特表 2022-543061 細胞内で形成されるタンパク質凝集体に起因する疾患の治療のために使用される植物エクソソーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】細胞内で形成されるタンパク質凝集体に起因する疾患の治療のために使用される植物エクソソーム

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/04 20060101AFI20220930BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 36/185 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 36/23 20060101ALI20220930BHJP

   A61K 36/88 20060101ALI20220930BHJP

【ＦＩ】

C12N5/04

A61P43/00

A61P25/00

A61P25/16

A61P25/28

A61P25/14

A61K36/185

A61K36/23

A61K36/88

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506473

(86)(22)【出願日】2020-07-30

(85)【翻訳文提出日】2022-03-01

(86)【国際出願番号】 TR2020050677

(87)【国際公開番号】W WO2021021063

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】2019/11667

(32)【優先日】2019-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】TR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】512081166

【氏名又は名称】イェディテペ・ウニヴェルシテシ

【氏名又は名称原語表記】ＹＥＤＩＴＥＰＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＳＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】シャヒン，フィクレッティン

(72)【発明者】

【氏名】キルバシュ，オウス カーン

(72)【発明者】

【氏名】ボズクルト，バトゥハン トゥルハン

(72)【発明者】

【氏名】タシュル，パキゼ ネスリハン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B065AA88X

4B065AC20

4B065BA30

4B065BD14

4B065BD38

4B065CA44

4B065CA46

4C088AB12

4C088AB40

4C088AB71

4C088AC01

4C088AC04

4C088AC05

4C088AC11

4C088CA12

4C088CA14

4C088CA17

4C088NA14

4C088ZA01

4C088ZA02

4C088ZA16

4C088ZA22

(57)【要約】

本発明は、細胞内で形成されるタンパク質凝集体およびそれらが細胞に引き起こす損傷を低減するための植物エクソソームの使用に関する。本発明の目的は、神経変性疾患、特にALSの治療に使用される薬物の代替物として、植物起源であり、トランスジェニックではないので信頼できる植物エクソソームを使用することである。さらに、この薬は、従来の用途と比較して、植物由来であるため、大量かつ手頃な価格で製造することができる、高効能で副作用のない製品を提供することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内で形成されるタンパク質凝集体によって引き起こされる疾患の治療のために使用される植物エクソソーム。

【請求項2】

神経変性疾患の治療のために使用される、請求項１に記載の植物エクソソーム。

【請求項3】

アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびプリオン病のいずれか1つであり、タンパク質凝集体によって引き起こされる疾患の治療のために使用される、請求項２に記載の植物エクソソーム。

【請求項4】

筋萎縮性側索硬化症(ALS)の治療のために使用される、請求項３に記載の植物エクソソーム。

【請求項5】

細胞内で形成されるタンパク質凝集体によって引き起こされる疾患の治療のために、エクソソーム値の範囲10μg～1mg以内の有効用量で使用される、請求項１に記載の植物エクソソーム。

【請求項6】

ザクロ、パイナップルおよびセロリ植物の少なくとも1つからの単離によって得られる、請求項１に記載の植物エクソソーム。

【請求項7】

植物全体、果実、葉、種子、根、ならびに植物の培養培地、幹細胞、廃棄物、殻または師部の少なくとも1つからの単離によって得られる、請求項１または６に記載の植物エクソソーム。

【請求項8】

二相分離、段階的遠心分離、限外濾過の単離方法、クロマトグラフィー法、ポリマーベースの単離およびマイクロビーズによる単離の少なくとも1つによる植物からの単離によって得られる、請求項７に記載の植物エクソソーム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞内で形成されるタンパク質凝集体およびそれらが細胞に引き起こす損傷を低減するための植物エクソソームの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、自発的な筋肉の動きを可能にする運動ニューロンの喪失を引き起こし、筋萎縮および麻痺を引き起こす疾患である。実施された研究によれば、世界中のALSの発生率は10万人中2.7人である[1]。病気の最初の症状の発症は、45～70歳で見られる。症状は、運動、筆記および会話の能力の喪失とともに進行し、麻痺による呼吸不全の結果として死に至る。患者は、病気の診断後、平均2～5年以内に亡くなる[2]。

【0003】

ALS患者の90％の疾患は、遺伝的理由とは関係なく散発的であるように思われる。残りの症例は、家族性ALSと名付けられており、これは遺伝子突然変異の遺伝の結果として発生し、そのうちの13は、親から子供まで、これまでに実施された研究で決定されている。これらの遺伝子の中で、スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)変異が、遺伝性ALS症例の20％、散発性と考えられる症例の5％に見られる[3]。

【0004】

抗酸化物質は、ALS疾患の過程で重要な役割を果たすことが知られている。SOD1遺伝子は、抗酸化剤として機能する酵素をコードする。突然変異の結果として生成された突然変異体SOD1は、その健康な形態とは異なって折り畳まれ(誤って折り畳み)、ニューロンの死をもたらすタンパク質凝集を引き起こす[4、5、6]。他の研究では、遺伝子の変異型が酸化的損傷を引き起こし、運動ニューロンのアポトーシス、したがってALSを引き起こすことが示されている[7]。ALSの治療のために、変異型SOD1酵素の産生を阻害し、酸化的損傷を軽減する薬剤が、病気の進行を遅らせるのに効果的であることが示されている。

【0005】

哺乳類の細胞には、エクソソームと呼ばれる小さな小胞構造が含まれている。これらのエクソソームが健康な細胞から分離されるとき、損傷されるか、または特定のストレス下にあり、自己再生を完了することができない細胞を、以前の健康な状態に戻すために使用することができる[8]。近年、細胞ベースの治療における幹細胞の使用も、最も有望な研究の1つである。これらの細胞から放出されたエクソソームの使用は、臨床応用における創傷治癒および発毛/強化にプラスの効果をもたらすと主張されている[9]。

【0006】

小胞は、細胞内の物質の輸送および貯蔵に関与し、細胞質液から少なくとも1つの脂質二重層によって分離されている小さな嚢である。エクソソームは、原核生物から高等真核生物に至るまでの多くの生物および植物から放出される小胞であり、さまざまなサイズの脂質二重層小胞を含んでいる[10]。これらの小胞の重要性は、細胞機能に影響を与えるために他の細胞に情報を転送する能力の背後にある。エクソソームを介した信号伝達は、タンパク質、脂質、核酸および糖からなる多くの異なるカテゴリーの生体分子によって実行される[11]。

【0007】

細胞外小胞と細胞との機能的相互作用は、精漿から単離された小胞が精子の運動性を増加させることを実験的に決定した1982年に最初に発見された[12]。この時点から、小胞の分子メカニズムに関連する開発と、暗闇に残された問題を明らかにすることについて、今日まで多くの異なる組織において研究が行われてきた。

【0008】

細胞内で形成された凝集体に関連する植物エクソソームの生存率および発毛刺激効果に関する細胞に関する研究は行われていないが、植物エクソソームの特性と癌細胞に対するそれらの効果が研究され始めている[13]。

【0009】

ALSの治療に使用される薬は、患者の症状を軽減し、患者の寿命を延ばすことを目的としている。これらの薬には重篤な副作用があり、効能は低い。最も一般的に使用される2つの薬を以下に示す。
・Edavore(Radicava)：静脈内投与されるこの抗酸化剤は、ニューロンの損傷を防ぐことを目的とする。ALSに対するこの薬の効果は完全にはわかっていない。その副作用は、体のあざ、歩行障害および頭痛である。
・リルゾール(リルテック)：この経口投与薬は、体内のグルタミン酸塩レベルを全身的に低下させる。これは、胃の障害、めまいおよび体のあざを引き起こす。

【0010】

最先端として知られている出願である国際公開第2018102397号は、治療薬の送達のためのエクソソームの使用を開示している。微小胞は多くの種類の細胞から生成され、これらの中には植物細胞もある。本発明の治療薬を充填されたエクソソームは、さまざまな疾患の重症度を治療または軽減するために使用され、これらの疾患の1つが筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。国際公開第2018102397号は、別の薬物の送達のために異なるエクソソームを使用することを含む。治療効果は、エクソソームによってではなく、それらが運ぶ薬物によって提供される。

【0011】

国際公開第2016033696号は、最新技術で知られている出願であり、エクソソームおよび遺伝子操作されたエクソソームを製造および使用する方法を開示している。エクソソームは、非哺乳動物細胞から得ることもでき、非哺乳動物細胞という用語は、植物および野菜からのエクソソームを包含する。エクソソームが使用される分野の1つは、哺乳類のメタボリックシンドロームの治療であり、これらのメタボリックシンドロームの1つが、筋萎縮性側索硬化症(ALS)である。国際公開第2016033696号は、運動後4時間以内に、運動後に個人によって生成されるエクソソームの収集について開示している。エクソソームは、それらが得られる供給源に固有のカーゴ、それらが生産される細胞の種類、およびその細胞がその時に経験する刺激およびストレスの状態で生成され、それらは前記カーゴに従って作用する。上記の研究は、それらが特定した条件でのエクソソームを主張している。

【0012】

最先端の技術において知られている出願である、米国特許出願公開第20170307638号は、光酸化誘導増幅による凝集タンパク質の高感度イムノアッセイによる体液ベースの神経変性疾患診断のための方法を開示する。本発明の方法の範囲内で、体液サンプルの調製中に、体液からエクソソームを抽出する工程段階、前記抽出されたエクソソームからニューロンエクソソームを単離する工程段階、またはエクソソームを溶解して分析されるサンプルを調製する工程段階が実行される。神経機能障害は、毒性があり、容易に凝集するタンパク質によって誘発される可能性があり、複数の神経疾患は、そのような状態によって特徴付けられる。これらの疾患の1つは筋萎縮性側索硬化症(ALS)疾患である。前記発明は、ニューロンによって生成されたエクソソーム内の凝集タンパク質によって神経変性疾患を患う個人を診断するためのものである。

【0013】

最先端の出願の1つである欧州特許出願公開第1165789号は、小胞関連タンパク質(VEAS)およびVEASの発現に関連する障害を診断、治療、または予防するための方法を開示する。前記発明の範囲内で治療または予防されることを目的とする疾患の1つは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)疾患である。前述の特許出願と同様に、開示された発明は完全に診断目的である。上記の文書では、患者自身から得られたエクソソームが診断目的で使用されている。

【0014】

最先端の出願の1つである欧州特許出願公開第2756847号は、アルツハイマー病の予防または治療のための治療薬を開示する。この治療薬には、脂肪組織由来の間葉系幹細胞の膜小胞(エクソソーム)が含まれており、膜小胞(エクソソーム)には、ネプリライシンが含まれている。これらのネプリライシン含有膜小胞(エクソソーム)は、アルツハイマー病の病原性タンパク質としてのアミロイド-βを分解する。これらのエクソソームをアルツハイマー病モデルマウスの脳に投与すると、アミロイドβの生成が抑制される。前記特許出願文書は、脂肪幹細胞由来のエクソソームを利用している。脂肪幹細胞を供給源として選択する理由は、これらのエクソソームがアミロイド斑を分解するネプリライシンタンパク質を含んでいるためである。エクソソームカーゴに影響を与える要因の1つは細胞型である。他のエクソソームと同じであるエクソソームはない。カーゴの違いにより、それぞれが異なる結果を示すことができる。脂肪細胞のエクソソームは、凝集タンパク質に対する植物のエクソソームの効果と同様には示さないであろうが、植物のエクソソームは、脂肪のエクソソームによって示されるこの効果を示さない可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明の目的は、エクソソームを適用することによって凝集体を排除することにより、細胞内で形成されるタンパク質凝集体によって引き起こされるALSなどの神経変性疾患の治療にそれらを使用することである。(凝集体の減少を図1に示す)。

【0016】

本発明の別の目的は、それが植物由来であるという事実のために、大量かつ手頃な価格で生産することができる、高い効力を有し、副作用のない薬物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0017】

発明の詳細な記載
本発明の目的を達成するために開発された「細胞内に形成されたタンパク質凝集体に由来する疾患の治療に使用される植物エクソソーム」を、添付の図において説明する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】細胞に異なる用量で適用されたザクロのエクソソームの効果のグラフ表示であり、凝集体形成において、バフィロマイシンA1、ベラパミルおよびMG132を適用することによって凝集体が形成される。

【図2】ベラパミルの適用時における凝集体の破壊に関与するザクロ、パイナップル、セロリのエクソソームのNF-kB遺伝子の発現レベルの変化のグラフ表示である。

【図3】(a)フローサイトメトリーによって、得られた植物のエクソソームとそれらのサイズ分布の特性がCD9、HSP70およびCD63マーカーに対して陽性であることを実証するグラフ表示、および(b)エクソソームのサイズ分布のグラフ表示を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、細胞内で形成されたタンパク質凝集体によって引き起こされる疾患の治療のための植物エクソソームの使用に関する。筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患は、これらの疾患の中で発現される可能性がある。本発明の範囲内で、植物エクソソームは単独で使用され、植物エクソソーム自体が凝集タンパク質を還元する。

【0020】

タンパク質凝集の上限値、すなわち凝集体形成は、MG132、ベラパミルおよびバフィロマイシンが適用されるときに生じる値であり、細胞に対して毒性がある。下限値は、図1において対照として指定されており、すなわち、正常な細胞を示す。同様に、図1から、さまざまな濃度のエクソソームを適用すると、凝集体、すなわち、タンパク質凝集が、大幅に減少することがわかる。

【0021】

本発明の範囲内に含まれる植物エクソソームの有効量を図1および2に示す。生体の場合、これらの有効用量値は、患者の年齢、体重および性別によって異なる場合がある。これらの図から理解されうるように、細胞に適用するエクソソーム(ザクロ)(25、50、100μg/mL)の量が増えると、凝集体の量は徐々に減少し、バフィロマイシンA1、ベラパミルおよびMG132を適用することにより凝集体が形成される。さらに、これらのエクソソームはさまざまな組み合わせで使用することができるが、使用範囲は、決定されている。図にも見られるように、細胞から凝集体を除去するために必要な植物エクソソームの効果は、図1に示す凝集体測定テストの結果に従って決定された。図2では、ザクロだけでなく他の植物も凝集体の分解に役立ちうることが示されている。ザクロ、パイナップルおよびセロリ植物の少なくとも1つから単離することによって得られる植物エクソソームは、本発明の範囲内で使用される(図2に見られるように)。本発明の1つの実施態様では、植物エクソソームは、細胞内に形成されたタンパク質凝集体によって引き起こされる疾患の治療のために、エクソソーム値の範囲10μg～1mg以内の有効用量で使用される。
上記のタンパク質凝集によって引き起こされる疾患のいくつかは次のとおりである：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)およびプリオン病。

【0022】

本発明の範囲内に含まれる植物エクソソームの効果レベルは、エクソソームが単離される植物部分に応じて変化しうる。これらは、植物全体、果実、葉、種子および根でありうるが、植物の培養培地、幹細胞、廃棄物、殻または師部などの分化した組織でもありうる。植物エクソソームは、二相分離、段階的遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー法による単離、ポリマーベースの単離およびマイクロビーズによる単離などの多くの方法によって単離することができる。最も純粋なエクソソーム分離を可能にする二相液体システムを使用した単離方法の準備手順は次のとおりである：植物溶解物からエクソソームを単離するために2,000g～10,000gの間で5～20分間行われる遠心分離による植物の崩壊から生じる大きなサイズの粒子は、二相分離プロセスの間に適用される遠心分離およびそれらの重量のために沈殿時にデキストラン相に不純物を引き起こさないことを目的とする。さらに、220ナノメートル以上大きさの粒子を除去するためのろ過工程で使用するフィルターが目詰まりしないようにする。調製工程の結果として得られた均質なエクソソーム-タンパク質混合物を分離するために、二相流体システムを使用することが推奨される。二相液体系において、タンパク質に対するPEG相およびリン脂質構造膜に対するDEX相の化学的傾向を利用することにより、エクソソームから非エクソソームタンパク質、細胞脂肪およびその他の不純物が除去される。溶液中で使用されるポリマーの濃度によって形成されるDEX相は、エクソソームを分離する。単離されたエクソソームは、エクソソームによって運ばれる表面マーカーCD9、CD63およびHSP70抗体によってマークされ、これらのマーカーを運ぶエクソソームは、フローサイトメトリー装置によって測定される。同時に、単離されたエクソソームの寸法は、Zeta Sizer(Malvern Zetasizer ZS)デバイスによって測定される(図1-3)。

【0023】

本発明を開発する過程において、本発明の主題は、「細胞内に形成されるタンパク質凝集体およびそれらが細胞に引き起こす損傷を低減するための植物エクソソームの使用」であるため、細胞上の生物学的システムで凝集体を形成することができる植物エクソソームの凝集体を、3つの異なる経路で調べた。バフィロマイシンA1は、エネルギー代謝の障害によって形成された凝集体を表すために使用された。ベラパミルは、カルシウムチャネルの破壊によって引き起こされた凝集体を表すために使用された。MG132は、凝集体の分解に関与するプロテアーゼの損傷と機能不全に関連する凝集体を表す。ストレス、加齢、放射線、化学物質の蓄積などの原因により細胞内で凝集が起こるが、凝集メカニズムの出現は、使用されるこれらの3つの化学物質で模倣することができる。

【0024】

本発明の範囲内で、凝集に対する植物エクソソームの効果を決定するために、凝集体の量を測定し、遺伝子レベルの分析を行った。ベラパミル、MG132およびバフィロマイシンの適用により細胞内で凝集体が形成された後のこれらの凝集体の検出に使用される方法は以下の通りである：
1．細胞の培地を除去し、200μlの1X PBSで2回洗浄する。(1cm²の表面積をカバーするには約200μlで十分である)
2．PBSを注意深く除去し、細胞を200μlの4％パラホルムアルデヒド溶液で室温にて30分間固定する。
3．4％パラホルムアルデヒド溶液を除去した後、細胞を200μlのPBSで2回洗浄する。
4．PBSを除去した後、膜の透過性を増加させるために、細胞を氷上で0.5％Triton X-100、3 mM EDTA(pH 8)を含む溶液とともに30分間インキュベートする。
5．PBSで2回洗浄した後、細胞を200μlの検出溶液(1μlのプロテオステート凝集色素、2μlのヘキスト33342)とともに暗所で30分間インキュベートする。
6．インキュベーション後、細胞を200μlのPBSで洗浄し、次に、接着溶液でカバーガラスを覆う。
7．染色した細胞を共焦点顕微鏡(倍率40倍)で分析した。細胞凝集体の画像化にはテキサスレッドフィルターを使用し、細胞核の検出にはDAPIフィルターを使用する。

【0025】

本発明を開発する過程において、細胞内の凝集体の破壊を引き起こすエクソソームのメカニズムを決定するために、NFB遺伝子の発現レベルも測定された。培養細胞は、それ自体の特性を失い、新しい特性を獲得する可能性がある。これらの特性は、形態学的レベルと遺伝子発現レベルの両方にある可能性がある。遺伝子発現レベルにおける変化を観察するためにリアルタイムPCR法を適用した。全RNAを単離し、6ウェル培養プレート(Corning Glasswork、Corning、NY)中、50,000細胞/ウェルで、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に播種した細胞からcDNAを合成した。合成されたcDNAを、最終容量が20μlになるようにFermentas Maxima SYBR Green混合物のプライマーと混合し、遺伝子の発現レベルをBIO-RADデバイスを使用して分析した。

【0026】

細胞内で形成されるタンパク質凝集体およびそれらが細胞に引き起こす損傷を低減するための植物エクソソームの使用により、本発明の範囲内で、高い効力を有し、かつ副作用がなく、大量かつ手頃な価格で生産することができる薬物を提供することができる。さらに、この薬は植物由来であり、トランスジェニックではないという事実により、手頃な価格で信頼することができる製品が提供される。

【0027】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3-a】

【図3-b】

【国際調査報告】