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特表2022-543323ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-11
(54)【発明の名称】ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20221003BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20221003BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N15/34
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022507801
(86)(22)【出願日】2020-10-23
(85)【翻訳文提出日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 KR2020014585
(87)【国際公開番号】W WO2021080377
(87)【国際公開日】2021-04-29
(31)【優先権主張番号】62/924,711
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522050169
【氏名又は名称】ジェネンメド カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】ドンウ・リ
(57)【要約】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システム、これを用いたガットレスアデノウイルス生産方法、これを用いて生産されたガットレスアデノウイルス及び該ガットレスアデノウイルスの用途に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヘルパープラスミド、ゲノムプラスミド及びウイルスパッケージング細胞株を含む、ガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システム。
【請求項2】
前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子以外のものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項3】
前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子に転換されないものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項4】
前記ヘルパープラスミドは、ＩＴＲを含まないものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項5】
前記ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を含まないものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項6】
前記ヘルパープラスミドは、１個～５個のプラスミドで構成されるものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項7】
前記ゲノムプラスミドは、５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、３’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、及び３’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）を含むものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項8】
前記ゲノムプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項７に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項9】
前記ゲノムプラスミドは、Ｏｒｉ複製原点をさらに含むものである、請求項７に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項10】
前記ゲノムプラスミドは、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）をさらに含むものである、請求項７に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項11】
前記スタッファーＤＮＡは、スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ）をさらに含むものである、請求項１０に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項12】
前記ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄのカプシド内にパッケージングされるＧＬＡｄゲノム部分を含んでいるものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項13】
前記ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）及び導入遺伝子発現に必要な要素を含んでいる最終ゲノムプラスミドである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項14】
前記システムは、クローニングシャトルプラスミドをさらに含むものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項15】
前記クローニングシャトルプラスミドは、５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ，ＭＣＳ）、ポリ（Ａ）信号配列、及び３’相同ストレッチ部位を含むものである、請求項１４に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項16】
前記クローニングシャトルプラスミドは、イントロンをさらに含むものである、請求項１５に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項17】
前記クローニングシャトルプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項１５に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項18】
前記クローニングシャトルプラスミドは、Ｏｒｉ複製原点をさらに含むものである、請求項１５に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項19】
前記クローニングシャトルプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素を含むものである、請求項１４に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項20】
前記ウイルスパッケージング細胞株は、アデノウイルスのＥ１領域に属するタンパク質を発現させる細胞株である、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項21】
前記システムは、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをさらに含むものである、請求項１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項22】
前記ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドは、配列番号７６の塩基配列を含んでいるものである、請求項２１に記載のガットレスアデノウイルス生産システム。
【請求項23】
下記の段階を含むガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産方法：最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階；及び
ヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階。
【請求項24】
前記最終ゲノムプラスミドは、制限酵素で線形化されたものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項25】
前記形質感染は、カルシウムホスフェート沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で行われる、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項26】
前記生産方法は、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階をさらに含む、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項27】
前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子以外のものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項28】
前記ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子に転換されないものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項29】
前記ヘルパープラスミドは、ＩＴＲを含まないものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項30】
前記ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を含まないものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項31】
前記ヘルパープラスミドは、１個～５個のプラスミドで構成されるものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項32】
前記最終ゲノムプラスミドは、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ポリ（Ａ）信号配列、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）、及び３’逆末端反復配列を含むものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項33】
前記最終ゲノムプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項34】
前記最終ゲノムプラスミドは、Ｏｒｉ複製原点をさらに含むものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項35】
前記スタッファーＤＮＡは、スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ）をさらに含むものである、請求項３２に記載の生産方法。
【請求項36】
前記最終ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄのカプシド内にパッケージングされるＧＬＡｄゲノム部分を含んでいるものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項37】
前記最終ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）及び導入遺伝子発現に必要な要素を含んでいるものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項38】
前記ウイルスパッケージング細胞株は、アデノウイルスのＥ１領域に属するタンパク質を発現させる細胞株である、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項39】
前記製造方法によって製造されたＧＬＡｄは、汚染物ウイルス種を含んでいないものである、請求項２３に記載の生産方法。
【請求項40】
前記汚染物ウイルス種は、アデノウイルス又は複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｘｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＡ）である、請求項３９に記載の生産方法。
【請求項41】
前記ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドは、配列番号７６の塩基配列を含んでいるものである、請求項２６に記載の生産方法。
【請求項42】
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ポリ（Ａ）信号配列、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）、及び３’逆末端反復配列を含む、ガットレスアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システム、これを用いるガットレスアデノウイルス生産方法、これを用いて生産されたガットレスアデノウイルス、及び該ガットレスアデノウイルスの用途に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療法（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）は、様々な先天性遺伝疾患に対して効果的な治療選択肢として浮上している。ヘルパー依存性アデノウイルス（ｈｅｌｐｅｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；以下、ＨＤＡｄ）とも知られているガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；以下、ＧＬＡｄ）は、広範な細胞及び組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）、高い感染力（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）に対する高い受容能力（ｃａｒｇｏ ｃａｐａｃｉｔｙ）及び宿主遺伝体に挿入されない特性など、先天性遺伝疾患において遺伝子治療法の具現のための遺伝子伝達ベクターとして注目すべき多くの特性を有する。また、ＧＬＡｄは、アデノウイルスから全ての遺伝子を除去した後に製造されるため、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が最小化し、宿主において導入遺伝子の長期発現を可能にする。
【0003】
しかしながら、ＧＬＡｄを生産する際にヘルパーとして必ず使用しなければならない高免疫原性アデノウイルスが汚染物として残る問題から、ＧＬＡｄは長い間、先天性遺伝疾患治療において臨床的に使用されずにいるのが実情である。
【0004】
欠陥遺伝子をそれに相応する正常遺伝子に代替することにより、この欠陥遺伝子の機能を正常に回復させる方式の遺伝子治療法は、レーバー先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ’ｓ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ，ＬＣＡ）及び脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）をはじめとする様々な先天性遺伝疾患に対して効果的な治療選択肢として浮上している。この種の遺伝子治療法は、正常機能を発揮する遺伝子を標的組織又は器官に伝達するために、ベクターと呼ばれる遺伝子伝達体を必要とする。
【0005】
先天性遺伝疾患治療のための遺伝子治療法は、生体外遺伝子伝達（ｅｘ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）及び生体内遺伝子伝達（ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）のような２種類の遺伝子伝達を考慮できる。生体外遺伝子伝達は、遺伝的に操作された細胞を用いる細胞治療剤ベースの接近法である。この接近法において、ベクターの安全性は、遺伝子操作細胞を患者の身体に移植する前の別の段階でモニタリングし続けることができる。これと対照的に、生体内遺伝子伝達は、治療用導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を、最終伝達位置である患者の組織又は器官に直接伝達する方式である。したがって、この接近法ではベクターの安全性が何よりも重要である。しかも、この接近法では、ベクターの安全性に加え、伝達された導入遺伝子の治療効能が長持ち可能なように、導入遺伝子の長期発現も保障される必要がある。
【0006】
現在、先天性遺伝疾患の臨床治療において最も広く用いられている生体内遺伝子伝達ベクターは、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）である。ＡＡＶの安全性は、広範な臨床試験によって非常によく確立されている。ＡＡＶは、感染に対する広範囲の細胞及び組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示し、様々な組織及び器官において導入遺伝子の長期発現を保障する。これらの特性から、ＡＡＶは、様々な先天性遺伝疾患治療において生体内遺伝子伝達ベクターとして非常に注目されてきている。それにも拘わらず、ＡＡＶは２つの注目すべき欠点があり、その第一は、挿入性突然変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）誘発可能性、その第二は、導入遺伝子に対する低い受容能力（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）、である。ＡＡＶは、宿主細胞において主にエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）で存在するが、頻度は低いといっても宿主細胞の遺伝体に無作為に挿入されることがある。このような特性は、挿入性突然変異誘発に対する恐れを招く。ＡＡＶは、また、導入遺伝子受容能力（～４．５ｋｂ）が低いため、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ，９．４ｋｂ）やジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ，１１ｋｂ）のような大きい遺伝子を伝達できず、１個のウイルス形態で複数個の遺伝子を一度に伝達することもできない。ＡＡＶが示しているこれらの特性は、理想的な生体内遺伝子伝達用ベクターとは、安全性が高く、大きい導入遺伝子受容能力を有する上に、宿主遺伝体に無作為に挿入されてはならないという点を指摘するとともに、こういうわけで、万一そのような全ての理想的な特性を有するベクターが存在することになれば、そのベクターは生体内遺伝子伝達においてずっと良い機会を提供するであろうと提案している。
【0007】
ＧＬＡｄは、最後の世代（ｌａｓｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のアデノウイルスとされてきている。ＧＬＡｄは、アデノウイルスから全ての遺伝子を除去して製造されるため、アデノウイルスタンパク質が全く発現しない。このような構造的特性は、宿主における免疫反応を最小化し、宿主組織又は器官において導入遺伝子の長期発現を可能にする。また、ＧＬＡｄは、感染において広範囲な細胞及び組織親和性と導入遺伝子伝達において高い形質導入効率を示す。実際に、ＧＬＡｄは、様々な安全性面においてＡＡＶと非常に似ている。しかしながら、宿主遺伝体への挿入及び導入遺伝子受容能力と関連しては、ＧＬＡｄはむしろＡＡＶよりも遥かに良好である長所を示す。すなわち、ＧＬＡｄは、宿主遺伝体に挿入されないため、挿入性突然変異誘発に対する恐れが全くない。また、ＧＬＡｄは、導入遺伝子受容能力（最大で３６ｋｂ）が高いため、大きい遺伝子の他に、１個のウイルス形態で複数個の遺伝子を一度に伝達することも可能である。
【0008】
しかしながら、これらの明白な長所にもかかわらず、生産して使用されている現在のＧＬＡｄは、生産に関連した面でいずれかの問題点を抱いている。すなわち、ＧＬＡｄは、アデノウイルス遺伝子が全て欠損しているため、組換えＧＬＡｄを製造するためには、ＧＬＡｄパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に必要なアデノウイルスタンパク質を提供するヘルパーアデノウイルスを必ず使用しなければならない。既存ＧＬＡｄの標準生産工程（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）において、ヘルパーアデノウイルスはヘルパー機能を提供する上に、同時に、活発に複製するため、最終ＧＬＡｄ生産品には汚染物として残ってしまう。Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ作動原理に基づいてΨパッケージング信号配列（Ψ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を除去することにより、汚染物であるヘルパーアデノウイルスを相当減少させることはできるが、完全に除去することは事実上極めて困難である。しかも、ヘルパーアデノウイルスは、ヘルパーアデノウイルスとパッケージング細胞に存在するＥ１領域間の相同組換えによって複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＡ）を生成することもできる。全く所望しない汚染物であるこのようなヘルパーアデノウイルス及びＲＣＡは、宿主に致命的な急性又は慢性の毒性を誘発することがある。しかも、これらの汚染物ウイルスから発現したウイルスタンパク質に対する宿主免疫反応は、組換えＧＬＡｄと汚染物ウイルスで共同感染された細胞を死滅させることがあり、これは、ＧＬＡｄによって伝達された治療用導入遺伝子が十分に発現しない結果につながり得る。解決不可なこれらの問題点は、ＧＬＡｄに対する安全性の恐れを触発させており、ＧＬＡｄが持つ固有の特性及び相当な長所にもかかわらず、結局、臨床的使用には及ばない結果となってしまった。このため、ＧＬＡｄにおいて、ヘルパーアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物が発生することを防止する組換えＧＬＡｄ生産システムを構築することは、実に極めて重要な課題であるといえる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、ヘルパーアデノウイルスを使用しなくともガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）を生産できるヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システム、これを用いたガットレスアデノウイルス生産方法、これを用いて生産されたガットレスアデノウイルス、及び該ガットレスアデノウイルスの用途に関する。
【0010】
具体的に、本発明において、ＧＬＡｄパッケージング及び追加の増幅のためのヘルパー機能は、ウイルスパッケージングに必要なシス作用要素（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）が全て除去されたヘルパープラスミドによって提供される。全てのシス作用要素が除去された構造的特性のため、前記ヘルパープラスミドはアデノウイルスに転換されることが不可能である。
【0011】
本発明者は、前記ヘルパープラスミドを用いてアデノウイルス及びＲＣＡ汚染が全くない組換えＧＬＡｄの大量生産に成功した。このように生産された組換えＧＬＡｄは、様々な標的導入遺伝子を効率的に伝達したし、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）のような先天性遺伝病に対する治療可能性を示した。そこで、本発明のＧＬＡｄ生産システムは、種々の先天性遺伝疾患治療においてＧＬＡｄベース遺伝子治療法がついに臨床に使用される道を開くものと期待される。
【0012】
したがって、本発明の目的はヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システムを提供することである。
【0013】
本発明の他の目的は、ガットレスアデノウイルス生産方法を提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、ガットレスアデノウイルスを提供することである。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、ガットレスアデノウイルスの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システム、これを用いたガットレスアデノウイルス生産方法、これを用いて生産されたガットレスアデノウイルス、及び該ガットレスアデノウイルスの用途に関する。
【0017】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0018】
本発明の一態様は、ガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システムに関する。
【0019】
線形二本鎖ＤＮＡで構成されているアデノウイルスゲノム、特にアデノウイルス第５型のゲノムはよく特徴付けられている。例えば、Ｅ１、ＩＸ、Ｅ２、ＩＶａ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子の位置と関連して、アデノウイルスゲノムの全体構造において一般的な保存がある。アデノウイルスゲノムのそれぞれの末端部には、逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）として公知された配列を含み、これは、ウイルス複製のために必要である。５’末端に位置する５’ＩＴＲに続いては、アデノウイルスゲノムのパッケージング及びカプシド化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）のために必要なシス作用要素であるΨパッケージング信号配列（Ψ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）が位置する。
【0020】
アデノウイルスゲノムの構造は、ウイルス遺伝子が宿主細胞形質導入後に発現する順序に基づいて記載される。より具体的に、ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製の開始前に起きるか又は開始後に起きるかによって初期（Ｅ）又は後期（Ｌ）遺伝子と称される。感染の初期段階において、アデノウイルスは、宿主細胞内にＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４遺伝子を発現させて、ウイルス複製のための宿主細胞の形質転換を誘導する。Ｅ１遺伝子はマスタースイッチであって、転写活性化剤として働き、初期及び後期遺伝子転写のいずれにも核心的に関与する。Ｅ２はＤＮＡ複製に関与し、Ｅ３は免疫調節に関与し、Ｅ４はウイルスｍＲＮＡ代謝を調節する。
【0021】
アデノウイルスの基本的なゲノム構造は、次の通りである：
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）－Ψパッケージング信号配列－Ｅ１－他の遺伝子－３’逆末端反復配列。
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）－Ψパッケージング信号配列－Ｅ１－他の遺伝子－３’逆末端反復配列。
【0022】
ここで、一部の要素、例えば、５’ＩＴＲ及び／又はΨパッケージング信号配列は、別の箇所に位置しているが、後で結合してもよい。このように結合させると、上の基本的なゲノム構造を再び作ることができる。一部の要素、例えば、Ｅ１の場合は、他の箇所に移され、アデノウイルスゲノムに戻ってこなくてもよい。すなわち、Ｅ１部分を他の細胞株に移し、この細胞株がＥ１タンパク質を発現させるようにすることにより、アデノウイルス生産細胞株としての活用が可能である。一部の要素、例えば、Ｅ３の場合は、アデノウイルス作製及び／又は生産には何ら影響も及ぼさず、完全に除去されることもある。
【0023】
本発明において、ガットレスアデノウイルス生産システムは、ヘルパープラスミド、ゲノムプラスミド及びウイルスパッケージング細胞株を含むものでよい。
【0024】
本発明において、ヘルパープラスミドは、Ｅ１及びＥ３部分の遺伝子以外のアデノウイルスの遺伝子を含むものでよいが、これに限定されない。すなわち、Ｅ１部分の遺伝子は、ウイルスパッケージング細胞株に含まれていればよく、Ｅ３部分の遺伝子は存在しなくてもウイルス製造には何ら問題もないので含まれていなくてもよい。ヘルパープラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素を含む最終ゲノムプラスミドがウイルス化、すなわちＧＬＡｄ化可能なようにアデノウイルスタンパク質を提供する。
【0025】
本発明において、ヘルパープラスミドは、ウイルスパッケージング細胞株が発現させているアデノウイルス遺伝子以外の、ＧＬＡｄ生産に必要な最小限のアデノウイルス遺伝子を含むものでよいが、これに限定されない。
【0026】
したがって、本発明の一具体例において、ヘルパープラスミドは、次のような構造的特性を有するものであってよい：
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、Ｅ１及び３’逆末端反復配列を含まなく；
Ｅ１直後部分からＥ３直前部分、及びＥ３直後部分から３’逆末端反復配列直前部分までは含み；及び
選択的に、Ｅ３を含んでも、含まなくてもよい。
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、Ｅ１及び３’逆末端反復配列を含まなく；
Ｅ１直後部分からＥ３直前部分、及びＥ３直後部分から３’逆末端反復配列直前部分までは含み；及び
選択的に、Ｅ３を含んでも、含まなくてもよい。
【0027】
上記のように、ヘルパープラスミドは、５’逆末端反復配列、Ψパッケージング信号配列、Ｅ１及び３’逆末端反復配列を含んでいない構造的特性により、ヘルパープラスミドはヘルパー機能だけを行うことができ、アデノウイルスへの転換は不可能である。すなわち、ヘルパープラスミドは、ウイルス生成に必須なシス作用要素を含んでいないので、アデノウイルスの遺伝子を含んでいるにもかかわらず感染性を有するアデノウイルス粒子への転換は不可能である。
【0028】
本発明において、ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子以外のものであってよい。
【0029】
本発明において、ヘルパープラスミドは、感染性を有するウイルス粒子に転換されないものであってよい。
【0030】
本発明において、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲを含まないものであってよいが、これに限定されるものではない。
【0031】
本発明において、ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を含まないものであってよいが、これに限定されるものではない。
【0032】
本発明において、ヘルパープラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものでよく、例えば、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子を含むものでよいが、これに限定されない。
【0033】
本発明において、ヘルパープラスミドは、Ｏｒｉ複製原点（Ｏｒｉ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）をさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0034】
本発明において、ヘルパープラスミドは、少なくとも１個のプラスミド、例えば、１個～５個のプラスミドで構成されるものでよいが、これに限定されない。
【0035】
本発明において、ヘルパープラスミドは、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲであってよいが、これに限定されない。
【0036】
本発明において、ゲノムプラスミドは、５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、３’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）及び３’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）を含むものでよい。
【0037】
本発明において、ゲノムプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものでよく、例えば、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子を含むものでよいが、これに限定されない。
【0038】
本発明において、ゲノムプラスミドは、Ｏｒｉ複製原点をさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0039】
本発明において、ゲノムプラスミドは、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）をさらに含むものでよい。
【0040】
本発明において、スタッファーＤＮＡは、スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ）をさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0041】
本発明において、ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄのカプシド内にパッケージングされるＧＬＡｄゲノム部分を含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0042】
本発明において、ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）及び導入遺伝子発現に必要な要素を含んでいる最終ゲノムプラスミドであってよいが、これに限定されるものではない。
【0043】
本発明において、最終ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素がクローニングシャトルプラスミドから移転されたものでよいが、これに限定されない。
【0044】
したがって、本発明において、ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄ生産に必要な全てのシス作用要素を有しながらも導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素をさらに含む最終ゲノムプラスミドである、又は導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素を含んでいないゲノムプラスミドであってよい。
【0045】
本発明において、最終ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄゲノム部分に含まれない領域が制限酵素で線形化されたものでよいが、これに限定されない。
【0046】
本発明において、最終ゲノムプラスミドは、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号（Ψ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ポリ（Ａ）信号（ｐｏｌｙ（Ａ） ｓｉｇｎａｌ）配列、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）及び３’逆末端反復配列を含むものでよい。
【0047】
本発明において、最終ゲノムプラスミドは、ＧＬＡｄのカプシド内にパッケージングされるＧＬＡｄゲノム部分を含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0048】
本発明において、導入遺伝子は、少なくとも１個でよいが、これに限定されるものではない。
【0049】
本発明において、導入遺伝子は、特定遺伝子産物の発現を抑制する機能を有するものでもよいが、これに限定されるものではない。
【0050】
本発明において、導入遺伝子は、因子ＩＸ［ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、血友病Ｂ（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ）治療のためのＲ３３８Ｌ Ｐａｄｕａ突然変異体遺伝子］、グルコセレブロシダーゼ［ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ，ＧＣＲ、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）治療のための遺伝子］、ヘクソサミニダーゼＡ［ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａ，ＨＥＸＡ、テイザックス病（Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ）の治療のための遺伝子］、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１［ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，ＨＰＲＴ１、レッシュナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、イズロネート－２－スルファターゼ［ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ，ＩＤＳ、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、メチル－ＣｐＧ－結合タンパク質２［ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＭＥＣＰ２、レット症候群（Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、運動ニューロン１生存因子［ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １，ＳＭＮ１、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）治療のための遺伝子］、及びジストロフィン遺伝子［ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）の治療のための遺伝子］からなる群から選ばれる１種以上でよいが、これに限定されるものではない。
【0051】
本発明において、ゲノムプラスミドは、ｐＧＬＡｄ又はｐＧＬＡｄ３でよいが、これに限定されるものではない。
【0052】
本発明において、システムは、クローニングシャトルプラスミドをさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0053】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ，ＭＣＳ）、ポリ（Ａ）信号配列、及び３’相同ストレッチ部位を含むものでよいが、これに限定されない。
【0054】
本発明において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はニワトリベータ－アクチン（ｃｈｉｃｋｅｎ β－ａｃｔｉｎ）プロモーターでよいが、これに限定されるものではない。
【0055】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、イントロンを含んでいるものでよいが、これに限定されるものではない。
【0056】
本発明において、イントロンは、ウサギベータ－グロビン（ｒａｂｂｉｔ β－ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子に由来したものでよいが、これに限定されない。
【0057】
本発明において、ポリ（Ａ）信号配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）信号配列でよいが、これに限定されるものではない。
【0058】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、抗生剤耐性遺伝子をさらに含むものでよく、例えば、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子を含むものでよいが、これに限定されない。
【0059】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、Ｏｒｉ複製原点をさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0060】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、ＧＬＡｄを用いて発現させようとする導入遺伝子及び導入遺伝子発現に必要な要素を含むものでよいが、これに限定されない。
【0061】
本発明において、導入遺伝子は、少なくとも１個であってよいが、これに限定されるものではない。
【0062】
本発明において、導入遺伝子は、特定遺伝子産物の発現を抑制する機能を有するものでよいが、これに限定されない。
【0063】
本発明において、導入遺伝子は、多重クローニング（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）部位にクローニングされたものでよいが、これに限定されない。
【0064】
本発明において、導入遺伝子は、因子ＩＸ［ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、血友病Ｂ（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ）の治療のためのＲ３３８Ｌ Ｐａｄｕａ突然変異体遺伝子］、グルコセレブロシダーゼ［ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ，ＧＣＲ、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療のための遺伝子］、ヘクソサミニダーゼＡ［ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａ，ＨＥＸＡ、テイザックス病（Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ）の治療のための遺伝子］、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１［ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，ＨＰＲＴ１、レッシュナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、イズロネート－２－スルファターゼ［ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ，ＩＤＳ、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、メチル－ＣｐＧ－結合タンパク質２［ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＭＥＣＰ２、レット症候群（Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、運動ニューロン１生存因子［ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １，ＳＭＮ１、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）の治療のための遺伝子］、及びジストロフィン遺伝子［ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）の治療のための遺伝子］からなる群から選ばれる１種以上でよいが、これに限定されるものではない。
【0065】
本発明において、クローニングシャトルプラスミドは、ｐＢｅｓｔ又はｐＢｅｓｔ４でよいが、これに限定されるものではない。
【0066】
本発明において、ウイルスパッケージング細胞株は、アデノウイルスのＥ１領域に属するタンパク質を発現させる細胞株でよく、例えば、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３Ｔでよいが、これに限定されるものではない。
【0067】
本発明において、システムは、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをさらに含むものでよいが、これに限定されない。ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをさらに含む場合、ＧＬＡｄの生産が顕著に増加する効果がある。
【0068】
本発明において、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドは、配列番号７６の塩基配列を含んでいるものでよい。
【0069】
本発明の他の一態様は、下記の段階を含むガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産方法に関する。
最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させる段階；及び
ヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階。
最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）させる段階；及び
ヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階。
【0070】
本発明において、前記方法の最終ゲノムプラスミドは上述した通りであり、その記載を省略する。
【0071】
本発明において、最終ゲノムプラスミドは、制限酵素で線形化されたものでよいが、これに限定されない。
【0072】
本発明において、前記方法のヘルパープラスミドは上述した通りであり、その記載を省略する。
【0073】
本発明において、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、カルシウムホスフェート沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）で行われてよいが、これに限定されない。
【0074】
本発明において、前記生産方法は、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階をさらに含んでよい。前記段階をさらに含む場合、ＧＬＡｄの生産が顕著に増加する効果がある。
【0075】
本発明において、ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドは、配列番号７６の塩基配列を含むものでよい。
【0076】
本発明において、最終ゲノムプラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階及びヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる段階は、順序に関係なく行われてよく、例えば、同時に行われてもよいが、これに限定されない。
【0077】
本発明において、前記製造方法によって製造されたＧＬＡｄは、汚染物ウイルス種を含んでいないものでよい。
【0078】
本発明において、汚染物ウイルス種は、アデノウイルス又は複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｘｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＲＣＡ）でよいが、これに限定されるものではない。
【0079】
本発明の一具体例において、本発明の生産方法は、次のように行われてよい：
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）はゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド及びヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってＧＬＡｄが生産される。
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）はゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド及びヘルパープラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってＧＬＡｄが生産される。
【0080】
本発明の他の具体例において、本発明の生産方法は、次のように行われてよい：
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、ゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド、ヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってＧＬＡｄが生産される。
導入遺伝子を含むクローニングシャトルプラスミドに含まれた導入遺伝子発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）は、ゲノムプラスミドに移動して最終ゲノムプラスミドとなる。最終ゲノムプラスミドを制限酵素で線形化する。その後、線形化された最終ゲノムプラスミド、ヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドをウイルスパッケージング細胞株に形質感染させる。前記形質感染段階によってＧＬＡｄが生産される。
【0081】
本発明のさらに他の具体例において、本発明の生産方法は、次のように行われてよい：
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むＧＬＡｄを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、ＧＬＡｄが生産される。このとき、生産されるＧＬＡｄは、増幅する様相を示してよい。
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むＧＬＡｄを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、ＧＬＡｄが生産される。このとき、生産されるＧＬＡｄは、増幅する様相を示してよい。
【0082】
本発明のさらに他の具体例において、本発明の生産方法は、次のように行われてよい：
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むＧＬＡｄを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、ＧＬＡｄが生産される。このとき、生産されるＧＬＡｄは、増幅する様相を示してよい。
ウイルスパッケージング細胞株にヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドを形質感染させる。適当な時間が経過した後、導入遺伝子発現カセットを含むＧＬＡｄを、前記形質感染された細胞株にさらに感染させる。適当な時間が経過すると、ＧＬＡｄが生産される。このとき、生産されるＧＬＡｄは、増幅する様相を示してよい。
【0083】
本発明の他の例は、下記の段階を含むクローニングシャトルプラスミドを製造する方法に関する。
ｐＧＴ２プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域に該当する第１ＤＮＡ断片を製造する段階；
第１ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψ５パッケージング信号配列、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ，ＭＣＳ）、ＳＶ４０ポリ（Ａ）信号配列、及び３’相同ストレッチ部位を含む第２ＤＮＡ断片を製造する段階；
第２ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断された第１ＤＮＡ断片と制限酵素で切断された第２ＤＮＡ断片とを結合してｐＢｅｓｔを製造する段階。
ｐＧＴ２プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域に該当する第１ＤＮＡ断片を製造する段階；
第１ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψ５パッケージング信号配列、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ，ＭＣＳ）、ＳＶ４０ポリ（Ａ）信号配列、及び３’相同ストレッチ部位を含む第２ＤＮＡ断片を製造する段階；
第２ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断された第１ＤＮＡ断片と制限酵素で切断された第２ＤＮＡ断片とを結合してｐＢｅｓｔを製造する段階。
【0084】
本発明において、ｐＧＴ２プラスミドは、配列番号６３の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６３の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0085】
本発明において、第１ＤＮＡ断片を製造する段階のプライマーセットは、配列番号１及び２の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0086】
本発明において、第１ＤＮＡ断片を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0087】
本発明において、第１ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＳｆｉＩ制限酵素サイト及びＸｃｍＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0088】
本発明において、第１ＤＮＡ断片のＳｆｉＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0089】
本発明において、第１ＤＮＡ断片のＸｃｍＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0090】
本発明において、第１ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＸｃｍＩ及びＳｆｉＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0091】
本発明において、第２ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＳｆｉＩ制限酵素サイト及びＸｃｍＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0092】
本発明において、第２ＤＮＡ断片のＳｆｉＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0093】
本発明において、第２ＤＮＡ断片のＸｃｍＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0094】
本発明において、第２ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＸｃｍＩ及びＳｆｉＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0095】
本発明において、ｐＢｅｓｔを製造する段階は、制限酵素で切断された第１ＤＮＡ断片と制限酵素で切断された第２ＤＮＡ断片とを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0096】
本発明において、ｐＢｅｓｔは、配列番号６４の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６４の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0097】
本発明のさらに他の例は、下記の段階を含むヘルパープラスミドの製造方法に関する。
【0098】
１．Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２の製造
ｐＧＴ２プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階；
Ψ５ゲノムのＢｓｔＺ１７Ｉ～ＢａｍＨＩ領域に該当する第３ＤＮＡ断片を製造する段階；
制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第３ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階；
Ψ５を鋳型とし、プライマーセットを用いて第４ＤＮＡ断片を製造する段階；
第４ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第４ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階。
ｐＧＴ２プラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階；
Ψ５ゲノムのＢｓｔＺ１７Ｉ～ＢａｍＨＩ領域に該当する第３ＤＮＡ断片を製造する段階；
制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第３ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階；
Ψ５を鋳型とし、プライマーセットを用いて第４ＤＮＡ断片を製造する段階；
第４ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第４ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階。
【0099】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号３及び４の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0100】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0101】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＢａｍＨＩ制限酵素サイト及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0102】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分のＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0103】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分のＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0104】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階は、ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0105】
本発明において、Ψ５ゲノムのＢｓｔＺ１７Ｉ～ＢａｍＨＩ領域に該当する第３ＤＮＡ断片は、配列番号６５の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６５の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0106】
本発明において、第３ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＢａｍＨＩ制限酵素サイト及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0107】
本発明において、第３ＤＮＡ断片のＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0108】
本発明において、第３ＤＮＡ断片のＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0109】
本発明において、第３ＤＮＡ断片を製造する段階は、ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0110】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階は、制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第３ＤＮＡ断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0111】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階は、ＣｌａＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0112】
本発明において、第４ＤＮＡ断片は、‘＊’（ａｓｔｅｒｉｓｋ）表示からＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトに至るＤＮＡ断片（図７のｂ）であってよい。
【0113】
本発明において、第４ＤＮＡ断片を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号５及び６の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0114】
本発明において、第４ＤＮＡ断片を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0115】
本発明において、第４ＤＮＡ断片は、配列番号６６の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６６の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0116】
本発明において、第４ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0117】
本発明において、第４ＤＮＡ断片のＣｌａＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0118】
本発明において、第４ＤＮＡ断片のＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0119】
本発明において、第４ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＣｌａＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0120】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階は、制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第４ＤＮＡ断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0121】
本発明において、用語“Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２”は、Ａｄ５（アデノウイルス５型、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００８）の５’ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を含む部分が除去されたもので、詳細には、塩基配列の１～３１３３番目の塩基が除去されたものである。
【0122】
２．Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２の製造
ｐＧＴ２プラスミド、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１又はΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階；
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階；
Ψ５ゲノムのＢａｍＨＩ～３’ＩＴＲ領域に該当する第５ＤＮＡ断片を製造する段階；
制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第５ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階；
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階；
Ψ５を鋳型とし、プライマーセットを用いて第６ＤＮＡ断片を製造する段階；
第６ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断された第Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第６ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階。
ｐＧＴ２プラスミド、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１又はΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を鋳型とし、プライマーセットを用いてΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階；
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階；
Ψ５ゲノムのＢａｍＨＩ～３’ＩＴＲ領域に該当する第５ＤＮＡ断片を製造する段階；
制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第５ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階；
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階；
Ψ５を鋳型とし、プライマーセットを用いて第６ＤＮＡ断片を製造する段階；
第６ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断された第Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第６ＤＮＡ断片を結合して、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階。
【0123】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号７及び８の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0124】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0125】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＰａｃＩ制限酵素サイト及びＢａｍＨＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0126】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分のＰａｃＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0127】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分のＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0128】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分を制限酵素で切断する段階は、ＢａｍＨＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0129】
本発明において、Ψ５ゲノムのＢａｍＨＩ～３’ＩＴＲ領域に該当する第５ＤＮＡ断片は、配列番号６７の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６７の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0130】
本発明において、Ψ５ゲノムのＢａｍＨＩ～３’ＩＴＲ領域に該当する第５ＤＮＡ断片を製造する段階は、Ψ５ＤＮＡをＢａｍＨＩ制限酵素で切断して行ってよいが、これに限定されない。
【0131】
本発明において、第５ＤＮＡ断片のＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0132】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を製造する段階は、制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１のＫａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域部分に、制限酵素で切断された第５ＤＮＡ断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0133】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１を制限酵素で切断する段階は、ＳｐｅＩ及びＮｄｅＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0134】
本発明において、Ψ５を鋳型とし、プライマーセットを用いて第６ＤＮＡ断片を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号９～１２の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0135】
本発明において、第６ＤＮＡ断片を製造する段階は、重複ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0136】
本発明において、第６ＤＮＡ断片は、配列番号６８の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６８の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0137】
本発明において、第６ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＳｐｅＩ制限酵素サイト及びＮｄｅＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0138】
本発明において、第６ＤＮＡ断片のＳｐｅＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0139】
本発明において、第６ＤＮＡ断片のＮｄｅＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0140】
本発明において、第６ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＳｐｅＩ及びＮｄｅＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0141】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を製造する段階は、制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１に、制限酵素で切断された第６ＤＮＡ断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0142】
本発明において、用語“Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２”は、Ａｄ５（アデノウイルス５型、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００８）塩基配列の２７８６４～３１０００番目の塩基が除去され、部分的に残っていたＥ３領域（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ Ｅ３ｒｅｇｉｏｎ）が完全に欠失したものである。
【0143】
３．ｐＡｄＢｅｓｔ製造
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；及び
制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２に、制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２から分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔを製造する段階。
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断する段階；
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；及び
制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２に、制限酵素で切断されたΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２から分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔを製造する段階。
【0144】
本発明において、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断する段階は、ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0145】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階は、ＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0146】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２をＣｌａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で切断して分離した大きい断片のＤＮＡは、配列番号６９の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号６９の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0147】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して分離した前記大きい断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＢａｍＨＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0148】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して分離した前記大きい断片のＣｌａＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されるものではない。
【0149】
本発明において、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して分離した前記大きい断片のＢａｍＨＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されるものない。
【0150】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを製造する段階は、制限酵素で切断されたΨ５－Ｒｉｇｈｔ＿Ａｒｍ－２にΨ５－Ｌｅｆｔ＿Ａｒｍ－２を制限酵素で切断して分離した前記大きい断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0151】
４．ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ製造
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して小さい断片を分離する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した小さい断片を、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含むアダプターに結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを鋳型とし、プライマーセットを用いて第７ＤＮＡ断片を製造する段階；
第７ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片に、制限酵素で切断された第７ＤＮＡ断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；及び
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲに、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲを製造する段階。
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して小さい断片を分離する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した小さい断片を、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含むアダプターに結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを鋳型とし、プライマーセットを用いて第７ＤＮＡ断片を製造する段階；
第７ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片に、制限酵素で切断された第７ＤＮＡ断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；及び
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲに、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲを製造する段階。
【0152】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して小さい断片を分離する段階は、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0153】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した前記小さい断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0154】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した前記小さい断片のＣｌａＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0155】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した小さい断片のＥｃｏＲＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0156】
本発明において、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含むアダプターは、配列番号１３及び１４の塩基配列からなるアダプターでよいが、これに限定されるものではない。
【0157】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを製造する段階は、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した小さい断片に前記アダプターを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0158】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階は、ＡｖｒＩＩ及びＲｓｒＩＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0159】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＡｖｒＩＩ制限酵素サイト及びＲｓｒＩＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0160】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＡｖｒＩＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0161】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＲｓｒＩＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されるものではない。
【0162】
本発明において、第７ＤＮＡ断片を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号１５～１８の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0163】
本発明において、第７ＤＮＡ断片を製造する段階は、重複ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）で行ってよいが、これに限定されない。
【0164】
本発明において、第７ＤＮＡ断片は、配列番号７０の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号７０の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0165】
本発明において、第７ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＡｖｒＩＩ制限酵素サイト及びＲｓｒＩＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0166】
本発明において、第７ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＡｖｒＩＩ及びＲｓｒＩＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0167】
本発明において、第７ＤＮＡ断片のＡｖｒＩＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0168】
本発明において、第７ＤＮＡ断片のＲｓｒＩＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0169】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを製造する段階は、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片に、制限酵素で切断された第７ＤＮＡ断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0170】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを制限酵素で切断する段階は、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0171】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階は、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0172】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0173】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＣｌａＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0174】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＥｃｏＲＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0175】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＩＴＲを製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲにｐＡｄＢｅｓｔを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0176】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲは、配列番号７１の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号７１の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0177】
本発明のさらに他の例は、下記の段階を含むゲノムプラスミド製造方法に関する。
ｐＡｄＢｅｓｔプラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いて第８ＤＮＡ断片を製造する段階；
第８ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断された第８ＤＮＡ断片にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１に存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれを制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれにアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２と制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡを混合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈを製造する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａに、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａと制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を混合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬを制限酵素で切断する段階；
スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔ）を製造する段階；
スキャフォールド／マトリックス付着要素を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬに、制限酵素で切断されたスキャフォールド／マトリックス付着要素を結合して、ｐＧＬＡｄを製造する段階。
ｐＡｄＢｅｓｔプラスミドを鋳型とし、プライマーセットを用いて第８ＤＮＡ断片を製造する段階；
第８ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断された第８ＤＮＡ断片にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１に存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれを制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれにアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２と制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡを混合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈを製造する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３にアダプターを結合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａに、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａを制限酵素で切断する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を制限酵素で切断する段階；
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａと制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を混合してｐＡｄＢｅｓｔＧＬを製造する段階；
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬを制限酵素で切断する段階；
スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔ）を製造する段階；
スキャフォールド／マトリックス付着要素を制限酵素で切断する段階；及び
制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬに、制限酵素で切断されたスキャフォールド／マトリックス付着要素を結合して、ｐＧＬＡｄを製造する段階。
【0178】
本発明において、第８ＤＮＡ断片を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号１９及び２０の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0179】
本発明において、第８ＤＮＡ断片を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0180】
本発明において、第８ＤＮＡ断片は、配列番号７２の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号７２の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0181】
本発明において、第８ＤＮＡ断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＳａｃＩ制限酵素サイト及びＡｓｃＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0182】
本発明において、第８ＤＮＡ断片を制限酵素で切断する段階は、ＳａｃＩ及びＡｓｃＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0183】
本発明において、第８ＤＮＡ断片のＳａｃＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0184】
本発明において、第８ＤＮＡ断片のＡｓｃＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0185】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１を製造する段階におけるアダプターは、配列番号２１及び２２の塩基配列からなるアダプターでよいが、これに限定されるものではない。
【0186】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１を製造する段階は、制限酵素で切断された第８ＤＮＡ断片に前記アダプターを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0187】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１に存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａを製造する段階で除去する制限酵素サイトは、ＣｌａＩ制限酵素サイトでよいが、これに限定されるものではない。
【0188】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａを製造する段階は、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１をＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後、自己結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0189】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれを制限酵素で切断する段階は、ＳａｃＩ及びＡｖｒＩＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0190】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を製造する段階におけるアダプターは、配列番号２３及び２４の塩基配列からなるアダプター（図８のｂ）でよいが、これに限定されない。
【0191】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれに前記アダプターを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0192】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を制限酵素で切断する段階は、ＨｐａＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0193】
本発明において、制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡでよいが、これに限定されるものではない。
【0194】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２と制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡを混合し、試験管内相同アニーリング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｎｅａｌｉｎｇ，ｉＨｏＡ）を用いて行ってよいが、これに限定されない。
【0195】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を制限酵素で切断する段階は、ＳａｃＩ及びＡｐａＩ制限酵素、又はＡｐａＩ及びＡｖｒＩＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0196】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈを製造する段階で制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３は、ＳａｃＩ及びＡｐａＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３でよいが、これに限定されるものではない。
【0197】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈを製造する段階におけるアダプターは、配列番号２５及び２６の塩基配列からなるアダプター（図８のｄ）でよいが、これに限定されるものではない。
【0198】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈを製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３に前記アダプターを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0199】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈを製造する段階で制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３は、ＡｐａＩ及びＡｖｒＩＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３でよいが、これに限定されるものではない。
【0200】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈを製造する段階におけるアダプターは、配列番号２７及び２８の塩基配列からなるアダプター（図８のｅ）でよいが、これに限定されるものではない。
【0201】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈを製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３に前記アダプターを結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0202】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを製造する段階で除去する制限酵素サイトは、ＣｌａＩ制限酵素サイトでよいが、これに限定されるものではない。
【0203】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを製造する段階は、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３ＨをＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後に自己結合して、Ｄａｍ－／－細菌性細胞（Ｄａｍ－／－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に形質転換させる段階；結果物であるｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿ｄＣｌａをＣｌａＩ制限酵素で再び切断する段階；クレノウで隙間を埋める段階；及び、自己結合（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）させる段階；を含んでよい。
【0204】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈに存在する制限酵素サイトを除去してｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを製造する段階で除去する制限酵素サイトは、ＣｌａＩ制限酵素サイトでよいが、これに限定されない。
【0205】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを製造する段階は、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５ＨをＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後に自己結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0206】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを制限酵素で切断する段階は、ＳａｃＩ及びＡｐａＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0207】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して大きい断片を分離する段階は、ＳａｃＩ及びＡｐａＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0208】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した前記大きい断片は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＳａｃＩ制限酵素サイト及びＡｐａＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0209】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＳａｃＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0210】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片のＡｐａＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0211】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａにｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａを制限酵素で切断して分離した大きい断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0212】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａを制限酵素で切断する段階は、ＨｐａＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0213】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を制限酵素で切断する段階は、ＳａｃＩ及びＡｖｒＩＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0214】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬを製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａと制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を混合してｉＨｏＡを用いて行ってよいが、これに限定されない。
【0215】
本発明において、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬを制限酵素で切断する段階は、ＡｐａＩ及びＮｓｉＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0216】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素を製造する段階におけるプライマーセットは、配列番号２９及び３０の塩基配列からなるプライマーセットでよいが、これに限定されるものではない。
【0217】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素を製造する段階は、ＰＣＲで行ってよいが、これに限定されない。
【0218】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素は、制限酵素サイトを含んでいるものでよく、例えば、ＡｐａＩ制限酵素サイト及びＮｓｉＩ制限酵素サイトを含んでいるものでよいが、これに限定されない。
【0219】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素を制限酵素で切断する段階は、ＡｐａＩ及びＮｓｉＩ制限酵素で行ってよいが、これに限定されない。
【0220】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素のＡｐａＩ制限酵素サイトは、５’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0221】
本発明において、スキャフォールド／マトリックス付着要素のＮｓｉＩ制限酵素サイトは、３’末端に位置していてよいが、これに限定されない。
【0222】
本発明において、ｐＧＬＡｄを製造する段階は、制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬに、制限酵素で切断されたスキャフォールド／マトリックス断片を結合して行ってよいが、これに限定されない。
【0223】
本発明において、ｐＧＬＡｄは、配列番号７３の塩基配列を含むものでよく、例えば、配列番号７３の塩基配列からなるものでよいが、これに限定されない。
【0224】
本発明のさらに他の例は、下記の構成を含むガットレスアデノウイルスに関する：
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ポリ（Ａ）信号配列、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）及び３’逆末端反復配列。
５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψパッケージング信号配列、プロモーター、イントロン、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ポリ（Ａ）信号配列、スタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ；ｓＤＮＡ）及び３’逆末端反復配列。
【0225】
本発明において、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター又はニワトリベータ－アクチン（ｃｈｉｃｋｅｎ β－ａｃｔｉｎ）プロモーターでよいが、これに限定されるものではない。
【0226】
本発明において、イントロンは、ウサギベータ－グロビン（ｒａｂｂｉｔ β－ｇｌｏｂｉｎ）遺伝子に由来するものでよいが、これに限定されない。
【0227】
本発明において、ポリ（Ａ）信号配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）信号配列でよいが、これに限定されるものではない。
【0228】
本発明において、スタッファーＤＮＡは、スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ）をさらに含むものでよいが、これに限定されない。
【0229】
本発明において、導入遺伝子は、少なくとも１個であってよいが、これに限定されるものではない。
【0230】
本発明において、導入遺伝子は、特定遺伝子産物の発現を抑制する機能を有するものでよいが、これに限定されない。
【0231】
本発明において、導入遺伝子は、因子ＩＸ［ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、血友病Ｂ（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ）の治療のためのＲ３３８Ｌ Ｐａｄｕａ突然変異体遺伝子］、グルコセレブロシダーゼ［ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ，ＧＣＲ、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療のための遺伝子］、ヘクソサミニダーゼＡ［ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａ，ＨＥＸＡ、テイザックス病（Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ）の治療のための遺伝子］、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１［ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，ＨＰＲＴ１、レッシュナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、イズロネート－２－スルファターゼ［ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ，ＩＤＳ、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、メチル－ＣｐＧ－結合タンパク質２［ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＭＥＣＰ２、レット症候群（Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、運動ニューロン１生存因子［ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １，ＳＭＮ１、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）の治療のための遺伝子］、及びジストロフィン遺伝子［ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）の治療のための遺伝子］からなる群から選ばれる１種以上でよいが、これに限定されるものではない。
【0232】
本発明において、前記ガットレスアデノウイルスは、既に詳述したヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システムを用いて製造されたものでよいが、これに限定されない。
【0233】
本発明において、前記ガットレスアデノウイルスは、既に詳述したガットレスアデノウイルス生産方法を用いて製造されたものでよいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【0234】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システム、これを用いたガットレスアデノウイルス生産方法、これを用いて生産されたガットレスアデノウイルス、及び該ガットレスアデノウイルスの用途に関する。本発明のヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムは、ヘルパープラスミド由来アデノウイルス及び複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；ＲＣＡ）を発生することなく、単に組換えＧＬＡｄだけを生産し、前記生産システムによって製造された組換えＧＬＡｄは、導入遺伝子の大きさに関係なくそれらの遺伝子を効果的に伝達しており、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）のような先天性遺伝病に対する治療可能性を示した。したがって、本発明は、ヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムがＧＬＡｄベース遺伝子治療法において新しいプラットホームになり得ることを提示する。
【図面の簡単な説明】
【0235】
【図1】本発明の一実施例であり、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びｐＧＬＡｄゲノムプラスミドの製造、及びこれを用いたＧＬＡｄの生産を示す図である。 ａは、最も広く使用されるヘルパーアデノウイルスの構造的特徴を示している。黒矢尻は、ｌｏｘＰサイトを示す。 ｂは、Ａｄ５ゲノム構造及び転写単位を示している。Ｅ及びＬはそれぞれ、初期遺伝子（ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）及び後期遺伝子（ｌａｔｅ ｇｅｎｅ）を示す。矢印は、転写単位の方向を示す。 ｃは、Ａｄ５、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド、ｐＧＬＡｄゲノムプラスミド及びＧＬＡｄゲノム構造の概略図を比較して示している。ＳＭＡＲは、スキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）を示す。色相は、ＤＮＡバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の起源を示す。 ｄは、ＧＬＡｄ生産の概略図を示している。ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素で線形化された組換えｐＧＬＡｄ＿ＸゲノムプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させることによって組換えＧＬＡｄ．Ｘウイルスを生産した。 ｅは、ＧＬＡｄ．ＬａｃＺウイルスで感染されたＨＥＫ２９３細胞のＬａｃＺ染色結果を示している。ＧＬＡｄ．ＬａｃＺウイルスでＨＥＫ２９３細胞を感染させて４８時間後に、細胞にＬａｃＺ染色を行った［上段：未処理対照群（白色点は、染色された細胞ではなくＸ－ｇａｌ結晶である。）；中段：１０ｍｌウイルス性培地のうち５０ｕｌが感染に使用された；下段：１ｍｌウイルス性細胞溶解物のうち５ｕｌが感染に使用された。］。
【図2】本発明の一実施例であり、新しいゲノムプラスミドであるｐＧＬＡｄ３の製造及びこれを用いたＧＬＡｄの生産を示す図である。 ａは、ｐＧＬＡｄ及びｐＧＬＡｄ３ゲノムプラスミドとそれに相応するＧＬＡｄの概略図を比較して示している。色相は、ＤＮＡバックボーンの起源を示す。 ｂは、組換えＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスを生産する間に観察されたＣＰＥを示している。ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素で線形化されたｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺゲノムプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させて４８時間後に、未処理対照群（左側）及び形質感染された細胞（右側）を顕微鏡で撮影した。 ｃは、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスで感染されたＨＥＫ２９３細胞のＬａｃＺ染色結果を示している。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスでＨＥＫ２９３細胞を感染させて４８時間後に、細胞にＬａｃＺ染色を行った。左側の数字は、１００ｍｍ培養皿で製造された１ｍｌウイルス性細胞溶解物のうち、感染に使用された体積（０、５又は２０ｕｌ）を示す。 ｄは、ヘルパーアデノウイルス、Ｅ１発現パッケージング細胞及びｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミドから確認された相同性領域部分を示している。相同組換えは、色付きのボックス領域で発生し得る。ＲＣＡが生成されるには、２箇所で相同組換えが発生しなければならず、そうしてこそ、Ｅ１がパッケージング細胞からヘルパーアデノウイルスに移動することができる。
【図3】本発明の一実施例であり、ＧＬＡｄの大量生産のためのワークフローである。 ａは、既存ＧＬＡｄの標準生産手続きに対する全過程を示している。ｐＨＤＡｄ．ＬａｃＺは、ＬａｃＺ発現カセットを含んでいるＧＬＡｄゲノムプラスミドである。力価（ｔｉｔｅｒ）は、各増幅段階で生成される全体感染性ＧＬＡｄ粒子（ＢＦＵは、ＬａｃＺ染色によって決定される。）を示す。 ｂは、シードＧＬＡｄ（ｓｅｅｄ ＧＬＡｄ，Ｐ０）の収得（ｒｅｓｃｕｅ）、連続増幅（Ｐ１～Ｐ３）及びＧＬＡｄの大量生産（規模によってＰ３、Ｐ４又はＰ５）に対する全過程を示している（詳細な内容は、材料及び実験方法参照）。力価（ＢＦＵ）は、各増幅段階においてＬａｃＺ染色で算出した。
【図4】本発明の一実施例であり、ＧＬＡｄ生産過程で生成されたアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物分析を示す図である。 ａは、１００ｍｍ培養皿ではＡｄ．ＬａｃＺ（陽性対照群）を、そして１５０ｍｍ培養皿ではＰ３ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（３×１０９ＢＦＵ）（それの生産は図３参照）を用いてＨＥＫ２９３細胞を順次の段階で感染させる過程を示している。上記の条件で、アデノウイルス及びＲＣＡは増幅可能である。陽性対照群において、１個の感染性ウイルス粒子は、２回未満の増幅段階だけでも５×１０５の感染性ウイルス粒子に増幅された（１ＢＦＵ－＞５×１０５ＢＦＵ）。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、Ｐ３ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺの製造に持続して利用されるヘルパープラスミドを分解するために使用された（カプシド皮内にパッケージングされるウイルスＤＮＡは、ベンゾナーゼに耐性を有する）。各増幅段階において、細胞を収集し、適当な方式で処理することによって、アデノウイルス及びＲＣＡを細胞から放出させた。増幅最終段階では、細胞及び培養培地を全て収集し、適当な方式で処理した後、アデノウイルス及びＲＣＡを分析した。 ｂは、図４のａのサンプルに対するアデノウイルス及びＲＣＡのＰＣＲ分析結果を示している。ＧＬＡｄゲノム又はＨＥＫ２９３細胞には存在しないが、アデノウイルス及びＲＣＡには共通に存在するｆｉｂｅｒ遺伝子のＮ末端ＤＮＡに対してＰＣＲを行ってサンプルを分析した。Ａｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ）をＰＣＲにおいて陽性対照群として用いた。Ａｄ．ＬａｃＺサンプルは、１００倍希釈前又は後にＰＣＲを行った（このように希釈すると、サンプルには単に５００個のウイルス粒子だけが残る）。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺサンプルは、さらに添加した（ｓｐｉｋｅｄ）Ａｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ）の存在又は不在下にＰＣＲで増幅された。矢尻は、標的ＰＣＲ生成物（４８４ｂｐ）を示す。Ｍは、１００ｂｐサイズマーカーを意味する。 ｃは、図４のａにおけると同様に、アデノウイルス及びＲＣＡの増幅のためにＰ４ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ又はＰ５ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺを用いてＨＥＫ２９３細胞を感染させた過程を示している。製造されたサンプルを用いてＰＣＲを行い、その結果を図４のｄに示した。 ｄは、図４のｃのサンプルに対するアデノウイルス及びＲＣＡのＰＣＲ分析結果を示している。サンプルに対するＰＣＲは、上の図４のｂと同様に行った。
【図5】本発明の一実施例であり、組換えＧＬＡｄによるハンチンチンｍｓｈＲ、コドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子、又はそれら２種類の発現を示す図である。 ａは、全長ヒト成熟型ハンチンチンｍＲＮＡ（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｈｕｍａｎ ｍａｔｕｒｅ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｍＲＮＡ）の概略図及びｍｓｈＲの位置を示している。数字１、２及び３はそれぞれ、ｍｓｈＲ１、ｍｓｈＲ２及びｍｓｈＲ３の標的位置を示す。 ｂは、ｍｓｈＲの鋳型配列（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を示している。２１ＮＴｓは、２１ヌクレオチド長のセンス及びアンチセンス配列を示す。 ｃは、ｍｓｈＲを発現させる発現プラスミドを示している。ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを用いて、このプラスミドに個別ｍｓｈＲ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｓｈＲ、表２１）をクローニングした。 ｄは、ｍｓｈＲ発現プラスミドによって内因性ハンチンチン発現が抑制されることを示している。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を未処理状態で置くか、或いは、ｐＧＴ２、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ１、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ２又はｐＧＴ２－ｍｓｈＲ３で形質感染させて４８時間後に、細胞を収得してウェスタンブロッティングを行い、内因性ハンチンチン発現を分析した。ＨＴＴは、ハンチンチンを意味する。 ｅは、全長ヒト成熟型ハンチンチンｍＲＮＡの概略図及びｍｓｈＲの位置を示している。上段の黒色及び下段の赤色の水平線はそれぞれ、天然（内因性）ハンチンチンｍＲＮＡ及びコドン最適化されたハンチンチンｍＲＮＡを示す。数字は、ｍｓｈＲ１、ｍｓｈＲ２及びｍｓｈＲ３の標的位置を示す。ｍｓｈＲ１及びｍｓｈＲ３の場合には、アミノ酸及び該当のコドンを示す。天然（内因性）ハンチンチンｍＲＮＡ及びコドン最適化されたハンチンチンｍＲＮＡとの間で異なる配列として確認されたヌクレオチドは、灰色で強調表示した。 ｆは、ｍｓｈＲ１、ｍｓｈＲ３及びコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子クローニングのためのｐＧＬＡｄ４ゲノムプラスミドを示している［正方向（ｒｉｇｈｔ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）又は逆（Ｒ）方向（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）］。 ｇは、ハンチンチンｍｓｈＲ及びコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子を同時に伝達する組換えＧＬＡｄを示している。ＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３は、正方向のコドン最適化されたハンチンチン遺伝子を伝達する。総長（２８．３ｋｂ）は、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまでの長さを意味する。 ｈは、組換えＧＬＡｄがｍｓｈＲ１／３及びコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子を同時に伝達する場合に、それらがハンチンチン発現に及ぼす影響を示している。ＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３又はＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３（逆方向のコドン最適化されたハンチンチン遺伝子）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させて４８時間後に細胞を収得し、ウェスタンブロッティングを行ってハンチンチン発現を分析した。ＨＴＴは、ハンチンチンを意味する。 ｉは、ハンチントン病（ＨＤ）において組換えＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３の作用モデルを示す概略図を示している。ｗｔＨＴＴ及びｍｔＨＴＴはそれぞれ、野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ハンチンチンｍＲＮＡ及び突然変異（ｍｕｔａｎｔ）ハンチンチンｍＲＮＡを示す。ｃｏＨＴＴは、コドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子から転写されたｍＲＮＡを示す。組換えＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３は、ｍｓｈＲ及びコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子の両方をハンチントン病標的組織に同時に伝達する。
【図6】本発明の一実施例であり、組換えＧＬＡｄが生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）にジストロフィン遺伝子を伝達することを示す図である。 ａは、組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓの概略図を示している。総長（２７．７ｋｂ）は、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまでの長さを意味する。 ｂは、動物実験に対する時間経過（ｔｉｍｅ ｆｒａｍｅ）を示している。 ｃは、ジストロフィンノックアウトＭＤＸマウスにおいてジストロフィン発現を検査した結果を示している。ＭＤＸマウスの腓腹筋（ｆｏｃａｌ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）にＰＢＳ又は５０ｕｌのＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルス（４×１０１０ウイルス粒子）を注射した。４週後、野生型対照群、ＰＢＳを注射したＭＤＸマウス、又はＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスを注射したＭＤＸマウスから筋肉組織を生検して免疫蛍光染色を行い、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で分析した（倍率＝２００倍；スケールバー＝２０μｍ）。
【図7】本発明の一実施例であり、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びｐＢｅｓｔクローニングシャトルプラスミドの製造を示す図である。 ａは、Ａｄ５の誘導体であるΨ５を示す概略図である。Ｅ１及びＥ３において垂直点線は、該当の遺伝子の実際欠失位置を示す。唯一に存在するＢａｍＨＩ制限酵素サイトを共に示している。 ｂ～ｅは、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミドの製造過程を示す概略図である。詳細な内容は、材料及び実験方法から確認できる。 ｆは、ｐＢｅｓｔクローニングシャトルプラスミドの構成を示す概略図である。黒色及び灰色ボックスは、ｉＨｏＡのための５’及び３’相同ストレッチ部位を示す。
【図8】本発明の一実施例であり、ｐＧＬＡｄゲノムプラスミドの構築を示す図である。詳細な内容は、材料及び実験方法から確認できる。
【図9】本発明の一実施例であり、組換えｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺの製造のためのｉＨｏＡの概略図である。 ａは、黒色ボックスがＰｍｅＩ制限酵素サイトを示し、矢尻がＰｍｅＩ制限酵素サイトの切断部分を示す。ＰｍｅＩ制限酵素で切断したｐＢｅｓｔ＿ＬａｃＺをＣｌａＩ制限酵素で切断したｐＧＬＡｄと混合し、ｉＨｏＡを行った。６８ｂｐ及び４９ｂｐはそれぞれ、ｐＢｅｓｔとｐＧＬＡｄとの間の５’及び３’相同ストレッチ部位を示す。 ｂは、ｉＨｏＡの中間産物を示している。整列された二本鎖ＤＮＡ（上、図９のａ）は、一本鎖ＤＮＡに変換された。この過程によりハイブリッドアニーリングが起こり、ｐＢｅｓｔ＿ＬａｃＺに存在していた５’ＩＴＲ、Ψパッケージング信号配列及びＬａｃＺ発現カセットがｐＧＬＡｄゲノムプラスミドに移動した。 ｃは、ｉＨｏＡの完了による最終結果物である。アニーリングされた鎖は、形質転換された細菌性細胞内で完全に修理されて復旧される。
【図10】本発明の一実施例であり、組換えｐＧＬＡｄ＿Ｘの製造においてｉＨｏＡの効率を示す図である。 ａは、ｉＨｏＡ後に、アガープレートに形成された細菌性コロニーを示している。矢印は、潜在的に正しい組換えｐＧＬＡｄ＿Ｘプラスミドを含んでいる、サイズの小さいコロニーを表示している。 ｂは、ｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺの制限酵素地図を示す概略図である。Ｅ及びＢはそれぞれ、ＥｃｏＲＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素サイトを示す。数字は、該当の制限酵素サイトの位置を示す。 ｃは、コロニースクリーニング結果である。サイズの小さい５個のコロニーを選択した後、それらのそれぞれからプラスミドを精製した。それぞれのプラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で切断した後、アガロースゲル上で分析した。Ｍは、ラムダＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカーである。 ｄは、さらに制限酵素を処理した結果である。クローン１及びクローン２をＥｃｏＲＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素を用いて同時に切断した。Ｍは、ラムダＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカーである。
【図11】本発明の一実施例であり、ｉＨｏＡが起こる相同ストレッチ部位に対する配列検証を示す図である。 ａは、ｉＨｏＡの最終結果物を示している。色付き矢尻は、シーケンシングプライマーを示す。黒矢尻は、ｉＨｏＡを行うとき、ｐＧＬＡｄの線形化に用いられたＣｌａＩ制限酵素サイト（ＣｌａＩ制限酵素サイトである５’－ＡＴＣＧＡＴ－３’は、ｉＨｏＡ後に破壊される。）の開始ヌクレオチドを示す。矢印は、ｉＨｏＡに用いられた相同ストレッチ部位の終了を示す。 ｂ及びｃは、シーケンシング結果である。相同ストレッチ部位との連結地点をボックスで示す。矢印及び矢尻は、図１１のａで説明したそれぞれに該当する位置を示す。
【図12】本発明の一実施例であり、新しいゲノムプラスミドであるｐＧＬＡｄ３の製造を示す図である。 ａは、マウスＥ－カドヘリンイントロン２領域（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ ｉｎｔｒｏｎ ２ ｒｅｇｉｏｎ）を示す概略図である。垂直の黒色ボックスは、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）を示す。水平線は、プライマーセット（表２０）を用いて獲得したＰＣＲ産物を示す。Ｎ、Ｃ及びＦ１～Ｆ５は、ＰＣＲ産物の名称である。水平線上の数字は、ＰＣＲ産物の長さを示す。 ｂは、ｐＧＬＡｄ３の製造工程を示す概略図である。詳細な内容は、材料及び実験方法から確認できる。 ｃは、ｐＢｅｓｔ４クローニングシャトルプラスミドの概略図である。黒色及び灰色ボックスは、ｉＨｏＡ実行のための５’及び３’相同ストレッチ部位を示す。ＭＣＳは、導入遺伝子の多重クローニング部位を示す。
【図13】本発明の一実施例であり、ＧＬＡｄ生産に用いられる２種類のヘルパーが、アデノウイルス及びＲＣＡ汚染物の発生に及ぼす影響を示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３パッケージング細胞において２種類のヘルパーを用いてＧＬＡｄを生産する概略図である。色付きのボックス領域で相同組換えが発生し得る。ＲＣＡは、複製可能アデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を意味する。
【図14】本発明の一実施例であり、ｐＧＬＡｄ３ゲノムプラスミドからｐＧＬＡｄ４ゲノムプラスミドへの変換を示す図である。ｐＧＬＡｄ３には、２つのＢｓｓＨＩＩ制限酵素サイトがある。ｐＧＬＡｄ３をＢｓｓＨＩＩ制限酵素で切断し、自己結合させた。この過程が成功的に行われると、星印で表示された部分が削除され、総長が２６，５９７ｂｐから１６，３９２ｂｐへと減少する。
【発明を実施するための形態】
【0236】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産システムに関する。
【実施例】
【0237】
以下、本発明を、下記の実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0238】
材料及び実験方法
試薬、キット、実験用マウス及び通常のクローニング技術
あらゆる種類の制限酵素、クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ、米国）から購入した。エニィヒュージョン（ＡｎｙＦｕｓｉｏｎ）及びＰｆｕ重合酵素は、ジェネンメド（Ｇｅｎｅｎｍｅｄ，ソウル、韓国）のものを使用した。Ａｄ５の一種であるΨ５は、以前に報告されたことがあり、それを使用した。化学物質試薬は、シグマ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ、米国）から入手した。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ）とウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）はそれぞれ、ウェルジン（Ｗｅｌｇｅｎｅ，キョンサンプクド、韓国）とセルセラ（ＣｅｌｌＳｅｒａ、ニューサウスウエスト、オーストラリア）から購入した。化学的反応能細胞（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であるＸＬ－１ Ｂｌｕｅ及びＤＨ１０ｂは、ＲＢＣ（タイペイ、台湾）から導入した。ヒトジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子、コドン最適化された（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ヒトハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）遺伝子及びｍｓｈＲｓは、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー、米国）で合成された。重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）及び合成オリゴ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏ）は、コスモジンテック（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、ソウル、韓国）から入手した。ヌクレオチド配列分析もコスモジンテックで行われた。Ｔ－ブラントＰＣＲクローニングキット（Ｔ－Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）とＬａｂｏＰａｓｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ分離キットは、それぞれ、ソルジェント（ＳｏｌＧｅｎｔ、デジョン、韓国）とコスモジンテックから購入した。カラムクロマトグラフィーのためのＱセファロースＸＬ（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ）及びキレート化セファロースＦＦ樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｒｅｓｉｎ）は、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イリノイ、米国）から購買した。ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ、分画分子量（ｃｕｔ ｏｆｆ）：１００ｋＤａ）は、サートリアス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）から購入した。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、メルク（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。ジストロフィン－ノックアウトＭＤＸ（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＤＸ，Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ）及び野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ）は、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メーン、米国）から購入した。ジストロフィン抗体（ａｂ１５２７７）及びハンチンチン抗体（ｓｃ－４７７５７）はそれぞれ、Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、英国）及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア、米国）から導入した。β－アクチン抗体（Ａｂｃ－２００２）は、アブクロン（ＡｂＣｌｏｎ，ソウル、韓国）から入手した。スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューハンプシャー、米国）から購入した。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣ（バージニア、米国）から入手した。ＤＮＡ配列のクローニング及び操作には、一般に用いられる汎用ＤＮＡ操作技術が適用された。
試薬、キット、実験用マウス及び通常のクローニング技術
あらゆる種類の制限酵素、クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡは、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ、米国）から購入した。エニィヒュージョン（ＡｎｙＦｕｓｉｏｎ）及びＰｆｕ重合酵素は、ジェネンメド（Ｇｅｎｅｎｍｅｄ，ソウル、韓国）のものを使用した。Ａｄ５の一種であるΨ５は、以前に報告されたことがあり、それを使用した。化学物質試薬は、シグマ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ、米国）から入手した。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ ）とウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）はそれぞれ、ウェルジン（Ｗｅｌｇｅｎｅ，キョンサンプクド、韓国）とセルセラ（ＣｅｌｌＳｅｒａ、ニューサウスウエスト、オーストラリア）から購入した。化学的反応能細胞（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）であるＸＬ－１ Ｂｌｕｅ及びＤＨ１０ｂは、ＲＢＣ（タイペイ、台湾）から導入した。ヒトジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺伝子、コドン最適化された（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ヒトハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）遺伝子及びｍｓｈＲｓは、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー、米国）で合成された。重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）及び合成オリゴ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏ）は、コスモジンテック（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、ソウル、韓国）から入手した。ヌクレオチド配列分析もコスモジンテックで行われた。Ｔ－ブラントＰＣＲクローニングキット（Ｔ－Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）とＬａｂｏＰａｓｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ分離キットは、それぞれ、ソルジェント（ＳｏｌＧｅｎｔ、デジョン、韓国）とコスモジンテックから購入した。カラムクロマトグラフィーのためのＱセファロースＸＬ（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ）及びキレート化セファロースＦＦ樹脂（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｒｅｓｉｎ）は、ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，イリノイ、米国）から購買した。ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ、分画分子量（ｃｕｔ ｏｆｆ）：１００ｋＤａ）は、サートリアス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）から購入した。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、メルク（Ｍｅｒｃｋ、ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。ジストロフィン－ノックアウトＭＤＸ（Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＤＸ，Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ）及び野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ）は、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メーン、米国）から購入した。ジストロフィン抗体（ａｂ１５２７７）及びハンチンチン抗体（ｓｃ－４７７５７）はそれぞれ、Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、英国）及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア、米国）から導入した。β－アクチン抗体（Ａｂｃ－２００２）は、アブクロン（ＡｂＣｌｏｎ，ソウル、韓国）から入手した。スーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューハンプシャー、米国）から購入した。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣ（バージニア、米国）から入手した。ＤＮＡ配列のクローニング及び操作には、一般に用いられる汎用ＤＮＡ操作技術が適用された。
【0239】
実施例１．ｐＢｅｓｔクローニングシャトルプラスミドの製造
Ｋａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域に該当するＤＮＡ断片は、ｐＧＴ２プラスミド（配列番号６３）を鋳型とし、下記表のプライマーセットを用いてＰＣＲで確保した：
Ｋａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域に該当するＤＮＡ断片は、ｐＧＴ２プラスミド（配列番号６３）を鋳型とし、下記表のプライマーセットを用いてＰＣＲで確保した：
【0240】
【表1】
【0241】
５’相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）、５’逆末端反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ，ＩＴＲ）、Ψ５パッケージング信号配列、ＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ，ＭＣＳ）、ＳＶ４０ポリ（Ａ）信号配列、及び３’相同ストレッチ部位を含むＤＮＡ断片（図７のｆ）は、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で化学的に合成された。この合成ＤＮＡの５’末端にはＳｆｉＩ制限酵素サイトが、３’末端にはＸｃｍＩ制限酵素サイトが含まれている。ｐＢｅｓｔプラスミド（配列番号６４）は、ＳｆｉＩ及びＸｃｍＩ制限酵素サイトを用いて前記ＰＣＲ生成物と合成ＤＮＡを共に結合させることによって製造された。
【0242】
実施例２．ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミドの製造
下記のプライマーセットを用いて、実施例１と同じ方法でＰＣＲ生成物を収得した：
下記のプライマーセットを用いて、実施例１と同じ方法でＰＣＲ生成物を収得した：
【0243】
【表2】
【0244】
ＰＣＲ生成物（Ｋａｎ～ＣｏｌＥ１領域）をＢａｍＨＩ／ＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素で切断し、Ψ５ゲノムのＢｓｔＺ１７Ｉ～ＢａｍＨＩ領域に該当する断片（配列番号６５）と結合させてΨ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１を製造した。次に、‘＊’（ａｓｔｅｒｉｓｋ）表示からＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素サイトに至るＤＮＡ断片（配列番号６６）（図７のａ）を、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで製造した後、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－１に結合させて、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２を製造した。
【0245】
【表3】
【0246】
Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２は、Ａｄ５（アデノウイルス５型、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００８）のヌクレオチド１～３１３３（５’ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を含む部分）に該当する部位が除去された状態である。
【0247】
Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－１（図７のｃ）の製造においても、Ｋａｎｒ～ＣｏｌＥ１領域に該当するＤＮＡ断片は、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで準備した：
【0248】
【表4】
【0249】
ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ制限酵素で切断し、Ψ５ゲノムのＢａｍＨＩ～３’ＩＴＲ領域に該当するＤＮＡ断片（配列番号６７）と結合させた。
【0250】
アデノウイルスのゲノムサイズを減少させるために、ＳｐｅＩ（２７０８２）制限酵素サイト及びＮｄｅＩ（３１０８９）制限酵素サイト、そして下記表５のプライマーセットを用い、Ａｄ Ψ５を鋳型として重複ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲ）を行うことにより、Ψ５ゲノムに部分的に残っていたＥ３領域（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ Ｅ３ ｒｅｇｉｏｎ）を完全に欠失させた。
【0251】
【表5】
【0252】
これにより、Ψ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２には、Ａｄ５のヌクレオチド２７８６４～３１０００に該当する部分が欠失している。
【0253】
その後、Ψ５－Ｌｅｆｔ－Ａｒｍ－２からＣｌａＩ～ＢａｍＨＩ領域に該当するＤＮＡ（配列番号６９）を分離してΨ５－Ｒｉｇｈｔ－Ａｒｍ－２に結合させることによってｐＡｄＢｅｓｔを製造した（図７のｄ）。
【0254】
ｐＡｄＢｅｓｔから３’ＩＴＲの除去は、次の段階によって行った：
ｐＡｄＢｅｓｔをＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断した後、小さい断片を分離し、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含む下記のアダプターに接合してｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを製造した。
ｐＡｄＢｅｓｔをＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断した後、小さい断片を分離し、ＣｌａＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを含む下記のアダプターに接合してｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａを製造した。
【0255】
【表6】
【0256】
次に、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿ＣｌａをＡｖｒＩＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断し、大きい断片を分離した。下記のプライマーセットを用い、ｐＡｄＢｅｓｔを鋳型として重複ＰＣＲを行った：
【0257】
【表7】
【0258】
ＰＣＲ生成物（配列番号７０）をＡｖｒＩＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断し、これをＡｖｒＩＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａの大きい断片と結合させた。このような過程により、ｐＡｄＢｅｓｔで３’ＩＴＲを完全に除去したｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲを製造した。その後、ｐＡｄＢｅｓｔのＣｌａＩ～ＥｃｏＲＩ領域に該当する大きい断片を、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ＥｃｏＲ＿Ｃｌａ＿ｄＩＴＲの相応するサイトにさらに結合させ、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ（配列番号７１）を製造した（図７のｅ）。
【0259】
実施例３．ｐＧＬＡｄゲノムプラスミドの製造
下記のプライマーセットを用いて、ｐＡｄＢｅｓｔを鋳型としてＰＣＲを行った：
下記のプライマーセットを用いて、ｐＡｄＢｅｓｔを鋳型としてＰＣＲを行った：
【0260】
【表8】
【0261】
ＰＣＲ生成物（配列番号７２）をＳａｃＩ／ＡｓｃＩ制限酵素で切断した後、下記のアダプターに結合させてｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１を製造した（図８のａ）。
【0262】
【表9】
【0263】
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１に唯一に存在するＣｌａＩ制限酵素サイト除去は、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１をＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後、自己結合させることによって実施され、この過程によりｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａを製造した。ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ１＿ｄＣｌａのそれぞれをＳａｃＩ／ＡｖｒＩＩ制限酵素で切断し、ＨｐａＩ制限酵素サイトを含む下記のアダプター（ＨｐａＩ－ｓｉｔｅ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ、図８のｂ）に結合させ、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を製造した。
【0264】
【表10】
【0265】
次に、ＨｐａＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断されたラムダファージＤＮＡ（矢印、図８のｃ）と混合し、試験管内相同アニーリング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｎｅａｌｉｎｇ，ｉＨｏＡ）を行ってｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３を製造した。ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ３をＳａｃＩ／ＡｐａＩ制限酵素又はＡｐａＩ／ＡｖｒＩＩ制限酵素で切断し、下記のＳａｃＩ／ＡｐａＩアダプター（図８のｄ）又は下記のＡｐａＩ／ＡｖｒＩＩアダプター（図８のｅ）に結合させて、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ及びｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈをそれぞれ製造した。
【0266】
【表11】
【0267】
【表12】
【0268】
ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａは、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈに存在するＣｌａＩ制限酵素サイトを連続して除去することによって製造されるが、具体的には、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３ＨをＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後に自己結合して、Ｄａｍ－／－細菌性細胞（Ｄａｍ－／－ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ）に形質転換させた。結果物であるｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿ｄＣｌａをＣｌａＩ制限酵素で再び切断し、クレノウで隙間を埋めた後、自己結合させることによって、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａを製造した。同様の方式で、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａはｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５ＨをＣｌａＩ制限酵素で切断し、クレノウで隙間を埋めた後、自己結合して製造した。次に、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿５Ｈ＿ｄＣｌａのＳａｃＩ～ＡｐａＩ領域に該当する断片（５’半分部）を、ＳａｃＩ／ＡｐａＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ４＿３Ｈ＿２ｄＣｌａに移し、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５を製造した（図８のｆ）。ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ（図８のｇ）製造は、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬ２＿ｗｔＣｌａをＨｐａＩ制限酵素で切断し、ＳａｃＩ／ＡｖｒＩＩ制限酵素で切断されたｐＡｄＢｅｓｔＧＬ５（図８のｆ）と混合し、ｉＨｏＡを行って製造した。その後、ｐＡｄＢｅｓｔＧＬをＡｐａＩ／ＮｓｉＩ制限酵素で切断し、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで準備したスキャフォールド／マトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ ｅｌｅｍｅｎｔ）と結合させることによって、最終的にｐＧＬＡｄ（配列番号７３）を製造した（図８のｈ）。
【0269】
【表13】
【0270】
実施例４．試験管内相同アニーリング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｎｅａｌｉｎｇ，ｉＨｏＡ）
ｉＨｏＡは、エニィヒュージョン（ＡｎｙＦｕｓｉｏｎ）を用いて行った。全過程にはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って実施した：５５℃で１０分間培養、室温で２０分間さらに培養した。その後、培養混合物を化学的反応能細胞であるＸＬ－１Ｂｌｕｅ又はＤＨ１０ｂ細胞に形質転換させ、抗生剤を含むアガープレートに塗抹した。
ｉＨｏＡは、エニィヒュージョン（ＡｎｙＦｕｓｉｏｎ）を用いて行った。全過程にはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って実施した：５５℃で１０分間培養、室温で２０分間さらに培養した。その後、培養混合物を化学的反応能細胞であるＸＬ－１Ｂｌｕｅ又はＤＨ１０ｂ細胞に形質転換させ、抗生剤を含むアガープレートに塗抹した。
【0271】
実施例５．ＧＬＡｄ．ＬａｃＺ及びＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスの製造
ｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺ又はｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺプラスミド（１０ｕｇ）をＰａｃＩ制限酵素で線形化し、ＰａｃＩ活性を熱不活性化（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させた。このＰａｃＩ制限酵素で線形化されたｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺ又はｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺゲノムプラスミドを、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド３０ｕｇと共に、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にカルシウムホスフェート沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて共同形質感染させた。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染細胞及び培地を回収し（この段階で、培地は‘ウイルス性培地’として保存された。）、細胞を１ｍｌの新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁し、凍結及び解凍過程を３回繰り返し行って粉砕した（透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。ウイルス性細胞溶解物を収得してＨＥＫ２９３細胞を感染させた（組換えＧＬＡｄ．ＬａｃＺ及びＧＬＡ３．ＬＡＺウイルスは、ＧＬＡｄウイルスだけではＨＥＫ２９３細胞において増幅されず、ＨＥＫ２９３細胞内で溶解性細胞死滅が誘導できない。）。処理４８時間後に、ＬａｃＺ発現のために細胞を染色した。
ｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺ又はｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺプラスミド（１０ｕｇ）をＰａｃＩ制限酵素で線形化し、ＰａｃＩ活性を熱不活性化（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させた。このＰａｃＩ制限酵素で線形化されたｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺ又はｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺゲノムプラスミドを、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド３０ｕｇと共に、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にカルシウムホスフェート沈殿法（ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて共同形質感染させた。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染細胞及び培地を回収し（この段階で、培地は‘ウイルス性培地’として保存された。）、細胞を１ｍｌの新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁し、凍結及び解凍過程を３回繰り返し行って粉砕した（透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。ウイルス性細胞溶解物を収得してＨＥＫ２９３細胞を感染させた（組換えＧＬＡｄ．ＬａｃＺ及びＧＬＡ３．ＬＡＺウイルスは、ＧＬＡｄウイルスだけではＨＥＫ２９３細胞において増幅されず、ＨＥＫ２９３細胞内で溶解性細胞死滅が誘導できない。）。処理４８時間後に、ＬａｃＺ発現のために細胞を染色した。
【0272】
実施例６．ＬａｃＺ染色
ＨＥＫ２９３細胞から培養培地を除去し、細胞を室温で２分間新鮮な固定液［２％ホルムアルデヒド／メタノール（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ｍｅｔｈａｎｏｌ）及び０．１％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含むＰＢＳ］で固定した。細胞をＰＢＳで２回丁寧に洗浄した後、染色溶液［１ｍｇ／ｍｌ Ｘ－ｇａｌ、２ｍＭ塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＭｇＣｌ２）、５ｍＭフェリシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉ－ｃｙａｎｉｄｅ）及び５ｍＭフェロシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏ－ｃｙａｎｉｄｅ）を含むＰＢＳ］でＬａｃＺ染色が十分になるまで３７℃で培養した。
ＨＥＫ２９３細胞から培養培地を除去し、細胞を室温で２分間新鮮な固定液［２％ホルムアルデヒド／メタノール（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ｍｅｔｈａｎｏｌ）及び０．１％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を含むＰＢＳ］で固定した。細胞をＰＢＳで２回丁寧に洗浄した後、染色溶液［１ｍｇ／ｍｌ Ｘ－ｇａｌ、２ｍＭ塩化マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＭｇＣｌ２）、５ｍＭフェリシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｉ－ｃｙａｎｉｄｅ）及び５ｍＭフェロシアン化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏ－ｃｙａｎｉｄｅ）を含むＰＢＳ］でＬａｃＺ染色が十分になるまで３７℃で培養した。
【0273】
実施例７．マウスの尻尾からゲノムＤＮＡの精製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尻尾からのゲノムＤＮＡ精製は、ＬａｂｏＰａｓｓ組織ゲノムＤＮＡ分離キットを用いて行った。全手続きにはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って行った。簡単にいうと、マウスの尻尾組織（２×２ｍｍ切片）を、タンパク質分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を含有する溶解緩衝液で完全に溶解されるまで培養した。このように処理された試料を１００％エタノールと混合し、ミニスピンカラムに通過させた。カラムフィルターに吸着しているゲノムＤＮＡを、２種類の洗浄緩衝液を用いて完全に洗浄し、蒸留水を用いて溶出させた。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尻尾からのゲノムＤＮＡ精製は、ＬａｂｏＰａｓｓ組織ゲノムＤＮＡ分離キットを用いて行った。全手続きにはやや修正を加えたものの、メーカーの指示事項に従って行った。簡単にいうと、マウスの尻尾組織（２×２ｍｍ切片）を、タンパク質分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を含有する溶解緩衝液で完全に溶解されるまで培養した。このように処理された試料を１００％エタノールと混合し、ミニスピンカラムに通過させた。カラムフィルターに吸着しているゲノムＤＮＡを、２種類の洗浄緩衝液を用いて完全に洗浄し、蒸留水を用いて溶出させた。
【0274】
実施例８．ｐＧＬＡｄ３ゲノムバックボーン（ｇｅｎｏｍｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）としてマウスＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）イントロン２領域（ｉｎｔｒｏｎ ２ ｒｅｇｉｏｎ）のクローニング
マウスの尻尾から精製したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにおいて鋳型として用いた。プライマーセット及び配列は、表２０に記載されている。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４又はＦ５断片を確保するためのＰＣＲ増幅（９５℃で３０秒、６０～６５℃で３０秒、７２℃で４分）は、それぞれのプライマーセット及びＰｆｕ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて４５サイクル行われた。それぞれのＰＣＲ生成物は、Ｔ－ブラントＰＣＲクローニングキットのＴ－Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングされた。結果物であるＴ－Ｆ１、Ｔ－Ｆ２、Ｔ－Ｆ３、Ｔ－Ｆ４及びＴ－Ｆ５（図１２のｂ）が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
マウスの尻尾から精製したゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにおいて鋳型として用いた。プライマーセット及び配列は、表２０に記載されている。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４又はＦ５断片を確保するためのＰＣＲ増幅（９５℃で３０秒、６０～６５℃で３０秒、７２℃で４分）は、それぞれのプライマーセット及びＰｆｕ重合酵素（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて４５サイクル行われた。それぞれのＰＣＲ生成物は、Ｔ－ブラントＰＣＲクローニングキットのＴ－Ｂｌｕｎｔベクターにクローニングされた。結果物であるＴ－Ｆ１、Ｔ－Ｆ２、Ｔ－Ｆ３、Ｔ－Ｆ４及びＴ－Ｆ５（図１２のｂ）が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
【0275】
実施例９．ｐＧＬＡｄ３ゲノムプラスミドの製造
マウスの尻尾から精製したゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型とし、プライマーセットＮ－Ｆ／Ｎ－Ｒ及びＣ－Ｆ／Ｃ－Ｒ（表２０）を用いて重複ＰＣＲ（９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で６０秒）を５０サイクル行った。ＢｓｐＥＩ、ＸｈｏＩ及びＮｓｉＩと同じ制限酵素サイトを含むＮＣ断片ＰＣＲ生成物とＳａｃＩ／ＡｖｒＩＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ（図１２のｂ）との間にｉＨｏＡを行い、ｐＧＬＡｄ＿ＮＣを製造した。その後、ｐＧＬＡｄ＿ＮＣをＮｓｉＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で切断し、アニーリングされた合成Ｎｓｉ－Ｘｈｏ断片（表２０）を結合させ、後でＦ１２３４５断片を受容する最終受容体となるｐＧＬＡｄ＿ＮＣ＿ＰＵを製造した。これと並行して、Ｔ－Ｆ１＿ｄＰａｃは、ＰａｃＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）して自己結合することによって製造したが、このようにして、Ｔ－Ｆ１に唯一に存在するＰａｃＩ制限酵素サイトを除去した。Ｔ－Ｆ２＿ＳＭＡＲは、ＳｆｉＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ２とＳＭ－Ｆ／ＳＭＡＲ－Ｒプライマー（表２０）、ｐＧＬＡｄを鋳型としてＰＣＲで製造されたＳＭＡＲ要素を結合させることによって製造した。その後、Ｔ－Ｆ１２は、ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ１＿ｄＰａｃ断片を、ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ２＿ＳＭＡＲに移すことによって製造した。Ｔ－Ｆ３４の製造は、ＰｖｕＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）して熱不活性化した後、ＰｃｉＩ制限酵素で追加切断したＴ－Ｆ４断片を、ＳｐｅＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティングして熱不活性化後にＰｃｉＩ制限酵素でさらに切断したＴ－Ｆ３断片に移すことによって完成した。Ｔ－Ｆ３４５は、Ｔ－Ｆ５のＭｌｕＩ～ＸｂａＩ領域に該当する断片を、ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ３４と結合させることによって製造した（ＳｐｅＩ制限酵素部位は、ＸｂａＩ制限酵素部位に結合させてよい。）。Ｔ－Ｆ１２３４５は、Ｔ－Ｆ１２のＳａｌＩ～ＲｓｒＩＩ領域に該当する断片を、ＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ３４５に移すことによって製造した。究極として、ｐＧＬＡｄ３（配列番号７４）の製造は、ＰｓｔＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ＿ＮＣ＿ＰＵとＸｈｏＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ１２３４５との間にｉＨｏＡを実施することによって完成した。製造手続きの全段階において、各生成物が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
マウスの尻尾から精製したゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型とし、プライマーセットＮ－Ｆ／Ｎ－Ｒ及びＣ－Ｆ／Ｃ－Ｒ（表２０）を用いて重複ＰＣＲ（９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で６０秒）を５０サイクル行った。ＢｓｐＥＩ、ＸｈｏＩ及びＮｓｉＩと同じ制限酵素サイトを含むＮＣ断片ＰＣＲ生成物とＳａｃＩ／ＡｖｒＩＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ（図１２のｂ）との間にｉＨｏＡを行い、ｐＧＬＡｄ＿ＮＣを製造した。その後、ｐＧＬＡｄ＿ＮＣをＮｓｉＩ／ＸｈｏＩ制限酵素で切断し、アニーリングされた合成Ｎｓｉ－Ｘｈｏ断片（表２０）を結合させ、後でＦ１２３４５断片を受容する最終受容体となるｐＧＬＡｄ＿ＮＣ＿ＰＵを製造した。これと並行して、Ｔ－Ｆ１＿ｄＰａｃは、ＰａｃＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）して自己結合することによって製造したが、このようにして、Ｔ－Ｆ１に唯一に存在するＰａｃＩ制限酵素サイトを除去した。Ｔ－Ｆ２＿ＳＭＡＲは、ＳｆｉＩ／ＳａｌＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ２とＳＭ－Ｆ／ＳＭＡＲ－Ｒプライマー（表２０）、ｐＧＬＡｄを鋳型としてＰＣＲで製造されたＳＭＡＲ要素を結合させることによって製造した。その後、Ｔ－Ｆ１２は、ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ１＿ｄＰａｃ断片を、ＮｏｔＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ２＿ＳＭＡＲに移すことによって製造した。Ｔ－Ｆ３４の製造は、ＰｖｕＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティング（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）して熱不活性化した後、ＰｃｉＩ制限酵素で追加切断したＴ－Ｆ４断片を、ＳｐｅＩ制限酵素で切断し、クレノウでブランティングして熱不活性化後にＰｃｉＩ制限酵素でさらに切断したＴ－Ｆ３断片に移すことによって完成した。Ｔ－Ｆ３４５は、Ｔ－Ｆ５のＭｌｕＩ～ＸｂａＩ領域に該当する断片を、ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ３４と結合させることによって製造した（ＳｐｅＩ制限酵素部位は、ＸｂａＩ制限酵素部位に結合させてよい。）。Ｔ－Ｆ１２３４５は、Ｔ－Ｆ１２のＳａｌＩ～ＲｓｒＩＩ領域に該当する断片を、ＳａｌＩ／ＲｓｒＩＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ３４５に移すことによって製造した。究極として、ｐＧＬＡｄ３（配列番号７４）の製造は、ＰｓｔＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ＿ＮＣ＿ＰＵとＸｈｏＩ制限酵素で切断されたＴ－Ｆ１２３４５との間にｉＨｏＡを実施することによって完成した。製造手続きの全段階において、各生成物が正しく作製されたかどうかは、シーケンシングを用いて検証した。
【0276】
実施例１０．ｐＢｅｓｔ４クローニングシャトルプラスミドの製造
このプラスミドのｐＣＡＧ部分は、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで製造された後、ＡｓｅＩ制限酵素及びＢｓａＩ制限酵素で切断することによって準備した。
このプラスミドのｐＣＡＧ部分は、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで製造された後、ＡｓｅＩ制限酵素及びＢｓａＩ制限酵素で切断することによって準備した。
【0277】
【表14】
【0278】
β－グロビンイントロン領域も同様、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲで製造された後、ＢｓａＩ制限酵素及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断することによって準備した。
【0279】
【表15】
【0280】
ｐＢｅｓｔ４（配列番号７５）シャトルプラスミドは、ＡｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断されたｐＢｅｓｔを、上で準備されたそれらＰＣＲ生成物に結合させることによって製造された。
【0281】
実施例１１．プラーク分析（Ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）
１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３細胞［８０～９０％の合流性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）］にＡｄ．ＬａｃＺウイルス［陽性対照群として１世代アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ａｄ）；１×１０３感染性ウイルス粒子］、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス［１．１２×１０７～１．８０×１０７ＢＦＵ（ｂｌｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）］又はヘルパープラスミド単独で形質感染後に、準備したＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物（表１８）を処理した。２４時間後に、培養培地を除去し、アガロース（０．３％）を含む１２ｍｌの滅菌された培養培地で丁寧に覆った後、１０～１５日間ＣＯ２培養器で培養した。希釈されたＭＴＴ溶液１０ｍｌを分取してアガロース層に添加し、５時間培養した。その後、照明箱上でウイルス性プラークを計数した。
１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３細胞［８０～９０％の合流性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）］にＡｄ．ＬａｃＺウイルス［陽性対照群として１世代アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ａｄ）；１×１０３感染性ウイルス粒子］、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス［１．１２×１０７～１．８０×１０７ＢＦＵ（ｂｌｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）］又はヘルパープラスミド単独で形質感染後に、準備したＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物（表１８）を処理した。２４時間後に、培養培地を除去し、アガロース（０．３％）を含む１２ｍｌの滅菌された培養培地で丁寧に覆った後、１０～１５日間ＣＯ２培養器で培養した。希釈されたＭＴＴ溶液１０ｍｌを分取してアガロース層に添加し、５時間培養した。その後、照明箱上でウイルス性プラークを計数した。
【0282】
実施例１２．ｐＡｄ５ｐＴＰ発現プラスミドの製造
アデノウイルス第５型（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ５，Ａｄ５）のｐＴＰ遺伝子は、Ａｄ Ψ５ＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行って確保した：
アデノウイルス第５型（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ５，Ａｄ５）のｐＴＰ遺伝子は、Ａｄ Ψ５ＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行って確保した：
【0283】
【表16】
配列番号２２の配列目録のボールド体部分は、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトである。
【0284】
ＰＣＲは、４０サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１２０秒）行われた。ｐＡｄ５ｐＴＰ（配列番号７６）発現プラスミドの製造は、ＰＣＲ生成物を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、ｐＬＶ＿ＶＳＶＧ＿ＸＬをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素で切断して準備したｐＬＶ＿ＸＬプラスミドにクローニングすることで完成された。
【0285】
実施例１３．組換えＧＬＡｄの大量生産
組換えＧＬＡｄの大量生産には、既存ＧＬＡｄの生産に適用されて標準生産方法で提示されたことのある連続増幅方法を利用した。具体的に、１０ｕｇのｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺ（ＰａｃＩ制限酵素で線形化した後に熱不活性化）、３０ｕｇのｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ及び２．５ｕｇのｐＡｄ５ｐＴＰの混合物を、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞［５０～７０％合流性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）］にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染された細胞を回収し、１ｍｌの新しい培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕し、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス（Ｐ０段階ＧＬＡｄ）を収得した（ｒｅｓｃｕｅ）。増幅の最初段階（Ｐ１）では、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ ４５ｕｇ及びｐＡｄ５ｐＴＰ ３．７５ｕｇの混合物を、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５０～７０％合流性）にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を、Ｐ０段階のＧＬＡｄを含む新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染された細胞及び培地を回収し（この段階で、培養培地を‘ウイルス性培地’として保存する。）、形質感染された細胞を１ｍｌの新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕した（透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。ウイルス性細胞溶解物を収得してウイルス性培地（総１０ｍｌ）と混合し、次の段階の増幅（Ｐ２）のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１０×１５０ｍｍ培養皿に培養）を感染させるのに使用した（図３参照）。ＧＬＡｄの生産規模は、追加の増幅（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５など）によって増やすことができる。それぞれの増幅段階の流れ図、収得されたウイルスの力価（ｔｉｔｅｒ）、必要な細胞培養皿の数、必要なヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰプラスミドの量は、図３に詳細に示した。
組換えＧＬＡｄの大量生産には、既存ＧＬＡｄの生産に適用されて標準生産方法で提示されたことのある連続増幅方法を利用した。具体的に、１０ｕｇのｐＧＬＡｄ３＿ＬａｃＺ（ＰａｃＩ制限酵素で線形化した後に熱不活性化）、３０ｕｇのｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ及び２．５ｕｇのｐＡｄ５ｐＴＰの混合物を、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞［５０～７０％合流性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）］にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染された細胞を回収し、１ｍｌの新しい培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕し、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス（Ｐ０段階ＧＬＡｄ）を収得した（ｒｅｓｃｕｅ）。増幅の最初段階（Ｐ１）では、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ ４５ｕｇ及びｐＡｄ５ｐＴＰ ３．７５ｕｇの混合物を、１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５０～７０％合流性）にカルシウムホスフェート沈殿法を用いて形質感染した。培養６時間後に、培養培地（１０％ ＦＢＳ）を、Ｐ０段階のＧＬＡｄを含む新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に交替した。４８時間後に、形質感染された細胞及び培地を回収し（この段階で、培養培地を‘ウイルス性培地’として保存する。）、形質感染された細胞を１ｍｌの新しい培養培地（５％ ＦＢＳ）に再懸濁した後、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕した（透明な溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。ウイルス性細胞溶解物を収得してウイルス性培地（総１０ｍｌ）と混合し、次の段階の増幅（Ｐ２）のためにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１０×１５０ｍｍ培養皿に培養）を感染させるのに使用した（図３参照）。ＧＬＡｄの生産規模は、追加の増幅（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５など）によって増やすことができる。それぞれの増幅段階の流れ図、収得されたウイルスの力価（ｔｉｔｅｒ）、必要な細胞培養皿の数、必要なヘルパープラスミド及びｐＡｄ５ｐＴＰプラスミドの量は、図３に詳細に示した。
【0286】
実施例１４．ＧＬＡｄ生産中に生成されたアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物の増幅
ＧＬＡｄと違い、アデノウイルス及びＲＣＡは、ＨＥＫ２９３細胞において自ら複製可能である。したがって、Ａｄ．ＬａｃＺ（陽性対照群）又はＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（Ｐ３，３×１０９ＢＦＵ；Ｐ４又はＰ５，１×１０８ＢＦＵ）がＨＥＫ２９３細胞を感染した後、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺに存在可能な潜在的汚染物であるアデノウイルス及びＲＣＡが１段階増幅（Ｐ４又はＰ５である場合）又は３段階増幅、陽性対照群である場合には殆ど２段階増幅によって複製されるように許容した。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺのＭＯＩ（感染の多数性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））数値が高すぎてＬａｃＺが過発現すると、感染された細胞を死滅させることがあり、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（Ｐ３，３×１０９ＢＦＵ）の初期感染には２個の１５０ｍｍ細胞培養皿が使用された。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、Ｐ３、Ｐ４又はＰ５ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺの製造に使用し続くヘルパープラスミドを分解するために使用した（ヘルパープラスミドはＰＣＲベースの分析に必要な標的遺伝子を含んでいる。ただし、ウイルスカプシド皮内にパッケージングされるウイルスＤＮＡはベンゾナーゼに分解されない。）。ベンゾナーゼ処理がアデノウイルス及びＲＣＡの感染性自体に影響を及ぼすかどうかを確認するために、ベンゾナーゼは陽性対照群（Ａｄ．ＬａｃＺ）に対しても処理した。各増幅段階では、ＨＥＫ２９３細胞をそれに相応するウイルスで感染させた後、７２時間後に収得した。これらの細胞を１ｍｌ（１００ｍｍ培養皿の場合）又は２．５ｍｌ（１５０ｍｍ培養皿の場合）の体積で再懸濁し、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕した（粉砕された溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。各ウイルス性細胞溶解物を追加増幅に使用し、最終的に細胞溶解物及び培地を共に収得した。このような増幅過程において、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）は顕微鏡を用いて確認した（全手続きは、図４のａ及びｃを参照）。
ＧＬＡｄと違い、アデノウイルス及びＲＣＡは、ＨＥＫ２９３細胞において自ら複製可能である。したがって、Ａｄ．ＬａｃＺ（陽性対照群）又はＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（Ｐ３，３×１０９ＢＦＵ；Ｐ４又はＰ５，１×１０８ＢＦＵ）がＨＥＫ２９３細胞を感染した後、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺに存在可能な潜在的汚染物であるアデノウイルス及びＲＣＡが１段階増幅（Ｐ４又はＰ５である場合）又は３段階増幅、陽性対照群である場合には殆ど２段階増幅によって複製されるように許容した。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺのＭＯＩ（感染の多数性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ））数値が高すぎてＬａｃＺが過発現すると、感染された細胞を死滅させることがあり、ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（Ｐ３，３×１０９ＢＦＵ）の初期感染には２個の１５０ｍｍ細胞培養皿が使用された。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、Ｐ３、Ｐ４又はＰ５ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺの製造に使用し続くヘルパープラスミドを分解するために使用した（ヘルパープラスミドはＰＣＲベースの分析に必要な標的遺伝子を含んでいる。ただし、ウイルスカプシド皮内にパッケージングされるウイルスＤＮＡはベンゾナーゼに分解されない。）。ベンゾナーゼ処理がアデノウイルス及びＲＣＡの感染性自体に影響を及ぼすかどうかを確認するために、ベンゾナーゼは陽性対照群（Ａｄ．ＬａｃＺ）に対しても処理した。各増幅段階では、ＨＥＫ２９３細胞をそれに相応するウイルスで感染させた後、７２時間後に収得した。これらの細胞を１ｍｌ（１００ｍｍ培養皿の場合）又は２．５ｍｌ（１５０ｍｍ培養皿の場合）の体積で再懸濁し、凍結及び解凍サイクルを３回繰り返し行って粉砕した（粉砕された溶解物を‘ウイルス性細胞溶解物’と呼ぶ。）。各ウイルス性細胞溶解物を追加増幅に使用し、最終的に細胞溶解物及び培地を共に収得した。このような増幅過程において、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）は顕微鏡を用いて確認した（全手続きは、図４のａ及びｃを参照）。
【0287】
実施例１５．ＰＣＲを用いた汚染物アデノウイルス及びＲＣＡの分析
ＨＥＫ２９３細胞を用いた連続増幅（図４のａ及びｃ）の結果物として収得したサンプルを、まず、９５℃で１０分間熱処理した後［この段階を省略すると、ＨＥＫ２９３細胞の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）が、分析のためにさらにサンプルに含めた（ｓｐｉｋｅｄ）Ａｄ５ ＤＮＡを分解する。］、ＰＣＲ方法を用いて、ＧＬＡｄゲノム又はＨＥＫ２９３細胞には存在しないが、アデノウイルス及びＲＣＡには存在するｆｉｂｅｒ遺伝子のＮ末端ＤＮＡを分析した。ＰＣＲの陽性対照群としてはＡｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ、Ａｄ Ψ５ＤＮＡ）を用いた。Ａｄ．ＬａｃＺサンプルは、希釈前、又は５００個のウイルス粒子だけが含まれるように１００倍希釈した後、ＰＣＲを行った。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺサンプルは、スパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）Ａｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ）の存在又は不在下でＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素及び下記のプライマーセットを用いて４０サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒）行い、結果は、アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて分析した（図４のｂ及びｄ）：
ＨＥＫ２９３細胞を用いた連続増幅（図４のａ及びｃ）の結果物として収得したサンプルを、まず、９５℃で１０分間熱処理した後［この段階を省略すると、ＨＥＫ２９３細胞の内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）が、分析のためにさらにサンプルに含めた（ｓｐｉｋｅｄ）Ａｄ５ ＤＮＡを分解する。］、ＰＣＲ方法を用いて、ＧＬＡｄゲノム又はＨＥＫ２９３細胞には存在しないが、アデノウイルス及びＲＣＡには存在するｆｉｂｅｒ遺伝子のＮ末端ＤＮＡを分析した。ＰＣＲの陽性対照群としてはＡｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ、Ａｄ Ψ５ＤＮＡ）を用いた。Ａｄ．ＬａｃＺサンプルは、希釈前、又は５００個のウイルス粒子だけが含まれるように１００倍希釈した後、ＰＣＲを行った。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺサンプルは、スパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）Ａｄ５ ＤＮＡ（１０ｐｇ）の存在又は不在下でＰＣＲで増幅した。ＰＣＲは、Ｐｆｕ重合酵素及び下記のプライマーセットを用いて４０サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒）行い、結果は、アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて分析した（図４のｂ及びｄ）：
【0288】
【表17】
【0289】
実施例１６．ｐＧＬＡｄ４ゲノムプラスミドの製造
ｐＧＬＡｄ３には２個のＢｓｓＨＩＩ制限酵素サイトがある（図１４）。ｐＧＬＡｄ４（配列番号７７）は、ｐＧＬＡｄ３をＢｓｓＨＩＩ制限酵素で切断した後、自己結合して製造されるが、こうすると、長さが２６，５９７ｂｐ（ｐＧＬＡｄ３）から１６，３９２ｂｐ（ｐＧＬＡｄ４）ほど減少する。完了後に、生成物が正しく作製されたかどうかは、ＢｓｓＨＩＩ制限酵素サイトシーケンシングを用いて検証した。
ｐＧＬＡｄ３には２個のＢｓｓＨＩＩ制限酵素サイトがある（図１４）。ｐＧＬＡｄ４（配列番号７７）は、ｐＧＬＡｄ３をＢｓｓＨＩＩ制限酵素で切断した後、自己結合して製造されるが、こうすると、長さが２６，５９７ｂｐ（ｐＧＬＡｄ３）から１６，３９２ｂｐ（ｐＧＬＡｄ４）ほど減少する。完了後に、生成物が正しく作製されたかどうかは、ＢｓｓＨＩＩ制限酵素サイトシーケンシングを用いて検証した。
【0290】
実施例１７．ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）ｍｓｈＲ発現プラスミドの製造
十分によく作動すると確認されたｍｓｈＲ発現用鋳型は、以前の他の論文に既に記述されたことがある。この鋳型の保存的配列及び構造的特徴に基づき、相応するＤＮＡを合成し（表２１）、ＢａｍＨＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを用いてｐＧＴ２プラスミド（配列番号６３）にクローニングした。
十分によく作動すると確認されたｍｓｈＲ発現用鋳型は、以前の他の論文に既に記述されたことがある。この鋳型の保存的配列及び構造的特徴に基づき、相応するＤＮＡを合成し（表２１）、ＢａｍＨＩ制限酵素サイト及びＥｃｏＲＩ制限酵素サイトを用いてｐＧＴ２プラスミド（配列番号６３）にクローニングした。
【0291】
実施例１８．ｍｓｈＲによる内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ハンチンチン発現のノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）
１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれ、１５ｕｇのｐＧＴ２、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ１、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ２又はｐＧＴ２－ｍｓｈＲ３で形質感染した。４８時間後に、未処理対照群及び形質感染細胞を収得し、内因性ハンチンチン発現に対するウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析を行った。
１００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれ、１５ｕｇのｐＧＴ２、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ１、ｐＧＴ２－ｍｓｈＲ２又はｐＧＴ２－ｍｓｈＲ３で形質感染した。４８時間後に、未処理対照群及び形質感染細胞を収得し、内因性ハンチンチン発現に対するウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析を行った。
【0292】
実施例１９．ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いて製造した全細胞溶解物（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を、ＳＤＳゲルから分子量によって分離した後、ニトロセルロース膜に移した。この膜を、室温で１時間、Ｂｌｏｔｔｏ Ａ溶液（ＴＢＳＴ、５％牛乳）で遮断培養し、４℃で１次抗体（１：５００～１：１，０００）を含むＢｌｏｔｔｏ Ｂ溶液（ＴＢＳＴ、１％牛乳）に入れて一晩培養した。ＴＢＳＴ［ＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０；ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）］で５分間１回洗浄した後、ニトロセルロース膜を、ＨＲＰ接合２次抗体を含むＢｌｏｔｔｏ Ｂ溶液（１：５，０００～１：１００，０００）に入れて室温で２時間培養した。ＴＢＳＴで５分ずつ２回洗浄した後、膜にスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を短時間処理し、生成されたイメージをバイオイメージングシステム（Ｂｉｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。
ＲＩＰＡ溶解緩衝液を用いて製造した全細胞溶解物（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を、ＳＤＳゲルから分子量によって分離した後、ニトロセルロース膜に移した。この膜を、室温で１時間、Ｂｌｏｔｔｏ Ａ溶液（ＴＢＳＴ、５％牛乳）で遮断培養し、４℃で１次抗体（１：５００～１：１，０００）を含むＢｌｏｔｔｏ Ｂ溶液（ＴＢＳＴ、１％牛乳）に入れて一晩培養した。ＴＢＳＴ［ＴＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０；ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）］で５分間１回洗浄した後、ニトロセルロース膜を、ＨＲＰ接合２次抗体を含むＢｌｏｔｔｏ Ｂ溶液（１：５，０００～１：１００，０００）に入れて室温で２時間培養した。ＴＢＳＴで５分ずつ２回洗浄した後、膜にスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質溶液（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を短時間処理し、生成されたイメージをバイオイメージングシステム（Ｂｉｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）で分析した。
【0293】
実施例２０．ｐＧＬＡｄ４＿ＨＴＴｍｓｈＲ１／３の製造
ｐＣＭＶ、ｍｓｈＲ及びＢＧＨｐＡ部分を含むＨＴＴｍｓｈＲ１及びＨＴＴｍｓｈＲ３（図５のｄ）は、適切なプライマーセット（表２２）とｐＧＴ２－ｍｓｈＲ１又はｐＧＴ－ｍｓｈＲ３を鋳型とし、ＰＣＲで準備した（図５のｃ及びｄ）。ｐＧＬＡｄ４＿ＨＴＴｍｓｈＲ１／３の製造は、Ａｃｃ６５Ｉ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４にＨＴＴｍｓｈＲ１を、そしてＰｃｉＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４にＨＴＴｍｓｈＲ３を、ｉＨｏＡでそれぞれ挿入することによって完成した（図５のｆ）。その後、生成物が正しく作製されたかどうかは、Ａｃｃ６５Ｉ及びＰｃｉＩ制限酵素サイトの隣接領域シーケンシングで検証した。
ｐＣＭＶ、ｍｓｈＲ及びＢＧＨｐＡ部分を含むＨＴＴｍｓｈＲ１及びＨＴＴｍｓｈＲ３（図５のｄ）は、適切なプライマーセット（表２２）とｐＧＴ２－ｍｓｈＲ１又はｐＧＴ－ｍｓｈＲ３を鋳型とし、ＰＣＲで準備した（図５のｃ及びｄ）。ｐＧＬＡｄ４＿ＨＴＴｍｓｈＲ１／３の製造は、Ａｃｃ６５Ｉ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４にＨＴＴｍｓｈＲ１を、そしてＰｃｉＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４にＨＴＴｍｓｈＲ３を、ｉＨｏＡでそれぞれ挿入することによって完成した（図５のｆ）。その後、生成物が正しく作製されたかどうかは、Ａｃｃ６５Ｉ及びＰｃｉＩ制限酵素サイトの隣接領域シーケンシングで検証した。
【0294】
実施例２１．ｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３及びｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３の製造
Ｑ２２を含む全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）コドン最適化された合成ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）遺伝子（９．４ｋｂ）をそれぞれ、異なる配列方向にｐＢｅｓｔ４シャトルプラスミドにクローニングした。既に確立した標準手続きに従い、ＰｍｅＩ制限酵素で切断されたｐＢｅｓｔ４＿ｃｏＨＴＴ又はｐＢｅｓｔ４＿ｃｏＨＴＴ（Ｒ）を、ＣｌａＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４＿ＨＴＴｍｓｈＲ１／３と共に混合し、ｉＨｏＡを行った。このｉＨｏＡ過程によってｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３（配列番号７８）又はｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３が製造された。正しく製造されたかどうかは、シーケンシングで検証した。
Ｑ２２を含む全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）コドン最適化された合成ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）遺伝子（９．４ｋｂ）をそれぞれ、異なる配列方向にｐＢｅｓｔ４シャトルプラスミドにクローニングした。既に確立した標準手続きに従い、ＰｍｅＩ制限酵素で切断されたｐＢｅｓｔ４＿ｃｏＨＴＴ又はｐＢｅｓｔ４＿ｃｏＨＴＴ（Ｒ）を、ＣｌａＩ制限酵素で切断されたｐＧＬＡｄ４＿ＨＴＴｍｓｈＲ１／３と共に混合し、ｉＨｏＡを行った。このｉＨｏＡ過程によってｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３（配列番号７８）又はｐＧＬＡｄ４＿ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３が製造された。正しく製造されたかどうかは、シーケンシングで検証した。
【0295】
実施例２２．組換えＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３及びＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３ウイルスの生産
組換えＧＬＡｄ．ＬａｃＺ及びＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスの生産に用いられた手続きを同一に適用して生産した。
組換えＧＬＡｄ．ＬａｃＺ及びＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルスの生産に用いられた手続きを同一に適用して生産した。
【0296】
実施例２３．組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスの精製
組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスは、図３に示すように生産されたが、特に、Ｐ３から精製された。精製は、２種類のカラムベースのクロマトグラフィー方法を利用し、以前に報告された方法をやや変形して実施した。簡略にいうと、ウイルス性細胞溶解物及び収得した培養培地を混合し（Ｐ３）、ベンゾナーゼの処理後に濾過して、精製第１段階としてＱセファロースカラムクロマトグラフィー（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。洗浄後に、吸着されたウイルスを溶出し、緩衝液で希釈して亜鉛－キレートクロマトグラフィーカラム（Ｚｎ－ｃｈｅｌａｔｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）にローディングした。カラムを十分に洗浄した後、吸着されたウイルスを溶出した。製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）への緩衝液変更及びウイルスの濃縮は、ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて同時に行った。製剤緩衝液については、既に記述した通りである。
組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスは、図３に示すように生産されたが、特に、Ｐ３から精製された。精製は、２種類のカラムベースのクロマトグラフィー方法を利用し、以前に報告された方法をやや変形して実施した。簡略にいうと、ウイルス性細胞溶解物及び収得した培養培地を混合し（Ｐ３）、ベンゾナーゼの処理後に濾過して、精製第１段階としてＱセファロースカラムクロマトグラフィー（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。洗浄後に、吸着されたウイルスを溶出し、緩衝液で希釈して亜鉛－キレートクロマトグラフィーカラム（Ｚｎ－ｃｈｅｌａｔｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ）にローディングした。カラムを十分に洗浄した後、吸着されたウイルスを溶出した。製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）への緩衝液変更及びウイルスの濃縮は、ビバスピンターボ超微細濾過スピンカラム（Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔｕｒｂｏ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）を用いて同時に行った。製剤緩衝液については、既に記述した通りである。
【0297】
実施例２４．ＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルス粒子の測定
精製された組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスを、ウイルス溶解緩衝液［ｖｉｒｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ，０．１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］を用いて連続して希釈し、軽く振盪しながら５６℃で１０分間培養した。次に、ＯＤ２６０を測定し、下記式を用いてウイルス粒子濃度を計算した：
［式］
ウイルス粒子（ＶＰ／ｍｌ）＝ＯＤ２６０×ウイルス希釈因子（ｖｉｒｕｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）×（１．１×１０１２）
この計算において、ブランク溶液（ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、ウイルス溶解緩衝液及びウイルス製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の混合からなっている。吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、既に確立されたものを用いた：
［吸光係数］
ＯＤ２６０ １単位＝１．１×１０１２ＶＰ／ｍｌ
精製された組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスを、ウイルス溶解緩衝液［ｖｉｒｕｓ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ，０．１％ ＳＤＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］を用いて連続して希釈し、軽く振盪しながら５６℃で１０分間培養した。次に、ＯＤ２６０を測定し、下記式を用いてウイルス粒子濃度を計算した：
［式］
ウイルス粒子（ＶＰ／ｍｌ）＝ＯＤ２６０×ウイルス希釈因子（ｖｉｒｕｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）×（１．１×１０１２）
この計算において、ブランク溶液（ｂｌａｎｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、ウイルス溶解緩衝液及びウイルス製剤緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の混合からなっている。吸光係数（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）は、既に確立されたものを用いた：
［吸光係数］
ＯＤ２６０ １単位＝１．１×１０１２ＶＰ／ｍｌ
【0298】
実施例２５．動物実験
全ての動物実験は、慶北大学校（大邱、大韓民国）の動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＵＣＣ）が承認した手続き（ＫＮＵ２０１８－０１３４）にしたがって行った。８週齢雄野生型対照群マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ）及びジストロフィンノックアウトＭＤＸマウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＤＸ ｍｉｃｅ，Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ）を、１２時間の明暗周期（ｃｙｃｌｅ）下で飼育し、キョンブク大学校の大学動物施設規定に従って水は自由に提供した。ＭＤＸマウスの腓腹筋（ｆｏｃａｌ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）にＰＢＳ（ｎ＝３）又は５０ｕｌの組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルス（４×１０１０粒子）（ｎ＝３）を、筋肉内注射した。４週後、筋肉組織試料を生検して分析した。
全ての動物実験は、慶北大学校（大邱、大韓民国）の動物実験倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＵＣＣ）が承認した手続き（ＫＮＵ２０１８－０１３４）にしたがって行った。８週齢雄野生型対照群マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ）及びジストロフィンノックアウトＭＤＸマウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＤＸ ｍｉｃｅ，Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ－Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ）を、１２時間の明暗周期（ｃｙｃｌｅ）下で飼育し、キョンブク大学校の大学動物施設規定に従って水は自由に提供した。ＭＤＸマウスの腓腹筋（ｆｏｃａｌ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）にＰＢＳ（ｎ＝３）又は５０ｕｌの組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルス（４×１０１０粒子）（ｎ＝３）を、筋肉内注射した。４週後、筋肉組織試料を生検して分析した。
【0299】
実施例２６．免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）に対する免疫蛍光染色は、以前に報告された方法をやや変形して実施した。採取された筋肉組織を、４％ ＰＦＡを含むＰＢＳで４℃で一晩固定した。次に、組織を、５％砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むＰＢＳで４℃で６時間培養し、２０％砂糖を含むＰＢＳで４℃で一晩培養した。このように処理された組織をＯＣＴ混合物に埋め立て、液体窒素で冷却されたイソペンタン（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｅ）に浸漬して凍結させた後、零下７０℃で保管した。４マイクロン（ｍｉｃｒｏｎ）厚の断面に切った後、１０分間ＰＢＳに静置させた後、室温でＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で１０分ずつ３回洗浄した。組織切片を、１０％ウマ血清を含むＰＢＳＴで４℃で一晩遮断培養し、ジストロフィン抗体（遮断培養緩衝液に１：１００に希釈）と共に４℃で一晩培養した後、室温でＰＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。最後に、組織切片を４℃で一晩ＴＲＩＴＣ接合された２次抗体（遮断培養緩衝液に１：１００に希釈）と共に培養し、室温でＰＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。染色された組織切片を、ＤＡＰＩを含む封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）で覆った後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で分析した。
ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）に対する免疫蛍光染色は、以前に報告された方法をやや変形して実施した。採取された筋肉組織を、４％ ＰＦＡを含むＰＢＳで４℃で一晩固定した。次に、組織を、５％砂糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むＰＢＳで４℃で６時間培養し、２０％砂糖を含むＰＢＳで４℃で一晩培養した。このように処理された組織をＯＣＴ混合物に埋め立て、液体窒素で冷却されたイソペンタン（ｉｓｏｐｅｎｔａｎｅ）に浸漬して凍結させた後、零下７０℃で保管した。４マイクロン（ｍｉｃｒｏｎ）厚の断面に切った後、１０分間ＰＢＳに静置させた後、室温でＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で１０分ずつ３回洗浄した。組織切片を、１０％ウマ血清を含むＰＢＳＴで４℃で一晩遮断培養し、ジストロフィン抗体（遮断培養緩衝液に１：１００に希釈）と共に４℃で一晩培養した後、室温でＰＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。最後に、組織切片を４℃で一晩ＴＲＩＴＣ接合された２次抗体（遮断培養緩衝液に１：１００に希釈）と共に培養し、室温でＰＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。染色された組織切片を、ＤＡＰＩを含む封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）で覆った後、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で分析した。
【0300】
結果
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びｐＧＬＡｄゲノムプラスミドの製造、並びにＧＬＡｄ生産においてそれらの使用
現在、ヘルパーアデノウイルスとして最も広く用いられているのは、Ψパッケージング信号配列の両側にｌｏｘＰサイトを含んでいるものである（図１のａ）。この構造的特性によって、相同組換え酵素であるＣｒｅを発現させるパッケージング細胞において、このヘルパーアデノウイルスは、アデノウイルスに対する汚染を下げながらも組換えＧＬＡｄを効率的に生産可能にする。ただし、このような精巧な生産システムにおいてすらヘルパーアデノウイルスの汚染を防ぐことは不可能である。しかも、このシステムにおいてＲＣＡに関する綿密な分析がなされたことはないが、このシステムでは、ヘルパーアデノウイルスとパッケージング細胞との間に共通に存在するＥ１領域における相同組換えによってＲＣＡが生成されることがある。このため、本発明者は、相同組換えに関与する領域を除去し、ヘルパーアデノウイルスをヘルパープラスミドに転換させると、ＧＬＡｄ製造においてアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物が発生することを同時に防止できると仮定した。本発明者は、このような目標を達成するために、ＧＬＡｄパッケージングに必要なウイルスタンパク質を供給しながらも、活性アデノウイルス粒子に転換されることは不可能なためＲＣＡを生成させない、ヘルパープラスミドの製造を試みた。
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びｐＧＬＡｄゲノムプラスミドの製造、並びにＧＬＡｄ生産においてそれらの使用
現在、ヘルパーアデノウイルスとして最も広く用いられているのは、Ψパッケージング信号配列の両側にｌｏｘＰサイトを含んでいるものである（図１のａ）。この構造的特性によって、相同組換え酵素であるＣｒｅを発現させるパッケージング細胞において、このヘルパーアデノウイルスは、アデノウイルスに対する汚染を下げながらも組換えＧＬＡｄを効率的に生産可能にする。ただし、このような精巧な生産システムにおいてすらヘルパーアデノウイルスの汚染を防ぐことは不可能である。しかも、このシステムにおいてＲＣＡに関する綿密な分析がなされたことはないが、このシステムでは、ヘルパーアデノウイルスとパッケージング細胞との間に共通に存在するＥ１領域における相同組換えによってＲＣＡが生成されることがある。このため、本発明者は、相同組換えに関与する領域を除去し、ヘルパーアデノウイルスをヘルパープラスミドに転換させると、ＧＬＡｄ製造においてアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物が発生することを同時に防止できると仮定した。本発明者は、このような目標を達成するために、ＧＬＡｄパッケージングに必要なウイルスタンパク質を供給しながらも、活性アデノウイルス粒子に転換されることは不可能なためＲＣＡを生成させない、ヘルパープラスミドの製造を試みた。
【0301】
ヘルパーアデノウイルスを必要としない本発明者の組換えＧＬＡｄ生産システムには、２つの独立したプラスミドが必要である。その一つは、ＧＬＡｄパッケージングにおいてヘルパーの役割を担うヘルパープラスミドであり、もう一つは、ＧＬＡｄゲノムとして役割を担うゲノムプラスミドである。
【0302】
本発明者は、ヘルパープラスミドとしてｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲ（～３１ｋｂ）を製造した（図７）。このヘルパープラスミドは、重複転写単位（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ）及び単一プロモーターによって作られる複数の転写体（図１のｂ）のような特性を考慮し、Ａｄ５の誘導体（図７のａ）であるΨ５ゲノムを適切に加工することによって作製された。このヘルパープラスミドは、アデノウイルスパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に絶対的に必要なＩＴＲとΨパッケージング信号配列（図１のｃ）を一切持っていない。このため、このヘルパープラスミドはヘルパーとしてのみ機能するだけで、活性アデノウイルス粒子への転換は不可能である。このヘルパープラスミド作製過程のうち、５’ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列は、導入遺伝子のクローニングに用いられるシャトルプラスミドであるｐＢｅｓｔ（図７のｆ）に移された。
【0303】
本発明者は、ＧＬＡｄゲノムプラスミドとしてｐＧＬＡｄを製造した（図１のｃ）。このｐＧＬＡｄは、ラムダファージ（ｌａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ）に由来したスタッファーＤＮＡ（ｓｔｕｆｆｅｒ ＤＮＡ、単純に長さを合わせる目的で用いられるＤＮＡ）からなっているが、ここには２個のＡｄ５のＩＴＲのうち３’ＩＴＲだけが含まれている。スキャフォールドマトリックス付着要素（ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，ＳＭＡＲ）は、細胞内で導入遺伝子の発現を向上させながらＧＬＡｄゲノムを安定化する目的で追加された（全作製過程は図８を参照）。
【0304】
一般に、ｐＧＬＡｄゲノムプラスミド（～２７ｋｂ）のような大型プラスミドに導入遺伝子を挿入することは、時間がかかる他、成功することも難しい過程である。この過程を迅速で簡易に行うための目的で、ｐＢｅｓｔ及びｐＧＬＡｄプラスミドを製造しながらそれらのプラスミドに短い相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）を追加した。実際に、それらの相同ストレッチ部位は、ｐＢｅｓｔからｐＧＬＡｄに導入遺伝子発現カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を迅速に移動させることを可能にした。
【0305】
この過程に関して一例を挙げると、まず、ＬａｃＺ遺伝子をｐＢｅｓｔにクローニングした後、希少サイトを切断する制限酵素（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）であるＰｍｅＩを用いて線形化された（図９のａ）。同時に、ｐＧＬＡｄも同様に、唯一の制限酵素サイトであるＣｌａＩサイトで切断されて線形化された。線形化されたそれらのｐＢｅｓｔ＿ＬａｃＺ及びｐＧＬＡｄを混合し、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＤＮＡを一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）ＤＮＡに転換できる核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるエニィヒュージョン（ＡｎｙＦｕｓｉｏｎ）を処理すると、試験管内で線形化された相同領域が効率的にアニーリングされる（試験管内相同アニーリングに対する全過程を‘ｉＨｏＡ’という）（図９のｂ）。試験管内でアニーリングされた相同ストレッチ部位の長さは十分な程度に安定性を提供するので、修理されていないこの状態でも細菌性細胞を形質転換させるには何ら問題がない。このような過程の結果物として作られた組換えｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺプラスミドは、ＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を全て回復したし、ＩＴＲの外側の側面には、希少サイトを切断するＰａｃＩ制限酵素サイト（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ ＰａｃＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）が位置している（図９のｃ）。この全過程は、導入遺伝子発現カセットをｐＧＬＡｄゲノムプラスミドに移動させる上で迅速で効率的である。なお、形質転換段階では、希望する正しいｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺプラスミドを含む細菌性細胞は、所望しない種類のプラスミドを含む細菌性細胞よりも顕著に小さいサイズのコロニーを形成するという点が観察された（図１０のａ）。肉眼でも確認可能なこの特徴は、正しいクローン（ｃｌｏｎｅ）を見出すのに必要な選別過程を、非常に迅速に済ませるようにした（図１０のｂ～ｄ）。この全過程を完了した後、作製された組換えｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺプラスミドの相同ストレッチ部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）が連結された接合部をシーケンシングした。ヌクレオチドの配列は、相同ストレッチ部位と完壁に一致したが（図１１）、これは、ｉＨｏＡが当初設計の通りに作動したことを意味する。
【0306】
ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及び組換えｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺゲノムプラスミドの作製を完成した後、本発明者は、この両プラスミドに基づく組換えＧＬＡｄ生産システムが作動するかどうか試験した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素処理で線形化されたｐＧＬＡｄ＿ＬａｃＺゲノムプラスミドで共同形質感染した（図１のｄ及びｅ）。共同形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、組換えＧＬＡｄ．ＬａｃＺウイルスを成功的に生産したが（図１のｅ）、この結果は、組換えＧＬＡｄの生産に関連した全てのプラスミド及び工程が、当初設計の通りに完壁に作動したことを示す。
【0307】
新しいゲノムプラスミドであるｐＧＬＡｄ３の製造
興味深いことに、ＧＬＡｄに使用されるスタッファーＤＮＡの特性が導入遺伝子の発現に否定的な影響を及ぼすと報告されたことがある。論議の余地が完全に解消されたわけではないが、特に、ラムダファージに由来したスタッファーＤＮＡがこのような特性を有することを示した。それにも拘わらず、本発明者がこの発明を始めた初期には、ラムダＤＮＡをスタッファーとして使用するが、それは、プラスミド作製過程に対する設計が正しくなされたかを速かに確認し、ヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムも、設計された通りに作動するかを優先的に確認する必要があったためである。上述したように、ＧＬＡｄ生産システムが設計通りに作動することがもう確実に確認されたので、本発明者は、ラムダスタッファーＤＮＡが導入遺伝子の発現を減少させ得るとの恐れを解消する目的で、新しいスタッファーＤＮＡを準備した。本発明者は、マウスＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）イントロン２領域において複数個のゲノム断片をクローニングし（図１２のａ）、新しいＧＬＡｄゲノムプラスミドとしてｐＧＬＡｄ３を製造した（図２のａ及び図１２のｂ）。本発明者は、さらに他のクローニングシャトルプラスミドであるｐＢｅｓｔ４（図１２のｃ）も製造したが、この新規のｐＢｅｓｔ４には強力なＣＡＧプロモーター及びイントロンを追加することにより、性能をさらにアップグレードした。ｐＢｅｓｔ及びｐＧＬＡｄを用いる元来システムと同様に、ＬａｃＺ遺伝子で試験されたｐＢｅｓｔ４及びｐＧＬＡｄ３ベースのこの新しいシステムも同様、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）（図２のｂ）を示しながら組換えＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス（表１８、図２のｂ及びｃ）を効率的に生産したが、このような結果は、ｐＣＡＧ、イントロン、ｉＨｏＡ及びＧＬＡｄパッケージングのような要素、そしてＧＬＡｄ作製に関連した全手続きが設計通りに正しく作動したことを示す。これとは極めて対照的に、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミドで単独形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、いかなるウイルス性粒子も生産できなかった（表１８）。その上、本発明者の２種類－プラスミドベースの（ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ）システムによって生産された組換えＧＬＡｄは、アデノウイルス又はＲＣＡのような別のウイルスを一切含有していなかった（表１８）。したがって、本発明者のヘルパープラスミドは、単にＧＬＡｄパッケージングのためのヘルパー機能のみを提供するだけで、活性ウイルス粒子に転換されることはない点か明らかである。さらに、このような結果は、本発明者のヘルパープラスミドはＲＣＡを生成することがない点を意味するが（図１３）、これは、構造的特性（図２のｄ）に起因する。
興味深いことに、ＧＬＡｄに使用されるスタッファーＤＮＡの特性が導入遺伝子の発現に否定的な影響を及ぼすと報告されたことがある。論議の余地が完全に解消されたわけではないが、特に、ラムダファージに由来したスタッファーＤＮＡがこのような特性を有することを示した。それにも拘わらず、本発明者がこの発明を始めた初期には、ラムダＤＮＡをスタッファーとして使用するが、それは、プラスミド作製過程に対する設計が正しくなされたかを速かに確認し、ヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムも、設計された通りに作動するかを優先的に確認する必要があったためである。上述したように、ＧＬＡｄ生産システムが設計通りに作動することがもう確実に確認されたので、本発明者は、ラムダスタッファーＤＮＡが導入遺伝子の発現を減少させ得るとの恐れを解消する目的で、新しいスタッファーＤＮＡを準備した。本発明者は、マウスＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）イントロン２領域において複数個のゲノム断片をクローニングし（図１２のａ）、新しいＧＬＡｄゲノムプラスミドとしてｐＧＬＡｄ３を製造した（図２のａ及び図１２のｂ）。本発明者は、さらに他のクローニングシャトルプラスミドであるｐＢｅｓｔ４（図１２のｃ）も製造したが、この新規のｐＢｅｓｔ４には強力なＣＡＧプロモーター及びイントロンを追加することにより、性能をさらにアップグレードした。ｐＢｅｓｔ及びｐＧＬＡｄを用いる元来システムと同様に、ＬａｃＺ遺伝子で試験されたｐＢｅｓｔ４及びｐＧＬＡｄ３ベースのこの新しいシステムも同様、細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ）（図２のｂ）を示しながら組換えＧＬＡｄ３．ＬａｃＺウイルス（表１８、図２のｂ及びｃ）を効率的に生産したが、このような結果は、ｐＣＡＧ、イントロン、ｉＨｏＡ及びＧＬＡｄパッケージングのような要素、そしてＧＬＡｄ作製に関連した全手続きが設計通りに正しく作動したことを示す。これとは極めて対照的に、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミドで単独形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、いかなるウイルス性粒子も生産できなかった（表１８）。その上、本発明者の２種類－プラスミドベースの（ｔｗｏ－ｐｌａｓｍｉｄ－ｂａｓｅｄ）システムによって生産された組換えＧＬＡｄは、アデノウイルス又はＲＣＡのような別のウイルスを一切含有していなかった（表１８）。したがって、本発明者のヘルパープラスミドは、単にＧＬＡｄパッケージングのためのヘルパー機能のみを提供するだけで、活性ウイルス粒子に転換されることはない点か明らかである。さらに、このような結果は、本発明者のヘルパープラスミドはＲＣＡを生成することがない点を意味するが（図１３）、これは、構造的特性（図２のｄ）に起因する。
【0308】
ＧＬＡｄの大量生産（ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）
ＧＬＡｄ大量生産において、既に確立された最適化された標準生産方法は、一連の増幅過程を伴う（図３のａ）。ＧＬＡｄは、ヘルパーアデノウイルスの存在下でのみ増幅可能なため、この標準生産方法では、増幅段階が進行する度に新しくヘルパーアデノウイルスを添加しなければならない。シードＧＬＡｄ（ｓｅｅｄ ＧＬＡｄ）は、４～６回反復して増幅され、大量培養された細胞（～１×１０９細胞）を用いて最終的に増幅される。全増幅過程を通じて～１×１０１２ＢＦＵ［～１，０００ＢＦＵ／ｃｅｌｌ；ＢＦＵは、ＬａｃＺ染色によって確認された青色形成単位（ｂｌｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）を意味する。］程度は容易に生産可能である。このようにＧＬＡｄを比較的高い収率で得ることは、ＧＬＡｄパッケージング及び増幅に必要なウイルスタンパク質を十分な量で供給する、自ら複製可能なヘルパーアデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を利用するためである。
ＧＬＡｄ大量生産において、既に確立された最適化された標準生産方法は、一連の増幅過程を伴う（図３のａ）。ＧＬＡｄは、ヘルパーアデノウイルスの存在下でのみ増幅可能なため、この標準生産方法では、増幅段階が進行する度に新しくヘルパーアデノウイルスを添加しなければならない。シードＧＬＡｄ（ｓｅｅｄ ＧＬＡｄ）は、４～６回反復して増幅され、大量培養された細胞（～１×１０９細胞）を用いて最終的に増幅される。全増幅過程を通じて～１×１０１２ＢＦＵ［～１，０００ＢＦＵ／ｃｅｌｌ；ＢＦＵは、ＬａｃＺ染色によって確認された青色形成単位（ｂｌｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）を意味する。］程度は容易に生産可能である。このようにＧＬＡｄを比較的高い収率で得ることは、ＧＬＡｄパッケージング及び増幅に必要なウイルスタンパク質を十分な量で供給する、自ら複製可能なヘルパーアデノウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）を利用するためである。
【0309】
ヘルパープラスミドを用いてＧＬＡｄを大量生産しようとする試みにおいて、本発明者は、ヘルパープラスミドがＧＬＡｄパッケージング細胞内で自ら複製ができないにもかかわらず、ＧＬＡｄ大量生産に用いられる既存の標準増幅手続きを適用した。本発明者は、既にヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素で線形化されたＧＬＡｄゲノムプラスミドを同時に形質感染させ、シードＧＬＡｄ（～２×１０７ＢＦＵ／１００ｍｍ培養皿）を生産できることを示したことがある（表１８）。このシードＧＬＡｄは、ヘルパープラスミドによって容易に増幅されたし、増幅効率が最適化されていないにもかかわらず、増幅されるＧＬＡｄの量は、増幅段階に比例して増大した（データは示さない。）。
【0310】
他の研究者らが実施した以前の研究において、Ｅ１Ａ、ｐＴＰ及びＩＶａ２のようなアデノウイルスタンパク質を個別に又は組み合わせてさらに発現させる場合に、アデノウイルス生産が増大するということが確認されたことがある。そこで、本発明者は、ＧＬＡｄ生産においても増幅効率を上げる目的で、それらのアデノウイルスタンパク質を個別に又は組み合わせて試験してみた。それらのうち、単に末端タンパク質前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐＴＰ）だけが、さらに発現する場合に、最大４倍までＧＬＡｄ生産量を増加させた（データは示さない。）。また、本発明者は、以前の実験に比べてより多量のヘルパープラスミド（１００ｍｍ培養皿において３０ｕｇよりは４５ｕｇ）を使用すると、ＧＬＡｄ生産においてより高い収率が得られることを確認した（Ｐ０ではそうでないが、Ｐ１及びそれ以降の増幅ではそうである；データは示さない。）。
【0311】
ヘルパーアデノウイルスを用いる既存の増幅手続きと類似に、それぞれの増幅段階において、ｐＡｄＢｅｓｔ＿ｄＩＴＲヘルパープラスミド及びｐＴＰ－発現プラスミドを共同にＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞に形質感染させた。最適化により、本発明者はヘルパープラスミドを用いてＧＬＡｄを大量生産できる標準工程を成功的に確立した（図３のｂ）。Ｐ３は、容易に５×１０１０～１×１０１１ＢＦＵ（５０～１００ＢＦＵ／ｃｅｌｌ）程度を生産するが、これは、自ら複製可能なヘルパーアデノウイルスを使用する既存の大量生産方法に比べて１０～２０倍程度しか低くない収率である（すなわち、自ら複製可能なヘルパーアデノウイルスを用いる既存の方法：ヘルパープラスミドを用いる新しい方法＝１×１０１１～２×１０１１ＢＦＵ：１×１０１０ＢＦＵ）。この計算によれば、Ｐ５は、１×１０１１細胞から５×１０１２～１×１０１３ＢＦＵ程度を生産すると予想される。
【0312】
ＧＬＡｄ生産中にアデノウイルス及びＲＣＡ汚染物の生成はない
ＧＬＡｄ生産においてアデノウイルス及びＲＣＡ汚染を防止することは、ＧＬＡｄの臨床的適用を考慮する上で非常に重要な要素である。本発明者は、ヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素で線形化されたＧＬＡｄゲノムプラスミドを共同に形質感染させることによってＧＬＡｄを生産できるということ、及び３回にわたる独立したＧＬＡｄ生産のうちいずれもアデノウイルス及び／又はＲＣＡを含まないこと、を既に示したことがある（表１８）。それにも拘わらず、本発明者は、規模面において十分に大きいことから、将来、臨床的に使用される可能性があるＧＬＡｄサンプル（Ｐ３、Ｐ４又はＰ５）において（図３）アデノウイルスとＲＣＡをより詳細に再び分析してみた。
ＧＬＡｄ生産においてアデノウイルス及びＲＣＡ汚染を防止することは、ＧＬＡｄの臨床的適用を考慮する上で非常に重要な要素である。本発明者は、ヘルパープラスミド及びＰａｃＩ制限酵素で線形化されたＧＬＡｄゲノムプラスミドを共同に形質感染させることによってＧＬＡｄを生産できるということ、及び３回にわたる独立したＧＬＡｄ生産のうちいずれもアデノウイルス及び／又はＲＣＡを含まないこと、を既に示したことがある（表１８）。それにも拘わらず、本発明者は、規模面において十分に大きいことから、将来、臨床的に使用される可能性があるＧＬＡｄサンプル（Ｐ３、Ｐ４又はＰ５）において（図３）アデノウイルスとＲＣＡをより詳細に再び分析してみた。
【0313】
陽性対照群として使用されたアデノウイルス（Ａｄ．ＬａｃＺ）は、ＨＥＫ２９３細胞において効率的に増幅された（図４のａ）。ただ１個の感染性ウイルス粒子（１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ，１ＢＦＵ）においても、完全に２回に至らない増幅段階によって～５×１０５ＢＦＵを生成した。この強力な増幅活性により、アデノウイルスは、肉眼でも容易に観察可能な深刻なＣＰＥを誘発した。この結果は、ＧＬＡｄサンプルに１個の感染性アデノウイルス（又はＲＣＡ）汚染物粒子でも存在すれば、数回の増幅段階だけで数え切れないほど多いウイルス粒子が生成し得ることを示唆する。そこで、本発明者は、３×１０９ＢＦＵを含むＰ３ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺ（図３）を分析した（図４のａ）。ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺをＨＥＫ２９３細胞に感染させた後、万一このサンプル内にアデノウイルス及びＲＣＡが存在すると、それらが十分に生成され得るように３回にわたって増幅した。この増幅条件は、１ ＢＦＵが５×１０５ＢＦＵ以上を生成するのに十分であるので、３番目の増幅段階ではＨＥＫ２９３細胞に深刻なＣＰＥを招くことがある。しかし、このような増幅過程でＣＰＥは全く観察されなかった。同様に、ＰＣＲベース分析でも何らアデノウイルス種（アデノウイルス及びＲＣＡ）も検出することができなかった（図４のｂ）。本発明者のかかる一連の実験結果は、Ｐ３ ＧＬＡｄ（少なくとも３×１０９ＢＦＵを含む）サンプルが、アデノウイルス及び／又はＲＣＡ汚染物を含んでいないということを示す。
【0314】
さらに、本発明者は、Ｐ４及びＰ５ ＧＬＡｄ３．ＬａｃＺサンプル（それぞれ１×１０８ＢＦＵを含んでいる）においてもアデノウイルス及びＲＣＡ汚染が存在するかを分析した。まず、先に示したように（図３）、Ｐ３及びＰ４ ＧＬＡｄを用いてそれぞれＰ４及びＰ５ ＧＬＡｄを準備した。ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）は、ヘルパープラスミドは効果的に除去するが、カプシドで保護されるアデノウイルス又はＲＣＡは除去できないものの、まず、ベンゾナーゼで前処理されたＰ４又はＰ５ ＧＬＡｄ（Ｐ４サンプルはＰ３から１回増幅して準備し、Ｐ５サンプルはＰ３から２回増幅して準備する。）をＨＥＫ２９３細胞に感染させ、さらに増幅することにより、潜在的に存在するかもしれないアデノウイルス及びＲＣＡが増幅され得るようにした（図４のｃ）。前のＰ３ ＧＬＡｄから既に確認したように、Ｐ４及びＰ５からも、ＰＣＲ分析でアデノウイルス種（アデノウイルス及びＲＣＡ）を検出することはできなかった（図４のｄ）。本発明者が得た結果をまとめると、ヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムは、不所望の汚染物であるアデノウイルス及び／又はＲＣＡを一切生成させないということが明らかである。
【0315】
効率的な試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子伝達ベクターとしての新しいＧＬＡｄ
上に言及した全てのものが成功的に作動したので、次に、本発明者は、組換えＧＬＡｄが試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実際に遺伝子伝達をよく行うかどうか試験してみた。そのために、本発明者は、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ，９．４ｋｂ）及びジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ，１１ｋｂ）を標的導入遺伝子として選定したが、その理由は、他のウイルスベクターはこのような長い遺伝子を伝達することが非常に難しく、また、遺伝子治療法がそれらの遺伝子と関連した疾患［ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）］において治療選択肢として長い間追求されてきたためである。
上に言及した全てのものが成功的に作動したので、次に、本発明者は、組換えＧＬＡｄが試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実際に遺伝子伝達をよく行うかどうか試験してみた。そのために、本発明者は、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ，９．４ｋｂ）及びジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ，１１ｋｂ）を標的導入遺伝子として選定したが、その理由は、他のウイルスベクターはこのような長い遺伝子を伝達することが非常に難しく、また、遺伝子治療法がそれらの遺伝子と関連した疾患［ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）］において治療選択肢として長い間追求されてきたためである。
【0316】
ウイルス粒子内によくパッケージングされるには、ＧＬＡｄゲノムサイズは、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまでにおいて長さが元来ゲノムサイズの７５％～１０５％に相当する、２７ｋｂ～３７．８ｋｂの範囲に属さなければならない。したがって、本発明者は、長い遺伝子をｐＧＬＡｄ３ゲノムプラスミドに挿入する場合、ゲノム長がウイルスパッケージングの上限に近づく問題のため、まず、ｐＧＬＡｄ３の長さを減らすためにｐＧＬＡｄ３をｐＧＬＡｄ４に転換した（図１４）。
【0317】
優性に遺伝するハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）においてポリ－ＣＡＧ（グルタミンを指定するコドン）が反復して拡張することによって発病する致命的な退行性神経疾患である。ハンチントン病患者は、このような突然変異遺伝子１コピー（ｃｏｐｙ）を有し、そのため、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉによって突然変異ハンチンチン発現が抑制される場合に、疾病状態は改善され得る。重要なのは、ハンチンチンが成人神経細胞で果たす正常な機能はまだよく知られていないが、初期胚芽発達では必須であるという点である（ハンチンチンノックアウトマウスは胚芽段階で死亡する）。また、正常機能を有する野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）ハンチンチンの過発現は、突然変異ハンチンチンの細胞毒性を減少させることが見られた。このような結果は、ハンチンチン遺伝子だけを単独で伝達する方よりは、ＲＮＡｉ及びハンチンチン遺伝子を同時に伝達する方が、ハンチントン病治療と関連した治療効果評価において、より適切な組換えＧＬＡｄになり得ることを示唆する。
【0318】
ＲＮＡｉの場合、本発明者は、ハンチンチン発現抑制のために、従来のｓｈＲＮＡの代わりにｍｉＲＮＡベースｓｈＲＮＡ（以下、ｍｓｈＲｓ）を選択したが、これは、ハンチンチンのノックダウンにおいてｍｓｈＲがｓｈＲＮＡよりも個体に安全なものとして立証されたためである。本発明者は、以前の別の研究から確実に作動するものと既に確認された３個の標的サイト（図５のａ）を選択し、合成ｍｓｈＲ（図５のｂ、表２１）及びｐＧＴ２プラスミド（図５のｃ）を用いてｍｓｈＲ発現体を製造した。予想したとおり、それらの各発現体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染させた結果、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ハンチンチン発現が減少した（図５のｄ）。したがって、適切なプライマーセット（表２２）を用いたＰＣＲを用いて、ｍｓｈＲ１及びｍｓｈＲ３を発現させることができる２個のｍｓｈＲ発現カセットをｐＧＬＡｄ４ゲノムプラスミドに挿入した。ハンチンチン遺伝子の場合には、ポリ－ＣＡＧ反復が、野生型及び突然変異ハンチンチン遺伝子において唯一の差異点であるということを考慮しなければならなかった。したがって、ノックダウン接近法は、内因性野生型及び突然変異ハンチンチンタンパク質の両方の発現を同時に減少させることができる。したがって、本発明者は、内因性野生型ハンチンチンの発現が減少することによって発生し得るいずれか不所望の毒性に対する心配を緩和する目的で、内因性野生型ハンチンチンの減少量を補充するべく、ｍｓｈＲがその発現に影響を及ぼさないようにコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子を利用した（図５のｅ）。本発明者は、ｉＨｏＡを用いて、ｍｓｈＲ１及びｍｓｈＲ３発現カセットが既に挿入されているｐＧＬＡｄ４ゲノムプラスミドに、異なる配列方向にコドン最適化された合成遺伝子発現カセットを成功的に挿入した（図５のｆ）。続いて、組換えＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３（図５のｇ）及びＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３ウイルスを生産した。
【0319】
ＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３ウイルスはハンチンチンを過発現させたのに対し、ＧＬＡｄ４．ｃｏＨＴＴ（Ｒ）．ＨＴＴｍｓｈＲ１／３ウイルスは内因性ハンチンチンの発現を抑制した（図５のｈ）。本発明者のこのような研究結果は、組換えＧＬＡｄがｍｓｈＲとコドン最適化された合成ハンチンチン遺伝子（総長は、～１３ｋｂ）を同時に細胞に伝達することに成功したことを示している（図５のｉ）。この組換えＧＬＡｄは、ハンチントン病治療のための遺伝子治療法として利用可能な潜在性があり、現在、臨床適用のためのさらなる研究が行われている。
【0320】
本発明者は、ハンチンチン遺伝子のような長い遺伝子を伝達する組換えＧＬＡｄの他にも、因子ＩＸ［ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、血友病Ｂ（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ）の治療のためのＲ３３８Ｌ Ｐａｄｕａ突然変異体遺伝子］、グルコセレブロシダーゼ［ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ，ＧＣＲ、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療のための遺伝子］、ヘクソサミニダーゼＡ［ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ Ａ，ＨＥＸＡ、テイザックス病（Ｔａｙ－Ｓａｃｈｓ）の治療のための遺伝子］、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１［ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １，ＨＰＲＴ１、レッシュナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙｈａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、イズロネート－２－スルファターゼ［ｉｄｕｒｏｎａｔｅ－２－ｓｕｌｆａｔａｓｅ，ＩＤＳ、ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］、メチル－ＣｐＧ－結合タンパク質２［ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，ＭＥＣＰ２、レット症候群（Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の治療のための遺伝子］及び運動ニューロン１生存因子［ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ １，ＳＭＮ１、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，ＳＭＡ）の治療のための遺伝子］のような、長さの短い導入遺伝子に対する組換えＧＬＡｄも成功的に構築した。これらの各組換えＧＬＡｄは試験管内で導入遺伝子を効率的に過発現させることが確認され（データは示さない。）、現在、それらの臨床適用可能性に対する検証を行っている。
【0321】
生体内研究は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，ＤＭＤ）の標的であるジストロフィン遺伝子（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ，～１１ｋｂ）を伝達する組換えＧＬＡｄを生産して実施した。まず、ヒトジストロフィン遺伝子をｐＢｅｓｔ４にクローニングし、ｉＨｏＡを用いて組換えｐＧＬＡｄ４＿Ｄｙｓプラスミドを製造した後、組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスを生産した（図６のａ）。その後、ＧＬＡｄ４．ＤｙｓウイルスをジストロフィンノックアウトＭＤＸマウス（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ－ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＭＤＸ ｍｉｃｅ）の腓腹筋（ｆｏｃａｌ ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）に注射した。４週後（図６のｂ）、注射部位の筋肉組織を生検し、ジストロフィン発現の有無を分析した（図６のｃ）。これにより、組換えＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスが標的組織においてジストロフィンを発現させるという事実を明らかに確認できた。疾病状態に対する改善を確認することはできなかったが（ヒトと違い、ＭＤＸマウスは疾病の徴候を示さない。）、本発明者のこのような結果は、ＧＬＡｄ４．Ｄｙｓウイルスが少なくとも４週間は標的組織においてジストロフィン発現を維持するという点を示す。
【0322】
考察
遺伝子治療法に使用される理想的な生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子伝達ベクターは、宿主ゲノムに無作為に挿入されないこと（挿入突然変異誘発に対する恐れを払拭する。）、ウイルスタンパク質発現がないこと［ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ウイルスゲノムを必要とすることにより宿主免疫反応を最小限に下げる。］、広範囲な細胞及び組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有すること、導入遺伝子伝達において高い形質導入効率を示すこと、及び如何なる導入遺伝子も伝達可能な程度の大きい受容能力を有すること、などのような特性を有するように推奨される。現在、利用可能な多くの遺伝子伝達ベクターのうち、ＧＬＡｄは、実際にこのような推奨特性を全て有する唯一のベクターであるといえる。にもかかわらず、こういう特性を全て揃えたＧＬＡｄがいままで動物における研究にのみ使用され、臨床には使用されたことがないため臨床データが存在しないという点は、非常に驚くべきことである。予想を覆すこのような結果は、既存ＧＬＡｄの生産工程においてパッケージング及び以降の増幅過程ではヘルパーとして必須であるが、生産工程の最後には汚染物として残るアデノウイルスと関連した安全性問題のためだと見なされる。ＧＬＡｄの臨床的使用のために克服すべき更なる障害物は、既存ＧＬＡｄの生産過程中に、又はヘルパーアデノウイルスの大量生産過程中に生成されるＲＣＡ汚染である。
遺伝子治療法に使用される理想的な生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子伝達ベクターは、宿主ゲノムに無作為に挿入されないこと（挿入突然変異誘発に対する恐れを払拭する。）、ウイルスタンパク質発現がないこと［ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）ウイルスゲノムを必要とすることにより宿主免疫反応を最小限に下げる。］、広範囲な細胞及び組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有すること、導入遺伝子伝達において高い形質導入効率を示すこと、及び如何なる導入遺伝子も伝達可能な程度の大きい受容能力を有すること、などのような特性を有するように推奨される。現在、利用可能な多くの遺伝子伝達ベクターのうち、ＧＬＡｄは、実際にこのような推奨特性を全て有する唯一のベクターであるといえる。にもかかわらず、こういう特性を全て揃えたＧＬＡｄがいままで動物における研究にのみ使用され、臨床には使用されたことがないため臨床データが存在しないという点は、非常に驚くべきことである。予想を覆すこのような結果は、既存ＧＬＡｄの生産工程においてパッケージング及び以降の増幅過程ではヘルパーとして必須であるが、生産工程の最後には汚染物として残るアデノウイルスと関連した安全性問題のためだと見なされる。ＧＬＡｄの臨床的使用のために克服すべき更なる障害物は、既存ＧＬＡｄの生産過程中に、又はヘルパーアデノウイルスの大量生産過程中に生成されるＲＣＡ汚染である。
【0323】
広く使用される複製不能１世代（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｆｉｒｓｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）アデノウイルスは免疫原性が非常に高いため（ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）、宿主にとって細胞毒性を誘発することがある。したがって、このウイルスは、抗癌療法のための遺伝子伝達ベクターとして広く用いられているが、このような高い免疫原性は、免疫増強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）としての機能を提供するので、このウイルスベクターによって伝達された抗癌遺伝子と協力する場合には、腫瘍組織をより効果的に除去できるわけである。これと対照的に、アデノウイルスは、遺伝子治療法、特に、長時間にわたって導入遺伝子発現を要求する遺伝疾患の治療では好ましくないことがあるが、これは、アデノウイルスに対する宿主の免疫反応が患者にとって導入遺伝子発現を下げたり短期に終わらせたりすることがあり、また、毒性も誘発することがあるためである。これらの点を勘案すると、既存の方式のうち技術的に最も優れているとされるヘルパーアデノウイルスベースＧＬＡｄ生産システムにおいてすら、アデノウイルス汚染に対する最上の結果が０．０１％、すなわち、全体１×１０１０のうち１×１０６の粒子が汚染物アデノウイルス粒子であるという点は、極めて注目する必要がある。
【0324】
安全性問題に関しては、複製不能である１世代アデノウイルス（ＧＬＡｄ生産に使用されるヘルパーアデノウイルスは、一般に１世代アデノウイルスである。）に比べてＲＣＡがより危険である。Ｅ１が消失しており、ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなＥ１発現パッケージング細胞でのみ複製可能な１世代アデノウイルスとは違い、ＲＣＡは、感染後に何ら細胞でも自律で複製できる複製可能アデノウイルスであるためである。特に、免疫が抑制された（又は、免疫が弱化した）状態にある患者に、ＲＣＡで汚染された遺伝子治療剤を用いて遺伝子治療法を実施する場合に、ＲＣＡはその自体で容易に複製可能なため、患者に致命的な毒性を招くことがある。しかも、ＲＣＡから発現したＥ１タンパク質は、Ｅ１欠乏による複製不能であるアデノウイルスのＥ１欠乏を補完することにより、この複製不能アデノウイルスの強力な複製／増幅を支援することがある。このため、米国食品医薬局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）はＲＣＡを厳格に統制しており、臨床に使用されるアデノウイルス生産単位（ｂａｔｃｈ）ごとにＲＣＡ粒子を定量することを要求し（ＧＬＡｄにも同様の規定を適用すると見なされる。）、１回投与容量において３×１０１０アデノウイルス粒子につき１個以下に感染性ＲＣＡが維持されるように規定している。したがって、ＧＬＡｄを治療目的で使用するには、治療目的のＡＡＶ生産標準手続きである３種類のプラスミドを用いた生産システムから立証されたように、ヘルパーアデノウイルスを新しいヘルパーに替え、アデノウイルス及びＲＣＡ汚染物に対する恐れが全くない新しいＧＬＡｄ生産システムを構築しなければならないという点は明らかである。
【0325】
本発明において、発明者は、ＧＬＡｄ生産のための新規のヘルパープラスミドを初めて報告している。本発明者のヘルパープラスミドは、ウイルスパッケージングに必須に要求されるＩＴＲ及びΨパッケージング信号配列を一切に含んでいない。また、ヘルパーアデノウイルスと違い、本発明者のヘルパープラスミドは、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３ＴのようなＧＬＡｄパッケージング細胞で発生し得る相同組換えと関連して、アデノウイルス５型（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５）の相同領域［ヌクレオチド３０３４～５０１５（１４８２ｂｐ）、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣ＿０００００８］部分を１個のみを含んでいる。このような構造的特性は、ヘルパープラスミドが感染性を持つウイルス粒子に転換される可能性を完全に除去する他、ＧＬＡｄ生産過程においてＲＣＡの生成も根本的に遮断する。実際に、本発明者は、大量生産されたＧＬＡｄではもとより、連続増幅によって生産された後段階（ｈｉｇｈ－ｐａｓｓａｇｅ）ＧＬＡｄでもアデノウイルスやＲＣＡ汚染物を検出することができなかった。本発明者が得たこのような結果は、本発明者が完成した新規のヘルパープラスミドベースのＧＬＡｄ生産システムは、アデノウイルス及びＲＣＡ汚染無しで標的組換えＧＬＡｄのみを生産することにより、それらの汚染物ウイルスから提起される安全性問題に対する恐れを顕著に減らし得ることを明確に示しているといえる。
【0326】
たとえ本発明者のヘルパープラスミドはＧＬＡｄパッケージング細胞において自ら複製することはできないとしても、相当な量の組換えＧＬＡｄ生産に要求されるＧＬＡｄパッケージング及び追加の増幅に必要な、十分のレベルのヘルパー機能を提供するには問題がなさそうである。ＧＬＡｄの大量生産において、本発明者のシステムが、既存のヘルパーアデノウイルスベースのシステムに比べて効率性にやや劣ることは事実である。それにも拘わらず、本発明者は、本発明者のシステムを用いてＧＬＡｄを大量生産するに何ら困難がなかった。治療用医薬品を開発するには、一般に、生産収率よりも安全性が遥かに重要である。このような点に鑑みると、本発明者のＧＬＡｄシステムが示している生産収率に関連してのやや不利な短所は、本発明者のＧＬＡｄ生産システムが持つ様々な安全性に関連しての長所によって十分に打ち消されるといえる。
【0327】
本発明者の組換えＧＬＡｄは、種々の導入遺伝子を試験管内及び生体内に効率的に伝達した。実際に、本発明者のＧＬＡｄは、ハンチンチン遺伝子（９．４ｋｂ）、ジストロフィン遺伝子（１１ｋｂ）、又はハンチンチン遺伝子及び２個のｍｓｈＲを含む複合発現カセット（総長、～１３ｋｂ）のような長い長さの遺伝子を効率的に伝達した。多くの研究において遺伝子伝達ベクターとしてＡＡＶを用いたジストロフィン遺伝子伝達が試みられたが、それらの研究はいずれも、ＡＡＶのパッケージング容量を超える全長ジストロフィン遺伝子ではなく、それの小さいバージョンであるミニジストロフィン又はマイクロジストロフィン遺伝子にのみフォーカスしたものであった。ハンチンチン遺伝子及び２個のｍｓｈＲを含む複合発現カセットをＧＬＡｄを用いて成功的に伝達したことは、ハンチントン病治療と関連して可能性ある治療法として試みられた初めての例示であるという点でその重要性はごく大きい。これらの例は、遺伝子伝達においてＧＬＡｄ固有の特性、特に、長い長さの遺伝子伝達と関連した多能性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）側面をよく示している。
【0328】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）に試みられる遺伝子治療法においてウイルスベクターを使用することは、諸刃の剣のようである。ウイルスベクターは導入遺伝子を相対的にごく効率的に伝達するが、反面、宿主にとって毒性を誘発することがある。ＡＡＶ及びＧＬＡｄのようなガットレスウイルスベクターは、ゲノム骨格に如何なるウイルス遺伝子も含んでいないため、ウイルスタンパク質を発現させる他のウイルスベクターよりは遥かに安全である。それにも拘わらず、高容量で深刻な急性毒性を示したＡＡＶから確認されたように、これらのベクターのカプシドタンパク質が誘発する毒性まで防ぐことはできない。しかし、免疫原性の高いアデノウイルス種で汚染されていないＧＬＡｄを利用するか、或いはＧＬＡｄベクターによって導入遺伝子が肝で発現するように（ＧＬＡｄ－ｂａｓｅｄ ｌｉｖｅｒ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）バルーン閉塞カテーテル媒介手術（ｂａｌｌｏｏｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｃａｔｈｅｔｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）のような安全な伝達技法を活用すれば、顕著に少ない量のＧＬＡｄを投与して済むので、ウイルスのカプシドタンパク質によって触発する毒性に対する恐れを相当減少させることはできるであろう。このバルーン閉塞カテーテル媒介手術は、非常に高い安全性を示しており、７年にわたる長期間に導入遺伝子発現を成功的に達成している。このような点を考慮して、ヘルパーアデノウイルス及びＲＣＡの汚染と関連して、ＧＬＡｄ生産のための新しいプラットホームを初めて確立し、生体内遺伝子伝達用ベクターとしての卓越性を明らかにしたという側面で（表１９）、本発明者が収めた成果は、その価値が十分に評価されるべきものといえる。
【0329】
結論的に、本発明者の研究結果が示しているのは、本発明者が完成したヘルパープラスミドベースのシステムが、アデノウイルス及びＲＣＡ汚染物がない組換えＧＬＡｄを効率的に生産できるという点である。最近になってはじめて、遺伝子治療法は、様々な先天性遺伝疾患治療においてこれまで充足できずにいたニーズに対して解決策を提示している。伝達ベクターに遺伝子を載せて生体内に伝達することによって遺伝病を治療しようとするこの類型の遺伝子治療法において、遺伝子伝達ベクターは実に中枢的な役割を担当する。どうか、本発明者が完成したヘルパープラスミド及びＧＬＡｄ生産システムが、将来のＧＬＡｄベース遺伝子治療の成功的な開発に礎石となることを期する。
【0330】
【表18】
ａ ＬａｃＺ染色で決定される（ＢＦＵ合計数）
ｂ アデノウイルス及び／又はＲＣＡ
ｃ プラーク分析（ｐｌａｑｕｅ ａｓｓａｙ）によって決定される
ｄ １００ｍｍ培養皿に培養されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染される
ｅ プラーク分析のための陽性対照群
【0331】
【表19】
ａ 相対的活性
ｂ ただし、その頻度は低い
【0332】
【表20】
【0333】
【表21】
【0334】
【表22】
【産業上の利用可能性】
【0335】
本発明は、ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス（ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ＧＬＡｄ）生産方法及びシステムに関する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0283】
【表16】
配列番号３６の配列目録のボールド体部分は、ＥｃｏＲＩ制限酵素サイトである。
【国際調査報告】