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特表2022-543446ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-12
(54)【発明の名称】ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20221004BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20221004BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20221004BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221004BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20221004BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221004BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221004BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221004BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
C12N9/00 ZNA
C12N15/85 Z
A61K31/7105
A61P25/28
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61K48/00
C12N15/63 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022507489
(86)(22)【出願日】2021-02-26
(85)【翻訳文提出日】2022-02-04
(86)【国際出願番号】 KR2021002443
(87)【国際公開番号】W WO2021172925
(87)【国際公開日】2021-09-02
(31)【優先権主張番号】10-2020-0025332
(32)【優先日】2020-02-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0025822
(32)【優先日】2021-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520062823
【氏名又は名称】アールズィーノミクス・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ソン－ウク・イ
(72)【発明者】
【氏名】スン・リュル・ハン
【テーマコード（参考）】
4B050
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050CC04
4B050LL01
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA161
4C084ZB211
4C084ZC411
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA16
4C086ZB21
4C086ZC41
(57)【要約】
【書類】
本発明は、アルツハイマー病の特異的トランススプライシングリボザイム、及びその用途に関する。前記トランススプライシングリボザイムは、アルツハイマー病の発症原因になったり発症危険を高める遺伝子のＲＮＡを疾患治療に有益な遺伝子のＲＮＡに置換して、疾患原因遺伝子の発現を低くし、疾患治療に有益な遺伝子の発現は増加させるため、アルツハイマー病の予防又は治療用途において便利に使用できる。
本発明は、アルツハイマー病の特異的トランススプライシングリボザイム、及びその用途に関する。前記トランススプライシングリボザイムは、アルツハイマー病の発症原因になったり発症危険を高める遺伝子のＲＮＡを疾患治療に有益な遺伝子のＲＮＡに置換して、疾患原因遺伝子の発現を低くし、疾患治療に有益な遺伝子の発現は増加させるため、アルツハイマー病の予防又は治療用途において便利に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ序列を標的とする、トランススプライシングリボザイム。
【請求項2】
前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ－リボザイム＊－エクソン－３’の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項3】
前記ＩＧＳ領域は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１、＋３０、＋４９、＋５６、＋７１、＋７７、＋８０、＋８２、＋９５、＋９８、＋１０４、＋１２８、＋１４０、＋１８１、＋２２９、＋２５５、＋２６３、＋２７５、＋３２６、＋３６８、＋８３０、又は＋８３９塩基を含む領域と相補的に結合される５～１０ｎｔの長さの塩基配列からなることを特徴とする、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項4】
前記ＩＧＳ領域は、序列番号２、４、又は６の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項5】
前記トランススプライシングリボザイムは、ＩＧＳ領域のアップストリームにＡＰＯＥ４ ＲＮＡの一部と相補的に結合される１０ｎｔ～２００ｎｔの長さのＡＳ領域をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項6】
前記ＩＧＳ領域は序列番号２の塩基配列を含み、前記ＡＳ領域は１５０ｎｔの長さであることを特徴とする、請求項５に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項7】
前記ＩＧＳ領域は序列番号４の塩基配列を含み、前記ＡＳ領域は５０ｎｔの長さであることを特徴とする、請求項５に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項8】
前記ＩＧＳ領域及びＡＳ領域は、５～１０ｎｔの長さのランダム塩基配列に連結されていることを特徴とする、請求項５に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項9】
前記リボザイム＊領域は、序列番号５の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項10】
前記エクソン領域は、ＡｐｏＥ２又はＡｐｏＥ３クライストチャーチ突然変異（Ｒ１３６Ｓ）を暗号化する塩基配列の一部又は全てを含むことを特徴とする、請求項２に記載のトランススプライシングリボザイム。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のトランススプライシングリボザイムを発現できる、発現ベクター。
【請求項12】
前記発現ベクターは、前記リボザイム遺伝子と作動可能に連結されたプロモータをさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項13】
前記プロモータは、神経細胞タイプの特異的なプロモータであることを特徴とする、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項14】
前記神経細胞タイプの特異的なプロモータは、ニューロン－、星状細胞－又は希突起膠細胞－特異的プロモータであることを特徴とする、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項15】
請求項１～１０に記載のトランススプライシングリボザイム、請求項１１～１４に記載の発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む遺伝子伝達システムからなる群から選択されるいずれか１つを有効成分として含むアルツハイマー病の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項16】
請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム、これを発現できるベクター、及び前記ベクターを含む遺伝子伝達システムからなる群から選択されるいずれか１つ以上を個体に投与することを含む、アルツハイマー病の予防又は治療方法。
【請求項17】
アルツハイマー病の予防又は治療薬剤の製造のための請求項１に記載のトランススプライシングリボザイム、これを発現できるベクター、又は前記ベクターを含む遺伝子伝達システムの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＰＯＥ４遺伝子特異的トランススプライシングリボザイム及びその用途などに関する。
【背景技術】
【0002】
経済が発展するにつれて食生活及び衛生状態が良くなり、医療技術も改善されることで人の平均寿命が延び続けている。韓国では、２０００年に６５歳以上人口比率が７．２％に達して高齢化社会に進入し、２０１７年には、その比重が１４％を越えて高齢社会となった。６５歳以上の老人人口の比重が急激に増加することで慢性老人性疾患を患う老人人口が増加しており、これは、老人人口及び家族生活の暮らしの質を著しく低下させ、また、社会的な費用も大きく増加させる。主な老人性疾患には、認知症、パーキンソン、脳卒中があり、国民健康保険公団の資料によると、２０１４年から２０１８年まで認知症、パーキンソン、脳卒中で診療を受けた人員は６０５万９、４３７人に達する。
【0003】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、認知症の主な原因の１つとして、アミロイドベータタンパク質、タウタンパク質などの異常たんぱく質が脳内に積もって徐々に脳神経細胞を損傷させる退行性脳疾患である。記憶力をはじめ、認知機能が次第に低下し、さらに進行すると、言語、歩行障害が現れ、一人では日常生活が難しくなる。
【0004】
アルツハイマー病の発症の機作に対する研究は、ほとんどアミロイド仮設を根拠としており、これに基づいてアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）、ベータ－サイトアミロイド前駆体タンパク質切断酵素（β－ｓｉｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ＢＡＣＥ）、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）遺伝子に対する研究、細胞内の異なる要因との相互作用及び調節に対する研究、因子の生成、分解及び信号伝達に対する研究が主であった。
【0005】
アミロイド仮設に基づいて多くのアルツハイマー病の治療候補物質は「ＢＡＣＥ１抑制」、「アミロイドベータフィブリル形成抑制」に焦点が当てらえている。しかし、アミロイドベータを狙った抗体であるリリーのソラネズマブ（ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）は軽度認知症患者において臨床III相に失敗し、ノバルティスやアムジェンがアルツハイマー病疾患を適応症として共同開発中であったＢＡＣＥ１抑制剤「ＣＮＰ５２０」もまた患者の認知機能の改善に失敗した。ここで、アルツハイマー病の発症原因と思われていたアミロイド仮設が揺れており、アルツハイマー病の治療のためには標的分子を変更するか、接近方式を変更すべきという主張が出ている。
【0006】
ＡｐｏＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ）は、肝臓及び脳などで発現するタンパク質であって、最近、脳で発現するＡｐｏＥタンパク質とアルツハイマー病との関連性を裏付ける研究結果が多数提示されている。ＡｐｏＥタンパク質は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４の異形態を有し、ＡｐｏＥ２は神経細胞を保護する機能を行い、ＡｐｏＥ４はベータアミロイドの蓄積に寄与し、それ自体で神経毒性を示すことが知られている。また、メタゲノム研究に基づいた統計分析の結果、ＡＰＯＥ４は、アルツハイマー病を誘発する遺伝的因子であることが明らかになった。ここで、アルツハイマー病の治療のために、ＡｐｏＥ４の機能を遮断しようとする試みが行われているが、まだ不十分な実状である。一方、ＡｐｏＥ３クライストチャーチ（ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ）（ＡｐｏＥ３ｃｈ）突然変異は、７０代の高齢の老人で発見されたＡｐｏＥ３の突然変異の形態であり、このような突然変異を有する人は、脳全体でアミロイドプラークが発見されるが、認知障害が発生しないことが明らかになっている（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１９；１１：１６８０－１６８３．）。
【0007】
一方、テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）からのグループＩイントロンリボザイムが、試験管内でリボザイムの３’末端に付着されているエクソンＲＮＡをトランスするように存在する５’エクソンを標的とした後に付着させることで、別に存在する転写体と相互連結させ得るトランススプライシング反応を引き起こす可能性があることが報告されている。これは、すぐにグループＩリボザイムのトランススプライシング反応を介して、様々な遺伝疾患と関連のある遺伝子の転写体も補正され得ることを示唆し、実際に、最近の鎌状赤血球（ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ）疾病を有する患者の赤血球前駆（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）細胞からβ－グロビン遺伝子転写体がトランススプライシングリボザイムによって抗鎌状赤血球化（ａｎｔｉ－ｓｉｃｋｌｉｎｇ）、γ－グロビン遺伝子転写体に転換されることが明らかになった。
【0008】
遺伝子治療方法として、トランススプライシングリボザイムは、突然変異遺伝子ＲＮＡを正常ＲＮＡに補正することができ、同様の原理で特定の遺伝子の発現を減少させると共に、目的遺伝子を宿主細胞に発現させることができる。その際、リボザイムは、ＲＮＡレベルで動作するため、宿主細胞のゲノム内のランダムな位置で遺伝子の混入による好ましくない免疫反応の問題及び安全性の問題などを引き起こさないメリットがある。
【0009】
ここで、本発明者は、ＡＰＯＥ４をターゲットとするトランススプライシングリボザイムを用いたアルツハイマー病の治療方法について鋭意研究し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１９；１１：１６８０－１６８３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、上記のような問題を解決するためのもので、安全性及び発現効率に優れたアルツハイマー病の特異的トランススプライシングリボザイム及びこれを用いたアルツハイマー病の治療用途を提供することにその目的がある。
【0012】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない更なる課題は、下の記載から、当技術分野の当業者が明らかに理解できるものである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡを標的とするトランススプライシングリボザイムを提供する。
【0014】
本発明の一実施形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’の構造を有することができる。
【0015】
本発明の他の実現形態として、前記ＩＧＳ領域は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの５’ＵＴＲ領域に特異的に結合し、Ｇ／Ｕゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成できる５～１０ｎｔの長さの塩基配列からなり、好ましくは、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１、＋３０、＋４９、＋５６、＋７１、＋７７、＋８０、＋８２、＋９５、＋９８、＋１０４、＋１２８、＋１４０、＋１８１、＋２２９、＋２５５、＋２６３、＋２７５、＋３２６、＋３６８、＋８３０、又は＋８３９の位置、好ましくは、＋２１、＋３０、又は＋５６の位置を含む領域と相補的に結合し、Ｇ／Ｕゆらぎ塩基対を形成できる５～１０ｎｔの長さの塩基配列からなり得る。
【0016】
本発明の更なる実現形態として、前記ＩＧＳ領域は、序列番号２、４、又は６の塩基配列を含むか、又はこれからなるものであってもよい。
【0017】
本発明の更なる実現形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、ＩＧＳ領域のアップストリームにＡＰＯＥ４遺伝子の一部と相補的に結合できるＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）領域をさらに含むことができる。
【0018】
本発明の更なる一実施形態として、前記ＡＳ領域の長さは、１０ｎｔ～２００ｎｔ、好ましくは、５０ｎｔ～１５０ｎｔであり得る。
【0019】
本発明の更なる実現形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、序列番号２からなるＩＧＳ領域を含み、１５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含むことができる。
【0020】
本発明の更なる実現形態として、前記トランススプライシングリボザイムは、序列番号４からなるＩＧＳ領域を含み、５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含むことができる。
【0021】
本発明の更なる実現形態として、前記ＩＧＳ領域とＡＳ領域との間には、５～１０個のランダムのヌクレオチドが含まれてもよく、前記ランダムのヌクレオチド序列は制限酵素序列であってもよく、前記ランダムのヌクレオチド序列は、好ましくは、６ｎｔの長さであってもよく、図１０に図式化されたＰ１及びＰ１０の一部と相補的な序列からなるものであってもよい。
【0022】
本発明の更なる実現形態として、前記リボザイム＊領域は、序列番号７の塩基配列を含むか、又はこれからなるものであってもよい。
【0023】
本発明の更なる実現形態として、前記エクソン領域は、アルツハイマー病の予防又は治療用遺伝子であってもよく、ＡｐｏＥ２又はＡｐｏＥ３クライストチャーチ（ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ）突然変異（Ｒ１３６Ｓ）を暗号化する塩基配列の一部又は全てを含むことができる。
【0024】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイムの塩基配列及び／又はこれと相補的な塩基配列を含むトランススプライシングリボザイム発現ベクターを提供する。
【0025】
本発明の一実施形態として、前記発現ベクターは、前記リボザイム遺伝子と作動可能に連結されたプロモータをさらに含んでもよく、前記プロモータは、神経細胞特異的なプロモータであってもよく、前記神経細胞は、ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、及び希突起膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）を含む。
【0026】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイム発現ベクターを含む遺伝子伝達システムを提供する。
【0027】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイム、これを発現できるベクター、及び前記ベクターを含む遺伝子伝達システムからなる群から選択されるいずれか１つ以上を有効成分として含むアルツハイマー病の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【0028】
また、本発明は、前記トランススプライシングリボザイム、これを発現できるベクター、及び前記ベクターを含む遺伝子伝達システムからなる群から選択されるいずれか１つ以上を個体に投与するステップを含むアルツハイマー病の予防又は治療方法を提供する。
【0029】
本発明の一実施形態として、前記個体は、アルツハイマー病の予防又は治療が必要なヒト、より具体的に、アルツハイマー病患者、高齢者（満６０歳以上）、又はＡＰＯＥ４対立遺伝子の保持者であり得る。
【0030】
本発明の他の実現形態として、前記方法は、個体の認知能力の程度を測定するステップをさらに含むことができる。
【0031】
また、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療薬剤の製造のための前記トランススプライシングリボザイム、これを発現できるベクター、又は前記ベクターを含む遺伝子伝達システムの用途を提供する。本発明において、前記アルツハイマー病は、アミロイドベータタンパク質、タウタンパク質など異常たんぱく質が脳内に積もって徐々に脳神経細胞が損傷される神経変性疾患であり、アルツハイマー病が進行されて現れる他の疾患、例えば、アルツハイマー性認知症のような疾患を含む。
【発明の効果】
【0032】
本発明に係るトランススプライシングリボザイムは、アルツハイマー病の発症原因になったり発症危険を高める遺伝子のＲＮＡを疾患治療に有益な遺伝子のＲＮＡに置換して、疾患の原因になったり発症危険を高める遺伝子の発現を低下させ、疾患治療に有益な遺伝子の発現を、標的遺伝子を発現する細胞又は組織特異的に増加させるため、アルツハイマー病の予防又は治療用途として有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図2】本発明のＡＰＯＥ４ ＲＮＡ標的用トランススプライシングリボザイムを概略的に示す図である。
【図3】ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋５６番の塩基をターゲットとする＋５６ターゲッティングリボザイムのトランススプライシング効果を確認したものであり、Ａは、＋５６ターゲッティングリボザイムによるトランススプライシング産物生成の有無を確認した結果であり、Ｂは、生成されたトランススプライシング産物の序列分析の結果である。
【図4】トランススプライシングの効率においてＡＳ領域の効果を確認したものであり、Ａは、ＡｐｏＥ ＲＮＡ標的用トランススプライシングリボザイムの５’末端にＡＳ領域を導入した構造を示し、Ｂは、ＡＳ領域の導入及び導入されたＡＳ領域の長さによるリボザイムのトランススプライシングの効率を確認したグラフである。
【図5A】神経細胞由来の細胞株でＡＳ領域の導入及び導入されたＡＳ領域の長さによる＋５６ターゲッティングリボザイムのトランススプライシングの効率を確認したものであって、図５Ａは、たんぱく質レベルで確認した図である。
【図5B】神経細胞由来の細胞株でＡＳ領域の導入及び導入されたＡＳ領域の長さによる＋５６ターゲッティングリボザイムのトランススプライシングの効率を確認したものであって、図５ＢのＡは、たんぱく質レベルで確認した図であり、図５ＢのＢは、トランススプライシング産物の序列分析の結果である。
【図6】インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）上でＡＰＯＥ４ ＲＮＡのリアクションサイトマッピング試験の模式図及びその結果図である。
【図7】細胞内でＡＰＯＥ４ ＲＮＡのリアクションサイトマッピング試験の模式図及びその結果図である。
【図8】ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの標的位置を異にしたリボザイムのトランススプライシングの効率を確認した図である。
【図9C】ＡＳ領域の導入及び導入されたＡＳ領域の長さによる＋２１ターゲッティングリボザイムのトランススプライシングの効率を確認したものであり、図９Ｃは、トランススプライシング産物の序列分析の結果である。
【図10A】本発明のトランススプライシングリボザイム構造模式図であって、図１０Ａは、＋２１ターゲッティングリボザイムの構造を示す。各リボザイムのＩＧＳ領域のアップストリームには、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡと相補的な３つのヌクレオチド領域（Ｐ１）が含まれ、リボザイムのターゲットとの結合特異性及び結合力を増加させることができる。また、各リボザイムは、図１０に図式化したように、リボザイム＊領域のダウンストリーム位置に前記Ｐ１領域を含む５’領域と相補的な５～１０ｎｔの長さのＰ１０領域を含み、リボザイムのトランススプライシングの効率を向上させることができる。ＡＳ領域及びエクソン領域を除いたリボザイムの具体的な序列に関して、＋２１ターゲッティングリボザイムは序列番号８、＋３０ターゲッティングリボザイムは序列番号９、＋５６ターゲッティングリボザイムは序列番号１０の塩基配列からなるか、これを含むものであってもよい。
【図10B】本発明のトランススプライシングリボザイム構造模式図であって、図１０Ｂは、＋３０ターゲッティングリボザイムの構造を示す。各リボザイムのＩＧＳ領域のアップストリームには、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡと相補的な３つのヌクレオチド領域（Ｐ１）が含まれ、リボザイムのターゲットとの結合特異性及び結合力を増加させることができる。また、各リボザイムは、図１０に図式化したように、リボザイム＊領域のダウンストリーム位置に前記Ｐ１領域を含む５’領域と相補的な５～１０ｎｔの長さのＰ１０領域を含み、リボザイムのトランススプライシングの効率を向上させることができる。ＡＳ領域及びエクソン領域を除いたリボザイムの具体的な序列に関して、＋２１ターゲッティングリボザイムは序列番号８、＋３０ターゲッティングリボザイムは序列番号９、＋５６ターゲッティングリボザイムは序列番号１０の塩基配列からなるか、これを含むものであってもよい。
【図10C】本発明のトランススプライシングリボザイム構造模式図であって、図１０Ｃは、＋５６ターゲッティングリボザイムの構造を示す。各リボザイムのＩＧＳ領域のアップストリームには、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡと相補的な３つのヌクレオチド領域（Ｐ１）が含まれ、リボザイムのターゲットとの結合特異性及び結合力を増加させることができる。また、各リボザイムは、図１０に図式化したように、リボザイム＊領域のダウンストリーム位置に前記Ｐ１領域を含む５’領域と相補的な５～１０ｎｔの長さのＰ１０領域を含み、リボザイムのトランススプライシングの効率を向上させることができる。ＡＳ領域及びエクソン領域を除いたリボザイムの具体的な序列に関して、＋２１ターゲッティングリボザイムは序列番号８、＋３０ターゲッティングリボザイムは序列番号９、＋５６ターゲッティングリボザイムは序列番号１０の塩基配列からなるか、これを含むものであってもよい。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明者は、ＡＰＯＥ４タンパク質自体の細胞毒性及びベータアミロイド蓄積機能とアルツハイマー病患者のうちＡＰＯＥ４対立遺伝子の保持者が多い統計的な結果から、ＡＰＯＥ４をターゲットとするアルツハイマー病の予防及び治療のための遺伝子治療方法について鋭意研究し、ＡＰＯＥ４をターゲットとするトランススプライシングリボザイムを完成した。
【0035】
より具体的に、本発明者は、様々なＡＰＯＥ ＲＮＡ変移体の序列分析を通じて、５’－ＵＴＲ領域に共通序列を確認し、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋５６番の塩基を含む領域をターゲットに設定した。ＡＰＯＥ４ ＲＮＡと反応特異性を向上させるために、前記ターゲット領域と相補的な序列の内部ガイド序列（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＧＳ）を含むトランススプライシングリボザイム（＋５６ターゲッティングリボザイム）を設計し（実施例１）、＋５６ターゲッティングリボザイムがＡＰＯＥ４ ＲＮＡの所望する位置で正確にトランススプライシングしたことを確認した（実施形態２及び３）。
【0036】
次に、本発明者は、＋５６ターゲッティングリボザイムの標的特異性及びトランススプライシングの効率増大のために、リボザイムの５’末端にＡＰＯＥ ＲＮＡと相補的な序列を有するアンチセンス（ＡＳ）領域を導入し、３’エクソン領域にルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼ活性測定を介してトランススプライシングの活性程度を確認した。その結果、ＡＳ領域の導入及び導入されたＡＳ領域の長さは、リボザイムのトランススプライシングの効率に影響を及ぼすことが分かった（実施形態３－１）。
【0037】
神経細胞に特異的でより効率的なトランススプライシングリボザイムを設計するために、神経細胞由来の細胞株で同様の試験を行った結果、＋５６ターゲッティングリボザイムは、１５０ｎｔの長さのＡＳ領域が導入される場合、優れたトランススプライシングの効率を示すことが分かった（実施形態３－２）。
【0038】
次に、本発明者は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋５６番の塩基以外の標的領域を確保するために、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムとを混合して生成されたトランススプライシング産物の序列分析を通じてリアクションサイトを確認し、各リアクションサイトをターゲットとするリボザイムのトランススプライシング効果を確認した結果、＋５６番の塩基以外にもＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１、＋３０、＋７１、及び＋７７サイトが効果的なターゲット領域として使用されることが分かった。そのうち、特に、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１及び＋３０を標的とするリボザイムのトランススプライシングの効率が優れていることを確認した（実施例４）。
【0039】
また、本発明者は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡのターゲット位置の変化による最適なＡＳ領域の長さを探求した結果、＋２１ターゲッティングリボザイムは５０ｎｔ長さのＡＳ領域が導入される場合、トランススプライシングの効率が増大することが確認できた（実施例５）。
【0040】
前記の結果から本発明者は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡを標的とするリボザイムにおいて、標的部位は＋２１、＋３０、及び＋５６番の塩基を含むことが好ましく、前記領域と相補的な５～１０ｎｔの長さのＩＧＳ序列を含むことで、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの特異的に効率的なトランススプライシングを発生させ得ることが分かる。
【0041】
また、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡを標的とするリボザイムにおいて、ＩＧＳ領域のアップストリームにＡＰＯＥ４ ＲＮＡと相補的な序列のＡＳ領域が含まれる場合、トランススプライシングの効率を向上させ得るが、効率増大のための最適なＡＳ領域の長さは、標的部位（標的塩基）と標的細胞に応じて互いに異なることが分かる。
【0042】
本発明者は、アルツハイマー病の予防及び治療のために、特に神経細胞でＡＰＯＥ４タンパク質の発現低下のためのトランススプライシングリボザイムを提供し、前記リボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’の構造、又は５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム＊－エクソン－３’の構造を有することができる。
【0043】
本発明で使用された「リボザイム」という用語は、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質で構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な３次構造を有するＲＮＡ分子として化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的な特性を有する。一部のリボザイムは、自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害し、他のリボザイムは、リボソームのアミノ伝達酵素（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を触媒するものと知られている。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム、及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれてもよい。
【0044】
本明細書でにおいて、「トランススプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」は、互いに異なる遺伝子からのＲＮＡを互いに連結することを意味する。
【0045】
本明細書において、リボザイムは、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡを切断して自己ＲＮＡ（特に、リボザイムの３’エクソン領域）に置換して宿主細胞内でＡＰＯＥ４タンパク質の発現を阻害し、エクソン領域に暗号化された遺伝子の発現を誘導するトランススプライシングリボザイムを意味する。本発明において、リボザイムは、５’－ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）－リボザイム＊－エクソン（ｅｘｏｎ）－３’、又は５’－ＡＳ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）－ＩＧＳ－リボザイム＊－エクソン－３’の構造を有してもよい。前記構造内のリボザイム＊領域は、トランススプライシングリボザイム内でＡＰＯＥ４ ＲＮＡの切断及び／又はエクソン領域における置換の機能を行う領域を意味し、序列番号７の塩基配列を含むか、又はこれからなるものであってもよい。本明細書において特別な言及がない限り、リボザイムは実質的な機能を行う領域であるリボザイム＊領域を含む前記全体構造を含むトランススプライシングリボザイムを称する。
【0046】
本発明において、リボザイムの３’エクソン（ｅｘｏｎ）領域に暗号化される遺伝子は、神経細胞の保護活性があるものと知られている公知のタンパク質（又は、ペプチド）を暗号化する遺伝子であり、好ましくは、ＡＰＯＥ２又はＡＰＯＥ３クライストチャーチ（ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ）遺伝子であってもよい。
【0047】
本明細書において、ベクターは、適切な宿主細胞でトランススプライシングリボザイムを発現できる発現ベクターであって、ベクター内に含まれたリボザイム遺伝子の挿入物が発現されるように、作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構造物を指す。
【0048】
本明細書において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的な機能を行う核酸発現調節の序列と目的とする遺伝子をコーディングする核酸序列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを指す。
【0049】
例えば、リボザイムの暗号化序列をプロモータに作動可能に連結すれば、リボザイムの暗号化序列の発現は、プロモータの影響又は調節下にある。２つの核酸序列（リボザイムの暗号化序列及びこの序列の５’末端のプロモータ部位の序列）は、プロモータ作用が誘導されてリボザイムの暗号化序列が転写されれば、作動可能に連結されたものであり、前記２つの序列間の連結特性がフレーム変更の突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導することなく、発現調節序列がリボザイムの発現を阻害しなければ、作動可能に連結されたものと見ることができる。再調合ベクターとの作動可能な連結は、この技術分野で公知の遺伝子の再調合技術を用いて製造することができ、部位－特異的ＤＮＡ切断及び連結は、この技術分野で一般に知られた酵素などを用いてもよい。
【0050】
本発明に係るベクターは、プロモータ、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素の他にも、膜の標的化又は分泌のための信号序列又はリーダー序列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。ベクターのプロモータは、構成的又は誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製の起源を含み得る。ベクターは、自己複製するか、又は宿主ＤＮＡに統合されてもよい。
【0051】
本発明に係るベクターは、好ましくは、プラスミドベクター、コスミドベクター又はウイルスベクターなどであってもよく、最も好ましくは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、鳥類肉種／白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ、ＭＭＴＶ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）、又は単純ヘルペスウイルスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）などに由来するベクターであってもよいが、これらに制限されることはない。本発明に係る再調合ベクターは、最も好ましくは、再調合アデノ関連ウイルスベクターであってもよい。
【0052】
本発明で使用された「プロモータ」という用語は、ＤＮＡの一部分として転写を開始できるようにＲＮＡ重合酵素の結合に関与する。一般に、標的遺伝子に隣接してこの上流に位置し、ＲＮＡ重合酵素又はＲＮＡ重合酵素を誘導するタンパク質である転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）が結合する個所であって、前記酵素又はタンパク質が正しい転写の開始部位に位置するように誘導することができる。即ち、センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）で転写しようとする遺伝子の５’部位に位置し、ＲＮＡ重合酵素が直接又は転写因子を介して該当位置に結合して標的遺伝子に対するｍＲＮＡ合成を開始するように誘導することで、特定の遺伝子序列を有する。
【0053】
本発明に係るプロモータは、神経細胞で遺伝子の発現を高めるための観点から神経細胞タイプの特異的なプロモータであってもよく、前記神経細胞は、ニューロン、星状細胞、及び希突起膠細胞を含む。
【0054】
本明細書において、「遺伝子伝達システム（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、リボザイム遺伝子及び／又は核酸序列の細胞内部における伝達効率を高め、発現効率を向上させ得るシステムを意味し、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに分類されてもよい。
【0055】
ウイルス媒介システムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターのようなウイルス性ベクターを用いて、ヒト細胞に感染を引き起こすウイルス固有の細胞内浸透機序を使用するため、非ウイルス性システムよりも細胞内の遺伝子伝達の効率が比較的に高いことが知られている。また、細胞中に入った後の非ウイルス性ベクターは、エンドソームがリソソームと融合した後、エンドリソソームで遺伝子が分解される問題があるが、ウイルス性ベクターは、リソソームを通過することなく核内に遺伝子を伝達する機序によって遺伝子の損失が小さく、遺伝子伝達の効率が高いという長所がある。
【0056】
本発明で用いられるウイルス性ベクターは、前記再調合ベクターで説明したように、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどに由来するベクターであってもよい。このようなウイルス性ベクターは、ウイルス粒子に組み立てられた後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のような形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）方法で細胞内部に導入することができる。
【0057】
前記非ウイルス性システムは、核酸及び／又は遺伝子の伝達媒介体で陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体などを用いるか、又は電気穿孔法を使用する方法である。
【0058】
陽イオン性脂質伝達体は、主に陽イオン性脂質からなるナノメートルサイズのリポソームや脂質素材ナノ粒子の陽電荷を用いて陰電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用により細胞内に伝達する方法である。細胞内に伝達された複合体は、エンドソームからリソソームに１次伝達された後、細胞質に抜け出て発現する。陽イオン性高分子伝達体は、脂質の代わりに高分子を使用することを除外すれば、陽イオン性脂質伝達体に類似の方式で遺伝子を伝達し、代表的な陽イオン性高分子として、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリライシ（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。
【0059】
従って、本発明の再調合ベクターが陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体と結合して形成された複合体は、遺伝子伝達体として使用されることができる。
【0060】
本発明において、前記遺伝子伝達システムは、前記説明した再調合ベクターを含み、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムの全てが使用されるが、ウイルス媒介システムを使用することが好ましい。
【0061】
一方、本発明のトランススプライシングリボザイムは、神経細胞でＡＰＯＥ４ ＲＮＡをターゲットにしてＡＰＯＥ４タンパク質発現を阻害し、ＡＰＯＥ４は、アルツハイマー病の主な発症危険誘発遺伝子として知られているが、本発明のトランススプライシングリボザイム、前記リボザイム発現ベクター、及び前記ベクターを含む遺伝子伝達システムは、アルツハイマー病の予防又は治療のための医薬組成物に用いられることができる。
【0062】
本発明で使用された「予防」という用語は、本発明に係る医薬組成物の投与によりアルツハイマー病を抑制するか、又は発症を遅延させる全ての行為を意味する。
【0063】
本発明で使用された「治療」という用語は、本発明に係るベクターを含む組成物の投与によりアルツハイマー病が好転したり、その症状を有利に変更したりする全ての行為を意味する。
【0064】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。
【0065】
本発明の医薬組成物は、目的とする方法により経口投与したり、非経口投与したりしてもよいが、非経口として投与することが好ましい。
【0066】
本発明の一実施形態によれば、本発明に係る医薬組成物は、静脈内、動脈内、脳組織内、皮下投与又は大槽内投与（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）であってもよい。本発明に係る注射剤は、患者に投与するときそのまま利用できるように滅菌媒質に分散した形態であってもよく、投与時に注射用蒸留水を加えて適切な濃度で分散させてから投与する形態であってもよい。また、注射剤で製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定剤などと混合されてもよく、単位投薬アンプル又は多重投薬の形態に製造されてもよい。
【0067】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の状態及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路、及び時間により異なるが、当業者により適切に選択されてもよい。一方、本発明に係る医薬組成物は単独に使用されるか、又は他のアルツハイマー病の治療剤又は治療方法と並行して使用されてもよい。
【0068】
本発明において、いずれかの部分がいずれかの構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含むことを意味する。
【実施例】
【0069】
以下、本明細書を具体的に説明するために実施形態の例を挙げて詳説する。しかし、本明細書に係る実施形態は異なる形態に変形されてもよく、本明細書の範囲が以下で上述する実施形態に限定されるものと解釈されない。本明細書の実施形態は、当業界で平均的な知識を有する者にとって本明細書をより完全に説明するために提供される。
【0070】
実施形態１．ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ＋５６ターゲッティングトランススプライシングリボザイムの設計及び製造
【0071】
ターゲットＲＮＡの部位を選定するために、ＮＣＢＩに公開されたＡＰＯＥ ＲＮＡ変移体Ｖ１～Ｖ５の序列を比較し、５’－ＵＴＲの共通序列（２３ｂｐ）のうち、リボザイムとＧ－Ｕゆらぎ塩基対（ｗｏｂｂｌｅ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成できるウラシル（Ｕ）塩基が含まれた序列（ＧＣＣＡＡＵ：序列番号１）をターゲット部位として選定した（図１）。
【0072】
前記ターゲット部位は、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ（序列番号１１）の＋５６位置の塩基を含み、５’末端に前記ターゲット部位を標的できるＩＧＳ（ＧＵＵＣＣＧ：序列番号２）と、３’末端には置換しようとする目的遺伝子であるＡｐｏＥ２の導入されたＡＰＯＥ４ ＲＮＡを標的とするトランススプライシングリボザイム（以下、「＋５６ターゲッティングリボザイム」という）を製造した（図２）。
【0073】
前記＋５６ターゲッティングリボザイムをｐｃＤＮＡベクターにクローニングしてトランススプライシングリボザイムの発現用ベクターを製造した。
【0074】
実施形態２．＋５６ターゲッティングリボザイムのトランススプライシングの効果確認
【0075】
上記の実施形態１で製造した＋５６ターゲッティングリボザイムの効果を下記のように確認した。
【0076】
リボザイム１ｐｍｏｌｅ及びＡＰＯＥ４ ＲＮＡ１ｐｍｏｌｅをトランススプライシング反応バッファ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）と混合した後、体積を９μｌに合わせ、９５℃で１分間加熱した。３７℃で３分間放置した後、１ｍＭ ＧＴＰ１μｌを添加して体積を１０μｌに合わせ、３７℃で３時間反応させた。反応の終了したＲＮＡ産物は、フェノール抽出／エタノール沈殿方法で回収し、ＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）の処理された蒸留水（Ｄ．Ｗ）１０μｌに溶かした。回収したＲＮＡにＲＹ－ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）１０ｐｍｏｌｅを入れて９５℃で１分間加熱し、常温で１０分間放置した。その後、ＲＮＡに１０ｍＭ ｄＮＴＰ１μｌ、５ｘ ＲＴａｓｅバッファ４μｌ、ＲＴａｓｅ１μｌ及びＤＥＰＣが処理されたＤ．Ｗを添加して体積を２０μｌに合わせ、４２℃で５０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。
【0077】
合成したｃＤＮＡ２μｌ、５Ｘ ＰＣＲバッファ１０μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ１μｌ、ＡｐｏＥ４の全方向プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧ－３’）１０ｐｍｏｌｅ、ＲＹ－ＴＳプライマー（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）１０ｐｍｏｌｅ及びＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ０．２μｌを混合した。これに、Ｄ．Ｗを添加して体積を５０μｌに合わせ、９８℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１５秒の条件で３０サイクルを増幅させ、トランススプライシング産物ＤＮＡを収得した。ＰＣＲ産物５μｌを２％ＴＢＥアガロースゲルで電気泳動してトランススプライシング産物の生成の有無を確認し、生成物の序列分析を行った。
【0078】
電気泳動の結果、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡがリボザイムの３’エクソンＲＮＡに置換されたとき生成されるトランススプライシング産物（１３１ｂｐ）を確認し、序列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の結果、生成物はＡＰＯＥ４ ＲＮＡの５’－ＵＴＲにリボザイムの３’エクソンＲＮＡが連結されていることが分かった（図３）。
【0079】
実施形態３．＋５６ターゲッティングトランススプライシングリボザイムの最適化
【0080】
３－１．アンチセンス（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ：ＡＳ）領域導入の効果確認
【0081】
実施形態１で製造した＋５６ターゲッティングリボザイムの標的特異性及びトランススプライシングの効率増加のために、リボザイムの５’末端にＡＰＯＥ４ ＲＮＡと相補的な序列を有するアンチセンス（ＡＳ）領域を導入した。前記ＡＳ領域の長さによるトランススプライシングの効率を確認するために、前記リボザイムの３’エクソン領域にルシフェラーゼ遺伝子を導入した。ＡＳ領域の長さが０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、又は１５０ｎｔであるとき、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【0082】
より具体的に、ＡｐｏＥを発現するＨｕｈ－７．５細胞株と、これを発現しない２９３Ａ細胞株にそれぞれのリボザイム発現ベクターを形質注入させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ信号を確認した結果、Ｈｕｈ－７．５細胞株では、アンチセンス序列５０個を導入したトランススプライシングリボザイムのトランススプライシングの効率が著しく優れているが、２９３Ａ細胞株では、各リボザイムのトランススプライシングの効率にそれ程の差がないことが確認された（図４のＢ）。
【0083】
前記の結果から、ＡＳ領域の導入とＡＳ領域の長さは、リボザイムのトランススプライシングの効率に影響を及ぼすことが確認された。
【0084】
３－２．ターゲット細胞株によるＡＳ領域の長さの最適化
【0085】
アルツハイマー病の予防及び治療ターゲットとして、ＡＰＯＥ４遺伝子発現の減少のために、前記トランススプライシングリボザイムは、神経細胞でトランススプライシングを効率よく実行しなければならない。ここで、神経細胞由来の細胞株において、上記の実施形態３－１の試験を繰り返し実行し、ＡＳ領域の長さによるトランススプライシングの効率を確認した。
【0086】
より具体的に、１×１０５個のＣＣＦ－ＳＴＴＧ１（Ｅ３／Ｅ４、ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）細胞を１２ウェルプレートに２４時間培養し、互いに異なる長さ（０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、又は１５０ｎｔ）のＡＳ領域を含む＋５６ターゲッティングリボザイムを発現するプラスミドベクター５００ｎｇと、ｐＴＫ－レニラルシフェラーゼ(ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ)プラスミドベクター５０ｎｇを４８時間の間に同時導入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。次に、培養液を全て除去した後、１ｘＰＢＳ５００ｕｌで１回洗浄し、受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９８０、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）１００ｕｌを各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れた後、常温で１５分間シェイクして細胞を溶解させた。溶解物を回収して１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、１０ｕｌの上層液を取ってルシフェラーゼ活性を測定した（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９８０、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）。陽性対照（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＣＦ）は、ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを使用した。
【0087】
その結果、ＡＳ領域の導入有無及びＡＳ領域の長さに関わらず、ＣＣＦ－ＳＴＴＧ１細胞でリボザイムによるＡＰＯＥ４ ＲＮＡのトランススプライシングが誘導されることが確認され、特に、１５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含むリボザイムによるトランススプライシングの効率が優れていることが確認された（図５Ａ）。
【0088】
前記結果を遺伝子レベルで再検証するために、電気泳動を行ってトランススプライシング産物（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）を検出した。より具体的に、２×１０５個のＣＣＦ－ＳＴＴＧ１、又はＵ１１８ＭＧ（Ｅ２／Ｅ４）細胞を６ウェルプレートに２４時間培養し、２．５ｕｇの＋５６ターゲッティングリボザイムの発現ベクターで形質転換を誘導した。４８時間が経過した後、培養液を全て除去し、１ｘＰＢＳ１ｍＬで１回洗浄して回収された細胞と、クロロホルム１００ｕＬを混合してトータルＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ １ｕｇにＲＴプライマー（５’－ＣＣＣＡＴＡＴＣＧＴＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣ－３’）を入れた後、２０ｕＬボリュームの条件で逆転写を行ってｃＤＮＡを生成した。前記ｃＤＮＡ ２ｕＬを正方向プライマー（５’－ＣＡＧＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＧＴ－３’）、逆方向プライマー（５’－ＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＴＣ－３’）と混合して９５℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒の条件で３０サイクルＰＣＲを行い、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認した。その結果、トランススプライシング産物と予想される２１１ｂｐ ＰＣＲ ＤＮＡバンドを確認することができ、特に、１５０ｎｔの長さのＡＳ領域を含むリボザイムが形質転換された細胞で最も濃いバンドを確認することができた（図５Ｂの（Ａ））。
【0089】
次に、所望する位置でトランススプライシングが実行されたかを確認するために、前記２１１ｂｐ ＰＣＲ ＤＮＡの序列分析を行った結果、トランススプライシング予想サイトで正確にトランススプライシングが生じ、ＡＰＯＥ ＲＮＡ＋ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＲＮＡ（Ｆｉｒｅｆｌｙ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）ｆｕｓｉｏｎ ＲＮＡが生成されたことが確認できた（図５Ｂの（Ｂ））。
【0090】
実施形態４．ＩＧＳ領域の最適化
【0091】
４－１．インビトロマッピング（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｐｐｉｎｇ）
【0092】
神経細胞でＡＰＯＥ４タンパク質を除去するための様々なツールを確保するために、試験管でＡＰＯＥ４ ＲＮＡとランダムライブラリーリボザイム（ｒａｎｄｏｍ ｌｉｂｒａｒｙ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を混合して反応させた後、ＲＴ－ＰＣＲを行ってからトランススプライシング産物として予想されるＰＣＲ ＤＮＡバンドの序列分析を通じて、トランススプライシングが発生したＡＰＯＥ４ ＲＮＡサイトを確認した。
【0093】
より具体的に、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡをインビトロ転写（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）過程を介して合成し、５’ｅｎｄにランダムの序列を（ＧＮＮＮＮＮ）有するトランススプライシングリボザイムＲＮＡライブラリーを、インビトロ転写過程を介して合成した。ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ０．１ｐｍｏｌｅ、リボザイムライブラリーＲＮＡ１ｐｍｏｌｅを１Ｘインビトロトランススプライシングリアクションバッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）と混合してトータル９ｕＬにした後、９５℃１分、３７℃３分で反応させ、１ｍＭ ＧＴＰ １ｕＬを入れ、ｆｉｎａｌ０．１ｍＭ ＧＴＰで濃度を合わせた後、３７℃で３時間反応させた。反応液をフェノール抽出（ｐｈｅｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）／ＥｔＯＨ沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）過程を経て、ＲＮＡを回収した後、ＲＴ－ＰＣＲを行った。次に、ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＴプライマー（５’－ＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴ－３’）を入れた後、２０ｕＬボリュームの条件で、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）でｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡ ２ｕＬを用いて、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ３’プライマー（ＲＹ－ＴＳ）（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）をそれぞれ１０ｐｍｏｌｅずつ使用し、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の条件で３５サイクルＰＣＲを行い、２％ＴＢＥアガロースゲルでＰＣＲバンドを確認し、確認された全てのＰＣＲバンドを、ゲル抽出過程を経て溶出した後、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡのどの部位でトランススプライシング反応が生じたかを塩基配列分析を通じて確認した。その結果、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ（序列番号１１）でトランススプライシングが発生したリアクションサイト及び発生頻度は下記の表１のとおりである。
【0094】
【表1】
【0095】
前記表１で確認されるように、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１番の部位で最も多いトランススプライシングが生じたことが確認された。前記結果から、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１番の塩基をターゲットとするトランススプライシングリボザイム（以下、「＋２１ターゲッティングリボザイム」という）がＡＰＯＥ４タンパク質の発現減少に効率的であることが分かる。
【0096】
４－２．セルマッピング（Ｃｅｌｌ ｍａｐｐｉｎｇ）
【0097】
試験管上でＡＰＯＥ４ ＲＮＡのトランススプライシングリアクションサイトマッピング（ｔｒａｎｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｍａｐｐｉｎｇ）の結果に続いて、これと同じ試験をＡＰＯＥ４ ＲＮＡとランダムライブラリーリボザイムを同時導入して２９３Ａ細胞内で実行した（図７）。その結果、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ（序列番号１１）でトランススプライシングが発生したリアクションサイト及び発生頻度は下記の表２のとおりである。
【0098】
【表2】
【0099】
４－３．各リアクションサイトをターゲットとするリボザイムのトランススプライシング効果の確認
【0100】
インビトロ及びセルのマッピングを介して確認されたターゲットサイトのうち重複して確認された＋３０、＋７１、＋７７、＋８０、＋８２サイトと、インビトロマッピングに最もトランススプライシング頻度の高い＋２１サイトを選別し、前記各サイトをターゲットとするリボザイムを製造してインビトロトランススプライシングリアクションを行ってトランススプライシングの有無を確認した。＋５６ターゲッティングリボザイムは対照群として使用した。
【0101】
より具体的には、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡ ０．１ｐｍｏｌｅを各トランススプライシングリボザイムライブラリーＲＮＡ １ｐｍｏｌｅと混合して、トランススプライシングリアクションを誘導した。各反応液でＲＮＡを回収し、ＲＴ－ＰＣＲを行って製造されたｃＤＮＡをＡＰＯＥ４ ＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃ５’プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＧＧ－３’）、ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ３’プライマー（５’－ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ－３’）を用いてＰＣＲ増幅し（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒、３５サイクル）、各増幅産物をアガロースゲルで電気泳動を介して確認した。
【0102】
その結果、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１、＋３０、＋７１、及び＋７７サイトをターゲットとするリボザイムによるトランススプライシングの効率に優れ、特に、＋２１ターゲッティングリボザイムと＋３０ターゲッティングリボザイムの効率が格別に優れていることが確認できた（図８）。
【0103】
ＡＰＯＥ４ ＲＮＡにおいて、＋２１番の塩基を含むターゲット領域は５’－ＧＧＡＧＧＵ－３’（序列番号３）であり、＋２１ターゲッティングリボザイムのＩＧＳは、５’－ＧＣＣＵＣＣ－３’（序列番号４）を有する。また、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡにおいて、＋３０番の塩基を含むターゲット領域は、５’－ＧＧＡＣＧＵ－３’（序列番号５）であり、＋３０ターゲッティングリボザイムのＩＧＳは、５’－ＧＣＧＵＣＣ－３’（序列番号６）を有する。
【0104】
実施形態５．＋２１ターゲッティングトランススプライシングリボザイムの最適化
【0105】
次に、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの標的部位を異にしたトランススプライシングリボザイムの標的特異性及びトランススプライシングの効率増加のために、上記の実施形態３と同様に長さの異なるＡＳ領域を導入したリボザイムを製造した後、Ｈｕｈ－７．５細胞、ＣＣＦ－ＳＴＴＧ１細胞、及びＵ１１８ＭＧ細胞に形質転換した後、トランススプライシングの発生程度をたんぱく質レベル及び遺伝子レベルで確認した。
【0106】
たんぱく質レベルで確認した結果、ＡＰＯＥ４ ＲＮＡの＋２１塩基をターゲットとするリボザイムは、ＡＳ領域の導入有無及びＡＳ領域の長さに関わらず、ＡＰＯＥ４を発現する細胞でＡＰＯＥ４ ＲＮＡのトランススプライシングを誘導し、特に、５０ｎｔの長さのＡＳ領域が導入されたリボザイムで著しく優れたトランススプライシングの効率を確認することができた（図９Ａ）。
【0107】
遺伝子レベルで、トランススプライシング産物の確認結果もたんぱく質レベルの確認結果と同一であり（図９Ｂ）、トランススプライシング産物の序列分析の結果、全てのトランススプライシングの予想位置で正確に反応が生じたことが確認された（図９Ｃ）。
【0108】
以上で本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されないことを明らかにする。従って、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とこれらの等価物によって定義されるものと言える。
【産業上の利用可能性】
【0109】
本発明のＡＰＯＥ４標的のトランススプライシングリボザイムは、それ自体でアルツハイマー病の発症率を高めるＡＰＯＥ４タンパク質の発現を抑制し、アルツハイマー病の予防又は治療のための薬剤として用いられることができ、トランススプライシングによってアルツハイマー病の発症率を低下させる遺伝子の発現を誘導でき、アルツハイマー病の治療遺伝子導入のためのプラットフォームとして用いられる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【配列表】
【国際調査報告】