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特表2022-543236エクソン４４標的化核酸およびジストロフィンベースのミオパチーの治療のための当該核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-11
(54)【発明の名称】エクソン４４標的化核酸およびジストロフィンベースのミオパチーの治療のための当該核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20221003BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221003BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20221003BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221003BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221003BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20221003BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221003BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221003BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20221003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
C12N5/10
C12N7/01
A61K31/7088
A61K48/00
A61P21/04
A61K35/76
C12N15/13 ZNA
C12N15/864 100Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022506614
(86)(22)【出願日】2020-08-03
(85)【翻訳文提出日】2022-02-28
(86)【国際出願番号】 US2020044755
(87)【国際公開番号】W WO2021026075
(87)【国際公開日】2021-02-11
(31)【優先権主張番号】62/882,216
(32)【優先日】2019-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウェイン， ニコラス セバスティアン
(72)【発明者】
【氏名】フラニガン， ケビン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA02
4B065BA06
4B065BA30
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA94
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA94
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA94
(57)【要約】
本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの治療のための遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、Ｕ７ベース核内低分子リボ核酸（ＲＮＡ）（ｓｎＲＮＡ）、Ｕ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を含む、核酸、およびＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える任意の突然変異を含むが、これに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）のスキッピングに適した突然変異に起因する、ＤＭＤを含むが、これに限定されない、筋ジストロフィーの治療における使用のためのエクソンスキッピングを誘導するＵ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を送達する核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４をコードするポリヌクレオチドに結合するか、または相補的であり、前記エクソン４４をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１もしくは２に示されるヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
【請求項2】
配列番号４、５、６、７、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つに結合するか、または相補的である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項4】
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項5】
配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項6】
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子のうちの少なくとも１つを含むゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項8】
前記ゲノムが、自己相補的ゲノムまたは一本鎖ゲノムである、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項9】
前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ－１、ｒＡＡＶ－２、ｒＡＡＶ－３、ｒＡＡＶ－４、ｒＡＡＶ－５、ｒＡＡＶ－６、ｒＡＡＶ－７、ｒＡＡＶ－８、ｒＡＡＶ－９、ｒＡＡＶ－１０、ｒＡＡＶ－１１、ｒＡＡＶ－１２、ｒＡＡＶ－１３、ｒＡＡＶ－ｒｈ７４、またはｒＡＡＶ－ａｎｃ８０である、請求項７または８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項10】
前記ｒＡＡＶのゲノムが、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く、請求項７～９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項11】
ＡＡＶ－１カプシド、ＡＡＶ－２カプシド、ＡＡＶ－３カプシド、ＡＡＶ－４カプシド、ＡＡＶ－５カプシド、ＡＡＶ－６カプシド、ＡＡＶ－７カプシド、ＡＡＶ－８カプシド、ＡＡＶ－９カプシド、ＡＡＶ－１０カプシド、ＡＡＶ－１１カプシド、ＡＡＶ－１２カプシド、ＡＡＶ－１３カプシド、ＡＡＶ－ｒｈ７４カプシド、またはＡＡＶ－ａｎｃ８０カプシドをさらに含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項12】
細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための方法であって、前記方法が、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子を前記細胞に提供することを含む、方法。
【請求項13】
細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための方法であって、前記方法が、請求項７～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを前記細胞に提供することを含む、方法。
【請求項14】
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）をスキップするのに適した突然変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するための方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子のうちの少なくとも１つを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項15】
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）をスキップするのに適した突然変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するための方法であって、請求項７～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶのうちの少なくとも１つを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項16】
前記突然変異が、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える任意の突然変異である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記突然変異が、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５～５６の欠失である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記投与することが、前記対象におけるジストロフィンタンパク質の増加した発現をもたらす、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記投与することが、前記対象におけるジストロフィー病理の進行を阻害する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記投与することが、前記対象における筋機能を改善する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記筋機能の改善が、筋力の改善である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記筋機能の改善が、立位および歩行における安定性の改善である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）をスキップするのに適した突然変異を有する対象における筋ジストロフィーの治療、改善、および／または予防における、請求項１～６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの核酸分子の使用。
【請求項24】
ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）をスキップするのに適した突然変異を有する対象における筋ジストロフィーの治療、改善、および／または予防における、請求項７～１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのｒＡＡＶの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２日に出願された、先行米国仮出願第６２／８８２，２１６号の利益を主張し、その開示は、参照によってその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１８年８月２日に出願された、先行米国仮出願第６２／８８２，２１６号の利益を主張し、その開示は、参照によってその全体が組み込まれる。
【0002】
本開示は、筋ジストロフィーの治療のための遺伝子療法の分野に関する。より具体的には、本開示は、Ｕ７ベース核内低分子リボ核酸（ＲＮＡ）（ｓｎＲＮＡ）、Ｕ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を含む、核酸、およびＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える任意の突然変異を含むが、これに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）をスキップするのに適した突然変異に起因する筋ジストロフィーの治療における使用のためのエクソンスキッピングを誘導するＵ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を送達する核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
【0003】
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５４３１３Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：２２，７７１バイト、作成：２０２０年８月３日）を含有し、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：５４３１３Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、サイズ：２２，７７１バイト、作成：２０２０年８月３日）を含有し、これは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、主に随意筋に影響を与える遺伝性変性疾患群である。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。
【0005】
ＭＤは、個人、家族、およびコミュニティに深刻な影響を与える、特定可能な治療のない疾患群である。コストは計り知れない。個人は、自尊心の喪失に関連する感情的な緊張および低減した生活の質に苦しむ。手足の機能の喪失に起因する極度の身体的困難は、日常生活の動作において苦難をもたらす。家族関係は、経済的損失および対人関係への課題によって苦しむ。影響を受けた兄弟は身動きがとれないと感じ、配偶者間の争いは、特に、筋ジストロフィーの責任が親パートナーの一方の足元に置かれ得る場合、しばしば離婚につながる。治療法を見つけるための探求の負荷は、多くの場合、人生のあらゆる側面を損ない、試す、生涯にわたる非常に集中した努力となる。家族を超えて、コミュニティは、特殊教育、特殊輸送、ならびに再発性気道感染症および心合併症を治療するための再入院のコストにおける筋ジストロフィー人口のハンディキャップに対応する追加施設の必要性による経済的負荷を負う。経済的責任は、州および連邦政府機関によって共有され、納税者コミュニティに責任が拡大される。
【0006】
ＭＤの１つの形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。これは、５０００人に１人の新生男児に影響を与える最も一般的な重度小児形態の筋ジストロフィーである。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子における突然変異によって引き起こされ、骨格筋および心筋、ならびに胃腸管および網膜におけるジストロフィンタンパク質（４２７ＫＤａ）の不在をもたらす。ジストロフィンは、筋鞘を伸張性収縮から保護するだけでなく、筋鞘のすぐ近くに多数のシグナル伝達タンパク質を固定する。ＭＤの別の形態は、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である。ＢＭＤは、ＤＭＤと同様に、体の筋肉を徐々に弱く、小さくする遺伝性疾患である。ＢＭＤは、臀部、骨盤、大腿部、および肩、ならびに心臓の筋肉に影響を及ぼすが、ＤＭＤほど深刻な問題を引き起こさないことが知られている。
【0007】
ＤＭＤの多くの臨床例は、ＤＭＤ遺伝子の欠失突然変異に関連している。欠失突然変異とは対照的に、ＤＭＤエクソン重複は、ジストロフィノパチー患者の偏りのない試料における疾患を引き起こす突然変異の約５％を占めるが［Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，１３４（３）：２９５－２９８（２００５）］、突然変異のいくつかのカタログでは、１１％であった、Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．［Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，３０（１２）：１６５７－１６６６（２００９）］によるＵｎｉｔｅｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｏｐａｔｈｙ Ｐｒｏｊｅｃｔによって発表されたものを含み、重複の数が多い。ＢＭＤはまた、タンパク質を過度に短くする、ジストロフィン遺伝子の変化によって引き起こされる。欠陥のあるジストロフィンは、通常の使用で筋細胞を損傷の危険にさらす。２０１２年３月２９日に公開された、米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号、２０１３年３月２１日に公開された、同第２０１３／００７２５４１号、および２０１３年２月２１日に公開された、同第２０１３／００４５５３８号も参照されたい。
エクソン４５の欠失は、ＤＭＤ患者に見られる最も一般的な欠失のうちの１つであるが、エクソン４４および４５の欠失は、一般にＢＭＤに関連している［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１：３２－４０（２０１４）］。したがって、エクソン４４がこれらのＤＭＤ患者の転写産物であるプレメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でバイパスされ得る場合、これはリーディングフレームを復元し、部分的に機能するＢＭＤ様ジストロフィンの産生を可能にするであろう［Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２７（５）：２５１－２５９（２０１７）］。実際、エクソン４５に隣接する欠失を有する多くの患者は、非常に低いレベルであるが、エクソン４４を自発的なスキップが見える。これは、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較される場合、わずかに増加したレベルのジストロフィンをもたらし、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較して、これらの患者において観察される重症度の低い疾患進行の根底にある可能性が最も高い［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８３４００（２０１４）、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ １：９１－９４（２０１４）］。
ＤＭＤ遺伝子の特定に続く多くの研究ラインにもかかわらず、治療選択肢は限定される。したがって、ＤＭＤを含む、ＭＤのための治療について当該技術分野には必要性が残っている。最も先進的な療法には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）媒介性エクソンスキッピングなどの突然変異特異的遺伝子アプローチを使用して、欠損したタンパク質、ジストロフィンの復元を目的としたものが含まれる。
エクソン４５の欠失は、ＤＭＤ患者に見られる最も一般的な欠失のうちの１つであるが、エクソン４４および４５の欠失は、一般にＢＭＤに関連している［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１：３２－４０（２０１４）］。したがって、エクソン４４がこれらのＤＭＤ患者の転写産物であるプレメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）でバイパスされ得る場合、これはリーディングフレームを復元し、部分的に機能するＢＭＤ様ジストロフィンの産生を可能にするであろう［Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２７（５）：２５１－２５９（２０１７）］。実際、エクソン４５に隣接する欠失を有する多くの患者は、非常に低いレベルであるが、エクソン４４を自発的なスキップが見える。これは、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較される場合、わずかに増加したレベルのジストロフィンをもたらし、他の欠失を有するＤＭＤ患者と比較して、これらの患者において観察される重症度の低い疾患進行の根底にある可能性が最も高い［Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８３４００（２０１４）、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ １：９１－９４（２０１４）］。
ＤＭＤ遺伝子の特定に続く多くの研究ラインにもかかわらず、治療選択肢は限定される。したがって、ＤＭＤを含む、ＭＤのための治療について当該技術分野には必要性が残っている。最も先進的な療法には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）媒介性エクソンスキッピングなどの突然変異特異的遺伝子アプローチを使用して、欠損したタンパク質、ジストロフィンの復元を目的としたものが含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１２／００７７８６０号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１３／００７２５４１号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２０１３／００４５５３８号明細書
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｄｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，１３４（３）：２９５－２９８（２００５）
【非特許文献2】Ｆｌａｎｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ，３０（１２）：１６５７－１６６６（２００９）
【非特許文献3】Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ ７１：３２－４０（２０１４）
【非特許文献4】Ａａｒｔｓｍａ－Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２７（５）：２５１－２５９（２０１７）
【非特許文献5】Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ８３４００（２０１４）
【非特許文献6】ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓ １：９１－９４（２０１４）
【発明の概要】
【0010】
本開示は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える任意の突然変異を含むが、これに限定されない、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４（ＤＭＤエクソン４４）のスキッピングに適した突然変異を含む筋ジストロフィーを治療、改善、その進行を遅延、および／または予防するための新規遺伝子療法のための製品、方法、および使用を提供する。より具体的には、本開示は、核酸、Ｕ７ベース核内低分子リボ核酸（ＲＮＡ）（ｓｎＲＮＡ）、およびＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５－５６の欠失に起因する筋ジストロフィーの治療における使用のためのジストロフィンタンパク質の改変形態を提供するエクソンスキッピングを誘導するＵ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を送達する核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
【0011】
本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４をコードするポリヌクレオチドに結合するか、または相補的である核酸分子を提供し、ＤＭＤエクソン４４をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１もしくは２に示されるヌクレオチド配列を含むか、もしくはそれからなるか、または配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする。
【0012】
本開示は、配列番号４、５、６、７、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つに結合するか、または相補的である、核酸分子を提供する。
【0013】
本開示は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を提供する。本開示は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、３２、３３、３４、または３５に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を提供する。
【0014】
本開示は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を提供する。本開示は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を提供する。
【0015】
本開示は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを含むゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶのゲノムは、自己相補的ゲノムまたは一本鎖ゲノムである。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ－１、ｒＡＡＶ－２、ｒＡＡＶ－３、ｒＡＡＶ－４、ｒＡＡＶ－５、ｒＡＡＶ－６、ｒＡＡＶ－７、ｒＡＡＶ－８、ｒＡＡＶ－９、ｒＡＡＶ－１０、ｒＡＡＶ－１１、ｒＡＡＶ－１２、ｒＡＡＶ－１３、ｒＡＡＶ－ｒｈ７４、またはｒＡＡＶ－ａｎｃ８０である。いくつかの態様では、本開示は、ｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。いくつかの態様では、本開示は、ｒＡＡＶを提供し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ－１カプシド、ＡＡＶ－２カプシド、ＡＡＶ－３カプシド、ＡＡＶ－４カプシド、ＡＡＶ－５カプシド、ＡＡＶ－６カプシド、ＡＡＶ－７カプシド、ＡＡＶ－８カプシド、ＡＡＶ－９カプシド、ＡＡＶ－１０カプシド、ＡＡＶ－１１カプシド、ＡＡＶ－１２カプシド、ＡＡＶ－１３カプシド、ＡＡＶ－ｒｈ７４カプシド、またはＡＡＶ－ａｎｃ８０カプシドをさらに含む。
【0016】
本開示は、細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを細胞に提供することを含む。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの２つ以上を細胞に提供することを含む。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶを細胞に提供する、を含む。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの２つ以上を含むｒＡＡＶを細胞に提供する、を含む。
【0017】
本開示は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを対象に投与することを含む、ＤＭＤエクソン４４スキッピングに適した任意の突然変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するための方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つを含むｒＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、方法は、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの２つ以上を含むｒＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、ＤＭＤエクソン４４スキッピングに適した突然変異は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与えるＤＭＤ遺伝子配列における突然変異である。いくつかの態様では、突然変異は、エクソン１－４３、２－４３、３－４３、４－４３、５－４３、６－４３、７－４３、８－４３、９－４３、１０－４３、１１－４３、１２－４３、１３－４３、１４－４３、１５－４３、１６－４３、１７－４３、１８－４３、１９－４３、２０－４３、２１－４３、２２－４３、２３－４３、２４－４３、２５－４３、２６－４３、２７－４３、２８－４３、２９－４３、３０－４３、３１－４３、３２－４３、３３－４３、３４－４３、３５－４３、３６－４３、３７－４３、３８－４３、３９－４３、４０－４３、４１－４３、４２－４３、４３－４５、４５－４６、４５－４７、４５－４８、４５－４９、４５－５０、４５－５１、４５－５２、４５－５３、４５－５４、４５－５５、４５－５６、４５－５７、４５－５８、４５－５９、４５－６０、４５－６１、４５－６２、４５－６３、４５－６４、４５－６５、４５－６６、４５－６７、４５－６８、４５－６９、４５－７０、４５－７１、４５－７２、４５－７３、４５－７４、４５－７５、４５－７６、４５－７７、および４５－７８の欠失、ならびに／またはエクソン４４の重複である。いくつかの態様では、突然変異は、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５－５６の欠失である。いくつかの態様では、投与することは、対象におけるジストロフィンタンパク質の改変形態またはジストロフィンタンパク質の機能的に活性である改変形態もしくは断片の増加した発現を含むが、これに限定されない、ジストロフィンタンパク質の増加した発現をもたらす。いくつかの態様では、投与することは、対象におけるジストロフィー病理の進行を阻害する。いくつかの態様では、投与することは、対象における筋機能を改善する。いくつかの態様では、そのような筋機能の改善は、筋力の改善である。いくつかの態様では、そのような筋機能の改善は、立位および歩行における安定性の改善である。
【0018】
本開示は、細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つの使用を提供する。いくつかの態様では、細胞は、対象内に見られるか、またはＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異を有する対象から単離される。いくつかの態様では、核酸分子は、ｒＡＡＶで提供される。いくつかの態様では、本明細書に開示もしくは記載される様々な核酸分子のうちの２つ以上、または本明細書に開示もしくは記載される様々な核酸分子の組み合わせは、ｒＡＡＶにおいて提供される。
【0019】
本開示は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異を有する対象における筋ジストロフィーの治療、改善、および／または予防における、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つの使用を提供する。本開示は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異を有する対象における筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するための医薬品の調製における、本明細書に開示または記載される核酸分子のうちの少なくとも１つの使用を含む。いくつかの態様では、核酸分子は、ｒＡＡＶで提供される。いくつかの態様では、本明細書に開示もしくは記載される様々な核酸分子のうちの２つ以上、または本明細書に開示もしくは記載される様々な核酸分子の組み合わせは、ｒＡＡＶにおいて提供される。いくつかの態様では、突然変異は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える配列における突然変異である。いくつかの態様では、突然変異は、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５－５６の欠失である。いくつかの態様では、使用は、ジストロフィンタンパク質の増加した発現、またはジストロフィンタンパク質の機能的活性を有するジストロフィンタンパク質の改変形態の増加した発現をもたらす。いくつかの態様では、使用は、ジストロフィー病理の進行を阻害する。いくつかの態様では、使用は、筋機能を改善する。いくつかの態様では、筋機能の改善は、筋力の改善である。いくつかの態様では、筋機能の改善は、立位および歩行における安定性の改善である。
【0020】
本開示の他の特徴および利点は、以下の図面の説明および詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、図面、詳細な説明、および特定の例は、開示される主題の実施形態を示すが、本開示の趣旨および範囲内である様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかになるため、単に例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1A】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図1B】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図1C】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図1D】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図1E】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図1F】図１Ａ～図１Ｆは、Ｄｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ、およびＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤの様々なウイルス構築物での形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを示す。図１Ａは、ＳＤ４４、ＬＥＳＥ４４、またはＳＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。ＳＤ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように、エクソンスキッピングを示す。ＬＥＳＥ４４またはＳＥＳＥ４４で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５－５６およびＤｅｌ４４－５６においてバンドによって示されるように、部分的なエクソンスキッピングを示す。図１Ｂは、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、ＳＤ４４、およびＢＰ４３ＡＳ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示す。図１Ｃは、ＳＤ４４、ＢＰ４３ＡＳ４４、およびＬＥＳＥ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤはエクソンスキッピングを示すが、ＳＤ４４は最大量のエクソンスキッピングを示すように見える。図１Ｄは、ＳＤ４４、４Ｘ－ＳＤ４４、またはＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す［Ｄｅｌ４５－５６（未処理）およびＤｅｌ ４４－５６（処理済み）］。すべての構築物で処理されたＤｅｌ４５－５６ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、すべての３つの構築物でＤｅｌ４４－５６において強いバンドによって示されるように強いエクソンスキッピングを示し、最も強力なバンドは、４Ｘ－ＳＤ４４およびＳＤ４４－スタッファー構築物で処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤに見られる。図１Ｅは、４Ｘ－ＳＤ４４、ＳＤ４４－スタッファー、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、Ｄｅｌ４５ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤで強いエクソン４４スキップを示す。図１Ｅは、ＳＤ４４－スタッファー、４Ｘ－ＳＤ４４、およびＳＤ４４構築物で処理されたＤｕｐ４４ ＦｉｂｒｏＭｙｏＤのＲＴ－ＰＣＲを示す［Ｄｅｌ４５（未処理）およびＤｅｌ ４４－４５（処理済み）］。すべての処理されたＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、強いエクソンスキッピングを示し、ＳＤ４４－スタッファーおよび４Ｘ－ＳＤ４４の両方が、これらの実験で最大量のエクソンスキッピングを示す。
【図2】３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス＃５７および＃５８（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス）におけるエクソンスキッピングの不在、マウス＃６０および＃６１（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス）における効率的なエクソンスキッピング、マウス＃６６および＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス）における効率的なエクソンスキッピング、ならびにマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス）における効率的なエクソンスキッピングを示した。Ｂｌａｃｋ ６（Ｂｌ６）マウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであり、したがって、ヒトＤＭＤの陰性対照である。
【図3A】図３Ａ～図３Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の３か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理マウス）から、マウス＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたマウス、図３Ｄ）から、およびマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたマウス、図３Ｅ）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、この免疫蛍光実験で使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。１か月の処理後、免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（図３Ｄ）および４Ｘ－ＳＤ４４ベクター（図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。図３Ａは、未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィン発現がないことを示す。図３Ｂは、抗体がマウスジストロフィンと反応するため、Ｂｌ６モデルにおけるジストロフィンの発現を示す。
【図3B】図３Ａ～図３Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の３か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理マウス）から、マウス＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたマウス、図３Ｄ）から、およびマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたマウス、図３Ｅ）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、この免疫蛍光実験で使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。１か月の処理後、免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（図３Ｄ）および４Ｘ－ＳＤ４４ベクター（図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。図３Ａは、未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィン発現がないことを示す。図３Ｂは、抗体がマウスジストロフィンと反応するため、Ｂｌ６モデルにおけるジストロフィンの発現を示す。
【図3C】図３Ａ～図３Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の３か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理マウス）から、マウス＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたマウス、図３Ｄ）から、およびマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたマウス、図３Ｅ）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、この免疫蛍光実験で使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。１か月の処理後、免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（図３Ｄ）および４Ｘ－ＳＤ４４ベクター（図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。図３Ａは、未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィン発現がないことを示す。図３Ｂは、抗体がマウスジストロフィンと反応するため、Ｂｌ６モデルにおけるジストロフィンの発現を示す。
【図3D】図３Ａ～図３Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の３か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理マウス）から、マウス＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたマウス、図３Ｄ）から、およびマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたマウス、図３Ｅ）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、この免疫蛍光実験で使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。１か月の処理後、免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（図３Ｄ）および４Ｘ－ＳＤ４４ベクター（図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。図３Ａは、未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィン発現がないことを示す。図３Ｂは、抗体がマウスジストロフィンと反応するため、Ｂｌ６モデルにおけるジストロフィンの発現を示す。
【図3E】図３Ａ～図３Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の３か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理マウス）から、マウス＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたマウス、図３Ｄ）から、およびマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたマウス、図３Ｅ）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、この免疫蛍光実験で使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。１か月の処理後、免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（図３Ｄ）および４Ｘ－ＳＤ４４ベクター（図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。図３Ａは、未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスにおいてジストロフィン発現がないことを示す。図３Ｂは、抗体がマウスジストロフィンと反応するため、Ｂｌ６モデルにおけるジストロフィンの発現を示す。
【図4】３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。１か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４スタッファーベクターが筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。これらのウエスタンブロット結果は、マウス＃５７および＃５８（未処理ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウス）から、マウス＃６０および＃６１（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７）が注射されたｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウス）から、マウス＃６６および＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３）が注射されたｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウス）から、ならびにマウス＃８４（Ｕ７－４ｘ－ＳＤ４４（配列番号２６）が注射されたｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウス）から得た。Ｂｌ６は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。
【図5A】図５Ａ～図５Ｅは、注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なエクソンスキッピング、タンパク質復元、および筋力改善を示す。図５Ａは、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図５Ａは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーウイルスベクターの注射後３か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各前脛骨（ＴＡ）で実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスｎ＝６のＴＡ筋）における非常にまれなエクソンスキッピング、およびマウス（ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーが注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（ｎ＝６のＴＡ筋、配列番号２７）における効率的なエクソンスキッピングを示した。ＷＴマウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないが、マウスＤＭＤ遺伝子を含有する野生型マウスであり、したがって、このＷＴマウスは、陽性対照である。図５Ｂは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーの注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＴＡ筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、３匹のマウスの各ＴＡで実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。３か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）による感染後に発現されたことを示した。これらのウエスタンブロット結果は、マウス、すなわち、注射された６つのＴＡのうちの３つから得た。ＷＴは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。図５Ｃ～Ｅは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）の注射後３か月の筋力の改善を示す。図５Ｃは、ハングワイヤの改善を示し、図５Ｄは、比力を示し、図５Ｅは、注射後３か月の伸張性収縮を示す。
【図5B】図５Ａ～図５Ｅは、注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なエクソンスキッピング、タンパク質復元、および筋力改善を示す。図５Ａは、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図５Ａは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーウイルスベクターの注射後３か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各前脛骨（ＴＡ）で実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスｎ＝６のＴＡ筋）における非常にまれなエクソンスキッピング、およびマウス（ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーが注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（ｎ＝６のＴＡ筋、配列番号２７）における効率的なエクソンスキッピングを示した。ＷＴマウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないが、マウスＤＭＤ遺伝子を含有する野生型マウスであり、したがって、このＷＴマウスは、陽性対照である。図５Ｂは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーの注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＴＡ筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、３匹のマウスの各ＴＡで実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。３か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）による感染後に発現されたことを示した。これらのウエスタンブロット結果は、マウス、すなわち、注射された６つのＴＡのうちの３つから得た。ＷＴは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。図５Ｃ～Ｅは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）の注射後３か月の筋力の改善を示す。図５Ｃは、ハングワイヤの改善を示し、図５Ｄは、比力を示し、図５Ｅは、注射後３か月の伸張性収縮を示す。
【図5C】図５Ａ～図５Ｅは、注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なエクソンスキッピング、タンパク質復元、および筋力改善を示す。図５Ａは、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図５Ａは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーウイルスベクターの注射後３か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各前脛骨（ＴＡ）で実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスｎ＝６のＴＡ筋）における非常にまれなエクソンスキッピング、およびマウス（ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーが注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（ｎ＝６のＴＡ筋、配列番号２７）における効率的なエクソンスキッピングを示した。ＷＴマウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないが、マウスＤＭＤ遺伝子を含有する野生型マウスであり、したがって、このＷＴマウスは、陽性対照である。図５Ｂは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーの注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＴＡ筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、３匹のマウスの各ＴＡで実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。３か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）による感染後に発現されたことを示した。これらのウエスタンブロット結果は、マウス、すなわち、注射された６つのＴＡのうちの３つから得た。ＷＴは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。図５Ｃ～Ｅは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）の注射後３か月の筋力の改善を示す。図５Ｃは、ハングワイヤの改善を示し、図５Ｄは、比力を示し、図５Ｅは、注射後３か月の伸張性収縮を示す。
【図5D】図５Ａ～図５Ｅは、注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なエクソンスキッピング、タンパク質復元、および筋力改善を示す。図５Ａは、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図５Ａは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーウイルスベクターの注射後３か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各前脛骨（ＴＡ）で実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスｎ＝６のＴＡ筋）における非常にまれなエクソンスキッピング、およびマウス（ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーが注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（ｎ＝６のＴＡ筋、配列番号２７）における効率的なエクソンスキッピングを示した。ＷＴマウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないが、マウスＤＭＤ遺伝子を含有する野生型マウスであり、したがって、このＷＴマウスは、陽性対照である。図５Ｂは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーの注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＴＡ筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、３匹のマウスの各ＴＡで実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。３か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）による感染後に発現されたことを示した。これらのウエスタンブロット結果は、マウス、すなわち、注射された６つのＴＡのうちの３つから得た。ＷＴは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。図５Ｃ～Ｅは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）の注射後３か月の筋力の改善を示す。図５Ｃは、ハングワイヤの改善を示し、図５Ｄは、比力を示し、図５Ｅは、注射後３か月の伸張性収縮を示す。
【図5E】図５Ａ～図５Ｅは、注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの形質導入後のヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なエクソンスキッピング、タンパク質復元、および筋力改善を示す。図５Ａは、ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す。図５Ａは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーウイルスベクターの注射後３か月の、３か月齢ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。実験は、２匹のマウスの各前脛骨（ＴＡ）で実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス（未処理ｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウスｎ＝６のＴＡ筋）における非常にまれなエクソンスキッピング、およびマウス（ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーが注射されたｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（ｎ＝６のＴＡ筋、配列番号２７）における効率的なエクソンスキッピングを示した。ＷＴマウスは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないが、マウスＤＭＤ遺伝子を含有する野生型マウスであり、したがって、このＷＴマウスは、陽性対照である。図５Ｂは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファーの注射後３か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスのＴＡ筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、３匹のマウスの各ＴＡで実施した（ｎ＝６のＴＡ筋）。３か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）による感染後に発現されたことを示した。これらのウエスタンブロット結果は、マウス、すなわち、注射された６つのＴＡのうちの３つから得た。ＷＴは、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであるが、このウエスタンブロットで使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識する。アクチニンを対照として使用した。図５Ｃ～Ｅは、ｒＡＡＶ．Ｕ７＿ＳＤ４４スタッファー（配列番号２７）の注射後３か月の筋力の改善を示す。図５Ｃは、ハングワイヤの改善を示し、図５Ｄは、比力を示し、図５Ｅは、注射後３か月の伸張性収縮を示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本開示は、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５－５６の欠失を含むが、これに限定されない、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異を含む筋ジストロフィーを治療、改善、その進行を遅延、および／または予防するための製品、方法、および使用を提供する。最大の既知のヒト遺伝子であるＤＭＤは、ジストロフィンと呼ばれるタンパク質を作製するための指示を提供する。ジストロフィンは主に、運動に使用される筋肉（骨格筋）および心臓（心）筋に位置する。
【0023】
より具体的には、本開示は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異に起因する筋ジストロフィーの治療における使用のためのジストロフィンタンパク質の改変形態を提供するＤＭＤエクソン４４に結合するように設計された配列またはＤＭＤエクソン４４およびその周辺イントロン配列を含む核酸を提供する。本開示は、Ｕ７ベース核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）（Ｕ７ ｓｎＲＮＡ）をコードし、含む、ヌクレオチド配列を含む核酸、およびＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異に起因する筋ジストロフィーの治療における使用のためのジストロフィンタンパク質の改変形態を提供するＤＭＤエクソン４４のエクソンスキッピングを誘導するＵ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を送達する核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）などの、ベクターを提供する。エクソンスキッピングは、ジストフィンの産生を補正および復元するための治療アプローチである。特定の遺伝子突然変異について、それは体がより短く、使用可能なジストフィンを作製することを可能にする。これまでのところ、エクソンスキッピングはＤＭＤの治療法ではないが、ＤＭＤの影響をそれほど深刻にしない場合がある。
【0024】
したがって、本開示は、エクソン４４スキッピングに適した任意の突然変異を治療するための核酸を提供する。いくつかの態様では、エクソン４４スキッピングに適したそのような突然変異は、ＤＭＤエクソン４４に関与する、この周辺の、またはこれに影響を与える突然変異である。エクソン４４スキッピングに適したそのような突然変異の例には、ｈｔｔｐｓ ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｃｕｒｅｄｕｃｈｅｎｎｅ．ｏｒｇ－ｓｌａｓｈ－ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ－ｓｌａｓｈ－ｕｐｌｏａｄｓ－ｓｌａｓｈ－２０１６－ｓｌａｓｈ－１１－ｓｌａｓｈ－Ｄｕｃｈｅｎｎｅ－Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ－Ａｍｅｎａｂｌｅ－ｔｏ－Ｅｘｏｎ－Ｓｋｉｐｐｉｎｇ－１１．１０．１６．ｐｄｆで提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。そのようなエクソン４４スキップに適した突然変異には、エクソン１－４３、２－４３、３－４３、４－４３、５－４３、６－４３、７－４３、８－４３、９－４３、１０－４３、１１－４３、１２－４３、１３－４３、１４－４３、１５－４３、１６－４３、１７－４３、１８－４３、１９－４３、２０－４３、２１－４３、２２－４３、２３－４３、２４－４３、２５－４３、２６－４３、２７－４３、２８－４３、２９－４３、３０－４３、３１－４３、３２－４３、３３－４３、３４－４３、３５－４３、３６－４３、３７－４３、３８－４３、３９－４３、４０－４３、４１－４３、４２－４３、４３－４５、４５－４６、４５－４７、４５－４８、４５－４９、４５－５０、４５－５１、４５－５２、４５－５３、４５－５４、４５－５５、４５－５６、４５－５７、４５－５８、４５－５９、４５－６０、４５－６１、４５－６２、４５－６３、４５－６４、４５－６５、４５－６６、４５－６７、４５－６８、４５－６９、４５－７０、４５－７１、４５－７２、４５－７３、４５－７４、４５－７５、４５－７６、４５－７７、および４５－７８の欠失、ならびにエクソン４４の重複が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、そのような突然変異は、ＤＭＤエクソン４４の重複、エクソン４３もしくは４５の欠失、またはエクソン４５－５６の欠失である。本開示はまた、本明細書に記載される核酸を、それを必要とする対象に送達するためのベクターを提供する。
【0025】
本開示は、エクソン４４またはエクソン４４の周辺のイントロン領域を標的とするように設計されたアンチセンス配列またはアンチセンス配列の逆相補体を含む核酸（または核酸分子）を送達するための方法を提供する。本開示は、エクソン４４標的化アンチセンス配列を含むＵ７ ｓｎＲＮＡをコードする核酸分子、「エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物」を送達するための方法を提供する。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド構築物は、送達のためにウイルスベクターのゲノムに挿入される。いくつかの態様では、エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を送達するために使用されるベクターは、ｒＡＡＶである。
【0026】
本開示は、したがって、目的のアンチセンスを発現し、したがってエクソンスキッピングを媒介するＵ７低分子ＲＮＡプロモーターを送達するためのｒＡＡＶを提供する。このアプローチの利点は、ｒＡＡＶウイルスが影響を受けた筋肉を効率的に標的とし、エクソンスキッピングシステムを送達することである。
【0027】
ＤＭＤ遺伝子は、ヒトにおける最大の既知の遺伝子である。サイズは２４０万塩基対であり、７９のエクソンを含み、転写および同時転写スプライシングされるのに１６時間超かかる。いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４を標的とするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、およびエクソン４４スキッピングを誘導するそのような核酸分子を含むベクターに関する。アンチセンス媒介性エクソンスキッピングの理論的根拠は、標的エクソンのスキッピングを誘導してリーディングフレームを復元することである。ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のポリヌクレオチド配列およびその周辺イントロン配列は、配列番号１に示される。大文字のヌクレオチドはエクソン配列を示し、小文字のヌクレオチドはイントロン配列を示す。ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のポリヌクレオチド配列は、配列番号２に示され、１４８塩基対からなり（米国特許公開第２０１２／００５９０４２号）、エクソン４４のアミノ酸配列は、配列番号３に示される。配列番号２の最初の「Ｇ」は、エクソン４３の最後のＣ末端アミノ酸をコードする末端ヌクレオチドである。したがって、「Ｇ」は配列番号２の第１のヌクレオチドであるが、エクソン４４は、配列番号３のＮ末端「Ｒ」（アルギニン）をコードする、「ＣＧＡ」によってコードされ始める。
【0028】
本開示は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４を標的とするように設計されたアンチセンスヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸（または核酸分子）または核酸（複数可）を提供する。周辺イントロン配列を有するＤＭＤ遺伝子のエクソン４４は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４は、配列番号２に記載されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードする。
【0029】
様々な態様では、本開示の方法はまた、配列番号１もしくは２に記載されるヌクレオチド配列、または配列番号３に記載されるアミノ酸配列のアイソフォームおよびバリアントを標的とする。いくつかの態様では、バリアントは、配列番号１もしくは２に記載されるヌクレオチド配列、または配列番号３に記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列との９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、および７０％の同一性を含む。表１は、ヒトＤＭＤエクソン４４およびその周辺イントロン領域の配列を提供する。
【表1】
【0030】
本開示は、表２に示されるセンスおよびアンチセンス配列を含む、エクソン４４中およびその周辺の様々な領域の標的配列を含む様々な核酸分子、ならびに細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための方法におけるそれらの使用を含む。したがって、本開示は、細胞にエクソン４４を標的とする核酸分子、すなわち、「エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物」を提供することを含む、細胞におけるＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングを誘導するための方法および使用を含む。本開示は、したがって、エクソン４４の様々な領域を標的とするアンチセンス配列およびこれらの配列の逆相補体を含む核酸分子を提供する。標的配列、すなわち、アンチセンス配列によって標的とされるエクソン４４の天然配列には、配列番号４［ＢＰ４３ＡＳ４４（分岐点４３アクセプター部位４４）標的配列］、配列番号５［ＬＥＳＥ４４（長いエクソンスプライシングエンハンサー４４）標的配列］、配列番号６［ＳＥＳＥ４４（短いエクソンスプライシングエンハンサー４４）標的配列］、もしくは配列番号７［ＳＤ４４（スプライスドナー）標的配列］に示される配列、またはそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、これらの標的配列は、Ｕ７コード配列、すなわち、配列番号２９に挿入される。いくつかの態様では、これらのアンチセンス配列は、Ｕ７コード配列、すなわち、配列番号２８に挿入される。いくつかの態様では、これらの配列の複数のコピーは、Ｕ７コード配列に挿入される。本開示はまた、エクソン４４の様々な領域を標的とする配列、標的配列の逆相補体、および配列番号３２［ＢＰ４３ＡＳ４４標的配列のｍＲＮＡ］、配列番号３３［ＬＥＳＥ４４標的配列のｍＲＮＡ］、配列番号３４［ＳＥＳＥ４４標的配列のｍＲＮＡ］、もしくは配列番号３５［ＳＤ４４標的配列のｍＲＮＡ］に示されるｍＲＮＡ配列、またはそれらのバリアントを含む核酸分子を提供する。表２を参照されたい。配列における大文字は、エクソン配列（すなわち、エクソン４４の配列）を表し、配列における小文字は、エクソン４４の周辺のイントロン配列を表す。これらの配列は、配列番号１または２内に見られるＤＭＤ遺伝子に存在する。
【表2】
【0031】
本開示は、アンチセンス配列（およびアンチセンス配列の逆相補体である配列）を含むか、またはこれらからなり、ＤＭＤ遺伝子における突然変異および得られたｍＲＮＡの改変バージョンに起因する筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するために短縮型ジストロフィンタンパク質の発現をもたらすｍＲＮＡのリーディングフレームを復元するためにＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングをもたらすスプライセオソームへの干渉によってＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の発現に干渉する、核酸分子を含む。したがって、本明細書で使用する場合、「ジストロフィンの増加した発現」には、「短縮型ジストロフィンタンパク質、ジストロフィンタンパク質の改変形態、またはジストロフィンタンパク質の機能的断片の増加した発現」が含まれる。いくつかの態様では、本開示は、エクソン４４を標的とするアンチセンス配列およびその周辺イントロン配列を含む。いくつかの態様では、アンチセンス配列は、配列番号８～１１のいずれかに記載される配列、またはそのバリアント配列を含む。いくつかの態様では、本開示は、エクソン４４およびその周辺イントロン配列を標的とするアンチセンスｍＲＮＡ配列を含む。いくつかの態様では、これらのアンチセンス配列のｍＲＮＡ配列は、配列番号１２～１５に記載される配列、またはそのバリアントを含む。表３を参照されたい。いくつかの態様では、これらのアンチセンス配列またはそれらの逆相補体は、Ｕ７コード配列、例えば、配列番号２８または２９に挿入される。いくつかの態様では、これらの配列の複数のコピーは、Ｕ７コード配列に挿入される。
【表3】
【0032】
本開示は、Ｕ７プロモーターの制御下で、配列番号４～１５もしくは３２～３５のいずれかに示される配列のうちのいずれか１つ以上を含むか、またはＵ７核内低分子ＲＮＡ（Ｕ７ ｓｎＲＮＡ）をコードする配列に挿入された、核酸を含む。Ｕ７ ｓｎＲＮＡをコードするそのような配列は、配列番号２８および２９に示され、表５に見ることができる。Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、エクソンスキッピングおよびスプライシング調節における重要なツールであることが見出された［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（７）：１２３４－４０（２００９）］。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用したスプライシング調節は、過去２０年間、多くの疾患、最も注目すべきはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のための潜在的な治療として開発されてきた。これには、前臨床および臨床試験を含む［Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ７４：６３７－４７（２０１３）］。しかしながら、そのようなＡＯＮは、心臓および横隔膜（すなわち、ＤＭＤ男児における最も影響を受けた筋肉）に弱くしか浸透せず、安定していない、すなわち、ＤＭＤ患者の再注射を必要とするため、弱いエクソンスキッピングを媒介することのみが示された。したがって、本明細書では、ＡＡＶベースＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子療法アプローチが、ＡＯＮの前述の潜在的な送達問題を回避するのに役立つことが記載されている。
【0033】
本開示は、Ｕ７ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（Ｕ７ ｓｎＲＮＡアンチセンス配列、すなわち、配列番号１６～１９、２４、および２５、および逆相補体Ｕ７ ｓｎＲＮＡアンチセンス配列、すなわち、配列番号２０～２３、２６、および２７）を含むか、またはこれらからなり、ＤＭＤ遺伝子における突然変異および得られたｍＲＮＡの改変バージョンに起因する筋ジストロフィーを治療、改善、および／または予防するために短縮型ジストロフィンタンパク質の発現をもたらすｍＲＮＡのリーディングフレームを復元するためにＤＭＤ遺伝子のエクソン４４のスキッピングをもたらすスプライセオソームへの干渉によってＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の発現に干渉する、核酸分子を含む。表４を参照されたい。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【0034】
本開示は、したがって、配列番号４～２７および３２～３５のいずれかに示されるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むか、または配列番号４～２７および３２～３５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、核酸（すなわち、核酸分子または核酸構築物）を含む。
【0035】
いくつかの態様では、本開示は、スプライシングを阻害するか、またはこれに干渉する本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含むＵ７ ｓｎＲＮＡ分子を使用する。Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンプレ－ｍＲＮＡ３’末端プロセシングに関与しているが、いくつかの態様では、スプライシング調節用の可変性ツールへと変換されるか、または細胞において継続的に発現されるアンチセンスＲＮＡとして変換される［Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６（５７０２）：１７９６－９（２００４）］。野生型Ｕ７ Ｓｍ結合部位をスプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のコンセンサス配列で置き換えることによって、得られたＲＮＡは、スプライセオソームｓｎＲＮＡにおいて見られる７つのＳｍタンパク質と会合する。結果として、このＵ７ Ｓｍ ＯＰＴ ＲＮＡは、核質においてより効率的に蓄積し、それ以上ヒストンプレ－ｍＲＮＡ切断を媒介しないが、依然としてヒストンプレ－ｍＲＮＡに結合し、野生型Ｕ７核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）の競合阻害剤として機能することができる。ヒストン下流因子に結合している配列と、スプライシング基質における特定の標的に相補的な配列とをさらに置き換えることで、特異的なスプライシング現象を調節可能であるＵ７ｓｎＲＮＡを生成することができる。Ｕ７誘導体を使用する１つの利点は、アンチセンス配列が核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）複合体内へと包埋されることである。さらに、遺伝子療法ベクターに埋め込まれる場合、これらの低分子ＲＮＡは、単一の注射後に標的細胞内部で恒久的に発現することができ、ＡＡＶアプローチを使用したそれらの使用は、インビボで調査された［Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １８（９）：９６９－７０（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ ３１（２）：１３６－４２（２０１０）、Ｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０（９）：９９２－１０００（２０１４）］。
【0036】
Ｕ７－ｓｎＲＮＡシステムには３つの主要な機能がある：（１）標的細胞における修飾されたｓｎＲＮＡの発現を駆動するＵ７プロモーター、（２）スプライスジャンクション、分岐点、またはスプライシングエンハンサーと塩基対を形成するように設計される、ｓｎＲＮＡバックボーンに挿入されたアンチセンス配列、（３）Ｕ７ｓｎＲＮＡと複合体を形成してより安定させるＲＮＡ結合タンパク質の別個の環を動員する修飾された配列（ｓｍＯＰＴと呼ばれる）。［Ｓｃｈｕｍｐｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６１：２５６０－７０（２００４）］。アンチセンス配列およびＵ７核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）（Ｕ７ ｓｎＲＮＡ）が、筋ジストロフィーの大型動物モデルにおいてインビボでの使用に安全であることが証明されたことは注目に値する［ＬｅＧｕｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：１９２３－３５（２０１４）］。
【0037】
本開示は、配列番号４～２７および３２～３５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸分子を含む。
【0038】
したがって、本開示は、標的配列をコードする核酸、アンチセンス配列およびアンチセンス配列の逆相補体をコードする核酸、Ｕ７ベース核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）、すなわち、Ｕ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸、Ｕ７ベースｓｎＲＮＡの逆補体をコードする核酸を含む、核酸、ならびに筋ジストロフィーの治療における使用のためのエクソンスキッピングを誘導するＵ７ベースｓｎＲＮＡをコードする核酸を送達する核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
【0039】
いくつかの態様では、本開示は、ＤＭＤ遺伝子のｍＲＮＡへのエクソン４４の発現および／または組み込みを阻害するか、またはこれに干渉する、完全な構築物（本明細書ではエクソン４４ Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物、またはエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡと呼ばれる）を含む。したがって、本開示は、（１）エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡコードポリヌクレオチド（例えば、配列番号１６～１９、２４、および２５）、および（２）エクソン４４標的化逆相補的Ｕ７ ｓｎＲＮＡコードポリヌクレオチド（例えば、配列番号２０～２３、２６、および２７）をコードする核酸配列を提供する。
【0040】
したがって、本開示は、配列番号１～７に示される標的配列のいずれかに結合するヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸、エクソン４４およびその周辺イントロン配列（すなわち、配列番号８～１１）を標的とするように設計されたアンチセンス配列（ＤＮＡレベルでの標的化配列の逆相補体）であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸、エクソン４４およびその周辺イントロン配列（すなわち、配列番号１２～１５）を標的とするように設計された逆相補的配列（ＲＮＡレベルの標的配列の逆相補体）であるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる核酸、配列番号４～１５および３２～３５に示されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ以上を含むか、またはそれからなるＵ７ ｓｎＲＮＡをコードする核酸、ならびに配列番号１６～２７に示されるヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ以上を含むか、またはそれからなる核酸を含む。本開示は、これらの阻害性スプライシングＲＮＡをコードする核酸が、配列特異的遺伝子エクソンスキッピングの関与であることを企図する。いくつかの態様では、本明細書に記載された核酸または核酸分子または構築物は、ベクターに挿入される。
【0041】
したがって、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを含む。いくつかの態様では、これらの核酸の２つ以上は、単一のベクターに組み合わされる。したがって、いくつかの態様では、エクソン４４標的化核酸またはエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡ構築物の組み合わせは、単一のベクターに存在する。本開示は、したがって、配列番号４～２７および３２～３５に示されるヌクレオチド配列、または配列番号４～２７および３２～３５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、ベクターを含む。いくつかの態様では、ベクターは、本明細書に開示されるようにＤＭＤエクソン４４スキッピングを媒介するアンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドを送達するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、およびワクシニアウイルスなどのウイルスベクターである。いくつかの態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が使用される。いくつかの態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が使用される。
【0042】
いくつかの態様では、本開示のｒＡＡＶゲノムは、例えば、１つ以上のＤＭＤエクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡ（すなわち、エクソン４４内または周辺の遺伝子配列に結合し、Ｕ７ ｓｎＲＮＡから発現されるｓｎＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ポリヌクレオチドは、転写制御ＤＮＡ、特に標的細胞において機能的であるプロモーターＤＮＡに作動可能に連結される。
【0043】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチド逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長であり、その二本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチドＩＴＲを含む、約２．３ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－６４（１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿００１８６２に提供されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも部分は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶｒｈ７４ゲノム、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７８：６３８１－８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－８３（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１２のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＤＱ８１３６４７．１に提供されており、ＡＡＶ－１３のゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＵ２８５５６２．１に提供されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組み込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が産生される。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連キャプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）に概説されている。
【0044】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染はサイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能にする。さらに、ＡＡＶは、緩徐に分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外要素）として本質的にそれらの細胞の寿命にわたって存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにおいてクローニングされたＤＮＡとして挿入され、組換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムカプシド形成を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されるため、内部約４．３ｋｂのゲノム（複製および構造カプシドタンパク質をコードする、ｒｅｐ－ｃａｐ）の一部またはすべてが、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６°～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【0045】
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物に隣接している１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。本明細書に記載されるエクソン４４標的化アンチセンス配列の各々を含むエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を有するゲノム、および本明細書に記載されるエクソン４４標的化アンチセンス配列のうちの２つ以上の各可能な組み合わせを含むエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を有するゲノムが具体的に企図される。例示的な実施形態を含むいくつかの実施形態では、Ｕ７ ｓｎＲＮＡポリヌクレオチドはそれ自身のプロモーターを含む。
【0046】
ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ｒｈ７４、ならびにＡＡＶ－ａｎｃ８０を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。これらの様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知である。本開示のいくつかの実施形態では、プロモーターＤＮＡは、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３３９３－３３９９（１９８９）］およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ＭＣＫ）要素、デスミンプロモーター、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心トロポニンＣ遺伝子、および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素、低酸素誘導性核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、ステロイド誘導性要素およびグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照されたい］、ならびに他の制御要素を含むが、これらに限定されない、筋特異的制御要素である。
【0047】
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－ｒｈ７４、ならびにＡＡＶ－ａｎｃ８０を含むが、これらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型由来であってもよい。同族成分の使用が、特に企図される。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。
【0048】
本開示のいくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、一本鎖ゲノムまたは自己相補的ゲノムである。方法のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠く。
【0049】
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング［Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７９：２０７７－８１（１９８２）］、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加［Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３（１９８３）］、または直接的な平滑末端ライゲーション［Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５９：４６６１－６（１９８４）］などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
【0050】
ｒＡＡＶ産生の一般的な原理は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９（１９９２）、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
【0051】
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
【0052】
上記および下記に記載される本開示の方法の細胞形質導入効率は、少なくとも約６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセント効率であり得る。
【0053】
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（６）：１０３１－９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７－４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
【0054】
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される核酸分子または構築物のいずれかを含むｒＡＡＶを含む組成物を企図する。一態様では、本開示は、本明細書に記載されるｓｎＲＮＡを送達するためのｒＡＡＶを含む組成物を含む。本開示の組成物は、薬学的に許容される担体中のｒＡＡＶを含む。組成物はまた、希釈剤などの他の成分を含んでもよい。許容される担体および希釈剤は、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投薬量および濃度では不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）、プルロニック（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0055】
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
【0056】
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、および細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍＬ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位（すなわち、それぞれ、１ｘ１０７ｖｇ、１ｘ１０８ｖｇ、１ｘ１０９ｖｇ、１ｘ１０１０ｖｇ、１ｘ１０１１ｖｇ、１ｘ１０１２ｖｇ、１ｘ１０１３ｖｇ、１ｘ１０１４ｖｇ）で表されてもよい。
【0057】
いくつかの態様では、本開示は、エクソン４４標的化ｓｎＲＮＡをコードするｒＡＡＶを対象に投与することを含む、配列番号４～２７および３２～３５のいずれかに示されるｓｎＲＮＡをコードするＤＮＡを、それを必要とする対象に送達する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、エクソン４４標的化ｓｎＲＮＡの送達のためのＡＡＶ形質導入細胞を提供する。
【0058】
インビボまたはインビトロで、ｒＡＡＶで標的細胞（例えば、骨格筋）を形質導入する方法が、本発明によって企図される。方法は、有効用量、または有効複数回用量の、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。用量が筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態では、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除もしくは低減）する、筋ジストロフィー、例えば、ＤＭＤの進行を遅延もしくは予防する、筋ジストロフィー障害／疾患状態の進行を遅延もしくは予防する、疾患の程度を軽減する、疾患の寛解（部分または完全）をもたらす、および／または疾患もしくは障害に罹患している対象の生存を延長する用量である。
【0059】
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、髄腔内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むが、これらに限定されない、当該技術分野における標準的な経路により得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、治療される感染および／または疾患状態、ならびに標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。いくつかの実施形態では、投与経路は筋肉内投与である。いくつかの実施形態では、投与経路は静脈内投与である。
【0060】
併用療法も本開示によって企図される。本明細書で使用する組み合わせは、同時治療または連続治療を含む。本開示の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイドおよび／または免疫抑制薬）との組み合わせは、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる、国際公開第２０１３／０１６３５２号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。
【0061】
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、髄腔内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むが、これらに限定されない、当該技術分野における標準的な経路により得る。本開示のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路および血清型は、治療される感染および／または疾患状態、ならびにエクソン４４標的化Ｕ７ベースｓｎＲＮＡを発現する標的細胞／組織を考慮して、当業者によって選択および／または適合され得る。
【0062】
特に、本開示のｒＡＡＶの実際の投与は、いくつかの態様では、ｒＡＡＶベクターを対象の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成される。本開示による投与には、筋肉、肝臓、脳脊髄液、または血流への注射が含まれるが、これらに限定されない。単純にリン酸塩緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁させることは、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するために十分であることが実証されており、担体またはｒＡＡＶと共投与することができる他の成分に既知の制限はない（が、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを伴う通常の方法では回避されるべきである）。いくつかの態様では、ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾される。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０２／０５３７０３を参照されたい。いくつかの態様では、組成物または薬学的組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製される。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤が先行して開発されており、本開示を実施する際に使用され得る。いくつかの態様では、ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体または賦形剤とともに使用される。
【0063】
いくつかの態様では、筋肉内注射を目的として、ゴマもしくはピーナツ油などのアジュバント中、または水性プロピレングリコール中の溶液、および滅菌水溶液が用いられる。そのような水溶液は、様々な態様では、所望に応じて、緩衝され、液体希釈剤は、生理食塩水またはグルコースと等張にされる。いくつかの態様では、遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸塩基を含有する）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合される、水中で調製される。様々な態様では、ｒＡＡＶの分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製される。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は、すべて当該技術分野における標準的な技法によって容易に入手可能である。
【0064】
注射可能な使用に適した薬学的形態を含む、製剤には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。すべての場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。いくつかの態様では、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒体である。適切な流動性は、いくつかの態様では、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。いくつかの態様では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、いくつかの態様では、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされる。
【0065】
滅菌されている注射可能な溶液は、いくつかの態様では、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙される様々な他の成分とともに組み込むこと、続いて濾過滅菌によって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌されている注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、様々な調製の方法は、活性成分プラスそれらの予め滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【0066】
ｒＡＡＶによる形質導入は、いくつかの態様では、インビトロでも実施される。一実施形態では、例えば、所望の標的筋細胞は、対象から除去され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。あるいは、同系または異種筋細胞は、いくつかの態様では、対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用される。
【0067】
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば、適切な培地における、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲなどの従来の技法を使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、目的のＤＮＡを有する細胞についてスクリーニングすることによってインビトロで形質導入される。形質導入された細胞は、いくつかの態様では、次いで、薬学的組成物を含む、組成物に製剤化され、組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、および／もしくは腹腔内注射による、または例えば、カテーテルを使用した、平滑筋および心筋への注射によるなどの、様々な技法によって対象に導入される。
【0068】
本開示は、有効用量（または本質的に同時に投与される用量、もしくは間隔をあけて与えられる用量）の阻害性ＲＮＡをコードするｒＡＡＶ、ならびにエクソン４４、およびエクソン４４のスキッピングを標的とする、ｓｎＲＮＡを含む、阻害性ＲＮＡの組み合わせをコードするｒＡＡＶを、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
【0069】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、エクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡの持続的発現をもたらす。「形質導入」という用語は、レシピエント細胞による１つ以上のエクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物の発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞への１つ以上のエクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物の投与／送達を指すように使用される。したがって、本開示は、エクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡを発現するｒＡＡＶを対象に投与／送達する方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。
【0070】
これらの方法は、血液および血管系、中枢神経系、ならびに組織（筋肉などの組織、肝臓および脳などの器官、ならびに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を本開示の１つ以上のｒＡＡＶで形質導入することを含む。形質導入は、いくつかの態様では、組織特異的制御要素を含む遺伝子カセットで行われる。例えば、本開示の一実施形態は、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子に由来する制御要素［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－９９（１９８７）］、心アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列要素［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－９（１９８９）を参照されたい］およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）要素、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心トロポニンＣ遺伝子、および遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する制御要素：低酸素誘導性核因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－４（１９９１）］、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性要素およびプロモーター［Ｍａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５６０３－７（１９９３）を参照されたい］、ならびに他の制御要素を含むが、これらに限定されない、筋特異的制御要素によって誘導される筋細胞および筋肉組織を形質導入する方法を提供する。
【0071】
ＡＡＶは、すべてのジストロフィン罹患器官を標的とするため、本開示は、阻害性ＲＮＡをコードするＤＮＡの、対象のすべての細胞、組織、および器官への送達を含む。いくつかの態様では、血管系、中枢神経系、筋組織、心臓および脳はインビボでのＤＮＡ送達のための誘引標的である。本開示は、ＤＭＤエクソン４４発現に影響を及ぼし（例えば、発現をスキップ、ノックダウン、または阻害し）、ＤＭＤタンパク質の発現を改変する形質導入細胞からのｓｎＲＮＡの持続的発現を含む。いくつかの態様では、筋肉組織は、本開示の核酸分子およびベクターの送達のために標的とされる。筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本開示は、いくつかの態様では、形質導入された筋線維からの１つ以上のエクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡの持続的発現を企図する。「筋細胞」または「筋肉組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心臓組織に由来する、骨格筋および平滑筋）に由来する細胞または細胞群を意味する。こうした筋細胞はいくつかの態様では、筋原細胞、ミオサイト、筋管、心筋細胞および心筋原細胞などに区別されるか、または区別されない。
【0072】
さらに別の態様では、本開示は、細胞をエクソン４４標的化Ｕ７ ｓｎＲＮＡをコードするｒＡＡＶと接触させることを含む、細胞におけるＤＭＤ遺伝子のオープンリーディングフレームを復元する方法を提供し、ＲＮＡは、配列番号４～２７および３２～３５のいずれか１つのうちの少なくとも１つ以上に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの態様では、エクソン４４のスキッピングは、エクソン４４の少なくとも約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、または１００パーセントの除外または阻害をもたらす。
【0073】
したがって、本開示は、有効用量（または本質的に同時に投与される用量、もしくは間隔をあけて与えられる用量）の、エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物または１つ以上のエクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物をコードするゲノムを含むｒＡＡＶを、それを必要とする対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーに罹患している対象または患者）に投与する方法を提供する。
【0074】
いくつかの態様では、患者における筋ジストロフィーを治療する方法が提供される。いくつかの態様では、「治療すること」は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む、筋ジストロフィーの１つ以上の症状（筋肉の消耗、筋力の低下、骨格筋の問題、心臓機能異常、呼吸困難、発話および嚥下の問題（構音障害および嚥下障害）、または認知障害を含むが、これらに限定されない）を改善、阻害、またはさらに予防することを含む。いくつかの態様では、治療する方法は、ジストロフィンタンパク質の増加した発現または対象において生理学的もしくは機能的に活性であるジストロフィンタンパク質の改変形態または断片の増加した発現をもたらす。特定の態様では、治療する方法は、対象におけるジストロフィー病理の進行を阻害する。いくつかの態様では、治療する方法は、対象における筋機能を改善する。いくつかの態様では、筋機能の改善は、筋力の改善である。いくつかの態様では、筋機能の改善は、立位および歩行における安定性の改善である。筋力の改善は、最大随意等尺性収縮試験（ＭＶＩＣＴ）などの、当該技術分野で知られている技法によって決定される。場合によっては、筋機能の改善は、立位および歩行における安定性の改善である。いくつかの態様では、安定性または強度の改善は、６分歩行試験（６ＭＷＴ）、１００メートル走行／歩行試験、または時限階段昇降などの、当該技術分野で知られている技法によって決定される。
【0075】
いくつかの実施形態では、治療する方法は、ベクターの使用なしに、１つ以上のエクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、治療する方法は、ｒＡＡＶを対象に投与するステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、１つ以上のエクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。
【0076】
さらに別の態様では、本開示は、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーに関連するジストロフィー病理の進行を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ベクターの使用なしに、１つ以上のエクソン４４ Ｕ７ベースｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｒＡＡＶを患者に投与するステップを含み、ｒＡＡＶのゲノムは、エクソン４４標的化Ｕ７ｓｎＲＮＡポリヌクレオチド構築物を含む。
【0077】
本明細書に引用される各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない範囲で、その全体が参照により組み込まれる。
【0078】
本明細書において特に指定のない限り、本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に入る各別個の値および各端点を個々に指す略記方法として役立つことを意図したものであるにすぎず、各別個の値および端点は、それが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0079】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において特に指定のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行われる。特に特許請求されない限り、本明細書に提供される任意およびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより良く説明することを意図しているにすぎず、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書中の言語は、いかなる特許請求されていない要素も本発明の実施に対して必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【0080】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。
【実施例】
【0081】
本開示のさらなる態様および詳細は、限定的ではなく例示的であることが意図される以下の実施例から明白であろう。
【0082】
実施例１
エクソン４４を標的とする配列の設計および生成
エクソン４４のスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡシステムの能力を試験するために、６つのＡＡＶ１－Ｕ７ｓｎＲＮＡを作製した。アンチセンス配列（すなわち、配列番号８～２７）は、ｍＲＮＡからエクソン（例えば、エクソン４４）を除外するために、「エクソン定義」（分岐点、スプライスドナーまたはアクセプター、およびエクソンスプライシングエンハンサー）に結合するように設計した。この「エクソン定義」は、オンラインソフトウェアＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ（ＨＳＦ、ｈｔｔｐ ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ－ｓｌａｓｈ－ＨＳＦ－ｓｌａｓｈ－ＨＳＦ．ｓｈｔｍｌ）を使用して予測することができる。本発明者らは、このソフトウェアを使用して、変動する長さおよび様々な結合部位を有する様々な標的配列および様々な標的化配列を設計した。配列は、商業的に合成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。
エクソン４４を標的とする配列の設計および生成
エクソン４４のスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡシステムの能力を試験するために、６つのＡＡＶ１－Ｕ７ｓｎＲＮＡを作製した。アンチセンス配列（すなわち、配列番号８～２７）は、ｍＲＮＡからエクソン（例えば、エクソン４４）を除外するために、「エクソン定義」（分岐点、スプライスドナーまたはアクセプター、およびエクソンスプライシングエンハンサー）に結合するように設計した。この「エクソン定義」は、オンラインソフトウェアＨｕｍａｎ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｆｉｎｄｅｒ（ＨＳＦ、ｈｔｔｐ ｃｏｌｏｎ－ｓｌａｓｈ－ｓｌａｓｈ－ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｂｅ－ｓｌａｓｈ－ＨＳＦ－ｓｌａｓｈ－ＨＳＦ．ｓｈｔｍｌ）を使用して予測することができる。本発明者らは、このソフトウェアを使用して、変動する長さおよび様々な結合部位を有する様々な標的配列および様々な標的化配列を設計した。配列は、商業的に合成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。
【0083】
以下の表（すなわち、以下の表５）は、ＤＭＤ遺伝子のエクソン４４の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）（およびエクソン４４の周辺のイントロン配列）、ＤＭＤ遺伝子上の標的配列（エクソン４４配列（配列番号１の大文字）およびエクソン４４の周辺のイントロン配列（配列番号１の小文字））、ＤＭＤ遺伝子上の配列（エクソン４４およびエクソン４４の周辺のイントロン配列）を標的とするために使用されるアンチセンス配列、ＤＭＤ遺伝子上の配列（エクソン４４およびエクソン４４の周辺のイントロン配列）を標的とするために使用されるアンチセンス配列の逆相補体、ＤＭＤ遺伝子上の配列（エクソン４４およびエクソン４４の周辺のイントロン配列）を標的とするために使用されるアンチセンス配列を含むＵ７配列、ならびにＤＭＤ遺伝子上の配列（エクソン４４およびエクソン４４の周辺のイントロン配列）を標的とするために使用されるアンチセンス配列を含むＵ７配列の逆相補体を提供する。
【0084】
配列番号１６～２７に示される構築物の各々を含有するプラスミドを増幅し、再配列し、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（すなわち、ＩＴＲＳ間）への挿入のためにＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ＶＶＣ）に送った。インビトロ形質導入研究のために、構築物は、ＡＡＶ１カプシドを使用して産生された。インビボ研究のために、構築物は、本明細書に記載されるように任意のＡＡＶカプシドに産生される。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【表5-5】
【0085】
実施例２
実験において使用される材料および方法
細胞株の作製
皮膚生検は、エクソン４５欠失、エクソン４４重複、またはエクソン４５－５６欠失のいずれかに罹患した３人の患者から得た。これらの皮膚生検は、線維芽細胞へのｈＴＥＲＴ（細胞を不死化する）およびＭｙｏＤ（細胞を筋管に分化転換させる）送達の両方のためにレンチウイルスベクターを使用した感染によって３つの細胞株に発展させて、ジストロフィンを発現する筋形成線維芽細胞（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ）を作製した。ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、本明細書に記載されるように様々なｒＡＡＶ調製物に感染させた。１０ｃｍ皿当たり２．５ｅ１１ウイルスゲノムを使用した。４～８日後、細胞を収集し、ＲＮＡおよびタンパク質抽出を行った。
実験において使用される材料および方法
細胞株の作製
皮膚生検は、エクソン４５欠失、エクソン４４重複、またはエクソン４５－５６欠失のいずれかに罹患した３人の患者から得た。これらの皮膚生検は、線維芽細胞へのｈＴＥＲＴ（細胞を不死化する）およびＭｙｏＤ（細胞を筋管に分化転換させる）送達の両方のためにレンチウイルスベクターを使用した感染によって３つの細胞株に発展させて、ジストロフィンを発現する筋形成線維芽細胞（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ）を作製した。ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、本明細書に記載されるように様々なｒＡＡＶ調製物に感染させた。１０ｃｍ皿当たり２．５ｅ１１ウイルスゲノムを使用した。４～８日後、細胞を収集し、ＲＮＡおよびタンパク質抽出を行った。
【0086】
ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスモデル
ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスモデル（本明細書では「ｈＤＭＤｄｅｌ４５ ｍｄｘ」モデルまたは「ｈＤＭＤ／ｄｅｌ４５ ｍｄｘ」モデルとも呼ばれる）は、Ｄｒ．Ｍｅｌｉｓｓａ Ｓｐｅｎｃｅｒ［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓ．２０１７；４（２）：１３９－１４５（２０１７）］から得た。このマウスは、ヒトバージョンのＤＭＤ遺伝子を含有するが、フレーム外転写産物をもたらすｈＤＭＤマウスにおけるヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の欠失を含有する。このマウスは、マウスＤＭＤ遺伝子において終止突然変異も含有する。全体として、これらの２つの突然変異は、このマウスモデルにおいてヒトまたはマウスジストロフィン発現を引き起こさない。ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスは、マウスおよびヒトジストロフィンの両方を欠くため、マウスは、体全体の複数の筋肉におけるジストロフィー筋病理を呈する。このマウスモデルは、本明細書に記載される様々な実験において使用される。
ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスモデル（本明細書では「ｈＤＭＤｄｅｌ４５ ｍｄｘ」モデルまたは「ｈＤＭＤ／ｄｅｌ４５ ｍｄｘ」モデルとも呼ばれる）は、Ｄｒ．Ｍｅｌｉｓｓａ Ｓｐｅｎｃｅｒ［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓ．２０１７；４（２）：１３９－１４５（２０１７）］から得た。このマウスは、ヒトバージョンのＤＭＤ遺伝子を含有するが、フレーム外転写産物をもたらすｈＤＭＤマウスにおけるヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン４５の欠失を含有する。このマウスは、マウスＤＭＤ遺伝子において終止突然変異も含有する。全体として、これらの２つの突然変異は、このマウスモデルにおいてヒトまたはマウスジストロフィン発現を引き起こさない。ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスは、マウスおよびヒトジストロフィンの両方を欠くため、マウスは、体全体の複数の筋肉におけるジストロフィー筋病理を呈する。このマウスモデルは、本明細書に記載される様々な実験において使用される。
【0087】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出を、細胞の遠心分離後、細胞ペレット上で行った。ペレットをすすぎ、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。細胞溶解物をピペッティングによってホモジナイズし、次いで５分間ＲＴでインキュベートした。細胞溶解物を１．５ｍｌチューブに移し、ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。溶解物／ＴＲＩｚｏｌ／クロロホルム混合物を手動で１５秒間振盪した。混合物を次いで２～３分間ＲＴでインキュベートし、１５分間１２，０００ｇ（＋４℃）で遠心分離した。水相（すなわち、上部）を収集し、新しいチューブに移した。０．５ｍｌのイソプロパノール（ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり）を加え、１０分間ＲＴで放置した。上清を次いで、１２，０００ｇで１０分間４℃での遠心分離後に除去し、ペレットを１ｍｌの７５％ＥｔＯＨ（ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり）で洗浄した。遠心分離（７，５００ｇ、４℃で５分間）後、ペレットを風乾し、ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリー水に１０分間６０℃で再懸濁させた。
ＲＮＡ抽出を、細胞の遠心分離後、細胞ペレット上で行った。ペレットをすすぎ、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。細胞溶解物をピペッティングによってホモジナイズし、次いで５分間ＲＴでインキュベートした。細胞溶解物を１．５ｍｌチューブに移し、ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。溶解物／ＴＲＩｚｏｌ／クロロホルム混合物を手動で１５秒間振盪した。混合物を次いで２～３分間ＲＴでインキュベートし、１５分間１２，０００ｇ（＋４℃）で遠心分離した。水相（すなわち、上部）を収集し、新しいチューブに移した。０．５ｍｌのイソプロパノール（ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり）を加え、１０分間ＲＴで放置した。上清を次いで、１２，０００ｇで１０分間４℃での遠心分離後に除去し、ペレットを１ｍｌの７５％ＥｔＯＨ（ＴＲＩｚｏｌの１ｍｌ当たり）で洗浄した。遠心分離（７，５００ｇ、４℃で５分間）後、ペレットを風乾し、ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリー水に１０分間６０℃で再懸濁させた。
【0088】
逆転写およびＰＣＲ増幅
このプロトコルは、製造業者最適化プロトコル（Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に基づく。１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２つのＰＣＲプライマーを増幅に使用した（すなわち、Ｆｗ：ＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＡＧ（配列番号３０）、Ｒｖ：ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣ（配列番号３１））。ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、６０℃のアニーリング温度でＰＣＲ増幅を行った。
このプロトコルは、製造業者最適化プロトコル（Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に基づく。１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。２つのＰＣＲプライマーを増幅に使用した（すなわち、Ｆｗ：ＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣＴＡＡＧ（配列番号３０）、Ｒｖ：ＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＡＣ（配列番号３１））。ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、６０℃のアニーリング温度でＰＣＲ増幅を行った。
【0089】
タンパク質抽出およびウエスタンブロッティング
マウス筋肉溶解物は、溶解バッファー（１５０ｍＭのトリス－ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（１８６０９３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｉｎｃ．））を使用して調製した。バッファー中の溶解物を氷上で１時間インキュベートした。バッファー中の溶解物を次いで１４０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を収集した。タンパク質定量化は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標））を使用して行った。上清を次いで従来のＳＤＳ－Ｐａｇｅバッファーと混合し、１００℃で５分間沸騰させた。１５０μｇの各タンパク質試料を、プレキャスト３～８％トリス－酢酸塩ゲル（ＮｕＰａｇｅ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上で１６時間８０Ｖ（４℃）で泳動させる。ゲルをニトロセルロースメンブレン上に一晩３００ｍＡで移す。
マウス筋肉溶解物は、溶解バッファー（１５０ｍＭのトリス－ＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（１８６０９３２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｉｎｃ．））を使用して調製した。バッファー中の溶解物を氷上で１時間インキュベートした。バッファー中の溶解物を次いで１４０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を収集した。タンパク質定量化は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標））を使用して行った。上清を次いで従来のＳＤＳ－Ｐａｇｅバッファーと混合し、１００℃で５分間沸騰させた。１５０μｇの各タンパク質試料を、プレキャスト３～８％トリス－酢酸塩ゲル（ＮｕＰａｇｅ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上で１６時間８０Ｖ（４℃）で泳動させる。ゲルをニトロセルロースメンブレン上に一晩３００ｍＡで移す。
【0090】
ジストロフィンのＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を使用した（１：２５０、ＰＡ１－２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、または１：４００、１５２７７、Ａｂｃａｍ）。ローディングコントロールとしてアルファ－アクチニン（１：５０００、Ａ－７８１１、Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＲＴでの１時間のインキュベーション後、メンブレンを洗浄し（ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＴＢＳＴで５×５分）、１：１０００希釈の二次抗体（ＲＴで６０分）に曝露した。すべての抗体は、１／２のＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（Ｌｉｃｏｒ（登録商標））および１／２のＴＢＳＴで希釈した。抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＣＷコンジュゲート）および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷコンジュゲート）（Ｌｉｃｏｒ（登録商標））を１：１０００希釈で使用した。ＴＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）での５×５分洗浄、続いてｄｄＨ２Ｏ浸漬を行った。２つの同時ＩＲＤｙｅ（登録商標）シグナルは、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＮＩＲを使用して走査した。筋肉切片については、各筋肉についてイムノブロッティングを行った。
【0091】
免疫組織化学
凍結した筋肉を８～１０ミクロンで切断し、切片を３０分間染色する前に風乾した。切片をＰＢＳで再水和し、正常ヤギ血清（１：２０）と１時間インキュベートし、続いてマウス切片の場合のみ、室温で抗マウスＩｇＧ非結合ｆａｂ断片と２時間インキュベートした。一次抗体は、一晩：ジストロフィン（１：２５０、ＰＡ１－２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で放置した。洗浄後、切片を適切な二次抗体、すなわち、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８結合で１時間（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。スライドは、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ ｐｌｕｓ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）でカバーした。観察は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１を使用して実現した。取得は、ＤＰコントローラー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して行った。
凍結した筋肉を８～１０ミクロンで切断し、切片を３０分間染色する前に風乾した。切片をＰＢＳで再水和し、正常ヤギ血清（１：２０）と１時間インキュベートし、続いてマウス切片の場合のみ、室温で抗マウスＩｇＧ非結合ｆａｂ断片と２時間インキュベートした。一次抗体は、一晩：ジストロフィン（１：２５０、ＰＡ１－２１０１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で放置した。洗浄後、切片を適切な二次抗体、すなわち、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８結合で１時間（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。スライドは、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ ｐｌｕｓ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）でカバーした。観察は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１を使用して実現した。取得は、ＤＰコントローラー（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して行った。
【0092】
実施例３
エクソン４４（ＡＡＶ１．Ｕ７△ｅｘ４４）を標的とするｒＡＡＶ構築物のインビトロトランスフェクションおよび発現
皮膚生検は、エクソン４５欠失、エクソン４４重複、またはエクソン４５－５６欠失のいずれかに罹患した３人の患者から得た。これらの皮膚生検は、線維芽細胞へのｈＴＥＲＴ（細胞を不死化する）およびＭｙｏＤ（細胞を筋管に分化転換させる）送達の両方のためにレンチウイルスベクターを使用した感染によって３つの細胞株に発展させて、ジストロフィンを発現する筋形成線維芽細胞（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ）を作製した。ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、４つの異なるｒＡＡＶ調製物に感染させた。
エクソン４４（ＡＡＶ１．Ｕ７△ｅｘ４４）を標的とするｒＡＡＶ構築物のインビトロトランスフェクションおよび発現
皮膚生検は、エクソン４５欠失、エクソン４４重複、またはエクソン４５－５６欠失のいずれかに罹患した３人の患者から得た。これらの皮膚生検は、線維芽細胞へのｈＴＥＲＴ（細胞を不死化する）およびＭｙｏＤ（細胞を筋管に分化転換させる）送達の両方のためにレンチウイルスベクターを使用した感染によって３つの細胞株に発展させて、ジストロフィンを発現する筋形成線維芽細胞（ＦｉｂｒｏＭｙｏＤ）を作製した。ＦｉｂｒｏＭｙｏＤは、４つの異なるｒＡＡＶ調製物に感染させた。
【0093】
４つの異なる配列［すなわち、エクソン４４またはエクソン４４およびエクソン４の周辺のイントロン配列に存在する、配列番号４～７（表２を参照されたい）］を標的化のために選択した。Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物は、標的配列に結合するように設計された配列番号８～１１の各々を含むように設計した。上記のＦｉｂｒｏＭｙｏＤから生成された筋芽細胞におけるエクソンスキッピング効率を評価するために、Ｕ７ｓｎＲＮＡ構築物（すなわち、配列番号１６～２５）の各々をＡＡＶ１にクローニングした。
【0094】
１０ｃｍ皿当たり２．５ｅ１１ウイルスゲノムを使用した。４～８日後、細胞を収集し、ＲＮＡおよびタンパク質抽出を行った。エクソンスキッピングを観察するために、ＲＴ－ＰＣＲ実験を３通り行った。すべての４つのＡＡＶ１．Ｕ７－アンチセンス（すなわち、配列番号２０～２３の各々を含むＡＡＶ）は、エクソン４４スキッピングのほぼ１００％を媒介することができた（図１Ａ～Ｃ）。同様に、３つのＡＡＶ１．Ｕ７－アンチセンス（すなわち、配列番号２３、２６、および２７の各々を含むＡＡＶ）は、エクソン４４スキッピングのほぼ１００％を媒介することができた（図１Ｄ～Ｆ）。
【0095】
エクソン４の効率的なスキッピングは、ＢＰ４３ＡＳ４４、ＬＥＳＥ４４、ＳＥＳＥ４４、およびＳＤ４４を含む構築物によってすでに実証されたが、ＳＤ４４、すなわち、Ｕ７．ＳＤ４４の４コピーは、単一の自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ１ベクターにクローニングした（「Ｕ７－４ｘＳＤ４４」と呼ばれる）。加えて、Ｕ７．ＳＤ４４によって媒介されるエクソンスキッピングはすでに非常に効率的であったため、Ｕ７．ＳＤ４４の１コピーのみを有する構築物および付加されたスタッファー配列、すなわち、ランダム非コードＤＮＡも作製した。
【0096】
１０ｃｍ皿当たり２．５ｅ１１ウイルスゲノムを使用した。４～８日後、細胞を収集し、ＲＮＡおよびタンパク質抽出を行った。エクソンスキッピングを観察するために、ＲＴ－ＰＣＲ実験を３通り行った。３つのＡＡＶ１．Ｕ７－アンチセンス（すなわち、配列番号２３、２６、および２７の各々を含むＡＡＶ）を使用した。配列番号２６（４ｘＳＤ４４）および２７（ＳＤ４４－スタッファー）の各々を含むＡＡＶは、エクソン４４スキッピングのほぼ１００％を媒介することができた（図１Ｄ－Ｆ）。この実験では、ＡＡＶ１．Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３を含むＡＡＶ）を陽性対照として使用した。
【0097】
実施例４
エクソン４４スキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡを含むｒＡＡＶ（ＡＡＶ９．Ｕ７△ｅｘ４４）の筋肉内送達は増加したジストロフィン発現をもたらす
６匹の２か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスに、ＡＡＶ１．Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１．Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７を含むＡＡＶ）、およびＡＡＶ１．Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６を含むＡＡＶ）を、２．５ｅ１１ＡＡＶ１ウイルス粒子で、各前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。ウイルス注射後１か月で、筋肉を３か月齢マウスから抽出し、ＲＴ－ＰＣＲによってヒトジストロフィン発現を測定することによってエクソンスキッピング効率を決定した（図２）。図２は、上記に示される３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターでの注射後１か月での前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス＃５７および＃５８（未処理マウス）におけるエクソンスキッピングの不在、マウス＃６０および＃６１（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー、すなわち、配列番号２７を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピング、マウス＃６６および＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４、すなわち、配列番号２３を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピング、ならびにマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４、すなわち、配列番号２６を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピングを示した。Ｂｌａｃｋ ６（Ｂｌ６）は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであり、したがって、ヒトＤＭＤの陰性対照である。
エクソン４４スキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡを含むｒＡＡＶ（ＡＡＶ９．Ｕ７△ｅｘ４４）の筋肉内送達は増加したジストロフィン発現をもたらす
６匹の２か月齢ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスに、ＡＡＶ１．Ｕ７－ＳＤ４４（配列番号２３を含むＡＡＶ）、ＡＡＶ１．Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７を含むＡＡＶ）、およびＡＡＶ１．Ｕ７－４ｘＳＤ４４（配列番号２６を含むＡＡＶ）を、２．５ｅ１１ＡＡＶ１ウイルス粒子で、各前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。ウイルス注射後１か月で、筋肉を３か月齢マウスから抽出し、ＲＴ－ＰＣＲによってヒトジストロフィン発現を測定することによってエクソンスキッピング効率を決定した（図２）。図２は、上記に示される３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターでの注射後１か月での前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトＤＭＤエクソン４４の効率的なスキッピングを示す。これらのＲＴ－ＰＣＲ結果は、マウス＃５７および＃５８（未処理マウス）におけるエクソンスキッピングの不在、マウス＃６０および＃６１（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー、すなわち、配列番号２７を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピング、マウス＃６６および＃７２（Ｕ７－ＳＤ４４、すなわち、配列番号２３を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピング、ならびにマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４、すなわち、配列番号２６を含むＡＡＶが注射されたマウス）における効率的なエクソンスキッピングを示した。Ｂｌａｃｋ ６（Ｂｌ６）は、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しない野生型マウスであり、したがって、ヒトＤＭＤの陰性対照である。
【0098】
ジストロフィン発現は、免疫蛍光法によって確認した（図３Ａ－Ｅ）。図３Ａ－Ｅは、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月の２か月齢のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンの免疫蛍光発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。
【0099】
これらの免疫蛍光実験結果は、＃５８（未処理ｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウス、図３Ａ）から、Ｂｌａｃｋ ６（Ｂｌ６）対照マウス（図３Ｂ）、すなわち、ヒトＤＭＤ遺伝子を含有しないＢｌ６マウスから、しかしながら、この免疫蛍光実験において使用される抗体は、ヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識し、マウス＃７２（Ｕ７．ＳＤ４４が注射されたマウス、図３Ｃ）から、マウス＃６０（Ｕ７－ＳＤ４４スタッファーが注射されたマウス、図３Ｄ）から、ならびにマウス＃８４（Ｕ７－４ｘＳＤ４４が注射されたマウス）（図３Ｅ）から得た。
【0100】
１か月後、筋肉の免疫染色は、ジストロフィンがすべての３つのｒＡＡＶベクターによるウイルス感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクター（Ｕ７－ＳＤ４４－スタッファー、すなわち、配列番号２７を含むＡＡＶが注射されたマウス、図３Ｄ）および４ｘ－ＳＤ４４ベクター（Ｕ７－４ｘＳＤ４４、すなわち、配列番号２６を含むＡＡＶが注射されたマウス、図３Ｅ）が筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。
【0101】
ジストロフィン発現は、ウエスタンブロット分析によって確認した（図４）。図４は、３つの異なるｒＡＡＶウイルスベクターの注射後１か月のｈＤＭＤ／ｍｄｘ ｄｅｌ４５マウスの前脛骨（ＴＡ）筋におけるヒトジストロフィンのウエスタンブロット発現を示す。実験は、２匹のマウスの各ＴＡで実施した（構築物当たりｎ＝４のＴＡ筋）。１か月後、ウエスタンブロット結果は、ジストロフィンが３つすべてのｒＡＡＶウイルスベクターに感染後に発現し、ＳＤ４４－スタッファーベクターが筋肉において最高レベルのジストロフィン発現をもたらすように見えることを示す。これらのウエスタンブロット結果は、マウス＃５７および＃５８（未処理マウス）から、マウス＃６０および＃６１（Ｕ７．ＳＤ４４－スタッファー、すなわち、配列番号２７を含むＡＡＶが注射されたマウス）から、マウス＃６６および＃７２（Ｕ７．ＳＤ４４、すなわち、配列番号２３を含むＡＡＶが注射されたマウス）から、ならびにマウス＃８４（Ｕ７．４ｘＳＤ４４、すなわち、配列番号２６を含むＡＡＶが注射されたマウス）から得た。このウエスタンブロットにおいて使用される抗体はヒトおよびマウスジストロフィンの両方を認識するため、ジストロフィンはＢｌ６対照によって発現する。
【0102】
したがって、Ｕ７．ＳＤ４４（配列番号２３を含むＡＡＶ）、Ｕ７．４ｘＳＤ４４（配列番号２６を含むＡＡＶ）、およびＵ７．ＳＤ４４－スタッファー（配列番号２７を含むＡＡＶ）を含むすべての３つのｒＡＡＶベクターにおけるＡＡＶ．Ｕ７ｓｎＲＮＡ－アンチセンスの送達は、エクソン４４に隣接するイントロン配列を標的とすることを含み、エクソン４４を標的とすることによってジストロフィン発現を誘導した。すべての構築物は、強力なジストロフィン発現につながる堅牢なエクソンスキッピングを媒介したが、ＳＤ４４－スタッファー構築物および４ｘ－ＳＤ４４構築物を含むｒＡＡＶ（図３Ｄ－Ｅおよび図４）は、これらの実験において他のものよりも効率的であるように見えた。
【0103】
実施例５
エクソン４４スキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡを含むｒＡＡＶ（ＡＡＶ９．Ｕ７△ｅｘ４４）の全身送達は増加したジストロフィン発現をもたらす
１０匹のｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（２か月齢）に、ＡＡＶ９．Ｕ７－ＳＤ４－スタッファーまたはＡＡＶ９．Ｕ７－４Ｘ－ＳＤ４４（ＡＡＶ９にクローン化された、それぞれ、配列番号２７および２６）を、３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～２ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の様々な用量で、側頭静脈（すなわち、新生児マウス）または尾静脈（すなわち、２か月齢マウス）に注射する。これらのウイルスベクターで形質導入されたマウスは、注射後１、３、または６か月で収集する。エクソンスキッピング効率は、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫蛍光法、および上記で本明細書に記載されるプロトコルを使用したウエスタンブロット分析によってジストロフィン発現を測定することによって決定する。
エクソン４４スキッピングを誘導するＵ７－ｓｎＲＮＡを含むｒＡＡＶ（ＡＡＶ９．Ｕ７△ｅｘ４４）の全身送達は増加したジストロフィン発現をもたらす
１０匹のｈＤＭＤｄｅｌ４５／ｍｄｘマウス（２か月齢）に、ＡＡＶ９．Ｕ７－ＳＤ４－スタッファーまたはＡＡＶ９．Ｕ７－４Ｘ－ＳＤ４４（ＡＡＶ９にクローン化された、それぞれ、配列番号２７および２６）を、３ｅ１３ｖｇ／ｋｇ～２ｅ１４ｖｇ／ｋｇの範囲の様々な用量で、側頭静脈（すなわち、新生児マウス）または尾静脈（すなわち、２か月齢マウス）に注射する。これらのウイルスベクターで形質導入されたマウスは、注射後１、３、または６か月で収集する。エクソンスキッピング効率は、ＲＴ－ＰＣＲ、免疫蛍光法、および上記で本明細書に記載されるプロトコルを使用したウエスタンブロット分析によってジストロフィン発現を測定することによって決定する。
【0104】
本開示は特定の実施形態といった点で記載された一方、その変更および修正が生じることが当業者に理解されるだろう。したがって、特許請求の範囲内に見られるようなこのような制限のみが本開示に課せられるべきである。
【0105】
本出願で参照されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、それらが参照される内容に特に留意される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【配列表】
【国際調査報告】