特表2022-543278細胞軌道を測定するためのシングルセル分析のための方法及び装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-11
(54)【発明の名称】細胞軌道を測定するためのシングルセル分析のための方法及び装置
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221003BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20221003BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221003BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20221003BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20221003BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12N15/10 100Z
C12Q1/6844 Z
C12M1/34 Z
C12M1/34 A
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022507335
(86)(22)【出願日】2020-08-05
(85)【翻訳文提出日】2022-03-17
(86)【国際出願番号】 US2020045001
(87)【国際公開番号】W WO2021026228
(87)【国際公開日】2021-02-11
(31)【優先権主張番号】62/882,750
(32)【優先日】2019-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521325444
【氏名又は名称】ミッション バイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ラフ デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】ディングラ ダリア
(72)【発明者】
【氏名】オーイ アイク
(72)【発明者】
【氏名】メンデス ペドロ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029AA27
4B029BB11
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB06
4B063QA13
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4B063QR08
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4B063QS03
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
ＲＮＡ転写産物のＲＮＡ配列決定と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのＤＮＡ配列決定とを組み合わせて使用するシングルセル分析を行い、シングルセルの軌道を測定する。プロテアーゼまたはトランスポザーゼを含まない試薬を使用して、個別の細胞を封入し溶解する。細胞溶解物は、ＲＮＡ転写産物、及びパッケージ化ＤＮＡ（例えば、クロマチンとしてパッケージされるＤＮＡ）を含む。パッケージ化ＤＮＡ内でＤＮＡのセグメントをプライミングし、増幅し、配列決定して、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのシーケンスリードを生成する。ＲＮＡ転写産物を逆転写してｃＤＮＡを生成し、これを次いでプライミングし、増幅し、配列決定してシーケンスリードを生成する。ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑによるシーケンスリードにより、細胞の異なる状態が明らかとなり、故に、細胞軌道を予測するのに有用である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞の細胞軌道を予測するための方法であって、試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも１つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、
前記細胞を前記エマルション内に溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、０．５０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び２．５％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
少なくとも１つのｃＤＮＡ分子を、前記少なくとも１つのＲＮＡを使用して生成することと、
前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、第２のエマルションに封入することと、
複数の核酸を生成するために、核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第２のエマルション内で行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子のうちの１つに由来する第１の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第２の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第１の核酸及び前記第２の核酸を配列決定することと
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記試薬が、０．１０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記試薬が、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記試薬がプロテアーゼを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記試薬が、０．１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記試薬が、０．０１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第２のエマルション内で行うことが、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第２のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第２のエマルションに封入することをさらに含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、第１のエマルションを４０℃～６０℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記試薬が逆転写酵素を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記試薬がＮＰ－４０を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記配列決定した第１の核酸及び前記配列決定した第２の核酸を使用して、前記細胞軌道を予測することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第１の核酸及び前記配列決定した第２の核酸を使用して、前記細胞の２つの異なる状態を測定することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記配列決定した第１の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第２の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１つのＲＮＡが、１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記少なくとも１つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか１つである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記第２のエマルションに、第１のバーコード及び第２のバーコードを、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ、少なくとも１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記第１の核酸が前記第１のバーコードを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記第２の核酸が前記第２のバーコードを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが同じバーコード配列を共有する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記第２のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写することが、前記第１のエマルション内で生じる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも５０％が、長さが１００～５００塩基対である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも１つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、前記細胞を前記エマルションに溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、０．５０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び２．５％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
前記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写することにより、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子を生成することと、
前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び試薬を、第２のエマルション内に封入することと、
複数の核酸を生成するために、前記第２のエマルション内でＰＣＲ反応を行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子のうちの１つに由来する第１の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第２の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第１の核酸及び前記第２の核酸を配列決定することと
を行うように構成された装置
を含む、システム。
【請求項30】
前記装置と通信可能に連結した演算装置であって、前記配列決定した第１の核酸及び前記配列決定した第２の核酸を使用することにより、細胞軌道を予測するように構成されている、前記演算装置をさらに含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項31】
前記試薬が、０．１０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項32】
前記試薬が、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項33】
前記試薬がプロテアーゼを含まない、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項34】
前記試薬が、０．１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、請求項２９～３３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項35】
前記試薬が、０．０１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、請求項２９～３３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項36】
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、請求項２９～３３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項37】
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第２のエマルション内で行うことが、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、請求項２９～３６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項38】
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第２のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第２のエマルションに封入することをさらに含む、
請求項２９～３７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項39】
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、第１のエマルションを４０℃～６０℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項40】
前記試薬が逆転写酵素を含む、請求項２９～３９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項41】
前記試薬がＮＰ－４０を含む、請求項２９～４０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項42】
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第１の核酸及び前記配列決定した第２の核酸を使用して、前記細胞の２つの異なる状態を測定することを含む、請求項３０～４１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項43】
前記配列決定した第１の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第２の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、請求項４２に記載のシステム。
【請求項44】
前記少なくとも１つのＲＮＡが、１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、請求項４２または４３に記載のシステム。
【請求項45】
前記少なくとも１つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、請求項４２または４３に記載のシステム。
【請求項46】
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか１つである、請求項３０～４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項47】
前記第２のエマルションに、第１のバーコード及び第２のバーコードを、前記少なくとも１つのｃＤＮＡ、少なくとも１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入するように、前記装置がさらに構成される、請求項２９～４６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項48】
前記第１の核酸が前記第１のバーコードを含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項49】
前記第２の核酸が前記第２のバーコードを含む、請求項４７または４８に記載のシステム。
【請求項50】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが同じバーコード配列を共有する、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項51】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、請求項４７～４９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項52】
前記第１のバーコード及び前記第２のバーコードが、前記第２のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、請求項４７～５１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項53】
前記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写することが、前記第１のエマルション内で生じる、請求項２９～５２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項54】
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２９～５３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項55】
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、請求項２９～５４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項56】
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも５０％が、長さが１００～５００塩基対である、請求項５５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１９年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８２，７５０号の利益及び優先権を主張し、これは、開示全体が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８２，７５０号の利益及び優先権を主張し、これは、開示全体が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景
シングルセル分析は、数年にわたって著しく進歩しており、細胞ゲノム、トランスクリプトミクス、及び／またはタンパク質発現の調査を可能にしている。以前の試みでは、並行ＲＮＡ配列決定、及び、配列決定を用いるトランスポザーゼがアクセス可能なクロマチンに対するアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）が利用されていた（例えば、米国特許出願第１６／２０６，１６８号（特許文献１）を参照されたい）。しかし、これらのワークフロー手順では、細胞内で検体を処理するための、プロテアーゼ及びトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼ）などの、様々な生物学的試薬が必要となる。様々な生物学的試薬を含めることで、ワークフロープロセスが著しく複雑になり、ノイズのある、かつ／または、欠陥のあるシーケンスリードがもたらされ得る。さらに、シングルセル分析のために様々な生物学的試薬を含めることは、特に、様々な試験体に由来する細胞数の増加を分析するシナリオにおいて、コストのかかる試みとなる。
シングルセル分析は、数年にわたって著しく進歩しており、細胞ゲノム、トランスクリプトミクス、及び／またはタンパク質発現の調査を可能にしている。以前の試みでは、並行ＲＮＡ配列決定、及び、配列決定を用いるトランスポザーゼがアクセス可能なクロマチンに対するアッセイ（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）が利用されていた（例えば、米国特許出願第１６／２０６，１６８号（特許文献１）を参照されたい）。しかし、これらのワークフロー手順では、細胞内で検体を処理するための、プロテアーゼ及びトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼ）などの、様々な生物学的試薬が必要となる。様々な生物学的試薬を含めることで、ワークフロープロセスが著しく複雑になり、ノイズのある、かつ／または、欠陥のあるシーケンスリードがもたらされ得る。さらに、シングルセル分析のために様々な生物学的試薬を含めることは、特に、様々な試験体に由来する細胞数の増加を分析するシナリオにおいて、コストのかかる試みとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】米国特許出願第１６／２０６，１６８号
【発明の概要】
【0004】
概要
本開示は概して、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの、ＲＮＡ配列決定及びＤＮＡ配列決定の組み合わせによる、シングルセル分析のための方法及び装置に関する。ここで、ＤＮＡ配列決定ワークフロープロセスは、ＡＴＡＣ－ｓｅｑに対する代替法を提示する。ＤＮＡ配列決定ワークフローは、Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼの使用を最小限に抑えるか、または避ける。このような方法は、エマルションに細胞を封入する第１の工程と、細胞を、細胞を溶解させる試薬に曝露することと、を含む、２段階ワークフローを伴う。様々な実施形態では、試薬は、細胞を溶解するための洗剤を含むが、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼの使用を最小限に抑えるか、または避ける。プロテアーゼまたはトランスポザーゼの使用を最小限に抑えるか、または避けるこのような試薬は、必要な消耗品が少なくなることでシングルセルワークフロープロセスが簡素化されるために好ましい。さらに、このような試薬は、特に、多数の細胞を分析する際に、シングルセルワークフロープロセスの消耗品及び操作のコストを下げる。細胞溶解物は、ＲＮＡ転写産物、及びパッケージ化ＤＮＡ（例えば、クロマチンとしてパッケージされるＤＮＡ）を含む。ＲＮＡ転写産物は逆転写され、対応するｃＤＮＡを生成する。第２の工程は、少なくとも、ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、バーコード及び／または反応混合物と共に第２のエマルションに封入することを伴う。第２のエマルションの中で、ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡはバーコード化を受け、反応混合物を使用して、核酸増幅反応を行う。パッケージ化ＤＮＡ内にアクセス可能なＤＮＡ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）のセグメントをプライミングして、増幅することができる。増幅核酸を配列決定して、ＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来するシーケンスリードを生成する。生成したシーケンスリードを分析して、シングルセルの軌道を測定する。例えば、ＲＮＡ転写産物のシーケンスリードは、シングルセルの以前の状態についての速写を提供する一方で、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのシーケンスリードは、シングルセルの将来の状態の速写を提供する。
本開示は概して、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの、ＲＮＡ配列決定及びＤＮＡ配列決定の組み合わせによる、シングルセル分析のための方法及び装置に関する。ここで、ＤＮＡ配列決定ワークフロープロセスは、ＡＴＡＣ－ｓｅｑに対する代替法を提示する。ＤＮＡ配列決定ワークフローは、Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼの使用を最小限に抑えるか、または避ける。このような方法は、エマルションに細胞を封入する第１の工程と、細胞を、細胞を溶解させる試薬に曝露することと、を含む、２段階ワークフローを伴う。様々な実施形態では、試薬は、細胞を溶解するための洗剤を含むが、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼの使用を最小限に抑えるか、または避ける。プロテアーゼまたはトランスポザーゼの使用を最小限に抑えるか、または避けるこのような試薬は、必要な消耗品が少なくなることでシングルセルワークフロープロセスが簡素化されるために好ましい。さらに、このような試薬は、特に、多数の細胞を分析する際に、シングルセルワークフロープロセスの消耗品及び操作のコストを下げる。細胞溶解物は、ＲＮＡ転写産物、及びパッケージ化ＤＮＡ（例えば、クロマチンとしてパッケージされるＤＮＡ）を含む。ＲＮＡ転写産物は逆転写され、対応するｃＤＮＡを生成する。第２の工程は、少なくとも、ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、バーコード及び／または反応混合物と共に第２のエマルションに封入することを伴う。第２のエマルションの中で、ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡはバーコード化を受け、反応混合物を使用して、核酸増幅反応を行う。パッケージ化ＤＮＡ内にアクセス可能なＤＮＡ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）のセグメントをプライミングして、増幅することができる。増幅核酸を配列決定して、ＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来するシーケンスリードを生成する。生成したシーケンスリードを分析して、シングルセルの軌道を測定する。例えば、ＲＮＡ転写産物のシーケンスリードは、シングルセルの以前の状態についての速写を提供する一方で、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのシーケンスリードは、シングルセルの将来の状態の速写を提供する。
【0005】
細胞に対する細胞軌道の予測方法であって、当該方法が、試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、当該細胞が、少なくとも１つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、上記封入することと、上記細胞を上記エマルションに溶解することであって、それにより、上記ＲＮＡ及び上記パッケージ化ＤＮＡを上記試薬に曝露し、上記試薬が、０．５０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ、及び２．５％（ｖ／ｖ）のトランスポザーゼを含む、上記溶解することと、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子を、上記少なくとも１つのＲＮＡを使用して生成することと、上記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、上記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を第２のエマルションに封入することと、複数の核酸を生成するために、核酸増幅反応を、上記反応混合物を使用して上記第２のエマルション内で行うことであって、上記複数の核酸が、上記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子のうちの１つに由来する第１の核酸、及び、上記パッケージ化ＤＮＡのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡの上記セグメントに由来する第２の核酸を含む、上記行うことと、上記第１の核酸及び上記第２の核酸を配列決定することと、を含む、上記方法を本明細書で記載する。様々な実施形態では、試薬は、０．１０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む。様々な実施形態では、試薬は、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む。様々な実施形態では、試薬はプロテアーゼを含まない。様々な実施形態では、試薬は、０．１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む。様々な実施形態では、試薬は、０．０１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む。様々な実施形態では、試薬はトランスポザーゼを含まない。
【0006】
様々な実施形態では、核酸増幅反応を、反応混合物を使用して第２のエマルション内で行い、複数の核酸を生成することは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントをパッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのプライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと、を含む。様々な実施形態では、方法は、エマルション内で、パッケージ化ＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を第２のエマルションに封入することは、伸長生成物を第２のエマルションに封入することをさらに含む。様々な実施形態では、パッケージ化ＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することは、第１のエマルションを４０℃～６０℃の温度に曝露することにより、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを脱安定化させることを含む。
【0007】
様々な実施形態では、試薬は逆転写酵素を含む。様々な実施形態では、試薬はＮＰ－４０を含む。様々な実施形態では、方法は、配列決定した第１の核酸及び配列決定した第２の核酸を使用して、細胞軌道を予測することをさらに含む。様々な実施形態では、方法は、配列決定した第１の核酸及び配列決定した第２の核酸を使用して、細胞軌道を予測することをさらに含む。様々な実施形態では、配列決定した第１の核酸を使用して、細胞の以前の状態を測定し、配列決定した第２の核酸を使用して、細胞の将来の状態を測定する。
【0008】
様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡを以前に、１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から転写することにより、細胞の以前の状態と将来の状態との間での共通性を示す。様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡを、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写することにより、細胞の以前の状態から、細胞の将来の状態への変化を示す。様々な実施形態では、細胞軌道は、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、または、外部刺激に対する将来の細胞応答のうちの１つである。
【0009】
様々な実施形態では、方法は、第２のエマルションに、第１のバーコード及び第２のバーコードを、少なくとも１つのｃＤＮＡ、少なくとも１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び反応混合物と共に封入することをさらに含む。様々な実施形態では、第１の核酸は第１のバーコードを含む。様々な実施形態では、第２の核酸は第２のバーコードを含む。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、同じバーコード配列を共有する。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、異なる配列を共有する。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、第２のエマルション内でビーズに解放可能に付着している。
【0010】
様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡの逆転写は、第１のエマルション内で生じる。様々な実施形態では、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。様々な実施形態では、複数の核酸は、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む。様々な実施形態では、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の少なくとも５０％は、長さが１００～５００塩基対である。
【0011】
さらに、システムであって、試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、当該細胞が、少なくとも１つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、上記封入することと、上記細胞を上記エマルションに溶解することであって、それにより、上記ＲＮＡ及び上記パッケージ化ＤＮＡを上記試薬に曝露し、上記試薬が、０．５０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ、及び２．５％（ｖ／ｖ）のトランスポザーゼを含む、上記溶解することと、上記少なくとも１つのＲＮＡを逆転写することにより、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子を生成することと、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、パッケージ化ＤＮＡ、及び試薬を第２のエマルションに封入することと、複数の核酸を生成するために、第２のエマルション内でＰＣＲ反応を行うことであって、上記複数の核酸が、上記少なくとも１つのｃＤＮＡ分子のうちの１つに由来する第１の核酸、及び、上記パッケージ化ＤＮＡのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡの上記セグメントに由来する第２の核酸を含む、行うことと、上記第１の核酸及び上記第２の核酸を配列決定することと、を行うように構成された装置を含む上記システムを、本明細書で開示する。
【0012】
様々な実施形態では、システムは、装置と通信可能に連結した演算装置であって、当該演算装置が、配列決定した第１の核酸及び第２の核酸を使用することにより、細胞軌道を予測するように構成されている、上記演算装置をさらに含む。
【0013】
様々な実施形態では、試薬は、０．１０ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む。様々な実施形態では、試薬は、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む。様々な実施形態では、試薬はプロテアーゼを含まない。様々な実施形態では、試薬は、０．１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む。様々な実施形態では、試薬は、０．０１％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む。様々な実施形態では、試薬はトランスポザーゼを含まない。
【0014】
様々な実施形態では、核酸増幅反応を、反応混合物を使用して第２のエマルション内で行い、複数の核酸を生成することは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントをパッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのプライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと、を含む。
【0015】
様々な実施形態では、システムは、エマルション内で、パッケージ化ＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成するようにさらに構成され、少なくとも１つのｃＤＮＡ分子、パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を第２のエマルションに封入することは、伸長生成物を第２のエマルションに封入することをさらに含む。様々な実施形態では、パッケージ化ＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することは、第１のエマルションを４０℃～６０℃の温度に曝露することにより、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを脱安定化させることを含む。
【0016】
様々な実施形態では、試薬は逆転写酵素を含む。様々な実施形態では、試薬はＮＰ－４０を含む。様々な実施形態では、方法は、配列決定した第１の核酸及び配列決定した第２の核酸を使用して、細胞軌道を予測することをさらに含む。様々な実施形態では、配列決定した第１の核酸を使用して、細胞の以前の状態を測定し、配列決定した第２の核酸を使用して、細胞の将来の状態を測定する。
【0017】
様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡを以前に、１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から転写することにより、細胞の以前の状態と将来の状態との間での共通性を示す。様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡを、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写することにより、細胞の以前の状態から、細胞の将来の状態への変化を示す。様々な実施形態では、細胞軌道は、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、または、外部刺激に対する将来の細胞応答のうちの１つである。様々な実施形態では、装置は、第２のエマルションに、第１のバーコード及び第２のバーコードを、少なくとも１つのｃＤＮＡ、少なくとも１つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び反応混合物と共に封入するようにさらに構成される。
【0018】
様々な実施形態では、第１の核酸は第１のバーコードを含む。様々な実施形態では、第２の核酸は第２のバーコードを含む。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、同じバーコード配列を共有する。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、異なる配列を共有する。様々な実施形態では、第１のバーコード及び第２のバーコードは、第２のエマルション内でビーズに解放可能に付着している。様々な実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡの逆転写は、第１のエマルション内で生じる。様々な実施形態では、核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応である。
【0019】
様々な実施形態では、複数の核酸は、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む。様々な実施形態では、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の少なくとも５０％は、長さが１００～５００塩基対である。
【0020】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明、及び添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】配列決定のためにシングルセルを処理し、増幅した核酸分子を生成する実施形態を示す。
【図2】シングルセルの検体に由来する配列決定リードを用いてシングルセルの細胞軌道を測定するためのフロープロセスである。
【図3】Ａ～Ｃは、プロテアーゼまたはトランスポザーゼの使用を含まない実施形態に従い、シングルセルの検体をエマルション中で処理し、放出することを示す。
【図4A】第１の実施形態に従い、ＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを第１のエマルション中で処理することを示す。
【図4C】第２の実施形態に従い、ＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを第１のエマルション中で処理することを示す。
【図5A】第１の実施形態に従い、細胞軌道を測定するためにシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した、配列決定リードを示す。
【図5B】第２の実施形態に従い、細胞軌道を測定するためにシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した、配列決定リードを示す。
【図6】シングルセル分析を行って、細胞軌道を予測するための、シングルセルワークフロー装置及び演算装置を含む、全体のシステム環境を示す。
【図8A】Ｋ－５６２細胞のオリゴｄＴプライミングにより入手したイントロン領域において、リードにより観察されたＤＮＡアンプリコンのサイズを示し、プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼ（Ｔｎ５）は封入の間に使用しなかった。
【図8B】参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＣＣＬ２遺伝子及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。
【図8C】参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＣＣＬ２遺伝子及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。
【図9A】ＭＣＦ７細胞の遺伝子特異的プライミングにより入手したイントロン領域において、リードにより観察されたＤＮＡアンプリコンのサイズを示し、プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼ（Ｔｎ５）は封入の間に使用しなかった。
【図9B】参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＶＩＭ遺伝子及びＭＫＩ６７遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。
【図9C】参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＶＩＭ遺伝子及びＭＫＩ６７遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0022】
詳細な説明
定義
請求項及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載するように定義する。
定義
請求項及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に記載するように定義する。
【0023】
用語「対象」または「患者」は、同じ意味で用いられ、生体、ヒトまたは非ヒト、哺乳類または非哺乳類、雄または雌を包含する。
【0024】
用語「試料」または「試験試料」は、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針穿刺吸引、洗浄試料、擦過、外科的切開、または、当該技術分野において公知の他の介入もしくは他の手段を含む手段により対象から採取された、シングルセルもしくは複数細胞、または細胞の断片、または、血液試料などの体液のアリコートを含むことができる。
【0025】
用語「検体」とは、細胞の構成成分を指す。細胞検体は、細胞の状態、挙動、または軌道を理解するのに有益である。したがって、本明細書に記載するシステム及び方法を用いて、細胞の１つ以上の検体のシングルセル分析を行うことは、細胞の状態または挙動を測定するのに有益である。検体の例としては、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、多糖類、糖、脂質、小分子、またはこれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、シングルセル分析は、ＲＮＡ及びＤＮＡなどの、２つの異なる検体を分析することを伴う。特定の実施形態では、シングルセル分析は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質などの、細胞の３つ以上の異なる検体を分析することを伴う。
【0026】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する個別の要素はドロップレットである。用語「エマルション」、「滴」、「ドロップレット」、及び「マイクロドロップレット」は、本明細書では同じ意味で用いられ、第１の流体相と不混和性である第２の流体相（例えば、油）により結合した、少なくとも第１の流体相、例えば水相（例えば水）を含有する、小型で、一般的には球状の構造体を意味する。いくつかの実施形態では、本開示に従ったドロップレットは、例えば、第２の不混和性流体相、例えば水相流体（例えば水）により結合した、第１の流体相、例えば油を含有することができる。いくつかの実施形態では、第２の流体相は、不混和性相キャリア流体である。故に、本開示に従ったドロップレットは、油中水型エマルション、または水中油型エマルションとして提供されてよい。ドロップレットは、個別の要素に対して、本明細書に記載するようにサイジングされる、及び／または形状化されることができる。例えば、本開示に従ったドロップレットは一般に、直径が１μｍ～１０００μｍ（両端を含む）の範囲である。本開示に従ったドロップレットを使用して、細胞、核酸（例えばＤＮＡ）、酵素、試薬、反応混合物、及び様々な他の構成成分を封入することができる。用語「エマルション」は、マイクロ流体デバイス内で、またはこれにより作製され、かつ／または、マイクロ流体デバイスにより流されるか、もしくはアプライされるエマルションを指すために使用することができる。
【0027】
用語「細胞軌道」、または「細胞の軌道」とは、細胞が、第１の状態から第２の状態に変化することを意味する。「細胞軌道」は、ＲＮＡ－ｓｅｑとＤＮＡ－ｓｅｑを組み合わせたシングルセル分析（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの配列決定）により測定される。ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の過去の状態の速写を提供する一方で、ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の将来の状態の速写を提供する。細胞軌道の例としては、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、外部刺激（例えば治療）に対する将来の細胞応答のいずれかが挙げられる。
【0028】
「相補性」とは、核酸が、従来のワトソン・クリック形式または従来型とは異なる他の形式のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力、すなわち、別の核酸配列とハイブリダイズする能力を指す。本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」とは、分子が、特定のヌクレオチド配列のみと、低ストリンジェント、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件で結合、二本鎖形成またはハイブリダイズすることを指す（その配列が、複合混合物（例えば全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合を含む）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３を参照されたい。ポリヌクレオチドのある特定の位置におけるヌクレオチドが、アンチパラレルなＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の同じ位置におけるヌクレオチドとワトソン・クリック対を形成できる場合には、そのポリヌクレオチドと、そのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その位置において、互いに相補的である。そのポリヌクレオチドと、そのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、所望のプロセスに影響が及ぶように、各分子における対応する位置が十分な数、互いにハイブリダイズまたはアニールすることができるヌクレオチドで占められている場合には、互いに「実質的に相補的」である。相補的な配列は、ストリンジェントな条件下でアニールして、相補鎖合成起点として機能する３’末端をもたらすことのできる配列である。
【0029】
「同一性」とは、当該技術分野において知られているように、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であって、それらの配列を比較することによって求めたものである。当該技術分野においては、「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の関連度であって、それらの配列からなる鎖間の一致率を求めたものも意味する。「同一性」及び「類似性」は、既知の方法によって容易に算出でき、その方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１及びＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，Ｓｉａｍ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない。加えて、同一性パーセントの値は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ８．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍｄ．）のＡｌｉｇｎＸというコンポーネントのデフォルト設定を用いて生成したアミノ酸配列アラインメント及びヌクレオチド配列アラインメントから得ることができる。同一性を求める好ましい方法は、試験する配列間の一致率が最も大きくなるように設計する。同一性及び類似性を求める方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を求めるための好ましいコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））が挙げられるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ Ｘというプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の供給源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））。周知であるＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて、同一性を求めてもよい。
【0030】
「増幅する」、「増幅すること」、「増幅反応」という用語、及びそれらの類似表現は概して、核酸分子の少なくとも一部（鋳型核酸分子という）を複製またはコピーして、追加の核酸分子を少なくとも１つもたらすいずれかの作用またはプロセスを指す。その追加の核酸分子は任意に、その鋳型核酸分子の少なくとも相当な部分と実質的に同一であるかまたは実質的に相補的である配列を含む。その鋳型核酸分子は、一本鎖であることも、二本鎖であることもでき、その追加の核酸分子は独立して、一本鎖であることも、二本鎖であることもできる。いくつかの実施形態では、増幅には、核酸分子の少なくとも相当な部分を少なくとも１コピー作製するか、または核酸分子の少なくとも相当な部分と相補的である核酸配列を少なくとも１コピー作製するための、酵素を触媒とする鋳型依存性のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応が含まれる。増幅には任意に、核酸分子の線形的または指数関数的な複製が含まれる。いくつかの実施形態では、このような増幅は、等温条件を用いて行い、別の実施形態では、このような増幅には、熱サイクリングを含めることができる。いくつかの実施形態では、増幅は、１回の増幅反応で複数の標的配列を同時に増幅することを含むマルチプレックス増幅である。その標的配列の少なくともいくつかは、１回の増幅反応に含まれる同じ核酸分子または異なる標的核酸分子に位置することができる。いくつかの実施形態では、「増幅」には、ＤＮＡベース及びＲＮＡベースの核酸の少なくとも相当部分を単独で、または組み合わせて増幅することが含まれる。その増幅反応は、一本鎖または二本鎖の核酸基質を含むことができ、さらに、当業者に知られている増幅プロセスのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、その増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、増幅反応としては、ＬＡＭＰなどの等温増幅反応が挙げられる。本発明では、核酸の「合成」及び「増幅」という用語を使用する。本発明では、核酸の合成とは、合成起点として機能するオリゴヌクレオチドから、核酸を延長または伸長させることを意味する。この合成のみならず、他の核酸の形成と、この形成された核酸の延長反応または伸長反応も連続的に行う場合、これらの一連の反応は、包括して増幅という。採用した増幅技術によって作製されたポリ核酸は一般に、「アンプリコン」または「増幅産物」という。
【0031】
ＰＣＲベースのアッセイ、例えば定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、または等温増幅のようないずれかの核酸増幅法を用いて、別個の物体、またはその構成成分の１つ以上、例えば、その物体に封入された細胞に存在するある特定の核酸、例えば、対象とする遺伝子の存在を検出してよい。このようなアッセイは、マイクロフルイディクスデバイスもしくはその一部、またはいずれかの他の好適な位置にある別個の物体に適用できる。このような増幅またはＰＣＲベースのアッセイの条件は、経時的に核酸の増幅を検出することを含んでよく、１つ以上の方法が異なっていてよい。
【0032】
本明細書に示されているある特定の実施形態で用いられる増幅反応では、多くの核酸ポリメラーゼを使用することができ、そのポリメラーゼには、ヌクレオチド（そのアナログを含む）が重合して核酸鎖となるのを触媒できるいずれの酵素も含まれる。ヌクレオチドのこのような重合は、鋳型依存的に行うことができる。このようなポリメラーゼとしては、天然のポリメラーゼ、そのサブユニット及びトランケート体のいずれか、変異ポリメラーゼ、バリアントポリメラーゼ、組み換えポリメラーゼ、融合ポリメラーゼ、または別段に操作したポリメラーゼ、化学的に改変したポリメラーゼ、合成の分子またはアセンブリ、ならびに上記のような重合を触媒する能力を保持するこれらのアナログ、誘導体または断片のいずれかを挙げることができるが、これらに限らない。任意に、そのポリメラーゼは、１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているか、そのポリメラーゼから１つ以上のアミノ酸が挿入もしくは欠失されているか、または２つ以上のポリメラーゼの一部分が連結されていることを伴う変異を１つ以上含む変異ポリメラーゼであることができる。典型的には、そのポリメラーゼは、ヌクレオチドの結合及び／またはヌクレオチドの重合の触媒を行うことができる活性部位を１つ以上含む。いくつかの例示的なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限らない。本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ」という用語及びその類似表現には、連結し合った少なくとも２つの部分を含む融合タンパク質も含まれ、その第１の部分は、ヌクレオチドが重合して核酸鎖となるのを触媒できるペプチドを含むとともに、第２のポリペプチドを含む第２の部分に連結されている。いくつかの実施形態では、その第２のポリペプチドは、レポーター酵素またはプロセッシビティ向上ドメインを含むことができる。任意に、そのポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性またはターミナルトランスフェラーゼ活性を有することができる。いくつかの実施形態では、そのポリメラーゼは任意に、例えば、熱を利用するか、化学物質によるか、または新たな量のポリメラーゼを反応混合物に再度加えることによって再活性化させることができる。いくつかの実施形態では、そのポリメラーゼとしては、任意に再活性化させることができるホットスタートポリメラーゼまたはアプタマーベースのポリメラーゼを挙げることができる。
【0033】
「標的プライマー」または「標的特異的プライマー」という用語、及びそれらの類似表現は、結合部位の配列と相補的であるプライマーを指す。標的プライマーは概して、標的核酸配列と少なくとも部分的に相補的である配列を少なくとも１つ含む一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド、典型的にはオリゴヌクレオチドである。
【0034】
「フォワードプライマー結合部位」及び「リバースプライマー結合部位」とは、鋳型ＤＮＡ及び／またはアンプリコンの領域のうち、フォワードプライマー及びリバースプライマーが結合する領域を指す。これらのプライマーは、元の鋳型ポリヌクレオチドの領域のうち、増幅の際に指数関数的に増幅される領域を定める働きをする。いくつかの実施形態では、追加のプライマーが、フォワードプライマー及び／またはリバースプライマーの５’側の領域に結合してよい。このような追加のプライマーを用いる場合、フォワードプライマー結合部位及び／またはリバースプライマー結合部位は、これらの追加のプライマーの結合領域と、そのプライマー自体の結合領域を含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法では、フォワードプライマー結合領域及び／またはリバースプライマー結合領域の５’側に位置する領域に結合する追加のプライマーを１つ以上使用してよい。このような方法は例えば、「置換プライマー」または「アウタープライマー」の使用について開示しているＷＯ００２８０８２に開示されている。
【0035】
「バーコード」核酸識別配列は、核酸に組み込むか、またはプライマーに連結して、独立したシーケンシング及び識別が、同一の試料に存在する分子に由来する情報及び識別に関係するバーコードを介して互いに関連することを可能にすることができる。個別の構成要素の中で核酸にバーコードを取り付けるために使用可能な、多数の技術が存在する。例えば、標的核酸をまず増幅して、より短い片に断片化してもよいし、しなくてもよい。分子を個別の構成要素、例えば、バーコードを含有するドロップレットと組み合わせることができる。バーコードを次に、例えば、オーバーラップ伸長によるスプライシングを使用して、分子に取り付けることができる。本アプローチにおいて、最初の標的分子は「アダプター」配列が追加されていることができ、これは、プライマーが合成可能な既知の配列の分子である。バーコードと組み合わせたときに、アダプター配列及びバーコード配列に相補的なプライマーを使用することができ、標的核酸とバーコードの両方の生成物であるアンプリコンが互いにアニールし、かつ、ＤＮＡ重合などの伸長反応により、互いに伸長することができ、バーコード配列に取り付けられた標的核酸を含む二本鎖生成物を生成する。あるいは、当該標的を増幅するプライマーは、それ自身がバーコード化されることができるため、標的へのアニーリング及び伸長の際に、生成されたアンプリコンは、アンプリコンに組み込まれたバーコード配列を有する。これは、ＰＣＲによる特異的増幅、または、例えばＭＤＡによる非特異的増幅を含む多数の増幅法により応用することができる。バーコードを核酸に取り付けるために使用可能な代替の酵素反応、平滑末端または付着末端ライゲーションを含むライゲーションである。本アプローチにおいて、ＤＮＡバーコードは、核酸標的及びリガーゼ酵素でインキュベートされ、バーコードの、標的へのライゲーションがもたらされる。核酸の末端は、分子末端に取り付けられるバーコードの数よりも大きな制御が可能なリガーゼまたは断片と共に導入されるアダプターを使用することを含む多数の技術により、必要に応じてライゲーションのために修飾することができる。
【0036】
本明細書で使用する場合、「同一性」及び「同一な」という用語、ならびにそれらの類似表現は、２つ以上の配列に関して使用する時には、その２つ以上の配列（例えば、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）が同じである程度を指す。２つ以上の配列に関しては、配列またはその部分配列の同一性パーセントまたは相同性パーセントは、配列の所与の一または領域において同じであるすべてのモノマー単位（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）のパーセンテージを示す（すなわち、約７０％の同一性、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性）。その同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０という配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメーターで用いるか、またはマニュアルアラインメント及び目視確認によって測定した場合において、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大限一致するように比較及びアラインメントを行った時の所定の領域に対するものであることができる。配列は、アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルの同一性が少なくとも８５％である時に、「実質的に同一」であるとする。好ましくは、その同一性は、少なくとも約２５残基長、約５０残基長もしくは約１００残基長である領域、または少なくとも１つの比較配列の全長に対して存在する。配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを求めるための典型的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）に記載されている。他の方法としては、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）などのアルゴリズムが挙げられる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、その２つの分子またはそれらの相補体が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、互いにハイブリダイズすることである。
【0037】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのバイオポリマーを指し、文脈上別段に示されている場合を除き、改変ヌクレオチド及び非改変ヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方、ならびに改変核酸主鎖を含む。例えば、ある特定の実施形態では、その核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックト核酸（ＬＮＡ）である。典型的には、本明細書に記載されているような方法は、ＤＮＡを増幅用の核酸鋳型として用いて行う。しかしながら、ヌクレオチドが、天然のＤＮＡまたはＲＮＡに由来する人工の誘導体または改変核酸に置き換えられている核酸も、相補鎖合成用の鋳型として機能する限りは、本発明の核酸に含めてよい。本発明の核酸は概して、生体試料に含まれている。その生体試料には、動物、植物または微生物の組織、細胞、培養液、及び排泄物または抽出物が含まれる。ある特定の態様では、その生体試料には、ウイルスまたはマイコプラズマのような細胞内寄生体のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。本発明の核酸は、上記生体試料に含まれる核酸に由来してよい。例えば、好ましくは、記載されている方法では、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ、または生体試料に由来する核酸に基づいて増幅した核酸を使用する。別段に示されていない限り、オリゴヌクレオチド配列が示されている場合、そのヌクレオチドは、左から右に向かって、５’から３’の順であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すと理解されたい。オリゴヌクレオチドは、「５’末端」及び「３’末端」を有するという。典型的には、モノヌクレオチドが反応して、ある１つのヌクレオチドの５’リン酸基または同等の基が、任意にホスホジエステル結合またはその他の好適な結合を介して、その隣接ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基または同等の基に結合することによって、オリゴヌクレオチドを形成するからである。
【0038】
鋳型核酸は、核酸増幅法において相補鎖を合成する際の鋳型として機能する核酸である。その鋳型と相補的なヌクレオチド配列を有する相補鎖は、その鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、これらの２つの関係は、相対的なものに過ぎない。すなわち、本明細書に記載されている方法によれば、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能できる。換言すると、相補鎖は、鋳型となることができる。ある特定の実施形態では、鋳型は、生体試料、例えば、植物、動物、ウイルス、微生物、細菌、真菌などに由来する。ある特定の実施形態では、その動物は、哺乳動物、例えばヒト患者である。鋳型核酸は典型的には、標的核酸を１つ以上含む。例示的な実施形態における標的核酸は、試料中に存在する疑いがあるか、または試料中に存在すると予測されるいずれの核酸配列も含め、本開示に従って増幅または合成できる一本鎖または二本鎖のいずれの核酸配列も含んでよい。
【0039】
本発明における実施形態で用いるプライマー及びオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドは、ポリメラーゼに選択的に結合できるか、またはポリメラーゼによって重合化できるいずれの化合物も含み、いずれの天然ヌクレオチドまたはそのアナログも含まれるが、これらに限らない。必然ではないが、典型的には、ヌクレオチドがポリメラーゼに選択的に結合した後には、そのヌクレオチドは、ポリメラーゼによって重合化して核酸鎖となるが、時折、ヌクレオチドが、核酸鎖に組み込まれずに、ポリメラーゼから解離することがあり、この事象は、本明細書では、「非生成」事象という。このようなヌクレオチドには、その構造にかかわらず、ポリメラーゼに選択的に結合できるか、またはポリメラーゼによって重合化できる天然のヌクレオチドのみならず、いずれのアナログも含まれる。天然のヌクレオチドは典型的には、塩基部分、糖部分及びリン酸部分を含むが、本開示のヌクレオチドは、このような部分のいずれか１つ、一部またはすべてが欠損している化合物を含むことができる。例えば、そのヌクレオチドは任意に、リン原子を３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれを上回る数含むリン原子鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのリン鎖は、糖環のいずれかの炭素（５’炭素など）に結合できる。そのリン鎖は、介在するＯまたはＳとともに、糖に連結できる。一実施形態では、その鎖のリン原子の１つ以上は、Ｐ及びＯを有するリン酸基の一部であることができる。別の実施形態では、その鎖のリン原子は、介在するＯ、ＮＨ、Ｓ、メチレン、置換メチレン、エチレン、置換エチレン、ＣＮＨ２、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（ＣＨ２）、ＣＨ２ＣＨ２またはＣ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ（式中、Ｒは、４－ピリジンまたは１－イミダゾールであることができる）とともに連結できる。一実施形態では、その鎖のリン原子は、Ｏ、ＢＨ３またはＳを有する側鎖基を有することができる。そのリン鎖では、Ｏ以外の側鎖基を持つリン原子は、置換リン酸基であることができる。そのリン鎖では、Ｏ以外の介在する原子を持つリン原子は、置換リン酸基であることができる。ヌクレオチドアナログの例のいくつかは、Ｘｕによる米国特許第７，４０５，２８１号に記載されている。
【0040】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは標識を含み、そのヌクレオチドは、本明細書では、「標識ヌクレオチド」といい、標識ヌクレオチドの標識は、本明細書では、「ヌクレオチド標識」という。いくつかの実施形態では、その標識は、末端リン酸基、すなわち、糖から最も遠いリン酸基に結合した蛍光部分（例えば色素）、発光部分などの形態であることができる。本開示の方法及び組成物で使用できるヌクレオチドの例のいくつかとしては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変リボヌクレオチド、改変デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドポリホスフェート、デオキシリボヌクレオチドポリホスフェート、改変リボヌクレオチドポリホスフェート、改変デオキシリボヌクレオチドポリホスフェート、ペプチドヌクレオチド、改変ペプチドヌクレオチド、メタロヌクレオシド、ホスホネートヌクレオシド、及び改変リン酸－糖という主鎖のヌクレオチド、上記化合物のアナログ、誘導体またはバリアントなどが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチドは、そのヌクレオチドのαリン酸と糖、そのヌクレオチドのαリン酸とβリン酸、そのヌクレオチドのβリン酸とγリン酸、そのヌクレオチドのいずれかの他の２つのリン酸、またはこれらをいずれかに組み合わせたものを架橋する酸素部分の代わりに、例えばチオ部分またはボラノ部分のような非酸素部分を含むことができる。「ヌクレオチド５’－三リン酸」とは、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、「ＮＴＰ」、または特にリボース糖の構造的特徴を示す目的で、「ｄＮＴＰ」及び「ｄｄＮＴＰ」と称する場合がある。三リン酸エステル基は、様々な酸素に対する硫黄置換基を含むことができる（例えばα－チオ－ヌクレオチド５’－三リン酸）。核酸化学の論評については、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい。
【0041】
概要
ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのＤＮＡ－ｓｅｑ）の組み合わせを使用してシングルセル分析を行い、シングルセルの軌道を予測する実施形態を、本明細書で記載する。細胞軌道の例としては、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、外部刺激（例えば治療）に対する将来の細胞応答のいずれかが挙げられる。一般に、シングルセル分析は、シングルセルを処理し、配列決定（例えばＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ、または、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑの両方）を行って、シングルセルの検体の配列決定リードを入手するためのワークフローを伴う。シングルセル分析は、配列決定リードを分析し、シングルセルの軌道を測定するコンピュータ工程をさらに含む。
ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのＤＮＡ－ｓｅｑ）の組み合わせを使用してシングルセル分析を行い、シングルセルの軌道を予測する実施形態を、本明細書で記載する。細胞軌道の例としては、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、外部刺激（例えば治療）に対する将来の細胞応答のいずれかが挙げられる。一般に、シングルセル分析は、シングルセルを処理し、配列決定（例えばＲＮＡ－ｓｅｑ、ＤＮＡ－ｓｅｑ、または、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑの両方）を行って、シングルセルの検体の配列決定リードを入手するためのワークフローを伴う。シングルセル分析は、配列決定リードを分析し、シングルセルの軌道を測定するコンピュータ工程をさらに含む。
【0042】
様々な実施形態では、シングルセルを処理するワークフローにより、シングルセル内のＲＮＡ転写産物に由来する核酸の配列決定、加えて、ヌクレオソーム及びクロマチン（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）と共にパッケージ化された場合においてもアクセス可能なＤＮＡに由来する、核酸の配列決定が可能となる。様々な実施形態では、細胞を、（ＲＮＡ転写産物上で逆転写を行うための）逆転写酵素を含むが、プロテアーゼまたはトランスポザーゼの使用を最小限に抑えるか、または避ける試薬に曝露する。したがって、パッケージ化ＤＮＡはインタクトなままである。ＲＮＡ－ｓｅｑを行って、ＲＮＡ転写産物に由来する核酸分子の配列決定リードを入手することができ、ＤＮＡ－ｓｅｑを行って、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸分子の配列決定リードを入手することができる。ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑから入手した配列決定リードを分析し、個々の細胞の軌道を測定する。
【0043】
ここで、配列決定のために単一細胞を処理し、増幅した核酸分子を生成する実施形態を示す、図１を参照する。具体的には、図１は、標的核酸分子の細胞封入１６０、検体放出１６５、細胞バーコード化、及び標的増幅１７５の工程を含むワークフロープロセスを示す。
【0044】
一般に、細胞封入工程１６０は、シングルセル１１０を試薬１２０と共に、エマルションに封入することを伴う。様々な実施形態では、エマルションは、細胞１１０及び試薬１２０を含有する水性流体を、キャリア流体（例えば、油１１５）に分画することにより、油中水性流体型エマルションを得ることにより形成される。エマルションは、封入細胞１２５、及び試薬１２０を含む。封入細胞は、工程１６５において、検体放出を受ける。一般に、試薬は細胞の溶解を引き起こすことにより、エマルション内で細胞溶解物１３０を生成する。特定の実施形態では、試薬１２０は、少なくとも逆転写酵素を含む。様々な実施形態において、試薬１２０は、減少した量のプロテアーゼまたはトランスポザーゼを含むか、またはプロテアーゼまたはトランスポザーゼを含まない。例えば、試薬１２０は少量のプロテイナーゼＫを含むか、または、プロテイナーゼＫ（もしくはその変異バリアント）を含まず、少量のトランスポザーゼＴｎ５をさらに含むか、または、トランスポザーゼＴｎ５（もしくはその変異バリアント）を含まない。細胞溶解物１３０は、１つ以上の異なる種類の検体（例えば、ＲＮＡ転写産物、ＤＮＡ、タンパク質、脂質、または炭化水素）を含むことができる、細胞の内容物を含む。様々な実施形態では、細胞溶解物１３０の異なる検体は、エマルション内で試薬１２０と相互作用することができる。例えば、試薬１２０中の逆転写酵素は、ｃＤＮＡ分子を、細胞溶解物１３０中に存在するＲＮＡ転写産物から逆転写することができる。
【0045】
細胞バーコード化工程１７０は、細胞溶解物１３０を第２のエマルションに、バーコード１４５及び／または反応混合物１４０と共に封入することを伴う。様々な実施形態では、第２のエマルションは、細胞溶解物１３０を含有する水性流体を、不混和性油１３５に分画することにより形成される。図１に示すように、反応混合物１４０及びバーコード１４５を、水性流体の個別の流れを通して導入することにより、反応混合物１４０及びバーコードを、細胞溶解物１３０と共に、第２のエマルションに分画することができる。
【0046】
一般に、バーコード１４５は、分析される標的核酸（例えば、細胞溶解物の検体）を標識することが可能であり、これにより、標的核酸に由来するシーケンスリードの起源の、その後の同定が可能となる。様々な実施形態では、複数のバーコード１４５は、細胞溶解物の複数の標的核酸を標識することにより、大量のシーケンスリードの起源の、その後の同定を可能にすることができる。一般に、反応混合物１４０は、核酸増幅反応などの反応の実施を可能にする。
【0047】
標的増幅工程１７５は、標的核酸を増幅することを伴う。例えば、細胞溶解物の標的核酸は、第２のエマルション中で反応混合物１４０を用いる増幅を受けることにより、標的核酸に由来するアンプリコンを生成する。図１Ｂは、細胞バーコード化１７０、及び標的増幅１７５を２つの個別の工程で示すものの、様々な実施形態では、標的核酸は、核酸増幅工程を通して、バーコード１４５で標識される。
【0048】
本明細書で参照するように、図１に示すワークフロープロセスは、細胞からの検体放出１６５が、細胞バーコード化１７０及び標的増幅１７５の工程とは別に生じる、２段階ワークフロープロセスである。例えば、細胞からの検体放出１６５は、第１のエマルション内で生じ、続いて、細胞バーコード化１７０及び標的増幅１７５が第２のエマルション内で生じる。様々な実施形態では、代替のワークフロープロセス（例えば、図１に示す２段階ワークフロープロセス以外のワークフロープロセス）を用いることができる。例えば、細胞１１０、試薬１２０、反応混合物１４０、及びバーコード１４５を、エマルションに封入することができる。したがって、検体放出１６５はエマルション内で生じることができ、続いて、細胞バーコード化１７０及び標的増幅１７５が同じエマルションで生じることができる。
【0049】
図２は、シングルセルの検体に由来する配列決定リードを用いてシングルセルの細胞軌道を測定するためのフロープロセスである。具体的には、図２は、工程２０５において、増幅核酸をプールする工程、工程２１０において、増幅核酸を配列決定する工程、工程２１５においてアラインメントを読み取る工程、及び、アラインしたシーケンスリードを用いて、細胞に関する細胞軌道を測定する工程と、を示す。一般に、図２に示す流れ作業は、図１に示すワークフロープロセスの続きである。
【0050】
例えば、図１の工程１７５における標的増幅の後で、増幅核酸２５０Ａ、２５０Ｂ、及び２５０Ｃを、図２に示す工程２０５でプールする。例えば、増幅核酸のエマルションをプールして収集し、エマルションの不混和性油を取り除く。したがって、複数の細胞由来の増幅核酸は、合わせてプールすることができる。図２は、３つの増幅核酸２５０Ａ、２５０Ｂ、及び２５０Ｃを示すが、様々な実施形態では、プールした核酸は、複数の細胞の検体に由来する、数百、数千、または数百万個の核酸を含むことができる。
【0051】
様々な実施形態では、各増幅核酸２５０は、少なくとも、標的核酸２４０及びバーコード２３０の配列を含む。様々な実施形態では、増幅核酸２５０は、ユニバーサルプライマー配列（例えば、オリゴ－ｄＴ配列）、ランダムプライマー配列、遺伝子特異的プライマーフォワード配列、遺伝子特異的プライマーリバース配列、または定常領域のいずれかなどの、さらなる配列を含むことができる。
【0052】
様々な実施形態では、増幅核酸２５０Ａ、２５０Ｂ、及び２５０Ｃは、同一のシングルセルに由来し、故に、バーコード２３０Ａ、２３０Ｂ、及び２３０Ｃは同一である。したがって、バーコード２３０を配列決定することにより、増幅核酸２５０が同一の細胞に由来するという測定が可能となる。様々な実施形態では、増幅核酸２５０Ａ、２５０Ｂ、及び２５０Ｃはプールされ、異なる細胞に由来する。したがって、バーコード２３０Ａ、２３０Ｂ、及び２３０Ｃは互いに異なり、バーコード２３０を配列決定することにより、増幅核酸２５０が異なる細胞に由来するという測定が可能となる。
【0053】
工程２１０において、プールした増幅核酸２５０は配列決定を受け、シーケンスリードを生成する。各増幅核酸に関して、シーケンスリードは、バーコード及び標的核酸の配列を含む。増幅核酸に含まれるバーコード配列に従い、個別の細胞に由来するシーケンスリードをクラスター化する。工程２１５において、各シングルセルに対するシーケンスリードを（例えば、参照ゲノムに対して）アラインする。シーケンスリードを参照ゲノムに対してアラインすることにより、ゲノム内のどこで、シーケンスリードが由来するかを測定することができる。例えば、ＲＮＡ転写産物から生成される複数のシーケンスリードは、ゲノム位置にアラインされた場合に、ゲノムの位置において、遺伝子が転写されたことを明らかにすることができる。別の例として、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡから生成した複数のシーケンスリードは、ゲノムの位置にアラインされた場合に、ゲノムの位置において遺伝子がアクセス可能であり、転写可能であることを明らかにすることができる。
【0054】
工程２００において、シングルセルに対してアラインしたシーケンスリードを分析して、シングルセルの軌道を測定する。例えば、ＲＮＡ転写産物から生成したシーケンスリードにより、細胞の初期状態における遺伝子発現の速写がもたらされる。加えて、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡから生成したシーケンスリードにより、細胞の将来の状態における遺伝子発現の速写がもたらされる。まとめると、細胞の初期状態、及び細胞の将来の状態は、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、外部刺激（例えば治療）に対する将来の細胞応答のいずれかなどの細胞軌道を測定するのに有用であることができる。
【0055】
シングルセル分析を行うための方法
封入、検体放出、バーコード化、及び増幅
本明細書に記載する実施形態は、（例えば、図１の工程１６０において）１つ以上の細胞を封入し、１つ以上の細胞にてシングルセル分析を行うことを伴う。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、対象または患者から入手した試験試料から単離することができる。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、健常な対象から採取した健常な細胞である。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、以前にがんと診断された対象から採取したがん細胞を含む。例えば、このようながん細胞は、がんと診断された対象の血流にて入手可能な腫瘍細胞であることができる。したがって、腫瘍細胞のシングルセルを分析することにより、対象のがんの細胞予測及び細胞下予測が可能となる。様々な実施形態では、試験試料は、対象の処置の後に（例えば、がん治療などの治療の跡に）、対象から入手される。したがって、細胞のシングルセルを分析することにより、治療に対する対象の応答の細胞予測及び細胞下予測が可能となる。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は前駆細胞である。したがって、前駆細胞のシングルセルを分析することにより、前駆細胞の、可能性のある細胞系統の予測が可能となる。
封入、検体放出、バーコード化、及び増幅
本明細書に記載する実施形態は、（例えば、図１の工程１６０において）１つ以上の細胞を封入し、１つ以上の細胞にてシングルセル分析を行うことを伴う。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、対象または患者から入手した試験試料から単離することができる。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、健常な対象から採取した健常な細胞である。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は、以前にがんと診断された対象から採取したがん細胞を含む。例えば、このようながん細胞は、がんと診断された対象の血流にて入手可能な腫瘍細胞であることができる。したがって、腫瘍細胞のシングルセルを分析することにより、対象のがんの細胞予測及び細胞下予測が可能となる。様々な実施形態では、試験試料は、対象の処置の後に（例えば、がん治療などの治療の跡に）、対象から入手される。したがって、細胞のシングルセルを分析することにより、治療に対する対象の応答の細胞予測及び細胞下予測が可能となる。様々な実施形態では、１つ以上の細胞は前駆細胞である。したがって、前駆細胞のシングルセルを分析することにより、前駆細胞の、可能性のある細胞系統の予測が可能となる。
【0056】
様々な実施形態では、細胞を試薬と共に封入することは、細胞及び試薬を含む水相を、不混和性油と組み合わせることにより達成される。一実施形態では、細胞及び試薬を含む水相は、流れている不混和性油と共に流れて油中水型エマルションが形成され、ここで、少なくとも１つのエマルションは、シングルセル及び試薬を含む。様々な実施形態では、不混和性油相は、フルオラス油、フルオラス非イオン性界面活性剤、またはその両方を含む。様々な実施形態では、エマルションは、約０．００１～１０００ピコメートルまたはそれ以上の内部体積を有することができ、直径は０．１～１０００μｍの範囲であることができる。
【0057】
様々な実施形態では、細胞及び試薬を含む水相は必ずしも、不混和性油相と同時に流れる必要はない。例えば、水相は流れて、不混和性油相の静止リザーバと接触することができ、これにより、静止した油リザーバ内で、油中水型エマルションの発生が可能となる。
【0058】
様々な実施形態では、水相と不混和性油相とを組み合わせることは、マイクロフルイディクスデバイス内で行うことができる。例えば、水相は、マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルを通って流れ、不混和性油相と接触することができ、これは同時に、個別のマイクロチャネルを通って流れているか、または、マイクロフルイディクスデバイスの静止リザーバ内で保持される。エマルションに封入された細胞及び試薬は次に、マイクロフルイディクスデバイスを通って流れ、細胞溶解を受けることができる。
【0059】
試薬及び細胞をエマルションに添加する、さらなる例示的実施形態は、細胞及び試薬を個別に含有するエマルションを合わせること、または、試薬をエマルション内にピコインジェクションすることを含むことができる。例示的実施形態のさらなる説明は、米国出願第１４／４２０，６４６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0060】
エマルションに封入された細胞を溶解し、細胞溶解物を生成する。様々な実施形態では、試薬中に存在する剤を溶解させることにより、細胞を溶解する。例えば、試薬は、細胞膜を溶解させる、ＮＰ４０など（例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ型ＮＰ－４０、またはノニルフェノキシポリエトキシエタノール）の洗剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞溶解はまた、または代わりに、試薬中で剤を溶解させることを伴わない技術に依存する。例えば、溶解は、様々なゲノム的特徴を用いて、細胞の穿孔、剪断、擦過などを達成し得る機械的技術により実現することができる。音響技術などの他の種類の機械的破壊もまた、使用することができる。さらに、熱エネルギーもまた使用して、細胞を溶解することができる。細胞溶解を達成する任意の便利な手段を、本明細書に記載の方法において用いることができる。
【0061】
ここで、第１の実施形態に従った、検体の処理及び放出、ならびにその後の、エマルション内でのシングルセルの検体の処理を示す、図３Ａ～３Ｃを参照する。具体的には、図３Ａ～３Ｃに示す実施形態では、エマルション３００Ａ内で、細胞と共に封入した試薬は、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）とトランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼＴｎ５）のいずれをも含まない。図３Ａにおいて、細胞膜の点線により示されるように、細胞は溶解される。一実施形態では、試薬は、細胞の溶解を引き起こす、ＮＰ４０（例えば、０．０１％または１．０％のＮＰ４０）を含むことができる。溶解した細胞は、細胞の細胞質内に、ＲＮＡ転写産物などの検体、加えてパッケージ化ＤＮＡを含み、パッケージ化ＤＮＡとは、ヒストンによるＤＮＡの組織化により、クロマチンとしてパッケージされたヌクレオソームを形成することを意味する。図３Ａに示すように、エマルション３００Ａは、逆転写酵素（「ＲＴ」と略す）をさらに含む。
【0062】
図３Ｂは、逆転写酵素としてのエマルション３００Ｂが、ＲＮＡ転写産物の逆転写を行うことを示す。図３Ｃは、合成したｃＤＮＡ鎖を示す。このようなｃＤＮＡ鎖は、リバースプライマーなどの試薬に含まれるプライマーを用いてプライミングすることができる。図３Ｃはまた、パッケージ化ＤＮＡをさらに詳述して示す。例えば、パッケージ化ＤＮＡは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０とも本明細書では呼ばれる、ＤＮＡのオープンセグメントを含む。クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０が、細胞転写機構（例えば、転写因子、ポリメラーゼなど）によりアクセスされる際に、遺伝子発現が生じることを考慮すると、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０は、細胞の状態を反映し得る。パッケージ化ＤＮＡは、転写のために結合され、アクセス不可能な、アクセス不可能なＤＮＡ３２０を含むヌクレオソーム３１０をさらに含む。様々な実施形態では、パッケージ化ＤＮＡ３０２に加えて、エマルション３００Ｃは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０から生成した伸長生成物３４０もまた含む。例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０のセグメントをプライミングすることができ、相補性ＤＮＡ鎖（例えば、伸長生成物３４０）を生成することができる。しかし、他の実施形態では、エマルション３００Ｃは、ｃＤＮＡ３０６及びパッケージ化ＤＮＡ３０２を含むが、伸長生成物３４０を含まない。
【0063】
図１における細胞バーコード化１７０の工程は、細胞溶解物１３０を、反応混合物１４０及びバーコード１４５と共に封入することを含む。様々な実施形態では、反応混合物１４０は、標的核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）上で核酸反応を行うための、プライマーなどの構成要素を含む。
【0064】
様々な実施形態では、細胞溶解物は、反応混合物及びバーコードを含む水相を、細胞溶解物及び不混和性油相と組み合わせることにより、反応混合物及びバーコードと共に封入される。一実施形態では、反応混合物及びバーコードを含む水相は、流れている細胞溶解物及び流れている不混和性油相と共に流れ、これにより油中水型エマルションが形成され、ここで、少なくとも１つのエマルションは、細胞溶解物、反応混合物、及びバーコードを含む。様々な実施形態では、不混和性油相は、フルオラス油、フルオラス非イオン性界面活性剤、またはその両方を含む。様々な実施形態では、エマルションは、約０．００１～１０００ピコメートルまたはそれ以上の内部体積を有することができ、直径は０．１～１０００μｍの範囲であることができる。
【0065】
様々な実施形態では、水相と不混和性油相とを組み合わせることは、マイクロフルイディクスデバイス内で行うことができる。例えば、水相は、マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルを通って流れ、不混和性油相と接触することができ、これは同時に、個別のマイクロチャネルを通って流れているか、または、マイクロフルイディクスデバイスの静止リザーバ内で保持される。エマルションに封入された細胞溶解物、反応混合物、及びバーコードを次に、マイクロフルイディクスデバイスを通して流し、標的核酸の増幅を行うことができる。
【0066】
反応混合物及びバーコードをエマルションに添加する、さらなる例示的実施形態は、細胞溶解物及び反応混合物及びバーコードを個別に含むエマルションを合わせること、または、反応混合物及び／もしくはバーコードをエマルションにピコインジェクションすることを含むことができる。エマルションを合わせる、または、物質をエマルションにピコインジェクションする例示的実施形態のさらなる説明は、米国出願第１４／４２０，６４６号に見出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0067】
反応混合物及びバーコードがエマルションに添加されると、エマルションは、核酸増幅反応を促進する条件下でインキュベートすることができる。様々な実施形態では、エマルションは、反応混合物及び／もしくはバーコードを添加するのに使用したのと同じマイクロフルイディクスデバイスでインキュベートすることができるか、または、別個の装置でインキュベートすることができる。特定の実施形態では、核酸増幅を促進する条件下でエマルションをインキュベートすることは、細胞を封入し、細胞を溶解するのに使用したのと同じマイクロフルイディクスデバイスで行う。エマルションをインキュベートすることは、様々な形態をとることができる。特定の態様では、反応混合物、バーコード、及び細胞溶解物を含有するエマルションは、核酸増幅に効果的な条件下でエマルションをインキュベートするチャネルを流れることができる。マイクロドロップレットがチャネルを流れることは、ＰＣＲに効果的な温度で維持される、様々な温度域にわたって蛇行するチャネルを伴う場合がある。このようなチャネルは例えば、２つ以上の温度域にわたってサイクルことができ、少なくとも１つの域は約６５℃にて維持され、少なくとも１つの域は約９５℃で維持される。滴がこのような域にまたがり移動するため、温度は、核酸増幅の必要に応じてサイクルする。域の数、及び、各域の対応する温度は、当業者により速やかに決定し、所望の核酸増幅を実現することができる。
【0068】
様々な実施形態では、核酸増幅の後で、増幅核酸を含有するエマルションを収集する。様々な実施形態では、エマルションは、マイクロフルイディクスデバイスのウェルなどのウェルにて収集される。様々な実施形態では、エマルションは、リザーバ、または、エッペンドルフチューブなどのチューブで収集される。収集されると、異なるエマルションにまたがる増幅核酸がプールされる。一実施形態では、エマルションは、外部刺激により破壊され、増幅核酸をプールする。一実施形態では、エマルションは、水相と不混和性油相との密度差を考慮すると、時間の経過とともに自然に凝集する。したがって、増幅核酸は水相にプールされる。
【0069】
プールした後、増幅核酸は、配列決定のためにさらなる調製を受けることができる。例えば、シーケンシングアダプターを、プールした核酸に添加することができる。例示的なシーケンシングアダプターは、Ｐ５及びＰ７シーケンシングアダプターである。シーケンシングアダプターにより、核酸のその後の配列決定が可能となる。
【0070】
ＲＮＡ及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡの例示的な処理
図４Ａは、第１の実施形態に従い、ＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを第１のエマルション中で処理することを示す。具体的には、図４Ａは、図１、及び図３Ａ～３Ｃに示す検体放出１６５のプロセスをさらに詳細に示す。単一のＲＮＡ分子、及び単一の二本鎖パッケージ化ＤＮＡのみを示すものの、シングルセルは、２つ以上のＲＮＡ分子、及び２つ以上のパッケージ化ＤＮＡを有意に含有することができ、故に、後続の説明は、さらなるＲＮＡ分子及びさらなるパッケージ化ＤＮＡにまたがり適用されることを、当業者は認識するであろう。
図４Ａは、第１の実施形態に従い、ＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを第１のエマルション中で処理することを示す。具体的には、図４Ａは、図１、及び図３Ａ～３Ｃに示す検体放出１６５のプロセスをさらに詳細に示す。単一のＲＮＡ分子、及び単一の二本鎖パッケージ化ＤＮＡのみを示すものの、シングルセルは、２つ以上のＲＮＡ分子、及び２つ以上のパッケージ化ＤＮＡを有意に含有することができ、故に、後続の説明は、さらなるＲＮＡ分子及びさらなるパッケージ化ＤＮＡにまたがり適用されることを、当業者は認識するであろう。
【0071】
前述したように、細胞を溶解することで、細胞溶解物を試薬に曝露する。ここで、図４Ａの上の図に示すように、細胞溶解物は、ＲＮＡ３０４と、ヌクレオソーム３１０及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０を含むパッケージ化ＤＮＡ３０２と、を含む。試薬は、ＲＮＡ３０４のセグメントとハイブリダイズする、リバースプライマー（点線で示す）などのプライマーを含む。様々な実施形態では、このようなリバースプライマーは、メッセンジャーＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズする、オリゴｄＴ配列である。さらに、リバースプライマーはＰＣＲハンドルを含む。リバースプライマーは、ＲＮＡ３０４分子をプライミングする。したがって、図４の下の図に示すように、ＲＮＡ３０４に対して相補的なｃＤＮＡ３０６が生成される。本実施形態では、パッケージ化ＤＮＡ３０２はプライミングされず、故に、変化しないままである。
【0072】
図４Ｂは、図４Ａに示す第１の実施形態に従った、ＲＮＡ及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の増幅及びバーコード化を示す。ここで、図４Ｂは、図１に示す細胞バーコード化１７０及び標的増幅の工程をさらに詳述する。図４Ｂの上の図は、図４Ａの下の図に示したような、生成したｃＤＮＡ３０６及びパッケージ化ＤＮＡ３０２を示す。図４Ｂの中央の図は、ｃＤＮＡ３０６及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０の、増幅及びバーコード化プロセスを示す。ｃＤＮＡ３０６をまず参照すると、反応混合物からもたらされるフォワードプライマーとリバースプライマーの対（点線で示すフォワード及びリバースプライマー）は、ｃＤＮＡをプライミングすることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＰＣＲハンドルなどの定常領域に結合することができる。フォワードプライマーのＰＣＲハンドルは、バーコード配列に結合したＰＣＲハンドルに対して相補的である（図４Ｂでは、「細胞ＢＣ」と注記する）。したがって、フォワード及びリバース合成は、中央の図に示す水平矢印により示される、フォワード及びリバースプライマーにより生じることができる。
【0073】
クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０を参照すると、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０のセグメントは、反応混合物からもたらされるリバースプライマー及びフォワードプライマー（点線で示すフォワード及びリバースプライマー）によりアクセス可能である。様々な実施形態では、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０は、制御性複合体により、ＤＮＡアクセス性に関して役割を果たすＤＮＡの呼吸性変動により、アクセス可能である。ＤＮＡの呼吸性変動についてのさらなる説明は、“ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ ＰＨ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＮＰ，Ｍａｒｃｕｓ ＡＨ．Ｆｉｆｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ＤＮＡ ”ｂｒｅａｔｈｉｎｇ”： Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｏｌｄ ａｎｄ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２０１３；９９（１２）：９２３－９５４”に見出され、その全体が参照により本明細書に援用されている。フォワードプライマーは、バーコード配列に結合したＰＣＲハンドルに対してさらに相補的な、ＰＣＲハンドルなどの定常領域に結合する。したがって、フォワード及びリバース合成は、中央の図に示す水平矢印により示される、フォワード及びリバースプライマーにより生じることができる。
【0074】
具体的には、フォワード及びリバースプライマーが異なるエクソンを標的にするため、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ由来の合成アンプリコンは、（ＲＮＡアンプリコンと比較して）長い。したがって、ＤＮＡアンプリコンは、実施例１で後述するような、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのプライミングが生じることを確認可能なイントロン配列を含有する。
【0075】
図４Ｂの下の図は、（ｃＤＮＡ３０６からの、及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０からの）増幅核酸の調製を示す。ここで、ｃＤＮＡ由来の増幅核酸は、Ｐ５配列アダプター、リード１、バーコード（「細胞ＢＣ」）、第１のＰＣＲハンドル、フォワードプライマー（点線で示す）、ｃＤＮＡ、リバースプライマー（点線で示す）、第２のＰＣＲハンドル、及び、Ｐ７配列アダプターの配列を含む。クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０由来の増幅核酸は、Ｐ５配列アダプター、リード１、バーコード（「細胞ＢＣ」）、第１のＰＣＲハンドル、フォワードプライマー、伸長生成物３４０（アクセス可能なＤＮＡ３３０に由来）、リバースプライマー、第２のＰＣＲハンドル、及び、Ｐ７配列アダプターの配列を含む。様々な実施形態では、リード２配列は、各増幅核酸に含まれることができる。あるシナリオでは、リード２配列は、リバースプライマーに結合した第２のＰＣＲハンドルに含まれることができる。別のシナリオでは、リード２配列は、Ｐ７配列アダプターに含まれることができる。
【0076】
ここで、第２の実施形態に従った、ＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡの第１のエマルション中での処理を示す、図４Ｃを参照する。再び、図４Ｃは、図１、及び図３Ａ～３Ｃに示す検体放出１６５のプロセスをさらに詳細に示す。図４Ｃの上の図に示すように、細胞溶解物は、ＲＮＡ３０４と、ヌクレオソーム３１０及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０を含むパッケージ化ＤＮＡ３０２と、を含む。エマルションは、４０℃～６０℃の温度といった、（例えば、生理学的温度と比較して増加した）増加した温度範囲に曝露することができる。様々な実施形態では、エマルションは、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、または６０℃の増加した温度に曝露することができる。
【0077】
増加した温度への曝露により、パッケージ化ＤＮＡ３０２の構造を変えることができる。例えば、図４Ｃの中央の図に示すように、パッケージ化ＤＮＡ３０２のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０のセグメントをほどくことができる。様々な実施形態では、増加した温度においてパッケージ化ＤＮＡ３０２がほどかれることは、制御性複合体による、ＤＮＡアクセス性に関して役割を果たすＤＮＡの呼吸性変動を模倣する。ＤＮＡの呼吸性変動についてのさらなる説明は、“ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ ＰＨ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＮＰ，Ｍａｒｃｕｓ ＡＨ．Ｆｉｆｔｙ ｙｅａｒｓ ｏｆ ＤＮＡ ”ｂｒｅａｔｈｉｎｇ”： Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｏｌｄ ａｎｄ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．２０１３；９９（１２）：９２３－９５４”に見出され、その全体が参照により本明細書に援用されている。全てを合わせると、中央の図は、制御エレメントによりアクセス可能であり転写に利用可能な、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントの速写である、細胞内でのパッケージ化ＤＮＡの状態を示す。図４Ｃの中央のパネルは、エマルション内での、添加された試薬のリバースプライマー（点線として示す）が、ＲＮＡ３０４分子の相補配列とハイブリダイズ可能であることをさらに示す。様々な実施形態では、このようなリバースプライマーは、メッセンジャーＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズする、オリゴｄＴ配列である。加えて、リバースプライマーは、少なくとも部分的に、増加した温度の観点において、構造的にほどかれた、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０の相補配列とハイブリダイズすることができる。
【0078】
図４Ｃの下の図を参照すると、相補性ｃＤＮＡ３０６分子は、ＲＮＡ３０４分子から合成される。加えて、伸長生成物３４０は、プライミング領域にて開始するクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０から合成される。したがって、ｃＤＮＡ３０６及び伸長生成物３４０を、本明細書に記載する後の行程（例えば、細胞バーコード化及び標的増幅）で、さらに処理することができる。
【0079】
図４Ｄは、図４Ｃに示す第２の実施形態に従った、ＲＮＡ及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の増幅及びバーコード化を示す。ここで、図４Ｃは、図１に示す細胞バーコード化１７０及び標的増幅の工程をさらに詳述する。図４Ｄの上の図は、図４Ｃの下の図に示したような、生成したｃＤＮＡ３０６、及びパッケージ化ＤＮＡ３０２の伸長生成物３４０を示す。図４Ｄの中央の図は、ｃＤＮＡ３０６及び伸長生成物３４０の増幅及びバーコード化プロセスを示す。一般に、ｃＤＮＡ３０６及び伸長生成物３４０は、共にＤＮＡ配列であることを考慮すると、同じ方法で処理される。ｃＤＮＡ３０６をまず参照すると、反応混合物からもたらされるフォワードプライマーとリバースプライマーの対（点線で示すフォワード及びリバースプライマー）は、ｃＤＮＡをプライミングすることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＰＣＲハンドルなどの定常領域に結合することができる。フォワードプライマーのＰＣＲハンドルは、バーコード配列に結合したＰＣＲハンドルに対して相補的である（図４Ｄでは、「細胞ＢＣ」と注記する）。したがって、フォワード及びリバース合成は、中央の図に示す水平矢印により示される、フォワード及びリバースプライマーにより生じることができる。伸長生成物３４０を参照すると、反応混合物からもたらされるフォワードプライマー及びリバースプライマーは、ｃＤＮＡをプライミングすることができる。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、ＰＣＲハンドルなどの定常領域に結合することができる。フォワードプライマーのＰＣＲハンドルは、バーコード配列に結合したＰＣＲハンドルに対して相補的である（図４Ｄでは、「細胞ＢＣ」と注記する）。したがって、フォワード及びリバース合成は、中央の図に示す水平矢印により示される、フォワード及びリバースプライマーにより生じることができる。
【0080】
図４Ｄの下の図は、（ｃＤＮＡ３０６からの、及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０からの）増幅核酸の調製を示す。ここで、ｃＤＮＡ由来の増幅核酸は、Ｐ５配列アダプター、リード１、バーコード（「細胞ＢＣ」）、第１のＰＣＲハンドル、フォワードプライマー（点線で示す）、ｃＤＮＡ、リバースプライマー（点線で示す）、第２のＰＣＲハンドル、及び、Ｐ７配列アダプターの配列を含む。（クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ３３０に由来する）伸長生成物３４０を含む増幅核酸は、Ｐ５配列アダプター、リード１、バーコード（「細胞ＢＣ」）、第１のＰＣＲハンドル、フォワードプライマー（点線で示す）、伸長生成物３４０、リバースプライマー（点線で示す）、第２のＰＣＲハンドル、及び、Ｐ７配列アダプターの配列を含むことができる。様々な実施形態では、リード２配列は、各増幅核酸に含まれることができる。あるシナリオでは、リード２配列は、リバースプライマーに結合した第２のＰＣＲハンドルに含まれることができる。別のシナリオでは、リード２配列は、Ｐ７配列アダプターに含まれることができる。
【0081】
配列決定、及びリードアラインメント
増幅核酸を配列決定し、配列決定ライブラリーを生成するためのシーケンスリードを入手する。シーケンスリードは、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、パイロシーケンス法、可逆的ターミネーターの化学作用を用いること、ホスホ結合蛍光ヌクレオチドを用いること、またはリアルタイム配列決定、のいずれかを行うプラットホームを含む、市販されている次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホームを用いて実現することができる。一例として、増幅核酸は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットホームで配列決定することができる。
増幅核酸を配列決定し、配列決定ライブラリーを生成するためのシーケンスリードを入手する。シーケンスリードは、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、パイロシーケンス法、可逆的ターミネーターの化学作用を用いること、ホスホ結合蛍光ヌクレオチドを用いること、またはリアルタイム配列決定、のいずれかを行うプラットホームを含む、市販されている次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホームを用いて実現することができる。一例として、増幅核酸は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑプラットホームで配列決定することができる。
【0082】
パイロシーケンス法の場合、アダプターに対して相補的なオリゴヌクレオチドでコーティングした顆粒を用いて、１つのマトリックス分子を捕捉することにより、ＮＧＳ断片のライブラリーをクローンｉｎ－ｓｉｔｕ増幅する。同じ種類のマトリックスを含有する各顆粒を、「油中水」型のマイクロバブルに配置し、エマルションＰＣＲと呼ばれる方法を用いて、マトリックスをクローン増幅する。増幅後、エマルションは破壊され、顆粒は、配列決定反応の間にフローセルとして作用する滴定ピコプレートの、別個のウェルにスタックされる。４つのｄＮＴＰ試薬のそれぞれをフローセルに、順序立てて複数回投与することは、配列決定酵素、及び、ルシフェラーゼなどの発光レポーターの存在下で生じる。好適なｄＮＴＰが配列決定プライマーの３’末端に添加される場合において、得られるＡＴＰは、ウェル内でのルミネセンスの発光を生み出し、これはＣＣＤカメラを用いて記録される。４００塩基以上の長さを達成することが可能であり、配列の１０６の読取り値を得ることが可能であり、結果として、最大５億個の塩基対（メガバイト）の配列が得られる。パイロシーケンス法のさらなる詳細は、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５： ６４１－６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７： ２８７－２９６；米国特許第６，２１０，８９１号、；同第６，２５８，５６８号に記載され、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に援用されている。
【0083】
Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームでは、配列決定データは短い読取り値の形態で作成される。本方法では、ＮＧＳ断片のライブラリーの断片が、オリゴヌクレオチドアンカー分子でコーティングされたフローセルの表面で捕捉される。アンカー分子はＰＣＲプライマーとして使用されるが、マトリックスの長さ、及び、他の付近のアンカーオリゴヌクレオチドへの近接性が原因で、ＰＣＲにより伸長により、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、及び、フローセル表面での架橋構造の形成を伴う、分子の「ヴォールト」の形成がもたらされる。これらのＤＮＡループは変性され、切断される。次いで、直鎖が、可逆的に染色されたターミネーターを用いて配列決定される。配列に含まれるヌクレオチドは、包含後に蛍光を検出することにより測定され、各蛍光剤、及びブロック剤は、次のｄＮＴＰ添加サイクルの前に取り除かれる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームを用いる配列決定のさらなる詳細は、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５： ６４１－６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７： ２８７－２９６；米国特許第６，８３３，２４６号；同第７，１１５，４００号；同第６，９６９，４８８号に見出され、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に援用されている。
【0084】
固体技術を用いる核酸分子の配列決定としては、エマルションＰＣＲを用いる、ＮＧＳ断片のライブラリーのクローン増幅が挙げられる。その後、マトリックスを含有する顆粒を、ガラスフローセルの誘導体化された表面で固定し、アダプターオリゴヌクレオチドに対して相補的なプライマーでアニールする。しかし、３’伸長のために示したプライマーを用いる代わりに、当該相補的なプライマーを使用して、２つのプローブ特異的塩基、続いて６個の縮退塩基、及び４個の蛍光標識のうちの１つを含有する、試験プローブ用のライゲーションのための５’リン酸基を入手する。固体システムにおいて、試験プローブは、各プローブの３’末端における２つの塩基と、５’末端における４つの蛍光染料のうちの１つとの、１６個の可能性のある組み合わせを有する。蛍光染料の色、及び故に、各プローブの同一性は、特定の色空間コードスキームに対応する。プローブのアラインメントの多くのサイクルの後で、プローブのライゲーション、及び蛍光シグナルの検出、変性、続いて、元のプライマーと比較して１塩基移動したプライマーを用いる第２の配列決定サイクル。このようにして、マトリックスの配列を計算により再構築することが可能であり、マトリックス塩基を２回確認することで、正確性の増加に繋がる。固体技術を用いる配列決定のさらなる詳細は、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５： ６４１－６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７： ２８７－２９６；米国特許第５，９１２，１４８号、；同第６，１３０，０７３号に見出され、これらそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。
【0085】
特定の実施形態では、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製のＨｅｌｉＳｃｏｐｅを使用する。配列決定は、ポリメラーゼの添加、及び、蛍光標識したｄＮＴＰ試薬の連続添加により達成される。切り替えにより、ｄＮＴＰに対応する蛍光シグナルの概観がもたらされ、特定のシグナルが、各ｄＮＴＰ添加サイクルの前に、ＣＣＤカメラにより捕捉される。配列の読取り値の長さは、２５～５０ヌクレオチドで変化し、分析作業サイクル１回当たりで、全収率が１０億個のヌクレオチド対を超える。ＨｅｌｉＳｃｏｐｅを用いる配列決定を行うためのさらなる詳細は、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５： ６４１－６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７： ２８７－２９６；米国特許第７，１６９，５６０号；同第７，２８２，３３７号；同第７，４８２，１２０号；同第７，５０１，２４５号；同第６，８１８，３９５号；同第６，９１１，３４５号；同第７，５０１，２４５号に見出され、これらそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。
【0086】
いくつかの実施形態では、Ｒｏｃｈｅの配列決定システム４５４を使用する。配列決定４５４は、２つの工程を伴う。第１の工程では、ＤＮＡは約３００～８００個の塩基対の断片に切断され、これらの断片は平滑末端を有する。オリゴヌクレオチドアダプターは次に、断片の末端にライゲーションされる。アダプターは、断片の増幅及び配列決定のためのプライマーとして機能する。断片は、例えば、５’－ビオチンタグを含有するアダプターを用いて、ＤＮＡ捕捉ビーズ、例えばストレプトアビジンでコーティングされたビーズに取り付けることができる。顆粒に取り付けられた断片は、油－水エマルションのドロップレット内で、ＰＣＲにより増幅される。結果は、各ビーズにおける、クローン増幅したＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２の段階において、顆粒はウェルで捕捉される（体積は数ピコリットル）。パイロシーケンス法を、各ＤＮＡ断片で並行して行う。１つ以上のヌクレオチドを添加することにより、光シグナルの生成がもたらされ、これは、配列決定機器のＣＣＤカメラに記録される。シグナル強度は、含まれるヌクレオチドの数に比例する。パイロシーケンス法はピロホスフェート（ＰＰｉ）を用い、これはヌクレオチドの添加の際に放出される。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下で、ＡＴＰスルフリラーゼを使用してＡＴＰに転換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用して、ルシフェリンをオキシルシフェリンに転換し、この反応の結果、光が生成され、これが検出及び分析される。配列決定４５４を行うためのさらなる詳細はＭａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｎａｔｕｒｅ ４３７： ３７６－３８０に見出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0087】
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡ重合の間に放出される水素イオンの検出に基づく、ＤＮＡ配列決定法である。マイクロウェルは、配列決定されるＮＧＳ断片のライブラリーの断片を含有する。マイクロウェル層の下には、超感度イオンセンサＩＳＦＥＴがある。全ての層が、エレクトロニクス産業で使用されるチップ同様に、半導体ＣＭＯＳチップの中に含まれる。ｄＮＴＰが生長する相補鎖に組み込まれるとき、水素イオンが放出され、超感度イオンセンサを励起する。ホモポリマーが鋳型の配列に存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子が１サイクルに含められる。これにより、相当量の、放出される水素原子、及び、それに比例した、より大きな電気シグナルがもたらされる。この技術は、修飾ヌクレオチドまたは光学装置を用いない他の配列決定技術とは異なる。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術についてのさらなる詳細は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９７０）：１１９０（２０１０）；米国特許出願公開第２００９００２６０８２号、同第２００９０１２７５８９号、同第２０１００３０１３９８号、同第２０１００１９７５０７号、同第２０１００１８８０７３号、及び同第２０１００１３７１４３号に見出され、これらそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。
【0088】
様々な実施形態では、ＮＧＳ法から得られる配列決定リードは、質により分類し、当該技術分野において公知の任意のアルゴリズム、例えばＰｙｔｈｏｎ ｓｃｒｉｐｔ ｂａｒｃｏｄｅＣｌｅａｎｕｐ．ｐｙを使用するバーコード配列によりグルーピングすることができる。いくつかの実施形態では、その塩基の約２０％超が、約９９％のベースコールの正確性を示す、Ｑ２０の品質スコア（Ｑ－スコア）を有する場合、所与の配列決定リードを廃棄してよい。いくつかの実施形態では、約５％超、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％が、それぞれ、約９０％、約９９％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％のベースコールの正確性を示す、Ｑ１０未満、Ｑ２０、Ｑ３０、Ｑ４０、Ｑ５０、Ｑ６０、またはそれ以上のＱ－スコアを有する場合、所与の配列決定リードを廃棄してよい。
【0089】
いくつかの実施形態では、５０個未満のリードを含有するバーコードと関連する全ての配列決定リードを破棄して、シングルセルを表す全てのバーコード基が、十分な数の高品質のリードを確実に含有することができる。いくつかの実施形態では、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、９０未満、１００未満、またはそれ以上を含有するバーコードと関連する全ての配列決定リードを廃棄して、シングルセルを表すバーコード基の質を確保することができる。
【0090】
共通のバーコード配列を有するシーケンスリード（例えば、同じ細胞に由来するシーケンスリードを意味する）を、当該技術分野において既知の方法を使用して参照ゲノムとアラインし、アラインメント位置情報を測定することができる。アラインメント位置情報は、所与のシーケンスリードの開始ヌクレオチド塩基及び末端ヌクレオチド塩基に対応する、参照ゲノム内の領域の開始位置及び終了位置を示し得る。参照ゲノム内の領域は、標的遺伝子、または遺伝子のセグメントと関連する場合がある。例示的なアライナーアルゴリズムとしては、ＢＷＡ、Ｂｏｗｔｉｅ、参照に対するスプライス転写物アラインメント（ＳＴＡＲ）、Ｔｏｐｈａｔ、またはＨＩＳＡＴ２が挙げられる。シーケンスリードを参照配列にアラインするためのさらなる詳細は、米国出願第１６／２７９，３１５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。様々な実施形態では、ＳＡＭ（配列アラインメントマップ）フォーマット、またはＢＡＭ（２元アラインメントマップ）フォーマットを有する出力ファイルを、例えば、細胞軌道を測定するための後の分析のために生成し、出力することができる。
【0091】
細胞軌道の測定
シングルセルのＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の配列決定リードを分析し、シングルセルの細胞軌道を測定する。一般に、細胞軌道とは、細胞のクロマチン構造により示される、細胞の、第１の状態から第２の状態への変化を意味する。したがって、細胞軌道は、細胞のクロマチン組織化プロファイルを反映したものである。ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の過去の状態の速写を提供する。例えば、ＲＮＡ転写産物の存在により、過去のクロマチンの組織化の詳細を明らかにすることができる（例えば、ＲＮＡ転写産物に対応する特定の遺伝子が発現することで、クロマチン内でアクセス可能となる）。ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の将来の状態の速写を提供する。例えば、ＤＮＡ－ｓｅｑの結果は、現在のクロマチンの組織化の詳細を明らかにする（例えば、クロマチンがアクセス可能な領域に対応する特定の遺伝子を、転写及び発現のために入手可能である）。全てを合わせると、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑのシーケンスリードは、クロマチン構造プロファイルを明らかにする。
シングルセルのＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の配列決定リードを分析し、シングルセルの細胞軌道を測定する。一般に、細胞軌道とは、細胞のクロマチン構造により示される、細胞の、第１の状態から第２の状態への変化を意味する。したがって、細胞軌道は、細胞のクロマチン組織化プロファイルを反映したものである。ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の過去の状態の速写を提供する。例えば、ＲＮＡ転写産物の存在により、過去のクロマチンの組織化の詳細を明らかにすることができる（例えば、ＲＮＡ転写産物に対応する特定の遺伝子が発現することで、クロマチン内でアクセス可能となる）。ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した配列決定リードは、細胞の将来の状態の速写を提供する。例えば、ＤＮＡ－ｓｅｑの結果は、現在のクロマチンの組織化の詳細を明らかにする（例えば、クロマチンがアクセス可能な領域に対応する特定の遺伝子を、転写及び発現のために入手可能である）。全てを合わせると、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑのシーケンスリードは、クロマチン構造プロファイルを明らかにする。
【0092】
細胞軌道を測定するために、ＲＮＡ転写産物に由来する、アラインされたシーケンスリードを、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する、アラインされたシーケンスリードと比較する。より具体的には、ＲＮＡ転写産物に由来するシーケンスリードのリード計数を、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する、アラインされたシーケンスリードのリード計数と比較する。様々な実施形態では、個別の遺伝子ベースで比較を行う。
【0093】
例えば、参照ゲノム内で、既知の範囲の位置を有する遺伝子に関しては、ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｘ」シーケンスリードが存在し得、ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｙ」シーケンスリードが存在し得る。一実施形態では、ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｘ」シーケンスリードは、遺伝子の発現を示し、ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｙ」シーケンスリードは、遺伝子が、ＤＮＡのクロマチンがアクセス可能な領域に対応することを示す。これにより、細胞が、以前の状態と将来の状態との両方において、パッケージ化ＤＮＡ内でアクセス可能であるということを考慮すると、細胞の以前の状態（ＲＮＡ－ｓｅｑにより明らかとなる）と、細胞の将来の状態（ＤＮＡ－ｓｅｑにより明らかとなる）の、共通性が明らかとなる。
【0094】
第１の実施形態に従い、細胞軌道を測定するために単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した、配列決定リードを示す、図５Ａを参照する。図５Ａは、参照ゲノムの４つのウィンドウを示す。各ウィンドウは、ゲノムに沿って一定範囲の位置を含む。様々な実施形態では、各ウィンドウは、既知の遺伝子の位置範囲を参照することができる。第２及び第３のグラフは、４つのウィンドウのそれぞれにおけるゲノム位置にそれぞれまたがる、ＲＮＡ－ｓｅｑ５２０及びＤＮＡ－ｓｅｑ５３０のリードの量を示す。ここで、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑの両方が、ウィンドウ１、３、及び４におけるシーケンスリードをもたらし、ウィンドウ２にシーケンスリードは存在しない。例えば、４つのウィンドウのそれぞれが遺伝子の位置を参照する場合、ＲＮＡ－ｓｅｑ５２０とＤＮＡ－ｓｅｑ５３０のリードは、４つの遺伝子の以前の状態と将来の状態における共通性を示す。すなわち、４つの遺伝子のクロマチン構造プロファイルは変化しない。これは、４つの遺伝子に対するクロマチン構造プロファイルが変化しないままである細胞軌道を同定するのに有益である。
【0095】
別の実施形態では、ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｘ」シーケンスリード、及び、「Ｙ」シーケンスリードにより、細胞の以前の状態と細胞の将来の状態とにおける変化が明らかになる。一例として、ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｘ」シーケンスリードは、遺伝子が発現しなかったことを示す。このようなシナリオでは、Ｘ＝０のシーケンスリードとなるか、またはほぼ０のシーケンスリードとなる。しかし、ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｙ」シーケンスリードは、遺伝子が、パッケージ化ＤＮＡ内でアクセス可能であり、転写のために利用可能であることを示す。これは、細胞が、遺伝子の非発現の以前の状態から、遺伝子が発現し得る将来の状態に変化していることを示し得る。別の例として、ＲＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｘ」シーケンスリードは、遺伝子が発現したことを示す。しかし、ＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した「Ｙ」シーケンスリードは、遺伝子が、パッケージ化ＤＮＡ内でアクセス不可能であり、転写のために利用不可能であることを示す。このようなシナリオでは、Ｙ＝０のシーケンスリードとなるか、またはほぼ０のシーケンスリードとなる。これは、細胞が、遺伝子の発現の以前の状態から、遺伝子が発現しない将来の状態に変化していることを示し得る。
【0096】
図５Ｂは、第２の実施形態に従い、細胞軌道を測定するためにシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑにより入手した、配列決定リードを示す。再び、図５Ｂは、参照ゲノムの４つのウィンドウを示す。各ウィンドウは、ゲノムに沿って一定範囲の位置を含む。様々な実施形態では、各ウィンドウは、既知の遺伝子の位置範囲を参照することができる。第２及び第３のグラフは、４つのウィンドウのそれぞれにおけるゲノム位置にそれぞれまたがる、ＲＮＡ－ｓｅｑ５２０及びＤＮＡ－ｓｅｑ５３０のリードの量を示す。
【0097】
ここで、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑは、ウィンドウ１、２、及び３において、異なるリードの量をもたらす一方で、ウィンドウ４におけるリードの量は一般に一致する。ここでもまた、４つのウィンドウのそれぞれが遺伝子の位置を参照する場合、ＲＮＡ－ｓｅｑ５２０及びＤＮＡ－ｓｅｑ５３０のリードは、遺伝子のうち３つ（例えば、ウィンドウ１、２、及び３）のクロマチンプロファイルにおける変化を示す一方で、４番目の遺伝子（例えばウィンドウ４）のクロマチンプロファイルは変化しない。具体的には、ウィンドウ１及び３は、対応する遺伝子が、アクセス可能な状態からアクセス不可能な状態に変化し得ることを示す。対応する遺伝子が、アクセス不可能な状態からアクセス可能な状態に変化し得ることを、ウィンドウ２は示す。これは、クロマチン構造プロファイルが、遺伝子のうち３つに対して変化を受け（例えば、アクセス可能からアクセス不可能、または、アクセス不可能からアクセス可能）、４番目の遺伝子に関しては変化しない、細胞軌道を同定するのに有益である。
【0098】
前述の例示的な説明では、単独の遺伝子、または限定数の遺伝子（例えば、図５Ａ及び５Ｂで示すように、４つの遺伝子）を参照するが、ＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ－ｓｅｑにより入手したシーケンスリードの分析は、ゲノムにまたがる、数十、数百、数千、または数万個の遺伝子に適用することができる。そのため、各細胞に関しては、細胞のゲノムにまたがって、変化していない、または変化したクロマチン構造プロファイルを測定することができる。変化していない、または変化したクロマチン構造プロファイルは、細胞系統、細胞運命、細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な細胞の将来の状態、外部刺激（例えば治療）に対する将来の細胞応答のいずれかなどの細胞軌道を測定するのに有益である。クロマチンプロファイルを使用して細胞系統を予測するさらなる説明は、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｈａｒｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ，ｂｉｏＲｘｉｖ，Ｊｕｎｅ １８，２０２０，ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０６．１７．１５６９４３に見出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0099】
バーコード及びバーコード化ビーズ
本発明の実施形態は、図１に示す工程１７０の間に、シングルセルの検体を標識するために、１つ以上のバーコード配列を提供すること伴う。１つ以上のバーコード配列は、エマルションに、シングルセルに由来する細胞溶解物と共に封入される。そのため、１つ以上のバーコードは細胞の検体を標識することにより、シーケンスリードが、細胞起源の検体に由来することをその後判定することを可能にする。
本発明の実施形態は、図１に示す工程１７０の間に、シングルセルの検体を標識するために、１つ以上のバーコード配列を提供すること伴う。１つ以上のバーコード配列は、エマルションに、シングルセルに由来する細胞溶解物と共に封入される。そのため、１つ以上のバーコードは細胞の検体を標識することにより、シーケンスリードが、細胞起源の検体に由来することをその後判定することを可能にする。
【0100】
様々な実施形態では、複数のバーコードをエマルションに、細胞溶解物と共に添加する。様々な実施形態では、エマルションに添加される複数のバーコードは、少なくとも１０２、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、または少なくとも１０８個のバーコードを含む。様々な実施形態では、エマルションに添加される複数のバーコードは、同一のバーコード配列を有する。様々な実施形態では、エマルションに添加される複数のバーコードは、「固有の識別配列」（ＵＭＩ）を含む。ＵＭＩは、そのＵＭＩがコンジュゲートされている１つ以上の第１の分子を、１つ以上の第２の分子から識別及び／または区別するのに利用できる配列を有する核酸である。ＵＭＩは典型的には、長さが短く、例えば、約５～２０塩基長であり、対象とする１つ以上の標的分子またはその増幅産物にコンジュゲートしてよい。ＵＭＩは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、バーコード配列及びＵＭＩの両方が、バーコードに組み込まれる。概して、ＵＭＩは、１つの集団または群における似た種類の分子を区別する目的で用いるのに対して、バーコード配列は、異なる細胞に由来する複数の分子集団または分子群を区別するのに用いる。いくつかの実施形態では、ＵＭＩ及びバーコード配列の両方を使用する場合、そのＵＭＩは、そのバーコード配列よりも配列の長さが短い。バーコードの使用は、米国特許出願第１５／９４０，８５０号にさらに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0101】
いくつかの実施形態では、バーコードは一本鎖バーコードである。一本鎖バーコードは、多数の技術を使用して生成することができる。例えば、一本鎖バーコードは、異なる分子の配列が少なくとも部分的に異なっている、複数のＤＮＡバーコードを入手することにより生成することができる。これらの分子を次に増幅し、例えば、非対称ＰＣＲを使用して、一本鎖のコピーを作製することができる。あるいは、バーコード分子を環状にした後で、ローリングサークル増幅に供することができる。これにより、バーコード化した元のＤＮＡが、単一の長い分子として何回も濃縮される、生成物である分子が得られる。
【0102】
いくつかの実施形態では、任意数の定常配列が隣接するバーコード配列を含有する、環状バーコードＤＮＡは、線状ＤＮＡを環状にすることで入手することができる。任意の定常配列をアニールするプライマーは、鎖置換ポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９ポリメラーゼなど）を使用することにより、ローリングサークル増幅を開始することができ、バーコードＤＮＡの長い直鎖コンカテマーを生成する。
【0103】
様々な実施形態では、バーコードは、当該バーコードが標的核酸を標識可能にするプライマー配列に結合することができる。一実施形態では、バーコードはフォワードプライマー配列に結合する。様々な実施形態では、フォワードプライマー配列は、核酸のフォワード標的とハイブリダイズする遺伝子特異的プライマーである。様々な実施形態では、フォワードプライマー配列は、遺伝子特異的プライマーに付着した相補配列とハイブリダイズする、ＰＣＲハンドルなどの定常領域である。遺伝子特異的プライマーに付着した相補配列を、反応混合物（例えば、図１の反応混合物１４０）中に提供することができる。バーコードが同一のフォワードプライマーを有することができ、遺伝子特異的フォワードプライマーに結合するように個別に設計される必要がないため、定常フォワードプライマー配列をバーコードに含めることが、好ましい場合がある。
【0104】
様々な実施形態では、バーコードは、ビーズなどの支持構造体に解放可能に付着することができる。したがって、バーコードの複数のコピーを含む単一のビーズを、細胞溶解物を含むエマルションに分画することができ、これにより、細胞溶解物の検体を、ビーズのバーコードで標識することが可能となる。例示的なビーズとしては、固体ビーズ（例えば、シリカビーズ）、高分子ビーズ、またはハイドロゲルビーズ（例えば、ポリアクリルアミド、アガロース、もしくはアルギン酸ビーズ）が挙げられる。ビーズは、様々な技術を用いて合成することができる。例えば、混合分離技術を使用すると、同一な無作為のバーコード配列の多くのコピーを伴うビーズを合成することができる。これは例えば、ＤＮＡを合成可能な部位を含む複数のビーズを作製することにより達成することができる。ビーズは４つの集まりに分けることができ、それぞれに、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣなどの塩基をビーズに添加する、緩衝液と混合することができる。母集団を４つの亜集団に分けることで、各亜集団は、その表面に添加された塩基のうちの１つを有することができる。本反応は、単一の塩基のみが添加され、更なる塩基が添加されない方法で達成することができる。４つの亜集団全てに由来するビーズを合わせて互いに混合し、２回目の４つの集団への分割を行うことができる。この分割工程において、以前の４つの集団に由来するビーズを、無作為に一緒に混合することができる。これらを次に、４つの異なる溶液に添加し、各ビーズの表面上の、別の無作為な塩基を添加することができる。本プロセスを繰り返し、ビーズ表面に、母集団が分離及び混合される時間数におよそ等しい長さの配列を生成することができる。これを１０回行ったら、例えば、結果は、各ビーズが、その表面に同一の無作為の１０個の塩基配列が合成された多数のコピーを有する、ビーズの母集団となろう。各ビーズ上の配列は、各分離混合サイクルを通して終了した、反応器の特定の配列により測定される。例示的なビーズ及びその合成についてのさらなる詳細は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６４４４号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0105】
試薬
本明細書に記載する実施形態は、細胞を試薬と共に、エマルションに封入することを含む。一般に、試薬は、細胞が溶解する条件下で封入細胞と相互作用し、これにより、細胞の標的検体を放出する。試薬をさらに、標的検体と相互作用して、後続のバーコード化及び／または増幅のために調製することができる。様々な実施形態では、試薬としては、ｄｄＮＴＰ、リボヌクレアーゼ阻害剤などの阻害剤、プライマー（例えば、オリゴｄＴまたは遺伝子特異的リバースプライマーなどのリバースプライマー）、及び、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの安定化剤が挙げられる。
本明細書に記載する実施形態は、細胞を試薬と共に、エマルションに封入することを含む。一般に、試薬は、細胞が溶解する条件下で封入細胞と相互作用し、これにより、細胞の標的検体を放出する。試薬をさらに、標的検体と相互作用して、後続のバーコード化及び／または増幅のために調製することができる。様々な実施形態では、試薬としては、ｄｄＮＴＰ、リボヌクレアーゼ阻害剤などの阻害剤、プライマー（例えば、オリゴｄＴまたは遺伝子特異的リバースプライマーなどのリバースプライマー）、及び、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの安定化剤が挙げられる。
【0106】
様々な実施形態では、試薬は、細胞を溶解させる１つ以上の溶解剤を含む。溶解剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＮＰ－４０、加えて細胞毒素などの洗剤が挙げられる。ＮＰ－４０の例としては、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮＰ－４０ Ｓｕｒｆａｃｔ－Ａｍｐｓ洗剤溶液、及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＮＰ－４０（ＴＥＲＧＩＴＯＬ型ＮＰ－４０）が挙げられる。いくつかの実施形態では、試薬としては、細胞膜を破壊し、細胞溶解を引き起こすのに十分ではあるが、クロマチンパッケージ化ＤＮＡを破壊しないＮＰ４０洗剤が挙げられる。様々な実施形態では、試薬は、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、または５．０％のＮＰ４０（ｖ／ｖ）を含む。様々な実施形態では、試薬は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、または少なくとも５％のＮＰ４０（ｖ／ｖ）を含む。
【0107】
様々な実施形態では、試薬は、細胞の溶解、及び／またはゲノムＤＮＡのアクセスを補助するプロテアーゼをさらに含む。様々な実施形態では、試薬中のプロテアーゼとしては、プロテイナーゼＫ、ペプシン、プロテアーゼ－サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、プロテアーゼ型Ｘ－ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、または、プロテアーゼ型ＸＩＩＩ－ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉを挙げることができる。様々な実施形態では、試薬中のプロテアーゼの量は、シングルセルワークフロー手順で用いるプロテアーゼの量を下回る。様々な実施形態では、試薬中のプロテアーゼの量は、従来のシングルセルワークフロー手順で存在する量の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満である。例えば、シングルセルワークフロー手順では、１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを使用している（その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ｍａｕｒｉｚｉｏ ｅｔ ａｌ．“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．” Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．２８，９（２０１８）： １３４５－１３５２を参照されたい）。したがって、様々な実施形態では、試薬は、０．０００１ｍｇ／ｍＬ未満、０．０００５ｍｇ／ｍＬ未満、０．００１０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００２０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００３０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００４０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００６０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００７０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００８０ｍｇ／ｍＬ未満、０．００９０ｍｇ／ｍＬ未満、０．０１ｍｇ／ｍＬ未満、０．０２ｍｇ／ｍＬ未満、０．０３ｍｇ／ｍＬ未満、０．０４ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５ｍｇ／ｍＬ未満、０．１０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１５ｍｇ／ｍＬ未満、０．２０ｍｇ／ｍＬ未満、０．３０ｍｇ／ｍＬ未満、０．４０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．５０ｍｇ／ｍＬ未満を含む。
【0108】
様々な実施形態では、試薬は、シングルセルから放出された標的検体と相互作用する剤をさらに含む。このような剤の一例としては、細胞から放出されるメッセンジャーＲＮＡを逆転写し、対応するｃＤＮＡを生成する、逆転写酵素が挙げられる。
【0109】
いくつかの実施形態では、剤は、パッケージ化ＤＮＡと相互作用して、クロマチン及び／またはヌクレオソームにより結合されない、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを生成するトランスポザーゼＴｎ５（または、変異したトランスポザーゼＴｎ５）を含む。様々な実施形態では、試薬中でのトランスポザーゼＴｎ５の量は、従来のＡＴＡＣ－ｓｅｑ手順で使用されるトランスポザーゼＴｎ５の量を下回る。従来のＡＴＡＣ－ｓｅｑ手順で使用するトランスポザーゼＴｎ５の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｔａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ酵素（Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号２００３４１９７または２００３４１９８）、及び、Ｎｅｘｔｅｒａ Ｔｎ５トランスポザーゼ，Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号ＦＣ－１２１－１０３０）が挙げられる。様々な実施形態では、試薬中のトランスポザーゼＴｎ５の量は、従来のＡＴＡＣ－ｓｅｑ手順で存在する量の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、または５０％未満である。例えば、従来のＡＴＡＣ－ｓｅｑ手順では、５％のトランスポザーゼＴｎ５（ｖ／ｖ）を用いる（それぞれが、その全体が参照により組み込まれている、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ．” Ｎａｔｕｒｅ，５２３（７５６１）：４８６－４９０．Ｊｕｌｙ ２３，２０１５、Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．“ＡＴＡＣ－ｓｅｑ：Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｓｓａｙｉｎｇ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ．” Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１０９ ２１．２９．１－２１．２９．９．５ Ｊａｎ．２０１５、及びＳｈａｓｈｉｋａｎｔ，Ｔａｎｖｉ，ａｎｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ Ｅｔｔｅｎｓｏｈｎ．“Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ＡＴＡＣ－ｓｅｑ．” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５１（２０１９）： ２１９－２３５を参照されたい）。したがって、様々な実施形態では、試薬は、０．０００５％未満、０．００２５％未満、０．００５％未満、０．０１％未満、０．０１５％未満、０．０２％未満、０．０２５％未満、０．０３０％未満、０．０３５％未満、０．０４０％未満、０．０４５％未満、０．０５０％未満、０．１％未満、０．１５％未満、０．２％未満、０．２５％未満、０．５％未満、０．７５％未満、１．０％未満、１．２５％未満、１．５％未満、１．７５％未満、２．０％未満、または２．５％未満のトランスポザーゼＴｎ５（ｖ／ｖ）を含む。
【0110】
本明細書の実施形態は、シングルセル由来のＤＮＡでＤＮＡ－配列決定を行うことについて記載する。好ましい実施形態では、ＤＮＡ－配列決定は、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ（例えば、クロマチンでパッケージ化されたときにアクセス可能なＤＮＡ）で行われる。クロマチンがアクセス可能なＤＮＡでＤＮＡ－配列決定を行うことと一致する特定の実施形態では、細胞と同時に封入される試薬は、プロテアーゼを含まず、より具体的には、プロテイナーゼＫ（または、変異したプロテイナーゼＫ）を含まない。さらに、試薬は、トランスポザーゼＴｎ５などのトランスポザーゼ、または、変異したトランスポザーゼＴｎ５などの、変異したトランスポザーゼを含まない。
【0111】
特定の実施形態では、試薬はＮＰ４０を含み、プロテイナーゼＫまたはトランスポザーゼを含まない。ＮＰ４０は、パッケージ化ＤＮＡを破壊することなく細胞を溶解するには十分であり、その後、パッケージ化ＤＮＡ内での、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのプライミングを行うことができ、これにより、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡを調査するＤＮＡ－配列決定が可能となる。プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼを欠いていることで、シングルセルワークフロープロセスが簡素化されるため、ＮＰ４０を含み、プロテイナーゼＫまたはトランスポザーゼを含まない試薬を用いることが好ましい。加えて、プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼを欠いていることにより、ワークフロープロセスで用いられる消耗品の数が少なくなり、これにより、大量の細胞のシングルセル分析を行うときに、より低コストがもたらされる。
【0112】
反応混合物
本明細書に記載されるように、反応混合物を、細胞溶解物と共にエマルションに供給する（例えば、図１の細胞バーコード化工程１７０を参照されたい）。一般に、反応混合物は、細胞溶解物の検体にて、核酸増幅などの反応を行うのに十分な反応物質を含む。
本明細書に記載されるように、反応混合物を、細胞溶解物と共にエマルションに供給する（例えば、図１の細胞バーコード化工程１７０を参照されたい）。一般に、反応混合物は、細胞溶解物の検体にて、核酸増幅などの反応を行うのに十分な反応物質を含む。
【0113】
様々な実施形態では、反応混合物は、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長生成物の合成が触媒される条件下に配置されるときに、相補鎖に沿って、合成の開始点として機能することができるプライマーを含む。様々な実施形態では、反応混合物は、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（アデノシン、グアニン、シトシン、及びチミン）を含む。様々な実施形態では、反応混合物は、核酸増幅のための酵素を含む。核酸増幅のための酵素の例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、熱サイクル増幅用の熱安定ポリメラーゼ、または、等温増幅のための複数置換増幅用ポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる増幅などの、さほど一般的でない他の増幅形態もまた適用し、それ自身がＤＮＡに逆転換し、本質的に、標的の増幅をもたらすことができる、元のＤＮＡ標的に由来するＲＮＡの複数のコピーを作製することができる。生体もまた使用して、例えば、標的を生体に変換することにより、標的を増幅することができ、これにより次いで、生体の複製を伴い、または伴わずに、標的をコピーすることが可能となるか、またはコピーを誘発することができる。
【0114】
様々な実施形態では、反応混合物の内容物は、好適な緩衝液中に存在し（「緩衝液」は、補助因子であるか、または、ｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換基を含む）、好適な温度にある。
【0115】
核増幅の程度を、反応混合物中で反応物質の濃度を制御することにより制御することができる。場合によっては、これは、増幅産物が用いられる反応の微細なチューニングに有用である。
【0116】
プライマー
本明細書に記載する本発明の実施形態は、プライマーを使用して、シングルセル分析を実施する。例えば、プライマーは、図１に示すワークフロープロセスの間に用意される。プライマーを使用して、対象となる核酸がバーコード化、及び／または増幅可能となるように、対象となる核酸の特定の配列とプライミング（例えばハイブリダイズ）することができる。加えて、プライマーにより、配列決定後の標的領域の同定が可能となる。後で説明するように、プライマーは、図１に示すワークフロープロセスにおいて、様々な工程で提供することができる。図１を再度参照すると、様々な実施形態では、プライマーを、細胞１１０と共に封入される試薬１２０に含めることができる。試薬１２０中のこのようなプライマーとしては、プライミングＲＮＡ用のＲＮＡプライマー、及び／または、パッケージ化ＤＮＡ内でクロマチンがアクセス可能なＤＮＡをプライミングするためのＤＮＡプライマーを含むことができる。様々な実施形態では、プライマーを、細胞溶解物１３０と共に封入される反応混合物１４０に含めることができる。反応混合物１４０中のこのようなプライマーとしては、ＲＮＡから逆転写されているｃＤＮＡをプライミングするためのｃＤＮＡプライマー、ならびに／または、パッケージ化ＤＮＡ中のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び／もしくは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡから生成されている生成物をプライミングするためのＤＮＡプライマーを挙げることができる。様々な実施形態では、プライマーを、細胞溶解物１３０と共に封入されるバーコード１４５に含めることができるか、または、これと結合させることができる。シングルセル分析ワークフロープロセスで使用されるプライマーのさらなる説明及び例は、米国出願第１６／７４９，７３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書に記載する本発明の実施形態は、プライマーを使用して、シングルセル分析を実施する。例えば、プライマーは、図１に示すワークフロープロセスの間に用意される。プライマーを使用して、対象となる核酸がバーコード化、及び／または増幅可能となるように、対象となる核酸の特定の配列とプライミング（例えばハイブリダイズ）することができる。加えて、プライマーにより、配列決定後の標的領域の同定が可能となる。後で説明するように、プライマーは、図１に示すワークフロープロセスにおいて、様々な工程で提供することができる。図１を再度参照すると、様々な実施形態では、プライマーを、細胞１１０と共に封入される試薬１２０に含めることができる。試薬１２０中のこのようなプライマーとしては、プライミングＲＮＡ用のＲＮＡプライマー、及び／または、パッケージ化ＤＮＡ内でクロマチンがアクセス可能なＤＮＡをプライミングするためのＤＮＡプライマーを含むことができる。様々な実施形態では、プライマーを、細胞溶解物１３０と共に封入される反応混合物１４０に含めることができる。反応混合物１４０中のこのようなプライマーとしては、ＲＮＡから逆転写されているｃＤＮＡをプライミングするためのｃＤＮＡプライマー、ならびに／または、パッケージ化ＤＮＡ中のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び／もしくは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡから生成されている生成物をプライミングするためのＤＮＡプライマーを挙げることができる。様々な実施形態では、プライマーを、細胞溶解物１３０と共に封入されるバーコード１４５に含めることができるか、または、これと結合させることができる。シングルセル分析ワークフロープロセスで使用されるプライマーのさらなる説明及び例は、米国出願第１６／７４９，７３１号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0117】
様々な実施形態では、試薬、反応混合物、またはバーコードのいずれかの中でのプライマーの数は、約１～約５００個以上の範囲、例えば、約２～１００個のプライマー、約２～１０個のプライマー、約１０～２０個のプライマー、約２０～３０個のプライマー、約３０～４０個のプライマー、約４０～５０個のプライマー、約５０～６０個のプライマー、約６０～７０個のプライマー、約７０～８０個のプライマー、約８０～９０個のプライマー、約９０～１００個のプライマー、約１００～１５０個のプライマー、約１５０～２００個のプライマー、約２００～２５０個のプライマー、約２５０～３００個のプライマー、約３００～３５０個のプライマー、約３５０～４００個のプライマー、約４００～４５０個のプライマー、約４５０～５００個のプライマーまたは約５００個以上のプライマーであってよい。
【0118】
標的化ＤＮＡ配列決定、及び標的化ＲＮＡ配列決定に関して、試薬（例えば、図１における試薬１２０）中のプライマーとしては、対象となる核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）において、逆標的に対して相補的なリバースプライマーを挙げることができる。様々な実施形態では、試薬中のプライマーは、対象となる遺伝子の逆標的を標的にする遺伝子特異的プライマーであってよい。様々な実施形態では、反応混合物（例えば、図１の反応混合物１４０）中のプライマーとしては、対象となる核酸（例えばＤＮＡ）のフォワード標的に対して相補的なフォワードプライマーであってよい。様々な実施形態では、反応混合物中のプライマーは、対象となる遺伝子のフォワード標的を標的にする遺伝子特異的プライマーであってよい。様々な実施形態では、試薬のプライマー、及び反応混合物のプライマーは、核酸上で、対象となる領域に対するプライマーセット（例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマー）を形成する。
【0119】
対象とする遺伝子用フォワードまたはリバースプライマーの添加数は、約１～５００個の範囲、例えば、約１～１０個のプライマー、約１０～２０個のプライマー、約２０～３０個のプライマー、約３０～４０個のプライマー、約４０～５０個のプライマー、約５０～６０個のプライマー、約６０～７０個のプライマー、約７０～８０個のプライマー、約８０～９０個のプライマー、約９０～１００個のプライマー、約１００～１５０個のプライマー、約１５０～２００個のプライマー、約２００～２５０個のプライマー、約２５０～３００個のプライマー、約３００～３５０個のプライマー、約３５０～４００個のプライマー、約４００～４５０個のプライマー、約４５０～５００個のプライマーまたは約５００個以上のプライマーであってよい。様々な実施形態では、ＤＮＡ－配列決定またはＲＮＡ－配列決定のいずれかに対する、対象となる遺伝子としては、ＣＣＮＤ３、ＣＤ４４、ＣＣＮＤ１、ＣＤ３３、ＣＤＫ６、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＲＥＢ３Ｌ４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ５、ＣＲＥＢ１、ＥＬＫ１、ＦＯＳ、ＦＨＬ１、ＦＡＳＬＧ、ＧＮＧ１２、ＧＳＫ３Ｂ、ＢＡＤ、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＯ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＳＰＢ１、ＩＫＢＫＧ、ＩＲＦ９、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＭＡＰ２Ｋ１ ＭＡＰＫ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＹＢ、ＮＦ１、ＮＦＫＢ１、ＭＹＣ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＭ１、ＰＩＡＳ１、ＰＲＫＣＢ、ＰＴＥＮ、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＡ、ＳＩＲＴ１、ＮＣＬ、ＲＨＯＡ、ＭＣＭ４、ＮＡＳＰ、ＳＯＳ１、ＴＣＬ１Ｂ、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ２、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＳＲＦ、ＴＰ５３、ＣＡＳＰ９、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＵＢＢ、ＭＰＲＬ１６、ＭＲＰＬ２１、ＦＡＭ３２Ａ、ＡＢＣＢ７、ＰＣＢＰ１、ＥＰＳ１５、ＮＲＡＳ、ＲＰＳ２７Ａ、ＡＦＦ３、ＰＡＸ３、ＣＭＴＭ６、ＲＨＯＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＮＳＤ１、ＰＴＰＲＫ、ＣＡＲＤ１１、ＥＧＦＲ、ＥＺＨ２、ＷＲＮ、ＪＡＫ２、ＧＡＴＡ３、ＤＫＫ１、ＰＯＬＡ２、ＣＣＮＤ１、ＡＴＭ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＫＲＡＳ、ＣＯＬ２Ａ１、ＫＭＴ２Ｄ、ＣＬＩＰ１、ＦＬＴ３、ＢＲＣＡ２、ＢＵＢ１Ｂ、ＰＡＬＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＮＣＯＲ１、ＥＲＢＢ２、ＫＡＴ２Ａ、ＲＡＢ５Ｃ、ＭＥＴＴＬ２３、ＳＲＳＦ２、ＭＦＳＤ１１、ＤＮＭ２、ＣＩＣ、ＢＣＲ、ＭＹＨ９、ＥＰ３００、及びＳＳＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0120】
全トランスクリプトームＲＮＡ配列決定のために、様々な実施形態では、試薬（例えば、図１の試薬１２０）のプライマーは、定常リバースプライマー及びランダムフォワードプライマーを含むことができる。定常リバースプライマーとしては、ユニバーサルプライマー領域、及び、ＰＣＲハンドルなどの逆定常領域を挙げることができる。例えば、ユニバーサルプライマー領域は、メッセンジャーＲＮＡ転写物のポリＡテールとハイブリダイズする、オリゴｄＴ配列であることができる。このプライミングにより、ｍＲＮＡ転写物を逆転写することが可能となる。ランダムフォワードプライマーは、逆転写ｃＤＮＡの配列とハイブリダイズするランダムプライマー配列を有することができ、これにより、ｃＤＮＡをプライミングすることが可能となる。様々な実施形態では、反応混合物（例えば、図１の反応混合物１４０）のプライマーは、定常フォワードプライマー及び定常リバースプライマーであることができる。定常フォワードプライマーは、ｃＤＮＡのプライミングを可能にするランダムフォワードプライマーとハイブリダイズすることができる。定常リバースプライマーは、以前にｍＲＮＡ転写物の逆転写を可能にした、ＰＣＲハンドルなどの逆定常領域の配列とハイブリダイズすることが可能である。
【0121】
様々な実施形態では、反応混合物（例えば、図１の反応混合物１４０）に含まれるプライマーの代わりに、このようなプライマーは、バーコード（例えば、図１のバーコード１４５）の含まれることができるか、またはこれに結合することができる。特定の実施形態では、プライマーは、バーコードの末端に結合し、それ故、細胞溶解物中で、核酸の標的配列とハイブリダイズするのに利用可能である。
【0122】
様々な実施形態では、反応混合物のプライマー、試薬のプライマー、またはバーコードのプライマーはエマルションに、１工程で、または２つ以上の工程で添加することができる。例えば、プライマーは、２工程以上、３工程以上、４工程以上または５工程以上で加えてよい。プライマーを１工程で加えるか、２工程以上で加えるかにかかわらず、プライマーは、溶解剤を加えた後、溶解剤を加える前、または溶解剤を加えるのと同時に加えてよい。溶解剤を加える前または加えた後にＰＣＲプライマーを加える場合、反応混合物のプライマーは、（例えば、図１に示す２段階ワークフロープロセスで例示されるように）溶解剤の添加とは別個の工程で添加することができる。
【0123】
標的核酸を増幅するためのプライマーセットは典型的には、標的核酸またはその相補体と相補的であるフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、１回の増幅反応において、複数の標的特異的プライマー対を用いて行うことができ、この場合、各プライマー対は、標的特異的なフォワードプライマー及び標的特異的なリバースプライマーを含み、それぞれ、試料中の対応する標的配列と実質的に相補的であるかまたは実質的に同一である配列を少なくとも１つ含み、各プライマー対は、対応する標的配列が異なる。したがって、本発明におけるある特定の方法を用いて、シングルセルの試料に由来する複数の標的配列を検出または識別する。
【0124】
例示的なシステム及び／またはコンピュータの実施形態
図６は、図１～５に記載する実施形態に従い、細胞（複数可）でシングルセル分析を行い、予測された細胞軌道６４０を生成するための、シングルセルワークフロー装置６２０及び演算装置６３０を含む全体のシステム環境を示す。様々な実施形態では、シングルセルワークフロー装置６２０は、細胞封入１６０、検体放出１６５、細胞バーコード化１７０、標的増幅１７５、核酸プール２０５、及び配列決定２１０の工程を行うように構成される。様々な実施形態では、演算装置６３０は、リードアラインメント２１５及び細胞軌道測定２２０のコンピュータによる工程を行うように構成される。
図６は、図１～５に記載する実施形態に従い、細胞（複数可）でシングルセル分析を行い、予測された細胞軌道６４０を生成するための、シングルセルワークフロー装置６２０及び演算装置６３０を含む全体のシステム環境を示す。様々な実施形態では、シングルセルワークフロー装置６２０は、細胞封入１６０、検体放出１６５、細胞バーコード化１７０、標的増幅１７５、核酸プール２０５、及び配列決定２１０の工程を行うように構成される。様々な実施形態では、演算装置６３０は、リードアラインメント２１５及び細胞軌道測定２２０のコンピュータによる工程を行うように構成される。
【0125】
様々な実施形態では、シングルセルワークフロー装置６２０は、少なくとも、細胞を試薬と共に封入し、細胞溶解物を反応混合物と封入し、核酸増幅反応を行うように構成される、マイクロフルイディクスデバイスを含む。例えば、マイクロフルイディクスデバイスは、流体連通している１つ以上の流体チャネルを含むことができる。したがって、第１のチャネルを通る水性流体と、第２のチャネルを通るキャリア流体とを組み合わせることにより、エマルションドロップレットの生成がもたらされる。様々な実施形態では、マイクロフルイディクスデバイスの流体チャネルは、ミリメートル以下のオーダー（例えば、約１ミリメートル以下）の、少なくとも１つの断面寸法を有することができる。マイクロチャネルのデザイン及び寸法についてのさらなる詳細は、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１６４４４号、及び、米国特許第１４／４２０，６４６号に記載されている。マイクロフルイディクスデバイスの一例は、Ｔａｐｅｓｔｒｉ（商標）Ｐｌａｔｆｏｒｍである。
【0126】
様々な実施形態では、シングルセルワークフロー装置６２０はまた、（ａ）対象装置及び／またはその中のドロップレットの、１つ以上の部分の温度を制御し、マイクロフルイディクスデバイス（複数可）に動作可能に接続されている、温度調節モジュール、（ｂ）マイクロフルイディクスデバイス（複数可）に動作可能に接続されている、検出手段、即ち検出器、例えば光学撮像器、（ｃ）マイクロフルイディクスデバイス（複数可）に動作可能に接続されている、インキュベーター、例えば細胞インキュベーター、ならびに、（ｄ）マイクロフルイディクスデバイス（複数可）に動作可能に接続したシーケンサーのうちの１つ以上を含むことができる。１つ以上の温度及び／または圧力制御モジュールは、装置の１つ以上の流路内での、キャリア流体の温度及び／または圧力の制御をもたらす。一例として、温度調節モジュールは、核酸増幅を行うために温度を制御する、１つ以上の熱サイクラーであってよい。１つ以上の検出手段、即ち検出器、例えば光学撮像器は、１つ以上のドロップレットの存在、または、その特徴（その組成を含む）を検出するように構成される。いくつかの実施形態では、検出手段は、１つ以上の流路内で、１つ以上のドロップレットの１つ以上の構成成分を認識するように構成される。シーケンサーは、次世代配列決定などの配列決定を行うように構成された、ハードウェア装置である。シーケンサーの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンサー（例えば、ＭｉｎｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）５５０ Ｓｅｒｉｅｓ、またはＮｅｘｔＳｅｑ（商標）２０００）、Ｒｏｃｈｅの配列決定システム４５４、及び、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのシーケンサー（例えば、Ｉｏｎ ＧｅｎｅＳｔｕｄｉｏ Ｓ５システム、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｘｕｓシステム）が挙げられる。
【0127】
図７は、図１～６を参照して記載するシステム及び方法を実装するための、例示的な演算装置を示す。例えば、例示的な演算装置６３０は、リードアラインメント２１５及び細胞軌道測定２２０のコンピュータによる工程を行うように構成される。演算装置の例としては、パーソナルコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップ、サーバーコンピュータ、クラスター内の演算ノード、メッセージプロセッサ、ハンドヘルドデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースまたはプログラミング可能な消費者エレクトロニクス、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、携帯電話、ＰＤＡ、タブレット、ポケベル、ルーター、スイッチなどを挙げることができる。
【0128】
図７は、図１～５に示すシステム及び方法を実装するための、例示的な演算装置６３０を示す。いくつかの実施形態では、演算装置６３０は、チップセット７０４に結合した少なくとも１つのプロセッサ７０２を含む。チップセット７０４は、メモリコントローラハブ７２０、及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）コントローラハブ７２２を含む。メモリ７０６およびグラフィックスアダプター７１２は、メモリコントローラハブ７２０に連結され、ディスプレイ７１８は、グラフィックスアダプター７１２に連結される。記憶装置７０８、入力インタフェース７１４、及びネットワークアダプター７１６が、Ｉ／Ｏコントローラハブ７２２に連結される。演算装置６３０の他の実施形態は、異なる構造を有する。
【0129】
記憶装置７０８は、ハードドライブ、コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、ＤＶＤ、またはソリッドステートメモリデバイス等の、非一時的コンピュータ可読記憶媒体である。メモリ７０６は、プロセッサ７０２によって使用される命令およびデータを保持する。入力インタフェース７１４は、タッチスクリーンインタフェース、マウス、トラックボール、または他の種類の入力インタフェース、キーボード、またはいくつかのこれらの組み合わせであり、データを演算装置６３０に入力するために使用する。いくつかの実施形態では、演算装置６３０は、入力インタフェース７１４から、ユーザのジェスチャを介して、入力（例えばコマンド）を受けるように構成されることができる。グラフィックスアダプター７１２は、ディスプレイ７１８に、イメージ及び他の情報を表示する。例えば、ディスプレイ７１８は、予測した細胞軌道の指標を示すことができる。ネットワークアダプター７１６は、演算装置６３０を１つ以上のコンピュータネットワークに結合する。
【0130】
演算装置６３０は、本明細書に記載される機能性を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを実行するように適合される。本明細書で使用される「モジュール」という用語は、指定された機能性を提供するために使用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアに実装することができる。一実施形態において、プログラムモジュールは、記憶装置７０８に記憶され、メモリ７０６にロードされ、プロセッサ７０２によって実行される。
【0131】
演算装置６３０の種類は、本明細書に記載する実施形態毎で変化し得る。例えば、演算装置６３０は、グラフィックスアダプター７１２、入力インタフェース７１４、及びディスプレイ７１８などの、上述した構成要素のいくつかを欠く場合がある。いくつかの実施形態では、演算装置６３０は、メモリ７０６に格納された命令を実行するためのプロセッサ７０２を含むことができる。
【0132】
シーケンスリードをアラインし、細胞軌道を測定する方法は、ハードウェアもしくはソフトウェア、またはこれらの組み合わせの中で実装することができる。一実施形態では、上述したものなどの、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供され、当該媒体は、上記データを用いるための指示でプログラミングされた機械を用いる際に、本発明の細胞軌道のデータセット及び実行及び結果のいずれかを表示可能な、機械で読取り可能なデータでコードされた、データ格納マテリアルを含む。このようなデータは、患者の監視、処置の考慮などの、様々な目的のために使用することができる。上述した方法の実施形態を、プロセッサ、データ格納システム（揮発性及び不揮発性メモリ、ならびに／または格納要素を含む）、グラフィックスアダプター、入力インタフェース、ネットワークアダプター、少なくとも１つの入力装置、ならびに少なくとも１つの出力装置を含む、プログラミング可能なコンピュータ上で実行するコンピュータプログラムに実装することができる。ディスプレイを、グラフィックスアダプターに結合する。プログラムコードを入力データに適用し、上述した機能を実施し、出力情報を生成する。出力情報を、既知の様式で１つ以上の出力装置に適用する。コンピュータは例えば、従来のデザインのパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、または、ワークステーションであることができる。
【0133】
各プログラムは、ハイレベルの手順またはオブジェクト指向プログラミング言語で実装して、コンピュータシステムと通信することができる。しかし、プログラムは、所望する場合、アセンブリまたは機械言語で実装することができる。いずれの場合も、言語はコンパイラ言語またはインタプリタ言語であることができる。このような各コンピュータプログラムは、ストレージ媒体または装置がコンピュータにより読み取られ、本明細書に記載する手順を実行するときに、コンピュータを構成して操作するために、汎用または特殊目的のプログラミング可能なコンピュータにより読み取り可能な、ストレージ媒体または装置（例えば、ＲＯＭまたは磁気ディスク）に格納されるのが好ましい。システムは、構成されたストレージ媒体が、コンピュータを特定かつ所定の様式で操作させ、本明細書に記載する機能を実施する場合に、コンピュータプログラムと共に構成される、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体として実装されるとみなされることもまた、可能である。
【0134】
署名パターン及びそのデータベースを、様々な媒体で提供して、その使用を容易にすることができる。「媒体」とは、本発明の署名パターン情報を含有するマニュファクチャを意味する。本発明のデータベースは、コンピュータが読み取り可能な媒体、例えば、コンピュータにより読み取られ、直接アクセス可能な任意の媒体に記録することができる。このような媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスクストレージ媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；ＣＤ－ＲＯＭなどの光学記憶媒体；ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体；ならびに、磁気／光学記憶媒体などの、これらのカテゴリーのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、現在知られているコンピュータで読み取り可能な媒体のいずれかを使用して、本データベース情報を記録することを含むマニュファクチャを作製する方法を速やかに理解することができる。「記録された」とは、当技術分野において既知の任意のこのような方法を使用して、コンピュータで読み取り可能な媒体に情報を格納するプロセスを意味する。格納した情報にアクセスするために使用する手段に基づき、任意の従来のデータ格納構造体を選択することができる。様々なデータプロセッサプログラム及びフォーマット、例えば、ワープロテキストファイル、データベースフォーマットなどを、格納のために使用することができる。
【0135】
例示的なキットの実施形態
個々の細胞、または細胞の集団の、ＲＮＡ転写産物及びＤＮＡ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）を分析するためのキットもまた、本明細書で提供する。キットは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：エマルションを形成するための流体（例えば、キャリア相、水相）、バーコード化ビーズ、シングルセルを処理するためのマイクロフルイディクスデバイス、細胞を溶解し、細胞検体を放出するための試薬、核酸増幅反応を行うための反応混合物、及び、本明細書に記載の方法に対応するキット成分のうちのいずれかを使用するための取扱説明書。
個々の細胞、または細胞の集団の、ＲＮＡ転写産物及びＤＮＡ（例えば、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡ）を分析するためのキットもまた、本明細書で提供する。キットは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：エマルションを形成するための流体（例えば、キャリア相、水相）、バーコード化ビーズ、シングルセルを処理するためのマイクロフルイディクスデバイス、細胞を溶解し、細胞検体を放出するための試薬、核酸増幅反応を行うための反応混合物、及び、本明細書に記載の方法に対応するキット成分のうちのいずれかを使用するための取扱説明書。
【実施例】
【0136】
実施例１：イントロン領域のＤＮＡアンプリコン－オリゴｄＴプライミング
Ｔａｐｅｓｔｒｉ（商標）を用いる、図１に示すワークフロープロセスを使用して、Ｋ－５６２細胞を処理した。具体的には、シングルセルを、試薬と共に、エマルションに分画した。試薬は、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）も、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼＴｎ５）も含まない。試薬は、ＳＳＩＶ ＲＴ、５Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｍＭのＤＴＴ、リボヌクレアーゼ阻害剤、５０ｕＭのオリゴｄＴ、ＮＰ－４０、及びｄＨ２Ｏを含んだ。試薬中の０．１％のＮＰ４０が、シングルセルの、エマルションへの溶解を引き起こす。封入ドロップレットを含有するチューブを５５℃で１０分間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。シシングルセルのＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、図４Ａ及び４Ｂに記載するプロセスに従い処理した。具体的には、第１のエマルション内で、シングルセル由来のＲＮＡ転写産物を、オリゴｄＴプライマーを使用してプライミングし、逆転写酵素を使用して生成した。
Ｔａｐｅｓｔｒｉ（商標）を用いる、図１に示すワークフロープロセスを使用して、Ｋ－５６２細胞を処理した。具体的には、シングルセルを、試薬と共に、エマルションに分画した。試薬は、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）も、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼＴｎ５）も含まない。試薬は、ＳＳＩＶ ＲＴ、５Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｍＭのＤＴＴ、リボヌクレアーゼ阻害剤、５０ｕＭのオリゴｄＴ、ＮＰ－４０、及びｄＨ２Ｏを含んだ。試薬中の０．１％のＮＰ４０が、シングルセルの、エマルションへの溶解を引き起こす。封入ドロップレットを含有するチューブを５５℃で１０分間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。シシングルセルのＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、図４Ａ及び４Ｂに記載するプロセスに従い処理した。具体的には、第１のエマルション内で、シングルセル由来のＲＮＡ転写産物を、オリゴｄＴプライマーを使用してプライミングし、逆転写酵素を使用して生成した。
【0137】
ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを含む細胞溶解物を次に、反応混合物及びバーコード化ビーズと共に（ビーズに解放可能に結合した、１００万個にわたるバーコードと共に）、第２のエマルションに封入した。反応混合物は、対象となる遺伝子を標的にする、（ＰＣＲハンドルが付いた）フォワード及びリバースプライマーを含む。フォワードプライマーを表１に示す。リバースプライマーを表２に示す。
【0138】
【表1】
【0139】
【表2】
【0140】
パッケージ化ＤＮＡ及びｃＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡをプライミングする。核酸増幅を行い、ＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する増幅核酸を生成した。
【0141】
増幅核酸をチューブ（例えば、ＰＣＲチューブまたはエッペンドルフチューブ）にプールし、エマルションを破壊した。増幅核酸は、Ｐ５及びＰ７配列アダプターを添加することにより、ライブラリー調製を受けた。核酸を配列決定し、シーケンスリードを得た。一般的なバーコードに従ってシーケンスリードをクラスター化し、参照ゲノムにアラインした。
【0142】
クロマチンがアクセス可能なＤＮＡがプライミングされ増幅したことを確認するために、参照ゲノムで既知の、ＤＮＡのイントロン領域を分析し、イントロン領域に対応するシーケンスリードが増幅され配列決定されたか否かを分析した。
【0143】
図８Ａは、Ｋ－５６２細胞のオリゴｄＴプライミングにより入手したイントロン領域において、リードにより観察されたＤＮＡアンプリコンのサイズを示し、プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼ（Ｔｎ５）は封入の間に使用しなかった。特に、イントロンリードは、１００～５００塩基対、５００～１００塩基対、１０００～１５００塩基対、及びさらに、１５００塩基対を超える長さを含む、様々な長さにて存在した。このことは、これらのイントロンリードが存在する、対応する遺伝子が、転写のためにアクセス可能であり利用可能である可能性が高いことを示している。逆に、いくつかのイントロンリードは観察されなかった。このことは、これらのイントロンリードが存在しない、対応する遺伝子が、転写のためにアクセス不可能で利用不可能であることを示している。
【0144】
図８Ｂ及び図８Ｃは、参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＣＣＬ２遺伝子及びＨＬＡ－Ｃ遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。図８Ｂ及び図８Ｃにおいて、多数の対形成したリード（例えば、フォワード及びリバースリード）が、ＣＣＬ２及びＨＬＡ－Ｃのイントロン領域とアラインされる。したがって、ＣＣＬ２及びＨＬＡ－Ｃのイントロン領域中にこれらのシーケンスリードが存在することは、ＣＣＬ２及びＨＬＡ－Ｃの遺伝子が、転写のためにアクセス可能であり利用可能であることを示している。
【0145】
全てを合わせると、図８Ａ～８Ｃの結果は、シングルセル分析プロセスにより入手したシーケンスリードが、イントロン領域とアラインされることを示す。このことは、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡは、パッケージ化状態にあるときに、上手くアクセスされ、プライミングされ、増幅され、配列決定されたことを示している。
【0146】
実施例２：イントロン領域のＤＮＡアンプリコン－遺伝子の特異的プライミング
Ｔａｐｅｓｔｒｉ（商標）を用いる、図１に示すワークフロープロセスを使用して、ＭＣ７細胞を処理した。具体的には、シングルセルを、試薬と共に、エマルションに分画した。試薬は、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）も、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼＴｎ５）も含まない。試薬は、ＳＳＩＶ ＲＴ、５Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｍＭのＤＴＴ、リボヌクレアーゼ阻害剤、リバースプライマー（３４重）、ＮＰ－４０、及びｄＨ２Ｏを含んだ。試薬中の０．１％のＮＰ４０が、シングルセルの、エマルションへの溶解を引き起こす。封入ドロップレットを含有するチューブを５０℃で１０分間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。シングルセルのＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、図４Ａ及び４Ｂに記載するプロセスに従い処理した。具体的には、第１のエマルション内で、シングルセル由来のＲＮＡ転写産物を、リバースプライマーを使用してプライミングし、逆転写酵素を使用して生成した。リバースプライマーを表３に示す。
Ｔａｐｅｓｔｒｉ（商標）を用いる、図１に示すワークフロープロセスを使用して、ＭＣ７細胞を処理した。具体的には、シングルセルを、試薬と共に、エマルションに分画した。試薬は、プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）も、トランスポザーゼ（例えば、トランスポザーゼＴｎ５）も含まない。試薬は、ＳＳＩＶ ＲＴ、５Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液、１０ｍＭのｄＮＴＰ、１００ｍＭのＤＴＴ、リボヌクレアーゼ阻害剤、リバースプライマー（３４重）、ＮＰ－４０、及びｄＨ２Ｏを含んだ。試薬中の０．１％のＮＰ４０が、シングルセルの、エマルションへの溶解を引き起こす。封入ドロップレットを含有するチューブを５０℃で１０分間、次いで８０℃で１０分間インキュベートした。シングルセルのＲＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを、図４Ａ及び４Ｂに記載するプロセスに従い処理した。具体的には、第１のエマルション内で、シングルセル由来のＲＮＡ転写産物を、リバースプライマーを使用してプライミングし、逆転写酵素を使用して生成した。リバースプライマーを表３に示す。
【0147】
【表3】
【0148】
ｃＤＮＡ及びパッケージ化ＤＮＡを含む細胞溶解物を次に、反応混合物及びバーコード化ビーズと共に（ビーズに解放可能に結合した、１００万個にわたるバーコードと共に）、第２のエマルションに封入した。反応混合物は、対象となる遺伝子を標的とするフォワードプライマーを含む。フォワードプライマーを下表４に示す。
【0149】
【表4】
【0150】
パッケージ化ＤＮＡ及びｃＤＮＡ内のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡをプライミングする。核酸増幅を行い、ＲＮＡ転写産物及びクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する増幅核酸を生成した。
【0151】
増幅核酸をエッペンドルフチューブにプールし、エマルションを破壊した。増幅核酸は、Ｐ５及びＰ７配列アダプターを添加することにより、ライブラリー調製を受けた。核酸を配列決定し、シーケンスリードを得た。一般的なバーコードに従ってシーケンスリードをクラスター化し、参照ゲノムにアラインした。
【0152】
クロマチンがアクセス可能なＤＮＡがプライミングされ増幅したことを確認するために、参照ゲノムで既知の、ＤＮＡのイントロン領域を分析し、イントロン領域に対応するシーケンスリードが増幅され配列決定されたか否かを分析した。
【0153】
図９Ａは、ＭＣＦ７細胞の遺伝子特異的プライミングにより入手したイントロン領域において、リードにより観察されたＤＮＡアンプリコンのサイズを示し、プロテイナーゼＫ及びトランスポザーゼ（Ｔｎ５）は封入の間に使用しなかった。特に、イントロンリードは、１００～５００塩基対、及び５００～１００塩基対を含む、様々な長さにて存在した。このことは、これらのイントロンリードが存在する、対応する遺伝子が、転写のためにアクセス可能であり入手可能である可能性が高いことを示している。逆に、いくつかのイントロンリードは観察されなかった。このことは、これらのイントロンリードが存在しない、対応する遺伝子が、転写のためにアクセス不可能で利用不可能であることを示している。
【0154】
図９Ｂ及び９Ｃは、参照ゲノムに対してアラインされた（それぞれ、ＶＩＭ遺伝子及びＭＫＩ６７遺伝子に対してアラインされた）シーケンスリードの、一体化されたゲノムビューワー（ＩＧＶ）スクリーンショットを示す。図９Ｂ及び９Ｃに示すように、リードは、ＶＩＭ遺伝子及びＭＫ１６７遺伝子のイントロン領域で観察され、このことは、遺伝子が、転写のためにアクセス可能であり利用可能であることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0019】
様々な実施形態では、複数の核酸は、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む。様々な実施形態では、イントロンＤＮＡ領域に対応するパッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する核酸の少なくとも５０％は、長さが１００～５００塩基対である。
[本発明1001]
細胞の細胞軌道を予測するための方法であって、
試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも1つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、
前記細胞を前記エマルション内に溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、0．50ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び2．5％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
少なくとも1つのｃＤＮＡ分子を、前記少なくとも1つのＲＮＡを使用して生成することと、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、第2のエマルションに封入することと、
複数の核酸を生成するために、核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子のうちの1つに由来する第1の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第2の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第1の核酸及び前記第2の核酸を配列決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記試薬が、0．10ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記試薬が、0．01ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記試薬がプロテアーゼを含まない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記試薬が、0．1％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記試薬が、0．01％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことが、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第2のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第2のエマルションに封入することをさらに含む、
本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、
第1のエマルションを40℃～60℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記試薬が逆転写酵素を含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記試薬がＮＰ－40を含む、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞軌道を予測することをさらに含む、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の2つの異なる状態を測定することを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記配列決定した第1の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか1つである、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記第2のエマルションに、第1のバーコード及び第2のバーコードを、前記少なくとも1つのｃＤＮＡ、少なくとも1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入すること
をさらに含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記第1の核酸が前記第1のバーコードを含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記第2の核酸が前記第2のバーコードを含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが同じバーコード配列を共有する、本発明1019～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、本発明1019～1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが、前記第2のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、本発明1019～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することが、前記第1のエマルション内で生じる、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、本発明1001～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも50％が、長さが100～500塩基対である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも1つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、
前記細胞を前記エマルションに溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、0．50ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び2．5％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することにより、少なくとも1つのｃＤＮＡ分子を生成することと、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び試薬を、第2のエマルション内に封入することと、
複数の核酸を生成するために、前記第2のエマルション内でＰＣＲ反応を行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子のうちの1つに由来する第1の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第2の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第1の核酸及び前記第2の核酸を配列決定することと
を行うように構成された装置
を含む、システム。
[本発明1030]
前記装置と通信可能に連結した演算装置であって、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用することにより、細胞軌道を予測するように構成されている、前記演算装置
をさらに含む、本発明1029のシステム。
[本発明1031]
前記試薬が、0．10ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1032]
前記試薬が、0．01ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1033]
前記試薬がプロテアーゼを含まない、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1034]
前記試薬が、0．1％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1035]
前記試薬が、0．01％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1036]
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1037]
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことが、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、本発明1029～1036のいずれかのシステム。
[本発明1038]
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第2のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第2のエマルションに封入することをさらに含む、
本発明1029～1037のいずれかのシステム。
[本発明1039]
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、
第1のエマルションを40℃～60℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、本発明1038のシステム。
[本発明1040]
前記試薬が逆転写酵素を含む、本発明1029～1039のいずれかのシステム。
[本発明1041]
前記試薬がＮＰ－40を含む、本発明1029～1040のいずれかのシステム。
[本発明1042]
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の2つの異なる状態を測定することを含む、本発明1030～1041のいずれかのシステム。
[本発明1043]
前記配列決定した第1の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、本発明1042のシステム。
[本発明1044]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、本発明1042または1043のシステム。
[本発明1045]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、本発明1042または1043のシステム。
[本発明1046]
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか1つである、本発明1030～1045のいずれかのシステム。
[本発明1047]
前記第2のエマルションに、第1のバーコード及び第2のバーコードを、前記少なくとも1つのｃＤＮＡ、少なくとも1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入するように、前記装置がさらに構成される、本発明1029～1046のいずれかのシステム。
[本発明1048]
前記第1の核酸が前記第1のバーコードを含む、本発明1047のシステム。
[本発明1049]
前記第2の核酸が前記第2のバーコードを含む、本発明1047または1048のシステム。
[本発明1050]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが同じバーコード配列を共有する、本発明1047～1049のいずれかのシステム。
[本発明1051]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、本発明1047～1049のいずれかのシステム。
[本発明1052]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが、前記第2のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、本発明1047～1051のいずれかのシステム。
[本発明1053]
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することが、前記第1のエマルション内で生じる、本発明1029～1052のいずれかのシステム。
[本発明1054]
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、本発明1029～1053のいずれかのシステム。
[本発明1055]
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、本発明1029～1054のいずれかのシステム。
[本発明1056]
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも50％が、長さが100～500塩基対である、本発明1055のシステム。
[本発明1001]
細胞の細胞軌道を予測するための方法であって、
試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも1つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、
前記細胞を前記エマルション内に溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、0．50ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び2．5％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
少なくとも1つのｃＤＮＡ分子を、前記少なくとも1つのＲＮＡを使用して生成することと、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、第2のエマルションに封入することと、
複数の核酸を生成するために、核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子のうちの1つに由来する第1の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第2の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第1の核酸及び前記第2の核酸を配列決定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記試薬が、0．10ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記試薬が、0．01ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記試薬がプロテアーゼを含まない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記試薬が、0．1％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記試薬が、0．01％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、本発明1001～1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことが、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第2のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第2のエマルションに封入することをさらに含む、
本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、
第1のエマルションを40℃～60℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記試薬が逆転写酵素を含む、本発明1001～1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記試薬がＮＰ－40を含む、本発明1001～1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞軌道を予測することをさらに含む、本発明1001～1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の2つの異なる状態を測定することを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記配列決定した第1の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか1つである、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記第2のエマルションに、第1のバーコード及び第2のバーコードを、前記少なくとも1つのｃＤＮＡ、少なくとも1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入すること
をさらに含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記第1の核酸が前記第1のバーコードを含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記第2の核酸が前記第2のバーコードを含む、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが同じバーコード配列を共有する、本発明1019～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、本発明1019～1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが、前記第2のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、本発明1019～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することが、前記第1のエマルション内で生じる、本発明1001～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、本発明1001～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、本発明1001～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも50％が、長さが100～500塩基対である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
試薬を含むエマルションに細胞を封入することであって、前記細胞が、少なくとも1つのＲＮＡ分子と、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントを含むパッケージ化ＤＮＡとを含む、前記封入することと、
前記細胞を前記エマルションに溶解することであって、それにより前記ＲＮＡ及び前記パッケージ化ＤＮＡを前記試薬に曝露し、前記試薬が、0．50ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼ、及び2．5％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、前記溶解することと、
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することにより、少なくとも1つのｃＤＮＡ分子を生成することと、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び試薬を、第2のエマルション内に封入することと、
複数の核酸を生成するために、前記第2のエマルション内でＰＣＲ反応を行うことであって、前記複数の核酸が、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子のうちの1つに由来する第1の核酸、及び
前記パッケージ化ＤＮＡの前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントに由来する第2の核酸
を含む、前記行うことと、
前記第1の核酸及び前記第2の核酸を配列決定することと
を行うように構成された装置
を含む、システム。
[本発明1030]
前記装置と通信可能に連結した演算装置であって、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用することにより、細胞軌道を予測するように構成されている、前記演算装置
をさらに含む、本発明1029のシステム。
[本発明1031]
前記試薬が、0．10ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1032]
前記試薬が、0．01ｍｇ／ｍＬ未満のプロテアーゼを含む、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1033]
前記試薬がプロテアーゼを含まない、本発明1029または1030のシステム。
[本発明1034]
前記試薬が、0．1％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1035]
前記試薬が、0．01％（ｖ／ｖ）未満のトランスポザーゼを含む、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1036]
前記試薬がトランスポザーゼを含まない、本発明1029～1033のいずれかのシステム。
[本発明1037]
前記複数の核酸を生成するために、前記核酸増幅反応を、前記反応混合物を使用して前記第2のエマルション内で行うことが、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを前記パッケージ化ＤＮＡ内でプライミングすることと、
前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記プライミングしたセグメントから、伸長生成物を生成することと
を含む、本発明1029～1036のいずれかのシステム。
[本発明1038]
前記エマルション内で、前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから伸長生成物を生成することをさらに含み、
前記少なくとも1つのｃＤＮＡ分子、前記パッケージ化ＤＮＡ、及び反応混合物を、前記第2のエマルションに封入することが、前記伸長生成物を前記第2のエマルションに封入することをさらに含む、
本発明1029～1037のいずれかのシステム。
[本発明1039]
前記パッケージ化ＤＮＡ内の前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡのセグメントから前記伸長生成物を生成することが、
第1のエマルションを40℃～60℃の温度に曝露することにより、前記クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの前記セグメントを脱安定化させること
を含む、本発明1038のシステム。
[本発明1040]
前記試薬が逆転写酵素を含む、本発明1029～1039のいずれかのシステム。
[本発明1041]
前記試薬がＮＰ－40を含む、本発明1029～1040のいずれかのシステム。
[本発明1042]
前記細胞軌道を予測することが、少なくとも、前記配列決定した第1の核酸及び前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の2つの異なる状態を測定することを含む、本発明1030～1041のいずれかのシステム。
[本発明1043]
前記配列決定した第1の核酸を使用して、前記細胞の以前の状態を測定し、前記配列決定した第2の核酸を使用して、前記細胞の将来の状態を測定する、本発明1042のシステム。
[本発明1044]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡを含むＤＮＡ領域から以前に転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態と前記将来の状態との間での共通性が示される、本発明1042または1043のシステム。
[本発明1045]
前記少なくとも1つのＲＮＡが、クロマチンがアクセス不可能なＤＮＡに対応するＤＮＡ領域から転写され、それにより、前記細胞の前記以前の状態から、前記細胞の前記将来の状態への変化が示される、本発明1042または1043のシステム。
[本発明1046]
前記細胞軌道が、細胞系統、細胞運命、前記細胞の将来の状態における細胞機能、不健康な前記細胞の将来の状態、または外部刺激に対する将来の細胞応答のうちのいずれか1つである、本発明1030～1045のいずれかのシステム。
[本発明1047]
前記第2のエマルションに、第1のバーコード及び第2のバーコードを、前記少なくとも1つのｃＤＮＡ、少なくとも1つのクロマチンがアクセス可能なＤＮＡ、及び前記反応混合物と共に封入するように、前記装置がさらに構成される、本発明1029～1046のいずれかのシステム。
[本発明1048]
前記第1の核酸が前記第1のバーコードを含む、本発明1047のシステム。
[本発明1049]
前記第2の核酸が前記第2のバーコードを含む、本発明1047または1048のシステム。
[本発明1050]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが同じバーコード配列を共有する、本発明1047～1049のいずれかのシステム。
[本発明1051]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが異なるバーコード配列を共有する、本発明1047～1049のいずれかのシステム。
[本発明1052]
前記第1のバーコード及び前記第2のバーコードが、前記第2のエマルション内でビーズに解放可能に付着している、本発明1047～1051のいずれかのシステム。
[本発明1053]
前記少なくとも1つのＲＮＡを逆転写することが、前記第1のエマルション内で生じる、本発明1029～1052のいずれかのシステム。
[本発明1054]
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、本発明1029～1053のいずれかのシステム。
[本発明1055]
前記複数の核酸が、イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡ内に、クロマチンがアクセス可能なＤＮＡの他のセグメントに由来する核酸をさらに含む、本発明1029～1054のいずれかのシステム。
[本発明1056]
前記イントロンＤＮＡ領域に対応する前記パッケージ化ＤＮＡの、他のクロマチンがアクセス可能なＤＮＡに由来する前記核酸の少なくとも50％が、長さが100～500塩基対である、本発明1055のシステム。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0138】
【表1】
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0139】
【表2】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0147】
【表3】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0149】
【表4】
【国際調査報告】