）、例えば、２型糖尿病性肝損傷を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与されて下記（１）～（３）のうちの１種以上の特徴を発生させるものであり得る：
（１）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、２．２倍以上、２．３倍以上、２．４倍以上、２．５倍以上、または２．６倍以上のＡＬＴ数値減少率、
（２）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、２．１倍以上、または２．２倍以上のＡＳＴ数値減少率、
（３）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて１倍超過、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、または１０倍以上の体重に対する肝重量比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）の減少率。

【0025】

本発明で用語‘有効成分’とは、単独で目的とする活性を示すかまたはそれ自体は活性のない担体と共に活性を示すことができる成分を意味する。

【0026】

本発明で用語‘予防’は、疾病、障害または疾患の発病を抑制するか遅延を意味する。疾病、障害または疾患の発病が予定された期間の間抑制されるか遅延された場合、予防は完全なことと見なすことができる。

【0027】

本発明で用語‘治療’とは、特定疾病、障害および／または疾患または疾患による症状を部分的にまたは完全に軽減、改善、緩和、阻害または遅延させ、重症度を減少させるか、一つ以上の症状または特徴の発生を減少させることを意味する。

【0028】

本発明の薬学的組成物は、前記有効成分以外に追加的に同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上追加的に含むことができる。

【0029】

また、本発明による薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が明確に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することによって単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。本発明で用語‘担体’は、細胞または組織内への化合物の付加を容易にする化合物を意味し、用語‘薬学的に許容される’とは、生理学的に許容され人間に投与される時、通常胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似の反応を起こさない組成物をいう。

【0030】

前記薬学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。

【0031】

また、本発明による薬学的組成物は、前記成分以外に、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などの添加剤を追加的に含むことができる。本発明において、前記薬学的組成物に含まれる添加剤の含量は特に限定されるのではなく、通常の製剤化に使用される含量範囲内で適切に調節できる。

【0032】

また、本発明による薬学的組成物は、経口用製剤に剤形化できる。前記経口用製剤の非制限的な例としては、錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調製粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤などが挙げられる。本発明による薬学的組成物を経口投与用として製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどのような結合剤；ジカルシウムホスフェートなどのような賦形剤；とうもろこしデンプンまたはさつまいもデンプンなどのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムなどを使用することができ、甘味剤、芳香剤、シロップ剤なども使用することができる。さらに、カプセル剤の場合には前記で言及した物質以外にも脂肪油のような液体担体などを追加的に使用することができる。

【0033】

本発明で用語‘賦形剤’は、治療剤でない、ある物質を意味し、治療剤の伝達のための担体または媒体として用いられるかまたは薬学的組成物に追加されるものを意味する。これによって、取り扱いおよび貯蔵特性を改善するかまたは組成物の単位投与量形成を許容および促進させるようになる。

【0034】

本発明による薬学的組成物はそれぞれの使用目的に合うように通常の方法によって液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、エキス剤、エマルジョン、シロップ剤、エアゾールなどの経口剤形、滅菌注射用水の注射剤など多様な形態に剤形化して使用することができ、経口投与するか静脈内、腹腔内、皮下、直腸、局所投与などを含む多様な経路を通じて投与できる。本発明で用語‘経口投与’は、活性物質が消化されるように製造された物質、即ち、吸収のための胃腸器官に投与されることを意味する。

【0035】

本発明による薬学的組成物の好ましい投与量は患者の状態および体重、年齢、性別、健康状態、食餌体質特異性、製剤の性質、疾病の程度、組成物の投与時間、投与方法、投与期間または間隔、排泄率および薬物形態によってその範囲が多様であり、この分野通常の技術者によって適切に選択できる。

【0036】

本発明で用語‘薬学的組成物の有効投与量’は、特定の症状を治療するために十分な活性成分の組成物の量を意味する。これは薬学的組成物の製剤化方法、投与方式、投与時間および／または投与経路などによって多様になり、薬学的組成物の投与で達成しようとする反応の種類と程度、投与対象になる個体の種類、年齢、体重、一般的な健康状態、病気の症状や程度、性別、食餌、排泄、該当個体に同時または一時に共に使用される薬物その他の組成物の成分などをはじめとする様々な因子および医薬分野でよく知られた類似因子によって多様になり得るが、当該技術分野で通常の知識を有する者は目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定して処方することができる。

【0037】

本発明による薬学的組成物の投与は一日に１回投与でき、数回に分けて投与されてもよい。前記組成物は個別治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次的または同時に投与できる。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大効果を得ることができる量で投与することができる。

【0038】

例えば、本発明による組成物は、体重１ｋｇ当り０．００１～１０，０００ｍｇ、０．００１～５，０００ｍｇ、０．００１～１，０００ｍｇ、０．００１～５００ｍｇ、０．００１～３００ｍｇ、０．００１～１００ｍｇ、０．００１～５０ｍｇ、０．００１～３０ｍｇ、０．００１～１０ｍｇ、０．００１～５ｍｇ、０．００１～１ｍｇ、０．００１～０．５ｍｇ、０．００１～０．１ｍｇ、０．００１～０．０５ｍｇ、０．００１～０．０１ｍｇ、０．０１～１０，０００ｍｇ、０．０１～５，０００ｍｇ、０．０１～１，０００ｍｇ、０．０１～５００ｍｇ、０．０１～３００ｍｇ、０．０１～１００ｍｇ、０．０１～５０ｍｇ、０．０１～３０ｍｇ、０．０１～１０ｍｇ、０．０１～５ｍｇ、０．０１～１ｍｇ、０．０１～０．５ｍｇ、０．０１～０．１ｍｇ、０．０１～０．０５ｍｇ、０．１～１０，０００ｍｇ、０．１～５，０００ｍｇ、０．１～１，０００ｍｇ、０．１～５００ｍｇ、０．１～３００ｍｇ、０．１～２００ｍｇ、０．１～１００ｍｇ、０．１～５０ｍｇ、０．１～３０ｍｇ、０．１～１０ｍｇ、０．１～５ｍｇ、０．１～１ｍｇ、０．１～０．５ｍｇ、１～１０，０００ｍｇ、１～５，０００ｍｇ、１～１，０００ｍｇ、１～５００ｍｇ、１～３００ｍｇ、１～２００ｍｇ、１～１００ｍｇ、１～５０ｍｇ、１～１０ｍｇ、１～５ｍｇ、１０～１０，０００ｍｇ、１０～５，０００ｍｇ、１０～１，０００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１０～３００ｍｇ、１０～２００ｍｇ、１０～１００ｍｇ、１０～５０ｍｇ、１０～４０ｍｇ、１０～３０ｍｇ、１０～２０ｍｇ、１００～１０，０００ｍｇ、１００～５，０００ｍｇ、１００～１，０００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、１００～３００ｍｇ、または１００～２００ｍｇの一日投与量で投与できるが、これに制限されるわけではない。一例として、本発明による組成物の一日投与量は、成人患者の経口投与基準にして０．００１～１０ｇ／１日、０．００１～５ｇ／１日、０．０１～１０ｇ／１日、または０．０１～５ｇ／１日であり得る。また、一日総投与量を分割して必要によって連続的または非連続的に投与することができる。

【0039】

本発明による組成物は、凍結乾燥保護剤を追加的に含むものであり得る。前記凍結乾燥保護剤は、単糖類、二糖類、多糖類、炭水化物、無機塩類、アミノ酸、ショ糖、リン酸カルシウム、アルギニン、塩化ナトリウム、果糖、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、およびトレハロースからなる群より選択された１種以上を含むものであり得る。

【0040】

前記ショ糖は１００～３００ｇ／Ｌ、１００～２５０ｇ／Ｌ、１００～２００ｇ／Ｌ、１５０～３００ｇ／Ｌ、１５０～２５０ｇ／Ｌ、１５０～２００ｇ／Ｌ、２００～３００ｇ／Ｌ、または２００～２５０ｇ／Ｌで凍結乾燥保護剤に添加でき、一例として２００ｇ／Ｌで添加できる。

【0041】

前記リン酸カルシウムは５～２０ｇ／Ｌ、５～１５ｇ／Ｌ、５～１２ｇ／Ｌ、５～１１ｇ／Ｌ、７～２０ｇ／Ｌ、７～１５ｇ／Ｌ、７～１２ｇ／Ｌ、７～１１ｇ／Ｌ、１０～２０ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ、１０～１２ｇ／Ｌ、または１０～１１ｇ／Ｌの濃度で凍結乾燥保護剤に添加でき、一例として１０．５ｇ／Ｌで添加できる。

【0042】

前記アミノ酸は１～１０ｇ／Ｌ、１～８ｇ／Ｌ、１～６ｇ／Ｌ、１～５ｇ／Ｌ、３～１０ｇ／Ｌ、３～８ｇ／Ｌ、３～６ｇ／Ｌ、３～５ｇ／Ｌ、４～１０ｇ／Ｌ、４～８ｇ／Ｌ、４～６ｇ／Ｌ、または４～５ｇ／Ｌの濃度で凍結乾燥保護剤に添加でき、一例として４ｇ／Ｌで添加できる。

【0043】

前記塩化ナトリウムは０．１～５ｇ／Ｌ、０．１～３ｇ／Ｌ、０．１～１ｇ／Ｌ、０．５～５ｇ／Ｌ、０．５～３ｇ／Ｌ、または０．５～１ｇ／Ｌの濃度で凍結乾燥保護剤に添加でき、一例として０．８ｇ／Ｌで添加できる。

【0044】

本発明によるルミノコッカス属菌株は、ルミノコッカスフェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）であり得る。一例として、前記ルミノコッカス属菌株は、寄託番号ＫＣＴＣ ｎｏ．５７５７を有するルミノコッカスフェシスであり得る。本明細書で前記寄託番号ＫＣＴＣ ｎｏ．５７５７を有するルミノコッカスフェシスは、ルミノコッカスフェシスＫＢＬ１０２８と表記できる。

【0045】

前記菌株は、炭素源の濃度５～３０％（ｗ／ｖ）、窒素源の濃度５０～９０％（ｗ／ｖ）、ミネラルの濃度５～１５％（ｗ／ｖ）、およびアミノ酸の濃度０．１～１０％（ｗ／ｖ）である培養培地で培養８時間、培養９時間、培養１０時間、培養１１時間、培養１２時間、培養１３時間、または培養１４時間以後に成長を持続するものであり得る。

【0046】

前記菌株は、表３による組成を有するＦＭＫ１０２８培地で培養効率に優れたものであり得る。例えば、前記菌株は、表３による組成を有するＦＭＫ１０２８培地で培養後吸光度が、ＹＢＨＩ培地、ＧＡＭ培地、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、およびＲＣＭ培地からなる群より選択された１種以上で培養後吸光度より高いことを特徴とすることができる。一例として、前記菌株は、表３による組成を有するＦＭＫ１０２８培地で１４時間培養後単位体積当り生菌数が、ＹＢＨＩ培地で培養した場合の１０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、または６００倍以上であり得る。

【0047】

本発明のまた他の一例は、炭素源および窒素源を含むルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養用組成物に関するものである。前記炭素源は、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、およびガラクトースからなる群より選択された１種以上のものであり得る。前記窒素源は、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、脱脂乳、トリプトン、カザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウ豆ペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、パパイック大豆ペプトン（ｐａｐａｉｃ ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、およびルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）からなる群より選択された１種以上のものであり得る。

【0048】

本発明のまた他の一例は、炭素源および窒素源を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養用組成物に関するものである。前記炭素源は５～３０％（ｗ／ｖ）の濃度であり、前記窒素源は５０～９０％（ｗ／ｖ）の濃度であり得る。前記ルミノコッカス属菌株は前述の通りである。

【0049】

前記炭素源は、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、およびガラクトースからなる群より選択された１種以上を含むものであり得る。

【0050】

前記窒素源は、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、脱脂乳、トリプトン、カザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウ豆ペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、パパイック大豆ペプトン（ｐａｐａｉｃ ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、およびルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）からなる群より選択された１種以上を含むものであり得る。

【0051】

前記ルミノコッカス属菌株の培養用組成物はルミノコッカス属菌株の培養８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、または１４時間以後の成長を促進するものであり得る。

【0052】

前記ルミノコッカス属菌株の培養用組成物は、ミネラル、アミノ酸、ビタミン、核酸、および無機塩類からなる群より選択された１種以上を追加的に含むものであり得る。

【0053】

前記ミネラルは、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、および硫酸マンガンからなる群より選択された１種以上を含むものであり得る。

【0054】

前記アミノ酸は、Ｌ－システイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｌ－イソロイシン（Ｌ－ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、Ｌ－バリン（Ｌ－Ｖａｌｉｎｅ）、Ｌ－トリプトファン（ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、Ｌ－トレオニン（Ｌ－ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、およびＬ－メチオニン（Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を含むものであり得る。

【0055】

前記炭素源の濃度は５～３０％（ｗ／ｖ）、前記窒素源の濃度は５０～９０％（ｗ／ｖ）、前記ミネラルの濃度は５～１５％（ｗ／ｖ）、および前記アミノ酸の濃度は０．１～１０％（ｗ／ｖ）であり得る。

【0056】

本発明のまた他の一例は、本発明によるルミノコッカス属菌株の培養用組成物に、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を接種して培養する段階を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養方法に関するものである。

【0057】

前記培養方法は、前記菌株接種８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、または１４時間以後の成長を促進することであり得る。

【0058】

前記培養は静置培養、流加式培養、または回分式培養であり得るが、これに制限されるわけではない。

【0059】

本発明のまた他の一例は、本発明による肝損傷予防、改善または治療用組成物をこれを必要とする対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む、肝損傷予防、改善または治療方法に関するものである。前記組成物は、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を含むものであり得る。前記肝損傷予防、改善または治療用組成物、前記ルミノコッカス属菌株などは前述の通りである。前記対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は肝損傷を有する対象であり、前記肝損傷を有する対象は前述の通りである。例えば、前記肝損傷を有する対象はインスリン抵抗性を有する対象であってもよく、一例として糖尿病を有する対象、具体的に２型糖尿病を有する対象であってもよい。

【発明の効果】

【0060】

本発明の予防または治療用薬学的組成物は、肝損傷、例えば非アルコール性脂肪肝疾患の治療に効果的に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1a】ＭＣＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与による肝損傷治療効果を調べてみるための実験過程を示した図である。

【図1b】ＭＣＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によるＡＬＴおよびＡＳＴ測定結果を示した図である。

【図1c】図１ｃ～１ｅは、ＭＣＤ食餌によって誘導された肝損傷の組織学的深刻性がルミノコッカスフェシスを食べさせたマウスで有意に改善されたことを示した図である。図１ｃ：ルミノコッカスフェシス投与による肝組織が緩和されたことをＨ＆Ｅ（上）、Ｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ（下）染色法を通じて示した図である。

【図1d】図１ｃ～１ｅは、ＭＣＤ食餌によって誘導された肝損傷の組織学的深刻性がルミノコッカスフェシスを食べさせたマウスで有意に改善されたことを示した図である。図１ｄ：ルミノコッカスフェシス投与で病理学的に緩和されたものをＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅを用いて定量した図である。

【図1e】図１ｃ～１ｅは、ＭＣＤ食餌によって誘導された肝損傷の組織学的深刻性がルミノコッカスフェシスを食べさせたマウスで有意に改善されたことを示した図である。図１ｅ：ルミノコッカスフェシス投与によって緩和された肝中のコラーゲン分布を示した図である。

【図1f】ＭＣＤ食餌による体重変化を示した図である。

【図1g】ルミノコッカスフェシス投与時（ＭＣＤ＋Ｒ．ｆａｅｃｉｓ）対照群投与マウス（ＭＣＤ）と比較して体重内肝比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）を示した図である。

【図1h】ルミノコッカスフェシス投与によって線維症発生および増殖のマーカが緩和されたことを示した図である。

【図1i】ＭＣＤ食餌によって減少した二次胆汁酸（ＤＣＡおよびＬＣＡ）の局所レベルがルミノコッカスフェシス処理によって増加したことを示した図である。

【図2a】ＣＤＡＨＦＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与による肝損傷治療効果を調べてみるための実験過程を示した図である。

【図2b】ＣＤＡＨＦＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によってＡＬＴレベルが減少したことを示した図である。

【図2c】ＣＤＡＨＦＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によってＡＳＴレベルが減少したことを示した図である。

【図2d】ＣＤＡＨＦＤ食餌によって誘導された肝損傷動物モデルでルミノコッカスフェシス投与による体重に対する肝重量の比率を示した図である。

【図3a】遺伝的レプチン－欠乏動物モデルでルミノコッカスフェシス投与による肝損傷治療効果を調べてみるための実験過程を示した図である。

【図3b】遺伝的レプチン－欠乏動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によってＡＬＴレベルが減少したことを示した図である。

【図3c】遺伝的レプチン－欠乏動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によってＡＳＴレベルが減少したことを示した図である。

【図3d】遺伝的レプチン－欠乏動物モデルでルミノコッカスフェシス投与によって体重に対する肝重量の比率が減少したことを示した図である。

【図3e】遺伝的レプチン－欠乏動物モデルでｉｐＧＴＴによって測定された血清空腹インスリン数値およびインスリン抵抗性を示した図である。

【図4a】肝線維化疾患群でルミノコッカスブロミが有意に減少した状態であることを示した図である。

【図4b】ルミノコッカスブロミ投与による体重内肝比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）数値を示した図である。

【図4c】ルミノコッカスブロミ投与によるＡＬＴ数値を示した図である。

【図5a】ＹＢＨＩ培地、ＲＣＭ培地、ＢＬ培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、またはＦＭＫ１０２８培地でルミノコッカスフェシスの培養性と細胞の形態を比較した結果を示した図である。

【図5b】ルミノコッカスフェシスの成長曲線と単位体積当り生菌数を示した図である。

【図5c】醗酵機で培養されたルミノコッカスフェシスの成長曲線と生菌数を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0062】

以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。

【実施例】

【0063】

実施例１：実験動物を用いた肝損傷治療試験
（１）実験動物の準備
ルミノコッカスフェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ、ＫＣＴＣ ｎｏ．５７５７［ＪＣＭ ｎｏ．１５９１７］）を韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ、Ｊｅｏｌｌａｂｕｋ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）から分譲を受けてＹＢＨＩ培地で嫌気性（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）条件下で培養し、２４時間後に採取し、ＰＢＳ（＋０．５％システイン）を使用して２回洗浄した後、経口で給食した。実験動物として６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を大学ガイドラインによってソウル大学校の一般動物施設で飼育し、全ての動物実験はソウル大学校実験動物運営委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けた。

【0064】

ＭＣＤ食餌によって誘導されたＮＡＦＬＤ動物モデル実験を行うために、マウスを標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）に適応させてから１週間後、ルミノコッカスフェシスの腸内定着のためにストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を１ｇ／Ｌ濃度で飲料水に処理して１週間給水した。以後５週間、マウスにメチオニンおよびコリン欠乏Ｌ－アミノ酸食餌（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｌ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｅｔ、ＭＣＤ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｄｉｅｔ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ；Ｃａｔ．ｎｏ．：Ａ０２０８２００２Ｂ）を供給すると同時に、２００μＬのＰＢＳに１０^９ＣＦＵが入るように懸濁したルミノコッカスフェシスまたは対照群ＰＢＳ（ｓｈａｍ）のうちの一つを２００μＬずつ毎日経口投与した（図１ａ）。５週間の投与以後、マウスを安楽死させて生化学的分析、解剖学的分析、肝線維症発生および増殖のマーカ発現確認、および胆汁酸分析を行った。

【0065】

（２）生花化学的分析
血清アラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ酸転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＡＳＴ）数値はＦｕｊｉ ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ３５００ｉ生化学分析機（ＦｕｊｉＦｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で測定した。ＡＬＴおよびＡＳＴ測定結果を図１ｂに示した。

【0066】

（３）解剖学的分析
安楽死後、肝試料を切除し１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に固定させた。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびシリウスレッド染色（Ｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ）は、ログワンバイオ融合研究財団（ＬＯＧＯＮＥ Ｂｉｏ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で行われた。染色された全体スライドイメージはＰａｎｎｏｒａｍｉｃ Ｖｉｅｗｅｒ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して分析された。コラーゲン比例面積（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ ａｒｅａ）を計算するために、グループ当り８個のイメージを無作為に選択しＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して分析した。

【0067】

また、体重に対する肝の比率は、５週間のルミノコッカスフェシスを投与したマウスの体重と肝の重量を測定した後、体重に対する肝の重量比率を計算した。マウスの体重測定結果を図１ｆに示し、体重に対する肝の重量比率を図１ｇに示した。

【0068】

（４）肝線維症発生および増殖のマーカ発現確認
肝サンプルの総ＲＮＡをｅａｓｙ－ｓｐｉｎ^ＴＭ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を用いて抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量的ＰＣＲは、ＳＹＢＲ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ^ＴＭ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ^ＴＭ ６ Ｆｌｅｘ ｑＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。使用したプライマー配列は以下の通りであった。

【0069】

【表1】

【0070】

（５）胆汁酸分析
マウスの盲腸を抽出した後、１０倍の体積比に該当する８０％メタノールを入れて混合した。胆汁酸抽出のために超音波紛砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で３分間試料を破砕した後、４℃条件で２４時間保管した。その後、遠心分離を通じて獲得した上清液に１００％メタノール１ｍＬを追加しｂｅａｄ ｂｅａｔｉｎｇ機械を用いて１５ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ、３０分条件で２回目抽出を行った。胆汁酸が溶解されたメタノールは３０℃、２４時間条件で真空乾燥を通じて液体状物質を全て蒸発させ、残り固形物質を５５％メタノールを用いて溶かした。抽出された胆汁酸を専用チューブに移して入れた後、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）Ｑ－ＴｏＦ質量分析機（Ｗａｔｅｒｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

【0071】

（６）実験結果
ルミノコッカスフェシス投与時（ＭＣＤ＋Ｒ．ｆａｅｃｉｓ）、対照群投与マウス（ＭＣＤ）と比較してＡＬＴおよびＡＳＴ数値が減少した（図１ｂ）。

【0072】

解剖学的および組織学的分析結果で、ＭＣＤ食餌によって誘導されたＮＡＦＬＤの組織学的深刻性がルミノコッカスフェシスを食べさせたマウスで有意に改善された（図１ｃ～図１ｅ）。ＭＣＤ食餌は既存の文献に知られた通り急激な体重低下を起こし、ルミノコッカスフェシス投与は体重に影響を与えなかった（図１ｆ）。しかし、ルミノコッカスフェシス投与時（ＭＣＤ＋Ｒ．ｆａｅｃｉｓ）、対照群投与マウス（ＭＣＤ）と比較して体重内肝比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）が減少した（図１ｇ）。

【0073】

肝線維症発生および増殖のマーカ発現確認結果、肝線維症発生および増殖のマーカがルミノコッカスフェシス給食マウスで顕著に緩和された（Ｔｉｍｐ１、ｐ＝０．００１８；α－ＳＭＡ、ｐ＝０．０３３０）（図１ｈ）。

【0074】

生化学的および組織学的肝損傷マーカの変化と並行して、二次胆汁酸（ＤＣＡおよびＬＣＡ）の局所レベルもＭＣＤ食餌によって減少し、ルミノコッカスフェシス処理によって増加された（図１ｉ）。

【0075】

このような結果は、ルミノコッカスフェシスＭＣＤダイエットマウスモデルで肝線維症に対する保護効果があるのを示す。

【0076】

実施例２：動物モデルを用いた肝損傷治療試験
非アルコール性脂肪肝による肝損傷に対するルミノコッカスフェシスの緩和効果を確認するために、体重減少を防止しインスリン抵抗性を示さないｃｈｏｌｉｎｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ、Ｌ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ－ｄｅｆｉｎｅｄ、ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ（ＣＤＡＨＦＤ）食餌マウスモデルを使用した。

【0077】

コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）は肝細胞中のトリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）をＶＬＤＬの形態に蓄積し排出させる役割を果たすが、ＣＤＡＨＦＤ食餌にはコリンが欠如していて高脂肪食餌によるトリグリセリドが肝細胞内に累積されて脂肪肝が誘導され、ＭＣＤモデルとは異なり、体重低下が発生せず肝線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）がさらにひどく誘導される食餌モデルである。しかし、ＣＤＡＨＦＤモデルはインスリン抵抗性が誘導されないと知られている。

【0078】

具体的に、図２ａに示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）に適応してから１週間後、ルミノコッカスフェシスの腸内定着のために１週間ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１ｇ／Ｌ）を飲用水に溶かして食べさせた。その後８週間、コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）が欠如し脂肪６０％の高脂肪が含まれているＣＤＡＨＦＤ（ｃｈｏｌｉｎｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ、Ｌ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ－ｄｅｆｉｎｅｄ、ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ）飼料を食べさせ、２００μＬのＰＢＳに１０^９ＣＦＵが添加されるように懸濁したルミノコッカスフェシスまたは対照群ＰＢＳ（ｓｈａｍ）のうちの一つを２００μＬずつ毎日経口投与した。８週間の投与以後、マウスを安楽死させて血清生化学的分析および解剖学的分析を行った。生化学的分析としてＡＬＴおよびＡＳＴ分析は前記実施例１と同様な方法で行い、体重に対する肝比率を前記実施例１と同様な方法で測定した。

【0079】

図２ｂ～図２ｄに示されているように、ルミノコッカスフェシス投与によってＡＬＴおよびＡＳＴレベルが減少し（図２ｂおよび図２ｃ）、但し、体重に対する肝比率はルミノコッカスフェシス投与によって有意な差を示さなかった（図２ｄ）。これは、ルミノコッカスフェシスがＣＤＡＨＦＤ飼料で誘導された非アルコール性脂肪肝損傷に対して治療効果を有することを意味し、但し、体重に対する肝比率が有意な差を示さないことは肝中に蓄積された脂肪が有意に減らなかったのを意味する。

【0080】

実施例３：遺伝的レプチン－欠乏モデルを用いた肝損傷治療試験
インスリン抵抗性を有する場合にもルミノコッカスフェシスによる非アルコール性脂肪肝治療効果が発生するかどうかを確認するために、インスリン抵抗性を有する自発的な糖尿病および脂肪肝を発生させる遺伝的レプチン欠乏（ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｅｐｔｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）（ｄｂ／ｄｂ）モデルを使用してルミノコッカスフェシスの非アルコール性脂肪肝治療効果を確認してみた。ｄｂ／ｄｂモデルの対照群としてｄｂ／ｍを使用し、ｄｂ ａｌｌｅｌｅのｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅに該当する。

【0081】

ｄｂ／ｄｂモデルはレプチン受容体（ｌｅｐｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に突然変異を有するモデルであって、肥満、インスリン抵抗性が誘導されて高血糖が示され、２型糖尿モデルとして多く使用される。ｄｂ／ｄｂモデルの場合には肝内脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）が速く誘導されると知られているが、脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は簡単に誘導されないと知られている。

【0082】

具体的に、図３ａに示されているように、ｄｂ／ｄｂモデルマウスを標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）に適応させてから１週間後、ルミノコッカスフェシスの腸内定着のために１週間ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１ｇ／Ｌ）を飲用水に溶かして処理した。その後５週間、普通食餌を給与すると同時に、２００μＬのＰＢＳに１０^９ＣＦＵが入るように懸濁したルミノコッカスフェシスまたは対照群ＰＢＳ（ｓｈａｍ）のうちの一つを２００μＬずつ毎日経口投与した。５週間の投与以後、マウスを安楽死させて生化学的分析および解剖学的分析を行った。生化学的分析としてＡＬＴおよびＡＳＴ分析は前記実施例１と実質的に同様な方法で行い、体重に対する肝比率を前記実施例１と実質的に同様な方法で測定した。

【0083】

ｄｂ／ｄｂマウスでｉｐＧＴＴによって測定された血清空腹インスリン数値は、Ｕｌｔｒａ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ、Ｅｌｋ Ｇｒｏｖｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して測定した。インスリン抵抗性を確認するための腹腔糖負荷検査はルミノコッカスフェシス投与３週目の時に行われ、１６時間の水以外の食餌制限後、グリコース溶液を体重１ｋｇ当り１ｇグリコースが投与されるように腹腔に投与した。その後、定められた時間にＡｃｃｕ－Ｃｈｅｋ（登録商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａ血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｉｓｃｈ－Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて血糖を測定した。

【0084】

図３ｂ～図３ｄに示されているように、ルミノコッカスフェシス投与によってＡＬＴおよびＡＳＴレベルが減少し（図３ｂおよび図３ｃ）、特に体重に対する肝比率も有意に減少した（図３ｄ）。それにもかかわらず、図３ｅに示されているように、ｄｂ／ｄｂマウスでｉｐＧＴＴによって測定された血清空腹インスリン数値およびインスリン抵抗性はルミノコッカスフェシス処理によって影響を受けなかった。

【0085】

ルミノコッカスフェシスはインスリン抵抗性を有するｄｂ／ｄｂモデルでも非アルコール性脂肪肝治療効果を示し、このような結果はルミノコッカスフェシスがインスリン非依存的方式にＮＡＦＬＤ治療効果を有することを意味し、２型糖尿病患者の非アルコール性脂肪肝治療にも効果的に使用できるのを意味する。

【0086】

特に、インスリン抵抗性差による治療反応感受性を確認するために、ｄｂ／ｄｂモデルとそれに対する比較モデルとしてＣＤＡＨＦＤモデルを選択した。その理由は、ＣＤＡＨＦＤモデルの場合、インスリン抵抗性なく非アルコール性脂肪肝疾患が誘導されるので、インスリン抵抗性が誘導されるｄｂ／ｄｂモデルと比較してインスリン抵抗性による治療効果を比較する時に適するためである。ＭＣＤモデルの場合、急激な体重低下をはじめとする身体機能の低下を引き起こすため、インスリン抵抗性差による治療反応の感受性を確認するための対照群として活用するには適しなかった。

【0087】

図３ｂに示されているように、ルミノコッカスフェシス投与によってＡＬＴ数値が約４２．９８％減少し、図３ｃに示されているようにＡＳＴ数値が約４１．００％減少し、図３ｄに示されているように体重に対する肝重量比率が約９．４３％減少した。これは、図２ｂのＣＤＡＨＦＤモデルでＡＬＴ数値が約１６．４０％減少したことに比べて約２．６倍以上のＡＬＴ数値減少率を示し、図２ｃのＣＤＡＨＦＤモデルでＡＳＴ数値が約１８．１８％減少したことに比べて約２．２倍以上のＡＳＴ数値減少率を示し、図２ｄのＣＤＡＨＦＤモデルで体重に対する肝重量比率が有意に減少しなかったがインスリン抵抗性を有する動物モデルでは体重に対する肝重量比率が有意に減少した点を考慮してみた時、ルミノコッカスフェシスはインスリン抵抗性の差、または２型糖尿病発病有無の差による肝損傷改善または治療と関連する感受性差を有し、２型糖尿病対象で顕著に優れた治療効果を示すのを意味する。

【0088】

実施例４：ルミノコッカスブロミ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒｏｍｉｉ）の線維症治療効果
（１）非アルコール性脂肪肝疾患群で有意に減少したルミノコッカスブロミ
生体検査を通じてＮＡＦＬＤを有していると立証された１７１人の対象者と３１人のＮＡＦＬＤを有しない対象者が含まれ、組織学的に（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）ＮＡＦＬＤを分類した。大便サンプルのＤＮＡはＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域をターゲットにしたシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）はＭｉＳｅｑ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行い、シークエンシングデータの追加的な分析はＱＩＩＭＥ^ＴＭパイプライン（ｖ１．８．０；ｈｔｔｐ：／／ｑｉｉｍｅ．ｏｒｇ／）を用いて行った。図４ａに示されているように、ルミノコッカスブロミは肝線維化疾患群で有意に減少したことが確認された。

【0089】

（２）ルミノコッカスブロミの非アルコール性脂肪肝治療効果検証
その次に、非アルコール性脂肪肝疾患群で有意に減少したことが確認されたルミノコッカスブロミが非アルコール性脂肪肝治療効果を有するかどうかを確認してみた。

【0090】

具体的に、ルミノコッカスブロミ（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒｏｍｉｉ、ＡＴＣＣ ｎｏ．２７２５５）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から分譲を受けてｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＹＧ培地で嫌気性（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）条件下で培養し、２４時間後に採取し、ＰＢＳ（＋０．５％システイン）を使用して２回洗浄した後、経口で給食した。

【0091】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを標準食餌（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｏｗ ｄｉｅｔ）で１週間環境適応後、ルミノコッカスブロミの腸内定着のために１週間ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（１ｇ／Ｌ）を飲用水に溶かして食べさせた。その後５週間、マウスにメチオニンおよびコリン欠乏Ｌ－アミノ酸食餌（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｌ－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｅｔ、ＭＣＤ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈｄｉｅｔ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ；Ｃａｔ．ｎｏ．：Ａ０２０８２００２Ｂ）を食べさせ、２００μＬのＰＢＳに１０^９ＣＦＵが入るように懸濁したルミノコッカスブロミまたは対照群ＰＢＳ（ｓｈａｍ）のうちの一つを２００μＬずつ毎日経口投与した。５週間の投与以後、マウスを安楽死させて生化学的分析を行った。生化学的分析としてＡＬＴおよびＡＳＴ分析は前記実施例１と実質的に同様な方法で行い、体重に対する肝比率を前記実施例１と実質的に同様な方法で測定した。

【0092】

しかし、図４ｂ～図４ｃに示されているように、ルミノコッカスブロミ投与時（ＭＣＤ＋Ｒ．ｂｒｏｍｉｉ）、対照群投与マウス（ＭＣＤ）と比較して体重内肝比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）とＡＬＴ数値が全て有意な変化が示されなかった。

【0093】

ルミノコッカスブロミは非アルコール性脂肪肝治療効果を示さなかったが、これは非アルコール性脂肪肝疾患群で減少したことが確認された全ての菌株が非アルコール性脂肪肝治療効果を有するのではないことが分かり、特にルミノコッカスフェシスと同一な属（ｇｅｎｕｓ）に属する菌株であっても全て非アルコール性脂肪肝治療効果を有するのではなく、したがって非アルコール性治療効果はルミノコッカスフェシスの固有の効果であることが分かった。また、ルミノコッカスブロミは非アルコール性脂肪肝疾患群で有意に減少したが、これを投与しても非アルコール性脂肪肝治療効果を示さなくて、非アルコール性脂肪肝で減少した菌株の投与が治療に連結されると予測するのは難しかった。

【0094】

実施例５：ルミノコッカスフェシスの培養および生産
（１）最適培地探索
ルミノコッカスフェシス（寄託番号ＫＣＴＣ ｎｏ．５７５７）の最適培地探索のために市販中のＢａｃｔｏ^ＴＭ ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ） Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を含むＹＢＨＩ培地と、市販中のＤｉｆｃｏ^ＴＭ Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＣＭ培地）（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）、ＭＢ ｃｅｌｌ ＢＬ ｂｒｏｔｈ（ＢＬ培地）（Ｋｉｓａｎ Ｂｉｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）、Ｄｉｆｃｏ^ＴＭ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ（ＭＲＳ培地）（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）、ＭＢ ｃｅｌｌ Ｇｉｆｕ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｄｉｕｍ（ＧＡＭ培地）（Ｋｉｓａｎ Ｂｉｏ、Ｓｅｏｕｌ、Ｒｅｐｕｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）と本発明で製造したＦＭＫ１０２８培地で培養性を確認した。最適培地選別のための培養性は、培養後吸光度増加とｐＨ減少、そして顕微鏡検鏡で確認された細胞均質性を基準にして評価した。ＹＢＨＩ培地とＦＭＫ１０２８培地の組成はそれぞれ下記表２と表３に示した。

【0095】

【表2】

【0096】

【表3】

【0097】

最適培地探索に使用された培地は、全て滅菌前ｐＨを６．８に調整した。ＹＢＨＩ培地で１４時間培養されたルミノコッカスフェシス前培養液をそれぞれＹＢＨＩ培地、ＲＣＭ培地、ＢＬ培地、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、またはＦＭＫ１０２８培地に最終体積比で１％になるようにそれぞれ接種した。接種後嫌気条件、３７℃で静置培養（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）し、１４時間後に培養液の６００ｎｍでの吸光度とｐＨを測定し細胞の形態を観察した。吸光度はＯｒｉｏｎ Ａｑｕａｍａｔｅ ８０００分光器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して測定し、ｐＨはＳｅｖｅｎＣｏｍｐａｃｔ ｐＨ／Ｉｏｎ ｍｅｔｅｒ（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、ＵＳＡ）で測定した。細胞の形態は、Ｏｐｔｉｎｉｔｙ ＫＢ－３２０光学顕微鏡（Ｋｏｒｅａ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で観察した。

【0098】

図５ａは、各培地でルミノコッカスフェシスの培養性と細胞の形態を比較した結果である。図５ａに示されているように、１４時間培養後培養液の吸光度はＦＭＫ１０２８培地で最も高く、その次はＹＢＨＩ培地、ＧＡＭ培地、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、ＲＣＭ培地の順に高かった。培養後培養液のｐＨはＦＭＫ１０２８培地で最も低く、その次はＢＬ培地、ＹＢＨＩ培地、ＭＲＳ培地、ＲＣＭ培地、ＧＡＭ培地の順に低かった。顕微鏡で観察した結果は、ＦＭＫ１０２８とＧＡＭ培地に由来した細胞の均質性が最も優れ、その次はＹＢＨＩ培地で培養された細胞が優れた。

【0099】

総合的に、ルミノコッカスフェシスの培養性は、本発明で製造したＦＭＫ１０２８培地で最も優れた。

【0100】

（２）最適培地成長曲線および生菌数
ルミノコッカスフェシスの培養性が最も優れたＦＭＫ１０２８培地を用いて成長曲線と生菌数を測定した。対照群としてＹＢＨＩ培地を使用した。

【0101】

ＹＢＨＩ培地で１４時間培養されたルミノコッカスフェシス前培養液をＹＢＨＩ培地とＦＭＫ１０２８培地に体積比で１％になるようにそれぞれ接種した。接種後嫌気条件、３７℃で静置培養（ｓｔａｎｄｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）を１４時間行い、培養液の６００ｎｍでの吸光度を測定して成長曲線で示した。

【0102】

生菌数測定のためにそれぞれの培地に接種されたルミノコッカスフェシスを１４時間培養後、ＧＡＭ培地を用いて十倍数連続希釈法（１０－ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によって希釈し、その希釈液０．１ｍＬを取ってＧＡＭ培地寒天（ａｇａｒ）平板に塗抹した後、嫌気条件、３７℃で２４時間培養した。培養後、３０－３００個程度のコロニーが形成された寒天平板のコロニーを計数して培養液の単位体積当り生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）に換算した。測定された成長曲線と単位体積当り生菌数は図５ｂに示した。図５ｂに示されているように、ルミノコッカスフェシスは、対照群のＹＢＨＩ培地で培養８時間後静止相に到達して吸光度２．５５を示した。ＦＭＫ１０２８培地で培養後８時間までＹＨＢＩと類似の成長曲線を示したが、培養後１４時間まで持続成長して吸光度６．１８を示した。１４時間培養後単位体積当り生菌数を測定した結果、ＹＢＨＩ培地よりＦＭＫ１０２８培地で６００倍高い生菌数が確認された。

【0103】

（３）醗酵機を用いた大量培養および原末化
ルミノコッカスフェシスの大量培養および原末化のために醗酵機を用いて培養細胞の回収時点を確認した。ルミノコッカスフェシス前培養液１６ｍＬを８ＬのＦＭＫ１０２８培地に接種後、醗酵機（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃ、Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｂｕｋ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を稼動して嫌気条件、３７℃、２５０ｒｐｍ条件で培養した。培養時間による成長曲線と生菌数を測定して図５ｃに示した。図５ｃは、醗酵機を稼動して培養したルミノコッカスフェシスの成長曲線と生菌数を示した結果である。

【0104】

図５ｃに示されているように、ルミノコッカスフェシスは、８時間培養後、静止相に到達して吸光度８．２５と生菌数５．１５×１０^９ＣＦＵ／ｍＬを示した。静止相である培養後１１時間には吸光度が減少して７．２５を示し、生菌数も小幅減少して４．９５×１０^９ＣＦＵ／ｍＬを示した。図５ｂで提示された静置培養結果とは異なり、醗酵機を用いた培養結果、静止相に到達する時間が８時間に短縮され、フラスコ回分培養時の１４時間培養結果と比較時、静止相での吸光度（６．１８→８．２５）および生菌数（１．２×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ→５．１５×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）測定結果も向上したのを確認することができた。

【0105】

前記結果を根拠にして醗酵機を用いてルミノコッカスフェシスを大量培養した。培養後８時間に２２３６Ｒ高速遠心分離機（Ｌａｂｏｇｅｎｅ、ＬｉｌｌｅｒФｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて７，０００ｒｐｍ、４０分条件で培養された細胞を回収した。回収された細胞は３００ｍＬビーカーに入れマグネチックバーと撹拌機を用いて凍結保護剤と重量比率１：１で２０分間混合した。使用された凍結保護剤の組成は下記表４に示した。凍結保護剤と混合された細胞は－８０℃超低温冷凍庫で２４時間凍結させた後、７２時間凍結乾燥後に細密粉砕して粉末化させた。

【0106】

【表4】

【0107】

最終的に、醗酵機を用いた大量培養および原末化過程で測定された生菌数は下記表５に示した。

【0108】

【表5】

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図1h】

【図1i】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【配列表】

2022542944000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-01-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を含む、肝損傷の予防、改善、または治療用薬学的または食品組成物。

【請求項2】

前記肝損傷は下記（１）～（５）のうちの１種以上の特性を有することである、請求項１に記載の組成物：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加する、
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加する、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少する、
（４）線維性遺伝子発現量が増加する、および
（５）体重に対する肝重量比率が増加する。

【請求項3】

前記肝損傷は、脂肪肝、肝炎、肝線維化、および肝硬変からなる群より選択された１種以上である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記脂肪肝は、非アルコール性脂肪肝である、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記非アルコール性脂肪肝は、糖尿病性非アルコール性脂肪肝である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物は、下記（１）～（５）のうちの１種以上を特徴とするものである、請求項１に記載の組成物：
（１）血中ＡＬＴ濃度の減少、
（２）血中ＡＳＴ濃度の減少、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度の増加、
（４）線維性遺伝子発現量の減少、および
（５）体重に対する肝重量比率の減少。

【請求項7】

前記二次胆汁酸は、ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＣＡ）、ｌｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＬＣＡ）、およびｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＵＤＣＡ）からなる群より選択された１種以上であるか、または前記線維性遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｉｍｐ１、およびα－ＳＭＡからなる群より選択された１種以上である、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物は、インスリン非依存的に肝損傷を改善または治療するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物は、インスリン抵抗性を有する対象に投与されるものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物は、インスリン抵抗性を有する対象に投与されて下記（１）～（３）のうちの１種以上を特徴とするものである、請求項１に記載の組成物：
（１）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、血中ＡＬＴ数値減少率、
（２）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、血中ＡＳＴ数値減少率、
（３）インスリン抵抗性を有しない対照群に比べて高い、体重に対する肝重量比率（ｌｉｖｅｒ ｒａｔｉｏ）の減少率。

【請求項11】

前記ルミノコッカス属菌株は、ルミノコッカスフェシス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｓ）である、請求項１に記載の組成物。

【請求項12】

前記菌株は、炭素源の濃度５～３０％（ｗ／ｖ）、窒素源の濃度５０～９０％（ｗ／ｖ）、ミネラルの濃度５～１５％（ｗ／ｖ）、およびアミノ酸の濃度０．１～１０％（ｗ／ｖ）である培養培地で培養８時間以後に成長を持続するものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記組成物は、凍結乾燥保護剤を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記凍結乾燥保護剤は、ショ糖、リン酸カルシウム、アルギニン、塩化ナトリウム、果糖、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、およびトレハロースからなる群より選択された１種以上を含むものである、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

５～３０％（ｗ／ｖ）濃度の炭素源および５０～９０％（ｗ／ｖ）濃度の窒素源を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養用組成物であって、
前記炭素源は、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜、およびガラクトースからなる群より選択された１種以上であり、
前記窒素源は、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、大豆ペプトン（ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、脱脂乳、トリプトン、カザミノ酸（Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）、ジャガイモペプトン（ｐｏｔａｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ）、エンドウ豆ペプトン（ｐｅａ ｐｅｐｔｏｎｅ）、小麦ペプトン（ｗｈｅａｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）、ソラマメペプトン（ｂｒｏａｄｂｅａｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）、パパイック大豆ペプトン（ｐａｐａｉｃ ｓｏｙ ｐｅｐｔｏｎｅ）、およびルピンペプトン（ｌｕｐｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ）からなる群より選択された１種以上であり、
前記組成物は、ルミノコッカス属菌株の培養８時間以後の成長を促進するものである、培養用組成物。

【請求項16】

前記組成物は、ミネラル、アミノ酸、ビタミン、核酸、および無機塩類からなる群より選択された１種以上を追加的に含むものである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

請求項１５～１６のいずれか一項に記載の培養用組成物に、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株を接種して培養する段階を含む、ルミノコッカス属（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）菌株の培養方法。

【請求項18】

前記培養方法は、前記菌株接種８時間以後の成長を促進することである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記培養は、静置培養、流加式培養、または回分式培養である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

対象における肝損傷の予防、改善、または治療のための医薬の製造における請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項21】

前記対象は、下記（１）～（５）のうちの１種以上の特性を有するものである、請求項２０に記載の使用：
（１）血中ＡＬＴ濃度が増加した状態、
（２）血中ＡＳＴ濃度が増加した状態、
（３）盲腸内二次胆汁酸濃度が減少した状態、
（４）線維性マーカ遺伝子が過発現された状態、
（５）体重に対する肝重量比率が増加した状態。

【請求項22】

前記対象は、インスリン抵抗性を有するものである、請求項２０に記載の使用。

【請求項23】

前記対象は、２型糖尿病を有するものである、請求項２０に記載の使用。

【国際調査報告】