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2022-543610遺伝子改変エンテロウイルスベクター

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-13

(54)【発明の名称】遺伝子改変エンテロウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

C12N 15/86 20060101AFI20221005BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20221005BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20221005BHJP

A61P 1/18 20060101ALI20221005BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20221005BHJP

A61P 15/14 20060101ALI20221005BHJP

A61K 35/76 20150101ALI20221005BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20221005BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20221005BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z ZNA

A61P35/00

A61P11/00

A61P1/18

A61P1/16

A61P15/14

A61K35/76

A61P35/02

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022507315

(86)(22)【出願日】2020-08-05

(85)【翻訳文提出日】2022-02-24

(86)【国際出願番号】 US2020045069

(87)【国際公開番号】W WO2021026275

(87)【国際公開日】2021-02-11

(31)【優先権主張番号】62/883,055

(32)【優先日】2019-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522046782

【氏名又は名称】ヴァイロジンバイオテックカナダリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部博信

(74)【代理人】

【識別番号】100111501

【弁理士】

【氏名又は名称】滝澤敏雄

(72)【発明者】

【氏名】ルオホングリン

(72)【発明者】

【氏名】ジアウィリアムウェイ－グオ

(72)【発明者】

【氏名】リウフイタオ

(72)【発明者】

【氏名】サムディオイスマエル

【テーマコード（参考）】

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087MA16

4C087MA28

4C087MA56

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

改変エンテロウイルスゲノム（例えば、ポリオウイルスゲノム、コクサッキーウイルスゲノムまたはエコーウイルスゲノム）を有する複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターを提供し、改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスゲノムの非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に連結された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを有する。がん（例えば、肺癌を含む）を治療するための組成物及び方法も提供する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変エンテロウイルスゲノムを含む複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターであって、前記改変エンテロウイルスゲノムが、エンテロウイルスゲノムの非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に連結された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを含む、前記複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項2】

エンテロウイルスがコクサッキーウイルスである、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項3】

コクサッキーウイルスが、コクサッキーウイルスＡまたはＢである、請求項２に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項4】

非翻訳領域（ＵＴＲ）が、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲである、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項5】

１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の前記１つ以上のコピーが、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを含む、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項6】

１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の間に、２～５０塩基対のサイズのスペーサーが挿入されている、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項7】

１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の前記１つ以上のコピーが、心臓特異的ｍｉＲＮＡまたは膵臓特異的ｍｉＲＮＡを認識する、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項8】

１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ１、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１２９、ｍｉＲ－１２９^*、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１３５ｂ、ｍｉＲ－１３６、ｍｉＲ－１３６^*、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１５４、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１８８、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ２１７、ｍｉＲ－２９９、ｍｉＲ－３００－３ｐ、ｍｉＲ－３００－５ｐ、ｍｉＲ－３２３、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３３７、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３４１、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－３７６ａ、ｍｉＲ－３７６ａ^*、ｍｉＲ－３７６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３７６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３７６ｃ、ｍｉＲ－３７７、ｍｉＲ－３７９、ｍｉＲ－３７９^*、ｍｉＲ－３８２、ｍｉＲ－３８２^*、ｍｉＲ－４０９－５ｐ、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４１１、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－４３３、ｍｉＲ－４３４、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－４６６ｂ、ｍｉＲ－４８５、ｍｉＲ－４９５、ｍｉＲ－４９９、ｍｉＲ－５３９、ｍｉＲ－５４１、ｍｉＲ－５４３^*、ｍｉＲ－５５１ｂ、ｍｉＲ－７５８、及びｍｉＲ－８７３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを認識する、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項9】

２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ１、ｍｉＲ１３３、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ１４５及びｍｉＲ１４３の標的配列を含む、請求項８に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項10】

ｍｉＲ１、ｍｉＲ１３３、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ１４５及びｍｉＲ１４３の標的配列の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのコピーを含む、請求項９に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項11】

１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが順方向にあり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが逆方向にある、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項12】

改変エンテロウイルスゲノムが、免疫刺激因子、抗体、及びチェックポイント遮断ペプチドからなる群から選択される非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含み、前記少なくとも１つの核酸が、適切な腫瘍特異的調節領域に作動可能に連結される、請求項１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項13】

非ウイルスタンパク質が、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体αサブユニット、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７３、及びチェックポイント阻害因子からなる群から選択される、請求項１２に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれかに記載の有効量の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターを腫瘍細胞に提供することを含む、腫瘍細胞の溶解方法。

【請求項15】

腫瘍細胞が、肺癌細胞を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

腫瘍細胞が、膵臓癌細胞、肝臓癌細胞、または乳癌細胞を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれかに記載の少なくとも１つの複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、治療用組成物。

【請求項18】

治療有効量の請求項１７に記載の組成物を含む組成物を投与するステップを含む、がんに罹患している対象におけるその治療方法。

【請求項19】

がんが、肺癌、膵臓癌、肝臓癌及び乳癌からなる群から選択される、実施形態１８に記載の方法。

【請求項20】

がんが、ＫＲＡＳ変異に関連する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、一般的にＴＰ５３及びＲｂ変異に関連する小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、または膵臓癌である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

投与が、静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与、または腫瘍内（ＩＴ）投与である、請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年８月５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８３，０５５号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、本出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、一般的に、遺伝子改変された腫瘍溶解性エンテロウイルスベクター、及び正常組織における毒性が低減されたその使用に関する。

【0002】

配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式コピーは、本明細書と同時にＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして提出され、作成日は２０１９年８月４日、サイズは２．２０ＫＢである。配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

がんには、細胞の制御されない、または異常な増殖を含む多種多様な疾患が含まれ、がんは、体の他の組織に拡散するかまたは侵入し、最初は身体機能の（がんの種類に応じた）変化を生じさせ、最終的には死に至らしめる。毎年約１４１０万例のがんの新規症例が生じている（メラノーマ以外の皮膚癌を除く）。
西欧諸国の多くでは、肺癌は男性と女性でそれぞれ３番目と２番目に多いがんであり、男女のがん関連死の主要な原因である。非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）は、肺癌症例の約８５％を占めている。それらの中で、腺癌は最も一般的なタイプの肺癌であり、すべての肺癌のほぼ半分を占めている。遺伝的変異は、ＮＳＣＬＣの発症に重要な役割を果たしている。よく知られている発がん性ドライバー変異には、上皮成長因子受容体（「ＥＧＦＲ」）とキルステンラット肉腫ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ（「ＫＲＡＳ」）があり、それぞれ肺腺癌の約１５％及び約３０％で発生する。ＥＧＦＲ変異は臨床的に標的になり得るが、ＫＲＡＳ変異は現在、治療が非常に困難であり、予後不良と関連している。小細胞肺癌（「ＳＣＬＣ」）は、すべての肺癌の約１５％を占める。ＳＣＬＣ症例の６０％～９０％は、腫瘍タンパク質ｐ５３及び／または網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）をコードする遺伝子の変異を特徴としている。ＳＣＬＣの標的療法も存在しない。

【0004】

がんを治療するために、例えば、放射線療法、化学療法、がんの外科的除去、またはこれらの療法のいくつかの組み合わせを含む、多くの療法が開発されてきた。進歩を示した治療の新規分野の１つは、「標的療法」であり、組成物及び方法を使用して、腫瘍細胞を特異的に標的にして（「正常な」細胞とは対照的に）殺傷する。
標的療法の一例は腫瘍溶解性ウイルスである。簡潔に述べると、腫瘍溶解性ウイルスは、自己複製プロセスを介して、好ましくは正常組織に実質的な損傷を引き起こすことなく、腫瘍細胞の溶解を誘導することができるウイルスとして定義される。他のがん治療に対する腫瘍溶解性ウイルスの最大の利点は、候補ウイルスを遺伝子操作して、特定のがんの種類に対する効力を高めることができることである。２０１５年、ＦＤＡは、メラノーマの治療のための最初の遺伝子組み換え単純ヘルペスウイルス１型（タリモジーン・ラハーパレプベック、すなわち「Ｔ－ＶＥＣ」）を承認した。過去数十年にわたって、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスを含むいくつかの異なる腫瘍溶解性ウイルスがすべて、がんの治療のための臨床試験で試験されてきた。しかしながら、全体的な抗がん効果と特異性は依然として低く、ＦＤＡに承認された肺癌のウイルス療法はまだ存在しない。

【0005】

したがって、形質転換細胞を溶解及び破壊し、その一方で健康な非形質転換細胞には実質的な損傷を引き起こさず、先行技術に関連する１つ以上の欠点を克服する、がん、例えば肺癌の改善された標的治療に対する必要性が残されている。
背景技術の節で議論した主題のすべては、必ずしも先行技術であるとは限らず、単に背景技術の節での議論の結果として先行技術であると想定されるべきではない。これらの方針に沿って、背景技術の節で説明されている、またはそのような主題に関連する先行技術の問題の認識は、先行技術であると明示的に述べられていない限り、先行技術として扱われるべきではない。代わりに、背景技術の節の主題の議論は、特定の問題に対する発明者のアプローチの一部として扱われるべきであり、それ自体も発明的であり得る。

【発明の概要】

【0006】

簡潔に述べると、本発明は、その腫瘍特異性をさらに増強するために、エンテロウイルスゲノム（例えば、Ｂ３などのコクサッキーウイルス）を改変するためのマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）ベースのアプローチに関する。
一態様では、本発明は、改変エンテロウイルスゲノム（例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルスまたはエコーウイルスゲノム）を有する複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター（すなわち、組換えベクター）を提供し、前記改変エンテロウイルスゲノム（例えば、ポリオウイルスゲノム、コクサッキーウイルスゲノムまたはエコーウイルスゲノム）には、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが含まれる。好ましい実施形態内で、ｍｉＲＮＡ標的配列は、エンテロウイルスゲノム（例えば、ポリオウイルスゲノム、コクサッキーウイルスゲノムまたはエコーウイルスゲノム）の非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルスは、コクサッキーウイルスＡまたはコクサッキーウイルスＢである。特定の実施形態では、エンテロウイルスはコクサッキーウイルスＢ３である。他の実施形態では、非翻訳領域（ＵＴＲ）は、５’ＵＴＲ、及び／または３’ＵＴＲである。

【0007】

いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーは、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを含む。他の実施形態では、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１２９、ｍｉＲ－１２９^*、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１３５ｂ、ｍｉＲ－１３６、ｍｉＲ－１３６^*、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１５４、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１８８、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ－２１６、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２９９、ｍｉＲ－３００－３ｐ、ｍｉＲ－３００－５ｐ、ｍｉＲ－３２３、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３３７、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３４１、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－３７６ａ、ｍｉＲ－３７６ａ^*、ｍｉＲ－３７６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３７６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３７６ｃ、ｍｉＲ－３７７、ｍｉＲ－３７９、ｍｉＲ－３７９^*、ｍｉＲ－３８２、ｍｉＲ－３８２^*、ｍｉＲ－４０９－５ｐ、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４１１、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－４３３、ｍｉＲ－４３４、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－４６６ｂ、ｍｉＲ－４８５、ｍｉＲ－４９５、ｍｉＲ－４９９、ｍｉＲ－５３９、ｍｉＲ－５４１、ｍｉＲ－５４３^*、ｍｉＲ－５５１ｂ、ｍｉＲ－７５８、及びｍｉＲ－８７３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを認識する。慣例により、最終産物であることがより頻繁に認められる鎖はｍｉＲＮＡと呼ばれ、よりまれなパートナーはｍｉＲＮＡ^*と呼ばれる。他の実施形態では、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３の標的配列を含む。さらに他の実施形態では、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲ－１４５の標的配列の４つのコピー及びｍｉＲ－１４３の標的配列の２つのコピーを含む。他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーは順方向であり、及び／または１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーは逆方向である。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、免疫刺激因子、抗体、及びチェックポイント遮断ペプチドからなる群から選択される非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含み、前記少なくとも１つの核酸は、適切な腫瘍特異的調節領域に作動可能に連結される。他の実施形態では、非ウイルスタンパク質は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体αサブユニット、ＯＸ４０Ｌ、及びＰＤ－Ｌ１遮断薬からなる群から選択される。

【0008】

別の態様では、本発明は、腫瘍細胞に上記の実施形態のいずれかの有効量の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターを提供することを含む、腫瘍細胞の溶解方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、肺癌細胞を含む。他の実施形態では、腫瘍細胞は、膵臓細胞を含む。
他の態様では、本発明は、上記の実施形態のいずれかの少なくとも１つの複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む治療用組成物を提供する。
他の態様では、本発明は、治療有効量の上記実施形態のいずれかの組成物を含む第１の組成物を投与するステップを含む、がんに罹患している対象のがんの治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）である。他の実施形態では、投与は、静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与、または腫瘍内（ＩＴ）投与である。

【0009】

本概要は、特定の概念を簡略化された形式で紹介するために提供され、これらは、以下の発明を実施するための形態においてさらに詳細に記載される。特に明記されている場合を除き、本概要は、特許請求する主題の主要な特徴または重要な特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求する主題の範囲を制限することを意図するものでもない。

【0010】

１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明において記載される。例示的な一実施形態に関連して図示または記載される特徴は他の実施形態の特徴と組み合わせてもよい。したがって、本明細書に記載の様々な実施形態のいずれかを組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。実施形態の態様は、必要に応じて、本明細書で特定される様々な特許、出願及び刊行物の概念を使用して、さらにさらなる実施形態を提供するように修正することができる。他の特徴、目的、及び利点は、明細書、図面、及び特許請求の範囲から明らかになる。

【0011】

本開示の例示的な特徴、その性質及び様々な利点は、添付の図面及び様々な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。非限定的かつ非網羅的な実施形態は、添付の図面を参照して説明され、同様のラベルまたは参照番号は、別段の指定がない限り、様々な図全体にわたって同様の部品を指す。図面中の要素の大きさ及び相対的な位置は、必ずしも正寸ではない。例えば、描画の判読性を向上させるために、様々な要素の形状を選択し、拡大し、配置する。描画される要素の特定の形状は、図面を認識しやすくするために選択されている。以下に、添付の図面の参照とともに、１つ以上の実施形態を記載する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ａ及びＢは、ｍｉＲＮＡの相対的発現レベルを示すヒストグラム図である。

【図2】改変腫瘍溶解性コクサッキーウイルスＢ３（「ＣＶＢ３」）ゲノムの構築の一実施形態を示す概略図である。

【図3A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株におけるウイルス力価及びＲＮＡコピーを示すグラフである。

【図3B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株におけるウイルス力価及びＲＮＡコピーを示すグラフである。

【図3C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株におけるウイルス力価及びＲＮＡコピーを示すグラフである。

【図4A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図4B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図4C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図4D】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図5A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図5B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図5C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図6A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図6B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図6C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図6D】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及びグラフである。

【図7A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図7B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図7C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図7D】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図7E】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図7F】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（ＳＣＩＤマウス）のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8C】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8D】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8E】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8F】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図8G】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系のデータを示す生存率プロット、組織学的写真、及びグラフである。

【図9A】３つの追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築、ならびにこれらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の体重変化、生存率、及び組織学的写真を示す概略図である。

【図9B】３つの追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築、ならびにこれらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の体重変化、生存率、及び組織学的写真を示す概略図である。

【図9C】３つの追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築、ならびにこれらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の体重変化、生存率、及び組織学的写真を示す概略図である。

【図9D-1】３つの追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築、ならびにこれらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の体重変化、生存率、及び組織学的写真を示す概略図である。

【図9D-2】３つの追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築、ならびにこれらの腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理したマウスモデル系（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の体重変化、生存率、及び組織学的写真を示す概略図である。

【図10A】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10B】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10C】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10D】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10E】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10F】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10G】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10H】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10I】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10J】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10K】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10L】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10M】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10N】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10O】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10P】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10Q】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10R】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10S】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10T】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10U】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10V】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10W】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10X】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10Y】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10Z】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10AA】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10BB】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10CC】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10DD】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10EE】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10FF】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10GG】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10HH】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10II】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10JJ】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10KK】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10LL】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10MM】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10NN】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10OO】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10PP】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10QQ】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10RR】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10SS】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10TT】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10UU】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10VV】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10WW】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10XX】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10YY】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10ZZ】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10AAA】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10BBB】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10CCC】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10DDD】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10EEE】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10FFF】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10GGG】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10HHH】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10III】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10JJJ】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10KKK】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10LLL】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10MMM】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10NNN】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10OOO】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10PPP】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10QQQ】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10RRR】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図10SSS】腫瘍内のマイクロＲＮＡの選択されたリストであり、これらはすべて全体が参照により援用される。

【図11A】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及び細胞生存率プロットである。

【図11B】腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株のデータを示す写真及び細胞生存率プロットである。

【図12A】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図12B】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図12C】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図12D】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図12E】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図12F】組織学的写真、データを示すグラフ、腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図、及びこれらの新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスで処理した免疫適格マウスモデル系の生存率プロットである。

【図13A】様々な腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスのウイルスＲＮＡコピー数を示す組織学的写真及びグラフである。

【図13B】様々な腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスを注射したＣ５７ＢＬ／６マウスのウイルスＲＮＡコピー数を示す組織学的写真及びグラフである。

【図14A】様々な腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株の細胞生存率を示すグラフである。

【図14B】様々な腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株の写真である。

【図15A】様々ながん細胞株の分類記載である。

【図15B】様々な腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株の写真である。

【図15C】新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスの概略図である。

【図15D】新規腫瘍溶解性ＣＶＢ３ウイルスに感染した細胞株の写真である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。
しかしながら、本発明をより詳細に説明する前に、本発明を理解するために、以下で使用する特定の用語の定義を最初に記載することが役立ち得る。

【0014】

本明細書中で使用する用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」とは、動物及び植物の両方を含む広範囲の生物で発現する短い（通常２１～２５ヌクレオチド）内在性の一本鎖ＲＮＡのファミリーを指す。ヒトにおいて発現されている１０００を上回る固有のｍｉＲＮＡが存在する。ｍｉＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に存在する特定の標的配列に結合する。ｍＲＮＡ分子の相補的または部分的に相補的な配列（標的配列）への結合は、ｍＲＮＡの切断による遺伝子発現の下方制御、そのポリＡテールの短縮による分解の増加、及び直接的な翻訳抑制をもたらす。腫瘍中のマイクロＲＮＡの選択されたリスト（関連する参考文献とともに）を、図９Ａ～９Ｚ、９ＡＡ～９ＺＺ、及び９ＡＡＡ～９ＳＳＳに示し、これらのリスト及び関連する参考文献は、その全体が参照により援用される。

【0015】

「マイクロＲＮＡ標的配列（複数可）」、「ｍｉＲＮＡ標的配列（複数可）」及び「ｍｉＲＮＡ結合配列（複数可）」とは、図１０に開示されているようなｍｉＲＮＡ配列に相補的であるか、または結合する（すなわち、それらは１００％相補的である必要はない）配列を指す。
用語「腫瘍溶解性エンテロウイルス」とは、腫瘍細胞において複製され、腫瘍細胞を死滅させることができるエンテロウイルスを指す。簡潔に述べると、エンテロウイルスは一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの属であり、糞口経路を介して伝染する哺乳類の疾患に最も一般的に関連している。エンテロウイルスの一般的な例として、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス及びエコーウイルスが挙げられる。
用語「腫瘍溶解性コクサッキーウイルス」または「ＣＳＶ」とは、一般的に、腫瘍細胞において複製され、死滅させることができるコクサッキーウイルスを指す。特定の実施形態では、腫瘍細胞をより選択的に標的化するために、及び／またはヒト宿主におけるＣＳＶの免疫媒介中和を低減するために、ウイルスを組換え的に（または「遺伝的に」）改変することができる。コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する単一のオープンリーディングフレームをコードするプラスＲＮＡゲノムを含む小さな非エンベロープウイルスである。

【0016】

本明細書中で使用する場合、「治療する」または「治療すること」または「治療」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つ以上の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち悪化しない）状態、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、疾患の再発の減少、及び寛解（部分的または全体的）が含まれ得るが、これらに限定されない。用語「治療すること」及び「治療」はまた、治療を受けない場合の予測生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。

【0017】

用語「がん」とは、対象における細胞の無秩序なまたは異常な増殖によって引き起こされる病状を指す。がんの代表的な形態として、癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫及び肉腫が挙げられる。さらなる例として、胆管癌、脳癌（例えば、神経膠芽腫）、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、ＣＮＳの癌（例えば、聴神経腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠芽腫、血管芽腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、松果体腫及び網膜芽細胞腫）、子宮内膜癌、造血細胞癌（例えば、白血病及びリンパ腫）、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、肝臓癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（例えば、黒色腫及び扁平上皮癌）及び甲状腺癌が挙げられる。がんには、固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫及び骨肉腫などの肉腫）、びまん性（例えば、白血病）、またはこれらのいくつかの組み合わせ（例えば、固形腫瘍と播種性またはびまん性のがん細胞の両方を有する転移性がん）が含まれ得る。がんはまた、従来の治療法（例えば、従来の化学療法及び／または放射線療法）に抵抗性であり得る。

【0018】

良性腫瘍及び他の望ましくない細胞増殖の病態も治療し得る。
本明細書の様々な実施形態の理解をさらに深めるために、様々な実施形態を説明する以下の節を提供する：Ａ．腫瘍溶解性エンテロウイルス；Ｂ．マイクロＲＮＡ；Ｄ．治療用組成物、及びＥ．投与。

【0019】

Ａ．腫瘍溶解性エンテロウイルス
上記のように、エンテロウイルスは一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの属であり、糞口経路を介して伝染する哺乳類の疾患に最も一般的に関連している。エンテロウイルスの一般的な例として、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス及びエコーウイルスが挙げられる。

【0020】

コクサッキーウイルスは、エンベロープを有さない線形のプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス科、ならびにポリオウイルス及びエコーウイルスを含むエンテロウイルス属に属するウイルスである。エンテロウイルスは、最も一般的で重要なヒト病原体の１つであり、通常、そのメンバーは糞口経路で感染する。コクサッキーウイルスは、無菌性髄膜炎の主な病因の１つである（他の通常の病因ウイルスはエコーウイルス及びムンプスウイルスである）。コクサッキーウイルスは、ポリオウイルスと多くの特徴を共有している。世界の大部分でポリオウイルス感染が制御されているため、コクサッキーウイルスなどの非ポリオエンテロウイルスの理解に注目が集まっている。（ＳｅａｎＰ，ＳｅｍｌｅｒＢＬ．ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＢＲＮＡｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ．ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ２００８；３２３：８９－１２１）。

【0021】

コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する単一のオープンリーディングフレームをコードするプラスＲＮＡゲノムを含む小さな非エンベロープウイルスである。ＣＶＢ３のライフサイクルは短く、通常、細胞死及び子孫ウイルスの放出が急速に進む。受容体へのウイルスの付着に続いて、ウイルスＲＮＡが細胞内に放出され、そのＲＮＡは細胞内でウイルスポリタンパク質の翻訳及びウイルスゲノムの複製のためのテンプレートとして機能する。

【0022】

Ｂ．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
上記のように、本発明は、エンテロウイルスの腫瘍特異性をさらに増強するために、エンテロウイルスゲノム（例えば、ポリオウイルスゲノム、コクサッキーウイルスゲノムまたはエコーウイルスゲノム）を改変するためのｍｉＲＮＡベースのアプローチを提供する。ｍｉＲＮＡは、進化的に保存された内在性の小さな非コードＲＮＡのクラスであり、標的となるｍＲＮＡのＵＴＲに結合することにより、幅広い基本的な細胞機能の主要な調節因子として機能する。その後、それらはｍＲＮＡ分解または遺伝子発現の抑制のいずれかを促進する。最近のエビデンスからは、ｍｉＲＮＡも腫瘍形成において重要な役割を果たしていることが示唆されている。ｍｉＲＮＡは、様々ながん組織において下方制御されることが一般的に観察されている。このユニークな機能を利用して、ｍｉＲＮＡ感受性の腫瘍特異的腫瘍溶解性ウイルスを開発することができる。ｍｉＲＮＡ－１４５（ｍｉＲ－１４５）及びｍｉＲ－１４３は、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡとして同定されており、肺癌組織において有意に下方制御される。
個々のｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの群は、特定の組織型で排他的または優先的に発現し得る。例示的なｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１２９、ｍｉＲ－１２９^*、ｍｉＲ－１３２、ｍｉＲ－１３５ｂ、ｍｉＲ－１３６、ｍｉＲ－１３６^*、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１５４、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１８８、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ－２１６、ｍｉＲ－２１７、ｍｉＲ－２９９、ｍｉＲ－３００－３ｐ、ｍｉＲ－３００－５ｐ、ｍｉＲ－３２３、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３３７、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３４１、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－３７６ａ、ｍｉＲ－３７６ａ^*、ｍｉＲ－３７６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３７６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３７６ｃ、ｍｉＲ－３７７、ｍｉＲ－３７９、ｍｉＲ－３７９^*、ｍｉＲ－３８２、ｍｉＲ－３８２^*、ｍｉＲ－４０９－５ｐ、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４１１、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－４３３、ｍｉＲ－４３４、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－４６６ｂ、ｍｉＲ－４８５、ｍｉＲ－４９５、ｍｉＲ－４９９、ｍｉＲ－５３９、ｍｉＲ－５４１、ｍｉＲ－５４３^*、ｍｉＲ－５５１ｂ、ｍｉＲ－７５８、及びｍｉＲ－８７３が挙げられる。慣例により、最終産物であることがより頻繁に認められる鎖はｍｉＲＮＡと呼ばれ、よりまれなパートナーはｍｉＲＮＡ^*と呼ばれる。

【0023】

本発明の特定の実施形態においては、ｍｉＲＮＡ標的配列を、コクサッキーウイルスＢ３ゲノムの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入することができる。特定の実施形態においては、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのｍｉＲＮＡ標的配列をタンデムに挿入することができる。さらなる実施形態においては、少なくとも１０個の標的配列を存在させてもよく、これらをタンデムに挿入することができる。他の実施形態においては、１０、１５、２０、５０、または１００未満の標的配列が存在する。ＣＳＶＢ３の発現レベルをアッセイすることにより、最適な数の標的配列を決定することができる。正常細胞では、ＣＳＶＢ３のレベルが低いか存在しないことが望ましい。複数のｍｉＲＮＡ標的配列はすべて同じｍｉＲＮＡに結合してもよく、または異なるｍｉＲＮＡに結合してもよい。標的配列はクラスターとして存在していてもよく（例えば、図２）、例えば、第１のｍｉＲＮＡに結合する少なくとも２つの標的配列がタンデムに存在し、続いて第２のｍｉＲＮＡに結合する少なくとも２つの標的配列がタンデムに存在し、任意選択で、第３のｍｉＲＮＡに結合する少なくとも２つの標的配列が続く。あるいは、異なるｍｉＲＮＡに結合する複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、特定の順序でなくてもよい。同様に、各ｍｉＲＮＡ標的配列の単一コピーのみが存在する場合がある。いくつかの実施形態では、２～４個の異なるｍｉＲＮＡ標的が存在する。他の実施形態では、各標的配列の２～４個のコピーが存在する。他の実施形態では、２～４個の異なるｍｉＲＮＡ標的、及びこれらの標的配列のそれぞれの２～４個のコピーがクラスター内に存在する。ｍｉＲＮＡ標的配列は、任意の方向または複数の方向の組み合わせで挿入してもよい。例示的な構築物については、図２を参照されたい。

【0024】

複数のｍｉＲＮＡ標的配列は、介在ヌクレオチドを含まずに隣接し得るか、または１～約２５、または１～約２０、または１～約１５、または１～約１０、または１～約５、または３～約１０、または５～約１０の介在ヌクレオチドを有し得る。介在ヌクレオチドは、５’ＵＴＲと同様のＧ＋Ｃ含有量を有し、好ましくはポリアデニル化シグナル配列を含まないように選択してもよい。

【0025】

Ｃ．治療組成物
例えばがんなどの疾患の影響を予防、治療、または改善するために使用し得る治療用組成物を提供する。より具体的には、本明細書に記載するような少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスを含む治療用組成物を提供する。
特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。語句「薬学的に許容される担体」とは、腫瘍溶解性ウイルスの生物学的活性の有効性を妨害せず、それを投与する対象に対して毒性がない任意の担体、希釈剤または賦形剤を包含することを意味する（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔｅｄ．（Ｍａｙ１，２００５ａｎｄｉｎＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐＥ１Ａ：ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＦｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ４０－ＮＦ３５ａｎｄＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓを参照のこと）。

【0026】

本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの場合、適切な薬学的担体の非限定的な例として、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。追加の薬学的に許容される担体として、ゲル、生体吸収性マトリックス材料、腫瘍溶解性ウイルスを含む移植片、または任意の他の適切なビヒクル、送達または分配手段または材料（複数可）が挙げられる。そのような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、有効な用量で対象に投与することができる。追加の薬学的に許容される賦形剤として、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸及びエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）及び有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）もその中に含めることができる。腫瘍溶解性ウイルスをがん細胞に送達するために使用し得るそのような薬学的に許容される（医薬品グレードの）担体、希釈剤及び賦形剤は、好ましくは、組成物を受け取る個体（対象）に免疫応答を誘導しない（そして好ましくは過度の毒性を伴わずに投与される）。

【0027】

本明細書中で提供する組成物は、様々な濃度で提供することができる。例えば、約１０⁶～約１０¹¹ｐｆｕの範囲の腫瘍溶解性ウイルスの用量を提供することができる。さらなる実施形態では、用量は、約１０⁶～約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの範囲とすることができ、大きな病巣（例えば、＞５ｃｍ）を有する患者には最大４ｍｌを、及び小さな病巣（例えば、＜０．５ｃｍ）を有する患者には少量（例えば、最大０．１ｍｌ）を治療の２～３週間ごとに注射する。
本発明の特定の実施形態において、標準よりも低い用量を利用してもよい。したがって、特定の実施形態では、約１０⁶ｐｆｕ／ｍｌ未満（２～３週間ごとに最大４ｍｌを患者に注射する）を患者に投与することができる。

【0028】

安定した貯蔵寿命をもたらす温度で組成物を保存してもよく、これには、室温（約２０℃）、４℃、－２０℃、－８０℃、及び液体窒素が含まれる。ｉｎｖｉｖｏでの使用を目的とした組成物は一般的に防腐剤を含まないため、貯蔵は一般的に低温で行われる。組成物は、乾燥状態（例えば、凍結乾燥）または液体形態で貯蔵してもよい。

【0029】

Ｅ．投与
本明細書に記載の組成物に加えて、本明細書に記載の有効用量または有効量の改変コクサッキーウイルスを対象に投与するステップを含む、疾患（例えば、がん）を治療または改善するためにそのような組成物を使用する様々な方法を提供する。
用語「有効用量」及び「有効量」とは、標的となるがんの治療を行うのに十分な腫瘍溶解性ウイルスの量、例えば、標的となる腫瘍のサイズまたは量を減らすのに有効な量、または標的となる腫瘍細胞の増殖速度を妨げる量を指す。より具体的には、そのような用語は、必要な用量及び治療期間において、所望の結果を達成するために有効である腫瘍溶解性ウイルスの量を指す。例えば、がんの治療に関して、本明細書に記載の有効量の組成物は、寛解を誘導し、腫瘍量を軽減し、及び／または腫瘍の拡散またはがんの成長を防止する量である。有効量は、対象の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに医薬製剤、投与経路などの要因によって様々に異なり得るが、それにもかかわらず、当業者であれば日常的に決定することができる。

【0030】

治療用組成物は、がんと診断された対象、またはがんを有することが疑われる対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。
本明細書に記載のＯＶ（例えば、コクサッキーウイルス）は、例えば、静脈内、腫瘍内、または腹腔内である経路によって与えられ得る。特定の実施形態においては、腫瘍溶解性ウイルスを、カニューレによって、カテーテルによって、または直接注射によって送達してもよい。投与部位は、腫瘍内または腫瘍から離れた部位であってもよい。投与経路は、多くの場合、標的となるがんのタイプによって異なる。本明細書に記載のＯＶ（例えば、ＣＳＶ）は、静脈内（ＩＶ）投与に特に適している。

【0031】

腫瘍溶解性ウイルスの最適または適切な投与計画は、患者データ、患者の所見、ならびに例えば対象のサイズ、体表面積、年齢、性別、及び投与する特定の腫瘍溶解性ウイルスを含む様々な臨床因子、投与の時間及び経路、治療するがんの種類、患者の健康全般、ならびに患者が受けている他の薬物療法に基づいて、担当医により、当業者の技能の範囲内で容易に決定され得る。特定の実施形態によれば、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを使用する対象の治療を、追加のタイプの療法、例えば、エトポシド、イホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、ドキシサイクリンなどの化学療法剤を使用する化学療法と組み合わせてもよい。

【0032】

ＯＶ（例えば、ＣＳＶ）を、臨床使用のための薬剤及び医薬組成物として製剤化してもよく、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントと組み合わせてもよい。製剤は、少なくとも部分的に、投与経路に依存する。適切な製剤は、無菌培地中にウイルス及び阻害剤を含み得る。製剤は、流体、ゲル、ペーストまたは固体形態であり得る。製剤は、対象または医療専門家に提供することができる。
好ましくは治療有効量を投与する。これは、対象に恩恵をもたらすのに十分な量である。実際に投与する量及び投与の時間経過は、少なくとも部分的に、がんの性質、対象の病態、送達部位、及び他の要因に依存するであろう。
本発明のさらに他の実施形態においては、腫瘍溶解性ウイルスは、様々な方法により、例えば、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または腫瘍の外科的切除後に投与することができる。

【0033】

以下は、本開示のさらなる例示的な実施形態である：
１．改変エンテロウイルスゲノムを含む複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターであって、前記改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスゲノムの非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に連結された１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを含む。関連する実施形態において、改変エンテロウイルスゲノムを含む複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターを提供し、前記改変エンテロウイルスゲノムは、エンテロウイルスゲノムの非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に連結された複数の１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。様々な実施形態において、前記エンテロウイルスは、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、またはエコーウイルスであり得る。
２．エンテロウイルスがコクサッキーウイルスである、実施形態１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【0034】

３．コクサッキーウイルスが、コクサッキーウイルスＡまたはＢである、実施形態２に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。
４．非翻訳領域（ＵＴＲ）が５’ＵＴＲである、実施形態１、２または３のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。他の実施形態では、ＵＴＲは３’ＵＴＲである。本発明のさらに別の実施形態において、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を、３’ＵＴＲに作動可能に連結してもよく、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を、５’ＵＴＲに作動可能に連結してもよい。

【0035】

５．１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが、２つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーを含む、実施形態１、２、３または４のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。
６．前記１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の間に、２～５０塩基対（「ｂｐ」）のサイズのスペーサーが挿入されている、実施形態１、２、３、４、または５のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。様々な実施形態において、前記スペーサーは、２～１０ｂｐ、１０～２０ｂｐのサイズ、２０～３０ｂｐのサイズ、３０～４０ｂｐのサイズ、または４０～５０ｂｐのサイズであり得る。
７．１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の前記１つ以上のコピーが、心臓または膵臓に特異的なｍｉＲＮＡを認識する、実施形態１に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。心臓特異的ｍｉＲＮＡの代表的な例として、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ１３３ａ／ｂ、ｍｉＲ－２０８ａ／ｂ及びｍｉＲ－４９９が挙げられる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡの代表的な例として、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２１６、ｍｉＲ－２１７、及びｍｉＲ－３７５が挙げられる。

【0036】

８．１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲ１、ｍｉＲ－７、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１２４^*、ｍｉＲ－１２７、ｍｉＲ－１２８、ｍｉＲ－１２９、ｍｉＲ－１２９^*、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１３５ｂ、ｍｉＲ－１３６、ｍｉＲ－１３６^*、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１５４、ｍｉＲ－１８４、ｍｉＲ－１８８、ｍｉＲ－２０４、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ２１７、ｍｉＲ－２９９、ｍｉＲ－３００－３ｐ、ｍｉＲ－３００－５ｐ、ｍｉＲ－３２３、ｍｉＲ－３２９、ｍｉＲ－３３７、ｍｉＲ－３３５、ｍｉＲ－３４１、ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｍｉＲ－３７５、ｍｉＲ－３７６ａ、ｍｉＲ－３７６ａ^*、ｍｉＲ－３７６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３７６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－３７６ｃ、ｍｉＲ－３７７、ｍｉＲ－３７９、ｍｉＲ－３７９^*、ｍｉＲ－３８２、ｍｉＲ－３８２^*、ｍｉＲ－４０９－５ｐ、ｍｉＲ－４１０、ｍｉＲ－４１１、ｍｉＲ－４３１、ｍｉＲ－４３３、ｍｉＲ－４３４、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－４６６ｂ、ｍｉＲ－４８５、ｍｉＲ－４９５、ｍｉＲ－４９９、ｍｉＲ－５３９、ｍｉＲ－５４１、ｍｉＲ－５４３^*、ｍｉＲ－５５１ｂ、ｍｉＲ－７５８、及びｍｉＲ－８７３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡを認識する、実施形態１、２、３、４、５、６、または７のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。慣例により、最終産物であることがより頻繁に認められる鎖はｍｉＲＮＡと呼ばれ、よりまれなパートナーはｍｉＲＮＡ^*と呼ばれる。様々な実施形態において、複製型腫瘍溶解性ウイルスは、プラス鎖ｍｉＲＮＡの１つ以上のコピー及び／またはマイナス鎖ｍｉＲＮＡの１つ以上のコピーを含み得る。

【0037】

９．異なるｍｉＲＮＡ標的配列の２つ以上（または複数）が、ｍｉＲ１、ｍｉＲ１３３、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ１４５及びｍｉＲ１４３の標的配列を含む、実施形態１、２、３、４、５、６、７、または８のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【0038】

１０．ｍｉＲ１、ｍｉＲ１３３、ｍｉＲ２１６、ｍｉＲ１４５及びｍｉＲ１４３の標的配列の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのコピーを含む、実施形態９に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。
１１．１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが順方向にあり、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列の１つ以上のコピーが逆方向にある、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。

【0039】

１２．改変エンテロウイルスゲノムが、免疫刺激因子、抗体（例えば、二重特異性抗体を含む）、及びチェックポイント遮断ペプチド（「チェックポイント阻害因子」または「チェックポイント調節因子」とも呼ばれる）からなる群から選択される非ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含み、前記少なくとも１つの核酸が、適切な腫瘍特異的調節領域に作動可能に連結する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１のいずれかの態様に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。本発明の様々な実施形態において、前記二重特異性抗体は、腫瘍抗原を認識する第１の抗原結合ドメイン、及びエフェクター細胞上の細胞表面分子を認識する第２の抗原結合ドメインを含む。本発明の他の実施形態において、前記チェックポイント調節因子は、ペプチドリガンド、天然受容体の可溶性ドメイン、ＲＮＡｉ、アンチセンス分子または抗体である。本発明のさらなる実施形態において、免疫調節剤は、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ及び／またはＣＴＬＡ４などの抑制性免疫チェックポイント（複数可）の活性を少なくとも部分的に弱める。

【0040】

１３．非ウイルスタンパク質が、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５受容体αサブユニット、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７３、及びチェックポイント阻害因子からなる群から選択される、実施形態１２に記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター。本発明のさらなる実施形態において、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のいずれかに記載の複製型腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染し、溶解させる能力を保持しているが、同じ株の未改変の野生型ウイルスと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏでの毒性が低下している（例えば、同じ株の未改変の野生型コクサッキーウイルスと比較して、ｉｎｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎｖｉｖｏでの毒性が、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、または９０％超低下したｍｉＲ改変コクサッキーウイルス）。特定の実施形態においては、心筋細胞、及び／または正常膵臓細胞において毒性が低下している。

【0041】

１４．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のいずれかに記載の有効量の複製型腫瘍溶解性ウイルスベクターを腫瘍細胞に提供することを含む、腫瘍細胞の溶解方法。腫瘍細胞は、例えば、本明細書に記載のがん内においてｉｎｖｉｖｏで見出すことができる。
１５．腫瘍細胞が、肺癌細胞を含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．腫瘍細胞が、膵臓癌細胞を含む、実施形態１４に記載の方法。
１７．上記の実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のいずれかに記載の少なくとも１つの複製型腫瘍溶解性ウイルスベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、治療用組成物。

【0042】

１８．治療有効量の実施形態１７に記載の組成物を含む組成物を投与するステップを含む、がんに罹患している対象におけるがんの治療方法。がんの代表的な例として、本明細書に記載のがんが挙げられる。特に好ましいがんとして、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、及び乳癌が挙げられる。
１９．がんが、肺癌、膵臓癌、肝臓癌及び乳癌からなる群から選択される、実施形態１８に記載の方法。
２０．がんが、ＫＲＡＳ変異に関連する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、一般的にＴＰ５３及びＲｂ変異に関連する小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、または膵臓癌である、実施形態１８に記載の方法。
２１．投与が、静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与、または腫瘍内（ＩＴ）投与である、実施形態１８、１９、または２０に記載の方法。

【0043】

＜実施例＞
以下の実施例は、例示として示されており、限定するために示されているものではない。

【実施例1】

【0044】

ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３は、肺癌細胞において下方制御される
本実施例では、肺細胞及び心筋細胞におけるｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３の発現を調べる実験について記載する。ｍｉＲＮＡレベルは、以下のステムループプライマーを用いて実施した逆転写反応によって検出した：ｍｉＲ－１４５：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡＴＴＣ（配列番号１）；ｍｉＲ－１４３：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡ（配列番号２）；及びｍｉＲ９３：ＣＴＣＡＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＴＡＣＣＴＧＣ（配列番号３）。これらのプライマーを使用して、細胞のｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１４３及びｍｉＲ－９３（内部対照）を、対応する相補的ＤＮＡに変換した。簡潔に述べると、様々な肺細胞及び心筋細胞由来の１μｇの総ＲＮＡを、１５μｌのヌクレアーゼフリー水中の各ｍｉＲＮＡ用の５０ｎＭＲＴプライマーを含む２μｌのＲＴプライマーミックスと混合した。反応物を６５℃で５分間、次いで氷上で２分間インキュベートして、ステムループを形成させた。次いで、ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ、１７０８８９０）を使用して、２５℃で５分間、４２℃で３０分間、及び８５℃で５分間、この混合物を４ｕｌ５×ｉＳｃｒｉｐｔ反応ミックス及び１μｌ逆転写酵素と混合することにより、逆転写に使用した。次いで、混合物を８０μｌのヌクレアーゼフリー水で希釈した。ｑＰＣＲについては、３つのプライマーペアを使用して、ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３の相対的な発現レベルを測定した：ｍｉＲ－１４５（順方向：ＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧ（配列番号４）；逆方向：ＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣ（配列番号５））、ｍｉＲ－１４３（順方向：ＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣ（配列番号６）；逆方向：ＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＡ（配列番号７））、ｍｉＲ－９３（順方向：ＣＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧ（配列番号８）；逆方向：ＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣ（配列番号９））。簡潔に述べると、１μｌのｃＤＮＡ産物を１０μｌの反応混合物に加え、ＬｕｎａユニバーサルｑＰＣＲマスターミックス（Ｎｅｂ、Ｍ３００３）を使用してメーカーが推奨するプライマー濃度にした。反応を以下のように繰り返した：９５℃で１分間、[９５℃で１０秒間、６５℃で３０秒間]を４５サイクル、次いで融解曲線をＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で設定した。試料は３つ組で実行し、対照試料を使用した比較ＣＴ（２－ΔΔＣＴ）法を使用して分析し、相対定量（ＲＱ）として示した。

【0045】

結果を、図１Ａ（ｍｉＲ－１４５の発現レベル）及び図１Ｂ（ｍｉＲ－１４３の発現レベル）に示す。これらの相対定量の結果は、正常な肺上皮細胞及び心筋細胞と比較して、ＫＲＡＳ変異を有する肺腺癌細胞株（Ｈ２０３０、Ｈ２３、Ａ５４９）及びＴＰ５３変異を有するＳＣＬＣ細胞株（Ｈ５２４、Ｈ５２６）において、ｍｉＲ－１４５とｍｉＲ－１４３の両方が有意に下方制御されることを示している。

【実施例2】

【0046】

ｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築
正常組織に対するウイルス毒性が低下した組換えＣＶＢ３ベクターを作製するために、図２に示すようにｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３を構築した。ｍｉＲ－１４５の標的配列の４コピーとｍｉＲ－１４３の標的配列の２コピーを、５’ＵＴＲとＶＰ４の開始コドンの間の位置に挿入して、ｍｉＲ－ＣＶＢ３として示すｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３を構築した。ＣＶＢ３（カンドルフ株）のインタクトなゲノムを含むプラスミドｐＣＶＢ３／Ｔ７をバックボーンとして使用して、ｍｉＲ－ＣＶＢ３を作製した。簡潔に述べると、ｐＣＶＢ３／Ｔ７をＸｂａＩで消化して、５’ＵＴＲ－ＶＰ４領域を残しながらＢａｍＨＩ部位を削除した。次いで、得られたプラスミドを、５’ＵＴＲとＶＰ４の開始コドンとの間にＢａｍＨＩ部位及びコザックコンセンサス配列を含む配列ＧＴＴＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＴＣＣＣＡＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＡＡＴＧ配列番号１０）を有するプライマーを用いて変異導入した。変異体バックボーンを、プライマーペア（順方向：ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧ（配列番号１１）；逆方向：ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＣＧＡＴＡＧＣＧＴＣＣＡＧＴＴＴＴＣ（配列番号１２））を使用してプラスミドｐＣＭＶ－ＩＣＰ２７－１４５Ｔから増幅した４コピーのｍｉＲ－１４５標的配列及びＣｌａＩ部位を含むＢａｍＨＩ消化したＰＣＲ産物を挿入することによってさらに改変した。次いで、得られたプラスミドのＣＶＢ３ゲノムを、ＢｇｌＩＩ－ＳａｌＩ断片からｐＣＶＢ３／Ｔ７の対応する断片に置き換えて修復し、ｐＣＶＢ３－ｍｉＲ１４５を構築した。最後に、２コピーのｍｉＲ－１４３標的配列を含むアニーリングされたオリゴペア（順方向：ＣＧＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＣＧＡＴＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＡＧＡＡＴ（配列番号１３）；逆方向：ＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＡＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡ（配列番号１４））をＣｌａＩサイトへ挿入することによって、プラスミドｐＣＶＢ３－ｍｉＲ１４５－ｍｉＲ１４３を作製した。ここで使用するすべての制限酵素は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製である。

【0047】

ｍｉＲ－ＣＶＢ３及び野生型ＣＶＢ３ストックを作製するために、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ＱｕｉｃｋＨｉｇｈＹｉｅｌｄＲＮＡ合成キット（＃Ｅ２０５０Ｓ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＳａｌＩ消化によって直鎖状化したｐＣＶＢ３－ｍｉＲ１４５－ｍｉＲ１４３及びｐＣＶＢ３／Ｔ７からウイルスゲノムをそれぞれ合成した。続いて、ウイルスＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの約７２時間後に細胞変性効果が最も顕著になった時点で上清を回収した。ウイルス力価が保存に望ましいレベルに達するまで、ウイルスを含む上清をＨｅＬａ細胞でさらに増殖させた。

【実施例3】

【0048】

心筋細胞におけるｍｉＲ－ＣＶＢ３ＲＮＡレベル、ウイルス力価、及び細胞毒性の低下
ｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３がｍｉＲＮＡ依存性の下方制御の影響を受けやすい場合、ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３の発現が豊富な細胞は、ウイルスの増殖またはｍｉＲ－ＣＶＢ３の複製を選択的に抑制し、一方、野生型ＣＶＢ３の増殖は影響を受けないと予測される。この予測を試験するために、細胞株のパネルをＭＯＩ０．１にてｍｉＲ－ＣＶＢ３または野生型ＣＶＢ３で処理し、感染の３６時間後に上清中のウイルス粒子の滴定を行った。図３Ａに示すように、ｍｉＲ－ＣＶＢ３の力価は、ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３が高度に発現しているＨＬ－１マウス心筋細胞において、野生型ＣＶＢ３と比較して有意に低下した。対照的に、ｍｉＲ－ＣＶＢ３の力価は、ｍｉＲＮＡレベルが下方制御されているＮＳＣＬＣ細胞株、ＳＣＬＣ細胞株及びＨｅＬａ細胞の野生型ＣＶＢ３と比較して有意に低下しなかった。

【0049】

心筋細胞ＨＬ－１及び肺癌ＫＲＡＳ^mutＨ２０３０及びＴＰ５３^mutＨ５２６細胞株におけるウイルスゲノムコピー数（図３Ｂ）及びウイルス力価（図３Ｃ）を測定することにより、両方のウイルスの細胞内複製及びワンステップ増殖曲線も評価し、細胞レベルごとに正規化した。野生型ＣＶＢ３と比較したｍｉＲ－ＣＶＢ３の増殖パターンにおいて、ＨＬ－１細胞株と２つの肺癌細胞株の間に有意差が確認された。特に、ＨＬ－１細胞におけるｍｉＲ－ＣＶＢ３の複製は、ウイルスＲＮＡコピーレベル及びウイルス力価に反映されたように厳密に抑制された一方で、野生型ＣＶＢ３ゲノム及びウイルス力価は増幅し続けた。対照的に、Ｈ２０３０細胞とＨ５２６細胞の両方で、両方のウイルスの複製はほぼ同じレベルまで増幅し続けた。

【0050】

肺癌細胞に比べて比較的高レベルのｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３を発現するマウス心筋細胞ＨＬ－１細胞株において、野生型ＣＶＢ３と比較したｍｉＲ－ＣＶＢ３の毒性を試験した。図４Ａ～Ｃに示すように、初期ウイルス感染ＭＯＩが０．０１～１００の場合、ウイルス感染の７２時間後にｍｉＲ－ＣＶＢ３の毒性が有意に低下することが観察された。野生型ＣＶＢ３は０．０１～０．１のＭＯＩでＨＬ－１細胞の損傷を引き起こし、一方、ＨＬ－１細胞に細胞変性効果を明確に誘導するには、はるかに高い用量のｍｉＲ－ＣＶＢ３（１０～１００のＭＯＩ）が必要であった。形態アッセイの結果（図４Ａ）は、野生型ＣＶＢ３処理細胞において空のウェルを示したクリスタルバイオレット染色試験（図４Ｂ）において、及び細胞生存率の差分値により、細胞生存率アッセイ（図４Ｃ）においても反映された。ＨＬ－１細胞株は腫瘍細胞に由来するため、ヒトｉＰＳＣ誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を使用して細胞生存率アッセイを検証したが、その結果はＨＬ－１細胞株で試験した結果と一致していた（図４Ｄ）。

【実施例4】

【0051】

ｍｉＲ－ＣＶＢ３は、ＫＲＡＳ^mut肺癌細胞を溶解する能力を維持する
ｍｉＲＮＡ改変がＫＲＡＳ^mut腺癌細胞に対するｍｉＲ－ＣＶＢ３の溶解能力を損なうかどうかを判定するために、変異型ＫＲＡＳを含む３つの一般的な細胞株Ｈ２０３０（Ｇ１２Ｃ）、Ｈ２３（Ｇ１２Ｃ）、及びＡ５４９（Ｇ１２Ｓ）を評価に使用した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、ｍｉＲ－ＣＶＢ３は、野生型ＣＶＢ３で観察されたのと同様の細胞溶解パターンで、３つの細胞株に対する溶解能力を維持している。さらに、ｍｉＲ－ＣＶＢ３は、腫瘍細胞の生存率を抑制する能力（図５Ｃ）において、０．１というＭＯＩで野生型ＣＶＢ３よりも弱いことが観察された。ＣＶＢ３の人工ｍｉＲＮＡ改変は、正常細胞とがん細胞の両方でｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３に対する自然免疫または抗ウイルス能力を選択的に高め、それによってがん細胞で観察されるｍｉＲ－ＣＶＢ３の溶解能力が野生型ＣＶＢ３に比べてわずかに低下することを説明していると推測することができる。心筋細胞におけるｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３の存在量はがん細胞よりもかなり高いため、心筋細胞はより大きな抗ｍｉＲ－ＣＶＢ３能力を獲得するはずであると予測される。

【実施例5】

【0052】

野生型ＣＶＢ３とｍｉＲ－ＣＶＢ３はいずれも小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞を死滅させ、一方、ヒト正常肺上皮細胞は、野生型ＣＶＢ３とｍｉＲ－ＣＶＢ３の両方に対して非許容性である。肺腺癌と比較して、ＳＣＬＣは、喫煙とより密接な相関関係を有する。もともと２人の喫煙者患者から寄贈された２つの浮遊ＳＣＬＣ細胞株であるＨ５２４とＨ５２６を播種して、１）ＣＶＢ３がＴＰ５３^mutＳＣＬＣを治療する可能性があるかどうか、及び２）ｍｉＲ－ＣＶＢ３がＳＣＬＣ細胞株の増殖を抑制する同等の能力を維持するかどうかを調べ始めた。図６Ａに示すように、野生型ＣＶＢ３及びｍｉＲ－ＣＶＢ３で処理した細胞は、「シャム（擬似）」ウェル内の未処理の対照細胞と比較して、両方とも異常な細胞形態（例えば、サイズの収縮）を示した。この観察結果は、ウイルス誘発性の細胞毒性を反映しており、これは細胞生存率アッセイの結果にも反映されている（図６Ｂ）。正常な肺上皮細胞株であるＢＥＡＳ２Ｂもこれらの実験で試験した。図６Ｃ及び６Ｄに示すように、ＢＥＡＳ２Ｂは、ＭＯＩが１００の高さであっても、野生型ＣＶＢ３とｍｉＲ－ＣＶＢ３の両方に対して非許容性または抵抗性である。

【実施例6】

【0053】

マウスモデルにおけるｍｉＲ－ＣＶＢ３のｉｎｖｉｖｏ試験
野生型ＣＶＢ３と比較したｍｉＲ－ＣＶＢ３の安全性試験を、免疫無防備状態のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおいて、ウイルス注射後１４日目のエンドポイントで行った。６週齢のマウスに、野生型ＣＶＢ３（４匹のマウス）またはｍｉＲ－ＣＶＢ３（５匹のマウス）を１×１０⁸ＰＦＵの単回投与で腹腔内投与した。次いで、処置したマウスを、体重、外観、行動の変化、及び腫瘍細胞注射部位での感染の徴候について毎日モニタリングした。エンドポイントの１４日目までマウスをケージ内で維持し、その後安楽死させた。心臓、膵臓、肺、肝臓、腎臓、及び脾臓を、Ｈ＆Ｅ及びウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１染色、ならびにウイルスプラークアッセイのために回収した。図７Ａに示すように、野生型ＣＶＢ３で処置したＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスは重度の毒性を示し、タイムコースを通じて１匹のマウスのみが生存した（２５％生存率）が、一方、ｍｉＲ－ＣＶＢ３で処置したすべてのマウスが実験終了時に生存していた（１００％生存率）。図７Ｂに示すＨ＆Ｅ染色スライドから、主要臓器間で、２つの群のマウス間で肺、膵臓、肝臓、脾臓に有意な病理学的差異は観察されず、病理学的スコアに基づいて、組織は正常であるように思われる（図７Ｃ）。それにもかかわらず、野生型ＣＶＢ３で処置したマウスの心臓スライドでは、紫色の領域で示される重度の壊死または組織損傷が観察され、これは、ｍｉＲ－ＣＶＢ３で処置したマウスの組織スライドには存在しなかった。病理学的スコア評価（図７Ｃ）では、野生型ＣＶＢ３で処置したマウスの心臓に高スコアの組織損傷が観察されたが、ｍｉＲ－ＣＶＢ３で処置したマウスでは観察されなかった。ｍｉＲ－ＣＶＢ３で処置したマウスでは心毒性がほとんどなくなったと推測される。ＶＰ１免疫染色によるウイルス定量（図７Ｄ及び７Ｅ）は、野生型ＣＶＢ３マウスと比較して、ウイルスタンパク質ＶＰ１発現の有意な減少（ｍｉＲ－ＣＶＢ３処置マウスの心臓ではほとんど検出されない）を示し、このことは、ｍｉＲ－ＣＶＢ３マウスにおける心臓損傷の減少が、主にウイルス複製の減少によるものであることを示している。ＶＰ１発現が、ｍｉＲ－ＣＶＢ３処置マウスの膵臓ではほとんど検出できないことも観察された。図７Ｆに示すように、両方の群由来のマウスの心臓、肺、及び膵臓の生存ウイルスも測定し、ｍｉＲ－ＣＶＢ３の力価は、心臓の野生型ＣＶＢ３と比較して有意に低下しているが、膵臓及び肺ではそれほど有意ではない。ｍｉＲ－ＣＶＢ３による有意な心毒性はなかったが；低レベルではあるものの、心臓にはまだ生存しているｍｉＲ－ＣＶＢ３が存在していた。

【0054】

ｍｉＲ－ＣＶＢ３腫瘍溶解性ウイルスの有効性試験では、ＴＰ５３^mutＳＣＬＣ細胞株Ｈ５２６を使用して異種移植マウスモデルを確立した。簡潔に述べると、Ｈ５２６細胞（１×１０⁷細胞）を８週齢の雄ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの左右の脇腹に皮下注射した。腫瘍のサイズが約１００ｍｍ³に達した時点（約１０日）で、マウスにＰＢＳ（８匹のマウス）、野生型ＣＶＢ３（５匹のマウス）、またはｍｉＲ－ＣＶＢ３（８匹のマウス）のいずれかを単回投与（１×１０⁸ＰＦＵ）で腹腔内注射した。マウスを、一般的な外観、行動、体重、及び腫瘍細胞注射部位での感染の徴候について毎日モニタリングした。腫瘍サイズを週２回測定し、腫瘍体積を、長さ×幅×幅／２として計算した。マウスを、ＣＶＢ３注射に関連する重篤な症状を示した場合か、または腫瘍の直径が２．０ｃｍを超えない限りはエンドポイントの２５日目までに安楽死させた。生存率（図８Ａ）が示すように、エンドポイントの２５日目まで、８匹のｍｉＲ－ＣＶＢ３処置マウスはすべて正常に見えたが、８匹のＰＢＳ処置シャムマウスのうち６匹は腫瘍サイズ超過のため、安楽死させた。野生型ＣＶＢ３で処置した５匹のマウスはすべて、死亡するかまたは１４日目に病的状態であったために安楽死させた。腫瘍増殖曲線（図８Ｂ）が示すように、ＰＢＳ処置マウスの腫瘍は、エンドポイント２５日目まで増殖を続けたが、両方のウイルス処置マウス群の腫瘍は、縮小を続けるか、または腫瘍増殖が低レベルに維持された。予想通り、野生型ＣＶＢ３で処置したマウスは、１４日目以降は生存しなかった。移植した腫瘍及び様々な臓器を、２５日目に採取した。腫瘍重量（平均±ＳＤ）（図８Ｃ）及びウイルス力価（平均±ＳＤ）（図８Ｄ）を測定し、Ｈ＆Ｅ染色（図８Ｅ）を実施した。ＰＢＳのシャム対照と比較して＃ｐ＜０．０１。ｍｉＲ－１４５（図８Ｆ）及びｍｉＲ－１４３（図８Ｇ）の発現レベルを、ＰＢＳ処置マウスの心臓、膵臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸、脳、及びＨ５２６由来腫瘍において、ｑＲＴ－ＰＣＲによって定量化した。結果を、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表す。異なるマウス組織とＨ５２６を移植した腫瘍の間のｍｉＲＮＡレベルを比較するために、独立スチューデントｔ検定を実行した。移植した腫瘍と比較して、＊、ｐ＜０．０５；＃、ｐ＜０．０１。これらのデータは、ｍｉＲ－１４５及びｍｉＲ－１４３のレベルが、正常なマウス組織と比較して、移植したＳＣＬＣで有意に低いことを示している。まとめると、これらの結果は、ｍｉＲ－ＣＶＢ３が、心毒性が実質的に低下したマウス異種移植モデルで腫瘍増殖を阻害する能力を維持していることを示している。

【実施例7】

【0055】

追加のｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３の構築及び免疫適格マウスモデルでのｉｎｖｉｖｏ試験
ｍｉＲ１４５の標的配列の４つのコピーとｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３、またはｍｉＲ－２１６の標的配列の２～４個のコピーを、ＣＶＢ３ゲノムの５’ＵＴＲに挿入することにより、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ａ、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｂ、及びｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｃとして示される３つの追加の組換えｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３ベクターを構築した（図９Ａを参照のこと）。

【0056】

約４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、野生型ＣＶＢ３（ｎ＝３）、ｍｉＲ－ＣＶＢ３（ｎ＝３）、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ａ（ｎ＝３）、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｂ（ｎ＝３）、またはｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｃ（ｎ＝３）を、１×１０⁸ＰＦＵで単回腹腔内接種するか、またはＰＢＳ（ｎ＝３）で１４日間シャム（擬似）感染させた。野生型ＣＶＢ３及びｍｉＲ－ＣＶＢ３を接種したマウスで体重の減少が観察されたが、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ａ、ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｂ、またはｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｃを接種したマウスは、ＰＢＳ対照を接種したマウスと同様の速度で体重が増加し続けた（図９Ｂを参照のこと）。興味深いことに、１２日で人道的なエンドポイントに到達して安楽死させなければならなかった野生型ＣＶＢ３処置マウスとは極めて対照的に、ｍｉＲ改変ＣＶＢ３ベクターのいずれかで処置したマウスは、１４日後に毒性の徴候を示さなかった（図９Ｃを参照のこと）。Ｈ＆Ｅ染色のためにマウスの臓器を採取し、各動物の心臓、肺、膵臓、肝臓、及び脾臓から単離した組織に病理学的スコアを割り当て、膵臓で最も高い病理学的スコアが観察された（図９Ｄを参照のこと）。

【実施例8】

【0057】

多重ｍｉＲＮＡ調節ＣＶＢ３変種のｉｎｖｉｔｒｏ心毒性
ｍｉＲ－１４５標的配列の４つのコピーのみ（順方向または逆方向のいずれかで）、またはｍｉＲ－１４３標的配列の２つのコピーと組み合わせて、ＣＶＢ３ゲノムの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに挿入されたいくつかのｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３を作製した。マウスＨＬ－１心筋細胞に対し、シャム（擬似）感染させるか、または野生型ＣＶＢ３もしくは様々な改変ＣＶＢ３を異なるＭＯＩで７２時間接種した。図１１Ａに示すように、細胞毒性をクリスタルバイオレット染色によって評価した。図１１Ｂに示すように、細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイによって測定した（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。ｍｉＲ－１４５の４つのコピーとｍｉＲ－１４３標的配列の２つのコピーを、ＣＶＢ３ゲノムの５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲのいずれかに挿入したｍｉＲＮＡ調節ＣＶＢ３は、ｉｎｖｉｔｒｏで最小の心毒性を示した。これらの結果に基づいて、ｍｉＲ－１４５／１４３（５’ＵＴＲ）－ＣＶＢ３（本明細書中ではｍｉＲ－ＣＶＢ３と表記）をさらなる試験のために選択した。

【実施例9】

【0058】

追加のｍｉＲＮＡ標的配列によるＣＶＢ３の改変は、免疫適格マウスにおける野生型ＣＶＢ３誘発性の心毒性と膵臓毒性の両方をさらに低下させる
本実験では、約４週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、ＰＢＳ（シャム、ｎ＝５）、野生型ＣＶＢ３（１×１０⁸ＰＦＵ、ｎ＝５）、またはｍｉＲ１４５／１４３－ＣＶＢ３（１×１０⁸ＰＦＵ、ｎ＝５）を単回腹腔内接種した。Ｈ＆Ｅ染色のために１２日目にマウスの臓器を採取した（図１２Ａ）。様々なマウス臓器及びヒトＳＣＬＣＨ５２６細胞由来腫瘍におけるｍｉＲ－１及びｍｉＲ２１６のレベルをＲＴ－ＰＣＲで測定した（図１２Ｂ）。図１２Ｃに示すように、新規ｍｉＲ－ＣＶＢ３を構築した。ｍｉＲ－１４５とｍｉＲ－１４３は腫瘍抑制性であり、一方、ｍｉＲ－１は筋肉組織において豊富であり、ｍｉＲ－２１６は膵臓で特異的に発現する。これらの配列は、マウスとヒトの間で１００％の相同性を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに上記のようにｍｉＲ１４５／１４３／１／２１６－ＣＶＢ３（ｎ＝３）を注射し、Ｈ＆Ｅ染色のために処置後１４日目に臓器を回収した（図１２Ｄ）。図１２Ａ及び１２Ｄに示すＨ＆Ｅ染色の病理学的スコアを図１２Ｅに示す。野生型ＣＶＢ３群と比較して、＊、ｐ＜０．０５；＃、ｐ＜０．０１。生存率のカプランマイヤープロットを図１２Ｆに示す。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに上記のように様々なタイプのＣＶＢ３を注射し、ウイルスタンパク質ＶＰ１のＩＨＣ染色（図１３Ａ）及び様々な臓器または血液中のウイルスＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ分析のために、処置後１３～１４日目に臓器を回収した（図１３Ｂ）。

【実施例10】

【0059】

ｍｉＲＮＡ１４５／１４３／１／２１６－ＣＶＢ３は、野生型ＣＶＢ３と同等のレベルでＳＣＬＣ細胞を強力に死滅させる
ＴＰ５３^mut／Ｒｂ１^mutＳＣＬＣ細胞株（Ｈ５２４及びＨ５２６）を、示されるように、擬似処理するか、または野生型ＣＶＢ３もしくはｍｉＲ１４５／１４３／１／２１６－ＣＶＢ３に異なるＭＯＩで７２時間感染させた。細胞生存率を、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を介して評価した。野生型ＣＶＢ３と比較して、＊、ｐ＜０．０５（図１４Ａ）。トランスジェニックマウスから単離されたマウスＴＰ５３^-/-／Ｒｂ１^-/-／ＰＴＥＮ^-/-ＳＣＬＣ細胞を上記のように処置し、クリスタルバイオレット染色によって細胞毒性を評価した（図１４Ｂ）。

【実施例11】

【0060】

ｍｉＲＮＡ改変ＣＶＢ３は、様々なマウス腫瘍細胞を効率的に死滅させる
本実験で使用する様々なマウス腫瘍細胞株、がんの種類、及び宿主情報を図１５Ａに示す。細胞株をシャム（擬似）感染させるか、またはｍｉＲ１４５／１４３－ＣＶＢ３に様々なＭＯＩで７２時間感染させた後、クリスタルブルー染色を行った（図１５Ｂ）。図１５Ｃに示すように、３つのｍｉＲ－ＣＶＢ３（ｍｉＲ－１４５／１４３－ＣＶＢ３（図９Ａでは「ｍｉＲ－ＣＶＢ３」と呼ばれる）、ｍｉＲ－１４５／１４３／１３３／２１６－ＣＶＢ３（図９Ａでは「ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｃ」と呼ばれる）、ｍｉＲ－１４５／１４３／１／２１６－ＣＶＢ３（図９Ａでは「ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ｂ」と呼ばれる）、及びｍｉＲ－１４５／１４３／２１６－ＣＶＢ３（図９Ａでは「ｍｉＲ－ＣＶＢ３－Ａ」と呼ばれる）を構築した。

【0061】

ヒトＫＲＡＳ^mutＨ２３細胞及び上記の様々なマウス腫瘍細胞株を、シャム（擬似）感染させるか、またはＭＯＩ０．１、１、もしくは１０で７２時間、様々なｍｉＲ－ＣＶＢ３に感染させた後、クリスタルバイオレット染色を行った（図１５Ｄ）。
本明細書において、本発明を広範かつ一般的に説明した。全般的開示の範囲内に含まれるより狭い種及び亜属種も、それぞれ本発明の一部を形成する。これには、本発明の全般的説明に、除外される材料が本明細書中に具体的に記載されているか否かに関わらず、その属から任意の対象を除外するという条件または否定的限定が付く場合も含まれる。

【0062】

本明細書中及び添付の特許請求の範囲中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含み、用語「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」、あるいは「Ｘ」と「Ｙ」の両方を意味し、名詞に続く文字「ｓ」は、その名詞の複数形と単数形の両方を示すむことも理解されたい。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュグループで記載される場合、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー及び任意の部分群もまた、本発明に包含され、それによって記載されることが意図されており、また、当業者はそのことを認識するであろう。出願人は、マーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループを具体的に参照するために本出願または特許請求の範囲を改訂する権利を留保する。
本明細書中で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、制限することを意図しないことを理解されたい。本明細書中で具体的に定義されない限り、本明細書中で使用する用語は、関連技術で知られているようなその伝統的な意味を与えられるべきであることをさらに理解すべきである。

【0063】

本明細書全体を通して、「一実施形態（ｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態（ａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」及びその変形への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書全体を通して、様々な箇所において出現する語句「一実施形態では（ｉｎｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態では（ｉｎａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」は、必ずしもすべて同一の実施形態を参照するものではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴を、１つ以上の実施形態において任意の好適な方法で組み合わせてもよい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容及び文脈により別様に明確に示されない限り、複数形の指示対象、すなわち１つ以上を含む。また、接続詞「及び」及び「または」は、包括性または排他性を内容及び文脈により明確に別様に示されない限り、場合により、一般的に「及び／または」を含む最も広い意味で使用されることに留意すべきである。したがって、選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の一方、両方またはその任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解すべきである。さらに、本明細書中で「及び／または」として記載される場合の「及び」及び「または」の構成は、関連する項目またはアイデアのすべてを含む実施形態、及び関連する項目またはアイデアのすべてより少ないものを含む１つ以上の他の代替の実施形態を包含することを意図する。

【0064】

文脈上別段の定めがない限り、本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのその同義語及び変形、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、非限定的かつ包括的な意味、例えば、「含むがこれに限定されない」で解釈されるべきである。用語「～から本質的になる」は、特許請求の範囲を、特定した材料もしくはステップに、または請求項にかかる発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
本明細書内で使用される見出しは、読者によるレビューを促進するためにのみ使用されており、いかなる方法によっても本発明または特許請求の範囲を制限するものと解釈すべきではない。したがって、本明細書中で提供する見出し及び開示の要約は、便宜上のものであり、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

【0065】

本明細書中に値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別様に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。表示範囲が一方または両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

【0066】

例えば、本明細書中に提供する任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に別段の指定のない限り、言及される範囲内の任意の整数の値を含み、必要に応じて、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特性に関連して本明細書に記載される任意の数の範囲は、特に明記しない限り、記載される範囲内の任意の整数を含むものと理解されるべきである。本明細書中で使用する場合、用語「約」とは、特に明記しない限り、示される範囲、値、または構造の±２０％を意味する。

【0067】

本明細書中で言及され、及び／または出願データシートに記載される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。そのような文書は、例えば、刊行物に記載された材料及び方法論を記載及び開示する目的で参照により援用され得、本発明に関連して使用され得る。上記及び本文全体を通して考察された刊行物は、単にそれらの開示が本出願の出願日以前であるために提供される。本明細書におけるいずれの内容も、先行発明により任意の参照される刊行物に先行する資格がないことを発明者らが認めるものと解釈されるべきではない。

【0068】

本明細書中で参照または言及されるすべての特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、及び他の文献及び資料は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示し、そのような参照される各文献及び資料は、あたかもその全体が参照により個別に援用されたか、またはその全体が本明細書に記載されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。出願人は、そのような特許、刊行物、科学論文、ウェブサイト、電子的に入手可能な情報、及び他の参照資料または文献からの任意及びすべての資料及び情報を本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。

【0069】

一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える均等物の全範囲とともに、すべての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
さらに、本特許明細書部分には、すべての請求項が含まれる。さらに、すべてのオリジナル請求項及び任意及びすべての優先権書類に由来するすべての請求項を含むすべての請求項は、その全体が参照により本明細書の書面による明細書部分に援用され、出願人は書明細書、または本出願の任意の他の部分、任意及びすべてのそのような請求項に物理的に組み込む権利を留保する。したがって、例えば、いかなる場合でも、特許は、請求項の寸分違わぬ用語が、特許の明細書部分においてこれらの言葉で記載されていないという主張に基づいて、請求項に関する書面による記載を提供していないものとして申し立てるように解釈すべきではない。

【0070】

請求項は、法律に従って解釈される。しかしながら、任意の請求項またはその部分の解釈の容易さまたは困難さの申し立てまたは認識にかかわらず、いかなる場合でも、本発明に繋がる本出願の遂行中における請求項またはその任意の部分のいかなる調整または補正も、本特許が、先行技術の一部を形成しないその任意及びすべての均等物に対するいかなる権利をも喪失したことと解釈すべきではない。

【0071】

他の非限定的な実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。本特許は、本明細書中で具体的に及び／または明示的に開示される特定の実施例または非限定的な実施形態または方法に限定されると解釈すべきではない。いかなる場合でも、本特許は、特許及び商標局のいずれかの審査官またはいずれかの他の職員もしくは被雇用者によりなされるいずれかの言明によって、その言明が出願人による応答書面内に具体的かつ但し書きまたは留保なしに明白に採用されない限り、限定されるものと解釈すべきではない。

【図1】