特表 2022-543735 新規のリボ核酸、及びそれを基にする薬剤学的組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-14

(54)【発明の名称】新規のリボ核酸、及びそれを基にする薬剤学的組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20221006BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221006BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K39/12

A61K39/02

A61K39/00 Z

A61K39/395 A

A61K39/395 H

A61P35/00

A61P31/12

A61P31/04

A61K31/713

A61K45/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021578257

(86)(22)【出願日】2020-07-01

(85)【翻訳文提出日】2022-02-17

(86)【国際出願番号】 KR2020008623

(87)【国際公開番号】W WO2021002688

(87)【国際公開日】2021-01-07

(31)【優先権主張番号】10-2019-0079470

(32)【優先日】2019-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0153760

(32)【優先日】2019-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0037711

(32)【優先日】2020-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522002261

【氏名又は名称】エヌエー ヴァクシン インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】キム，ドン ホ

(72)【発明者】

【氏名】カン，ミュン ソ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084AA27

4C084MA02

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA38

4C085BA07

4C085BA51

4C085BA99

4C085BB01

4C085EE03

4C085EE06

4C085FF21

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA28

4C086MA02

4C086MA05

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は、任意の配列と、任意の長さとを有し、完全な相補性を有するＴＬＲ３リガンドとして作用する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）部位が真ん中に位置し、任意の配列（望ましくは、ＴＬＲ７リガンド配列）と、任意の長さとを有する一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）が、二本鎖リボ核酸の両側３’末端に連結されたヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）に関する。また、本発明は、それを含むウイルス感染または細菌感染、及び癌の予防及び治療のための組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとのいずれもの任意の特定配列と、特定定められた長さとを有することができる、真ん中に位置し、その両側３’末端に、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）オーバーハングが連結されたヘテロポリマ二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ：hetero structured ＲＮＡ）ヘテロ構造。

【請求項2】

前記ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３リガンドとして作用する、塩基長は、１４０ないし１６８２baseであることを特徴とする請求項１に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項3】

前記ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）の塩基長は、２０％範囲内において、増減されうることを特徴とする請求項２に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項4】

前記二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３リガンドとして作用し、塩基長は、１０６ないし１，６４８ｂｐであることを特徴とする請求項１に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項5】

前記二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の塩基長は、２０％範囲内において、増減されること特徴とする請求項４に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項6】

前記ｓｓＲＮＡは、ＴＬＲ７類似リガンドまたはＴＬＲ８類似リガンドとして作用することを特徴とする請求項１に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項7】

下記のところのうちから選択されるヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）：
（１）配列番号１の塩基配列と、配列番号３２の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２）配列番号２の塩基配列と、配列番号３３の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（３）配列番号３の塩基配列と、配列番号３４の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（４）配列番号４の塩基配列と、配列番号３５の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（５）配列番号５の塩基配列と、配列番号３６の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（６）配列番号６の塩基配列と、配列番号３７の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（７）配列番号７の塩基配列と、配列番号３８の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（８）配列番号８の塩基配列と、配列番号３９の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（９）配列番号９の塩基配列と、配列番号４０の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１０）配列番号１０の塩基配列と、配列番号４１の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１１）配列番号１１の塩基配列と、配列番号４２の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１２）配列番号１２の塩基配列と、配列番号４３の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１３）配列番号１３の塩基配列と、配列番号４４の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１４）配列番号１４の塩基配列と、配列番号４５の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１５）配列番号１５の塩基配列と、配列番号４６の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１６）配列番号１６の塩基配列と、配列番号４７の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１７）配列番号１７の塩基配列と、配列番号４８の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１８）配列番号１８の塩基配列と、配列番号４９の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（１９）配列番号１９の塩基配列と、配列番号５０の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２０）配列番号２０の塩基配列と、配列番号５１の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２１）配列番号２１の塩基配列と、配列番号５２の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２２）配列番号２２の塩基配列と、配列番号５３の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２３）配列番号２３の塩基配列と、配列番号５４の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２４）配列番号２４の塩基配列と、配列番号５５の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２５）配列番号２５の塩基配列と、配列番号５６の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２６）配列番号２６の塩基配列と、配列番号５７の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２７）配列番号２７の塩基配列と、配列番号５８の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２８）配列番号２８の塩基配列と、配列番号５９の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（２９）配列番号２９の塩基配列と、配列番号６０の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（３０）配列番号３０の塩基配列と、配列番号６１の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と、２個の一本鎖リボ核酸オーバーハングとを含むヘテロ構造リボ核酸と、
（３１）配列番号３１の塩基配列と、配列番号６２の塩基配列とが相補的に結合した結果として形成された二本鎖リボ核酸と一本鎖リボ核酸と、を含むことを特徴とする請求項１に記載のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）。

【請求項8】

請求項１または７に記載のｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡを除去することによって得られる、均質なｄｓＲＮＡ。

【請求項9】

前記ｄｓＲＮＡは、配列番号６３ないし９３によって構成される群から選択された任意の配列、及びそれらの相補的配列を含むものである、請求項８に記載の均質なｄｓＲＮＡ。

【請求項10】

請求項１または７に記載のｈｓＲＮＡ、または請求項８に記載のｄｓＲＮＡを含む薬剤学的組成物。

【請求項11】

前記薬剤学的組成物は、ウイルス感染またはバクテリア感染、癌、または癌関連疾病を予防または治療するためのものであり、追加のアジュバントまたは免疫源をさらに含むものである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記薬剤学的組成物は、癌、または癌関連疾病を予防または治療するためのものであり、前記癌は、皮膚癌、乳癌、肺癌、大腸癌及び膵臓癌を含むものである、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記薬剤学的組成物は、ＯＸ－４０抗体またはＰＤ－１抗体を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

活性成分として、請求項１または７に記載のｈｓＲＮＡ、または請求項８に記載のｄｓＲＮＡを含む、均質な薬剤学的作用剤。

【請求項15】

活性成分として、請求項１または７に記載のｈｓＲＮＡ、または請求項８に記載のｄｓＲＮＡを含む均質な、癌治療作用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、長さ非均質性、高い毒性、及び活性の非一貫性のようなPoly（Ｉ：Ｃ）の問題点を克服した新規のリボ核酸に関する。具体的には、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいずれもの任意の特定配列と、特定の定められた長さとを有し、真ん中に位置し、その両側３’末端に、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）オーバーハングが連結された非ホモポリマー状二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、いわゆる、ヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ：hetero structured ＲＮＡ）に関する。前記ｄＲＮＡは、完全相補性を有し、ＴＬＲ３リガンドとして作用する一方、ｓｓＲＮＡ配列は、望ましくは、ＴＬＲ７類似リガンドとして特徴づけられる。前記ヘテロ構造リボ核酸は、長さが高度に均質であり、高い先天免疫活性及び安定性を有する。

【0002】

前述の開示されたヘテロ構造リボ核酸及び二本鎖リボ核酸は、副作用がほとんどない薬剤学的作用剤であり、それにより、ウイルス感染または細菌感染、及び癌の予防及び治療のための組成物の活性成分として有用である。

【背景技術】

【0003】

Ａ）先天免疫活性剤としてのＴＬＲ３リガンド
ＴＬＲ３は、樹枝状細胞（ＤＣ：dendritic cell）上、Ｂ細胞上、単核細胞由来大食細胞上、及び多くの腫瘍組織上のエンドソーム（endosome）区画で正常に発現され、ｄｓＲＮＡを感知する。該ｄｓＲＮＡは、ウイルス、またはウイルス感染された異常な細胞に由来しうる。ＴＬＲ３がｄｓＲＮＡを認識すれば、第Ｉ型インターフェロンと炎症誘発性サイトカイン（proinflammatory cytokines）との分泌を刺激し、また、抗原エピトープがＭＨＣ－１分子上にローディングされ、ナイーブＴ細胞に提供されるように、ＤＣが成熟した抗原提示細胞（ＡＰＣ）に活性化されるように刺激する。ＴＬＲ３によるＤＣの活性化は、微生物病原体に対する先天免疫反応及び適応免疫反応の誘導に寄与するだけではなく、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と自然殺害（ＮＫ）細胞とを活性化させる（非特許文献１）。インビトロでＴＬＲ３を誘導することができるｄｓＲＮＡの最小長さは、４５ｍｅｒであると知られている。試験管内内で培養された樹枝状前駆細胞を、前記ｄｓＲＮＡと、ＦＬＴ３リガンドまたはＧＭ－ＣＳＦとで処理した細胞を対象に、分析が行われたとしても、それらの生体内機能寄与は、今のところ明確に理解されていない(非特許文献１)。

【0004】

ｄｓＲＮＡ類似体であるPoly（Ｉ：Ｃ）を、感染及び腫瘍に適用した報告がある（特許文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）が、ＤＣ、ＮＫ及びＣＴＬ（cytotoxic lymphocyte）を刺激し、腫瘍の成長を停止させる（非特許文献２）。しかし、長さのはなはだしい不均質性から内在的に発生する、Poly（Ｉ：Ｃ）の高い毒性及び均一ではない活性により、Poly（Ｉ：Ｃ）の臨床分野に適用することが制限されてきた。Poly（Ｉ：Ｃ）は、長さにによって異なる細胞反応を示すが、さらに短い形態は、ＴＬＲ３を活性化させ、さらに長い形態は、それぞれＴＬＲ３とＭＤＡ５との活性を介して先天免疫を活性化させる（非特許文献１）。

【0005】

Ｂ）先天免疫において、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８リガンドの役割を行うｓｓＲＮＡ
グアノシン（Ｇ）及びウリジン（Ｕ）を含む（望ましくは、「ＧＵＵ」が反復される配列を有する）ｓｓＲＮＡは、ＤＣ及び大食細胞を刺激し、それは、ＮＦ－κＢ活性化、サイトカイン分泌及び先天免疫において、ＭＹＤ８８及びＴＲＡＦ６を介する炎症反応によって媒介される。ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、エンドソームの膜上に存在し、ｓｓＲＮＡを認識する。ＴＬＲ７は、グアノシン及びウリジンを含むｓｓＲＮＡに係わる二重受容体であるが、結合第１部位は、小さいリガンド(すなわち、Ｇ)を優先して感知し、結合第２部位は、ｓｓＲＮＡのウリジン部分を認識する。

【0006】

Ｃ）Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡの極端な長さ非均質性、及び毒性
生体内外において、ＤＣを活性化させるｄｓＲＮＡ長を正確に定義する必要がある。いくつかのリボ核酸誘導体が、ワクチンアジュバント候補物質として提示されたが（特許文献１－１８）、その生産の内在的限界により、同一性及び均質性を保証することができない。そのような点のために、Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡは、機能及び安全性において、はなはだしい非均質性を示し、その適用が制限される（特許文献１－１４）。前記Poly（Ｉ：Ｃ）系物質の製造過程と、それによる問題点は、以下の通りある。

【0007】

Poly（Ｉ：Ｃ）は、合成ｄｓＲＮＡ類似体であり、イノシンホモポリマー鎖（inosine homopolymer）Poly（Ｉ）とシチジルホモポリマー鎖（cytidyl homopolymer）Poly（Ｃ）とによって構成され、それらは、相補的に互いに結合し、非天然ｄｓＲＮＡを形成する。各鎖は、ポリヌクレオチドリン酸化酵素（ＰＮＰａｓｅ：polynucleotide phosphorylase）を利用し、末端に位置した塩基に、新たな塩基を追加する方式で酵素的に別途に合成されるために、生成されたホモポリマーの長さが非常に多様である。さらに、長いホモポリマー配列（例：平均４００ｂａｓｅ Poly（Ｉ））に相補的な長いホモポリマー（例：平均４００base Poly（Ｃ））を対応させ、アニーリング（annealing）させれば、上部鎖(すなわち、Poly（Ｉ））は、その相補的下部鎖（すなわち、Poly（Ｃ））に沿い、どこにでも結合し（鎖滑り（chain slippage））、両鎖の３’末端または５’末端のどこにも一本鎖領域を不可避に生成する。さらには、その領域に前記相補的鎖が再び結合すれば、数十ないし数百ｋｂｐ以上のきわめて多用な長さを作る（鎖延長（chain extension））。それだけではなく、鎖延長後、不特定位置に、不特定個数のニック（nick）が存在する。従って、該ニックが存在する位置を認識して切断するＲＮａｓｅ Ｔ１を処理すれば、長さがランダムに短くなる（図８Ｃ）参照）。

【0008】

Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｌ－リシン－メチルセルロース（Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣ）は、Poly（Ｉ：Ｃ）誘導体のうち一つであり、血清内において、ＲＮａｓｅによる分解には、あまり敏感ではないが、製造方式は、Poly（Ｉ：Ｃ）と本質的に同一である。従って、長さが一定ではない（特許文献１－１４）。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、ＩＦＮ－γ分泌を誘導し、ＣＴＬ反応及び抗原特異抗体を増大させる。Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣは、多少緩和された毒性を有する。他のPoly（Ｉ：Ｃ）誘導体であるＰＩＫＡも、長さが一定ではないPoly（Ｉ：Ｃ）の形態を有する（非特許文献３及び非特許文献４）。

【0009】

Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、Poly（Ｉ）とPoly（Ｃ）とによって構成され、Poly（Ｃ）のうちＵは、１２Ｃごとに付加され、規則的に分散された不一致を有する不完全なｄｓＲＮＡを形成する。多重ニックにより、Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、Poly（Ｉ：Ｃ）に比べ、ＲＮａｓｅ Ｔ１による分解にさらに敏感であり、さらに短い半減期を有し、さらに少ない副作用を有し、Ｍｙｄ８８よりもＴＲＡＦにさらに高い選択性を有する。それにもかかわらず、長さは、依然としてきわめて非均質的である。

【0010】

Poly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）は、カナダとアルゼンチンとにおいて、ヒトに使用するように承認され、２０００年には、ヨーロッパ連合において、慢性疲労症侯群（ＣＦＳ）治療のための希少疾病用医薬品（orphan drug）として許可されたが、米国ＦＤＡの承認は、なされていない。それら以外にも、Poly（Ｉ：Ｃ）の合成は、Poly（Ｉ：Ｃ）よりもさらに均一な長さを有するように改善されたが、長さ多様性問題は、依然として残っている。Poly（Ｉ：Ｃ）（１００ないし４００）を例に挙げれば、短鎖（例：Poly（Ｉ）１００について平均１０８base）を長鎖（例：Poly（Ｃ）４００について平均３４４base）に相補結合させるものが採用される。該方法により、平均長が４００ｂｐに近接するｄｓＲＮＡが製造されたが、長さ範囲は、００ないし２，０００baseと非常に広い。短いホモポリマー配列（例：Poly（Ｉ）１００）が、長いホモポリマー（例：Poly（Ｃ）４００）に相補的に結合し、鎖滑りと鎖延長とが生じることを防ぐことができなかった。要約すれば、Poly（Ｉ：Ｃ）系ｄｓＲＮＡ類似体は、一定長を有することができず、ｄｓＲＮＡ内部の不特定位置に、不特定個数のニックが存在しており、ＲＮａｓｅ Ｔ１に対する安定性が非常に低い（特許文献３、非特許文献２、非特許文献５）。

【0011】

Ｄ）癌微細環境における、ＯＸ４０分子とＰＤ－１分子との役割
先天免疫反応及び適応免疫反応は、いずれも腫瘍の成長と制御とに関与する（非特許文献７）。免疫機能が腫瘍微細環境（ＴＭＥ）において、一般的に抑制されている。Ｔ細胞抑制受容体に係わる拮抗剤、またはＴ細胞受容体に係わる刺激剤を使用するさまざまな方法がＴ細胞活性を増進させるためにテストされた（非特許文献８）。

【0012】

腫瘍懐死因子受容体スーパーファミリーであるＯＸ４０は、ナイーブＴ細胞においては、発現されないが、抗原に露出された後、活性化されたＴ細胞において誘導される（ＴＣＲ）（非特許文献９）。それだけではなく、ＯＸ４０は、活性Ｂ細胞、活性樹枝状細胞、活性好酸球、自然殺害Ｔ（ＮＫＴ）細胞及びＮＫ細胞記憶Ｔ細胞、並びに調節Ｔ細胞で一般的に発現される（非特許文献９）。ＯＸ４０に結合するＯＸ４０リガンドであるＯＸ４０Ｌは、主に、抗原提示細胞で発現される。ＯＸ４０-ＯＸ４０Ｌ相互作用は、ＣＤ４細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞に共同刺激し、細胞増殖、生存、エフェクタ機能及び移動を向上させる。また、ＯＸ４０は、記憶Ｔ細胞の発達及び機能を誘導し、免疫抑制環境を克服させる。 。

【0013】

樹枝状細胞のような抗原提示細胞が成熟されれば、Ｂ７ファミリー（例：ＣＤ８０及びＣＤ８６）及びＯＸ４０Ｌは、ＡＰＣの表面において増大し、Ｔ細胞免疫反応及び記憶分化を決定するのに一助となる（非特許文献１０）。

【0014】

ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ結合連繋（相互作用）は、三重価受容体（trimer）を形成し、さらに高次的なクラスタリング（clustering）及び後続信号伝達を誘導する（非特許文献１１）。マウスＯＸ４０刺激ラット（rat）由来抗体（anti－ｍＯＸ４０rat agonist Ａｂ）は、マウスモデルにおいて、腫瘍拒否反応を誘導することができる（非特許文献１２、非特許文献１３）。ヒトＯＸ４０刺激マウス由来抗体（anti－ｈＯＸ４０ mouse agonist Ａｂ）も、癌患者において、癌免疫の機能を増進させると示された（非特許文献１４）。ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ相互作用は、移植片対宿主疾病（例：臓器移植拒否反応）、喘息／アトピー、脳脊髄炎、リウマチ性関節炎、大腸カタル／炎症性腸疾患、非肥満糖尿病マウスの糖尿病及び粥状動脈硬化症、ループス、炎症性疾病及び自家免疫疾病、並びに障害において、免疫反応とも係わっている（非特許文献１５）。

【0015】

ＰＤ－Ｌ１は、多くの癌において、過発現され、折々、好ましくない予後と関連性がある（非特許文献１６、非特許文献１７）。興味深いこととして、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球のほとんどは、正常組織及び末梢血液Ｔリンパ球とは対照的に、ＰＤ－１を発現する。Ｔ細胞において、ＰＤ－１の上向き調節が、免疫抑制性腫瘍微細環境を構成することができる（非特許文献１８）。本質的には、腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＰＤ－１と、腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１との相互作用は、Ｔ細胞機能を弱化させる（非特許文献１９、非特許文献２０）。従って、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１（または、ＰＤ－Ｌ２）相互作用の阻害は、免疫抑制性ＴＭＥを破壊してしまう。しかし、最適の治療のためには、そのようなＰＤ－１受容体とリガンドとの相互作用遮断以外にも、さらなる免疫増強療法の開発が必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】Double-stranded ribonucleic acid for adjuvants; US 20150307884 A1

【特許文献2】Adjuvant compositions; WO 2003028656 A2: shorter form of Poly(I:C)

【特許文献3】Clinical method for the immunomodulatory and vaccine adjuvant use of poly-ICLC and other dsRNAs; US 7834064 B2

【特許文献4】dsRNAs as influenza virus vaccine adjuvants or immuno-stimulants; US 20070224219 A1

【特許文献5】Process for the maturation of dendritic cells and a vaccine; US 7981673 B2

【特許文献6】Topically active compositions of mismatched dsRNAs; US 5712257 A

【特許文献7】Treatment of hepatitis with mismatched dsRNA; US 5906980 A

【特許文献8】Double-stranded PolyC: Poly (G/I) RNA for immunostimulation and cancer treatment; EP 3083962 A1

【特許文献9】Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded ribonucleic acid mediated cell death; WO 2014165296 A1

【特許文献10】Polyinosinic acid-polycytidylic acid-based adjuvant; US 20070160632 A1

【特許文献11】In-situ cancer autovaccination with intra tumoral stabilized dsRNA viral mimic; US 20090088401 A1

【特許文献12】Novel nucleic acid having adjuvant activity and use thereof; WO 2012014945 A

【特許文献13】Improved treatment of cancer using tlr3 agonists in combination with another therapeutic agent; WO 2009130301 A1

【特許文献14】Double-Stranded Ribonucleic Acid Conjugates And Their Use; US 20170107517 A1

【特許文献15】Double-stranded ribonucleic acids with rugged physico-chemical structure and highly specific biologic activity; WO 2010047835 A2

【特許文献16】Immunization strategy to prevent H1N1 infection; EP 2477652 A4

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Jelinek I et al., (2011) J Immunol 186 (4):2422-9

【非特許文献2】Mian MF et al., (2013) J Leukoc Biol 94 (5):1025-36

【非特許文献3】Zhang Y et al., (2016) Virology 489:165-72

【非特許文献4】Lau YF et al., (2010) Virology 406 (1):80-7

【非特許文献5】Nakano T et al., (2018) Biosci Biotechnol Biochem 82 (11):1889-1901

【非特許文献6】Matsumoto M et al., (2015) 6:6280

【非特許文献7】Vesely MD et al., (2011) Annu Rev Immunol 29: 235-271

【非特許文献8】Mellman I et al., (2011) Nature 480: 480-489

【非特許文献9】Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420-431

【非特許文献10】Soroosh P et al., (2006) J Immunol 176: 5975-5987

【非特許文献11】Compaan DM et al., (2006) Structure 14: 1321-1330

【非特許文献12】Weinberg AD et al., (2000) J Immunol 164: 2160-2169

【非特許文献13】Piconese S et al., (2008) J Exp Med 205: 825-839

【非特許文献14】Curti BD et al., (2013) Cancer Res 73: 7189-7198

【非特許文献15】Croft M et al., (2009) Immunol Rev 229(1): 173-191

【非特許文献16】Okazaki T et al., Intern. Immun 2007 19 (7): 813

【非特許文献17】Thompson RH et al., Cancer Res 2006, 66 (7): 3381

【非特許文献18】Ahmadzadeh M et al., Blood. 2009 Aug 20;114(8):1537-44

【非特許文献19】Sharpe et al., Nat Rev 2002

【非特許文献20】Keir ME et al., 2008 Annu. Rev. Immunol. 26: 677

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0018】

１）Poly（Ｉ：Ｃ）型リボ核酸基盤アジュバントが有する極端な長さの非均質性克服
薬学的組成物は、一貫した再現性及び均質性を有さなければならない。ｄｓＲＮＡ類似体であるPoly（Ｉ：Ｃ）と、その誘導体との適用を、臨床用途において制限する最大の理由は、極端な長さの非均質性を含め、生産時の再現性不足、予測不可能な薬物動態、一貫性ない効能（非特許文献３、非特許文献６）及び関節痛、発熱、紅斑及び耐毒素類似ショック（特許文献１５及び１７）のような症状を起こす深刻な毒性のためである。これまで、ｄｓＲＮＡ類似体は、Poly（Ｉ：Ｃ）、Poly（Ｉ：Ｃ）－ＬＣ及びPoly（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）を含み、いずれも２本の相補的ホモポリマー鎖によって構成される。結果として、それら誘導体の長さは、特定の長さとして定義されえず、きわめて多様である。

【0019】

本発明は、Poly（Ｉ：Ｃ）が有する極端な長さの非均質性及び毒性、並びに量産製造時の問題点を解決することができる新規のｈｓＲＮＡを提供するものである。本発明のｈｓＲＮＡは、必要により、ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理し、ｓｓＲＮＡ領域を除去し、ｄｓＲＮＡ部位のみを選択的に抽出することができる。また、本発明のｈｓＲＮＡは、正確な全体長、ｓｓＲＮＡの正確な長さ及び位置、並びにｄｓＲＮＡの正確な長さと位置とを特定することができる特長点を有し、そのような特性により、既存のPoly（Ｉ：Ｃ）及びその誘導体の問題を克服することができるのである。

【0020】

２）ワクチンにおいて抗原の必要な抗原用量の低減
本発明は、要求される抗原量を低減させながら、さらに力強い防御免疫を誘導することができるｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとを提供するものである。現在使用される季節性の三価ワクチンまたは四価ワクチンの場合、効果的な予防免疫のために予測される１つのウイルスごとに、ワクチン抗原１回当り最小１５μｇを必要とする。大量の抗原が毎年必要であるために、ワクチン供給不足に係わる潜在的リスクが存在する。ＦＬＵＡＤに対し、ＭＦ５９（スクアレン水中油エマルジョン）アジュバントが６５歳以上の者を対象に米国で承認された。依然として効能を毀損させずに、抗原量を実質的に低減させることができる承認されたオズバント添加ワクチンはない。

【0021】

３）抗癌効能が増強された癌ワクチン組成物の提供
本発明は、生体内において、樹枝状細胞を、一貫性あって強力に活性化させ、原発性癌だけではなく、遠隔転移癌の予防または治療を行うｈｓＲＮＡと、ＯＸ４０抗体及び／またはＰＤ－１抗体とを含む癌ワクチン組成物を提供する。

【0022】

本発明のｈｓＲＮＡは、癌細胞の死滅を促進させ、癌細胞から、癌連関抗原（ＴＡＡ）の放出を促進する。そのようにして、ＯＸ４０アゴニストに対する抗体、またはPＰＤ－１に対する抗体と組み合わされたｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、ＴＡＡ依存的免疫反応を誘発したり、はなはだしくは、相乗作用したりして、癌細胞を破砕（lyse）したりもする。

【課題を解決するための手段】

【0023】

１）本発明は、双方向合成を介し、高度の長さ均質性と安定性とを備えたリボ核酸を提供する
本発明は、特異的長さ、完璧な塩基ペアリング、及び室温において、高い安定性を有する高度に均質的なｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡに係わるものである。

【0024】

本発明のｈｓＲＮＡを製造する方法は、次の通りである。標的ＲＮＡの転写を指示することができるＤＮＡ切片が、両５’末端において、Ｔ７プロモーターによって結合され（flank）、任意のプラスミドベクターに挿入される。必要であるならば、ＴＬＲ７リガンド配列、または任意の長さ、及び任意の配列を有した断片が、Ｔ７プロモーター配列の５’末端に付加されうる。

【0025】

前記ＤＮＡ切片を、Ｔ７ポリメラーゼによるインビトロ転写（ＩＶＴ）ためのテンプレートのためにＰＣＲで増幅した。双方向ＩＶＴは、ＩＶＴの間、ほとんど同一のモル比で完璧な相補性を有したヘテロポリマーｓｓＲＮＡの上部鎖と下部鎖とを生成し、室温において、自発的に高度に純粋なｈｓＲＮＡを形成する。前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＳは、蛋白質をコーディングしなかったり、選択的に蛋白質をコーディングしたりすることができる。一具現例において、前記ｓｓＲＮＡは、ランダム配列であるか、あるいはＧＵＵ反復配列を含みうるが、それに制限されるものではなく、ｓｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理により、選択的に除去されうる。

【0026】

これまで、生体内において、ＤＣ及び免疫系を活性化させるための最小及び最適の長さを有するｄｓＲＮＡは、１つの塩基対長さほど違いのあるｄｓＲＮＡの合成において、技術的困難さによって完全に理解されていない。対照的に、本発明の方法は、生体内外において、ＴＬＲ３活性化またはＴＬＲ７活性化に要求される最適の免疫活性化を示すリボ核酸の正確な数の長さまたは構造を指定することができる。

【0027】

２）本発明は、感染に対するワクチン抗原必要使用量を低減させることができるリボ核酸を含む感染予防及び感染治療のワクチン組成物を提供する
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含むウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。

【0028】

負電荷を強く帯びるリボ核酸は、多くの大型抗原を効果的に受容し、ＶＬＰ（virus-like particle）に匹敵するほどのナノ複合体を作ることができる。適切な剤形に抗原をカプセル化させたナノ複合体は、樹枝状細胞または大食細胞に捕獲され、Ｂ細胞及びＴ細胞において抗原が提示されることを効果的に誘導する。本発明の、感染予防及び感染治療のワクチン組成物は、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、サブユニット（subunit）、スプリット（split）タンパク質抗原、糖蛋白質、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、ポリヌクレオチド、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択されたものでもあるが、それらに制限されるものではない。

【0029】

３）本発明の前記リボ核酸アジュバントを含む抗癌ワクチン組成物、及び本発明の前記リボ核酸と、下記のような抗体とを含む疾病予防用または癌治療用の薬学組成物を提供する
本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含む疾病予防用または癌治療用の薬剤学的組成物、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体をさらに含む癌予防用または癌治療用の薬学組成物を提供する。

【発明の効果】

【0030】

本発明のｈｓＲＮＡは、Poly（Ｉ：Ｃ）が有する極端な長さの多様性と、組成の非均質性とを克服し、特定の長さと配列とによって特定されうる長所を提供する。さらには、ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去することにより、高度に均質的なｄｓＲＮＡを得ることができる。また、前記ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡオーバーハングを除去する場合、本願発明の前記ｈｓＲＮＡは、相補的な配列を有し、改善された免疫反応を誘導するｄｓＲＮＡとして製造されうる。

【0031】

また、本発明のｈｓＲＮＡと複合体となった抗原は、抗原提示細胞内部に伝達され、Ｔ細胞及びＢ細胞に抗原を効率的に提示することができる。さらには、本発明の、ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、必要抗原量を低減させることができ、ウイルス感染または細菌感染と、癌とに対する防御免疫効果を誘導することができる。

【0032】

結果として、本発明のリボ核酸アジュバントは、（１）抗原に対する適応免疫を強化させ、（２）ワクチンの必要抗原量を低減させ、（３）抗原特異的なＴｈ１極性化された交差防御反応を向上させ、（４）抗原なしに単独で使用する場合、先天免疫を強化させる活性を示す。

【0033】

また、本発明の、ｈｓＲＮＡを単独で含むか、あるいはｈｓＲＮＡ、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体を含む癌ワクチン組成物は、原発性癌及び遠隔性癌のいずれに対する抗癌効能も示す。また、本発明の癌ワクチン組成物は、ＰＤ－１抗体のような免疫チェックポイント抑制剤を単独で処理する場合に反応しない不応性癌を反応性癌に転換させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、ＤＣを活性化させるリボ核酸基盤物質に係わる生体内（in vivo）活性検証の結果を示す（実施例１）。図１は、ネクストアジュバント（ＮＡと略され、ＮＶＴ、ＶＰ１、ＶＰ１０ともされる）が、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した、ＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ細胞において、補助刺激因子（ＣＤ４０、ＣＤ８６）及びＭＨＣIIの発現が増大することを示す。ＮＡ １０μｇは、Poly（Ｉ：Ｃ）１００μｇに比べ、すぐれていた。図１は、ＮＡが、Poly（Ｉ：Ｃ）と比べ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αの分泌をさらに強く誘導することを示す。図１は、ＮＡが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７Ａ）ではなく、Ｔｈ１細胞マーカーＴ－ｂｅｔ、及びＴｈ１細胞サイトカインであるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）ｍＲＮＡを誘導することを示すｑＲＴ－ＰＣＲ結果である。各データは、三種の独立した分析の平均値である。

【図2】図２は、本発明の、ｈｓＲＮＡ長による生体内ＤＣの活性を示す（実施例２）。図２Ａは、人工配列（Backbone Group １）で製造したｈｓＲＮＡシリーズ１の試験管内合成結果であり、それぞれ１４０塩基長ｈｓＲＮＡ（ＮＡ１００１）、１９０塩基長（ＮＡ１５０１）、２４０塩基長（ＮＡ２００１）、３４０塩基長（ＮＡ３００１）、４４０塩基長（ＮＡ４００１）、５４０塩基長（ＮＡ５００１）、６４０塩基長（ＮＡ６００１）及び８４０塩基長（ＮＡ８００１）を示す。図２Ｂは、トマト配列（Backbone Group ２）に由来するｈｓＲＮＡシリーズ２の試験管内合成結果であり、それぞれ１４０塩基長（ＮＡ１００２）、１９０塩基長（ＮＡ１５０２）、２４０塩基長（ＮＡ２００２）、３４０塩基長（ＮＡ３００２）、４４０塩基長（ＮＡ４００２）、５４０塩基長（ＮＡ５００２）、６４０塩基長（ＮＡ６００２）、７４０塩基長（ＮＡ７００２）及び８４０塩基長（ＮＡ８００２）を示す。図２Ｃは、図２Ａに表示されたｈｓＲＮＡそれぞれに係わる、５μｇ注射時に示されるＣＤ４０及びＣＤ８６の表面発現のＭＦＩを示している。各データは、３回の独立した分析の平均値である。図２Ｄは、図２Ｂに表示されたｈｓＲＮＡそれぞれにつき、５μｇ注射時に示されるＣＤ４０及びＣＤ８６の表面発現のＭＦＩを示している。各データは、３回の独立した分析の平均値である。

【図3】図３は、本発明のｈｓＲＮＡの先天免疫活性指標及び免疫反応結果を示す（実施例３）。図３Ａは、本発明のｈｓＲＮＡ（Ｒ１ないしＲ１１、ＶＰ１０、表２参照）を製造した後、長さを確認するために、１％アガロースゲルで電気泳動させた図である。図３Ｂは、ＨＥＫ ２９３において、図３ＡのｈｓＲＮＡの一次的共移入（cotransfection）に反応したＩＦＮ－β増大、及びＩＦＮ－βプローモーター駆動ルシフェラーゼを示す。図３Ｃは、ｈｓＲＮＡが錯化されたオブアルブミン（ＯＶＡ）をマウス筋肉内注射し、血清における、Anti－ＯＶＡ ＩｇＧ１（Ｔｈ２極性化）、及び Anti－ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１極性化）を誘導したところを示す。本発明のＮＡＲ７（Ｒ７）が、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ１０より、Ｔｈ１（ＩｇＧ２ａ）反応及びＴｈ２（ＩｇＧ１）反応を強化させた。

【図4】図４は、本発明のｈｓＲＮＡのうち一つであるＮＡ（ＮＶＴ）の物理化学的特性を示す（実施例４）。図４Ａは、 ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理し、大きさ均質性を示すものと共に、ＮＡ長がＨＰＬＣ分析において、単一に一定であることを示し、それは、ｄｓＲＮＡ部位が良好に保存されるところを示す。図４Ｂは、前記ｄｓＲＮＡが４５℃で１５０日以上安定しているところを示す。図４Ｃは、ＮＡが、１００％子牛血清（Serum）で１０分未満の短い半減期を有するところを示す。図４Ｄは、ＮＡと複合体を形成した抗原である場合、有効期間が長いことを示す。

【図5】図５は、本発明の、ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとを皮下（ｓ．ｃ．）注射した後、先天免疫活性指標の様相を示す（実施例５）。図５Ａは、ｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４－Ｔ１）は、ｄｓＲＮＡ（ＮＶＴ４＋Ｔ１）よりもさらに低い抗炎症性サイトカイン反応（proinflammatory cytokine response）を誘導するところをを示す。ＮＶＴ４（ＮＶＴ ＩＶ、ＶＰ２０と同一である；表２参照）が本研究に使用された。図５Ｂは、ｈｓＲＮＡの皮下注射が２４時間経過後、さらに高いＤＣを活性化（ＣＤ８６誘導）を刺激することをを示す。図５Ｃは、２４時間と４８時間とが経た後、ドレインリンパ節（ｄＬＮ）における免疫細胞プロファイルを示す。４８時間経過時、ｄｓＲＮＡがｈｓＲＮＡに比べ、免疫活性度が高いところを示している。図５Ｄは、ｄｓＲＮＡがｈｓＲＮＡに比べ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β及びＩＬ－６を高く誘導するところをを示す。それは、ｄｓＲＮＡがさらに強く先天免疫を誘導する一方、ｈｓＲＮＡは、安全性に有利な物質であるところを示唆する。

【図6】図６は、ＮＡ（ＮＶＴ）が錯化されたＯＶＡワクチンが他のアジュバントに比べ、Ｔｈ１極性化免疫反応をさらに強く誘導するところを示す（実施例６）。図６Ａは、ＢａｌＢ／ｃマウスに、アジュバントが錯化されているか、あるいは錯化されていないワクチンを、０日及び１４日、２回にわたって筋肉内にそれぞれプライミングとブースティングとを行ったところを示す。２１日目、末梢血液と脾臓細胞とを抽出し、流式細胞分析をＩｇＧ定量を実施した。図６Ｂ及び図６Ｃは、ＮＡ（ＮＶＴ）が、Ｔｈ１反応（ＩｇＧ２ｃ）は、他のアジュバントより高く活性化させ、脾臓において、ＩＦＮ－γを分泌するＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４Ｔ細胞との数を増加させるが、Ｔｈ２免疫反応（ＩｇＧ２）ではないことを示す。

【図7】図７は、先天免疫性誘導と適応免疫誘導とにおいて、ＮＡ（ＮＶＴ）とＮＶＴ＋ＳＥ（スクアレンエマルジョン）（ＮＶＴII）との比較を示す（実施例７）。図７Ａは、ＮＶＴとＮＶＴIIとの筋肉内注射を介する活性検証方法である。図７Ｂは、注射後２４時間目、ＮＶＴ及びＰＢＳ（リン酸緩衝塩水）に対しし、ＮＶＴIIが鼠蹊部リンパ節（ｉＬＮ）でＤＣ活性を誘導するところを示す。図７Ｃは、ＮＶＴとＮＶＴIIとが、いずれも血清において、中和抗体を誘導するが、ＮＶＴよりＮＶＴIIが２倍以上強く誘導した結果を示す。

【図8】図８は、本発明のｈｓＲＮＡの構造を示す（実施例８）。真ん中にあるヘテロポリマー性ｄｓＲＮＳは、３’末端において、それぞれｓｓＲＮＡ オーバーハングによって結合されている。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、いずれも単一塩基の違いによって合成されうる。図８Ａは、前記ｈｓＲＮＡの模式図である。ｈｓＲＮＡの真ん中にあるヘテロポリマー性ｄｓＲＮＡは、任意の長さと、完全な相補性を有する任意の配列とを有する。ｄｓＲＮＡの両側３’末端にある２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングは、潜在的ＴＬＲ７／８リガンドとして作用することができる相補性のない、任意の特定長を有する。ｄｓＲＮＡは、人工配列でもあり、自然配列でもあるが、タンパク質を暗号化しない。ｄｓＲＮＡにＲＮａｓｅIIIを処理すれば、平均して、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片に切断する。ｄｓＲＮＡには、作用せず、ｓｓＲＮＡオーバーハングにだけ作用するＲＮＡｓｅ Ｔ１を処理すれば、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、完全に分解される。本発明は、長さ（＞１００ｂｐ）のｄｓＲＮＡを、インビトロで、Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素を利用し、ＤＮＡの両鎖に由来した二種の相補的ｓｓＲＮＡを、類似したモル比で大量合成することができるという利点を提供する。本発明において、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、単純なオーバーハングではなく、特定ＴＬＲ７／８リガンドとして作用することができる特定の長さ及び配列（ＴＬＲ７リガンド配列であるＧＵを多数含む配列）によってなることを特徴とする。さらには、ｓｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの末端が分解されることを防止する機能を有することができる。１つのテンプレートＤＮＡからの双方向転写は、ほとんど同一モル比でもって、２個の相補的な上端ｓｓＲＮＡ及び下端ｓｓＲＮＡを生成する。ＩＶＴの間、２本の鎖は、その後、自発的アニーリングを行い、真ん中に完璧なｄｓＲＮＡを有し、両３’末端に２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングを有したｈｓＲＮＡを形成する。特に重要には、前記２個のｓｓＲＮＡ オーバーハングは、互いに相補的ではないように設計され、塩基対形成（base pairing）または鎖延長が防止される。図８Ｂは、ｈｓＲＮＡを、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅIII及びＲＮＡｓｅIII＋ＲＮａｓｅ Ｔ１で消化させた結果物を示す。ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡをいずれも分解することができるＲＮａｓｅ Ａを処理すれば、全てのＲＮＡが分解され（分解された）。ｄｓＲＮＡを、２０ないし２５ｂｐ長さに切断するＲＮａｓｅIIIを処理する場合、２５ｂｐほどの長さを有する切片のバンドが最も多く示された。ＲＮａｓｅIIIは、提供されたｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４）の ｓｓＲＮＡオーバーハング（それぞれ５１，５８base）を切断しない。従って、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、分解されずに残り、それらは、およそ25bp重なる。ＲＮａｓｅIII及びＲＮＡｓｅ Ｔ１を同時に処理すれば、前記ｓｓＲＮＡ切片（５１，５８base）が完全に分解されて消え、２５ｂｐのバンドだけが鮮明に示される。図８Ｃは、ＮＡ（５３３base ｈｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ部位４２４ｂｐ）を、ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅ Ｔ１とで処理する前、及びその処理後、アガロースゲルで分離したものであり、特定の長さに一定の結果物が示されるところを示す図である。ＩＶＴ後、残存するＤＮＡテンプレートは、ＤＮａｓｅＩを処理し、除去（除去され）、ｈｓＲＮＡだけ残る。ＲＮａｓｅ Ｔ１で、ｈｓＲＮＡに存在するｓｓＲＮＡオーバーハングが除去されれば、ｄｓＲＮＡ部位だけ残る。もしｄｓＲＮＡ部位内部にニックが１個以上存在すれば、ＲＮａｓｅ Ｔ１がそのニック部位を切断し、２以上のｄｓＲＮＡ切片を生成する。対照的に、ゲルにおける単一バンドは、前記ｄｓＲＮＡ部位及びｓｓＲＮＡ オーバーハングにニックがないということを証明している。図８Ｄ）他発明の競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）が、極端な長さ多様性により、非均質性を有するところを示し、そのような点は、製造段階から生じるものであり、製造後、分画を終えた後にも克服することができない（非特許文献２）。図８Ｅ）他発明の競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）の基本構造を示したものであり、特定の長さではない平均長だけでもって表示されうる。例えば、平均およそ３８９baseであるホモポリマーPolyＩと、平均３４４base PolyＣとをそれぞれ合成し、互いに相補的にアニーリングさせ、ｄｓＲＮＡが製造される。しかし、予測することができない非特定部位に、相補結合が発生する鎖滑り（ランダム部位塩基対形成）が生じるために、予測することができない位置に多用な間隙を有する複数のニック（nick）の形成は、不可避である。さらには、前記ランダム部位塩基対形成は、５’末端または３’末端に係わりなく、両側位置に、Poly（Ｉ）とPoly（Ｃ）との特定することができない塩基ストレッチを生成してしまい、そこに、相補的鎖が再び結合し、鎖延長が生じてしまう。従って、その長さが数百kilobase以上に延長される（非特許文献２）（非特許文献５）。さらに、ＰＮＰａｓｅが、Poly（Ｉ：Ｃ）の製造過程に使用されるために、リン酸基（Ｐ）が５’末端に常時付着し、それにより、収率は、低い（非特許文献２及び非特許文献５）。対照的に、本発明のｈｓＲＮＡは、対照的に、Poly（Ｉ：Ｃ）とその誘導体とにある、鎖延長を防止する互いに相補的配列を有さない特定長を有する両側３’末端にだけあるｓｓＲＭＡテイルのオーバーハングにより、隣接するｄｓＲＮＡを形成するように設計されうる。

【図9】図９は、本発明のＮＡ（ＮＶＴ）に錯化された不活化インフルエンザ全ワクチン（ｉＰＲ８+ＮＶＴ）またはＮＡ（ＮＶＴ）に錯化されていない不活化インフルエンザ全ワクチン（ｉＰＲ８）またはＮＶＴ単独を、鼻腔（ｉ．ｎ．）内に投与した後の免疫反応を示した （実施例９）。図９Ａは、試験方法を図式化した図である。図９Ｂは、ＮＶＴ、ｉＰＲ８及びｉＰＲ８+ＮＶＴ処理群のマウスからの肺胞洗浄液において、肺胞大食細胞、好中球、自然殺害細胞のプロファイルを示す。図９Ｃは、２４時間経過後、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αの際立った増加を示す。図９Ｄは、７日目に、縦隔洞リンパ節（ｍＬＮ）において、ＧＣＢ（germinal center Ｂ）細胞とＴ_ＦＨ（follicular helper Ｔ cell）の増加を示す。図９Ｅは、ｉＰＲ８＋ＮＶ群において、２１日が経た後、血清Anti－ｉＰＲ８ ＩｇＧが増加することを示す。図９Ｆは、２１日目、鼻腔洗浄液でにおけるＩｇＡ増加を示す。

【図10】図１０は、本発明のｈｓＲＮＡであるＮＡ（ＮＶＴ）による商業的インフルエンザワクチン（４ＩＶ（Vaxigrip））の効能及び抗原容量節減に対する本発明のアジュバントの効果に係わる（実施例１０）。図１０Ａは、試験方法を図式化した図である。図１０Ｂは、ＮＡ（ＮＶＴ）アジュバントまたはＮＡ＋ＳＥ（ＮＶＴII）アジュバントが、ＩｇＧを誘導するのに必要な抗原使用量をそれぞれ約１／５以下と約１／２５以下とに低下させた。Ｖａｘｉｇｒｉｐ（２０１８／２０１９季節的四価インフルエンザワクチン４ＩＩＶ）がモデル抗原として使用された。図１０Ｃは、ワクチン接種後、１７週まで、ＮＶＴＩ群及びＮＶＴII群において、総ＩｇＧ量が多く維持されるところを示す。図１０Ｄは、中和抗体の量と比例し、１７週目に至るまで、ヘマグルチン阻害力価（ＨＡＩ）が４０以上に高く維持されているところを示す。ＨＡＩ ４０以上は、ワクチン接種された個体の５０％以上が保護される保護相関性（correlate of protection、COP）である。

【図11】図１１は、本発明の、ＮＶＴIIが錯化された脳髄膜炎菌ワクチン（Menactra、Sanofi）に対し、抗体ＩｇＧ誘導を示す（実施例１１）。図１１Ａは、試験方法を図式化した図である。図１１Ｂ及び図１１Ｃは、プライミング以後、それぞれ１４日と２１日とにおいて総錯化された抗原（Menactra）及び抗原Ａ型に対する抗体を示す。

【図12】図１２は、前記ＮＶＴIIアジュバントの免疫原性復元効能を示す（実施例１２）。図１２Ａは、試験方法を図式化した図である。Vaxigripが、３７℃において５週間熱処理し、かつＮＶＴIIまたはＰＢＳで錯化し、その後、ＩｇＧ反応のために、筋肉内ワクチン接種スケジュールを遂行した。図１２Ｂは、ＮＶＴIIがＩｇＧ抗体レベルによって検査されたように、Ｖａｘｉｇｒｉｐの免疫原性を回復させるということを示す。Ｖａｘｉｇｒｉｐ単独は、前記免疫原性を完全に喪失させたことに留意する。図１２Ｃは、ＮＶＴII－媒介されたＩｇＧレベルは、１８週でＩＡＶ Ｈ１Ｎ１及びＩＢＶに対するＨＡＩ力価５０以上において、上昇と相関している。

【図13】図１３は、本発明のリボ核酸単独が、黒色腫成長中止に及ぼす影響を示す（実施例１３）。図１３Ａは、試験方法の図式的図面である。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ黒色腫細胞を移植した後、６，８，１０日目ＮＡ（ＮＶＴ）を、筋肉内経路に投与した後、腫瘤重量及びマウス生存を測定した。図１３Ｂは、本発明のｈｓＲＮＡが黒色腫成長を顕著に停止させるということを示す。図１３Ｃは、ｈｓＲＮＡが生存率を上昇させるということを示す。

【図14】図１４は、本発明のリボ核酸単独が、大腸癌と肺癌との成長中止に及ぼす影響を示す（実施例１４）。

【図15】図１５は、本発明のリボ核酸単独が、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の成長中止及び転移に及ぼす影響を示す（実施例１５）。図１５Ａは、試験方法を図式化した図である。７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、４Ｔ１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株を、乳腺脂肪組織皮下に移植した。８日目から、２日に１回ずつ総９回にわたり、腫瘍内（ｉ．ｔ．）にＮＡ（ＮＶＴ）リボ核酸を投与し、指定された日に腫瘤重量を測定した。図１５Ｂは、ＮＡ（ＮＶＴ）が原発性乳癌の成長を６０％に中止させることを示す。図１５Ｃは、ＮＶＴ原発性乳癌の肺への転移を抑制するということを示す。

【図16】図１６は、ｈｓＲＮＡが錯化されたＯＶＡ癌抗原ワクチンの腹腔内投与時、黒色腫細胞の転移に対する抑制効果を示す（実施例１6）。図１６Ａは、試験方法を図式化した図である。図１６Ｂは、１８日目に、脾臓及び肝臓の形態を示す図であり、肝臓における大きさ及び転移結節を明確に見ることができる。図１６Ｃは、８日目に脾臓及び肝臓の重量平均を示す。図１６Ｄは、肝臓に転移された腫瘍結節の数を示す。ＮＡ単独またはＮＡ＋ＯＶＡの処理群においては、肝臓への転移が顕著に抑制された。

【図17】図１７は、ｈｓＲＮＡ及びＯＸ４０抗体を含む癌ワクチン組成物が、原発性癌及び遠隔性癌成長に及ぼす抑制効果を示す（実施例１７）。図１７Ａは、試験方法を図式化した図である。黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０ＯＶＡを、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの左側脇腹に皮下移植した。移植６日後、指示された投与計画（regimen）（すなわち、ＩＲ＋ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂ）を２日ごとに４回投与した（原発癌）。１５日目に、同一マウスは、右側脇腹に、Ｂ１６Ｆ１０－Ｏｖａ細胞またはＥＧ７／Ｏｖａ細胞を受け（遠隔癌）、その後、指定された日に腫瘍重量を測定した。図１７Ｂは、照射された癌細胞（ＩＲ：irradiated cancer）＋ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂ組成物が、原発癌の成長を相当に抑制したところを示す。図１７Ｃは、ＩＲ cellなしに、ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂが、原発黒色腫成長を完全に阻害するということを示す。図１７Ｄ及び図１７Ｅは、ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂだけでも、原発癌と同一なＢ１６Ｆ１０／ＯＶＡ遠隔癌と、それと異質的なＥＧ７／ＯＶＡ遠隔癌を完全に阻害することを示す。

【図18】図１８は、ＰＤ－１抗体またはＯＸ４０抗体と複合体化された前記ｈｓＲＮＡが、黒色腫成長に対する抑制効果を示す（実施例１８）。図１８Ａは、試験方法を図式化した図である。図１８Ｂは、ＮＡ＋ＰＤ－１組成物の腫瘍阻害効果が、ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂ組成物と大方類似している結果を示す。図１８Ｃは、２つの組成物が、遠隔癌の腫瘍に対し、類似している阻害効果を有するところを示す。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、添付図面を参照し、本発明が属する技術分野において当業者が容易に実施することができるように、本願の実施態様及び実施例について詳細に説明する。しかし、本願は、さまざまな形態に具現され、ここで説明する実施態様及び実施例に限定されるものではない。

【0036】

本願明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、それは、特別に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含んでもよいということを意味する。

【0037】

本発明は、その両側３’－末端のｓｓＲＮＡによって隣接された真ん中に位置するｄｓＲＮＡを含み、ｄｓＲＮＡとｓｓＲＮＡとのいずれもが、任意の特定配列を有した特定された長さを有することができるｈｓＲＮＡ（１４０－１６８２塩基）を提供する。前記ｄｓＲＮＡ２個の完全に相補的なヘテロポリマー鎖によって構成された特定長を有すると定義される。前記ｓｓＲＮＡテールは、ＴＬＲ７類似リガンドまたはＴＬＲ８類似リガンドとして作用することができ、ＴＬＲ７リガンドとして作用する非相補的Ｇ／Ｕ配列、望ましくは、ＧＵＵ反復配列を有することができ、１０base以上、望ましくは、１５ないし８０base以上、望ましくは、１７ないし７５塩基の長さを有することができる。

【0038】

本発明のヘテロ構造リボ核酸（ｈｓＲＮＡ）は、目的とする長さに均一に製造され、高い安定性を有する。

【0039】

前記ｈｓＲＮＡと対照的に、Poly（Ｉ：Ｃ）及びその誘導体は、ホモポリマー鎖間の鎖滑り及び鎖延長により、特定の構造重量（formula weight）に定義されえない。

【0040】

また、本発明は、下記の段階を含むヘテロ構造リボ核酸の製造方法を提供する：
１）両側５’位置にT7プローモーター配列が添加されたテンプレートＤＮＡ切片を任意のプラスミドベクターに挿入する段階；
２）T7ＲＮＡ重合酵素を利用し、テンプレートＤＮＡからのＲＮＡの双方向インビトロ転写（ＩＶＴ）を行い、ほとんど同一のモル比で、２本のヘテロポリマー相補鎖を生成し、ＩＶＴの間、自発的鎖・鎖アニーリングにより、ｈｓＲＮＡを形成する段階；
３）テンプレートＤＮＡを除去する段階；及び
４）前記hｓＲＮＡを得て精製する段階。

【0041】

必要な場合、追加配列が、前記プローモーター配列の５’末端にも添加される。本発明は、また次のように、他の配列を添加する方法を提供する：
１）前記プローモーター配列の５’末端に、意のＴＬＲ７／８リガンド類似配列を挿入する段階；及び
２）Ｔ７ポリメラーゼを使用し、テンプレートＤＮＡから双方向ＩＶＴを遂行する段階であり、ＩＶＴの間、ｓｓＲＮＡの２個の相補的な上端鎖及び下端鎖がほぼ同一モル比に生成され、続いて、アニーリングされてｈｓＲＮＡを形成する段階。

【0042】

本発明のｈｓＲＮＡは、ＴＬＲ３リガンドとして作用することができ、１４０ないし１，６８２baseの塩基長を有することができ、望ましくは、２００ないし１，５００base、さらに望ましくは、３００ないし１，０００base、一層望ましくは、４００ないし９００base、最も望ましくは、６００ないし９００baseでもあるが、それらに限定されるものではない。

【0043】

ｈｓＲＮＡの効果は、塩基の長さが長いほど、高い樹枝状細胞活性化レベルを示す傾向を有する。しかしながら、塩基の長さが長くなるほど、大量製造コストも上昇する。

【0044】

同様に、本発明のｄｓＲＮＡ部分の塩基長は、１０６ないし１，６４８ｂｐでもあり、望ましくは、２００ないし１，５００ｂｐ、さらに望ましくは、３００ないし１，０００ｂｐ、一層望ましくは、４００ないし９００ｂｐ、最も望ましくは、６００ないし９００baseであるが、それらに限定されるものではない。

【0045】

前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡの塩基長は、２０％範囲内において、増減されうる。

【0046】

本発明は、配列番号６３ないし９３からなる群のうちから選択されるいずれか１つの塩基配列を含み、ＴＬＲ３リガンドとして作用することを特徴とするｄｓＲＮＡを提供する。前記ｄｓＲＮＡの塩基長は、１０６、１５６、２０６、３０６、３１９、３９７、４０６、４２４、４６６、５０６、５８８、６０６、６６４、７０６、７３３、８０６、８２２、８８５、１，０３２、１，１５３または１，６４８ｂｐであってもよい。

【0047】

本発明で使用するリボ核酸の名称と基本情報は、下記表１及び下記表２に示した。表２に示されているように、本発明において、同一の長さと配列とを有するが、さまざまな名称で記載されてもいるが、ＮＡ、ＮＶＴ（next adjuvantの略語）、ＶＰ１、ＶＰ１０、ＶＰ１１がその例である。ただし、ＶＰ１１は、ＶＰ１０ｈｓＲＮＡをＲＮａｓｅ Ｔ１で処理したｄｓＲＮＡである。また、ＮＶＴIV（ＮＶＴ４）とＶＰ２０は、同一リボ核酸を意味する。

【0048】

本発明は、ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡを除去することによって得られる均質なｄｓＲＮＡを提供する。

【0049】

前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡは、下記表１に示した配列番号の塩基配列によってなるものでもある。下記表１は、本発明の実施例に記載されたそれぞれのｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡと、配列との対応関係を示したものである。

【0050】

【表1】

【0051】

前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡは、樹枝状細胞、好中球、Ｂ細胞、大食細胞、Ｔ細胞、肥満細胞及び自然殺害細胞を含む免疫細胞を活性化させることができる。

【0052】

本発明は、真ん中に位置するヘテロポリマーｄｓＲＮＡ、及び両側３’末端の２個ｓｓＲＮＡオーバーハングを含み、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいずれも、任意の特定配列を有した任意の定義された長さを有することができる薬剤学的組成物を提供する。

【0053】

本発明は、ｈｓＲＮＡからｓｓＲＮＡを除去することによって得られる均質なｄｓＲＮＡを含む薬剤学的組成物を提供する。前記ｄｓＲＮＡは、配列番号６３ないし９３によってなる群のうちから選択された任意の１つの塩基配列とその相補的配列とを含む。

【0054】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含むワクチンアジュバントを提供する。

【0055】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む均質な薬剤学的作用剤を提供する。

【0056】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む癌治療的作用剤を提供する。

【0057】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む抗癌作用剤を提供する。

【0058】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含み、及び追加のアジュバントまたは免疫源をさらに含むことを特徴とする、ウイルス感染または細菌感染、癌または癌関連疾病の予防用または治療用の薬剤学的組成物を提供する。前記「薬剤学的組成物」は、インフルエンザウイルスまたは脳髄膜炎球菌のような、ウイルス感染またはバクテリア感染の予防用または治療用ワクチン組成物を含む。

【0059】

前記免疫源は、三価季節性インフルエンザワクチン、四価季節性インフルエンザワクチン、不活化インフルエンザワクチン、または脳髄膜炎球菌（Neisseria meningitidisグループＡ，Ｃ，Ｙ及びＷ－１３５）ワクチンでもある。前記免疫源は、同種または異種亜型のウイルスに対する防御効果を示すことができる。

【0060】

前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源（抗原）の必要使用量を低減させることができる。前記必要使用量は、例えば、１／２以下、１／３以下、１／５以下、１／１０以下、１／２５以下、１／５０以下または１／１００以下まで低減されうる。

【0061】

前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、免疫源の抗原性を増強させるか、あるいは維持または復元させることができる。

【0062】

前記ウイルス感染または細菌感染の予防用または治療用のワクチン組成物は、さらなるアジュバントを含んでもよい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュバント、アルミニウム塩、フロイントアジュバント（Freund adjuvant）及びＤＯＴＡＰ（１，２－dioleoyl－３－trimethylammonium－propane）からなる群のうちから選択される１以上でもあり、前記水中油エマルジョンアジュバントは、スクアレン（squalene）水中油エマルジョンでもある。

【0063】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含み、追加のアジュバントまたは免疫源をさらに含みうることを特徴とする、癌または癌関連疾病を予防したり治療したりするための薬剤学的組成物を提供する。「薬剤学的組成物」は、癌を予防したり治療したりするためのワクチン組成物を含む。

【0064】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ、及び免疫源を含む、癌を予防したり治療したりするためのワクチン組成物を提供する。

【0065】

前記免疫源は、ペプチド、全蛋白質抗原、蛋白質 抗原のドメイン、不活性化または生弱毒化された個体、細胞に由来したもの、不活性化された癌組織、癌細胞質、癌関連抗原、または免疫決定基（エピドープ）のＤＮＡまたはｍＲＮＡをコーディングする蛋白質からなる群のうちから選択されうるが、それらに限定されるものではない。

【0066】

前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡがないワクチン組成物と比べ、免疫源の必要使用量を低減させることができる。前記必要使用量は、例えば、1/２倍以下、1/３以下、1/５以下、1/１０以下、1/２５以下、1/５０以下または1/１００以下まで低減されうる。

【0067】

前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、免疫源の抗原性を増強させたり、維持または復元させたりすることができる。

【0068】

前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、さらなるアジュバントを含んでもよい。前記さらなるアジュバントは、水中油エマルジョンアジュバント、アルミニウム塩、フロイントアジュバント、及びＤＯＴＡＰ（１，２－dioleoyl－３－trimethylammonium－propane）からなる群のうちから選択される１以上でもあり、前記水中油エマルジョンアジュバントは、スクアレン水中油エマルジョンでもある。

【0069】

前記癌は、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞種及び肉腫を含むが、それらに制限されるものではない。癌のさらに具体的な例としては、扁平細胞癌腫、骨髄腫、皮膚癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸管癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽細胞性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形成膠芽細胞腫、子宮頸部癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌腫、頭頸部癌、またはそれらの転移癌が含まれるが、それらに制限されるものではない。

【0070】

前述の癌予防用または癌治療用のワクチン組成物は、癌転移抑制効果を示すことができる。

【0071】

本発明は、前記ｈｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡ、及びＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体を含む癌予防用または癌治療用の薬学組成物を提供する。

【0072】

前記ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０アゴニスト抗体でもあり、ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１拮抗剤抗体でもある。また、前記ＯＸ４０抗体は、ＯＸ４０と特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片でもある。ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１と特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片でもあり。前記ＯＸ４０抗体またはＰＤ－１抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはマウス抗体でもあり、ヒト不変領域を含んでもよい。前記ヒト不変領域は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４不変領域からなる群のうちから選択され、望ましくは、ＩｇＧ１不変領域またはＩｇＧ４不変領域である。一実施態様において、前記抗原結合性断片は、Ｆａｂ，Ｆａｂ’－ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２，ｓｃＦｖ及びＦｖ断片からなる群のうちから選択される。前記ＰＤ－１拮抗剤抗体としても使用される特異的ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の例としては、ペムブロリズマブ（pembrolizumab）、ニボルマブ（nivolumab）、アベルマブ（avelumab）、ピディルリズマブ（pidilizumab）などを含むあ、それらに制限されるものではない。

【0073】

本発明の実施例で使用された４種の異なるバックボーンのベクターに由来するｈｓＲＮＡを表２に列挙した。以下の実施例においては、各ｈｓＲＮＡをそれぞれの名称と称する。

【0074】

【表2】

【0075】

以下、実施例を介し、本発明についてさらに詳細に説明するが、下記の実施例は、単に説明の目的のためのものであり、本願発明の範囲を限定するものではない。実施例のほとんど、全部ではないところにおいて、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理されたｄｓＲＮＡ、例えば、ＮＡ（別称として、ＮＶＴ、ＶＰ１、ＶＰ１０）がテストされた。ＮＡは、別途に、ｈｓＲＮＡとして言及されなければ、ｄｓＲＮＡを示す。

【実施例1】

【0076】

hsＲＮＡ基盤ネクストアジュバントの生体内樹枝状細胞（ＤＣ）活性化
本実施例は、前記ｈｓＲＮＡ基盤ネクストアジュバント（ＮＡと略称する）のＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内投与の生体内先天免疫活性を証明する。（図１）。

【0077】

本発明のＮＡの一例（別称して、ＮＶＴまたはＶＰ１０）は、Poly（Ｉ：Ｃ）１００μｇと同等であるか、あるいはそれ以上のレベルに樹枝状細胞マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－II）の分化を誘導した（図１）。前記ＮＡは、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞をＴｈ１ＣＤ４Ｔ細胞側への偏り（skewness）に係わる１型インターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）及びＩＬ－６及びＩＬ－１２の分泌を誘導した（図１）。また、ＮＡは、Ｔ－ｂｅｔ（Ｔｈ１細胞マーカー）及びＩＦＮ－γを誘導したが、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）及びＴｈ１７サイトカイン（ＩＬ－１７Ａ）は、誘導しなかった（図1）。前記ＮＡは、前記Poly（Ｉ：Ｃ）陽性対照群に比べ、ＤＣを強力に活性化させる。

【実施例2】

【0078】

生体内ＤＣ活性化は、ｈｓＲＮＡの配列ではない長さに依存する
前記ｈｓＲＮＡは、２個の独立したバックボーンから、ｄｓＲＮＡ領域が１０６－８０６ｂｐに変わる、さまざまな長さに準備されたが、ｓｓＲＮＡオーバーハングは、本実施例２において、両末端において、１７塩基で一定し（図２Ａ及び図２Ｂ）、マウスにおいて、脾臓ＤＣ活性化のために腹腔でテストされた。

【0079】

ＣＤ４０とＣＤ８６との誘導によって検査されたように、ＤＣ活性化レベルは、リボ核酸の長さが長いほど上昇し、４００～９００baseで高い活性を示す（図２Ｃ及び図２Ｄ）。

【0080】

また、全てのｈｓＲＮＡは、陽性対照群であるPoly（Ｉ：Ｃ）より、さらにすぐれた活性を示した。

【0081】

全てのｓｓＲＮＡオーバーハングは、各末端において、非相補的１７塩基であり、総３４塩基であるために、ｈｓＲＮＡからのＤＣ活性化において、違いは、ｄｓＲＮＡ長が長くなることにより、生じなければならない。従って、前述の約４０６ないし８０６ｂｐの範囲を有するｄｓＲＮＡが高い活性を示した。

【0082】

高い活性を示す５４０ｈｓＲＮＡ（５０６ｂｐ ｄｓＲＮＡ）を多様な濃度（０．５～２０μｇ）で再検査した結果、１０μｇにおいて、最大活性を示した。前記活性は、生体内において、Poly（Ｉ：Ｃ）と比較し、１０倍ないし２０倍高い活性を示した。

【実施例3】

【0083】

抗原-特異的抗体反応は、ｈｓＲＮＡの長さに依存する
広範囲のさらに多くのＲＮＡ（３５３～１，６８２base）は、実施例２に示された最初の２つのベクターとは異なる３番目バックボーンベクターに由来する（図３Ａ）。

【0084】

ＩＦＮ－βプロモーター駆動ベクターと共に、それらＲＮＡをＨＥＫ２９３に共移入（co-transfection）した後、先天免疫活性化の代理レポーター（surrogate reporter）を決定した（図３Ｂ）。前記ＩＦＮ－βプロモーター活性は、ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとの長さに比例して増大し、４０６ｂｐないし８０６ｂｐの範囲で最大に逹した。注目すべきこととして、前記活性は、ＲＮＡの特異的配列に独立しており、それは、実施例２と一貫している。

【0085】

それらのうちいくつか（Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ１０）は、モデル抗原ＯＶＡと複合体化され、抗ＯＶＡＩｇＧの誘導につき、マウス生体内で試験された。

【0086】

前述のところと一貫し、抗ＯＶＡ ＩｇＧ１、及びＴｈ１媒介された抗ＯＶＡ ＩｇＧ２の高レベルは、Ｒ５（ｄｓＲＮＡ長６６４ｂｐ）の近傍で観察された（図３Ｃ）。

【0087】

総合すれば、ｈｓＲＮＡ（１４０ないし１６８２base）及びｄｓＲＮＡ（１０６ないし１６４８ｂｐ）は、先天性及び適応反応にすぐれた効果を示した。

【0088】

従って、本発明は、前述のところで試験されたそれぞれのｈｓＲＮＡ（１４０ないし１６８２ｂｐ）から２０％範囲において、短くなったり長くなったりするｈｓＲＮＡ（１１２～２，０１８base）を請求する。また、本発明は、配列番号６３ないし９３から選択されたそれぞれのｄｓＲＮＡ以外にも、それらの２０％範囲において、短くなったり長くなったりするｄｓＲＮＡ（８５～１，９７７ｂｐ）を含む。

【実施例4】

【0089】

ｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの物理化学的特性分析
ＨＰＬＣ分析及びアガロースゲル電気泳動は、本発明の高度に均質な大きくによってなるｈｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを証明し（図４Ａ）、それは、Poly（Ｉ：Ｃ）と対照される（図８Ｃ）。

【0090】

前記ＮＡは、は、４５℃で１５０日以上安定している（図４Ｂ）、ＲＮＡｓｅが多く存在する血清が補充された培地においては、非常に短い半減期を有するが（図４Ｃ）、それは、ターゲッティングの可能な方式として、ヒットエンドランを反映させるものである。前記ＮＡに複合体化された抗原は、室温において、延長された時間の間、保存が可能であった（図４Ｄ）。

【実施例5】

【0091】

ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡと間の共通及び区別される免疫プロファイリング
（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理していないｈｓＲＮＡ（ＮＶＴ４－Ｔ１）、（ii）ＲＮａｓｅ Ｔ１を処理したｄｓＲＮＡ（ＮＶＴ４＋Ｔ１）を、ＢａｌＢ／Ｃマウスに皮下（ｓ。ｃ。）処理した後、先天性免疫指示子をＮＶＴ４（ＶＰ２０）を使用し、２４，４８時間が経た後、生体内で比較した。

【0092】

ｈｓＲＮＡとｄｓＲＮＡとのいずれも、ＤＣ活性化を強く誘導したが、ｄｓＲＮＡがｈｓＲＮＡに比べ、さらに多くの免疫細胞（特に、Ｂ細胞及び好中球）を増加させ、それは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－β及びＩＬ－６も、それと比例し、増加と相関す（図５）。総合すれば、ＲＮＡがさらに強く先天免疫を誘導する。ｈｓＲＮＡが、低いレベルに、好中球、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αを誘導し、安全性問題に有利であろう。

【実施例6】

【0093】

ＮＡと、他のアジュバントとのうちのＴｈ１極性化免疫反応の比較
前記ＯＶＡを、ＮＡ、Ａｌｕｍ、スクアレン（ＳＥ）、ＩＦＡ、Poly（Ｉ：Ｃ）に複合体化させた後、筋肉に投与し（図６Ａ）、免疫反誘導を比較した。

【0094】

Ｔｈ２免疫反応（ＩｇＧ１）の活性は、類似しているが、他のものよりさらに高いＴｈ１反応（ＩｇＧ２ｃ）は、ＮＡアジュバントされたＯＶＡから生じた（図６Ｂ）。脾臓において、ＩＦＮ－γを分泌するさらに多くの脾臓ＣＤ８Ｔ細胞と脾臓ＣＤ４Ｔ細胞が、ＮＡアジュバントされたＯＶＡワクチンフォーマットに対する反応として増殖した（図６Ｃ）。鼻腔に投したときにも、他のアジュバントより、ＮＡが体液（涙、鼻腔及びドレナージ）及び血清において、さらに強力に粘膜ＩｇＡと粘膜ＩｇＧとを誘導した（データは、示されていない）。

【実施例7】

【0095】

ｈｓＲＮＡと、ｈｓＲＮＡプラス追加アジュバントとの先天性及び抗原特異的な抗体反応
（ｉ）ＮＶＴ：ｄｓＲＮＡ（ＮＡ）、
（ii）ＮＶＴII：ＮＶＴ（ＮＡ）＋ＳＥ（スクアレンエマルジョン）の２個剤形を準備した（図７Ａ）。ＢａｌＢ／Ｃマウスに筋肉内注射した後、ＤＣ活性をフローサイトメトリーによって測定した。鼠蹊部リンパ節（ｉＬＮ）においてＤＣ刺激は、ＮＶＴにおいて、さらにＮＶＴIIでさらに高かった（図７Ｂ）。

【0096】

また、（ｉ）ＯＶＡ、（ii）ＯＶＡ＋ＮＶＴ、（iii）ＯＶＡ＋ＮＶＴIIを含む、モデルワクチンを準備し、抗ＯＶＡ ＩｇＧ１（Ｔｈ２反応）及び抗ＯＶＡ ＩｇＧ２ａ（Ｔｈ１反応）につき、同一マウスで試験した。

【0097】

その結果、ＯＶＡ＋ＮＶＴは、ＯＶＡ単独より約１００倍さらに強い抗体反応を誘導した。ＯＶＡ＋ＮＶＴIIは、ＯＶＡ＋ＮＶＴより２倍以上さらに強い抗体反応を誘導した（図７Ｃ）。

【実施例8】

【0098】

ｈｓＲＮＡの構造及び長さの均質性
本発明のｈｓＲＮＡは、真ん中に位置するｄｓＲＮＡ、及び両側３’末端において、２個ｓｓＲＮＡオーバーハングを有する。２つのｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡは、非ホモポリマー配列を有し、正確な長さでもって定義され、ホモポリマー媒介の鎖滑り及び鎖延長を防止することができる。

【0099】

ｄｓＲＮＡ領域は、任意の特定長と、任意の特定配列とを有し、完全に相補的である。前記配列は、人工配列でもあり、自然配列でもあるが、タンパク質を暗化しない。前記ｄｓＲＮＡの２つのい３’末端において、前記２つのｓｓＲＮＡは、暫定的ＴＬＲ７／８類似リガンドとして作用する、任意の特定長と、任意の特定配列とを有する。前記２つのｓｓＲＮＡテールは、相補的ではないために、２つのオーバーハング配列内、及び２つのオーバーハング配列間に塩基対形成が起こらず、内在的に鎖延長を遮断するが、ＴＬＲ７／８暫定的リガンドに該当する（図８Ａ）。

【0100】

２つの末端において、前記２つのｓｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ Ｔ１処理によって除去され、ブラント末端ｄｓＲＮＡを生成することができる。真ん中に位置する前記ｄｓＲＮＡの存在は、ＲＮａｓｅIII処理によって確認された。前記ｄｓＲＮＡは、短時間、ＲＮａｓｅIIIにより、平均２０ないし２５ｂｐの切片に切断される。前記ｄｓＲＮＡのさらに長い処理は、１２ｂｐ以下の長さを有する切片を生成する。前述の結果は、多様なＲＮａｓｅの作用方式と一貫する。両側３’末端に、５１baseと５８baseとのｓｓＲＮＡオーバーハングを有するｈｓＲＮＡにＲＮＡｓｅIIIを処理すれば、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片と、約５０baseのｓｓＲＮＡ切片とが確認されると予測される。同一の前記ｈｓＲＮＡに、ＲＮＡｓｅIII及びＲＮＡｓｅＴ１を処理する場合、ｓｓＲＮＡは、分解され、２０ないし２５ｂｐのｄｓＲＮＡ切片だけが残った。ＲＮａｓｅＡを処理すれば、全てのＲＮＡが分解された（図８Ｂ）。

【0101】

また、ｈｓＲＮＡにＲＮａｓｅ Ｔ１を処理する場合、前記ｄｓＲＮＡの部位の相補性及び安全性は、処理前後において、アガロースゲル上の単一から確認された（図８Ｃ）。

【0102】

任意の特定ｈｓＲＮＡは、単一塩基単位まで極めて高い長さ均質性を有する（図２Ａ、図３Ａ及び図４Ａ）。

【0103】

他の具的例として、ポリウリジン（Ｕ）基を含む任意の特定一本鎖（１７base）が、ｄｓＲＮＡの両側に追加されうる。また、ヘアピン構造や回文環構造のような内部ｄｓＲＮＡを形成するように、特定配列を追加し、安定性を有したり、ＴＬＲ７類似リガンドとして作用したりするように、一本鎖をデザインすることができる。

【0104】

それと対照的に、競争薬物であるPoly（Ｉ：Ｃ）は、極端な長さ多様性を有し、一定長に製造されえない。代わりに、それは、内部に特定することができないニックを有し、ｄｓＲＮＡの３’末端のような特定された部位において、ｓｓＲＮＡテールを有さない人工ホモポリマーｄｓＲＮＡである。Poly（Ｉ：Ｃ）の長さ多様性は、鎖滑りと鎖延長とによって引き起こされる。その結果、ｄｓＲＮＡ部位の特定することができない部位に複数ニックが形成され、それらは、ＲＮａｓｅ Ｔ１により、多様な長さに切断される（図８Ｄ）。さらに、ｄｓＲＮＡを形成する前述の上部鎖及び下部鎖の数は、Poly（Ｉ：Ｃ）内の制御されない鎖延長によって特定されえない。従って、Poly（Ｉ：Ｃ）は、ＲＮａｓｅ Ｔ１によって消化されやすい。Poly（Ｉ：Ｃ）の極端的非均質性は、原記事のうち一つに公開されている（非特許文献２）（図８Ｄ左側）。

【0105】

Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｌ（long species）のＲＮＡｓｅIII消化は、Poly（Ｉ：Ｃ）－Ｓ（short species）と類似した小さい種を生成する（図８Ｄ）（非特許文献２）。その極端な非均質性は、短いPolyＣ（平均１００塩基のＰ１００）を、長いPolyＩ（平均４００塩基のＰ４００）に、相補的結合を介する鎖延長を低減させることにより、部分的に改善される。それにもかかわらず、前記長さは、１００ｂｐから１００ｋｂｐまで多様な範囲において変わる（非特許文献５）。

【0106】

本発明のリボ核酸は、既存発明とは、次の事項において本質的な違いを有する。

【0107】

Poly（Ｉ：Ｃ）と対照的に、本発明のリボ核酸は、１）高い長さ均質性を有し、配列の非同型重合であり、完全な相補性により、ｄｓＲＮＡにニックを有さず、２）ＴＬＲ３リガンド及びＴＬＲ７類似リガンドとして作用することができる。

【0108】

ｓｉＲＮＡと比較し、本発明のリボ核酸は、１）合成されるｓｉＲＮＡと比較し、製造過程において本質的違いを有し、２）ｓｉＲＮＡが有する特定遺子を標的阻害する機能を有さず、３）ｓｉＲＮＡの範囲が２１ないし２５ｂｐと短く、ＴＬＲ３を刺激することができないのに反し、本発明のリボ核酸の長さは、４５ｂｐ以上であるので、十分な活性を示すＴＬＲ３リガンドとして作用することができ（非特許文献１）、４）ｓｉＲＮＡ末端において、非常に短い３’オーバーハングは、機能がない単純な残存配列に該するが、本発明のｓｓＲＮＡは、特定長以上（例えば、１７base以上）の特定配列を有し、ＴＬＲ７／８類似リガンドの役割を行う。ｓｓＲＮＡを有する前記ｈｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡと比較し、インビトロで低い毒性指標を示した（実施例５）。

【実施例9】

【0109】

鼻腔投与を介するｄｓＲＮＡにアジュバントされた不活化インフルエンザ全ワクチン（ｉＰＲ８）に対する免疫反応
ＢａｌＢ／ｃマウスに、ＮＡ（ＮＶＴ）をｉＰＲ８と共に投与する場合、２４時間が経た後、縦隔洞リンパ節において、ｍＤＣ細胞とｒＤＣ細胞との数が増加し、ＤＣ（ＣＤ８０、ＣＤ８６）が活性化されていて、９６時間後、基底レベルに低下した（データは、示されていない）。また、ｉＰＲ８と共にＮＶＴを処理すれば、肺胞洗浄液においても、総細胞、肺胞大食細胞、好中球及び自然殺害細胞が増加し（図９Ｂ）、それは、ＩＬ－６、ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αの増加と比例し、ＮＶＴ単独も、そのような抗炎症性サトカインの上昇に肯定的効果を示した（図９Ｃ）。そのような先天免疫指標の増加は、ＧＣＢ（germinal center ＢＢ）細胞及びＴ_ＦＨ（follicularhelper Ｔ cell）、並びに血清及び鼻腔洗浄液におけるＩｇＧとＩｇＡとの増加と同伴している（図９Ｄ及び図９Ｅ）。

【0110】

前記ＮＡ アジュバント単独でも、抗原なしに致死量生ウイルス感染に対する防御効果を有した。前記ＮＡがマウスに鼻腔に何回か投与された場合、寿命は、平均４日以上延長され、ウイルス感染（viremia）に係わる死亡率は、約２０％低下した（データは、示されていない）。また、抗原なしに、本発明の前記ＮＡアジュバント単独は、ロバストな免疫増強作用を示した。

【実施例10】

【0111】

ｈｓＲＮＡによる商業用インフルエンザスプリットワクチン抗原低減効果
商業的ワクチン抗原において、アジュバント役割を試験した。試験されたワクチンは、（ｉ）四不活性化インフルエンザワクチン（４ＩＩＶ，Vaxigrip，Sanofi Pasteur）、（ii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴ（ＮＡ）、（iii）４ＩＩＶ＋ＮＶＴII（ＮＡ＋ＳＥ）を含む。メスＢａｌｂ／ｃマウスに、２週間隔で、筋肉内（ｉ．ｍ．）へのプライミング及びブスティング後、ＩｇＧレベル及びヘマグルチン化阻害力価（ＨＡＩ）を、プライミング後の１８週にわたって決定した（図１０Ａ）。

【0112】

その結果、抗原用量は、非アズバント抗原を単独に接種した場合と比較し、ＮＶＴアズバントされたグループにおいては、約１．５レベルであり、ＮＶＴIIアズバントされたグループにおいては、約１／２５に低減された（図１０Ｂ）。そのような効果は、注射後、最小１７週まで持続した（図１０Ｃ）。本発明のＮＡアジュバントは、抗原用量を節減することができ、必要な免疫を確保するのに必要なワクチン抗原の量を、かなり低減させることができた。

【0113】

前記結合抗体の増加は、血球凝集阻害能（ＨＡＩ：hema agglutination inhibition）力が４０以上増大することと密接に連しており、それは、チャレンジまたは感染された個体の５０％に十分な防御免疫を提供することができるような、インフルエンザウイルスに対する防御の相関関係（ＣＯＰ：correlate of protection）である。２つのアジュバントがＨＡＩ力価をかなり増大させたとしても、ＮＶＴIIは、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶサブタイプＨ１Ｎ１）及びインフルエンザＢウイルス（ＩＢＶ）のいずれについても、３倍ないし５倍のＨＡＩ力価を特に誘導した（図１０Ｄ）。

【実施例11】

【0114】

ｈｓＲＮＡによる商業用脳髄膜炎ワクチンの抗原用量低減効果
マウスに、メナクトラワクチンを投与しながら、アジュバントとしてＮＡを使用した（図１１Ａ）。

【0115】

メナクトラワクチンは、脳髄膜炎球菌（Meningococcus）であるNeisseria meningitidisグループ（Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ－１３５）に対するＣＲＭ１９７接合体ワクチンである。具体的には、ワクチン抗原は、ジフテリア毒素由来キャリア蛋白質ＣＲＭ１９７に、共有して連結されている。本発明のＮＶＴIIアジュバントされたメナクトラは、メナクトラ特異抗体を５倍以上強く誘導した（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。

【実施例12】

【0116】

ＮＶＴIIの免疫原性復元効果
インフルエンザワクチン（２０１８／２０１９ ＱＩＶ Vaxigrip）を、３７℃で５週間処理し、免疫原性を消失させた後、ＮＶＴIIとアジュバント化させ、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。プライミング１８週まで、指定された時間点において、ＩｇＧ ELISA及びＨＡＩアッセイを行った（図１２Ａ）。

【0117】

その結果、結合抗体が格段に増加し、免疫原性が復元されたように見えた（図１２Ｂ）。また、最小１０倍の抗原節減効果があった。１８週目、Ｈ１Ｎ１とＩＢＶとに対するＨＡＩ力価が４０以上に増大したのは、中和抗体の増加と関連がある（図１２Ｃ）。

【0118】

他の実験において、VaxigripをＮＶＴIIと事前混合し、３７℃で５週間放置すれば、抗原性が完全に維持され、ＨＡＩ力価も、４０以上に増大した（データは、示されていない）。

【実施例13】

【0119】

ｈｓＲＮＡのインビボ黒色腫成長に対する抗腫瘍効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０－ＯＶＡ黒色腫細胞を皮下移植した後、６日目からＮＡを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）または筋肉内に２日間隔で３回にわたって投与した（図１３Ａ）。

【0120】

対照群に比べ、ＮＡを投与したマウスにおいて、腫瘍成長が遅延され、さらに長く生存した（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。

【実施例14】

【0121】

ｈｓＲＮＡのインビボ大腸癌と肺癌との成長に及ぼす阻害効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＴ２６大腸癌とＬＬ／２肺癌とを皮下移植した後、２日に１回総８回にわたり、ＮＶＴ単独で、皮下、腫瘍組織内（ｉ．ｔ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。

【0122】

マウスにおいて、大腸癌と肺癌の成長は、前記ＮＡ処理によって遅延された（図１４）。

【実施例15】

【0123】

ｈｓＲＮＡ単独のインビボ三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）成長と肺転移に対する阻害効果
７週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、４Ｔ１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株を、乳腺脂肪組織皮下移植後、８日目からＮＡ単独で、腫瘍内（ｉ．ｔ．）に、２日間隔で９回投与した（図１５Ａ）。

【0124】

その結果、原発性乳癌が６０％遅延され（図１５Ｂ）、そのような成長中止（arrest）は、肺への遠隔転移における格段な低減と一致した（図１５Ｃ）。

【実施例16】

【0125】

インビボｈｓＲＮＡ単独、またはｈｓＲＮＡ-複合体化のＴＡＡワクチンの肝臓に対する抗-転移
ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＯＶＡ，（iii）ＮＡ，（iv）ＯＶＡ＋ＮＡを、０日に腹膜内投与した。３日後、同一ワクチンを腹膜内投与した後、脾臓から肝臓への転移程度を調査した（図１６Ａ）。

【0126】

ＮＡ処理された群と、ＯＶＡ＋ＮＡ処理された群とにおいて、転移は、非処理群またはＯＶＡ単独処理群よりもさらにさらに低かった（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。１８日目、肝臓への転移は、ＮＡ単独において、約５０％、及びＯＶＡ＋ＮＡ群において、９０％以上ほど低かった（図１６Ｄ）。生存につき、全てのマウスは、全ての他の群において、１４日から始まって１８日以内に死亡し、ＯＶＡ＋ＮＡ処理群において、マウスは、２４日から始まって２８日以内に死亡した。

【実施例17】

【0127】

ｈＲＮＡアジュバントされたＯＸ４０抗体複合体の原発性及び遠隔性の黒色腫成長の抑制効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの左側脇腹に皮下移植し、腫瘍を移植した後、２日間隔で、４回（６日、８日、１０日及び１２日）原発癌組織に、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＰＤ－１Ａｂ，（iii）ＩＲ細胞（放射線を照射した癌細胞），（iv）ＩＲ細胞＋ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂをそれぞれ投与した（図１７Ａ）。各癌の成長は、２２日目まで測定した。

【0128】

その結果、原発性癌成長は、前述のＰＤ－１抗体及びＩＲ細胞においてのみ、約５０％ほど及び２０％ほどそれぞれ抑制され、９０％成長中止が、ＩＲ＋ＮＶＴ＋ＯＸ４０Ａｂ群で観察された（図１７Ｂ）。

【0129】

また、ＩＲ細胞のない、ＮＡ＋ＯＸ４０抗体は、原発性癌の成長を、前述のところとほぼ同一程度に抑制し、前記ワクチン組成物において、前記ＴＡＡを必要としない（図１７Ｃ）。

【0130】

１５日目、反側右側腹部に、同種（allogeneic origin）由来の２つの癌（Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ）及びＴ細胞リンパ腫（ＥＧ７／ＯＶＡ））を第２部位に移植した。その後、それ以上治療用ワクチンを投与せず、１６日間、癌組織の成長程度を測定した。

【0131】

その結果、本発明の、ＮＡ＋ＯＸ４０Ａｂ注射された全てのマウスは、第２部位癌において、ほとんど成長しなかった。対照的に、ＮＡ＋イソタイプ抗体群の全てのマウスは１１日前に死亡した。従って、腫瘤塊の大きさは、に表示していない（図１７Ｄ及び図１７Ｅ）。

【0132】

以上の結果をまとめれば、原発性黒色腫の成長は、ＩＲと係わりなく、ＮＡ＋ＯＸ４０抗体により、９０％以上阻害された。さらに、他の部位に移植された遠隔癌は、ＮＡ＋ＯＸ４０抗体によってまた中止された。

【実施例18】

【0133】

ｈｓＲＮＡアジュバントされたＰＤ－１抗体またはＯＸ４０抗体複合体の原発性及び遠隔性黒色腫の阻害効果
Ｂ１６Ｆ１０／ＯＶＡ黒色腫細胞を、７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの右側及び左側の脇腹（flank）に皮下移植した後、癌ワクチン（ｉ）ＰＢＳ，（ii）ＮＡ，（iii）ＮＡ＋ＯＸ４０抗（ＯＸ４０ Ａｂ）（clone ＯＸ－８６、Rat ＩｇＧ１、InvivoGen）及び（iv）ＮＡ＋ＰＤ－１抗（ＰＤ－１Ａｂ）（clone ＲＭＰ１－１４、Rat ＩｇＧ２ａ／λ、InvivoGen）を腫瘍移植した後、２日に１回ずつ４回（６日、８日、１０日及び１２日）、左側原発性癌組織に腫瘍内投与した。左側脇腹側（ワクチン接種された腫瘍）及び右側（遠隔腫瘍）において、癌成長を２０日まで測定した（図１８Ａ）。

【0134】

その結果、原発性癌に対するＮＡ＋ＰＤ－１抗体の阻害効果は、ＮＡ＋ＯＸ４０ Ａｂのそれと類似しているか、あるいはそれよりすぐれていた。同一結果が、非ワクチン接種の遠隔腫瘍で観察された（図１８Ｂ及び図１８Ｃ）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【国際調査報告】