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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-13
(54)【発明の名称】温度制御下における顆粒球コロニー刺激因子の精製
(51)【国際特許分類】
C07K 14/535 20060101AFI20221005BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20221005BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20221005BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20221005BHJP
B01D 15/36 20060101ALI20221005BHJP
B01D 15/22 20060101ALI20221005BHJP
B01D 15/12 20060101ALI20221005BHJP
B01D 15/42 20060101ALI20221005BHJP
【ＦＩ】
C07K14/535 ZNA
C07K1/18
A61K38/19
A61P7/00
B01D15/36
B01D15/22
B01D15/12
B01D15/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500904
(86)(22)【出願日】2020-07-07
(85)【翻訳文提出日】2022-03-03
(86)【国際出願番号】 US2020041060
(87)【国際公開番号】W WO2021007243
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】62/871,905
(32)【優先日】2019-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518377997
【氏名又は名称】タンベックス バイオファーマ ユーエスエー，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100170852
【弁理士】
【氏名又は名称】白樫 依子
(72)【発明者】
【氏名】ジェニファー レニー ホップ
【テーマコード（参考）】
4C084
4D017
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA06
4C084BA44
4C084DA19
4C084MA17
4C084MA66
4C084ZA511
4C084ZA512
4D017AA09
4D017BA07
4D017CA13
4D017DA03
4D017DB02
4H045AA10
4H045AA40
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA11
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA21
4H045GA22
4H045GA23
4H045GA25
4H045GA26
(57)【要約】
本明細書においては、特に、組成物、システム、及び顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を精製するための方法を提供する。本開示の方法及びシステムにより得られるＧＣＳＦ、それを含む医薬組成物並びに疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする個体の疾患又は健康状態を治療及び／又は予防するための方法も提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を精製するための方法であって、前記方法は、ＧＣＳＦ含有試料を、前記試料中の前記ＧＣＳＦに結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を備えるクロマトグラフィー用容器に負荷することであって、前記クロマトグラフィー用容器は、温度制御された囲いの中に配置されており、且つ前記クロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は、約７℃～約１３℃に設定されていること、及び
前記ＧＣＳＦを前記ＡＥＸ材料から溶出緩衝液を用いて溶出することにより、前記精製されたＧＣＳＦを得ること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記ＧＣＳＦ含有試料は、前記クロマトグラフィー用容器に、温度制御された囲いの中に配置された流路を用いて負荷され、前記流路の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記容器の囲い及び前記流路の囲いの前記設定温度は等しい、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記クロマトグラフィー用容器の囲い及び前記流路ジャケットの囲いの前記設定温度は異なる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記クロマトグラフィー用容器の囲い及び前記流路の囲いの少なくとも１つの温度は約１０℃に設定されている、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記クロマトグラフィー用容器は、カラム、槽、充填床、流動床、カートリッジ、内封された膜、貯留器、チャンバ、コンテナ及び混合槽からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項7】
前記流路は、チューブ、パイプ、バッグ、コンテナ、貯蔵タンク、混合槽又は他の流体案内手段である、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記方法は、前記ＧＣＳＦ試料を負荷する前に、前記ＡＥＸ材料を、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨが約７．０～約８．０である平衡化緩衝液で平衡化することを更に含む、請求項１～７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記平衡化緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨは約７．６である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記方法は、前記ＧＣＳＦを溶出する前に、未結合又は弱く結合している夾雑物を除去するために、前記ＡＥＸ材料を洗浄緩衝液で洗浄することを更に含む、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記洗浄緩衝液及び前記平衡化緩衝液は、同一の緩衝液組成を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＧＣＳＦ含有試料は、負荷緩衝液を含む、請求項１～１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記負荷緩衝液のｐＨは、約７．４～約８．０である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＧＣＳＦ試料の前記クロマトグラフィー用容器への負荷は、約１．５～約３．０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される、請求項１～１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記溶出緩衝液は、約３０ｍＭ～６０ｍＭのＴｒｉｓ、約３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．４～約８．０である、請求項１～１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記溶出緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ、約５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．７である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＡＥＸ材料からの前記ＧＣＳＦの溶出は、約７．４～約８．２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される、請求項１～１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＡＥＸ材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１～１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＡＥＸ材料は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂を含む、請求項１～１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＥＸ材料のストリッピング及び／又はサニテーションの１又は複数の段階を更に含む、請求項１～２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、全ての段階のための直線流速で操作される、請求項１８～２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記直線流速は、約１５０ｃｍ／ｈｒである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ストリッピング及びサニテーション段階の少なくとも１つは、５０ｃｍ／ｈｒで実施される、請求項２１～２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＧＣＳＦは、組換えヒトＧＣＳＦ（ｈＧＣＳＦ）又はその変異体である、請求項１～２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記試料は、組換え真核細胞又は組換え原核細胞から得られたＧＣＳＦを含む、請求項１～２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項27】
少なくとも１つの追加の精製プロセスを更に含む、請求項１～２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記少なくとも１つの追加の精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、遠心分離、ダイアフィルトレーション及び限外濾過からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記少なくとも１つの追加の精製プロセスは、前記ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの前に実施される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記少なくとも１つの追加の精製プロセスは、前記ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの後に実施される、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項31】
ＧＣＳＦに結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を備えるクロマトグラフィー用容器を備える、ＧＣＳＦを製造するためのシステムであって、前記クロマトグラフィー用容器は、温度制御された囲いで覆われており、前記クロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は、約７℃～約１３℃に設定されている、システム。
【請求項32】
温度制御された囲いの中に配置された流路を更に含み、前記流路の囲いの少なくとも一部の温度は、約７℃～約１３℃に設定されている、請求項３１に記載のシステム。
【請求項33】
請求項１～３０の何れか一項に記載の方法又は請求項３１若しくは３２に記載のシステムにより精製された顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）。
【請求項34】
請求項３３に記載のＧＣＳＦを含む医薬組成物。
【請求項35】
前記医薬組成物は水性組成物、凍結乾燥物又は粉末である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項36】
疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療又は予防するための方法であって、前記対象に、請求項３３に記載のＧＣＳＦ及び／又は請求項３４若しくは３５に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項37】
前記疾患又は健康状態は、好中球減少症である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，９０５号明細書の優先権の利益を主張するものである。上に参照した出願の開示内容を、図面も含め、その全体を参照することにより本明細書に明示的に援用する。
本出願は、２０１９年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，９０５号明細書の優先権の利益を主張するものである。上に参照した出願の開示内容を、図面も含め、その全体を参照することにより本明細書に明示的に援用する。
【0002】
発明の分野
本開示は、全体として、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を精製するための、温度制御下における陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィープロセスに関する。
本開示は、全体として、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を精製するための、温度制御下における陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィープロセスに関する。
【背景技術】
【0003】
背景
バイオ医薬品の安全性を確保するため、規制当局は、ヒトに投与することが意図された組換えタンパク質に対し厳しい精製基準及び関連する品質特性（例えば、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、純度及び生物活性）を課している。タンパク質をベースとする治療用製品に要求される共通の基準は、目的の組換えタンパク質の凝集体、断片及び不活性変異体等の製品関連の夾雑物並びにクロマトグラフィー樹脂から浸出したリガンド、培養培地成分、宿主細胞タンパク質及び核酸、混入ウイルス並びに内毒素等のプロセス関連の夾雑物等の不純物を実質的に含まないことである。
バイオ医薬品の安全性を確保するため、規制当局は、ヒトに投与することが意図された組換えタンパク質に対し厳しい精製基準及び関連する品質特性（例えば、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、純度及び生物活性）を課している。タンパク質をベースとする治療用製品に要求される共通の基準は、目的の組換えタンパク質の凝集体、断片及び不活性変異体等の製品関連の夾雑物並びにクロマトグラフィー樹脂から浸出したリガンド、培養培地成分、宿主細胞タンパク質及び核酸、混入ウイルス並びに内毒素等のプロセス関連の夾雑物等の不純物を実質的に含まないことである。
【0004】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド及び他の生体分子の分離及び精製に最も一般的に使用されている技法の一つである。ＩＥＣを使用する主な理由の一部は、その適応範囲の広さ、容量の大きさ及びシステムの効率の潜在的な高さにある。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）に関しては、効率的であり、スケーラブルであり、且つ工業的に適用可能な、例えば、商業的製造規模で実施可能な精製プロセスを発展させることを目指して、ＧＣＳＦの単離及び精製に関する研究が長年に亘り行われている。ＧＣＳＦの精製及び調製にＩＥＣを適用することは、本分野を前進させる重要な一歩であった。ＧＣＳＦの精製収率に影響を与える幾つかのクロマトグラフィーパラメータを詳細に調査したところ、移動相中の緩衝剤の濃度、ｐＨ値、チオールの対の濃度及び比率並びに移動相の流速等のパラメータが非常に重要であることが示された。一方、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）等の多くの既存のＩＥＣ操作においては、ＧＣＳＦが低収率であり、及び／又は収率が安定しないことが観測されている。このように収率が低く及び／又は安定しないことは、ＧＣＳＦ製造プロセスのスケールアップの設計及び発展を図る上で最も困難な障壁の一部である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、費用対効果が高く、ＧＣＳＦの回収率が高く且つ安定しており、及び大規模生産に適応可能な改良された製造方法に対する要求は依然として満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【0006】
概要
本明細書においては、特に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質を精製及び／又は調製するための組成物、方法及びシステムを提供する。本開示の特定の態様及び実施形態は、高く且つ安定した収率でＧＣＳＦを得るために低温条件下で実施されるＡＥＸ手順を用いて、ＧＣＳＦタンパク質の精製を最適化する新規な手法に関する。特に本発明者らは、ジャケット付きクロマトグラフィーカラムを使用し、ジャケットの少なくとも一部の温度を約７℃～約１３℃に設定した結果、驚くべきことに、ＧＣＳＦ製品の収率が向上することを示した。この種の方法、システムにより得られるＧＣＳＦ、それを含む医薬組成物並びに疾患又は健康状態の治療及び／又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療及び／又は予防するための方法も提供する。
本明細書においては、特に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質を精製及び／又は調製するための組成物、方法及びシステムを提供する。本開示の特定の態様及び実施形態は、高く且つ安定した収率でＧＣＳＦを得るために低温条件下で実施されるＡＥＸ手順を用いて、ＧＣＳＦタンパク質の精製を最適化する新規な手法に関する。特に本発明者らは、ジャケット付きクロマトグラフィーカラムを使用し、ジャケットの少なくとも一部の温度を約７℃～約１３℃に設定した結果、驚くべきことに、ＧＣＳＦ製品の収率が向上することを示した。この種の方法、システムにより得られるＧＣＳＦ、それを含む医薬組成物並びに疾患又は健康状態の治療及び／又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療及び／又は予防するための方法も提供する。
【発明を実施するための形態】
【0007】
一態様においては、本明細書において、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を精製するための様々な方法であって、（ａ）試料中のＧＣＳＦと結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を含むクロマトグラフィー用容器（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｖｅｓｓｅｌ）にＧＣＳＦ含有試料を負荷することであって、クロマトグラフィー用容器は温度制御された囲い（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）の中に配置されており、且つクロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されていること、及び（ｂ）ＡＥＸ材料から溶出緩衝液を用いてＧＣＳＦを溶出することにより精製されたＧＣＳＦを得ること、を含む方法を提供する。
【0008】
本開示の方法を例示する非限定的な実施形態は、以下に示す１又は複数の特徴を含む。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、クロマトグラフィー用容器に、温度制御された囲いの中に配置された流路を用いて負荷され、この流路の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている。幾つかの実施形態において、容器の囲い及び流路の囲いの設定温度は等しい。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路ジャケットの囲いの設定温度は異なる。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いの少なくとも１つの温度は約１０℃に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、カラム、槽（ｔａｎｋ）、充填床、流動床、カートリッジ、内封された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）膜、貯留器（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）、チャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）、コンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）及び混合槽（ｍｉｘｉｎｇ ｖｅｓｓｅｌ）からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、流路は、チューブ（ｔｕｂｅ）、パイプ（ｐｉｐｅ）、バッグ（ｂａｇ）、コンテナ、貯蔵タンク（ｓｔｏｒａｇｅ ｔａｎｋ）、混合槽又は他の流体案内手段（ｆｌｕｉｄ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅａｎｓ）である。
【0009】
幾つかの実施形態において、本方法は、ＧＣＳＦ試料を負荷する前に、ＡＥＸ材料を、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨが約７．０～約８．０である平衡化緩衝液で平衡化することを更に含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、本方法は、ＧＣＳＦを溶出する前に、未結合又は弱く結合している夾雑物を除去するために、ＡＥＸ材料を洗浄緩衝液で洗浄することを更に含む。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液は、同一の緩衝液組成を有する。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は負荷緩衝液を含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約１．５～約３．０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。
【0010】
幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約３０ｍＭ～６０ｍＭのＴｒｉｓ、約３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ、約５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦ溶出は、約７．４～約８．２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィーを含む。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）樹脂を含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）樹脂を含む。
【0011】
幾つかの実施形態において、本方法は、ＡＥＸ材料のストリッピング（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ）及び／又はサニテーション（ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ）の１又は複数の段階を更に含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、全ての段階のための直線流速（linear flow rate）で実施される。幾つかの実施形態において、直線流速は約１５０ｃｍ／ｈｒである。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階（ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅｓ）の少なくとも１つは５０ｃｍ／ｈｒで実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦは組換えヒトＧＣＳＦ（ｈＧＣＳＦ）又はその変異体である。幾つかの実施形態において、試料は、組換え真核細胞又は組換え原核細胞から得られたＧＣＳＦを含む。
【0012】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示する方法は、少なくとも１つの追加の精製プロセスを更に含む。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、遠心分離、ダイアフィルトレーション及び限外濾過からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの前に実施される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの後に実施される。
【0013】
他の態様においては、本明細書において、ＧＣＳＦに結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を含むクロマトグラフィー用容器を含む、ＧＣＳＦを製造するための様々なシステムであって、クロマトグラフィー用容器は、温度制御された囲いに覆われて（ｅｎｃａｓｅｄ）おり、且つクロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている、システムを提供する。
【0014】
本開示のシステムを例示する非限定的な実施形態は、以下に示す１又は複数の特徴を含む。幾つかの実施形態において、このシステムは、温度制御された囲いの中に配置された流路を更に含み、この流路の囲いの少なくとも一部の温度は７℃～約１３℃に設定されている。幾つかの実施形態において、容器の囲い及び流路の囲いの設定温度は等しい。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路ジャケットの囲いの設定温度は異なる。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いの少なくとも１つの温度は約１０℃に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、カラム、槽、充填床、流動床、カートリッジ、内封された膜、貯留器、チャンバ、コンテナ及び混合槽からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、流路は、チューブ、パイプ、バッグ、コンテナ、貯蔵タンク、混合槽又は他の流体案内手段である。
【0015】
幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＧＣＳＦ試料を負荷する前に、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨが約７．０～約８．０である平衡化緩衝液で平衡化される。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＧＣＳＦを溶出する前に、未結合又は弱く結合している夾雑物を除去するために洗浄緩衝液で洗浄される。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液は、同一の緩衝液組成を有する。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は負荷緩衝液を含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約１．５～約３．０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。
【0016】
本開示のシステムの幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約３０ｍＭ～６０ｍＭのＴｒｉｓ、約３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ、約５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦの溶出は、約７．４～約８．２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィーを含む。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂を含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を含む。
【0017】
幾つかの実施形態において、本システムは、ＡＥＸ材料のストリッピング及び／又はサニテーションのうちの１又は複数の段階を更に含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、全ての段階のための直線流速で実施される。幾つかの実施形態において、直線流速は約１５０ｃｍ／ｈｒである。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階の少なくとも１つは５０ｃｍ／ｈｒで実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦは、組換えヒトＧＣＳＦ（ｈＧＣＳＦ）又はその変異体である。幾つかの実施形態において、試料は、組換え真核細胞又は組換え原核細胞から得られたＧＣＳＦを含む。
【0018】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示するシステムは、少なくとも１つの追加の精製プロセスを更に含む。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、遠心分離、ダイアフィルトレーション及び限外濾過からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの前に実施される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの後に実施される。
【0019】
他の態様において、本開示の幾つかの実施形態は、本明細書に開示する方法又は本明細書に開示するシステムにより精製された顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）に関する。関連態様において、本開示の幾つかの実施形態は、本明細書に開示するＧＣＳＦを含む医薬組成物に関する。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、水性組成物、凍結乾燥物又は粉末である。
【0020】
更なる他の態様において、本明細書においては、疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療又は予防するための様々な方法であって、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又は本明細書に開示する医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態において、疾患又は健康状態は、好中球減少症である。
【0021】
上述の概要は単なる例示であり、いかなる形でも限定を意図するものではない。本明細書に記載する好ましい実施形態及び特徴に加えて、本開示の更なる態様、実施形態、目的及び特徴は、図面及び詳細な説明及び特許請求の範囲から充分に明らかになるであろう。
【0022】
本明細書に記載する態様及び実施形態のそれぞれは、実施形態又は態様の文脈から明示的に又は明確に除外されていない限り、一緒に用いることができる。
【0023】
本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、雑誌の論文、電子データベースの収録内容（entry）を参照する。本明細書に引用する全ての特許、特許出願及び他の刊行物を参照することにより、その開示全体をあらゆる目的のために本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本明細書に開示する方法の幾つかの実施形態に従う例示的な実験における、ＤＥＡＥ溶出ピーク全体に亘るＧＣＳＦ製品の品質の分布をグラフで示したものである。この実験においては、２８０ｎｍのＯＤが０．５になった時点でＤＥＡＥ樹脂からの体積０．５ＣＶの画分の回収を開始し、ＯＤが０．５に低下した時点で停止した。次いでこれらの画分を逆相（ＲＰ）で分析し、そして宿主細胞由来タンパク質含有量に関する分析を行った。
【0025】
開示の詳細な説明
本明細書においては、特に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質を精製及び／又は調製するための、組成物、方法及びシステムを提供する。本開示の特定の態様及び実施形態は、高く且つ安定した収率でＧＣＳＦを得るために、低温条件下で実施されるＡＥＸ手順を用いて、ＧＣＳＦタンパク質の精製を最適化する新規な手法に関する。
本明細書においては、特に、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）タンパク質を精製及び／又は調製するための、組成物、方法及びシステムを提供する。本開示の特定の態様及び実施形態は、高く且つ安定した収率でＧＣＳＦを得るために、低温条件下で実施されるＡＥＸ手順を用いて、ＧＣＳＦタンパク質の精製を最適化する新規な手法に関する。
【0026】
イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）においては、クロマトグラフィーカラムの温度がイオン交換反応の選択性及びカラムの効率に影響を及ぼし、したがってイオン分離の品質に影響を及ぼす因子であることが報告されている。例えば、古典的なＩＥＣでは、カラムの温度が無機イオンに対する選択性に影響を及ぼす因子であることが立証されている。後により詳細に説明するように、温度制御された囲いで覆われたクロマトグラフィー用容器等の温度制御されたクロマトグラフィー用容器を含むＡＥＸの結合／溶出操作を組み入れ、この囲いを約７℃～約１３℃の範囲の特定の温度に設定することにより、ＧＣＳＦ製品を高い及び／又は安定した収率で得ることが可能になり、したがって、ＧＣＳＦの製造に好適に使用することができる。実施例において後述するように、温度制御下におけるＤＥＡＥクロマトグラフィープロセスで組換えｈＧＣＳＦを調製するための様々なパラメータを、幾つかの頑健性試験を行うことにより評価及び最適化した。このパラメータには、（１）負荷濃度、（２）負荷液のｐＨ、（３）負荷液の電気伝導率、（４）平衡化緩衝液のｐＨ、（５）平衡化緩衝液の電気伝導率、（６）溶出緩衝液のｐＨ、（７）溶出緩衝液の電気伝導率、（８）負荷液ジャケットの温度設定値及び（９）カラムジャケットの温度設定値が含まれる。これらの実験において、ＤＥＡＥは、酸化性化学種、ＤＮＡ及び大腸菌（（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来タンパク質（ＥＣＰ）を低減する潜在能力を有するキャプチャークロマトグラフィーカラムとして機能する。本明細書に示す実験データは、特定のパラメータがＧＣＳＦ製品の品質及び／又は収率に有意に影響することを示している。例えば、クロマトグラフィー用容器及び負荷液のジャケットの温度設定値は、両方共、最終ＧＣＳＦ製品の品質及び収率に有意に影響する主要工程パラメータ（ＫＰＰ）であることが確認された（例えば、実施例３及び表１３参照）。特に、クロマトグラフィー用容器のジャケット温度は、Ｃ３逆相ＨＰＬＣ分析により測定される製品関連の夾雑物に影響を及ぼし、且つＣＥＸ ＨＰＬＣ分析により測定されるＧＣＳＦ最終製品の電荷不均一性にも影響を及ぼすことが判明した。更に、負荷液のジャケット温度は、最終ＧＣＳＦ製品の宿主細胞由来タンパク質含有量に影響を及ぼすことが判明した。
【0027】
後に更に説明するように、本明細書に開示するＧＣＳＦの調製方法は、高純度の、例えば、医薬品グレードまでの組換えＧＣＳＦを、品質、経済性及び規制上の要件を考慮した上で、工業規模で効果的に製造するプロセスを好適に提供することができる。本明細書においてはまた、本開示の幾つかの実施形態において、この種の方法により得られるＧＣＳＦ、それを含む医薬組成物並びに疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療及び／又は予防するための方法も提供する。
【0028】
定義
本明細書において使用する全ての技術用語、表記法及び他の科学用語又は専門用語は、別途定義されていない限り、本開示が関連する技術分野の当業者が通常理解している意味を有することが意図されている。場合によっては、通常理解されている意味を有する用語を、明確化のため及び／又は直ぐに参照できるように本明細書に定義し、この種の定義を本明細書に包含するが、これが必ずしも当該技術分野において一般に理解されているものとの実質的な差を表すと解釈されるべきではない。本明細書において記載又は参照する技法及び手順の多くは、当業者に充分に理解されており、従来の方法論を用いて一般に採用されているものである。
本明細書において使用する全ての技術用語、表記法及び他の科学用語又は専門用語は、別途定義されていない限り、本開示が関連する技術分野の当業者が通常理解している意味を有することが意図されている。場合によっては、通常理解されている意味を有する用語を、明確化のため及び／又は直ぐに参照できるように本明細書に定義し、この種の定義を本明細書に包含するが、これが必ずしも当該技術分野において一般に理解されているものとの実質的な差を表すと解釈されるべきではない。本明細書において記載又は参照する技法及び手順の多くは、当業者に充分に理解されており、従来の方法論を用いて一般に採用されているものである。
【0029】
単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他のことが指示されていない限り、複数の指示対象も包含する。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、１個又はそれらの混合物を含む複数個の細胞を包含する。本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」を使用する場合、次に示す代替対象を全て包含する：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」並びに「Ａ及びＢ」。
【0030】
本明細書においては、特定の値及び範囲を、数値の前に「約」という語を付記して示す。本明細書において、「約」という語は、その語に先行される正確な数に加えて、その語に先行される、該数に近い（ｎｅａｒ ｔｏ）又は近似値（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）である数の文言をサポートするために使用する。一般に、「約」という語は、それが近似値であるという通常の意味を有する。近似の程度が文脈から他の形で明らかでない場合、「約」は、提示された値に対し前後１０％の範囲内にあるか又は提示された値が最も近い有効数字に丸められた値であるかのいずれかを意味し、全ての場合において、提示された値が包含される。範囲が提示された場合は、境界値も包含される。
【0031】
本明細書に記載する本開示の態様及び実施形態は、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及び「基本的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」態様及び実施形態を含むことが理解される。
【0032】
本明細書全体を通して与えられている最大値の数値限定は、いずれも、それぞれの低い方の数値限定が、そのような低い方の数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、含まれることを意図している。本明細書全体を通して与えられている最小値の数値限定は、いずれも、それぞれの高い方の数値限定が、そのような高い方の数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、含まれることとなる。本明細書全体を通して与えられている数値範囲は、いずれも、そのようなより広い数値範囲に含まれるあらゆるより狭い数値範囲が、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように、含まれることとなる。
【0033】
見出し、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に本明細書及び特許請求の範囲を読みやすくする目的で示されている。本明細書及び特許請求の範囲において使用する見出しは、ステップ又は構成要素を、アルファベット若しくは数字の順序又はそれらが提示されている順序で実施することを要求するものではない。
【0034】
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、ヒトの好中球減少症の治療に広く使用されている多機能サイトカインである。ＧＣＳＦは、主に骨髄間質の線維芽細胞及び内皮細胞並びに免疫担当細胞（例えば、単球、マクロファージ等）から産生される、造血性の細胞系列特異的なサイトカインである。ＧＣＳＦ受容体（ＧＣＳＦＲ）は、サイトカイン及びヘマトポエチン受容体スーパーファミリーの一部であり、そしてＧＣＳＦＲの変異は重度の先天的好中球減少症を引き起こす。ＧＣＳＦ／ＧＣＳＦＲ結合の主な作用は、骨髄における好中球の分化、増殖、動員、生存及び走化性を刺激すること並びにそれらの血流中への放出を制御することである。これに加えて、（ｉ）内皮細胞の増殖及び遊走、（ｉｉ）ノルエピネフリン再取り込みの低下、（ｉｉｉ）破骨細胞活性の亢進並びに（ｉｖ）骨芽細胞活性の低下を含む他の多くのＧＣＳＦの作用が報告されている。
顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、ヒトの好中球減少症の治療に広く使用されている多機能サイトカインである。ＧＣＳＦは、主に骨髄間質の線維芽細胞及び内皮細胞並びに免疫担当細胞（例えば、単球、マクロファージ等）から産生される、造血性の細胞系列特異的なサイトカインである。ＧＣＳＦ受容体（ＧＣＳＦＲ）は、サイトカイン及びヘマトポエチン受容体スーパーファミリーの一部であり、そしてＧＣＳＦＲの変異は重度の先天的好中球減少症を引き起こす。ＧＣＳＦ／ＧＣＳＦＲ結合の主な作用は、骨髄における好中球の分化、増殖、動員、生存及び走化性を刺激すること並びにそれらの血流中への放出を制御することである。これに加えて、（ｉ）内皮細胞の増殖及び遊走、（ｉｉ）ノルエピネフリン再取り込みの低下、（ｉｉｉ）破骨細胞活性の亢進並びに（ｉｖ）骨芽細胞活性の低下を含む他の多くのＧＣＳＦの作用が報告されている。
【0035】
ヒト第１７染色体上に位置するヒトＧＣＳＦ遺伝子は、選択的スプライシングによって２種のタンパク質産物：１７７個のアミノ酸から構成されるアイソフォームＡ及び１７４個のアミノ酸から構成されるアイソフォームＢをコードする。アイソフォームＡは、アイソフォームＢのＬｅｕ３５の後に挿入されている追加の３つの残基（Ｖａｌ－Ｓｅｒ－Ｇｌｎ）を含む。アイソフォームＢはアイソフォームＡよりも生物活性及び安定性が高い。したがって、ヒト（ｈ）ＧＣＳＦのアイソフォームＢが主としてクローニング及び発現の対象とされてきた。ｈＧＣＳＦは、その生物活性に不可欠な５個のシステイン残基及び２本の分子内ジスルフィド結合を有する１８．８ｋＤａの糖タンパク質である。大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生される組換え（ｒ）ｈＧＣＳＦは、天然のヒトタンパク質と類似の生物活性を有するが、Ｎ－末端メチオニン残基を有する点及びグリコシル化されていない点が異なっている。ｒｈＧＣＳＦを大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））で発現させると、多くの場合、封入体（ＩＢ）と呼ばれる不溶性の凝集体を形成する。既存の精製プロセスでは、こうした不溶性凝集体を、変性剤を含む緩衝液中で可溶化した後、一般には、再生ステップにより、変性された形態を適切な三次元構造を有する生物活性形態に変換する。
【0036】
ＧＣＳＦの治療適応は、非好中球減少症患者の感染症、生殖医療、神経障害、急性心筋梗塞後の再生療法及び骨格筋の再生療法並びにＣ型肝炎治療等、幅広く報告されている。現在、ＧＣＳＦは、骨髄移植又はがん化学療法後の造血能の回復を促進するために臨床的に使用されている。腫瘍学においては、ＧＣＳＦは、特に、化学療法により誘発される好中球減少の一次予防に利用されているが、造血幹細胞移植に使用することもでき、その場合、一部の骨髄性白血病では単球への分化誘導が可能である。
【0037】
ＧＣＳＦを精製するための方法
初期の報告では、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））等の組換え原核細胞内でのｒｈＧＣＳＦの発現量は、低～中程度（１０～３５％）であることが示されており、最終製品の収率は非常に低く、そして許容できるとは言い難いものであった。このような低い収率の原因は、生産性の悪い下流の処理技術、例えば、純度の低い封入体の単離、回収、ミスフォールディング、凝集体の形成並びにタンパク質リフォールディング操作及びクロマトグラフィープロセスの最適化されていない条件を含む、多くの要因であり得る。したがって、スケーラブルであり、費用対効果が高く、且つ安定性が高い、ＧＣＳＦを高回収率で回収するための改良された製造方法が依然として必要とされている。
初期の報告では、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））等の組換え原核細胞内でのｒｈＧＣＳＦの発現量は、低～中程度（１０～３５％）であることが示されており、最終製品の収率は非常に低く、そして許容できるとは言い難いものであった。このような低い収率の原因は、生産性の悪い下流の処理技術、例えば、純度の低い封入体の単離、回収、ミスフォールディング、凝集体の形成並びにタンパク質リフォールディング操作及びクロマトグラフィープロセスの最適化されていない条件を含む、多くの要因であり得る。したがって、スケーラブルであり、費用対効果が高く、且つ安定性が高い、ＧＣＳＦを高回収率で回収するための改良された製造方法が依然として必要とされている。
【0038】
本開示の特定の態様及び実施形態は、ＧＣＳＦを高く且つ安定した収率で得ることを目的として、低温条件下で実施されるＡＥＸ手順を用いてＧＣＳＦタンパク質の精製を最適化する新規な手法に関する。本開示の幾つかの実施形態は、結合／溶出操作及び温度制御下で操作を行うために適切に取り付けられた、温度制御された囲いの中に配置されたクロマトグラフィー用容器を用いてＧＣＳＦを精製するための方法に関する。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、（ｉ）試料中のＧＣＳＦに結合することができるＡＥＸ材料を含むクロマトグラフィー用容器にＧＣＳＦ含有試料を負荷することであって、クロマトグラフィー用容器は温度制御された囲いに覆われており、且つクロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されていること、及び（ｉｉ）ＧＣＳＦを溶出緩衝液でＡＥＸ材料から溶出すること、を含む。幾つかの実施形態において、試料中に存在するＧＣＳＦは、ＡＥＸ材料に可逆的に結合する。当業者は、対象分子（例えば、ＧＣＳＦ）をクロマトグラフィー材料に結合させるとは、分子がクロマトグラフィー材料の内部又は表面にリガンド－タンパク質相互作用によって可逆的に固定化されるように、分子をクロマトグラフィー材料に適切な条件（例えば、ｐＨ及び／又は電気伝導率）下で曝露することであると理解するであろう。非限定的な例として、分子とイオン交換材料の１個又は複数個の帯電した基とのイオン的相互作用が挙げられる。
【0039】
本出願における精製という用語は、ＧＣＳＦ含有試料中の１種又は複数種の望ましくない夾雑物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）(例えば、任意の外来の又は望ましくない不純物）の濃度を、ＧＣＳＦタンパク質の濃度に対し低下させることにより、ＧＣＳＦタンパク質の純度の程度を高める手順を指す。ＧＣＳＦ含有試料という用語は、１種又は複数種の夾雑物（不純物）が存在する、ＧＣＳＦタンパク質を含む混合物を指す。後により詳細に説明するが、本明細書に記載する方法を用いて精製されるＧＣＳＦタンパク質は、概して、組換え技法を用いて、真核生物（例えば、酵母及び哺乳動物細胞株）内で又は細菌等の原核生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）））内で産生されたものであり得る。ＧＣＳＦ含有試料中に存在する夾雑物は、標的タンパク質（例えば、ＧＣＳＦ）の凝集体、断片及び不活性変異体等の、製品関連の夾雑物であり得る。夾雑物はまた、浸出したクロマトグラフィー樹脂、培養培地成分、細胞残屑、宿主細胞由来タンパク質、塩、脂質、糖質、核酸、混入ウイルス及び内毒素等のプロセス関連の夾雑物の可能性もある。
【0040】
プロセスの出発材料に応じて、望ましくない夾雑物をＧＣＳＦ製品から完全に又は部分的に除去することができる。後により詳細に説明するように、ジャケット付きクロマトグラフィー用容器等の温度制御されたクロマトグラフィー用容器を含む、結合／溶出ＡＥＸ操作を組み入れ、容器のジャケット温度を約７℃～約１３℃の範囲内の特定の温度に設定することにより、ＧＣＳＦ製品を高い及び／又は安定した収率で得ることが可能になり、これは、ＧＣＳＦの工業的製造に好適に使用することができる。
【0041】
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）
本開示の方法の非限定的な好ましい実施形態は、低温条件下で実施される結合／溶出ＡＥＸ操作を組み入れることを含む。ＡＥＸは、高ｐＨ下で負電荷を有する、タンパク質、アミノ酸、糖／糖質及び他の酸性物質等の生体分子を、単離及び／又は精製するために広く慣用されている分離技法である。ＡＥＸは、正電荷を有する基を含む固定相イオン交換材料（例えば，マトリックス、媒体又は樹脂）を使用して、物質をその電荷に基づき分離するものである。この電荷は、１種又は複数種のイオン交換基、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルヒドロキシプロピル（ＱＡ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、４級アミノメチル（Ｑ）、ジエチル－（２－ヒドロキシプロピル）－アミノエチル、トリエチルアミノメチル（ＴＥＡＥ）、トリエチルアミノプロピル（ＴＥＡＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を固定相に、例えば、共有結合によって結合させることにより付与することができる。これに替えて又はこれに加えて、電荷は固定相の固有の性質であってもよい（例えば、全体として正電荷を有するシリカの場合のように）。溶液中では、ＡＥＸ材料は正に帯電した対イオン（陽イオン）で覆われている。ＡＥＸ材料は、負に帯電した分子と、その対イオンを置き換えることにより結合する。この物質と樹脂との結合の強さは、物質の負電荷の強度に基づく。
本開示の方法の非限定的な好ましい実施形態は、低温条件下で実施される結合／溶出ＡＥＸ操作を組み入れることを含む。ＡＥＸは、高ｐＨ下で負電荷を有する、タンパク質、アミノ酸、糖／糖質及び他の酸性物質等の生体分子を、単離及び／又は精製するために広く慣用されている分離技法である。ＡＥＸは、正電荷を有する基を含む固定相イオン交換材料（例えば，マトリックス、媒体又は樹脂）を使用して、物質をその電荷に基づき分離するものである。この電荷は、１種又は複数種のイオン交換基、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルヒドロキシプロピル（ＱＡ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、４級アミノメチル（Ｑ）、ジエチル－（２－ヒドロキシプロピル）－アミノエチル、トリエチルアミノメチル（ＴＥＡＥ）、トリエチルアミノプロピル（ＴＥＡＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を固定相に、例えば、共有結合によって結合させることにより付与することができる。これに替えて又はこれに加えて、電荷は固定相の固有の性質であってもよい（例えば、全体として正電荷を有するシリカの場合のように）。溶液中では、ＡＥＸ材料は正に帯電した対イオン（陽イオン）で覆われている。ＡＥＸ材料は、負に帯電した分子と、その対イオンを置き換えることにより結合する。この物質と樹脂との結合の強さは、物質の負電荷の強度に基づく。
【0042】
一般に、本開示の方法に使用するためのＡＥＸ材料は、タンパク質のＡＥＸクロマトグラフィーに適した官能基（例えば、陰イオン交換体）を含む任意のＡＥＸ材料とすることができる。本開示の方法に適したＡＥＸ官能基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルヒドロキシプロピル（ＱＡ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）、４級アミノメチル（Ｑ）、ジエチル－（２－ヒドロキシプロピル）－アミノエチル、トリエチルアミノメチル（ＴＥＡＥ）、トリエチルアミノプロピル（ＴＥＡＰ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられる。商業的に入手可能な好適な製品の例としては、これらに限定されるものではないが、ＤＥＡＥ－セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＦ、ＤＥＡＥ－セファロース ＣＬ－４Ｂ、Ｑ－セファロース ＦＦ、Ｑ－セファロース ＣＬ－４Ｂ、Ｑ－セファロース ＨＰ、Ｑ－セファロース ＸＬ、Ｑ－セファロース Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、ＱＡＥ－セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、ＤＥＡＥ－セファデックス、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｃａｐｔｏ Ｑ ＩｍｐＲｅｓ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、ＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ、Ｎｕｖｉａ Ｑ、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＤＥＡＥ－６５０、トヨパールＳｕｐｅｒＱ－６５０、トヨパールＱＡＥ－５５０、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＥＭＤ ＤＥＡＥ、フラクトゲルＥＭＤ ＴＭＡＥ、バイオセプラ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ及びバイオセプラＤＥＡＥ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤが挙げられる。当該技術分野において知られている好適なＡＥＸ材料の他の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｐｏｒｏｓ ＨＱ ５０、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ ５０、Ｐｏｒｏｓ Ｄ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ及びＭｕｓｔａｎｇ Ｑが挙げられる。
【0043】
本開示の方法に使用するためのＡＥＸ材料の選択は、所望の分離性能、プロセス時間、洗浄に対する頑健性（ｃｌｅａｎｉｎｇ ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）、再現性、結合容量、ロット間の一貫性及び全体的な経済性等に基づき行うことができる。当業者は、ＡＥＸ官能基に加えて、ＡＥＸ樹脂の骨格の性質及びビーズのサイズも考慮する必要があることを理解するであろう。幾つかの実施形態においては、メタクリレート誘導体をベースとするマトリックス、例えば、マクロプレップ（Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ）（登録商標）及びトヨパール（登録商標）等を使用することができる。この種のマトリックスは、特に良好な分解能及び再現性を有すると報告されている。幾つかの実施形態においては、架橋されたアガロースマトリックス、例えば、セファロース（登録商標）等を使用することができる。ＡＥＸクロマトグラフィーは結合／溶出操作に使用するので、選択的な溶出条件を用いることができ、この条件は、塩濃度を段階的に若しくは勾配をかけて増加させることによるか、又は溶出緩衝液のｐＨを段階的に若しくは勾配をかけて低下させることのいずれかにより与えることができる。
【0044】
幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、例えば、ＤＥＡＥ官能基等の弱陰イオン交換体を含む。ＤＥＡＥは古典的な弱陰イオン交換基であり、後述する実験において良好な分解能及び短時間で平衡化する特性を示した。幾つかの実施形態においては、ＤＥＡＥセファロースＦＦを用いたＡＥＸクロマトグラフィーを実施することにより、高い流速及び良好な製品回収率が可能になる。
【0045】
幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィーを含む。幾つかの実施形態において、陰イオン交換材料は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂を含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を含む。
【0046】
本明細書に開示する方法に使用するのに適したＡＥＸ材料は、一般に、被分析物（例えば、ＧＣＳＦポリペプチド）を混合物中に存在する他の分子から分離することができる任意の形態の固定相とすることができる。一般に、移動相の影響下において、混合物の個々の分子が固定された固定相中を移動する速度に差が生じる結果として、被分析物を他の分子から分離することができる。別法として、被分析物を他の分子から、結合／溶出操作で分離することができる。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ操作は結合／溶出モードで実施され、その場合、ＧＣＳＦ（即ち、被分析物）のＡＥＸ材料への結合は、ＧＣＳＦがＧＣＳＦとＡＥＸ材料の１個又は複数個の電荷を有する基との間のイオン性相互作用によってクロマトグラフィー材料の内部又は表面に可逆的に固定化されるように、ＧＣＳＦを適切な条件（例えば、ｐＨ、温度及び／又は電気伝導率）下でＡＥＸ材料と接触させることを含む。
【0047】
一般に、次いでフロースルーで、及び／又は後続の緩衝液洗浄により、未結合不純物を回収することができる。ＧＣＳＦ分子は正電荷を有するＡＥＸ材料に結合して保持され、その後、一般に用いられている２種の技法のうちの少なくとも１種により溶出することができる。１つの技法における幾つかの実施形態においては、溶出緩衝液の塩濃度を徐々に増加させることにより、ＡＥＸ材料に結合しているＧＣＳＦ分子を溶出することができる。この場合、塩溶液中の陰イオン（例えば、Ｃｌ-)は、ＡＥＸ材料への結合においてタンパク質と競合する。第２の技法における他の実施形態においては、ＡＥＸ材料に結合しているＧＣＳＦ分子は、溶液のｐＨを徐々に低下させ、その結果としてＧＣＳＦ上の正電荷をより高くし、ＡＥＸ材料から遊離させることにより溶出することができる。これらの技法はいずれも負に帯電したＧＣＳＦを追い出すことができ、次いでＧＣＳＦは試験管の画分中へ溶出緩衝液と一緒に溶出する。
【0048】
本開示の方法に適したＡＥＸ材料の非限定的な例として、ＡＥＸ樹脂、ＡＥＸマトリックス、ＡＥＸ媒体及びＡＥＸ膜が挙げられる。幾つかの実施形態において、本開示の方法に使用されるＡＥＸ材料は、樹脂とすることができる。幾つかの実施形態において、本開示の方法に使用されるＡＥＸ材料は、１級アミン、２級アミン、３級アミン、４級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基及びジエチルアミノエチル官能基のうちの１種又は複数種を含むことができる。幾つかの実施形態において、本開示の方法に使用されるＡＥＸ材料は、クロマトグラフィー用容器（例えば、カラム）に充填される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料はＡＥＸ膜である。
【0049】
ＡＥＸ材料の体積、使用されるクロマトグラフィー用容器（例えば、カラム）の長さ及び直径に加えて、動的容量及び流速は、被処理流体の体積及び本開示の精製方法に付される試料中のＧＣＳＦタンパク質の濃度等の幾つかのパラメータに依存することになることを当業者は理解するであろう。これらのパラメータの決定は当業者の平均的な技術範囲に充分に収まる。
【0050】
温度制御された容器
上に記載したように、本開示の幾つかの実施形態は、温度制御下で操作を行うために適切に取り付けられたＡＥＸクロマトグラフィーシステムを使用してＧＣＳＦを精製するための方法に関する。開示された方法において、クロマトグラフィー用容器は、一般に、ＡＥＸ材料（例えば、樹脂、媒体又はマトリックス）を収容することが可能な任意の好適なクロマトグラフィー用器具とすることができる。本開示の方法に使用するのに適したクロマトグラフィー用容器の非限定的な例として、クロマトグラフィーカラム、槽、充填床、流動床、貯留器、チャンバ、コンテナ及び混合槽が挙げられる。使用に適した更なるクロマトグラフィー用容器として、これらに限定されるものではないが、例えば、内封された膜等のクロマトグラフィーカートリッジが挙げられる。一般に、本開示のクロマトグラフィー用容器は、円筒形状を有することができる。本開示の幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、ＡＥＸ材料を収容するのに適した他の形状、例えば、円筒形状、楕円形状、円錐形状、他の丸みを帯びた形状、より丸みの少ない壁部を有する形状、より直線的な壁部を有する形状、立方体形状、他の平たい形状又はこれらの組合せ等を有することができる。幾つかの実施形態において、本開示のクロマトグラフィー用容器は、円筒形のクロマトグラフィーカラム又は槽とすることができる。
上に記載したように、本開示の幾つかの実施形態は、温度制御下で操作を行うために適切に取り付けられたＡＥＸクロマトグラフィーシステムを使用してＧＣＳＦを精製するための方法に関する。開示された方法において、クロマトグラフィー用容器は、一般に、ＡＥＸ材料（例えば、樹脂、媒体又はマトリックス）を収容することが可能な任意の好適なクロマトグラフィー用器具とすることができる。本開示の方法に使用するのに適したクロマトグラフィー用容器の非限定的な例として、クロマトグラフィーカラム、槽、充填床、流動床、貯留器、チャンバ、コンテナ及び混合槽が挙げられる。使用に適した更なるクロマトグラフィー用容器として、これらに限定されるものではないが、例えば、内封された膜等のクロマトグラフィーカートリッジが挙げられる。一般に、本開示のクロマトグラフィー用容器は、円筒形状を有することができる。本開示の幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、ＡＥＸ材料を収容するのに適した他の形状、例えば、円筒形状、楕円形状、円錐形状、他の丸みを帯びた形状、より丸みの少ない壁部を有する形状、より直線的な壁部を有する形状、立方体形状、他の平たい形状又はこれらの組合せ等を有することができる。幾つかの実施形態において、本開示のクロマトグラフィー用容器は、円筒形のクロマトグラフィーカラム又は槽とすることができる。
【0051】
一般に、クロマトグラフィー用容器の容積は特に制限されない。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の容積は、約１ｍＬ超、約２ｍＬ超、約３ｍＬ超約４ｍＬ超、約５ｍＬ超、約６ｍＬ超、約７ｍＬ超、約８ｍＬ超、約９ｍＬ超、約１０ｍＬ超、約１５ｍＬ超、約２０ｍＬ超、約２５ｍＬ超、約３０ｍＬ超、約４０ｍＬ超、約５０ｍＬ超、約７５ｍＬ超、約１００ｍＬ超、約２００ｍＬ超、約３００ｍＬ超、約４００ｍＬ超、約５００ｍＬ超、約６００ｍＬ超、約７００ｍＬ超、約８００ｍＬ超、約９００ｍＬ超、約１Ｌ超、２Ｌ超、３Ｌ超、４Ｌ超、５Ｌ超、６Ｌ超、７Ｌ超、８Ｌ超、９Ｌ超、１０Ｌ超、２５Ｌ超、５０Ｌ超、１００Ｌ超、２００Ｌ超、３００Ｌ超、４００Ｌ超、５００Ｌ超、６００Ｌ超、７００Ｌ超、８００Ｌ超、９００Ｌ超又は１０００Ｌ超とすることができ、これらの容積に含まれる全ての値及び範囲を包含する。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の容積は、約１ｍＬ～約１０ｍＬ、約１５ｍＬ～約５０ｍＬ、約７５ｍＬ～約３００ｍＬ、約４００ｍＬ～約９００ｍＬ、約１Ｌ～約５Ｌ、約６Ｌ～約５０Ｌ、約１００Ｌ～約６００Ｌ又は約７００Ｌ～約１０００Ｌの範囲にある。
【0052】
幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境は、約７℃～約１３℃の範囲の温度に維持（例えば、安定化）される。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境は、約７℃～約１３℃、約８℃～約１２℃、約９℃～約１１℃、約７℃～約１２℃、約８℃～約１１℃又は約９℃～約１０℃の範囲の温度に維持される。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境は、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃又は約１３℃の温度に維持される。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境は１０℃に維持される。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境に温度勾配を使用することができる。例えば、クロマトグラフィー用容器に沿って、容器の出口端が容器の入口端よりも低温となるように、負の温度勾配を確立することができる。別法として、クロマトグラフィー用容器に沿って、容器の出口端が容器の入口端よりも高温となるように、正の温度勾配を確立することができる。
【0053】
幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の周囲環境の温度を、冷媒供給（ｃｏｏｌｉｎｇ ｓｕｐｐｌｙ）又は冷却装置に熱的に結合された温度制御された囲いを使用することにより、所望の温度に維持することができる。例示的な温度制御された囲いとしては、これらに限定されるものではないが、冷媒供給又は冷却装置に熱的に結合された、ジャケット、冷却ブロック、水浴、冷却用隔室（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）又はチャンバ及び冷却用配管（ｃｏｏｌｉｎｇ ｔｕｂｉｎｇ）が挙げられる。例えば、幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、循環する冷却用気体又は流体（例えば、水）と共に配置することができる。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、ウォータージャケット又はガスジャケットとすることができる温度制御されたジャケットで覆われている。幾つかの実施形態において、温度制御されたクロマトグラフィー用容器は、ウォータージャケット付きクロマトグラフィー用容器である。幾つかの実施形態において、温度制御されたクロマトグラフィー用容器は、ガスジャケット付きクロマトグラフィー用容器である。幾つかの実施形態において、温度制御されたクロマトグラフィー用容器は、断熱用真空ジャケット付きである。
【0054】
幾つかの実施形態によれば、クロマトグラフィー用容器の温度を所望の温度（約７℃～約１３℃の範囲）に維持するために、適切な熱移動を確保するべく、温度制御された囲い（例えば、ジャケット）をクロマトグラフィー用容器の表面積の少なくとも一部、例えば、クロマトグラフィー用容器の表面積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％を覆うように構成することができる。幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、クロマトグラフィー用容器全体を覆っているが、他の幾つかの実施形態においては、温度制御された囲いは、適切な熱移動を確保するように、及び／又はクロマトグラフィー用容器全体の温度が均一になるように、クロマトグラフィー用容器の表面積のかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）部分、例えば、その表面積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を覆っている。温度制御された囲いは、その設計及び製造が単純（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）なものとなり得ることから、一般に、均一な厚みを有するものとなり得るが、温度制御された囲いは、不均一な厚みを有するように構成することもできる。例えば、幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、頂部よりも底部の方がより多い量の気体又は流体（例えば、水）を収容し得る。別法として、幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、頂部よりも底部の方がより少ない量の気体又は流体（例えば、水）を収容し得る。これに加えて、又は任意選択的に、温度制御された囲い及びクロマトグラフィー用容器は、単一構成部品の器具（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｄｅｖｉｃｅ）として製造する（例えば、組み立てる（ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ））ことができる。
【0055】
温度制御された流路
幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、流路を介してクロマトグラフィー用容器に負荷され、この流路は、温度制御された囲いの中に配置されているか、又はそれ以外の形で温度制御下で操作するために適切に取り付けられている。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は所望の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃～約１３℃の範囲の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃～約１３℃、約８℃～約１２℃、約９℃～約１１℃、約７℃～約１２℃、約８℃～約１１℃又は約９℃～約１０℃の範囲の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃又は約１３℃の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は１０℃に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境に温度勾配を用いることができる。例えば、流路に沿って、容器の出口端が流路の入口端よりも低温となるように、負の温度勾配を確立することができる。別法として、流路に沿って、流路の出口端が流路の入口端よりも高温となるように、正の温度勾配を確立することができる。
幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、流路を介してクロマトグラフィー用容器に負荷され、この流路は、温度制御された囲いの中に配置されているか、又はそれ以外の形で温度制御下で操作するために適切に取り付けられている。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は所望の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃～約１３℃の範囲の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃～約１３℃、約８℃～約１２℃、約９℃～約１１℃、約７℃～約１２℃、約８℃～約１１℃又は約９℃～約１０℃の範囲の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃又は約１３℃の温度に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境は１０℃に維持される。幾つかの実施形態において、流路の周囲環境に温度勾配を用いることができる。例えば、流路に沿って、容器の出口端が流路の入口端よりも低温となるように、負の温度勾配を確立することができる。別法として、流路に沿って、流路の出口端が流路の入口端よりも高温となるように、正の温度勾配を確立することができる。
【0056】
幾つかの実施形態において、流路の温度は、温度制御された囲い、例えば、冷媒供給又は冷却装置に熱的に結合された、ジャケット、冷却ブロック、水浴、冷却用隔室又はチャンバ及び冷却用配管等を使用することにより所望の温度に維持される。幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、循環する冷却用気体又は流体（水）と共に配置することができる。幾つかの実施形態において、流路は、温度制御されたジャケットで覆われている。幾つかの実施形態において、温度制御された流路は、ウォータージャケット付き流路である。幾つかの実施形態において、温度制御された流路は、ガスジャケット付き流路である。幾つかの実施形態において、温度制御された流路は、断熱用真空ジャケット付きである。
【0057】
幾つかの実施形態によれば、流路の温度を所望の温度に維持するために、温度制御された囲い（例えば、ジャケット）は、適切な熱移動を確保するべく、流路の表面積の少なくとも一部、例えば、流路の表面積の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％を覆うように構成することができる。幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは流路全体を覆っているが、他の幾つかの実施形態においては、温度制御された囲いは、適切な熱移動を確保するように、及び／又はクロマトグラフィー用容器全体の温度が均一になるように、流路の表面積のかなりの部分、例えば、その表面積の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％を覆っている。この囲いは、その設計及び製造が単純なものとなり得ることから、一般に、均一な厚みを有するものとなり得るが、温度制御された囲いは、不均一な厚みを有するように構成することもできる。例えば、幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、頂部よりも底部の方がより多い量の気体又は流体（例えば、水）を収容し得る。別法として、幾つかの実施形態において、温度制御された囲いは、頂部よりも底部の方がより少ない量の気体又は流体（例えば、水）を収容し得る。これに加えて、又は任意選択的に、温度制御された囲い及びクロマトグラフィー用容器は、単一構成部品の器具として製造する（例えば、組み立てる）ことができる。幾つかの実施形態において、流路の少なくとも一部は約７℃～約１３℃の温度に設定される。
【0058】
幾つかの実施形態において、容器の囲い及び流路の囲いの設定温度は等しい。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路ジャケットの囲いの設定温度は異なる。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いの少なくとも１つの温度は約７℃～約１３℃に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いの少なくとも１つの温度は約１０℃に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲いの温度は約７℃～約１３℃に設定され、流路の囲いの温度は室温（例えば、約１５℃～約２５℃）に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲いの温度は約１０℃に設定され、流路の囲いの温度は室温（例えば、約１５℃～約２５℃）に設定されている。
【0059】
幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器及び流路は同一の温度制御された囲いの中に配置されている。他の実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いを、所望により異なる温度に設定できるように、クロマトグラフィー用容器及び流路は、別々の温度制御された囲いの中に配置されている。
【0060】
本明細書に開示する方法において、流路は、流体がその中を流動することが可能な寸法を有する任意の好適な流体流路とすることができる。概して、流路は、温度制御下で操作するために適切に取り付けられた可撓性チューブ又はキャピラリーチューブ等のチューブとすることができる。幾つかの実施形態において、流路は、温度制御下で操作するために適切に取り付けられた、チューブ、パイプ、バッグ、コンテナ、貯蔵タンク、撹拌槽（ｓｔｉｒｒｅｄ－ｔａｎｋ）、混合槽又は他の流体案内手段とすることができる。幾つかの実施形態において、流路は、ＧＳＣＦ含有試料を、負荷する前及び／又は途中に混合するためのスタティックミキサー又は超音波ミキサー等の混合機構を含むように構成された、温度制御されたコンテナを含む。幾つかの実施形態において、流路は、温度制御されたウォータージャケットを含む。幾つかの実施形態において、流路は、温度制御されたガスジャケットを含む。幾つかの実施形態において、流路は、温度制御された断熱用真空ジャケットを含む。
【0061】
後により詳細に説明するように、本明細書に開示する方法の実施形態は、１種又は複数種の緩衝液を使用することを含む。当業者は、緩衝液という用語が、一般に、その共役酸－共役塩基成分の作用により、ｐＨ変化に抵抗する溶液を指すことを理解するであろう。例えば、緩衝液に所望されるｐＨ、緩衝液に所望される電気伝導率、精製すべきＧＣＳＦタンパク質の特性及びＡＥＸ材料に応じて、様々な緩衝液を採用することができる。これらのパラメータの決定は充分に当業者の平均的な技術範囲内である。この点に関する追加の情報は、例えば、“Ｂｕｆｆｅｒｓ Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ” Ｍｏｈａｎ Ｃ．，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標）Ｃｏｒｐ．，２００６に記載されている。本開示の方法に有用な緩衝液の例として、負荷緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液及び洗浄緩衝液が挙げられる。本開示の幾つかの実施形態において、精製プロセスの最中に使用される負荷緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液及び／又は洗浄緩衝液のうちの１種又は複数種は同一である。本開示の幾つかの実施形態において、精製プロセスの最中に使用される負荷緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液及び／又は洗浄緩衝液は全て同一である。幾つかの実施形態において、精製プロセスの最中に使用される負荷緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液及び／又は洗浄緩衝液は互いに異なる。
【0062】
幾つかの実施形態において、本方法は、精製すべきＧＣＳＦ試料を負荷する前に、陰イオン交換材料を平衡化緩衝液で平衡化することを更に含む。本開示の平衡化緩衝液に好適な緩衝液系の非限定的な例としては、リン酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＦＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＴＥＳ、ＢＥＳ、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリシン、ビシン、アセトアミドグリシン、グリシンアミド又はｐＫａが７を超える生体適合性を有する他の緩衝物質をベースとするものが挙げられる。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約３０ｍＭ～５０ｍＭの範囲、例えば、約３０ｍＭ～４０ｍＭ、約３５ｍＭ～４５ｍＭ、約４０ｍＭ～５０ｍＭ、約４５ｍＭ～５０ｍＭ、約３０ｍＭ～４５ｍＭ又は約３５ｍＭ～５０ｍＭ等の範囲のモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ又は５０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約４０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。
【0063】
幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液に好適なｐＨは、約７．０～８．０の範囲、例えば、約７．０～７．５、約７．１～７．６、約７．２～７．７、約７．３～７．８、約７．４～７．９又は約７．５～７．８の範囲等にある。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは、約７．４～７．８又は約７．５～７．７の範囲にある。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０である。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは約７．５である。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液のｐＨは約７．８である。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、ｐＨは７．６である。
【0064】
当業者は、ＡＥＸ材料を使用前に適切に状態調整することが必要であり、及びＧＣＳＦ含有試料を負荷する前に充分に平衡化することも必要であることを理解するであろう。本明細書に開示する方法のために、ＡＥＸ材料は、少なくとも１カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液で平衡化され得る。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、少なくとも１ＣＶ、２ＣＶ、３ＣＶ、４ＣＶ、５ＣＶ、６ＣＶ、７ＣＶ又は８ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、６ＣＶの平衡化緩衝液で平衡化される。
【0065】
樹脂に結合しているＧＣＳＦを溶出する前に、本明細書に開示する幾つかの実施形態による方法は、ＧＣＳＦを溶出する前に、クロマトグラフィー材料の洗浄に使用される緩衝液である洗浄緩衝液で陰イオン交換樹脂を洗浄することを更に含む。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は、未結合又は弱く結合している夾雑物を除去するために使用される。洗浄緩衝液に使用するのに適した緩衝剤の例として、これらに限定されるものではないが、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール及びその塩又は誘導体が挙げられる。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は、緩衝剤としてＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約３０ｍＭ～５０ｍＭの範囲、例えば、約３０ｍＭ～４０ｍＭ、約３５ｍＭ～４５ｍＭ、約４０ｍＭ～５０ｍＭ、約４５ｍＭ～５０ｍＭ、約３０ｍＭ～４５ｍＭ又は約３５ｍＭ～５０ｍＭ等の範囲のモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ又は５０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約４０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。
【0066】
幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液に適したｐＨは、約７．０～８．０の範囲、例えば、約７．０～７．５、約７．１～７．６、約７．２～７．７、約７．３～７．８、約７．４～７．９又は約７．５～７．８の範囲等にある。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは、約７．４～７．８又は約７．５～７．７の範囲にある。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは、約７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは約７．５である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは約７．８である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液は４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、ｐＨは７．６である。
【0067】
当業者は、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液が異なる緩衝液組成を有していても、又は同一の緩衝液組成を有していてもよいことを理解するであろう。したがって、幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液は同一の緩衝液組成を有する。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液は異なる緩衝液組成を有する。
【0068】
負荷
ＧＣＳＦ試料を好適なＡＥＸ材料を含むクロマトグラフィー用容器に負荷する場合、ＧＣＳＦ及び１種又は複数種の不純物を含む試料をクロマトグラフィー用容器に負荷するために、負荷緩衝液が使用される。結合／溶出モードにおいて、負荷緩衝液の電気伝導率及び／又はｐＨは、ＧＣＳＦがＡＥＸクロマトグラフィー材料に可逆的に結合する一方で、大部分の又は理想的には全ての不純物が結合せずに容器を素通りするように調整することができる。
ＧＣＳＦ試料を好適なＡＥＸ材料を含むクロマトグラフィー用容器に負荷する場合、ＧＣＳＦ及び１種又は複数種の不純物を含む試料をクロマトグラフィー用容器に負荷するために、負荷緩衝液が使用される。結合／溶出モードにおいて、負荷緩衝液の電気伝導率及び／又はｐＨは、ＧＣＳＦがＡＥＸクロマトグラフィー材料に可逆的に結合する一方で、大部分の又は理想的には全ての不純物が結合せずに容器を素通りするように調整することができる。
【0069】
負荷緩衝液に使用するのに適した緩衝剤の非限定的な例として、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール及びその塩又は誘導体が挙げられる。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液は、緩衝剤としてＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液は、約３０ｍＭ～５０ｍＭの範囲、例えば、約３０ｍＭ～４０ｍＭ、約３５ｍＭ～４５ｍＭ、約４０ｍＭ～５０ｍＭ、約４５ｍＭ～５０ｍＭ、約３０ｍＭ～４５ｍＭ又は約３５ｍＭ～５０ｍＭ等の範囲のモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液は、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ又は５０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液は、約４０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。
【0070】
負荷緩衝液に好適なｐＨは、約７．４～８．０の範囲、例えば、約７．４～７．６、約７．５～７．７、約７．６～７．８、約７．７～７．９又は約７．８～８．０等の範囲にある。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは、約７．４～７．８又は約７．５～７．７の範囲にある。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは、約７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０である。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．５である。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液のｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．８である。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液は４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、ｐＨは７．６である。
【0071】
幾つかの実施形態において、負荷緩衝液及び平衡化緩衝液は同一の緩衝液組成を有する。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液及び平衡化緩衝液は異なる緩衝液組成を有する。負荷緩衝液及び平衡化緩衝液が異なる緩衝液組成を有する例においては、クロマトグラフィー用容器に負荷する前に、ＧＣＳＦ含有試料の緩衝液を、平衡化緩衝液と類似の組成を有する緩衝液に交換することができる。
【0072】
負荷緩衝液のｐＨに加えて、電気伝導率も、ＧＣＳＦがＡＥＸクロマトグラフィー材料に可逆的に結合する一方で、大部分の又は理想的には全ての不純物が結合せずに容器を素通りするように調整することができる。電気伝導率とは、水溶液が２つの電極間に電流を流す能力を指す。溶液中では、イオンが輸送されることにより電流が流れる。したがって、水溶液中のイオンの量が増加するに従い、溶液の電気伝導率が高くなることになる。電気伝導率の測定値の基本単位はジーメンス（又はモー）、ｍｈｏ（ｍＳ／ｃｍ）であり、Ｏｒｉｏｎ電気伝導率計の各種モデル等の電気伝導率計を用いて測定することができる。電気伝導率は溶液中でイオンが電流を運ぶ能力であり、溶液の電気伝導率はその中のイオンの濃度を変化させることにより変化させることができる。例えば、所望の電気伝導率を達成するために、溶液中の緩衝剤の濃度及び／又は塩の濃度（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又は塩化カリウム）を変化させることができる。幾つかの実施形態において、所望の電気伝導率を達成するために、負荷緩衝液の塩濃度が修正される。
【0073】
幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、３．０ｍＳ／ｃｍ未満、例えば、２．５ｍＳ／ｃｍ未満、２．０ｍＳ／ｃｍ未満、１．５．０ｍＳ／ｃｍ未満又は１．０ｍＳ／ｃｍ未満の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約１．０～２．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５～２．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０～３．０ｍＳ／ｃｍ、約１．０～３．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５～３．０ｍＳ／ｃｍ又は約１．０～２．５ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約０．５ｍＳ／ｃｍ、１．０ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍＳ／ｃｍ、２．０ｍＳ／ｃｍ、２．５ｍＳ／ｃｍ又は３．０ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約２．５ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で実施される。
【0074】
本明細書に開示する精製方法は、ある範囲のタンパク質負荷濃度を有するＧＣＳＦ含有試料と一緒に用いることができ、タンパク質負荷濃度とは、ある体積のクロマトグラフィー材料（例えば、ＡＥＸ樹脂）と接触するタンパク質の量を指す。一般に、負荷濃度は、ｇ／Ｌ単位で表される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、クロマトグラフィー用容器に、ＧＣＳＦの負荷濃度が、約１ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料～１０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料、約５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料～１５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料、約１０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料～２０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料、約１５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料～２５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料又は約２０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料～３０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料の範囲になるように負荷される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、クロマトグラフィー用容器に、ＧＣＳＦの負荷濃度が、約５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、１０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、１５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、２０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、２５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、３０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、３５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、４０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、４５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満又は５０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満のいずれかとなるように負荷される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、クロマトグラフィー用容器に、ＧＣＳＦの負荷濃度が、約１ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約２ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約３ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約４ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約６ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約７ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約８ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約９ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１０ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１１ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１２ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１３ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１４ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満、約１５ｇ／Ｌ ＡＥＸ材料未満のいずれかとなるように負荷される。幾つかの実施形態において、最大負荷濃度は、ＡＥＸ樹脂１リットル当たりＧＣＳＦ１５グラムである。
【0075】
溶出
ＡＥＸクロマトグラフィー材料への試料の負荷が完了したら、次いでＡＥＸクロマトグラフィー材料からＧＣＳＦ製品を溶出（例えば、除去）させることができる。この目的のために、ＧＣＳＦ製品を固定相、例えば、ＡＥＸクロマトグラフィー材料から溶出するための溶出緩衝液を使用することができる。多くの場合、溶出緩衝液は、負荷緩衝液及び／又は洗浄緩衝液とは異なる物理的特性を有する。溶出緩衝液の電気伝導率及び／又はｐＨを、ＡＥＸクロマトグラフィー材料からＧＣＳＦ製品が溶出するように調整することができる。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、移動相の組成が溶出プロセス全体を通して変化しないアイソクラティック溶出条件下で実施される。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、溶出プロセスを行う間、移動相の電気伝導率又はｐＨが上昇／低下するグラジエント溶出（例えば、線形グラジエント溶出）条件下で実施される。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、グラジエント溶出を行う間、２つ以上の条件が変更される疑似グラジエント（ｐｓｅｕｄｏ－ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出条件下で実施される。疑似グラジエント方法の例として、これらに限定されるものではないが、溶出プロセスを行う間、移動相の電気伝導率を上昇させながら、それと並行して移動相のｐＨを低下させるものが挙げられ、それにより、アイソクラティック溶出又は移動相の条件を１つだけ変化させるグラジエントを実施する場合と比較して、より高い純度水準が達成される。疑似グラジエント溶出の他の例は、イオン交換溶出中にｐＨ及び塩濃度を並行して変化させることにより複合的効果を得るものがある。
ＡＥＸクロマトグラフィー材料への試料の負荷が完了したら、次いでＡＥＸクロマトグラフィー材料からＧＣＳＦ製品を溶出（例えば、除去）させることができる。この目的のために、ＧＣＳＦ製品を固定相、例えば、ＡＥＸクロマトグラフィー材料から溶出するための溶出緩衝液を使用することができる。多くの場合、溶出緩衝液は、負荷緩衝液及び／又は洗浄緩衝液とは異なる物理的特性を有する。溶出緩衝液の電気伝導率及び／又はｐＨを、ＡＥＸクロマトグラフィー材料からＧＣＳＦ製品が溶出するように調整することができる。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、移動相の組成が溶出プロセス全体を通して変化しないアイソクラティック溶出条件下で実施される。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、溶出プロセスを行う間、移動相の電気伝導率又はｐＨが上昇／低下するグラジエント溶出（例えば、線形グラジエント溶出）条件下で実施される。幾つかの実施形態において、溶出ステップは、グラジエント溶出を行う間、２つ以上の条件が変更される疑似グラジエント（ｐｓｅｕｄｏ－ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶出条件下で実施される。疑似グラジエント方法の例として、これらに限定されるものではないが、溶出プロセスを行う間、移動相の電気伝導率を上昇させながら、それと並行して移動相のｐＨを低下させるものが挙げられ、それにより、アイソクラティック溶出又は移動相の条件を１つだけ変化させるグラジエントを実施する場合と比較して、より高い純度水準が達成される。疑似グラジエント溶出の他の例は、イオン交換溶出中にｐＨ及び塩濃度を並行して変化させることにより複合的効果を得るものがある。
【0076】
原則として、溶出緩衝液は、負荷緩衝液及び／又は洗浄緩衝液と比較して、より高い又はより低い電気伝導率及びより高い又はより低いｐＨの任意の組合せを有し得る。例えば、溶出緩衝液は、負荷緩衝液とは異なる電気伝導率又は負荷緩衝液とは異なるｐＨを有し得る。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、負荷緩衝液よりも低い電気伝導率を有する。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、負荷緩衝液よりも高い電気伝導率を有する。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液の電気伝導率は、負荷緩衝液及び／又は洗浄緩衝液の電気伝導率から、ステップグラジエント又は線形グラジエントにより変化する。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は負荷緩衝液よりも低いｐＨを有する。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は負荷緩衝液よりも高いｐＨを有する。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、負荷緩衝液とは異なる電気伝導率及び異なるｐＨを有する。
【0077】
これに加えて、クロマトグラフィー材料からのＧＣＳＦ製品の結合／溶出モードでの溶出を、夾雑物を最小限にし、且つプール体積を最小限にして製品を得るために最適化することができる。例えば、ＧＣＳＦ含有試料を、負荷緩衝液中で、ＡＥＸ材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに負荷することができる。負荷が完了したら、ＧＣＳＦ製品を、溶出緩衝液の電気伝導率は一定のまま、幾つかの異なるｐＨを有する緩衝液を用いて溶出することができる。別法として、ＧＣＳＦ製品を、溶出緩衝液のｐＨは一定のまま、幾つかの異なる電気伝導率を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィー材料から溶出することができる。クロマトグラフィー材料からのＧＣＳＦ製品の溶出後に得られるプール画分に含まれる夾雑物の量は、所与のｐＨ又は電気伝導率ごとの、夾雑物からの製品の分離に関する情報となる。
【0078】
溶出緩衝液をＧＣＳＦを固定相、即ち、ＡＥＸクロマトグラフィー材料から溶出するために使用する。溶出緩衝液の電気伝導率及び／又はｐＨを、ＡＥＸ材料に結合しているＧＣＳＦを確実に適切に溶出するために監視及び／又は調整することができる。本開示の溶出緩衝液に好適な緩衝液系の非限定的な例としては、リン酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＥＰＦＳ、ＣＡＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＴＥＳ、ＢＥＳ、ＴＡＰＳ、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリシン、ビシン、アセトアミドグリシン、グリシンアミド又はｐＫａが７を超える生体適合性を有する他の緩衝物質をベースとするものが挙げられる。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約２０ｍＭ～６０ｍＭの範囲、例えば、約２０ｍＭ～４０ｍＭ、約２５ｍＭ～４５ｍＭ、約３０ｍＭ～５０ｍＭ、約３５ｍＭ～５５ｍＭ、約４０ｍＭ～６０ｍＭ、約２０ｍＭ～５０ｍＭ、約３０ｍＭ～６０ｍＭ又は約４０ｍＭ～６０ｍＭ等の範囲のモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ又は６０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約３０ｍＭ～６０ｍＭのモル濃度のＴｒｉｓを含む。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は４０ｍＭのＴｒｉｓを含む。
【0079】
幾つかの実施形態においては、ＡＥＸ材料に結合しているＧＣＳＦ分子を、溶出緩衝液の塩濃度を増加することにより溶出することができる。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、ＡＥＸ材料に結合しているＧＣＳＦが確実に適切に溶出するように調整することができるモル濃度で含む。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、ＮａＣｌを、約３０ｍＭ～８０ｍＭの範囲、例えば、約３０ｍＭ～６０ｍＭ、約３５ｍＭ～６５ｍＭ、約４０ｍＭ～７０ｍＭ、約４５ｍＭ～７５ｍＭ、約５０ｍＭ～８０ｍＭ、約３０ｍＭ～５０ｍＭ、約４０ｍＭ～６０ｍＭ又は約５０ｍＭ～８０ｍＭ等の範囲のモル濃度で含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、ＮａＣｌを、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ又は８０ｍＭのモル濃度で含む。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、ＮａＣｌを、約６０ｍＭ～７０ｍＭ ＮａＣｌのモル濃度で含む。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
【0080】
溶出緩衝液に好適なｐＨは、約７．４～８．０の範囲、例えば、約７．４～７．６、約７．５～７．７、約７．６～７．８、約７．７～７．９又は約７．８～８．０等の範囲にある。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、約７．４～７．８又は約７．５～７．７の範囲にある。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは、約７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは約７．５である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは約７．８である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液のｐＨは７．６である。
【0081】
幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦの溶出は、約７．４～８．２ｍＳ／ｃｍの範囲、例えば、約７．４～８．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５～８．１ｍＳ／ｃｍ又は約７．６～８．２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦの溶出は、約７．４ｍＳ／ｃｍ、７．５ｍＳ／ｃｍ、７．６ｍＳ／ｃｍ、７．７ｍＳ／ｃｍ、７．８ｍＳ／ｃｍ、７．９ｍＳ／ｃｍ、８．０ｍＳ／ｃｍ、８．１ｍＳ／ｃｍ又は８．２ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦの溶出は、約７．８ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で実施される。
【0082】
本開示の方法の幾つかの実施形態において、溶出された製品のクロマトグラフィー画分（例えば、溶出液（ｅｌｕａｔｅ））を回収することができる。幾つかの実施形態において、回収されるクロマトグラフィー画分は、約０．０１ＣＶ（カラム体積）超、０．０２ＣＶ超、０．０３ＣＶ超、０．０４ＣＶ超、０．０５ＣＶ超、０．０６ＣＶ超、０．０７ＣＶ超、０．０８ＣＶ超、０．０９ＣＶ超、０．１ＣＶ超、０．２ＣＶ超、０．３ＣＶ超、０．４ＣＶ超、０．５ＣＶ超、０．６ＣＶ超、０．７ＣＶ超、０．８ＣＶ超、０．９ＣＶ超、１．０ＣＶ超、２．０ＣＶ超、３．０ＣＶ、超４．０ＣＶ超、５．０ＣＶ超、６．０ＣＶ超、７．０ＣＶ超、８．０ＣＶ超、９．０ＣＶ超又は１０．０ＣＶ超である。幾つかの実施形態において、回収されるクロマトグラフィー画分の体積は０．５ＣＶである。幾つかの実施形態において、製品、例えば、ＧＣＳＦを含むクロマトグラフィー画分はプールされる。幾つかの実施形態において、負荷画分から及び溶出画分から得られるＧＣＳＦを含む画分がプールされる。クロマトグラフィー画分中のＧＣＳＦの量は、当業者が測定することができ、例えば、クロマトグラフィー画分中のＧＣＳＦの量は、ＵＶ分光分析により２８０ｎｍの吸光度を用いて、又はＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｄｙｅにより決定することができる。幾つかの実施形態においては、検出可能な量のＧＣＳＦを含む画分がプールされる。幾つかの実施形態においては、ＡＥＸ材料を、例えば溶出後に、高い塩濃度（例えば、５ＣＶの２Ｍ ＮａＣｌ）でストリッピングすることができる。幾つかの実施形態において、この方法は、ＡＥＸ材料を、例えば、５ＣＶの０．５Ｎ水酸化ナトリウムで、又は２Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｎ ＮａＯＨで殺菌するステップを更に含む。
【0083】
幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、全ての段階のための直線流速で操作される。幾つかの実施形態において、直線流速は、約５０ＣＶ／ｈｒ未満、４０ＣＶ／ｈｒ未満又は３０ＣＶ／ｈｒ未満のいずれかである。この流速は、約５ＣＶ／ｈｒ～約５０ＣＶ／ｈｒの間、約１０ＣＶ／ｈｒ～約４０ＣＶ／ｈｒの間又は約１８ＣＶ／ｈｒ～約３６ＣＶ／ｈｒの間のいずれかとすることができる。幾つかの実施形態において、流速は、約９ＣＶ／ｈｒ、１８ＣＶ／ｈｒ、２５ＣＶ／ｈｒ、３０ＣＶ／ｈｒ、３６ＣＶ／ｈｒ又は４０ＣＶ／ｈｒのいずれかである。幾つかの実施形態において、流速は、約２００ｃｍ／ｈｒ未満、１７５ｃｍ／ｈｒ未満、１５０ｃｍ／ｈｒ未満、１２５ｃｍ／ｈｒ未満、１００ｃｍ／ｈｒ未満、７５ｃｍ／ｈｒ未満、５０ｃｍ／ｈｒ未満又は２５ｃｍ／ｈｒ未満のいずれかである。流速は、約２５ｃｍ／ｈｒ～２００ｃｍ／ｈｒの間、５０ｃｍ／ｈｒ～１５０ｃｍ／ｈｒの間、１００ｃｍ／ｈｒ～１７５ｃｍ／ｈｒの間、５０ｃｍ／ｈｒ～１００ｃｍ／ｈｒの間、１２５ｃｍ／ｈｒ～１７５ｃｍ／ｈｒの間、１００ｃｍ／ｈｒ～２００ｃｍ／ｈｒの間又は２５０ｃｍ／ｈｒ～２００ｃｍ／ｈｒの間のいずれかとすることができる。幾つかの実施形態において、直線流速は約１５０ｃｍ／ｈｒである。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階の少なくとも１つは、２５ｃｍ／ｈｒ、５０ｃｍ／ｈｒ又は７５ｃｍ／ｈｒで実施される。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階の少なくとも１つは５０ｃｍ／ｈｒで実施される。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階は異なる流速で実施される。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階は同一の低速で実施される。
【0084】
ＧＣＳＦ供給源
上に述べたように、本明細書に記載する方法を用いて精製されるＧＣＳＦタンパク質、例えば、ヒトＧＣＳＦは、一般に、組換え技法を用いて、真核生物（例えば、酵母及び哺乳動物細胞株）内で又は細菌等の原核生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）））内で産生される。組換え技法を用いる場合、ＧＣＳＦタンパク質は、細胞内で産生させるか、ペリプラズム間隙内で産生させるか又は培地に直接分泌させることができる。産生される組換えＧＣＳＦの形態は、発現に使用する宿主生物の種類に依存する。組換えＧＣＳＦを真核細胞内で発現させる場合は、一般に、可溶性形態で産生及び分泌される。他方、組換えＧＣＳＦを原核細胞、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））内で発現させると、封入体（ＩＢ）と呼ばれる不活性且つ不溶性の凝集体が形成されることが多く、これは一般に、二次構造を有し、且つ密に凝集している。一般に、既存の精製プロセスでは、こうした不溶性凝集体は、変性剤を含む緩衝液中で可溶化した後、変性された形態を再生ステップによって適切な三次元構造を有する生物活性形態に変換する。したがって、幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、ＧＣＳＦを発現する組換え細胞から得られたＩＢを含み、発現したＧＣＳＦは組換え細胞内でＩＢを形成する。幾つかの実施形態において、組換え細胞は原核細胞である。幾つかの実施形態において、原核細胞は大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞である。幾つかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。幾つかの実施形態において、組換え真核細胞は、真菌細胞（例えば、糸状真菌又は酵母）、ＳＦ９細胞等の昆虫細胞又は動物細胞である。幾つかの実施形態において、動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等の組換え哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態において、組換え真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉs）細胞である。
上に述べたように、本明細書に記載する方法を用いて精製されるＧＣＳＦタンパク質、例えば、ヒトＧＣＳＦは、一般に、組換え技法を用いて、真核生物（例えば、酵母及び哺乳動物細胞株）内で又は細菌等の原核生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）））内で産生される。組換え技法を用いる場合、ＧＣＳＦタンパク質は、細胞内で産生させるか、ペリプラズム間隙内で産生させるか又は培地に直接分泌させることができる。産生される組換えＧＣＳＦの形態は、発現に使用する宿主生物の種類に依存する。組換えＧＣＳＦを真核細胞内で発現させる場合は、一般に、可溶性形態で産生及び分泌される。他方、組換えＧＣＳＦを原核細胞、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））内で発現させると、封入体（ＩＢ）と呼ばれる不活性且つ不溶性の凝集体が形成されることが多く、これは一般に、二次構造を有し、且つ密に凝集している。一般に、既存の精製プロセスでは、こうした不溶性凝集体は、変性剤を含む緩衝液中で可溶化した後、変性された形態を再生ステップによって適切な三次元構造を有する生物活性形態に変換する。したがって、幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、ＧＣＳＦを発現する組換え細胞から得られたＩＢを含み、発現したＧＣＳＦは組換え細胞内でＩＢを形成する。幾つかの実施形態において、組換え細胞は原核細胞である。幾つかの実施形態において、原核細胞は大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞である。幾つかの実施形態において、組換え細胞は真核細胞である。幾つかの実施形態において、組換え真核細胞は、真菌細胞（例えば、糸状真菌又は酵母）、ＳＦ９細胞等の昆虫細胞又は動物細胞である。幾つかの実施形態において、動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞等の組換え哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態において、組換え真菌細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉs）細胞である。
【0085】
組換えにより産生されたＧＣＳＦタンパク質は、培養培地から又は宿主細胞溶解物から回収することができる。ポリペプチドの発現に用いた細胞は、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊又は細胞溶解剤等の様々な物理的又は化学的手段により破壊することができる。ポリペプチドを細胞内で産生した場合、第１ステップとして、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかである粒子状の残屑を、遠心分離又は限外濾過によって除去する。残屑細胞は遠心分離によって除去することができる。ＧＣＳＦが培地に分泌される場合は、一般に、そのような発現系の上清を、まず市販のポリペプチド濃縮フィルタ、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、上述のステップのいずれかにおいてＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を含有させることができ、及び外来性夾雑物の増殖を防止するために抗生物質を含有させることができる。
【0086】
したがって、幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は、ヒトＧＣＳＦ（ｈＧＣＳＦ）ポリペプチドを含むことができる。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦポリペプチドは、配列番号１に示すヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧＣＳＦ）の配列を有するポリペプチド又はＧＣＳＦ活性を示すｈＧＣＳＦの変異体とすることができる。
【0087】
ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥＬＶＬＬＧＨＳＬＧＩＰＷＡＰＬＳＳＣＰＳＱＡＬＱＬＡＧＣＬＳＱＬＨＳＧＬＦＬＹＱＧＬＬＱＡＬＥＧＩＳＰＥＬＧＰＴＬＤＴＬＱＬＤＶＡＤＦＡＴＴＩＷＱＱＭＥＥＬＧＭＡＰＡＬＱＰＴＱＧＡＭＰＡＦＡＳＡＦＱＲＲＡＧＧＶＬＶＡＳＨＬＱＳＦＬＥＶＳＹＲＶＬＲＨＬＡＱＰ（配列番号１）。
【0088】
ＧＣＳＦ活性は、ＧＣＳＦポリペプチドがＧＣＳＦ受容体にｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで結合する能力によって評価することができる。ＧＣＳＦ活性は、その細胞増殖活性とすることもでき、これは、例えば、マウス細胞株ＮＦＳ－６０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８３８）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験により測定することができる。ＮＦＳ－６０細胞株を使用するＧＣＳＦ活性に適したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ らによるＪ． Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３（１）：９－２０，１９９５に記載されている。ＧＣＳＦ活性を示すポリペプチドは、測定可能な作用、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で測定可能な増殖活性を示した場合に、そのような活性を有すると見なされる。ＧＣＳＦの機能的活性はまた、その（ｉ）内皮細胞の増殖及び遊走、（ｉｉ）ノルエピネフリン再取り込みの減少、（ｉｉｉ）破骨細胞活性の上昇並びに（ｉｖ）骨芽細胞活性の低下のうちの１種又は複数種の効果を評価することにより決定することもできる。ＧＣＳＦの機能的活性はまた、その造血前駆細胞の分化及び増殖並びに／又は造血系の成熟細胞の活性化を促進する能力により決定することもできる。
【0089】
幾つかの実施形態において、「ＧＣＳＦ変異体」という用語は、一般に、ｈＧＣＳＦポリペプチドとは異なるが、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドを指す。一般に、ＧＣＳＦ変異体は、ｈＧＣＳＦポリペプチドと、全体として密接に類似しており、且つ多くの領域において同一である。したがって、ＧＣＳＦ変異体という用語は、ヒトＧＣＳＦのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。幾つかの実施形態において、変異体とは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。
【0090】
「機能性変異体」という用語は、ｈＧＣＳＦと比較して完全に機能するか；又はｈＧＣＳＦの生物活性の少なくとも一部、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％を保持しているポリペプチド変異体を指す。幾つかの実施形態において、機能性変異体とは、配列番号１のポリペプチドと比較して完全に機能するポリペプチド変異体を指す。したがって、機能性変異体は、機能性断片、誘導体（例えば、ｈＧＣＳＦと構造的及び機能的に類似しているもの）を包含する。幾つかの実施形態において、機能性変異体は、その融合分子又は融合タンパク質であり得る。ポリペプチド、融合タンパク質、融合分子及びポリペプチド又は機能性ポリペプチド変異体と結合しているタンパク質複合体も、「機能性変異体」という用語に包含されることが理解される。幾つかの実施形態において、本開示のｈＧＣＳＦ機能性変異体は、造血前駆細胞の分化及び増殖並びに／又は造血系の成熟細胞の活性化を促進することができる。
【0091】
本明細書に開示する方法の幾つかの実施形態において、負荷試料は、昆虫細胞又はＣＨＯ細胞等の組換え真核細胞により産生され、次いで培養培地に分泌されたＧＣＳＦを含む。幾つかの実施形態において、負荷試料は、不溶性ＩＢから得られたＧＣＳＦを含む。更なる幾つかの実施形態において、負荷試料は、両方の供給源から得られたＧＣＳＦ、即ち、分泌されたＧＣＳＦ及び不溶性ＩＢから得られたＧＣＳＦを含む。
【0092】
追加の精製技法
バイオ医薬品の安全性を確保するため、規制当局は、ヒトに投与することが意図された組換えタンパク質に対し厳しい精製基準及び関連する品質特性（例えば、本質、純度及び生物活性）を課している。高品質のＧＣＳＦ製品を得るために、本方法の幾つかの実施形態は、本明細書に記載するいずれかのＡＥＸクロマトグラフィーの前又は後のいずれかに１又は複数の精製ステップを更に含むことができる。一般に、当該技術分野において知られている任意のタンパク質精製技法を、本明細書に開示する精製方法と組み合わせて使用することができる。本開示の方法に使用するのに適したタンパク質精製技法の例として、これらに限定されるものではないが、ＡＥＸ及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）等のイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー及びプロテインＧクロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿並びにＧＣＳＦのエピトープタグを有する形態に結合する金属キレートカラムが挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示する方法は、アフィニティークロマトグラフィー、ＣＥＸクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー及びＭＭＣクロマトグラフィーから選択される１又は複数の精製ステップを更に含むことができる。塩、酸又はポリマーＰＥＧによる沈殿等の、クロマトグラフィー分離以外の技法も考えられ得る。本開示の方法に使用するのに適したクロマトグラフィー以外の追加のタンパク質精製技法としては、これらに限定されるものではないが、遠心分離、抽出、ダイアフィルトレーション及び限外濾過が挙げられる。
バイオ医薬品の安全性を確保するため、規制当局は、ヒトに投与することが意図された組換えタンパク質に対し厳しい精製基準及び関連する品質特性（例えば、本質、純度及び生物活性）を課している。高品質のＧＣＳＦ製品を得るために、本方法の幾つかの実施形態は、本明細書に記載するいずれかのＡＥＸクロマトグラフィーの前又は後のいずれかに１又は複数の精製ステップを更に含むことができる。一般に、当該技術分野において知られている任意のタンパク質精製技法を、本明細書に開示する精製方法と組み合わせて使用することができる。本開示の方法に使用するのに適したタンパク質精製技法の例として、これらに限定されるものではないが、ＡＥＸ及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）等のイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー及びプロテインＧクロマトグラフィー等のアフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿並びにＧＣＳＦのエピトープタグを有する形態に結合する金属キレートカラムが挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示する方法は、アフィニティークロマトグラフィー、ＣＥＸクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー及びＭＭＣクロマトグラフィーから選択される１又は複数の精製ステップを更に含むことができる。塩、酸又はポリマーＰＥＧによる沈殿等の、クロマトグラフィー分離以外の技法も考えられ得る。本開示の方法に使用するのに適したクロマトグラフィー以外の追加のタンパク質精製技法としては、これらに限定されるものではないが、遠心分離、抽出、ダイアフィルトレーション及び限外濾過が挙げられる。
【0093】
幾つかの実施形態において、１種又は複数種のタンパク質精製技法は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を含む。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、特に高い流速及び良好な製品回収を可能にする、選択された材料（例えば、ＣＭセファロース（登録商標）ＦＦ）を用いて実施される更なるＣＥＸステップを含む。これらの例において、ＧＣＳＦは酸性環境下で正に帯電するので強力な結合体となり、そして酸性化されたｐＨで塩化ナトリウムの線形グラジエントを用いることによって、少量の所望の緩衝液中に高濃度で溶出することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーを実施するシステム及び方法は当業者によく知られている。一般に、ＧＣＳＦは、特定のｐＨ範囲内で、その正味電荷が正であることに起因して陽イオン交換マトリックスに結合するが、その一方で、核酸、リポ多糖及びタンパク質等の宿主細胞に由来する夾雑物の大部分並びに異なるｐＨ値を有するＧＣＳＦのイオン性異性体及びＧＣＳＦの改変形態は結合することができず、そしてフロースルー中に現れるか又は洗浄により除去される。
【0094】
ＣＥＸ樹脂に使用するのに適した官能基としては、これらに限定されるものではないが、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホネート（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）及びスルホエチル（ＳＥ）が挙げられる。これらはバイオクロマトグラフィープロセスに慣用されている陽イオン交換官能基である。好適な市販の製品としては、これらに限定されるものではないが、カルボキシメチル（ＣＭ）セルロース、ＡＧ ５０ Ｗ、Ｂｉｏ－Ｒｅｘ ７０、カルボキシメチル（ＣＭ）セファデックス、スルホプロピル（ＳＰ）セファデックス、カルボキシメチル（ＣＭ）セファロースＣＬ－６Ｂ、ＣＭセファロースＨＰ、Ｈｙｐｅｒ Ｄ－Ｓ ｃｅｒａｍｉｃ（バイオセプラ）及びスルホネート（Ｓ）セファロース、ＳＰ セファロースＦＦ、ＳＰセファロースＨＰ、ＳＰセファロース１５ ＸＬ、ＣＭセファロースＦＦ、ＴＳＫ ｇｅｌ ＳＰ ５ＰＷ、ＴＳＫ ｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ－ＨＲ、トヨパールＳＰ－６５０Ｍ、トヨパールＳＰ－６５０Ｓ、トヨパールＳＰ－６５０Ｃ、トヨパールＣＭ－６５０Ｍ、トヨパールＣＭ－６５０Ｓ等、スルホプロピルマトリックス、特に、製品であるＳＰセファロースＸＬ及びＳＰセファロースＦＦ（ファストフロー）及びＳ－セファロースＦＦが挙げられる。幾つかの実施形態において、陽イオン交換材料は、スルホプロピル陽イオン交換材料である。幾つかの特定の実施形態において、ＣＥＸは、ＣＭ－セファロースＦＦを用いて実施される。
【0095】
幾つかの実施形態において、１種又は複数種のタンパク質精製技法は、細胞残屑、不溶性夾雑タンパク質及び核酸沈殿物等の夾雑物を除去するための、限外濾過、精密濾過又はダイアフィルトレーション操作を含む。この濾過操作は、細胞残屑、夾雑タンパク質及び沈殿物を経済的に除去するための好都合な手段を提供するものである。当業者は、フィルタ又は濾過方式（ｆｉｌｔｅｒ ｓｃｈｅｍｅ）の選択に当たり、上流の事象の変化又は変動の発生においても性能の頑健性を確保することが重要であることを理解するであろう。良好な清澄化性能と工程収率との間のバランスを維持するためには、様々な濾材を有する多種多様なタイプのフィルタを検討することが必要である。好適なフィルタのタイプとしては、セルロースフィルタ、再生セルロース繊維、無機濾過助剤（例えば、珪藻土、パーライト、フュームドシリカ）を組み合わせたセルロース繊維、無機濾過助剤及び有機樹脂を組み合わせたセルロース繊維又はこれらの任意の組合せ並びに効果的な除去を達成するための高分子フィルタを挙げることができる。高分子フィルタの好適な例としては、これらに限定されるものではないが、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホンが挙げられる。幾つかの実施形態において、濾過操作、例えば、ダイアフィルトレーション及び／又は限外濾過ステップは、ポリエーテルスルホン膜を用いて実施される。幾つかの実施形態において、ダイアフィルトレーション及び／又は限外濾過ステップは、サイウス・ハイストリーム（Ｓｉｕｓ Ｈｙｓｔｒｅａｍ）（登録商標）膜を用いて実施される。
【0096】
更に、本明細書に開示する幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ調製物中の製品濃度をより高くするために、ＧＣＳＦタンパク質を、透析、限外濾過又はダイアフィルトレーションに付すことにより、不要な緩衝液成分等の夾雑物を除去することができる。特に、ダイアフィルトレーションは、より小さい分子は膜を通過させて洗い流し、より大きな対象分子を保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中に残留させる分画プロセスである。これは、塩の除去若しくは交換、洗剤の除去、結合分子からの遊離分子の分離、低分子量物質の除去又はイオン性若しくはｐＨ環境を速やかに変化させるための簡便且つ効率的な技法であると広く認識されている。ダイアフィルトレーションプロセスは、一般に、対象の製品をスラリーから取り出しながら、スラリー濃度を一定に維持するために、精密濾過又は限外濾過膜を使用する。
【0097】
幾つかの実施形態において、上に記載した少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの前に実施することができる。幾つかの実施形態において、上に記載した少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの後に実施することができる。
【0098】
本出願の他の態様は、ＧＣＳＦに結合することができるＡＥＸ材料を含むクロマトグラフィー用容器を含む、ＧＣＳＦを製造するためのシステムであって、クロマトグラフィー用容器は、温度制御された囲いに覆われており、クロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている、システムに関する。幾つかの実施形態において、このシステムは、温度制御された囲いの中に配置された流路を更に含み、流路の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている。
【0099】
本開示の組成物
本開示はまた、本明細書に開示する方法により精製されるＧＣＳＦ分子に加えて、それを含む医薬組成物も提供する。幾つかの実施形態において、この種の方法により得られる精製されたＧＣＳＦは、純度及び／又は機能的活性が向上している、生物活性を有するＧＣＳＦとなり得、特に治療用途に適したものとなり得る。
本開示はまた、本明細書に開示する方法により精製されるＧＣＳＦ分子に加えて、それを含む医薬組成物も提供する。幾つかの実施形態において、この種の方法により得られる精製されたＧＣＳＦは、純度及び／又は機能的活性が向上している、生物活性を有するＧＣＳＦとなり得、特に治療用途に適したものとなり得る。
【0100】
幾つかの実施形態において、精製されたＧＣＳＦは、生物活性を有するＧＣＳＦを８０％を超える純度で含む。幾つかの実施形態において、精製されたＧＣＳＦは、生物活性を有するＧＣＳＦを、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超える純度で含む。精製されたＧＣＳＦの精製の程度を定量化するための様々な方法が当業者に知られている。そのようなものとして、例えば、活性ＧＣＳＦの比活性の測定又は最終製品中のＧＣＳＦの量のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析による評価が挙げられる。本開示の方法により得られるＧＣＳＦの純度を評価する例示的な方法は、得られたＧＣＳＦの比活性を算出し、そしてそれを初期抽出物の比活性と比較し、そしてそれにより純度の程度を算出するものである。
【0101】
本開示に従い得られたＧＣＳＦの生物活性は、当該技術分野において知られている多くの技法により、例えば、当該技術分野において知られているバイオアッセイを用いて測定することができ、そしてそれを標準的な市販のＧＣＳＦの活性と比較する。例えば、本明細書に記載する方法により得られるＧＣＳＦの生物活性を、細胞増殖（ＮＦＳ－６０細胞）の刺激に基づく試験により、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（１９９５、上記参照））により記載されている方法及び国際標準品のヒト組換えＧＣＳＦを使用して測定することができる。
【0102】
こうすることにより、本明細書に記載するように精製されたＧＣＳＦで処理された細胞が、標準品で処理されたものと全く同じように又はそれよりも良好に増殖することを示すことができる。特に、本開示の方法に従い得られる精製されたＧＣＳＦは、ＮＦＳ－６０増殖試験において、ＷＨＯの参照標準品を基準とする生物活性が８０～１００％であるという特徴を示すことができる。
【0103】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載するように精製されたＧＣＳＦは、純度及び／又は機能的活性が向上しているＧＣＳＦである。幾つかの実施形態において、本明細書に記載するＧＣＳＦは、純度が８０％を超え、例えば、純度が８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超等である。幾つかの実施形態において、得られたＧＣＳＦは、比活性が大幅に増大しており、例えば、比活性は少なくとも１×１０5ＩＵ／ｍｇである。幾つかの実施形態において、得られたＧＣＳＦは、比活性が少なくとも１×１０6ＩＵ／ｍｇであり、好ましくは、少なくとも１×１０7ＩＵ／ｍｇであり、より好ましくは、比活性は２～９×１０7ＩＵ／ｍｇの範囲にあり、最も好ましくは、比活性は約１×１０8ＩＵ／ｍｇであり、この比活性は、細胞増殖刺激に基づく方法により測定される。
【0104】
本開示の関連する態様において、本明細書に開示する幾つかの実施形態は、本明細書に開示する治療有効量の生物活性を有するＧＣＳＦを含み、且つ治療用及び臨床用として使用するのに適した医薬組成物に関する。
【0105】
本開示による医薬組成物は、ヒト及び獣医学用として使用される組成物及び製剤を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に開示する生物活性を有するＧＣＳＦと医薬的に許容される補助物質との混合物を含む。好適な医薬的に許容可能な補助物質としては、ＧＣＳＦ療法に有用な、好適な希釈剤、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）及び／又は担体が挙げられる。医薬的に許容される補助物質の非限定的な例として、これらに限定されるものではないが、薬剤投与に適合性を有する生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤並びに吸収遅延剤及び同種のものが挙げられる。補助的な活性物質も組成物に組み込むことができる。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、緩衝剤、塩及び安定剤等の医薬的に許容される添加剤を更に含む。本開示に従い得られるＧＣＳＦ及び医薬組成物は、（ｉ）そのまま使用するか又は（ｉｉ）更に処理する、例えば、後により詳細に説明するように、若しくは例えば、国際公開第２００８／１２４４０６号パンフレットに記載されているようにＰＥＧ化した後、粉末形態若しくは凍結乾燥物若しくは液体形態で保存するかのいずれかとすることができる。幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は液体組成物である。幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は凍結乾燥物又は粉末である。
【0106】
医薬組成物の活性成分としてのＧＣＳＦは、典型的な方法で、静脈内、動脈内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）、経皮、経鼻、吸入、局所、直腸、経口、眼内又は皮下経路で投与することができる。投与方法は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、そして皮下又は静脈内投与がより好ましい。
【0107】
幾つかの実施形態において、注射用途に好適な医薬組成物は、無菌注射用溶液又は分散液を用時調製するための、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液と、無菌粉末とを含む。静脈内投与の場合、好適な補助物質としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。場合によっては、組成物は無菌とすべきであり、且つ容易に通針する範囲の流体とすべきである。これは、製造及び保管条件下で安定であるべきであり、且つ細菌及び真菌等の微生物による汚染作用に対し防腐を行わなければならない。補助物質は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール及び同種のもの）及びこれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することにより、分散液の場合は要求される粒子径を維持することにより、及び界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを使用することにより、維持することができる。微生物による作用は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同種のものによって防止することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、塩化ナトリウムを含有させることが好ましいであろう。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることにより、注射可能な組成物を長時間かけて吸収させることが可能である。
【0108】
本明細書に開示するＧＣＳＦを含む医薬組成物に好適な補助剤の追加の例としては、これらに限定されるものではないが、糖及び糖アルコール、アミノ酸並びに界面活性剤、例えば、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－６０、ポリソルベート－６５、ポリソルベート－８０等に加えて、好適な緩衝物質が挙げられる。本開示の方法による幾つかの実施形態において、精製されたＧＣＳＦは、ｐＨ４．０の１０ｍＭの酢酸、０．００２５％のポリソルベート８０及び５０ｇ／Ｌのソルビトール中で製剤化される。
【0109】
無菌注射用溶液は、活性化合物を所要量の適切な溶媒に、必要に応じて、上に列挙した１種の成分又は成分の組合せと一緒に混合した後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上に列挙したものからの他の必要な成分を含む無菌媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）に、活性化合物を添加することにより調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製に慣用されている方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、この方法を用いることにより、活性化合物に任意の追加の所望の成分を加えた溶液を予め濾過滅菌することにより得られた溶液から、粉末が生成する。
【0110】
経口用組成物を使用する場合は、一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。経口による治療的投与を目的とする場合、活性化合物（例えば、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又はそれを含む医薬組成物）を賦形剤と混合し、そして錠剤、トローチ剤又はカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口用組成物はまた、洗口液として使用するための流体担体を用いて調製することもできる。薬学的な適合性を有する結合剤及び／又は補助物質を、組成物の一部として含有させることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤及び同種のものは、以下に示す成分又は類似の性質を有する化合物のいずれかを含むことができる：結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントガム若しくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプン若しくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）（商標）若しくはコーンスターチ；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）（商標）；流動化剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロース若しくはサッカリン；又は矯味剤、例えば、ハッカ、サリチル酸メチル若しくはオレンジ風味剤。
【0111】
吸入により投与を行う場合、本開示の本明細書に開示する対象のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物を、二酸化炭素等の好適な噴射剤を含む加圧容器若しくはディスペンサーからエアゾールスプレー形態で、又は噴霧器で送達する。この種の方法は米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されている。
【0112】
本明細書に開示する対象のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物の全身投与は、経粘膜又は経皮手段により行うこともできる。経粘膜又は経皮投与の場合、浸透させるべきバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。この種の浸透剤は当該技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻スプレー又は坐剤を用いて実施することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当該技術分野において一般に知られている軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、ザルベ軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤又はクリーム剤に配合される。
【0113】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示する対象のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物は、直腸送達用の坐剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を含む）又は停留浣腸の形態で調製することもできる。幾つかの実施形態において、本開示のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物は、当該技術分野において知られている方法を用いてトランスフェクション又は感染により投与することもできる。
【0114】
一実施形態において、本開示の医薬組成物は、組換えＧＣＳＦが体内から急速に排出されることを防ぐであろう担体と一緒に、例えば、植え込み注射剤及びマイクロカプセル化送達系を含む徐放製剤等として調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。この種の製剤は標準的な技法を用いて調製することができる。材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬的に許容される担体として使用することができる。これらは当業者に知られている方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されている方法に従い調製することができる。
【0115】
幾つかの実施形態において、本開示の組換えＧＣＳＦは、そのｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏにおける半減期を延ばすために更に修飾することができる。本開示の組換えＧＣＳＦの修飾に適した公知の戦略及び方法論の非限定的な例として、（１）ポリペプチドがプロテアーゼと接触することを防ぐ、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）等の溶解性の高い高分子による本明細書に記載するポリペプチドの化学的修飾；及び（２）本明細書に記載するポリペプチドを、例えば、アルブミン等の安定なタンパク質に共有結合させるか又は共役させることが挙げられる。したがって、幾つかの実施形態において、本開示の組換えＧＣＳＦは、アルブミン等の安定なタンパク質に融合させることができる。例えば、ヒトアルブミンは、そこに融合したポリペプチドの安定性を高めるのに最も有効なタンパク質の１種として知られており、且つ多くのこの種の融合タンパク質が報告されている。
【0116】
幾つかの実施形態において、本開示の組換えＧＣＳＦは、１又は複数のポリエチレングリコール部分で化学的に修飾されている、例えば、ＰＥＧ化されているか；又は類似の修飾が施されている、例えば、ＰＡＳ化されている。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ分子又はＰＡＳ分子は、インターフェロンの１又は複数のアミノ酸側鎖と共役している。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたＧＣＳＦポリペプチドは、１個のアミノ酸のみがＰＥＧ又はＰＡＳ部分を含む。他の実施形態において、ＰＥＧ化又はＰＡＳ化されたＧＣＳＦポリペプチドは、ＰＥＧ又はＰＡＳ部分を、２個以上のアミノ酸上に含み、例えば、２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上又は２０個以上の異なるアミノ酸残基に結合している。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ又はＰＡＳ鎖は、２０００、２０００超、５０００、５，０００超、１０，０００、１０，０００超、１０，０００超、２０，０００、２０，０００超及び３０，０００Ｄａである。ＰＡＳ化されたＧＣＳＦポリペプチドは、ＰＥＧ又はＰＡＳに（例えば、連結基なしで）、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介して直接結合させることができる。幾つかの実施形態において、本開示の組換えＧＣＳＦは、平均分子量が２０，０００ダルトンであるポリエチレングリコールに共有結合している。
【0117】
幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、１種又は複数種のＰＥＧ化試薬を含む。本明細書において使用する「ＰＥＧ化」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に共有結合させることによりタンパク質を修飾することを指し、「ＰＥＧ化された」は、タンパク質にＰＥＧが結合されたことを指す。約１０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトンの任意選択的な範囲のサイズを有する様々なＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体を、様々な化学反応を利用して、本開示の組換えポリペプチドに結合させることができる。本開示の方法及び組成物に好適なＰＥＧ化試薬の例として、これらに限定されるものではないが、メトキシポリエチレングリコール－プロピオン酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＰＡ）、ｍＰＥＧ－酪酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＢＡ）、ｍＰＥＧ－コハク酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＳ）、ｍＰＥＧ－炭酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＣ）、ｍＰＥＧ－グルタル酸スクシンイミジル（ｍＰＥＧ－ＳＧ）、ｍＰＥＧ－Ｎ－ヒドロキシル－コハク酸イミド（ｍＰＥＧ－ＮＨＳ）、ｍＰＥＧ－トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）及びｍＰＥＧ－アルデヒドが挙げられる。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬はポリエチレングリコールである。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ化試薬は、タンパク質のＮ－末端メチオニン残基に共有結合している、平均分子量が２０，０００ダルトンであるポリエチレングリコールである。
【0118】
治療方法
本開示の方法に従い得られる、精製されたＧＣＳＦ、及び、特にこの種の方法により得られる生物活性を有するＧＣＳＦは、治療用途に特に適している。したがって、本開示の幾つかの実施形態において、疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療又は予防するための方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又は本明細書に開示する医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。
本開示の方法に従い得られる、精製されたＧＣＳＦ、及び、特にこの種の方法により得られる生物活性を有するＧＣＳＦは、治療用途に特に適している。したがって、本開示の幾つかの実施形態において、疾患又は健康状態の治療又は予防を必要とする対象の疾患又は健康状態を治療又は予防するための方法であって、対象に治療有効量の本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又は本明細書に開示する医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。
【0119】
本明細書において使用する「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」及び「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、生物活性を有する組成物又は製剤を、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内及び局所又はこれらの組合せを含む投与経路により送達することを指す。この用語は、これらに限定されるものではないが、医療の専門家による投与及び自己投与を含む。本明細書において使用する「治療有効量」という用語は、本明細書に開示する方法により得られる生物活性を有するＧＣＳＦの量であって、生物活性を有するＧＣＳＦが治療効果を示す量を指す。
【0120】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物は、それに意図された投与経路に適合するように製剤化される。本開示のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物は、経口又は吸入により与えることができるが、非経口経路を介して投与される傾向が高い。非経口投与経路の例として、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮（局所）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。非経口用途に使用するための溶液又は懸濁液は、次に示す成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒等の無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の張度を調整するための薬剤。ｐＨは、一－及び／若しくは二塩基性のリン酸ナトリウム、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で（例えば、ｐＨ約７．２～７．８、例えば、７．５に）調整することができる。経口用製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアルに封入することができる。
【0121】
本開示のこの種の対象のＧＣＳＦ及び／又は医薬組成物の用量、毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％を死亡させる用量）及びＥＤ50（集団の５０％に治療効果が表れる用量）を決定するための標準的な薬学的手順を用いて、細胞培養又は実験動物により決定することができる。毒性作用を示す用量及び治療効果を示す用量の比は治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表すことができる。一般に、高い治療指数を示す化合物が使用され得る。有毒な副作用を示す化合物を使用することもできるが、非感染細胞が損傷を受ける可能性を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、この種の化合物を患部組織の部位に標的化する送達系の設計に注意を払うべきである。
【0122】
細胞培養試験及び動物実験から得られたデータを、哺乳動物、例えば、ヒトに使用するための様々な投与量を製剤化するために使用することができる。この種の化合物の投与量は、血中濃度が、一般に、ＥＤ50を含み、毒性を殆ど又は全く示さない範囲にある。投与量は、採用される剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。本開示の治療方法に使用される任意の医薬組成物に関する治療有効用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）は、まず細胞培養試験から推定することができる。動物モデルには、循環血漿中濃度が、細胞培養で測定されたＩＣ50（例えば、試験化合物が症状の最大値の半数を阻害する濃度）を含む範囲になるように、用量を処方することができる。この情報を、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。
【0123】
幾つかの実施形態において、本開示の方法は、好中球減少症及び好中球減少が関連する臨床的後遺症、慢性好中球減少症、好中球減少性及び非好中球減少性感染症、細胞障害性化学療法後の発熱性好中球減少症による入院の低減及び骨髄破壊的療法後に骨髄移植を受けた、重篤な好中球減少症が長期に亘るリスクが高いと考えられる患者の好中球減少症の期間の短縮からなる群から選択される１種又は複数種の適応症に関連する疾患又は健康状態の治療及び／又は予防に適している。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、末梢血幹細胞（ＰＢＰＣ）の動員及び慢性炎症状態に関連する疾患又は健康状態の治療及び／又は予防に適している。
【0124】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又はそれを含む医薬組成物の長期投与は、好中球数を増加させると共に、感染関連事象の発生率及び期間を低減し、ＨＩＶ感染進行期の患者の細菌感染のリスクを低下させるための持続性好中球減少症の治療に適応する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又はそれを含む医薬組成物は、集中治療室患者及び危篤状態の患者に対する臨床的成果の改善、創傷／皮膚潰瘍／火傷の治癒及び治療、化学療法及び／又は放射線療法の強化、抗炎症性サイトカインの増加、光線力学的療法の抗腫瘍効果の増強に適応する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示するＧＣＳＦ及び／又はそれを含む医薬組成物は、様々な脳機能障害により引き起こされる病気の予防及び治療、血栓ができる病気及びその合併症の治療並びに放射線照射後の赤血球形成の回復に適応する。これはまた、ＧＣＳＦの適応症として報告されている他のあらゆる病気の治療にも使用することができる。
【0125】
したがって、本明細書に開示する方法により得られる生物活性を有するＧＣＳＦを含む医薬組成物は、患者、小児又は成人に、上に述べた疾患又は健康状態の１種又は複数種の治療又は予防に有効な治療量で投与することができる。幾つかの実施形態において、本開示の方法は、好中球減少症の治療及び／又は予防に適している。
【0126】
上に述べたように、本明細書に開示する組成物のいずれか１種、例えば、精製されたＧＣＳＦ及び医薬組成物を、単独療法（例えば、単剤療法）としてそれを必要とする患者に投与することができる。これに加えて又はこれに替えて、本開示の幾つかの実施形態において、本明細書に開示する精製されたＧＣＳＦ及び医薬組成物の１種又は複数種を、第１療法として、第２療法と組み合わせて患者に投与することができる。幾つかの実施形態において、第２療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法及び手術からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、第１療法及び第２療法は併用して（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）施される。幾つかの実施形態において、第１療法は第２療法と同時に施される。幾つかの実施形態において、第１療法及び第２療法は順次施される。幾つかの実施形態において、第１療法は第２療法の前に施される。幾つかの実施形態において、第１療法は第２療法の後に施される。幾つかの実施形態において、第１療法は第２療法の前及び／又は後に施される。幾つかの実施形態において、第１療法及び第２療法は交互に施される。幾つかの実施形態において、第１療法及び第２療法は単一の製剤で一緒に投与される。
【0127】
システム
本明細書においては、ＧＣＳＦを製造するための様々なシステムも提供する。特に、本開示の幾つかの実施形態は、ＧＣＳＦに結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を含む１又は複数のクロマトグラフィー用容器を含むシステムであって、クロマトグラフィー用容器は温度制御された囲いに覆われており、且つクロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている、システムに関する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示するシステムは、バイオリアクターを含む上流構成要素と、本明細書に記載する１又は複数のＡＥＸクロマトグラフィー用容器を含む精製モジュールを含む下流構成要素とを含む。幾つかの実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも１種の細胞培養培地及びＧＣＳＦを発現するように構成された少なくとも１種の組換え細胞を含む懸濁液を収容した増殖槽（ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｍｂｅｒ）を含む。
本明細書においては、ＧＣＳＦを製造するための様々なシステムも提供する。特に、本開示の幾つかの実施形態は、ＧＣＳＦに結合することができる陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）材料を含む１又は複数のクロマトグラフィー用容器を含むシステムであって、クロマトグラフィー用容器は温度制御された囲いに覆われており、且つクロマトグラフィー用容器の囲いの少なくとも一部の温度は約７℃～約１３℃に設定されている、システムに関する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示するシステムは、バイオリアクターを含む上流構成要素と、本明細書に記載する１又は複数のＡＥＸクロマトグラフィー用容器を含む精製モジュールを含む下流構成要素とを含む。幾つかの実施形態において、バイオリアクターは、少なくとも１種の細胞培養培地及びＧＣＳＦを発現するように構成された少なくとも１種の組換え細胞を含む懸濁液を収容した増殖槽（ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｍｂｅｒ）を含む。
【0128】
本開示のシステムを例示する非限定的な実施形態は、以下に示す１又は複数の特徴を含む。幾つかの実施形態において、このシステムは、温度制御された囲いの中に配置された流路を更に含み、この流路の囲いの少なくとも一部の温度は７℃～約１３℃に設定されている。幾つかの実施形態において、容器の囲い及び流路の囲いの設定温度は等しい。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路ジャケットの囲いの設定温度は異なる。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器の囲い及び流路の囲いの少なくとも１つの温度は約１０℃に設定されている。幾つかの実施形態において、クロマトグラフィー用容器は、カラム、槽、充填床、流動床、カートリッジ、内封された膜、貯留器、チャンバ、コンテナ及び混合槽からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、流路は、チューブ、パイプ、バッグ、コンテナ、貯蔵タンク、混合槽又は他の流体案内手段である。
【0129】
幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＧＣＳＦ試料を負荷する前に、約３０ｍＭ～約５０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨが約７．０～約８．０である平衡化緩衝液で平衡化される。幾つかの実施形態において、平衡化緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓを含み、且つｐＨは約７．６である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＧＣＳＦを溶出する前に、未結合又は弱く結合している夾雑物を除去するために洗浄緩衝液で洗浄される。幾つかの実施形態において、洗浄緩衝液及び平衡化緩衝液は、同一の緩衝液組成を有する。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ含有試料は負荷緩衝液を含む。幾つかの実施形態において、負荷緩衝液のｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦ試料のクロマトグラフィー用容器への負荷は、約１．５～約３．０ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。
【0130】
本開示のシステムの幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約３０ｍＭ～６０ｍＭのＴｒｉｓ、約３０ｍＭ～８０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．４～約８．０である。幾つかの実施形態において、溶出緩衝液は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ、約５０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、且つｐＨは約７．７である。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料からのＧＣＳＦの溶出は、約７．４～約８．２ｍＳ／ｃｍの範囲の電気伝導率で実施される。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換クロマトグラフィーを含む。幾つかの実施形態において、ＡＥＸ材料は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂を含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）樹脂は、ＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を含む。
【0131】
幾つかの実施形態において、本システムは、ＡＥＸ材料のストリッピング及び／又はサニテーションの１又は複数の段階を更に含む。幾つかの実施形態において、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、全ての段階のための直線流速で実施される。幾つかの実施形態において、直線流速は約１５０ｃｍ／ｈｒである。幾つかの実施形態において、ストリッピング及びサニテーション段階の少なくとも１つは５０ｃｍ／ｈｒで実施される。幾つかの実施形態において、ＧＣＳＦは、組換えヒトＧＣＳＦ（ｈＧＣＳＦ）又はその変異体である。幾つかの実施形態において、試料は、組換え真核細胞又は組換え原核細胞から得られたＧＣＳＦを含む。
【0132】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示するシステムは、少なくとも１つの追加の精製プロセスを更に含む。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属アフィニティークロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、遠心分離、ダイアフィルトレーション及び限外濾過からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの前に実施される。幾つかの実施形態において、この少なくとも１つの追加の精製プロセスは、ＡＥＸクロマトグラフィープロセスの後に実施される。
【0133】
本開示において言及されている全ての刊行物及び特許出願を参照することにより、個々の刊行物又は特許出願のそれぞれが参照により具体的に且つ個別に援用されることが示されているのと同程度に、本明細書に援用する。
【0134】
本明細書に引用されている参考文献は、これらが先行技術を構成することを認めるものではない。参考文献の解説は、その著者の主張を述べたものであり、本発明者は、引用した文書の正確性及び妥当性に関し異議を唱える権利を有している。本明細書においては、科学雑誌の論文、特許文書及び教科書を含む多くの情報源を参照するが、この参照は、これらの文書が当該技術分野における一般知識の一部を構成することを認めるものではないことが明確に理解されるであろう。
【0135】
本明細書に示す一般的な方法の説明は、例示のみを目的とする。当業者が本開示を再検討することにより、他の代替的な方法及び代替物が明らかとなり、これらは本出願の主旨及び範囲内に包含されるべきである。
【0136】
追加の実施形態を以下の実施例に更に詳細に開示するが、これらは例示を目的として提供するものであって、いかなる形でも本開示又は特許請求の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0137】
追加の実施形態を以下の実施例に更に詳細に開示するが、これらは例示を目的として提供するものであって、いかなる形でも本開示又は特許請求の範囲を限定することを意図していない。
【0138】
実施例１
陰イオン交換クロマトグラフィーパラメータの改良
本実施例においては、（１）ＡＥＸ操作温度、（２）負荷濃度、（３）分画及び（４）樹脂の寿命を含む幾つかのＡＥＸクロマトグラフィーパラメータがＧＣＳＦ製品に関連する品質及び収率に与える影響を評価するために実施した実験の結果をまとめる。後により詳細に説明するように、事前にＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を用いて保持時間の安定性に関する試験を実施したところ、ＤＥＡＥへの負荷を室温条件で維持した場合、収率が不安定になることが認められた。
陰イオン交換クロマトグラフィーパラメータの改良
本実施例においては、（１）ＡＥＸ操作温度、（２）負荷濃度、（３）分画及び（４）樹脂の寿命を含む幾つかのＡＥＸクロマトグラフィーパラメータがＧＣＳＦ製品に関連する品質及び収率に与える影響を評価するために実施した実験の結果をまとめる。後により詳細に説明するように、事前にＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー樹脂を用いて保持時間の安定性に関する試験を実施したところ、ＤＥＡＥへの負荷を室温条件で維持した場合、収率が不安定になることが認められた。
【0139】
カラム操作温度
ＤＥＡＥ負荷液は、安定性のために冷却して保存する必要があるので、氷水浴（２～８℃）で冷却した負荷液を用いてＤＥＡＥクロマトグラフィー操作を評価した。これに加えて、クロマトグラフィー自体の温度の影響を理解するために、冷却したクロマトグラフィーカラム（氷水浴中、２～８℃）についても評価した。表１にまとめるように、４種の実験条件について試験を行った：（１）低温の負荷液及び低温のカラム；（２）室温の負荷液及び低温のカラム；（３）低温の負荷液及び室温のカラム；並びに（４）室温の負荷液及び室温のカラム。４種の条件には全て同一の供給原料を使用した。必要に応じて、カラム及び負荷液の冷却に氷浴を使用した。表１のデータに基づき、冷却したカラムを用いることにより、収率が最も向上したことが認められた。
ＤＥＡＥ負荷液は、安定性のために冷却して保存する必要があるので、氷水浴（２～８℃）で冷却した負荷液を用いてＤＥＡＥクロマトグラフィー操作を評価した。これに加えて、クロマトグラフィー自体の温度の影響を理解するために、冷却したクロマトグラフィーカラム（氷水浴中、２～８℃）についても評価した。表１にまとめるように、４種の実験条件について試験を行った：（１）低温の負荷液及び低温のカラム；（２）室温の負荷液及び低温のカラム；（３）低温の負荷液及び室温のカラム；並びに（４）室温の負荷液及び室温のカラム。４種の条件には全て同一の供給原料を使用した。必要に応じて、カラム及び負荷液の冷却に氷浴を使用した。表１のデータに基づき、冷却したカラムを用いることにより、収率が最も向上したことが認められた。
【表1】
【0140】
次いで、実験１から得られたＧＣＳＦ試料を用いてより制御された温度に関する試験を実施した。この材料を、負荷液及びカラムの両方を１つの冷却器で、１０℃、１５℃及び２０℃の等しい設定温度で冷却して、負荷濃度を１５ｇ／ＬとしてＤＥＡＥカラムに負荷した。この制御された温度に関する試験の結果をまとめたものを表２に示す。
【表2】
【0141】
温度が低いほど収率が向上することが認められたが、表１及び表２に示したデータを得るために処理した供給原料間で収率が依然として変動することが認められた。特定の理論に束縛されるものではないが、この収率の変動は、供給原料の製品の品質が経時的に（例えば、供給原料の古さ）変化することに起因する可能性が最も高い。表１及び表２に示したデータに基づき、以降のＧＣＳＦ製造は、ＧＭＰ規則に準拠し、ジャケット付きのカラム及び負荷液用容器を有する温度制御された設備を組み込んだ。この設備のジャケットの温度設定値を１０℃に設定した。
【0142】
負荷濃度
ＤＥＡＥクロマトグラフィーの負荷濃度の効果を２種の異なる供給原料を用いて評価した。最初の評価においては、ＧＣＳＦ含有試料（試料１）をＤＥＡＥカラムに負荷濃度を増加しながら負荷した：１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌ。この第１試験においては、負荷液を１０℃に冷却し、カラムを室温に維持した。これらの負荷濃度条件で得られたＧＣＳＦ収率を評価し、表３に示した。第２負荷濃度試験においては、他のＧＣＳＦ含有試料（試料２）を使用した。この第２試験においては、負荷液及びカラムジャケットを冷却器で１０℃に制御した。試料２を、負荷濃度を５ｇ／Ｌ～１７ｇ／Ｌの範囲で増加させ、ＤＥＡＥカラムに負荷した。ＧＣＳＦ収率及び製品の品質を評価し、表４に示した。表３及び表４に示したデータに基づき、負荷濃度を８ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌと定めた。
ＤＥＡＥクロマトグラフィーの負荷濃度の効果を２種の異なる供給原料を用いて評価した。最初の評価においては、ＧＣＳＦ含有試料（試料１）をＤＥＡＥカラムに負荷濃度を増加しながら負荷した：１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌ。この第１試験においては、負荷液を１０℃に冷却し、カラムを室温に維持した。これらの負荷濃度条件で得られたＧＣＳＦ収率を評価し、表３に示した。第２負荷濃度試験においては、他のＧＣＳＦ含有試料（試料２）を使用した。この第２試験においては、負荷液及びカラムジャケットを冷却器で１０℃に制御した。試料２を、負荷濃度を５ｇ／Ｌ～１７ｇ／Ｌの範囲で増加させ、ＤＥＡＥカラムに負荷した。ＧＣＳＦ収率及び製品の品質を評価し、表４に示した。表３及び表４に示したデータに基づき、負荷濃度を８ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌと定めた。
【表3】
【表4】
【0143】
ＤＥＡＥ分画
ＡＥＸクロマトグラフィー材料への試料の負荷及びクロマトグラフィー材料からプール画分への製品の溶出が完了した後の、プール画分中の夾雑物（例えば、宿主細胞由来タンパク質、ＨＣＰ）の量は、ｐＨ又は電気伝導率等の所与の溶出条件における製品の夾雑物からの分離に関する有用な情報を提供することができる。
ＡＥＸクロマトグラフィー材料への試料の負荷及びクロマトグラフィー材料からプール画分への製品の溶出が完了した後の、プール画分中の夾雑物（例えば、宿主細胞由来タンパク質、ＨＣＰ）の量は、ｐＨ又は電気伝導率等の所与の溶出条件における製品の夾雑物からの分離に関する有用な情報を提供することができる。
【0144】
表５に示す実験において、ピーク全体に亘る製品の品質の分布を理解することを試みて、溶出した製品全体のピークの分画を実施した。概して、ＧＣＳＦ供給原料を未使用の（ｎａｉｖｅ）ＤＥＡＥカラムに負荷濃度１５ｇ／Ｌで負荷し、２８０ｎｍのＯＤが０．５になった時点で、ＤＥＡＥ樹脂から体積０．５ＣＶ画分の回収を開始し、ＯＤが０．５に低下した時点で停止した。次いでこれらの画分を逆相（ＲＰ）で分析し、そして宿主細胞由来タンパク質含有量に関する分析を行った。結果の概要を図１及び表５に示す。（１）より疎水性の高い化学種（ＭＨＳ）の比率がピーク全体の画分の中で増加し；（２）タンパク質含有量当たりの宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）はプールの最初及び最後に最大となり、分布がピーク全体に亘り比較的一定していることが観察された。
【表5】
【0145】
ＤＥＡＥカラムの寿命
ＤＥＡＥ樹脂の寿命を次に示すように評価した。負荷液及びカラムの温度条件を再考し、樹脂の寿命を、２種の異なる供給原料、即ち、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １材料及びＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２材料を用いて類似の条件で評価した。
ＤＥＡＥ樹脂の寿命を次に示すように評価した。負荷液及びカラムの温度条件を再考し、樹脂の寿命を、２種の異なる供給原料、即ち、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １材料及びＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２材料を用いて類似の条件で評価した。
【0146】
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １材料を用いて、負荷濃度を１５ｇ／Ｌとし、負荷液及びカラムジャケット温度の設定値を１０℃として、繰返し性（ｃｙｃｌｉｎｇ）を評価した。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １の繰り返し試験から得られたプール液の収率を分析した。結果を表６に示す。
【表6】
【0147】
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２材料を用いて同様の条件で繰返し性を評価した。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １及びＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２の差は、供給原料の製品品質の経時変化を調整するために行った負荷材料の取扱いによって発生したものである。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １を用いた繰返し試験の最初の５サイクルは負荷液を１０℃に保持し、残りの２サイクルは解凍直後（ｆｒｅｓｈ ｔｈａｗ）のものを用いた。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２を用いた繰返し試験は、２サイクルごとに解凍直後の負荷液を使用した。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２を用いた繰返し試験から得られたプール液の収率及び製品品質を分析した（表７）。１回目のサイクル後から、サイクル数と共に、収率が比例的に僅かに上昇する。これらの試験に基づき推奨される寿命は８サイクルであるが、延長できる可能性もある。最も注目すべき変化は、サイクル数に伴う凝集体の量の増加である。このことが重要であるかどうかを判断するためには、より多くのサイクル数が必要となるであろう。
【表7】
【0148】
上のデータに基づき、ＧＣＳＦを精製するための改良されたＤＥＡＥクロマトグラフィープロセスを決定した。改良されたプロセスの詳細を次の表８及び９に記載する。改良されたプロセスにおいて、ＡＥＸ操作は、概して、表８に記載するクロマトグラフィーパラメータを使用して実施することができる。緩衝液／溶液及び運転条件を表９にも記載する。
【0149】
改良されたプロセスの最も注目すべき特徴は、負荷液及びカラムを、ジャケットの設定値を１０℃として配置することを含む。結合容量を８ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌに設定し、寿命を８サイクルとした。特定の理論に束縛されるものではないが、冷却操作によってカラムを再生する能力が改善されるので、カラムの寿命が延長される可能性がある。
【表8】
【表9】
【0150】
実施例２
温度制御下におけるＡＥＸクロマトグラフィー手順を用いたＧＣＳＦの精製
本実施例には、本明細書に開示する方法の幾つかの実施形態に従う、温度制御下におけるＡＥＸクロマトグラフィー手順を用いた組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）の精製を記載する。これらの実験においては、ジャケット付きＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー（ＦＦ）を使用し、結合／溶出モードにて低温条件下でＤＥＡＥクロマトグラフィーを実施した。水冷ジャケット付きカラムにＤＥＡＥセファロース（登録商標）ＦＦ樹脂を充填し、ｐＨ７．６の４０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡化した。カラムのジャケット温度及び負荷液用容器のジャケット温度を両方共１０±３℃に設定した。ＤＥＡＥカラムは、５０ｃｍ／ｈｒで実施したストリップ及びサニテーションステップ（ｓｔｒｉｐ ａｎｄ ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｅｐｓ）を除き、全てのステップを１５０ｃｍ／ｈｒの直線流速で操作した。
温度制御下におけるＡＥＸクロマトグラフィー手順を用いたＧＣＳＦの精製
本実施例には、本明細書に開示する方法の幾つかの実施形態に従う、温度制御下におけるＡＥＸクロマトグラフィー手順を用いた組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）の精製を記載する。これらの実験においては、ジャケット付きＤＥＡＥセファロース（登録商標）ファストフロー（ＦＦ）を使用し、結合／溶出モードにて低温条件下でＤＥＡＥクロマトグラフィーを実施した。水冷ジャケット付きカラムにＤＥＡＥセファロース（登録商標）ＦＦ樹脂を充填し、ｐＨ７．６の４０ｍＭ Ｔｒｉｓで平衡化した。カラムのジャケット温度及び負荷液用容器のジャケット温度を両方共１０±３℃に設定した。ＤＥＡＥカラムは、５０ｃｍ／ｈｒで実施したストリップ及びサニテーションステップ（ｓｔｒｉｐ ａｎｄ ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｅｐｓ）を除き、全てのステップを１５０ｃｍ／ｈｒの直線流速で操作した。
【0151】
カラムをまず６カラム体積（ＣＶ）の平衡化緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）で平衡化した後、緩衝液をｐＨ７．６の４０ｍＭ Ｔｒｉｓに交換してリフォールディングしたＧＣＳＦ試料を、ジャケット付きカラムに、最大タンパク質負荷濃度が樹脂１リットル当たりＧＣＳＦ１５ｇ（１５ｇ／Ｌ）となるように負荷した。
【0152】
ＧＣＳＦのＤＥＡＥセファロース樹脂への結合が完了したら、結合したＧＣＳＦをまず平衡化緩衝液１０ＣＶで洗浄し、次いでＤＥＡＥ樹脂を溶出緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．７）１０ＣＶで溶出した。２８０ｎｍのＯＤが０．５になった時点で、ＤＥＡＥ樹脂から溶出したＧＣＳＦプール液の回収を開始し、ＯＤが０．５に低下した時点で停止した。次いでカラムを２Ｍの塩化ナトリウム５ＣＶを用いてストリッピングし、０．５Ｎの水酸化ナトリウム５ＣＶを用いて消毒し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム４ＣＶを用いて保管した。
【0153】
実施例３
ＡＥＸクロマトグラフィーパラメータの最適化
本実施例においては、温度制御下のＤＥＡＥクロマトグラフィープロセスにより組換えｈＧＣＳＦを調製するための様々なパラメータを評価及び最適化するために実施した幾つかの頑健性試験の結果を記載する。このパラメータには、（１）負荷濃度、（２）負荷液のｐＨ、（３）負荷液の電気伝導率、（４）平衡化緩衝液のｐＨ、（５）平衡化緩衝液の電気伝導率、（６）溶出緩衝液のｐＨ、（７）溶出緩衝液の電気伝導率、（８）負荷液ジャケットの温度設定値及び（９）カラムジャケットの温度設定値が含まれる。これらの実験において、ＤＥＡＥは、酸化性化学種、ＤＮＡ及び大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来タンパク質（ＥＣＰ）を低減する潜在能力を有するキャプチャークロマトグラフィーカラムとして機能する。以下に示すこの実験の結果は、特定のパラメータが製品品質又は収率に影響を与えることを示している。これらの試験により、リスクアセスメントから、パラメータの分類を、重要工程パラメータ（ＣＰＰ）、主要工程パラメータ（ＫＰＰ）又は非主要工程パラメータ（ＮＫＰ）として確認するか又はパラメータの分類を変更した。
ＡＥＸクロマトグラフィーパラメータの最適化
本実施例においては、温度制御下のＤＥＡＥクロマトグラフィープロセスにより組換えｈＧＣＳＦを調製するための様々なパラメータを評価及び最適化するために実施した幾つかの頑健性試験の結果を記載する。このパラメータには、（１）負荷濃度、（２）負荷液のｐＨ、（３）負荷液の電気伝導率、（４）平衡化緩衝液のｐＨ、（５）平衡化緩衝液の電気伝導率、（６）溶出緩衝液のｐＨ、（７）溶出緩衝液の電気伝導率、（８）負荷液ジャケットの温度設定値及び（９）カラムジャケットの温度設定値が含まれる。これらの実験において、ＤＥＡＥは、酸化性化学種、ＤＮＡ及び大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来タンパク質（ＥＣＰ）を低減する潜在能力を有するキャプチャークロマトグラフィーカラムとして機能する。以下に示すこの実験の結果は、特定のパラメータが製品品質又は収率に影響を与えることを示している。これらの試験により、リスクアセスメントから、パラメータの分類を、重要工程パラメータ（ＣＰＰ）、主要工程パラメータ（ＫＰＰ）又は非主要工程パラメータ（ＮＫＰ）として確認するか又はパラメータの分類を変更した。
【0154】
実施例に記載する頑健性試験は全て、適格性のあるＤＥＡＥクロマトグラフィー用の１．０ｃｍ×１０ｃｍのスケールダウンモデルで実施した。
【0155】
試験デザイン
この試験に用いる実験の組を決めるために、Ｄ最適計画の拡張（Ｄ－ｏｐｔｉｍａｌ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ）を行った。Ｄ最適計画は、非線形モデルに適用可能であり、且つ 従来の要因計画と比較して、要因組合せを評価する能力が向上している。Ｄ最適計画は、ＪＭＰ（商標）ソフトウェアを用いた反復探索アルゴリズムにより、パラメータ推定の共分散を最小化しようとするものである。この計画を、２因子間交互作用を最小限に抑え、プロセスに大きく影響する可能性のある因子との交互作用のみになるように更に最適化した。
この試験に用いる実験の組を決めるために、Ｄ最適計画の拡張（Ｄ－ｏｐｔｉｍａｌ ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ）を行った。Ｄ最適計画は、非線形モデルに適用可能であり、且つ 従来の要因計画と比較して、要因組合せを評価する能力が向上している。Ｄ最適計画は、ＪＭＰ（商標）ソフトウェアを用いた反復探索アルゴリズムにより、パラメータ推定の共分散を最小化しようとするものである。この計画を、２因子間交互作用を最小限に抑え、プロセスに大きく影響する可能性のある因子との交互作用のみになるように更に最適化した。
【0156】
この９個のパラメータを評価するための実験計画法により、様々なパラメータの組合せで４８回の実験を行った。評価したパラメータの範囲を表１０にまとめる。
【表10】
【0157】
データ解析
ピボタル段階の試験（ｐｉｖｏｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃａｍｐａｉｇｎ）から得られたインプロセスデータを使用して、製品関連夾雑物に関するＤＥＡＥの頑健性データの妥当性を評価した。逆相（ＲＰ）による純度、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び陽イオン交換（ＣＥＸ）等の製品品質に関する分析のそれぞれに対し、主要成分ピークの平均値±３標準偏差を限界値と定めた（例えば、表１１参照）。ＳＥＣデータはデータセットの変動が小さかったため、主要成分ピークの下限値を９９．０％とした。これはＤＥＡＥスケールダウンモデルの適格性評価に使用したものと同じ限界値である。
ピボタル段階の試験（ｐｉｖｏｔａｌ ｐｈａｓｅ ｃａｍｐａｉｇｎ）から得られたインプロセスデータを使用して、製品関連夾雑物に関するＤＥＡＥの頑健性データの妥当性を評価した。逆相（ＲＰ）による純度、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び陽イオン交換（ＣＥＸ）等の製品品質に関する分析のそれぞれに対し、主要成分ピークの平均値±３標準偏差を限界値と定めた（例えば、表１１参照）。ＳＥＣデータはデータセットの変動が小さかったため、主要成分ピークの下限値を９９．０％とした。これはＤＥＡＥスケールダウンモデルの適格性評価に使用したものと同じ限界値である。
【表11】
【0158】
ＪＭＰ（商標)ソフトウェアを使用して、この試験に関し得られたデータをモデル化した。標準的な最小二乗法を用いて、選択したプロセスのアウトプット（ＲＰによる純度、ＳＥＣ、ＣＥＸ、ＥＣＰ、ＤＮＡ及び収率）にプロセスの各インプット（表１０参照）が与える影響を評価した。この解析から影響の要約表を作成し、アウトプットに与える統計的影響が大きいものから順にパラメータをランク付けした。ｐ値が＜０．０１であることは、プロセスのインプットがアウトプットに与える影響が統計的に有意であることを示す。
【0159】
統計的に有意なパラメータを、ソフトウェアの予測プロファイラ（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）により評価した。この解析から、他のパラメータを固定したままあるパラメータを変化させた場合に予測される応答を視覚化できるプロファイル曲線（ｐｒｏｆｉｌｅ ｔｒａｃｅ）を作成した。グラフ表示することにより、望ましさをグラフ化（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）することができた。この解析により、アウトプットの範囲設定が可能となった。ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ、ＳＥＣ及びＣＥＸの最小値（０）及び最大値（１）の範囲の設定値は、表１０に示す平均値±３ＳＤと定義した。望ましさのグラフ（ｄｅｓｉｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｃｅ）は、所望のアウトプットがその範囲の平均値である場合は、各パラメータの予測応答のグラフと等価である。
【0160】
統計的に有意なパラメータを、ソフトウェアの等高線図プロファイラ（Ｃｏｎｔｏｕｒ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ）でも評価した。この解析により、一度に２因子の応答曲面を作成した。それにより、２つの因子が複合的影響を示す場合の、定義されたアウトプット範囲内での予測応答を視覚化することができる。
【0161】
解析方法
以下に示す測定法を用いて、ＤＥＡＥクロマトグラフィー精製により得られるＧＣＳＦ試料の幾つかの品質特性を評価した：（１）製品関連夾雑物をＣ３逆相ＨＰＬＣを用いて分析した；（２）ＧＣＳＦ試料の純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定した；（３）ＧＣＳＦ試料の電荷不均一性をＣＥＸ ＨＰＬＣを用いて測定した；（４）ＧＣＳＦ試料中の大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来タンパク質（ＥＣＰ）を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した；（５）残存大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来ＤＮＡの濃度をＱ－ＰＣＲを用いて測定した。
以下に示す測定法を用いて、ＤＥＡＥクロマトグラフィー精製により得られるＧＣＳＦ試料の幾つかの品質特性を評価した：（１）製品関連夾雑物をＣ３逆相ＨＰＬＣを用いて分析した；（２）ＧＣＳＦ試料の純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて測定した；（３）ＧＣＳＦ試料の電荷不均一性をＣＥＸ ＨＰＬＣを用いて測定した；（４）ＧＣＳＦ試料中の大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来タンパク質（ＥＣＰ）を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した；（５）残存大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））宿主細胞由来ＤＮＡの濃度をＱ－ＰＣＲを用いて測定した。
【0162】
結果
ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（ＳＡＳ）を使用して、ＤＥＡＥ頑健性実験により得られたデータの統計解析を行った。これらの実験において解析したアウトプットは、ＲＰによる主要成分の純度（ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎ）、ＳＥＣによる主要成分の比率（ＳＥＣ％ｍａｉｎ）、ＣＥＸによる主要成分の比率（ＣＥＸ％ｍａｉｎ）、ＥＣＰ及びＤＮＡを含む。以下に示す９個のパラメータが有意に影響する（ｐ値＜０．０１）ことが分かった（影響が大きいものから順に）：（１）平衡化緩衝液のｐＨ、（２）カラム温度の設定値、（３）平衡化緩衝液の電気伝導率、（４）溶出緩衝液の電気伝導率、（５）負荷液の電気伝導率、（６）溶出緩衝液のｐＨ、（７）負荷濃度及び負荷液ｐＨの複合的相互作用、（８）負荷濃度と平衡化緩衝液のｐＨとの複合的相互作用、並びに（９）平衡化緩衝液の電気伝導率と溶出緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用。
ＪＭＰ（登録商標）ソフトウェア（ＳＡＳ）を使用して、ＤＥＡＥ頑健性実験により得られたデータの統計解析を行った。これらの実験において解析したアウトプットは、ＲＰによる主要成分の純度（ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎ）、ＳＥＣによる主要成分の比率（ＳＥＣ％ｍａｉｎ）、ＣＥＸによる主要成分の比率（ＣＥＸ％ｍａｉｎ）、ＥＣＰ及びＤＮＡを含む。以下に示す９個のパラメータが有意に影響する（ｐ値＜０．０１）ことが分かった（影響が大きいものから順に）：（１）平衡化緩衝液のｐＨ、（２）カラム温度の設定値、（３）平衡化緩衝液の電気伝導率、（４）溶出緩衝液の電気伝導率、（５）負荷液の電気伝導率、（６）溶出緩衝液のｐＨ、（７）負荷濃度及び負荷液ｐＨの複合的相互作用、（８）負荷濃度と平衡化緩衝液のｐＨとの複合的相互作用、並びに（９）平衡化緩衝液の電気伝導率と溶出緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用。
【0163】
これらの特定された因子がＲＰ純度の範囲の限界値である９０．６０～９２．９１％に与える影響を決定するために更に解析を行った（データは示さず）。この解析から、これらの９個のパラメータはＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎに影響を与えるものの、その影響によってＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎがその下限値である９０．６０％を下回ることはないと示された。
【0164】
この特定された因子を等高線プロファイラでも解析し、上限値／下限値（ｈｉｇｈ／ｌｏｗ ｌｉｍｉｔ）に基づき応答の限界値（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｎｄ）を求めた（データは示さず）。これらの解析における等高線のプロットから、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ ％ ｍａｉｎは、試験を行ったパラメータの範囲（例えば、表１０参照）では、指定された範囲内に収まることが確認された。
【0165】
パラメータがＳＥＣ％Ｍａｉｎに与える影響
ＳＥＣの製品品質に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための実験も実施した。次に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液の電気伝導率、溶出緩衝液のｐＨ、負荷濃度及び平衡化緩衝液の電気伝導率と溶出緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用（データは示さず）。
ＳＥＣの製品品質に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための実験も実施した。次に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液の電気伝導率、溶出緩衝液のｐＨ、負荷濃度及び平衡化緩衝液の電気伝導率と溶出緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用（データは示さず）。
【0166】
これらの特定されたパラメータを更に予測プロファイラで解析することにより、これらがＳＥＣの範囲である９９．０％に与える影響を決定した（データは示さず）。この解析から、これらの４個のパラメータは、ＳＥＣ％ｍａｉｎに影響を与えるものの、その影響によってＳＥＣ％ｍａｉｎが９９．０％を下回ることはないことが確認された。
【0167】
この特定されたパラメータを等高線プロファイラでも解析し、上限値／下限値に基づき応答の限界値を決定した（データは示さず）。これらの解析における等高線のプロットから、ＳＥＣ％ｍａｉｎは、試験を行ったパラメータの範囲（例えば、表１０参照）では、指定された範囲内に入ることが確認された。
【0168】
パラメータがＣＥＸ％Ｍａｉｎに与える影響
ＣＥＸの製品品質に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための追加の実験を実施した。以下に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液の電気伝導率、負荷濃度、カラム温度設定値並びにカラム温度設定値と平衡化緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用。
ＣＥＸの製品品質に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための追加の実験を実施した。以下に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液の電気伝導率、負荷濃度、カラム温度設定値並びにカラム温度設定値と平衡化緩衝液の電気伝導率との複合的相互作用。
【0169】
これらの特定されたパラメータを更に予測プロファイラで解析することにより、これらが９５．９５％までと定められたＣＥＸの範囲に与える影響を決定した（データは示さず）。この解析から、これらの４個のパラメータは、ＣＥＸ％ｍａｉｎに影響を与えるものの、その影響によってＣＥＸ％ｍａｉｎが９２．１８～９５．９５％の範囲を外れることはないと示された。
【0170】
この特定されたパラメータを等高線プロファイラでも解析し、上限値／下限値に基づき応答の限界値を決定した（データは示さず）。これらの等高線のプロットから、ＣＥＸ ％ ｍａｉｎは、試験を行ったパラメータの範囲（表１０）では、指定された範囲内に収まることが確認された。
【0171】
パラメータがＥＣＰに与える影響
ＥＣＰ夾雑物に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための更なる実験を実施した。以下に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液のｐＨ、溶出緩衝液の電気伝導率、負荷液の温度設定値と溶出緩衝液のｐＨとの複合的相互作用並びに負荷液の温度設定値。
ＥＣＰ夾雑物に統計的に有意に影響する（ｐ値＜０．０１）プロセスのインプットを特定するための更なる実験を実施した。以下に示す４個のパラメータが有意に影響することが分かった（影響が大きいものから順に）：溶出緩衝液のｐＨ、溶出緩衝液の電気伝導率、負荷液の温度設定値と溶出緩衝液のｐＨとの複合的相互作用並びに負荷液の温度設定値。
【0172】
これらの特定されたパラメータを更に予測プロファイラで解析することにより、これらがＥＣＰに与える影響を決定した（データは示さず）。この解析では２００～６００ｐｐｍの範囲を使用した。この解析から、溶出緩衝液のｐＨ及び溶出緩衝液の電気伝導率がＥＣＰ含有量に僅かに影響することが示された。ＥＣＰの除去能についても評価した。
【0173】
この特定されたパラメータを等高線プロファイラでも解析し、上限値／下限値に基づき応答の限界値を求めた（データは示さず）。等高線による視覚化を行うために下限値を０ｐｐｍに設定し、上限値を４２３ｐｐｍに設定した。等高線から、ＤＥＡＥプロセスは、試験を行ったパラメータの範囲（表１０）では、プール液中のＥＣＰの変動を最小限に抑えられるであろうことを示している。
【0174】
これらを総合して、選択されたパラメータが製品の品質特性に与える影響を理解するために、ＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムに関連するプロセスの特性評価を行った。この頑健性試験で評価する９個のパラメータを特定した。得られたデータをモデル化することにより、製品の品質特性であるＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎ、ＳＥＣ％ｍａｉｎ、ＣＥＸ％ｍａｉｎ、ＥＣＰ及びＤＮＡに影響を与えるパラメータを特定した。特定した影響を与えるパラメータの要約表を表１２に示す。ピボタル段階の製造試験をもとに定めたＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ、ＳＥＣ及びＣＥＸ％ｍａｉｎに関する製品品質の限界値（平均値±３ＳＤ）に対し、全てのパラメータが製品品質に与える影響をモデル化した。このモデル化から、本試験で各パラメータに関する評価を行った全ての範囲で、製品品質は許容可能な範囲内に収まることになると予測された。ＥＣＰ評価では、影響を与えるパラメータによって、評価した範囲から最小限の変動があることが示された。評価したパラメータは、ＤＥＡＥプール液中のＤＮＡ含有量に影響しないことも確認された。評価したパラメータはまた、クロマトグラフィー操作の収率にも影響を与えなかった。
【表12】
【0175】
ＧＣＳＦ下流のリスクアセスメントから決定したパラメータの分類を、本頑健性試験により変更した分類を含め、表１３にまとめる。リスクアセスメントによりＮＫＰと決定された４個のパラメータは、本頑健性試験でもＮＫＰのままである。これらのＮＫＰは、平衡化緩衝液のｐＨ、平衡化緩衝液の電気伝導率、溶出緩衝液のｐＨ及び溶出緩衝液の電気伝導率である。これらのパラメータは元々リスクアセスメントでもＮＫＰと評価されていたが、操作範囲に関する知見を高めるために評価を行う目的で選択したものである。これらのパラメータはいずれも、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎ、ＳＥＣ％ｍａｉｎ及びＣＥＸ％ｍａｉｎに関する様々な製品品質に影響を与えることが分かっている。これらのｐＨ及び電気伝導率の値は、緩衝液の調製によって充分に制御されるため、これらはＮＫＰに分類されている。緩衝液特性の測定値が操作範囲を外れるものについては、出荷規格（ｒｅｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を満たさないことになり、したがって製造には使用されないであろう。
【表13】
【0176】
カラム及び負荷液のジャケット温度設定値は、両方共、リスクアセスメントにおいてＫＰＰに分類された。カラムジャケット温度は、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎ及びＣＥＸ％ｍａｉｎの両方に影響を与えた。負荷液のジャケット温度はＥＣＰに影響を与えることが示された。温度設定値は冷却器のインターフェースで適切に制御することができた。こうした理由から、本試験による設定値の分類を両方共ＫＰＰのままとした。両方のパラメータの操作範囲は冷却器によって固定される温度設定値である。試験を行った範囲では、製品品質が許容される範囲を外れなかったので、許容範囲を、この頑健性試験で評価を行った範囲と定めた。
【0177】
タンパク質負荷液のｐＨは、この頑健性試験ではＮＫＰのままであった。このパラメータは、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎに対してのみ、負荷濃度との複合的相互作用を示し、純度は範囲内のままとなるため、ＮＫＰのままである。ＤＥＡＥ負荷液のｐＨは、ＵＦ／ＤＦ Ｉ操作で使用するダイアフィルトレーション緩衝液のｐＨにより制御した。この緩衝液と、１０ダイアフィルトレーション体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）を交換する。
【0178】
この頑健性試験から、タンパク質負荷液の電気伝導率パラメータの分類を変更した。このパラメータはリスクアセスメントではＮＫＰと評価されていた。タンパク質負荷液の電気伝導率をＫＰＰに分類し直した。この電気伝導率は、ダイアフィルトレーション緩衝液を介してある程度制御されるが、ＤＥＡＥ負荷前に行う深層濾過操作もあり、使用前に注射用水（ＷＦＩ）を流し（ｆｌｕｓｈ）、及び使用後に製品を回収するためにＷＦＩを流すことにより、フィルタの滞留物（ｈｏｌｄｕｐ）を介して負荷液の電気伝導率が低下する。タンパク質負荷液の電気伝導率はＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎに影響を与える。操作範囲及び許容範囲を＜３ｍＳ／ｃｍと定める。本試験では１．５～２．５の範囲について評価した。本実施例に記載する実験データから、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎは、本試験で評価した電気伝導率範囲では、製品品質の範囲内に充分に収まることが確認された。こうした理由から、電気伝導率の操作及び許容範囲を丸めて＜３ｍＳ／ｃｍとした。
【0179】
タンパク質負荷濃度は、ＲＰ Ｐｕｒｉｔｙ％ｍａｉｎに対し、負荷液のｐＨ及び平衡化緩衝液のｐＨと複合的に影響する。このパラメータはまた、ＳＥＣ％ｍａｉｎ及びＣＥＸ％ｍａｉｎにも独立に影響を与える。このパラメータは、元々はリスクアセスメントによりＮＫＰと定められていたが、その製品品質に与える影響に基づき、ＫＰＰに分類し直した。このパラメータの許容範囲は、本試験において評価した負荷濃度の範囲と定めた。操作範囲は、この許容範囲に対し安全率を与えたものである。
【0180】
本開示の特定の代替を開示してきたが、様々な修正及び組合せが可能であり、且つ添付の特許請求の範囲の真の主旨及び範囲内に含まれることが意図されていると理解すべきである。したがって、本明細書に示す正確な要約及び開示を限定する意図はない。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】