特表 2022-543076 関節炎治療のためのＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-07

(54)【発明の名称】関節炎治療のためのＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/02 20060101AFI20220930BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20220930BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20220930BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220930BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20220930BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20220930BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20220930BHJP

【ＦＩ】

A61K38/02

A61P29/00

A61P19/02

A61P17/00

A61P19/00

A61P27/16

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

C07K14/78

C07K7/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506538

(86)(22)【出願日】2020-08-07

(85)【翻訳文提出日】2022-01-31

(86)【国際出願番号】 EP2020072280

(87)【国際公開番号】W WO2021028347

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】19191077.7

(32)【優先日】2019-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500242786

【氏名又は名称】フラウンホファー ゲセルシャフト ツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー．ファオ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】ヌー－グエン ド

(72)【発明者】

【氏名】ビルマ ウルボナビシウテ

(72)【発明者】

【氏名】シルビア ツィエンツィアラ

(72)【発明者】

【氏名】リカルド ホルムダール

(72)【発明者】

【氏名】ハーラルト ブルクハルト

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA17

4C084BA18

4C084BA41

4C084CA53

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA34

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB11

4C084ZB15

4H045BA10

4H045BA15

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA10

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、ヒト患者における関節炎などの、慢性炎症性疾患の治療における使用のための、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体であって、ここでＣＩＩペプチドは、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている複合体に関する。ＣＩＩペプチド中のリジン、特にＣＩＩペプチド中の第一のリジンは、翻訳後修飾されてよい。本発明は更に、哺乳類細胞において該ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を生成する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト患者における慢性炎症性疾患の治療における使用のための、
（ａ）少なくともα１ドメインを含む、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；
（ｂ）少なくともβ１ドメインを含む、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域；及び、
（ｃ）リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖の、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ、任意に融合された、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）：を含む、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物であって；
ここでＣＩＩペプチドが、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びに、
ここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含む、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物。

【請求項2】

（ａ）コンドロイチン－結合ペプチドが、その遊離型であり；
（ｂ）組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、その組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して多量体化されず；及び／又は、
（ｃ）組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、その組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して更なる分子に結合されていない：請求項１記載の使用のための組成物。

【請求項3】

（ａ）ＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域が、α１及びα２ドメインを含み；並びに／又は、
（ｂ）ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域が、β１及びβ２ドメインを含む：請求項１又は２記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記ＣＩＩペプチドが、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている、請求項１～３のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前述の少なくともα１ドメインが、ＤＲＡ＊０１０１に由来し、並びに少なくともβ１ドメインが、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレルに、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１に由来する、請求項１～４のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記ＣＩＩペプチドが、AGFKGEQGPKG、好ましくはAGFKGEQGPKGEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEPのアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記コンドロイチン－結合ペプチドが、５～２０個のアミノ酸、好ましくは６～１２個のアミノ酸を含む、請求項１～６のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記コンドロイチン結合ペプチドが、ポリヒスチジンタグ、好ましくは少なくともヘキサヒスチジンタグである、請求項１～７のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項9】

（ａ）少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；及び
（ｂ）少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域が、単独の融合ポリペプチドとして発現され；並びに、任意に
（ｃ）コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）が、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖の、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている、請求項１～８のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項10】

（ａ）少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域を含む第一のポリペプチド；
（ｂ）少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域を含む第二のポリペプチド；
（ｃ）リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ任意に融合された、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）：を含み；並びに
（ｄ）ここでＨＬＡ－ＤＲα鎖が、そのＣ－末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一の機能ドメインへ融合され、及びＨＬＡ－ＤＲβ鎖が、そのＣ－末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第二の相補的機能ドメインへ融合されている、請求項１～８のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記第一の機能ドメイン及び第二の相補的機能ドメインが：
（ａ）酸性及び塩基性ロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン；並びに／又は
（ｂ）ｊｕｎ－ｆｏｓロイシンジッパーモチーフ：である、請求項１０記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、未修飾及び／又は１もしくは複数の翻訳後修飾されたリジン残基（複数可）を伴うＣＩＩペプチドを含み、好ましくはここで
（ａ）ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチドからなるか；
（ｂ）ＣＩＩペプチドは、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか；
（ｃ）ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか；
（ｄ）ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか；
（ｅ）ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；
（ｆ）ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；
（ｇ）ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにガラクトシル－ヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；あるいは
（ｈ）ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにＯ－グリコシル化されたヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含み；並びに
ここで、翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおける任意の第二のリジンは、未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン及び／又はグルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン；好ましくは未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン、より好ましくは未修飾である、請求項１～１１のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記組成物が、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン修飾を伴うＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含まない、請求項１２記載の使用のための組成物。

【請求項14】

前記慢性炎症性疾患が、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、Ｘ線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、再発性多発性軟骨炎、全身性紅斑性狼瘡、ライム病、メニエール病、内耳自己免疫病（ＡＩＥＤ）、又はスチル病である、請求項１～１３のいずれか一項記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、ヒト患者における関節炎などの、慢性炎症性疾患を治療するための、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体であって、ここでＣＩＩペプチドは、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている複合体に関する。ＣＩＩペプチド中のリジン、特にＣＩＩペプチド中の第一のリジンは、翻訳後修飾されてよい。本発明は更に、哺乳類細胞において該ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を生成する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

技術的背景
関節リウマチ（ＲＡ）は、欧州において４００万～７００万人が罹患している大きい健康上の懸念を呈する一般的な重度の疾患である。これは、疼痛、進行性の軟骨及び骨の破壊に関連した、関節の異常な自己免疫炎症により引き起こされ、機能障害に繋がり、適切に治療されない場合は、最終的に不動／疾病(invalidity)に至る。今日の薬物治療は、臨床診断の確定時に直ちに開始され、症例の６０～７０％において効果があるが、この疾患からの治癒は達成されない。薬物治療は、炎症の共通のエフェクター経路を主に標的化し、これにより感染症リスクの増大に関連した、広範な免疫抑制効果を引き起こす。

【0003】

ＲＡの免疫遺伝学は、疾患の開始及び／又は永続化におけるＴ細胞活性化の異常な経路についての重要な役割を示唆している。Ｔ細胞活性化プロセスにおいて、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ（ヒト白血球抗原－ＤＲアイソタイプ（ＨＬＡ－ＤＲ）など）と複合体化された抗原性ペプチド断片により結合され(engaged)、プロフェッショナル抗原提示細胞により提供される共刺激シグナルとの関連でそれらの活性化に繋がる。疾患の病態形成におけるＣＤ４^＋ Ｔ細胞の役割を裏付ける最も強力な証拠は、ＲＡと、ＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲのペプチド結合ポケットのβ鎖上のアミノ酸コンセンサスモチーフQ/R R/K R A A（アミノ酸位置７０－７４、いわゆる「共有抗原配列」）をコードしているＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座の特定のアレルの間の遺伝的関連である(Gregersen PKら、Arthritis Rheum. 1987;30:1205-1213)。ＲＡにおけるＴ細胞の病態形成での役割に関する説得力のある証拠は、更に、中等度から重度の疾患の炎症性滑膜浸潤物におけるそれらの頻繁な検出能により提供され、これは特異的自己抗体反応の成熟を促進するための、局所的免疫反応におけるＢ細胞とのそれらの協力を示している。更に、損なわれたＣＤ４^＋ ＣＤ２５（ｈｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能が、ＲＡの病態形成に関与していることが示唆されている。従ってＲＡにおける制御不全の慢性的に活性化されたＴ細胞コンパートメントは、治療的免疫調節介入のための重要な標的を表している。

【0004】

ＲＡは、現在では、臨床的発症の数年前には始まると考えられている。最強の危険因子としてＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座における前述の共有されたエピトープをコードしているアレルによる多元発生的疾患としてのＲＡは、各自素因を持つ個体において発生する。しかし、依然疾患－規定された環境因子及び／又は生活習慣因子（喫煙）もまた、最大２０年間の前臨床期間について、関節炎の傾向があるが依然健康な個体において持続し得る、ＩｇＧ（リウマチ因子）及びシトルリン化されたタンパク質（ＡＣＰＡ）に対する抗体産生に関連した自己免疫応答の引き金に関与している。臨床的発病近くで、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）及びシトルリン化されたＣＩＩに対する免疫応答が、検出可能である(Burkhardt Hら、Eur J Immunol. 2005; 35:1643-52)。ＣＩＩは、関節軟骨中の主要タンパク質成分である。ＤＲＢ１＊０４０１アレルを保持するＲＡ患者（白人のＲＡ患者の５０％）は、三重螺旋ＣＩＩ領域のアミノ酸配列２５９－２７３に対応する主要ＣＩＩエピトープに特異的に反応するそれらのレパトア内にＴ細胞を収容することが明らかにされている。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化に重要なＴ細胞決定因子は、２６４位での生理的にガラクトシル化されたヒドロキシリジン残基に左右されることが説明されている(Baecklund J.ら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:9960-5)。しかし、ヒトにおけるこの依存性は、確立されたマウスモデルと比べて厳格さが低く、並びにネイキッドの翻訳後修飾されないＣＩＩペプチド及び翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを認識する自己反応性Ｔ細胞は、ＲＡヒト患者において、ＣＩＩ免疫処置されたマウスと比べ、より大きい相対程度で検出されるように見える。

【0005】

ＲＡに関して最も一般的に使用される動物モデルは、マウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）である。実験的関節炎は、ＭＨＣクラスＩＩ依存性であり、マウスのクラスＩＩアレルＡｑに関連し、並びにガラクトシル化されたＣＩＩ２５９－２７３エピトープのＴ細胞認識に左右される(Holmdahl R.ら、Ageing Res Rev. 2002;1: 135-47)。ＣＩＡは、創薬において抗関節炎の効力を持つ新規化合物の治療効率を試験するための、標準モデルとして使用される。従って、多種多様なプロトコールが、抗原特異的免疫寛容を誘導するために開発されており、並びにワクチン接種により関節炎を予防及び治癒する候補抗原の一種は、ＣＩＩである。今のところ何らかの認め得る副作用を伴わない、成体マウスにおける最も効率的なプロトコールは、結合ポケット中の主要抗原ＣＩＩペプチド、すなわちガラクトシル化されたＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴うＭＨＣクラスＩＩ分子Ａｑの細胞外ドメインからなる組換えタンパク質複合体、又はＡｑ／ｇａｌＣＩＩ複合体の静脈内注射により、免疫寛容を誘導することである(Dzhambazov Bら、J Immunol 2006; 176: 1525-1533)。関節炎発症前であるが、ＣＩＩによる免疫処置後のＡｑ／ｇａｌＣＩＩ複合体の注射は、関節炎の発症のほぼ完全な予防に繋がり、及び慢性再発性関節炎のマウスの治療は、この炎症活性のダウンレギュレーションに繋がる。寛容原性のＡｑ／ｇａｌＣＩＩ作用は、その抗関節炎力は処置されたマウスからナイーブレシピエントへＴ細胞により伝達されるので、ドミナントである。

【0006】

２６４位にガラクトシル化を伴わないＣＩＩペプチドを含むＡｑの複合体は、無作用で有り続けた。この驚くほど選択的な制御作用の理由は、おそらく、ガラクトシル化されたＣＩＩは、軟骨においてのみ発現される(Baecklund J.ら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:9960-5)のに対し、グリコシル化されないＣＩＩは、胸腺においても発現される(Chin R. K.ら、J Immunol. 2006;177: 290-7)という事実に関連しているであろう。従って、グリコシル化されないＣＩＩに対するＴ細胞反応は、中枢性寛容により調節されるのに対し、ガラクトシル化された抗原に対するＴ細胞反応は、末梢性寛容機序により調節される。従ってＲＡ病態形成における主要な駆動力としての、特に可動関節の構造成分に対する生理的に末梢の自己寛容の混乱が示唆され、且つその再建(reestablishment)は、寛容原性治療戦略の開発にとって論理的根拠となる。このアプローチは、傍観者抑制による関節炎発症性(arthritogenic)Ｔ細胞応答をダウンレギュレーションする免疫制御性Ｔ細胞を誘導するような先行する遺伝子型決定により、ＤＲＢ１＊０４０１アレルのキャリアとして確定されたバイオマーカーで選択されたヒトＲＡ患者へのＤＲ４／ＣＩＩ複合体の非経口的投与からなる。従来の治療アプローチとは対照的に、この作用機序は、関節炎発症性適応免疫応答の選択的免疫調節からなるが、防御免疫は影響を受けないままである。これは、ＤＲＢ１＊０４０１陽性患者など、特定のＨＬＡアレルを伴う患者に限定された、個人別の又はＨＬＡ－限定された治療アプローチである。加えて、ＣＩＡ治療の前臨床データは、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ複合体は、確定されたＲＡにおける治療効果、並びにＲＡを発症するリスクがある個体、すなわち疾患兆候前の個体における予防作用を実現する可能性があることを示唆している。従ってこの作用様式は、既に確立されたＲＡの療法とは基本的に異なる。

【0007】

ＷＯ２００７／０５８５８７Ａ１は、「自己抗原性ペプチド及びＭＨＣ結合モチーフを伴う担体を含む化合物」に関連し、且つこれは、（ａ）ペプチド、及び（ｂ）担体を含む化合物であって、ここで該ペプチドは、少なくともモチーフX-X-X-X-X-X-Xを有し、並びにここで少なくとも１個のアミノ酸残基Ｘはグリコシル化されている、化合物を開示している。更にこのペプチドは、ペプチド結合タンパク質に連結されており、及び該担体は、少なくともＭＨＣ結合モチーフを含み、ここでこの連結は共有的であってよい。しかしこのペプチドは、同じ宿主細胞によりＭＨＣＩＩタンパク質と一緒には発現されないか、又はリンカーペプチドを介して、ＭＨＣＩＩタンパク質へ連結される。

【0008】

より新しい証拠は、ヒトにおいてもまた、翻訳後修飾を伴わないＭＨＣＩＩ／ＣＩＩペプチド複合体は、免疫寛容を誘導する活性があることを裏付けている。従ってＣＩＩペプチド中のリジンの翻訳後修飾は、ヒトにおいてもまた恐らく最も利点があるにも関わらず、これは厳密に必要とはされない。

【0009】

ＭＨＣＩＩ複合体は、複合体の精製を簡単にするために、ポリヒスチジンタグを保有するように通常調製される。ポリヒスチジンタグは、その生化学的特性の先行する知識がない事実上あらゆるタンパク質の精製を可能にする、タンパク質精製のツールとして使用される親和性タグである。しかし治療的適用のために、このタグは、典型的には、例えばプロテアーゼ及び切断部位を使用し、融合タンパク質から除去されなければならない。従って本発明者らの最良の知識として、ヒトの慢性炎症性疾患の治療において使用するための治療薬としてのＭＨＣＩＩ／ＣＩＩペプチド複合体においてポリヒスチジンタグに関連した作用はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

発明の概要
本発明は、ヒト患者における慢性炎症性疾患、特に慢性炎症性関節疾患及び／又は関節炎の治療における使用のための、（ａ）少なくともα１ドメインを含む、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；（ｂ）少なくともβ１ドメインを含む、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域；及び、（ｃ）リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ、任意に融合された、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）：を含む組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物であって；ここでＣＩＩペプチドが、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含む、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物に関する。好ましくは、慢性炎症性疾患の治療において使用するための組成物は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、Ｘ線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、再発性多発性軟骨炎、全身性紅斑性狼瘡、ライム病、メニエール病、内耳自己免疫病（ＡＩＥＤ）、又はスチル病からなる群から選択される。

【課題を解決するための手段】

【0011】

特定の実施態様において、コンドロイチン－結合ペプチドは、その遊離型である。このことは、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、その組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して多量体化されず、及び／又は、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、その組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して更なる分子に結合されていないことを意味する。コンドロイチン－結合ペプチドは、５～２０個のアミノ酸、好ましくは６～１２個のアミノ酸を含んでよい。一実施態様において、コンドロイチン結合ペプチドは、ポリヒスチジンタグ、好ましくは少なくともヘキサヒスチジンタグである。

【0012】

特定の実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域は、α１及びα２ドメインを含み；並びに／又は、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域は、β１及びβ２ドメインを含む。別の実施態様において又は加えて、ＣＩＩペプチドは、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、アミノ酸配列AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX₁G、AGFKGEX₂GPKG、AGFKGX₃QGPKG、AGFKX₄EQGPKG、AGFKGEX₂GPX₁G、AGFKGX₃QGPX₁G及びAGFKX₄EQGPX₁Gを含み、ここでＸ_１は、Ｋを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＲ、Ａ、Ｇ又はＱ、より好ましくはＲであり；Ｘ_２は、Ｑを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｒ、Ｈ又はＧであり；Ｘ_３は、Ｅを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｄ、Ｑ又はＧであり；並びに、Ｘ_４は、Ｇを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、より好ましくはＡ、Ｓ、Ｖ又はＬである。好ましくはＸ_２、Ｘ_３又はＸ_４は、Ｋではない。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG又はAGFKGEQGPX₁G、好ましくはAGFKGEQGPKGEP又はAGFKGEQGPX₁GEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEP又はGIAGFKGEQGPX₁GEPのアミノ酸配列を含む。

【0013】

本発明に従う使用のための組成物において、少なくともα１ドメインは、好ましくはＤＲＡ＊０１０１に由来し、並びに少なくともβ１ドメインは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレル、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１に由来する。

【0014】

少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；及び、少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域は、単独の融合ポリペプチドとして発現されてよく；並びに、任意に、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）は、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている。あるいは、このα及びβ鎖は、個別のポリヌクレオチドとして発現されてよく、ここでＨＬＡ－ＤＲ複合体は、少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域を含む第一のポリペプチド；少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域を含む第二のポリペプチド；及び、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ任意に融合された、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）：を含み；並びにここで、ＨＬＡ－ＤＲα鎖は、そのＣ－末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一の機能ドメインへ融合され、及びＨＬＡ－ＤＲβ鎖は、そのＣ－末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第二の相補的機能ドメインへ融合されている。ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一及び／又は第二の機能ドメインには、更に、コンドロイチン－結合ペプチドが続く。第一の機能ドメイン及び第二の相補的機能ドメインは、酸性及び塩基性のロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン、好ましくはｊｕｎ－ｆｏｓロイシンジッパーモチーフであってよい。

【0015】

本発明に従う使用のための組成物中に含まれる組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、未修飾の及び／又は１又は複数の翻訳後修飾されたリジン残基（複数可）を伴うＣＩＩペプチドを含む。一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチドからなるか、ＣＩＩペプチドは、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか、ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか、又はＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなる。別の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにガラクトシル－ヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；あるいは、ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにＯ－グリコシル化されたヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含む。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおける任意の第二のリジンは、未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン及び／又はグルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジンであってよく；好ましくは未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン、より好ましくは未修飾であってよい。好ましい実施態様において、本組成物は、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン修飾を伴うＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有しない。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１：ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の概略図。共有結合したＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴うＭＨＣＩＩ分子。ＢｉｒＡ：ビオチン化部位、ＨＩＳ：ポリ（６×）ヒスチジンタグ、ＪＵＮ／ＦＯＳ：ロイシンジッパーの相補的ドメイン（ヘテロ二量体化ドメイン）、ＴＥＶ：タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）システインプロテアーゼ切断部位、リンカー：Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーペプチド、トロンビン切断部位、ｓｔｒｅｐ－タグ、ＣＩＩペプチド２５９－２７３。

【0017】

【図2】図２：ＨＥＫ２９３細胞（上側）、Ｓ２昆虫細胞において（中央）、及び抗－ＣＤ３抗体刺激（下側）産生された、Ａｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体（組換え、インサイチュでグリコシル化されたＡｑ／ｒＣＩＩ）に反応した、Ａｑ－拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマクローンのＩＬ－２（ＦＵ）分泌。使用したマウスＴ細胞ハイブリドーマクローンは、以下の特異性を有する：ＨＣＱ３（ＣＩＩ、Ｇａｌ－ＨＫ２６４）、ＨＣＱ．４（ＣＩＩ、未修飾及びＨＫ２６４）、ＨＣＱ．１１（Ｇｌｃ－Ｇａｌ－ＨＫ２６４）、ＨＭ１Ｒ．２（ＣＩＩ、Ｇａｌ－ＨＫ２６４及びＧａｌ－ＨＫ２６４＋２７０）、ＨＰ３（Ａｑ－拘束性、ペプシン－ペプチド）、ここでＫは、リジンの略語であり、並びにＨＫは、ヒドロキシリジンの略語である。

【0018】

【図3】図３：マウスＣＩＡモデルにおけるＨＥＫ２９３細胞において産生されたインサイチュでグリコシル化されたＡｑ／ｒＣＩＩを使用する治療的ワクチン接種。Ａ）用量－反応－曲線：ナイーブマウスは、関節炎を誘導するためにＣＩＩにより免疫処置し、並びに３５日目に追加免疫を受け取った。マウスは、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の異なる用量で処置した：１０、５０又は１００μｇ（ｎ＝９）。関節炎マウスの数は、１００μｇ処置群において、対照と比べ、有意に低い（ｐ＜０．０５、カイ二乗）。Ｂ）ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を投与するために、浸透圧ポンプを、３５日目の追加免疫後、７日間埋め込み、このワクチンの連続投与を確実にした（例えば、１００μｇ：１５μｇ／２４ｈを７日間）。

【0019】

【図4】図４：グリコシル化拘束性ヒトＴ細胞ハイブリドーマの活性化。ヒトＴ細胞ハイブリドーマ細胞は、抗原－特異的様式で、ヒトＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体（ＤＲ４／ｈＣＩＩ）による刺激時に、活性化された。ヒトＴ細胞ハイブリドーマｍＤＲ１．１及び３Ｈ８の認識は、ＣＩＩペプチドのグリコシル化プロファイルによって決まる。Ａ）Ｔ細胞ハイブリドーマクローンｍＤＲ１．１は、ＨＬＡ－ＤＲ４により提示されたガラクトシル化されたＫ２６４により、活性化され；Ｂ）他方、Ｔ細胞ハイブリドーマクローン３Ｈ８は、ＨＬＡ－ＤＲ４により提示された未修飾ＣＩＩエピトープにより活性化される。これら２種の異なるＴ細胞ハイブリドーマクローンの反応性は、合成ガラクトシル化された又は未修飾のＣＩＩペプチド（各々、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ及びＤＲ４／ｎＣＩＩ）、及び天然にグリコシル化されたＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体（ＤＲ４／ｈＣＩＩ）が負荷された、ヒトＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を使用することにより、比較した。ＩＬ－２の分泌は、ＥＬＩＳＡにより測定した。

【0020】

【図5】図５：関節リウマチのＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１患者の末梢血中の抗原特異性Ｔ細胞の検出。Ａ）ビオチン化されたＤＲ４／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体を、蛍光色素（ＰＥ、ＡＰＣ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンと共にインキュベーションした。これらの四量体を使用し、Ｋ２６４でのガラクトシル化を伴うＣＩＩ２５９－２７３ペプチドに特異的なＴ細胞を検出した。ＲＡ患者及び健常ドナーのＰＢＭＣ中の抗原特異性（ＣＩＩ２５９－２７３、Ｋ２６４ｇａｌ）Ｔ細胞は、フローサイトメトリーを使用し検出した。Ｂ）検出に、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩペプチド四量体、ＤＲ４／ｎＣＩＩペプチド四量体又はＤＲ４／ｈＣＩＩペプチド四量体を使用する、抗原特異性Ｔ細胞の頻度の比較。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞集団内の四量体陽性Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより測定した。

【0021】

【図6】図６：ヒトＴ細胞活性化。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１のＲＡ患者の末梢血中の抗原特異性Ｔ細胞の検出。Ｔ細胞は、ｇａｌＣＩＩ時に活性化され、未修飾ＣＩＩペプチド刺激により、より少ない程度に活性化される。ＣＤ１５４のアップレギュレーションは、フローサイトメトリーにより測定した（有意性：ｐ－値＝０．０３３２、マンホイットニー検定）。

【0022】

【図7-1】図７：インビトロにおいて刺激されたＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性ＲＡ患者（ｎ＝２０）由来のＰＢＭＣによる、サイトカイン放出のLegendplex(商標)分析。標準ＴＲ１細胞分化条件（ＴＲ１）及び陰性対照（ＣＯ）による刺激と比較した、ＤＲ４／ｎＣＩＩペプチド複合体又はＤＲ４／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体でのインビトロ刺激による、ＩＬ－２、ＩＬ－１７ｆ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７ａ、及びＴＮＦ－αの放出の特異的誘導が示されている。

【図7-2】図７：インビトロにおいて刺激されたＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性ＲＡ患者（ｎ＝２０）由来のＰＢＭＣによる、サイトカイン放出のLegendplex(商標)分析。標準ＴＲ１細胞分化条件（ＴＲ１）及び陰性対照（ＣＯ）による刺激と比較した、ＤＲ４／ｎＣＩＩペプチド複合体又はＤＲ４／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体でのインビトロ刺激による、ＩＬ－２、ＩＬ－１７ｆ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７ａ、及びＴＮＦ－αの放出の特異的誘導が示されている。

【0023】

【図8】図８：Ｈｉｓ－タグを伴う又は伴わない複合体の比較。（Ａ）ＤＲ４－特異的抗体及びペルオキシダーゼ－結合した二次抗体を使用し、ＤＲ４／ｎＣＩＩ、対、ＤＲ４／ｎＣＩＩ Ｔｅｖ－切断された複合体の等モル溶液による、マイクロタイターウェルのコーティング有効性を比較するＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートへのコーティングに使用されたＤＲ４／ｎＣＩＩ溶液の指定されたタンパク質濃度［μｇ／ｍｌ］での、４０５ｎｍの吸収が示されている。（Ｂ）指定された濃度での、マイクロタイターウェルへのコーティング前のＤＲ４／ｎＣＩＩ、対、ＤＲ４／ｎＣＩＩ Ｔｅｖ－切断された複合体による、３Ｈ８ハイブリドーマ細胞の活性化。マイクロタイタープレートへのコーティングのために使用したＤＲ４／ｎＣＩＩ溶液の指定されたタンパク質濃度［μｇ／ｍｌ］での、活性化後の上清中のＩＬ－２濃度が、示されている。

【0024】

【図9-1】図９：Ｔ細胞活性化に対するＤＲ４／ｈＣＩＩペプチド複合体中のＨｉｓ－タグ、並びに、Ａ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、Ｂ）ヒアルロナン、Ｃ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）とのそれらの相互作用の影響：コンドロイチン硫酸によりブロックされたか又はプレコーティングされたかのいずれかのマイクロタイターウェル中の溶質相中の指定された濃度での、ＤＲ４／ｈＣＩＩ、対、ＤＲ４／ｈＣＩＩΔＨｉｓ、及び同じく（Ａ）においてはＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤによる、３Ｈ８ハイブリドーマ細胞におけるＩＬ－２反応の誘導。活性化後の上清中のＩＬ－２濃度が示されている。

【図9-2】図９：Ｔ細胞活性化に対するＤＲ４／ｈＣＩＩペプチド複合体中のＨｉｓ－タグ、並びに、Ａ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、Ｂ）ヒアルロナン、Ｃ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）とのそれらの相互作用の影響：コンドロイチン硫酸によりブロックされたか又はプレコーティングされたかのいずれかのマイクロタイターウェル中の溶質相中の指定された濃度での、ＤＲ４／ｈＣＩＩ、対、ＤＲ４／ｈＣＩＩΔＨｉｓ、及び同じく（Ａ）においてはＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤによる、３Ｈ８ハイブリドーマ細胞におけるＩＬ－２反応の誘導。活性化後の上清中のＩＬ－２濃度が示されている。

【0025】

【図10】図１０：指定された濃度でマイクロタイターウェルにプレコーティングされたＤＲ４／ｈＣＩＩ、対、ＤＲ４／ｈＣＩＩΔＨｉｓ、対、ＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤによる、３Ｈ８ハイブリドーマ細胞の活性化。マイクロタイタープレートへのコーティングに使用したＤＲ４／ｎＣＩＩ溶液の指定されたタンパク質濃度［μｇ／ｍｌ］での、活性化後の上清中のＩＬ－２濃度が示されている。

【0026】

【図11】図１１：３Ｈ８ハイブリドーマ細胞におけるＩＬ－１０反応の刺激に対する、ＤＲ４／ｈＣＩＩペプチド複合体中のＨｉｓ－タグ、並びに、溶質相中のコンドロイチン硫酸（ＣＳ）とのそれらの相互作用の影響：プラスチック表面がブロックされたマイクロタイターウェル中の、コンドロイチン硫酸（２．５ｍｇ／ｍｌ）を伴う又は伴わない（ｗ／ｏ）、溶質相中の指定された濃度でのＤＲ４／ｎＣＩＩによる３Ｈ８ハイブリドーマ細胞の活性化。マイクロタイタープレートのコーティングに使用されたＤＲ４／ｎＣＩＩ溶液の指定されたタンパク質濃度［μｇ／ｍｌ］での、活性化後の上清中のＩＬ－１０濃度が示されている。

【0027】

【図12】図１２：インビボにおいてコラーゲンＩＩに対するＤＴＨ反応により誘導された耳膨潤に対する、Ｈｉｓ－タグを含むか又は欠くかのいずれかのＡｑ／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体の治療効果の比較。ポリヒスチジンタグを伴う（Ｈｉｓ）及び伴わない（ｗ／ｏＨｉｓ）Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ構築体の作用は、その結合溝に連結されたマウスの変異されたＣＬＩＰペプチド（ＣＬＩＰｍｔ）を含むＡｑ／ｍＣＬＩＰｍｔ対照構築体と比較して示している（＊は、ｐ値＜０．０５を示し、及び＊＊は、ｐ値＜０．０１を示す）。

【0028】

【図13】図１３：組換えＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体におけるＣＩＩ－ペプチドの翻訳後修飾における異質性。質量分析により分析した指定されたＫ位置の各位置での検出可能な修飾の百分率を、示している。［ＯＨ＝ヒドロキシリジン、Ｈｅｘ＝ガラクトシル－ヒドロキシリジン、ＤｉＨｅｘ＝グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン、Ｕｂ＝ユビキチン、ＰＯＨ＝ヒドロキシプロリン］。

【0029】

【図14-1】図１４：Ｐｌｏｄ３遺伝子（ＬＨ３）ノックダウンＥｘｐｉ２９３細胞の作製。（Ａ）多機能コラーゲン－修飾酵素ＬＨ３により媒介された、リジンから、ヒドロキシリジン、Ｇａｌ－ヒドロキシリジン、及びＧｌｃ－Ｇａｌヒドロキシルへと段階的移行の概略的表現。（Ｂ）ウェスタンブロットによるＰＬＯＤ３の検出。Ｐｌｏｄ３特異的ｓｈ－ＲＮＡをコードしているレンチウイルス１×１０^６個により形質導入された様々なＥｘｐｉ２９３ ＨＥＫ細胞クローンからの溶解液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに装加し、且つＰＬＯＤ３を、抗－ＰＬＯＤ３抗体を使用するウェスタンブロットで検出した。ＰＬＯＤ３は、理論的分子量８４ｋＤａを有する。クローン＃４、＃１８及び＃２０を、更なる増殖のために使用した。（Ｃ）質量分析によるグリカン分析。ｐｌｏｄ３遺伝子をノックダウンするようｓｈＲＮＡによりレンチウイルスを形質導入した後、質量分析によるグリカン分析を、ガラクトシルヒドロキシリシル残基のグルコシル化の減少を調べるために行った。一番上に示したコラーゲンＩＩ型エピトープ（配列番号：１）内の両方のリジン（Ｋ２６４及びＫ２７０）を、分析した。グルコ－ガラクトシルヒドロキシリシル残基（ＤｉＨｅｘ）の明確な減少が、明らかにされる。Ｕｎｍｏｄ＝未修飾、ＯＨ＝水酸化された、ＤｉＯＨ＝ジヒドロキシル化された、Ｈｅｘ＝ガラクトシル化されたヒドロキシリシル、ＤｉＨｅｘ＝グルコ－ガラクトシルヒドロキシリシル。

【図14-2】図１４：Ｐｌｏｄ３遺伝子（ＬＨ３）ノックダウンＥｘｐｉ２９３細胞の作製。（Ａ）多機能コラーゲン－修飾酵素ＬＨ３により媒介された、リジンから、ヒドロキシリジン、Ｇａｌ－ヒドロキシリジン、及びＧｌｃ－Ｇａｌヒドロキシルへと段階的移行の概略的表現。（Ｂ）ウェスタンブロットによるＰＬＯＤ３の検出。Ｐｌｏｄ３特異的ｓｈ－ＲＮＡをコードしているレンチウイルス１×１０^６個により形質導入された様々なＥｘｐｉ２９３ ＨＥＫ細胞クローンからの溶解液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに装加し、且つＰＬＯＤ３を、抗－ＰＬＯＤ３抗体を使用するウェスタンブロットで検出した。ＰＬＯＤ３は、理論的分子量８４ｋＤａを有する。クローン＃４、＃１８及び＃２０を、更なる増殖のために使用した。（Ｃ）質量分析によるグリカン分析。ｐｌｏｄ３遺伝子をノックダウンするようｓｈＲＮＡによりレンチウイルスを形質導入した後、質量分析によるグリカン分析を、ガラクトシルヒドロキシリシル残基のグルコシル化の減少を調べるために行った。一番上に示したコラーゲンＩＩ型エピトープ（配列番号：１）内の両方のリジン（Ｋ２６４及びＫ２７０）を、分析した。グルコ－ガラクトシルヒドロキシリシル残基（ＤｉＨｅｘ）の明確な減少が、明らかにされる。Ｕｎｍｏｄ＝未修飾、ＯＨ＝水酸化された、ＤｉＯＨ＝ジヒドロキシル化された、Ｈｅｘ＝ガラクトシル化されたヒドロキシリシル、ＤｉＨｅｘ＝グルコ－ガラクトシルヒドロキシリシル。

【0030】

【図15】図１５：β鎖を含む配列のＣ－端側に交互に正帯電されたアミノ酸タグを伴う、Ａｑ／ｇａｌ２６４ＣＩＩ構築体。Ａ）Ｈ２ＡＮタグ（Ｎ－端側Ｈ２Ａ配列；ヒストンＮＴ；配列番号：３４）、Ｈ２ＡＣタグ（Ｃ－端側Ｈ２Ａ配列；ヒストンＣＴ；配列番号：４０）、及びＮＨタグ（修飾されたＨｉｓ；配列番号：３５）の配列が、示されている。Ｂ）ヒト及びマウスのヒストンＨ２Ａの配列アラインメントが、示されている。マッチは、（＊）により示し、及びミスマッチは、（：）により示した。ボックスは、ヒストンＮＴ及びＣＴ配列の位置を示している。

【0031】

【図16】図１６：Ａｑβ鎖のＣ－端側に交互に正帯電されたアミノ酸タグを伴う、Ａｑ／ｇａｌ２６４ＣＩＩ構築体を試験するための、ハイブリドーマアッセイ。Ｈｉｓ－タグ又は交互に正帯電されたアミノ酸タグを伴う構築体を、上側に示し、ＴＣＳは、図１のように、β鎖前のリンカーが続くトロンビン切断を表し、並びにＳ－タグは、ストレプトアビジン－タグを表している。交互に正帯電されたアミノ酸タグを伴うＡｑ／ｇａｌ２６４ＣＩＩペプチド複合体（Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ（修飾されたＨｉｓ））、Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ（ヒストンＣＴ）、Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ（ヒストンＮＴ）は、マイクロタイターウェルのプラスチック表面に、異なる濃度でコーティングされた。ＨＣＱ．３ Ｔ細胞ハイブリドーマが添加され、並びにＩＬ－２分泌が、特異的細胞活性化の測定値として、ＥＬＩＳＡにより決定された。Ｈｉｓ－タグ付けしたＡｑ／ｇａｌＣＩＩ（Ｈｉｓ）は、陽性対照として働き、及びいかなるタグも付けていないＡｑ／ｇａｌＣＩＩ（ｗ／ｏＨｉｓ）は、陰性対照として働いた。

【0032】

【図17】図１７：インビボにおいてコラーゲンＩＩに対するＤＴＨ反応により誘導された耳膨潤に対する、Ｈｉｓ－タグを伴う又は伴わないＡｑ／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体、及びヒストンＮＴ－タグを伴うＡｑ／ｇａｌＣＩＩペプチド複合体の治療効果の比較。ポリヒスチジンタグを伴う（Ｈｉｓ）及び伴わない（ΔＨｉｓ）及びヒストンＮＴ－タグを伴うＡｑ／ｇａｌＣＩＩ構築体の作用を、その結合溝中に連結されたマウスＣＬＩＰペプチド（ＣＬＩＰｍｔ）を含むＡｑ／ｍＣＬＩＰｍｔ対照構築体と比較して示している。

【発明を実施するための形態】

【0033】

好ましい実施態様の詳細な説明
全般的態様「含んでいる」又は「含まれる」は、より具体的な態様「からなる」を包含する。更に、単数形及び複数形は、限定的な様式では使用されない。本明細書において使用される単数形「ある（a、an及びthe）」は、単数のみを指定することを明確に言及しない限りは、単数及び複数の両方を指定する。

【0034】

用語「タンパク質」は、「アミノ酸配列」又は「ポリペプチド」と互換的に使用され、並びに任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、非限定的に、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、糖化又はタンパク質プロセシングを含む反応を通じて、翻訳後修飾されたタンパク質も含む。例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失もしくは挿入などの修飾及び変更をポリペプチドの構造に行う一方で、その分子はその生物学的機能活性を維持することができる。例えば、特定のアミノ酸配列置換は、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列に行うことができ、並びにタンパク質は、同じ特性を得ることができる。

【0035】

用語「ポリペプチド」は、典型的には、２０個より多いアミノ酸の配列を指し、用語「ペプチド」は、長さが最大２０個のアミノ酸の配列を意味する。しかしこれらの用語は、互換的に使用されてよい。タンパク質は、二量体などの多量体を形成してよく、ここで二量体は、ヘテロ二量体又はホモ二量体であってよい。本発明に従うＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外領域及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外領域を含み、これは典型的には、それらの鎖の一方のＮ－端側に融合されたコラーゲンＩＩペプチドを収容するための結合溝を形成する、ヘテロ二量体を形成する。しかし当業者は、ヘテロ二量体を形成する２つのタンパク質は、任意に可動性リンカーを介して互いに連結されたドメインを伴う単独のポリペプチド鎖を形成する融合タンパク質、すなわち一本鎖ヘテロ二量体としても作製され得ることを理解するであろう。

【0036】

「融合タンパク質」は、２種以上の当初は個別の天然又は修飾されたタンパク質の完全な配列又はその配列の任意の部分を含むタンパク質として定義される。融合タンパク質は、２種以上の当初は個別の天然もしくは異種タンパク質、又はその一部を当初コードしている、２種以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ、又はそれらの一部を融合することによる、組換えＤＮＡ技術を使用する遺伝子操作アプローチにより、構築されることができる。これは結果的に、当初のタンパク質の各々に由来する機能特性を持つ融合タンパク質を生じる。従って、ペプチド又はタンパク質は、ペプチド結合又は好ましくはリンカーペプチドにより、別のタンパク質に連結される。

【0037】

用語「ゲノムＤＮＡ」又は「ゲノム」は、互換的に使用され、並びに宿主生物の遺伝性の遺伝子情報を指す。ゲノムＤＮＡは、核のＤＮＡ（染色体ＤＮＡとも称される）を含むが、他の細胞小器官（例えばミトコンドリア）のものも含む。

【0038】

本明細書において使用される用語「遺伝子」は、機能性産物として発現されることによるか、又は遺伝子発現の調節により、生物の形質に影響を及ぼす、遺伝性のゲノム配列のＤＮＡ遺伝子座を指す。遺伝子及びポリヌクレオチドは、ゲノム配列の中にイントロン及びエクソンを、又は開始コドン（メチオニンコドン）及び翻訳終止コドンを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などのｃＤＮＡに含まれるようなコード配列だけを含んでよい。遺伝子及びポリヌクレオチドはまた、転写開始、翻訳及び転写の終止など、それらの発現を調節する領域も含むことができる。従って、プロモーターなどの調節エレメントも含む。

【0039】

本明細書において使用される用語「核酸」、「ヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、並びに５’末端から３’末端に読み進む、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指し、並びに二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、組換えＤＮＡ又は組換えＲＮＡ、及び例えば修飾された骨格を含むものなどのそれらの誘導体を含む。好ましくは、ポリヌクレオチド、特に哺乳類のゲノムへ安定して組み込まれるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｃＤＮＡである。本発明に従うポリヌクレオチドは、異なる様式（例えば、化学合成により、遺伝子クローニングによりなど）で調製されることができ、並びに様々な形態（例えば、線状又は分岐状、一本鎖又は二本鎖、もしくはそのハイブリッド、プライマー、プローブなど）をとることができる。用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、個別の一本鎖の又は二重鎖のいずれかとしての、核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を指す。

【0040】

本明細書において使用される用語「組換えポリヌクレオチド」は、例えば、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの、レシピエントとは異なる細胞、生物又は異なる種に由来したか、又は組換え技術を用いレシピエントへ導入された、ポリヌクレオチドを指す。本発明の状況において、当業者は、これは、ＤＮＡ又はｃＤＮＡを指すことを理解するであろう。組換えポリヌクレオチドはまた、導入遺伝子又は異種ポリヌクレオチドも指してよい。従ってこれは、組換えタンパク質をコードしている遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であってよい。ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞などの、哺乳類細胞の状況において、「組換えポリヌクレオチド」は、異なる細胞に由来した又は人工的に合成されたポリヌクレオチドを指す。用語「組換え」は、分子クローニングなど、遺伝子組換えの実験室での方法により形成された、ポリペプチド分子又はポリ核酸分子などの分子を指す。そのような方法は、複数の給源からの遺伝物質を一緒にするか、又は天然に存在しない配列を作出する。核酸の一部分に関して使用される場合、「組換え」はまた、天然において互いに同じ関係では認められない２種以上の配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドも含む。従って組換えはまた、同じ細胞株に由来するが、典型的にはそれが認められない位置でゲノムに挿入されている遺伝子もしくは導入遺伝子、又はそれらの一部、あるいは典型的にはそれが認められない生物の細胞へ導入された遺伝子などの、ポリヌクレオチド配列を指す。

【0041】

本明細書で使用される「組換えポリヌクレオチド」、「組換え遺伝子」又は「組換え配列」は、標的細胞又は宿主細胞へ、直接に、又は好ましくは「発現ベクター」、好ましくは哺乳類の発現ベクターを使用することにより、導入され得る。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知である。ベクターは、プラスミドベクター、コスミド、人工／ミニ－染色体（例えばＡＣＥ）、又はレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルスなどのウイルスベクターを含み得るが、これらに限定されるものではない。真核生物の発現ベクターは、典型的には、複製起点などの細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物の配列、及び細菌における選択のための抗生物質耐性遺伝子も含むであろう。そこへポリヌクレオチドが機能的に連結されるクローニング部位を含む、多種多様な真核生物の発現ベクターが、当該技術分野において周知である。通常発現ベクターはまた、該発現マーカーを保有する宿主細胞の選択を可能にする、選択マーカーをコードしている発現カセットも含む。

【0042】

用語「サイトカイン」は、細胞により放出され、且つ例えば、分泌細胞の周囲の細胞の挙動に影響するなど、細胞内メディエーターとして作用する、小型タンパク質を指す。サイトカインは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージなどの、免疫細胞又は他の細胞により分泌され得る。サイトカインは、自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達など、細胞内シグナル伝達事象に関与し得る。これらは、非限定的に免疫、炎症、及び造血を含む、広範な生物学的プロセスを媒介し得る。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン又は腫瘍壊死因子であり得る。

【0043】

本明細書において使用される用語「発現」は、宿主細胞内での核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。宿主細胞における関心対象の遺伝子産物の発現のレベルは、細胞中に存在する対応するＲＮＡの量、又は選択された配列によりコードされたポリペプチドの量のいずれかを基に決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞ＲＮＡへのインサイチュハイブリダイゼーション、又はｑＰＣＲなどのＰＣＲにより、定量することができる。選択された配列によりコードされたタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、放射免疫測定、免疫沈降、タンパク質の生物活性のアッセイ、タンパク質の免疫染色とそれに続くＦＡＣＳ分析、又はホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによるなどの、様々な方法により、定量することができる。ｍｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどの、非コードＲＮＡの発現のレベルは、ｑＰＣＲなどのＰＣＲにより定量することができる。

【0044】

用語「遺伝子産物」は、ＲＮＡポリヌクレオチド及び遺伝子もしくはＤＮＡポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの両方を指す。

【0045】

本明細書において使用される用語「タンパク質原性のアミノ酸」は、翻訳時にタンパク質への生合成により組み込まれる全てのアミノ酸を指す。用語「タンパク質原性」とは、タンパク質の作製を意味する。真核生物において２１種の遺伝的にコードしているアミノ酸、すなわち標準の遺伝暗号の２０種及びセレノシステインであるタンパク質原性のアミノ酸が存在する。標準の遺伝暗号の２０種のアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンである。

【0046】

本明細書において使用される用語「翻訳後修飾」又は「翻訳後修飾された」は、細胞において生成される際に生じ得る、ＣＩＩペプチド中のリジン残基の天然の修飾を指す。リジン残基の翻訳後修飾は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を生じるか、又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌ、例えばガラクトシル－ヒドロキシリジン又はグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン、好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンであることができる。

【0047】

本明細書において使用される用語「ドメイン」は、タンパク質の残りの部分とは無関係な三次元構造を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般にドメインは、タンパク質の個別の機能特性に寄与し、並びに多くの場合において、そのタンパク質及び／又はドメインの残りの部分の機能を失うことなく、他のタンパク質へ付加、除去又は転移され得る。例えば、ＭＨＣＩＩα鎖のα１ドメイン及びＭＨＣＩＩβ鎖のβ１ドメインは各々、一緒にＭＨＣＩＩ分子のペプチド結合溝を形成する折り畳まれたポリペプチドドメインである。

【0048】

ヒトにおける慢性炎症性疾患の治療における使用のためのコンドロイチン－結合ペプチドを含む組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物
一態様において、本発明は、ヒト患者における慢性炎症性疾患の治療において使用するための、少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域；及び、任意にリンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されている、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）を含む組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物を提供し、ここでＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含む。一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合されている。一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合されている。

【0049】

一実施態様において、コンドロイチン－結合ペプチドは、インビボにおいて、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のコンドロイチンへの結合を媒介する。理論に結びつけられるものではないが、このコンドロイチン－結合ペプチドは、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の、軟骨、好ましくは関節軟骨内のコンドロイチンへの結合を媒介してよい。あるいは又は加えて、このコンドロイチン－結合ペプチドは、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の、免疫細胞、特にＴ細胞上の及び／又はリンパ節もしくは滑液のような他の組織のマトリクス内の細胞表面上、コンドロイチン又はコンドロイチン－様構造などの、負帯電した糖への結合を媒介してよい。帯電したグリコサミノグリカンは、関節の能動免疫が媒介した慢性関節炎時に、軟骨マトリクス及び／又は滑膜裏層細胞のいずれかから、滑液へ高濃度で放出される（およそ４ｍｇ／１００ｍｌ；Seppala POら、Clin Chim Acta 1975; 36: 549-553)。

【0050】

驚くべきことに、図１に示されたようなＨＬＡ－ＤＲβ鎖の１つを含むポリペプチド鎖のＣ－末端及びヘテロ二量体化ドメインのＣ－端側に付加されたＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体中のＨｉｓ－タグは、インビトロにおけるＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の作用を改善することが示された。更に驚くべきことに、Ｈｉｓ－タグは、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の細胞外マトリクス成分コンドロイチンへの結合を促進すること、並びにコンドロイチン硫酸によりコーティングされたマイクロタイタープレートにおいて、Ｈｉｓ－タグ付き複合体のみが、可溶性型のＴ細胞ハイブリドーマに十分なＩＬ－２反応を誘導することができることがわかった。理論により結びつけられるものではないが、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の細胞外マトリクス成分コンドロイチン硫酸への結合は、改善された空間配向及び／又は多量体化に繋がり、結果的にＴＣＲ認識のためのペプチド結合基の提示の改善に繋がる。この知見は、Ｈｉｓ－タグを伴わない複合体と比較した、Ｈｉｓ－タグ付き複合体の投与後の、ＣＩＩ誘導した遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルにおける低下した膨潤を明らかにしている、インビボデータにより確認されている。従って理論により結びつけられるものではないが、Ｈｉｓ－タグは、コンドロイチンなどの、細胞表面又は組織表面上の負帯電した分子との相互作用のために、増大した結合力による、組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の、ＴＣＲへの結合に重要であり、これは複合体の多量体化及び／又は正確な配向に繋がり、複合体のＴＣＲとの相互作用を促進し得る。加えてこのコンドロイチン相互作用はまた、コンドロイチンに結合するか及び／又はコンドロイチン部分それ自身を含むかのいずれかであり得るＴ細胞膜上の共刺激分子、例えばＣＤ４４又はＣＤ７４、タンパク質チロシンホスファターゼＰＴＰσなどの結合を補助することもある。

【0051】

コンドロイチンはまた本明細書ではコンドロイチン硫酸とも称されるが、これは、糖質、Ｎ－アセチルガラクトサミン及びグルクロン酸が交互である鎖からなる硫酸化されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。これは、プロテオグリカンの一部として、タンパク質に付着されることが多いことがわかっている。プロテオグリカンは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の主要成分である。コンドロイチン硫酸はまた、軟骨の重要な構造成分でもある。これは更に、滑液滲出液もしくはリンパ液などの細胞外体液中に、並びに例えば関節軟骨もしくは滑膜などの組織中に存在する。従って、Ｈｉｓ－タグは、関節炎時に最も影響を受ける体の部位である関節構造、又はリンパ節への局在化を支援し、従ってインビボにおけるこの複合体の有利な分布を媒介し得る。当業者は、この能力は、ヘキサヒスチジンタグ又は好ましくはヘプタヒスチジンタグなどのポリヒスチジンタグに限定されるものではなく、任意のコンドロイチン結合ペプチドにより媒介されることができることを理解するであろう。

【0052】

従って、本発明に従う使用のための組成物は、少なくとも１つのコンドロイチン－結合ペプチド、好ましくはコンドロイチン－及びヒアルロン酸（ヒアルロナンとも称される）結合ペプチドを含む、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する。好ましくは、このコンドロイチン－結合ペプチドは、この複合体の少なくとも１つのポリペプチド鎖のＣ－末端に位置する。一実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、少なくとも１つのＣ－端側コンドロイチン－結合ペプチドを含む。コンドロイチン－結合ペプチドは、当該技術分野において公知であり、且つ非限定的に、アミノ酸配列EKRIWFPYRRF（配列番号：３１）、YKTNFRRYYRF（配列番号：３２）又はVLIRHFRKRYY（配列番号：３３）を有するペプチドを含む(Butterfield KCら、Biochemistry, 2010 Feb 23;49(7):1549-55)。一実施態様において、このコンドロイチン結合ペプチドは、５～２０個のアミノ酸、好ましくは６～２０個のアミノ酸、好ましくは６～１２個のアミノ酸、より好ましくは６～１２個、更により好ましくは６～１２個のアミノ酸を含む。同じく正帯電したヒストンペプチド、特にアミノ酸配列SGRGKQGGKARAKAKTRSSR（配列番号：３４）を含むペプチドなどのヒトＨ２Ａヒストンのペプチドが、本明細書において確定されている。用語コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸は、本明細書において互換的に使用され、従ってコンドロイチン－結合ペプチドは、コンドロイチン硫酸結合ペプチドと称されてもよい。ヒアルロナンへの結合を増大するために、結合コンセンサスモチーフを含む例証的配列は、以下のように規定される：Ｂ（Ｘ７）Ｂ、ここでＢは、Ｒ又はＫのいずれかであり、並びにＸ７は、酸性残基を含まず、及び少なくとも１個の塩基性アミノ酸を含む(Yang Bら、EMBO J. 1994 Jan 15;13(2):286-96)。本明細書において明らかにしたように、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体はまた、ｈｉｓ－タグを介して、コンドロイチン硫酸に結合することもできる。従ってコンドロイチン－結合ペプチドは、ポリヒスチジンタグ、好ましくはヘキサヒスチジンタグ、又はコンドロイチンへの結合親和性を増大する任意の他のアミノ酸配列、例えばEKRIWFPYRRF（配列番号：３１）、YKTNFRRYYRF（配列番号：３２）又はVLIRHFRKRYY（配列番号：３３）などであってよい。用語Ｈｉｓ－タグは、本明細書において、ポリヒスチジン－タグと同義的に使用され、並びに少なくとも６個の連続するヒスチジン残基を有するタグ（少なくともヘキサヒスチジン－タグ）を指す。好ましくは、このＨｉｓ－タグは、少なくともヘプタヒスチジン－タグである。

【0053】

一実施態様において、（ａ）Ｃ－端側コンドロイチン－結合ペプチドは、その遊離型であり；（ｂ）組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、この組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して、多量体化されず；（ｃ）組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、この組成物中のコンドロイチン－結合ペプチドを介して、更なる分子に結合されないか；あるいは、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の任意の組合せである。従ってこのコンドロイチン－結合ペプチドは、インビボにおいてはコンドロイチンへ結合していない。

【0054】

用語「ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体」は、ペプチド結合溝を形成するヒトＭＨＣ ＩＩタンパク質の細胞外ドメイン（ＨＬＡ－ＤＲアイソタイプ）又はその一部、及びコラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）を含む、可溶性複合体を指し、ここでこのペプチドは、任意にα鎖又はβ鎖のいずれかのＮ－端側へ融合（すなわち連結）される。好ましくはＣＩＩペプチドは、α鎖又はβ鎖のいずれかのＮ－端側へ、並びにより好ましくはＭＨＣクラスＩＩβ鎖のＮ－端側へ融合される。あるいは、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質は、クラスＩＩ結合インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）などの、サロゲートペプチドにより生成されることができ、プロテアーゼ切断部位（例えばトロンビン切断部位）を含むリンカーペプチドにより、β鎖又はα鎖の、好ましくはβ鎖の細胞外部分のＮ－端側へ融合され；該プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼ（例えばトロンビン）を用いてＣＬＩＰを切断し；並びに、翻訳後修飾された又は未修飾のＣＩＩペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質を負荷し、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を形成する。ＨＬＡ－ＤＲタンパク質は、α鎖の細胞外ドメインを形成するα１ドメイン及びα２ドメイン、並びにβ鎖の細胞外ドメインを形成するβ１ドメイン及びβ２ドメインを含む。用語「細胞外ドメイン」及び「細胞外領域」は、本明細書において同義的に使用される。α１ドメイン及びβ１ドメインは、ペプチド結合溝、すなわちＣＩＩペプチドなどのペプチドと相互作用及び結合する部位を形成する。従ってＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、少なくともＨＬＡ－ＤＲタンパク質のα１ドメイン及びβ１ドメインを含む。好ましくはＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質のα１ドメイン、α２ドメイン、β１ドメイン及びβ２ドメインを含む。

【0055】

ヒトのＲＡに関して、ＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲのペプチド結合ポケットのβ鎖上のアミノ酸コンセンサスモチーフ(Q/R R/K R A A)（アミノ酸位置７０－７４、いわゆる「共有されたエピトープ」）をコードしているＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座の特定のアレルとの遺伝的関連が存在する。ＲＡと関連するＨＬＡ－ＤＲＢ１アレルの例は、QKRAA－コーディングアレル：ＨＬＡ＿ＤＲＢ１＊０４０１及び０４０９、QRRAA－コーディングアレル：ＨＬＡ＿ＤＲＢ１＊０４０４、０４０５、０４０８、０１０１、０１０２及び１４０２、RRRAA－コーディングアレル：ＨＬＡ＿ＤＲＢ１＊１００１、並びにDKRAA－コーディングアレル：ＨＬＡ＿ＤＲＢ１＊１３０３である。従ってＭＨＣクラスＩＩα鎖の細胞外領域及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖の細胞外領域は、ＨＬＡ－ＤＲに由来し、好ましくは少なくともα１ドメインは、ＤＲＡ＊０１０１に由来し、及び少なくともβ１ドメインは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１及びＤＲＢ１＊１４０２、より好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４及びＤＲＢ１＊０４０５からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレルに由来する。より好ましくは、α１ドメイン及びα２ドメインは、ＤＲＡ＊０１０１に由来し、並びにβ１ドメイン及びβ２ドメインは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１及びＤＲＢ１＊１４０２、より好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４及びＤＲＢ１＊０４０５からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレルに由来する。

【0056】

本発明に従う使用のための組成物中の組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、未修飾のＣＩＩペプチド及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド、より具体的には未修飾もしくは１又は複数の翻訳後修飾されたリジン（複数可）を伴う、好ましくは翻訳後修飾された第一のリジンを伴う、ＣＩＩペプチドを含む。本明細書において使用される用語「翻訳後修飾された」又は「翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド」は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ガラクトシル－ヒドロキシリジン又はグルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジンから選択された第一の及び任意に第二のリジン残基への修飾、すなわち細胞内のコラーゲン中のリジン残基の翻訳後修飾により入手可能な修飾を保有するＣＩＩペプチドを指す。従ってこの修飾が、翻訳後修飾、すなわち細胞内で得られることは、必須ではなく、インビトロにおいては酵素的手段又は合成的手段により恐らく得られるであろう。

【0057】

翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドは、ＣＩＩペプチドの少なくとも１つのリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）であり、及び／又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌであるＣＩＩペプチドを含む。好ましくは、ＣＩＩペプチドの第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）であり、及び／又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌである。本組成物中のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、同じＣＩＩペプチドを含んでよい。従って一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチドからなるか；又は、ＣＩＩペプチドは、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか；又は、ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなる。本組成物中のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体はまた、ＣＩＩペプチドの混合物を含んでもよい。これは、未修飾のＣＩＩペプチド及び翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドの混合物によるＨＬＡ－ＤＲタンパク質の負荷によるか、あるいは未修飾又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドによるＨＬＡ－ＤＲ複合体の負荷及びその後のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体との混合により、達成されてよい。当業者は、翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドは、典型的にはインビトロにおいて合成的又は酵素的のいずれかにより生成されることを理解するであろう。あるいはこれは、コラーゲン中のリジン残基へ翻訳後修飾を追加することが可能である細胞株を使用し、インビボにおいてリンカーペプチドによりＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されたＣＩＩペプチドを伴うＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を調製することにより達成されてよい。従って別の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドからなるか；ＣＩＩペプチドは、ガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド及びガラクトシル－ヒドロキシリジンである第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにガラクトシル－ヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含むか；あるいは、ＣＩＩペプチドは、未修飾のリジン残基を伴うＣＩＩペプチド、並びにＯ－グリコシル化されたヒドロキシリジン及び／又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）である第一のリジンを伴うＣＩＩペプチドを含む。この実施態様において、翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド中の任意の第二のリジンは、未修飾、ヒドロキシリジン、及び／又はＯ－グリコシル化されたヒドロキシリジンであるか；より具体的には未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン及び／又はグルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジンであるか；好ましくは、未修飾、ヒドロキシリジン、ガラクトース－ヒドロキシリジン、より好ましくは未修飾であってよい。一実施態様において、ＣＩＩペプチド又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド中の任意の第二のリジンは、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジンではない。一実施態様において、本組成物は、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン修飾を伴う、すなわち第一又は任意の第二のリジンではない、ＣＩＩペプチド含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は含まない。

【0058】

このＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX₁G、AGFKGEX₂GPKG、AGFKGX₃QGPKG、AGFKX₄EQGPKG、AGFKGEX₂GPX₁G 及びAGFKGX₃QGPX₁G、AGFKX₄EQGPX₁Gのアミノ酸配列を含み、ここでＸ_１は、Ｋを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＲ、Ａ、Ｇ又はＱ、より好ましくはＲであり；Ｘ_２は、Ｑを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｒ、Ｈ又はＧであり；Ｘ_３は、Ｅを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｄ、Ｑ又はＧであり；並びに、Ｘ_４は、Ｇを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、より好ましくはＡ、Ｓ、Ｖ又はＬである。好ましくは、Ｘ_２、Ｘ_３又はＸ_４は、Ｋではない。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG又はAGFKGEQGPX₁G、好ましくはAGFKGEQGPKGEP又はAGFKGEQGPX₁GEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEP又はGIAGFKGEQGPX₁GEPのアミノ酸配列を含む。ＣＩＩペプチドGIAGFKGEQGPKGEPは、三重螺旋ＣＩＩ領域のアミノ酸２５９－２７３に対応している。ＨＬＡ－ＤＲの結合ポケットへの結合に適しているＣＩＩペプチドは、長さ１０～２０個のアミノ酸であり、好ましくはＣＩＩペプチドは、長さ１１～１５個のアミノ酸であり、より好ましくはＣＩＩペプチドは、長さ１３～１５個のアミノ酸である。一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、アミノ酸配列AGFKGEQGPKG、より好ましくはAGFKGEQGPKGEP、及び更により好ましくはGIAGFKGEQGPKGEPを含む。あるいは、ＣＩＩペプチドは、１１個、好ましくは１２個、より好ましくは１３個及び最も好ましくは１５個の連続アミノ酸GIAGFKGEQGPKGEPを含む。一実施態様において、第二のＫ（Ｋ２７０）は、好ましくはＲへ、変異され得る。従ってＣＩＩペプチドが、アミノ酸配列AGFKGEQGPXG、AGFKGEQGPXGEP及びGIAGFKGEQGPXGEPを含む実施態様も、同じく包含され、ここでＸは、Ｋ以外の任意のタンパク質原性のアミノ酸であり、好ましくはＸは、Ｒ、Ａ、Ｇ又はＱであり、より好ましくはＸは、Ｒである。従って一実施態様において、ＣＩＩペプチドは、アミノ酸配列AGFKGEQGPRG、AGFKGEQGPRGEP及びGIAGFKGEQGPRGEPを含む。本発明により包含されるＣＩＩペプチドは、表１に明らかにしている：
表１：

【表1】

【0059】

本発明に従う使用のための組成物中のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、未修飾のＣＩＩペプチド及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含む。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドは、ＣＩＩペプチドの少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）であるか、及び／又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌである、ＣＩＩペプチドを含む。好ましくは、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）及び／又はガラクトシル－ヒドロキシリジン、より好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンである。ＣＩＩペプチドの第一のリジン（Ｋ）残基は、三重螺旋のＣＩＩ領域のアミノ酸配列の２６４位である、GIAGFKGEQGPKGEP中の第一のＫに対応している（配列番号：１から１２の４位のアミノ酸、及び配列番号：１３－１５の６位のアミノ酸に対応している）。従って本明細書において使用される「第一のリジン残基」はまた、Ｋ２６４として、又は２６４位のリジンとして称されてよい。ＣＩＩペプチド中の任意の第二のリジン（Ｋ）残基は、三重螺旋ＣＩＩ領域のアミノ酸配列の２７０位の、GIAGFKGEQGPKGEP中の第二のＫに対応している（配列番号：１、３－５又は１０の１０位のアミノ酸、及び配列番号：１３の１２位のアミノ酸に対応している）。従って本明細書において使用される「第二のリジン残基」又は「更なるリジン残基」はまた、Ｋ２７０として又は２７０位のリジンとして称されてよい。使用のための組成物中のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、未修飾のＣＩＩペプチド及び翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド（Ｈｙｌ、ｇａｌ－Ｈｙｌ及びｇｌｃ－ｇａｌ－Ｈｙｌ、好ましくはＨｙｌ及びｇａｌ－Ｈｙｌ、より好ましくはｇａｌ－Ｈｙｌ）を含む、すなわち翻訳後修飾を伴う又は伴わない異なるＣＩＩペプチドを含む複合体の混合物であってよいか、あるいは未修飾のＣＩＩペプチドを有するか又はＨｙｌもしくはｇａｌ－Ｈｙｌ修飾のいずれか、好ましくはｇａｌ－Ｈｙｌ修飾を有する、翻訳後修飾されたＣＩＩペプチド修飾を有するＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体、すなわち翻訳後修飾を伴う又は伴わない同じＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体からなってよい。好ましい実施態様において、本発明に従う使用のための組成物中のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、未修飾のＣＩＩペプチド及び翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含み、ここで少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン及び／又はガラクトシル－ヒドロキシリジンである。用語「ガラクトシル－ヒドロキシリジン」は、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧａｌ－Ｈｙｌと称されてもよく、並びにグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジンへの修飾は排除している。

【0060】

本発明に従うＣＩＩペプチド配列中のリジン残基、特に第一のリジン残基、すなわち２６４位のリジン残基のコラーゲン特異的翻訳後ガラクトシル化は、ＴＣＲを介したＴ細胞認識に関与し、結果的に薬理学的効果に関与することができる。２７０位のリジン残基は、ＤＲ４分子の結合溝の縁に配置され、及びそのガラクトシル－ヒドロキシリジン修飾は、ＴＣＲ認識には余り重要ではないと考えられる。従って第二の又は更なるリジン残基（Ｋ２７０に対応する）は、未修飾、ヒドロキシリジン又はガラクトシル－ヒドロキシリジンのいずれか、好ましくは未修飾であってよい。ｇａｌ２６４エピトープを認識するＴ細胞ハイブリドーマのＴＣＲは、Ｋ２７０Ｒ変異により影響を受けないことが、示されている。好ましい実施態様において、特に複合体がコラーゲン内のリジン残基を翻訳後修飾することが可能である細胞株内でインビボにおいて生成される場合、ＣＩＩペプチドは第一のリジン残基のみを含み、並びにいずれかの更なる任意のＫ（任意の第二のＫなど）は変異され、好ましくはＲ、Ａ、Ｇ又はＱへ変異され、より好ましくはＲへ変異される。従ってアミノ酸配列AGFKGEQGPRG、好ましくはAGFKGEQGPRGEP及びより好ましくはGIAGFKGEQGPRGEPを含むＣＩＩペプチドもまた、本発明により包含される。第二のリジンの変異は、生成物の異質性を低下する利点を有し、従って正確に修飾されたペプチドの割合は、より高くなる。更に、ガラクトシル－ヒドロキシリジンは、宿主産生細胞内でインビボにおいてグルコシル化され、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇｌｃ－Ｇａｌ－Ｈｙｌ、又はＧＧ－Ｈｙｌ）を形成し、これは恐らく、特にＫ２７０位の二糖（Ｇｌｃ－Ｇａｌ）の嵩高性のためにＴＣＲ認識に負の作用を有するであろう。従ってＫ２７０変異、特にＫ２７０Ｒは、この位置では二糖修飾は結合することができないので、更なる結合との干渉を回避する。

【0061】

一実施態様において、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）は、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に、好ましくはＭＨＣクラスＩＩβ鎖のＮ－端側に融合される。このことは、宿主産生細胞内のＣＩＩペプチドのそれぞれの翻訳後修飾を含む複合体全体の生成を可能にする。用語「リンカーペプチド」は、複数のアミノ酸残基からなるポリペプチドを指す。リンカーペプチドは、そのペプチドが、ＭＨＣＩＩ複合体により形成されたペプチド結合ポケットへ結合することを可能にするのに十分に長く且つ可動性である限りは、任意のペプチドであってよい。好適なリンカーペプチドの例は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。本発明に従い、ＣＩＩペプチド、リンカーペプチド並びにＭＨＣＩＩα鎖及びＭＨＣＩＩβ鎖の少なくとも１つの細胞外領域は、１つのポリペプチドとして発現され、且つ１つのポリヌクレオチドによりコードされる。本明細書において使用される用語「へ融合される」は、「へ連結される」を意味し、ここで連結は、任意にリンカーペプチドを使用するペプチド結合を介しており、従って融合タンパク質が作製される。あるいは、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質は、トロンビン切断部位などの、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーペプチドを介してＨＬＡ－ＤＲ鎖の１本へ連結されている、ＣＬＩＰペプチドなどの、代理ペプチドにより、生成される。従って生成後このペプチドは、タンパク質分解性に切断され、並びに典型的にはインビトロにおいて合成的又は酵素的に調製される、未修飾又はガラクトシル化されたＣＩＩペプチド（すなわち、Ｋ２６４位にｇａｌ－Ｈｙｌを保有するＣＩＩペプチド）は、インビトロにおいてこの複合体上に負荷される。従って代わりの実施態様において、未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質上に配置され、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を形成する。この合成による未修飾又はガラクトシル化されたペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ分子へ共有的に連結され得るが、この連結は、リンカーペプチドを介してはいない。この状況において、翻訳後修飾は、ＣＩＩペプチド中の少なくとも１つのリジン残基の、Ｈｙｌ、ｇａｌ－Ｈｙｌ又はｇｌｃ－ｇａｌ－Ｈｙｌへの修飾に関連し、ここでこの修飾は、インビボにおいてコラーゲン中のリジン残基を翻訳後修飾することが可能である宿主産生細胞内のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体に、あるいはインビトロにおいて合成的又は酵素的にＨＬＡ－ＤＲタンパク質上に配置されているＣＩＩペプチドへ、付加されてよい。

【0062】

実施例において使用され並びに図１に示されたような、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されたＣＩＩペプチドを含み、シグナルペプチドを伴わない、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体（配列番号：１６及び配列番号：１７）は、リンカーとＣＩＩペプチドの間に酵素切断部位（トロンビン切断部位、図１）を依然含んでいるが、これは、必ずしもではなく、治療的生成物から除去されることが好ましい。このリンカーペプチドは、この生成物の安定性を向上し、並びにペプチド喪失を防止することができる。従って好ましくは、本発明に従うＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＣＩＩペプチドとＨＬＡ－ＤＲβ鎖（又はＨＬＡ－ＤＲα鎖）の細胞外領域の間のアミノ酸配列中に、酵素（タンパク質分解性）切断部位を含まない。更に治療的目的のためには、本組成物を構成するＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、図１に示され且つ「実施例」において使用される例証的複合体中に存在する、（１）精製のためのストレプトアビジン-タグ(SAWSHPQFEK、配列番号：３０）、（２）ＨＬＡ－ＤＲα／ＨＬＡ－ＤＲβ鎖とヘテロ二量体化ドメインの間の切断部位（例えば、ＴＥＶ切断部位）、並びに／又は（３）大腸菌ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）の認識部位（例えば、ＡｖｉＴａｇ）：を含まない。これらのエレメントは、インビトロ及びインビボにおいてこの複合体の機能に作用を及ぼさないことが示された（データは示さず）。本発明に従う例証的最小のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、配列番号：１８及び配列番号：１９のアミノ酸配列によりコードされてよい。当業者は、このペプチド配列は、請求項に包含されるように変動してよく、並びにＨｉｓ－タグは、本明細書に開示されたコンドロイチン結合ペプチドなどの、交互に正帯電されたペプチドにより置き換えられてよいことを理解するであろう。

【0063】

下記実施例において使用される例証的複合体の配列は、以下の通りである：
１）ＤＲ４－構築体：
・ＤＲ４構築体α鎖（配列番号：１６）、シグナルペプチド、後続のＤＲＡ＊０１０１細胞外α鎖領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＦｏｓドメイン（太字及び下線付き）、及びビオチン化部位（ＢｉｒＡ、イタリック及び下線付き）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGIKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITNVPPEVTVLTNSPVELREPNVLICFIDKFTPPVVNVTWLRNGKPVTTGVSETVFLPREDHLFRKFHYLPFLPSTEDVYDCRVEHWGLDEPLLKHWEFDASGGGENLYFQGGGGSLTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGGGSGLNDIFEAQKIEWHE
・最小のＤＲ４構築体α鎖（配列番号：１８）、シグナルペプチド、後続のＤＲＡ＊０１０１細胞外α鎖領域（下線付き）、及びｃＦｏｓドメイン（太字及び下線付き）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGIKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITNVPPEVTVLTNSPVELREPNVLICFIDKFTPPVVNVTWLRNGKPVTTGVSETVFLPREDHLFRKFHYLPFLPSTEDVYDCRVEHWGLDEPLLKHWEFDASGGGGGGSLTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
・ｈＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴うＤＲ４構築体β鎖（配列番号：１７）、シグナルペプチド、その直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及びＣＩＩペプチド２５９－２７３（イタリック及び下線）、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、ＤＲＢ＊０４０１細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）、及びＨｉｓ－タグ（イタリック）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGEPSGGGSLVPRGSGGGGSGDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
・ｈＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴う最小ＤＲ４構築体β鎖（配列番号：１９）、シグナルペプチド、直後のＣＩＩペプチド２５９－２７３（イタリック及び下線）、ＤＲＢ＊０４０１細胞外領域（下線付き）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）、及びＨｉｓ－タグ（イタリック）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGGIAGFKGEQGPKGEPSGGGSGGGGSGDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSGGGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
２）ＤＲ４－ｈＣＬＩＰｍｕｔ構築体：
・上記のＤＲ４構築体α鎖（配列番号：１６）
・ｈＣＬＩＰｍｕｔを伴うＤＲ４構築体β鎖（配列番号：２０）、シグナルペプチド、直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及び変異したｈＣＬＩＰペプチド（イタリック及び下線）、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、ＤＲＢ＊０４０１細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）、及びＨｉｓ－タグ（イタリック）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKPVSKARMATGALAQASGGGSLVPRGSGGGGSGDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
３）Ａｑ－ｒＣＩＩ構築体：
・Ａｑ構築体α鎖（配列番号：２１）、シグナルペプチド、後続のＡｑ細胞外α鎖領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＦｏｓドメイン（太字及び下線付き）、及びビオチン化部位（ＢｉｒＡ、イタリック及び下線付き）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGEDDIEADHVGFYGIVVYQSPGDIGQYTHEFDGDEWFYVDLDKKETVWMLPEFGQLTSFDPQGGLQNIATGKHNLGGWTKRSNFTPATNEAPQATVFPKSPVLLGQPNTLICFVDNIFPPVINITWLRNSKSVTDGVYETSFLVNRDHSFHKLSYLTFIPSDDDIYDCKVEHWGLDEPVLKHWEPEIPATMSELTETVSGGGENLYFQGGGGSLTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGGGSGLNDIFEAQKIEWHE
・ラットＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴うＡｑ構築体β鎖（配列番号：２２）、シグナルペプチド、直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及びＣＩＩペプチド２５９－２７３（イタリック及び下線）、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、Ａｑ細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）、及びＨｉｓ－タグ（イタリック）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGETSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
・Ｈｉｓ－タグを伴わずラットＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを伴うＡｑ構築体β鎖（配列番号：２３）、シグナルペプチド、直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及びＣＩＩペプチド２５９－２７３（イタリック及び下線）、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、Ａｑ細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、及びｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGETSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
４）Ａｑ－ｍＣＬＩＰｍｔ構築体：
・上記のＡｑ構築体α鎖（配列番号：２１）
・ｍＣＬＩＰペプチドを伴うＡｑ構築体β鎖（配列番号：２４）、シグナルペプチド、直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及びｍＣＬＩＰｍｔペプチド（イタリック及び下線）、各端がグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、Ａｑ細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）、及びＨｉｓ－タグ（イタリック）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKPVSQARMATPLLMRPSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHHHHHHH
・Ｈｉｓ－タグを伴わずｍＣＬＩＰペプチドを伴うＡｑ構築体β鎖（配列番号：２５）、シグナルペプチド、直後のＳｔｒｅｐ－タグ（太字及び二重下線付き）、及びｍＣＬＩＰｍｔペプチド（イタリック及び下線）、各部位でグリシンリンカーにより挟まれたトロンビン切断部位（太字及び点線）、Ａｑ細胞外領域（下線付き）、ＴＥＶ切断部位（太字）、ｃＪｕｎドメイン（太字及び下線付き）を含む配列：
MKLCILLAVVAFVGLSLGSAWSHPQFEKPVSQARMATPLLMRPSGGGSLVPRGSGGGGSERHFVAQLKGECYFTNGTQRIRSVNRYIYNREEWVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQPEILERTRAEVDTVCRHNYEGVETHTSLRRLEQPNVAISLSRTEALNHHNTLVCSVTDFYPAKIKVRWFRNGQEETVGVSSTQLIRNGDWTFQVLVMLEMTPHQGEVYTCHVEHPSLKSPITVEWRAQSESARSKSGGGENLYFQGGGGSRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
本明細書に開示された構築体の個々のエレメントの更なるアミノ酸配列を、以下に提供している：
・ｃＦｏｓドメイン（配列番号：２６）：LTDTLQAETDQLEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH
・ｃＪｕｎドメイン（配列番号：２７）：RIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNH
・修飾されたヒトＣＬＩＰ－ペプチド（配列番号：２８）：PVSKARMATGALAQA
・ラットＣＩＩ－ペプチド２５９－２７３（配列番号：２９）：GIAGFKGEQGPKGET
・ストレプトアビジン－タグ（配列番号：３０）：SAWSHPQFEK。

【0064】

一実施態様において、少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域及び少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域は、単独の融合ポリペプチド（一本鎖ヘテロ二量体）として発現され；並びに、任意にコラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）は、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖の、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合される。一実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、多量体化ドメイン又はヘテロ二量体化ドメイン、特にＩｇＧドメインは含まない。一実施態様において、各ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の１つの細胞外領域及びＨＬＡ－ＤＲβ鎖の１つの細胞外領域のみを含む。

【0065】

代わりの実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩ複合体は、少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩα鎖の細胞外領域を含む第一のポリペプチド；少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩβ鎖の細胞外領域を含む第二のポリペプチド；及び、任意にリンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖の、好ましくましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合された、コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）：を含み；並びにここで、ＨＬＡ－ＤＲα鎖は、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一の機能ドメインへ、そのＣ－末端で融合され、及びＭＨＣクラスＩＩβ鎖は、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第二の相補的機能ドメインへ、そのＣ－末端で融合されている。第一の機能ドメイン及び第二の相補的機能ドメインは、酸性及び塩基性のロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン、好ましくはｊｕｎ－ｆｏｓロイシンジッパーモチーフであってよい。一実施態様において、このｊｕｎ－ｆｏｓロイシンジッパーモチーフは、配列番号：２６のアミノ酸配列を有するｃＦｏｓドメイン、及び配列番号：２７のアミノ酸配列を有するｃＪｕｎドメインを含む。当業者は、第一及び／又は第二のポリペプチドは、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの機能ドメインのＣ－端側に、ポリヒスチジンタグなどの、コンドロイチン－結合ペプチドを含むことを理解するであろう。一実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、更なる多量体化ドメイン又はヘテロ二量体化ドメインを含まず、特にＩｇＧドメインを含まない。一実施態様において、各ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の１つの細胞外領域及びＨＬＡ－ＤＲβ鎖の１つの細胞外領域のみを含む。

【0066】

当業者は、本発明に従う使用のための組成物は、特にコラーゲン中のリジン残基を翻訳後修飾することが可能である宿主産生細胞において生成される場合、ＣＩＩペプチドの、特にＣＩＩペプチドの第一及び任意に第二のリジン残基の異なる翻訳後修飾、並びに未修飾のＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の異質性の混合物中に、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含み得ることを理解するであろう。この異質性の混合物は、第一のリジンにＫ、Ｈｙｌ、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧＧ－Ｈｙｌを、及び任意の第二のリジンに独立してＫ、Ｈｙｌ、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧＧ－Ｈｙｌを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含んでよい（ここで、Ｋ＝リジン、Ｈｙｌ＝ヒドロキシリジン、Ｇ－Ｈｙｌ＝ガラクトシル－ヒドロキシリジン、ＧＧ－Ｈｙｌ＝グルコシルガラクトシルヒドロキシリジン）。

【0067】

従って一実施態様において、本発明に従い使用するための組成物は、ＣＩＩペプチドの第一のリジン残基がガラクトース－ヒドロキシリジンであるＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有し、並びに更にＣＩＩペプチドの第一のリジン残基が、未修飾、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）又はグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）である、好ましくは未修飾又はヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）であり、及びＣＩＩペプチドの任意の第二のリジン残基が、独立して未修飾、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇ－Ｈｙｌ）又はグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）である、好ましくは未修飾、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇ－Ｈｙｌ）であるＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する。一実施態様において、本組成物は、グルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）修飾されたＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体、すなわち第一及び／又は任意に第二のリジン残基がグルコシル－ガラクトシル－ヒドロキシリジンである、Ｏ－グリコシル化されたＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、含有しない。

【0068】

ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の異種性の混合物中にＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する本発明に従う使用のための組成物において、本組成物は好ましくは、この混合物又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチドの第一のリジン（Ｋ２６４）でＧ－Ｈｙｌを、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する。更に本組成物は、この混合物又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の未修飾のＣＩＩペプチドが、９０％を超えない、８０％を超えない、７０％を超えない、６０％を超えない、又は５０％を超えないＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する。特定の実施態様において、本組成物は、この混合物又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチド中ＧＧ－Ｈｙｌを、好ましくは２０％未満、１０％未満、５％未満、より好ましくは１％未満含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する。ここで百分率は、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体中の総ＣＩＩペプチドの、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体中のＣＩＩペプチドの割合を指す。特に好ましい実施態様において、該第二のリジン残基（Ｋ２７０）は、変異され、例えばアルギニンに変異される（Ｋ２７０Ｒ）。更なる実施態様において、（任意の）第二のリジンは、グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）へ翻訳後修飾されず、未修飾のリジン、ヒドロキシリジン又はガラクトシル－ヒドロキシリジンとして存在する。

【0069】

当業者は、本発明に従う使用のための組成物は、代わりに、未修飾のＣＩＩペプチド又は、特にＣＩＩペプチドの第一のリジン残基の同じＣＩＩペプチドの翻訳後修飾を含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の均質性の混合物中にＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有し得ることを理解するであろう。均質性の混合物は、ＣＩＩペプチドの第一のリジンにＫ、Ｈｙｌ、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧＧ－Ｈｙｌを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含み得る（ここで、Ｋ＝リジン、Ｈｙｌ＝ヒドロキシリジン、Ｇ－Ｈｙｌ＝ガラクトシル－ヒドロキシリジン、ＧＧ－Ｈｙｌ＝グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン）。好ましくは、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、修飾を含まないか、又は存在するとしても、ＣＩＩペプチドの第二のリジンには少なくともＧＧ－Ｈｙｌを含まない。ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の均質性の混合物は、合成的に調製された未修飾又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドによる、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の負荷により実現され得る。あるいは、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、コラーゲン中のリジン残基の翻訳後修飾が可能である宿主産生細胞株を使用し、並びに翻訳後修飾に感受性のある様式でこの複合体を認識する抗体を使用する親和性クロマトグラフィーを使用するか、あるいは親和性リガンドとして該ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩ複合体に特異的なＴＣＲ（又はその断片）を使用し、各ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を精製することにより、作製され得る。

【0070】

更なる態様において、本発明は、ヒト患者における慢性炎症性疾患の治療において使用するための本明細書に開示された方法により得られた又は得ることができる組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を提供し、ここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を作製する方法は、（ｉ）少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｉｉ）少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；並びに、（ｉｉｉ）リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合されたコラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）をコードしているポリヌクレオチド：により、哺乳類細胞をトランスフェクションすることであって、ここでＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端に、コンドロイチン－結合ペプチドを含むこと；（ｂ）この哺乳類細胞を、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を生成するのに適した条件下で培養すること；並びに、（ｃ）未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む細胞上清及び任意に細胞を収集すること：を含む。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおいて、ＣＩＩペプチドの少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌであってよい。好ましくは、少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン又はガラクトシル－ヒドロキシリジン、より好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンである。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含む該組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、特に包含され、ここでＣＩＩペプチドの第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）であるか又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌである。従って一実施態様において、Ｏ－グリコシル化されたＣＩＩペプチドを含む組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、本明細書記載の方法により得られる。

【0071】

特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX₁G、AGFKGEX₂GPKG、AGFKGX₃QGPKG、AGFKX₄EQGPKG、AGFKGEX₂GPX₁G及びAGFKGX₃QGPX₁G、AGFKX₄EQGPX₁Gのアミノ酸配列を含み、ここでＸ_１は、Ｋを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＲ、Ａ、Ｇ又はＱ、より好ましくはＲであり；Ｘ_２は、Ｑを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｒ、Ｈ又はＧであり；Ｘ_３は、Ｅを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｄ、Ｑ又はＧであり；並びに、Ｘ_４は、Ｇを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、より好ましくはＡ、Ｓ、Ｖ又はＬである。好ましくはＸ_２、Ｘ_３又はＸ_４は、Ｋではない。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG又はAGFKGEQGPX₁G、好ましくはAGFKGEQGPKGEP又はAGFKGEQGPX₁GEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEP又はGIAGFKGEQGPX₁GEPのアミノ酸配列を含む。

【0072】

また更なる態様において、本発明は、本明細書記載の方法により得られたＣＩＩペプチドを含む組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物を提供する。

【0073】

本発明に従う使用のための組成物は、医薬組成物である。従って本発明はまた、本明細書記載の組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む組成物及び医薬として許容し得る賦形剤を含有する医薬組成物も開示している。本組成物又は医薬組成物は、任意の投与経路により、好ましくは皮下（ｓ．ｃ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）に投与されてよい。一実施態様において、本組成物又は医薬組成物は、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプを使用し、投与される。本発明に従う使用のための組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含有する組成物又は医薬組成物は、凍結乾燥されるか、又は水溶液であってよい。医薬として許容し得る賦形剤は、担体、並びに安定剤を含んでよい。

【0074】

本発明に従う使用のための組成物は、慢性炎症性疾患、特に関節炎又は他の慢性炎症性関節疾患の治療のためである。好ましくは、本組成物は、医薬として許容し得る賦形剤を更に含有する医薬組成物である。一実施態様において、本組成物は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、Ｘ線基準を満たさない体軸性脊椎関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、再発性多発性軟骨炎、全身性紅斑性狼瘡、ライム病、メニエール病、内耳自己免疫病（ＡＩＥＤ）、又はスチル病からなる群から選択される慢性炎症性疾患の治療における使用のためである。一実施態様において、本発明に従う使用のための組成物は、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎又はスチル病からなる群から選択される関節炎の型を、好ましくは関節リウマチ、変形性関節症又は乾癬性関節炎を、より好ましくは関節リウマチを治療するためである。特定の実施態様において、本発明に従う組成物は、メトトレキセート及び／又は常用の合成（小型分子）の疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に対し不適切に反応する対象の治療のための、生物学的ＤＭＡＲＤ（例えば、抗－ＴＮＦ抗体、抗－ＣＴＬＡ４抗体（アバタセプト）、抗－ＩＬ－６抗体、抗－ＣＤ２０抗体（リツキシマブ））に不適切に反応する対象の治療のための、標的化された合成ＤＭＡＲＤ（例えばＪＡＫ－インヒビター）に対し不適切に反応する対象の治療のための、関節リウマチの第一選択治療である。代わりの実施態様において、本発明に従う組成物は、筋骨格症状の新たな発症を伴う抗－ｃｃｐ抗体陽性の喫煙者など、関節リウマチの発症のリスクが高い患者における予防的治療のためである。

【0075】

好ましくは、本組成物は、皮下又は静脈内に、より好ましくは皮下に投与される。本組成物は、約１０μｇ～約２５０μｇ、好ましくは２０～２００μｇ、より好ましくは５０μｇ～１００μｇの単回用量で投与されてよい。一実施態様において、治療は、負荷相及び維持相を含む。負荷相は、連続する日の３～１０回、好ましくは６回の逐次適用を含んでよい。維持用量は、毎週又は３～１４日毎に、好ましくは毎週、隔週、毎月、隔月又はより高い頻度で投与されてよい。

【0076】

組換えＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の作製方法
本発明に従う使用のためのＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、β鎖又はα鎖の細胞外部分のＮ－端側に融合されたＣＩＩペプチドにより、インビボにおいて（すなわち、哺乳類細胞株内で）、あるいは代わりにβ鎖又はα鎖の細胞外部分のＮ－端側へ融合された代理ペプチドにより、及びその後の代理ペプチドの切断及びＣＩＩペプチドの負荷により、調製されてよい。ＣＩＩペプチドが、哺乳類細胞において、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質と一緒に発現されるならば、生成に使用される哺乳類細胞に応じて、ＣＩＩペプチドは、翻訳後修飾されるか又は未修飾であってよい。ＣＩＩペプチドがＨＬＡ－ＤＲタンパク質に負荷される場合、ＣＩＩペプチドは、インビトロにおいて合成的又は酵素的に調製され、並びに未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドとして複合体上に負荷されてよい。

【0077】

より具体的には、本発明に従う使用のためのＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、（ｉ）少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン切断部位）を含むリンカーペプチドにより、β鎖又はα鎖、好ましくはβ鎖の細胞外部分のＮ－端側へ融合した代理ペプチドとして、クラスＩＩ結合インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）を含む、少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド：により、哺乳類細胞をトランスフェクションすることであって；ここで、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質は、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含むこと；（ｂ）この哺乳類細胞を、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を生成するのに適した条件下で培養すること；（ｃ）ＨＬＡ－ＤＲタンパク質を含む細胞上清及び任意に細胞を収集すること；（ｄ）該プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼ（例えばトロンビン）を使用し、ＣＬＩＰを切断すること；並びに、このＨＬＡ－ＤＲタンパク質に未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを負荷し、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を形成することであって、ここでＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むこと：を含む、ＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を作製する方法により、調製されてよい。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおいて、ＣＩＩペプチドの少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）及び／又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌであってよい。好ましくは翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドの少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン及び／又はガラクトシル－ヒドロキシリジン、より好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンである。従って、このペプチドの生成後に、タンパク質分解性の切断が続き、並びに合成的に調製されたガラクトシル化されたペプチド（すなわち、Ｋ２６４位にｇａｌ－Ｈｙｌを保有するＣＩＩペプチド）及び／又は未修飾のＣＩＩペプチドは、インビトロにおいてこの複合体上に負荷される。この合成ガラクトシル化されたペプチド及び／又は未修飾は、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質へ共有的に連結されてよいが、この連結は、リンカーペプチドを介さない。

【0078】

あるいは、本発明に従う使用のための組成物は、（ｉ）少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｉｉ）少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；並びに、（ｉｉｉ）リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側へ融合されたコラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）をコードしているポリヌクレオチド：により、哺乳類細胞をトランスフェクションすることであって；ここで、ＣＩＩペプチドが、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPXG、AGFKGEXGPKG、AGFKGXQGPKG、AGFKXEQGPKG、AGFKGEXGPXG、AGFKGXQGPXG及びAGFKXEQGPXGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、並びにここでＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体が、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを含むこと；（ｂ）この哺乳類細胞を、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を生成するのに適した条件下で培養すること；並びに、（ｃ）未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む細胞上清及び任意に細胞を収集すること：を含む、ＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を作製する方法により調製されてよい。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおいて、ＣＩＩペプチドの少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）又はＯ－グリコシル化されたＨｙｌであってよい。好ましくは、少なくとも第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン又はガラクトシル－ヒドロキシリジン、より好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンである。

【0079】

本方法は、更に、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチドのグリコシル化プロファイルを分析する工程を含む。グリコシル化プロファイルを分析する方法は、当該技術分野において周知であり、並びに、質量分析などの方法を含む。ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を作製する方法は、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、細胞培養皿又は発酵槽中の細胞株内で生成されるという意味において、インビトロ方法においてである。更に本方法は、初代細胞よりもむしろ、哺乳類細胞株の使用を含む。

【0080】

特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG、AGFKGEQGPX₁G、AGFKGEX₂GPKG、AGFKGX₃QGPKG、AGFKX₄EQGPKG、AGFKGEX₂GPX₁G、AGFKGX₃QGPX₁G及びAGFKX₄EQGPX₁Gのアミノ酸配列を含み、ここでＸ_１は、Ｋを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＲ、Ａ、Ｇ又はＱ、より好ましくはＲであり；Ｘ_２は、Ｑを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｒ、Ｈ又はＧであり；Ｘ_３は、Ｅを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、好ましくはＡ、Ｄ、Ｑ又はＧであり；並びに、Ｘ_４は、Ｇを除くタンパク質原性のアミノ酸のいずれか、より好ましくはＡ、Ｓ、Ｖ又はＬである。好ましくはＸ_２、Ｘ_３又はＸ_４は、Ｋではない。特定の実施態様において、ＣＩＩペプチドは、AGFKGEQGPKG又はAGFKGEQGPX₁G、好ましくはAGFKGEQGPKGEP又はAGFKGEQGPX₁GEP、より好ましくはGIAGFKGEQGPKGEP又はGIAGFKGEQGPX₁GEPのアミノ酸配列を含む。

【0081】

好ましくは、少なくともα１ドメインは、ＤＲＡ＊０１０１由来であり、並びに少なくともβ１ドメインは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１及びＤＲＢ１＊１４０２、より好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４及びＤＲＢ１＊０４０５、更により好ましくはＤＲＢ１＊０４０１からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレル由来である。より好ましくは、α１ドメイン及びα２ドメインは、ＤＲＡ＊０１０１由来であり（α１及び２ドメイン：配列番号：１６のアミノ酸１９－２００）、並びにβ１ドメイン及びβ２ドメインは、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４及びＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１、ＤＲＢ１＊１４０２及びＤＲＢ１＊１３０３、好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４、ＤＲＢ１＊０４０５、ＤＲＢ１＊０４０８、ＤＲＢ１＊０４０９、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０１０２、ＤＲＢ１＊１００１及びＤＲＢ１＊１４０２、より好ましくはＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０４０４及びＤＲＢ１＊０４０５、更により好ましくはＤＲＢ１＊０４０１からなる群から選択されるＨＬＡ－ＤＲアレル由来である（β１及び２ドメイン：配列番号：１７のアミノ酸６０－２５０）。

【0082】

実施例において使用される具体的ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、以下のように略記され：ＤＲ４／ｈＣＩＩ（天然にグリコシル化された、ヒト）、ＤＲ４／ｎＣＩＩ（ネイキッド又は未修飾、ヒト）、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ（ガラクトシル化された（Ｋ２６４でＧａｌ－Ｈｙｌ）、ヒト）、ここで使用されるＣＩＩペプチドは、アミノ酸配列GIAGFKGEQGPKGEP（配列番号：１３）を有する。実施例において使用される各々のマウスＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体は、以下のように略記され：Ａｑ／ｒＣＩＩ（天然にグリコシル化された、ラットＣＩＩ）、Ａｑ／ｎＣＩＩ（ネイキッド又は未修飾、ラットＣＩＩ）、Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ（ガラクトシル化された（Ｋ２６４でＧａｌ－Ｈｙｌ）、ラット）、ここで使用されるラットＣＩＩペプチドは、アミノ酸配列GIAGFKGEQGPKGET（配列番号：２９）を有する。

【0083】

コラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）は、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合されてよい。用語「リンカーペプチド」は、複数のアミノ酸残基からなるポリペプチドを指す。リンカーペプチドは、このペプチドが、ＭＨＣＩＩ複合体により形成されたペプチド結合ポケットへ結合することを可能にするのに十分に長く且つ柔軟である限りは、任意のペプチドであってよい。好適なリンカーの例は、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーである。ＣＩＩペプチド、リンカーペプチド並びに少なくとも１つのＭＨＣＩＩα鎖及びＭＨＣＩＩ鎖の細胞外領域は、１つのポリペプチドとして発現され、且つ１つのポリヌクレオチドによりコードされる。この文脈中の用語「へ融合される」は、「へ連結する」を意味し、ここで連結は、任意にリンカーペプチドを使用し、ペプチド結合を介しており、従って融合タンパク質が作製される。

【0084】

このＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、少なくとも１つのコンドロイチン－結合ペプチド、好ましくはコンドロイチン－及びヒアルロン酸（同じくヒアルロナンとも称される）結合ペプチドを含む。好ましくはコンドロイチン－結合ペプチドは、この複合体の少なくとも１つのポリペプチド鎖のＣ－末端に配置される。一実施態様において、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、少なくとも１つのＣ－端側のコンドロイチン－結合ペプチドを含む。コンドロイチン－結合ペプチドは、当該技術分野において公知であり、且つアミノ酸配列EKRIWFPYRRF（配列番号：３１）、YKTNFRRYYRF（配列番号：３２）又はVLIRHFRKRYY（配列番号：３３）を有するペプチドを含むが、これらに限定されるものではない(Butterfield KCら、Biochemistry, 2010 Feb 23;49(7):1549-55)。同じく正帯電したヒストンペプチド、特に配列SGRGKQGGKARAKAKTRSSR（配列番号：３４）を含むペプチドなどのヒトＨ２Ａヒストンのペプチドが、本明細書において同定される。一実施態様において、コンドロイチン結合ペプチドは、５～２０個のアミノ酸、好ましくは６～２０個のアミノ酸、より好ましくは６～１２個のアミノ酸を含む。好ましくは、コンドロイチン結合ペプチドは、５個以上、好ましくは６個以上、より好ましくは７個以上の正帯電したアミノ酸を含む。加えて又は独立して、コンドロイチン結合ペプチドは、少なくとも２個の連続する正帯電したアミノ酸、好ましくは少なくとも３個の連続する正帯電したアミノ酸を含む。同じくより塩基性のアミノ酸、例えばリジン（ｐＫ１０．５）及びアルギニン（ｐＫ１２．５）などは、特に交互に正帯電されたアミノ酸について、ヒスチジン（ｐＫ６．０）のコンドロイチン結合作用を改善するように見える。しかし、非常に塩基性のペプチドを含むことによる、そのタンパク質の生化学的特徴の変化を避けるように、注意すべきである。一実施態様において、コンドロイチン－結合ペプチドは、好ましくは少なくとも６個の連続ヒスチジン残基（少なくともヘキサヒスチジン－タグ）を有する、より好ましくは少なくとも７個の連続ヒスチジン残基（少なくともヘプタヒスチジン－タグ）を有する、ポリヒスチジン－タグである。

【0085】

用語コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸は、本明細書において互換的に使用され、従ってコンドロイチン－結合ペプチドはまた、コンドロイチン硫酸結合ペプチドとも称されてよい。ヒアルロナンへの結合を増大するために、結合コンセンサスモチーフを含む例証的配列は、以下のように規定され：Ｂ（Ｘ７）Ｂ、ここでＢは、Ｒ又はＫのいずれかであり、Ｘ７は、酸性残基を含まず、少なくとも１個の塩基性アミノ酸を含む(Yang Bら、EMBO J. 1994 Jan 15;13(2):286-96)。本明細書に開示されたように、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体はまた、ｈｉｓ－タグを介して、コンドロイチン硫酸に結合することができる。従って、コンドロイチン－結合ペプチドは、ポリヒスチジン－タグ又はコンドロイチンへの結合親和性を増大する任意の他のアミノ酸配列、例えばEKRIWFPYRRF（配列番号：３１）、YKTNFRRYYRF（配列番号：３２）、VLIRHFRKRYY（配列番号：３３）又はSGRGKQGGKARAKAKTRSSR（配列番号：３４）などであってよい。ポリヒスチジンタグは、ヘキサヒスチジン－タグ（６ｘＨｉｓ、HHHHHH；配列番号：４１）、より好ましくはヘプタヒスチジン－タグ（７ｘＨｉｓ；HHHHHHH；配列番号：４２）、少なくとも７個の連続するヒスチジンを含むヒスチジンタグ、又は少なくとも６個のヒスチジンを含む修飾されたヒスチジンタグ、例えばヒスチジン及びグルタミンを交互に含むＨＱタグ、ヒスチジン及びアスパラギンを交互に含むＨＮタグ、もしくはアミノ酸配列KDHLIHNVHKEEHAHAHNK（配列番号：３６）を含むＨＡＴタグなどであってよい。ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体がヘテロ二量体化ドメインを含む場合、コンドロイチン－結合ペプチドは、ヘテロ二量体化ドメインのＣ－端側である。コンドロイチン及びヒアルロン酸は両方共、軟骨の重要な成分である。

【0086】

本明細書において使用されるトランスフェクトするとは、当該技術分野において公知のトランスフェクション法を使用し、ＤＮＡを哺乳類細胞へ導入することを意味する。本明細書において使用される用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクトする」は、真核細胞へのウイルス－媒介した遺伝子導入を説明するために使用されることが多い、「形質導入」及び「形質導入する」を含む。これらのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであってよい。トランスフェクションは、一過性トランスフェクション又は安定したトランスフェクションであってよい。好ましくはこのポリヌクレオチドは、ベクター内、好ましくは発現ベクター内に存在する。

【0087】

安定した組込み法は、当該技術分野において周知である。簡単に述べると、安定した組込みは、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチド又は少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含むベクターを、哺乳類の宿主細胞へ一過性に導入することにより、通常達成され、これは、該組換えポリヌクレオチド（複数可）の哺乳類細胞ゲノムへの安定した組込みを促進する。典型的には、この組換えポリヌクレオチドは、相同なアーム、すなわち組込み部位の上流及び下流の領域に相同な配列により隣接される。組換えポリヌクレオチドを哺乳類細胞へ導入するためのベクターは、例えば、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ－由来エピソームなど、非常に多種多様な好適なベクター系から選択されてよい。様々なシャトルベクター、例えば大腸菌及びシュードモナス種など複数の宿主微生物において自立複製し得るベクターが使用されてよい。それらの哺乳類の宿主細胞への導入前に、環状ベクターは、哺乳類細胞ゲノムへの組込みを促進するために、線状化されてよい。ベクターの哺乳類細胞への導入の方法は、当該技術分野において周知であり、ウイルス送達などの生物学的方法による；例えば、陽イオンポリマー、リン酸カルシウム、陽イオン脂質又は陽イオンアミノ酸を使用する化学的方法による；例えば、電気穿孔法又は微量注入など、物理的方法による、トランスフェクションを含む。

【0088】

哺乳類細胞のゲノムへ安定して組込まれた組換えポリヌクレオチドは、発現カセットの一部であってよい。発現カセットは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質などの遺伝子産物をコードしている異種ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、プロモーター及び任意に遺伝子産物（複数可）の発現を制御する更なる手段へ機能的に連結される、そのような手段は、エンハンサー、終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、及び典型的にはポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域を含むが、これらに限定されるものではない。プロモーターは、弱いプロモーター、又は関心対象の遺伝子産物の高いレベルの発現を支援する強いプロモーターであってよい。該プロモーターは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（サル空胞ウイルス４０）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ＣＨＥＦ－１（ＣＨＯ－由来伸長因子－１）プロモーター、ポリオーマ、及び強い哺乳類のプロモーター、例えば未変性免疫グロブリン及びアクチンプロモーター、又は少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドの天然プロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０プロモーター、最も好ましくはＣＭＶプロモーターである。ポリアデニル化シグナルの例は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期又は初期ポリＡ；あるいは、免疫グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲなどを、使用することができる。当業者は、３’非翻訳領域は、例えばＡＲＥ（アデニレート－ウリジレートリッチエレメント）などの、不安定なエレメントを除去することにより、高レベルの発現を支援するように操作され得ることを、更に理解するであろう。

【0089】

この遺伝子産物は更に、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）など、増幅可能な遺伝子選択マーカーの制御下に配置されてよい。増幅可能な選択マーカー遺伝子は、分泌型治療的タンパク質発現カセットと同じ発現ベクター上に存在することができる。あるいは、増幅可能な選択マーカー遺伝子及び分泌型治療的タンパク質発現カセットは、異なる発現ベクター上に存在するが、非常に近接して宿主細胞のゲノムへ組込まれることができる。同時に共トランスフェクトされる２種以上のベクターは、例えば宿主細胞のゲノムへ非常に近接して組込まれることが多い。その後分泌型治療的タンパク質発現カセットを含む遺伝子領域の増幅は、増幅物質（例えば、ＤＨＦＲのためのＭＴＸ又はＧＳのためのＭＳＸ）を培養培地へ添加することにより、媒介される。

【0090】

宿主細胞又は産生細胞(producer)中の遺伝子産物の十分に高い安定したレベルは、例えば発現ベクターへ異種ポリヌクレオチドの複数のコピーをクローニングすることにより、達成され得る。組換えポリヌクレオチドの発現ベクターへの複数のコピーのクローニング及び前述の分泌型治療的タンパク質発現カセット（ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体をコードしている）の増幅は、更に組合せられてよい。

【0091】

少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域をコードしているポリヌクレオチドは、１つのベクター（第一のポリヌクレオチド）に、及び少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲ鎖の細胞外領域をコードしているポリヌクレオチド（第二のポリヌクレオチド）は、別のベクターに存在してよく、ここでコンドロイチン－結合ペプチドは、更に、第一又は第二のいずれかのポリヌクレオチドによりコードされ、ＨＬＡ－ＤＲα鎖及び／又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖を含むポリペプチドのＣ－末端にコンドロイチン－結合ペプチドを提供する。あるいはこの第一及び第二のポリヌクレオチドは、同じベクター上の個別の発現カセットの一部であってよい。第一及び第二のポリヌクレオチドはまた、少なくともα１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲα鎖の細胞外領域；少なくともβ１ドメインを含むＨＬＡ－ＤＲβ鎖の細胞外領域；及び、任意に更に、リンカーペプチドにより、ＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖の、好ましくはＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合されたコラーゲンＩＩペプチド（ＣＩＩペプチド）を含む単独の融合ポリペプチドをコードしている単独のポリヌクレオチドを形成してよく、ここでこのＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、融合ポリペプチド（一本鎖ヘテロ二量体）のポリペプチドのＣ－末端に、コンドロイチン－結合ペプチドを含む。

【0092】

あるいは、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質が２つのポリペプチドとして発現される場合、ＨＬＡ－ＤＲα鎖は、そのＣ－末端（Ｃ－端側に）で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第一の機能ドメインへ融合され、並びにＨＬＡ－ＤＲβ鎖は、そのＣ－末端で、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの第二の相補的機能ドメインへ融合される。第一の機能ドメイン及び第二の相補的機能ドメインは、酸性及び塩基性のロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン、好ましくはｊｕｎ－ｆｏｓロイシンジッパーモチーフであってよい。第一及び／又は第二のポリヌクレオチドは、更に、ロイシンジッパーヘテロ二量体化モチーフの機能ドメインのＣ－末端に、ポリヒスチジンタグなどの、コンドロイチン－結合ペプチドをコードしている（複数可）。

【0093】

哺乳類細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の生成に適した条件下で培養され、細胞上清及び／又は細胞が収集され、ここで細胞上清及び／又は細胞は、未修飾及び／又は翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む（複数可）。翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドにおいて、ＣＩＩペプチドの第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）又はＯ－グリコシル化されたヒドロキシリジンであってよく、好ましくは第一のリジン残基は、ヒドロキシリジン又はガラクトシル－ヒドロキシリジン、より好ましくはガラクトシル－ヒドロキシリジンである。この方法は更に、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチドのグリコシル化プロファイルを分析する工程を含んでよい。グリコシル化プロファイルを分析する方法は、当該技術分野において周知であり、質量分析などの方法を含む。

【0094】

原則として、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を含む、高収率のタンパク質生成に適した任意の哺乳類細胞は、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の生成に使用されてよい。ＣＩＩペプチドがリンカーペプチドによりＨＬＡ－ＤＲα鎖又はＨＬＡ－ＤＲβ鎖のＮ－端側に融合され、及びＣＩＩペプチドが翻訳後修飾される場合、哺乳類細胞株は、それがリジンのヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）への水酸化、及びＨｙｌのガラクトシルヒドロキシリジン（Ｇａｌ－Ｈｙｌ）へのガラクトシル化を含む、コラーゲン中のリジン残基を翻訳後修飾するための酵素を含む限りは、適している。リジンの文脈において本明細書で使用される用語「ガラクトシル化された」とは、リジンが、ガラクトシル化の前に、ヒドロキシリジンへ水酸化されることを含む。これらの酵素は、細胞内に内在性に存在するか、又は細胞において組換え発現されてよい。好ましくは、哺乳類細胞は、リジン水酸化酵素(EC 1.14.11.4)及びコラーゲンガラクトシル基転移酵素(EC 2.4.1.50)、好ましくはリジン水酸化酵素１（ＬＨ１）及び／又はリジン水酸化酵素２（ＬＨ２）、並びにコラーゲンガラクトシル基転移酵素ＧＬＴ２５Ｄ１及び／又はＧＬＴ２５Ｄ２、好ましくはＧＬＴ２５Ｄ１を含む。これらの酵素は、コラーゲンを翻訳後修飾する。従ってこれらの酵素は恐らく、コラーゲンを産生する細胞株、例えば腎細胞、線維芽細胞、又は破骨細胞の中、特に例えばＨＥＫ２９３細胞もしくはその誘導体などの腎細胞の中に存在するであろう。ＨＥＫ２９３細胞は、接着細胞として又は浮遊液中で成長し得る。本発明に従う方法に適したＨＥＫ２９３細胞の例は、ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３Ｆ細胞、例えばＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞(Gibco、カタログ番号A14527、カタログ番号100044202で寄託されたｃＧＭＰとしても入手可)である。他の好適なＨＥＫ２９３細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び／又はそれらの浮遊細胞を含む。同じくＭＨＣＩＩタンパク質により提示される小型ペプチドも、これらの細胞において翻訳後修飾され得ることは驚くべきことであった。これらのペプチドは、コラーゲンから誘導されるが、これらはＭＨＣＩＩ複合体内の全体的に異なる（非天然の）環境において存在する。本発明者らは、これに関して、天然のＭＨＣＩＩタンパク質は、ＡＰＣにおいて消化される細胞外（翻訳後修飾された）タンパク質由来のペプチドを負荷されることに注目する。従ってこの修飾は、エンドサイトーシスされたタンパク質上に既に存在し、且つ細胞内的では追加されない。更に、インサイチュでグリコシル化された場合に生成された異質性の生成物は、治療に適していることは、驚くべきことである。好適な細胞は、好適な抗体を使用するウェスタンブロットによるか又はＲＮＡ発現によるかにより、又はＩＩ型コラーゲンもしくはＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体をグリコシル化するそれらの能力により機能的になど、コラーゲン中のリジン残基の翻訳後修飾に必要とされる酵素に関して、容易にスクリーニングすることができる。遺伝子もしくはタンパク質の発現又は酵素活性及びグリコシル化プロファイルを検出する方法は、当該技術分野において周知である。好適な哺乳類細胞の例は、腎細胞、線維芽細胞又は破骨細胞であり、好ましくはＨＥＫ２９３細胞又は細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は、リジン水酸化酵素ＰＬＯＤ１及びＰＬＯＤ２（各々、ＬＨ１及びＬＨ２をコードしている）、ガラクトシル基転移酵素ＧＬＴ２５Ｄ１及びＧＬＴ２５Ｄ２並びに更にはＰＬＯＤ３（ＬＨ３をコードしている）を発現することが、先に説明されている。

【0095】

タンパク質生成に一般に使用されるＣＨＯ細胞は、試験されており、且つコラーゲン又は本明細書記載のＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体においてガラクトシルヒドロキシリジン（Ｇａｌ－Ｈｙｌ）を生じるよう、リジン残基で翻訳後修飾を十分に追加することはできない。しかし、哺乳類細胞はまた、リジン水酸化酵素及びコラーゲンガラクトシル基転移酵素を発現するように、遺伝子操作された細胞であってもよい。好ましくは哺乳類細胞は、リジン水酸化酵素１（ＬＨ１）及び／又はリジン水酸化酵素２（ＬＨ２）並びにコラーゲンガラクトシル基転移酵素ＧＬＴ２５Ｄ１及び／又はＧＬＴ２５Ｄ２、好ましくはＧＬＴ２５Ｄ１を組換え的に発現するように遺伝子操作される。ＧＬＴ２５Ｄ２は、ごくわずかな細胞型においてのみ発現され、従って恐らく通常のコラーゲン修飾には余り寄与しないであろう。任意の哺乳類細胞は、リジン水酸化酵素及びコラーゲンガラクトシル基転移酵素、好ましくはリジン水酸化酵素１（ＬＨ１）及び／又はリジン水酸化酵素２（ＬＨ２）並びにコラーゲンガラクトシル基転移酵素ＧＬＴ２５Ｄ１及び／又はＧＬＴ２５Ｄ２を組換え的に発現するように、遺伝子操作されてよい。好ましくは、説明されたように遺伝子操作された哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞、より好ましくはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯグルタミン合成酵素（ＧＳ）－欠損細胞又はこれらの細胞のいずれかの誘導体である。

【0096】

当業者は、コラーゲンにおけるリジン残基の翻訳後修飾が可能である、すなわちコラーゲン中のリジン残基を翻訳後修飾する酵素を含む、哺乳類細胞において生成されたＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は、特にＣＩＩペプチドの第一及び任意に第二のリジン残基での、ＣＩＩペプチドの異なる翻訳後修飾を含む、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の異質性混合物であることを理解するであろう。この異質性混合物は、第一のリジンにＫ、Ｈｙｌ、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧＧ－Ｈｙｌを、並びに任意の第二のリジンに独立してＫ、Ｈｙｌ、Ｇ－Ｈｙｌ又はＧＧ－Ｈｙｌを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む（ここで、Ｋ＝リジン、Ｈｙｌ＝ヒドロキシリジン、Ｇ－Ｈｙｌ＝ガラクトシルヒドロキシリジン、ＧＧ－Ｈｙｌ＝グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン）。

【0097】

従って、収集された細胞上清及び任意に収集された細胞は、ＣＩＩペプチドの第一のリジン残基はＨｙｌ又はｇａｌ－Ｈｙｌである、ＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含み、並びに更にＣＩＩペプチドの第一のリジン残基は、未修飾又はグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）、好ましくは未修飾であり、並びにＣＩＩペプチドの任意の第二のリジン残基は、独立して、未修飾、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇ－Ｈｙｌ）又はグルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）、好ましくは未修飾、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）又はガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇ－Ｈｙｌ）である、ＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体を含む。好ましくは収集された細胞上清及び任意に収集された細胞は、第二のリジン残基は、グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジンである、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は含まない。より好ましくは、収集された細胞上清及び任意に収集された細胞は、グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）修飾されたＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体、すなわち第一及び／又は任意に第二のリジン残基は、グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジンである、Ｏ－グリコシル化されたＣＩＩペプチドを含むＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体は含まない。ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の混合物はまた、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質上に未修飾及び翻訳後修飾されたＣＩＩペプチドを負荷することにより、達成されてもよい。当業者は、様々な比が達成されることを理解するであろう。

【0098】

ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体（ＨＬＡ－ＤＲタンパク質との融合タンパク質としてのＣＩＩペプチド負荷又はＣＩＩペプチド発現により調製される）の異質性の混合物は、この混合物中又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチドの第一のリジン（Ｋ２６４）に、Ｇ－Ｈｙｌを、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％含む。更に、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の異質性の混合物は、この混合物中又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の未修飾のＣＩＩペプチドを、９０％を超えない、８０％を超えない、７０％を超えない、６０％を超えない、又は５０％を超えないで含む。好ましくは、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチドの異質性の混合物は、この混合物中又は組成物中の総ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体のＣＩＩペプチド中、ＧＧ－Ｈｙｌを、２０％未満、１０％未満、５％未満、及びより好ましくは１％未満、個別に又は追加して含む。ここで百分率は、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体中の総ＣＩＩペプチドの、ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体中のＣＩＩペプチドの割合を指す。第二のリジン残基（Ｋ２７０）は、変異されてよく、例えば、アルギニン（Ｋ２７０Ｒ）へ変異されてよい。このことは、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質との融合タンパク質として発現されたＣＩＩペプチドのこの位置での翻訳後修飾を回避し、並びにＴＣＲ結合との可能性のある相互干渉を回避する。好ましくは、（任意の）第二のリジンは、グルコシルガラクトシル－ヒドロキシリジン（ＧＧ－Ｈｙｌ）へは翻訳後修飾されず、及び未修飾のリジン、ヒドロキシリジン又はガラクトシルヒドロキシリジンとして存在し、好ましくは未修飾で存在する。

【0099】

ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩペプチド複合体の混合物の異質性及び嵩高なグルコシルガラクトシルヒドロキシリジン形成を減少するために、哺乳類細胞が、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素(EC 2.4.1.66)活性を欠いているかどうかは、更に利点がある。一実施態様において、哺乳類細胞は、従って、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を欠いている。好ましくは、哺乳類細胞は、リジン水酸化酵素３（ＬＨ３）を欠いている。ＬＨ３は、リジン水酸化酵素（ＬＨ）、ガラクトシル基転移酵素（ＧＴ）及びガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素（ＧＧＴ）の活性を含む、多機能酵素であり、ここでこの酵素の主要機能は、ＧＧＴ活性であるように見える。ＬＨ３活性は、ノックダウン又はノックアウトアプローチを使用し、欠失又は減少され得る。酵素発現は、例えばｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を使用し、減少されることができる。

【0100】

用語「ＲＮＡ干渉」（ＲＮＡｉ）は、タンパク質合成の全般的抑制を伴わずに、遺伝子発現（タンパク質合成）を配列－特異的又は遺伝子特異的に抑制することを指す。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ－誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解、転写されたｍＲＮＡの翻訳の防止が関与し得る。ＲＮＡｉにより引き起こされる遺伝子発現の抑制は、一過性であり得るか、又はこれは、より安定、永久的でさえあり得る。ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡにより媒介され得る。好ましくは、本発明に従うＲＮＡｉは、遺伝子－特異的である（１つの遺伝子のみが標的化される）。遺伝子－特異的ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡにより媒介され得る。

【0101】

本明細書において使用される用語「低分子干渉」又は「短分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、所望の遺伝子に標的化され並びにそれと相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することが可能であるヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖を指す。これは、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡから形成される。このＲＮＡ二重鎖は典型的には、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７個の塩基対を形成し、且つ２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９個のヌクレオチドの２つの相補的１本鎖ＲＮＡを含み、好ましくはＲＮＡ二重鎖は、１７－２５個の塩基対を形成し、且つ２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する、１９－２７個のヌクレオチドの２つの相補的１本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、遺伝子に「標的化され」、ここでｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列は、標的化された遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対し相補的である。ｓｉＲＮＡ又はその前駆体は、常に細胞へ外来性に、例えば直接的に、又は該ｓｉＲＮＡをコードしている配列を有するベクターのトランスフェクションにより導入され、並びに内在性ｍｉＲＮＡ経路は、ｓｉＲＮＡの正確なプロセシング及び標的ｍＲＮＡの切断又は分解のために、利用される。この二重鎖ＲＮＡは、単独の構築体から細胞において発現されることができる。

【0102】

本明細書において使用される用語「ｓｈＲＮＡ」（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）は、ｓｉＲＮＡの一部が、ヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ）の部分である、ＲＮＡ二重鎖を指す。ｓｈＲＮＡは、細胞内で、機能性ｓｉＲＮＡへプロセシングされ得る。この二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２つの配列間に配置されたループ部分を含んでよい。このループの長さは、変動し得る。一部の実施態様において、ループは、長さ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のヌクレオチドである。ヘアピン構造はまた、３’又は５’オーバーハング部分も含むことができる。一部の態様において、オーバーハングは、長さ０、１、２、３、４又は５個のヌクレオチドの３’又は５’オーバーハングである。本発明の一態様において、ベクターに含まれるヌクレオチド配列は、センス領域、ループ領域及びアンチセンス領域を含む低分子ヘアピンＲＮＡの発現のための鋳型として働く。発現後、センス領域及びアンチセンス領域は、二重鎖を形成する。ｓｈＲＮＡは、常に外来的に、例えば該ｓｈＲＮＡをコードしている配列を有するベクターのトランスフェクションにより導入され、並びに内在性ｍｉＲＮＡ経路は、ｓｉＲＮＡの正確なプロセシング及び標的ｍＲＮＡの切断又は分解のために、利用される。ｓｈＲＮＡをコードしている配列を有するベクターの使用は、標的遺伝子の抑制が典型的には長期間安定している点で、化学的に合成されたｓｉＲＮＡの使用に勝る利点を有する。

【0103】

典型的には、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、完全な配列相補性（すなわち、低分子干渉ＲＮＡのＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡの間の完全な塩基対形成）により、ｍＲＮＡ抑制を媒介し、従ってそれらの標的について特異的である。ＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖はまた、ＲＮＡ二重鎖の活性鎖と称されてもよい。本明細書において使用される完全な塩基対形成の完全な配列相補性は、低分子干渉ＲＮＡのＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖は、少なくとも１５連続ヌクレオチド、少なくとも１６連続ヌクレオチド、少なくとも１７連続ヌクレオチド、少なくとも１８連続ヌクレオチド及び好ましくは少なくとも１９連続ヌクレオチドについて、標的ｍＲＮＡと少なくとも８９％の配列同一性を有するか、又は好ましくは少なくとも１５連続ヌクレオチド、少なくとも１６連続ヌクレオチド、少なくとも１７連続ヌクレオチド、少なくとも１８連続ヌクレオチド及び好ましくは少なくとも１９連続ヌクレオチドについて、標的ｍＲＮＡと少なくとも９３％の配列同一性を有することを意味する。より好ましくは、低分子干渉ＲＮＡのＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖は、少なくとも１５連続ヌクレオチド、少なくとも１６連続ヌクレオチド、少なくとも１７連続ヌクレオチド、少なくとも１８連続ヌクレオチド及び好ましくは少なくとも１９連続ヌクレオチドについて、標的ｍＲＮＡと１００％の配列同一性を有する。

【0104】

あるいは、この酵素は、発現されないか、又はこの遺伝子は、変異もしくは欠失されることがある。従ってこの哺乳類細胞は、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を欠いている。特定の実施態様において、この哺乳類細胞は、多機能酵素ＬＨ３を欠いている。例えば、この遺伝子は、サイレンシングされるか、又は十分に発現されないことがある。他の特定の実施態様において、哺乳類細胞は、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を欠いている変異体ＬＨ３酵素を含む。

【0105】

この哺乳類細胞はまた、低下したガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を有するか又は活性を有さないように、遺伝子操作されてもよい。ＬＨ３をコードしているＰＬＯＤ３遺伝子は、変異もしくは欠失されてよく；並びに／又は、ＬＨ３酵素は、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を欠いている変異されたＬＨ３酵素であってよい。遺伝子を欠失又は変異する方法は、当該技術分野において周知であり、且つ配列特異的ＤＮＡ編集酵素の使用を含んでよい。本明細書において使用される「配列特異的ＤＮＡ編集酵素」又は「部位特異的ヌクレアーゼ」は、指定されたヌクレオチド配列（認識部位）でＤＮＡの切断ができるタンパク質である。該切断は、２本の相補的ＤＮＡ鎖の一方又は両方において生じ、その結果例えば、標的化された変異誘発、特異的ゲノムＤＮＡ配列の標的化された欠失を可能にするか、又は異種ポリヌクレオチドにより、切断された標的ＤＮＡの位置指定された組換えを生じる。該編集酵素の配列特異性は、その編集酵素内の１もしくは複数の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質ドメインから、又はこれをガイドポリヌクレオチドと少なくとも部分的相補性を伴うＤＮＡ配列に向ける該ガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）に結合する酵素から、生じ得る。従って該編集酵素の認識部位は、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインの操作によるか、又は代替のガイドポリヌクレオチドの使用により変更され得る。複数の配列特異的ＤＮＡ編集酵素が、当該技術分野において公知であり、その非限定的例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ結合ヌクレアーゼがある。

【0106】

好ましくは、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性を欠くように遺伝子操作された哺乳類細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又は細胞株である。ＨＬＡ－ＤＲ／ＣＩＩ複合体を生成するためのガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素を減少することから恩恵がある細胞株の例は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞(Gibco、カタログ番号A14527、カタログ番号100044202で寄託されたｃＧＭＰとしても入手可)である。ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素活性はまた、培養時にカルミン酸を使用しても阻害される。

【0107】

哺乳類細胞は、好ましくは、無血清条件下で、及び任意に動物起源の何らかのタンパク質／ペプチドを含まない培地中で、樹立され、馴化され、及び完全に培養される。PreproGow(商標)ＨＥＫ２９３培地(PREPROTECH, USA)、Ｅｘｐｉ２９３(商標)発現培地(Thermo Fisher, USA)、ハムのＦ１２(Sigma, ダイゼンホーフェン, 独国)、ＲＰＰＭＩ(Sigma)、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ；Sigma)、最小必須培地（ＭＥＭ；Sigma)、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma)、ＣＤ－ＣＨＯ(Invitrogen, カールスバッド, CA)、無血清ＣＨＯ培地(Sigma)、及び無タンパク質ＣＨＯ培地(Sigma)などの市販の培地は、好適な栄養液の例である。任意の培地には、様々な化合物を必要に応じて補充することができ、その非限定的例は、組換えホルモン及び／又は他の組換え成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮細胞成長因子、インスリン様成長因子など）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩など）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース又は他の同等のエネルギー源、抗生物質並びに微量元素である。任意の他の必要な補充物質もまた、当業者に公知である好適な濃度で含まれてよい。選択可能な遺伝子を発現するよう遺伝的に改変された細胞の成長及び選択のために、好適な選択物質が、培養培地に添加される。

【実施例】

【0108】

実施例
被験物質及び製剤
Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ又はＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ（合成Ｇａｌ－ペプチド：GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEPが負荷された）及びＡｑ／ｎＣＩＩ又はＤＲ４／ｎＣＩＩ（未修飾のペプチド：GIAGFKGEQGPKGEP；配列番号：１３が負荷された）：Ａｑ－ｍＣＬＩＰｍｔタンパク質は、一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３細胞株（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、Gibco、カタログ番号A14527）又はＣＨＯ細胞において発現させ（図４）、Ｈｉｓ－タグを使用する固定された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組合せを用いて精製した。その後、共有結合したプレ－ペプチドを、トロンビン切断、及び過剰なＧａｌ－ペプチド又は未修飾ペプチドの付加により置き換えた。最後に、ＳＥＣを行い、切断されたプレ－ペプチド及び過剰なＧａｌ－ペプチド又は未修飾ペプチドを除去した。Ｇａｌ－ペプチド：GIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)は、論文Diogo, D.ら、 Curr Opin Rheumatol. 2014; 26: 85-92；Gregersen PKら、Arthritis Rheum. 1987;30:1205-1213；Duke Oら、Clin Exp Immunol. 1982;49:22-30に記載されたように、合成し、精製し、且つ特徴決定した。

【0109】

天然にグリコシル化されたマウスＡｑ／ｒＣＩＩ及びヒトＤＲ４／ｈＣＩＩ：天然にグリコシル化されたマウスＡｑ／ｒＣＩＩ及びヒトＤＲ４／ｈＣＩＩタンパク質を、一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３細胞株（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、Gibco、カタログ番号A14527)において発現させ、Ｈｉｓ－タグを使用する固定された金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組合せを用いて精製した。インビボにおける実験のために、ＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を、無菌ＰＢＳ(Gibco)中、所望の濃度に希釈し、DynaGard ０．２μｍシリンジチップフィルターを使用し濾過し、１００μｌタンパク質溶液を、無菌技術を使用しALZETマイクロ－浸透圧ポンプ(DURECT社、モデル1007D、０．５μｌ／ｈ、７日間）に充填した。このポンプは、手術用手袋で操作した。物質の即時ポンプ輸送を確実にするために、予め充填したポンプを、埋め込み前にＰＢＳ中に、４℃で一晩配置した。

【0110】

より具体的には、５’及び３’末端に、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限部位を持つ、図１に描いたようなこの複合体の２本の鎖をコードしているｃＤＮＡを、Eurofinsで、合成した。合成したｃＤＮＡを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ(FastDigest(商標)、ThermoFisher Scientific)を用いて消化した。消化されたＤＮＡ断片を、個別に、哺乳類の発現ベクターｐＣＥＰ４(Life technologies)へクローニングし、その後同じ制限酵素により消化した。配列を検証した後、複合体の２本の鎖をコードしている２種の組換えプラスミドを、FectoPRO(商標)ＤＮＡトランスフェクション試薬(Polyplus transfection)により、Ｅｘｐｉ３９３Ｆ（商標）細胞へ、同時トランスフェクションした。上清を、トランスフェクション後６日目に収集した。この組換えタンパク質を最初に、５ｍｌ HisTrap Excel(GE Healthcare Life Sciences)アフィニティカラムを用い、引き続きSuperdex 200pg(GE Healthcare life Sciences)上のサイズ排除クロマトグラフィーにより捕獲した。この組換えタンパク質を、単独のピークとして精製し、濃縮し、１０ｋＤａのＭＷＣＯを持つＡｍｉｃｏｎ遠心分離装置を用い、ビオチン化緩衝液（２０ｍＭトリス－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対し透析した。ビオチン－タンパク質リガーゼを使用するビオチン化は、製造業者(Avidity)の指示に従い行い、この反応を３０℃で２ｈ実行した。遊離のビオチンを、Superdex 200pgカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。

【0111】

動物
雄のＱＢマウス（Ｂ１０．Ｑ×ＢＡＬＢ／ｃ、ｎ＝９）Ｆ１、１２～１６週齢を、この実験において使用した。Ｂ１０．Ｑマウスの樹立系統は、J. Klein(テュービンゲン, 独国)により当初提供され、及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。全てのマウスは、Medical Inflammation Research(Karolinska Institute)の動物施設において繁殖させ且つ飼育した。使用した全ての動物は、標準齧歯類餌を摂食させ、水は自在に摂取させた。実験バイアスを最小化するために、異なる実験群を、一緒に飼育した。地域の倫理委員会は、全ての動物実験を承認した(Stockholms Norra Djurforsoksetiska Namnd、ストックホルム、スウェーデン)。全てのインビボ関節炎実験は、倫理に関する番号Ｎ２１３／１４及びＮ３５／１６により対象とされた。動物の麻酔は、イソフルラン吸入により達成させたのに対し、屠殺は、ＣＯ_２により行った。

【0112】

関節炎の誘導及び臨床評価
ラットＩＩ型コラーゲン（ｒＣＩＩ）は、論文Chavele KM及びEhrenstein MR、FEBS Lett. 2011;585:3603-10に記載されたように、Ｓｗａｒｍ軟骨肉腫（Ｓｗａｒｍラット軟骨肉腫、ＳＲＣ）から、限定されたペプシン消化、及び更なる精製により、調製した。調製したｒＣＩＩは、使用時まで４℃で貯蔵した。コラーゲン－誘導関節炎（ＣＩＡ）を誘導するために、各マウスに、ＣＦＡ(Difco)中に１：１で乳化したｒＣＩＩの１００μｇを総容積１００μｌで、尾の根元に、注射した。３５日後、マウスに、ＩＦＡ(Difco)中に１：１で乳化したラットＣＩＩの５０μｇを総容積５０μｌで、ブースター注射した。臨床的関節炎の発症は、各脚中の炎症関節の数を基に、動物の目視によるスコア化により行い、これは免疫処置後２週間に開始し、実験終了時まで続けた。１匹のマウスにつき最大６０のスコアになるよう各脚について１～１５の範囲である、論文Klareskog Lら、Annu Rev Immunol. 2008;26:651-75に記載された拡大されたスコア化プロトコールを、使用した。マウスは、免疫処置後９０日間にわたり、１週間に２～４回検査した。

【0113】

治療プロトコール
様々な量の天然にグリコシル化されたＡｑ／ｒＣＩＩ（ｎ＝９）又はＰＢＳ（対照群、ｎ＝９）のいずれかを拡散するALZETマイクロ－浸透圧ポンプを、免疫処置後７日目に、ＱＢマウスの皮下に埋め込んだ。外科的埋め込み手技時には、無菌技術を使用した。皮下留置のために、肩甲骨の間の皮膚に小さい切開を作製し、小さいポケットを形成し、切開から離れた流量モデレーターポインティングを備えるポンプを、ポケットに挿入した。皮膚の切開を、創傷クリップを用いて閉鎖した。

【0114】

臨床的関節炎の治療について、マウスにおける１００μｇの単回の皮下注射は、７連続日の１５μｇ／日の皮下ポンプ注入と、ほぼ同等に効果があった。しかし、治療したマウスのリンパ節Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析により証明されるように、延長された治療は、制御性ＴＲ１細胞の誘導についてより効果があるように見えた。

【0115】

ＤＴＨ
ラットＣＩＩ／ＣＦＡ（ｒＣＩＩ）により予備免疫処置したＱＢマウスには、免疫処置後８日目に、左耳へ、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解したｒＣＩＩの１０μｇを、皮内注射した。対照のために、右耳に、溶媒を注射し、且つ耳の膨潤を、動物の治療について盲検化された治験責任医師が、キャリパーを使用し、２４時間後に測定した。治療は、ｒＣＩＩによる免疫処置後４日目に埋め込まれた浸透圧ポンプを用い、Ａｑ／ペプチド複合体１００μｇの２４時間適用により行った。群：Ａｑ／ｍＣＬＩＰｍｔ（ｎ＝６）、Ｈｉｓ－タグを伴う（Ｈｉｓ、ｎ＝５）及び伴わない（ｗ／ｏＨｉｓ、ｎ＝５）Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ。

【0116】

Ｔ細胞ハイブリドーマアッセイ
ＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体を、無菌ＰＢＳ中に希釈し、且つ４℃で一晩のインキュベーションによりプレート上にコーティングするか、又はＴ細胞ハイブリドーマへ可溶性型で直接添加した。次にＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体でコーティングされたプレートを、無菌ＰＢＳで２回洗浄し、未結合の複合体を除去し、並びに１個のウェルにつき、５％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭの２００μｌ中の５×１０^４個Ｔ－ハイブリドーマ細胞を添加した。Ｔ細胞ハイブリドーマ３Ｈ８並びに各々ＧａｌＯＫ２６４及び未修飾ＣＩＩ２５９-２７３（Ｋ２６４）に特異的なｍＤＲ１．１を、使用した。２４時間後、培養上清中のＩＬ－２又はＩＬ－１０（一部の実験において）を、サンドイッチＥＬＩＳＡ(BioLegend)により測定した。マウスｒＩＬ－２又はｒＩ－１０は各々、陽性対照及び標準として利用した。

【0117】

Ｔ－ハイブリドーマ細胞を使用する刺激実験を、マイクロタイターウェルにおいて以下の異なる条件下で行った：１）組換えＤＲ４／ＣＩＩ－ペプチド複合体により予備－コーティングされたウェル、２）ヒアルロナン(Sigma Aldrich(#H7630))又はコンドロイチン硫酸(Sigma Aldrich(#C9819))によりコーティングされ、引き続きこれにＤＲ４／ＣＩＩ－ペプチド複合体を液体相で添加したウェル。このデザインは、ＤＲ４／ＣＩＩ－ペプチド複合体によるＴ細胞活性化に対する両成分の可能性のある相互作用の影響を試験するために選択し、並びにＤＲ４／ＣＩＩ－ペプチド複合体の、組織及び排液しているリンパ系中の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）において生理的に発現される結合組織成分との相互作用を模倣している、又は３）罹患組織コンパートメントの体液、例えば関節滲出液又はリンパ液における、Ｔ細胞機能の変更に関するモデルとして、Ｔ－ハイブリドーマ細胞へのそれらの影響を調べるために、溶質ＥＣＭ成分ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸又はヘパリン硫酸、並びにＤＲ４／ＣＩＩ－ペプチド複合体が添加されたブロックされた表面を伴うウェル。

【0118】

ＭＨＣＩＩ四量体染色による抗原特異性Ｔ細胞の検出
ＭＨＣＩＩ／ペプチド四量体複合体は、ＰＥ－標識したストレプトアビジン及びＡＰＣ－標識したストレプトアビジン(Biolegend)の組換えタンパク質へのモル比１：４での添加、及び＋４℃で１時間のインキュベーションにより、新たに調製した。ペプチド－特異性Ｔリンパ球を同定するために、細胞を、ＤＲ４／ペプチド四量体複合体（２０μｇ／ｍｌ）と共に、小型－分子タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である５０ｎＭダサチニブの存在下、＋３７℃で１時間インキュベーションし、引き続き細胞表面マーカーについて染色した。生存度染色溶液(Zombie NIR; Biolegend)を、分析から死滅細胞を排除するために捕捉する直前に添加した。試料を、FacsDiVaソフトウェア(BD Biosciences)を使用し、LSR Fortessaフローサイトメーターを使用することにより捕捉し、データはFlowJoソフトウェア(v10, FlowJo LLC)により解析した。

【0119】

ＣＩＩペプチド刺激時のヒトＴ細胞の活性化
ＰＢＭＣを解凍し、TexMACS(Biolegend)中、１．５×１０^６個細胞／ウェルで一晩安置した。細胞を、抗－ＣＤ２８抗体１μｇ／ｍｌ(BioLegend)と一緒にした各ペプチド変種GIAGFKGEQGPKGEP（配列番号：１３）及びGIAGFK(Gal-Hyl)GEQGPKGEP)の濃度５０μｇ／ｍｌにより、７時間刺激した。陽性対照及びＣＤ１５４アッセイ感度の決定のために、ブドウ球菌性エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を１μｇ／ｍｌ(Sigma-Aldrich)で、個別の培養物に添加した。刺激後、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ識別マーカー(BioLegend)により処理し、その後ポジティブゲーティングに関してＣＤ３及びＣＤ４の表面発現について、並びにＢ細胞の排除に関してＣＤ１９について染色した。バックグラウンドレベルを、刺激していない細胞（抗－ＣＤ２８抗体で処理）により決定し、更にＣＩＩ－刺激した培養物から減算した。試料を、FacsDiVaソフトウェア(BD Biosciences)を使用し、LSR Fortessaフローサイトメーターを使用することにより捕捉し、データはFlowJoソフトウェア(v10, FlowJo LLC)により解析した。

【0120】

ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１－陽性ＲＡ患者の末梢血由来のＴ細胞のインビトロにおける刺激／分化
インビトロアッセイを行い、数日間の延長されたインキュベーション期間にわたるＤＲ４／ＣＩＩ－モノマーにより刺激時の、制御性Ｔ細胞機能の誘導／分化、例えばＴｒ１表現型関連サイトカインＩＬ－１０のアップレギュレーションを分析した。従ってＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離により単離し、TexMACS(MiltenyiBiotec, カタログ番号130-097-196)中の１．２×１０^６個細胞／ｍＬの細胞を、１μｇ／ｍＬ抗－ＣＤ３抗体(Biolegend、カタログ番号317304)及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２７(Peprotech、カタログ番号200-38B)（陽性対照、Ｔｒ１）、３．６μｇ／ｍＬのＤＲ４／ｎＣＩＩ、３．６μｇ／ｍＬのＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ、３．６μｇ／ｍＬのＤＲ４／ｈＣＩＩにより、８日間刺激するか、又は刺激せずに放置した（陰性対照、ｗ／ｏ）。刺激は、２つ組で行った。８日目に、培養上清を収集し、製造業者のプロトコールに従い、マルチプレックスビーズ－ベースのLEGENDplex(商標)アッセイにおいてヒトサイトカインの検出のための特注のパネルを使用し、放出されたサイトカインについて分析した。

【0121】

結果
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞における機能活性Ａｑ／ｒＣＩＩの生成
先行する実験において、合成ガラクトシル化されたＣＩＩ２５９－２７３ペプチドが負荷されたＡｑ分子の２回の静脈内注射は、マウスを、関節炎の発症から保護することができることは証明されている。しかし、ガラクトシル化されたＣＩＩ２５９－２７３の合成は、時間と経費の両方がかかる。加えて、この合成ペプチドの組換えＭＨＣクラスＩＩ分子への負荷は、些細なことではなく、且つ費用効果も悪い。従って、インサイチュにおける水酸化その後のガラクトシル化によりＣＩＩ－ペプチドの２６４位でのリジン側鎖の適切な翻訳後修飾を保証する、宿主細胞においてＭＨＣＩＩ鎖の１本に融合された共有結合されたＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを含むＭＨＣＩＩ分子（図１）の一工程生成を可能にする、生合成プロセスを確立することは、意味のある利点であろう。しかし、翻訳後コラーゲンペプチド修飾は、それぞれの酵素活性、すなわち、リジン水酸化酵素活性及びコラーゲンβガラクトシル基転移酵素活性の存在に左右される。例えば、大腸菌－産生したタンパク質は通常そのような修飾を示さず、並びに一部の昆虫細胞は、リジン残基を水酸化する能力を有する一方で、これらはヒドロキシリジンのＯ－結合型グリコシル化を含むＣＩＩ－ペプチドを産生しない。更に、必要とする酵素活性を提供する宿主細胞は実際に、非－コラーゲン性ＭＨＣＩＩタンパク質配列のフレーム内のＣＩＩ－ペプチドの選択的アミノ酸位置での必要とされる修飾を提供することが可能であるかどうかは不明であった。

【0122】

以下において、最初に、Ａｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体は、ＨＥＫ２９３細胞において発現され得ること、及び精製された複合体は、共有結合されたＣＩＩペプチド（ＣＩＩ２５９－２７３）を含み、そこでリジンは２６４位で翻訳後修飾されることが示されている。本発明者らは、ＣＩＩペプチド内のリジン側鎖の修飾の種類、並びに精製されたインサイチュガラクトシル化されたＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体は、ガラクトシル化されたＣＩＩ２５９－２７３ペプチドが負荷された組換えＡｑ分子について認められるものと類似した様式で、ＣＩＡマウスモデルにおいて保護的であるかどうかを分析した。ＨＥＫ２９３－生成されたＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体の治療能を試験するために、本発明者らは、免疫処置の１週間後に皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプを使用した。浸透圧ポンプは、静脈内注射に勝る利点があり、その理由はＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体は、一定レベルで循環中に留まり、且つインビボにおいてより長期間にわたり免疫寛容の誘導が得られるからである。２４時間、７日間又は６週間にわたりそれらの内容物を放出する３種の異なる型のポンプを比較すると、合成ガラクトシル化されたＣＩＩ－ペプチドが負荷されたＡｑ－分子を含む場合に、３種のポンプ全て、関節炎からの保護を媒介することがわかった（データは示さず）。しかし、７日間持続放出するポンプを使用すると、このポンプは、２４時間ポンプと比べ、制御能を伴うＣＩＩ－特異性Ｔ細胞の発達により強力に関連した保護を媒介することがわかった（データは示さず）。理論により結びつけられるものではないが、低投与量での遅い放出速度は、制御性Ｔ細胞の発達を生じるのに対し、高投与量でのより早い放出は、病原性Ｔ細胞の枯渇を生じ得る。しかし、観察された差異はまた、長期間の曝露によっても説明され、これは、循環から除去される前にＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体と相互作用するＣＩＩ－特異性Ｔ細胞の可能性－これは低い頻度で起こる－を増大する。以下に説明された実験は、７日間にわたりそれらの内容物を放出する浸透圧ポンプを使用し行った。

【0123】

Ａｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体がＨＥＫ２９３細胞において生成された場合に、どの翻訳後修飾が存在するかを評価するために、ＣＩＩ２５９－２７３エピトープに対し異なる特異性を持つＡｑ－拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマクローンを、精製された複合体によりインビトロにおいて刺激した（図２）。

【0124】

対照ＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体は、Ｓ２昆虫細胞において生成され、これはリジン側鎖のＯ－結合型グリコシル化に関して、翻訳後修飾を生じる能力が強力に損なわれている。予想されるように、２６４位で未修飾又は水酸化されたリジンを伴うＣＩＩ２５９－２７３ペプチドを認識するＨＣＱ．４クローンのみが、Ｓ２昆虫細胞において生成されるＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体に反応した。対照的に、全てのＣＩＩ－特異性クローンが、ＨＥＫ２９３細胞において生成されたＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体に反応した。使用したＴ細胞ハイブリドーマクローンの他の特異性は、以下の通りである：ＨＣＱ３（ＣＩＩ、Ｇａｌ－ＨＫ２６４）、ＨＣＱ．４（ＣＩＩ、未修飾及びＨＫ２６４）、ＨＣＱ．１１（Ｇｌｃ－Ｇａｌ－ＨＫ２６４）、ＨＭ１Ｒ．２（ＣＩＩ、Ｇａｌ－ＨＫ２６４及びＧａｌ－ＨＫ２６４＋２７０）、ＨＰ３（Ａｑ－拘束、ペプシン－ペプチド）。これは、ＨＥＫ２９３細胞において生成される場合に、２６４位が実際、翻訳後修飾され始めることを示している。更に、２６４位が、未修飾及び／又は水酸化されたリジン、並びに単糖及び二糖の両方のグリコシル化されたリジンを含む場合、生じる複合体は、異質性である。ペプシン－ペプチドに特異的であるＡｑ－拘束性クローンＨＰ３は、いずれのＡｑ／ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体に対しても、反応しなかった。

【0125】

実施例２：マウスＣＩＡモデルにおいてインサイチュグリコシル化されたＡｑ／ｒＣＩＩ
アジュバント中のＣＩＩにより免疫処置されたマウスは、３種の異なる量のＨＥＫ２９３－生成したＡｑ－ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体を負荷した浸透圧ポンプを、７日後（初回免疫の３５日後に追加免疫した後）、及び関節炎の発症後、埋め込んだ。陰性対照として、マウスには、ＰＢＳのみを負荷したポンプを埋め込んだ。図３Ａに示したように、Ａｑ－ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体は、投与量に依存した様式で、保護をもたらし、並びに最高量のＡｑ－ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体（１００μｇ）により治療されたマウスは、関節炎の発症から完全に保護された。中間量のＡｑ－ｒＣＩＩ（２５９－２７３）複合体（５０μｇ）で治療されたマウスは、若干の保護を示したのに対し、最低量（１０μｇ）の治療は、頻繁に関節炎を生じ、これはＰＢＳ－治療した対照と同等であった。

【0126】

実施例３：ＨＥＫ２９３細胞における機能活性ＤＲ４／ｈＣＩＩの生成
本発明者らは、宿主細胞のインサイチュグリコシル化機構を使用し、機能性マウスＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体（Ａｑ／ｒＣＩＩ）を、ＨＥＫ２９３細胞において調製することができることを証明した。本発明者らは次に、ヒトＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体は、その細胞のインサイチュグリコシル化機構を使用し、ＨＥＫ２９３細胞において調製することができるかどうかを調べた。これらの複合体は、ＨＥＫ２９３細胞において先に説明したように調製した。対照複合体は、ＣＨＯ細胞において発現され、並びに未修飾ペプチド（ＤＲ４／ｎＣＩＩ）又はガラクトシル化されたペプチド（ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ）が負荷された。２つの活性化拘束性ヒトＴ細胞ハイブリドーマ（３Ｈ８：未修飾のＣＩＩ－エピトープ、ｍＤＲ１．１：ガラクトシル化されたＣＩＩ－エピトープ）を使用し、未修飾ペプチド又はガラクトシル化されたペプチドのいずれかを負荷されたＤＲ４／ペプチド複合体と比べ、天然にグリコシル化されたＤＲ４／ペプチド複合体（ＤＲ４／ｈＣＩＩ）のガラクトシル化状態をチェックした。図４Ａに示したように、Ｔ細胞ハイブリドーマｍＤＲ１．１は、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ複合体による刺激時に活性化を獲得したのに対し、ＤＲ４／ｎＣＩＩによる刺激は、ほぼ陰性であり続けた。ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ及びＤＲ４／ｎＣＩＩとの比較において、ＤＲ４／共有結合したＣＩＩ（ＤＲ４／ｈＣＩＩ）は、ガラクトシル化状態に関して、異質性の生成物である。これは、ＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体を含有する組成物は、２６４位にガラクトシル化された及び未修飾のリジン残基を持つペプチドを含むことを意味する。ＤＲ４／ｈＣＩＩで刺激された細胞の活性化レベルは、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ複合体と比べわずかに低く、ＤＲ４／ｎＣＩＩ複合体に非常に類似している（図４Ｂ、３Ｈ８細胞を使用）。

【0127】

実施例４：ヒトにおけるＣＩＩペプチド特異性Ｔ細胞の検出
この目的は、ＲＡ患者及び健常ドナーの末梢血（ＰＢＭＣ）中の抗原特異性Ｔ細胞を直接検出する四量体ベースの方法を確立することであった。従って、ビオチン化されたＤＲ４／ＣＩＩペプチド複合体を、ストレプトアビジン－ＰＥ又はストレプトアビジン－ＡＰＣのいずれかと共にインキュベーションした。四量体の非特異的結合を減少するために、２種の蛍光色素による二重四量体染色を行った。ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ四量体を使用し抗原特異性Ｔ細胞（ＣＩＩ２５９－２７３、Ｋ２６４ｇａｌ）を、ＲＡ－患者、並びに健常ドナーにおいて検出した（図５Ａ）。更に、未修飾のＣＩＩペプチドに対し特異性を持つＴ細胞を、ＤＲ４／ｎＣＩＩ四量体を用いて検出することができる（図５Ｂ）。抗原特異性Ｔ細胞の平均頻度は、天然にグリコシル化されたＤＲ４／ｈＣＩＩ四量体を使用すると、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ四量体又はＤＲ４／ｎＣＩＩ四量体と比べ、より高かった（図５Ｂ）。末梢血中の抗原－特異性Ｔ細胞の頻度は極めて低い（０．０１～０，１％）ので、観察された数は、予想された通りである。

【0128】

活性化されたＣＤ４^＋ Ｔ細胞もまた、Ｔ細胞活性化のマーカーとしてＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）表面染色を使用するフローサイトメトリーにより、ｇａｌＣＩＩペプチド刺激後のＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１ ＲＡ患者のＰＢＭＣにおいて検出された（図６）。陽性対照として、細胞はまた、スーパー抗原ＳＥＢと共にインキュベーションし、これは活性化マーカーＣＤ１５４の強力なアップレギュレーションに繋がった（データは示さず）。対照的に、共刺激性ＣＤ２８に対する抗体のみと共にインキュベーションした細胞は、主に陰性であった（データは示さず）。末梢血中抗原－特異性Ｔ細胞集団の予想された頻度は極めて低いので、０．０１～０，１％のＣＤ１５４^＋ Ｔ細胞の検出（親集団：ＣＤ３／ＣＤ４生存Ｔ細胞）は、満足できるものである。Ｔ細胞は、未修飾の（ネイキッド）ＣＩＩペプチドを使用し、少なく活性化されるという事実は、注目に値することである。ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ又はＤＲ４／ｎＣＩＩ四量体染色を使用する抗原特異性Ｔ細胞の数は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１ ＲＡ患者のＰＢＭＣ中で類似していたので（図５）、ペプチド活性化後に認められた差異は、それぞれのＴ細胞の活性又は機能状態の差異によるものであるように見える。

【0129】

実施例５：ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性ＲＡ患者の末梢血由来のＴ細胞のインビトロにおける刺激／分化
８日間の延長されたインキュベーション期間にわたるＤＲ４／ＣＩＩ－モノマーによる刺激時の、制御性Ｔ細胞機能の誘導／分化、例えばＴｒ１表現型関連サイトカインＩＬ－１０のアップレギュレーションを調べるために、インビトロ試験を行った。従って、遺伝子型判定されたＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１陽性ＲＡ患者から単離されたＰＢＭＣを、Ｔｒ１細胞誘導条件下、抗－ＣＤ３及びＩＬ－２７抗体で（陽性対照、Ｔｒ１）、ＤＲ４／ｎＣＩＩ（３．６μｇ／ｍＬ）で、ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ（３．６μｇ／ｍＬ）で、又は刺激なし（陰性対照、Ｋ１）のいずれかで、８日間刺激した。刺激は、２つ組で行った。８日目に、培養上清を収集し、製造業者のプロトコールに従い、マルチプレックスビーズ－ベースのLEGENDplex(商標)アッセイフォーマットにおいてヒトサイトカインに関する特注のパネルを使用し、サイトカイン放出について分析した。図７において示した結果は、ＤＲ４／ｎＣＩＩ及びＤＲ４／ｇａｌＣＩＩの、ＲＡ患者由来のＰＢＭＣ中の抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の放出を誘導する能力、及び従来のＴＲ１誘導条件で８日間インキュベーションした陽性対照と比べて更にわずかに高いレベルを明確に明らかにしている。前炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆ、又はＩＦＮ－γの増大した誘導に繋がる経路の同時の活性化の証拠は存在しない。

【0130】

実施例６：ＤＲ４／ＣＩＩペプチド複合体中のＨｉｓ－タグ：薬理作用への貢献
ポリヒスチジン－タグ（Ｈｉｓ－タグ）、ビオチン化部位、ＴＥＶ切断部位、トロンビン切断部位及びｓｔｒｅｐ－タグの、この組換え複合体のＴ細胞活性化特性への貢献を含む、ＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体に直接的に必須ではない配列は、この構築体から省略することができるかどうかが調べられている。典型的には、ＤＲ４／ＣＩＩペプチド複合体、並びに抗－ＣＤ３抗体（陽性対照）は、標準ハイブリドーマ活性化アッセイにおいて、マイクロタイターウェルのプラスチック表面にコーティングされる。最初の実験において、本発明者らは、ＩＬ－２分泌により測定したＴ－ハイブリドーマ細胞（３Ｈ８）に対する活性化に対する、Ｈｉｓ－タグのタンパク質分解性の切断の作用を調べるために、マイクロタイターウェルにコーティングされた非切断のＤＲ４／ｈＣＩＩペプチド複合体と比べて、ＤＲ４／ｎＣＩＩペプチド複合体の内部ＴＥＶ－切断部位を使用した。タンパク質分解性切断の有効性は、ウェスタンブロット分析により管理した。更に切断及び非切断の複合体の等モル溶液を使用するマイクロタイターウェルの同等のコーティング有効性を、ＤＲ４－特異的抗体及びペルオキシダーゼ－結合した二次抗体を使用するＥＬＩＳＡにより確認した（図８）。これはまた、この複合体は、解離せず、且つヘテロ二量体として存在することを確認している。本発明者らのデータは、Ｔハイブリドーマ細胞のＴＣＲにより認識されたＤＲ４／ｎＣＩＩ複合体の機能ドメインは、プラスチック表面に対する類似の有効性でコーティングされるが、Ｔハイブリドーマ細胞の活性化において、切断された構築体の強力な低下を示している（図８）。ジッパー切断は、この複合体の解離に繋がる高い可能性がある。ジッパーは、生合成プロセス時のこの複合体の形成に、主に必要とされるのに対し、形成されたＭＨＣＩＩ－ペプチド－複合体それ自身は、両鎖の可変領域により形成された結合溝に結合したペプチドの安定化作用のために、少なくともインビトロにおいてかなり安定している。

【0131】

本発明者らは、非切断ＤＲ４／ｎＣＩＩ複合体中のＨｉｓ－タグは、プラスチック表面上の帯電した接触領域と優先的に接触することにより、Ｔ細胞に対しペプチド結合溝を露出する多量体化されたアラインメントの表面上の複合体の正確な配向に必要とされると結論付けた。この結論を確認するために、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖のカルボキシ－末端のＨｉｓ－タグ（６×Ｈｉｓ）のみを欠いているが、その他の点ではＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体と同一である、すなわちＪＵＮ／ＦＯＳヘテロ二量体化ドメインを含む、ＤＲ４／ｈＣＩＩΔＨｉｓ複合体を作製した（図１と比較）。ヒスチジンの正帯電した機能性イミダゾール基による静電相互作用の関与に関する追加の対照として、Ｈｉｓ－タグが負帯電したアミノ酸残基Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ（ＤＥＤ）のトリプレットと置き換えられた、ＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体の更に変異した組換えバリアント（ＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤ）を調製した。同じく本発明者らは、非生理的物質プラスチックを、細胞表面上、滑膜滲出液又はリンパ液などの細胞外体液、並びに関節軟骨もしくは滑膜などの組織中に存在する、帯電した細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分（コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロナン）と交換した。この目的のために、本発明者らは、最初に、マイクロタイターウェルを、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸及びヒアルロナン溶液の高濃度溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）により、コーティングした。これらのコーティングされた表面を、十分に洗浄し、且つ３Ｈ８ハイブリドーマ細胞のインビトロ刺激実験を、ＤＲ４／ＣＩＩペプチド複合体の液相への添加により行い、出力(read-out)として上清中のＩＬ－２濃度を使用した。対照のために、ＥＣＭ－成分が存在しないブロックされた表面を持つマイクロタイタープレートにおいて、並行実験を行った。図９Ａに示された結果は、これらの条件下で、Ｈｉｓ－タグを含む複合体のみが、強力なＩＬ－２反応を誘導したこと、並びにＴ細胞を活性化するその能力は、マイクロタイターウェルの表面にコーティングされたコンドロイチン硫酸に決定的に左右されるように見えるのに対し、ヒアルロナン（ＨＡ）の影響は、より少なく公表され続け（図９Ｂ）、及びヘパリン硫酸についてはほとんど検出不可能である（図９Ｃ）ことを明らかにしている。可溶性ＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤ対照複合体は、マイクロタイターウェルのコンドロイチン硫酸コーティングされた表面の存在下においてＩＬ－２反応を誘導しなかった（図９Ａ）。しかしＨｉｓ－タグ付き複合体の観察された作用は、ポリヒスチジンタグの正帯電したイミダゾール基を介したポリ硫酸化された陰イオン性グリコサミノグリカンの静電相互作用により、簡単に説明することはできず、その理由は、ヘパラン硫酸は同様に、高度の負帯電した硫酸基を含むが、可溶性Ｈｉｓ－タグ付きＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体により刺激された３Ｈ８ハイブリドーマ細胞のＩＬ－２反応を有意に促進するようには見えないからである。従ってこれらの結果は、ポリヒスチジンタグのコンドロイチン硫酸マトリクスとの特異的相互作用は、溶解されたＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体により刺激された３Ｈ８ハイブリドーマ細胞のＩＬ－２反応を増大することを示唆している。

【0132】

３つの異なる濃度（０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌ）でのプラスチック表面への異なるＤＲ４／ｈＣＩＩ構築体の直接コーティングを使用する並行Ｔハイブリドーマ細胞刺激実験において、Ｔｅｖ－切断されたＤＲ４／ｎＣＩＩ複合体により得られた最初の結果が確認された。ＤＲ４／ｈＣＩＩΔＨｉｓ複合体並びに変異されたＤＲ４／ｈＣＩＩ＿ＤＥＤ複合体によるＩＬ－２反応を誘導する能力は、コーティングに０．１ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌを使用すると、強力に減少される。しかしコーティング１ｍｇ／ｍｌを使用すると、１／１０のコーティング濃度での未修飾の複合体（ＤＲ４／ｈＣＩＩ）と同等のレベルの反応が、認められた（図１０）。

【0133】

しかし、これらの実験はまた、全ての構築体は、３Ｈ８ハイブリドーマ細胞のＴＣＲ活性化の必要要件として、ＤＲ４－結合溝中に機能性ペプチドを収容することも明らかにしている。従って、本発明者らの研究は、ＤＲ４／ＣＩＩ複合体中のＨｉｓ－タグは、この複合体の活性を改善することの明白な証拠を提供している。理論により結びつけられるものではないが、Ｈｉｓ－タグは、ＥＣＭ成分コンドロイチン硫酸との相互作用への影響を介して、ＴＣＲ認識のためのペプチド結合溝の改善された空間的配向を提供するように見える。加えて図１１に示した後続の研究は、Ｈｉｓ－タグを含むＤＲ４／ＣＩＩ複合体の、ブロックされたプラスチック表面を持つマイクロタイターウェルの固相中のコンドロイチン硫酸又はヒアルロナンとの相互作用は、Ｔハイブリドーマ細胞によりＩＬ－１０反応を刺激するその能力を増強することができることを明らかにしている。

【0134】

このインビトロデータは、ＤＲ４／ＣＩＩ複合体中のＨｉｓ－タグの、その免疫調節の薬理学的作用に関する重要な機能的役割を裏付けている。更に、Ａｑ発現しているＱＢマウスにおけるＴ細胞依存型ＣＩＩ－誘導型過敏反応のモデルを使用するインビボ試験を行った。ＣＩＩ－予備免疫処置したマウスは、一方の耳への皮内ＣＩＩ注射により、免疫処置後８日目に、Ｔ細胞依存型炎症性膨潤の発達を引き起こし、これは対側の耳へ適用されたビヒクルトリガーにより制御された。ＤＴＨ反応の誘導の前に、これらのマウスは、免疫処置後４日目に、２４時間の皮下ポンプ注入により、その結合溝内に、Ｈｉｓ－タグ含有Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ複合体、Ｈｉｓ－タグを欠くＡｑ／ｇａｌＣＩＩΔＨｉｓ複合体、又は連結された対照ペプチド［クラスＩＩ結合インバリアント鎖：ＣＬＩＰ］を含む対照のＡｑ／ＣＬＩＰ複合体のいずれかを受け取った。図１２に示した結果は、実験的ＣＩＩ－特異的ＤＴＨ－反応により誘導されたＴ細胞に依存した耳膨潤の治療的減少に対する、Ｈｉｓ－タグの機能性影響に関する、明らかな証拠を提供している。従って本発明者らの研究は、Ｔ細胞に対する免疫調節治療効果に関するポリヒスチジン配列を含むＭＨＣＩＩ／ＣＩＩペプチド複合体の改善された機能を一貫して明らかにしており、このことはインビボにおいて細胞表面、組織成分及び体液上の標的化された構造の状況において豊富に利用可能であるＥＣＭ成分との相互作用に対するその影響を介して最も媒介されそうである。

【0135】

実施例７：ＨＥＫ細胞におけるＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ複合体の組換え生成の妨げ
組換えＤＲ４－複合体の結合溝中のペプチドのＣＩＩ配列の翻訳後修飾は、異なる酵素によるいくつかの逐次工程に関与している。これらのコラーゲン－特異的翻訳後修飾は、２６４位及び２７０位のリジン残基に優先的に影響を及ぼす。最初の工程は、リジン水酸化酵素により媒介されたリジン水酸化であり、それに続けてガラクトシル基転移酵素により媒介される水酸化されたリジンへのガラクトシル転移である。更に、単独のグルコース残基が、ガラクトシル化されたヒドロキシリジンへ付加されてよい。これらの工程は全て、ＨＥＫ細胞においてなど、コラーゲンの翻訳後機構により、細胞内で生合成プロセス時に起こり、これによりインビボにおいて軟骨中の天然のＥＣＭ－タンパク質と同等の異質性組換え生成物に繋がる。ヒトにおいて、この混合物は、免疫が媒介した関節疾患を抑制するために、ＩＬ－１０などの抗炎症性メディエーターを産生する制御性細胞への調節に関する全レパトアから動員することができる可能性のあるＴ細胞のスペクトルを増大する目的のために恐らく利点があるであろう。ガラクトシル化されたＣＩＩ（ＤＲ４／ｇａｌＣＩＩ）又は未修飾ＣＩＩ（ＤＲ４／ｎＣＩＩ）のいずれかのペプチドを含む組換えＤＲ４／ＣＩＩ複合体に対する反応における、ＲＡ患者の末梢血由来のＴ細胞のＩＬ－２及びＩＬ－１０反応のインビトロ活性化に関する研究は、この方向での実験的裏付けを提供する。しかし、ＨＥＫ細胞において生成されたＣＲ４／ｈＣＩＩのいくつかのバッチの質量分析は、かなりの量の組換えタンパク質が、両方のリジン残基に高度な二糖（Ｇｌｃ－Ｇａｌ－Ｈｙｌ）含量を示すことを明らかにし（図１３）、これは恐らく、それによりＴＣＲ認識が妨害される、嵩高な糖構造によるペプチド結合溝の占拠に起因したＴＣＲ認識の欠点であろう。

【0136】

特に残基２６４での組換えＤＲ４／ｈＣＩＩ構築体のＣＩＩペプチド配列中のリジン残基のコラーゲン特異的翻訳後ガラクトシル化は、ＴＣＲを介したＴ細胞認識及び生じる薬理学的作用に重要である。２７０位のリジン残基は、ＤＲ４分子の結合溝の端に位置するので、その糖修飾は一般に、ＴＣＲ認識には関与しないとみなされる。異質性並びに２７０位の水酸化されたリジン残基（Ｋ２７０）への糖付着によるＤＲ４結合溝におけるＣＩＩ－ペプチドのＴＣＲ－認識との負の干渉のための可能性のあるリスクを低下するために、Ｋ２７０は、アルギニン残基（Ｒ）へ変異されてよい。この変異は、抗原－特異的Ｔ細胞ハイブリドーマのＴＣＲへの結合に影響を及ぼさないことが先に示されている。

【0137】

更により関連があるのは、２６４位のガラクトシル化されたヒドロキシリジンへのグルコース残基の最終的な転移の防止である。嵩高で可動性の二糖（Ｇｌｃ－Ｇａｌ）は、ＴＣＲ結合と干渉し得るので、この糖部分は恐らく、ＴＣＲ認識に対する負の作用を有するであろう。ＲＡ患者の末梢血由来のＴ細胞のインビトロ刺激は、未修飾の（ｎＣＩＩ）及びモノガラクトシル化されたペプチド（ｇａｌＣＩＩ）は、認識され得ることを示している。グルコース残基のガラクトシル化されたヒドロキシリジンへの転移を触媒する反応は、ガラクトシルヒドロキシリシルグルコシル転移酵素（同義名：プロコラーゲンリシル水酸化酵素(hydroylase)３（ＬＨ３））である。ＬＨ３は、言及されたリジン修飾の最初の工程の前に触媒することも可能である多機能酵素であり、すなわち、水酸化は、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）を生じ、及びガラクトシル転移は、ガラクトシル－ヒドロキシリジン（Ｇａｌ－Ｈｙｌ）を生じる（図１４Ａ）。しかし、その非還元活性は、ガラクトシルヒドロキシリジンへの最終のグルコース転移である。

【0138】

従って本発明者らは、ＬＨ３酵素をノックダウンするように、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を遺伝子操作した。ＣＩＩペプチドにおいてガラクトシルヒドロキシリジンへの最終のグルコシル転移が選択的に欠損されているＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体を生成するためのＨＥＫ細胞株は、組換え生成されたＤＲ４／ｈＣＩＩ複合体の有効性を改善するために有利であると予想される。これは、ＨＥＫ２９３ ＬＨ３ノックアウト細胞を作製することにより、例えばＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ遺伝子編集アプローチを使用する、リジン水酸化酵素３遺伝子をコードしているｐｌｏｄ３遺伝子へ遺伝子破壊する変異を導入することにより、実現することができる。

【0139】

最初の工程において、本発明者らは、組換え発現系の改善により増大した特異的Ｔ細胞活性化活性を伴う異質性の低い生成物を得るためのこの戦略の可能性を調べるために、特異的ｓｈＲＮＡのレンチウイルスのトランスフェクションによりノックダウンされたｐｌｏｄ３を伴うＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞を作製した。形質導入のために、Ｅｘｐｉ２９３細胞を、１２－ウェルプレート中に２００，０００個細胞／ウェルを使用し、播種し、引き続きこれらのプレートを３７℃、８％ＣＯ_２及び１２０ｒｐｍで３時間振盪した。レンチウイルス粒子２００ｕＬ(Sigmaからの特別注文したレンチウイルス粒子）を、１０ｕＬ ＰＥＩｐｒｏトランスフェクション試薬(Polyplus)と混合し、前記細胞へ添加し、且つ３７℃、１２０ｒｐｍ及び８％ＣＯ_２で播種し、更に４時間インキュベーションした。新鮮な培地１ｍＬを添加し、３日間インキュベーションを継続し、その後形質導入効率を分析した。

【0140】

Ｐｌｏｄ３を標的化するｓｈＲＮＡによるレンチウイルス形質導入の３日後、これらの細胞を、２つの部分に分けた。第１部分に、形質導入されなかった細胞を死滅させるためにピューロマイシンを、最終濃度２ｕｇ／ｍＬとなるよう添加し、並びに他方部分は、形質導入効率をチェックするために、フローサイトメトリーにより分析した。これらの細胞を、形質導入されなかった細胞が死滅するまで抗生物質選択圧下に置き、並びに形質導入された細胞を、生存率が９０％を上回るまで、約１８日間分裂させた。これらの安定して形質導入された混合されたプールを、５００ｍＬまで増殖し、前述のようにＤＲ４／ｈＣＩＩによりトランスフェクションした。精製後、質量分析によるグリカン分析を行い、ｐｌｏｄ３ノックダウンＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞及びＥｘｐｉ２９３Ｆ対照細胞におけるガラクトシルヒドロキシリシル残基のグルコシル化の減少を調べた。ＩＩ型コラーゲンエピトープ内の両方のリジン（Ｋ２６４及びＫ２７０）を分析した。グルコ－ガラクトシルヒドロキシリシル残基（ＤｉＨｅｘ）の明らかな減少が、Ｅｘｐｉ２９３のＫＯ細胞において可視化された（図１４Ｃ）。

【0141】

その一方で、安定して形質導入された細胞を、希釈し、且つミニプール作製のために、９６－ウェルプレート上に播種した。播種のプロセスにおいて、これらの細胞は、選択圧の下で成長させ、４０のミニプールを単離した。これらの細胞を増殖させ、ＰＬＯＤ３発現を、細胞溶解液においてウェスタンブロットにより決定し、Ｐｌｏｄ３の効率的ノックダウンを証明した。１×１０^６個レンチウイルス形質導入されたＥｘｐｉ２９３Ｆミニプール由来の溶解液を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上に装加した。成功したノックダウンのウェスタンブロット分析を、抗－ＰＬＯＤ３抗体(Thermo Fisher PAS-48435)及び二次抗－ウサギＨＲＰ抗体を用いて行った。ＰＬＯＤ３は、理論的分子量８４ｋＤａを有する。クローン＃４、＃１８及び＃２０は、効率的Ｐｌｏｄ３ノックダウンを示し、従って更なる増殖及び実験に使用した。クローン１８は、生存率の低下のために喪失し、クローン４及び２０を、更なる生成のために選択し、グリカン分析が進行中である。

【0142】

実施例８：β鎖を含む配列のＣ－端側に交互に正帯電したアミノ酸－タグを伴うＡｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩ構築体
先に示したように、ＤＲ４／ｎＣＩＩ複合体中のＨｉｓ－タグは、Ｔ細胞に対しペプチド結合溝を露出している多量体化されたアラインメント中の表面上のこの複合体の正確な配向を可能にするように見え、並びにＨｉｓ－タグの有益な作用は、ＤＴＨモデルでインビボにおいて確認されている。従って本発明者らは、類似の作用を媒介する代替タグについて探索した。この探索に関する基本的な考察は、この構築体中で使用した６×Ｈｉｓ－配列は、非天然構造であることであり、従って本発明者らは、免疫－調節性ＭＨＣＩＩ／ＣＩＩペプチド複合体においてＨｉｓ－タグと置き換わることができるヒト自己－タンパク質における配列を探索した。従って、機能的に等効力の自己－構造によるＨｉｓ－タグ置き換えは、可能性のある免疫原性の低下を目的としている。中でも、機能的に関連のある塩基性アミノ酸残基の比較的高い含有量及び自己免疫認識を恐らく減らす進化で保存された構造を持つ候補となる自己－タンパク質は、ヒストンファミリーのタンパク質であった。

【0143】

従って例えばコンドロイチン硫酸における、負帯電した硫酸化された糖構造との可能性のある相互作用のために塩基性アミノ酸残基を含む自己タンパク質における配列に関する本発明者らの探索において、本発明者らは、マウスとヒトの間で保存されたＮ－端側(SGRGKQGGKARAKAKTRSSR；配列番号：３４）、並びにカルボキシ－端側(HKAKGK)の各候補領域の両方でヒトヒストン２ Ａ１の配列において同定した（図１５）。代替Ｃ－端側タグを使用し、ＡＱ／ｇａｌ２６４ＣＩＩ－ペプチド複合体を特異的に認識するＴ細胞ハイブリドーマＨＣＱ．３の活性化を、図１６に示している。本発明者らは、Ｔ細胞活性化特性に対するＨｉｓ－タグの置き換えとして、図１６の上側に描いたような、Ａｑ－複合体のβ鎖を含む配列のＣ－末端に結合した様々な代替配列の影響を調べた。ヒストンＮＴ－タグ(SGRGKQGGKARAKAKTRSSR)及びヒストンＣＴ－タグ(HKAKGK)に加え、６個の交互のＮＨモチーフを含む修飾されたＨｉｓ－タグ(NHNHNHNHNHNH、配列番号：３５）を試験した。この目的のために、ハイブリドーマ刺激アッセイを、標準条件下で行った：Ａｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩペプチド複合体は、マイクロタイターウェルのプラスチック表面にコーティングし、且つ特異的細胞活性化の測定として、ＩＬ－２分泌をＥＬＩＳＡにより決定する。Ｈｉｓ－タグ付きＡｑ／ｇａｌ２６４ＣＩＩ（Ｈｉｓ）を、陽性対照として使った。図１６に示したように、ヒストンＮＴ－タグ付きバリアントは、濃度範囲０．０１～１μｇ／ｍＬで、陽性対照と同等である、Ｔ細胞刺激活性を示した。ヒストンＣＴ－タグバリアント、並びに修飾されたＨｉｓ－タグは、ＨＣＱ．３細胞の活性化の効果は低かったが、Ｈｉｓ－タグを欠き及び何らかの置き換えを伴わない構築体と比べると、依然小さい作用を示した。従って各ＨＩＳ－タグ付き複合体と比較した、Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ複合体の融合構築体中の両方のヒストン２Ａ１配列の予備的インビトロ試験は、Ｎ－端側配列（ＮＴ）：SGRGKQGGKARAKAKTRSSRは、Ｈｉｓ－タグと同等に機能的であるのに対し、ヒストン２Ａ１のＣ－端側配列（ＣＴ）は、小さい作用を示すのみであり、並びに修飾されたヒストンタグは、中間の作用を示したことを明らかにした。本発明者らは、正帯電したアミノ酸の数は重要であり（少なくとも６個の正帯電したアミノ酸）及び連続する正帯電したアミノ酸はより有益であることを推測した。交互に正帯電したアミノ酸の場合、リジン（ｐＫ１０．５）及びアルギニン（ｐＫ１２．５）などのより塩基性のアミノ酸は、ヒスチジン（ｐＫ６．０）よりも好ましいように見える。

【0144】

一貫して、Ａｑ発現しているＱＢマウスでのＴ細胞－依存型ＣＩＩ－誘導した過敏反応のモデルにおける予備的インビボ試験は、Ｈｉｓ－タグがＨ２Ａ１－由来のＮＴ－配列により置き換えられているＭＨＣＩＩ／ＣＩＩ複合体の機能的に等効力の免疫調節の薬理学的作用を明らかにした。ＣＩＩ－予備免疫処置されたマウスは、一方の耳への皮内ＣＩＩ注射により、免疫処置後８日目に、Ｔ細胞依存型炎症性膨潤を引き起こし、これは対側の耳へ適用されたビヒクルトリガーにより制御された。ＤＴＨ反応の誘導の前に、このマウスは、免疫処置後４日目に、２４時間のｓｃ．ポンプ注入により、その結合溝内に、Ｈｉｓ－タグ含有Ａｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩ複合体（Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ－Ｈｉｓ）、Ｈｉｓ－タグを欠くＡｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩ複合体（Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ－ΔＨｉｓ）、又はＨ２Ａ１－由来の配列を含むＡｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩ複合体（Ａｑ／ｇａｌＣＩＩ－ヒストンＮＴ）のいずれかを受け取った。その結合溝中で連結された対照ペプチドを含むＨｉｓタグ付きＡｑ－複合体［クラスＩＩ結合インバリアント鎖：ＣＬＩＰ］を、陰性対照として本試験に含んだ。図１７に示したように、これらの結果は、治療的Ａｑ／ｇａｌ２６４ ＣＩＩ複合体中のＨｉｓ－タグとＮＴ－配列の機能的同等性を明らかにしている。

【0145】

配列表：
配列番号：1 AGFKGEQGPKG
配列番号：2 AGFKGEQGPXG
配列番号：3 AGFKGEX₂GPKG
配列番号：4 AGFKGX₃QGPKG
配列番号：5 AGFKX₄EQGPKG
配列番号：6 AGFKGEX₂GPX₁G
配列番号：7 AGFKGX₃QGPX₁G
配列番号：8 AGFKX₄EQGPX₁G
配列番号：9 AGFKGEQGPRG
配列番号：10 AGFKGEQGPKGEP
配列番号：11 AGFKGEQGPX₁GEP
配列番号：12 AGFKGEQGPRGEP
配列番号：13 GIAGFKGEQGPKGEP
配列番号：14 GIAGFKGEQGPX₁GEP
配列番号：15 GIAGFKGEQGPRGEP
配列番号：16 DR4構築体α鎖
配列番号：17 hCII259-273ペプチドを伴うDR4構築体β鎖
配列番号：18 最小DR4構築体α鎖
配列番号：19 hCII259-273ペプチドを伴う最小DR4構築体β鎖
配列番号：20 hCLIPmutを伴うDR4構築体β鎖
配列番号：21 Aq構築体α鎖
配列番号：22 ラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号：23 His-タグを持たないラットCII259-273ペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号：24 mCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号：25 His-タグを持たないmCLIPペプチドを伴うAq構築体β鎖
配列番号：26 cFosドメイン
配列番号：27 cJuneドメイン
配列番号：28 修飾されたヒトCLIP-ペプチド
配列番号：29 ラットCII-ペプチド259-273
配列番号：30 ストレプトアビジン-タグ
配列番号：31 EKRIWFPYRRF
配列番号：32 YKTNFRRYYRF
配列番号：33 VLIRHFRKRYY
配列番号：34 SGRGKQGGKARAKAKTRSSR
配列番号：35 NHNHNHNHNHNH
配列番号：36 KDHLIHNVHKEEHAHAHNK
配列番号：37 H2A1_ヒト
配列番号：38 H2A1P_マウス
配列番号：39 SAWSHPQFEKGIAGFKGEQGPKGEPSGGGS
配列番号：40 H₂ACタグ
配列番号：41 6×His
配列番号：42 7×His

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2022543076000001.app

【国際調査報告】