特表 2022-543520 フルクトースの酵素的生産

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-13

(54)【発明の名称】フルクトースの酵素的生産

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/02 20060101AFI20221005BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20221005BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20221005BHJP

【ＦＩ】

C12P19/02 ZNA

C12N9/16 B

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570833

(86)(22)【出願日】2020-06-01

(85)【翻訳文提出日】2022-01-26

(86)【国際出願番号】 US2020000022

(87)【国際公開番号】W WO2020242538

(87)【国際公開日】2020-12-03

(31)【優先権主張番号】62/855,397

(32)【優先日】2019-05-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518059587

【氏名又は名称】ボヌモーズ、インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウィチェレキー、ダニエル、ジョセフ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050EE02

4B050LL02

4B064AF02

4B064CA21

4B064CB04

4B064CC09

4B064CD02

4B064DA10

(57)【要約】

フルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）が、１つ以上の二価陽イオン、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋及びＭｎ^２＋の存在下でフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）からフルクトースへの変換を触媒する工程による、糖類からのフルクトースの生産が本明細書で開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む、糖類からフルクトースを調製するための方法：
Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンの存在下でフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）によって触媒される、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をフルクトースに変換する工程
。

【請求項2】

Ｆ６ＰＰによって触媒される、Ｆ６Ｐをフルクトースに変換する工程が、Ｍｇ^２＋と、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンとの存在下のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

二価陽イオンの濃度が、０．０１ｍＭ～５００ｍＭの範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

二価陽イオンがＣｏ^２＋又はＭｎ^２＋である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

二価陽イオンがＣｏ^２＋である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

二価陽イオンがＭｎ^２＋である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換する工程をさらに含み、該工程がホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換する工程をさらに含み、該工程がホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

糖類が、スクロース、デンプン、又はアミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトトリオース、マルトデキストリン、マルトース及びグルコースからなる群から選択されるデンプン誘導体、から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

糖類をＧ１Ｐに変換する工程をさらに含み、該工程が少なくとも１つの酵素によって触媒される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

糖をＧ１Ｐに変換する工程における少なくとも１つの酵素が、α－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ及びスクロースホスホリラーゼならびにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

糖類がデンプンであり、デンプンをデンプン誘導体に変換する工程をさらに含み、前記デンプン誘導体が、デンプンの酵素加水分解によるか又はデンプンの酸加水分解によって調製されたものである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が方法において添加される、請求項１１又は１２に記載の方法。

【請求項14】

デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、α－アミラーゼ又はそれらの組合せによって触媒されるデンプンの酵素加水分解によって調製される、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれかに記載の方法であって、前記方法の工程が、約３７℃～約９５℃の範囲の温度、約５．０～約８．０の範囲のｐＨで、及び／又は約８時間～約４８時間行われる、方法。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれかに記載の方法であって、前記方法の工程が、単一のバイオリアクター中で行われる、方法。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれかに記載の方法であって、前記方法の工程が、ＡＴＰフリー、NAD(P)(H)フリー、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸が再利用され、及び／又は方法の少なくとも１つの工程が、エネルギー的に好ましい化学反応を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フルクトースの酵素的生産のための方法に関する。

【0002】

フルクトースは、多くの植物に見られる単純なケトン型の単糖であり、グルコースに結合して二糖であるスクロースを形成することが多い。商業的には、フルクトースは、サトウキビ、サトウダイコン及びトウモロコシ由来である。フルクトースが食品及び飲料に商業的に使用される主な理由は、そのコストが低いことに加えて、その高い相対的な甘味である。これは、全ての天然炭水化物の中で最も甘味が強い。フルクトースは、酵素でのトウモロコシシロップの処理及び、平衡状態によって収率が限定されるグルコースからフルクトースへの変換によって生産される人工甘味料である高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）中でも見られる。（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｆｒｕｃｔｏｓｅ＃Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ＿ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ－－３／７／１８アクセス）。或いは、フルクトースは、代替甘味料アルロース（例えば、国際公開第２０１６１６０５７３Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１５０３２７６１Ａ１号パンフレット、国際公開第２０１４０４９３７３Ａ１号パンフレットを参照）の製造のための前駆体として、又はヒドロキシメチルフルフラールの前駆体として使用され得、これらは次に２，５－フランジカルボン酸又は２，５－ジメチルフランなどの様々な有用な化学物質に変化させ得る（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ）。これらの用途は高純度フルクトースを必要とするが、一方で甘味料としての用途は高純度又は低純度フルクトースの何れかとして利用され得る。

【0003】

本発明の方法のうち少なくとも１つの工程がエネルギー的に有利な化学反応を含む、フルクトースの高収率、高純度生産のための費用効果の高い合成経路を開発する必要がある。さらに、方法の工程が１つのタンク又はバイオリアクター内で行われ得、及び／又は高価な分離工程が回避又は排除される製造方法が必要とされている。リン酸を再利用し得、及び／又は当該方法はリン酸の添加源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を使用することを必要としない、比較的低濃度のリン酸で行われ得るフルクトース生産の高収率で、高純度を達成する方法も必要とされている。

【0004】

フルクトースを調製するための酵素的な方法が、その全体において参照により組み込まれる国際公開第２０１８／１６９９５７号パンフレットで提供されている。フルクトース収率及び酵素活性を改善して、方法のコストを削減することが望ましい。これに関して、以下に記載されるように、フルクトースを生産するための方法において特定の二価陽イオンを使用すると、その結果、フルクトース６－リン酸ホスファターゼ活性及びフルクトース収率が顕著に改善する。

【0005】

本明細書に記載の発明は、一般に、フルクトースの酵素的生産のための改善された方法に関する。とりわけ、本発明の方法は、例えばＭｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せを含む１つ以上の二価陽イオンの存在下でのフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）によって触媒される反応によって、フルクトース６－リン酸をフルクトースに変換する工程を含む。従って、本発明による方法は、Ｍｇ^２＋と、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンとの存在下でのＦ６ＰＰにより触媒される反応によって、フルクトース６－リン酸をフルクトースに変換する工程を含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１は、デンプン又はその誘導生成物をフルクトースに変換する酵素経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＩＡ、イソアミラーゼ；ＰＡ、プルラナーゼ；ａＧＰ、アルファグルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ；ＭＰ、マルトースホスホリラーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＰ、フルクトース６－リン酸ホスファターゼ。

【0007】

【図2】図２は、スクロースをフルクトースに変換する酵素経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＳＰ、スクロースホスホリラーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ｆ６ＰＰ、フルクトース６－リン酸ホスファターゼ。

【0008】

【図3】図３は、マルトデキストリンからのフルクトースの収率に対する、様々な二価陽イオンとマグネシウムとの効果の研究のクロマトグラムを示す。フルクトースは～１９分の保持時間で見られ、出発物質は８～１１．５分の間、マルトトリオースは１１．７５分、マルトースは１２．７５分、グルコースは１４分で見られる。さらなる二価陽イオンなし＝青色；カルシウム＝赤色；コバルト＝緑色；マンガン＝ピンク；銅＝金；及び亜鉛＝紫。

【0009】

【図4】図４は、反応混合物中のマグネシウムとの様々な濃度のＣｏ２＋及びＭｎ２＋の試験のクロマトグラムを示す。１ｍＭコバルト＝青色；０．５ｍＭコバルト＝赤色；０．１ｍＭコバルト＝緑色；１ｍＭマンガン＝ピンク；０．５ｍＭマンガン＝金色；及び０．１ｍＭマンガン＝紫色。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本明細書に記載の発明は、フルクトース生産コストを低下させながら、高い産物収率でフルクトースを生産するための改善された、酵素的な経路又は方法を提供する。これらの方法によって生産されるフルクトースも本明細書に記載される。フルクトースの酵素的生産のための、本発明の改善された方法は、二価陽イオンの存在下でフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）によって触媒される、フルクトース６－リン酸をフルクトースに変換する工程を含む。例えば、Ｆ６Ｐをフルクトースに変換するための本発明の方法は、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の二価陽イオンの存在下で行われ得る。いくつかの実施形態は、Ｍｇ^２＋と、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンとの存在下でＦ６ＰＰによって触媒される、フルクトース６－リン酸をフルクトースに変換する工程を含む。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、二価陽イオンはＦ６ＰＰを安定化し、その結果、活性がより高くなり、全体的な収率がより高くなると考えられる。当技術分野で公知のような適切な塩を使用して、本発明による方法に所望の金属陽イオンを導入し得る。例えば、ハロゲン化物、例えば塩化物又は硫酸塩などを本発明による方法で使用し得る。

【0011】

いくつかの本発明の方法では、二価陽イオンの濃度は０．０１ｍＭ～５００ｍＭの範囲である。本発明のいくつかの好ましい改善された酵素的な方法では、二価陽イオンはＣｏ^２＋又はＭｎ^２＋である。いくつかの好ましい実施形態では、二価陽イオンはＣｏ^２＋である。他の好ましい実施形態では、二価陽イオンはＭｎ^２＋である。二価陽イオンがＣｏ^２＋である場合、Ｃｏ^２＋の濃度は約０．０１ｍＭ～５００ｍＭの範囲である。例えばＣｏ^２＋の濃度は約０．１ｍＭである。０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ又は５００ｍＭ。二価陽イオンがＭｎ^２＋である場合、Ｍｎ^２＋の濃度は約０．０１ｍＭ～５００ｍＭの範囲である。例えばＭｎ^２＋の濃度は、約０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．４５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．５５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．６５ｍＭ、０．７ｍＭ、０．７５ｍＭ、０．８ｍＭ、０．８５ｍＭ、０．９ｍＭ、０．９５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ又は５００ｍＭである。

【0012】

本発明の改善された酵素的な方法では、Ｆ６ＰＰはフルクトースに特異的であり、即ちＦ６ＰＰは、例えばグルコース６－リン酸などの他の糖リン酸よりもフルクトースに対して高い比活性を有する。Ｆ６ＰＰの非限定的な例は、配列番号１（ＭＩＥＡＶＩＦＤＭＤＧＶＩＩＮＳＥＰＩＨＹＫＶＮＱＩＩＹＥＫＬＧＩＫＶＰＲＳＥＹＮＴＦＩＧＫＳＮＴＤＩＷＳＦＬＫＲＫＹＮＬＫＥＳＶＳＳＬＩＥＫＱＩＳＧＮＩＫＹＬＫＳＨＥＶＮＰＩＰＧＶＫＰＬＬＤＥＬＳＥＫＱＩＴＴＧＬＡＳＳＳＰＥＩＹＩＥＴＶＬＥＥＬＧＬＫＳＹＦＫＶＴＶＳＧＥＴＶＡＲＧＫＰＥＰＤＩＦＥＫＡＡＲＩＬＧＶＥＰＰＨＣＶＶＩＥＤＳＫＮＧＶＮＡＡＫＡＡＧＭＩＣＩＧＹＲＮＥＥＳＧＤＱＤＬＳＡＡＤＶＶＶＤＳＬＥＫＶＮＹＱＦＩＫＤＬＩ）に示されるアミノ酸配列を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ８ＣＷＶ３である。

【0013】

Ｆ６ＰＰの例としては、上述のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤに対する少なくとも２５％、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％又は少なくとも９４％及びさらに最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する何れかの相同体も挙げられる。

【0014】

本発明のいくつかの好ましい改善された酵素的な方法では、Ｆ６Ｐをフルクトースに変換するためのＦ６ＰＰは、触媒作用のためのロスマノイド折り畳みドメインを含有するが含有することに限定されず；さらに、限定されないが、基質特異性のためのＣ１又はＣ２キャッピングドメインを含有し；加えて、限定されないが、第２のＡｓｐが一般的な酸／塩基触媒である二価陽イオンを配位させるために、ロスマノイド折り畳みの第１のβ鎖にＤｘＤシグネチャーを含有し；さらに、限定されないが、反応中間体の安定性を助けるロスマノイド折り畳みの第２のβ鎖の末端にＴｈｒ又はＳｅｒを含有し；さらに、限定されないが、反応中間体の安定性を助けるロスマノイド折り畳みの第３のβ鎖に対してＣ末端のα－ヘリックスのＮ末端にＬｙｓを含有し；さらに、限定されないが、二価陽イオンを配位させるために、ロスマノイド折り畳みの第４のβ鎖の末端にＧＤｘｘｘＤ、ＧＤｘｘｘｘＤ、ＤＤ又はＥＤシグネチャーを含有する。これらの特徴は当技術分野で公知であり、例えば、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＡＤ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６；３６１；１００３－１０３４を参照のこと。

【0015】

本発明によるフルクトースを調製するためのいくつかの改善された酵素的な方法はまた、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに酵素により変換する工程を含む。他の実施形態では、本発明は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換する工程をさらに含む。またさらなる実施形態では、フルクトース生産工程は、少なくとも１つの酵素によって触媒される、糖類をＧ１Ｐに変換する工程も含む。デンプン誘導体を含む一部のフルクトース生産工程では、収率を高めるために４－α－グルコトランスフェラス（ｇｌｕｃｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓ）（４ＧＴ）が添加される。

【0016】

一実施形態では、本発明によるフルクトースを調製するための改善工程は、例えば、以下の工程を含む：（ｉ）１つ以上の酵素を使用した、糖類からグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）への変換；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を用いたＧ１ＰからＧ６Ｐへの変換；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を用いたＧ６ＰからＦ６Ｐへの変換；（ｉｖ）Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンの存在下でのＦ６ＰＰを使用したＦ６Ｐからフルクトースへの変換。別の実施形態では、本発明によるフルクトースを調製するための改善工程は、例えば、以下の工程を含む：（ｉ）１つ以上の酵素を使用した糖類からグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）への変換；（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を用いたＧ１ＰからＧ６Ｐへの変換；（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を用いたＧ６ＰからＦ６Ｐへの変換；（ｉｖ）Ｍｇ^２＋と、Ｚｎ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋及びそれらの組合せからなる群から選択される二価陽イオンとの存在下でのＦ６ＰＰを使用したＦ６Ｐからフルクトースへの変換。

【0017】

典型的には、開示の工程で使用される酵素単位の比は、１：１：１：１：１（４ＧＴ：αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ｆ６ＰＰ）である。生成物収率を最適化するために、これらの比を何らかの数の組合せで調整し得る。例えば、特定の酵素は、他の酵素の量に対して約２倍、３倍、４倍、５倍などの量で存在し得る。

【0018】

本発明の改善工程の重要な長所の１つは、方法の工程を単一のバイオリアクター又は反応容器中で行い得ることである。或いは、これらの工程を直列に配置される複数のバイオリアクター又は反応容器中でも行い得る。

【0019】

次いで、脱リン酸化工程中に生じたリン酸イオンは、特に全ての方法の工程が単一のバイオリアクター又は反応容器中で行われる場合、糖類をＧ１Ｐに変換する方法の工程で再利用され得る。開示される方法においてリン酸を再利用する能力は、非化学量論量のリン酸を使用することを可能にし、反応リン酸濃度を低く保つ。これは、全体的な経路及び全体的な方法の速度に影響を及ぼすが、個々の酵素の活性を制限せず、フルクトース生産方法の全体的な効率的働きを可能にする。

【0020】

例えば、各方法における反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ又はより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、各方法における反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ又は約５５ｍＭであり得る。

【0021】

リン酸濃度が低いと、全リン酸量が低いため生産コストが低下し、したがってリン酸除去コストが低下する。また、これは、高濃度の遊離リン酸による、方法における酵素の阻害も防ぎ、リン酸汚染の可能性を低下させる。

【0022】

いくつかの実施形態では、本発明の改善された酵素的な方法は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加せず、即ちＡＴＰ不含で、行われる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を添加する必要なく、即ちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）不含でも行われ得る。他の長所としては、フルクトースを製造するための開示される方法の最後の工程がエネルギー的に好ましい化学反応を含むという事実も挙げられる。

【0023】

デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体並びにスクロース及びその誘導体からフルクトースを調製する方法は、例えば、その全体において参照により組み込まれる国際公開第２０１８／１６９９５７号パンフレットで見ることができる。

【0024】

デンプンの誘導体は、デンプンの酵素的加水分解によって又はデンプンの酸加水分解によって調製され得る。具体的には、デンプンの酵素による加水分解は、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ．３．２．１．６８）；α－１，６－グルコシド結合を加水分解するプルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ．３．２．１．４１）；短いマルトオリゴ糖のトランスグリコシル化を触媒し、より長いマルトオリゴ糖をもたらす４－α－グルカノトランスフェラーゼ（４ＧＴ、ＥＣ．２．４．１．２５）；又はα－１，４－グルコシド結合を切断するα－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）によって触媒又は促進され得る。

【0025】

さらに、セルロースの誘導体は、セルラーゼ混合物によって触媒されるセルロースの酵素的加水分解によって、酸によって、又はバイオマスの前処理によって調製され得る。

【0026】

糖をＧ１Ｐに変換するために使用される酵素は、αＧＰを含み得る。例えば、糖類がデンプンを含む方法では、Ｇ１Ｐは、αＧＰによってデンプンから生成され；この糖類が可溶性デンプン、アミロデキストリン又はマルトデキストリンを含有する場合、Ｇ１Ｐは、可溶性デンプン、アミロデキストリン又はマルトデキストリン及び遊離リン酸からαＧＰにより生成される。糖類がマルトデキストリンであるいくつかの実施形態では、マルトデキストリンが脱灰される。他の実施形態では、マルトデキストリンは脱灰されない。

【0027】

糖類がマルトースを含み、酵素がマルトースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはマルトースホスホリラーゼによってマルトース及び遊離リン酸から生成される。糖類がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロース及び遊離リン酸から生成される。

【0028】

糖類がセロビオースを含み、酵素がセロビオースホスホリラーゼを含有する場合、セロビオースホスホリラーゼによってセロビオースからＧ１Ｐが生成され得る。糖類がセロデキストリンを含有し、酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐは、セロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリン及び遊離リン酸から生成され得る。糖類をＧ１Ｐに変換する際、糖類がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロース及び遊離リン酸から生成され得る。

【0029】

フルクトースはスクロースからも作製され得る。スクロースをフルクトースに変換する本発明の改善された酵素的な方法は、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）によって触媒されるスクロース及び遊離リン酸からのＧ１Ｐの生成；ＰＧＭによって触媒されるＧ１ＰからＧ６Ｐへの変換；ＰＧＩによって触媒されるＧ６ＰからＦ６Ｐへの変換；Ｆ６ＰＰによって触媒されるＦ６Ｐからフルクトースへの変換を含む。Ｆ６Ｐ脱リン酸化工程中に生成されるリン酸イオンは、スクロースをＧ１Ｐに変換する工程で再利用され得る。

【0030】

本発明の改善された方法は、デンプン中の多糖類及びオリゴ糖類、セルロース、スクロース及びそれらの誘導産物などの糖類をフルクトースに変換するための方法を含む。無細胞酵素カクテルを使用してデンプン、セルロース、スクロース及びそれらの誘導生成物をフルクトースに変換するために、人工（非天然）ＡＴＰ不含酵素経路が提供され得る。

【0031】

いくつかの酵素は、デンプンを加水分解してＧ１Ｐ収量を増加させるために使用され得る。このような酵素としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ及びα－アミラーゼが挙げられる。コーンスターチは、αＧＰ作用を妨げる多くの分岐を含有する。イソアミラーゼ及びプルランセ（ｐｕｌｌｕｌａｎｓｅ）を使用してデンプンの分岐をなくし、直鎖状アミロデキストリンを得ることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼは、α－１，６－グリコシド結合を切断し、α－グルカンホスホリラーゼによるデンプンのより完全な分解を可能にする。α－アミラーゼはα－１，４－グリコシド結合を切断するので、フルクトースへのより迅速な変換及び溶解性の向上のためにデンプンを断片（即ちマルトデキストリン）に分解するため、α－アミラーゼが使用される。

【0032】

マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を使用して、分解産物マルトースをＧ１Ｐ及びグルコースへとリン酸化的に切断することによってフルクトース収率を上昇させ得る。或いは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を使用して、分解産物であるグルコース、マルトース及びマルトトリオースをより長いマルトオリゴ糖へと再利用することによってフルクトース収率を上昇させ得；これをαＧＰによってリン酸化的に切断してＧ１Ｐを得ることができる。

【0033】

さらに、セルロースは、最も豊富な生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成成分である。非食品リグノセルロース性バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニン並びに他の微量成分を含有する。Ａｖｉｃｅｌ（微結晶セルロース）、再生非晶質セルロース、細菌セルロース、濾紙などを含む純粋なセルロースは、一連の処理を介して調製され得る。部分加水分解セルロース系基質としては、重合度が７を超える非水溶性セロデキストリン、重合度が３～６の水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース及びフルクトースが挙げられる。

【0034】

セルロース及びその誘導生成物は、一連の工程を通してフルクトースに変換され得る。本発明の改善された方法はまた、以下の工程を含むインビトロ合成経路を提供する：それぞれセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によって触媒される、セロデキストリン及びセロビオース並びに遊離リン酸からのＧ１Ｐの生成；ＰＧＭによって触媒されるＧ１ＰからＧ６Ｐへの変換；ＰＧＩによって触媒されるＧ６ＰからＦ６Ｐへの変換。この方法では、セロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに変換する工程によってリン酸イオンが再利用され得る。

【0035】

いくつかの酵素を使用して、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解し得る。このような酵素には、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが含まれるが、β－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。

【0036】

セルロース加水分解及びＧ１Ｐ生成の前に、セルロース及びバイオマスを前処理してそれらの反応性を高め、セルロース鎖の重合度を低下させ得る。セルロース及びバイオマス前処理法は、希酸による前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画化、アンモニア繊維膨張、アンモニア水浸漬、イオン液体処理及び、塩酸、硫酸、リン酸及びそれらの組合せを含む濃酸を使用することによる部分加水分解を含む。

【0037】

ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本発明による方法に付加し得、したがって分解産物グルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによってフルクトースの収率を上昇させる。

【0038】

フルクトースは、グルコースから生産され得る。フルクトース生産のための方法は、ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）によって触媒されるグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成させる工程及びＰＧＩによって触媒されるＧ６ＰからＦ６Ｐへの変換の工程を含み得る。

【0039】

当技術分野で公知の何らかの適切な生物学的に適合性の緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａなどを本発明の方法のそれぞれで使用し得る。本発明による方法のための反応緩衝液は、５．０～８．０の範囲のｐＨを有し得る。より好ましくは、反応緩衝液ｐＨは約６．０～約７．３の範囲であり得る。例えば、反応緩衝液ｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２又は７．３であり得る。

【0040】

本発明の方法のそれぞれにおいて、方法の工程が行われる反応温度は、３７～９５℃の範囲であり得る。より好ましくは、この工程は、約４０℃～約９０℃の範囲の温度で行い得る。温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃又は約９０℃であり得る。好ましくは、反応温度は約５０℃である。

【0041】

フルクトースを生成させるための改善された方法のそれぞれの反応時間は、必要に応じて調整され得、例えば、約８時間～約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間又は約４８時間であり得る。より好ましくは、反応時間は約２４時間である。いくつかの実施形態では、フルクトースは連続反応で生産される。

【0042】

本発明の方法は、低コストの出発材料を使用し、原料及び生成物の分離に関連するコストを低減することによって製造コストを低下させる。デンプン、セルロース、スクロース及びそれらの誘導体のいくつかは、例えばラクトースよりも安価な原料である。フルクトースがバイオマス又はラクトースから生産される場合、収率は本発明よりも低く、フルクトースはクロマトグラフィーを介して他の糖から分離しなければならず、これにより製造コストがより高くなる。さらに、本発明の方法は動物を含まない。

【0043】

本発明によるＦ６Ｐをフルクトースに変換する工程は、原料にかかわらず、不可逆的ホスファターゼ反応である。従って、後続の生成物分離コストを効果的に最小限に抑えながら、フルクトースが非常に高い収率で生産される。

【0044】

いくつかの実施形態では、本発明は、フルクトースの無細胞調製を含み、細胞内外への基質／生成物の輸送を遅くすることが多い細胞膜が排除されているので、比較的高い反応速度を有する。それはまた、栄養豊富な発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終産物を有する。

【0045】

本発明の特定の実施形態は、フルクトースを生産するための本明細書に記載の改善された方法によって生産されるフルクトースである。

【0046】

例
材料及び方法
全ての化学物質は試薬グレード以上であり、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）又はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。制限酵素、Ｔ４リガーゼ及びＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）の何れかによって合成された。ＤＮＡ操作のための宿主細胞としてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｓｉｇ１０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用し、組み換えタンパク質発現のための宿主細胞としてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用した。１００ｍｇ Ｌ－１アンピシリン又は５０ｍｇ Ｌ－１カナマイシンの何れかを含むＺＹＭ－５０５２培地をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞増殖及び組み換えタンパク質発現のために使用した。プルラナーゼ（カタログ番号：Ｐ１０６７）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）によって製造された。マルトースホスホリラーゼ（カタログ番号：Ｍ８２８４）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｄｅａｓｈｅｄ Ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ＤＥ５はＣａｒｇｉｌｌ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。

【0047】

１００ｍｇ Ｌ－１アンピシリン又は５０ｍｇ Ｌ－１カナマイシンの何れかを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地を含む１Ｌエーレンマイヤーフラスコ中でタンパク質発現プラスミドを保有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を温置した。２２０ｒｐｍで回転振盪しながら３７℃で１６～２４時間、細胞を増殖させた。１２℃での遠心分離によって細胞を回収し、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）（熱沈殿及びセルロース結合モジュール）又は３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．５）（ニッケル精製）の何れかで１回洗浄した。細胞ペレットを同じ緩衝液中で再懸濁し、超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ５００；パルスオン５秒、オフ１０秒、振幅５０％で合計２１分）によって溶解させた。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を精製した。

【0048】

３つのアプローチを使用して、様々な組み換えタンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付加タンパク質をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製した。表面積が大きい再生非晶質セルロース上での高親和性吸着を通じて、セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）及び自己開裂インテインを含有する融合タンパク質を精製した。６０～９５℃で５～３０分間の熱沈殿を使用して、超耐熱性酵素を精製した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって組み換えタンパク質の純度を調べた。

【0049】

Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．（サーマス種）ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１由来のα－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０）を使用した。カルジバチルス・デビリス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）由来のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）を使用した。サームス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）を使用した。アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来の組み換え４－α－グルカノールトランスフェラーゼを使用した（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅ８ＭＸＰ８）。ハロサーモスリックス・オレニイ（Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ ｏｒｅｎｉｉ）由来のフルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ８ＣＷＶ３）を使用した。

【0050】

例１．マルトデキストリンからフルクトースへの変換に対する二価陽イオンの効果を決定するための二価陽イオンの試験。マルトデキストリンからフルクトースへの変換に対する二価陽イオンの効果を決定するために様々なさらなる二価陽イオンを試験した。５０ｍＭホスファートｐＨ７．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、さらなる二価陽イオン（２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．９６ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＣｕＣｌ_２、２ｍＭ ＺｎＣｌ_２、２ｍＭ ＣｏＣｌ_２、２ｍＭ ＭｎＣｌ_２）、２００ｇ／Ｌの脱分岐及び脱灰マルトデキストリン、０．８ｇ／Ｌ αＧＰ、０．１ｇ／Ｌ ＰＧＭ、０．１ｇ／Ｌ ＰＧＩ、１．０ｇ／Ｌ Ｆ６ＰＰ及び０．０５ｇ／Ｌ ４ＧＴの反応物を調製し、５０℃で２４時間温置した。１６、２０及び２４時間で、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を用いた酵素の濾過を介して反応を停止させた。Ｓｕｐｅｌ Ｃｏｇｅｌ Ｐｂカラム及び屈折率検出器を使用して生成物フルクトースを評価した。試料を０．６ｍＬ／分で超純水中に８０℃で２５分間流した。１６時間で生成されたフルクトースの量を使用して各反応の相対活性を決定し、同時に、２４時間で生成されたフルクトースの量（完全反応）を使用して各反応の相対収率を決定する。例えば、２４時間で、さらなる二価陽イオン反応がないとマルトデキストリンの重量でフルクトースの～約４１％の収率しか達成しないが、コバルト反応はマルトデキストリンの重量でフルクトースの～約８８％の収率を達成する。結果を表１及び図３で示す：いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、示される利益の殆どは、Ｆ６ＰＰの安定性の促進に起因すると考えられる。

【表1】

【0051】

例２．マルトデキストリンからフルクトースへの変換に対するコバルト及びマンガンのさらなる特徴評価。コバルト及びマンガンが最も効果があったので、コバルト又はマンガンの濃度を除いて例１と同じ濃度勾配試験を行った。１６時間で生成されたフルクトースの量を使用して各反応の相対活性を決定し、同時に、２４時間で生成されたフルクトースの量（完全反応）を使用して各反応の相対収率を決定する。図４のクロマトグラムは、マンガンが０．１ｍＭ以下の低濃度で有効であるのに対して、コバルトは１ｍＭ未満で有効性を失うことを示す。１ｍＭコバルト＝青色；０．５ｍＭコバルト＝赤色；０．１ｍＭコバルト＝緑色；１ｍＭマンガン＝ピンク；０．５ｍＭマンガン＝金色；及び０．１ｍＭマンガン＝紫色。表２は、上記反応の活性％（１６時間の時点）並びに相対収率（２４時間の時点）を示す。

【表2】

【0052】

例３：マルトデキストリンからフルクトースへの変換に対するマグネシウム及びコバルト／マンガンの相互依存。マグネシウム及びコバルト／マンガンの相互依存性を決定するために、マグネシウムの漸増量又はマグネシウムを含まないコルバルト／マンガンの漸増量で実験を行った。総二価金属が以下：２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＣｏＣｌ_２又は１ｍＭ ＭｎＣｌ_２と等しいことを除いて、反応は例１と同じである。１６時間で生成されたフルクトースの量を使用して各反応の相対活性を決定し、同時に、２４時間で生成されたフルクトースの量（完全反応）を使用して各反応の相対収率を決定する。表３は、上記反応の活性％（１６時間の時点）並びに相対収率（２４時間の時点）を示す。

【0053】

まとめると、この例は、一般に、二価陽イオンがより多い方が反応に有益であることを示す。驚くべきことに、５倍のマグネシウム濃度を用いた反応は、マンガンのみを用いた反応と同様の％活性及び相対収率を示した。マグネシウムとマンガン又はコバルトとの混合物は、導電率又はイオン強度を制限することに目を向けた工程に好ましい。

【表3】

【0054】

配列表

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2022543520000001.app

【国際調査報告】