特表 2022-543657 オステオポンチンに対する治療用抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-13

(54)【発明の名称】オステオポンチンに対する治療用抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221005BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221005BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20221005BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221005BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221005BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221005BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221005BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20221005BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221005BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221005BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/18

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N15/63 Z

C12N15/62 Z

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K9/107

A61K9/06

A61K9/127

A61K9/51

A61K45/00

A61P43/00 121

A61P35/00

A61P43/00 111

A61P9/00

A61P29/00

A61K47/68

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022507624

(86)(22)【出願日】2020-08-07

(85)【翻訳文提出日】2022-03-30

(86)【国際出願番号】 US2020045466

(87)【国際公開番号】W WO2021030209

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】62/884,818

(32)【優先日】2019-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(71)【出願人】

【識別番号】513171172

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ レプリゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】レオン， ローレンス エル． ケー．

(72)【発明者】

【氏名】モーサー， マイケル ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】マイルズ， ティモシー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C076AA09

4C076AA17

4C076AA19

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC11

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

オステオポンチンに特異的な治療用抗体、およびオステオポンチン関連障害を治療するためのそれらの使用方法が提供される。特に、オステオポンチンのトロンビン切断を阻害するか、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片の活性をブロックする抗体、またはその抗原結合断片が提供される。加えて、抗体コンジュゲート、および抗体または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物または製剤、ならびに抗体、コンジュゲート、または製剤を含むキットも提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、オステオポンチンのトロンビン切断または前記オステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する、単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

ａ）配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または前記配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、または前記配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

ａ）配列番号２２のアミノ酸配列、または前記配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列、または前記配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

ａ）配列番号２６のアミノ酸配列、または前記配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、
ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列、または前記配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

前記オステオポンチンのトロンビン切断断片が、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

前記抗体が、前記ＯＰＮ－Ｒ断片へのインテグリン結合を阻害する、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項10】

前記抗体が、配列番号８の参照配列に対して付番されたオステオポンチンのＡｒｇ１６８を含むエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項11】

前記抗体が、配列番号１～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなるオステオポンチンペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項12】

前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆ_ｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、オステオポンチン関連障害を治療するための組成物。

【請求項14】

薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記薬学的に許容される担体が、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および軟膏からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

抗がん療法剤をさらに含む、請求項１４または１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記抗がん療法剤が、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記オステオポンチン関連障害が、炎症、心臓肥大、心筋線維症、黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、または肺がんである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

オステオポンチン関連障害を治療するための方法であって、治療有効量の請求項１３～１９のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項21】

前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

少なくとも１つの追加の抗がん療法剤を投与することをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗がん療法剤が、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記オステオポンチン関連障害が、オステオポンチンの過剰発現に関連する炎症またはがんである、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記オステオポンチン関連障害が、心臓肥大、心筋線維症、黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、または肺がんである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｂ－Ｒａｆ阻害剤が、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＧＤＣ－０８７９、およびＰＬＸ－４７２０からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、およびＰＤ－３２５９０１からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記抗体が、毎日の投与計画に従って、または間欠的に投与される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

少なくとも部分的な腫瘍反応をもたらすのに十分な期間、複数サイクルの治療が前記対象に施される、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記期間が、少なくとも６ヶ月である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記期間が、少なくとも１２ヶ月である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

完全な腫瘍反応がもたらされる、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記抗体が、前記対象におけるトロンビンの凝固促進活性を妨げない、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

対象における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法であって、有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項36】

請求項１３～１９のいずれか一項に記載の組成物と、がんまたは炎症を治療するためにキットを使用するための指示書と、を含む、キット。

【請求項37】

前記組成物を対象に投与するための手段をさらに含む、請求項３６に記載のキット。

【請求項38】

請求項１に記載の抗体を産生する方法であって、配列番号５～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含む免疫原性ペプチドに対する対象の免疫応答を誘発することを含む、方法。

【請求項39】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、抗がん療法剤、検出可能な標識、およびイメージング剤からなる群から選択される薬剤と、を含む、コンジュゲート。

【請求項40】

前記抗がん療法剤が、細胞傷害性剤、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項３９に記載のコンジュゲート。

【請求項41】

単離された核酸であって、
ａ）配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列、
ｃ）配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
ｄ）配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列、
ｅ）ａ）～ｄ）のヌクレオチド配列と９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ならびに
ｆ）ａ）～ｅ）の相補体、を含む、単離された核酸。

【請求項42】

請求項４１に記載の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、組換え核酸。

【請求項43】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、ベクター系。

【請求項44】

前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または前記配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、または前記配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項４３に記載のベクター系。

【請求項45】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、ベクター系。

【請求項46】

前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２２のアミノ酸配列、または前記配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列、または前記配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項４５に記載のベクター系。

【請求項47】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む、ベクター系。

【請求項48】

前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２６のアミノ酸配列、または前記配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２８のアミノ酸配列、または前記配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖と、を含む、請求項４７に記載のベクター系。

【請求項49】

前記抗体またはその抗原結合断片が、キメラ化またはヒト化される、請求項４３～４８のいずれか一項に記載のベクター系。

【請求項50】

請求項４３～４９のいずれか一項に記載のベクター系を含む、宿主細胞。

【請求項51】

抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、
ａ）前記抗体またはその抗原結合断片の産生に好適な条件下で、請求項５０に記載の宿主細胞を培養することと、
ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片を前記宿主細胞から単離することと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

オステオポンチン（ＯＰＮ）は、幅広いインテグリンに結合する高度に保存されたＲＧＤドメインを有する、マトリックス細胞の多機能タンパク質である。マウスのＡｒｇ１５３（ヒトのＡｒｇ１６８）におけるトロンビン切断は、ＯＰＮ－Ａｒｇ（ＯＰＮ－Ｒ）およびＯＰＮ－Ｃ末端断片（ＯＰＮ－ＣＴＦ）を生成する。Ｃ末端にＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３）を有するＯＰＮ－Ｒは、全長ＯＰＮが結合しないインテグリンのサブセット（α４β１およびα９β１）に結合する。ＯＰＮ－Ｒ断片の生理学的役割は、細胞接着、遊走および生存を促進する免疫調節物質としての役割を含むと考えられる（Ｋａｈｌｅｓ Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３：３８４）。ＯＰＮ－ＣＴＦ断片の役割は十分に研究されていないが、ケモカインに応答して樹状細胞と相互作用し、それらの走化性を促進することが示されている（Ｓｈａｏ Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２７１４６）。ＯＰＮ－Ｒは、関節リウマチ等の炎症性障害に関与してきたが（Ｓｏｎｇ ＪＪ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：３５１７）、がんにおけるその役割は依然として不明である（Ｃａｓｔｅｌｌｏ ＬＭ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１７：４０４９０９８）。カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）またはカボキシペプチダーゼＮ（ＣＰＮ）は、ＯＰＮ－ＲからＣ末端アルギニンを除去してそれをＯＰＮ－Ｌｅｕ（ＯＰＮ－Ｌ）に変換し、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３）結合モチーフへのインテグリン結合を抑止する（Ｍｙｌｅｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５１）：５１０５９－５１０６７，Ｓｈａｏ Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２７１４６）。ＯＰＮ－ＲおよびＯＰＮ－Ｌのレベルの上昇は、関節リウマチ患者からの滑液試料において見られたが、変形性関節症または乾癬性関節炎患者ではそれほど上昇しなかった（Ｓｈａｒｉｆ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ６０：２９０２）。ＯＰＮ－ＣＴＦの役割は、ＯＰＮ－ＣＴＦに対する抗体が保護効果を有することを示唆するマウス実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）モデルにおいても実証されている（Ｃｌｅｍｅｎｔｅ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３２１）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0002】

【非特許文献1】Ｋａｈｌｅｓ Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３：３８４

【非特許文献2】Ｓｈａｏ Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２７１４６

【非特許文献3】Ｓｏｎｇ ＪＪ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：３５１７

【非特許文献4】Ｃａｓｔｅｌｌｏ ＬＭ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１７：４０４９０９８

【非特許文献5】Ｍｙｌｅｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５１）：５１０５９－５１０６７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

オステオポンチンに特異的な治療用抗体、およびオステオポンチン関連障害を治療するためのそれらの使用方法が提供される。特に、オステオポンチンのトロンビン切断、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片とインテグリンおよび／もしくは他の細胞受容体との相互作用を阻害する抗体は、炎症、心臓肥大、心筋線維症、ならびに黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、および肺がん等のオステオポンチンを過剰発現するがん等のオステオポンチン関連障害の治療に有用である。
一態様において、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片が提供され、抗体は、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、オステオポンチンのＡｒｇ１６８を含むエピトープに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなるオステオポンチンペプチドに特異的に結合する。

【0004】

ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0005】

ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0006】

ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0007】

ある特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、二重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、三重特異性抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆ_ｖ断片、またはｓｃＦｖ断片である。

【0008】

別の態様において、オステオポンチン関連障害を治療するための組成物が提供され、組成物は、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を含み、抗体またはその抗原結合断片は、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する。いくつかの実施形態において、オステオポンチン関連障害は、黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、心臓肥大、心筋線維症、または炎症である。

【0009】

ある特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および軟膏からなる群から選択される。

【0010】

ある特定の実施形態において、組成物は、限定されないが、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感剤、および放射性同位体、またはそれらの組み合わせを含む抗がん療法剤をさらに含む。

【0011】

ある特定の実施形態において、組成物は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、またはそれらの組み合わせをさらに含む。例示的なＢ－Ｒａｆ阻害剤としては、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＧＤＣ－０８７９、およびＰＬＸ－４７２０が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、およびＰＤ－３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0012】

別の態様において、オステオポンチン関連障害を治療する方法が提供され、方法は、トロンビン切断部位でオステオポンチンに、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片に特異的に結合する、治療有効量の本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、抗体は、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＯＰＮ－Ｒ断片へのインテグリン結合を阻害する。好ましくは、抗体は、対象におけるトロンビンの凝固促進活性を妨げない。

【0013】

ある特定の実施形態において、オステオポンチン関連障害は、オステオポンチンを過剰発現するがんである。例えば、オステオポンチンを過剰発現するがんとしては、黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、および肺がんが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、方法は、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感剤、および放射性同位体、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、少なくとも１つの追加の抗がん療法剤を投与することをさらに含む。

【0014】

ある特定の実施形態において、方法は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤を投与することをさらに含む。例示的なＢ－Ｒａｆ阻害剤としては、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＧＤＣ－０８７９、およびＰＬＸ－４７２０が挙げられるが、これらに限定されない。

【0015】

ある特定の実施形態において、方法は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤を投与することをさらに含む。例示的なＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、およびＰＤ－３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0016】

ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、毎日の投与計画に従って、または間欠的に投与される。少なくとも部分的な腫瘍反応、またはより好ましくは完全な腫瘍反応をもたらすのに十分な期間、複数サイクルの治療が対象に施され得る。いくつかの実施形態において、期間は、少なくとも６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１．５年、２年またはそれ以上である。

【0017】

別の態様において、対象における腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための方法が提供され、方法は、有効量の、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含み、抗体またはその抗原結合断片は、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する。

【0018】

別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片と、抗がん療法剤、検出可能な標識、およびイメージング剤からなる群から選択される薬剤とを含むコンジュゲートが提供される。例示的な抗がん療法剤としては、細胞傷害性剤、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤、および放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0019】

別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む組成物と、オステオポンチン関連障害を治療するためにキットを使用するための指示書と、を含むキットが提供される。キットは、組成物を対象に投与するための手段をさらに含み得る。

【0020】

別の態様において、抗体を産生する方法が提供され、方法は、配列番号５～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含む免疫原性ペプチドに対する対象の免疫応答を誘発することを含む。

【0021】

別の態様において、ａ）配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖をコードするヌクレオチド配列、ｃ）配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ｄ）配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列、ｅ）ａ）～ｄ）のヌクレオチド配列と８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を有するヌクレオチド配列、ならびにｆ）ａ）～ｅ）の相補体、を含む、単離された核酸が提供される。

【0022】

別の態様において、本明細書に記載の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え核酸が提供される。

【0023】

別の態様において、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含むベクター系が提供される。

【0024】

ある特定の実施形態において、ベクター系は、抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含み、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、または配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖とを含む。

【0025】

ある特定の実施形態において、ベクター系は、抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含み、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２４のアミノ酸配列、または配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖とを含む。

【0026】

ある特定の実施形態において、ベクター系は、抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上のベクターを含み、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む重鎖と、配列番号２８のアミノ酸配列、または配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む軽鎖とを含む。

【0027】

ある特定の実施形態において、本明細書に記載のベクター系は、キメラ化またはヒト化される抗体またはその抗原結合断片をコードする。

【0028】

別の態様において、本明細書に記載のベクター系を含む宿主細胞が提供される。

【0029】

別の態様において、抗体またはその抗原結合断片を産生する方法が提供され、方法は、ａ）抗体またはその抗原結合断片の産生に好適な条件下で、本明細書に記載のベクター系を含む宿主細胞を培養することと、ｂ）抗体またはその抗原結合断片を宿主細胞から単離することと、を含む。

【0030】

別の態様において、本明細書に記載の抗体を産生するハイブリドーマが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0031】

本発明は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むと最もよく理解される。慣例に従って、図面の様々な特徴が縮尺通りでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面には、以下の図が含まれる。

【0032】

【図1】トロンビンおよびＣＰＢ２媒介性ＯＰＮ切断の概略図を示す。

【図2A】ＷＴマウスと比較して、ＯＰＮ ＫＯおよびＯＰＮＲ１５３Ａ ＫＩマウスにおけるＢ１６腫瘍成長の低下を示す。

【図2B】ＷＴマウスと比較して、ＯＰＮ ＫＯおよびＯＰＮＲ１５３Ａ ＫＩマウスにおけるＢ１６腫瘍成長の低下を示す。

【図3A】ＯＰＮ ＫＯおよびＯＰＮ ＫＩマウスの転移モデルにおいて、Ｂ１６腫瘍の成長が同様に抑制されたことを示す。

【図3B】ＯＰＮ ＫＯおよびＯＰＮ ＫＩマウスの転移モデルにおいて、Ｂ１６腫瘍の成長が同様に抑制されたことを示す。

【図4A】脇腹にＢ１６黒色腫を有するマウスのダビガトランエテキシレート処理により、ＷＴにおいて腫瘍成長が抑制されたが、ＯＰＮ－ＫＩマウスでは抑制されなかったことを示す。

【図4B】脇腹にＢ１６黒色腫を有するマウスのダビガトランエテキシレート処理により、ＷＴにおいて腫瘍成長が抑制されたが、ＯＰＮ－ＫＩマウスでは抑制されなかったことを示す。

【図5A】肺にＢ１６黒色腫転移を有するマウスのダビガトランエテキシレート処理により、ＷＴにおいて腫瘍成長が抑制されたが、ＯＰＮ－ＫＯまたはＯＰＮ－ＫＩマウスでは抑制されなかったことを示す。

【図5B】肺にＢ１６黒色腫転移を有するマウスのダビガトランエテキシレート処理により、ＷＴにおいて腫瘍成長が抑制されたが、ＯＰＮ－ＫＯまたはＯＰＮ－ＫＩマウスでは抑制されなかったことを示す。

【図6】ＷＴマウスと比較して、ＯＰＮ－ＫＩマウスにおけるＩｄ８卵巣がん成長の低下を示す。

【図7】全長オステオポンチン（ＯＰＮ－ＦＬ）に結合して、トロンビンによるその切断をブロックするモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を同定するためのスクリーニング戦略を示す。以下の種に由来する、トロンビン切断部位の周囲からのＯＰＮタンパク質配列（一文字アミノ酸コード）が示される：ウサギ、ラット、マウス、ヒト、アカゲザル、カニクイザル、およびブタが示される。アミノ酸の色は、それらの化学的特性を表す。黒い四角は、トロンビン切断部位を囲んでいる。アスタリスクは、保存されたアミノ酸を示している。ウサギモノクローナル抗体を開発するために、キーホールリンペットヘモシアニンに共有結合したペプチド抗原

【数1】

（配列番号１１、太字のアミノ酸はトロンビンにより切断される）を使用してウサギにおいて抗体を産生させた。トロンビン切断部位の周囲のＯＰＮ配列がマウスおよびヒト配列とは異なるため、ウサギを選択した。

【数2】

（配列番号４７、太字のアミノ酸はトロンビンにより切断される）。ペプチド抗原に結合した抗体を産生する細胞は、それらの重鎖および軽鎖ｃＤＮＡをクローニングし、ウサギＩｇＧを発現する発現ベクターに挿入した。次いで、これらの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、培地をアッセイした。次いで、抗体スクリーニングを用いて、マウス、ラット、およびヒトのオステオポンチンと反応する抗体を産生するクローンを同定した。次いで、いくつかの選択されたクローン（以下の図９を参照）をより大きな規模で成長させ、培地を回収し、ＩｇＧを精製した。

【図8】ＯＰＮ抗原ペプチドに対する直接ＥＬＩＳＡにおけるウサギモノクローナルクローンのスクリーニングの結果を示す。３５個の陽性（図示）が同定された。抗ＯＰＮ ＩｇＧを産生するクローンを同定するアッセイのために、９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍＬのアビジンで一晩コーティングした後、ビオチンで標識したＯＰＮ抗原ペプチドを３０分間添加した。次いで、クローンからの上清を１：５０に希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。クローン上清中のＩｇＧの濃度を決定するために、９６ウェルプレートを、２ｕｇ／ｍＬの抗ウサギＩｇＧで一晩コーティングした。次いで、クローンからの上清を１：５０に希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。クローン上清中のＩｇＧの濃度は、ウサギＩｇＧの標準希釈曲線から計算した。

【図9】抗原ペプチド（中灰色、図８のデータ）、マウスＯＰＮ－ＦＬ（薄灰色）およびヒトＯＰＮ－ＦＬ（暗灰色）に対する直接ＥＬＩＳＡにおけるウサギモノクローナル抗体のスクリーニング結果を示す。ヒトＯＰＮ－ＦＬまたはマウスＯＰＮ－ＦＬに結合したクローンを同定した。マウスまたはヒトＯＰＮ－ＦＬ（矢印）への結合に基づいて、４つのクローンがさらなる調査のために選択された。

【図10】ペプチド抗原結合アッセイにおける４つのクローンのＥＣ_５０の決定を示す。精製した抗ＯＰＮ ＩｇＧのＥＣ_５０を決定するために、９６ウェルプレートを２ｕｇ／ｍＬのアビジンで一晩コーティングした後、ビオチンで標識したＯＰＮ抗原ペプチドを３０分間添加した。次いで、選択されたクローンからの上清中のＩｇＧを、プロテインＡ／Ｇセファロースビーズに結合させて溶出することによって精製した。次いで、精製したＩｇＧを段階希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。

【図11】ＯＰＮ抗原ペプチドに結合させるための４つのクローンのＥＣ_５０値を示す。図４のデータに基づいて、図１０のデータを用いたＰｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して、４パラメータフィット方程式からＥＣ_５０値を計算した。Ａ２＝２．６ｎｇ／ｍＬ、Ａ６＝３．２ｎｇ／ｍＬ、Ｅ５＝４．０ｎｇ／ｍＬ、およびＧ７＝９３．２ｎｇ／ｍＬ。

【図12】マウスＯＰＮ－ＦＬに対する直接結合ＥＬＩＳＡにおける４つのクローンのＥＣ_５０値の決定を示す。クローンＡ２、Ａ６およびＥ５は、マウスＯＰＮ－ＦＬに結合する。ＰＢＳ緩衝液中のヤギポリクローナル抗マウスオステオポンチンＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。組換えマウスオステオポンチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をＰＢＳ中１％のＢＳＡで希釈し（２００ｎｇ／ｍｌから開始して希釈）、２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（５００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。

【図13】ヒトＯＰＮ－ＦＬに対する直接結合ＥＬＩＳＡにおける、選択された４つのクローンのＥＣ_５０値の決定を示す。４つのクローンはすべて、ヒトＯＰＮ－ＦＬに結合する。ＰＢＳ緩衝液中のマウスモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体（４μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。組換えヒトオステオポンチンタンパク質（ＧＳＴ－ＯＰＮ－ｈｉｓ、社内で精製）をＰＢＳ中１％のＢＳＡで希釈し（２００ｎｇ／ｍｌから開始して希釈）、２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（５００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。

【図14】ＯＰＮ－Ｒの特異的ＥＬＩＳＡにおいて、切断生成物のうちの１つであるＯＰＮ－Ｒの生成を決定することによって、４つのクローンについてヒトＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断の阻害の決定を示す。４つのクローンすべてが、ヒトＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断を阻害する。３．２μＭの組換えヒトオステオポンチンタンパク質（Ｍｙｌｅｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８（５１）：５１０５９－５１０６７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように精製）を、精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（濃度はデータに示される通り）とともに、またはそれらなしで、室温で２０分間インキュベートした。ヒトトロンビン（３２ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を試料に添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰＰＡＣＫを４．８μＭまで添加した。試料をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１／３００に希釈し、生成されたＯＰＮ－ＲをＯＰＮ－Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡ：ＰＢＳ緩衝液中のマウスモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体（４μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。グルタチオンＳ－トランスフェラーゼタグを有する組換えヒトＯＰＮ－Ｒタンパク質（ＧＳＴ－ＯＰＮ－Ｒ，Ｍｙｌｅｓｅｔａｌ．（２００３），上記）を、較正標準としてＰＢＳの１％のＢＳＡで希釈した（２００ｎｇ／ｍｌから開始して希釈）。トロンビン切断生成物の標準および試料（１／３００希釈から開始してさらに希釈）を２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のビオチン化ウサギポリクローナル抗ＯＰＮ－Ｒ抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｈａｒｉｆ ｅｔ ａｌ，２００９Ａ＋Ｒ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。各試料において生成されたＯＰＮ－Ｒの量を、ＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡにおけるＯＰＮ－Ｒ標準から計算し、次いで、抗体を含まない対照と比較して、異なる濃度での各抗体クローンのトロンビン切断の阻害を計算し、グラフ化した。

【図15】図１４のデータに基づいて、ヒトＯＰＮ－ＦＬの切断の阻害における４つのクローンの阻害％を示す。Ａ２＝８２％、Ａ６＝９５．４％、Ｅ５＝７７．２％、およびＧ７＝６０．１％。

【図16】ＯＰＮ－Ｒの特異的ＥＬＩＳＡにおいて、切断生成物のうちの１つであるＯＰＮ－Ｒの生成を決定することによって、４つのクローンについてマウスＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断の阻害の決定を示す。４つのクローンすべてが、マウスＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断を阻害する。組換えマウスオステオポンチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（２μＭ）を、精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（２μＭ）とともに、またはそれらなしで、室温で２０分間インキュベートした。ヒトトロンビン（２０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を試料に添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰＰＡＣＫを４．７μＭまで添加した。試料をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１／１００または１／３０に希釈し、生成されたＯＰＮ－ＲをマウスＯＰＮ－Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。各試料において生成されたＯＰＮ－Ｒの量を、ＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡにおけるＯＰＮ－Ｒ標準から計算し、次いで、異なる濃度での各抗体クローンのトロンビン切断の阻害を計算し、グラフ化した。

【発明を実施するための形態】

【0033】

オステオポンチンに特異的な治療用抗体、およびオステオポンチン関連障害を治療するためのそれらの使用方法が提供される。特に、オステオポンチンのトロンビン切断を阻害するか、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片の活性をブロックする抗体、またはその抗原結合断片が提供される。加えて、抗体コンジュゲート、および抗体または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物または製剤、ならびに抗体、コンジュゲート、または製剤を含むキットも提供される。

【0034】

治療用抗体、およびオステオポンチン関連障害の治療におけるそれらの使用方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法または組成物に限定されるものではなく、それ自体が当然変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためのものであることも理解されたい。

【0035】

値の範囲が提供される場合、文脈上別段の指示のない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。規定範囲における任意の規定値または介在値と、その規定範囲における任意の他の規定値または介在値との間のより小さい各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してその範囲に含まれても、または除外されてもよく、より小さい範囲に限度のいずれかが含まれる範囲、どちらも含まれない範囲、または両方の限度が含まれる範囲の各々も、規定範囲内の任意の具体的に除外されている限度に従って本発明に包含される。規定範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。

【0036】

別段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの潜在的および好ましい方法および材料を次に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、その刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示が、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することを理解されたい。

【0037】

本開示を読めば当業者に明らかになるように、本明細書に記載および例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または主旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはそれと組み合わされ得る別個の構成要素および特徴を有する。記載される任意の方法は、記載される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。

【0038】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示のない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「がん細胞（ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｃｅｌｌ）」への言及は、当業者に既知のがん細胞、腫瘍細胞、新生細胞、および悪性細胞等の１つ以上のがん細胞およびその均等物への言及を含む等である。

【0039】

「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびにハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を包含する。抗体という用語は、ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３－２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；二重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体（ＢｉＴＥ）、三重特異性抗体、および他の多重特異性抗体（例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．８：１３０、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．１８５：１２２－１３４を参照）、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆ_ｖ分子（非共有結合ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６を参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）；ナノボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｎｔ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：３２８７－３３０３、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９１１：１５－２６を参照；二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９－１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９：１２０９－１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；ａｎｄ Ｕ．Ｋ．Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＧＢ ２，２７６，１６９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２１ Ｓｅｐ．１９９４を参照）；ならびにそのような分子から得られる任意の機能的断片を含み、そのような断片は、親抗体分子の特異的抗原結合特性を保持する。

【0040】

抗原（例えば、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片）への抗体の結合に関して「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生物学的物質の不均一な集団における抗原の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、バックグラウンド上で少なくとも２回特定の抗原に結合し、試料中に存在する他の抗原には有意な量で実質的に結合しない。そのような条件下での抗原への特異的結合は、特定の抗原に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウス、またはヒト等の特定の種由来の抗原に対して産生された抗体は、多型変異体および対立遺伝子を除いて、抗原と特異的に免疫反応し、他のタンパク質とは反応しない抗体のみを得るように選択することができる。この選択は、他の種由来の分子と交差反応する抗体を取り去ることによって達成され得る。様々なイムノアッセイフォーマットを使用して、特定の抗原と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用される（例えば、特定の免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０～１００倍超である。

【0041】

本明細書で使用される「抗体断片」、およびそのすべての文法的変異形は、インタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部として定義され、その部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；連続したアミノ酸残基の１つの中断されない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」称される）、例えば、（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）関連する重鎖部分を有しない、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチド、または軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、（３）関連する重鎖部分を有しない、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片、および（４）非ヒト種からの単一Ｉｇドメイン、または他の特定の単一ドメイン結合モジュールを含むナノボディ；ならびに抗体断片から形成される多重特異性または多価構造が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖（複数可）は、インタクトな抗体の非Ｆｃ領域に見出される任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプ中のＣＨ１）を含有することができ、かつ／またはインタクトな抗体に見出される任意のヒンジ領域配列を含有することができ、かつ／または、ヒンジ領域配列もしくは重鎖（複数可）の定常ドメイン配列に融合されるかまたは位置するロイシンジッパー配列を含有することができる。

【0042】

「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、またはウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分も含む。

【0043】

本開示で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。

【0044】

「単離された」とは、ポリペプチドに言及する場合、指示された分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離して、別個であること、または同じ種類の他の生物学的巨大分子の実質的な非存在下に存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然において通常それに付随する配列の全体もしくは一部を欠く核酸分子、または天然に存在するが、それに付随する異種配列を有する配列、または染色体から解離した分子である。

【0045】

「コンジュゲートされた」という用語は、２つの化合物または薬剤の共有結合または非共有結合手段による結合を指す。

【0046】

「治療」、「治療すること」、「治療する」等の用語は、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指すために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状（複数可）を完全にもしくは部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点では治療的であり得る。「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患または症状の素因を有し得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患および／または症状（複数可）の発生を防止すること、（ｂ）疾患および／または症状（複数可）を阻害すること、すなわち、それらの発症を阻止すること、または（ｃ）疾患症状（複数可）を緩和すること、すなわち、疾患および／または症状（複数可）の抗体を引き起こすことを含む。治療を必要とするものには、既に生じているもの（例えば、がんを有するもの）、ならびに予防が所望されるもの（例えば、がんに対する感受性の増加を有するもの、がんを有すると疑われるもの、再発のリスクを有するもの等）が含まれる。

【0047】

本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物のための単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすのに十分な量で計算された所定の量の本開示の化合物を含有する。新規の単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物および達成される効果、ならびに宿主内の各化合物に関連する薬力学に依存する。

【0048】

「オステオポンチン関連障害」には、炎症、心臓肥大、心筋線維症、ならびに黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、および肺がん等のオステオポンチンを過剰発現するがんを含むが、これらに限定されないオステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片のレベルの上昇に関連する任意の疾患または障害が含まれる。

【0049】

「腫瘍」、「がん」および「新生物」という用語は、互換的に使用され、その成長、増殖、または生存が、正常なカウンターパート細胞の成長、増殖、または生存を超えている哺乳動物の細胞または細胞の集団、例えば、細胞増殖性、過剰増殖性、または分化性障害を指す。典型的には、成長は制御されていない。「悪性腫瘍」という用語は、近傍組織への侵入を指す。「転移」または二次、再発または再発腫瘍、がんまたは新生物という用語は、腫瘍、がんまたは新生物の、対象内の他の部位、位置、または領域への拡散または散在を指し、その部位、位置、または領域は、原発腫瘍またはがんとは異なる。新生物、腫瘍、およびがんは、良性、悪性、転移性、および非転移性種を含み、新生物、腫瘍、もしくはがん、または進行中、悪化中、安定した、もしくは寛解中の新生物、腫瘍、がん、もしくは転移の任意の病期（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、もしくはＶ）またはグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３等）を含む。特に、「腫瘍」、「がん」、および「新生物」という用語には、扁平上皮がん、腺がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、および小細胞がん等のがんが含まれ、限定されないが、頭頸部がん、皮膚がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、膵臓がん、末梢神経腫、膠芽腫、副腎皮質がん、エイズ関連リンパ腫、肛門がん、膀胱がん、髄膜腫、神経膠腫、星状細胞腫、子宮頸がん、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、子宮内膜がん、上皮がん、食道がん、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃がん、胃腸カルチノイド腫瘍、妊娠性栄養腫瘍、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、咽頭下部がん、島細胞がん、カポジ肉腫、喉頭がん、白血病、口唇がん、口腔がん、肝臓がん、男性乳がん、悪性中皮腫、髄芽腫、メルケル細胞がん、転移性子宮頸扁平上皮細胞がん、多発性骨髄腫および他の形質細胞腫瘍、真菌症ファンゴイドおよびセザリー症候群、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中咽頭がん、骨肉腫および骨の線維性組織球腫を含む骨がん、副鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、小腸がん、軟組織肉腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、松果体芽腫、精巣がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰部がん、ならびにウィルムス腫瘍および他の小児腎臓腫瘍が含まれる。

【0050】

特に、「黒色腫」という用語は、転移性黒色腫を含む任意の病期の任意の種類の黒色腫を含む。例えば、「黒色腫」という用語には、悪性黒子、悪性黒子由来黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、ポリポイド黒色腫、および線維形成性黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。黒色腫は、黒色腫細胞によってコードされるタンパク質が、患者の体内の他の場所のタンパク質と異なることを意味する、ゲノムＤＮＡ配列の変化（変異）を含有し得る。一例として、細胞への成長シグナル伝達に関与するタンパク質であるＢ－Ｒａｆは、変異を有し得る。したがって、この用語はまた、Ｖ６００Ｅ変異またはＶ６００Ｋ変異を含む黒色腫を含むが、これらに限定されないＢ－ＲＡＦ変異黒色腫も含む。

【0051】

「抗腫瘍活性」とは、細胞増殖率の低下、したがって、既存の腫瘍または治療中に生じる腫瘍の成長率の低下、および／または既存の新生（腫瘍）細胞または新たに形成された新生細胞の破壊、したがって、治療中の腫瘍の全体的なサイズの減少を意図する。そのような活性は、動物モデルを使用して評価することができる。

【0052】

オステオポンチンまたはそのトロンピン切断断片に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の「治療有効用量または治療有効量」とは、本明細書に記載されるように投与された場合に、抗腫瘍活性または抗炎症活性等の有益な治療反応をもたらす量を意図する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の１つまたは複数の薬物、投与様式等に応じて、対象ごとに異なる。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、本明細書に提供される情報に基づいて、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「腫瘍反応」という用語は、すべての測定可能な病変の減少または消失を意味する。腫瘍反応の基準は、ＷＨＯ報告基準［ＷＨＯ Ｏｆｆｓｅｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，４８－Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９７９）］に基づいている。理想的には、すべての一次元的または二次元的に測定可能な病変は、各評価で測定されるべきである。任意の臓器に複数の病変が存在する場合、そのような測定は不可能である可能性があり、そのような状況下では、可能な場合、最大６つの代表的な病変が選択されるべきである。

【0054】

本明細書で使用される「完全奏効」（ＣＲ）という用語は、少なくとも４週間間隔で２つの評価によって決定される、すべての臨床的に検出可能な悪性疾患の完全消失を意味する。

【0055】

本明細書で使用される「部分奏効」（ＰＲ）という用語は、評価可能な疾患の進行なしに、かつ少なくとも４週間間隔での少なくとも２つの連続した評価によって決定される任意の新しい病変の証拠なしに、すべての測定可能な疾患の最長垂直径の積の和におけるベースラインからの５０％以上の減少を意味する。評価は、溶解性病変のサイズの部分的な減少、溶解性病変の再石灰化、または芽球性病変の密度の低下を示すべきである。

【0056】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、対応する天然アミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0057】

「実質的に精製された」とは、一般に、物質（例えば、抗体、コンジュゲート、化合物、薬物、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド）の単離を指し、そのため物質は、該物質が存在する試料の大部分を構成し、全試料の割合として定義される。典型的には、試料中、実質的に精製された成分は、試料の５０％、好ましくは８０％～８５％、より好ましくは９０％～９５％を占める。目的の物質を精製するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および密度に応じた沈降が含まれる。

【0058】

「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、治療、または療法が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の動物園、競技、または愛玩用の動物を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

【0059】

「薬学的に許容される賦形剤または担体」は、任意選択的に本発明の組成物に含まれてもよく、患者に有意な有害な毒性効果を引き起こさない賦形剤を指す。

【0060】

「薬学的に許容される塩」としては、限定されないが、アミノ酸塩、無機酸で調製される塩、例えば、塩化物、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化物、および硝酸塩、または前述のいずれかの対応する無機酸形態から調製される塩、例えば、塩酸塩等、または有機酸で調製される塩、例えば、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、エチルコハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、パルモ酸塩、サリチル酸塩およびステアリン酸塩、ならびにエストレート、グルセプテートおよびラクトビオン酸塩が挙げられる。同様に、薬学的に許容されるカチオンを含有する塩としては、限定されないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウム（置換アンモニウムを含む）が挙げられる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」、「検出剤」、「イメージング剤」、「診断剤」、および「検出可能な部分」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、蛍光剤、化学発光体、発色団、生物発光タンパク質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、同位体標識、半導体ナノ粒子、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）等を含む、検出可能な分子または物質を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲内で蛍光を示すことができる物質またはその一部を指す。本発明の実施において使用され得る検出可能な標識の特定の例としては、^３Ｈ、^２Ｈ，^１２０Ｉ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^１５Ｎ、^１３Ｎ、^１１０Ｉｎ、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^１８Ｆ、^５２Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^９０Ｙ、^８９Ｚｒ、^９４ｍＴｃ、^９４Ｔｃ、^９９ｍＴｃ、^１５４Ｇｄ、^１５５Ｇｄ、^１５６Ｇｄ、^１５７Ｇｄ、^１５８Ｇｄ、^１５Ｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^５１Ｍ、^５２ｍＭｎ、^５５Ｃｏ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^７６Ｂｒ、^８２ｍＲｂ、および^８３Ｓｒ等の放射性および非放射性の同位体を含む同位体標識が挙げられる。特に、検出可能な標識は、限定されないが、^６４Ｃｕ、^８９Ｚｒ、^６８Ｇａ、^１７７Ｌｕ、^８２Ｒｂ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、および^１８Ｆ等のＰＥＴイメージングに好適な陽電子放射性核種、または限定されないが、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、および^１３１Ｉ等の単光子放射線コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）イメージングに好適なγ放射性核種を含み得る。検出可能な標識はまた、限定されないが、Ｍｎ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｆｅ^２＋、Ｇｄ^３＋、Ｔｉ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、およびＣｕ^２＋等のＭＲＩイメージングに好適な非放射性の常磁性金属イオンを含んでもよい。検出可能な標識はまた、ＳＹＢＲ緑色、ＳＹＢＲ金、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒｅｎｇ ５６０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０、およびＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５等のＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｑｕａｓａｒ ５７０、Ｑｕａｓａｒ ６７０、およびＱｕａｓａｒ ７０５等のＱｕａｓａｒ色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、および Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７８４等のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｃｙ ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５、およびＣｙ７等のシアン色素、フルオレセイン、２’，４’，５’，７’－テトラクロロ－４－７－ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ＦＩＴＣ、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、および量子ドットを含むが、これらに限定されないフルオロフォア、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ、Ｇ４１８^ｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢリン酸転移酵素（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、およびキサンチングアニンホスホリボシル基転移酵素（ＸＧＰＲＴ）等の酵素、β－グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、および分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含む。酵素タグは、それらの同族基質とともに使用される。これらの用語には、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、およびペルオキシオキサレート等の化学発光標識、ならびにホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、およびアエコリン等の生物発光タンパク質も含まれる。これらの用語はまた、既知の蛍光強度の色分けされたミクロスフェア（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によってもたらされるｘＭＡＰ技術を用いたミクロスフェアを参照）、量子ドットナノ結晶を含有するミクロスフェア、例えば、異なる比率および組み合わせの量子ドット色を含有するミクロスフェア（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製のＱｄｏｔナノ結晶）、ガラス被覆金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）製のＳＥＲＳナノタグを参照）、バーコード材料（例えば、サブミクロンサイズの縞模様の金属ロッド、例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のナノバーコードを参照）、着色バーコードでコードされた微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ）製のＣｅｌｌＣａｒｄを参照）、デジタルホログラフィックコード画像を有するガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照）、近赤外（ＮＩＲ）プローブ、およびナノシェルも含む。これらの用語はまた、超音波造影剤（例えば、六フッ化硫黄を含むＳｏｎｏＶｕｅマイクロバブル、アルブミンシェルおよびオクタフルオロプロパンガスコアを含むＯｐｔｉｓｏｎマイクロバブル、脂質／ガラクトースシェルおよび空気コアを含むＬｅｖｏｖｉｓｔマイクロバブル、パーフルオロカーボンマイクロバブルを含むＰｅｒｆｌｅｘａｎｅ脂質ミクロスフェア、ならびに外側脂質シェルに封入されたオクタフルオロプロパンを含むＰｅｒｆｌｕｔｒｅｎ脂質ミクロスフェア）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）造影剤（例えば、ガドジアミド、ガドベン酸、ガドペンテト酸、ガドテリドール、ガドフォスベセット、ガドベルセタミド、ガドキセト酸）、ならびに、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線撮影、または蛍光透視法のための放射線造影剤（例えば、ジアトリゾ酸、メトリゾ酸、ヨーダミド、イオタラム酸、イオキシタラム酸、イオグリシン酸、アセトリゾ酸、イオカルミン酸、メチオダール、ジオドン、メトリザミド、イオへキソール、イオキサグル酸、イオパミドール、イオプロミド、イオトロラン、イオベルソール、イオペントール、イオジキサノール、イオメプロール、イオビトリドール、イオキシラン、ヨードキサム酸、イオトロクス酸、イオグリカム酸、アジピオドン、イオベンザミン酸、イオパノ酸、イオセタム酸、イポダートナトリウム、チロパノ酸、およびイポダートカルシウム）等の造影剤も含む。検出可能な標識またはイメージング剤は、抗体に間接的にまたは直接的に結合されてもよく、標識または造影剤は、イメージングにおける抗体の使用を促進する。

【0062】

「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド分子間のパーセント同一性を指す。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、配列が、分子の規定の長さにわたって少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８０％ ８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約９５％ ９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用される場合、実質的に相同とは、指定された配列に対する完全な同一性を示す配列も指す。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド対応またはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。パーセント同一性は、配列を整列させ、整列させた２つの配列間の正確な一致数をカウントし、より短い配列の長さで除し、その結果に１００を乗じることにより２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。ペプチド解析のために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ ４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムを採用したＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ等の、容易に利用可能なコンピュータプログラムを知油して解析を補助することができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラム、例えば、同様にＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムが、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において利用可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、上記に言及されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント同一性は、デフォルトのスコアリング表および６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティを有するスミスおよびウォーターマンの相同性アルゴリズムを使用して決定することができる。

【0063】

本発明との関連においてパーセント同一性を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布しているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、デフォルトパラメータ（例えば、ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ１、およびギャップ６）がスコアリング表に用いられるＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用され得る。生成されたデータから、「マッチ」値が「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性または類似性を計算するのに適した他のプログラムは、一般に当該技術分野において既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、容易に入手可能である。

【0064】

代替として、相同性は、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼ（複数可）による消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定することができる。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特定のシステムについて定義されるストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当該技術分野の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）；ＤＮＡクローニング（上記）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｏｎ（上記）を参照されたい。

【0065】

核酸分子を説明するために本明細書で使用される「組換え」とは、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ウイルス起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドであって、その起源または操作によって、それが天然で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部と会合しないポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般に、目的の遺伝子は、後にさらに記載するように、クローニングされ、次いで形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を産生するために外来遺伝子を発現する。

【0066】

「形質転換」という用語は、挿入に使用される方法に関わらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、直接取り込み、形質導入、またはｆ交配が含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクターとして、例えば、プラスミドとして維持され得るか、または代替的に、宿主ゲノムに組み込むことができる。

【0067】

「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および単細胞実体として培養される微生物または高等真核細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る、または使用されてきた細胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の元の子孫を含む。

【0068】

「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれたときに、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定することができる。コード配列は、限定されないが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に位置し得る。

【0069】

典型的な「制御エレメント」としては、限定されないが、転写促進因子、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンに対して３’側に位置する）、翻訳開始の最適化配列（コード配列に対して５’側に位置する）、および翻訳終結配列が挙げられる。

【0070】

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が、それらの通常の機能を実行するように構成されるエレメントの配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現に影響を及ぼし得る。プロモーターは、コード配列の発現を誘導するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、プロモーター配列とコード配列との間に、未翻訳であるが転写された介在する配列が存在してもよく、それでもなおプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。

【0071】

「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を誘導することができるアセンブリを指す。発現カセットは、概して、上記のように、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）と（転写を誘導するために）作動可能に連結されたプロモーター等の制御エレメントを含み、多くの場合、ポリアデニル化配列も含む。本発明のある特定の実施形態において、本明細書に記載の発現カセットは、ドナーポリヌクレオチド、プラスミド、またはウイルスベクター構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、構築物は、１つ以上の選択マーカー、構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３複製起点）、少なくとも１つの複数のクローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）も含み得る。

【0072】

「精製されたポリヌクレオチド」は、そのポリペプチドが天然で会合しているタンパク質を実質的に含まない、例えば、該タンパク質を約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは少なくとも約９０％未満を含有する、目的のポリヌクレオチドまたはその断片を指す。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、カオトロピック剤によるポリヌクレオチドを含有する細胞の破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、および密度に応じた沈降によるポリヌクレオチド（複数可）およびタンパク質の分離を含む。

【0073】

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。細胞膜内に外因ＤＮＡが導入された場合、細胞は「トランスフェクション」されている。いくつかのトランスフェクション技術が、一般に、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術は、１つ以上の外因ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。この用語は、遺伝物質の安定した取り込みおよび一過性の取り込みの両方を指し、ペプチドまたは抗体結合ＤＮＡの取り込みを含む。

【0074】

「ベクター」は、核酸配列を標的細胞（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、およびリポソーム）に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」は、目的の核酸の発現を誘導することができ、核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにプラスミドおよびウイルスベクターを含む。

【0075】

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供されている。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のために、そのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、独立して確認する必要があり得る。

【0076】

本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正が行われ得ることは、当業者には明白であろう。

【0077】

抗オステオポンチン抗体
オステオポンチンの１つ以上のエピトープに特異的に結合する抗オステオポンチン抗体が提供される。いくつかの実施形態において、抗オステオポンチン抗体は、トロンビン切断部位に特異的に結合し、オステオポンチンのトロンビン切断を阻害し、かつ／またはオステオポンチンのトロンビン切断断片（例えば、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片）に特異的に結合し、トロンビン切断断片の生物学的活性を低下させる。ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体は、オステオポンチンのＡｒｇ１６８を含むエピトープに特異的に結合する。前述の番号付けは、ヒトオステオポンチンの参照アミノ酸配列（配列番号８）に対するものであり、他の種から得られたオステオポンチンタンパク質における対応する位置もまた、本開示によって包含されることが意図されることを理解されたい。

【0078】

本明細書で使用される「抗オステオポンチン抗体」という用語は、全長抗体、および抗体の抗原結合領域を含むその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、もしくはＦ_ｖ断片等の抗オステオポンチン抗体のＣＤＲを含む分子、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または任意の他の種類の目的断片の抗体断片（上記の用語「抗体」の定義を参照）を包含する。主題の方法の実施において使用され得る抗オステオポンチン抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体、ならびに：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３－２９９および米国特許第４，８１６，５６７号を参照）；Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆ_ｖ分子（非共有結合ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２、およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６を参照）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照）；ナノボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：３２８７－３３０３，Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９１１：１５－２６を参照）；二量体および三量体抗体断片構築物；ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９－１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０－１２６を参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６；および英国特許公開台ＧＢ２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照）；ならびにそのような分子から得られる任意の機能性断片（そのような断片は親抗体分子の特異的結合特性を保持する）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0079】

ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むかまたはそれからなるオステオポンチンペプチドに特異的に結合する。

【0080】

ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0081】

ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0082】

ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。

【0083】

トロンビン切断部位でオステオポンチンに、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片（例えば、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片）に特異的に結合する抗体は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を用いて調製することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ ｅｄ．１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）を参照されたい。例えば、オステオポンチンのトロンビン切断部位またはオステオポンチンのトロンビン切断断片（例えば、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片）を含むオステオポンチンのペプチド断片を含む抗原を使用して、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒト等の哺乳動物において免疫応答を誘発して、ポリクローナル抗体を産生することができる。免疫応答を誘発して抗オステオポンチン抗体を産生するために使用することができる例示的なペプチドとしては、配列番号１～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むかまたはそれからなるオステオポンチンペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（実施例も参照されたい）。必要であれば、抗原を、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質にコンジュゲートすることができる。宿主種に応じて、様々なアジュバントを使用して免疫応答を増加させることができる。そのようなアジュバントとしては、限定されないが、フロイントアジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、および表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）が挙げられる。ヒトに使用されるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。

【0084】

オステオポンチン抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術としては、限定されないが、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、およびＥＢＶハイブリドーマ法が挙げられる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５－９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１ ４２，１９８５；Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６－３０，１９８３；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６２，１０９－２０，１９８４）。

【0085】

加えて、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術である、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためのヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングも用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１－５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４－０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２－５４，１９８５）。モノクローナル抗体および他の抗体は、抗体が治療的に使用される場合に、患者が抗体に対する免疫応答を開始することを防止するために「ヒト化」することもできる。そのような抗体は、治療に直接使用されるヒト抗体と配列が十分に類似し得るか、またはいくつかの重要な残基の改変を必要とし得る。げっ歯類抗体とヒト配列との間の配列差は、個々の残基の部位特異的突然変異誘発によって、または相補性決定領域全体のグラフティングによって、ヒト配列内の残基とは異なる残基を置き換えることにより最小限に抑えることができる。

【0086】

代替として、ヒト化抗体は、後述するように、組換え法を用いて作製することができる。特定の抗原に特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているように、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含有することができる。ヒトモノクローナル抗体は、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（５），９２８－３６，２００７に記載されるようにインビトロで調製することができる。

【0087】

代替として、当該技術分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のために記載された技術を、特定の抗原に特異的に結合する一本鎖抗体を産生するように適合させることができる。関連する特異性を有するが、明確なイディオタイプ組成の抗体は、ランダムコンビナトリアル免疫グロビンライブラリからの鎖シャッフリングによって生成することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０－２３，１９９１）。一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法を用いて構築することもできる（Ｔｈｉｒｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ．５，５０７－１１，１９９６）。一本鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であり得、二価または四価であり得る。四価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９－６３，１９９７に教示されている。二価の二重特異性一本鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ＆Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９－２０６，１９９４に教示されている。

【0088】

一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、後述するように、手動または自動ヌクレオチド合成を用いて構築し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローニングし、細胞に導入してコード配列を発現させることができる。代替として、一本鎖抗体は、例えば、繊維状ファージ技術を用いて直接産生することができる（Ｖｅｒｈａａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７－５０１，１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１－９１，１９９３）。

【0089】

オステオポンチン抗原に特異的に結合する抗体は、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによって、または文献に開示されるように、免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生され得る（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３ ３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３ ２９９，１９９１）。

【0090】

キメラ抗体は、ＷＯ９３／０３１５１に開示されているように構築することができる。免疫グロブリンに由来し、ＷＯ９４／１３８０４に記載されている「ダイアボディ」等の多価かつ多特異性である結合タンパク質も調製することができる。

【0091】

いくつかの実施形態において、Ｂリンパ球からの抗オステオポンチン抗体は、血液ドナーから得られ、クローニングされる。可変ドメイン相補性決定領域（例えば、Ｆａｂ）を含有する抗体の軽鎖および重鎖またはその断片をコードする核酸を、ＰＣＲによって増幅し、ベクターにクローニングすることができる。ＳｃＦｖ抗体は、１つのオープンリーディングフレーム内のリンカーを介して軽鎖および重鎖を接続する構築物をベクター内にクローニングすることによって生成することができる。血液ドナーは、任意の種のドナーであり得る。いくつかの実施形態において、ヒト血液ドナーは、ヒト抗体の生成に使用される。他の実施形態において、ラクダ科の血液ドナーは、ラクダ科動物の抗体の生成に使用される。ラクダ科動物の抗体は、例えば、ドロメダルラクダ、バクトリアンラクダ、ラマ、およびアルパカに由来し得る。そのようなラクダ科動物は、軽鎖を欠く独自の種類の抗体を産生する。重鎖抗体（ＨＣＡｂ）またはその可変ドメイン断片（例えば、単一ドメイン抗体またはナノボディ）も、主題の方法に使用することができる（例えば、Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９１１：１５－２６，Ｋｒａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．３８（１）：２１－８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。

【0092】

抗体は、当該技術分野で周知の方法によって精製することができる。例えば、抗体は、関連する抗原が結合するカラムを通過させることによって親和性を精製することができる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を使用してカラムから溶出することができる。

【0093】

キメラおよびヒト化抗体
好適な抗オステオポンチン抗体としては、そのような抗体の完全ヒト化抗体、ヒト化、またはキメラバージョンが挙げられる。例えば、ヒト化抗体は、抗原性が低いため、ヒトにおけるインビボ用途に有用である。同様に、イヌ化、ネコ化等を行った抗体は、それぞれ、イヌ、ネコ、および他の種における用途に有用である。目的の抗体としては、ヒト化抗体、またはイヌ化、ネコ化、ウマ化、ウシ化、ブタ化等を行った抗体、およびそれらの変異体が挙げられる。

【0094】

非ヒト（例えば、マウス）モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒト定常Ｉｇドメインに融合されたキメラモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の標準的な手順を使用して生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８４１－６８５５（１９８４）、およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３－６４６，（１９８４）を参照）。

【0095】

ヒト化抗体は、例えば、以下を含む様々な方法によって達成され得る：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域上にグラフトすること（当該技術分野において「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と称されるプロセス）、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによりそれらをヒト様表面で「覆う」すること（当該技術分野において「ベニヤ化」と称されるプロセス）、または（３）抗原結合またはタンパク質折り畳みのいずれかに有害作用を及ぼす可能性は低いが、ヒト環境における免疫原性を低下させる可能性が高いと判定された位置でヒトアミノ酸を置換すること（例えば、ＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ）。本開示において、ヒト化抗体は、「ヒト化」、「ベニヤ化」、および／または「ＨＵＭＡＮ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ」抗体を含み得る。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９－４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９－２１７（１９９４）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：０５－８１４，１９９４；Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８－２９７６（１９９４）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）；およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４：７７３－７８３（１９９１）に開示されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

【0096】

ＣＤＲグラフティングは、マウス重鎖および軽鎖可変Ｉｇドメインの６つのＣＤＲのうちの１つ以上を、ヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入することを伴う。この技法（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）を参照）は、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１－ＦＲ４）を足場として利用して、抗原との主要な接触点であるＣＤＲループを支持する。しかしながら、ＣＤＲグラフティングの欠点は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与し得るため、およびＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響を及ぼし得るために、元のマウス抗体よりもかなり低い結合親和性を有するヒト化抗体をもたらし得ることである。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最もよく似たヒトフレームワーク領域を選択することによって、および抗原結合部位のコンピュータモデリングを利用したフレームワークまたはＣＤＲ内の単一アミノ酸の部位特異的突然変異誘発によって、ＣＤＲ移植技術を改善することができる（例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８－２９７６（１９９４））。

【0097】

抗体断片
抗オステオポンチン抗体は、抗体断片の形態であり得る。抗体断片は、インタクトな全長抗体の一部を含み、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含み得る。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体等の多重特異性抗体断片（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニボディ、キレート組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、および抗体断片から形成される他のポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１２６－３６（２００５））を参照されたい。

【0098】

抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有するＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨドメインからなる一価断片である、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理によって、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片がもたらされ、これらは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む２つの「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片を有し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間に、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含むことができ、その結果として一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）がもたらされ、ＶＬおよびＶＨ領域が合成リンカーを介して一価分子を形成するように対合し、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６，１９８８，ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３，１９８８）。ＳｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１ １３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。

【0099】

さらなる抗体断片は、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，１９８９）を含む。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する二価抗体である（例えば、ＥＰ ４０４，０９７；ＷＯ ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８，１９９３、およびＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３，１９９４を参照）。ダイアボディは、二重特異性または単一特異性であり得る。

【0100】

抗オステオポンチン抗体の産生方法
上記で考察したように、本開示は、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、オステオポンチンのトロンビン切断、またはオステオポンチンのトロンビン切断断片とインテグリンおよび／もしくは他の細胞受容体との相互作用を阻害する。抗オステオポンチン抗体の例示的な作製方法を以下に示す。

【0101】

抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の多種多様な技術を用いて調製することができる。例えば、抗体は、ファージディスプレイの方法を用いて作製および単離され得る。抗体はまた、全タンパク質およびその断片を包含するオステオポンチンを含む免疫原性組成物で免疫された動物宿主の血清から単離されてもよい。例示的な抗体としては、オステオポンチンに特異的に結合することができる単離された抗体（例えば、オステオポンチンのトロンビン切断部位）またはオステオポンチンのトロンビン切断断片が挙げられる。

【0102】

ファージディスプレイパニングのためにウェルをコーティングする抗原、または本開示の抗体を誘発するために使用される免疫原性組成物は、１つ以上の抗原の凝集体を含み得る。この方法は、凝集体を形成するために抗原を凝集条件に曝露することを含み得る。したがって、上述の産生方法は、単離された抗原の凝集体を形成するステップをさらに含み得る。凝集条件の例としては、加熱、凝集を促進する賦形剤の添加等が挙げられる。

【0103】

ファージパニングのためにウェルをコーティングするために、または本開示の抗体を誘発するために使用される抗原は、別の分子にコンジュゲートされ得る。例えば、抗原は、特定の細胞（例えば、がん細胞、心筋細胞等）または細胞位置（例えば、形質膜、リソソーム、エンドソーム、ミトコンドリア等）、組織、または他の身体位置（例えば、血液、特定の器官、腫瘍等）を標的とすること等によって、溶解性、貯蔵または他の取り扱い特性、細胞透過性、半減期、放出および／または分布を助けるペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物等の第２の分子にコンジュゲートされ得る。

【0104】

第２の分子にコンジュゲートされた抗原の特定の実施形態は、第２の分子が免疫調節剤である場合である。「免疫調節剤」は、免疫応答を直接的または間接的に変化させる分子である。特定のクラスの免疫調節剤は、免疫応答を刺激するか、または刺激を補助するものを含む。例としては、抗原、および破傷風トキソイドを含む毒素またはその誘導体等の抗原担体が挙げられる。

【0105】

ファージディスプレイ
ファージディスプレイは、タンパク質相互作用のハイスループットスクリーニングに使用される。ファージは、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識されたオステオポンチン、または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉されたオステオポンチンを用いて、選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ（軽鎖または重鎖からの個々のＦｖ領域）、またはファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。例示的な方法は、例えば、ＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０００，２１：３７１；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００２，８：８０１；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８：２６８２；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２，３１５：１０６３に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０：７７９－７８３）は、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、コンビナトリアル感染およびインビボ組換えについて記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイを使用して、ディスプレイプラットフォームとしてのバクテリオファージを置き換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８：１２８７；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００１，９８：３７５０；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００１，２４８：３１を参照）。細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングしてもよい（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００，９７：１０７０１；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０００，２４３：２１１）。そのような手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための従来のハイブリドーマ技術に対する代替手段を提供する。

【0106】

ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に提示される。例えば、重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅されるか、またはそうでなければ単離される。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーによって一緒に結合され、ファージミドベクター（例えば、ｐ ＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）にクローニングされ得る。ベクターはＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションされ、Ｅ．ｃｏｌｉにヘルパーファージを感染させる。ＶＨまたはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換えによって融合される。目的の抗原（例えば、オステオポンチンのセリンプロテアーゼドメイン）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉された抗原を用いて、抗原で選択または同定することができる。

【0107】

抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法のさらなる例としては、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、ＰＣＴ公報第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号、第ＷＯ９５／２０４０１号、および米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示されているものが挙げられ、これらのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0108】

上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離し、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９２，１２：８６４－８６９；およびＳａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ １９９５，３４：２６－３４；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４０：１０４１－１０４３（上記参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されるもの等の当該技術分野で既知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）_２断片を組換えによって産生する技術を利用することもできる。

【0109】

免疫および抗体産生
宿主動物において抗体を誘発する方法は、有効量のオステオポンチンまたはその断片を抗原として宿主動物（すなわち、マウス、ウサギもしくはモルモット等の好適な哺乳動物、ニワトリ等の好適な鳥類、またはラクダ科動物）に投与して、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する抗体の産生を誘発することを含む。宿主動物において免疫応答を誘発して抗オステオポンチン抗体を産生するために使用され得る例示的な免疫原性ペプチドとしては、配列番号５～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むかまたはそれからなる免疫原性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（実施例も参照されたい）。使用されるアジュバント、ブースタースケジュール、注射部位、好適な動物等を含む動物の免疫方法は、当該技術分野で十分に理解されており（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、動物への生細胞の投与は、いくつかの哺乳動物および鳥類について記載されている（例えば、ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：５４３－８，１９８９）、Ｓｃｕｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．Ｔｕｍｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２：２３３－４２，１９８５）、Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ（Ｓｕｒｇｅｒｙ ９６：２６４－７２，１９８４）およびＤｒｅｂｉｎ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５４５－８，１９８４）。次に、抗体産生細胞の集団を生成する。一実施形態において、細胞集団は、当業者に周知のハイブリドーマ法を用いて産生される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。細胞を、細胞培養において無制限に複製することが可能な骨髄腫細胞または形質転換細胞等の不死化細胞に融合させ、それによって不死の免疫グロブリン分泌細胞株を産生する。用いられる不死の細胞株は、ある特定の栄養素の利用に必要な酵素が欠損しているように選択することができる。多くのそのような細胞株（骨髄腫等）は、当業者に既知であり、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を含む。これらの欠損は、例えば、ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地（ＨＡＴ）上で成長する能力に応じて、融合細胞の選択を可能にする。代替の実施形態において、モノクローナル抗体を発現する細胞集団は、ファージディスプレイ法を用いて作製され得る。

【0110】

抗オステオポンチン抗体の抗原結合断片を含む抗オステオポンチン抗体も、遺伝子工学によって産生され得る。この技術では、標準的なハイブリドーマ手順と同様に、抗体産生細胞を所望の抗原または免疫原に感作させる。免疫脾細胞またはハイブリドーマから単離されたメッセンジャーＲＮＡが、ＰＣＲ増幅を用いてｃＤＮＡを作製するための鋳型として使用される。増幅された免疫グロブリンｃＤＮＡの適切な切片を発現ベクターに挿入することによって、初期抗原特異性を保持する１つの重鎖遺伝子および１つの軽鎖遺伝子をそれぞれ含有するベクターのライブラリーが産生される。コンビナトリアルライブラリーは、重鎖遺伝子ライブラリーと軽鎖遺伝子ライブラリーとを組み合わせることによって構築することができる。これにより、（抗体分子のＦａｂ断片または抗原結合断片に類似する）重鎖および軽鎖を共発現するクローンのライブラリーが得られる。これらの遺伝子を担持するベクターが、宿主（例えば、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または他の好適なタンパク質産生宿主細胞）にコトランスフェクトされる。トランスフェクトされた宿主において抗体遺伝子合成を誘導さすると、重鎖および軽鎖タンパク質が自己組織化して、抗原または免疫原でスクリーニングすることによって検出することができる活性抗体を生成する。

【0111】

ファージパニングおよびスクリーニング
抗体産生細胞またはファージの集団が産生されると、抗体は、様々なアッセイの１つまたは組み合わせを用いてスクリーニングされる。概して、これらのアッセイは機能アッセイであり、抗体の結合親和性または特異性を検出するアッセイ、およびプロセスを初期化または阻害する抗体の能力を検出するアッセイにグループ分けされ得る。

【0112】

例えば、抗原は、ビーズまたはウェルまたは他の固体支持体に結合され、目的の抗体を提示するファージとともにインキュベートされる。洗浄後、結合したファージを、次いで対数期Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の接種によって回収する。細胞をヘルパーファージで成長および拡張させる。緊密に結合したファージの増幅のためにステップを繰り返す。数ラウンドの濃縮後、ファージ感染Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを採取し、Ｆａｂ抗体をペリプラズム画分から精製する。次いで、精製された抗体を、当該技術分野で既知の方法に従って分析する。ある特定の例示的な例を以下に詳述する。

【0113】

ファージ感染細胞またはハイブリドーマから単離された抗体の集団を、インビトロまたはインサイツ（例えば、細胞上）で、複数の抗原のうちの単一の抗原（すなわち、複数の抗原の他の抗原と混合されていない抗原）への結合についてさらに分析および／またはスクリーニングする。免疫特異的結合は、当該技術分野において日常的かつ既知の方法に従って行われ得る。使用することができるイムノアッセイとしては、ほんの数例を挙げると、限定されないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイ等の技術を用いた競合および非競合のアッセイシステムが挙げられる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。

【0114】

本開示の抗体は、インビボでスクリーニングすることもできる。この方法は、疾患または状態（すなわち、オステオポンチン関連障害）のために抗オステオポンチン抗体を動物モデルに投与することと、モデル動物の疾患または状態に対する抗体の効果を決定することとを含む。本発明のインビボアッセイは対照を含み、好適な対照は、抗体の非存在下で試料を含む。一般に、複数のアッセイ混合物を並行して異なる抗体濃度で実施して、様々な濃度に対する差次的反応を得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照として、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満で機能する。

【0115】

目的のモノクローナル抗体は、抗体の非存在下で対照と比較した場合、動物モデルの疾患または状態の症状を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上調節する、すなわち低減するまたは増加する抗体である。一般に、目的のモノクローナル抗体は、対象動物を、疾患または状態に罹患していない同等の動物により類似させる。本発明の方法および組成物を使用して同定された治療的価値を有する抗体は、「治療用」抗体と称される。

【0116】

目的の選択されたモノクローナル抗体は、日常的な組織培養方法を用いてインビトロで、または哺乳動物対象を用いてインビボで増殖させることができる。例えば、プリスタンでプライミングされたマウスは、腹水産生のために、ＰＢＳ中の対数期ハイブリドーマ細胞を接種することができる。腹水は、さらなる精製の前に－７０℃で保存することができる。

【0117】

スクリーニングの方法
本開示によって提供されるスクリーニング方法は、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する抗体をスクリーニングするためのファージライブラリーの使用を含み得、任意選択的に、本明細書に記載される追加の特徴のいずれかを有する（例えば、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する）。結合剤は、オステオポンチンの強力な阻害および／またはその特異的結合親和性のために選択され得る。方法は、上記のファージ提示方法に従って実行され得る。

【0118】

簡単に述べると、オステオポンチンまたはその断片は、疎水性吸着、ビオチン－アビジン相互作用、およびＮｉ^２＋－６×Ｈｉｓ相互作用等の共有結合または非共有相互作用によって、ＥＬＩＳＡプレート上またはビーズ上に固定化することができる。次いで、ファージライブラリーを固定化した抗原／プロテアーゼとともにインキュベートし、洗浄し、回収する。パニングおよび選択の間、結合したファージがＥ．ｃｏｌｉにおいて回収され、増幅される。複数の連続した選択ラウンドにより、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的な抗体として作用するポリペプチドを提示するファージの選択を確実にする。洗浄のストリンジェンシーは、数回のラウンド（例えば、３回）にわたって増加する。回収されたファージの特異性を増加させるために、当該技術分野で周知の多くの技術が用いられ得る。例としては、洗浄時間の増加、洗剤剤濃度の増加、塩濃度の増加、および既知の巨大分子阻害剤（例えば、小ペプチド基質、ＢＰＴＩ、エコチン、および／または以前に同定された抗体阻害剤）の包含が挙げられる。阻害抗体の同定には、ＥＬＩＳＡおよび阻害アッセイが含まれ得る。抗オステオポンチン抗体を選択および単離する方法で実行されるアッセイの詳細については上述している。

【0119】

また、本明細書に記載される候補抗オステオポンチン抗体をコードする核酸構築物のライブラリーも本開示によって企図される。ライブラリーは、共通の１つ以上のポリペプチド領域（例えば、少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ）と、集団間で変化する少なくとも１つの他のポリペプチド領域とを有し得る複数の候補抗オステオポンチン抗体をコードする。

【0120】

抗オステオポンチン抗体をコードする核酸、ベクター、およびベクター系
ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体重鎖および軽鎖、またはその抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆ_ｖ断片、またはｓｃＦｖ断片）は、ベクターから産生される。「ベクター」は、目的の核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。抗体軽鎖および／または重鎖、またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチドは、単一のベクターを用いて、または別個のベクター（すなわち、ベクター系）で細胞内に導入することができる。抗オステオポンチン抗体を産生する構築物の能力は、経験的に決定することができる。

【0121】

限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含む多数のベクターが、当該技術分野で既知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられる。発現構築物は、生細胞で複製され得るか、または合成的に作製され得る。本出願の目的のために、「発現構築物」、「発現ベクター」、および「ベクター」という用語は、一般的で例示的な意味において本発明の適用を示すために互換的に使用され、本発明を限定することを意図するものではない。

【0122】

一実施形態において、抗オステオポンチン抗体を発現するための発現ベクターは、抗オステオポンチン重鎖および／または軽鎖、またはその断片（例えば、それらの可変ドメインＣＤＲを含む）をコードするポリヌクレオチドに「作動可能に連結された」プロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」または「転写制御下で」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに関して正しい位置および配向にあることを意味する。

【0123】

ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドをコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要な、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入されるＤＮＡ配列を指す。プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩの開始部位の周囲にクラスター化された転写制御モジュール群を指すために本明細書において使用される。哺乳動物細胞発現のための典型的なプロモーターとしては、とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーター等のＣＭＶプロモーター（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１６８，０６２号および第５，３８５，８３９号を参照）、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモーター等が挙げられる。マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーター等の他の非ウイルスプロモーターもまた、哺乳動物の発現に使用される。これらおよび他のプロモーターは、当該技術分野で周知の技術を用いて、市販されているプラスミドから得ることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい。エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加させるために、プロモーターと関連して使用され得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１に記載されているようなＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７に記載されているようなラウス肉腫ウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター、、およびＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１に記載されているようなヒトＣＭＶに由来するエレメント、例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメントが挙げられる。

【0124】

典型的には、転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルも発現構築物中に存在する。そのような配列の例としては、限定されないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）に記載されているようなＳＶ４０に由来するもの、およびウシ成長ホルモン末端配列が挙げられる（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号を参照）。さらに、５’－ＵＴＲ配列は、それらの発現を増強するために、コード配列に隣接して配置することができる。そのような配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むＵＴＲを含み得る。

【0125】

ＩＲＥＳの包含は、ベクターからの１つ以上のオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。ＩＲＥＳエレメントは、真核生物のリボソーム翻訳開始複合体を誘引し、翻訳開始を促進する。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：４４８５－４４９０；Ｇｕｒｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９６）２２９：２９５－２９８；Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２０：１０２－１１０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）２１：３９９－４０２；およびＭｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９７ ２２ １５０－１６１を参照されたい。多数のＩＲＥＳ配列が既知であり、多種多様なウイルスに由来する配列、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲ等のピコルナウイルスのリーダー配列（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：１６５１－１６６０）、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒトライノウイルス２型ＩＲＥＳ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００（２５）：１５１２５－１５１３０）、を参照されたい）、口蹄疫ウイルス由来のＩＲＥＳエレメント（Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９９６）２４：２６９７－２７００）、ジアルジアウイルスＩＲＥＳ（Ｇａｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９（５）：３３８９－３３９７）等が挙げられる。限定されないが、酵母由来のＩＲＥＳ配列、ならびにヒトアンジオテンシンＩＩの１受容体ＩＲＥＳ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００３）２１２：５１－６１）、線維芽細胞成長因子ＩＲＥＳ（ＦＧＦ－１ ＩＲＥＳおよびＦＧＦ－２ ＩＲＥＳ、Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２４（１７）：７６２２－７６３５）、血管内皮成長因子ＩＲＥＳ（Ｂａｒａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（１２）：４７３３－４７３８、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（６）：３１１２－３１１９、Ｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＲＮＡ １２（６）：１０７４－１０８３）、およびインスリン様成長因子２ ＩＲＥＳ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６３（Ｐｔ １）：３７－４４）を含む様々な非ウイルスＩＲＥＳ配列も本明細書で使用される。これらのエレメントは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）およびＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって市販されているプラスミドで容易に市販される。また、実験的に検証されたＩＲＥＳ構造のデータベースであるＩＲＥＳｉｔｅ（ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇ）も参照されたい。ＩＲＥＳ配列は、例えば、抗オステオポンチン抗体重鎖またはその断片を、発現カセットからの抗オステオポンチン抗体軽鎖またはその断片と組み合わせて発現するために、ベクターに含まれ得る。

【0126】

代替として、ウイルスＴ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、単一のベクターから複数のタンパク質産物（例えば、抗オステオポンチン抗体軽鎖またはその断片と組み合わせた抗オステオポンチン抗体重鎖またはその断片）の産生を可能にすることができる。２Ａリンカーペプチドは、マルチシストロン性構築物のコード配列間に挿入される。自己切断性である２Ａペプチドは、マルチシストロン性構築物からの共発現タンパク質が等モルレベルで産生されることを可能にする。限定されないが、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス、およびブタテッショウウイルス－１に由来する２Ａペプチドを含む、様々なウイルス由来の２Ａペプチドが用いられ得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（４）：ｅ１８５５６、Ｔｒｉｃｈａｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．６：４０、Ｐｒｏｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅｓｉｓ ４５（１０）：６２５－６２９、Ｆｕｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１１）：８６４－８７３を参照されたい。

【0127】

１つ以上のベクターを含む発現ベクターまたはベクター系を使用して、単離された細胞、細胞株、または細胞集団を形質転換することができ、目的の遺伝子産物（例えば、抗体軽鎖および重鎖、またはそれらの断片）は、単数または複数の細胞によって選択的に発現される。いくつかの実施形態において、抗オステオポンチン抗体が産生され、分泌される。形質転換された細胞は抗体を周囲の媒体に分泌する。ある特定の調節配列は、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダー配列、インターフェロン（γまたはα）シグナル配列、または既知の分泌タンパク質由来の他のシグナルペプチド配列を使用して、分泌を増強するためにベクターに含まれ得る。次いで、分泌された抗体は、例えば、限定されないが、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降等の標準的な精製技術を用いて、本明細書に記載される様々な技術によって単離され得る。

【0128】

代替として、タンパク質は分泌されず、形質転換された細胞は、細胞を溶解するが、組換えタンパク質を実質的にインタクトな状態に保つ、化学的、物理的または機械的手段を使用して破壊される。細胞内タンパク質はまた、ポリペプチドの漏出が生じるように、例えば、洗浄剤または有機溶媒の使用によって、細胞膜から成分を除去することによっても得ることができる。そのような方法は、当業者に既知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｓｉｍｏｎ Ｒｏｅ，Ｅｄ．，２００１）に記載されている。

【0129】

例えば、細胞を破壊する方法としては、限定されないが、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎまたはｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）；撹拌；液体または固体押出；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧衝撃；トリプシン、ノイラミニダーゼおよびリゾチーム等のプロテアーゼを含む溶解酵素による処理；アルカリ処理；ならびに胆汁酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトン、ＮＰ４０およびＣＨＡＰＳ等の洗浄剤および溶媒の使用が挙げられる。細胞を破壊するために用いられる特定の技術は、主に選択の問題であり、ポリペプチドが発現される細胞型、培養条件、および用いられる任意の前処理に依存するであろう。

【0130】

細胞の破壊に続いて、一般に遠心分離によって細胞残屑が除去され、限定されないが、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降等の標準的な精製技術を用いて、細胞内で産生されたポリペプチドがさらに精製される。

【0131】

重鎖および軽鎖、またはその断片を含む抗体は、例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、抗オステオポンチン重鎖または軽鎖エピトープ）に結合する抗体を使用する免疫親和性クロマトグラフィー、または固定化されたオステオポンチン抗原を用いた抗原特異的親和性クロマトグラフィーによって、親和性精製を用いて精製することができる。好適な親和性樹脂の選択は、当該技術分野の範囲内である。親和性精製後、発現抗体は、当該技術分野で周知の従来技術を用いて、例えば、上述の技術のいずれかによってさらに精製され得る。

【0132】

抗体コンジュゲート
抗オステオポンチン抗体はまた、治療および診断（例えば、インビボイメージング等）用途でも使用される。例えば、そのような抗体は、治療剤（例えば、細胞傷害性ペイロード）または標識剤（例えば、インビボイメージング剤）等のペイロードにコンジュゲートされ得、抗体がオステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に結合すると、治療剤または標識剤は、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片のレベルが上昇した標的細胞（例えば、オステオポンチンを過剰発現するがん細胞）に選択的に送達される。オステオポンチンを過剰発現する細胞に対する治療剤またはイメージング剤の選択的標的化は、非標的細胞の治療剤への望ましくない曝露を低減し、投与時の毒性を低減することができる。さらに、イメージング用途（例えば、診断、予後、および／または任意の他の目的のためのインビボイメージング）では、オステオポンチンを過剰発現する細胞への抗体の選択的結合は、そのような細胞内でイメージング剤を濃縮し、それによって、得られる画像のシグナル対ノイズ比および診断／予後値を増加させる。

【0133】

したがって、本明細書に記載の任意の抗オステオポンチン抗体は、非コンジュゲート形態であってもよいか、または治療剤および／もしくはイメージング化（例えば、診断）剤等の薬剤に直接コンジュゲートされてもよいか、またはそのような他の治療剤もしくはイメージング剤を含む担体ポリマーに間接的にコンジュゲートされてもよい。

【0134】

いくつかの実施形態において、抗体は、細胞傷害性薬剤、例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされる。好適な化学療法剤としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）上記）。好適な毒素としては、ジフテリア毒素等の細菌毒素；リシン等の植物毒素；ゲルダナマイシン等の小分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３－８１（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５－１０２８（２０００）；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３．７８６－９１（２００２））、マイタンシノイド（ＥＰ １３９１２１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８－２３（１９９６））、アウリスタチン（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：７７８－８４（２００３）およびカリケアマイシンＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８（１９９８）；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６－３３４２（１９９３））が挙げられる。

【0135】

抗体は、放射性同位体、親和性標識（ビオチン、アビジン等）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識または発光標識または生物発光標識（ＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等の使用を通して検出可能に標識され得る。そのような標識を達成するための手順は既知である。例えば、（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６））を参照されたい。

【0136】

ある特定の態様において、本開示の抗オステオポンチン抗体コンジュゲートのイメージング剤は、近赤外線（ＮＩＲ）光学イメージング、単光子放射線コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング等のインビボイメージングに使用されるイメージング剤である。そのような用途に使用される標識剤としては、限定されないが、蛍光標識および放射性同位体等が挙げられる。ある特定の態様において、標識剤は、２つ以上のイメージング手法を用いてインビボイメージングを可能にするマルチモーダルインビボイメージング剤である（例えば、Ｔｈｏｒｐ－Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照）。

【0137】

抗体部分のコンジュゲーションは、米国特許第６，３０６，３９３号に記載されている。一般的な技術はまた、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２－８３９（１９８８）；Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１－１１０６（１９９０）；およびｄ Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０５７，３１３号にも記載されている。この一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン機能を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または他の治療剤が添加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により、初期のシッフ塩基（イミン）結合がもたらされ、これを二級アミンへの還元によって安定化して最終的なコンジュゲートを形成することができる。

【0138】

担体ポリマーは、例えば、少なくとも５０個のアミノ酸残基のアミノデキストランまたはポリペプチドであってもよい。薬物または他の薬剤を担体ポリマーにコンジュゲートするための様々な技術が、当該技術分野において既知である。ポリペプチド担体は、アミノデキストランの代わりに使用され得るが、ポリペプチド担体は、鎖内に少なくとも５０個のアミノ酸残基を有するべきであり、約１００～５０００個のアミノ酸残基であり得る。アミノ酸の少なくともいくつかは、リジン残基、またはグルタミン酸残基もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基のペンダントアミンならびにグルタミンおよびアスパラギン酸のペンダントカルボキシレートは、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素付加物、または他の治療剤を付着させるのに便利である。好適なポリペプチド担体の例としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー、およびこれらのアミノ酸と他のもの、例えば、セリンとの混合ポリマーが挙げられ、得られた負荷担体およびコンジュゲートに望ましい溶解性特性を付与する。抗体がコンジュゲートされ得る薬剤の例は、本明細書に記載される細胞傷害性化学療法剤のいずれかを含む。

【0139】

コンジュゲートされた抗体は、抗体成分を治療剤または標識剤と直接コンジュゲートすることによって調製することができる。一般的な手順は、治療剤または標識剤が酸化された抗体成分に直接結合していることを除いて、間接的なコンジュゲーションの方法に類似している。例えば、抗体の炭水化物部分は、半減期を延長するためにポリエチレングリコールと結合させることができる。

【0140】

治療剤または標識剤は、ジスルフィド結合形成を介して、またはＮ－スクシニル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二官能性架橋剤を使用して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ”、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ１８７～２３０（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ６０～８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照されたい。Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）等の様々な二官能性タンパク質カップリング剤が当該技術分野で既知である。

【0141】

医薬組成物
抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）は、任意選択的に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に製剤化することができる。例示的な賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。注射用組成物に好適な賦形剤としては、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、リン脂質、および界面活性剤が挙げられる。糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、および／または糖ポリマー等の炭水化物が賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、単糖類、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース等；二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等；多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；およびアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール等が挙げられる。賦形剤はまた、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせ等の無機塩または緩衝剤も含むことができる。

【0142】

組成物はまた、微生物成長を防止または抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0143】

抗酸化剤も同様に、組成物中に存在することができる。抗酸化剤を使用して酸化を防止し、それによって抗体または調製物の他の構成要素の劣化を防止する。本発明で使用するのに好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0144】

界面活性剤は、賦形剤として存在することができる。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０」および「Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０」等のポリソルベート、ならびにＦ６８およびＦ８８（ＢＡＳＦ、Ｍａｔ Ｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ））等のプルロニック（登録商標）；ソルビタンエステル；レシチンおよび他のホスファチジルコリン等のリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（但し、好ましくはリポソーム形態ではない）、脂肪酸、ならびに脂肪エステル等の脂質；コレステロール等のステロイド；ＥＤＴＡ等のキレート剤；ならびに亜鉛、および他のそのような好適なカチオンが挙げられる。

【0145】

酸または塩基は、組成物中に賦形剤として存在することができる。使用することができる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0146】

組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の性質および機能、ならびに組成物の特定の必要性に応じて異なる。典型的には、任意の個々の賦形剤の最適量は、日常的な実験を通じて、すなわち、様々な量（低量～高量に及ぶ）の賦形剤を含有する組成物を調製すること、安定性および他のパラメータを調べること、次いで、有意な副作用なしに最適な性能が達成される範囲を決定することによって決定される。しかしながら、一般的に、賦形剤（複数可）は、組成物中に、賦形剤の約１重量％～約９９重量％、好ましくは約５重量％～約９８重量％、より好ましくは約１５重量％～約９５重量％の量で存在し、最も好ましくは、濃度が３０重量％未満である。これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤とともに、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（１９９５），ｔｈｅ”Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，５２ｎｄ ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８）、およびＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００に記載されている。

【0147】

組成物は、すべての種類の製剤、特に、注射に適した製剤、例えば、使用前に溶媒で再構成することができる粉末または凍結乾燥物、ならびに即注射可能な溶液または懸濁液、使用前にビヒクルと組み合わせるための乾燥不溶性組成物、ならびにエマルジョンおよび投与前に希釈するための液体濃縮物を包含する。注射前に固体組成物を再構成するのに適した希釈剤の例としては、注射用静菌水、５％ブドウ糖水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびそれらの組み合わせが挙げられる。液体医薬組成物に関して、溶液および懸濁液が想定される。追加の好ましい組成物は、経口または局所送達用の組成物を含む。

【0148】

本明細書における医薬製剤は、意図される送達および使用の様式に応じて、シリンジ、移植デバイス等に収容することもできる。好ましくは、本明細書に記載の抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）を含む組成物は単位剤形であり、すなわち、計量済みまたは包装済み形態の、単回投与に適した抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）の量である。

【0149】

本明細書における組成物は、任意選択的に、１つ以上の追加の薬剤、例えば、オステオポンチン関連障害を治療するための薬物、または対象の状態もしくは疾患を治療するために使用される他の医薬品を含み得る。例えば、配合調製物は、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）、ならびに限定されないが、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感薬、および放射性同位体等のがんを治療するための１つ以上の薬物を含み得る。黒色腫を治療するために、化合物調製物は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含み得る。例示的なＢ－Ｒａｆ阻害剤としては、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＧＤＣ－０８７９、およびＰＬＸ－４７２０が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、およびＰＤ－３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、そのような薬剤は、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）を含む組成物とは別個の組成物中に含有され得、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）を含む組成物と同時に、その前に、またはその後、併用投与され得る。

【0150】

オステオポンチン関連障害の治療方法
本開示は、オステオポンチンの活性に関連するオステオポンチン関連障害を治療する方法を提供する。例示的なオステオポンチン関連疾患としては、炎症、心臓肥大、心筋線維症、ならびに黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、および肺がん等のオステオポンチンを過剰発現するがんを含むが、これらに限定されないオステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片のレベルの上昇に関連する任意の疾患または障害が挙げられる。

【0151】

この方法は、概して、治療有効量の本明細書に記載の任意の抗オステオポンチン抗体、抗原結合断片、またはコンジュゲートを、単独で（例えば、単剤療法）、または１つ以上の追加の治療剤（例えば、抗がん療法剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、および／もしくはＭＥＫ阻害剤）と組み合わせて（例えば、併用療法）、それを必要とする対象に投与することを含む。ある特定の態様において、この方法は、治療有効量の抗オステオポンチン抗体（例えば、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する本開示の抗体であって、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリンの結合を阻害する抗体）を、それを必要とする患者に投与することによって、オステオポンチン関連障害を治療することを含む。

【0152】

様々な宿主がこの方法に従って治療可能である。一般に、そのような宿主は「哺乳類」または「哺乳動物」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む、哺乳類綱に属する生物を説明するために広く使用される。多くの実施形態において、宿主はヒトである。

【0153】

本開示の抗体組成物のプロドラッグもまた、本明細書に記載の方法において企図される。そのようなプロドラッグは、一般に、必要な化合物にインビボで容易に変換可能な化合物の機能的誘導体である。したがって、本開示の方法において、「投与すること」という用語は、具体的に開示されている化合物を投与すること、または具体的に開示されていないかもしれないが、それを必要とする対象に投与した後にインビボで特定の化合物に変換する化合物とともに投与することを包含する。好適なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための従来の手順は、例えば、Ｗｅｒｍｕｔｈ，”Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ”ｉｎ Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄ．Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ Ｅｄ．，ｐｐ．５６１－５８６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００３）に記載されている。プロドラッグは、インビボ（例えば、ヒト体内）で加水分解して、本明細書に記載の化合物を生成するエステルを含む。好適なエステル基としては、各アルキルまたはアルケニル部分が６個以下の炭素原子を有する、薬学的に許容される脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケノ酸、シクロアルカン酸およびアルカン二酸に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なエステルとしては、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、およびエチルコハク酸塩が挙げられる。

【0154】

投与量
本開示の方法において、有効量の抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそれを含むコンジュゲート）が、それを必要とする対象に投与される。投与される量は、投与の目標、治療される特定のオステオポンチン関連障害、治療される個体の健康および身体状態、年齢、治療される個体の分類群（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類等）、所望の分解能の程度、抗オステオポンチン抗体またはコンジュゲートの製剤、治療を行う臨床医による医療状況の評価、および他の関連因子に応じて異なる。量は、日常的な臨床試験を通して決定することができる比較的広い範囲に収まることが予想される。例えば、炎症、心臓肥大、心筋線維症、またはがん細胞の成長、転移および／または侵襲性を阻害するために使用される抗オステオポンチン抗体またはコンジュゲートの量は、さもなければ対象にとって不可逆的に毒性となり得る量（すなわち、最大耐用量）以下である。他の場合には、量は、毒性閾値の周辺であるまたはそれよりもはるかに低いが、依然として有効濃度範囲内であるか、または閾値用量と同じくらい低い。

【0155】

個々の用量は、典型的には、対象に測定可能な効果をもたらすのに必要な量以上であり、抗体またはコンジュゲートの吸収、分布、代謝、および排泄（「ＡＤＭＥ」）のための薬物動態および薬理学に基づいて、したがって対象内の組成物の体内動態に基づいて決定され得る。これには、例えば、非経口（全身または局所効果のために消化管以外の経路によって適用される）適用のために調整することができる投与経路および投与量の考慮が含まれる。例えば、抗オステオポンチン抗体またはコンジュゲートの投与は、典型的には、局部的であるか、または注射（例えば、静脈内、筋肉内、もしくは腫瘍内）を介してであるか、またはそれらの組み合わせである。

【0156】

抗体またはコンジュゲートの体内動態および対象内での対応する生物学的活性は、典型的には、目的の標的に存在する抗体の画分に対して測定される。例えば、抗体は、一旦投与されると、そのオステオポンチンまたはトロンビン切断断片のレベルが上昇した疾患細胞中の物質を濃縮する生物学的標的（例えば、オステオポンチン）に蓄積することができる。したがって、抗体が経時的に目的の標的に蓄積するように投与される投与計画は、より低い個々の用量を可能にする戦略の一部であり得る。これはまた、例えば、インビボでより緩徐に除去される抗体の用量を、インビトロアッセイから計算される有効濃度と比較して低減することができる（例えば、インビトロでの有効量はｍＭ濃度に近いのに対し、インビボではｍＭ濃度未満である）ことも意味し得る。

【0157】

一例として、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害するための所与の抗体のＩＣ５０から、用法または投与計画の有効量を測定することができる。「ＩＣ５０」とは、インビトロでの５０％の阻害に必要な濃度を意図する。代替として、有効量は、所与の抗体濃度のＥＣ５０から測定することができる。「ＥＣ５０」とは、インビボでの最大効果の５０％を得るために必要な血漿濃度を意図する。

【0158】

一般に、本開示の抗オステオポンチン抗体またはコンジュゲートに関して、有効量は、通常、計算されたＩＣ５０の２００倍以下である。典型的には、投与される抗体またはコンジュゲートの量は、計算されたＩＣ５０の約２００倍未満、約１５０倍未満、約１００倍未満であり、多くの実施形態では、約７５倍未満、約６０倍未満、５０倍未満、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１５倍未満、１０倍未満、およびさらには、約８倍未満または２倍未満である。一実施形態において、有効量は、計算されたＩＣ５０の約１倍～５０倍、および時には、計算されたＩＣ５０の約２倍～４０倍、約３倍～３０倍、または約４倍～２０倍である。他の実施形態において、有効量は、計算されたＩＣ５０と同じであり、ある特定の実施形態において、有効量は、計算されたＩＣ５０よりも多い量である。

【0159】

有効量は、計算されたＥＣ５０の１００倍以下であり得る。例えば、投与される抗体またはコンジュゲートの量は、計算されたＥＣ５０の約１００倍未満、約５０倍未満、約４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、または２５倍未満であり、多くの実施形態では、約２０倍未満、約１５倍未満、およびさらには、約１０倍未満、９倍未満、９倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、２倍未満、または１倍未満である。一実施形態において、有効量は、計算されたＥＣ５０の約１倍～３０倍、および時には、計算されたＥＣ５０の約１倍～２０倍、または約１倍～１０倍である。他の実施形態において、有効量は、計算されたＥＣ５０と同じであり、ある特定の実施形態において、有効量は、計算されたＥＣ５０よりも多い量である。

【0160】

有効量は、アッセイから、安全性および漸増および用量範囲の試験、個々の臨床医と患者の関係、ならびにインビトロおよびインビボアッセイから、経容易に験的に決定することができる。

【0161】

投与
オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）の少なくとも１つの治療有効用量が投与される。抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片の「治療有効用量または量」とは、投与されたときに、オステオポンチン関連障害のための個体の治療に関して陽性の治療反応をもたらす量が意図される。特に興味深いのは、抗腫瘍作用もしくは抗炎症作用を提供するか、または心臓肥大もしくは心筋線維症を低減する、抗オステオポンチン抗体、またはその抗原結合断片の量である。「陽性治療応答」とは、本発明による治療を受けている個体が、その個体が治療を受けているオステオポンチン関連障害の１つ以上の症状の改善を示すことを意図する。

【0162】

したがって、例えば、「陽性治療反応」は、療法に関連する疾患の改善、および／または療法に関連する疾患の１つ以上の症状の改善である。例えば、がんの治療に関する陽性治療反応は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指す：（１）腫瘍サイズの減少、（２）がん細胞数の減少、（３）腫瘍成長の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、（４）末梢臓器へのがん細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、（５）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、および（６）がんに関連する１つ以上の症状のある程度の緩和。そのような治療反応は、改善の程度としてさらに特徴付けることができる。したがって、例えば、改善は、完全奏効として特徴付けられ得る。「完全奏効」とは、身体検査、臨床検査、核および放射線による検査（すなわち、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）ならびに／またはＭＲＩ（磁気共鳴画像法））、ならびに試験に参加した時点で陽性であったすべての初期異常もしくは部位について繰り返された他の非侵襲的手技によって確認されたすべての測定可能または評価可能な疾患のすべての症状および兆候の消失の証拠である。代替として、疾患の改善は、部分的な反応であると分類され得る。「部分奏効」とは、治療前の測定値と比較した場合に、測定可能なすべての病変の垂直径の積の和における５０％を超える減少を意図する（評価可能な反応のみを有する患者の場合、部分奏効は適用されない）。

【0163】

ある特定の実施形態において、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）を含む組成物、および／あるいは１つ以上の他の治療剤、例えば、がん、炎症、心臓肥大、心筋線維症を治療するための他の薬物、または他の医薬品の複数の治療有効用量が、毎日の投与計画に従って、または間欠的に投与される。例えば、治療有効用量は、週に１日、週に２日、週に３日、週に４日、または週に５日等投与することができる。「間欠的」投与とは、治療有効用量が、例えば、隔日、２日毎、３日毎等に投与され得ることが意図される。例えば、いくつかの実施形態において、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）は、１、２、３、４、５、６、７、８．．．１０．．．１５．．．２４週間等の長期間にわたって、週２回または週３回投与される。「週２回」または「１週間当たり２回」とは、当該薬剤の２回分の治療有効用量が、７日間の期間内に、投与の最初の週の１日目から開始して、最短の投与間隔は７２時間、最長の投与間隔は９６時間で対象に投与されることを意図する。「週３回」または「１週間当たり３回」とは、３回分の治療有効用量が７日間の期間内に対象に投与され、最短の投与間隔４８時間、最長の投与間隔７２時間を可能にすることを意図する。本発明の目的のために、この種類の投与は、「間欠的」な療法と称される。本発明の方法によれば、対象は、所望の治療反応が達成されるまで、１回以上の週サイクルの間、間欠的な療法（すなわち、治療有効量の週２回または週３回の投与）を受けることができる。薬剤は、本明細書で後述する任意の許容される投与経路によって投与することができる。

【0164】

抗オステオポンチン抗体、もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）を含む組成物は、必ずしもそうではないが、典型的には、経口的に、注射（皮下、静脈内、または筋肉内）により、注入によって、局部的にまたは局所的に投与される。動脈内、腹腔内、肺、鼻、経皮、病変内、胸骨内、実質内、直腸、経皮、経粘膜、くも膜下腔内、心膜、動脈内、眼内等の追加の投与様式も企図される。抗オステオポンチン抗体、もしくはその抗原結合断片（そのコンジュゲートの）を注射によって投与する場合、投与は、連続注入、または単回もしくは多回ボーラスによるものであってもよい。

【0165】

例えば、抗オステオポンチン抗体またはコンジュゲートは、注入によってまたは局所注射によって、例えば、約５０ｍｇ／時間～約４００ｍｇ／時間、約７５ｍｇ／時間～約３７５ｍｇ／時間、約１００ｍｇ／時間～約３５０ｍｇ／時間、約１５０ｍｇ／時間～約３５０ｍｇ／時間、約２００ｍｇ／時間～約３００ｍｇ／時間、約２２５ｍｇ／時間～約２７５ｍｇ／時間の速度で注入によって投与され得る。例示的な注入速度は、例えば、約１ｍｇ／ｍ^２／日～約９ｍｇ／ｍ^２／日、約２ｍｇ／ｍ^２／日～約８ｍｇ／ｍ^２／日、約３ｍｇ／ｍ^２／日～約７ｍｇ／ｍ^２／日、約４ｍｇ／ｍ^２／日～約６ｍｇ／ｍ^２／日、約４．５ｍｇ／ｍ^２／日～約５．５ｍｇ／ｍ^２／日を含む、約０．５ｍｇ／ｍ^２／日～約１０ｍｇ／ｍ^２／日の所望の治療用量を達成することができる。投与（例えば、注入による）は、所望の期間にわたって、例えば、約１日～約５日の期間にわたって、または数日に１回、例えば、約５日間、約１ヶ月、約２ヶ月等にわたって繰り返すことができる。

【0166】

本発明による調製物はまた、局所治療に好適である。特定の実施形態において、組成物は、がんの治療のための抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）の局所送達のために使用される。例えば、組成物は、腫瘍またはがん性細胞に直接投与され得る。投与は、局所カテーテルを介した灌流、または病変内直接注射によって行われ得る。黒色腫の治療のために、組成物は、例えば、病変部位で皮膚に適用される抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）を含有するクリームまたはゲル中で局部的に投与され得る。

【0167】

医薬製剤は、投与直前には液体溶液または懸濁液の形態であってもよいが、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、カプセル、粉末、ゲル、マトリックス、座剤等の別の形態をとってもよい。抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）および他の薬剤を含む医薬組成物は、当該技術分野で既知の任意の医学的に許容される方法に従って、同じまたは異なる投与経路を用いて投与され得る。

【0168】

別の実施形態において、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）および／または他の薬剤を含む医薬組成物は、例えば、オステオポンチン関連障害の発生または進行を防止するために、予防的に投与される。そのような予防的使用は、がん進行または心臓肥大または心筋線維症のリスクが高い対象にとって特に価値がある。

【0169】

本発明の別の実施形態において、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）および／または他の薬剤を含む医薬組成物は、徐放性製剤、または徐放デバイスを使用して投与される製剤中にある。そのようなデバイスは、当該技術分野において周知であり、例えば、経皮パッチ、および非徐放性医薬組成物で徐放効果を達成するために、様々な用量で連続した定常状態で経時的に薬物送達を提供することができる小型の埋込型ポンプを含む。

【0170】

本発明はまた、本明細書で提供される抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片（例えば、治療剤、検出可能な標識、またはイメージング剤にコンジュゲートされる）を含むコンジュゲートを、オステオポンチン関連障害を有する患者に投与するための方法も提供する。この方法は、好ましくは医薬組成物の一部として提供される、治療有効量のコンジュゲートまたは薬物送達系を、本明細書に記載の様式のいずれかによって投与することを含む。投与方法は、抗オステオポンチン抗体による治療に反応を示す任意のオステオポンチン関連障害を治療するために用いることができる。より具体的には、本明細書の組成物は、炎症、心臓肥大／心筋線維症、およびオステオポンチンの発現の上昇に関連するがんの治療に有効である。

【0171】

当業者は、抗オステオポンチン抗体が効果的に治療することができる状態を理解するであろう。投与される実際の用量は、対象の年齢、体重、および全身状態、ならびに治療される状態の重症度、医療従事者の判断、および投与されるコンジュゲートに応じて異なる。治療有効量は、当業者によって決定することができ、各特定の症例の特定の要件に応じて調整される。

【0172】

一般に、治療有効量は、１日約０．５０ｍｇ～５ｇの抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）、より好ましくは１日約５ｍｇ～２ｇ、さらにより好ましくは１日約７ｍｇ～１．５ｇの範囲である。好ましくは、そのような用量は、１０～６００ｍｇを１日４回（ＱＩＤ）、２００～５００ｍｇＱＩＤ、２５～６００ｍｇを１日３回（ＴＩＤ）、２５～５０ｍｇＴＩＤ、５０～１００ｍｇＴＩＤ、５０～２００ｍｇＴＩＤ、３００～６００ｍｇＴＩＤ、２００～４００ｍｇＴＩＤ、２００～６００ｍｇＴＩＤ、１００～７００ｍｇを１日２回（ＢＩＤ）、１００～６００ｍｇＢＩＤ、２００～５００ｍｇＢＩＤ、または２００～３００ｍｇＢＩＤの範囲である。投与される化合物の量は、特定の抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）の効力、ならびに所望の大きさまたは効果、および投与経路に依存する。

【0173】

精製された抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲート（この場合も同様に、好ましくは、医薬製剤の一部として提供される）は、臨床医の判断、患者のニーズ等に応じて様々な投与スケジュールに従って、単独で、あるいはオステオポンチン関連障害を治療するための１つ以上の他の治療剤、例えば、抗がん療法剤、例えば、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤もしくは標的療法剤と、または特定の状態もしくは疾患を治療するために使用される他の医薬品と組み合わせて投与することができる。特定の投与スケジュールは、当業者によって既知であるか、または日常的な方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投与スケジュールとしては、１日５回、１日４回、１日３回、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、毎月１回、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい組成物は、１日に１回以下の投与を必要とするものである。

【0174】

抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートは、他の薬剤の前、それと同時、またはその後に投与することができる。他の薬剤と同時に提供される場合、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートは、同じ組成物中または異なる組成物中で提供され得る。したがって、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲート、および他の薬剤は、併用療法によって個体に提示することができる。「併用療法」とは、療法を受けている対象に物質の組み合わせの治療効果がもたらされるような対象への投与を意図する。例えば、併用療法は、特定の投与計画に従って、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートを含むある用量の医薬組成物と、がんを治療するための別の薬物等の少なくとも１つの他の薬剤を含むある用量の医薬組成物とを投与することによって達成され得るが、これらは併せて治療有効用量を構成する。同様に、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲート、および１つ以上の他の治療剤は、少なくとも１つの治療用量で投与することができる。療法を受けている対象にこれらの物質の組み合わせの治療効果がもたらされる限り、別個の医薬組成物の投与は、同時にまたは異なる時間に（すなわち、同じ日または異なる日に、いずれかの順序で順次）行うことができる。

【0175】

前述の投与計画に従って療法を受けている対象が、長期間の寛解後に部分奏効または再発を示す場合、疾患の完全な寛解を達成するために、その後の一連の併用療法が必要であり得る。したがって、第１の治療期間からの一定期間の休止期間の後、対象は、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートを用いた１つ以上の追加の治療期間を有し得る。治療期間の間のそのような期間は、本明細書では中止期間と称される。中止期間の長さは、これらの治療剤との任意の以前の治療期間の併用療法により達成された腫瘍反応の程度（すなわち、完全対部分的）に依存することを認識されたい。

【0176】

がん患者において、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、限定されないが、手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、または分子標的療法もしくは生物療法等の任意の他のがんの医学的処置と組み合わせてもよい。これらの他の医学的処置法と、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートとの任意の組み合わせを使用して、対象のがんを効果的に処置することができる。

【0177】

例えば、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、限定されないが、アビトレキセート、アドリアマイシン、アドルシル、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アントラサイクリン、アザシチジン、アザチオプリン、ＢｉＣＮＵ、ブレノキサン、ブスルファン、ブレオマイシン、カンプトサール、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン、セルビジン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、コスメゲン、シタラビン、サイトサール、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エレンス、エルスパー、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、フルダラ、ゲムシタビン、ジェムザール、ハイカムチン、ヒドロキシウレア、ハイドレア、イダマイシン、イダルビシン、イホスファミド、ＩＦＥＸ、イリノテカン、ランビス、ロイケラン、ロイスタチン、マツラン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、ムタマイシン、ミレラン、ミロサール、ナベルビン、ニペント、ノバントロン、オンコビン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パラプラチン、ペントスタチン、プラチノール、プリカマイシン、プロカルバジン、プリントール、ラルチトレキセド、タキソテール、タキソール、テニポシド、チオグアニン、トムデックス、トポテカン、バルルビシン、ベルバン、ベプシド、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ－１６およびブモン等の１つ以上の化学療法剤を用いた化学療法と組み合わせてもよい。

【0178】

別の例では、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、限定されないが、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ、ＳＴＩ－５７１としても知られている）、ゲフィチニブ（Ｉｌｅｓａ、ＺＤ１８３９としても知られている）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａとして市販されている）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｉｎａ）、およびボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）等のチロシンキナーゼ阻害剤；トファシチニブ等のヤヌスキナーゼ阻害剤；クリゾチニブ等のＡＬＫ阻害剤；オブクラックスおよびゴシポール等のＢｃｌ－２阻害剤；イニパリブおよびオラパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤；ペリホシン等のＰＩ３Ｋ阻害剤；アパチニブ等のＶＥＧＦ受容体２阻害剤；［Ｄ－Ｌｙｓ（６）］－ＬＨＲＨと連結されたＡＮ－１５２（ＡＥＺＳ－１０８）ドキソルビシン；ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、およびＬＧＸ８１８等のＢｒａｆ阻害剤；トラメチニブ等のＭＥＫ阻害剤；ＰＤ－０３３２９１およびＬＥＥ０１１等のＣＤＫ阻害剤；サリノマイシン等のＨｓｐ９０阻害剤；ビンタフォリド等の小分子薬物コンジュゲート；テムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）、エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）、トラメチニブ（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ）、およびダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）等のセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；ならびにリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａまたはＲｉｔｕｘａｎとして市販されている）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、アレムツズマブ、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘとして市販されている）、パニツムマブ、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎとして市販されている）、およびイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）等の１つ以上の小分子阻害剤またはモノクローナル抗体を用いた標的療法と組み合わせてもよい。

【0179】

さらなる例では、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、限定されないが、以下のいずれかを使用する免疫療法と組み合わせてもよい：がんワクチン（例えば、Ｅ７５ＨＥＲ２由来ペプチドワクチン、Ｎｅｌｉｐｅｐｉｍｕｔ－Ｓ（ＮｅｕＶａｘ）、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）、抗体療法（例えば、トラスツズマブ、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アレムツズマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、ニボルマブ、ペムロリズマブ、またはリツキシマブ）、サイトカイン療法（例えば、Ｉ型（ＩＦＮαおよびＩＦＮβ）、ＩＩ型（ＩＦＮγ）およびＩＩＩ型（ＩＦＮλ）を含むインターフェロン、ならびにインターロイキン（ＩＬ－２）を含むインターロイキン）、アジュバント免疫療法（例えば、ポリサッカライド－Ｋ）、養子Ｔ細胞療法、および免疫チェックポイント遮断療法。

【0180】

さらなる例では、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、限定されないが、ヨウ－１３１、ストロンチウム－８９、サマリウム－１５３、およびラジウム－２２３を含む、放射性同位体を用いる放射線療法と組み合わせてもよい。さらに、放射線療法は、限定されないが、シスプラチン、ニモラゾール、およびセツキシマブ等の放射線増感薬の投与と組み合わせてもよい。

【0181】

黒色腫を有する患者の場合、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片またはそのコンジュゲートによる治療は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、またはそれらの組み合わせの投与と組み合わせてもよい。例示的なＢ－Ｒａｆ阻害剤としては、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＧＤＣ－０８７９、およびＰＬＸ－４７２０が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、およびＰＤ－３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0182】

キット
本明細書に記載の組成物のいずれも、キットに含まれ得る。例えば、キットは、抗オステオポンチン抗体、その抗原結合断片、抗オステオポンチン抗体のコンジュゲート、抗オステオポンチン抗体および／もしくはそのコンジュゲートを含む医薬製剤、抗オステオポンチン抗体をコードする組換え核酸もしくはベクター系、ならびに／または宿主細胞（抗オステオポンチン抗体をコードする組換え核酸またはベクター系でトランスフェクトされたか、または別個のもの）を含む組成物を含み得る。

【0183】

いくつかの実施形態において、キットは、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片に特異的に結合する抗オステオポンチン抗体またはその抗原結合断片、を含み、抗体は、オステオポンチンのトロンビン切断またはオステオポンチンのトロンビン切断断片へのインテグリン結合を阻害する。ある特定の実施形態において、キットは、抗オステオポンチン抗体コンジュゲートまたは抗体および／もしくはコンジュゲートを含む製剤を含む。

【0184】

ある特定の実施形態において、キットに含まれる抗体またはその抗原結合断片は、ＯＰＮ－Ｒ断片またはＯＰＮ－ＣＴＦ断片に特異的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、オステオポンチンのＡｒｇ１６８を含むエピトープに特異的に結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１～７、配列番号９～１２、および配列番号４７からなる群から選択される配列を含むオステオポンチンペプチドに特異的に結合する。

【0185】

ある特定の実施形態において、キットに含まれる抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１６もしくは配列番号２０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0186】

ある特定の実施形態において、キットに含まれる抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0187】

ある特定の実施形態において、キットに含まれる抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）、および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２６のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２８のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８０～１００％の配列同一性（この範囲内の任意のパーセント同一性、例えば、それに対する８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を含む）を示す配列を含む軽鎖を含む。

【0188】

ある特定の実施形態において、キットに含まれる抗オステオポンチン抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ナノボディ、二重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー抗体、三重特異性抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆ_ｖ断片、またはｓｃＦｖ断片である。

【0189】

キットは、本明細書に記載の抗体組成物を含む１つ以上の医薬製剤を含み得る。したがって、キットは、１つ以上の単位剤形として存在する単一の医薬組成物を含み得る。さらに他の実施形態において、キットは、２つ以上の別個の医薬組成物を含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局部送達（例えば、黒色腫の治療のための抗体またはコンジュゲートを含むゲルまたはクリーム）に好適である。

【0190】

いくつかの実施形態において、キットは、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含む組成物をさらに含み得る。

【0191】

いくつかの実施形態において、キットは、限定されないが、化学療法剤、免疫療法剤、生物療法剤、アポトーシス促進剤、血管新生阻害剤、光活性剤、放射線増感剤、および放射性同位体、またはそれらの組み合わせを含む、１つ以上の抗がん療法剤を含む組成物をさらに含み得る。

【0192】

組成物は、液体形態であり得るか、または凍結乾燥させることができる。組成物に好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成することができる。容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液等の、薬学的に許容される緩衝液を含む容器をさらに含むことができる。キットはまた、緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジ、または他の送達デバイス等の、他の薬学的に許容される製剤化溶液を含む、エンドユーザに有用な他の材料を含むこともできる。キットはまた、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）で予め充填された送達デバイスも提供し得る。

【0193】

上記の構成要素に加えて、主題のキットは、（ある特定の実施形態では）主題の方法を実施するための指示書（すなわち、本明細書に記載のオステオポンチン関連障害を治療するための指示書）をさらに含み得る。これらの指示書は、様々な形態で主題のキット内に存在し得、そのうちの１つ以上が、キット内に存在し得る。これらの指示書が存在し得る１つの形態は、キットのパッケージ中、添付文書中等の、好適な媒体または基板上の印刷情報としてであり、例えば、情報が印刷されている１枚または複数枚の紙等である。これらの指示書のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、ＤＶＤ、ブルーレイ、フラッシュドライブ等である。存在し得る、これらの指示書のさらに別の形態は、離れた場所で情報にアクセスするために、インターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。

【0194】

有用性
本明細書に記載の抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）は、炎症、心臓肥大、心筋線維症、ならびに黒色腫、膠芽腫、卵巣がん、乳がん、および肺がん等の、オステオポンチンまたはそのトロンビン切断断片のレベルの上昇に関連する任意の疾患または障害を含む、オステオポンチン関連障害の治療に有用である。

【0195】

特に、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）は、悪性黒子、悪性黒子由来黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端黒子型黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、ポリポイド黒色腫、および線維形成性黒色腫を含むが、これらに限定されない黒色腫の治療に有用である。黒色腫細胞は、黒色腫細胞によってコードされるタンパク質が、患者の体内の他の場所のタンパク質と異なることを意味する、ゲノムＤＮＡ配列の変化（変異）を含有し得る。一例として、細胞への成長シグナル伝達に関与するタンパク質であるＢ－Ｒａｆは、変異を有し得る。特に、抗オステオポンチン抗体もしくはその抗原結合断片（またはそのコンジュゲート）は、Ｖ６００Ｅ変異またはＶ６００Ｋ変異を含む黒色腫を含むが、これらに限定されないＢ－ＲＡＦ変異黒色腫を治療するために使用され得る。抗オステオポンチン抗体（またはその抗原結合断片）は、転移性黒色腫を含む任意の病期の黒色腫を治療するために使用され得る。

【0196】

実験
以下の実施例は、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図するものでもなく、また、以下の実験が行われたすべてのまたは唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保する努力がなされてはいるが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

【0197】

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0198】

本発明は、本発明の実施のための好ましい様式を含むように、本発明者によって見出されたまたは提唱された特定の実施形態に関して記載されてきた。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態において多数の修正および変更を行うことができることを認識するであろう。例えば、コドン冗長性のために、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎を成すＤＮＡ配列に変更を行うことができる。生物学的機能等価性の考慮によって、種類または量で生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造に変更を行うことができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

【0199】

実施例１
オステオポンチンのトロンビン切断は、黒色腫の成長および進行を促進する
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、幅広いインテグリンに結合する高度に保存されたＲＧＤドメインを有する、マトリックス細胞の多機能タンパク質である。トロンビンは、ＯＰＮを、新たなインテグリン結合部位を有するＯＰＮ－Ｒと、走化性を促進するＣ末端断片（ＣＴＦ）の２つの断片に切断する（図１）。Ｃ末端にＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３）を有するＯＰＮ－Ｒは、インテグリンα４β１およびα９β１に結合する。トロンビン切断部位におけるアルギニンのアラニン（Ｒ１５３Ａ）への変異は、ＯＰＮをトロンビン切断に耐性にする。Ｎｅｍｏｔｏら（Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．２００１）により、ＯＰＮを欠くマウス（ＯＰＮノックアウト［ＫＯ］マウス）では、Ｂ１６黒色腫の成長が抑制されることが報告されている。しかしながら、がん進行におけるＯＰＮの重要性に関する広範な研究にもかかわらず、ＯＰＮのトロンビン切断の役割は不明である。

【0200】

ＯＰＮのトロンビン切断が炎症性障害およびがんの病理において果たす役割をさらに理解するために、実験マウスモデルにおいて、ＯＰＮ遺伝子にＡｒｇ１５３Ａｌａ変異を導入することによりＯＰＮのトロンビン切断部位を無効にした。トロンビン切断に耐性のあるＯＰＮを有するマウスは、Ａｒｇ１５３をＡｌａに置き換えることによって作製した（ＯＰＮＲ１５３Ａ；ＯＰＮノックイン［ＫＩ］）。マウスの脇腹にＢ１６黒色腫細胞を皮下接種し、腫瘍成長を監視し、屠殺後に腫瘍重量を測定した。転移のモデルにおいて、マウスの尾静脈を通してＢ１６黒色腫細胞を静脈内に注入し、屠殺後、結節の数を視覚的にカウントし、メラニン含量を決定することによって肺内の黒色腫を定量した（メラニンは、肺内の黒色腫細胞の量の認められている尺度である）。何匹かのマウスに、トロンビン阻害剤であるダビガトランエテキシレートを含有する固形飼料を与えた。

【0201】

経時的な体積または屠殺時の体重として監視した場合、野生型（ＷＴ）マウスにおいて強固な腫瘍成長が観察されたが、ＯＰＮノックアウト（ＫＯ）マウスおよびＯＰＮＲ１５３Ａ－ＫＩマウスの両方で腫瘍成長がほぼ同じ程度に抑制された（図２Ａ～図２Ｂ）。転移モデルにおいて、ＷＴマウスは、ＯＰＮ ＫＩマウスよりも肺に多くの腫瘍結節を有し、肺に多くのメラニンが存在した（図３Ａ～図３Ｂ）。

【0202】

ＯＰＮのトロンビン切断の役割は、特定の経口トロンビン阻害剤であるダビガトランエテキシレート（ＤＥ）でマウスを処理することによって確認した。ＤＥで処理した野生型マウス（ＷＴ）では、脇腹の腫瘍成長（図４Ａ～図４Ｂ）が、ＯＰＮ－ＫＩマウスに見られるのと同じレベルまで減少した。同様に、転移モデルにおいて、ＷＴマウスの転移が、ＯＰＮ－ＫＩおよびＯＰＮ－ＫＯマウスに見られるのと同じレベルまで減少した（図５Ａ～図５Ｂ）。

【0203】

ＯＰＮのトロンビン切断が他のがんにおいて重要であることを実証するために、Ｉｄ８細胞（卵巣がん）を腹腔内に注入した卵巣がんモデルを使用した。体重の増加は腫瘍の成長を表すため、マウスの体重を測定した。ＯＰＮ－ＫＩマウスにおけるＩｄ８卵巣がん腫瘍の成長は、ＷＴマウスのものと比較して有意に低下した。

【0204】

我々のデータは、がん生物学におけるＯＰＮのトロンビン切断の重要性の最初の証拠を提供する。ＯＰＮ ＫＩマウスは、ＯＰＮの不在に等しいＢ１６腫瘍成長の減少を示し、宿主ＯＰＮのトロンビン切断がインビボでの黒色腫成長において重要な役割を果たすことが示唆された。加えて、ＯＰＮ ＫＩマウスにおいて、ＷＴマウスと比べてＩｄ８卵巣がんの成長が抑制された。トロンビン阻害剤ダビガトランエテキシレートによる処理は、皮下移植モデルおよび転移モデルの両方におけるＢ１６黒色腫の成長を、ＯＰＮを欠くマウス、またはトロンビンによって切断され得なかったＯＰＮを有するマウスにおいて観察されたものと同様のレベルまで低下させた。

【0205】

実施例２
治療用モノクローナル抗体
ＯＰＮ－ＫＩマウスを用いた黒色腫および卵巣がん試験（実施例１）の結果は、ＯＰＮ切断の遮断および／またはＯＰＮ断片のブロックが、黒色腫および他のがんにおける治療的介入の可能性を有することを示している。異なる形式（ｍＡＢ、二重特異性、三重特異性、ナノボディ等）のモノクローナル抗体を、以下の標的に対して作製する。
ＯＰＮ－ＦＬ：ＯＰＮの切断をブロックする抗体：
トロンビンのアニオン結合エキソサイト１および２に結合するヒトＯＰＮまたはＯＰＮ配列のＳＶＶＧＬＲ（配列番号１）またはＳＫＳＫＫＦ（配列番号２）に対する抗体。
ＯＰＮ－Ｒ：ヒトＯＰＮの露出ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３）に対する抗体を使用して、ＯＰＮ－Ｒへのインテグリン結合をブロックする抗体
ＯＰＮ－ＣＴＦ：ＣＴＦ多量体形成をブロックするヒトＯＰＮのＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号４）配列をブロックする抗体

【0206】

用途：
黒色腫および他のがんは、単剤療法として、または標準療法と組み合わせて、抗体を用いて治療することができる。治療効果は、ＯＰＮトロンビン切断部位（ＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ、配列番号９）、ＯＰＮ－Ｒ ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号３）インテグリン結合モチーフ、およびがんにおけるＣＴＦ多量体形成に関与するＯＰＮ－ＣＴＦ領域ＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１０）の機能ブロックのためのモノクローナル抗体の生成によって得られる。トロンビン上のＯＰＮの結合部位、エキソサイト１および２を標的とする抗体は、トロンビンによるＯＰＮ切断を低減するのにも有用であり得る。トロンビン結合エキソサイト１および２に特異的に結合するが、トロンビンの凝固促進活性を妨げないペプチドも有用であり得る。

【0207】

この抗体は、トロンビン阻害剤または他の抗凝固剤が使用される場合、出血リスクの副作用なしにＯＰＮ切断防止の有益な効果を達成するのに有用である。

【0208】

実施例３
オステオポンチンのトロンビン切断を阻害するモノクローナル抗体の産生
我々の目標は、全長オステオポンチン（ＯＰＮ－ＦＬ）に結合して、トロンビンによるその切断をブロックするモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を同定することであった。図７は、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、アカゲザル、カニクイザル、およびブタのトロンビン切断部位の周囲のＯＰＮタンパク質配列のアラインメントを示す。ウサギモノクローナル抗体を開発するために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共有結合したペプチド抗原

【数3】

（配列番号１１、太字のアミノ酸はトロンビンにより切断される）を使用してウサギにおいて抗体を産生させた。ペプチド抗原をポリエチレングリコールで修飾して溶解度を増加させ、６－アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）リンカーを、Ａｈｘ（ＰＥＧ）_３－ＹＧＬＲＳＫＳ－Ａｈｘ－Ｃ）によって連結されたＣ末端Ｃｙｓで修飾した。トロンビン切断部位の周囲のＯＰＮ配列がマウスおよびヒト配列とは異なるため、ウサギを選択した。

【数4】

（配列番号４７、太字のアミノ酸はトロンビンにより切断される）。ペプチド抗原に結合した抗体を産生する細胞は、それらの重鎖および軽鎖ｃＤＮＡをクローニングし、ウサギＩｇＧを発現する発現ベクターに挿入した。次いで、これらの発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトし、培地をアッセイした。次いで、抗体スクリーニングを用いて、マウス、ラット、およびヒトのオステオポンチンと反応する抗体を産生するクローンを同定した。

【0209】

ＯＰＮ抗原ペプチドに対する直接ＥＬＩＳＡを用いて、ウサギモノクローナルクローンをスクリーニングした（図８）。３５個の陽性（図示）が同定された。抗ＯＰＮ ＩｇＧを産生するクローンを同定するアッセイのために、９６ウェルプレートを２μｇ／ｍＬのアビジンで一晩コーティングした後、ビオチンで標識したＯＰＮ抗原ペプチドを３０分間添加した。次いで、クローンからの上清を１：５０に希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。

【0210】

クローン上清中のＩｇＧの濃度を決定するために、９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍＬの抗ウサギＩｇＧで一晩コーティングした。次いで、クローンからの上清を１：５０に希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。クローン上清中のＩｇＧの濃度は、ウサギＩｇＧの標準希釈曲線から計算した。

【0211】

図９は、抗原ペプチド、マウスＯＰＮ－ＦＬおよびヒトＯＰＮ－ＦＬに対する直接ＥＬＩＳＡにおけるウサギモノクローナル抗体のスクリーニング結果を示す。ヒトまたはマウス由来のＯＰＮ－ＦＬに結合したクローンを同定した。４つのクローン（Ａ２、Ａ６、Ｅ５、およびＧ７）が、さらなる調査のために選択された。ペプチド抗原結合アッセイにおいて、これらの４つのクローンのＥＣ_５０を決定した（図１０）。精製した抗ＯＰＮ ＩｇＧのＥＣ_５０を決定するために、９６ウェルプレートを２μｇ／ｍＬのアビジンで一晩コーティングした後、ビオチンで標識したＯＰＮ抗原ペプチドを３０分間添加した。次いで、選択されたクローンからの上清中のＩｇＧを、プロテインＡ／Ｇセファロースビーズに結合させて溶出することによって精製した。精製したＩｇＧを段階希釈した後、１０^３倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ Ｆｃで検出した。ＨＲＰの基質を添加し、色を測定した。

【0212】

図１１は、ＯＰＮ抗原ペプチドに結合させるための４つのクローンのＥＣ_５０値を示す。図１０のデータに基づいて、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄを使用して４パラメータフィット方程式からＥＣ_５０値を計算した。ＥＣ_５０値は、Ａ２クローンでは２．６ｎｇ／ｍＬ、Ａ６クローンでは３．２ｎｇ／ｍＬ、Ｅ５クローンでは４．０ｎｇ／ｍＬ、Ｇ７クローンでは９３．２ｎｇ／ｍＬであった。

【0213】

マウスＯＰＮ－ＦＬに対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて４つのクローンのＥＣ_５０値を決定し（図１２）、Ａ２、Ａ６、およびＥ５を含むすべてのクローンが、マウスＯＰＮ－ＦＬに結合することが見出された。ＰＢＳ緩衝液中のヤギポリクローナル抗マウスオステオポンチンＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。組換えマウスオステオポンチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をＰＢＳ中１％のＢＳＡで希釈し（２００ｎｇ／ｍｌから開始して希釈）、２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（５００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。

【0214】

加えて、ヒトＯＰＮ－ＦＬに対する直接結合ＥＬＩＳＡにおいて４つのクローンのＥＣ_５０値を決定し、４つのクローンはすべて、ヒトＯＰＮ－ＦＬに結合することが見出された（図１３）。ＰＢＳ緩衝液中のマウスモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体（４μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。組換えヒトオステオポンチンタンパク質（ＧＳＴ－ＯＰＮ－ｈｉｓ、社内で精製）をＰＢＳ中１％のＢＳＡで希釈し（２００ｎｇ／ｍｌから開始して希釈）、２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（５００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。

【0215】

次に、４つのクローンからのモノクローナル抗体がヒトＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断を阻害する能力を、ＯＰＮ－Ｒの特異的ＥＬＩＳＡにおいて、切断生成物のうちの１つであるＯＰＮ－Ｒの生成の阻害を検出することによって決定した。４つのクローンすべてが、ヒトＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断を阻害することが見出された（図１４）。組換えヒトオステオポンチンタンパク質（３．２μＭ、社内で精製）を、精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照とともに、またはそれらなしで、室温で２０分間インキュベートした。ヒトトトロンビン（３２ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を試料に添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰＰＡＣＫを４．８μＭまで添加した。試料をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１／３００に希釈し、生成されたＯＰＮ－ＲをＯＰＮ－Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。

【0216】

ヒトＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡ：
ＰＢＳ緩衝液中のマウスモノクローナル抗ヒトオステオポンチン抗体（４μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。組換えヒトＯＰＮ－Ｒタンパク質（ＧＳＴ－ＯＰＮ－Ｒ、Ｍｙｌｅｓ ｅｔ ａｌ，２００３ ＪＢＣ））を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈した（２００ｎｇ／ｍｌから開始し、希釈した）。トロンビン切断生成物の標準および試料（１／３００希釈から開始してさらに希釈）を２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のビオチン化ウサギポリクローナル抗ＯＰＮ－Ｒ抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｈａｒｉｆｅｔａｌ，２００９Ａ＋Ｒ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。各試料において生成されたＯＰＮ－Ｒの量を、ＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡにおけるＯＰＮ－Ｒ標準から計算し、次いで、異なる濃度での各抗体クローンのトロンビン切断の阻害を計算し、グラフ化した。[図１５]ヒトＯＰＮ－ＦＬの切断の阻害における４つのクローンの阻害％を示す。Ａ２は８２％、Ａ６は９５．４％、Ｅ５は７７．２％、Ｇ７は６０．１％。

【0217】

また、ＯＰＮ－Ｒの特異的ＥＬＩＳＡにおいて、切断生成物のうちの１つであるＯＰＮ－Ｒの生成を決定することによって、４つのクローンについてマウスＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断の阻害を評価した。４つのクローンはすべて、マウスＯＰＮ－ＦＬのトロンビン切断を阻害することが見出された（図１６）。組換えマウスオステオポンチンタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）（２μＭ）を、精製抗体Ａ２、Ａ６、Ｅ５、Ｇ７またはＩｇＧ対照（２μＭ）とともに、またはそれらなしで、室温で２０分間インキュベートした。ヒトトロンビン（２０ｎＭ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を試料に添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、続いてＰＰＡＣＫを４．７μＭまで添加した。試料をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１／１００または１／３０に希釈し、生成されたＯＰＮ－ＲをＯＰＮ－Ｒ特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。

【0218】

マウスＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡ：
ＰＢＳ緩衝液中のヤギポリクローナル抗マウスオステオポンチンＩｇＧ（４μｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、非特異的結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。トロンビン切断生成物の試料（１／３０または１／１００希釈から開始し、さらに希釈）を２時間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０で洗浄した後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のビオチン化ウサギポリクローナル抗ＯＰＮ－Ｒ抗体（２μｇ／ｍｌ）（Ｓｈａｒｉｆ ｅｔ ａｌ，２００９Ａ＋Ｒ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、試料を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のペルオキシダーゼ抱合ストレプトアビジン（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質を１０分間インキュベートし、続いてストップ溶液を添加し、４５０ｎｍで吸光度の測定を行った。各試料において生成されたＯＰＮ－Ｒの量を、ＯＰＮ－Ｒ ＥＬＩＳＡにおけるＯＰＮ－Ｒ標準から計算し、次いで、異なる濃度での各抗体クローンのトロンビン切断の阻害を計算し、グラフ化した。

【0219】

クローンを配列決定した。Ａ２、Ａ６、Ｅ５、およびＧ７モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列、ならびにそれらをコードする核酸配列、ならびにそれらのＣＤＲの配列を決定し、配列表の配列番号１３～４６に示される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】