特表 2022-543046 ウイルス様粒子ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】ウイルス様粒子ワクチン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/44 20060101AFI20220930BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220930BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20220930BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/11 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20220930BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20220930BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20220930BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 14/44 20060101ALI20220930BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20220930BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220930BHJP

【ＦＩ】

C12N15/44

A61K39/02 ZNA

A61K39/12

A61K39/215

A61K39/39

A61P31/10

A61P31/04

A61P31/12

A61P31/16

A61P31/14

A61K9/00

A61K47/24

A61K47/26

A61K47/64

A61K47/28

A61K39/00 H

A61K39/145

C12N7/01

C07K14/195

C07K14/37

C07K14/47

C07K14/005

C07K14/11

C07K14/165

C12Q1/04

C12Q1/06

C07K16/10

C12N15/50

C07K14/44

G01N33/569 L

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506419

(86)(22)【出願日】2020-07-30

(85)【翻訳文提出日】2022-03-24

(86)【国際出願番号】 US2020044196

(87)【国際公開番号】W WO2021022008

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】62/880,547

(32)【優先日】2019-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/990,318

(32)【優先日】2020-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ジップロック

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522040805

【氏名又は名称】バーンダリ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｎｄａｒｉ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ヘンダーソン，ダニエル アール

(72)【発明者】

【氏名】エリソン，トーマス ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】タルボット，ジョージ シー

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ヨンジュ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ10

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR79

4B063QS36

4B063QX01

4B065AA01Y

4B065AA57Y

4B065AA86X

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA51

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB31

4C076CC06

4C076DD63

4C076DD67

4C076DD70

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF68

4C076GG01

4C085AA03

4C085BA07

4C085BA51

4C085BA57

4C085BA71

4C085BB01

4C085BB11

4C085CC07

4C085CC08

4C085CC21

4C085DD84

4C085EE06

4C085FF12

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA53

4H045BA55

4H045CA01

4H045CA10

4H045CA11

4H045CA20

4H045CA22

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

特定の実施形態では、合成エンベロープＶＬＰ又は合成膜ＶＬＰ等のウイルス様粒子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは脂質二重層を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、脂質二重層に固定された、精製された抗原を含む。いくつかの実施形態は、ＶＬＰを含むワクチン、ワクチンを使用する方法、及びワクチン又はＶＬＰを作製する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）合成、半合成又は天然の脂質二重層と、
（ｂ）前記脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、
（ｃ）前記アンカー分子に結合した抗原と、
を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

【請求項2】

前記脂質二重層が、ホスファチジルコリン種等の第１の脂質を含む、請求項１に記載のＶＬＰ。

【請求項3】

前記脂質二重層が、ホスファチジルエタノールアミン種等の第２の脂質を含む、請求項２に記載のＶＬＰ。

【請求項4】

前記第１の脂質及び／又は前記第２の脂質がそれぞれ、４～１８の炭素原子を含むアシル鎖を含む、請求項３に記載のＶＬＰ。

【請求項5】

前記第１の脂質及び／又は前記第２の脂質がそれぞれ、４以下の不飽和結合を含む、請求項３又は４に記載のＶＬＰ。

【請求項6】

前記脂質二重層の前記第１の脂質及び／又は前記脂質二重層の前記第２の脂質が合成である、請求項３から５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項7】

前記脂質二重層、前記脂質二重層の前記第１の脂質、及び／又は前記脂質二重層の前記第２の脂質が、少なくとも９９％純粋であるか、あるいは生物学的材料を含まないか、又は実質的に含まない、請求項３から６のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項8】

前記第１の脂質がＤＯＰＣを含む、請求項３から７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項9】

前記第２の脂質がＤＯＰＥを含む、請求項３から８のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項10】

前記脂質二重層が、１：０．２５～１：４の所定の比で、前記第１の脂質及び前記第２の脂質を含む、請求項３から９のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項11】

前記脂質二重層がステロール又はステロール誘導体を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項12】

前記ステロール又はステロール誘導体が、コレステロール又はＤＣ－コレステロールを含む、請求項１１に記載のＶＬＰ。

【請求項13】

前記脂質二重層が、前記第１の脂質及び／又は前記第２の脂質に対して、０～３０ｍｏｌ％の比で、前記ステロール又はステロール誘導体を含む、請求項１１又は１２に記載のＶＬＰ。

【請求項14】

前記抗原が、少なくとも７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲、純粋である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項15】

前記抗原が前記アンカー分子に直接結合しているか、又は前記抗原が前記アンカー分子を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項16】

前記抗原が細菌抗原又はその断片を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項17】

前記細菌抗原が、アクチノミセス抗原（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ）、バチルス抗原（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からの免疫原性抗原、バクテロイド抗原（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボルデテラ抗原（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、バルトネラ抗原（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボレリア抗原（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｂ．ブルグドフェリＯｓｐＡ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ抗原（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、カンピロバクター抗原（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、キャプノサイトファーガ抗原（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クラミジア抗原（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クロストリジウム抗原（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム抗原（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コクシエラ抗原（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、デルマトフィルス抗原（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エンテロコッカス抗原（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エーリキア抗原（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エシェリキア抗原（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フランキセラ抗原（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フゾバクテリウム抗原（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモバルトネラ抗原（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモフィルス抗原（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｈ．インフルエンザ ｂ型外膜タンパク質、ヘリコバクター抗原（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クレブシエラ抗原（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、Ｌ型菌抗原、レプトスピア抗原（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リステリア抗原（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコバクテリア抗原（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコプラズマ抗原（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ナイセリア抗原（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ネオリケッリア抗原（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ノカルジア抗原（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、パスツレラ抗原（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトストレプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肺炎球菌抗原（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、プロテウス抗原（Ｐｒｏｔｅｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シュードモナス抗原（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リケッチア抗原（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ロシャリメア抗原（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、サルモネラ抗原（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シゲラ抗原（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、スタフィロコッカス抗原（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ストレプトコッカス抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｓ．ピオゲネスＭタンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、トレポネーマ抗原（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）及びエルシニア抗原（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｙ．ペストＦ１（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ Ｆ１）及びＶ抗原（Ｖ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含む、請求項１６に記載のＶＬＰ。

【請求項18】

前記抗原が真菌抗原又はその断片を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項19】

前記真菌抗原が、大腸バランチジウム抗原（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エントアメーバ・ヒストリチカ抗原（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肝蛭抗原（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ランブル鞭毛虫抗原（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リーシュマニア抗原（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びプラスモジウム抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含む、請求項１８に記載のＶＬＰ。

【請求項20】

前記抗原が癌抗原又はその断片を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項21】

前記癌抗原が、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータ鎖（ｈＣＧベータ）、Ｃ３５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ－１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥを含む、請求項２０に記載のＶＬＰ。

【請求項22】

前記抗原がウイルス抗原又はその断片を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項23】

前記ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、狂犬病ウイルス、コロナウイルス（例えば、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス、又は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ニパウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘルペスウイルス、又はＡ型肝炎（ＨｅｐＡ）ウイルス、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、若しくはＣ型肝炎（ＨｅｐＣ）ウイルス等の肝炎ウイルスに由来する抗原を含む、請求項２２に記載のＶＬＰ。

【請求項24】

前記抗原がインフルエンザタンパク質又はその断片を含む、請求項１から１５、２２又は２３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項25】

前記インフルエンザタンパク質が、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、若しくはＰＢ２インフルエンザタンパク質、又はその断片を含む、請求項２４に記載のＶＬＰ。

【請求項26】

前記インフルエンザタンパク質が、配列番号１～１６のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む、請求項２４又は２５に記載のＶＬＰ。

【請求項27】

前記インフルエンザタンパク質が、配列番号１～１６のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む、請求項２４又は２５に記載のＶＬＰ。

【請求項28】

前記インフルエンザタンパク質が、配列番号１～１６のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一である配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる、請求項２４又は２５に記載のＶＬＰ。

【請求項29】

前記インフルエンザタンパク質が、配列番号１～１６のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、核酸の置換、欠失及び／又は挿入を有する配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる、請求項２４又は２５に記載のＶＬＰ。

【請求項30】

前記抗原がコロナウイルスタンパク質又はその断片を含む、請求項１から１５、２２又は２３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項31】

前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含む、請求項３０に記載のＶＬＰ。

【請求項32】

前記コロナウイルスタンパク質が、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜タンパク質（Ｍ）、又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む、請求項３０又は３１に記載のＶＬＰ。

【請求項33】

前記コロナウイルスタンパク質がＳ１又はＳ２を含む、請求項３０から３２のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項34】

前記コロナウイルスタンパク質が、配列番号２０～２９のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項35】

前記コロナウイルスタンパク質が、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項36】

前記アンカー分子が、膜貫通タンパク質、脂質アンカータンパク質、又はその断片若しくはドメインを含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項37】

前記アンカー分子が疎水性部分を含む、請求項１から３６のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項38】

前記アンカー分子が、プレニル化タンパク質、脂肪アシル化タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール連結タンパク質、又はその断片を含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項39】

前記ＶＬＰがｓｅＶＬＰであり、前記脂質二重層が合成脂質小胞の形態である、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項40】

前記脂質二重層が、内面及び外面を含む、請求項３９に記載のＶＬＰ。

【請求項41】

前記抗原が前記脂質小胞の前記外面に提示される、請求項４０に記載のＶＬＰ。

【請求項42】

前記抗原が前記脂質小胞の前記内面に提示される、請求項４０に記載のＶＬＰ。

【請求項43】

前記ＶＬＰがｓｍＶＬＰであり、前記脂質二重層がナノディスクの形態である、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＶＬＰ。

【請求項44】

前記ナノディスクが５～２００ｎＭの直径からなる、請求項４３に記載のＶＬＰ。

【請求項45】

前記ナノディスクが、両親媒性のドーナツ形状ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマー、スチレン－マレイン酸脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）、ジイソブチレンマレイン酸（ＤＩＢＭＡ）コポリマー、又はＡｐｏＡのアルファヘリックスの非免疫原性模倣ペプチドを含む、請求項４３又は４４に記載のＶＬＰ。

【請求項46】

請求項１から４５のいずれか一項に記載のＶＬＰと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又はアジュバントと、を含むワクチン。

【請求項47】

前記賦形剤が、付着防止剤、結合剤、コーティング、色素又は染料、崩壊剤、香味剤、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤、甘味料、又はビヒクルを含む、請求項４６に記載のワクチン。

【請求項48】

前記アジュバントが、イミキモド、Ｆｌｔ３リガンド、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）等のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、又はＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む、請求項４６又は４７に記載のワクチン。

【請求項49】

前記アジュバントがイミキモドである、請求項４６から４８のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項50】

前記ワクチンが、生理食塩水等の溶媒又は液体、乾燥粉末、あるいは糖ガラスとして製剤化される、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項51】

前記ワクチンが凍結乾燥されている、請求項４６から５０のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項52】

前記ワクチンが、鼻腔内、皮内、筋肉内、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与用に製剤化される、請求項４６から５１のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項53】

前記ワクチンが、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のｓｅＶＬＰを含む、請求項４６から５２のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項54】

前記ワクチンが、２５ｐＬ、５０ｐＬ、１００ｐＬ、２５０ｐＬ、５００ｐＬ、７５０ｐＬ、１ｎＬ、５ｎＬ、１０ｎＬ、１５ｎＬ、２０ｎＬ、２５ｎＬ、５０ｎＬ、１００ｎＬ、２５０ｎＬ、５００ｎＬ、１μＬ、１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ若しくは５ｍＬの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のワクチンを含む、請求項４６から５３のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項55】

前記ワクチンが、マイクロニードルに１００ｐＬ～２０ｎＬ用量でマイクロニードル投与するために製剤化される、請求項４６から５４のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項56】

トレハロース糖ガラスを更に含む、請求項４６から５５のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項57】

請求項４６から５６のいずれか一項に記載のワクチンが充填されたマイクロニードルデバイス。

【請求項58】

前記マイクロニードルデバイスが、シートと、そこから延在する複数のマイクロニードルと、を含む基板を含む、請求項５７に記載のマイクロニードルデバイス。

【請求項59】

前記ワクチンが糖ガラスの形態である、請求項５７又は５８に記載のマイクロニードルデバイス。

【請求項60】

前記糖ガラスがトレハロースである、請求項５９に記載のマイクロニードルデバイス。

【請求項61】

テープによって支持材料に固定された金属スナップアプリケータを更に含む、請求項５８から６０のいずれか一項に記載のマイクロニードルデバイス。

【請求項62】

（ｉ）アンカー分子に結合した抗原を含む水溶液と、（ｉｉ）第１の脂質及び第２の脂質を含むエタノール溶液とを微小流体的に組み合わせ、それにより、前記水溶液を前記エタノール溶液と混合して、前記第１及び第２の脂質を含む脂質二重層を含み、前記アンカー分子が前記脂質二重層に埋め込まれているｓｅＶＬＰを形成すること
を含む、ｓｅＶＬＰを作製する方法。

【請求項63】

前記水溶液を前記エタノール溶液と微小流体的に組み合わせることが、前記水溶液の流れを前記エタノール溶液の流れと混合することを含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

必要とする対象において、疾患を予防するか、疾患の発症を減少させるか、又は疾患の重症度を低下させる方法であって、
請求項４６から５６のいずれか一項に記載の前記ワクチンを前記対象に投与することを含み、
前記投与が前記疾患を予防するか、前記疾患の発症を減少させるか、又は前記疾患の重症度を低下させる、方法。

【請求項65】

前記疾患が感染症である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記疾患が細菌、真菌、又はウイルス感染症である、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ウイルス感染症がインフルエンザ感染症である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記ウイルス感染症がコロナウイルス感染症である、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記ウイルス感染症がコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）である、請求項６６又は６８に記載の方法。

【請求項70】

前記対象が哺乳動物又はヒト対象である、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記投与が１つ以上の針又はマイクロニードルによる投与を含む、請求項６４から７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記投与が、予め形成された液体シリンジによる投与を含む、請求項６４から７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記投与が、鼻腔内、皮内、筋肉内、皮膚パッチ、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与を含む、請求項６４から７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記投与が、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量の前記ｓｅＶＬＰ又はワクチンを投与することを含む、請求項６４から７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

１００ｐＬ～２０ｎＬのワクチンが各マイクロニードルによって投与される、請求項６４から７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

５～２０ｎＬのワクチンが各マイクロニードルによって投与される、請求項６４から７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記ワクチンが、請求項５６から６１のいずれか一項に記載のマイクロニードルデバイスを使用して投与される、請求項６４から７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

請求項１から４５のいずれか一項に記載の前記ＶＬＰ又は請求項４６から５６のいずれか一項に記載の前記ワクチンで充填されたマイクロニードル、及びワイプ、乾燥剤並びに／あるいは包帯を含む、キット。

【請求項79】

請求項５５から５９のいずれか一項に記載の前記マイクロニードルデバイスを更に含む、請求項７８に記載のキット。

【請求項80】

イミキモドワイプを更に含む、請求項７８又は７９に記載のキット。

【請求項81】

ワクチンを投与された対象から得られた、ウイルスの存在又は量を含む試料を得ることと、
ウイルスタンパク質に結合することができるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）又はその断片を含む基質を提供することと、
前記基質を前記試料と接触させて、前記試料中のウイルス又はタンパク質ウイルスを前記ＡＣＥ２又はその断片に結合させることと、
前記基質の前記ＡＣＥ２又はその断片に結合したウイルス又はタンパク質ウイルスを検出することと、
前記基質の前記ＡＣＥ２又はその断片に結合した、前記検出されたウイルス又はタンパク質ウイルスに基づいて、前記試料中の前記ウイルスの存在又は量を決定し、それによって前記ワクチンの有効性を決定することと、
を含む、ワクチンの有効性を決定する方法。

【請求項82】

前記試料が対象に由来する、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記試料が、血液、血清又は血漿を含む、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

前記ウイルスがコロナウイルスである、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記ウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記ウイルスタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項８１から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記試料中のウイルスの量が、前記対象に前記ワクチンを投与する前に前記対象から得られた別の試料と比較して減少する、請求項８１から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記試料中のウイルスの量が、前記対象に前記ワクチンを投与する前に前記対象から得られた別の試料と比較して増加している、請求項８１から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記試料中の前記ウイルスの量又は前記ワクチンの有効性に基づいて、前記対象にウイルス治療を推奨又は提供することを更に含む、請求項８１から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記ウイルス治療が、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

ワクチンを投与された対象から得られた、抗ウイルス抗体の存在又は量を含む試料を得ることと、
前記抗ウイルス抗体に結合することができるウイルスタンパク質又はその断片を含む基質を提供することと、
前記基質を前記試料と接触させて、前記試料中の抗ウイルス抗体を前記ウイルスタンパク質又はその断片に結合させることと、
前記基質の前記ウイルスタンパク質又はその断片に結合した抗ウイルス抗体を検出することと、
前記基質の前記ウイルスタンパク質又はその断片に結合した、前記検出された抗ウイルス抗体に基づいて、前記試料中の前記抗ウイルス抗体の存在又は量を決定し、それによって前記ワクチンの有効性を決定することと、
を含むワクチンの有効性を決定する方法。

【請求項92】

前記試料が対象に由来する、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記試料が、血液、血清又は血漿を含む、請求項９１又は９２に記載の方法。

【請求項94】

前記ウイルスがコロナウイルスである、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記ウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項９１から９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記ウイルスタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項９１から９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記試料中の抗ウイルス抗体の量が、前記対象に前記ワクチンを投与する前に前記対象から得られた別の試料と比較して減少する、請求項９１から９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記試料中の抗ウイルス抗体の量が、前記対象に前記ワクチンを投与する前に前記対象から得られた別の試料と比較して増加する、請求項９１から９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記試料中の前記抗ウイルス抗体の量又は前記ワクチンの有効性に基づいて、ウイルス治療を前記対象に推奨又は提供することを更に含む、請求項９１から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記ウイルス治療が、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

（ａ）第１の脂質及び第２の脂質を含む合成脂質二重層と、
（ｂ）前記脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、
（ｃ）前記アンカー分子に結合した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）タンパク質と、
を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。

【請求項102】

前記第１の脂質がホスファチジルコリン種を含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項103】

前記第１の脂質がＤＯＰＣを含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項104】

前記第２の脂質がホスファチジルエタノールアミン種を含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項105】

前記第２の脂質がＤＯＰＥを含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項106】

前記脂質二重層が、１：０．２５～１：４の所定の比で、前記第１の脂質及び前記第２の脂質を含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項107】

前記脂質二重層が、コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はそれらの誘導体を更に含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項108】

前記脂質二重層が、前記コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はそれらの誘導体を、前記第１の脂質又は前記第２の脂質に対して０～３０ｍｏｌ％の比で含む、請求項１０７に記載のＶＬＰ。

【請求項109】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質が前記アンカー分子に直接結合しているか、又は前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質が前記アンカー分子を含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項110】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質がスパイクタンパク質を含む、請求項１０１に記載のＶＬＰ。

【請求項111】

前記スパイクタンパク質がＳ１又はＳ２を含む、請求項１１０に記載のＶＬＰ。

【請求項112】

前記スパイクタンパク質が、配列番号２５と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載のＶＬＰ。

【請求項113】

前記スパイクタンパク質が、配列番号２５と比較して１０以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１０に記載のＶＬＰ。

【請求項114】

前記スパイクタンパク質が、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する、請求項１１０に記載のＶＬＰ。

【請求項115】

請求項１０１に記載の前記ＶＬＰと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体又はアジュバントとを含むワクチン。

【請求項116】

前記アジュバントがイミキモドを含む、請求項１１５に記載のワクチン。

【請求項117】

前記ワクチンが、マイクロニードルによる注射用に製剤化される、請求項１１５に記載のワクチン。

【請求項118】

前記ワクチンが凍結乾燥される、請求項１１５に記載のワクチン。

【請求項119】

前記ワクチンが、糖ガラスとして製剤化される、請求項１１５に記載のワクチン。

【請求項120】

請求項１１５に記載の前記ワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含むワクチン接種方法。

【請求項121】

（ａ）内面及び外面を有する脂質二重層を含む合成脂質小胞と、
（ｂ）前記脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、
（ｃ）前記アンカー分子に結合した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）タンパク質と、
を含む、合成エンベロープウイルス様粒子（ｓｅＶＬＰ）。

【請求項122】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質が、前記脂質小胞の前記外面上に提示される、請求項１２１に記載のｓｅＶＬＰ。

【請求項123】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質が、前記脂質小胞の前記内面上に提示される、請求項１２１に記載のｓｅＶＬＰ。

【請求項124】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質がＳ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む、請求項１２１に記載のｓｅＶＬＰ。

【請求項125】

注射用糖ガラスとして製剤化される、請求項１２１に記載のｓｅＶＬＰ。

【請求項126】

（ａ）内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成ナノディスクと、
（ｂ）前記脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、
（ｃ）前記アンカー分子に結合した重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）タンパク質と、
を含む、合成膜ウイルス様粒子（ｓｍＶＬＰ）。

【請求項127】

前記ナノディスクが５～２００ｎＭの直径からなる、請求項１２６に記載のｓｍＶＬＰ。

【請求項128】

前記ナノディスクが、両親媒性のドーナツ形状ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマー、スチレン－マレイン酸脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）、ジイソブチレンマレイン酸（ＤＩＢＭＡ）コポリマー、又はＡｐｏＡのアルファヘリックスの非免疫原性模倣ペプチドを含む、請求項１２６に記載のｓｍＶＬＰ。

【請求項129】

前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質がＳ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む、請求項１２６に記載のｓｍＶＬＰ。

【請求項130】

注射用糖ガラスとして製剤化される、請求項１２６に記載のｓｍＶＬＰ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８８０５４７号及び２０２０年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０３１８号の利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は、４７７５０－７０５＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１４３キロバイトである。

【背景技術】

【0003】

感染症によって引き起こされる疾患は広範囲に及んでいる。多くの感染症は予防が困難である。例えば、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）等のコロナウイルス感染症の数は増加しており、治療法は有効ではない。これらの疾患に対抗するためには、より良いワクチンが必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

特定の実施形態では、（ａ）合成又は天然の脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合した抗原と、を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が本明細書に開示される。特定の実施形態では、（ａ）合成脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合した抗原と、を含むＶＬＰが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、ホスファチジルコリン種等の第１の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、ホスファチジルエタノールアミン種等の第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質及び／又は第２の脂質はそれぞれ、４～１８の炭素原子を含むアシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質及び／又は第２の脂質はそれぞれ、４以下の不飽和結合を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層の第１の脂質及び／又は脂質二重層の第２の脂質は合成である。いくつかの実施形態では、脂質二重層、脂質二重層の第１の脂質、及び／又は脂質二重層の第２の脂質は、少なくとも９９％純粋であるか、あるいは生物学的材料を含まないか、若しくは実質的に含まない。いくつかの実施形態では、第１の脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、１：０．２５～１：４の所定の比で第１の脂質及び第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層はステロール又はステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ステロール又はステロール誘導体は、コレステロール又はＤＣ－コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、第１の脂質及び／又は第２の脂質に対して０～３０ｍｏｌ％の比でステロール又はステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、少なくとも７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲で、純粋である。いくつかの実施形態では、抗原はアンカー分子に直接結合しているか、又は抗原はアンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、細菌抗原又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、細菌抗原は、アクチノミセス抗原（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ）、バチルス抗原（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からの免疫原性抗原、バクテロイド抗原（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボルデテラ抗原（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、バルトネラ抗原（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボレリア抗原（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｂ．ブルグドフェリＯｓｐＡ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ抗原（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、カンピロバクター抗原（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、キャプノサイトファーガ抗原（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クラミジア抗原（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クロストリジウム抗原（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム抗原（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コクシエラ抗原（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、デルマトフィルス属抗原（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エンテロコッカス抗原（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エーリキア属抗原（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エシェリキア属抗原（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フランキセラ属抗原（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フゾバクテリウム抗原（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモバルトネラ属抗原（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモフィルス抗原（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｈ．Ｂ型インフルエンザ型外膜タンパク質、ヘリコバクター抗原（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クレブシエラ抗原（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、Ｌ型菌、レプトスピア抗原（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リステリア抗原（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコバクテリア抗原（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコプラズマ抗原（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ナイセリア抗原（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ネオリケッリア抗原（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ノルカジア抗原（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、パスツレラ抗原（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトストレプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肺炎球菌抗原（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、プロテウス抗原（Ｐｒｏｔｅｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シュードモナス抗原（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リケッチア抗原（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ロシャリメア抗原（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、サルモネラ抗原（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シゲラ抗原（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、スタフィロコッカス抗原（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ストレプトコッカス抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｓ．ピオゲネスＭタンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、トレポネーマ抗原（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）及びエルシニア抗原（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｙ．ペストＦ１（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ Ｆ１）及びＶ抗原（Ｖ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、真菌抗原又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、真菌抗原は、大腸バランチジウム抗原（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エントアメーバ・ヒストリチカ抗原（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肝蛭抗原（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ランブル鞭毛虫抗原（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リーシュマニア抗原（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びプラスモジウム抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、癌抗原又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、癌抗原は、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータ鎖（ｈＣＧベータ）、Ｃ３５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ－１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ウイルス抗原又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、狂犬病ウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ニパウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヘルペスウイルス、又はＡ型肝炎（ＨｅｐＡ）ウイルス、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、若しくはＣ型肝炎（ＨｅｐＣ）ウイルス等の肝炎ウイルスに由来する抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザタンパク質又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、若しくはＰＢ２インフルエンザタンパク質、又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１６のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１６のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１６のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一である配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１６のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、核酸の置換、欠失及び／又は挿入を有する配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗原は、コロナウイルスタンパク質又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜タンパク質（Ｍ）、又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、Ｓ１又はＳ２を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、アンカー分子は、膜貫通タンパク質、脂質アンカータンパク質、又はその断片若しくはドメインを含む。いくつかの実施形態では、アンカー分子は疎水性部分を含む。いくつかの実施形態では、アンカー分子は、プレニル化タンパク質、脂肪アシル化タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール連結タンパク質、又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、脂質二
重層を含む合成脂質小胞を更に含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、内面及び外面を含む。いくつかの実施形態では、抗原は脂質小胞の外面に提示される。いくつかの実施形態では、抗原は脂質小胞の内面に提示される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはｓｅＶＬＰであり、脂質二重層は合成脂質小胞の形態である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ナノディスクを含む合成膜ウイルス様粒子（ｓｍＶＬＰ）の形態である。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５～２００ｎＭの直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノディスクは両親媒性ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクはスチレン－マレイン酸脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクはジイソブチレンマレイン酸（ＤＩＢＭＡ）コポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡコポリマーはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、両親媒性ドーナツ形状ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマー、ＳＭＡＬＰ、又はＤＩＢＭＡコポリマーを含む。

【0005】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＶＬＰと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、及び／又はアジュバントとを含むワクチンが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、賦形剤は、付着防止剤、結合剤、コーティング、色素又は染料、崩壊剤、香味剤、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤、甘味料、又はビヒクルを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、イミキモド、Ｆｌｔ３リガンド、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）等のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、又はＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントはイミキモドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、生理食塩水等の溶媒又は液体、乾燥粉末、あるいは糖ガラスとして製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔内、皮内、筋肉内、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のｓｅＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２５ｐＬ、５０ｐＬ、１００ｐＬ、２５０ｐＬ、５００ｐＬ、７５０ｐＬ、１ｎＬ、５ｎＬ、１０ｎＬ、１５ｎＬ、２０ｎＬ、２５ｎＬ、５０ｎＬ、１００ｎＬ、２５０ｎＬ、５００ｎＬ、１μＬ、１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、若しくは５ｍＬの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１００ｐＬ～２０ｎＬ用量のマイクロニードル投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、用量は、マイクロニードルデバイスの各マイクロニードル上、又は各マイクロニードル内にある。いくつかの実施形態では、ワクチンはトレハロース糖ガラスとして製剤化される。

【0006】

特定の実施形態では、（ａ）第１の脂質及び第２の脂質を含む合成脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含むＶＬＰが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、第１の脂質は、ホスファチジルコリン種を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質はＤＯＰＣを含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質はホスファチジルエタノールアミン種を含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質はＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、１：０．２５～１：４の所定の比で第１の脂質及び第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はそれらの誘導体を更に含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、第１の脂質又は第２の脂質に対して０～３０ｍｏｌ％の比で、コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質はアンカー分子に直接結合しているか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質がアンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質はスパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｓ１又はＳ２を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号２５と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号２５と比較して、１０以下のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する。特定の実施形態では、ＶＬＰと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、又はアジュバントとを含むワクチンが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、アジュバントはイミキモドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードルによる注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、ワクチンは糖ガラスとして製剤化される。特定の実施形態では、それを必要とする対象にワクチンを投与することを含むワクチン接種方法が本明細書に開示される。

【0007】

特定の実施形態では、（ａ）内面及び外面を有する脂質二重層を含む合成脂質小胞と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含む合成エンベロープウイルス様粒子（ｓｅＶＬＰ）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、脂質小胞の外面に提示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、脂質小胞の内面に提示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、注射用の糖ガラスとして製剤化される。

【0008】

特定の実施形態では、（ａ）内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成ナノディスクと、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含むｓｍＶＬＰが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５～２００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、両親媒性のドーナツ形状ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマー、ＳＭＡＬＰ、ＤＩＢＭＡコポリマー、又はＡｐｏＡのアルファヘリックスの非免疫原性模倣ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは、注射用の糖ガラスとして製剤化される。

【0009】

特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンを充填したマイクロニードルデバイスが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、シートと、そこから延在する複数のマイクロニードルとを含む基板を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは糖ガラスとして製剤化される。いくつかの実施形態では、糖ガラスはトレハロースである。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、テープによって支持材料に固定された金属スナップアプリケータを含む。

【0010】

特定の実施形態では、（ｉ）アンカー分子に結合した抗原を含む水溶液と、（ｉｉ）第１の脂質及び第２の脂質を含むエタノール溶液とを微小流体的に合わせ、それによって水溶液をエタノール溶液と混合して、アンカー分子が脂質二重層に埋め込まれている、第１及び第２の脂質を含有する脂質二重層を含むｓｅＶＬＰを形成することを含む、ｓｅＶＬＰを作製する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、水溶液をエタノール溶液と微小流体的に組み合わせることは、水溶液の流れをエタノール溶液の流れと混合することを含む。

【0011】

特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンを対象に投与することを含む、疾患を予防するか、疾患の発生を減少させるか、又は疾患の重症度を低減させるための方法が本明細書で開示され、当該投与が、疾患を予防するか、疾患の発生を減少させるか、又は疾患の重症度を低減させる。いくつかの実施形態では、疾患は感染症を含む。いくつかの実施形態では、疾患は、細菌、真菌、又はウイルス感染症を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症はインフルエンザ感染症を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ１９）である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物又はヒト対象である。いくつかの実施形態では、投与は、１つ以上の針又はマイクロニードルによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、予め形成された液体シリンジによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、鼻腔内、皮内、筋肉内、皮膚パッチ、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のｓｅＶＬＰ又はワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、１００ｐＬ～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、５～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、本明細書に記載のマイクロニードルデバイスを使用して投与される。

【0012】

特定の実施形態では、記載されるＶＬＰ又はワクチンを充填したマイクロニードル、並びにワイプ、乾燥剤、及び／又は包帯を含むキットが本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のマイクロニードルデバイスを含む。いくつかの実施形態では、キットはイミキモドワイプを含む。

【0013】

特定の実施形態では、ワクチンを投与された対象から得られた、ウイルスの存在又は量を含む試料を得ることと、ウイルスタンパク質に結合することができるＡＣＥ２又はその断片を含む基質を提供することと、基質を試料と接触させて、試料中のウイルス又はタンパク質ウイルスをＡＣＥ２又はその断片に結合させることと、基質のＡＣＥ２又はその断片に結合したウイルス又はタンパク質ウイルスを検出することと、基質のＡＣＥ２又はその断片に結合した検出されたウイルス又はタンパク質ウイルスに基づいて、試料中のウイルスの存在又は量を決定し、それによってワクチンの有効性を決定することと、を含む、ワクチンの有効性を決定する方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、試料は対象に由来する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血清、又は血漿を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、試料中のウイルスの量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して減少する。いくつかの実施形態では、試料中のウイルスの量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して増加する。いくつかの実施形態は、試料中のウイルスの量又はワクチンの有効性に基づいて、対象にウイルス治療を推奨又は提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルス治療は、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはＶＬＰを含む。

【0014】

特定の実施形態では、ワクチンを投与された対象から得られた、抗ウイルス抗体の存在又は量を含む試料を得ることと、抗ウイルス抗体に結合することができるウイルスタンパク質又はその断片を含む基質を提供することと、基質を試料と接触させて、試料中の抗ウイルス抗体をウイルスタンパク質又はその断片に結合させることと、基質のウイルスタンパク質又はその断片に結合した抗ウイルス抗体を検出することと、基質のウイルスタンパク質又はその断片に結合した検出された抗ウイルス抗体に基づいて、試料中の抗ウイルス抗体の存在又は量を決定し、それによりワクチンの有効性を決定することと、を含むワクチンの有効性を決定する方法が本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、試料は対象に由来する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血清、又は血漿を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、試料中の抗ウイルス抗体の量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して減少する。いくつかの実施形態では、試料中の抗ウイルス抗体の量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して増加する。いくつかの実施形態は、試料中の抗ウイルス抗体の量又はワクチンの有効性に基づいて、対象にウイルス治療を推奨又は提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルス治療は、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはＶＬＰを含む。

【0015】

特定の実施形態では、第１の脂質及び第２の脂質を含む合成脂質二重層と、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含むウイルス様粒子ＶＬＰが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、第１の脂質は、ホスファチジルコリン種を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質はＤＯＰＣを含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質はホスファチジルエタノールアミン種を含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質はＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、１：０．２５～１：４の所定の比で第１の脂質及び第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はそれらの誘導体を更に含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は、第１の脂質又は第２の脂質に対して０～３０ｍｏｌ％の比で、コレステロール若しくはＤＣ－コレステロール、又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質はアンカー分子に直接結合しているか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質がアンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質はスパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｓ１又はＳ２を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号２５と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、配列番号２５と比較して、１０以下のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質はＡＣＥ２に結合する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＶＬＰと、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、又はアジュバントとを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントはイミキモドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードルによる注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、ワクチンは糖ガラスとして製剤化される。いくつかの実施形態は、ワクチンをそれを必要とする対象に投与することを含むワクチン接種方法を含む。

【0016】

特定の実施形態では、内面及び外面を有する脂質二重層を含む合成脂質小胞と、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含むｓｅＶＬＰが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、脂質小胞の外面に提示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、脂質小胞の内面に提示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、注射用の糖ガラスとして製剤化される。

【0017】

特定の実施形態では、内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成ナノディスクと、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質とを含むｓｍＶＬＰが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５～２００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、両親媒性のドーナツ形状ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマー、スチレンマレイン酸脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）、ＤＩＢＭＡコポリマー、又はＡｐｏＡのアルファヘリックスの非免疫原性模倣ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１又はＳ２スパイクタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは、注射用の糖ガラスとして製剤化される。

【0018】

本主題の特徴及び利点のより良い理解は、例示的な実施形態及び添付の図面を記載する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】抗原のいくつかの例の図である。

【0020】

【図2】抗原を調製するための方法の一例を示すフロー図である。

【0021】

【図3】いくつかの実施形態による抗原精製に関連するデータを示すチャートである。

【0022】

【図4】いくつかの実施形態による溶出した抗原を示すウエスタンブロット画像である。

【0023】

【図5】いくつかのリポソームのサイズ及び体積を示す表及びチャートを含む図である。

【0024】

【図6】いくつかの実施形態によるリポソーム調製に関するデータを示すチャートを含む図である。

【0025】

【図7】いくつかのマイクロニードルの拡大画像である。

【0026】

【図8】いくつかの実施形態によるＥＬＩＳＡデータを示すチャートである。

【0027】

【図9】マイクロニードルデバイスの一例の画像を含む図である。

【0028】

【図10】ＶａｘｉＰａｔｃｈの一例の概略図である。

【0029】

【図11】本明細書に記載のワクチンを含むキットの一例の正面及び背面を示す画像である。

【0030】

【図12】マイクロニードルデバイスを作製するための例示的なプロセスにおけるプリントアレイの曲げ治具への挿入を示す画像である。

【0031】

【図13】マイクロニードルデバイスを作製するための例示的なプロセスにおいて支持材料に取り付けられた金属スナップアプリケータを示す画像である。

【0032】

【図14】ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）ワクチン接種の問題に対処するための例示的な３方面からなる手法を示す図である。

【0033】

【図15A】マイクロニードルアレイの例示的なシートを示す図である。

【図15B】マイクロニードルアレイの例示的なシートを示す図である。

【0034】

【図16】ワクチン充填マイクロアレイの一例を示す図である。

【0035】

【図17】ヒト対象における５分のＶａｘｉＰａｔｃｈ色素送達の一例を示す図である。

【0036】

【図18】ラットにおけるＶａｘｉＰａｔｃｈ色素送達の一例を示す図である。

【0037】

【図19】ＩｇＧタイムコースによるＶａｘｉＰａｔｃｈラットＥＬＩＳＡ力価を示す図である。

【0038】

【図20】Ｂ／コロラド２０１７に対するＶａｘｉＰａｔｃｈのＥＬＩＳＡによる力価を示す図である。

【0039】

【図21】Ｂ／コロラド２０１７に対する赤血球凝集阻害力価のドットプロットを示す図である。

【0040】

【図22】ＨＡＩデータの棒グラフを示す図である。

【0041】

【図23】抗原研究のＶａｘｉＰａｔｃｈ ＶＭＬＰ加速安定性を示す図である。

【0042】

【図24】ＣＯＧＳが業界平均より低いことを示す図である。

【0043】

【図25】エンベロープ糖タンパク質サブユニットワクチンを含む例示的なチャートを示す図である。

【0044】

【図26】ワクチンパイプラインのイントロダクションを示す図である。

【0045】

【図27】ＥｘｐｉＣＨＯにおける例示的なＣＯＶＩＤ－Ｓ発現を示す図である。

【0046】

【図28】組換えＣＯＶＩＤ－Ｓタンパク質についての同一性を確認する例示的なＣＯＶＩＤスパイクウエスタンブロットを示す図である。

【0047】

【図29】ＣＯＶＩＤ－ＳのＩＭＡＣ精製の溶出プロファイルによる全長スパイク精製を示す図である。

【0048】

【図30】ＣＯＶＩＤ－１９スパイクレンチウイルス偽型構築物を示す図である。

【0049】

【図31】精製からの試料を示す例示的なクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す図である。

【0050】

【図32】ＡＣＥ－２試料の活性レベルの一例を示す図である。

【0051】

【図33】この実験のデータの例示的な線形回帰を示す図である。

【0052】

【図34】ＶｒＳ０１が４つの異なる濃度にわたって２５０ｎｇのＡＣＥ－２に結合する能力の試験からの例示的な標準曲線を示す図である。

【0053】

【図35A】ＶｒＳ０１の安定性を異なる温度で試験した例示的な実験の結果を示す図である。

【0054】

【図35B】吸光度値の変換に基づいて決定された残存する効力のあるＶｒＳ０１の量を示す図である。

【0055】

【図36】「プリントミックス」ＶＭＬＰの例示的な線形回帰を示す図である。

【0056】

【図37】異なるｐＨレベルにおけるＡＣＥ－２結合を示すグラフの図である。

【0057】

【図38】平均吸光度のプロットを有する棒グラフを示す図である。

【0058】

【図39】本構築物（ＶｒＳ０１）の概略図である。

【0059】

【図40】ＳＤラットにおけるＶｒＳ０１に対する特異的ＩｇＧ応答を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0060】

特定の実施形態では、（ａ）内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成脂質小胞と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合した抗原とを含むｓｅＶＬＰが本明細書に開示される。また、特定の実施形態では、内面及び外面を含む、合成、半合成又は天然の脂質二重層を含むナノディスクと、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合した抗原とを含むｓｍＶＬＰが本明細書に開示される。特定の実施形態では、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰを含むワクチン、並びにそれらの使用及び製造方法が本明細書に開示される。

【0061】

本明細書に記載のいくつかのワクチンの利点は、それらが従来のワクチン又は市販のワクチンよりも費用対効果が高く安全であることである。市販されているいくつかの予防ウイルスワクチンは、不活化ウイルス又は弱毒ウイルスに基づいている。ホルマリン不活化又は不活化ポリオ、（Ｉｐｏｌ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）及びインフルエンザ（ｆｌｕ）（Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）、Ｓｅｑｉｒｉｓ；Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）ワクチンは不活化ウイルスワクチンの例であり、一方、弱毒生麻疹、流行性耳下腺炎及び風疹（ＭＭＲ－ＩＩ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）ワクチンは弱毒生ウイルスワクチンの例である。

【0062】

Ｉ．概要
本明細書に記載のＶＬＰは、従来のワクチンよりも費用対効果が高いか、より安全であるか、又は作製がより迅速なワクチンを提供する必要性を満たすために開発された。ＶＬＰは、それらの親ウイルスに似た非感染性粒子である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、それらの親ウイルスの抗原を有するか、又はそれらの親ウイルスに類似する抗原を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰの抗原性タンパク質は、組換えＤＮＡ法によって細菌、酵母、昆虫、植物又は哺乳動物の発現系で産生される。安全性以外で、いくつかのＶＬＰの別の利点は、それらがＴＬＲ等の病原体関連分子パターン認識受容体（ＰＡＭＰ）によって、他のワクチンよりもより容易に認識される構造アレイで抗原性タンパク質を提示することである。このようにして、いくつかの実施形態では、ＶＬＰは抗原性タンパク質に対するアジュバントとなる。結果として、いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、それらが構成されている個々の可溶性タンパク質よりも免疫原性が高い。

【0063】

いくつかの非エンベロープＶＬＰワクチンは、Ｂ型肝炎ワクチン（酵母及びＨＰＶで産生されるＥｎｇｅｒｉｘ－Ｂ（登録商標）、ＧＳＫ；それぞれ酵母及び昆虫細胞で産生されるＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９、Ｍｅｒｃｋ、Ｃｅｖａｒｉｘ（登録商標）、ＧＳＫ）を含み、これらのワクチンは、単一のタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢｓＡｇ及び空の正二十面体カプシドシェルを自発的に形成するＨＰＶのＬ１を有する。いくつかの追加の非エンベロープＶＬＰワクチンは、Ｅ．コリで産生されるＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）（Ｈｅｒｃｏｌｉｎ１（登録商標），Ｘｉａｍｅｎ Ｉｎｎｏｖａｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｃｈｉｎａ）、昆虫細胞で産生されるマラリア（Ｍｏｓｑｕｉｒｉｘ（登録商標），ＧＳＫ）、及び２つの第二世代Ｂ型肝炎ワクチン（Ｓｃｉ－Ｂ－Ｖａｃ（登録商標），ＶＢＩ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．及びＨＥＰＬＩＳＡＶ－Ｂ（登録商標），Ｄｙｎａｖａｘ）を含む。

【0064】

いくつかのＶＬＰはエンベロープされている（ｅＶＬＰ）。ｅＶＬＰは、それらが産生される発現系に由来する脂質並びに親ウイルス由来の免疫原性タンパク質のうちの１つ以上を含有するという点で、非エンベロープＶＬＰよりも複雑である。このようなｅＶＬＰは、それらの宿主細胞の出芽からそれらの脂質膜を得る。例えば、そのようなｅＶＬＰは、ＨＩＶ、インフルエンザ、Ｃｈｉｃｋｕｎｇｕｎｙａ、ＳＡＲＳ、ニパ、エボラ、デング熱、リフトバレー熱及びラッサウイルスに対するものであった。これらのｅＶＬＰは、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び植物において産生された。しかし、これらのｅＶＬＰワクチンはいずれも商業生産に到達していない。

【0065】

問題により、ｅＶＬＰ及び他のワクチンの商業的使用が阻まれた。例えば、市販のｅＶＬＰワクチンは、インフルエンザワクチンであるＩｎｆｌｅｘａｌ（登録商標）である。Ｉｎｆｌｅｘａｌを製造するために、インフルエンザウイルスをニワトリの卵で増殖させる。ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイロアミニダーゼ（ＮＡ）糖タンパク質を含有するビリオンを界面活性剤オクタエチレングリコールモノ（ｎ－ドデシル）エーテルで可溶化し、ヌクレオカプシドを遠心分離によって除去し、得られた未定義の粗製上清混合物に追加の外部リン脂質を１０％補充した。これらのｅＶＬＰは、界面活性剤の混合及び除去によって製造された。Ｉｎｆｌｅｘａｌは１９９７年に欧州市場に導入された。Ｉｎｆｌｅｘａｌに関しては、商品のコストが問題であった。２０１２年に、汚染されたＩｎｆｌｅｘａｌの２つのロットがスイスからイタリアに出荷され、Ｉｎｆｌｅｘａｌの製造は終了した。これらのｅＶＬＰは、卵由来のタンパク質及び脂質汚染物質、未定義の比のインフルエンザＨＡ及びＮＡ、並びに未知の量のインフルエンザＭ２を含んでいた。ｅＶＬＰを製造する混合プロセス及び界面活性剤除去は十分に定義されておらず、汚染を導き、製造を終了させた。

【0066】

したがって、既存のｅＶＬＰは、それらの成功を制限する問題を有する。いくつかのｅＶＬＰは、脂質膜により単一タンパク質カプシドＶＬＰよりも安定性が低い。いくつかのｅＶＬＰは、産生細胞を出芽することによって形成されるため、発現系においてより低い収率で製造される。いくつかのｅＶＬＰは、発現系の細胞から出芽するプロセスで、ｅＶＬＰ内に封入された宿主細胞タンパク質によって汚染される。昆虫細胞系で製造されるいくつかのｅＶＬＰは、ほぼ同一のサイズ及び形態のバキュロウイルス粒子によって汚染される。いくつかのｅＶＬＰは精製が困難であり、スクロース勾配による超遠心分離を必要とすることが多い。本明細書に記載されるワクチンのいくつかの実施形態は、これらの問題の１つ以上を解決し、安全で、汚染物質を含まず、有効である改善されたワクチンに関して当技術分野で長年感じられてきた必要性に対する解決策を提供する。

【0067】

以前のワクチンは、卵に由来する他のタンパク質又は脂質が除去された完全合成小胞を含まなかった。合成エンベロープＶＬＰ又はワクチンの作製は、細胞から作製された現在のＶＬＰワクチンの未定義の性質の問題を解決する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンは迅速に開発又は製造されるが、以前のインフルエンザワクチンは、例えば、開発に非常に時間がかかるか、又は特定のインフルエンザシーズン中に完全に有効とするには非常に費用がかかった。

【0068】

Ａ型インフルエンザは、世界中で毎年最大５０万人の死亡の原因である。いくつかのサブタイプが一般にヒトにおいて広まっているが、いくつかの実施形態では、新しいサブタイプが、人獣共通感染によって常に導入される。いくつかの実施形態では、人獣共通感染は、Ｈ５Ｎ１又はＨ７Ｎ９を含む。季節性ワクチンは毎年更新されるが、これらの人獣共通伝染は予測不可能であり、ワクチンでは考慮されない。現在利用可能なワクチンは、（１）不活化ワクチンが堅牢な粘膜免疫応答を生成せず、（２）弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）は、過剰に弱毒化され、使用ガイドラインが制限されていることから、問題があるため、十分ではなく、野生型ウイルスとの再集合のリスクのために、季節性株には存在しないＨＡ及びＮＡサブタイプを有するＬＡＩＶを使用することができない。現在利用可能なワクチンは、特定の株に対して保護するように設計され、毎年再製剤化され、普遍的な保護を提供しない。鳥インフルエンザウイルスに対する、不活化及びＬＡＩＶの両方の特定のプレパンデミックワクチンは、さほど免疫原性ではない。人獣共通インフルエンザ感染症の流行を防ぐことを目的としたユニバーサルワクチンは、現在の季節性ワクチンを補うことができ、公衆衛生に有益であろう。いくつかの実施形態では、ユニバーサルワクチンは、全ての鳥サブタイプに対して、１６の鳥ＨＡサブタイプ（Ｈ１～Ｈ１６）に対して保護するか、又は流行の場合に迅速に製造される。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＮＡに対するＨＡの免疫優性の問題を回避するために、各々が単一のＡ型インフルエンザＨＡサブタイプ（又は単一のＮＡサブタイプ）を含有するインフルエンザｓｅＶＬＰの多価混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ａ型インフルエンザＮＡタンパク質を含有するｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰである。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、２つ以上の異なる抗原、例えばＡ型インフルエンザＮＡタンパク質及びＡ型インフルエンザマトリックスタンパク質、例えばＭ１、Ｍ２、若しくはその両方を含む。これらの多価ＶＬＰは、非感染性であり、安全であり、製造及び使用が容易である。いくつかの実施形態では、これらの多価ＶＬＰは、広く保護的な「ユニバーサル」プレパンデミックワクチン及びより広く反応性の季節性ワクチンを提供するために使用される。

【0070】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔内、筋肉内、皮内、全身、又は静脈内に送達されて、インフルエンザウイルスＨＡのヘッド（ｈｅａｄ）及びストーク（ｓｔａｌｋ）上の保存されたエピトープ並びにＮＡエピトープに対する広範な反応性免疫を誘発し、それによって広範囲のＡ型インフルエンザウイルスに対する防御を付与する。いくつかの実施形態では、ＨＡは抗原的に多様であるが、ＨＡ受容体結合ドメイン及びストークドメイン中の保存されたエピトープは、交差反応性ワクチンの製造を可能にする。

【0071】

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するサブユニットワクチンは、哺乳動物細胞株で組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現させ、タンパク質を精製し、膜結合粒子（ＶＭＬＰ）に製剤化することによって開発されて、デュアルアジュバント系と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、サブユニットワクチンの開発における態様は、ワクチンに使用される抗原の効力を決定することを含む。この目的のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然の細胞受容体標的、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）を、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で利用することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳがＡＣＥ－２に結合する能力をこのアッセイで定量化し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ効力の指標として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの安定性は、異なる貯蔵条件又は異なる製剤で経時的に測定される。

【0072】

いくつかの実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡの改変を、サブユニットワクチンが有効な免疫応答を誘発したかどうかの尺度として使用することもできる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＡＣＥ－２への結合を中和する抗体の能力は、防御免疫応答と相関することが本明細書で示される。結果として、本明細書に記載されるアッセイを使用して、人々をスクリーニングして、彼らがＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２中和抗体（ＮＡｂ）を有するかどうかを調べることができる。更に、ＮＡｂの量を測定し、ＣＯＶＩＤ－１９から人々を保護するために必要とされるＮＡｂのレベルと相関させることができる。現在、ＮＡｂは、生きているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＢＳＬ３を必要とし、変動係数（ＣＶ）が高い）、又はレポーター遺伝子を発現するＶＳＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質等の偽型ウイルス（ＢＳＬ２を必要とし、変動係数（ＣＶ）が高い）のいずれかによって生物学的に測定される。本明細書に記載される改善は、ＮＡｂ試験を低いＣＶを有する単純なＢＬＳ１定量的イムノアッセイに変える。様々な形式の市販のイムノアッセイが想定される。

【0073】

いくつかの実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡを開発するために、哺乳動物発現ベクターが、タンパク質の最初の７４０アミノ酸（配列番号１７）に対応するＡＣＥ－２の外部ドメイン（配列番号１８）を生成するよう依頼される。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィを使用してＡＣＥ－２を精製し、蛍光発生基質アッセイを使用してその酵素活性を保持しているかどうかを判定するために試験した。いくつかの実施形態では、高結合ＥＬＩＳＡプレートを一晩ＡＣＥ－２でコーティングし、ウシ血清アルブミンでブロックし、次いで異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓとインキュベートしてアッセイの線形範囲を決定した。いくつかの実施形態では、「インハウス（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）」ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（ＶｒＳ０１）を市販のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓと比較した。いくつかの実施形態では、ＡＣＥ－２への結合がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓに特異的であることを確実にするために、結合を「インハウス」ヘマグルチニンと比較した。いくつかの実施形態では、熱ストレス、ｐＨストレス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＳ１ドメインに対して産生された市販のポリクローナル抗体を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ／ＡＣＥ－２結合に影響を及ぼすそれらの能力について試験した。

【0074】

いくつかの実施形態では、精製組換えＡＣＥ－２を、ワクチン抗原としての組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの効力を試験するために使用されるサンドイッチＥＬＩＳＡの捕捉工程に使用することができる。これらの分子間の結合相互作用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳがｐＨ又は熱でストレスを受けた場合に破壊され、このアッセイがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの品質及び立体配座の変化に感受性を有することを示唆している。広範囲のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ濃度にわたってＡＣＥ－２との結合相互作用には線形関係があり、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓが膜結合粒子に組み込まれた場合、ＡＣＥ－２結合関係は線形のままであり、ワクチン製剤の他の成分によって阻害されない。同じ濃度でアッセイした場合、インフルエンザのＢ／コロラド’１７株由来のヘマグルチニンはＡＣＥ－２に結合しないため、ＡＣＥ－２への結合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓに特異的である。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＳ１サブユニットに対して産生された市販のポリクローナル抗体は、ＡＣＥ－２への結合を阻害し得る。したがって、ＡＣＥ－２結合に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの効力及び／又は安定性を決定する際の強力なツールであり、ワクチン接種個体からの血清が中和抗体を有するかどうかを判定する際の有用性を有する。いくつかのそのような実施形態の非限定的な例は、実施例１２～１６に含まれる。

【0075】

ＩＩ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記並びに他の技術的及び科学的用語又は学術用語は、特許請求される主題が属する技術分野の通常の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために、及び／又は容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書にそのような定義を含めることは、当技術分野で一般に理解されるものとの実質的な違いを表すものと必ずしも解釈されるべきではない。

【0076】

本明細書で使用される場合、ワクチンを対象に「投与する」ことは、ワクチンを対象と接するように与えること、適用すること、又はもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、投与は、多数の経路のいずれかによって達成される。いくつかの実施形態では、投与は、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内又は皮内経路によって達成される。

【0077】

本明細書で使用される場合、「抗体」は、いくつかの実施形態では、特定のアミノ酸配列を有するＢリンパ球様細胞によって産生される免疫グロブリン分子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、抗体結合断片を含むか、又は抗体結合断片からなる。いくつかの実施形態では、抗体結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、又はＦｃ配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、抗体はヒトＩｇＧを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、特定の抗原（ＨＡ及びＮＡ等の免疫原）によってヒト又は他の動物において誘発される。抗体は、いくつかの実施形態では、いくつかの実証可能な方法で抗原と特異的に反応することを特徴とし、抗体及び抗原はそれぞれ他方に関して定義されている。「抗体応答を誘発する」は、いくつかの実施形態では、抗原又は他の分子が抗体の産生を誘導する能力を指す。

【0078】

いくつかの実施形態では、「抗原」又は「免疫原」は、動物に注射又は吸収される組成物を含む、動物における抗体の産生又はＴ細胞応答を刺激する化合物、組成物又は物質を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特定の体液性又は細胞性免疫の産物と反応する。開示される組成物及び方法のいくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、又はその両方である。本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、いくつかの実施形態では、抗原を含むワクチン（異なるインフルエンザＨＡタンパク質を有する複数のｓｅＶＬＰ等）である。

【0079】

「免疫応答」は、いくつかの実施形態では、抗原又はワクチン（Ａ型若しくはＢ型インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡタンパク質等）等の刺激に対する、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ又は多形核球等の免疫系の細胞の応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫応答は、例えばインターフェロン又はサイトカインを分泌する上皮細胞を含む、宿主防御応答に関与する身体の任意の細胞を含む。免疫応答は、自然免疫応答又は炎症を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、防御免疫応答は、対象を感染症から保護する（感染症を防止する、又は感染症に関連する疾患の発症を防止する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は当技術分野で周知であり、例えば、リンパ球（Ｂ又はＴ細胞等）の増殖及び／又は活性、サイトカイン又はケモカインの分泌、炎症、抗体産生等を測定することを含む。

【0080】

「単離された」生物学的成分（核酸、タンパク質、ＶＬＰ、又はウイルス等）は、いくつかの実施形態では、他の生物学的成分（細胞片、又は他のタンパク質若しくは核酸等）から実質的に分離又は精製されている。いくつかの実施形態では、「単離された」生物学的成分は、標準的な精製方法によって精製された成分を含む。この用語はまた、いくつかの実施形態では、組換え核酸、タンパク質、ウイルス及びＶＬＰ、並びに化学合成された核酸又はペプチドを包含する。

【0081】

いくつかの実施形態では、「精製された」という用語は、絶対的純粋性を必要とせず、むしろ相対的な用語として意図されている。いくつかの実施形態では、精製されたタンパク質、ウイルス、ＶＬＰ又は他の化合物は、天然に関連するタンパク質及び他の汚染物質から全体的又は部分的に単離されたものである。いくつかの実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、又は他の粗製調製物から単離され、初期調製物の様々な成分、例えばタンパク質、細胞片及び他の成分を除去するために分別された、タンパク質、ウイルス、ＶＬＰ又は他の活性化合物を指す。いくつかの実施形態では、単離又は精製された生物学的成分、タンパク質、ウイルス、ＶＬＰ又は他の化合物は、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％、若しくは０．０００００１％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲の汚染物質を有する、又は含む。いくつかの実施形態では、単離又は精製された生物学的成分、タンパク質、ウイルス、ＶＬＰ又は他の化合物は、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％、０．００００５％、０．００００１％、０．０００００５％又は０．０００００１％未満の汚染物質を有する、又は含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、「脂質」は、天然に存在する、半合成、及び完全合成の脂質を含む。ＶＬＰを製造するために使用される脂質のいくつかの例は、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩））、コレステロール、並びにそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態は、１０：４．２５：３：１：３の比で混合された、ホスファチジルコリン（５０ｍｇ／ｍｌ）、コレステロール（２０ｍｇ／ｍｌ）、ホスファチジルエタノールアミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ホスファチジルセリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、スフィンゴミエリン（２０ｍｇ／ｍｌ）及びホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）を含むもの等の混合物を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と「作動可能に連結される」。いくつかの実施形態では、プロモータがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモータはコード配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質コード領域を同じ読み枠に連結する必要がある場合、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続している。

【0084】

アミノ酸又は核酸配列間の類似性は、場合によっては、配列間の類似性に関して表され、そうでなければ「配列同一性」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、配列同一性は、同一性（又は類似性若しくは相同性）の百分率に関して測定され、例えば、百分率が高いほど、２つの配列はより類似している。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子又はタンパク質の相同体又は変異体は、標準的な方法を使用して整列させた場合、比較的高程度の配列同一性を有する。

【0085】

いくつかの実施形態では、「治療有効量」は、薬剤で治療されている対象において所望の効果を達成するのに十分な特定の薬剤の量を指す。いくつかの実施形態では、これは、対象において免疫応答を誘発するため、及び／又はインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染症又は疾患を予防するために有用なワクチン又はＶＬＰの量である。いくつかの実施形態では、ワクチンの治療有効量は、対象において実質的な細胞傷害効果を引き起こすことなく、対象においてインフルエンザウイルス（Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、又はその両方等）によって引き起こされる感染症に対する耐性を増加させ、感染症を予防し、改善し、及び／又は治療するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、対象における感染症に対する耐性を増加させ、予防し、改善し、及び／又は治療するのに有用なワクチンの有効量は、例えば、治療されている対象、治療用組成物の投与様式及びアジュバント等の他の因子に依存するであろう。

【0086】

いくつかの実施形態では、「ワクチン」は、感染性疾患等の疾患の予防、改善、又は治療のために投与される、免疫応答を刺激することができる免疫原性物質の調製物を指すか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性物質は、本明細書に開示されるＶＬＰである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、予防的（防止的）応答及び治療的応答の両方を誘発する。いくつかの実施形態では、投与方法は、ワクチンに従って変化するか、あるいは接種、摂取、鼻腔内、皮内、又は他の投与形態を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、免疫応答を増強するためにアジュバントと共に投与される。

【0087】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１つ以上のウイルス構造タンパク質で構成されるがウイルスゲノムを欠くウイルスに似たエンベロープ構造を指すか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはウイルスゲノムを欠き、非感染性である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、非エンベロープ及びｅＶＬＰに分けられる。いくつかの実施形態では、エンベロープＶＬＰは脂質膜を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、適切に折り畳まれた機能性抗原を提示する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、上皮細胞又は赤血球上の受容体に結合するＨＡを提示する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはＮＡを提示し、シアル酸を切り離す酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、合成エンベロープＶＬＰ（ｓｅＶＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、ＨＡ又はＮＡタンパク質を提示するか、あるいは含み、出芽及び宿主細胞からの粒子の放出を駆動するウイルスコアタンパク質（インフルエンザＭ１、Ｍ２又は両方等）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはｓｍＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰはナノディスクを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、第１の面及び第２の面を含む合成、半合成又は天然の脂質二重層と、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合した抗原と、を含む。

【0088】

本出願を通して、様々な実施形態が範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１～６等の範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0089】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。いくつかの実施形態では、「試料」という用語は、それらの混合物を含む複数の試料を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、「対象」は、発現した遺伝物質を含有する生物学的実体である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

【0091】

本明細書で使用される場合、「約」数という用語は、その数の±１０％を指す。「約」範囲という用語は、その範囲の最低値のマイナス１０％及び最大値のプラス１０％を指す。

【0092】

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、いくつかの実施形態では、レシピエントにおいて有益又は所望の結果を得るための医薬レジメンに関して使用される。有益又は所望の結果には、治療的利益及び／又は予防的利益が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、治療上の利益は、治療されている症状又は根底にある障害の根絶又は改善を指す。いくつかの実施形態では、治療上の利益は、対象が依然として根底にある障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、根底にある障害に関連する生理学的症状の１つ以上が根絶するか、又は改善して、対象において改善が観察されることによって達成される。いくつかの実施形態では、予防効果は、疾患若しくは状態の出現を遅延させるか、予防するか、若しくは排除するか、疾患若しくは状態の症状の発症を遅延させるか、若しくは排除するか、疾患若しくは状態の進行を遅らせるか、停止させるか、若しくは逆転させるか、又はそれらの任意の組合わせを含む。いくつかの実施形態では、予防的利益のために、疾患の診断がなされていなくても、特定の疾患を発症するリスクがある対象、又は疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象が治療を受ける。いくつかの実施形態では、治療上の利益は、疾患に対する免疫化を含む。

【0093】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためだけであり、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0094】

ＩＩＩ．ＳＥＶＬＰ及びＳＭＶＬＰ
特定の実施形態では、（ａ）内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成脂質小胞と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合した抗原と、を含むか、又はそれからなる合成エンベロープＶＬＰ（ｓｅＶＬＰ）が本明細書に開示される。特定の実施形態では、第１の面及び第２の面を含む合成、半合成又は天然の脂質二重層を含むナノディスクと、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合した抗原と、を含むｓｍＶＬＰも本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰＳは室温で安定である。いくつかの実施形態では、脂質二重層は合成である。いくつかの実施形態では、脂質二重層は半合成である。いくつかの実施形態では、脂質二重層は天然又は非合成である。いくつかの実施形態では、脂質二重層は合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は半合成であり、天然又は非合成脂質、及び合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層は天然脂質を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、抗原は、精製された組換えタンパク質を使用して作製される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は培養細胞から産生される。いくつかの実施形態では、培養細胞は、抗原をコードする核酸を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）は、定義された脂質と混合された定義された精製組換えタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、化学的に定義された完全合成ｓｅＶＬＰを含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、膜に埋め込まれた抗原タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、膜に埋め込まれた本明細書に記載のアンカー分子を含む抗原タンパク質を含有する。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、膜アンカードメインによって膜に埋め込まれた抗原タンパク質を含み、一方、ｓｅＶＬＰの表面は、目的の抗原タンパク質の親水性ドメインで装飾されている。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、単一のｓｅＶＬＰ中に抗原の組合わせを含む。いくつかの実施形態では、異なるｓｅＶＬＰを一緒に混合して単一のワクチンとする。

【0097】

いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、抗原のタンパク質親油性膜貫通ドメインによって適所に固定された抗原を含み、一方抗原の親水性ドメインは脂質膜の内面及び外面の両方に提示される。いくつかの実施形態では、膜の脂質は免疫応答を増強するのに役立ち、抗原を提示することは、また免疫応答を増強するための構造化された秩序配列である。いくつかの実施形態では、抗原は、その天然の三次元立体配座をｓｅＶＬＰ又はリポソーム内に保持する。

【0098】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ｓｍＶＬＰを含むか、又はｓｍＶＬＰからなる。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰはディスクを含む。いくつかの実施形態では、ディスクはナノディスクである。いくつかの実施形態では、ナノディスクは膜を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスク又は膜は、合成、半合成又は天然の脂質二重層を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層の脂質は、疎水性脂肪族側鎖を含む。いくつかの実施形態では、脂質二重層の脂質は親水性ヘッドを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、第１の面及び第２の面を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の面の各々は平坦である。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の面の各々は、脂質二重層に埋め込まれた抗原を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクはエッジを含む。いくつかの実施形態では、エッジは円形である。いくつかの実施形態では、エッジは外周を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ドーナツ形状、円盤形状、又はコイン形状である。

【0099】

いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマーから作製されるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーは両親媒性である。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーはナノディスクの外周又はエッジに巻き付く。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーは、ナノディスクの外周又はエッジの周りにドーナツ形状を形成する。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、スチレン－マレイン酸脂質粒子（ＳＭＡＬＰ）から作製されるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは両親媒性である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは、ナノディスクの外周又はエッジの周りに巻き付く。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは、ナノディスクの外周又はエッジの周りにドーナツ形状を形成する。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは、ＳＭＡＬＰ ２５０１０Ｐ、ＳＭＡＬＰ ３００１０Ｐ、及び／又はＳＭＡＬＰ ４０００５Ｐ（例えば、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｌｅｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ製）を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ＰＭＡコポリマー及びＳＭＡＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクはＳＭＡＬＰＳを含まない。いくつかの実施形態では、ナノディスクはＰＭＡコポリマーを含まない。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、膜足場タンパク質（ＭＳＰＳ）又は両親媒性ＭＳＰＳを含まない。いくつかの実施形態では、ナノディスクはアポリポタンパク質Ａ－１（ＡｐｏＡ）を含まない。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ＡｐｏＡの反復アルファヘリックスドメインに由来する非免疫原性の２２のアミノ酸模倣ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクはヒト使用のために製剤化される。いくつかの実施形態では、ＰＭＡコポリマーは、ナノディスクをヒト使用に適したものにする利点を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＭＡは非毒性である。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは、ナノディスクをヒト使用に適したものにする利点を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは非毒性である。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ポリメタクリレートコポリマー（例えば、Ｎ－Ｃ４－５２－６．９）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＡは、低ｐＨ又は二価金属イオンの存在下で不安定である。

【0100】

いくつかの実施形態では、ナノディスクはＤＩＢＭＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ＤＩＢＭＡＡコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡコポリマーはドーナツ形状である。いくつかの実施形態では、ナノディスクは両親媒性ドーナツ形状ＤＩＢＭＡコポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは、スチレンを含まないか、又はスチレン非含有ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは、ＤＩＢＭＡ又はポリメタクリレートコポリマー（ＰＭＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡ又はＰＭＡはナノディスクを形成し、脂質アシル鎖に影響を及ぼすか、又はＳＭＡと比較して二価金属イオンに対する安定性が改善されている。

【0101】

いくつかの実施形態では、ナノディスク膜は、１つ以上の膜結合抗原タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、又は５００ｎＭの直径、あるいは前述の直径のいずれか２つによって定義される直径の範囲からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５～２００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５０～２００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、又は５００ｎＭ未満の直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、５、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、又は５００ｎＭ超の直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、５０ｎＭ未満の直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、５０ｎＭ超の直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは５０～１００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、１００～１５０ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは１５０～２００ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクは７５～１２５ｎＭの直径からなる。いくつかの実施形態では、直径は、ＶＬＰの脂質二重層の直径である。いくつかの実施形態では、直径は、ＶＬＰの外側エッジ上のドーナツ形状タンパク質の直径である。

【0102】

いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ナノディスクの脂質膜に埋め込まれた抗原（例えばインフルエンザＨＡ抗原）を有する５０ｎＭ超の直径からなる。いくつかの実施形態では、ナノディスクはエンベロープ又は脂質エンベロープを含まない。いくつかの実施形態では、ナノディスクは単一の抗原又はアンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは大きなナノディスクを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、複数の抗原及び／又はアンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、ナノディスク又は大きなナノディスクは、一連の抗原を埋め込む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、複数のｓｍＶＬＰ又は多価ｓｍＶＬＰを含むワクチンの成分である。いくつかの実施形態では、脂質二重層の第１の面は、第１のアンカー分子及び／又は第１の抗原を含み、脂質二重層の第２の面は、第２のアンカー分子及び／又は第２の抗原を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、ナノディスクは、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合した抗原と、を含む。いくつかの実施形態では、抗原は脂質二重層に直接埋め込まれる。

【0104】

Ａ．脂質小胞
いくつかの実施形態では、脂質小胞は、ホスファチジルコリン種等の第１の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、ホスファチジルエタノールアミン種等の第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、第１の脂質及び第２の脂質を所定の比で含む。いくつかの実施形態では、所定の比は、１：０．２５～１：４である。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、１：０．２５～１：４の所定の比で第１の脂質及び第２の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、本明細書に記載されるようなｓｅＶＬＰの一部である。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の第１の脂質、第２の脂質、及び／又は第３の脂質を有するＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰの脂質（複数可）は、脂質小胞を形成しない。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは脂質小胞を含まない。

【0105】

いくつかの実施形態では、第１の脂質及び／又は第２の脂質はそれぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれを超える炭素原子、あるいは前述の数字のいずれか２つによって定義される範囲の炭素原子を含むアシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質及び／又は第２の脂質はそれぞれ、４～１８の炭素原子を含むアシル鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質及び／又は第２の脂質はそれぞれ、４以下の不飽和結合を含む。いくつかの実施形態では、第１の脂質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以下の不飽和結合、又は前述の数のいずれか２つによって定義される範囲の不飽和結合を含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以下の不飽和結合、又は前述の数のいずれか２つによって定義される範囲の不飽和結合を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、脂質小胞の第１の脂質及び／又は第２の脂質は、精製された脂質を含むか又は精製された脂質からなる。いくつかの実施形態では、精製された脂質は、少なくとも７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲で、純粋である。いくつかの実施形態では、精製された脂質は少なくとも９９％純粋である。

【0107】

いくつかの実施形態では、第１の脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＤＯＰＣ又はＤＯＰＥ等の１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはコレステロールを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＤＳＰＥ－ｐｅｇ２０００（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホホエタノアミン－Ｎ［アミノ（ポリエテレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、又は関連脂質を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、脂質小胞はステロール又はステロール誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ステロール又はステロール誘導体は、コレステロール又はＤＣ－コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、ステロール又はステロール誘導体を、第１の脂質及び／又は第２の脂質に対して、０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｍｏｌ％の比で、あるいは前述のモルモル百分率のいずれか２つによって定義される範囲で含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞は、第１の脂質及び／又は第２の脂質に対して０～３０ｍｏｌ％の比でステロール又はステロール誘導体を含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、脂質小胞、脂質小胞の第１の脂質、及び／又は脂質小胞の第２の脂質は合成である。いくつかの実施形態では、脂質小胞、脂質小胞の第１の脂質、及び／又は脂質小胞の第２の脂質は天然脂質である。いくつかの実施形態では、脂質小胞、脂質小胞の第１の脂質、及び／又は脂質小胞の第２の脂質は、天然及び合成の脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞、脂質小胞の第１の脂質、及び／又は脂質小胞の第２の脂質は、生物学的物質を含まないか、又は実質的に含まない。

【0110】

Ｂ．抗原
いくつかの実施形態では、脂質小胞は外面を含み、抗原は脂質小胞の外面上に提示される。いくつかの実施形態では、脂質小胞は内面を含み、抗原は脂質小胞の内面上に提示される。

【0111】

いくつかの実施形態では、抗原は、細菌、酵母、植物、昆虫細胞又は哺乳動物細胞で産生される。いくつかの実施形態では、抗原は精製された抗原であるか、精製された抗原からなるか、又は精製された抗原を含む。いくつかの実施形態では、精製された抗原は、少なくとも７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲で、純粋である。いくつかの実施形態では、精製された抗原は少なくとも９９％純粋である。いくつかの実施形態では、抗原は、１つ以上の脂質と混合される前に精製される。

【0112】

いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載の膜アンカーに直接結合する。いくつかの実施形態では、抗原は膜アンカーを含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、抗原は、ヘキサヒスチジンタグ又はＦＬＡＧタグ等のタグを含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）は、呼吸器合胞体ウイルス、水痘、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、エボラ、ニパ、デング熱、リフトバレー熱、狂犬病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ラッサ熱及びマールブルグウイルス等の膜貫通抗原を含む。いくつかの実施形態の合成的性質は、定義された脂質を定義されたタンパク質と組み合わせ、いくつかの例では目的の任意の抗原に延長する技術を教示する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、本明細書に記載のコロナウイルス抗原等のコロナウイルス抗原を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、抗原は病原体抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、病原体のタンパク質又は成分である。いくつかの実施形態では、病原体はウイルス又は寄生生物である。ＶＬＰ標的のウイルス及び寄生生物の種類の非限定的な例は、いくつかの実施形態では、レンチウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、コロナウイルス、パラミクソウイルス、ＨＰＶ、ヘルペスウイルス、Ｃ型肝炎（ＨｅｐＣ）ウイルス、プラスモジウム寄生生物、又はトリパノソーマ寄生生物を含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、抗原は、癌関連ペプチド若しくは抗原、又はそれらの断片である。癌関連抗原の例には、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、ＧＭ２、Ｔｎ、ｓＴｎ、ＴＦ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、Ｌｅ（ｙ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、癌胎児性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータ鎖（ｈＣＧベータ）、Ｃ３５、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＫＳＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ－１、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥ、及び関連タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。

【0117】

いくつかの実施形態では、抗原は、細菌ペプチド若しくは抗原、又はそれらの断片である。細菌抗原の例には、アクチノミセス抗原（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ）、バチルス抗原（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）からの免疫原性抗原、バクテロイド抗原（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボルデテラ抗原（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、バルトネラ抗原（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ボレリア抗原（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｂ．ブルグドフェリＯｓｐＡ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ抗原（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、カンピロバクター抗原（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、キャプノサイトファーガ抗原（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クラミジア抗原（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クロストリジウム抗原（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム抗原（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、コクシエラ抗原（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、デルマトフィルス抗原（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エンテロコッカス抗原（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エーリキア抗原（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エシェリキア抗原（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フランキセラ抗原（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、フゾバクテリウム抗原（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモバルトネラ抗原（Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ヘモフィルス抗原（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｈ．Ｂ型インフルエンザ型外膜タンパク質、ヘリコバクター抗原（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、クレブシエラ抗原（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、Ｌ型菌抗原、レプトスピア抗原（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リステリア抗原（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコバクテリア抗原（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、マイコプラズマ抗原（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ナイセリア抗原（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ネオリケッリア抗原（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ノカルジア抗原（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、パスツレラ抗原（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ペプトストレプトコッカス抗原（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肺炎球菌抗原（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、プロテウス抗原（Ｐｒｏｔｅｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シュードモナス抗原（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リケッチア抗原（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ロシャリメア抗原（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、サルモネラ抗原（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、シゲラ抗原（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、スタフィロコッカス抗原（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ストレプトコッカス抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｓ．ピオゲネスＭタンパク質（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、トレポネーマ抗原（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）及びエルシニア抗原（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、例えば、Ｙ．ペストＦ１（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ Ｆ１）及びＶ抗原（Ｖ ａｎｔｉｇｅｎｓ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0118】

いくつかの実施形態では、抗原は、真菌ペプチド若しくは抗原、又はそれらの断片である。寄生性抗原の例には、大腸バランチニウム抗原（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エントアメーバ・ヒストリチカ抗原（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肝蛭抗原（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ランブル鞭毛虫抗原（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リーシュマニア抗原（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びプラスモジウム抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）（例えば熱帯熱マラリア原虫抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ））が含まれるが、これらに限定されない。

【0119】

いくつかの実施形態では、抗原は、寄生性ペプチド若しくは抗原、又はそれらの断片である。寄生生物の例には、大腸バランチニウム抗原（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、エントアメーバ・ヒストリチカ抗原（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、肝蛭抗原（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、ランブル鞭毛虫抗原（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、リーシュマニア抗原（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ａｎｔｉｇｅｎｓ）、及びプラスモジウム抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ）（例えば熱帯熱マラリア原虫抗原（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｎｔｉｇｅｎｓ））が含まれるが、これらに限定されない。

【0120】

いくつかの実施形態では、抗原は、ウイルスペプチド若しくは抗原、又はそれらの断片である。ウイルス抗原性及び免疫原性抗原の例には、アデノウイルス抗原、アルファウイルス抗原、カリシウイルス抗原、例えばカリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肝炎ウイルス（Ａ～Ｅ）抗原、例えばＢ型肝炎コア又は表面抗原、ヘルペスウイルス抗原、例えば単純ヘルペスウイルス又は水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルス抗原、例えばヒト免疫不全ウイルスエンベロープ又はプロテアーゼ、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、例えばＡ型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ又は核タンパク質、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルソミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、例えばヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルス抗原、パルボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、例えばポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルス抗原、例えばワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルス抗原、例えば狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、及びロタウイルス抗原が含まれるが、これらに限定されない。

【0121】

レンチウイルスの場合、抗原は、いくつかの実施形態ではＨＩＶ抗原又はタンパク質である。フラビウイルスの場合、抗原は、いくつかの実施形態では、デングウイルス、ジカウイルス、又は西ナイルウイルスの抗原又はタンパク質である。フィロウイルスの場合、抗原は、いくつかの実施形態では、エボラウイルス、マールブルグウイルス、又は狂犬病ウイルスの抗原又はタンパク質である。コロナウイルスの場合、抗原は、いくつかの実施形態では、ＭＥＲＳウイルス又はＳＡＲＳウイルスの抗原又はタンパク質である。パラミクソウイルスの場合、抗原は、いくつかの実施形態では、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）又はニパウイルスの抗原又はタンパク質である。マラリア原虫の場合、抗原は、いくつかの実施形態では、プラスモジウム寄生生物抗原又はタンパク質である。トリパノソーマ寄生生物の場合、抗原は、いくつかの実施形態では、シャガス寄生生物、睡眠病寄生生物、又はリーシュマニア症寄生生物の抗原又はタンパク質である。

【0122】

適切な抗原のいくつかの非限定的な例は、エンベロープウイルスの表面タンパク質及び糖タンパク質（ＧＰ）等の糖タンパク質、例えばＨＩＶのＧａｇ及び／又はＥｎｖ、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ及び／又はＭ２タンパク質、チクングニアのＣ、Ｅ３、Ｅ２、６ｋ及び／又はＥ１タンパク質、ＳＡＲＳのＳ、Ｅ、Ｍ及び／又はＮタンパク質、ニパのＭ、Ｇ、Ｆタンパク質、エボラのＶ４０、ＧＰ、ＮＰタンパク質、デングのｐｒＭ及びＥタンパク質、リフトバレー熱ウイルスのＧｎ、Ｇｃ又はＮＰタンパク質、あるいはラッサ熱ウイルスのＧＰＣ、ＮＰ又はＺタンパク質を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザＨＡの膜アンカードメインに融合したＨＰＶのＬ２タンパク質等の非膜タンパク質に融合した膜アンカードメイン等の膜アンカーを含有するか、又は含むハイブリッドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、ＭＵＣ、ＨＰＶ Ｅ６及び／又はＥ７、ＭＡＧＥ－Ａ３、又はＣＥＡ等の任意の数の腫瘍関連抗原であるか、あるいはそれらを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、抗原は、任意のエンベロープウイルスの糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載されるようなｓｅＶＬＰを形成する脂質含有構造体の外側表面に付着する。いくつかの実施形態では、抗原はｓｍＶＬＰの側面に付着する。

【0125】

いくつかの実施形態では、抗原はタンパク質融合物を含む。いくつかの実施形態では、抗原は膜アンカードメインに融合される。

【0126】

いくつかの実施形態では、抗原は、膜アンカーを含有するキャリアタンパク質に化学的に結合した炭水化物抗原を含む。いくつかの実施形態では、抗原は膜アンカーを有さない。

【0127】

いくつかの実施形態では、抗原は融合タンパク質を含む。融合タンパク質のいくつかの実施形態では、抗原は、表面タンパク質又は表面糖タンパク質の膜貫通ドメインに融合される。例えば、ＨＰＶがいくつかの実施形態において使用される。ＨＰＶ感染症は、一部の子宮頸癌の前駆体である。いくつかのＨＰＶ ＶＬＰは免疫優性タンパク質Ｌ１、外カプシドタンパク質に基づくが、Ｌ１に基づくＨＰＶ ＶＬＰは株特異的である。Ｇａｒｄａｓｉｌ９（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）は、非エンベロープＶＬＰに集合する９つの異なるＬ１タンパク質から構成される。対照的に、Ｌ２タンパク質は、いくつかの実施形態では免疫原性が低いが、ＨＰＶ株の一般的な抗原である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶのＬ２タンパク質に基づくＶＬＰを作製するために、Ｌ２をインフルエンザＨＡの膜貫通ドメインに融合する。いくつかの実施形態では、これは、抗原がタンパク質のＮ末端にあり、ＨＡ膜貫通ドメインがタンパク質のＣ末端にある場合である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＨＰＶの通常は免疫原性が低いＬ２タンパク質の構造化及びパターン化されたアレイをもたらすであろう。いくつかの実施形態では、Ｌ２に基づくＨＰＶ ＶＬＰは、他のＨＰＶ株に対して保護すると予想されるであろう。いくつかの実施形態では、ＨＰＶのＥ６及びＥ７タンパク質の融合抗原を使用して、子宮頸癌を有する患者を治療するＶＬＰを作製する。

【0128】

１．インフルエンザ抗原
いくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザウイルス抗原、又はその変異体若しくは断片である。インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科ファミリに含まれる断片化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。３つの型のインフルエンザウイルス、Ａ、Ｂ及びＣが存在する。Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）は、例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１及びＰＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヘマグルチニン（サブユニットＨＡ１及びＨＡ２）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）及び非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）を含む、１１のタンパク質をコードする８つのＲＮＡ断片（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ及びＮＡ）を有するネガティブセンス一本鎖断片化ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、エラータンパク質ポリメラーゼ及び断片再集合によって急速に進化する傾向がある。Ａ型インフルエンザの宿主範囲は非常に多様であり、ヒト、鳥類（例えば、ニワトリ及び水鳥）、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、コウモリ、マウス、フェレット、ネコ、トラ、トラ、及びイヌを含む。動物において、ほとんどのＡ型インフルエンザウイルスは、呼吸器及び腸管の軽度の局所感染を引き起こす。いくつかの実施形態では、Ｈ５Ｎ１等の高病原性Ａ型インフルエンザ株は、家禽において全身感染症を引き起こし、死亡率が１００％に達する。いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザに感染した動物は、インフルエンザウイルスのリザーバとして作用し、特定のサブタイプは、ヒトに対する種の障壁を越える。

【0129】

いくつかの実施形態では、抗原は、Ａ型インフルエンザウイルス抗原、又はその変異体若しくは断片である。Ａ型インフルエンザウイルスは、表面糖タンパク質をコードする２つの遺伝子、すなわち、ウイルス付着及び細胞放出に必要とされるヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原領域における対立遺伝子変異に基づいてサブタイプに分類される。現在、１８の異なるＡ型インフルエンザウイルスＨＡ抗原サブタイプ（Ｈ１～Ｈ１８）及び１１の異なるＡ型インフルエンザウイルスＮＡ抗原サブタイプ（Ｎ１～Ｎ１１）が存在する。いくつかの実施形態では、１－Ｈ１６及びＮ１－Ｎ９は、野鳥宿主に見られ、ヒトに対する流行の脅威である。Ｈ１７～Ｈ１８及びＮ１０～Ｎ１１は、コウモリの宿主について記載されており、現在、ヒトに対する流行の脅威であるとは考えられていない。

【0130】

Ａ型インフルエンザの具体例には、Ｈ１Ｎ１（１９１８ Ｈ１Ｎ１等）、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ７、Ｈ２Ｎ２（１９５７ Ｈ２Ｎ２等）、Ｈ２Ｎ１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ５、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ２、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１１Ｎ１、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、及びＨ１４Ｎ５が含まれるが、これらに限定されない。一例において、Ａ型インフルエンザは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、及びＨ５Ｎ１等のヒトにおいて広まることが知られているものを含む。

【0131】

動物では、一部のＡ型インフルエンザウイルスは、哺乳動物の呼吸器及び／又は鳥類の腸管の自然治癒の局所感染症を引き起こす。いくつかの実施形態では、Ｈ５Ｎ１等の高病原性Ａ型インフルエンザ株は、家禽において全身感染症を引き起こし、死亡率が１００％に達する。２００９年には、Ｈ１Ｎ１インフルエンザがヒトインフルエンザの最も一般的な原因である。豚起源Ｈ１Ｎ１の新しい株が２００９年に出現し、世界保健機関によって流行が宣言されている。この株を「豚インフルエンザ」と呼ぶ。Ｈ１Ｎ１Ａ型インフルエンザウイルスはまた、１９１８年のスペインかぜの流行、１９７６年のフォートディックスにおける発生、及び１９７７～１９７８年のソ連かぜの流行の原因であった。

【0132】

いくつかの実施形態では、抗原は、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原、又はその変異体若しくは断片を含む。Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）は、８つのＲＮＡ断片を有するネガティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＩＢＶのカプシドはエンベロープされているが、そのビリオンはエンベロープ、マトリックスタンパク質、核タンパク質複合体、ヌクレオカプシド及びポリメラーゼ複合体を含む。表面突起はノイラミニダーゼ（ＮＡ）及びヘマグルチニンからなる。このウイルスは、Ａ型インフルエンザよりも進化しにくいが、持続的な免疫が達成されないように十分に変異する。Ｂ型インフルエンザの宿主範囲は、Ａ型インフルエンザよりも狭く、ヒト及びアザラシのみに感染することが知られている。Ｂ型インフルエンザウイルスはサブタイプに分類されないが、系統及び株に更に分けられる。Ｂ型インフルエンザの具体例には、Ｂ／山形、Ｂ／ビクトリア、Ｂ／上海／３６１／２００２及びＢ／香港／３３０／２００１が含まれるが、これらに限定されない。

【0133】

いくつかの実施形態では、抗原は、インフルエンザウイルス抗原若しくはタンパク質、又はその断片である。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、ＰＡ、ＰＢ１、若しくはＰＢ２インフルエンザタンパク質、又はその断片を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１４のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１５又は１６と、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１４のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１５又は１６と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１５のアミノ酸配列、又はその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号１６のアミノ酸配列、又はその変異体を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１４のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一である配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１５又は１６のアミノ酸をコードする核酸配列と、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一である配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１～１４のアミノ酸のいずれかをコードする核酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、核酸の置換、欠失及び／又は挿入を有する配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、インフルエンザタンパク質は、配列番号１５又は１６のアミノ酸をコードする核酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、核酸の置換、欠失及び／又は挿入を有する配列を有する核酸、あるいはその断片によってコードされる。

【0136】

いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、又はＤ型である。いくつかの実施形態では、ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである場合、それはＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、又はＨ２Ｎ３である。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９である。

【0137】

インフルエンザウイルス株の例を表１に列挙する。いくつかのＶＬＰは、対象において表１の株の少なくとも８０％に対する免疫応答を活性化する抗原のセットを含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、対象において表１の株の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％に対する免疫応答を活性化する抗原のセットを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは表１の株の抗原を含む。いくつかのＶＬＰは、表１の株の１つ以上の抗原の１つ以上の相同体を含む。いくつかの場合、そのような相同体は、表１の抗原に対して少なくとも９０％の配列同一性を含む。いくつかの場合、そのような相同体は、表１の抗原に対して少なくとも８０％の配列同一性を含む。いくつかの場合、そのような相同体は、表１の抗原に対して少なくとも８５％の配列同一性を含む。いくつかの場合、そのような相同体は、表１の抗原に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。いくつかの場合、そのような相同体は、表１の抗原に対して少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0139】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの２つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの３つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの４つ以上の抗原を含む。場合によっては、ＶＬＰはインフルエンザワクチンの一部であり、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの５つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの６つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、又はＨ７Ｎ９のうちの７つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、及びＨ７Ｎ９の抗原を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、抗原は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、又はその変異体若しくは断片を含む。ＮＡはインフルエンザウイルス膜糖タンパク質であり、いくつかの実施形態では、感染細胞の表面の炭水化物部分から末端シアル酸残基を切り離すことによるウイルスＨＡの細胞受容体の破壊に関与する。ＮＡはまた、いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質からシアル酸残基を切り離し、ウイルスの凝集を防止する。ＮＡ（ＨＡと共に）は、２つの主要なインフルエンザウイルス抗原決定因子のうちの１つである。いくつかのインフルエンザＮＡタンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されているもの等、公的に入手可能である。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＮＡはホモ四量体を含む。いくつかの実施形態では、ＮＡは、鳥由来のインフルエンザウイルスにおいて同定されているサブタイプを含む（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８又はＮ９）。いくつかの実施形態では、ＮＡは山形様及びビクトリア様抗原系統を含む。いくつかの実施形態では、ＮＡは、感染細胞の表面上の炭水化物部分から末端ノイラミン酸（シアル酸とも呼ばれる）残基を切り離すことによって、ウイルスＨＡの細胞受容体の破壊に関与する。ＮＡはまた、いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質からシアル酸残基を切り離し、ウイルスの凝集を防止する。いくつかの実施形態では、ＮＡは、新しく形成されたウイルス粒子が細胞膜に沿って蓄積するのを防ぐことによって、並びに粘膜表面に存在する粘液を介したウイルスの輸送を促進することによって、ウイルス子孫の放出を促進する。

【0142】

ＧｅｎＢａｎｋから入手可能な非限定的な例示的ＮＡ配列（鳥類に見られるＩＶＡ ＮＡ等）は、Ｎ１ＦＪ９６６０８４．１、ＡＣＰ４１１０７．１、ＨＭ００６７６１．１、ＡＤＤ９７０９７．１、ＡＦ４７４０４８．１、ＡＡＯ３３４９８．１、ＡＹ２５４１４５．１、ＡＡＰ２１４７６．１、ＡＹ２５４１３９．１、ＡＡＰ２１４７０．１、ＣＹ１８７０３１．１、ＡＨＺ４３９３７．１、ＣＹ０２０８８７．１、ＡＢＯ５２０６３．１、ＡＹ２０７５３１．１、ＡＡＯ６２０４５．１、ＡＹ２０７５３３．１、ＡＡＯ６２０４７．１、ＡＹ２０７５２８．１、ＡＡＯ６２０４２．１、Ｎ５、Ｍ２４７４０．１、ＡＡＡ４３６７２．１、Ｐ０３４７８．２、ＮＭＩＶＡＡ、Ｎ６、ＡＹ２０７５５７．１、ＡＡＯ６２０７１．１、ＡＹ２０７５５６．１、ＡＡＯ６２０７０．１、ＡＹ２０７５５３．１、ＡＡＯ６２０６７．１、Ｎ７、Ｍ３８３３０．１、ＡＡＡ４３４２５．１、Ｐ１８８８１．１、Ｎ８、Ｌ０６５７５．１、ＡＡＡ４３４０４．１、ＡＹ５３１０３８．１、ＡＡＴ０８００５．１、ＣＹ０２０９０３．１、ＡＢＯ５２０８５．１、Ｎ９，Ｍ１７８１２．１、ＡＡＡ４３５７５．１、Ｍ１７８１３．１、ＡＡＡ４３５７４．１、ＡＢ４７２０４０．１、ＢＡＨ６９２６３．１、ＮＡ、ＡＢ０３６８７０．１、ＢＡＢ３２６０９．１、ＮＣ＿００２２０９．１、ＮＰ＿０５６６６３．１、Ｄ１４８５５．１、ＢＡＡ０３５８３．１、ＡＪ４１９１１０．１、ＡＣＴ８５９６５．１、ＡＪ７８４１０４．１、ＡＧＡ１８９５７．１、ＡＪ４１９１１１．１、及びＡＡＯ３８８７２．１を含む。ＮＡアミノ酸配列のいくつかの例は、本明細書では配列番号１～４として提供される。

【0143】

いくつかの実施形態では、抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、又はその変異体若しくは断片を含む。ＨＡはインフルエンザウイルス表面糖タンパク質である。ＨＡは、宿主細胞へのウイルス粒子の結合及びその後のウイルスの宿主細胞への侵入を媒介する。いくつかの実施形態では、ＨＡはまた、赤血球細胞を凝集させる。多数のインフルエンザＨＡタンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、当該分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されているもの等、公的に入手可能である。ＨＡ（ＮＡと共に）は、２つの主要なインフルエンザウイルス抗原決定因子のうちの１つである。例えば、Ａ型インフルエンザ由来の１６のＨＡサブタイプ及びＢ型インフルエンザ由来のＨＡの例の例示的なＨＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。ＨＡアミノ酸配列のいくつかの例は、本明細書では配列番号５～８として提供される。

【0144】

いくつかの実施形態では、抗原はＨＡ及びシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ中のＨＡペプチドは、シグナル配列（すなわち、例えば、前処理されたＨＡタンパク質配列のアミノ酸１～１５、１～１６、１～１７、１～１８又は１～１９について）を含まない。いくつかの実施形態では、ＨＡ又は変異体ＨＡ（例えば、ＶＬＰの一部である場合）は、哺乳動物又は鳥等の対象に投与された場合に免疫応答を誘発する能力を保持する。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＨＡ又は本明細書に記載の任意の他の抗原をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞又は昆虫細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、核酸分子はＲＮＡ安定性のために最適化される。

【0146】

いくつかの実施形態では、抗原は、マトリックスタンパク質若しくはインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質抗原、又はそれらの変異体若しくは断片を含む。Ａ型インフルエンザウイルスは、２つのマトリックスタンパク質、Ｍ１及びＭ２を有する。Ｍ１は、ウイルスエンベロープ内に見出される構造タンパク質である。Ｍ１は、ＲＮＡ－核タンパク質コアの膜エンベロープへのカプシド形成を媒介する二機能性膜／ＲＮＡ結合タンパク質である。Ｍ１は、リンカー配列によって連結された２つのドメインからなる。Ｍ２タンパク質は、Ｈ＋イオンチャネル活性を有する四量体を形成する単一スパン膜貫通タンパク質であり、エンドソーム中の低ｐＨによって活性化されると、ビリオンの内部を酸性化し、その脱コーティングを促進する。Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｍ１及びＢＭ２中の相同タンパク質が記載されている。

【0147】

本明細書に開示されるＶＬＰは、ＨＡサブタイプ又はＮＡサブタイプを含むか、有するか、又は提示することに加えて、いくつかの実施形態では、Ｍ１、Ｍ２、又はその両方等のインフルエンザマトリックスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗原はマトリックスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、インフルエンザマトリックスタンパク質は、ＨＡ又はＨＡと同じインフルエンザ型に由来する（例えば、ＶＬＰ中のＨＡ又はＮＡがＡ型インフルエンザに由来する場合、マトリックスタンパク質はＡ型インフルエンザに由来するが、ＶＬＰ中のＨＡ又はＮＡがＢ型インフルエンザに由来する場合、マトリックスタンパク質はＢ型インフルエンザに由来する）。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＶＬＰに存在するマトリックスペプチド配列は、Ａ型インフルエンザＭ１、Ｍ２、又はＭ１及びＭ２配列、例えば鳥のＭ１、Ｍ２、又はＭ１及びＭ２配列、あるいはＢ型インフルエンザマトリックスペプチド（例えば、Ｍ１、ＢＭ２、又はＭ１及びＢＭ２の両方）である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ａ型インフルエンザＭ１タンパク質を含む（例えば、ＶＬＰがＡ型インフルエンザＮＡ又はＨＡタンパク質を含む場合）。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ａ型インフルエンザＭ１及びＡ型インフルエンザＭ２タンパク質の両方を含む（例えば、ＶＬＰがＡ型インフルエンザＮＡ又はＨＡタンパク質を含む場合）。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｂ型インフルエンザマトリックスペプチドを含む（例えば、ＶＬＰがＢ型インフルエンザＮＡ又はＨＡタンパク質を含む場合）。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ｂ型インフルエンザＭ１及びＢ型インフルエンザのＢＭ２タンパク質の両方を含む（例えば、ＶＬＰがＢ型インフルエンザＮＡ又はＨＡタンパク質を含む場合）。

【0148】

多数のＡ型インフルエンザＭ１及びＭ２タンパク質、並びにＢ型インフルエンザマトリックスタンパク質のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されているもの等、公的に利用可能である。ＧｅｎＢａｎｋから入手可能な例示的な配列。ＩＢＶマトリックス、Ｍ１、及びＭ２配列等のいくつかの例示的な配列は、ＣＹ００２６９７．１、ＡＢＡ１２７１８．１、ＡＢ１８９０６４．１、ＡＢＡ１２７１９．１、ＤＱ８７０８９７．１、ＡＦ２３１３６１．１、ＡＢＳ５２６０７．１、ＡＹ０４４１７１．１、ＡＡＤ４９０６８．１、ＡＢＱ１２３７８．１、ＡＹ５０４６０５．１、ＡＢＳ５２６０６．１、ＡＢＶ５３５６０．１、ＡＢ１２０２７４．１、ＡＡＤ４９０９１．１、ＡＡＫ９５９０２．１、ＡＦ１００３８２．１、ＤＱ５０８９１６．１、ＡＡＴ６９４２９．１、ＢＡＤ２９８２１．１、ＡＢＦ２１３１８．１、及びＡＨＷ４６７７１．１を含む。マトリックス又はＭ２アミノ酸配列のいくつかの例は、本明細書では配列番号９～１２として提供される。いくつかの実施形態では、マトリックス配列は、より大きな細胞質マトリックスタンパク質ではなく、小さなＭ２膜タンパク質である。場合によっては、より大きな細胞質マトリックスタンパク質を共発現させて、従来のＶＬＰの粒子の出芽を促進するか、又は配列番号９～１２で提供されるもの等の小さなＭ２膜タンパク質を本明細書で提供されるＶＬＰに使用する。

【0149】

いくつかの実施形態では、抗原又はインフルエンザ抗原は、インフルエンザＮＢペプチド又はその断片を含む。ＮＢペプチド配列のいくつかの例は、本明細書では配列番号１３～１４として提供される。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザ等のインフルエンザウイルスは、２つの小イオンチャネル膜貫通タンパク質（ＮＢ及びＢＭ２）を、Ａ型インフルエンザのもの（Ｍ２）ではなくビリオンに組み込む。いくつかの実施形態では、抗原又はインフルエンザ抗原は、ＮＢ又はＢＭ２を含む。いくつかの実施形態では、ＮＢは、ＲＮＡ等の核酸によってコードされ、ＮＡと同じ核酸断片上にあるが、異なる読み枠にある。

【0150】

開示されるインフルエンザＨＡ、ＮＡ、Ｍ１及びＭ２タンパク質ならび本明細書に開示されるにコード配列の変異体は、いくつかの実施形態では、デフォルトパラメータに設定したＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐを使用して、アミノ酸配列との全長アラインメントにわたってカウントされた、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列機能は、デフォルトパラメータ（ギャップイグジステンスコストは１１、残基当たりのギャップコストは１）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、いくつかの実施形態で使用される。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）をアライメントする場合、アライメントは、デフォルトパラメータ（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して、Ｂｌａｓｔ２配列機能を使用して実行されるべきである。参照配列とのより大きな類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性等、同一性百分率の増加を示すであろう。いくつかの実施形態では、配列同一性について配列全体よりも少ないものを比較すると、相同体及び変異体は、いくつかの実施形態では、１０～２０アミノ酸のショートウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、いくつかの実施形態では、参照配列に対するそれらの類似性に応じて、少なくとも８５％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。このようなショートウィンドウで配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が案内のためにのみ提供され、提供された範囲外にある非常に有意な相同体が得られる可能性があることは完全に可能であることを理解するであろう。したがって、変異インフルエンザＨＡ、ＮＡ又はマトリックスタンパク質（又はコード配列）は、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の抗原又は抗原配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法及び組成物において使用される。

【0151】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、Ａ型インフルエンザＭ１、Ａ型インフルエンザＭ２、又はＡ型インフルエンザＭ１及びＡ型インフルエンザＭ２の両方のタンパク質と組み合わせて、Ａ型インフルエンザＨＡ又はＡ型インフルエンザＮＡタンパク質を提示するか、あるいはそれらを含む。本明細書の他の実施形態では、インフルエンザＶＬＰは、Ｂ型インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ１又はＢ型インフルエンザＭ１及びＢＭ２タンパク質の両方と組み合わせて、Ｂ型インフルエンザＨＡ又はＢ型インフルエンザＮＡタンパク質を提示するか、あるいはそれらを含む。

【0152】

２．コロナウイルス抗原
いくつかの実施形態では、抗原を含むＶＬＰが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、抗原は、コロナウイルス抗原、又はその変異体若しくは断片である。いくつかの実施形態では、断片は機能性断片である。いくつかの実施形態では、抗原はコロナウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は変異体又はコロナウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は断片又はコロナウイルス抗原である。

【0153】

コロナウイルス抗原は、コロナウイルスに由来し得る。コロナウイルスの非限定的な例は、ＭＨＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＡＩＢＶ、ＢｃｏＶ、ＴＧＶ、ＦＩＰＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＭＥＲＳウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスはＭＥＲＳウイルスである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスはウイルス感染症を引き起こす。例えば、ＳＡＲＳコロナウイルスは、ＳＡＲＳ感染症を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コロナウイルス疾患２０１９を引き起こす。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）である。いくつかの実施形態では、対象はウイルス感染症を有する。いくつかの実施形態では、対象はＣＯＶＩＤ－１９を有する。

【0155】

いくつかの実施形態では、コロナウイルス抗原は、コロナウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原は、コロナウイルスタンパク質又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、コロナウイルスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜タンパク質（Ｍ）、又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質はスパイク（Ｓ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質はエンベロープ（Ｅ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、膜タンパク質（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、Ｓ１又はＳ２を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｓ１及び／又はＳ２に切り離される。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｓ１を含む。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、Ｓ２を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、組換え型及び／又は非天然型である。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は、機能性スパイクタンパク質又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質は受容体に結合する。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質断片は受容体に結合する。いくつかの実施形態では、受容体はＡＣＥ２を含む。いくつかの実施形態では、受容体はアンジオテンシンＡＣＥ２である。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質はＡＣＥ２に結合する。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質断片はＡＣＥ２に結合する。いくつかの実施形態では、受容体はヒトタンパク質である。いくつかの実施形態では、受容体はＡＣＥ２である。いくつかの実施形態では、ヒト受容体に結合すると、スパイクタンパク質は細胞内に内在化され得る。

【0156】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと、７５．０％、８０．０％、８５．０％、９０．０％、９１．０％、９２．０％、９３．０％、９４．０％、９５．０％、９６．０％、９７．０％、９７．５％、９８．０％、９８．５％、９９．０％、９９．５％、９９．９％、１００％、又は前述の百分率のいずれか２つによって定義される百分率の範囲において同一であるアミノ酸配列を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと、少なくとも７５．０％同一、少なくとも８０．０％同一、少なくとも８５．０％同一、少なくとも９０．０％同一、少なくとも９１．０％同一、少なくとも９２．０％同一、少なくとも９３．０％同一、少なくとも９４．０％同一、少なくとも９５．０％同一、少なくとも９６．０％同一、少なくとも９７．０％同一、少なくとも９７．５％同一、少なくとも９８．０％同一、少なくとも９８．５％同一、少なくとも９９．０％同一、少なくとも９９．５％同一、少なくとも９９．９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと、７５．０％以下同一、８０．０％以下同一、８５．０％以下同一、９０．０％以下同一、９１．０％以下同一、９２．０％以下同一、９３．０％以下同一、９４．０％以下同一、９５．０％以下同一、９６．０％以下同一、９７．０％以下同一、９７．５％以下同一、９８．０％以下同一、９８．５％以下同一、９９．０％以下同一、９９．５％以下同一、９９．９％以下同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２０と比較して、百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０の断片の配列を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２１と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２１と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２１の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２１の断片の配列を含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２２と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２２と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２２の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２２の断片の配列を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２３と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２３と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２３の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２３の断片の配列を含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２４と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２４と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２４の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２４の断片の配列を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２５と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２５と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２５の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２５の断片の配列を含む。

【0165】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２６と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２６と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２６の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２６の断片の配列を含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２７と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２７と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２７の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２７の断片の配列を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２８と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２８と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２８の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２８の断片の配列を含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２９と、７５．０％同一、８０．０％同一、８５．０％同一、９０．０％同一、９１．０％同一、９２．０％同一、９３．０％同一、９４．０％同一、９５．０％同一、９６．０％同一、９７．０％同一、９７．５％同一、９８．０％同一、９８．５％同一、９９．０％同一、９９．５％同一、９９．９％同一、若しくは１００％同一であるアミノ酸配列又はその断片を含むか、あるいは配列番号２９と比較して百分率同一性の範囲を含むアミノ酸配列又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスのタンパク質は、配列番号２９の断片の配列を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0170】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０以下、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０～２９のいずれかと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２０と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２３と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２３と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２４と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２５と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２６と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２６と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２７と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0180】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２８と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0181】

いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列、あるいはその断片を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、配列番号２９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、４０、又は前述の整数のいずれかによって定義される範囲の、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有するアミノ酸配列を含む。

【0182】

３．多価ＶＬＰ
２つ以上の異なるＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）、例えば２つ以上の異なるＶＬＰ集団を含有するワクチンが本明細書で提供される。そのようなワクチンは、多価ＶＬＰ（又は多価ＶＬＰ含有ワクチン）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、異なる抗原を含むＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、異なるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドを含むＶＬＰ、例えば、第１のＨＡポリペプチドを含有するか又はそれからなる第１のＶＬＰと、第２のＨＡポリペプチドを含有するか又はそれからなる第２のＶＬＰと、を含み、第１及び第２のＨＡポリペプチドは異なるサブタイプである（又はＡ型インフルエンザ及びＢ型インフルエンザ等の異なるインフルエンザウイルスに由来する）。いくつかの実施形態では、ワクチンは、それぞれが異なるインフルエンザ（例えば、Ａ及びＢ）由来の異なるＨＡサブタイプ又はＨＡからなるか、又は含有する複数の異なるＶＬＰを含有する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、薬学的に許容可能な担体及び／又はアジュバント等の他の試薬を含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、開示されるワクチンは、それぞれＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザ由来の単一のＨＡサブタイプを含有するインフルエンザＶＬＰの多価混合物を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザのＮＡタンパク質を含有するＶＬＰ（例えば、それぞれがＡ型インフルエンザＮＡサブタイプ又はＢ型インフルエンザＮＡを含む更なるＶＬＰ集団）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザマトリックスタンパク質も含む。いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザＮＡ又はＨＡを含むＶＬＰは、Ａ型インフルエンザＭ１、Ｍ２又はその両方を含み、Ｂ型インフルエンザＮＡ又はＨＡを含むＶＬＰは、Ｂ型インフルエンザＭ１、ＢＭ２、又はその両方等のＢ型インフルエンザマトリックスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、鼻腔内、皮内、全身、若しくは静脈内送達又は投与を使用して、粘膜免疫及び全身免疫を誘導する。いくつかの実施形態では、一価又は多価ＶＬＰは、非感染性であり、安全であり、製造及び使用が容易である。いくつかの実施形態では、多価ＶＬＰ（いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザのＨＡを含むＶＬＰ集団の混合物を含む）は、広く反応性を有する季節性ワクチンを提供するために使用される。

【0184】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも２つの異なるＶＬＰ、例えば少なくとも２つの異なるＶＬＰ集団を含み、各ＶＬＰ又はＶＬＰ集団は１つのＨＡサブタイプを含む（又は１つのインフルエンザウイルス、例えばＡ型インフルエンザ及びＢ由来のＨＡを含有する）。いくつかの実施形態は、第１のＨＡサブタイプ（Ｈ－Ｘ）を含む第１のＶＬＰ及び異なるＨＡサブタイプ（Ｈ－Ｙ）を含む第２のＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＬＰはＢ型インフルエンザ由来の第１のＨＡ（Ｈ－Ｘ）を含有し、第２のＶＬＰはＢ型インフルエンザとは異なる第２のＨＡ（Ｈ－Ｙ）を含有するか、又は第１のＶＬＰはＡ型インフルエンザ由来の第１のＨＡ（Ｈ－Ｘ）を含有し、第２のＶＬＰはＡ型インフルエンザとは異なる第２のＨＡ（Ｈ－Ｙ）を含有する。いくつかの実施形態では、第１のＶＬＰはＡ型インフルエンザ由来の第１のＨＡ（Ｈ－Ｘ）を含有し、第２のＶＬＰはＢ型インフルエンザ由来の第２のＨＡ（Ｈ－Ｙ）を含有する。いくつかの実施形態では、各ＶＬＰは複数のＶＬＰを含み、各集団は異なるＨＡサブタイプ（又は異なるインフルエンザウイルス由来のＨＡ）を含む。

【0185】

いくつかの実施形態では、３つ以上の異なるＶＬＰ又はワクチンがワクチンに含まれる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、それぞれが異なる抗原を含む、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の異なるＶＬＰ又はＶＬＰ集団を含む。いくつかの実施形態では、異なる抗原はそれぞれ、異なるインフルエンザＨＡサブタイプに由来するか、並びに／あるいは異なるインフルエンザウイルス、例えば２～８、２～６、５～６、又は４～６の異なるＶＬＰ又はＶＬＰ集団に由来する（各ＶＬＰ又はＶＬＰ集団は、異なるウイルスに由来する異なるＨＡタンパク質サブタイプ及び／又はＨＡを有する）。いくつかの実施形態では、第１のＶＬＰは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択される第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、一方、第２のＶＬＰは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択される第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、第１及び第２のＨＡポリペプチドは異なるサブタイプである。したがって、ワクチンが第３のＶＬＰ集団等の第３のＶＬＰを含む場合、第３のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択され、第３のＨＡポリペプチドサブタイプは、第１及び第２のＨＡポリペプチドサブタイプとは異なるであろう。

【0186】

いくつかの実施形態では、第１のＶＬＰは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択される第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含み、一方、第２のＶＬＰは、山形又はビクトリア様抗原等の第１のＢ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含む。ワクチンが第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含有する第３のＶＬＰ集団等の第３のＶＬＰを含む場合、それは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６からなる群から選択され、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドサブタイプは、第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドサブタイプとは異なるであろう。ワクチンが第２のＢ型インフルエンザＨＡポリペプチドを含有する第３のＶＬＰ集団等の第３のＶＬＰを含む場合、第２のＢ型インフルエンザＨＡは第１のＢ型インフルエンザＨＡとは異なるであろう。特定の例では、ワクチンは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の異なるＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を含み、少なくとも１つのＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨＡサブタイプを含み、少なくとも１つのＶＬＰ集団はＢ型インフルエンザＨＡを含み、場合により少なくとも１つのＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＮＡサブタイプを含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、別個のＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を含む。いくつかの実施形態では、第１のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨ１を含み、第２のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨ３を含み、第３のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨ５を含み、第４のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨ７を含み、第５のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＮ１を含み、第６のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＮ２を含み、第７のＶＬＰ集団はＢ型インフルエンザ山形様又はビクトリア様抗原を含み、場合により、第８のＶＬＰ集団はＢ型インフルエンザ山形様又はビクトリア様抗原（第７のＶＬＰ集団とは異なる）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、季節性ワクチン又はプレパンデミックワクチンとして使用される。

【0188】

いくつかの実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡの２つの主要な群が存在し、群１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６を含み、群２は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５サブタイプを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、群１の少なくとも１つのＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、又はＨ１６）を含む第１のＶＬＰ又は第１のＶＬＰ集団、及び群２の少なくとも１つのＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、又はＨ１５）を含む第２のＶＬＰ又は第２のＶＬＰ集団を含む。別の例では、ワクチンは、少なくとも２つの異なるＶＬＰ又は異なるＶＬＰ集団を含み、それぞれが群１の異なるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、又はＨ１６）を含む。別の例では、ワクチンは、少なくとも２つの異なるＶＬＰ又は異なるＶＬＰ集団を含み、それぞれが群２の異なるＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、又はＨ１５）を含む。同様に、Ｂ型インフルエンザウイルスＨＡは異なるサブタイプを有さないが、２つの主要な抗原系統、ビクトリア様及び山形様が存在し、これらは系統学的にも異なる。

【0189】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の異なるＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を含み、それぞれ群１の異なるＡ型インフルエンザＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、又はＨ１６）を含む。具体的な例において、ワクチンは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、例えば２、３、４、５、又は６つの異なるＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を含み、それぞれ群２の異なるＡ型インフルエンザＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、又はＨ１５）を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２又はＨ５であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドは、ＨＡサブタイプＨ３、Ｈ７又はＨ９である。別の具体例では、第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７又はＨ９であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドは、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７又はＨ９であり、第１及び第２のＨＡポリペプチドは異なるサブタイプである。いくつかの実施形態では、（ｉ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ２であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ５であり；（ｉｉ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ３であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ７であり；（ｉｉｉ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ１であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ３であり；（ｉｖ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ２であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ７であり；（ｖ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ５であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ３であり；又は（ｖｉ）第１のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ１であり、第２のＡ型インフルエンザＨＡポリペプチドはＨＡサブタイプＨ７である。

【0191】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも４つの異なるＶＬＰ集団を含み、第１のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ１を含み、第２のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ３を含み、第３のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ５を含み、第４のＶＬＰ集団はＡ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ７を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ９を含む第５のＶＬＰ集団を更に含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｎ１又はＮ２等のＡ型インフルエンザＮＡを含む第６のＶＬＰ集団を更に含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザＮＡのＮ１（第７の集団）及びＮ２（第８の集団）を含む第７及び第８のＶＬＰ集団を更に含む。そのようなＶＬＰは、いくつかの実施形態では、Ｍ１及びＭ２も含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、本開示のＶＬＰは、ＨＡタンパク質を有することに加えて、インフルエンザマトリックスタンパク質（例えば、Ａ型インフルエンザＭ１、Ａ型インフルエンザＭ２、又はその両方）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン１０６は、第１のＨＡサブタイプＨ－Ｘ及びマトリックスタンパク質Ｍ１を有するＶＬＰ又はＶＬＰ集団と、第２のＨＡサブタイプＨ－Ｙ及びマトリックスタンパク質Ｍ１を有するＶＬＰ又はＶＬＰ集団と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｍ２は、ＶＬＰ及び／又はＶＬＰ集団に存在する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ又はＶＬＰ集団は、Ａ型インフルエンザ由来の第１のＨＡ（Ｈ－Ｘ）及びＭ１又はＭ２等のＡ型インフルエンザマトリックスタンパク質を含み、第２のＶＬＰ又はＶＬＰ集団は、Ｂ型インフルエンザ由来の第２のＨＡ（Ｈ－Ｙ）及びＢ型インフルエンザマトリックスタンパク質を含む。

【0193】

いくつかの実施形態は、ＨＡを含むＶＬＰを含むことに加えて、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）ポリペプチドを含むＶＬＰ（又はＶＬＰの集団）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、それぞれが異なるインフルエンザＮＡポリペプチドを有する、２つ以上の異なるＶＬＰ又はＶＬＰ集団を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、第１のインフルエンザＮＡポリペプチドを含む第１のＶＬＰ、第２のインフルエンザＮＡポリペプチドを含む第２のＶＬＰ、又はそれらの両方を含み、第１及び第２のＮＡポリペプチドは異なるサブタイプであるか、又は異なるインフルエンザウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、それぞれ異なるＨＡサブタイプ（又は異なるインフルエンザウイルス由来のＮＡ）を有するＶＬＰ又はＶＬＰ集団を含み、ＮＡサブタイプＮ－Ｘを有するＶＬＰ又はＶＬＰ集団を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ又はワクチンは、インフルエンザマトリックスタンパク質（例えば、Ｍ１、Ｍ２、又はその両方）を含む。

【0194】

系統的に、２つの群を形成するＡ型インフルエンザウイルスＮＡの２つの群が存在し、群１は、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、及びＮ８を含み、群２は、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、及びＮ９を含む。したがって、一例では、多価ＶＬＰ含有ワクチンは、群１（例えば、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、又はＮ８）の少なくとも１つのＮＡポリペプチドを含有する第１のＶＬＰ又は第１のＶＬＰ集団と、群２（例えば、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、又はＮ９）の少なくとも１つのＮＡポリペプチドを含有する第２のＶＬＰ又は第２のＶＬＰ集団と、を更に含む。別の例では、多価ＶＬＰ含有ワクチンは、少なくとも２つの異なるＶＬＰ又は異なるＶＬＰ集団を更に含み、それぞれが群１（例えば、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、又はＮ８）の異なるＮＡポリペプチドを含有する。別の例では、多価ＶＬＰ含有ワクチンは、少なくとも２つの異なるＶＬＰ又は異なるＶＬＰ集団を更に含み、それぞれが群２（例えば、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、又はＮ９）の異なるＮＡポリペプチドを含有する。

【0195】

いくつかの実施形態では、多価ＶＬＰ含有ワクチンは、１、２、３、又は４つの異なるＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を更に含み、それぞれが群１（例えば、Ｎ１、Ｎ４、Ｎ５、及びＮ８）の異なるＮＡポリペプチドを含有する。具体的な例では、ワクチンは、１、２、３、４、又は５つの異なるＶＬＰ（又はＶＬＰ集団）を含み、それぞれが群２（例えば、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、又はＮ９）の異なるＮＡポリペプチドを含有する。

【0196】

同様に、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＡは異なるサブタイプを有さないが、２つの主要な抗原系統、ビクトリア様及び山形様が存在し、これらは系統学的にも異なる。いくつかの実施形態では、多価ＶＬＰ含有ワクチンは、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＮＡポリペプチド（例えば、ビクトリア様）を含有する第１のＶＬＰ又は第１のＶＬＰ集団と、少なくとも１つのＢ型インフルエンザＮＡポリペプチド（例えば山形様）を含有する第２のＶＬＰ又は第２のＶＬＰ集団と、を更に含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＮＡタンパク質を有することに加えて、本開示のＮＡ－ＶＬＰは、インフルエンザマトリックスタンパク質（例えば、Ａ型インフルエンザＭ１、Ａ型インフルエンザＭ２、又はその両方、あるいはＢ型インフルエンザＭ１、Ｂ型インフルエンザＢＭ２、又はその両方）を含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ１を含む第１のＶＬＰ集団と、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ３を含む第２のＶＬＰ集団と、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ５を含む第３のＶＬＰ集団と、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ７を含む第４のＶＬＰ集団と、を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザＨＡサブタイプＨ９を含む第５のＶＬＰ集団を更に含むか、又は場合によって含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｎ１又はＮ２等のＡ型インフルエンザＮＡを含む第６のＶＬＰ集団を更に含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ａ型インフルエンザＮＡのＮ１（第６の集団）及びＮ２（第７の集団）を含む第６及び第７のＶＬＰ集団を更に含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、Ｂ型インフルエンザ山形様又はビクトリア様抗原を含む第８のＶＬＰ集団を更に含み、場合により、第９のＶＬＰ集団は、Ｂ型インフルエンザ山形様又はビクトリア様抗原（第８のＶＬＰ集団とは異なる）を含む。いくつかの実施形態では、このようなワクチンは、季節性ワクチン又はプレパンデミックワクチンとして使用される。

【0199】

Ｃ．アンカー分子
特定の実施形態では、（ａ）内面及び外面を含む脂質二重層を含む合成脂質小胞と、（ｂ）脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、（ｃ）アンカー分子に結合した抗原と、を含むか、又はそれらからなるｓｅＶＬＰが本明細書に開示される。特定の実施形態では、第１の面及び第２の面を含む合成、半合成又は天然の脂質二重層と、脂質二重層に埋め込まれたアンカー分子と、アンカー分子に結合した抗原と、を含む、ｓｍＶＬＰも本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは室温で安定である。

【0200】

いくつかの実施形態では、アンカー分子は、膜貫通タンパク質、脂質アンカータンパク質、又はその断片若しくはドメインを含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、アンカー分子は疎水性部分を含む。いくつかの実施形態では、アンカー分子は、プレニル化タンパク質、脂肪アシル化タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール連結タンパク質、又はその断片を含む。

【0202】

いくつかの実施形態では、アンカー分子は、疎水性膜貫通ドメイン、グリコシルホスファチジルイノシトール結合、又はタンパク質－タンパク質会合ドメイン、脂質会合ドメイン、糖脂質会合ドメイン若しくはプロテオグリカン会合ドメイン、例えば細胞表面受容体結合ドメイン、細胞外マトリックス結合ドメイン若しくは脂質ラフト会合ドメイン等の、膜への抗原の局在化を補助する別の構造的特徴を含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、アンカー分子は膜貫通ポリペプチドドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドドメインは、原形質膜二重層の内部を形成するリン脂質脂肪アシルテールとのエネルギー的に有利な相互作用が可能な疎水性領域を含む膜貫通ドメイン（［α］－ヘリックスドメイン等）、又は膜挿入ドメインポリペプチドを含み、いくつかの実施形態では、膜挿入ドメインポリペプチドは、原形質膜二重層の内部を形成するリン脂質脂肪アシルテールとのエネルギー的に有利な相互作用が可能な疎水性領域であるが、いくつかの実施形態では膜全体を貫通しない。１つ以上の膜貫通ポリペプチドドメインを有する膜貫通タンパク質のいくつかの例は、インテグリンファミリのメンバー、ＣＤ４４、グリコホリン、ＭＨＣクラスＩ及びＩｌ糖タンパク質、ＥＧＦ受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリ、受容体チロシンキナーゼ（インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦＲ）及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）等）、ポリンファミリ及び他の膜貫通タンパク質を含む。いくつかの実施形態は、膜挿入特性を有する切断型ポリペプチド等の膜貫通ポリペプチドドメインの一部の使用を含む。

【0204】

いくつかの実施形態では、アンカー分子は、タンパク質－タンパク質会合ドメイン、例えば細胞表面タンパク質又は糖タンパク質の細胞外に配置された領域と特異的に会合することができるタンパク質－タンパク質会合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質－タンパク質会合ドメインは、例えば、細胞表面タンパク質の合成、プロセシング、折畳み、集合、輸送及び／又は細胞表面への輸送と同時に、細胞内で開始される会合をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質－タンパク質会合ドメインは、膜に固定され、細胞表面上に外側に配置された別の細胞表面タンパク質と会合することが知られている。そのようなドメインの非限定的な例は、インテグリンが可能なものを含むＲＧＤ含有ポリペプチドを含む。

【0205】

いくつかの実施形態では、アンカー分子又は膜貫通ドメインをコードする配列は、ポリペプチドに含まれて、抗原又は抗原及びアンカー分子を含む融合タンパク質の表面発現を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、選択可能なマーカとインフレームでクローニングされて、生産的なインフレーム産物の選択を可能にする。

【0206】

ＩＶ．ワクチン
特定の実施形態では、（ａ）ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）と、（ｂ）賦形剤、担体又はアジュバントと、を含むワクチンが本明細書に開示される。

【0207】

いくつかの実施形態では、ワクチンは少なくとも１つの賦形剤を含有する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、付着防止剤、結合剤、コーティング、色素又は染料、崩壊剤、香味剤、流動促進剤、潤滑剤、保存剤、吸着剤、甘味料、又はビヒクルである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、浸透圧を調整するための薬学的に許容可能な塩、緩衝剤、保存剤等を含む。

【0208】

いくつかの実施形態では、賦形剤はアルギン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、賦形剤はアルギネートミクロスフェアを含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、例えばデンプンと組み合わせてカーボポールを含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、キチン脱アセチル化によって製造される非毒性の線状多糖であるキトサンを含む。一例では、キトサンは、Ｎ－トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ベースのナノ粒子等のキトサンナノ粒子の形態である。

【0209】

いくつかの実施形態では、賦形剤は、湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、細菌起源の１つ以上のリポペプチド、又はそれらの合成誘導体、例えばＰａｍ３Ｃｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ、単鎖／多鎖パルミチン酸及びリポアミノ酸（ＬＡＡ））を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１つ以上のアジュバント、例えばＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、Ｆｌｔ３リガンド、及びＭＬＡのうち１つ以上等の粘膜アジュバントを含有する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、臨床グレードのＭＬＡ製剤、例えばＭＰＬ（３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、例えばＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、Ｆｌｔ３リガンド、及びＭＬＡのうち１つ以上のような、粘膜アジュバント等の薬学的に許容可能な担体及びアジュバントを含有する。一例では、アジュバントは、ＭＬＡ、例えば臨床グレード製剤、例えばＭＰＬ（３－Ｏ－デサシル－４’－モノホスホリルリピドＡ）アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、リピドＡモノホスホリル（ＭＰＬ）、Ｆｌｔ３リガンド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧオリゴヌクレオチド等）、又はそれらの組合わせ等の１つ以上のアジュバントを含有する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、イミキモド、Ｆｌｔ３リガンド、ＭＬＡ等のＴＬＲアゴニスト、又はＣｐＧオリゴヌクレオチド等の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントはイミキモドである。

【0210】

いくつかの実施形態では、ワクチンは少なくとも１つのアジュバントを含有する。本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、抗原（例えば、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡ）に対する免疫応答を非特異的に増強する物質又はビヒクルである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、本明細書に開示されるＶＬＰと共に使用される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、抗原が吸着された無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、又はホスフェート）の懸濁液、又は抗原溶液が鉱油（例えば、フロイント不完全アジュバント）中で乳化されている油中水型エマルジョンを含み、時として抗原性を更に増強するために死滅したマイコバクテリア（フロイント完全アジュバント）を含む。いくつかの実施形態では、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＣｐＧモチーフを含むもの等）がアジュバントとして使用される。アジュバントのいくつかの例は、共刺激分子等の生物学的分子を含む。例示的な生物学的アジュバントは、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ及び４１ ＢＢＬを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＴＬＲ１／２（いくつかの実施形態では合成リガンドである）（例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、ＴＬＲ２（例えば、ＣＦＡ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ）、ＴＬＲ３（例えば、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、ｐｏｌｙＡ：Ｕ）、ＴＬＲ４（例えば、ＭＰＬＡ、リピドＡ、及びＬＰＳ）、ＴＬＲ５（例えば、フラジェリン）、ＴＬＲ７（例えば、ガーディキモド、イミキモド、ロキソリビン、レシキモド）、ＴＬＲ７／８（例えば、Ｒ８４８）、ＴＬＲ８（例えば、イミダゾキノリン、ｓｓＰｏｌｙＵ、３Ｍ－０１２）、ＴＬＲ９（例えば、ＯＤＮ１８２６（タイプＢ）、ＯＤＮ２２１６（タイプＡ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）及び／又はＴＬＲ１１／１２（例えば、プロフィリン）のアゴニスト等の１つ以上のＴＬＲアゴニストである。いくつかの実施形態では、アジュバントは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型ミネソタＲｅ５９５由来のリピドＡモノホスホリル（ＭＰＬ）等のリピドＡである。

【0211】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含有する。いくつかの実施形態では、担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、ゴマ油、エタノール、及びそれらの組合わせである。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、投与されている特定のワクチンによって、及び／又はワクチンを投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。薬学的に許容可能な担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、ゴマ油、エタノール、及びそれらの組合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、担体は無菌であり、製剤は投与様式に適する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、又は粉末剤を含有する。

【0212】

非経口投与用の調製物は、滅菌水溶液又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等を含む。いくつかの実施形態では、保存剤又は他の添加剤は、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス等が存在する。

【0213】

いくつかの実施形態では、担体は、１つ以上の生分解性粘膜付着性ポリマー担体を含む。いくつかの実施形態では、ポリラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、キトサン（例えば、Ｎ－トリメチルキトサン（ＴＭＣ）ベースのナノ粒子等のキトサンナノ粒子の形態で）、アルギネート（アルギン酸ナトリウム等）及びカーボポール等のポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、賦形剤又は担体は、アルギン酸ナトリウム又はカーボポール等の１つ以上の親水性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、例えばデンプンと組み合わせてカーボポールを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、静脈内又は全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）及び／又はビロゾーム等のポリマー粒子を含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、担体は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、又は粉末剤を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、液体、又は凍結乾燥若しくはフリーズドライ粉末を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、従来の結合剤及びトリグリセリド等の担体と共に、坐剤として製剤化される。いくつかの実施形態では、経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等の１つ以上の標準担体を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、担体は、１つ以上の生分解性粘膜付着性ポリマー担体を含む。いくつかの実施形態では、ポリラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、キトサン、アルギネート及びカーボポール等のポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、アルギン酸ナトリウム又はカーボポール等の親水性ポリマーは、水素結合を形成することによって粘液に吸収され、その結果、鼻腔内滞留時間が延長され、いくつかの実施形態では、開示されるワクチンに含まれる。

【0216】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔投与に使用される粒子送達系として製剤化されるか、又は静脈内若しくは全身の投与若しくは送達のために製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）及び／又はビロゾーム等のポリマー粒子を含む。いくつかの実施形態では、リポソームは表面修飾されている（例えば、コーティングされたグリコールキトサン又はオリゴマンノース）。いくつかの実施形態では、リポソームは、融合性又はカチオン性融合性である。

【0217】

いくつかの実施形態では、ワクチンは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、開示されるワクチンはフリーズドライされる。いくつかの実施形態では、ワクチンは糖ガラスとしてガラス化される。

【0218】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、生理食塩水等の溶媒又は液体、乾燥粉末、あるいは糖ガラスとして製剤化される。例えば、いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、鼻腔内投与又はＩＭ若しくはＩＤ注射によるワクチンとして使用され、生理食塩水、乾燥粉末又はトレハロースから作製された糖ガラスとして製剤化され、及び／又はワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントと混合される。いくつかの実施形態では、ワクチンは糖ガラスを含む。いくつかの実施形態では、糖ガラスはトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、糖ガラスに埋め込まれたＶＬＰ及びアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、プリントされ乾燥された塩緩衝トレハロース溶液に製剤化されたＶＬＰ又はアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、乾燥はガラス化によるものである。いくつかの実施形態では、これは室温安定性の利点を提供する。

【0219】

いくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、トレハロース及びイミキモドを含有する。いくつかの実施形態では、ワクチンは、スルホブチル－β－シクロデキストリン等のシクロデキストリンを含有する。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原は、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、コレステロール及びＤＳＰＥ－ｐｅｇ２０００（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホホエタノアミン－Ｎ［アミノ（ポリエテレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）を含むリポソーム製剤に包埋される。

【0220】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードル投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、鼻腔内、皮内、筋肉内、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、開示されるワクチンは、鼻腔内投与、例えば粘膜免疫のために製剤化される。

【0221】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、２５ｐＬ、５０ｐＬ、１００ｐＬ、２５０ｐＬ、５００ｐＬ、７５０ｐＬ、１ｎＬ、５ｎＬ、１０ｎＬ、１５ｎＬ、２０ｎＬ、２５ｎＬ、５０ｎＬ、１００ｎＬ、２５０ｎＬ、５００ｎＬ、１μＬ、１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、若しくは５ｍＬの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、用量は、本明細書に記載のマイクロニードルデバイスの各マイクロニードル上又は各マイクロニードル内にある。

【0222】

Ｖ．デバイス
特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンが充填されたマイクロニードルを含むマイクロニードルデバイスが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、シートと、そこから延在する複数のマイクロニードルとを含む基板を含む。いくつかの実施形態では、当該マイクロニードルのそれぞれが先端を含む。いくつかの実施形態では、当該マイクロニードルのそれぞれが基部を含む。いくつかの実施形態では、当該マイクロニードルのそれぞれは、マイクロニードルをシートに接続する基部にヒンジを含む。いくつかの実施形態では、当該マイクロニードルのそれぞれは、ワクチンを含むウェルを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは脱水される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、ワクチン含有する糖ガラスを含む。いくつかの実施形態では、糖ガラスはトレハロースを含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、ＶａｘｉＰａｔｃｈ等のワクチンパッチを含む。

【0223】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、マイクロメートル～ミリメートルサイズの構造を含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、皮膚を穿刺し、対象の表皮又は真皮にワクチンを送達するように設計される。マイクロニードルは、従来の皮下注射又は筋肉内注射よりもいくつかの利点を提供する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルを使用してワクチンを皮膚の免疫細胞に直接送達し、これは免疫化目的に有利である。マイクロニードル投与に必要なワクチンの量は、従来の皮下注射又は筋肉内注射と比較して少なく、製造コスト及び時間を短縮することができる。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは自己投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンをマイクロニードル上で乾燥させ、これにより、室温におけるワクチンの安定性が大幅に向上する。マイクロニードル投与は無痛であり、より許容される投与形態となる。

【0224】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルは固体構造である。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは中空構造である。いくつかの実施形態では、ワクチンは中空構造を通して放出される（例えば、液体ワクチンが皮膚に注射又は注入される）。いくつかの実施形態では、ワクチンはマイクロニードル上にパッケージングされる（例えば、形成後にマイクロニードルの表面にコーティングされる）。いくつかの実施形態では、ワクチンは、乾燥形態としてマイクロニードル上にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードル上にパッケージングされた後に脱水される。いくつかの実施形態では、ワクチンはマイクロニードルにパッケージングされる（例えば、マイクロニードルの内部への付着によって、又はマイクロニードルを形成するために使用される混合物に含めることによって、マイクロニードル自体の部分を形成すること）。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮膚区画に溶解される。いくつかの実施形態では、ワクチンは皮膚に注射される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、複数のマイクロニードルを含むアレイに形成される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、５ｘ５アレイのマイクロニードルである。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、固体支持体又は基板に物理的又は動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、パッチである。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、ワクチンの皮内投与のために皮膚に直接適用される。

【0225】

マイクロニードルアレイパッチは、任意の適切な形状又はサイズであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイパッチは、顔の特徴、例えば眉毛を模倣するように成形される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイパッチは、選択された量の生物活性剤を送達するために許容される最小サイズである。

【0226】

マイクロニードルのサイズ及び形状は所望に応じて変化する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、先端を有する円錐形部分に物理的又は動作可能に連結された円筒形部分を含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、全体的にピラミッド形状又は全体的に円錐形状を有する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、基部及び先端を含む。いくつかの実施形態では、先端は、約１マイクロメートル以下の半径を有する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、角質層に浸透し、表皮又は真皮に入るのに十分な長さである。特定の実施形態では、マイクロニードルは、約０．１マイクロメートル～約５ミリメートル、例えば約５ミリメートル以下、４ミリメートル以下、約１ミリメートル～約４ミリメートル、約５００マイクロメートル～約１ミリメートル、約１０マイクロメートル～約５００マイクロメートル、約３０マイクロメートル～約２００マイクロメートル、又は約２５０マイクロメートル～約１，５００マイクロメートルの長さ（それらの先端からそれらの基部まで）を有する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、約４００マイクロメートル～約６００マイクロメートルの長さ（それらの先端からそれらの基部まで）を有する。

【0227】

いくつかの実施形態では、個々のマイクロニードルのサイズは、特定の組織型における破損を回避するために、所望の標的深度又は針の強度要件に応じて最適化される。いくつかの実施形態では、経皮マイクロニードルの断面寸法は、約１０ｎｍ～１ｍｍ、又は約１マイクロメートル～約２００マイクロメートル、又は約１０マイクロメートル～約１００マイクロメートルである。いくつかの実施形態では、中空針の外径は、約１０マイクロメートル～約１００マイクロメートルであり、中空針の内径は、約３マイクロメートル～約８０マイクロメートルである。

【0228】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルをパターンに配置する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、長方形若しくは正方形のグリッド又は同心円等の均一な方法で間隔をあけて配置される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、長方形グリッドの外周等、基板の外周に間隔を置いて配置される。いくつかの実施形態では、間隔は、マイクロニードルの高さ及び幅、マイクロニードルの表面に適用されるフィルムの特性、並びにマイクロニードルを通って移動することが意図されている物質の量及び種類を含む、多くの要因に依存する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルの配置は、約５０マイクロメートル以上、約１００マイクロメートル～約８００マイクロメートル、又は約２００マイクロメートル～約６００マイクロメートルのマイクロニードル間の「先端－先端」間隔である。

【0229】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、任意の適切な材料を含むか、又はそれからなる。材料の例は、金属、セラミック、半導体、有機物、ポリマー、及び複合材料を含む。いくつかの実施形態では、構造材料には、それだけに限らないが、医薬品グレードのステンレス鋼、金、チタニウム、ニッケル、鉄、金、スズ、クロム、銅、これら又は他の金属の合金、ケイ素、二酸化ケイ素、及びポリマーが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリマーは生分解性ポリマー又は非生分解性ポリマーである。代表的な生分解性ポリマーには、ヒドロキシ酸、例えば乳酸及びグリコール酸ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド－コ－グリコリドのポリマー、並びにＰＥＧとのコポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）が含まれるが、これらに限定されない。代表的な非生分解性ポリマーは、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオルエチレン及びポリエステルを含む。

【0230】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、溶解性、生体可溶性、生分解性、又はそれらの任意の組合わせである。「生分解性」は、細菌又は別の生物によって分解される任意の物質又は物体を指すために使用される。本明細書に開示されるワクチン及び方法と共に使用するために、任意の適切な溶解性、生体可溶性、及び／又は生分解性マイクロニードルが企図される。いくつかの実施形態では、溶解性、生体可溶性、又は生分解性マイクロニードルは水溶性材料からなる。いくつかの実施形態では、これらの材料は、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、マルトース、デキストロース、ガラクトース、アルギネート、アガロース、セルロース（カルボキシメチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース等）、デンプン、ヒアルロン酸、又はそれらの任意の組合わせを含む。いくつかの実施形態では、選択された材料は、皮膚への浸透を可能にするのに十分な弾性である。いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルは、数秒以内、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、５０、６０、１２０、１８０秒又はそれ以上の秒以内に皮膚に溶解する。いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルは、数分以内、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、６０、１２０以上の分以内に皮膚に溶解する。いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルは、マイクロニードル構造体の一部が皮膚に溶解するように、溶解性部分（マイクロニードルの先端等）及び非溶解性部分（マイクロニードルの基部等）を含む。いくつかの実施形態では、溶解性マイクロニードルは、マイクロニードル構造体全体が皮膚に溶解するようにマイクロニードル全体を包含する。いくつかの実施形態では、溶解性コーティングのみが皮膚に溶解するように、溶解性コーティングが非溶解性支持構造上に形成される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、溶解性、生分解性、生体可溶性、又はそれらの任意の組合わせであるポリマーでコーティングされる。

【0231】

いくつかの実施形態では、溶解性、生分解性、又は生体可溶性マイクロニードル上にワクチンが直接コーティングされる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、溶解性、生分解性、又は生体可溶性マイクロニードル自体内に含まれる（例えば、溶解性ポリマーマトリックスの一部を形成することによって）。いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードル構造体の成形及び重合の前にポリマーマトリックスと混合される。

【0232】

いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、医療グレードのステンレス鋼（ＳＳ）の薄いシートを含む。いくつかの実施形態では、光化学エッチングを使用して、二次元（ｘ、ｙ軸）のアレイを作成する。いくつかの実施形態では、個々の各先端が形成され、予め形成されたヒンジによってＳＳシートに依然として接続される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、尖った先端及び輪郭のはっきりした縁部を有して形成され、それぞれが、その後適切なワクチンを受けるように設計された予め形成されたウェルを有する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体分注器具を使用して、正確な量のワクチンを予め形成された各ウェルに送達する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体分注装置は、ステンレス鋼シートに輪郭が描かれた数百のウェルに流体を同時に及び／又は正確に適用する。いくつかの実施形態では、少量のワクチンは直ちに乾燥し、マイクロニードルのウェルに付着する。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、３７マイクロニードルの１．２ｃｍ円形マイクロアレイを含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、光化学的にエッチングされたステンレス鋼を含む。

【0233】

マイクロニードルを製造するための様々な方法が利用可能であり、マイクロニードル又はマイクロニードルアレイを製造するための任意の適切な方法が、本明細書に開示されるワクチン及び方法と共に使用するために企図される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、限定するものではないが、成形（例えば、自己成形、マイクロ成形、マイクロエンボス加工、マイクロインジェクション等）、鋳造（例えば、ダイカスト）、又はエッチング（例えば、ソフトマイクロリソグラフィ技術）を含む任意の適切な方法を使用して製造される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、実施例１０に従って調製される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、実施例１０に記載される１つ以上の工程に従って調製される。

【0234】

ＶＩ．キット
特定の実施形態では、本明細書に記載されるようなワクチンを含むキットが提供され、ワクチンが充填されたマイクロニードル、洗浄ワイプ、乾燥剤、及び包帯を含んでいる。特定の実施形態では、キットは、アジュバントがイミキモドである第２のアジュバント含有ワイプも含む。

【0235】

いくつかの実施形態では、キットは容器又はバイアルを含む。いくつかの実施形態では、容器又はバイアルはそれぞれ異なるＶＬＰ又はワクチンを含む。いくつかの実施形態では、容器は、ＰＢＳ又は他の薬学的に許容可能な担体等と共に、懸濁液中にＶＬＰを含む。いくつかの実施形態では、ワクチン又はＶＬＰは、エンドユーザによって（例えば、ＰＢＳ又は他の薬学的に許容可能な担体を用いて）再構成されるように構成された、凍結乾燥又はフリーズドライ等の乾燥又は動力を備えた形態である。いくつかの実施形態では、ワクチン又はＶＬＰは、マイクロニードル皮内投与用のトレハロース糖ガラス中にある。いくつかの実施形態では、キットは、第１の抗原（例えば、第１のＨＡサブタイプ、又は第１のインフルエンザウイルス由来のＨＡ）を含有するＶＬＰを含む第１の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、第２の抗原（例えば、第２のＨＡサブタイプ又は第２のインフルエンザウイルス由来のＨＡ）を含有するＶＬＰを含む第２の容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、第３の抗原（例えば、第１のＮＡサブタイプ）を含有するＶＬＰを含む第３の容器を含む。いくつかの実施形態では、容器は、本明細書に提供されるＶＬＰの混合物を含む。いくつかの実施形態では、キット中の容器はアジュバントを含む。いくつかの実施形態では、アジュバントはキット中の別個の容器にある。いくつかの実施形態では、容器は、ＰＢＳ等の薬学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な担体は、別個の容器内にある（例えば、ＶＬＰがフリーズドライ又は凍結乾燥されている場合）。いくつかの実施形態では、キット中の容器は、１つ以上の安定剤を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、対象へのＶＬＰの投与を可能にするデバイスを含む。そのようなデバイスの例は、ＶａｘｉＰａｔｃｈ中のマイクロニードル又は本明細書で提供される他のデバイスを含む。いくつかの実施形態では、キットはイミキモドワイプを含む。

【0236】

ＶＩＩ．製造方法
特定の実施形態では、（ｉ）本明細書に記載の抗原を含む第１の溶液と、（ｉｉ）第１の脂質及び第２の脂質等の１つ以上の脂質を含む第２の溶液とを微小流体的に組み合わせることを含む、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ）を作製する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の溶液は水溶液を含む。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の溶液はエタノール溶液を含む。いくつかの実施形態では、抗原はアンカー分子に結合している。いくつかの実施形態では、第１及び第２の溶液を組み合わせることは、第１及び第２の溶液を混合して、本明細書に記載のＶＬＰを形成する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、本明細書に記載の脂質小胞を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは脂質二重層を含む。いくつかの実施形態では、脂質小胞又は脂質二重層は、アンカー分子が脂質二重層に埋め込まれた第１の脂質及び／又は第２の脂質を含む。

【0237】

いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）アンカー分子に結合した抗原を含む水溶液を、（ｉｉ）第１の脂質及び第２の脂質を含むエタノール溶液と微小流体的に組み合わせ、それによって水溶液をエタノール溶液と混合して、アンカー分子が脂質二重層に埋め込まれている、第１及び第２の脂質を含む脂質二重層を含有するＶＬＰを形成することを含む。いくつかの実施形態では、水溶液をエタノール溶液と微小流体的に組み合わせることは、水溶液の流れをエタノール溶液の流れと混合することを含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、方法は、抗原ドメイン及び膜アンカードメインを含むペプチドを含む水溶液を提供すること、第１の脂質及び第２の脂質を含むエタノール溶液を提供すること、並びに／あるいは水溶液をエタノール溶液と組み合わせて、ペプチドが膜アンカードメインによって脂質小胞に固定され、抗原ドメインが脂質小胞の外面にあるＶＬＰを製造することを含む。いくつかの実施形態では、水溶液とエタノール溶液とを組み合わせることは、水溶液の流れとエタノール溶液の流れとのマイクロ流体混合を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、抗原は、組換えＤＮＡ法を使用して製造された精製タンパク質から製造される。いくつかの実施形態では、定義された精製組換えタンパク質を、マイクロ流体ミキサを使用して定義された脂質と混合して、化学的に定義されたＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）を形成する。マイクロ流体ミキサの例は、ＮａｎｏＡｓｓｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ）は、（１）任意の組換えＤＮＡベースのタンパク質発現系で本質的に純粋な抗原性タンパク質を製造すること、（２）脂質を化学的に定義すること、及び（３）マイクロ流体ミキサを使用してインビトロで組み立てることによって製造される。

【0240】

いくつかの実施形態では、方法は、制御されたマイクロ流体プロセスによってｓｅＶＬＰを製造する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体力学は、均一なサイズのリポソームをスケーラブルな市販量で製造する。いくつかの実施形態では、マイクロ流体力学は、抗原の天然の特性を保存する穏やかな溶媒を使用する。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、透析又は界面活性剤を使用せずに製造される。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、透析又は界面活性剤により製造される。

【0241】

いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載の界面活性剤等の界面活性剤を使用して精製される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は切断可能である。いくつかの実施形態では、界面活性剤により精製された抗原は、ＶＬＰを作製するために使用される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、オクチルグルコシド（ｎ－オクチル－β－ｄ－グルコシド）を含む。いくつかの実施形態では、切断可能な界面活性剤は、界面活性剤を除去するための製造における時間を短縮する（例えば、約５日から数分）。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、化学的に切断可能な界面活性剤（ＣＣＤ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＤは、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド等の界面活性剤中のジスルフィド結合のジスルフィド組込みによって誘導される。いくつかの実施形態では、界面活性剤のジスルフィド結合は、トリス（２－カルボキシエチル）ホヒン（ＴＣＥＰ）によって切断される。いくつかの実施形態では、界面活性剤のジスルフィド結合は、ジスルフィド結合を含有する天然タンパク質中のジスルフィドを切断しない条件下で切断される。いくつかの実施形態は、オクチルグルコシドの切断可能なジスルフィド複製を含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ）は、２つの工程によって作製される。第１の工程において、抗原は、組換えＤＮＡ法によって製造及び／又は精製される。第２に、抗原は、マイクロ流体力学によって規定の脂質と混合される。いくつかの実施形態では、抗原はタンパク質発現系において発現される。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＡ、ＮＡ、又はインフルエンザマトリックスタンパク質（インフルエンザＭ１又はＭ２等）である。いくつかの実施形態では、タンパク質発現系は、細菌、酵母、植物、昆虫細胞又は哺乳動物細胞系である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、細胞における抗原の発現を可能にするのに十分な条件下で、（１）抗原をコードするウイルス又は抗原をコードするウイルスで、及びいくつかの実施形態では、（２）抗原をコードするウイルスでもトランスフェクト又は感染される。第２に、いくつかの実施形態では、抗原は、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）等のマイクロフルイダイザ中でＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びコレステロールと混合される。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは押出成形によって作製される。いくつかの実施形態では、押出形成は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ製の押出装置等の押出装置の使用を含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、水溶液中でそれらの抗原と共に、エタノール溶液中で脂質と共に形成される。それぞれが水性溶液又はエタノール溶液のいずれかを含む２つの流れが、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ製のＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）等のミキサ内でマイクロ流体混合によって合わされる。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、少なくとも１つの合成又は本質的に純粋なホスファチジルコリン（ＰＣ）種及び少なくとも１つの合成又は本質的に純粋なホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を、３：１から１：３のモル比で含有又は含む、脂質成分を含み、アシル鎖が４～１８の炭素原子を有し、アシル鎖における不飽和結合の総数が４以下であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、合成ｌ，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及び合成ｌ，２－コレオイル－Ｓ７－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が使用される。いくつかの実施形態では、ＤＳＰＥ－ｐｅｇ２０００（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホホエタノアミン－Ｎ［アミノ（ポリエテレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、又は関連する脂質を使用して（例えば、精製された抗原と混合される）ＶＬＰを作製する。いくつかの実施形態では、脂質成分は、コレステロール等のステロール、又はステロール誘導体により、添加された総リン脂質の０～３０ｍｏｌ％の比で補充される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、合成又は本質的に純粋な成分で作製され、それを含み、又はそれからなる。いくつかの実施形態は、定義された品質、純度及び化学構造の外因的に添加された非ウイルス性リン脂質種を含む。いくつかの実施形態は、合成又は本質的に純粋なＰＣ及び／又はＰＥ種を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ｐｅｇ２０００を組み合わせることによって作製される。

【0244】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＤＯＰＥ対ＤＯＰＣの比が４：１～０．５：１で製造される。いくつかの実施形態では、ステロール又はステロール誘導体を添加して、ｓｅＶＬＰの保存安定性を高める。ステロール誘導体の例は、コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、フィトステロール、例えばラノステロール、エルゴステロール、並びにビタミンＤ及びビタミンＤ関連化合物を含む。いくつかの実施形態では、合わせたＤＯＰＣ及びＤＯＰＥに対するコレステロールの量は、約２０ｍｏｌ％である。

【0245】

いくつかの実施形態は、脂質に対する抗原の所定の比を含む。本開示のいくつかの実施形態の顕著な特徴は、マイクロ流体混合中のｓｅＶＬＰの膜への抗原の挿入である。ｓｅＶＬＰを調製するために、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を３００μｍのＳｔａｇｇｅｒｅｄ Ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ Ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒと共に使用する。いくつかの実施形態では、脂質をメタノール又はエタノールに所定の比率で溶解し、抗原を、界面活性剤である０．１～１０％オクチルグルコシド（ｎ－オクチル－β－ｄ－グルコシド）（ＯＧ）を含有するＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４水性緩衝液に溶解する。別の界面活性剤は、１，２－ジカプロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＣＰＣ）である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインを有する抗原は、ｓｅＶＬＰを形成する前に界面活性剤（複数可）中に維持される。いくつかの実施形態では、ＯＧ及びＤＣＰＣの臨界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ．）は、それぞれ２５ｍＭ及び１４ｍＭである。いくつかの実施形態では、５ｍＭ未満のｃ．ｍ．ｃ．を使用して、透析によって界面活性剤を除去する。一例として、水性緩衝生理食塩水及び１５～２０ｍＭのＤＣＰＣ中のインフルエンザｒＨＡタンパク質を、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐを用いてエタノール中のＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、コレステロール及び２～５ｍＭのＤＣＰＣと混合して、溶出液がＤＳＰＣの１４ｍＭのｃ．ｍ．ｃ．をわずかに下回るようにする。いくつかの実施形態では、この高速界面活性剤除去は、脂質界面活性剤及び脂質タンパク質界面活性剤ミセルの同時合体を導き、脂質及びタンパク質の直接共再構成をもたらし、均質なｓｅＶＬＰを形成する。いくつかの実施形態では、界面活性剤なしで、抗原の膜貫通ドメインは凝集体を形成し、これはインフルエンザＨＡの場合、ロゼット形成を導く。いくつかの実施形態では、そのような凝集は不可逆的である。いくつかの実施形態では、ｓｅＶＬＰは、組換えインフルエンザ膜タンパク質（複数可）の１ｍｇ当たり、２００～５００ｎｍｏｌのＤＯＰＣ、６００～１０００ｎｍｏｌのＤＯＰＥ、約２００～３００ｎｍｏｌのコレステロールを含む。水性流と溶媒流との間の流量比は、１：１～５：１（水性：アルコール）であり、３：１の比が好ましい。総流量は１～１０ｍＬ／分である。ｓｅＶＬＰを、７５０ｋＤタンジェンシャルフロー（ＴＦＦ）カラムＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＥ Ｔｕｂｉｎｇ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡを用いて精製及び濃縮した。

【0246】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ）は狭いサイズ分布を有する。いくつかの実施形態では、脂質小胞又はＶＬＰは、４０～２００ｎｍ、５０ｎｍ～１５０ｎｍ、又は７０ｎｍ～１３０ｎｍの範囲の直径（粒径）を有する。いくつかの実施形態では、脂質小胞又はＶＬＰは、１５０ｎｍ超の粒径を有するＶＬＰの１５％未満又は１０％未満、及び５０ｎｍ未満の粒径を有するＶＬＰの１５％未満又は１０％未満の均一なサイズ分布を有する。いくつかの実施形態では、モード径は９０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、コレステロールは、ＤＯＰＣの必要性を低下させ、ｓｅＶＬＰを安定化させる。

【0247】

いくつかの実施形態では、ＶＬＰのマイクロ流体調製が使用される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは超音波処理によって調製されず、及び／又は界面活性剤除去は透析によって行われない。いくつかの実施形態では、ＶＬＰのマイクロ流体調製は、超音波処理又は透析による界面活性剤除去によって調製されたｅＶＬＰ等のＶＬＰと比較して、サイズ変動をより均一なサイズに狭める。

【0248】

いくつかのＶＬＰは、本方法の１つ以上の工程又は工程の全てにおいて、界面活性剤を使用せずに作製される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰ（例えば、ｓｍＶＬＰ）は、ポリマーベースのナノディスクを用いて製造される。いくつかの実施形態では、ｓｍＶＬＰは、ポリメタクリレート（ＰＭＡ）コポリマーの使用を含む方法によって作製される。いくつかの実施形態では、メタクリレートコポリマーは、脂質二重層ナノディスクを形成する天然アポリポタンパク質の両親媒性らせん構造を模倣するように作製される。いくつかの実施形態では、両親媒性αヘリックスペプチドを使用してナノディスクを形成する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質及びペプチドの両親媒性構造は、脂質ナノディスクを形成するのに有益である。いくつかの実施形態では、そのようなタンパク質又はペプチドの両親媒性を模倣するために、疎水性及び親水性側鎖を含む両親媒性ポリメタクリレートランダムコポリマーを使用して、ナノディスク形成ポリマーを製造する。いくつかの実施形態では、それらのモノマー配列はランダムであるが、両親媒性ポリメタクリレートランダムコポリマーは、脂質二重層との相互作用時に両親媒性構造を提供する。いくつかの実施形態では、得られたポリマーの疎水性ブチルメタクリレート及びカチオン性メタクロイルコリンクロリドは、それぞれ脂質の疎水性アシル鎖及びアニオン性リン酸ヘッド基と相互作用して、ポリマーに囲まれた脂質ナノディスク構成を形成する。いくつかの実施形態では、コポリマーは、アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）によって開始されるフリーラジカル重合を使用して合成される。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、連鎖移動剤として使用されるメチル３－メルカプトプロピオネートの量を変化させることによって調整される。いくつかの実施形態では、疎水性／カチオン性の比は、２つのモノマーの供給比によって変化する。いくつかの実施形態では、得られたポリマーは、ジエチルエーテル中の再沈殿によって精製され、これはいくつかの実施形態では未反応モノマーの完全な除去の利益を提供する。

【0249】

いくつかの実施形態では、各合成ポリマーが脂質を可溶化する能力を、押出成形法によって調製されたＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）の大きな単ラメラ小胞（直径１００ｎｍのＬＵＶ）に対して濁度測定を実施することによって調べる。いくつかの実施形態では、ＤＭＰＣ小胞へのポリマーの添加は、多くの場合、溶液濁度の低下をもたらし、小胞のポリマー誘発断片化及び結果として生じる脂質ナノディスク形成を反映する。いくつかの実施形態では、両親媒性バランスの最適化は、効率的なナノディスク形成ポリマーを得るために有益である。

【0250】

いくつかの実施形態では、ナノディスクは、スチレンマレイン酸（ＳＭＡ）ポリマー又はコポリマーを含むか、又はそれを使用して形成される。いくつかの実施形態では、合成又は生物学的脂質膜へのＳＭＡの添加は、ナノディスクの自発的形成を導く。いくつかの実施形態では、そのようなポリマー結合ナノディスクは、保存された組み込まれた脂質分子の二重層組織化を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＡを使用する利点は、ネイティブな細胞膜環境からタンパク質を直接抽出するＳＭＡポリマーの能力である。脂質材料の起源に応じて、ＳＭＡＬＰという用語は、いくつかの実施形態では合成リポソームに由来する粒子に使用され、合成天然ナノディスクは、いくつかの実施形態では生体膜からの単離を指すために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰの使用は、界面活性剤を用いた膜タンパク質の単離、膜タンパク質のリポソームへの挿入、及びその後のＳＭＡの添加によるナノディスクの形成を含む。いくつかの実施形態では、これは、脂質がインビトロで定義されるという利点を有する。いくつかの実施形態では、天然のナノディスク系は、タンパク質を安定化させる最小限に乱された天然の脂質環境を維持しながら、界面活性剤と同様の可溶化力をナノディスクの小さな粒径と組み合わせる。

【0251】

いくつかの実施形態では、ＳＭＡＬＰは、ポリ（スチレン－コ－マレイン酸）（ＳＭＡ）から作製される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡは膜に組み込まれ、自発的にＳＭＡＬＰを形成する。いくつかの実施形態では、スチレン無水マレイン酸コポリマー試薬は、２：１のスチレン対マレイン酸比を使用する。いくつかの実施形態では、無水物ポリマー粉末が得られ、加水分解を使用して酸に変換される。いくつかの実施形態では、スチレン無水マレイン酸コポリマーは、１ＭのＮａＯＨに溶解される。いくつかの実施形態では、反応は、溶液を加熱及び還流しながら行われる。いくつかの実施形態では、室温で冷却した後である。いくつかの実施形態では、スチレン無水マレイン酸コポリマーは、濃ＨＣｌの添加によってｐＨを５未満に低下させることによって沈殿される。いくつかの実施形態では、沈殿物を水で３回洗浄し、続いて遠心分離を使用して分離する。いくつかの実施形態では、３回目の洗浄の最後に、沈殿物を０．６ＭのＮａＯＨに再懸濁する。いくつかの実施形態では、溶液を沈殿させ、再び洗浄し、０．６ＭのＮａＯＨに再懸濁する。いくつかの実施形態では、次いで、ｐＨをｐＨ８に調整する。いくつかの実施形態では、ポリマーは凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、スチレン無水マレイン酸コポリマーは、脂質の懸濁液に添加される。いくつかの実施形態では、ＳＭＡは脂質二重層と相互作用し、ＳＭＡＬＰに自己集合する。

【0252】

いくつかの実施形態では、免疫系に抗原を提示するＶＬＰとして使用される場合、ナノディスク技術は、一連の膜ＶＬＰ（ｍＶＬＰ）（細胞由来の天然ｍＶＬＰから、外因性脂質が脂質混合物に補充される半合成半合成ｍＶＬＰ、全ての脂質がインビトロで定義され供給される完全なｓｍＶＬＰまでを提供する。

【0253】

いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡ又はＳＭＡは、天然の細胞膜から膜タンパク質を直接抽出する能力を提供する。いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に記載のＶＬＰが組換えＤＮＡ法によって製造されたインフルエンザＨＡ、ＮＡ又はＭ２抗原を含む場合）、これはワクチンナノディスク形成を単純化する。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡを細胞膜に直接添加して、タンパク質発現系の膜に埋め込まれた組換え方法によって製造されたワクチン抗原（複数可）を抽出する。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡは、Ａｎａｔａｃｅから得られる。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡを含むナノディスクの抗原は、例えば抗原のＣ末端にＨＩＳタグを含む。いくつかの実施形態では、抗原及び／又はＤＩＢＭＡナノディスクはＩＭＡＣクロマトグラフィによって精製される。いくつかの実施形態では、ナノディスクは、ＤＩＢＭＡのベルトによって定義される産生細胞の平坦な脂質膜に埋め込まれた抗原（例えばＨＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＩＢＭＡにＤＭＰＣ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）が補充される。いくつかの実施形態では、そのような補充は、産生細胞からの抗原の抽出を改善する利点を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは天然ナノディスクを含む。いくつかの実施形態では、ナノディスクは合成又は半合成である。

【0254】

いくつかの実施形態では、組換えペプチドを含む抗原をコードする核酸分子を含むベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクター等の組換えポリペプチドの発現のための任意の適切なベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｐＣＡＧＧＳ発現ベクター又はｐＦａｓｔＢａｃｌバキュロウイルス移入ベクタープラスミドである。いくつかの実施形態では、トランスフェクション又はバキュロウイルス発現に使用される任意の発現ベクターが使用される。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。特定の例では、プロモータはＣＭＶ又はＳＶ４０プロモータである。

【0255】

Ａ．哺乳動物細胞における抗原生成
本明細書に記載のワクチン及び方法と共に使用するための抗原は、任意の適切な方法によって作製される。いくつかの実施形態では、ＨＡタンパク質又はＮＡタンパク質等の所望の抗原をコードする核酸分子は、いくつかの実施形態では、インフルエンザマトリックスタンパク質（複数可）をコードする核酸分子と共に、それぞれ発現プラスミド（例えば、ｐＣＡＧＧＳ）にクローニングされる。いくつかの実施形態では、抗原、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ及び／又はＨＡコード配列は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、得られたベクターを、マトリックスタンパク質（複数可）含有ベクターと共に細胞にトランスフェクトする。いくつかの実施形態では、マトリックスタンパク質（複数可）は、ＨＡ又はＮＡと同じベクターから発現される。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。いくつかの実施形態では、細胞は、２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、ＣＨＯ細胞等を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、細胞は、抗原が細胞によって発現されることを可能にする条件下でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を３７℃で約７２時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、タンパク質は当業者に周知の標準的な技術によって精製される。

【0257】

いくつかの実施形態では、タンパク質の量は、ウエスタンブロット又は他の定量的イムノアッセイ、ブラッドフォードアッセイ、及びＨＡの場合、ＦＤＡ承認の力価試験、単純放射状イムノアッセイ（ＳＲＩＤ）試験によって決定される。

【0258】

Ｂ．昆虫細胞における抗原生成
いくつかの実施形態では、抗原は昆虫細胞で産生される。いくつかの実施形態では、核酸分子は抗原をコードする。いくつかの実施形態では、インフルエンザマトリックスタンパク質（複数可）をコードする核酸分子と共に、それぞれバキュロウイルス移入ベクタープラスミド（例えば、ｐＦａｓｔＢａｃｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ）にクローニングされる。いくつかの実施形態では、マトリックスタンパク質（複数可）は、ＨＡ又はＮＡと同じバキュロウイルス移入ベクターから発現される。いくつかの実施形態では、抗原、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１及び／又はＭ２の発現は、オートグラファカリフォルニア多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ポリヘドリンプロモータの転写制御下にある。いくつかの実施形態では、抗原、Ｍ１、Ｍ２、ＮＡ及び／又はＨＡコード配列は、昆虫細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、各組換えバキュロウイルス構築物をプラーク精製し、マスターシードストックを調製し、同一性について特性決定し、ワーキングウイルスストックを調製するために使用する。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスマスター及びワーキングストックの力価を、迅速滴定キット（例えば、ＢａｃＰａｋ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）を用いて決定する。

【0259】

いくつかの実施形態では、昆虫細胞、例えばＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７１１）は、昆虫無血清培地（例えば、ＨｙＱ－ＳＦＸ ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）中、２７±２℃で懸濁培養として維持される。いくつかの実施形態では、組換えバキュロウイルスストックを、細胞当たり＜０．０１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の低感染多重度（ＭＯＩ）で細胞に感染させることによって調製し、感染の６８～７２時間後（ｈｐｉ）に回収する。

【0260】

いくつかの実施形態では、得られた抗原含有バキュロウイルスベクターを使用して細胞を感染させる。いくつかの実施形態では、マトリックスタンパク質（複数可）と共にバキュロウイルスベクターを含有する。いくつかの実施形態では、約２～３ｘ１０^６細胞／ｍｌが抗原含有バキュロウイルスベクターに感染される。得られた感染細胞を２７±２℃で連続的に撹拌しながらインキュベートし、例えば遠心分離（例えば、４０００ｘｇで１５分間）によって約６８～７２ｈｐｉで回収する。いくつかの実施形態では、抗原は、当技術分野で公知の標準的な方法によって精製される。

【0261】

ＶＩＩＩ．使用方法
特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を予防する、その発生を減少させる、及び／又はその重症度を低下させる方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を予防する方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンをそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患の発生を減少させる方法が本明細書に開示される。特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチンをそれを必要とする対象に投与することを含む、疾患の重症度を低下させる方法が本明細書に開示される。

【0262】

いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は疾患の重症を予防する。いくつかの実施形態では、投与は疾患の発生を減少させる。いくつかの実施形態では、投与は疾患の重症度を低下させる。いくつかの実施形態では、投与は、疾患を予防し、その発生を減少させ、及び／又はその重症度を低下させる。いくつかの実施形態では、方法は、疾患を予防すること、疾患の発生を減少させること、又は疾患の重症度を低下させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のワクチンを対象に投与することを含み、当該投与が、疾患を予防するか、疾患の発生を減少させるか、又は疾患の重症度を低下させる。

【0263】

方法のいくつかの実施形態では、疾患は感染症である。いくつかの実施形態では、疾患は、細菌、真菌、又はウイルス感染症を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症はインフルエンザ感染症を含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物又はヒト対象である。

【0264】

特定の実施形態では、ワクチンを対象に投与することを含む、疾患を予防するか、疾患の発生を減少させるか、又は疾患の重症度を低下させるための方法が本明細書で開示され、当該投与が、疾患を予防するか、疾患の発生を減少させるか、又は疾患の重症度を低下させる。いくつかの実施形態では、疾患は感染症である。いくつかの実施形態では、疾患は、細菌、真菌、又はウイルス感染を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス感染症はインフルエンザ感染症である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物又はヒト対象である。

【0265】

いくつかの実施形態では、投与は、１つ以上の針又はマイクロニードルによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、予め形成された液体シリンジによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、鼻腔内、皮内、筋肉内、皮膚パッチ、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、又は髄腔内投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇの用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される範囲の用量のワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、１００ｐＬ～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、５～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、１０～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。

【0266】

Ａ．投与方法
開示されるワクチンのいずれかは、任意の適切な方法によって対象に投与される。適切な投与方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、全身、皮下、粘膜、膣、直腸、鼻腔内、吸入又は経口が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、皮下、静脈内又は筋肉内投与等の非経口投与は注射によって達成される。いくつかの実施形態では、注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液、注射前の液体の溶液若しくは懸濁液に適した固体形態、又はエマルジョンのいずれかの従来の形態で調製される。いくつかの実施形態では、注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、錠剤等から調製される。いくつかの実施形態では、投与は全身性である。いくつかの実施形態では、投与は局所的である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンは、経口、鼻腔内、肺、直腸及び膣等の粘膜ワクチン接種用に製剤化される。具体的な例において、これは鼻腔内投与によって達成される。いくつかの実施形態では、投与は、糖ガラスを含む本明細書に記載のワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態では、糖ガラスはトレハロースを含む。

【0267】

いくつかの実施形態では、投与は、予め形成された液体シリンジによる投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、１つ以上の針又はマイクロニードルによる投与を含む。いくつかの実施形態では、１００ｐＬ～２０ｎＬのワクチンは、各マイクロニードルによって投与される。いくつかの実施形態では、投与は、鼻腔内、皮内、筋肉内、皮膚パッチ、局所、経口、皮下、腹腔内、静脈内、全身、又は髄腔内投与を含む。

【0268】

いくつかの実施形態では、投与は、針又はマイクロニードルでワクチンを注射する前に、投与部位においてワイプで対象の皮膚を擦る又は拭き取ることを含む。いくつかの実施形態では、ワイプは洗浄ワイプである。いくつかの実施形態では、ワイプはイミキモドワイプである。いくつかの実施形態では、マイクロニードルデバイスを用いて投与部位にワクチンを注射する前に、イミキモドワイプを対象の投与部位の対象の皮膚に擦り込んで、イミキモドがワクチン接種部位の皮膚に擦り込まれるようにする。

【0269】

いくつかの実施形態は、マイクロニードル投与を含む。いくつかの実施形態は、皮膚パッチ投与を含む。いくつかの実施形態は、マイクロニードルスキンパッチ投与を含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルを対象の洗浄された皮膚上に配置し、皮膚内に押し込む。いくつかの実施形態では、マイクロニードル皮膚パッチは、液体分注工程でマイクロニードル上又はマイクロニードル内に充填された用量のワクチンを含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードル当たり１０～２０ｎＬのマイクロ流体分注が使用される。

【0270】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、各マイクロニードル内のウェル内で乾燥される。いくつかの実施形態では、これは、１０ニュートン未満の軽い力が送達に成功するのに十分であるようにマイクロニードルを鋭く保つ。いくつかの実施形態では、ワクチンを各マイクロニードルの外側で乾燥させる。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイが投与に使用される。

【0271】

いくつかの実施形態では、ワクチンはマイクロニードル上にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ワクチンはマイクロニードルにパッケージング又は包埋される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、マイクロニードルの中又は上にパッケージングした後に脱水される。いくつかの実施形態では、マイクロニードルは、単位用量のワクチンで個別にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、単位用量は、抗原に対する免疫応答を対象において誘導するのに有効である。いくつかの実施形態では、単位用量は、室温で少なくとも約１週間（例えば、約１、２、３、４、６、８、１２週間又はそれを超える週）貯蔵した後、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効である。いくつかの実施形態では、単位用量は、室温で少なくとも約１ヶ月間（例えば、約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２ヶ月又はそれを超える月）貯蔵した後、対象において抗原に対する免疫応答を誘導するのに有効である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、抗原に対する対象の免疫応答を誘導するのに有効な量で存在する。いくつかの実施形態では、マイクロニードル投与は無痛である。

【0272】

いくつかの実施形態では、ワクチン抗原は、用量当たりの抗原の量に関して発現される。いくつかの実施形態では、用量は、１００μｇの抗原又は総タンパク質（例えば、１～１００μｇ、例えば約１μｇ、５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ又は１００μｇ）を有する。いくつかの実施形態では、発現ははるかに低いレベル（例えば、１μｇ／用量、１００ｎｇ／用量、１０ｎｇ／用量、又は１ｎｇ／用量）で見られる。

【0273】

いくつかの実施形態では、対象は、ワクチン接種前にアジュバントで前治療される。いくつかの実施形態では、アジュバントはイミキモドである。

【0274】

Ｂ．投与時期
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のワクチンの複数回投与又は用量を含む。いくつかの実施形態では、開示されるワクチンは、単回又は複数回用量（例えば、追加免疫）として投与される。いくつかの実施形態では、第１の投与の後に第２の投与が続く。いくつかの実施形態では、第２の投与は、投与されたワクチンと同じであるか、又は異なるワクチンである。いくつかの実施形態では、第２の投与は、投与された第１のワクチンと同じワクチンである。いくつかの実施形態では、第２の投与は、投与された第１のワクチンとは異なるＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）を含むワクチンによるものである。いくつかの実施形態では、第１のワクチンが第１のＨＡサブタイプ及び第２のＨＡサブタイプを含む場合、第２のワクチンは第３のＨＡサブタイプ及び第４のＨＡサブタイプを含み、４つのサブタイプは全て異なる（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、及びＨ９のうちの４つ等）。

【0275】

いくつかの実施形態では、２つ以上のＶＬＰを含有するワクチンは、複数回用量、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回用量（２～３回用量等）として投与される。いくつかの実施形態では、用量間のタイミングは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、又は少なくとも５年、例えば１～４週間、２～３週間、１～６ヶ月、２～４ヶ月、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、又は１０年、あるいはそれらの組合わせである（例えば、少なくとも３回の投与があり、第１の用量と第２の用量との間、及び第２の用量と第３の用量との間のタイミングが、いくつかの実施形態では、同じであるか、又は異なる）。

【0276】

Ｃ．用量
いくつかの実施形態では、方法は、１ｐｇ、１０ｐｇ、２５ｐｇ、１００ｐｇ、２５０ｐｇ、５００ｐｇ、７５０ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、若しくは１ｇのワクチン若しくはＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）の用量、又は前述の用量のいずれか２つによって定義される用量の範囲を投与することを含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、対象に、約１～約１００μｇの各ＶＬＰ、例えば、約１μｇ～約５０μｇ、１μｇ～約２５μｇ、１μｇ～約５μｇ、約５μｇ～約２０μｇ、又は約１０μｇ～約１５μｇの各ＶＬＰが投与される（例えば、静脈内又は全身）。いくつかの実施形態では、対象に、約１５μｇの各ＶＬＰが投与される。いくつかの実施形態では、対象に、約１０μｇの各ＶＬＰが投与される。いくつかの実施形態では、対象に、約２０μｇの各ＶＬＰが投与される。いくつかの実施形態では、対象に、約１μｇ又は２μｇの各ＶＬＰが投与される。

【0278】

いくつかの実施形態では、対象に投与される用量は、対象において有益な治療応答を経時的に誘導するか、又は感染症を阻害若しくは予防するのに十分である。いくつかの実施形態では、用量は対象ごとに異なるか、又は対象の種、年齢、体重及び全身状態、治療されている感染症の重症度、及び／又は使用されている特定のワクチン及びその投与様式に応じて投与される。

【0279】

Ｄ．免疫応答を測定する方法
いくつかの実施形態は、免疫応答を測定することを含む。いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるワクチンが免疫応答を誘発又は刺激するかどうか、例えば免疫化の成功を達成するかどうかを決定する方法を含む。例示的なアッセイが本明細書で提供されるが、本開示は特定のアッセイの使用に限定されない。

【0280】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンの投与後、１つ以上のアッセイを実施して、得られた免疫応答を評価する。いくつかの実施形態では、アッセイはまた、ワクチンの投与前に、及び／又はベースライン若しくは対照として機能するために行われる。いくつかの実施形態では、ワクチンの投与後に、血液又は血清試料等の試料を対象から回収する。いくつかの実施形態では、試料は、第１のワクチン投与の少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、又は少なくとも８週間後（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週後）に回収される。いくつかの実施形態では、例えば後続のワクチン投与後に、後続の試料も得られる。

【0281】

１．赤血球凝集アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンの製造及び精製後、赤血球凝集アッセイが行われる。いくつかの実施形態では、そのようなアッセイは、赤血球凝集単位（ＨＡＵ）を測定又は評価するために行われる。いくつかの実施形態では、これは、ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）が機能性ＨＡ三量体を提示し、いくつかの実施形態では、ＶＬＰ調製物中のＨＡタンパク質を定量するために使用されることを評価するために使用される。赤血球凝集はまた、チャレンジウイルスに使用されるインフルエンザウイルスの量を定量するために、又は例えば、チャレンジ動物の肺又は呼吸器に存在するウイルスの量（力価）を定量するために使用される。いくつかの実施形態では、ワクチン接種対象は、偽ワクチン接種対象と比較してウイルス力価の低下を示す。

【0282】

いくつかの実施形態では、アッセイを使用して、ＶＬＰの量を定量するか、又は更に本明細書で提供されるワクチンを以前に投与したウイルスチャレンジ対象からの肺試料等の試料中のウイルスを定量する。いくつかの実施形態では、ワクチンを段階希釈し（例えば、１：４から１：４０９６の２倍）、次いで、赤血球（ＲＢＣ）を含むウェルに添加する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ溶液（０．７５％～１％ＲＢＣ等）をウェルに添加する。いくつかの実施形態では、次いで、混合物を室温で３０分間インキュベートし、これによりＲＢＣを沈降させる。いくつかの実施形態では、次いで、試料は、例えば試料が配置されているマイクロ力価ウェルを調べることによって、得られた凝集パターンについて分析される。例えば、その端部に配置されたマイクロタイタープレートでは、ＲＢＣ対照ウェル内のＲＢＣは特徴的なティアドロップ形状に流れる（インフルエンザウイルスは存在せず、したがって凝集はない）。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスを含有するウェルは、ＲＢＣを様々な程度に凝集させる。いくつかの実施形態では、ウイルスが架橋赤血球を有し、それらのペレット化を妨げるため、最大量のウイルスを含むウェルは濁って見える。いくつかの実施形態では、後続のウェル中のより少ない量のウイルスが部分凝集をもたらすが、ペレットはＲＢＣ対照ウェル中のペレットと同様のティアドロップ形状に流れ込まない。いくつかの実施形態では、エンドポイントは、ＲＢＣの完全な凝集をもたらすワクチンの最大希釈として決定される。

【0283】

いくつかの実施形態では、滴定される試料中の赤血球凝集単位（ＨＡＵ）の数が決定される。ＨＡ力価は、ＲＢＣの完全な凝集を示す一連の最後のウェルの希釈の逆数である（例えば、最後の希釈が１：６４０である場合、試料の力価は６４０ＨＡ単位／５μｌ試料である）。

【0284】

２．赤血球凝集阻害（ＨＡ１）アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンの投与後、赤血球凝集阻害（ＨＡ １）アッセイが行われる。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、赤血球を凝集させ、これは赤血球凝集と呼ばれるプロセスである。いくつかの実施形態では、表面ヘマグルチニンに対する特異的抗体の存在下で、赤血球凝集が阻止される。いくつかの実施形態では、この現象は、血清中の特異的抗ウイルス抗体を検出及び定量するために使用されるＨＡ１アッセイの基礎を提供する。したがって、ＨＡ１は、（ＲＢＣの赤血球凝集によって評価されるように）ＨＡ受容体結合を遮断する抗体の存在を測定する。

【0285】

いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンのヘッドに対する抗体の存在について評価される血清を、３７℃で一晩、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）で処理する。いくつかの実施形態では、翌日、ＲＤＥを５６℃で１時間のインキュベーションによって不活性化する。いくつかの実施形態では、使用されるアッセイプレートは、９６ウェル非滅菌非組織培養処理済み丸底マイクロタイタープレートである。いくつかの実施形態では、２倍段階希釈がプレートの行Ｂから行Ｇまでの各試料に対して行われる。ウイルス抗原のワーキング希釈物５０μｌ（設定数のＨＡＵ）が、列Ｈ（ＲＢＣ対照ウェル）及び抗原対照ウェルを除くマイクロタイタープレートの全てのウェルに添加される。いくつかの実施形態では、プレートを室温で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ中１％ＲＢＣ懸濁液５０μｌを全てのウェルに添加し、プレートを室温で３０～４５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、マイクロタイタープレートを分析して凝集パターンを読み取る。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスがＲＢＣを完全に凝集させるため、陰性対照ウェル（抗インフルエンザ抗体を含まない正常血清を含有するもの）は濁って見える。いくつかの実施形態では、陽性対照ウェル（既知の抗インフルエンザ抗血清を含有するもの）は、凝集を阻害するのに十分な抗インフルエンザ抗体が存在する場合に限り、列Ｈ対照ペレットと外観が類似したＲＢＣペレットを有する。いくつかの実施形態では、血清希釈が増加すると、抗体の量が減少し、したがってＲＢＣ凝集の量が増加することが明らかになる。いくつかの実施形態では、各血清試料の赤血球凝集阻害（ＨＡ１）力価は、ＲＢＣの凝集を完全に阻害する最大希釈の逆数である（例えば、ＲＢＣペレットを形成する希釈系列の最後のウェル）。いくつかの実施形態では、各試料に対するＨＡ１力価は、その二重希釈系列のエンドポイント力価の平均である。いくつかの実施形態では、複製物の力価が２倍超の希釈で異なる場合、その試料についてＨＡ１力価が繰り返される。

【0286】

３．インフルエンザウイルス中和アッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンの投与後、中和アッセイが行われる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるワクチンを受けた対象からの血清試料を希釈し、インフルエンザウイルスを添加し、ウイルス増殖を予防するのに必要な血清の量を決定する。いくつかの実施形態では、中和は、ウイルス複製を阻害する抗体の存在を評価する。いくつかの実施形態では、ＨＡのストークに対する抗体は、例えば、ウイルス複製を中和するが、エピトープが受容体結合ドメインの周囲にないため、赤血球凝集には影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ヘッドに結合し、赤血球凝集を阻害する抗体は、通常、中和している。

【0287】

いくつかの実施形態では、血清試料を、例えば９６ウェル丸底組織培養処理マイクロタイタープレート中の組織培養培地（抗生物質を含有するＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ等）中でインキュベートする。いくつかの実施形態では、血清試料を、例えばマイクロウェルプレートの隣接する２組のウェルで段階希釈する（例えば、最初に希釈した１：１０を１：６４０の試料に希釈する）。いくつかの実施形態では、（任意のサブタイプの）以前に滴定されたインフルエンザウイルスを、希釈して、１ＴＣＩＤ_{５０／５０}μｌを含む。いくつかの実施形態では、等量のワーキングストックウイルス（約５０ＴＣＩＤ_５０等）を各血清試料（段階希釈を含む）に添加し、３７℃で１時間インキュベートする。いくつかの実施形態では、このプロトコルを用いて、ウイルスの最終量が１０～１００ＴＣＩＤ_５０である場合、同じ中和力価が得られる。いくつかの実施形態では、インキュベーション後に、２．５ｘ１０^５のＭＤＣＫ細胞／ｍｌ（又は他の細胞）を含有する組織培養培地（抗生物質を含むＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ等）を血清試料（例えば、マイクロタイタープレートの全てのウェル）に添加する。いくつかの実施形態では、これを加湿３７℃、５％のＣＯ_２インキュベータ内で一晩インキュベートする。いくつかの実施形態では、いくつかのインフルエンザウイルスは、３４℃～３５℃の温度でより良好に増殖し、したがって、それらの温度が使用される。いくつかの実施形態では、培地を除去し、トリプシン（０．０００２％等）を含有する組織培養培地（抗生物質を含むＤＭＥＭ等）と交換し、混合物を加湿３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで４日間インキュベートする。いくつかの実施形態では、続いて、滅菌０．５％ＲＢＣ／ＰＢＳ溶液を添加し、混合物を４℃で１時間インキュベートし、ウェルを凝集の存在について確認する。いくつかの実施形態では、特定の血清試料のウイルス中和力価は、両方のウェルがＲＢＣの凝集を示さない血清の最高希釈の逆数として定義される。

【0288】

いくつかの実施形態では、十分な濃度でインフルエンザウイルス中和抗体を含有する試料（例えば、マイクロウェル内で）は、ウイルスが細胞に感染することを防ぎ、その結果、ウイルスの増殖が起こらないようにする。いくつかの実施形態では、ＲＢＣをこれらのウェルに添加すると、ＲＢＣのペレットが形成される。対照的に、いくつかの実施形態では、抗インフルエンザ抗体を全く含まないか、又は中和濃度よりも低い試料（例えば、マイクロウェル内で）は、４日間のインキュベーションの最後にインフルエンザウイルスが存在するであろう。いくつかの実施形態では、これらの試料に添加されたＲＢＣは凝集するであろう。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、赤血球を架橋し、マイクロウェルにおけるそれらの沈降を阻害し、したがって、ウェルは濁って見える。

【0289】

４．ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体価アッセイ
いくつかの実施形態では、ノイラミニダーゼ阻害（ＮＩ）抗体価は、ワクチンがＮＡタンパク質を含有する場合に測定される。いくつかの実施形態では、ＮＩ抗体価を測定するために、適切なＮＡを含有する再集合体ウイルスが、例えば、プラスミドに基づく逆遺伝学を使用することによって作製される。いくつかの実施形態では、適切なＮＡは、対象に投与されたワクチン中に存在するもの（複数可）と同じである。いくつかの実施形態では、ＮＩアッセイは、フェチュインをＮＡ基質として使用して行われる。例示的な方法を以下に提供する。

【0290】

いくつかの実施形態では、ＮＩ力価は、ＮＡ活性の少なくとも５０％の阻害をもたらす血清の最大希釈の逆数である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＶＬＰの使用は、ＶＬＰを投与された対象におけるチャレンジウイルス力価を減少させるか、又は排除さえすることが予想されるであろう。いくつかの実施形態では、ＶＬＰを投与された対象は、ＶＬＰを投与されなかった対象（例えば、擬似ワクチン接種されている）に比べて、肺内に多くとも１０分の１、多くとも２０分の１、多くとも５０分の１、又は更には１００分の１となるウイルスを有すると予想される。

【0291】

いくつかの実施形態では、ＮＩ抗体価が、脱シアリル化されたフェチュインに結合するためにペルオキシダーゼ標識ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ－ＰＯ）を使用する酵素結合レクチンアッセイにおいて決定される。いくつかの実施形態では、ＮＡ活性は、フェチュインコーティングマイクロタイタープレート上で精製された全長ＮＡの段階希釈液をインキュベートすることによって決定される。いくつかの実施形態では、室温で３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＰＮＡ－ＰＯを添加する。いくつかの実施形態では、室温で１時間のインキュベーション後、プレートを再び洗浄し、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを添加し、発色を１０分間進行させた。いくつかの実施形態では、発色を停止させ、プレートのＯＤ４５０を測定する。いくつかの実施形態では、９５％のＮＡ活性に対応する希釈度が決定される。

【0292】

いくつかの実施形態では、ＮＡサブタイプに対するＮＩ力価が、９６ウェルＵ底組織培養プレートにおいて、血清の１：２０希釈から始めて、その後、２倍段階希釈で測定される。いくつかの実施形態では、９５％の最大活性に対応するＮＡを希釈血清に添加し、室温で３０分間インキュベートし、その後、血清／ＮＡ試料をフェチュインコーティングマイクロタイタープレートに移す。いくつかの実施形態では、プレートを３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、ＰＮＡ－ＰＯを添加する。いくつかの実施形態では、プレートを室温で更に１時間インキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢを添加する。いくつかの実施形態では、発色は、１０分後に停止され、プレートのＯＤ４５０が測定される。いくつかの実施形態では、ＮＩ力価は、５０％のＮＡ活性が阻害される希釈の逆数である。いくつかの実施形態では、アッセイの定量の下限は２０である。２０未満の力価はネガティブであると見なされ、１０の値が割り当てられる。いくつかの実施形態では、良好又はポジティブな応答は、＞３０の値をもたらし、一方、不十分な応答又は応答なしは、＜２０の値をもたらす。

【0293】

５．ウイルス肺力価及び病理
いくつかの実施形態では、ウイルス肺力価及び病理学が決定される。いくつかの実施形態では、肺試料（例えば、膨張した肺試料）等の組織試料を固定し（例えば、１０％ホルムアルデヒド中で２４時間の固定）、包埋し（例えば、パラフィン中）、切片に切断し（例えば、５μｍ等の１～１０μｍ）、マウントする。

【0294】

いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルス抗原分布は、適切な抗体を使用する免疫組織化学によって評価される。いくつかの実施形態では、抗体は、対象をチャレンジするために使用されるウイルスに特異的であるか、又は異なるインフルエンザウイルス株に対して交差反応性であるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるワクチンの使用は、ワクチンを受けた対象のウイルス力価を減少させるか、又は排除さえするであろうことが予想される。いくつかの実施形態では、ワクチンを投与された対象は、ワクチンを投与されなかった対象（例えば、擬似ワクチン接種されている）に比べて、肺内に多くとも１０分の１、多くとも２０分の１、多くとも５０分の１、又は更には１００分の１となるウイルスを有すると予想される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるワクチンの使用は、ワクチンを受けた対象において、気管支炎、細気管支炎、肺胞炎、及び／又は肺水腫等のインフルエンザ感染の症状を減少させるか、又は排除さえするであろうことが予想される。いくつかの実施形態では、ワクチンを受けた対象は、ワクチンを受けなかった対象（例えば、擬似ワクチン接種されている）と比較して、気管支炎、細気管支炎、肺胞炎、及び／又は肺水腫（又はこのような症状の重症度における減少）が少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％少ないと予想される。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは多価である。

【0295】

６．他の例示的なアッセイ
いくつかの実施形態では、対象は、呼吸ＩｇＡ及び／又は全身性ＩｇＧ、Ｔ細胞応答について評価される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、トランスクリプトミクス及びサイトカインＥＬＩＳＡ又は他のサイトカインイムノアッセイによって分析される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、マイクロ中和試験によって分析される。いくつかの実施形態では、免疫応答は、抗ＨＡストークアッセイによって分析される。

【0296】

Ｅ．ワクチンを評価する方法
特定の実施形態では、ワクチンの有効性を決定する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態は、ワクチンを投与された対象から得られた試料を得ることを含み、試料はウイルスの存在又は量を含む。いくつかの実施形態は、ウイルスタンパク質に結合することができるＡＣＥ２又はその断片を含む基質を提供することを含む。いくつかの実施形態は、基質を試料と接触させて、試料中のウイルス又はタンパク質ウイルスをＡＣＥ２又はその断片に結合させることを含む。いくつかの実施形態は、基質のＡＣＥ２又はその断片に結合した、ウイルス又はタンパク質ウイルスを検出することを含む。いくつかの実施形態は、基質のＡＣＥ２又はその断片に結合した検出されたウイルス又はタンパク質ウイルスに基づいて、試料中のウイルスの存在又は量を決定し、それによってワクチンの有効性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、試料は対象に由来する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血清、又は血漿を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、試料中のウイルスの量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して減少する。いくつかの実施形態では、試料中のウイルスの量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して増加する。いくつかの実施形態は、試料中のウイルスの量又はワクチンの有効性に基づいて、対象にウイルス治療を推奨又は提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルス治療は、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＶＬＰを含むワクチン等の本明細書に記載のワクチンである。

【0297】

特定の実施形態では、ワクチンを投与された対象から得られた、抗ウイルス抗体の存在又は量を含む試料を得ることを含む、ワクチンの有効性を決定する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態は、抗ウイルス抗体に結合することができるウイルスタンパク質又はその断片を含む基質を提供することを含む。いくつかの実施形態は、基質を試料と接触させて、ウイルスタンパク質又はその断片に試料中の抗ウイルス抗体を結合させることを含む。いくつかの実施形態は、基質のウイルスタンパク質又はその断片に結合した抗ウイルス抗体を検出することを含む。いくつかの実施形態は、基質のウイルスタンパク質又はその断片に結合した検出された抗ウイルス抗体に基づいて試料中の抗ウイルス抗体の存在又は量を決定し、それによってワクチンの有効性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、試料は対象に由来する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血清、又は血漿を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、試料中の抗ウイルス抗体の量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して減少する。いくつかの実施形態では、試料中の抗ウイルス抗体の量は、対象がワクチンを投与される前に対象から得られた別の試料と比較して増加する。いくつかの実施形態は、試料中の抗ウイルス抗体の量又はワクチンの有効性に基づいて、対象にウイルス治療を推奨又は提供することを更に含む。いくつかの実施形態では、ウイルス治療は、ＣＯＶＩＤ－１９治療等のコロナウイルス治療を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ＶＬＰを含むワクチン等の本明細書に記載のワクチンである。

【0298】

ＩＸ．実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれ、本発明の範囲を限定することを意図しない。

【実施例1】

【0299】

ＶＬＰワクチンの使用
実験動物における最適な広域交差反応性ＶＬＰ（例えば、ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ）ワクチンの選択後、多価インフルエンザｓｅＶＬＰ（例えば、Ｐａｒａｇｏｎ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．製等の適正製造規範（ＧＭＰ）を使用して製造されるもの）を用いてヒトにおいて試験を行う。いくつかの実施形態では、ＶＬＰはＭ１及びＭ２も含む。多価ＶＬＰは、いくつかの実施形態では、アジュバントとしてＭＰＬも含む。

【0300】

Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、及びＨ９を別々に提示するＨＡ ＶＬＰと、Ｎ１及びＮ２を別々に提示するＮＡ ＶＬＰとの混合物を含む多価ワクチン製剤は、ＧＭＰ法を使用して作製し、マイクロインジェクションによってヒトに投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されていない他の多価インフルエンザワクチンを試験する。

【0301】

簡潔には、ＶＬＰの多価混合物（１０μｇ～２０μｇ、例えばＨＡ／ＮＡのそれぞれが１５μｇ）を有するトレハロース糖ガラスを含むＶａｘｉＰａｔｃｈマイクロニードルアレイによるマイクロニードルインジェクションによってヒトにワクチン接種する。約３～１２週間後（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２週間後）、ヒトを同じ混合物で追加免疫する。ヒトの第２の群は、（例えば、生理食塩水で）擬似ワクチン接種される。いくつかの実施形態では、血液試料を得、保存する。試験の経過中の有害事象（ＡＥ）について、患者をモニタリングする。ＶＬＰワクチンは感染性ではないため、優れた安全性プロファイルを有することが予想される。

【0302】

ＶＬＰは第Ｉ相試験で安全であることが示されており、第ＩＩ相有効性試験は、ＮＩＨ臨床センターで開発されたようなヒトインフルエンザチャレンジモデルを使用して行う（例えば、Ｍｅｍｏｌｉ らによる、Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｗｉｌｄ－Ｔｙｐｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ Ｍｏｄｅｌ：Ｈ１Ｎ１ｐｄＭＩＳＴ，Ａｎ Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ Ｄｏｓｅ Ｆｉｎｄｉｎｇ ＩＮＤ Ｓｔｕｄｙを参照されたい）。対象を、健康状態についてスクリーニングし、チャレンジ２００９パンデミックＨ１Ｎ１ウイルスに対する低力価（＜１：１０）についてＨＡ１アッセイによってスクリーニングする。試験に登録されたスクリーニングされた患者に、ＶＬＰの多価混合物（コホート１）、又は生理食塩水による擬似ワクチン接種（コホート２）で、記載されるようにマイクロニードルインジェクションによってワクチン接種する。それらを３週間で追加免疫し、次いで６週間でそれらの血清学的力価をＨＡ１又は他のアッセイによって評価し、チャレンジ前のＨＡ１力価＜１：１０の６０％超の対象においてインフルエンザ病及び放出を誘導することが確認されたウイルスの用量で対象をチャレンジする。ワクチン有効性は、ワクチン接種に対する血清学的応答の発生、症状の軽減、ウイルス力価の低下、及び／又はウイルス放出期間の短縮によって評価される。

【実施例2】

【0303】

インフルエンザに対するワクチン接種
一価ＨＡ ｓｅＶＬＰ又は一価ＨＡ ｓｍＶＬＰをマイクロニードルインジェクション（全身免疫を誘導するため）でワクチン接種したラットは、異種致死的インフルエンザチャレンジから保護される。更に、アジュバントとしてＴＬＲアゴニストをワクチン接種したラットは、アジュバントを含まない同様のワクチンを投与したラットと比較して、罹患率の低下を示す。場合によっては、多価ｓｅＶＬＰ又はｓｍＶＬＰ混合物は、１９１８ Ｈ１Ｎ１、１９５７ Ｈ２、２００４ Ｈ５Ｎ１及び２０１３ Ｈ７Ｎ９等の致死的Ａ型インフルエンザウイルスから保護する。

【実施例3】

【0304】

非限定的な例示的方法
クローニング、発現及びタンパク質精製：抗原の遺伝子配列を合成し、Ｎｄｅｌ制限部位とＢａｍＨ１制限部位との間の発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）でクローニングする。クローニングは配列決定によって確認される。構築物は、大腸菌での発現のためにコドン最適化されている。

【0305】

タンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で過剰発現させ、細胞培養溶解物の可溶性画分から精製する。目的の抗原をコードする核酸を含むプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一コロニーを、５０ｍｌのＴａｒｔｏｆｆ－Ｈｏｂｂｓ ＨｉＶｅｇ．ＴＭ．培地（ＨｉＭｅｄｉａ）に接種する。一次培養物を３７℃で一晩増殖させる。２ＬのＴａｒｔｏｆｆ－Ｈｏｂｂｓ ＨｉＶｅｇ培地（５００ｍｌｘ４）（ＨｉＭｅｄｉａ）に１％の一次接種材料を接種し、約０．６～０．８のＯＤ_６００に達するまで３７℃で増殖させる。次いで、細胞を１ｍＭイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、２０℃で更に１２～１６時間増殖させる。細胞を５０００ｇで回収し、１００ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。細胞懸濁液を氷上での超音波処理によって溶解し、続いて１４，０００ｇで遠心分離する。上清を緩衝液平衡化Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）と共に４℃で２時間、穏やかな混合条件下でインキュベートして結合を促進する。重力流下、イミダゾール勾配（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）を用いてタンパク質を溶出する。目的のタンパク質又は抗原を含有する画分をプールし、１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ ７．４）に対して透析する。透析したタンパク質をＡｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）撹拌細胞装置中で約１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで濃縮する。タンパク質純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し、その同一性をＥＳＩ－ＭＳによって確認する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は抗原は、ポリペプチド又は抗原をコードする発現系特異的プロモータ又はコドン最適化ＤＮＡ配列を使用して、大腸菌以外の他の発現系、例えば酵母、植物及び動物で産生される。

【0306】

免疫化及びチャレンジ試験：雌のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（４～５週齢）を使用する。ラット（１０匹／群）を、０日目（プライム）、及び／又は２８日目（追加免疫）において、１００μｇのＣｐＧ７９０９アジュバント（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）と共に２０μｇの試験免疫原で筋肉内免疫化する。未処置（緩衝液単独）ラット及び／又はアジュバント処置ラットを対照として使用する。プライム後２１日及び／又は追加免疫の１４日後、ラットから、尾静脈静脈穿刺により得た血清試料をＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清分離管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）に採取する。一次及び／又は二次免疫化の２１日後、ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、２０μＬのＰＢＳ中のラット適応ウイルスのＩＬＤ_９０で鼻腔内チャレンジする。より高用量のウイルスに対する防御を試験するために、抗原でプライム及び追加免疫を行ったラットの１つの群を、同種ウイルスの２ＬＤ_９０でチャレンジする。ワクチンが防御を付与する能力を評価する。チャレンジされたラットの生存及び体重変化を、チャレンジ後１４日間毎日モニタリングする。各時点で、一群の生存ラットを一緒に秤量し、平均体重を計算する。平均体重の誤差は、同じ数の健康なラットの平均体重の３回の反復測定から推定する。

【0307】

血清抗体価の決定：試験免疫原に対する抗体価をＥＬＩＳＡによって決定する。試験免疫原を、４℃で一晩、５０μｌのＰＢＳ中、４μｇ／ｍｌで９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）にコーティングする。次いで、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を含有するＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳＴ中３％スキムミルクで１時間ブロックする。試験免疫原に対して生じた抗血清１００μｌをミルク－ＰＢＳＴで４倍系列に希釈し、各ウェルに添加する。プレートを室温で２時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで洗浄する。ミルク－ＰＢＳＴ中の５０μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を所定の希釈度（１：５０００）で各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルの基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液で展開し、３～５分の展開後に１００μｌ／ウェルのＴＭＢ用停止溶液で停止させる。４５０ｎｍにおけるＯＤを測定し、抗体価を、対照ウェルの平均＋２標準偏差を上回るＯＤ値を与えた最大希釈の逆数として定義する。

【実施例4】

【0308】

Ｂ／コロラド／０６／２０１７ ｒＨＡ構築物の設計、発現及び精製
Ｂ／コロラド／０６／２０１７（Ｂ／ＣＯ’１７）組換えＨＡ（ｒＨＡ）は、ＨＡのＣ末端に６ｘＨＩＳタグをもたらすトロンビン切断部位により設計した。切断されると、Ｂ／ＣＯ’１７タンパク質産物は、野生型配列に付加された３つのアミノ酸残基（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ）のみを含む。合成構築物のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＭＫＡＩＩＶＬＬＭＶＶＴＳＳＡＤＲＩＣＴＧＩＴＳＳＮＳＰＨＶＶＫＴＡＴＱＧＥＶＮＶＴＧＶＩＰＬＴＴＴＰＴＫＳＨＦＡＮＬＫＧＴＥＴＲＧＫＬＣＰＫＣＬＮＣＴＤＬＤＶＡＬＧＲＰＫＣＴＧＫＩＰＳＡＲＶＳＩＬＨＥＶＲＰＶＴＳＧＣＦＰＩＭＨＤＲＴＫＩＲＱＬＰＮＬＬＲＧＹＥＨＶＲＬＳＴＨＮＶＩＮＡＥＧＡＰＧＧＰＹＫＩＧＴＳＧＳＣＰＮＩＴＮＧＮＧＦＦＡＴＭＡＷＡＶＰＤＫＮＫＴＡＴＮＰＬＴＩＥＶＰＹＶＣＴＥＧＥＤＱＩＴＶＷＧＦＨＳＤＮＥＴＱＭＡＫＬＹＧＤＳＫＰＱＫＦＴＳＳＡＮＧＶＴＴＨＹＶＳＱＩＧＧＦＰＮＱＴＥＤＧＧＬＰＱＳＧＲＩＶＶＤＹＭＶＱＫＳＧＫＴＧＴＩＴＹＱＲＧＩＬＬＰＱＫＶＷＣＡＳＧＲＳＫＶＩＫＧＳＬＰＬＩＧＥＡＤＣＬＨＥＫＹＧＧＬＮＫＳＫＰＹＹＴＧＥＨＡＫＡＩＧＮＣＰＩＷＶＫＴＰＬＫＬＡＮＧＴＫＹＲＰＰＡＫＬＬＫＥＲＧＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥＧＧＷＥＧＭＩＡＧＷＨＧＹＴＳＨＧＡＨＧＶＡＶＡＡＤＬＫＳＴＱＥＡＩＮＫＩＴＫＮＬＮＳＬＳＥＬＥＶＫＮＬＱＲＬＳＧＡＭＤＥＬＨＮＥＩＬＥＬＤＥＫＶＤＤＬＲＡＤＴＩＳＳＱＩＥＬＡＶＬＬＳＮＥＧＩＩＮＳＥＤＥＨＬＬＡＬＥＲＫＬＫＫＭＬＧＰＳＡＶＥＩＧＮＧＣＦＥＴＫＨＫＣＮＱＴＣＬＤＫＩＡＡＧＴＦＤＡＧＥＦＳＬＰＴＦＤＳＬＮＩＴＡＡＳＬＮＤＤＧＬＤＮＨＴＩＬＬＹＹＳＴＡＡＳＳＬＡＶＴＬＭＩＡＩＦＶＶＹＭＶＳＲＤＮＶＳＣＳＩＣＬＶＰＲＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号：１５）

【0309】

下線の配列は合成トロンビン切断部位を表し、最後の６つのアミノ酸はＣ末端６ｘＨｉｓタグである。ネイティブインフルエンザＨＡ０、ＳａｎｏｆｉからのＦｌｕＢｌｏｋ（登録商標）のＨＡ０及びＶｅｒｎｄａｒｉ ｒＨＡ０００２３構築物を示す図を図１に示す。

【0310】

合成ベンダーとしてＡＴＵＭ ｂｉｏを使用した。ｐＤ２６００－ｖ１０プラスミド骨格を使用した。このベクターは、高レベルの一過性発現のために設計され、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を有する。ＣＨＯ細胞の配列最適化後、ＤＮＡ配列は配列番号１６に従った。

【0311】

ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｆｉｓｈｅｒ）を、Ｐ４継代で、Ｐ１で凍結したバイアルから２つのＥ２５０フラスコに増殖させた。この増殖培養物は、８．５５６ｘ１０６の密度を達成した。それぞれが２５ｍＬの培地中に１５０Ｍ細胞を含む５つのＥ１２５フラスコを調製した。５０ｍＬの培地中３００Ｍ細胞を用いて１つのＥ２５０フラスコも調製した。１２．３３ｕＬのプラスミドストックを用いて１ｕｇ／ｍＬでトランスフェクションを行った。トランスフェクションの１９時間後、エンハンサ及び供給試薬をトランスフェクション培養物に添加し、トリパンブルー色素排除によって初期密度及び生存率評価を行った。その後、これらの評価を、０．４ｍＬの懸濁培養物を使用して毎日行った。トランスフェクトされた細胞ペレットは、組換えＨＡの大部分を保持する。Ｂ／コロラド／０６／２０１７ ｒＨＡ０の精製のフローチャートを図２に示す。

【0312】

使用した溶解緩衝液は、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２ｍＭのＭｇＣｌ２（ベンゾナーゼ活性を支持するため）並びに２％ＬＤＡＯ界面活性剤（ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン－Ｎ－オキシド、Ａｎａｔｒａｃｅ）で構成されていた。ＬＤＡＯ界面活性剤をＩＭＡＣカラムで１％オクチルグルコシド界面活性剤に交換した。図３は、ＩＭＡＣカラムにおける溶解物の充填、界面活性剤交換及びｒＨＡの溶出を示す。

【0313】

図４のウエスタンブロットは、５００ｍＭのイマドゾールの勾配を有するｒＨＡ溶出プロファイルを示す。プールしたｒＨＡを濃縮し、緩衝液を１％含有ＰＢＳに交換した。このｒＨＡを使用して合成膜ＶＬＰを製造した。

【実施例5】

【0314】

リポソームの製造
イミキモド（ＩＭＱ）をリポソームに配合した。リポソームは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣを使用して形成した。水相はＰＢＳであった。有機相は、エタノール中の２５ｍｇ／ｍＬの脂質混合物及び３．５ｍｇ／ｍＬのＩＭＱからなっていた。流速は８ｍｌ／分であった。有機物に対する水の流量比は２．５であった。リポソームを直ちにＰＢＳで１０倍希釈した。エタノール及び組み込まれていないＩＭＱを、３０Ｋｄ Ａｍｉｃｏｎ濾過カラム及び４０００ｇ遠心分離で除去した。Ａｍｉｃｏｎ濃縮物をＰＢＳで希釈し、Ａｍｉｃｏｎ濾過を繰り返した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ－ＮＳを使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって、リポソームのサイズを決定した。図５に示すように、リポソームのサイズは平均９２ｎｍであった。

【0315】

ＩＭＱをＨＰＬＣによってリポソーム中で定量した。ＨＰＬＣは、Ｘｔｅｒｒａ Ｃ１８カラム（ＭＳ Ｃ１８ ５ｕｍ ４．６Ｘ１５０ｍｍカラム）、２９９８フォトダイオードアレイ検出器、２５２５バイナリ勾配モジュール、及びＵＶフラクションマネージャを備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ機器を含んでいた。移動相は１５％アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸であった。この系は、６０ｕＭ～３ｍＭのＩＭＱからのＩＭＱの線形線量反応曲線を与えた。

【0316】

図６は、ＩＭＱ含有リポソームの２４２ｎｍ、２４５ｎｍ及び２５４ｎｍにおけるＵＶスキャンを示す。ＩＭＱは９．７８分で溶出している。ＩＭＱを含有するこれらのリポソームを、ＶａｘｉＰａｔｃｈマイクロアレイ上にプリントされたｓｅＶＬＰを含む１５％トレハロースに製剤化されたアジュバントとして使用し、動物実験で使用した。

【実施例6】

【0317】

ｓｅＶＬＰの製造
実施例４のＢ／コロラド／０６／２０１７のｒＨＡを、ｓｅＶＬＰを作製するために２つの方法で使用した。ｓｅＶＬＰを作製する第１の方法は透析を含んでいた。ｓｅＶＬＰとして再構成するために、２ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン（５０ｍｇ／ｍｌ）、コレステロール（２０ｍｇ／ｍｌ）、ホスファチジルエタノールアミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、ホスファチジルセリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、スフィンゴミエリン（２０ｍｇ／ｍｌ）及びホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ１０：４．２５：３：１：３及び０．５％の比で混合したもの）を４００μｌの１０％ＯＧに溶解した。次いで、５００ｕｇのＢ／コロラド／０６／２０１７ ｒＨＡを溶解した脂質に添加し、総体積を２ｍｌにして、４％ＯＧの最終濃度を得た。２ｍｌの試料を、少量（３ｍｌ）のＰＢＳの多数の変化に対して４℃で２４時間透析した。次いで、試料を４ｘ１２ｍｌのＰＢＳに対して２４時間を超えて透析した。次いで、試料を２ｘ２．５Ｌに２４時間移し、最後に５ＬのＰＢＳに４８時間移してＯＧを除去した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ－ＮＳを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定されるように、ｓｅＶＬＰのサイズは１００～２００ｎＭであった。

【0318】

ｓｅＶＬＰを作製する第２の方法は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒを含んだ。臨界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ．）２５ｍＭのＯＧに基づいて、脂質と混合しながら、３０ｎＭから２０ｍＭにＯＧを減少させることによって、ｓｅＶＬＰを形成した。水性緩衝食塩水及び３０ｍＭのＯＧ中のインフルエンザｒＨＡタンパク質を、エタノール中のＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、コレステロール及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）アミンと混合した。水と有機物の体積比は２：１であった。流速は８ｍｌ／分であった。ｓｅＶＬＰＳをＰＢＳに回収し、緩衝液をＰＢＳに交換し、Ａｍｉｃｏｎ ３０ｋｄカラムを使用して濃縮した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ－ＮＳを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されるように、ｓｅＶＬＰのサイズは１００～２００ｎＭであった。

【0319】

ｓｅＶＬＰ中のｒＨＡ Ｂ／コロラド／０６／２０１７の活性及び効力を赤血球凝集及びＳＲＩＤによって決定した。

【実施例7】

【0320】

ＶａｘｉＰａｔｃｈマイクロアレイ上のワクチンのＢｉｏＤｏｔプリント
ＶａｘｉＰａｔｃｈ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ Ｐａｔｃｈｅｓ（ＭＡＰ）は、ＢｉｏＤｏｔ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）マイクロ流体分注装置を利用するように設計された。この分注は二次元（Ｘ、Ｙ）で行った。個々のＶａｘｉＰａｔｃｈ ＭＡＰは、それぞれが３７個の個々のＭｉｃｒｏＴｉｐを有する直径１．２ｃｍの円形であった。ＢｉｏＤｏｔマイクロ流体分注器を使用して、ＭＡＰにトレハロース中のワクチンを充填した。手動モードでは、３７個の個々のマイクロチップ全てに、１０秒でチップ当たり５～２０ｎＬで二次元Ｘ、Ｙ平面に装填した。カスタム設計の分注装置のスケールアップにより、一度に１０アレイの平行分注が可能になり、毎分数百アレイのスループットが得られる。マイクロアレイを装填し、乾燥させたら、アレイをサンドイッチ治具に配置した。治具は、サンドイッチが圧縮された際にＭｉｃｒｏＴｉｐがＺ平面に曲げられるように、アレイに対応するペグを含んでいた。次いで、個々のＭＡＰをダイで打ち抜いた。乾燥剤の存在により、室温安定性を達成した。１ｕｇ ｒＨＡ及び１ｕｇアジュバントをＰＢＳ中１５％トレハロースに製剤化した。次いで、混合物を、ＢｉｏＤｏｔ ＡＤ１５２０を使用してＶａｘｉＰａｔｃｈマイクロアレイ上にプリントした。乾燥及びガラス化すると、糖ガラスが形成された。図７は、青色色素１番を含有する１０ｎＬのワクチンを充填したＶａｘｉＰａｔｃｈマイクロニードルアレイの単一マイクロニードルを示す。図中の光反射は、中実糖ガラスの表面を示す。ｒＨＡ Ｂ／コロラド／０６／２０１７の効力をＳＲＩＤによって示した。

【実施例8】

【0321】

動物試験
Ｂ／コロラド／０６／２０１７からのｒＨＡを提示するｓｅＶＬＰをプールし、３０ｋＤカットオフ膜を有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５スピンダイアフィルトレーションカラムを使用して濃縮した。ワクチン材料（１．６２ｍＬ）を、予め冷却した遠心分離機ロータ中、１３ｋ ＲＰＭで３０分間遠心分離した。次いで、濃縮物を１３ｋ ＲＰＭで１分間の回転で溶出した後、製剤化した。カラムによるｒＨＡの完全な保持及び放出を仮定すると、初期濃縮材料はｒＨＡタンパク質について３．２４ｍｇ／ｍＬであると推定した。３０％トレハロース（４％ＢＢ色素を含むか、又は含まない）を１：１で製剤化し、これは、単一の１０ｎＬ滴でプリントした場合、０．３８９ｕｇのｒＨＡ／アレイと同等であった。得られた材料は、可視化及び送達評価のために２％のＢＢを含むか、又は含まない１５％トレハロースであった。より低用量に関しては、濃縮ｒＨＡは各ｒＨＡタンパク質について２．３２ｍｇ／ｍＬであると推定した。次いで、この材料をヌクレアーゼ非含有水で希釈し、製剤化し、２％ブリリアントブルーＦＣＦ染料を含む１５％トレハロース中で０．２ｕｇ／ｒＨＡ及び０．０４ｕｇ／ｒＨＡプリント用量を調製した。

【0322】

事前に毛を除去したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを、５分間の直接圧力（ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙパッチからのワクチン材料のおよそ９０％の放出が可能であることが実証された方法）を利用してこれらのアレイで処置した。選択した適用部位は背中の正中線であり、イソフルラン下で動物を処置した。全ての動物を、ｓｅＶＬＰ Ｂ／コロラド／０６／２０１７ワクチンに対する免疫応答のアッセイのために毎週採血して維持した。

【0323】

３匹の動物の別の対照群に、０．２ｕｇ／ｓｅＶＬＰ Ｂ／コロラド／０６／２０１７（滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈）の皮内注射を行った。処理送達の効率は、処置後アレイ上に保持された色素を有する平行プリントされた非適用アレイからの色素溶出の比較に基づいて、全ての色素配合ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙパッチ処理に対して９０％を超えると推定した。

【0324】

毎週採血を４週目まで行い、その時点で動物を人道的に安楽死させ、心臓穿刺によって最終採血を回収した。これらの「４週目」の血液からの血清を、ＥＬＩＳＡアッセイによってＢ／コロラド／０６／２０１７ ｒＨＡに対する反応性について分析した。

【0325】

ＥＬＩＳＡアッセイ：プレートを、１００ｍＭ炭酸緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのｒＨＡタンパク質（Ｂ／コロラド／０６／２０１７）で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートをＴｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、ＴＢＳ中５％ＢＳＡで室温において１時間ブロッキングした。洗浄後、ラット血清（１：１００－１：１２５００）及び陽性対照抗体（１：６２、５００～１：７、８１２，５００；モノクローナル抗ＨＡ抗体、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中のＩｍｍｕｎｅＴｅｃｈを添加し、室温で２時間インキュベートした後、洗浄した。１：２０，０００のヤギ抗ラットＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，１１２－０３５－１４３）を使用した。データを図８に示す。図８では、ＭＡＰ＝マイクロアレイ皮膚パッチ；ＩＭ＝筋肉内注射であり、Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ試験で使用される血清の希釈度である。

【実施例9】

【0326】

ヒトワクチン接種のためのＶａｘｉＰａｔｃｈキット
ＶａｘｉＰａｔｃｈの一例を図９に示し、これはＶａｘｉＰａｔｃｈの背面（左パネル）、側面（中央パネル）、及び背面（右パネル）の画像を含む。前面は、投与時に対象の皮膚上に配置される。右パネルは、ワクチンが充填された直径１．２ｃｍのＭＡＰを示す。

【0327】

ワクチン投与：ＶａｘｉＰａｔｃｈデバイスの層を引き離し、ＭＡＰを覆う透明なドームを取り除き、ＭＡＰを、手首の尺骨のふしの近位の約１インチの皮膚上に配置する。約６ニュートンの力で人差し指でＶｅｒｎｄａｒｉロゴ（図９の左パネルに示す）の中心が押され、装置が可聴クリック音を発した時、十分な力が加えられたことを示す。ＭＡＰは、再現性の高い方法で皮膚内に推進される。装置は、３Ｍの医療用接着剤によって適所に保持された状態で１０分間皮膚上に留まる。１０分後、ＶａｘｉＰａｔｃｈを取り除き、ポーチに戻し、ジップロックシールで密封し、医療廃棄物として廃棄する。

【0328】

皮膚中の水分は、ＭＡＰからワクチンを溶解し、ワクチンは皮膚に入り、樹状細胞及びランゲルハン細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞によって処理される。マイクロニードルは長さが６００μｍであり、神経に到達するには短すぎるため、ワクチン接種は痛みを伴わない。

【0329】

図９に示す透明なプラスチックドーム（中央及び右パネル）は、ＭＡＰ上のワクチンに対する１次無菌性バリアを提供し、マイクロニードルを保護する。しかし、ドームは密閉構造ではない。ＶａｘｉＰａｔｃｈデバイスは、スキンワイプのペーパータオル及び乾燥剤と共に２次的な密閉構造バリアエンベロープにパッケージングされる。乾燥剤及び密閉構造バリアエンベロープは、室温安定性を提供するワクチン糖ガラスの完全性の維持に役立つ乾燥環境を維持する。図１０は、ＶａｘｉＰａｔｃｈの一例の拡大図を表す概略図を示す。

【0330】

ＶａｘｉＰａｔｃｈワクチン接種キットの一例を図１１に示す。ＶａｘｉＰａｔｃｈ、スキンワイプ及び乾燥剤を含む両面再密封可能な４インチｘ７インチのパウチを示す。キットは、従来の針又はシリンジを含まない。パウチは、前面が箔であり、背面が透明なプラスチックの密閉構造である。パウチは、その最も厚い点で幅が１／４インチである。

【実施例10】

【0331】

ＶａｘｉＰａｔｃｈ組立て
この実施例に記載される手順の目的は、マイクロアレイパッチの指定された半エッチングされたウェルにワクチンを調製、製剤化及びプリントする方法を実証することである。

【0332】

この実施例に記載される手順は、最終的な乾燥及び貯蔵の前に、調製されたＶａｘｉＰａｔｃｈを乾燥剤と共に個々のパウチに効果的に組み立て、パッケージングするように設計されている。

【0333】

ＶａｘｉＰａｔｃｈを組み立てる際にいくつかの実施形態で使用される機器及び材料の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
・滅菌乾燥トレイ
・ステンレス鋼鉗子、タイプＰＬ－３０（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ １２－０００－１２２）
・顕微鏡（Ｃｅｌｅｓｔｒｏｎ，Ｍｏｄｅｌ＃：ＯＭＡＸ ４０Ｘ－２５００Ｘ）
・カスタムステンレス鋼アレイプリントトレイ（Ｖｅｒｎｄａｒｉ Ｉｎｃ）
・カスタムステンレス鋼曲げ治具（Ｖｅｒｎｄａｒｉ Ｉｎｃ）
・カスタムステンレス鋼スナップアプリケータ（Ｖｅｒｎｄａｒｉ Ｉｎｃ．（Ｗｅｉｃｈｈａｒｔ Ｓｔａｍｐｉｎｇ Ｃｏ．により製造された））
・個別包装３ｇ乾燥剤袋（ＤｒｉｅＲｉｔｅ（登録商標）、カタログ番号：６００１３Ｔ）
・ＧＭＰ規格ヒートシーラ（Ａｃｃｕ－Ｓｅａｌ，Ｍｏｄｅｌ＃：８０００－ＧＶ）
・乾燥アルゴン圧縮気体シリンダ（Ｈａｒｒｉｓ ｇａｓ）
・Ｆｏｉｌｐａｋ Ｐｏｕｃｈ パウチ５’インチｘ８’インチ－４．５ｍＬ：箔及びポリプロピレンの３面シールバリアパウチ（ＡＭＰＡＣ Ｆｌｅｘｉｂｌｅｓ，ｉｔｅｍ＃：ＫＳＰ－１５０－１ＭＢ）
・組立前パッケージングピース＃１（内部で設計され、３Ｍ ＭＢＫ Ｔａｐｅで製造）
・両面リング状テープ（内部で設計され、３Ｍ ＭＢＫ Ｔａｐｅで製造）
・無菌透明ドーム（内部で設計され、ＵＣ Ｄａｖｉｓ ＴＥＡＭ Ｌａｂで製造）
・ＦｏｉｌＰａｋ：薄い金属製パウチ

【0334】

非限定的で例示的な指示は以下の通りである。

【0335】

パッケージングのために、滅菌プリントアレイ、カスタムステンレス鋼曲げ治具、ステンレス鋼鉗子、予め組み立てられた包装ピース＃１、及び両面リング状テープを準備する。滅菌された平らな面に、両面リングテープ、透明ドーム、スナップアプリケータ、予め組み立てられたパッケージング支持材料、鉗子、プリントアレイ、曲げ治具を集める。

【0336】

図１２に示すように、プリントされたアレイを曲げ治具に挿入する。図１２の矢印は、マイクロアレイ先端部の頂部が位置する方向を示す。矢印と一致するように先端を上に向けて、プリントされたウェル側を下に向けてアレイを挿入する。

【0337】

次に、曲げ治具をしっかりと押してマイクロアレイを傾けて、マイクロニードルを適切な皮膚に適用可能な形態で開始する。例えば、アレイを押し下げ、取り出した後、アレイは、マイクロニードルが延在する金属平面から９０度延在するマイクロニードルを含む。滅菌鉗子を使用して滅菌表面に屈曲アレイを取っておく。

【0338】

次に、支持材料及び金属スナップアプリケータを含む予め組み立てられたパッケージングセットを得る。いくつかの実施形態では、金属スナップアプリケータは、すぐに適用できる形態である「作動前」形態である。

【0339】

支持材料を反転させて、白色円形裏材を上向きに示す。不透明な白色円形テープ裏材片を慎重に取り外して、円形テープを露出させる。

【0340】

次に、円形テープ及び金属スナップ式アプリケータ（上を向いた凸形状）を位置合わせし、金属スナップアプリケータの縁部を慎重に押圧して、図１３に示すように支持材料にしっかりと取り付ける。次に、組み立てられた部品を反転させて、他方の面を上に向ける。

【0341】

最上部の透明テープ裏材を取り外して、小さな円形接着剤を露出させる。調製した９０度曲げアレイを慎重に整列させ（マイクロニードルを上に向けて）、支持体材料に取り付ける。滅菌金属鉗子を使用してアレイの外縁部を軽くタップする。

【0342】

次に、円形リングテープを得、手袋をはめた手を使用してリング状の白色テープ裏材を除去する。透明ドームを入手し、透明ドームを円形テープに適切に位置合わせして取り付ける。透明ドームの縁部を軽くタップして、しっかりと取り付けられていることを確認する。

【0343】

次に、より大きな裏材を除去して透明ドーム＋両面リング接着剤を分離し、それをアレイの上に慎重に配置する。透明な３Ｄドームは、マイクロニードル曲げアレイを保護する機能を有することを前提とするため、適切なアライメントがこの工程に不可欠であることに留意されたい。

【0344】

次に、完全に組み立てられたＶａｘｉＰａｔｃｈ部品、３ｇ乾燥剤パッケージ、及び薄い金属製パウチ（例えば、Ｆｏｉｌｐａｋ）を得る。３ｇの乾燥剤パッケージを最初に置き、組み立てられたＶａｘｉＰａｔｃｈ部品を金属製パウチに慎重に配置する。

【0345】

ヒートシーラをオンにする。ヒートシーラに正確な圧力を提供するために、アルゴンガスバルブをオンにする。「レシピ１」を選択する。２つのシーリングガスケット間にパウチフィンの開放界面を保持する。パウチが適切に配置され、指がシール領域から安全に取り外されると、ロッカーペダルを使用して熱シーリングを開始する。可聴ビープ音が鳴って、完了を示し、シール面が分離する。次いで、密封されたパウチを取り外すことができる。下部シーリングガスケットから分離するために軽い圧力が必要な場合がある。パウチを密封し、２０℃で保存する。

【実施例11】

【0346】

ポイントオブケアワクチン
この実施例に記載される手順の目的は、インフルエンザ、狂犬病、帯状疱疹、ＣＯＶＩＤ－１９等の疾患を引き起こす感染症のためのポイントオブケアワクチンを提供する方法を実証することである。いくつかの例は、ワクチン接種キットを含み、室温で安定しており（例えば、郵送のため）、例えば、無痛の５分間包帯による自己投与が可能であり、ワクチン接種の写真証明を可能にし（例えば、モバイルデバイスを介して）、例えばプラスチック製保管バッグで販売業者に郵送することができる。

【0347】

図１４は、ポイントオブケアワクチン接種の問題に対処するための例示的な３方面からなる手法を示す。この実施例は、どのようにしてｒＧＰ抗原、アジュバント、及び配送を一緒にして完全ワクチン接種パッケージを提供するかを示す。いくつかの実施形態では、ｒＧＰは、ウイルス表面由来の組換え糖タンパク質である。

【0348】

図１５Ａ及び１５Ｂは、マイクロニードルアレイの例示的なシートを示す。いくつかの実施形態では、これらのシートは医療グレードのステンレス鋼を含む。いくつかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、２次元（Ｘ、Ｙ）でワクチンをプリントする。いくつかの実施形態では、治具を使用して、アレイ内のマイクロニードルをＺ平面内で傾斜させることができる。いくつかの実施形態では、中央スポット真空ピックを使用して広げ、配置して、ＶａｘｉＰａｔｃｈキットの自動組立てを可能にすることができる。

【0349】

図１６は、ワクチン充填マイクロアレイの一例を示す。図示の例は、１０ｎＬワクチンプリント混合物／マイクロニードルのＢｉｏＤｏｔプリントを示す。

【0350】

図１７は、ヒト対象における５分のＶａｘｉＰａｔｃｈ色素送達の一例を示す。

【0351】

図１８は、ラットにおけるＶａｘｉＰａｔｃｈ色素送達の一例を示す。実施例は、ＭＬＰＶｉとして０．３ｕｇの一価ｒＨＡ、ＶＡＳ１．０として０．５ｕｇのＱＳ－２１＋／－（０．３ｕｇのＰＨＡＤ）、青色色素１番（ｗ／ｖ）を含む０．５％のＦＤ＆Ｃ、Ｆｌｕｂｌｏｋの１／１５０のｒＨＡ、及びＳｈｉｎｇｒｉｘとして１／１００のＱＳ－２１の用量を含んだ。実施例ＶａｘｉＰａｔｃｈアレイを、群当たりｎ＝６（雄３匹、雌３匹）、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットで５分間適用し、免疫前及び毎週の採血、続いて２８日目の最終採血を行った。皮膚の赤み／刺激についてのドレイズ評価は、ＶａｘｉＰａｔｃｈ、用量又は製剤からの刺激を示さなかった。

【0352】

図１９は、ＩｇＧ経時変化によるＶａｘｉＰａｔｃｈラットＥＬＩＳＡ力価を示す。図示のように、Ｂ／コロラド／０６／２０１７由来のＨＡに特異的なＩｇＧ抗体のレベルを、インハウス全長ｒＨＡ０タンパク質（ＶｒＨＡ００２６）に対するＥＬＩＳＡアッセイによってワクチン接種されたＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの血清で評価した。群当たり６匹の動物のＮ（それぞれ雄３匹及び雌３匹）にわたる５倍希釈系列に基づいてエンドポイント力価を割り当てた。力価をｌｏｇ１０変換し、平均値をプロットしたデータ点に使用した。エラーバーは、群当たり６のＮについてのＳＥＭを表す。最初の１：１００希釈で陰性の試料（ノンレスポンダと推定される）に「５」の任意の力価を割り当てた。両方のアジュバント製剤は、ワクチン接種後１４日という早期に高レベルの特異的ＩｇＧを示し、３～４週目までにピークレベルを示した。アジュバント化ＶａｘｉＰａｔｃｈ動物は、７日目以降の全ての時点でＩＭ注射比較群よりも実質的に高いエンドポイント力価を達成した。

【0353】

図２０は、Ｂ／コロラド２０１７に対するＶａｘｉＰａｔｃｈ ＥＬＩＳＡ力価を示す。図は、最終日である２８日時点の各ワクチン接種群内の個々の変動を、各動物のマーカと共に示す。濃い影付きのマーカは雌動物を表す。幾何平均は、各群について破線で表される。筋肉内注射対照動物は４．５マイクログラムの抗原の単回用量を受け、一方ＶａｘｉＰａｔｃｈ動物は０．３マイクログラムのタンパク質を受けた。ＦｌｕＢｌｏｋ用量は、四価産物（総タンパク質１８マイクログラム）であるため、各株４．５マイクログラムを含むように選択されたことに留意されたい。群間の統計的有意性は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）及びテューキーのＨＳＤ事後検定に基づいて、グラフの上に示されている。

【0354】

図２１は、Ｂ／コロラド２０１７ドットプロットに対する赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を示す。Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットワクチン接種によって誘発された免疫応答の質を評価するために、同族ＷＨＯ標準抗原であるＢＰＬ不活性化Ｂ／コロラド／０６／２０１７インフルエンザビリオンに対して赤血球凝集阻害アッセイを行った。ヒト血清の場合、１：４０の力価は、ＨＡＩアッセイにおいて保護的であると考えられる。ワクチン接種後２８日目に採取したラット血清を、カオリン処理して、凝集の非特異的阻害剤を除去した。処理した免疫後血清の２倍段階希釈物をＢＰＬ不活性化抗原と共に室温で４５分間インキュベートして結合させた。ヒト単一ドナーＯ＋赤血球を添加し、凝集反応を阻害する免疫血清の能力をスコア化した。このドットプロットは、群当たり６匹全ての動物のスコアを示し、濃い影付きのマーカは雌動物を表す。Ｙ軸は、希釈系列を反映するＬｏｇ２スケールである。各群の幾何平均を破線で示す。群間の統計的有意性を再び示し、一元配置分散分析、続いてテューキーのＨＳＤ事後検定によって評価する。

【0355】

図２２は、ＨＡＩデータの棒グラフを示す。図２１に示すものと同じデータセットは、ここでは明確にするために棒グラフとして表し、幾何平均値は、１セット当たり６の群サイズの平均の標準誤差を表しているエラーバーと共にプロットされる。抗原のＩＭ注射とＶａｘｉＰａｔｃｈ送達との間、及び非アジュバント化ＶａｘｉＰａｔｃｈ製剤とアジュバント化ＶａｘｉＰａｔｃｈ製剤との間に有意差が観察された。

【0356】

図２３は、抗原試験のＶａｘｉＰａｔｃｈ ＶＭＬＰ加速安定性を示す。本発明者等のワクチン製剤の安定性を評価するために、本発明者等の製剤化されたプリントミックス（ｒＨＡ抗原、色素、及びトレハロースを含有する）の１ｕＬ部分を乾燥下で一晩包装して糖ガラス形成を誘導した。翌日、加速老化試験のために試料を様々な貯蔵温度（４、２０、４０、又は６０℃）に分離した。適切な時点で、試料を取り出し、ＰＢＳ中で再構成し、次いで、ＮＩＢＳＣ（Ｐｏｔｔｅｒｓ ｂａｒ，ＵＫ）からの較正された株特異的試薬に基づいて、一元放射状免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）を使用して効力試験を経た。値は、分離時に再構成された「０日目」対照と比較して残存する効力の百分率として表す。ＱＳ－２１及び３Ｄ－（６Ａ）－ＰＨＡＤを含む１つのアジュバント調製物もこのプロットに示す。驚くべきことに、元のＨＡ効力の大部分は、６０℃であっても２８日間にわたって保持される。

【0357】

図２４は、ＣＯＧＳが業界平均より低いことを示す。例えば、今日のインフルエンザワクチン市場は、先進国のみで約５０億ドル、であり、米国では３０億ドルである。ＣＭＳ ２０１９／２０２０ ＡＷＰは、古典的インフルエンザでは２０．３４ドルであり、高用量では５６．００ドルである。ＦｌｕＢｌｏｋ（登録商標）は５６．００ドルである。Ｓｈｉｎｇｒｉｘ（登録商標）は３４６ドルである。

【0358】

図２５は、エンベロープ糖タンパク質サブユニットワクチンを含む例示的なチャートを示す。いくつかの実施形態では、図２５のウイルスのタンパク質は、本明細書に記載のＶＬＰ中の抗原として含まれる。図に含まれるウイルスのいずれか１つがワクチンに含まれていてもよい。

【0359】

図２６は、ワクチンパイプライン導入を示す。組換え抗原を産生する手法は広く適用可能である。Ｃ末端６ｘＨｉｓタグによって可視化されるように、Ｂ型インフルエンザ ｒＨＡ０の２つのバッチからのトランスフェクトされた細胞溶解物を左側のレーンに示す。このウエスタンブロットの中央レーンは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ－ｇＥ）由来のｇＥ抗原の発現の初期時間経過を示し、これは、現在承認されている唯一の組換え帯状疱疹ワクチンで使用されているものと同じタンパク質である。右側のレーンは、狂犬病ウイルス由来のＧタンパク質（ＲＡＢＶ－Ｇ）でトランスフェクトした細胞の時間経過を示す。これらのウイルス糖タンパク質のそれぞれは、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有し、初期検出及び精製に対する広く同様の手法を可能にしている。発現レベルは構築物間で異なるが、全て同じ哺乳動物高密度細胞株（この例ではＥｘｐｉ２９３）で作製することができる。

【0360】

図２７は、ＥｘｐｉＣＨＯにおける例示的なＣＯＶＩＤ－Ｓ発現を示す。ＣＯＶＩＤ－１９の病因物質であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の糖タンパク質スパイクタンパク質も、本発明者等の系において一過性に発現され得る。ここでは、Ｈｉｓタグ付き全長ＣＯＶＩＤ－Ｓ構築物によるトランスフェクション後２日目のＥｘｐｉＣＨＯ細胞溶解物を示す。右側のパネルは、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体からのシグナルを示し、高グリコシル化１２７３－ａａタンパク質と一致する約１７５ｋＤの特異的バンドを示している。このバンドは、無関係な発現構築物（ＶＳＶＧ）でトランスフェクトした平行ＥｘｐｉＣＨＯフラスコ溶解物には存在しない。右端の３つのレーンは、レンチウイルスパッケージングプラスミド及び構成的ＧＦＰ遺伝子を有するシングルサイクルベクターで同時トランスフェクトしたＥｘｐｉＣＨＯ細胞培養物からのものである。偽型の複製欠損レポーターウイルス粒子を作製するために、これらを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）、ＣＯＶＩＤ－Ｓ又はＶＺＶ－ｇＥと適合させた。ＣＯＶＩＤ－Ｓ及びＶＺＶ－ｇＥ発現は、それらのＣ末端Ｈｉｓタグに基づいてこれらの試料で検出されるが、ＶＳＶ－Ｇ対照は、Ｈｉｓタグを欠くために検出されない。

【0361】

図２８は、組換えＣＯＶＩＤ－Ｓタンパク質についての同一性を確認する例示的なＣＯＶＩＤスパイクウエスタンブロットを示す。１７５－ｋＤ、Ｈｉｓタグ反応性種が実際にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質であることを確認するために、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクタンパク質を発現するプラスミドＤＮＡベクターに対して産生された市販のウサギポリクローナル抗体（ＩＴ－００２－０３０，Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）を使用してウエスタンブロットを行った。陽性対照として、市販の組換えタンパク質対照も実行した（ＩＴ－００２－００３２，Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）。精製されたタンパク質対照は、左のレーンにあり、「ＩＴ－ｒＳ」と標識されている。抗ウサギ二次抗体は、精製タンパク質対照について予想される約１７５ｋＤのサイズで材料を可視化した。３つのＣＯＶＩＤ－１９トランスフェクト細胞溶解物（Ａｄ３、Ｂｄ３、Ｄｄ３）には同程度のサイズのシグナルが存在したが、ＣＯＶＩＤ－１９発現構築物を受け取らなかったトランスフェクト細胞溶解物（Ｃｄ３）には存在しなかった。これは、本発明者等の組換えＣＯＶＩＤ－Ｓ抗原についての同一性の重要な二次的指標となった。

【0362】

図２９は、ＣＯＶＩＤ－ＳのＩＭＡＣ精製の溶出プロファイルを用いた全長スパイク精製を示す。およそ３０ｍＬの高密度ＥｘｐｉＣＨＯ細胞培養物からの細胞抽出物を、０．５％ＬＤＡＯを含有する緩衝液で予備平衡化したＨｉｓＴｒａｐ Ｃｒｕｄｅ ＦＦ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。１％オクチルグルコシドへの界面活性剤交換後、一定の１％オクチルグルコシド下で段階的勾配のイミダゾールを適用して、緩く結合した宿主細胞タンパク質を放出し、続いてＨｉｓタグ付き組換えタンパク質を放出した。青色の破線トレースは、２８０ｎｍにおける吸光度に基づく放出されたタンパク質のレベルを示す。１５４．５ｍＬのメジャーピークは組換えタンパク質産物を含む。ニッケルカラム精製は、前臨床試験のための初期候補ワクチン材料の迅速かつ非常に特異的な精製を可能にするが、組換え抗原産物への異種エピトープタグの付加を必要としない従来のタンパク質クロマトグラフィ法によって置き換えることができる。

【0363】

図３０は、ＣＯＶＩＤ－１９スパイクレンチウイルス偽型構築物を示す。新規ワクチンを検証する重要な課題は、潜在的な有効性をどのように実証するかである。ＩｇＧ ＥＬＩＳＡは、特異的免疫応答の大きさをモデル化し得るが、機能的にウイルスを阻害する抗体と、標的タンパク質の非必須（又は構造的に閉塞された）エピトープに結合し得る抗体と、を区別しない。免疫後血清がインビトロで許容細胞へのウイルス侵入を阻止する能力について試験される中和アッセイは、インビボの有効性を予測するための強力なツールとなり得る。そのようなアッセイに感染性の高いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用する必要性を回避するために、ＣＯＶＩＤ－Ｓタンパク質を使用して複製欠損レポーターレンチウイルスがパッケージングされる偽型アッセイが開発されている。この偽型ウイルスがインビトロで許容細胞に形質導入することができる場合、それを中和アッセイにおける真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の代用として使用することが可能であるはずである。選択されたレンチウイルスベクターは、構成的ＧＦＰレポーターを含む。このプロットは、経時的にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ細胞における蛍光を示し、レンチウイルスベクタープラスミドの活性を示している。（レンチウイルスベクターなしで）ＣＯＶＩＤ－Ｓ構築物のみをトランスフェクトしたフラスコＢは、バックグラウンドレベルの蛍光しか示さないが、パッケージングミックスをトランスフェクトした３つ全てのフラスコは、トランスフェクション後４日目までに強いＧＦＰシグナルを示す。

【実施例12】

【0364】

ＡＣＥ－２の生成
いくつかの実施形態では、ｅｘｐｉ２９３細胞に一過性にトランスフェクトされたＡＴＵＭ Ｂｉｏから委託された哺乳動物発現構築物を使用してＡＣＥ－２を生成した。そのような実施形態では、ＡＣＥ－２の外部ドメインは、細胞培養培地中に分泌される。そのような実施形態では、トランスフェクションの３日後、細胞培養上清を回収し、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ，カタログ番号１７－０８５１－０１）を使用して脱塩し、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６で溶出した。そのような実施形態では、溶出液を平衡化ＨｉＴｒａｐ ＦＦ ＤＥＡＥイオン交換カラムに充填し、洗浄し、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ７．６で溶出した。

【0365】

図３１は、精製からの試料を示すクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。図示のように、第１のレーンは、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製の市販のＡＣＥ－２（カタログ番号１０１０８Ｈ０８Ｈ２０）である。ＡＣＥ－２タンパク質を決定するために、酵素活性を精製によって保持し、蛍光発生基質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号ＥＳ００７）を使用して酵素活性アッセイを行った。一文字アミノ酸配列ＹＶＡＤＡＰＫ（配列番号１７）を有する小ペプチドを、共鳴エネルギー移動によってＭｃａの蛍光を効率的に消光する、高蛍光７－メトキシクマリン（Ｍｃａ）基と２，４－ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）基との間に挿入した。ＡＣＥ－２は、プロリンとリジンとの間で基質を切断し、蛍光の増加を、３２０ｎｍの励起波長及び４０５ｎｍの発光を有する蛍光プレートリーダを使用して測定した。

【0366】

アッセイの基本プロトコルは以下の通りであった。
１．基質をアッセイ緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）中で４０ｕＭに希釈する。
２．アッセイする各ウェルについて、５０ｕＬの基質を黒色９６ウェル蛍光アッセイプレートに添加する。
３．同じアッセイバッファーで希釈した５０ｕＬの試料を添加する。
４．蛍光プレートリーダで蛍光を経時的に測定する。

【0367】

蛍光発生基質を使用するＡＣＥ－２活性アッセイのために、精製された「インハウス」ＡＣＥ－２を、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから市販されているＡＣＥ－２タンパク質に対して試験した。内部で使用するための１回の凍結融解サイクル（－２００℃で２．５時間のインキュベーション）の後、４０℃で２０％グリセロール中でＡＣＥ－２が活性であるかどうかを試験して、貯蔵条件を決定した。４つ全ての試料が同様のレベルの活性を有すると思われ、ＡＣＥ－２に使用される精製方法が酵素活性に有害な影響を及ぼさなかったことを示している。これはまた、ＡＣＥ－２を２０％グリセロールに保存し、有意な量の活性を失うことなく少なくとも１回凍結融解を経ることができることを示唆している。図３２は、ＡＣＥ－２試料における活性レベルを示す。

【実施例13】

【0368】

サンドイッチＥＬＩＳＡ開発
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ効力アッセイの一般プロトコルを以下に記載する。いくつかの実施形態では、高結合性平底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３２０６）を、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのＡＣＥ－２（インハウスの精製されたＡＣＥ－２）で４℃において一晩コーティングした。次いで、プレートを、０．０５％ＴＢＳＴを含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＴＢＳ中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温において２～４時間ブロックした。更なるＴＢＳＴ洗浄の１回後、１％のＢＳＡ／ＴＢＳＴ中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓタンパク質を添加し、室温で２時間インキュベートした後、ＴＢＳＴで更に４回洗浄した。次いで、マウス抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ６３２６０４）を１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１：５０００で添加し、室温で１時間インキュベートした。更に４回洗浄した後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中１：５，０００でヤギ抗マウスＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，７１５－０３５－１５０）を添加し、室温で１時間インキュベートした。最後に４回洗浄した後、１００ｕＬのＴＭＢ基質を添加し、室温で３０分間インキュベートした。５０ｕＬの２Ｎ硫酸を添加することによって反応を停止した。次いで、得られた吸光度を自動マイクロプレートリーダ（ＡｃｃｕＳｋａｎ ＦＣ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４５０ｎｍで読み取った。

【実施例14】

【0369】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ効力アッセイ
効力アッセイを行って、ＶｒＳ０１の効力を、Ｉｍｍｕｎｅ－Ｔｅｃｈから市販されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（カタログ番号ＩＴ－００２－０３２ｐ）と比較した。インハウス製のＢ／コロラド’１７抗原由来のヘマグルチニン（ＨＡ）を陰性対照として含めた。結果は、市販の（Ｓ ｃｏｍ）タンパク質とインハウスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ（ＶｒＳ０１ ０５１５）タンパク質との間で類似しており、ＨＡは試験した全ての濃度でほぼ０の結合を有していた。図３３は、得られたデータ又はこの実験の線形回帰を示す。

【実施例15】

【0370】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ効力に対する熱ストレスの影響
ＶｒＳ０１が４つの異なる濃度（１００、２５、６．２５、及び１．５６ｎｇ）にわたって２５０ｎｇのＡＣＥ－２に結合する能力を試験して、以下により詳細に記載される予備安定性実験の標準曲線を確立した。図３４は、標準曲線を示す。

【0371】

ＶｒＳ０１の安定性を異なる温度（２０、４０、及び６０℃）で試験し、試料を一晩インキュベートした。ＶｒＳ０１をＴＢＳＴ中１％ＢＳＡで０．５ｎｇ／ｕＬの濃度で希釈して、１００ｕｌのこれらの試料をＡＣＥ２コーティングウェルに添加した場合、５０ｎｇを添加した。９５０Ｃの試料も５分間沸騰させた。図３５Ａは、この実験で得られたデータを示す。図３５Ｂは、図３４に示す標準曲線を使用して吸光度値を変換することに基づいて決定された残存する効力のあるＶｒＳ０１の量を示す。

【0372】

百分率としての各条件に対する百分率効力は、効力のあるＶｒＳ０１を、ウェルに添加したＶｒＳ０１の量で割り、１００を掛けることによって計算することができる。表２に示すように値を算出した。

【表2】

【実施例16】

【0373】

アジュバントと製剤化されたＶＭＬＰ結合ＶｒＳ０１
「プリントミックス」（例えば、ＶａｘｉＰａｔｃｈアレイをプリントするために使用される配合物）に製剤化されたＶＭＬＰがＡＣＥ－２に結合する能力を、４００、１００、２５、又は６．２５ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓを２５０ｎｇのＡＣＥ－２を含有するウェルに添加することによって試験した。ＶＭＬＰの量とウェルで測定された吸光度との間の線形関係が観察された。ＡＣＥ－２への結合量に関して観察された値は、「遊離」タンパク質についてよりも低かった。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳがＶＭＬＰに組み込まれた場合の製剤による効力の低下又は結合の動態の違いによる可能性がある。図３６は、「プリントミックス」ＶＭＬＰの線形回帰を示す。

【表3】

【実施例17】

【0374】

ＡＣＥ－２／ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ結合のｐＨ感受性
ＡＣＥ－２／ＶｒＳ０１結合のｐＨ感受性を試験した。２、５、７．５、９又は１２のｐＨレベルで２５０ｕｌの１ｎｇ／ｕＬ ＶｒＳ０１をプレインキュベートすることによって実験を行った。ｐＨをＮａＯＨ又はＨＣｌのいずれかで調整し、ｐＨ紙のストリップを使用して測定した。１００ｕｌの各試料を２５０ｎｇのＡＣＥ－２でコーティングしたプレートに二連で載せ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＡＣＥ－２結合の量は、ｐＨ５及び９でわずかに減少したように見えたが、ｐＨ２及び１２ではバックグラウンドをわずかに上回っただけであった。図３７は、異なるｐＨレベルにおけるＡＣＥ－２結合を示す。

【表4】

【実施例18】

【0375】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＳ１サブユニットに対するポリクローナル抗体によるＡＣＥ－２結合の阻害
ワクチン接種動物モデルの血清の分析を行う準備及び予想において、市販のポリクローナルウサギ抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＳのＳ１サブユニットに対してＡＣＥ－２との結合相互作用を阻害する能力について試験を行った。ＡＣＥ－２コーティングプレートがブロッキング溶液中にある間に、１ｎｇ／ｕｌ又は０．２５ｎｇ／ｕｌを市販の抗体の複数の希釈液と共に、インハウスのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓでインキュベートしたことを除いて、上記の設計に記載したように結合アッセイを行った。抗体の添加後、試料を３７℃で２時間インキュベートした。試料を２５０ｎｇのＡＣＥ－２でコーティングしたウェルに二連で載せ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。図３８は、平均吸光度のプロットによる棒グラフを示す。

【0376】

ポリクローナル抗体は、１：１００又は１：１０００の希釈を使用した場合、ＡＣＥ－２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓの結合を効果的に阻害することができ、１：１０，０００の希釈で結合の部分的阻害が存在した。この結果は、１００ｎｇ及び２５ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ条件の両方に当てはまった。

【表5】

【実施例19】

【0377】

組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質精製及びＶＭＬＰ製剤
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ’１９）組換えスパイク（ｒＳ）を、ＯＲＦのＣ末端に６ｘＨＩＳタグをもたらすトロンビン切断部位を有するように設計し、ＶｒＳ０１と示した。トロンビンによって切断されると、ｒＳタンパク質産物は、野生型配列に付加された４つの残留アミノ酸（Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ）のみを含む。Ｓタンパク質の天然の多塩基性Ｓ１／Ｓ２切断部位を無傷のままにした。合成構築物のアミノ酸配列は、配列番号３０に従った。注：下線の配列は合成トロンビン切断部位を表し、最後の６つのアミノ酸はＣ末端６ｘＨｉｓタグである。

【0378】

図３９は、Ｈｉｓタグ付きＲＢＤ単独（ＶｒＳ１２）並びにＤ６１４Ｇ及びフリン部位変異を有する全長分泌可能な外部ドメイン構築物（ＶｒＳ１４）と比較した、この構築物（ＶｒＳ０１）の概略図を示す。合成ベンダーとしてＡＴＵＭ ｂｉｏを使用した。ｐＤ２６１０－ｖ１０プラスミド骨格を使用した。このベクターは、高レベルの一過性発現のために設計され、細菌選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を有する。ＣＨＯ細胞の配列最適化後、ＤＮＡ配列は配列番号３１（ＶｒＳ０１ ＤＮＡ配列、哺乳動物発現のために最適化されたコドン）に従った。

【0379】

ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｆｉｓｈｅｒ）を、Ｐ１で凍結したバイアルからＥ１０００フラスコに継代Ｐ８で増殖させた。この増殖培養物は、８．６６ｘ１０６の密度を達成した。２００ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ発現培地中１２００Ｍ細胞を用いて１つのＥ１０００フラスコを調製した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯトランスフェクションキット（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、１６０ｕＬのプラスミドストックを１ｕｇ／ｍＬで使用してトランスフェクションを行った。トランスフェクションの２４時間後、エンハンサ及び供給試薬をトランスフェクション培養物に添加し、３２℃への温度シフトを適用した。毎日の密度及び生存率の評価を、０．４ｍＬの懸濁培養物を使用してトリパンブルー色素排除によって行った。洗浄した細胞ペレットをトランスフェクション後２日目及び３日目に積み立て、３日目の細胞ペレットをパイロット免疫原性試験のためのＶｒＳ０１の精製に使用した。

【0380】

凍結細胞ペレットを１ｘＰＢＳに再懸濁し、４，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、一部の可溶性細胞タンパク質を除去した。次いで、ＶｒＳ０１を有する細胞ペレットの溶解を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２（ベンゾナーゼ活性を支持するため）及び２％のＬＤＡＯ界面活性剤（ｎ－ドデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン－Ｎ－オキシド、Ａｎａｔｒａｃｅ）中で行った。ベンゾナーゼ処理（２００Ｕ）を室温で１０分間適用し、続いて４℃で１時間穏やかに回転させた。不溶性細胞片の透明抽出物に２回の遠心分離（４，０００ｘｇで２０分間の第１スピン、続いて１０，０００ｘｇで４０分間の第２スピン）を適用した。次いで、清澄化した抽出物を、予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｌｅｎｔｉｌレクチン樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）と混合し、４℃で４～６時間回転させた。結合した樹脂を洗浄緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＬＤＡＯ、ｐＨ７．５）で洗浄した後、更なる洗浄のために重力カラムに充填した。オンカラム界面活性剤交換を１％オクチルグルコシド、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中で行い、続いて３００ｍのＭα－Ｄメチル－グルコシドで溶出した。次いで、この溶出液にイミダゾールを５ｍＭまで補充し、シリンジポンプを介して１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦクルードカラムに適用した。溶出液をカラムに３回通した後、５ｍＭのイミダゾール、１％のＯＧ溶液で洗浄し、最終的に５００ｍＭのイミダゾールで溶出した。得られたＯＧミセル化ＶｒＳ０１をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ３０Ｋ透析濾過カラムで濃縮し、ＶＤＢ－ＯＧ（１０ｍＭのＮａＰ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１％オクチルグルコシド、ｐＨ７．２）に対して透析してイミダゾールを除去した。次いで、ＶｒＳ０１をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって定量化し、純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した。

【0381】

ＶｒＳ０１を用いて、実施例６に記載したものと同じ方法でＶＭＬＰを形成した。ｓｅＶＬＰとして再構成するために、０．６５ｍｇの脂質（ホスファチジルコリン（５０ｍｇ／ｍｌ）及び植物コレステロール（２０ｍｇ／ｍｌ）を２：１の比）を１３０μｌの１０％ＯＧに溶解した。次いで、２００ｕｇのＯＧミセル化ＶｒＳ０１を溶解脂質に添加し、総体積を０．６５ｍＬまでにして、最終濃度約４％ＯＧを得た。試料を、少量（２６ｍｌ）のＰＢＳの多数の変化に対して４℃で２４時間透析した。次いで、試料を４ｘ３２ｍｌのＰＢＳに対して２４時間透析した。次いで、試料を４８時間かけて４ｘ２Ｌに移して、ＯＧを除去した。全ての透析工程は、４℃でＶＤＢ（１０ｍＭのＮａＰ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に対するものであった。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ－ＮＳを用いた動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定したところ、平均直径１９０～２００ｎｍを有する並行して調製された空のＤＯＰＣ／ｃｈｏｌリポソーム（ＶｒＳ０１取り込みなし）と比較して、ｓｅＶＬＰの平均直径は２３０～２５０ｎｍであった。

【実施例20】

【0382】

Ｓｐｒａｇｕｅ－ＤａｗｌｅｙラットにおけるＶｒＳ０１ ｓｅＶＬＰの免疫原性
ＶａｘｉＰａｔｃｈアレイは、１００又は５００ｎｇのいずれかのｓｅＶＬＰ－ＶｒＳ０１を含有するように配合されたプリントミックスから、パッチ当たり５００ｎｇのＱＳ－２１及び５００ｎｇの３Ｄ（６－アシル）－ＰＨＡＤの用量でリポソームアジュバントと共に、実施例７及び８に記載のように、可視化のための０．５％（ｗ／ｖ）ＦＤ＆Ｃ Ｎｏ．１の青色染料と共に調製した。これらを８匹のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（雄４匹、雌４匹）に実施例８と同様に適用した。簡潔には、予め毛を除去したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを、イソフルオラン麻酔下で背部の正中線への５分間の直接圧力を利用するアレイで処置した。血清を、処置の２、３及び４週間後に伏在静脈採血によって回収した。５週目に、両群の動物は、１７５ｎｇのｓｅＶＬＰ－ＶｒＳ０１＋上記のアジュバント（５００ｎｇのＱＳ－２１、５００ｎｇの３Ｄ（６－アシル）－ＰＨＡＤ）からなる同じ方法による追加のＶａｘｉＰａｔｃｈ追加免疫を受けた。血清を再度採取し、追加免疫の２週間後に試験した。

【0383】

血清中の特異的ＩｇＧ応答を、０．５μｇ／ｍＬの全長ｒＳ（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈ，ＩＴ－００３－０３２ｐ）を含む１００ｍＭ炭酸緩衝液中、４℃で一晩コーティングしたプレートでＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。検出用のラットＩｇＧに対するＨＲＰコンジュゲートポリクローナルヤギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ，１１２－０３５－１４３）を使用して、１：１００～１：１２，５００までの５倍段階希釈物を試験した。陽性を、プレートのブランクウェルの２倍を超えるシグナルに基づいて割り当て、エンドポイント力価を割り当てるために使用した。

【0384】

図４０は、ＳＤラットにおけるＶｒＳ０１に対する特異的ＩｇＧ応答を要約する。左パネルは、割り当てられたエンドポイント力価のｌｏｇ１０に基づくＶｒＳ０１処置群の時間経過を示し、矢印は両方のワクチン接種処置のタイミングを示している。エラーバーはＳＥＭを表す（ｎ＝８／群）。右側のパネルは、５００ｎｇ処置群内の個々の動物からのエンドポイント力価を、初回ワクチン接種後４週間及び追加免疫後２週間において比較する。より濃い陰影のマーカは雄動物を表す。破線は、各群のＧＭＴ力価を示す。

【0385】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、上記実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解するべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【表6-8】

【表6-9】

【表6-10】

【表6-11】

【表6-12】

【表6-13】

【表6-14】

【表6-15】

【表6-16】

【表6-17】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

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【国際調査報告】