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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-13
(54)【発明の名称】ウイルスベクター産生のための効力アッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20221005BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221005BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20221005BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20221005BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20221005BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20221005BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20221005BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20221005BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70 ZNA
C12Q1/02
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022507623
(86)(22)【出願日】2020-08-07
(85)【翻訳文提出日】2022-03-07
(86)【国際出願番号】 US2020045423
(87)【国際公開番号】W WO2021026461
(87)【国際公開日】2021-02-11
(31)【優先権主張番号】62/884,252
(32)【優先日】2019-08-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】398050098
【氏名又は名称】バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】フェスチェンコ， マリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ベルゲルソン， スヴェトラーナ
(72)【発明者】
【氏名】レイム， アンソニー クリストフ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR77
4B063QR79
4B063QS33
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065AA95X
4B065AA97X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、組換えウイルスベクターによってコードされるペイロードの効力を決定するための高感度かつロバストなアッセイを提供する。特に、本開示は、脊髄性筋萎縮症の治療のために使用される組換えウイルスベクターによって発現されるＳＭＮポリペプチドの効力を決定するためのアッセイを提供する。本明細書は、とりわけ、組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）、例えば、相対的効力を決定するための方法を包含する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターの効力を決定する方法であって、（ａ）前記組換えウイルスベクターを用いて改変宿主細胞を形質導入することであって、前記改変宿主細胞が、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して前記ＳＭＮポリペプチドの発現の低下を含む、前記形質導入することと、
（ｂ）前記改変宿主細胞を、前記ＳＭＮポリペプチドの検出のための第１の薬剤と接触させることと、
（ｃ）前記改変宿主細胞を、前記第１の薬剤の検出のための検出部位を含む第２の薬剤と接触させることと、
（ｄ）コイル小体対（ＧＥＭ）の存在を検出し、それによって、前記少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドの効力を決定することと、を含む、前記方法。
【請求項2】
前記組換えウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのバリアントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶｈｕ６８を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＡＶベクターが、ニワトリ－βアクチンプロモーター（ＣＢ７）に作動可能に連結されたＳＭＮ１遺伝子を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
前記ＡＡＶベクターが、前記ＳＭＮ１遺伝子に隣接する２つのＩＴＲを含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＡＡＶベクターが、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記改変宿主細胞が、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記改変宿主細胞が、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンのための少なくとも１つのｓｈＲＮＡを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも１つのｓｈＲＮＡが、（ｉ）ｓｈＲＮＡ１２０もしくはｓｈＲＮＡ１２８を含む、及び／または
（ｉｉ）前記組換えウイルスベクターを標的としない、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記改変宿主細胞が、哺乳類宿主細胞を含むか、または哺乳類宿主細胞である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記改変宿主細胞が、ヒト細胞を含むか、またはヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記改変宿主細胞が、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を含むか、またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記改変宿主細胞が、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を含むか、またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
形質導入の前に、（ｉ）宿主細胞が、少なくとも１回凍結され、解凍される、
（ｉｉ）宿主細胞が、少なくとも３回継代される、
（ｉｉｉ）宿主細胞が、ドキシサイクリンで処理される、及び／または
（ｉｖ）宿主細胞が、約５．０×１０３～約５．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種される、のうちの１つ以上が生じる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記改変宿主細胞が、２４時間以内に播種され、形質導入される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
形質導入工程（ｂ）が、段階希釈によって達成される約５つの異なるＭＯＩで実施される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記形質導入工程（ｂ）が、約６．１×１０５ＶＧ／細胞～約４×１０６ＶＧ／細胞のＭＯＩで実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
シグナル対ノイズ比が、約２．５超であるか、または約２．５である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記第１の薬剤が、抗ＳＭＮ１抗体もしくはその抗原結合断片、またはアプタマーを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記検出部分が、蛍光標識、比色標識、もしくは酵素標識を含むか、またはそれらである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記第２の薬剤が、蛍光標識二次抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ＧＥＭの存在が、免疫蛍光によって検出される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＧＥＭの存在が、イメージングによって検出される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記イメージングが、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）を含むか、またはそれである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記方法が、少なくとも１つのヘルパー機能を使用せずに、または実質的に使用せずに実施される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記少なくとも１つのヘルパー機能が、Ａｄ２またはＡｄ５ヘルパーウイルスを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
同じ型または異なる型の非改変基準宿主細胞による形質導入よりも少ない量の組換えウイルスベクターが、形質導入に必要である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記方法が、低標準偏差を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
効力が、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の正確度で決定される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
効力が、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の精度で決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記方法が、例えば、前記組換えウイルスベクターの温熱ストレスに続いて、前記組換えウイルスベクターの安定性を示す、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記組換えウイルスベクターの効力が、中空カプシドの存在によって影響を受けない、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記組換えウイルスベクターが、複数の中空ウイルスカプシドを含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８８４，２５２号に対する優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８８４，２５２号に対する優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ウイルスベクター媒介遺伝子治療は急速に発展している治療分野である。治療用ウイルスベクターの多くの側面は、治療として使用する前に安全性及び有効性を決定するために評価される必要がある。
【0003】
したがって、組換えウイルスベクターの効力を決定するための改善された方法が依然として必要とされている。特に、組換えウイルスベクターによって発現されるポリペプチド等のペイロードの効力の改善された決定を可能にする方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
本明細書は、とりわけ、組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）、例えば、相対的効力を決定するための方法を包含する。本明細書に記載の方法は、組換えウイルスベクターによって発現されるペイロード（例えば、ＳＭＮポリペプチド等のポリペプチド）の効力を決定するための従来の方法よりも改善された特徴を有する。いくつかの実施形態において、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、少なくとも１つのペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現が低下した改変宿主細胞の使用により、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの効力アッセイの改善が可能になる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用される改変宿主細胞（例えば、ヒト改変宿主細胞、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞）は、他の型の宿主細胞（例えば、初代細胞及び／または非ヒト哺乳類細胞、例えば、マウス細胞）よりも生理学的に関連性が高く、及び／または培養しやすい。いくつかの実施形態において、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞は、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）内に、例えば、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）に対する阻害性核酸、例えば、ＳＭＮ１に対するｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＭＮ１遺伝子に対するドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８）を含むか、または発現するノックダウン（例えば、構成的または条件付き）を含む。
【0005】
そのような改善された特徴としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）方法は、ヘルパー機能（例えば、Ａｄ２またはＡｄ５ヘルパーウイルス）を使用せずに完全に実施し得る、（ｉｉ）同じ型もしくは異なる型の非改変基準宿主細胞での形質導入よりも少ない量の組換えウイルスベクターが、形質導入に必要とされ得る、（ｉｉｉ）方法は、低標準偏差を有する、（ｉｖ）約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくはそれ以上の正確度で効力を測定し得る、（ｖ）約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、もしくは約１０％の精度で効力を決定し得る、（ｖｉ）方法は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの安定性を、例えば、組換えウイルスベクターの温熱ストレスに続いて示し得る、（ｖｉｉ）本明細書に記載の組換えウイルスベクターの効力は、中空カプシドの存在によって影響を受けない、及び／または（ｖｉｉｉ）改変宿主細胞株（例えば、ＳＭＮ遺伝子（例えばＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）内にノックダウン（例えば構成的または条件付き）を含み、例えば、ＳＭＮ遺伝子（例えばＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）に対する阻害性核酸、例えばＳＭＮ１に対するｓｈＲＮＡ（例えばＳＭＮ１遺伝子に対するドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８）を含むかもしくは発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞）の選択により高いシグナル対ノイズを達成することが可能である。
【0006】
一態様において、本開示は、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドをコードする組換えウイルスベクターの効力を決定する方法であって、（ａ）組換えウイルスベクターを用いて改変宿主細胞を形質導入することであって、改変宿主細胞が、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドの発現の低下を含む、形質導入することと、（ｂ）改変宿主細胞を、ＳＭＮポリペプチドの検出のための第１の薬剤と接触させることと、（ｃ）改変宿主細胞を、第１の薬剤の検出のための検出部分を含む第２の薬剤と接触させることと、（ｄ）コイル小体対（ＧＥＭ）の存在を検出し、それによって、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドの効力を決定することと、を含む、方法を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｈｕ６８を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ニワトリ－βアクチンプロモーター（ＣＢ７）に作動可能に連結されたＳＭＮ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＳＭＮ１遺伝子に隣接する２つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルを含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンまたはノックアウトを含む。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンのための少なくとも１つのｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｓｈＲＮＡは、（ｉ）ｓｈＲＮＡ１２０もしくはｓｈＲＮＡ１２８を含み、及び／または（ｉｉ）本明細書に記載の組換えウイルスベクターを標的としないか、または影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、哺乳類宿主細胞を含むか、または哺乳類宿主細胞である。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ヒト細胞を含むか、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を含むか、またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を含むか、またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞である。
【0009】
いくつかの実施形態において、形質導入の前に、（ｉ）宿主細胞は少なくとも１回凍結され、解凍される、（ｉｉ）改変宿主細胞は少なくとも３回継代される、（ｉｉｉ）宿主細胞は（例えば、ＳＭＮ遺伝子のノックダウンを誘導するために）ドキシサイクリンで処理される、及び／または（ｉｖ）宿主細胞は、約５．０×１０３～約５．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種される、のうちの１つ以上が生じる。
【0010】
いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、２４時間以内に播種及び形質導入される。いくつかの実施形態において、形質導入工程は、段階希釈によって達成される約５つの異なるＭＯＩで実施される。いくつかの実施形態において、形質導入工程（ｂ）は、約６．１×１０５ＶＧ／細胞～約４×１０６ＶＧ／細胞（例えば、約６．１×１０５ＶＧ／細胞、約９．８×１０５ＶＧ／細胞、約１．６×１０６ＶＧ／細胞、約２．５×１０６ＶＧ／細胞、及び約４×１０６ＶＧ／細胞）のＭＯＩで実施される。いくつかの実施形態において、シグナル対ノイズ比は、約２．５超であるか、または約２．５である。
【0011】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、抗ＳＭＮ１抗体もしくはその抗原結合断片、またはアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、検出部分は、蛍光標識、比色標識、または酵素標識を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、蛍光標識二次抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、免疫蛍光によって検出される。いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、イメージングによって検出される。いくつかの実施形態において、イメージングは、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）を含むか、またはそれである。
【0012】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのヘルパー機能を使用せずに、または実質的に使用せずに実施される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヘルパー機能は、Ａｄ２またはＡｄ５ヘルパーウイルスを含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、同じ型または異なる型の非改変基準宿主細胞による形質導入よりも少ない量の組換えウイルスベクターが、形質導入に必要とされる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、低標準偏差を有する。
【0014】
いくつかの実施形態において、効力は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の正確度で決定される。いくつかの実施形態において、効力は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の精度で決定される。
【0015】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、例えば、組換えウイルスベクターの温熱ストレスの後に組換えウイルスベクターの安定性を示す。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの効力は、中空カプシドの存在によって影響を受けない。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、複数の中空ウイルスカプシドを含む。
【0016】
本明細書における刊行物、特許、または特許出願の任意の引用は、それらの全体が参照により組み込まれる。本出願において、約／およその有無にかかわらず使用される任意の数字は、関連技術分野の当業者によって理解される任意の通常の変動を包含することを意味する。
【0017】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、本発明の実施形態を示す一方で、詳細な説明は、限定ではなく単なる例示として与えられることを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【0018】
以下に記載する図は、一緒に図面を構成するものであり、限定のためではなく、例示のみを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】ＨｅＬａ－ＲＣ３２細胞におけるＧＥＭ検出の高いばらつきを示す。ＨｅＬａ－ＲＣ３２細胞を９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（１×１０６～３．１×１０４ＶＧ／細胞）及びヒトアデノウイルス５の滴定曲線での同時感染の２４時間前に、細胞を５０のＭＯＩで播種した。細胞を、２日間感染させ、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図2】ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２０及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２８ＤＯＸ処理細胞におけるＳＭＮ１のノックダウンを示す。未処理細胞をトリプシン化し、遠心分離し、次いで６ウェルプレート当たり１×１０６細胞で播種し、または－７０℃で凍結した（Ｔ＝０）。播種した細胞を、収集の３及び７日前にＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）で処理した。収集した細胞をＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離し、ペレットを－７０℃で凍結した。Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システム（Ｌｉ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、メーカーのプロトコルに従ってウエスタンブロッティングを実施した。免疫ブロットから定量化したデータを、ローディング対照：チューブリンによって正規化した。
【図3】ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞の細胞継代と形成されたＧＥＭの数との間の相関を示す。１１、１５及び２５継代（左パネル）の細胞ならびに４、７及び１５継代（右パネル）の細胞をＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）で３日間処理し、凍結した。１×１０４の解凍細胞を、感染前に２４時間、ＴＣ処理９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。細胞を、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（４×１０６～６．１×１０５ＶＧ／細胞）の滴定曲線で２日間感染させ、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって検出した。
【図4】培養したＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞と「解凍及び開始（ｔｈａｗ－ａｎｄ－ｇｏ）」ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞との比較を示す。２×１０４の培養下細胞または「解凍及び開始」細胞を、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。細胞を、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（２×１０６～６．２５×１０４ＶＧ／細胞）の滴定曲線で感染の２４時間前にプレーティングした。細胞を、２日間感染させ、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図5】ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞の最適な細胞密度の決定を示す。ＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）で前処理した解凍ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞を、以下の密度でプレーティングした：（Ａ）２、２．５及び３×１０４細胞／ウェル、（Ｂ）１．５及び２×１０４細胞／ウェル、ならびに（Ｃ）１×１０４細胞／ウェル、及びｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の１：２（Ａ及びＢ）または１：１．５（Ｃ）の段階希釈液のいずれかで感染させた。細胞を、２日間処理し、次いで固定し、ＴＤ－ＴＤＭＰ－９９０に記載のようにＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図6】アッセイ性能に対するＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞の感染の長さの影響を示す。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（２×１０６～２．１×１０４ＶＧ／細胞）の滴定曲線での感染の２４時間前に、２×１０４細胞／ウェルをＴＣ処理９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、感染後４８または７２時間後に固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図7】ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１によるＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞の同日対翌日の処理を示す。１×１０４細胞／ウェルをＴＣ処理９６ウェルプレートにプレーティングした。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（４×１０６～６．１×１０５ＶＧ／細胞）の滴定曲線での感染の前に、細胞を６時間または２４時間播種した。細胞を、２日間インキュベートし、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図8】ヒトアデノウイルス５の有無にかかわらず、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞感染を示す。２×１０４の培養下細胞を、ＰＤＬでコーティングした９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（１×１０６～３．１×１０４ＶＧ／細胞）－ヒトアデノウイルス５の滴定曲線での感染前に２４時間、細胞を５０のＭＯＩで播種した。細胞を、２日間感染させ、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図9】４℃及び室温でのＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞固定の比較を示す。ＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）で前処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞を１×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１で１：１．６の段階希釈で感染させた。細胞を２日間処理し、次いで４℃または室温で２０分間４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で固定して、ＳＭＮを染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図10】ブロッキングバッファーの比較を示す。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を１×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートのウェルごとに播種し、翌日ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１で２日間感染させた。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を、ＬＩ－ＣＯＲブロッキング試薬または５％ＮＧＳ／ＰＢＳ中で１時間ブロックし、次いでＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングによって評価した。
【図11】効力アッセイが再現可能であることを示す。２×１０４の培養下ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を、ポリＤ－リジン（ＰＤＬ）コーティングした９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（２×１０６～６．２５×１０４ＶＧ／細胞）の滴定曲線での感染前に２４時間細胞を播種した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を、２日間感染させ、次いで固定し、ＳＭＮについて染色した。ＧＥＭ／細胞の数を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用したハイコンテントイメージングにより評価した。
【図12】ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１効力に対する中空粒子の効果を示す。ＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）で前処理したＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈ１２０細胞を１×１０４細胞／ウェルでプレーティングし、ウェルごとにｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（４×１０６ＶＧ／細胞）及び中空ＡＡＶｈｕ６８粒子を１：１及び１：３の最終的な完全粒子：中空粒子比で感染させた。カプシドの混合を、ＡＡＶ９カプシド力価に基づいて実施した。
【図13A】１：１のアセトン：メタノール固定後のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞（ｓｈＲＮＡ１２０によるノックダウン）におけるＧｅｍｉｎ２－ＳＭＮ１染色の例示的な画像を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用して示す。マージされた画像は、ＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２の重複するシグナルを示す。
【図13B】１：１のアセトン：メタノール固定後のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞（ｓｈＲＮＡ１２０によるノックダウン）におけるＧｅｍｉｎ２－ＳＭＮ１染色の例示的な画像を、ＣＸ５ ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔを使用して示す。マージされた画像は、ＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２の重複するシグナルを示す。
【図14】ＳＭＮ１抗体が細菌精製ＳＭＮタンパク質を特異的に検出することを示す。１００及び２００ｎｇの精製ＳＭＮタンパク質ならびに２００ｎｇの非関連タンパク質（ＲＳ１）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、ＳＭＮ１抗体でブロットした。Ｍｏｎｏ．：モノクローナル抗体、ｐｏｌｙ．：ポリクローナル抗体、Ｉ．Ｂ．：免疫ブロット。
【図15】ウエスタンブロットによるＳＭＮ１抗体の特異性及び感受性の試験を示す。５０ｎｇの細菌精製ＳＭＮタンパク質または５０ｎｇのＨＥＫ２９３Ｔ全細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、上記の表に記載のＳＭＮ１抗体を４℃で一晩ブロットした。Ｎ．Ｂ．：Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｔ．Ｆ．：Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、ｍｏｎｏ．：モノクローナル抗体、ｐｏｌｙ．：ポリクローナル抗体、Ｉ．Ｂ．：免疫ブロット。
【発明を実施するための形態】
【0020】
定義
本出願において、文脈から別途明確でない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉ）「または」という用語は、「及び／または」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それら自体によって提示されるか、または１つ以上の追加の構成要素もしくは工程と共に提示されるかにかかわらず、項目化された構成要素または工程を包含すると理解されてもよく、（ｉｖ）「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、標準的な変動を可能にすると理解されてもよく、（ｖ）範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。
本出願において、文脈から別途明確でない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉ）「または」という用語は、「及び／または」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それら自体によって提示されるか、または１つ以上の追加の構成要素もしくは工程と共に提示されるかにかかわらず、項目化された構成要素または工程を包含すると理解されてもよく、（ｉｖ）「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように、標準的な変動を可能にすると理解されてもよく、（ｖ）範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。
【0021】
約またはおよそ：本明細書で使用される場合、数値に関する「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数値が可能な値の０％未満または１００％を超える場合を除いて）、数値のいずれかの方向（それを超えるまたはそれ未満）で５％、１０％、１５％、または２０％の範囲内に入る数値を含むと一般的に理解される。
【0022】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原に特異的結合を付与するのに十分な標準的免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で知られているように、自然界で産生されるインタクトな抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）で構成されるおよそ１５０ｋＤの四量体作用物質であり、これらは、一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものに互いに会合する。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（それぞれ約１１０アミノ酸長）－アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）と、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの茎の基部に位置する）とで構成されている。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りに接続する。このヒンジ領域における２つのジスルフィド結合は、インタクトな抗体において、２つの重鎖ポリペプチドを互いに接続する。各軽鎖は、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、続いて別の「スイッチ」によって互いに分離されるカルボキシ末端定数（ＣＬ）ドメインという２つのドメインで構成されている。インタクトな抗体四量体は、重鎖及び軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結されている２つの重鎖－軽鎖二量体で構成されており、２つの他のジスルフィド結合は、重鎖ヒンジ領域を互いに接続しているため、二量体は互いに接続され、四量体が形成される。自然に産生される抗体も、典型的にはＣＨ２ドメイン上でグリコシル化される。自然抗体内の各ドメインは、圧縮された反平行ベータバレル内に互いに詰め合わさった２つのベータシート（例えば、３本鎖、４本鎖、または５本鎖シート）から形成された「免疫グロブリン折り畳み」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、ならびに４つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含有する。自然抗体が折り畳まれるとき、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域は、三次元空間に集約され、それらは、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を作製する。自然発生の抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、例えば、細胞毒性を媒介するエフェクター細胞を含む、エフェクター細胞上の受容体にも結合する。当該技術分野で知られているように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／または他の結合属性は、グリコシル化または他の改変を介して調節され得る。いくつかの実施形態において、本発明に従って産生及び／または利用される抗体は、そのようなグリコシル化を改変または操作したＦｃドメインを含む、グリコシル化Ｆｃドメインを含む。本発明の目的のために、ある特定の実施形態において、自然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが自然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される）か、または組換え工学、化学合成、または他の人工系もしくは方法論によって産生されるかにかかわらず、「抗体」と称され、及び／または「抗体」として使用され得る。いくつかの実施形態において、抗体はポリクローナルであり、いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態において、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体の特徴である定常領域配列を有する。いくつかの実施形態において、抗体配列要素は、当該技術分野で知られているように、ヒト化、霊長類化、キメラ等である。さらに、本明細書で使用される場合「抗体」という用語は、適切な実施形態において（別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り）、代替の提示において抗体の構造的特徴及び機能的特徴を利用するための、当該技術分野で既知のまたは開発された構築物もしくは形式のいずれかを指すことができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明に従って利用される抗体は、インタクトなＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重または多重特異的抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそれらのセット等の抗体断片、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそれらの断片等のサメ単一ドメイン抗体）、カメロイド抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））、小型モジュラー免疫薬剤（ＳＭＩＰ（商標））、単一鎖またはタンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒａｎｓｂｏｄｙ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（登録商標）、及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるが、限定されない形式である。いくつかの実施形態において、抗体は、それが自然に産生される場合にもたらされる共有結合改変（例えば、グリカンの結合）を欠いてもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、共有結合改変（例えば、グリカン、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分等］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコール等］の付着）を含有してもよい。
【0023】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」及び「ＡＡＶ」という用語は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科及びＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属のウイルス粒子の全体または一部を指す。ＡＡＶは、小さな複製欠損、非エンベロープウイルスである。ＡＡＶには、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３（血清型３Ａ及び３Ｂを含む）、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ血清型１０、ＡＡＶ血清型１１、ＡＡＶ血清型１２、ＡＡＶ血清型１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、及び上記のいずれかの任意のバリアントが含まれるが、これらに限定されない。野生型ＡＡＶは複製欠損であり、複製するためには典型的には、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペス、またはワクシニアウイルスによる細胞の同時感染を必要とする。
【0024】
アプタマー：本明細書で使用される場合、「アプタマー」という用語は、特定の分子標的（例えば、ＳＭＮポリペプチド）にしっかりと結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）から構成される巨大分子を指す。特定のアプタマーは、直鎖ヌクレオチド配列によって記載されることができ、典型的には、長さが約１５～６０ヌクレオチドである。いかなる理論に拘束されることを望むものではないが、アプタマーにおけるヌクレオチド鎖は、分子を複雑な三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成し、この三次元形状によって、アプタマーがその標的分子の表面にしっかりと結合することが可能になることが企図される。すべての可能なヌクレオチド配列の領域内に存在する分子形状の驚異的な多様性を考えると、アプタマーは、タンパク質及び小分子を含む多様な分子標的について得られ得る。高度の特異性に加えて、アプタマーは、典型的には、標的に対して非常に高い親和性（例えば、タンパク質に対するピコモル～低ナノモルの範囲の親和性）を有する。多くの実施形態において、アプタマーは化学的に安定であり、活性が低下することなく煮沸または凍結され得る。合成分子であるため、アプタマーは、特定の用途のためにその機能を最適化することができる様々な改変を受けやすい。例えば、アプタマーは、インビボ用途での使用のために、血液中の酵素による分解に対するそれらの感受性を劇的に低減させるように改変され得る。加えて、アプタマーは、それらの生体内分布または血漿滞留時間を変更するように改変され得る。
【0025】
含む：１つ以上の指名された要素または工程を「含む」として本明細書に記載される組成物または方法は、オープンエンドであり、指定された要素または工程が必須であるが、他の要素または工程が組成物または方法の範囲内で追加され得ることを意味する。冗長を避けるために、１つ以上の指定された要素または工程を「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（または「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））として記載される任意の組成物または方法は、同じ指定された要素または工程「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（または「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）対応する、より限定された組成物または方法も記載することも理解され、組成物または方法が、指定された必須の要素または工程を含み、組成物または方法の基本的及び新規特徴（複数可）に実質的に影響を与えない追加の要素または工程も含み得ることを意味する。また、１つ以上の指定された要素または工程を「含む」または「から本質的になる」として本明細書に記載される任意の組成物または方法は、任意の他の指定されてない要素または工程を除外して、指定された要素または工程「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」（または「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ））対応する、より限定され、かつクローズエンドの組成物または方法を記載することも理解される。本明細書に開示される任意の組成物または方法において、任意の指定された必須の要素または工程の既知または開示された均等物は、その要素または工程に対して置換し得る。
【0026】
検出部分：本明細書で使用される場合「検出部分」という用語は、検出可能な任意の元素、分子、官能基、化合物、断片または部分を指す。いくつかの実施形態において、検出部分は、単独で提供されるか、または利用される。いくつかの実施形態において、検出部分は、別の薬剤（例えば抗体またはその抗原結合断片）に会合して（例えば結合して）提供及び／または利用される。検出部位の例としては、様々な蛍光色素（例えば、蛍光体（例えば、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ４８８、またはＤｙＬｉｇｈｔ４８８）、蛍光色素、アクリジン色素、ＳＹＢＲ色素、ローダミン色素、オキサジン色素等）、リガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒ等）、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタン等）、電気化学発光剤（例えば、Ｓｕｌｆｏ Ｔａｇ等）、生物発光剤（例えば、ルシフェリン）、スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（例えば、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、または白金）、ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼ）、比色標識（例えば、色素またはコロイド金）、ビオチン、ジオキシゲニン、ハプテン、及び抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能であるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
決定する：本明細書に記載の多くの方法は、「決定する」工程を含む。当業者は、本明細書を読めば、そのような「決定すること」が、例えば、本明細書で明示的に言及される特定の技法を含む、当業者に利用可能な様々な技法のうちのいずれかの使用を利用するか、またはそれを通じて達成することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、決定することは、物理的な試料の操作を伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、例えば、関連する分析を実施するように適合させたコンピュータまたは他の処理装置を利用して、データまたは情報の考察及び／または操作を伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、供給源から関連する情報及び／または材料を入手することを伴う。いくつかの実施形態において、決定することは、試料または実体の１つ以上の特徴を同等の参照と比較することを伴う。
【0028】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」または「コード化」という用語は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、エディティング、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、及び／または（４）ポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後改変。
【0029】
断片：本明細書で使用される場合、「断片」または「部分」という用語は、全体の個別の部分を含むが、全体の構造に見出される１つ以上の部分が欠如している構造を指す。いくつかの実施形態において、断片は、そのような個別の部分からなる。いくつかの実施形態において、断片は、全体に見出される特徴的な構造要素または部分からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出される、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ以上の単量体単位（例えば、核酸）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出される単量体単位（例えば、残基）の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、材料または実体全体は、全体の「親」と称され得る。
【0030】
遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードするＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態において、遺伝子は、コード（例えば、エキソン）配列及び非コード（例えば、イントロン）配列の両方を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝子は、例えば、遺伝子発現の１つ以上の態様（例えば、誘導性発現等）を制御または影響し得る１つ以上の調節要素を含んでもよい。
【0031】
遺伝子治療：本明細書で使用される場合、「遺伝子治療」という用語は、そのような治療が求められる障害または状態を治療または予防するための特定のゲノムＤＮＡ配列の挿入または欠失を指す。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ配列の挿入または欠失は、特定の細胞（例えば、標的細胞）において生じる。標的細胞は、哺乳類由来であってもよく、及び／または哺乳類対象における細胞であってもよい。哺乳類には、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ラマ等が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、異種ＤＮＡは、標的細胞に移される。異種ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現され、それによってコードされる治療産物が産生されるような方法で、選択された標的細胞に導入されてもよい。加えてまたは代替的に、異種ＤＮＡは、何らかの方法で、治療産物をコードするＤＮＡの発現を媒介することができるか、または何らかの方法で、治療産物の発現を直接もしくは間接的に媒介するペプチドもしくはＲＮＡ等の産物をコードし得る。遺伝子治療はまた、欠陥のある遺伝子を置き換えるか、または哺乳類もしくはそれが導入されている細胞によって産生された遺伝子産物を補充する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用され得る。治療産物をコードする異種ＤＮＡは、その産物またはその発現を増強するか、またはそれ以外の場合には変化させるために、罹患する宿主の細胞への導入前に改変され得る。遺伝子治療はまた、遺伝子発現の阻害剤もしくはリプレッサー、または他の調節物質の送達を伴ってもよい。遺伝子治療は、インビボまたはエクスビボ技法を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする核酸を哺乳類細胞または標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、裸核酸、及びポロキサマーまたはリポソーム等の送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後にエピソームまたは統合されたゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｆｅｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４９：１７９１－１７９４（１９９６）、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１，６３６－６４６（２０１０）、及びＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２８２（１８２１）：ｐｉｉ ２０１４３００３（２０１５）を参照のこと。
【0032】
ヘルパー機能：本明細書で使用される場合、「ヘルパー機能」という用語は、組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）が宿主細胞によって複製及びパッケージングされることを可能にする機能を指す。ヘルパー機能は、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）複製及びパッケージングを補助する、ヘルパーウイルスとして、またはヘルパーウイルス遺伝子として、いくつかの形態で提供され得るが、これらに限定されない。ヘルパーウイルス遺伝子には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ等のアデノウイルスヘルパー遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。ヘルパーウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア等のポックスウイルス、及びバキュロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。アデノウイルスは、いくつかの異なる亜群を包含するが、亜群Ｃのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類、及びトリ起源の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣ等の保管所から入手可能である。ＡＴＣＣ等の保管所からも入手可能なヘルペスファミリーのウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含む。保管所から入手可能なバキュロウイルスとしては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルスが挙げられる。
【0033】
宿主細胞：本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ＤＮＡ（組換えまたはそれ以外）が導入された細胞を指す。本開示を読んだ当業者は、このような用語が特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫も指すことを理解するであろう。変異または環境の影響のいずれかにより、ある特定の改変が後続の世代で生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではなく、本明細書で使用される場合「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、外因性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに好適な生命の界のうちのいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞を含む。
【0034】
「改善する」、「増加する」、「阻害する」、または「低下する」：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、「阻害する」、「低下する」という用語、またはそれらの文法的均等物は、ベースラインまたは他の参照測定値に対して相対的な値を示す。いくつかの実施形態において、適切な参照測定値は、（例えば、その前及び／またはその後）特定の薬剤もしくは治療の非存在下、または適切な同等の参照薬剤の存在下で、他の点では同等の条件下で、特定の系（例えば、単一の試料における、例えば、培地の）における測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態において、適切な参照測定値は、関連する薬剤または治療の存在下で、特定の方法で反応することが知られているか、または期待される、同等の系内の測定値であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【0035】
作動可能に連結されている：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、記載の構成成分が、それらが意図される方法で機能することを可能にする関係にある近位を指す。いくつかの実施形態において、調節要素は、機能要素に「作動可能に連結される」。いくつかのそのような実施形態において、作動可能に連結された調節要素は、機能要素の発現及び／または活性が調節要素と適合する条件下で達成されるような方法で関連付けられる。いくつかの実施形態において、「作動可能に連結された」調節要素は、目的のコーディング要素と隣接しており（例えば、共有結合されている）、いくつかの実施形態において、調節要素は、目的の機能要素に対してトランスで、またはそれ以外の場合には目的の機能要素から離れて作用する。
【0036】
ペイロード：本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、細胞、組織、器官、生物、及び／または細胞を含む系に導入されることが所望される目的の核酸配列（例えば、標的ポリペプチド等の標的ペイロードをコードする配列を含む）を指す。ペイロードは、治療目的を有する異種タンパク質、例えば、酵素または抗体であり得る。ペイロードは、治療目的を有する異種核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡであり得る。当業者は、ペイロードが任意の目的の異種タンパク質または核酸から選択され得ることを認識するであろう。
【0037】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、一般に、少なくとも３つのアミノ酸のポリマーの当該技術分野で認識される意味を有する。当業者は、「ポリペプチド」という用語が、本明細書に列挙される完全な配列を有するポリペプチドだけでなく、そのような完全なポリペプチドの機能的断片（例えば、少なくとも１つの活性を保持する断片）を表すポリペプチドも包含するように十分に一般的であるように意図されていることを理解するであろう。さらに、当業者は、タンパク質配列が一般に、活性を破壊することなくいくつかの置換を許容することを理解する。したがって、活性を保持し、同じクラスの別のポリペプチドと少なくとも約３０～４０％の全体の配列同一性を共有し、多くの場合には約５０％、６０％、７０％、または８０％を超え、さらに通常、はるかに高い同一性の少なくとも１つの領域を含み、１つ以上の高度に保存された領域において多くの場合には９０％、またはさらに９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を超え、通常少なくとも３～４個、多くの場合には２０個まで、またはそれを超えるアミノ酸を包含する、任意のポリペプチドは、本明細書で使用される場合、関連用語「ポリペプチド」内に包含される。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、またはそれらの両方を含有し得、当該技術分野で既知の様々なアミノ酸改変または類似体のいずれかを含有し得る。有用な改変は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は、一般に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すために使用される。
【0038】
組換え：本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、組換え手段によって設計、操作、調製、発現、作製、製造、及び／または単離されたポリペプチド、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させたポリペプチド；組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリーから単離されたポリペプチド；トランスジェニックであるか、またはそれ以外の場合には、遺伝子もしくは遺伝子（複数可）、またはポリペプチドもしくはその１つ以上の構成成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）の発現をコードする、及び／または指示する遺伝子構成成分を発現するように操作された動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚等）から単離されたポリペプチド；及び／または選択された核酸配列要素を互いにスプライシングすること、もしくはライゲーションすること、選択された配列要素を化学的に合成すること、及び／またはそれ以外の場合にはポリペプチドもしくはその１つ以上の構成成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）の発現をコードする、及び／または指示する核酸を産生することを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離されたポリペプチドを指すことが意図される。いくつかの実施形態において、このような選択された配列要素のうちの１つ以上が自然界に見出される。いくつかの実施形態において、このような選択された配列要素のうちの１つ以上は、インシリコで設計される。いくつかの実施形態において、１つ以上のこのような選択された配列要素は、既知の配列要素の変異誘発（例えば、インビボまたはインビトロで）、例えば、目的の供給源生物（例えば、ヒト、マウス等）の生殖細胞系中等の自然または合成供給源から生じる。
【0039】
参考文献：本明細書で使用される場合、比較が実施されるものに対する標準または対照を記載する。例えば、いくつかの実施形態において、目的の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値を、参照もしくは対照の薬剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と比較する。いくつかの実施形態において、参照または対照は、目的の試験または決定と実質的に同時に試験及び／または決定される。いくつかの実施形態において、参照または対照は、任意に、有形の媒体に具体化された歴史的な参照または対照である。典型的には、当業者によって理解されるように、参照または対照は、評価されているものと同等の条件または状況下で決定または特徴付けられる。当業者は、特定の可能な参照または対照への信頼及び／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在するときに理解することになる。
【0040】
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全範囲もしくはほぼ全範囲または程度を示す定性的条件を指す。生物学的分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、かつてない限り、完全性に達する、及び／または完全性に進む、または絶対的な結果を達成または回避することはほとんどないことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるために本明細書で使用される。
【0041】
形質導入：本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、組換えウイルスベクターが１つ以上の特定の細胞型に入り、組換えウイルスベクター内に含有されるＤＮＡを細胞内に移入する能力を指す。形質導入は、細胞または細胞集団における組換えウイルスＤＮＡまたは組換えウイルスＤＮＡから発現される組換えウイルスＲＮＡの量を測定することによって、及び／またはＤＮＡから発現される組換えウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを含有する集団における細胞の数を評価することによって評価することができる。形質導入効率は、開始量の組換えウイルスベクター（例えば、インビボで注入される、またはインビトロで細胞に適用されるベクターの開始量）からの形質導入のレベルの尺度であり、及び／または特定の対照、例えば、プロトタイプの組換えウイルスベクターを参照して、定量的または定性的であり得る。例えば、候補組換えウイルスベクターが、対照ベクターの２倍の数の細胞を形質導入する場合、及び／または候補組換えウイルスベクターによる形質導入からの細胞当たりの組換えウイルスＤＮＡの量が、対照ベクターによる形質導入の２倍であり、各ベクターの開始量が同じであった場合（例えば、対象に注入されるか、または細胞に適用される各ベクターの量が同じであった場合）、候補組換えウイルスベクターの形質導入効率は、対照ベクターの形質導入効率より２００％高いか、または２倍であると言える。
【0042】
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。非限定的な例として、ベクターの１つの型は、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。別の型のベクターは、「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）での自律複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【0043】
標準的な技法は、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養ならびに形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のために使用され得る。酵素反応及び精製技法は、メーカーの仕様に従って、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように、実施され得る。前述の技法及び手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通して引用及び議論される種々の一般的及びより具体的な参照に記載されるように、実施され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、参照によりその全体を本明細書に組み込む）を参照されたい。
【0044】
特定の実施形態の詳細な説明
本開示は、とりわけ、組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）を決定するための定量的な細胞ベースのインビトロアッセイを提供する。本開示は、一部は、定量的かつ正確な両方である少なくとも１つのペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）をコードする組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の効力、例えば、相対的な効力を決定するためのアッセイの発見に基づいている。特に、本明細書に記載の効力アッセイは、長くて面倒であり、比較的高い失敗率を有していた従来の方法よりも改善されている。したがって、本開示は、とりわけ、遺伝子治療のための組成物、ならびに遺伝子治療方法を用いた疾患及び障害（例えば、脊髄性筋萎縮症）の治療において有用な組換えウイルスベクターの効力を決定するための改善された方法及び組成物を提供する。
本開示は、とりわけ、組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）を決定するための定量的な細胞ベースのインビトロアッセイを提供する。本開示は、一部は、定量的かつ正確な両方である少なくとも１つのペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）をコードする組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）の効力、例えば、相対的な効力を決定するためのアッセイの発見に基づいている。特に、本明細書に記載の効力アッセイは、長くて面倒であり、比較的高い失敗率を有していた従来の方法よりも改善されている。したがって、本開示は、とりわけ、遺伝子治療のための組成物、ならびに遺伝子治療方法を用いた疾患及び障害（例えば、脊髄性筋萎縮症）の治療において有用な組換えウイルスベクターの効力を決定するための改善された方法及び組成物を提供する。
【0045】
理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、（ｉ）同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、少なくとも１つのペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現が低下した改変宿主細胞、及び／または（ｉｉ）コイル小体対（ＧＥＭ）の存在の検出は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの効力アッセイの改善を可能にすると考えられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞内にノックダウン（例えば、構成的または条件付き）を含むヒト改変宿主細胞（例えば、神経芽腫細胞株）は、他の型の宿主細胞（例えば、初代細胞及び／または非ヒト哺乳類細胞、例えば、マウス細胞）よりも生理学的に関連性が高く、及び／または培養しやすい。いくつかの実施形態において、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞は、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）内に、例えば、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）に対する阻害性核酸、例えば、ＳＭＮ１に対するｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＭＮ１遺伝子に対するドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８）を含むか、または発現するノックダウン（例えば、構成的または条件付き）を含む。
【0046】
組換えウイルスベクター
本開示は、とりわけ、組換えウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）を提供する。組換えウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）に挿入するために広く使用されるようになった。多くの形態のベクターを使用して、本明細書に記載のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）を送達することができる。発現ベクターの非限定的な例として、ウイルスベクター（例えば、遺伝子治療に適したベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、及び人工染色体が挙げられる。
本開示は、とりわけ、組換えウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）を提供する。組換えウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）に挿入するために広く使用されるようになった。多くの形態のベクターを使用して、本明細書に記載のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）を送達することができる。発現ベクターの非限定的な例として、ウイルスベクター（例えば、遺伝子治療に適したベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、及び人工染色体が挙げられる。
【0047】
ウイルスベクターの非限定的な例として、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、またはラウス肉腫ウイルス）、アデノウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、またはポリオウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0048】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを含むか、またはレトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科に属するエンベロープウイルスである。複製欠損レトロウイルスの産生のためのプロトコルは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照されたい）。次いで、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボまたはエクスビボのいずれかで送達することができる。いくつかのレトロウイルス系が当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第５，９９４，１３６号、同第６，１６５，７８２号、及び同第６，４２８，９５３号を参照されたい。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のレンチウイルスを含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ感染症貧血（ＥＩＡ）、またはヴィスナウイルスを含むか、またはそれらである。
【0049】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、アデノウイルスベクターを含むか、またはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、任意の起源、任意の亜群、任意の亜型、亜型の混合物、または任意の血清型に由来し得る。例えば、アデノウイルスは、亜群Ａ（例えば、血清型１２、１８、及び３１）、亜群Ｂ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、及び５０）、亜群Ｃ（例えば、血清型１、２、５、及び６）、亜群Ｄ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、及び４２～４８）、亜群Ｅ（例えば、血清型４）、亜群Ｆ（例えば、血清型４０及び４１）、非分類血清型（例えば、血清型４９及び５１）、または任意の他のアデノウイルス血清型のものであり得る。アデノウイルス血清型１～５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から入手可能である。非群Ｃアデノウイルス、さらには非ヒトアデノウイルスを使用して、複製欠損アデノウイルスベクターを調製することができる。非群Ｃアデノウイルスベクター、非群Ｃアデノウイルスベクターの産生方法、及び非群Ｃアデノウイルスベクターの使用方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号、同第５，８３７，５１１号及び同第５，８４９，５６１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９７／１２９８６号及び同第ＷＯ９８／５３０８７号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アデノウイルスベクターのさらなる例は、米国公開第２０１５００９３８３１号、同第２０１４０２４８３０５号、同第２０１２０２８３３１８号、同第２０１００００８８８９号、同第２００９０１７５８９７号、及び同第２００９００８８３９８号に見出すことができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0050】
組換えウイルスベクターは、アルファウイルスに基づいてもよい。アルファウイルスとしては、Ｓｉｎｄｂｉｓ（及びＶＥＥＶ）ウイルス、Ａｕｒａウイルス、Ｂａｂａｎｋｉウイルス、Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、Ｂｅｂａｒｕウイルス、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａウイルス、Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓウイルス、Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎウイルス、Ｇｅｔａｈウイルス、Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、Ｍａｙａｒｏウイルス、Ｍｅ Ｔｒｉウイルス、Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇウイルス、Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓウイルス、Ｍｕｃａｍｂｏウイルス、Ｎｄｕｍｕウイルス、Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇウイルス、Ｐｉｘｕｎａウイルス、Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓウイルス、Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒウイルス、Ｓａｌｍｏｎ Ｐａｎｃｒｅａｓウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｔｒｏｃａｒａウイルス、Ｕｎａウイルス、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、及びＷｈａｔａｒｏａウイルスが挙げられる。一般に、このようなウイルスのゲノムは、宿主細胞の細胞質において翻訳可能な非構造的（例えば、レプリコン）及び構造的タンパク質（例えば、カプシド及びエンベロープ）をコードする。Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス（ＳＦＶ）、及びＶｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス（ＶＥＥＶ）は、すべて、導入遺伝子送達のためのウイルス伝達ベクターを開発するために使用されている。偽型ウイルスは、アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質及びレトロウイルスカプシドを組み合わせることによって形成され得る。アルファウイルスベクターの例は、米国公開第２０１５００５０２４３号、同第２００９０３０５３４４号、及び同第２００６０１７７８１９号に見出すことができ、それらのベクター及び作製方法は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0051】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶ系は概して当該技術分野において周知である（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ＡＡＶベクターを産生及び使用するための方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0052】
一般に、本明細書に記載の方法及び組成物で使用されるＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型であってもよい。いくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられており、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびにそれらのバリアント及び／またはハイブリッドが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、またはＡＡＶ２／９ベクター（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有するＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９血清型）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９バリアントは、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、米国特許第８，９２７，５１４号、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及び米国特許第８，７３４，８０９号に記載されるものを含み、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0053】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、Ｎ Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））による記載のように、これらに限定されないがＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．８４等の、ＡＡＶ９における変異を有し得る、または含み得る。ある特定の実施形態において、ＡＡＶ９バリアントは、例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＡＡＶｈｕ６８またはそのバリアントを含む。他のＡＡＶベクターは、例えば、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１０ Ｆｅｂ １５；８１（２－３）：２７３に記載されており、その全体が参照により、本明細書に組み込まれる。
【0054】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、自然発生のＡＡＶを含むか、または自然発生のＡＡＶである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、改変ＡＡＶ（すなわち、自然発生のＡＡＶのバリアント）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、遺伝子治療の１つ以上の特性を改善するために、例えば、中和抗体による免疫応答または認識を回避または低減するために、及び／またはより効率的及び／または標的化された形質導入のために、ＡＡＶ配列に改変を導入するために、例えばＤＮＡシャッフル、ペプチド挿入、またはランダム変異誘発によって、指向性進化によって産生され得る（Ａｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０．２（２０１２）：３２９－３３８を参照されたい）。ＡＡＶベクターを操作するために指向性進化を使用する方法は、例えば、米国特許第８，６３２，７６４号に見出だされ得る。いくつかの実施形態において、改変ＡＡＶは、特定のトロピズムを含むように改変される。
【0055】
ＡＡＶベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用の５’及び３’反転末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５－１６８（１９９０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。いくつかの実施形態において、ＩＴＲをコードする実質的に全体の配列は、ＡＡＶベクター内で使用されるが、これらの配列のある程度の微量の改変は許容され得る。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は、当業者に既知である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ“、２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい。これらはそれぞれその全体を参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、本開示のＡＡＶベクターは、ペイロードを含有する「シス作用型」プラスミドであり、選択されたペイロード配列及び関連調節要素は、５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、既知の哺乳類ＡＡＶ型及び／または本明細書に記載のものを含む任意の既知のＡＡＶから得られ得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、例えば、大きなペイロード（例えば、約５ｋｂを超えるペイロード）の送達のために、及び／または単一のＡＡＶベクターの投与に関連する安全上の懸念に対処するために、二重または三重ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、二重ＡＡＶベクターは、２つの別々のＡＡＶベクターを含んでもよく、それぞれは、目的の大型のペイロードの完全な配列の断片を含み、組換え時に、断片は、目的の大型のペイロードの完全な配列、またはその機能部分を形成する。いくつかの実施形態において、三重ＡＡＶベクターは、３つの別々のＡＡＶベクターを含んでもよく、それぞれは、目的の大型のペイロードの配列の断片を含み、組換えられると、断片は、目的の大型のペイロードの完全な配列、またはその機能部分を形成する。
【0057】
複数のＡＡＶ（例えば、二重または三重ＡＡＶベクター）を同じ細胞に送達して共形質導入することができ、ここでペイロードの２つまたは３つの断片は一緒に組換えられ、目的の大きなペイロード全体の単一のｍＲＮＡ転写産物を産生する。いくつかの実施形態において、断片化されたペイロードは、非重複配列を含む。いくつかの実施形態において、断片化されたペイロードは、指定された重複配列を含む。いくつかの実施形態において、二重または三重トランスフェクションの複数のＡＡＶベクターは、同じ型のＡＡＶベクター（例えば、同じ血清型及び／または同じ構築物）であり得る。いくつかの実施形態において、二重または三重の複数のＡＡＶベクターは、異なる型のＡＡＶベクター（例えば、異なる血清型または構築物）であり得る。
【0058】
本開示に従って有用な例示的なＡＡＶベクターとしては、一本鎖（複数可）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓ）または自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、本明細書に記載の発現構築物と、発現構築物に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１つ以上の領域とを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ウイルスカプシドによってカプシド化される。いくつかの実施形態において、ｔａウイルスカプシドは、６０個のカプシドタンパク質サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスカプシドは、ＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３を含む。いくつかの実施形態において、ＶＰｌ、ＶＰ２、及びＶＰ３サブユニットは、約１：１：１０にそれぞれ記載されている。
【0059】
いくつかの実施形態において、本開示のＡＡＶベクターのＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびにそれらのバリアント及び／またはハイブリッド）に由来し得るか、または複数の血清型に由来し得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、１つ以上の他の血清型に由来する。ＩＴＲ配列を含有するＩＴＲ配列及びプラスミドは、当該技術分野で既知であり、市販されている（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａ；及びＡｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；及びＫｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．１９９６ Ｎｏｖ ２６；９３（２４）：１４０８２－７；Ｍａｃｈｉｄａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（商標）．Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１０．１３８５／１－５９２５９－３０４－６：２０１（著作権）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．２００３．Ｃｈａｐｔｅｒ １０．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ；ならびに米国特許第５，１３９，９４１及び同第５，９６２，３１３号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0060】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、以下の血清型のうちのいずれかから選択される血清型、及びそのバリアントを含み得るか、またはそれらに基づき得るが、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．ｌ、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒｌ、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．ｌ、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒｌ．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、Ｂ Ｐ６１ ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６２ ＡＡＶ、Ｂ Ｐ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、及び／またはＡＡＶ ＳＭ１０－８。
【0061】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ－ＤＪ８）等のＡＡＶＤＪまたはそのバリアントであり得、これらはＧｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２（１２）：５８８７－５９１１（２００８））に、または米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ６，１５６，３０３号に記載される配列、またはその誘導体を含むか、または有することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはそれらのバリアント等であるが、これらに限定されない、国際出願公開第ＷＯ２０１５１２１５０１号に記載される配列であり得るか、または含み得る。
【0062】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、任意の数の種に由来し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，２３８，８００号に記載される配列であってもよく、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であってもよい。ＢＡＡＶ血清型は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，１９３，７６９号に記載される配列であってもよく、またはそれを含む。ＢＡＡＶ血清型は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，３９６号に記載の配列であってよいか、またはその配列を有することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、カプリンＡＡＶであってもよい。カプリンＡＡＶ血清型は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７４２７３９６号に記載の配列であってよいか、またはそれを含むことができる。ＡＡＶ血清型はまた、前述のいずれかのバリアントまたはハイブリッドであってもよい。
【0063】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）による記載のように、アミノ酸（３９０～６２７）（ＶＰ１番号付け）内に変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリーによって産生される血清型であり得る。いくつかの実施形態において、血清型及び対応するヌクレオチド及びアミノ酸置換は、これらに限定されないが、以下であってよい：ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８Ａ及びＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３Ｄ及びＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０Ｃ及びＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ、Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（ＣＩ５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ、Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ，；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）及びＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）。
【0064】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、改変カプシドタンパク質（例えば、修飾ＶＰ３領域を含むカプシドタンパク質）を含むカプシドを含む。改変カプシドタンパク質の産生方法は、当該技術分野において既知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３０３１０４４３を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、野生型カプシドタンパク質中の表面曝露アミノ酸（例えば、表面曝露チロシン）に対応する位置に少なくとも１つの非天然アミノ酸置換を含む改変カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、野生型カプシドタンパク質中の表面曝露されたチロシンアミノ酸に対応する位置に非チロシンアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）、野生型カプシドタンパク質中の表面曝露されたスレオニンアミノ酸に対応する位置に非スレオニンアミノ酸（例えば、バリン）、野生型カプシドタンパク質中の表面曝露されたリジンアミノ酸に対応する位置に非リジンアミノ酸（例えば、グルタミン酸）、野生型カプシドタンパク質中の表面曝露されたセリンアミノ酸に対応する位置に非セリンアミノ酸（例えば、バリン）、またはそれらの組み合わせを含む改変カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のアミノ酸置換を有する改変カプシドタンパク質が含まれるカプシドを含む。
【0065】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、目的の遺伝子のコード配列、例えば、コード配列に作動可能に連結された発現制御配列の発現を促進する配列を含む１つ以上の領域を含む。発現制御配列の非限定的な例としては、プロモーター、絶縁体、サイレンサー、応答要素、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、及びポリ（Ａ）テールが挙げられる。このような制御配列の任意の組み合わせが、本明細書において企図される（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）。いくつかの実施形態において、発現構築物は、ＷＰＲＥ等の他の調節要素を含む。
【0066】
ＡＡＶベクターは、本明細書に記載の任意のポリペプチドまたはペイロードをコードする核酸に、本明細書に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞における転写、翻訳、及び／または発現を可能にする方法で作動可能に連結された従来の制御要素を含むことができる。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、ウサギβ－グロビンポリＡシグナル）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を向上させる配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を向上させる配列、ならびに所望により、コード産物の分泌を向上させる配列が挙げられる。天然、構成的、誘導性、及び／または組織特異的であるプロモーターを含むいくつかの発現制御配列は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載のベクターに含まれ得る。構成的プロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを伴う）、ＳＶ４０プロモーター、及びジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターが挙げられる。
【0067】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態（例えば、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞内のみ）の存在によって調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導性系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、及びＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない、様々な商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制性システム、テトラサイクリン誘導性系、ＲＵ４８６誘導性系、及びラパマイシン誘導性系が挙げられる。有用であり得るさらに他の種類の誘導性プロモーターは、温度、急性相、細胞の特定の分化状態等の特定の生理学的状態によって、または複製細胞のみにおいて調節される。
【0068】
いくつかの実施形態において、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。ある場合には、組織特異的制御配列は、組織特異的方法で転写を誘導する組織特異的転写因子を結合する。このような組織特異的制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等）は当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ７）、Ｃｂｈプロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーター、またはｐｏｌＩＩＩプロモーターである。
【0069】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織または細胞特異的プロモーターである。例えば、ニューロン特異的プロモーターには、ヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーター（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３；９０：１４６０－１４６４に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、マウスカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９６；９３：１３２５０－１３２５５に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ラットチューブリンアルファＩ（Ｔａｌ）プロモーター（例えば、Ｇｌｏｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９４；１４：７３１９－７３３０に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ラットニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｆｏｒｓｓ－Ｐｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ １９９０；５：１８７－１９７に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びヒト血小板由来成長因子ベータ鎖（ＰＤＧＦ）プロモーター（例えば、Ｓａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １９９１；６４：２１７－２２７に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれ得る。
【0070】
別の実施形態において、本明細書に記載の任意のペイロードをコードする核酸の天然プロモーターまたはその断片を使用してもよい。いくつかの実施形態において、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位、またはＫｏｚａｋコンセンサス配列等の他の天然発現制御要素もまた、天然の発現を模倣するために使用され得る。
【0071】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶベクターにおけるペイロードは、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド長、またはそれらの間の任意の整数値であってもよい。いくつかの実施形態において、ペイロードをコードする核酸配列は、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも３５０ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも４５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも５５０ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも６５０ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも８５０ヌクレオチドを含む。ヌクレオチド、少なくとも８８０ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも９５０ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１１００ヌクレオチド、少なくとも１２００ヌクレオチド、少なくとも１３００ヌクレオチド、少なくとも１４００ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１６００ヌクレオチド、少なくとも１７００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２５００ヌクレオチド、少なくとも３０００ヌクレオチド、少なくとも４０００ヌクレオチド、少なくとも５０００ヌクレオチド、少なくとも６０００ヌクレオチド、少なくとも７０００ヌクレオチド、少なくとも８０００ヌクレオチド、少なくとも９０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ペイロードをコードする核酸配列は、５０～２５，０００ヌクレオチド長、１００～２０，０００ヌクレオチド長、５００～１０，０００ヌクレオチド長、１，０００～８，０００ヌクレオチド長、及び／または２，０００～５，０００ヌクレオチド長を含む。
【0072】
いくつかの実施形態において、本方法は、形質導入のために、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）を最適化することを含む。いくつかの実施形態において、線形範囲のアッセイ結果を産生するＭＯＩが選択される。いくつかの実施形態において、複数のＭＯＩをアッセイすることは、段階希釈によって達成される。いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）は、段階希釈によって達成される異なるＭＯＩ（例えば、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０ＭＯＩ）で組換えウイルスベクターを用いて形質導入される。いくつかの実施形態において、約１．２倍、約１．４倍、約１．６倍、約１．８倍、約２倍、約２．２倍、約２．４倍、約２．２倍、約２．４倍、または約３段階希釈またはそれらの組み合わせが使用される。いくつかの実施形態において、約５つの異なるＭＯＩは、段階希釈によって試験される。
【0073】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約６．１×１０５ＶＧ／細胞～約４．０×１０６ＶＧ／細胞、例えば、約６．１×１０５ＶＧ／細胞、約６．２×１０５ＶＧ／細胞、約６．３×１０５ＶＧ／細胞、約６．４×１０５ＶＧ／細胞、約６．５×１０５ＶＧ／細胞、約７．０×１０５ＶＧ／細胞、約７．５×１０５ＶＧ／細胞、約８．０×１０５ＶＧ／細胞、約８．５×１０５ＶＧ／細胞、約９．０×１０５ＶＧ／細胞、約９．５×１０５ＶＧ／細胞、約９．８×１０５ＶＧ／細胞、約１．０×１０６ＶＧ／細胞、約１．５×１０６ＶＧ／細胞、約１．６×１０６ＶＧ／細胞、約２．０×１０６ＶＧ／細胞、約２．５×１０６ＶＧ／細胞、約３．０×１０６ＶＧ／細胞、約３．５×１０６ＶＧ／細胞、または約４．０×１０６ＶＧ／細胞のＭＯＩで細胞培養に添加する。
【0074】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－５０％、６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－４０％、６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－３０％、６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－２０％、６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－１０％、６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－５％、または６．１×１０５ＶＧ／細胞＋／－１％のＭＯＩで細胞培養に添加する。
【0075】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－５０％、９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－４０％、９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－３０％、９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－２０％、９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－１０％、９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－５％、または９．８×１０５ＶＧ／細胞＋／－１％のＭＯＩで細胞培養に添加する。
【0076】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－５０％、１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－４０％、１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－３０％、１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－２０％、１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－１０％、１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－５％、または１．６×１０６ＶＧ／細胞＋／－１％のＭＯＩで細胞培養に添加する。
【0077】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－５０％、２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－４０％、２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－３０％、２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－２０％、２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－１０％、２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－５％、または２．５×１０６ＶＧ／細胞＋／－１％のＭＯＩで細胞培養に添加する。
【0078】
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約４×１０６ＶＧ／細胞＋／－５０％、４×１０６ＶＧ／細胞＋／－４０％、４×１０６ＶＧ／細胞＋／－３０％、４×１０６ＶＧ／細胞＋／－２０％、４×１０６ＶＧ／細胞＋／－１０％、４×１０６ＶＧ／細胞＋／－５％、または４×１０６ＶＧ／細胞＋／－１％のＭＯＩで細胞培養物に添加する。
【0079】
いくつかの実施形態において、効力アッセイ結果の線形範囲を産生するＭＯＩが選択される。他の実施形態において、非線形範囲の効力アッセイ結果を産生するＭＯＩが選択される。いくつかの実施形態において、効力アッセイのシグナル対ノイズ比は、約２．５であるが、または２．５以上、例えば、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０、もしくはそれ以上のシグナル対ノイズ比である。いくつかの実施形態において、約２．５以上のシグナル対ノイズ比は、非線形範囲の効力アッセイ結果の使用を可能にする。
【0080】
ＡＡＶベクターの産生
ＡＡＶベクターを得るための方法は、当該技術分野で既知である。典型的には、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）及びペイロードで構成されるＡＡＶベクター、及び／または組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを伴う方法は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得、本明細書に記載の任意のＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。擬似型ＡＡＶの製造は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示される。
ＡＡＶベクターを得るための方法は、当該技術分野で既知である。典型的には、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ反転末端反復（ＩＴＲ）及びペイロードで構成されるＡＡＶベクター、及び／または組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子へのパッケージングを可能にするのに十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを伴う方法は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来し得、本明細書に記載の任意のＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。擬似型ＡＡＶの製造は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ０１／８３６９２号に開示される。
【0081】
ＡＡＶカプシド内のＡＡＶベクターを包装するために宿主細胞内で培養される成分は、トランスで宿主細胞に提供され得る。代替的に、必要な構成要素（例えば、ＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のうちの任意の１つ以上は、当業者に既知の方法を使用して、必要な構成要素のうちの１つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。いくつかの実施形態において、そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下に必要な成分（複数可）を含有する。他の実施形態において、必要な構成要素（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。他の実施形態において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された成分、及び１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された成分を含有し得る。例えば、安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下でのＥ１ヘルパー機能と、誘導性プロモーターの制御下でのｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質とを含む、産生され得る。他の安定した宿主細胞は、当業者によって、日常的な方法を使用して産生され得る。
【0082】
本開示のＡＡＶベクターを産生するために必要な組換えＡＡＶ、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子要素（例えば、ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝子要素は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法、例えば、核酸操作の当業者に送達されてもよく、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。同様に、ＡＡＶビリオンの産生方法は周知であり、任意の好適な方法を本開示と共に使用することができる（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0083】
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、三重トランスフェクション法を使用して産生され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，００１，６５０号に記載される）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及び付属機能ベクターにパッケージ化されるＡＡＶベクター（ペイロードを含む）でトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ複製及びカプシド形成のためにトランスで機能するヘルパー機能配列（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、任意の検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能的ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）を産生することなく、効率的なＡＡＶベクター産生を支持する。本開示と共に使用するのに好適なベクターの非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，００１，６５０号を参照されたい）及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５６，３０３号を参照されたい）が挙げられる。
【0084】
アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（すなわち、「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能には、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれ、これには、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベースの付属機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、及びワクシニアウイルス等の任意の既知のヘルパーウイルスに由来し得る。
【0085】
いくつかの実施形態において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性ＤＮＡの取り込みを指して使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに「トランスフェクション」されている。いくつかのトランスフェクション技法は、当技術分野で一般的に知られている（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい）。そのような技法を使用して、ヌクレオチド統合ベクター及び他の核酸分子等の１つ以上の外因性核酸を、好適な宿主細胞に導入することができる。
【0086】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、付属機能ベクター、及び／または組換えＡＡＶの産生に関連する他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用される場合「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトした細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発的な、または意図的な変異のために、必ずしも元の親としての形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体において完全に同一ではない場合があることを理解されたい。
【0087】
対象への送達に好適なＡＡＶウイルスベクターを産生及び単離するためのさらなる方法は、例えば、米国特許第７，７９０，４４９号、同第７，２８２，１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0088】
いくつかの実施形態において、プロデューサー細胞株は、ＩＴＲに隣接するペイロードをコードする構築物と、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物とで一時的にトランスフェクトされる。別の系では、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株は、ＩＴＲに隣接するペイロードをコードする構築物で一時的にトランスフェクトされる。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して産生され、ｒＡＡＶは、汚染ウイルスから分離される。他の系は、ＡＡＶを回復するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない。いくつかの実施形態において、ヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、及びヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた、トランス系によって供給される。そのような系において、ヘルパー機能は、ヘルパー機能をコードする構築物を有する細胞の一過性トランスフェクションによって供給され得るか、または細胞を操作して、その発現を転写レベルまたは転写後レベルで制御することができるヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含有するようにすることができる。
【0089】
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に隣接するペイロードは、バキュロウイルスに基づくベクターに感染することによって、昆虫宿主細胞に導入される。このような産生系は、当該技術分野において既知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい）。これら及び他のＡＡＶ産生系の作製及び使用方法は、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、及び同第７，４３９，０６５号にも記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0090】
組換えベクターを産生するための前述の方法は、限定するものではなく、他の好適な方法が当業者には明らかであろう。
【0091】
ペイロード
目的の例示的なペイロードは、ＳＭＮ（例えば、ヒトＳＭＮ）である。ヒトＳＭＮは、３８ｋＤａの多機能タンパク質であり、細胞質及び核の両方で普遍的に発現され、見出され、ＳＭＮの作用機序を反映するコイル小体対（ＧＥＭ）と呼ばれる異なる構造で核内に濃縮される。特に高いレベルのＳＭＮ発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞に見出される。細胞質では、ＳＭＮは、Ｇｅｍｉｎ（Ｇｅｍｉｎ２～８）と呼ばれるタンパク質と相互作用してＳＭＮ複合体を形成することによって、スプライソソームの組み立てに重要な役割を果たす。形成されると、ＳＭＮ複合体は、Ｓｍタンパク質と小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）とを一緒にして、核内のｍＲＮＡへのｍＲＮＡ前処理に不可欠な小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）を形成することにより重要である。
目的の例示的なペイロードは、ＳＭＮ（例えば、ヒトＳＭＮ）である。ヒトＳＭＮは、３８ｋＤａの多機能タンパク質であり、細胞質及び核の両方で普遍的に発現され、見出され、ＳＭＮの作用機序を反映するコイル小体対（ＧＥＭ）と呼ばれる異なる構造で核内に濃縮される。特に高いレベルのＳＭＮ発現は、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞に見出される。細胞質では、ＳＭＮは、Ｇｅｍｉｎ（Ｇｅｍｉｎ２～８）と呼ばれるタンパク質と相互作用してＳＭＮ複合体を形成することによって、スプライソソームの組み立てに重要な役割を果たす。形成されると、ＳＭＮ複合体は、Ｓｍタンパク質と小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）とを一緒にして、核内のｍＲＮＡへのｍＲＮＡ前処理に不可欠な小核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）を形成することにより重要である。
【0092】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスレクターの産生のためのペイロードは、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチドは、ヒトＳＭＮポリペプチドを含むか、またはヒトＳＭＮポリペプチドである。
【0093】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）もしくはその断片を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）は、ヒトＳＭＮ１もしくはＳＭＮ２遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）は、コドン最適化される。いくつかの実施形態において、ＳＭＮ１遺伝子（例えば、コドン最適化ＳＭＮ１遺伝子）は、ＷＯ２０１８／１６０５８５（例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８５の配列番号１）に開示される核酸配列を含む。ＳＭＮｌの例示的なヒト核酸（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００３４４．４）、ヒトアミノ酸配列、及びヒトコドン最適化核酸配列を表１に示す。
【表1-1】
【表1-2】
【0094】
宿主細胞
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクターによる形質導入のための宿主細胞（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を提供する。宿主細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つのベクターでトランスフェクトした元の細胞の子孫細胞を含む。親細胞の子孫細胞は、自然、偶然、または意図的な変異のために、親細胞としての形態またはゲノム含有量において実質的に同一ではない場合がある。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのウイルスベクターによる形質導入のための宿主細胞（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を提供する。宿主細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つのベクターでトランスフェクトした元の細胞の子孫細胞を含む。親細胞の子孫細胞は、自然、偶然、または意図的な変異のために、親細胞としての形態またはゲノム含有量において実質的に同一ではない場合がある。
【0095】
本開示は、細胞がウイルスベクターに対して許容度が異なることを認識する。さらに、本開示は、細胞が、ウイルスベクターによってコードされるタンパク質を転写及び翻訳する能力が異なることを認識する。したがって、いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本開示は、本明細書に記載の効力アッセイに使用される宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）が、ウイルスベクターに対して非常に許容的である必要があることを認識する。したがって、様々な実施形態によれば、本明細書に記載のアッセイは、目的のペイロードをコードするウイルスベクターに対して許容的な細胞を利用する。
【0096】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳類細胞を含むか、または哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、もしくはマウス細胞を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ヒト細胞を含むか、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、非ヒト哺乳類細胞（例えば、マウス細胞）ではない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不死化細胞を含むか、または不死化細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、腫瘍もしくは骨髄腫細胞を含むか、またはそれである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細胞株を含むか、または細胞株である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、初代細胞ではない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、神経細胞組織に由来する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、腎組織に由来する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、肝組織に由来する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、眼組織に由来する。
【0097】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ、Ｂ３５、ＩＭＲ－３２またはＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞）、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＨｅＬａ－ＲＣ３２細胞）、腎細胞（例えば、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１、またはＢＨＫ細胞）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ Ｋｌ、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、またはＶｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞）、肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）、網膜細胞（例えば、ＲＰＥ１、Ｒ２８、またはＭＵ－ＰＨ１細胞）、線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）、または前述の細胞に由来する細胞株もしくはバリアントを含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、神経芽腫細胞（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞）を含むか、または神経芽腫細胞である。
【0098】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、改変宿主細胞を含むか、または改変宿主細胞である。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現を欠くか、または低減された発現を有する。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、本明細書に記載の宿主細胞（例えば、哺乳類、例えば、本明細書に記載のヒト宿主細胞；または例えば、本明細書に記載の宿主細胞の神経芽細胞腫（例えば、神経芽細胞腫）、例えば、哺乳類神経細胞（例えば、神経芽細胞腫）、例えば、ヒト神経細胞（例えば、神経芽細胞腫）を含み、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）内にノックダウン（例えば、構成的または条件付き）をさらに含む、いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）に対する阻害性核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）を含む。ある特定の実施形態において、改変宿主細胞は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞）を含むか、またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である。いくつかの実施形態において、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞は、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）内にノックダウン（例えば、構成的または条件付き）を含み、ノックダウンは、例えば、ＳＭＮ遺伝子（例えば、ＳＭＮ１またはＳＭＮ２遺伝子）に対する阻害性核酸、例えば、ＳＭＮ１に対するｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＭＮ１に対するドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８）、Ｊａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１４（１２）：Ｅ２３４７－Ｅ２３５６，２０１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の例えば、ｓｈＲＮＡを含むか、または発現する。いくつかの実施形態において、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、例えば、Ｊａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１４（１２）：Ｅ２３４７－Ｅ２３５６，２０１７に記載のように、ＳＭＮ１遺伝子に対するｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＭＮ１遺伝子に対するドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８）を発現する少なくとも１つのレンチウイルスベクターを用いて形質導入される。いくつかの実施形態において、ＳＭＮ１に対する阻害性核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターを標的としないか、または影響を及ぼさない（例えば、阻害性核酸、例えば、ｓｈＲＮＡは、本明細書に記載の組換えウイルスベクターのペイロード（例えば、コドン最適化ＳＭＮ１遺伝子）を標的としない）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞または改変宿主細胞は、初代細胞を含まない（例えば、初代細胞でない）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の宿主細胞または改変宿主細胞は、細胞株、例えば、不死化／連続細胞株を含む（例えば、不死化／連続細胞株である）。
【0099】
目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現を欠くか、または低減させた改変宿主細胞は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）のノックアウトもしくはノックダウン（例えば、条件付きノックアウトまたはノックダウン）を含む任意の好適な手段によって得ることができる。例えば、改変宿主細胞は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び／またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）のノックダウンを含むことができる。いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）に対する阻害性核酸を含む。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）をノックダウンするための少なくとも１つのｓｈＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ１２０またはｓｈＲＮＡ１２８を含む。いくつかの実施形態において、阻害性核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターを標的としない。いくつかの実施形態において、阻害性核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターのペイロード（例えば、コドン最適化ＳＭＮ１遺伝子）を標的としない。
【0100】
いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）は、比較的短い期間、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または約２４時間の期間内に播種され、形質導入される。
【0101】
いくつかの実施形態において、改変宿主細胞は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現レベルの低下、例えば、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約９６倍、約９７倍、約９８倍、約９９倍、またはそれ以上の発現レベルの低下を含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、トランスフェクションの前に、宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を、複数回、例えば、約１０回～約３０回継代させる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１０回、例えば、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも１６回、少なくとも１７回、少なくとも１８回、少なくとも１９回、少なくとも２０回、少なくとも２１回、少なくとも２２回、少なくとも２３回、少なくとも２４回、少なくとも２５回、少なくとも２６回、少なくとも２７回、少なくとも２８回、少なくとも２９回、少なくとも３０回、またはそれ以上継代される。いくつかの実施形態において、トランスフェクションの前に、宿主細胞は、少なくとも１つの凍結解凍サイクル、例えば、少なくとも２回、３回、４回、またはそれ以上の凍結解凍サイクルに供される。
【0103】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスベクターによる形質導入の前に、宿主細胞（例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を基質（例えば、細胞培養容器）に播種する。宿主細胞は、細胞培養容器内で培養することができる。細胞培養容器は、細胞培養皿、プレート、またはフラスコを含み得る。例示的な細胞培養容器は、３５ｍｍ、６０ｍｍ、１００ｍｍ、もしくは１５０ｍｍの皿、マルチウェルプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、または９６ウェルプレート）、またはフラスコ（例えば、Ｔフラスコ、例えば、Ｔ－２５、Ｔ－７５、またはＴ－１６０フラスコ）、もしくはシェーカーフラスコを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養容器は、ガラス底アッセイプレートを含むか、またはガラス底アッセイプレートである。
【0104】
いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞の発現を含むか、または低減させた改変宿主細胞）は、ある特定の密度で播種される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、約５．０×１０３～約５．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、約５．０×１０３、約５．５×１０３、約６．０×１０３、約６．５×１０３、約７．０×１０３、約７．５×１０３、約８．０×１０３、約８．５×１０３、約９．０×１０３、約９．５×１０３、約１．０×１０４、約１．５×１０４、約２．０×１０４、約２．５×１０４、約３．０×１０４、約３．５×１０４、約４．０×１０４、約４．５×１０４、または約５．０×１０４細胞／ウェルの密度で播種される。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、約５．０×１０３の密度で播種される。
【0105】
組換えウイルスベクターの効力の決定
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）は、目的のペイロード（例えば、少なくともＳＭＮポリペプチド上）の発現レベルによって決定される。いくつかの実施形態において、効力アッセイは、（ｉ）目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）をコードする本明細書に記載の組換えウイルスベクターを用いて宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、本明細書に記載の例えばＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を形質導入することと、（ｉｉ）目的のペイロードの検出のために、宿主細胞を第１の薬剤（例えば、任意に検出部分を含む）と接触させることと、（ｉｉｉ）第１の薬剤の検出のために、宿主細胞を第２の薬剤（例えば、任意に検出部分を含む）と接触させることと、（ｉｖ）コイル小体対（ＧＥＭ）の存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、ヒト宿主細胞、例えば、神経芽腫細胞株、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞））は、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現を低下させるように改変される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスベクターの効力（例えば、生物学的活性）は、目的のペイロード（例えば、少なくともＳＭＮポリペプチド上）の発現レベルによって決定される。いくつかの実施形態において、効力アッセイは、（ｉ）目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）をコードする本明細書に記載の組換えウイルスベクターを用いて宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、本明細書に記載の例えばＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を含むか、または低減させた改変宿主細胞）を形質導入することと、（ｉｉ）目的のペイロードの検出のために、宿主細胞を第１の薬剤（例えば、任意に検出部分を含む）と接触させることと、（ｉｉｉ）第１の薬剤の検出のために、宿主細胞を第２の薬剤（例えば、任意に検出部分を含む）と接触させることと、（ｉｖ）コイル小体対（ＧＥＭ）の存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、ヒト宿主細胞、例えば、神経芽腫細胞株、例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞））は、同じ型の非改変基準宿主細胞と比較して、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の発現を低下させるように改変される。
【0106】
いくつかの実施形態において、アッセイは、組換えウイルスベクターによってコードされるポリペプチド（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）の効力を決定するために使用される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの効力は、蛍光アッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの効力は、比色アッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの効力は、酵素アッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、効力アッセイは、ＧＥＭの検出のためのイメージング（例えば、蛍光イメージング、例えば、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ））を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で言及される効力とは、例えば、標準試料との相対効力を指す。
【0107】
ＳＭＮポリペプチドの検出
いくつかの実施形態において、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）は、第１の薬剤と第２の薬剤との組み合わせで検出される。いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、標識される。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、標識される。
いくつかの実施形態において、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）は、第１の薬剤と第２の薬剤との組み合わせで検出される。いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、標識される。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、標識される。
【0108】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。例示的な抗ＳＭＮ抗体またはその断片は、当該技術分野で既知であり、市販されている（例えば、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｗｎ，ＣＯ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；及びＧｅｎＴｅｘ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡから入手可能な製品を参照されたい）。いくつかの実施形態において、第１の薬剤はアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、アプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アプタマーは、目的のペイロード（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド）に緊密に結合する。
【0109】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、検出部分を含む。いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、検出部分と共有結合的または非共有結合的に会合している。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、検出部分を含む。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、検出部分と共有結合的または非共有結合的に会合している。いくつかの実施形態において、第１の薬剤及び第２の薬剤は、検出部分を含む。いくつかの実施形態において、第１の薬剤及び第２の薬剤は、検出部分と共有結合的または非共有結合的に会合している。
【0110】
検出部分は、検出可能な任意の要素、分子、官能基、化合物、断片、または部分を含み得る。いくつかの実施形態において、検出部分は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン色素、アクリジン色素、ＳＹＢＲ色素、ローダミン色素、またはオキサジン色素）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、または８９Ｚｒ）、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステルまたは安定化ジオキセタン）、電気化学発光剤（例えば、Ｓｕｌｆｏ Ｔａｇ）、生物発光剤（例えば、ルシフェリン）、無機蛍光半導体ナノ結晶（例えば、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、または白金）、ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、比色標識（例えば、色素またはコロイド金）、もしくは前述の任意の誘導体を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、検出部分は、蛍光色素もしくはその誘導体を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、検出部位は、フルオロフォアを含むか、またはフルオロフォアである（例えば、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ４８８、またはＤｙＬｉｇｈｔ４８８）。
【0111】
コイル小体対（ＧＥＭ）の検出
ヒトＳＭＮポリペプチドは、普遍的に発現され、細胞質及び核の両方で見出される。核では、ＳＭＮはコイル小体対（ＧＥＭ）と呼ばれる異なる構造に集中している。いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、例えば、核内の明るく、密集したＧＥＭ構造の結果として、目視検査によって検出される。
ヒトＳＭＮポリペプチドは、普遍的に発現され、細胞質及び核の両方で見出される。核では、ＳＭＮはコイル小体対（ＧＥＭ）と呼ばれる異なる構造に集中している。いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、例えば、核内の明るく、密集したＧＥＭ構造の結果として、目視検査によって検出される。
【0112】
いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、イメージングによって検出される。いくつかの実施形態において、イメージングは、蛍光イメージング（例えば、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ））を含む。例えば、ＨＣＩは、自動顕微鏡法、マルチパラメータ画像処理、及び細胞集団から定量的データを抽出するための可視化ツールを使用する一連の分析方法を説明する。ＨＣＩを使用して、個々の細胞または細胞構造における標的の空間分布等のパラメータを定量的に報告することができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＨＣＩは、高スループットフォーマットでの試料の蛍光イメージングを含む。いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、ＨＣＩを使用して検出される。いくつかの実施形態において、ＨＣＩは、宿主細胞（例えば、少なくとも１つのＳＭＮポリペプチド、例えば、本明細書に記載のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を含むか、または低減させた改変宿主細胞）における亜細胞レベルでの変化（例えば、核におけるＧＥＭの存在）を検出する。
【0113】
いくつかの実施形態において、ＧＥＭの存在は、ＧＥＭのマーカー（例えば、Ｇｅｍｉｎ２～８ポリペプチドのうちの１つ以上）をアッセイすることによって検出される。いくつかの実施形態において、ＧＥＭのマーカーは、ＧＥＭとの共局在を示す。いくつかの実施形態において、ＧＥＭのマーカーは、Ｇｅｍｉｎ１ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ２ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ３ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ４ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ５ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ６ポリペプチド、Ｇｅｍｉｎ７ポリペプチド、及び／またはＧｅｍｉｎ８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＧＥＭのマーカーは、イメージングによってアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＧＥＭのマーカーは、蛍光イメージング（例えば、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ））によってアッセイされる。
【0114】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の効力アッセイは、組換えウイルスベクター（例えば、ＳＭＮポリペプチドをコードするペイロードを含む）の安定性を示す。いくつかの実施形態において、効力は、組換えウイルスベクターの温熱ストレス後に決定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、特定の温度で（例えば、温熱ストレスを引き起こす）特定の時間の長さにわたって供される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、約４０℃～約８０℃、例えば、約４０℃、約４５℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、または約８０℃の温度に供される）。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、特定の温度（例えば、温熱ストレスを引き起こす）で１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、またはそれ以上保持される。
【0115】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクター（例えば、ＳＭＮポリペプチドをコードするペイロードを含む）の効力は、中空カプシドの存在下では低下しない。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、複数の中空ウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、複数の中空ウイルスカプシド（例えば、中空ＡＡＶカプシド）を含み、例えば、組換えウイルスベクターを含むカプシドに対する中空カプシドの比率は、約２：１～約１：１０、例えば、約１：１～約１：３である。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクター調製物（例えば、ＡＡＶ調製物）は、３０％以下の中空カプシド、例えば、４０％、２５％、２０％、１５％、１０％、７．５％、５％、２．５％、１％、またはそれ以下の中空カプシドを含む。
【0116】
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの相対的効力は、例えば、標準曲線に対する平行線分析（ＰＬＡ）によって、例えば、線形回帰データフィット後の標準試料の相対的効力によって決定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターの相対的効力は、標準試料と比較して、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、またはそれ以上である。任意の適切な標準試料を使用し得る。本明細書で使用される場合、「標準試料」は、その濃度及び／または効力が既知である組換えウイルスベクター（例えば、ＳＭＮポリペプチドをコードする）を含む組成物を指す。
【0117】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のアッセイは、高い正確度で効力を決定する。いくつかの実施形態において、効力は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の正確度で決定される。いくつかの実施形態において、効力は、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の精度で決定される。
【0118】
使用
本開示は、とりわけ、細胞または組織に遺伝子治療を送達する方法を提供する。特に、本開示は、本明細書に記載の方法で効力をアッセイした複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）で対象を治療する方法を提供する。
本開示は、とりわけ、細胞または組織に遺伝子治療を送達する方法を提供する。特に、本開示は、本明細書に記載の方法で効力をアッセイした複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）で対象を治療する方法を提供する。
【0119】
いくつかの実施形態において、本発明の方法及びキットは、遺伝子治療の評価及び／またはモニタリングのために使用し得る。いくつかの実施形態において、遺伝子治療は、本明細書に記載の方法でアッセイされた複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）の投与を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子治療を評価及び／またはモニタリングための試料は、遺伝子治療の開始前に得られ得る。いくつかの実施形態において、試料は、第１の遺伝子治療処置または用量の後に得られる。いくつかの実施形態において、試料は、遺伝子治療の終了後に得られる。いくつかの実施形態において、試料は、遺伝子治療が実施される前、実施される間、もしくは実施後の特定の時点、間隔、または任意の他の時間の測定基準で得られる。
【0120】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で効力をアッセイした複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、疾患、障害、または状態に罹患しているか、または疾患、障害、または状態のリスクに曝されている対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、器官、組織、または細胞とエクスビボで接触する。器官、組織、または細胞は、対象に導入することができ、そうでなければレシピエントの免疫系によって引き起こされる損傷から保護することができる。
【0121】
いくつかの実施形態において、疾患または障害は、運動ニューロン疾患または障害、例えば、運動ニューロンの１つ以上の機能に影響を及ぼす疾患または障害を含むか、または疾患または障害である。いくつかの実施形態において、中枢神経系（ＣＮＳ）運動ニューロンにおけるタンパク質欠乏または機能障害は、運動ニューロン疾患または障害を引き起こす。いくつかの実施形態において、運動ニューロンは、脳組織内にある。いくつかの実施形態において、運動ニューロンは、脊髄組織内にある。例示的な運動ニューロンの疾患及び障害には、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽球根運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、進行性筋萎縮症（ＰＭＡ）、進行性球根麻痺（ＰＢＰ）、及び遠位遺伝性運動ニューロパチーが含まれるが、これらに限定されない。
【0122】
本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）の送達のために企図される脳領域には、運動皮質及び／または脳幹が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、脊髄に送達される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、下位運動ニューロンに送達される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、神経細胞、グリア細胞、及び／またはＳｃｈｗａｎｎ細胞に送達される。いくつかの実施形態において、グリア細胞は、ミクログリア細胞、乏突起膠細胞、または星状細胞を含むか、またはそれらである。
【0123】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の複数の組換えウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）は、ＳＭＡを有するか、またはＳＭＡのリスクがある対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象は、脊髄における運動ニューロン変性及び／または骨格筋萎縮を呈する。いくつかの実施形態において、対象は、筋力低下、身体障害、及び／または死亡リスクの増加を含む１つ以上の症状を呈する。
【0124】
ＳＭＡは、米国では１万人に１人の発症率で、小児の死亡を引き起こす、最も一般的に遺伝する進行性遺伝性神経筋疾患である。いくつかの実施形態において、対象は、子供である。いくつかの実施形態において、対象は、青少年である。ＳＭＡは、亜型間及び亜型内の年齢発症、重症度、進行速度、及びばらつきの幅広い範囲を有する。ＳＭＡ１型～４型の４つの亜型について、１型は、２歳以内の最悪の予後及び死亡に関連する最も重篤な型であると分類される。いくつかの実施形態において、ＳＭＡは、ＳＭＡ１型、ＳＭＡ２型、ＳＭＡ３型、ＳＭＡ４型、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態において、対象は、ＳＭＮ１遺伝子のホモ接合変異を含む。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、野生型ＳＭＮ１遺伝子を有する対象と比較して、ＳＭＮポリペプチドの発現が低減する。
【0125】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号を含む、本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参照文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。
【0126】
本開示を以下の実施例によってさらに例示する。実施例を例示のみを目的として提供する。本開示の範囲または内容をいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0127】
以下の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、以下の実験が実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。
【0128】
実施例１．効力アッセイの開発
本実施例は、ロバストな効力アッセイの開発を示す。本実施例は、ＡＡＶｈｕ６８ウイルスベクターによってコードされるＳＭＮタンパク質の効力を決定するための重要な試薬及びプロセスを説明する。
本実施例は、ロバストな効力アッセイの開発を示す。本実施例は、ＡＡＶｈｕ６８ウイルスベクターによってコードされるＳＭＮタンパク質の効力を決定するための重要な試薬及びプロセスを説明する。
【0129】
１．１抗ＳＭＮ抗体によるＳＭＮタンパク質検出
抗体特異性は、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）アッセイの実施に不可欠である。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）で産生された市販の精製したＳＭＮタンパク質に対して、５つの異なる市販の抗体（表２）の特異性をウエスタンブロットで試験した。図１４にウエスタンブロットで示すように、これらの５つの抗体（メーカーの推奨に基づいて異なる希釈で試験した）は、精製したＳＭＮタンパク質（１００及び２００ｎｇ）を認識したが、陰性対照として使用したＲＳ１タンパク質は認識しなかった。
抗体特異性は、ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）アッセイの実施に不可欠である。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）で産生された市販の精製したＳＭＮタンパク質に対して、５つの異なる市販の抗体（表２）の特異性をウエスタンブロットで試験した。図１４にウエスタンブロットで示すように、これらの５つの抗体（メーカーの推奨に基づいて異なる希釈で試験した）は、精製したＳＭＮタンパク質（１００及び２００ｎｇ）を認識したが、陰性対照として使用したＲＳ１タンパク質は認識しなかった。
【表2】
【0130】
高レベルの内因性ＳＭＮタンパク質を発現するＨＥＫ２９３全細胞溶解物（５０ｎｇ）に対して抗体の特異性をさらに評価した。図１５に示すように、ＧｅｎｅＴｅｘ及びＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒから購入した抗体は、細菌精製ＳＭＮタンパク質及び内因性ＳＭＮタンパク質の両方を検出するように見える。さらに、３つのＧｅｎｅＴｅｘ抗体の感受性は、ＨＥＫ２９３細胞溶解物中の５０ｎｇほど低い精製ＳＭＮ１タンパク質または内因性ＳＭＮタンパク質を検出できないＮｏｖｕｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌモノクローナルＳＭＮ１抗体と比較して、高かった（図２）。
【0131】
１．２細胞株の選択
次の工程は、使用する細胞型を決定することであった。細胞株は、培養しやすく、可能であれば目的の疾患の作用機序に関連して感染しやすい必要がある。試験した細胞株には、ＨｅＬａ－ＲＣ３２及びＳＨ－ＳＹ５Ｙが含まれた。ＳＭＮの高い内因性発現により、ＨｅＬａ－ＲＣ３２細胞株を使用することは困難であったが、ＨＣＩにより検出されたバックグラウンドシグナルが高く、図１に示すように結果のばらつきが増加した。
次の工程は、使用する細胞型を決定することであった。細胞株は、培養しやすく、可能であれば目的の疾患の作用機序に関連して感染しやすい必要がある。試験した細胞株には、ＨｅＬａ－ＲＣ３２及びＳＨ－ＳＹ５Ｙが含まれた。ＳＭＮの高い内因性発現により、ＨｅＬａ－ＲＣ３２細胞株を使用することは困難であったが、ＨＣＩにより検出されたバックグラウンドシグナルが高く、図１に示すように結果のばらつきが増加した。
【0132】
ヒト神経芽腫細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、インビトロでの急性なＳＭＮ低下の効果を評価するために、ＳＭＡの代表的な細胞培養モデルとして以前に使用した。神経細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、ＳＭＮの作用機序に関連しており、ＡＡＶ９ベクターに許容的である。ＳＭＮについて条件付きでノックダウンしたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（例えば、Ｊａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１１４（１２）：Ｅ２３４７－Ｅ２３５６、２０１７に記載のＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞）は、ＨＣＩによって検出されたＳＭＮバックグラウンドの大幅な低減を示し、結果としてアッセイのばらつきを示した。
【0133】
条件付きＳＭＮノックダウンの効率を確認するために、操作されたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２０及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２８細胞（２つの異なるｓｈＲＮＡ配列を発現する２つのＳＭＮ ＫＤ細胞株）を播種し、ＤＯＸで３日間及び７日間処理した。しかしながら、細胞が不健康に見えるため、７日間のＤＯＸ処理をさらなる開発で使用しないものとする。ウエスタンブロッティングによって評価したＳＭＮの発現（図２）は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２０及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２８細胞における３日間のＤＯＸ処理後、０日目（未処理細胞）と比較してＳＭＮ内因性タンパク質の大幅な低下を示す。結論として、ＳＭＮ発現は、両ｓｈＲＮＡによって効率的にノックダウンされている。
【0134】
１．３感染パラメータの最適化
ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞の最適継代の決定
ＧＥＭ形成に対する細胞継代の影響を調べるために、異なる継代で操作したＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞をドキシサイクリンで３日間処理し、凍結した。アッセイを、図３の詳細な説明に記載のように実施した。初期の継代からの細胞を使用して得られたデータは、１１、１５、及び２５継代（より高い継代は試験しなかった）での細胞と比較して低いシグナル及び傾きを有した。したがって、このアッセイでは、１１～２５継代の細胞のみを使用した。
ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞の最適継代の決定
ＧＥＭ形成に対する細胞継代の影響を調べるために、異なる継代で操作したＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞をドキシサイクリンで３日間処理し、凍結した。アッセイを、図３の詳細な説明に記載のように実施した。初期の継代からの細胞を使用して得られたデータは、１１、１５、及び２５継代（より高い継代は試験しなかった）での細胞と比較して低いシグナル及び傾きを有した。したがって、このアッセイでは、１１～２５継代の細胞のみを使用した。
【0135】
培養下ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞対凍結状態からの細胞のプレーティング
細胞は、多くの場合、細胞ベースのバイオアッセイの最も可変かつ予測不可能な成分であり、培養下細胞は、ばらつきが高くなる傾向がある。培養下に維持された細胞及び凍結状態から解凍及びプレーティングされた細胞（「解凍及び開始」細胞）の性能を比較した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞について顕著な差異は見られなかった（図４）。「解凍及び開始」細胞は、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１感染後のＧＥＭの形成のために、十分な細胞バンクを維持すること、及び各細胞バンクの評価を必要とするが、この方法は、分析者にとってより便利であり、アッセイ時間を低減し、細胞を同期させ、継代によるばらつきを排除する。したがって、「解凍及び開始」細胞をアッセイで使用した。
細胞は、多くの場合、細胞ベースのバイオアッセイの最も可変かつ予測不可能な成分であり、培養下細胞は、ばらつきが高くなる傾向がある。培養下に維持された細胞及び凍結状態から解凍及びプレーティングされた細胞（「解凍及び開始」細胞）の性能を比較した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞について顕著な差異は見られなかった（図４）。「解凍及び開始」細胞は、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１感染後のＧＥＭの形成のために、十分な細胞バンクを維持すること、及び各細胞バンクの評価を必要とするが、この方法は、分析者にとってより便利であり、アッセイ時間を低減し、細胞を同期させ、継代によるばらつきを排除する。したがって、「解凍及び開始」細胞をアッセイで使用した。
【0136】
９６ウェルプレートにおけるプレーティング密度の最適化
効力アッセイに使用する最適な細胞密度を決定するために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞を９６ウェルプレート中のウェルごとに６つの異なる細胞密度でプレーティングした。異なるｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１ ＭＯＩで細胞当たり形成されたＧＥＭの数を調べた。ウェル当たり２×１０４の細胞を用いて実施した方法開発中の予備実験を、それらの実験の参照として使用した。図５に示すように、所与のＭＯＩに関して、試験したすべての細胞密度に関して良好なシグナルが達成された。これらの結果に基づいて、ベクター材料を節約するために、アッセイ開発に、１×１０４細胞／ウェルのより低い細胞密度を使用した。
効力アッセイに使用する最適な細胞密度を決定するために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞を９６ウェルプレート中のウェルごとに６つの異なる細胞密度でプレーティングした。異なるｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１ ＭＯＩで細胞当たり形成されたＧＥＭの数を調べた。ウェル当たり２×１０４の細胞を用いて実施した方法開発中の予備実験を、それらの実験の参照として使用した。図５に示すように、所与のＭＯＩに関して、試験したすべての細胞密度に関して良好なシグナルが達成された。これらの結果に基づいて、ベクター材料を節約するために、アッセイ開発に、１×１０４細胞／ウェルのより低い細胞密度を使用した。
【0137】
感染時間の最適化
ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１によるＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞の感染を最適化して、３日間細胞を感染させることが、より良い曲線またはシグナル対バックグラウンド比を産生するかどうかを決定した。以下の図６に示すように、感染後３日間細胞をインキュベートすることで、細胞当たり形成されるＧＥＭの数が増加されるのではなく、アッセイの長さが延長される。細胞を２日間感染させることを、さらなる開発に使用した。
ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１によるＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞の感染を最適化して、３日間細胞を感染させることが、より良い曲線またはシグナル対バックグラウンド比を産生するかどうかを決定した。以下の図６に示すように、感染後３日間細胞をインキュベートすることで、細胞当たり形成されるＧＥＭの数が増加されるのではなく、アッセイの長さが延長される。細胞を２日間感染させることを、さらなる開発に使用した。
【0138】
アッセイをさらに合理化するために、同日対翌日の感染プロトコルを比較した。同日にプレーティングして感染した細胞によって形成されたＧＥＭの数は、翌日に感染した細胞と比較して多かったが、アッセイのダイナミックレンジは同様のままであった（図７）。さらに、同日に細胞をプレーティングして感染させると、実験の長さも短くなり、１週間に２つではなく３つのアッセイが可能になる。したがって、同日感染をさらなる開発作業に使用した。
【0139】
ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１及びアデノウイルス５の同時感染は必要ない
ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）は、産生細胞株によるｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の産生におけるヘルパーウイルスとして使用される。この種類のアプローチは、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１だけでなく、不要なヘルパーウイルスを排除するために追加の精製工程を必要とするアデノウイルス粒子も産生する。しかしながら、一部の試料は、精製後に残留Ａｄ５を含有し得る。Ａｄ５が効力アッセイの結果に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞を、ヒトアデノウイルス５の存在または非存在下で同時感染させた（図８）。５０ＭＯＩでのＡｄ５の存在に有意差は見られなかった。
ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）は、産生細胞株によるｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の産生におけるヘルパーウイルスとして使用される。この種類のアプローチは、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１だけでなく、不要なヘルパーウイルスを排除するために追加の精製工程を必要とするアデノウイルス粒子も産生する。しかしながら、一部の試料は、精製後に残留Ａｄ５を含有し得る。Ａｄ５が効力アッセイの結果に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙｓｈ１２０細胞を、ヒトアデノウイルス５の存在または非存在下で同時感染させた（図８）。５０ＭＯＩでのＡｄ５の存在に有意差は見られなかった。
【0140】
１．４免疫染色の最適化
一次抗体及び二次抗体の最適化
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞におけるＧＥＭ染色及び検出を改善するために、２つの濃度の一次抗体（１：２５０及び１：５００）を、２つの濃度の３種の異なる二次抗体（Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ ＩｇＧ１ヤギ抗マウス、及びＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス；１：５００及び１：１０００）で試験した。染色後、細胞当たりの検出されたＧＥＭの数は、使用した一次抗体／二次抗体の組み合わせとは無関係に同様であった。結論として、アッセイ開発中に一次抗体及び二次抗体を１：５００希釈で使用し、アッセイ用に同じ濃度で組み合わせて使用した。
一次抗体及び二次抗体の最適化
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞におけるＧＥＭ染色及び検出を改善するために、２つの濃度の一次抗体（１：２５０及び１：５００）を、２つの濃度の３種の異なる二次抗体（Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ ＩｇＧ１ヤギ抗マウス、及びＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５５５ヤギ抗マウス；１：５００及び１：１０００）で試験した。染色後、細胞当たりの検出されたＧＥＭの数は、使用した一次抗体／二次抗体の組み合わせとは無関係に同様であった。結論として、アッセイ開発中に一次抗体及び二次抗体を１：５００希釈で使用し、アッセイ用に同じ濃度で組み合わせて使用した。
【0141】
細胞固定
細胞固定の質は、免疫蛍光の質を決定し、結果として、効力アッセイの結果を決定する。固定の温度は、固定の効率、画像の品質に影響を与える重要なパラメータであり、細胞形態（ブルブ形成、空胞形成等）に影響を与え得る。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の異なるＭＯＩについて細胞当たりの検出されたＧＥＭの数は、４℃またはＲＴで４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で固定された細胞間で同等であった（図９）。その結果、より使いやすいため細胞をＲＴで固定した。
細胞固定の質は、免疫蛍光の質を決定し、結果として、効力アッセイの結果を決定する。固定の温度は、固定の効率、画像の品質に影響を与える重要なパラメータであり、細胞形態（ブルブ形成、空胞形成等）に影響を与え得る。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の異なるＭＯＩについて細胞当たりの検出されたＧＥＭの数は、４℃またはＲＴで４％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で固定された細胞間で同等であった（図９）。その結果、より使いやすいため細胞をＲＴで固定した。
【0142】
ブロッキングバッファー
ブロッキングバッファーは、免疫染色の質を向上させる抗体の非特異的結合を防止するために不可欠である。ブロッキングが部分的または不十分である場合、抗体は、特異的抗体－抗原反応性に関連しない様々な部位に結合し得る。ＬＩ－ＣＯＲバッファーによるブロッキングを、自家製５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）／ＰＢＳと比較した。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の異なるＭＯＩについて細胞当たりに検出されたＧＥＭの数は、ＬＩ－ＣＯＲブロッキング試薬または５％ＮＧＳ／ＰＢＳ中でインキュベートする細胞間で同等であった（図１０）。結果として、組成物が完全に特徴付けられ、制御されるので、細胞を５％ＮＧＳ／ＰＢＳブロッキング試薬中でインキュベートした。
ブロッキングバッファーは、免疫染色の質を向上させる抗体の非特異的結合を防止するために不可欠である。ブロッキングが部分的または不十分である場合、抗体は、特異的抗体－抗原反応性に関連しない様々な部位に結合し得る。ＬＩ－ＣＯＲバッファーによるブロッキングを、自家製５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）／ＰＢＳと比較した。ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の異なるＭＯＩについて細胞当たりに検出されたＧＥＭの数は、ＬＩ－ＣＯＲブロッキング試薬または５％ＮＧＳ／ＰＢＳ中でインキュベートする細胞間で同等であった（図１０）。結果として、組成物が完全に特徴付けられ、制御されるので、細胞を５％ＮＧＳ／ＰＢＳブロッキング試薬中でインキュベートした。
【0143】
１．５データの取得及び分析
神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞株を、１×１０４細胞／ウェルの比較的低い細胞密度でプレーティングした。その結果、より多く表す分析のために、取得した画像の数は、２０フィールド／ウェルから３０フィールド／ウェルに増加した。
神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞株を、１×１０４細胞／ウェルの比較的低い細胞密度でプレーティングした。その結果、より多く表す分析のために、取得した画像の数は、２０フィールド／ウェルから３０フィールド／ウェルに増加した。
【0144】
ＧＥＭを検出及び定量化するためのパラメータは、アッセイの品質及び信頼性に不可欠である。分析の２つの主要なパラメータは、定量化の領域及びＧＥＭ定量化の方法である。ＳＭＮ複合体の形成が細胞質内で行われるため、ＧＥＭ定量化の領域は、核及び核の外側の８ピクセルを含んだ。分析を核または核の外側の４ピクセルに限定すると、ＧＥＭ／細胞の数は比例してのみ低下するが、アッセイの結果には影響しない。
【0145】
「ローカルマキシマ」方法は、スポット検出領域内の画素強度のスパイクを識別するＧＥＭの数を決定するためのピーク検出方法である。この方法に基づいて、１つのスポット領域内で多くのピーク（１ピーク＝１オブジェクト）を検出することができ、細胞当たりに検出されるオブジェクトの数が増加する。大きさ、形状、及び強度について計数、測定し得る領域としてスポットを識別する「ボックス」方法を実施した。この方法を用いることで、１細胞当たりの検出オブジェクト数は低下するが、１細胞当たりのＧＥＭ数をより多く表すと考えられた。さらに、予想されるように、ＤＯＸ処理細胞ではＧＥＭは検出されなかった。結論として、「ボックス」方法解析を用いて、ＧＥＭを、核内にその外側の８ピクセルを加えて定量化した。
【0146】
多くの生物学的応答はシグモイド曲線に適合する。１細胞当たりに形成されたＧＥＭの数の上限に達するように、広い範囲のｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１のＭＯＩ（６．２５×１０４～８×１０６ＶＧ／細胞）を試験した。しかしながら、曲線の上部漸近線には一貫して到達しなかった。したがって、曲線の線形部分（６×１０５～４×１０６ＶＧ／細胞）を平行線分析に使用した。
【0147】
１．６効力アッセイの再現性
再現性を評価するために、アッセイを異なる日に２名の異なる分析者によって３回実施し、結果を比較した。図１１に示すように、３つの実験は同様であり、平均結果を表す曲線上に低標準偏差でさらに示す。
再現性を評価するために、アッセイを異なる日に２名の異なる分析者によって３回実施し、結果を比較した。図１１に示すように、３つの実験は同様であり、平均結果を表す曲線上に低標準偏差でさらに示す。
【0148】
１．７アッセイの安定性を示す特性の調査
ＧＥＭ形成効力アッセイが安定性を示すかどうかを決定するために、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１材料を、様々な期間にわたって異なる温度での温熱ストレスに供した（表３）。温熱ストレス後の試料のゲノム力価を決定した。ゲノム力価のわずかな低下を有する試料のみを、アッセイにおけるそれらの濃度を新たに決定したゲノム力価に従って調整した後に、効力について試験した。表３に提示する結果は、ゲノム力価の低下に依存しない効力に著しい低下があったことを示す。結論として、ＧＥＭ形成アッセイは、安定性を示すものであり、ＳＡＲ及び安定性研究に使用することができる。
ＧＥＭ形成効力アッセイが安定性を示すかどうかを決定するために、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１材料を、様々な期間にわたって異なる温度での温熱ストレスに供した（表３）。温熱ストレス後の試料のゲノム力価を決定した。ゲノム力価のわずかな低下を有する試料のみを、アッセイにおけるそれらの濃度を新たに決定したゲノム力価に従って調整した後に、効力について試験した。表３に提示する結果は、ゲノム力価の低下に依存しない効力に著しい低下があったことを示す。結論として、ＧＥＭ形成アッセイは、安定性を示すものであり、ＳＡＲ及び安定性研究に使用することができる。
【表3】
【0149】
１．８効力アッセイに対する中空カプシドの効果
ＡＡＶ材料は、精製プロセス中に除去することができない中空ＡＡＶ粒子の一部を含有し（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の標準試料は、中空粒子の５．６％を含有する）、完全粒子の形質導入の効率に影響を及ぼし得る。ウイルスベクター効力に対する中空粒子の影響を決定するために、固定量の完全粒子を含有するｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１材料を中空カプシド調製物でスパイクして、両者間の１：１及び１：３の比率を達成した。ＨＥＫ２９３懸濁細胞をヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＳＭＮ１プラスミドで一過性トランスフェクションした後に中空粒子を得、ＣＩＭＱカラム上で完全カプシドから分離し、０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ－Ｆ６８を含むＨａｒｖａｒｄバッファー中で中和し、濃縮し、バッファー交換した。カプシド力価ならびにｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１及び中空カプシド材料中の残留不純物のレベルも、完全対中空比率及びマトリックス評価の計算のために決定した（表４）。高レベルのＨＥＫ ＨＣＰが中空の調製物中に見出され、完全粒子の感染力に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、中空粒子材料は、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１効力には影響を及ぼさず（図１２）、それ自体はいかなる活性も生じなかった。
ＡＡＶ材料は、精製プロセス中に除去することができない中空ＡＡＶ粒子の一部を含有し（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１の標準試料は、中空粒子の５．６％を含有する）、完全粒子の形質導入の効率に影響を及ぼし得る。ウイルスベクター効力に対する中空粒子の影響を決定するために、固定量の完全粒子を含有するｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１材料を中空カプシド調製物でスパイクして、両者間の１：１及び１：３の比率を達成した。ＨＥＫ２９３懸濁細胞をヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＳＭＮ１プラスミドで一過性トランスフェクションした後に中空粒子を得、ＣＩＭＱカラム上で完全カプシドから分離し、０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ－Ｆ６８を含むＨａｒｖａｒｄバッファー中で中和し、濃縮し、バッファー交換した。カプシド力価ならびにｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１及び中空カプシド材料中の残留不純物のレベルも、完全対中空比率及びマトリックス評価の計算のために決定した（表４）。高レベルのＨＥＫ ＨＣＰが中空の調製物中に見出され、完全粒子の感染力に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、中空粒子材料は、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１効力には影響を及ぼさず（図１２）、それ自体はいかなる活性も生じなかった。
【表4】
【0150】
結論
ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１等のＡＡＶ－ＳＭＮ組換えウイルスベクターのために開発された細胞ベースの効力アッセイは、ハイコンテントイメージングによるＧＥＭの正確な検出及び定量化に依存する。このアッセイは、ＳＭＮタンパク質のバックグラウンド発現を低下させる、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンを有するＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ神経芽腫細胞株を使用する。この細胞株の使用により、アッセイは作用機序との関連性がより高いものとなり、アッセイ性能を向上させる。さらに、アッセイは適格であり、９９．６％の正確度を示し、９．２％の精度は、５０～１５０％の相対的効力の線形範囲であった。
ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１等のＡＡＶ－ＳＭＮ組換えウイルスベクターのために開発された細胞ベースの効力アッセイは、ハイコンテントイメージングによるＧＥＭの正確な検出及び定量化に依存する。このアッセイは、ＳＭＮタンパク質のバックグラウンド発現を低下させる、ＳＭＮ１遺伝子の条件付きノックダウンを有するＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ神経芽腫細胞株を使用する。この細胞株の使用により、アッセイは作用機序との関連性がより高いものとなり、アッセイ性能を向上させる。さらに、アッセイは適格であり、９９．６％の正確度を示し、９．２％の精度は、５０～１５０％の相対的効力の線形範囲であった。
【0151】
例示的なアッセイ条件は以下の通りであった：
・細胞モデル：ＳＭＮ ＫＤヒト神経芽腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２０をドキシサイクリンで前処理した。
・細胞播種密度：ウェル当たり１×１０４の細胞。凍結状態から直接プレーティングした。
・４×１０６ＶＧ／細胞の開始ＭＯＩ及び１．６倍段階希釈による５点曲線を、標準、試料、及び対照について三つ組で行う。
・ヘルパーウイルス（Ａｄ５）は必要ない。
・細胞モデル：ＳＭＮ ＫＤヒト神経芽腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ｓｈＲＮＡ１２０をドキシサイクリンで前処理した。
・細胞播種密度：ウェル当たり１×１０４の細胞。凍結状態から直接プレーティングした。
・４×１０６ＶＧ／細胞の開始ＭＯＩ及び１．６倍段階希釈による５点曲線を、標準、試料、及び対照について三つ組で行う。
・ヘルパーウイルス（Ａｄ５）は必要ない。
【0152】
結論として、このアッセイは、ＳＭＮ（例えば、ＳＭＮ１）製剤原料及び製剤の放出、特徴付け、及び安定性の研究のための、ＳＭＮをコードする遺伝子（複数可）（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１）活性を含有するウイルスベクターの相対的効力を測定するために使用することができる。
【0153】
実施例２．Ｇｅｍｉｎ２及びＳＭＮ１の共局在
以下の実施例は、宿主細胞をアセトン：メタノールの１：１混合物で固定したときに、Ｇｅｍｉｎ２が免疫蛍光によって可視化され得ることを示した。染色及び検出されたＧＥＭの数を改善する試みの中で、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞（ｓｈＲＮＡ１２０によるノックダウン）をＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１に感染させた。この実験の目標は、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）によって、Ｇｅｍｉｎ２及びＳＭＮタンパク質がＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞のＧＥＭに共局在していることを示すことであった。
以下の実施例は、宿主細胞をアセトン：メタノールの１：１混合物で固定したときに、Ｇｅｍｉｎ２が免疫蛍光によって可視化され得ることを示した。染色及び検出されたＧＥＭの数を改善する試みの中で、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞（ｓｈＲＮＡ１２０によるノックダウン）をＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１に感染させた。この実験の目標は、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）によって、Ｇｅｍｉｎ２及びＳＭＮタンパク質がＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞のＧＥＭに共局在していることを示すことであった。
【0154】
０日目：細胞をプレーティングする
１．ドキシサイクリンで前処理した凍結ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を、３７℃の水浴中で２分間解凍した後、温かい培地（４２．３％ＤＭＥＭ＋４２．３％ＨａｍのＦ－１２栄養素混合物＋１５％ＦＢＳ）中で再懸濁した。
２．細胞を遠心分離し（２５０ｇで５分間）、次いで５ｍＬの培地に再懸濁し、計数した。
３．次いで、総体積２０ｍＬの細胞中の１×１０６細胞について１×１０４細胞／２００μＬまたは５×１０４細胞／ｍＬで細胞をプレーティングした。９１％生存細胞（０．９×１０６細胞；１３ｍＬ培地中の５ｍＬ細胞）についてドキシサイクリンを０．１８×１０６生存細胞／ｍＬに添加した。
４．次いで、２００μＬを各ウェルに添加した。
５．各プレートをフード内に２０分間放置した。
６．各プレートを５％ＣＯ２で、３７℃で一晩インキュベートした。
１．ドキシサイクリンで前処理した凍結ＳＨ－ＳＹ５Ｙ ＫＤ細胞を、３７℃の水浴中で２分間解凍した後、温かい培地（４２．３％ＤＭＥＭ＋４２．３％ＨａｍのＦ－１２栄養素混合物＋１５％ＦＢＳ）中で再懸濁した。
２．細胞を遠心分離し（２５０ｇで５分間）、次いで５ｍＬの培地に再懸濁し、計数した。
３．次いで、総体積２０ｍＬの細胞中の１×１０６細胞について１×１０４細胞／２００μＬまたは５×１０４細胞／ｍＬで細胞をプレーティングした。９１％生存細胞（０．９×１０６細胞；１３ｍＬ培地中の５ｍＬ細胞）についてドキシサイクリンを０．１８×１０６生存細胞／ｍＬに添加した。
４．次いで、２００μＬを各ウェルに添加した。
５．各プレートをフード内に２０分間放置した。
６．各プレートを５％ＣＯ２で、３７℃で一晩インキュベートした。
【0155】
１日目：細胞感染
１．培地を、３７℃の水浴中で２０分間温めた。
２．ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（４．２７ｅ１３ＧＣ／ｍｌ）を解凍した。
３．希釈を、以下（表５）に記載のように、２ｍＬの低タンパク質結合ディープウェルプレート中で実施し、次いで各ウェル中で６～７回上下に混合した。
４．次いで、細胞を含有するすべてのウェルから培地を除去し、１５０μｌの完全培地を非感染細胞に添加し、１５０μｌのＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１を添加した。
５．プレートを５％ＣＯ２下で、３７℃で４８時間インキュベートした。
１．培地を、３７℃の水浴中で２０分間温めた。
２．ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１（４．２７ｅ１３ＧＣ／ｍｌ）を解凍した。
３．希釈を、以下（表５）に記載のように、２ｍＬの低タンパク質結合ディープウェルプレート中で実施し、次いで各ウェル中で６～７回上下に混合した。
【表5】
５．プレートを５％ＣＯ２下で、３７℃で４８時間インキュベートした。
【0156】
３日目：細胞染色
１．培地をマルチチャンネルピペットでプレートから吸引し、直接漂白剤に投棄した。
２．１００μｌのメタノール：アセトン１：１混合液（作りたて）中、－２０℃で１５分間固定した。
３．固定液を吸引し、化学フード内のボトルに投棄した。
４．ＤＰＢＳで２×３００μｌ洗浄した。
５．３００μｌのＬｉｃｏｒのＰＢＳブロッキングバッファー（ＩＦプロトコルの開始時に冷蔵庫から取り出す）を添加し、続いて室温で１．５時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
６．ブロッキングバッファーをシンクに投棄し、ペーパータオル上でプレートを下に向けて余分なバッファーを取り除いた。
７．ＳＭＮ１抗体（ＧＴＸ１０１０４７（ウサギ））及びＧｅｍｉｎ２（マウス）抗体をＬｉｃｏｒバッファーで、１：２５０で希釈した。
８．ウェル当たり１００μｌの一次抗体（ＳＭＮ１及び／またはＧｅｍｉｎ２）を添加し、室温で２時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
９．３×３００μｌのＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０で３回洗浄し、ベリーダンサー上で合計１５分間（３＊５分間）ゆっくりと（速度約２）揺動させた。
１０．二次蛍光抗体を光から保護するために、以下のすべての工程を暗所（プレートをアルミホイル紙で覆った）で実施した。
１１．Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体をＬｉｃｏｒブロッキングバッファーで、１：５００で希釈した。
１２．ウェル当たり１００μｌの対応する二次抗体を添加し、室温で１時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
１３．３×３００μｌのＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０で３回洗浄し、ベリーダンサー上で合計１５分間ゆっくりと揺動した（速度約２）。（３＊５分間）。
１４．ＤＰＢＳで希釈したＤＡＰＩ（１：６，０００）２００μｌを攪拌せずに室温で２０分間添加した。
１５．ＤＡＰＩを除去し、２００μｌのＰＢＳを添加した。
１６．ホイル紙に４℃で保存した。
１．培地をマルチチャンネルピペットでプレートから吸引し、直接漂白剤に投棄した。
２．１００μｌのメタノール：アセトン１：１混合液（作りたて）中、－２０℃で１５分間固定した。
３．固定液を吸引し、化学フード内のボトルに投棄した。
４．ＤＰＢＳで２×３００μｌ洗浄した。
５．３００μｌのＬｉｃｏｒのＰＢＳブロッキングバッファー（ＩＦプロトコルの開始時に冷蔵庫から取り出す）を添加し、続いて室温で１．５時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
６．ブロッキングバッファーをシンクに投棄し、ペーパータオル上でプレートを下に向けて余分なバッファーを取り除いた。
７．ＳＭＮ１抗体（ＧＴＸ１０１０４７（ウサギ））及びＧｅｍｉｎ２（マウス）抗体をＬｉｃｏｒバッファーで、１：２５０で希釈した。
８．ウェル当たり１００μｌの一次抗体（ＳＭＮ１及び／またはＧｅｍｉｎ２）を添加し、室温で２時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
９．３×３００μｌのＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０で３回洗浄し、ベリーダンサー上で合計１５分間（３＊５分間）ゆっくりと（速度約２）揺動させた。
１０．二次蛍光抗体を光から保護するために、以下のすべての工程を暗所（プレートをアルミホイル紙で覆った）で実施した。
１１．Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ抗体をＬｉｃｏｒブロッキングバッファーで、１：５００で希釈した。
１２．ウェル当たり１００μｌの対応する二次抗体を添加し、室温で１時間、ベリーダンサー上でゆっくりと（速度約２）揺動させた。
１３．３×３００μｌのＤＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０で３回洗浄し、ベリーダンサー上で合計１５分間ゆっくりと揺動した（速度約２）。（３＊５分間）。
１４．ＤＰＢＳで希釈したＤＡＰＩ（１：６，０００）２００μｌを攪拌せずに室温で２０分間添加した。
１５．ＤＡＰＩを除去し、２００μｌのＰＢＳを添加した。
１６．ホイル紙に４℃で保存した。
【0157】
４日目：イメージング
ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ ＨＣＩプラットフォームを使用して画像を取得した。
ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ ＨＣＩプラットフォームを使用して画像を取得した。
【0158】
結果：
Ｇｅｍｉｎ２（赤色）染色は、画像を取得するために必要な高曝露時間（約０．５秒）で決定したように弱かったが、細胞内のＧｅｍｉｎ２位置を決定した。ＳＭＮ１（緑色）染色は良好であり、低曝露時間は約０．２秒であった。ごく少数のＧｅｍｉｎ２陽性構造を細胞質に局在させた（写真当たり約１、上記の写真の赤い矢印）。ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１による細胞感染後により多くのＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２陽性構造を可視化した。ＨＣＩで取得した画像は、ＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２の重複シグナルを示す（図１３Ａ～Ｂ）。
Ｇｅｍｉｎ２（赤色）染色は、画像を取得するために必要な高曝露時間（約０．５秒）で決定したように弱かったが、細胞内のＧｅｍｉｎ２位置を決定した。ＳＭＮ１（緑色）染色は良好であり、低曝露時間は約０．２秒であった。ごく少数のＧｅｍｉｎ２陽性構造を細胞質に局在させた（写真当たり約１、上記の写真の赤い矢印）。ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１による細胞感染後により多くのＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２陽性構造を可視化した。ＨＣＩで取得した画像は、ＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２の重複シグナルを示す（図１３Ａ～Ｂ）。
【0159】
結論として、これらの結果は、ＳＭＮ１及びＧｅｍｉｎ２の共局在性を示し、ＡＡＶｈｕ６８－ＳＭＮ１による宿主細胞感染後に観察されたＳＭＮ１構造がＧＥＭであることを示す。
【0160】
均等物及び範囲
当業者は、日常的な実験だけを使用して本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載の通りである。
当業者は、日常的な実験だけを使用して本明細書に記載の本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載の通りである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】