特表 2022-543871 副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ１）の調節剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-14

(54)【発明の名称】副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ１）の調節剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/16 20060101AFI20221006BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20221006BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221006BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221006BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221006BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221006BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221006BHJP

   C07K 14/635 20060101ALI20221006BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20221006BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20221006BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20221006BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20221006BHJP

   A61P 3/14 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 5/18 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221006BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20221006BHJP

【ＦＩ】

C12N15/16 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K14/635

C07K19/00

A61K38/16

A61K47/59

A61K47/62

A61K47/68

A61P3/14

A61P19/10

A61P5/18

A61P19/00

A61P35/00

A61P35/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022507873

(86)(22)【出願日】2020-08-07

(85)【翻訳文提出日】2022-04-06

(86)【国際出願番号】 US2020045517

(87)【国際公開番号】W WO2021030222

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】62/884,703

(32)【優先日】2019-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521353768

【氏名又は名称】フラッグシップ・パイオニアリング・イノベーションズ・ブイアイ，エルエルシー

【氏名又は名称原語表記】ＦＬＡＧＳＨＩＰ ＰＩＯＮＥＥＲＩＮＧ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＶＩ，ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100087941

【弁理士】

【氏名又は名称】杉本 修司

(74)【代理人】

【識別番号】100112829

【弁理士】

【氏名又は名称】堤 健郎

(74)【代理人】

【識別番号】100142608

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 由佳

(74)【代理人】

【識別番号】100155963

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】100154771

【弁理士】

【氏名又は名称】中田 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100150566

【弁理士】

【氏名又は名称】谷口 洋樹

(74)【代理人】

【識別番号】100213470

【弁理士】

【氏名又は名称】中尾 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100220489

【弁理士】

【氏名又は名称】笹沼 崇

(72)【発明者】

【氏名】マタ－フィンク・ジョルディ

(72)【発明者】

【氏名】ゴー・リー・フオン

(72)【発明者】

【氏名】グリゴリヤン・ゲヴォルグ

(72)【発明者】

【氏名】マッケンジー・クレイグ・オーウェン

(72)【発明者】

【氏名】ホプソン・クリステン・パーク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC21

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE24

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA19

4C084BA23

4C084BA41

4C084BA42

4C084NA13

4C084ZA96

4C084ZA97

4C084ZB26

4C084ZC06

4C084ZC21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA41

4H045BA57

4H045CA40

4H045DA30

4H045DA70

4H045DA75

4H045FA34

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA25

(57)【要約】

【課題】副甲状腺ホルモン受容体１（ＰＴＨＲ１）などの副甲状腺ホルモン受容体の活性を調節することができる合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を提供する。本また、これらのｓＰＴＨを使用して、例えば、生物中の細胞などの細胞において、ＰＴＨＲ活性を調節する方法を提供する。
【解決手段】副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）に特異的に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を含む、ポリペプチド。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）に特異的に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

前記ｓＰＴＨが、
ａ）１～３個の極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも４つの極性残基、少なくとも１つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｃ）少なくとも５つの極性残基、少なくとも２つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｄ）少なくとも５つの極性残基、２位のバリン、及び配列番号７に対する１～１３個のアミノ酸置換；又は
ｅ）少なくとも６つの極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換
を含む、１４アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ｓＰＴＨが、
ａ）最大で１３個の極性残基、及び配列番号８に対する１～３２個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも１４個の極性残基、２位のバリン、及び配列番号８に対する１～３１個の置換；
ｃ）少なくとも１４個の極性残基、及び配列番号８に対する２２～２８個のアミノ酸置換；又は
ｄ）配列番号８の１～１４位、及び配列番号５に対する１５～３２位の１～１８個のアミノ酸置換
を含む、３２アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、２～３１個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、２～１８個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０９～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約２～３１個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約２～１８個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記ｓＰＴＨが、２８～３６個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記ｓＰＴＨが、３０～３４個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記ｓＰＴＨが、３２個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記ｓＰＴＨが、配列番号５に対して、少なくとも２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

前記ｓＰＴＨが、配列番号５に対して、５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項21】

前記ｓＰＴＨが、配列番号５に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項22】

前記ｓＰＴＨが、配列番号５に対する２～１８個のアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項23】

前記ｓＰＴＨが、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項24】

前記配列番号６に示されるアミノ酸配列が、前記ｓＰＴＨのＮ末端にある、請求項２３に記載のポリペプチド。

【請求項25】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項26】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、７５～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチド。

【請求項27】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項28】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項29】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、保存的置換である、請求項６、１２及び２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、高度に保存的な置換である、請求項２９に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記アミノ酸置換が、保存的置換である、請求項２、３、７、８、１３、１４及び２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記アミノ酸置換が、高度に保存的な置換である、請求項３１に記載のポリペプチド。

【請求項33】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％高い親和性でＰＴＨＲに結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項34】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％低い親和性でＰＴＨＲに結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項35】

前記ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも約５％以下低い親和性でＰＴＨＲに結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項36】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアゴニストである、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項37】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストである、請求項３６に記載のポリペプチド。

【請求項38】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲの逆アゴニストである、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項39】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアンタゴニストである、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項40】

前記ポリペプチドが、異種部分にコンジュゲートされている、請求項１～３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項41】

前記異種部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヘキサデカン酸、ヒドロゲル、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、及び異種ポリペプチド配列、或いはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４０に記載のポリペプチド。

【請求項42】

前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）を含む、請求項４１に記載のポリペプチド。

【請求項43】

前記異種ポリペプチド配列が、担体ポリペプチドを含む、請求項４０に記載のポリペプチド。

【請求項44】

前記担体ポリペプチドが、アルブミン又はＦｃポリペプチドである、請求項４３に記載のポリペプチド。

【請求項45】

請求項１～４４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。

【請求項46】

請求項１～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項４５に記載の融合タンパク質をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項47】

請求項４６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項48】

請求項４６に記載のポリヌクレオチド又は請求項４７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項49】

請求項１～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項４５に記載の融合タンパク質を含む、組成物。

【請求項50】

１つ以上の医薬賦形剤、希釈剤、又は担体をさらに含む、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

哺乳動物細胞を、有効量の請求項４９又は５０に記載の組成物と接触させることを含む、前記哺乳動物細胞におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項52】

有効量の請求項４９又は５０に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象を処置する方法。

【請求項53】

有効量の請求項４９又は５０に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法。

【請求項54】

前記対象が哺乳動物である、請求項５２又は５３に記載の方法。

【請求項55】

前記対象がヒトである、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記対象が成人である、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象が少なくとも５０歳である、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記対象が女性である、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記対象が、閉経周辺期、閉経期、又は閉経後である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記対象が、調節不全のカルシウムホメオスタシスを有するか、又はそれを発症するリスクを有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記対象が、骨粗鬆症、ブロムストランド型軟骨異形成、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、オリエ病、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクを有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアゴニストである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が、低い骨密度を有するか、又はそれを発症するリスクを有する、請求項５２～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記対象が、ブロムストランド型致死性軟骨異形成、オリエ病、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、短指症Ｅ型、副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクを有する、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記対象が、骨粗鬆症を有するか、又はそれを発症するリスクがある、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記量が、カルシウムホメオスタシスを促進すること、骨塩量の低下を増大、維持若しくは減少させること、骨折のリスクを減少させること、骨折治癒を促進すること、又は前述の組み合わせに有効である、請求項５２～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記有効量が、異化骨吸収を誘導しない、請求項５２～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺癌、転移性骨疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記副甲状腺機能亢進症が、副甲状腺癌の合併症として発生する、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記転移性骨疾患が、関連する高カルシウム血症を伴って発生する、請求項６９又は７０に記載の方法。

【請求項72】

前記対象が、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、慢性腎疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記慢性腎疾患が、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、又はそれらの組み合わせと関連して、又はその結果として発生する、請求項７２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願］
本出願は、２０１９年８月９日に出願された米国仮特許出願第６２／８８４，７０３号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルの資料の参照による組み込み
本出願には、本明細書と同時に提出される次のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表が参照により組み込まれる。
ファイル名：５７０８１０２８００１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；２０２０年８月７日作成、サイズ５７ＫＢ。

【背景技術】

【0003】

副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ又はＰＴＨ１Ｒ、ＨＧＮＣ：９６０８、ヒト遺伝子ＩＤ：５７４５、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２６７）は、骨及び腎臓において高レベルで発現し、カルシウムイオンのホメオスタシスを制御するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＰＴＨＲは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）及び副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の２つの天然リガンドを有する。ＰＴＨＲのバイオロジーの変化は、骨粗鬆症及びその他のカルシウムホメオスタシス調節不全の疾患を含む多くの重要な疾患に関与している。ＰＴＨＲの不活性化変異によって引き起こされる疾患には、たとえば、ブロムストランド型致死性軟骨異形成、オリエ病、歯牙萌出の家族性原発性不全、及びＥｉｋｅｎ症候群が含まれる。リガンドの不均衡によって引き起こされる疾患には、短指症Ｅ型及び副甲状腺機能低下症が含まれる。骨吸収と骨形成プロセスの間の不均衡である骨粗鬆症も、ＰＴＨＲを介したシグナル伝達によって制御されている。

【0004】

ＰＴＨＲの天然リガンドに基づく治療用ペプチドは組換えにより産生されており、骨粗鬆症の処置のための薬剤：テリパラチド（ＰＴＨのアミノ酸１～３４に対応、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）及びアバロパラチド（ＰＴＨｒＰのアミノ酸１～３４、Ｒａｄｉｕｓ ｈｅａｌｔｈ）として承認されている。

【0005】

それらのＦＤＡの承認及び臨床用途にもかかわらず、どちらの天然リガンドも重篤な副作用を有する。テリパラチド及びアバロパラチドはどちらも、骨肉腫のリスクのブラックボックスラベル警告付きで販売されており、当該薬剤による、患者の生涯にわたって２年を超える処置は推奨されていない。さらに、テリパラチドへの長期暴露は、しばしば患者の異化骨吸収を引き起こし、処置の望ましい結果を相殺する。さらに、これらの化合物は、例えば、ＰＴＨＲのアンタゴニスト又は逆アゴニスト活性を要する他の疾患に対処しない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書に開示される発明は、部分的に、本発明のポリペプチドが副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）に特異的に結合するという発見に基づいている。したがって、本発明は、一般に、細胞におけるＰＴＨＲ媒介性シグナル伝達を調節するために有用な組成物（例えば、ポリペプチド、医薬組成物）及び方法に関する。

【0007】

ＰＴＨＲに特異的に結合するポリペプチドが本明細書で提供される。一態様において、本発明は、ＰＴＨＲに特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、
ａ）１～３個の極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも４つの極性残基、少なくとも１つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｃ）少なくとも５つの極性残基、少なくとも２つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｄ）少なくとも５つの極性残基、２位のバリン、及び配列番号７に対する１～１３個のアミノ酸置換；又は
ｅ）少なくとも６つの極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換
を含む、１４アミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、
ａ）最大で１３個の極性残基、及び配列番号８に対する１～３２個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも１４個の極性残基、２位のバリン、及び配列番号８に対する１～３１個の置換；
ｃ）少なくとも１４個の極性残基、及び配列番号８に対する２２～２８個のアミノ酸置換；
ｄ）配列番号８の１～１４位、及び配列番号５に対する１５～３２位の１～１８個のアミノ酸置換
を含む、３２アミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号５に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号６に示されるアミノ酸配列は、ｓＰＴＨのＮ末端にある。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、ＰＴＨＲのアゴニストである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、ＰＴＨＲの逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、ＰＴＨＲのアンタゴニストである。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、融合タンパク質である。

【0017】

他の態様において、本発明は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0018】

別の態様において、本発明は、哺乳動物細胞を、有効量の本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物（例えば、医薬組成物）と接触させることを含む、哺乳動物細胞におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。

【0019】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物（例えば、医薬組成物）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象（例えば、骨粗鬆症を有する対象）を処置する方法を提供する。

【0020】

別の態様において、本発明は、有効量の本明細書に開示されるポリペプチド又は本明細書に開示されるポリペプチドを含む組成物（例えば、医薬組成物）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象（例えば、骨粗鬆症を有する対象）におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。

【0021】

前述の内容は、添付の図面に示されているように、例示的な実施形態の以下のより具体的な説明から明らかであり、同様の参照文字は、異なる表示の全体にわたって同じ部分を参照している。図面は必ずしも原寸に比例しておらず、代わりに実施形態を説明することに重点が置かれている。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】β１－アレスチン動員アッセイの結果を示す。

【図2】β２－アレスチン動員アッセイの結果を示す。

【図3】ｃＡＭＰ蓄積アッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、例示的な実施形態の説明である。

【0024】

ＰＴＨＲ活性を調節することができるＰＴＨＲに対する新規リガンドが必要とされている。本発明は、とりわけ、ＰＴＨＲの活性を調節できる合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）、並びにｓＰＴＨ、ｓＰＴＨをコードする核酸を含むコンジュゲート（例えば、異種部分を含む）、融合タンパク質、及び組成物、並びにｓＰＴＨを使用する方法（例えば、ＰＴＨＲ活性を調節するため（例えば、カルシウムホメオスタシス及び／又はＰＴＨＲシグナル伝達の障害を処置するため））を提供する。

【0025】

［ＰＴＨ及び関連ペプチド］
ＰＴＨＲの天然リガンドであるＰＴＨ（ＨＧＮＣ：９６０６）は、ＰＴＨＲに結合する分泌ペプチドホルモンである。ペプチドは、シグナル配列及び切断されたプロペプチドフォールドで構成され、８４アミノ酸の活性分子（アミノ酸３２～１１５）を残す。ＰＴＨの生理活性配列は、配列番号１として提供される（表１）。ＰＴＨＲのバイオロジー及び疾患におけるその役割のレビューは、Ｃｈｅｌｏｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１（１２）：７１２－２４（２０１５）に見出される。

【0026】

ＰＴＨＲの第２の天然リガンドであるＰＴＨｒＰ（ＨＧＮＣ：９６０７）は、ＰＴＨＲに結合する分泌ペプチドホルモンである。ペプチドは、シグナルペプチド、プロペプチド、及びエンドプロテオリシスによって、ＰＴＨｒＰ［１－３６］、ＰＴＨｒＰ［３８－９４］、及びオステオスタチン（ＰＴＨｒＰ［１０７－１３９］）と呼ばれる３つの主要な分泌型に切断される長鎖から構成される。ＰＴＨＲｒＰの完全な配列は、配列番号２として提供される（表１）。

【0027】

実験結果から、ＰＴＨのＮ末端の１４アミノ酸であるＰＴＨ［１－１４］は、受容体と結合し、シグナル伝達を促進し、一方、Ｃ末端の２０アミノ酸であるＰＴＨ［１５－３４］は、ＰＴＨＲの細胞外ドメインに結合し、ある程度の受容体特異性を付与することが知られている（Ｐｉｏｓｚａｋ＆Ｘｕ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０５（１３）：５０３４－３９（２００８）；Ｐｉｏｓｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８４（４１）：２８３８２－９１（２００９））。

【0028】

天然リガンドＰＴＨのアミノ酸１～３４に対応する治療用ペプチドテリパラチドの配列は、配列番号３として提供される（表１）。

【0029】

治療用ペプチドアバロパラチドの配列は、配列番号４（表１）として提供され、天然リガンドＰＴＨｒＰの最初の２０アミノ酸に対応する。残基２１～３４は、非天然アミノ酸の２－アミノイソ酪酸（「Ｘ」と表記）を含む、ＰＴＨｒＰのＣ末端の１４アミノ酸に対して５０％の多様性を有する。

【0030】

ＰＴＨＲの構造は、最近、ＰＴＨとＰＴＨｒＰのハイブリッドであるペプチドリガンドＬＡ－ＰＴＨとの複合体で解明された。Ｚｈａｏ ＬＨ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６４：１４８－５３（２０１９）を参照されたい。３２－ｍｅｒのＬＡ－ＰＴＨの配列は、配列番号５として提供され、ＬＡ－ＰＴＨのＮ末端の１４－ｍｅｒは、配列番号６として提供される（表１）。

【0031】

前述のＰＴＨ及びＰＴＨｒＰ配列を包含するコンセンサス配列は、配列番号７及び配列番号８に提供される（表１）。

【0032】

【表1】

【0033】

［本発明によって提供されるｓＰＴＨ］
一態様において、本発明は、ＰＴＨＲに特異的に結合するポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を含む。

【0034】

「合成副甲状腺ホルモン」又は「ｓＰＴＨ」又は「本発明によって提供されるｓＰＴＨ」などは、ＰＴＨＲに結合し、成熟ＰＴＨペプチドの生物活性部分とサイズが類似したアミノ酸配列を含み、野生型ＰＴＨ（配列番号１）、野生型ＰＴＨｒＰ（配列番号２）、テリパラチド（ＦＯＲＴＥＯ（登録商標）；配列番号３）、アバロパラチド（ＴＹＭＬＯＳ（登録商標）；配列番号４）、又は「長時間作用型」ＰＴＨ（Ｎ末端３２－ｍｅｒ（配列番号５）又はＮ末端１４－ｍｅｒ（配列番号６））のアミノ酸配列を含まないか、それからならないか、又は本質的にそれからならない、ポリペプチドを指す。

【0035】

特定の実施形態において、本発明によって提供されるｓＰＴＨは、配列番号７、配列番号８、及び／又は配列番号１０７に示されるコンセンサスアミノ酸配列を含まないか、それからならないか、又は本質的にそれからならない。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨは、米国特許第６，９２１，７５０号明細書、米国特許第７，８０３，７７０号明細書、及び／又は国際公開第２０００／０１０５９６号パンフレットに開示されるアミノ酸配列を含まないか、それからならないか、又は本質的にそれからならない。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨは、配列番号７、配列番号８又は配列番号１０７のコンセンサス配列に含まれ、表２に示される１つ以上の基準を満たすアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む。

【0036】

【表2】

【0037】

「極性」アミノ酸残基には、塩基性、酸性及び親水性であるが非荷電のカノニカルアミノ酸及び非カノニカルアミノ酸が含まれる。特定の実施形態において、極性残基は、カノニカルアミノ酸、例えば、塩基性（Ｋ、Ｒ、Ｈ）、酸性（Ｄ、Ｅ）又は親水性であるが非荷電（Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）である。いくつかの実施形態において、極性残基は、非カノニカルアミノ酸である。

【0038】

「荷電」残基には、塩基性及び酸性のカノニカルアミノ酸及び非カノニカルアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態において、荷電残基は、カノニカルアミノ酸、例えば、塩基性（Ｋ、Ｒ、Ｈ）又は酸性（Ｄ、Ｅ）である。いくつかの実施形態において、荷電残基は、非カノニカルアミノ酸である。

【0039】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び１０８～１５９（表３）から選択されるアミノ酸配列、又はその変異体を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0040】

【表3】

【0041】

【表4】

【0042】

【表5】

【0043】

【表6】

【0044】

「ｓＰＴＨの変異体」ポリペプチド（例えば、ｓＰＴＨに関する「変異体」）などは、参照配列（例えば、配列番号９～１０７又は１０８～１６０のうち１つ）と比較して、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列（より長い配列の場合はそれ以上、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１など）を含む。特定の実施形態において、本発明によって提供されるｓＰＴＨの変異体は、最大１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸置換、例えば、１～３個のアミノ酸置換を含む。非カノニカルアミノ酸での置換を含む、本発明によって提供されるｓＰＴＨの変異体の様々なアミノ酸置換が可能である。非カノニカルアミノ酸の非限定的な例には、任意のカノニカルアミノ酸のＤ－異性体（例えば、Ｄ－アラニン）、セレノシステイン、ピロリシン、β－アラニン、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、及びオルニチンが含まれる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。参照配列に対する「保存的置換」とは、ＢＬＯＳＵＭ６２で所与のアミノ酸置換の値が０以上であることを意味する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、高度に保存的なアミノ酸置換である。参照配列に対する「高度に保存的な置換」とは、ＢＬＯＳＵＭ６２で所与のアミノ酸置換の値が１以上（例えば、いくつかの実施形態において、２以上）であることを意味する。

【0045】

いくつかの実施形態において、「ｓＰＴＨの変異体」ポリペプチドは、本発明によって提供されるｓＰＴＨ（例えば、配列番号９～１０６又は１０８～１６０（表３）のｓＰＴＨ）と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含む。たとえば、変異体は、配列番号９～１０６及び１０８～１６０（表３）のいずれか１つ以上のｓＰＴＨと、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一である。

【0046】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」という用語は、配列がアラインされて最大レベルのパーセンテージで表される同一性を達成するときに、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。配列アライメント及び比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として指定され、これと試験配列が比較される。参照配列と試験配列の間の配列同一性は、参照配列と試験配列のアライメント時に参照配列と試験配列が同じヌクレオチド又はアミノ酸を共有して最大レベルの同一性を達成する、参照配列の全長にわたる位置のパーセンテージとして表される。一例として、最大レベルの同一性を達成するためのアライメント時に、試験配列が、参照配列の全長にわたって同じ位置の７０％に同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する場合、２つの配列は７０％の配列同一性を有すると見なされる。

【0047】

最大レベルの同一性を達成するための比較用の配列のアライメントは、適切なアライメント方法又はアルゴリズムを使用して、当業者によって容易に実施され得る。場合によっては、アライメントは、最大レベルの同一性を提供するために導入されたギャップを含み得る。例には、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及び外観検査（一般的に、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）が含まれる。

【0048】

配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、その後必要に応じて座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。パーセント配列同一性を決定するために一般的に使用されるツールは、米国国立衛生研究所の国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＰ）である。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。

【0049】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、
ａ）１～３個の極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも４つの極性残基、少なくとも１つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｃ）少なくとも５つの極性残基、少なくとも２つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｄ）少なくとも５つの極性残基、２位のバリン、及び配列番号７に対する１～１３個のアミノ酸置換；又は
ａ）少なくとも６つの極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換
を含む、１４アミノ酸配列を含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、
ａ）最大で１３個の極性残基、及び配列番号８に対する１～３２個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも１４個の極性残基、２位のバリン、及び配列番号８に対する１～３１個の置換；
ｃ）少なくとも１４個の極性残基、及び配列番号８に対する２２～２８個のアミノ酸置換；
ｄ）配列番号８の１～１４位、及び配列番号５に対する１５～３２位の１～１８個のアミノ酸置換
を含む、３２アミノ酸配列を含む。

【0051】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％；約２０～９７％、約２５～９７％、約２５～９５％、約３０～９５％、約３０～９０％、約３５～９０％、約３５～８５％、約４０～８５％、約４０～８０％、約４５～７５％、約４５～７０％、約５０～７０％、約５０～６５％若しくは約５５～６５％；又は最大で約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９７％の配列同一性を有するものである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0052】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個；又は約１～３２、約１～２８、約１～２４、約１～２０、約１～１５、約１～１０、約１～５、約２～３２、約２～２８、約２～２４、約２～２０、約２～１５、約２～１０、約２～５、約３～３２、約３～２８、約３～２４、約３～２０、約３～１５、約３～１０、約３～５、約４～３２、約４～２８、約４～２４、約４～２０、約４～１５、約４～１０又は約４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0053】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大３２個のアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１個；又は最大で１～３２、１～２８、１～２４、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、２～３２、２～２８、２～２４、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、３～３２、３～２８、３～２４、３～２０、３～１５、３～１０、３～５、４～３２、４～２８、４～２４、４～２０、４～１５、４～１０又は４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0054】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％；約２０～９７％、約２５～９７％、約２５～９５％、約３０～９５％、約３０～９０％、約３５～９０％、約３５～８５％、約４０～８５％、約４０～８０％、約４５～７５％、約４５～７０％、約５０～７０％、約５０～６５％若しくは約５５～６５％；又は最大で約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９７％の配列同一性を有するものである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個；又は約１～３２、約１～２８、約１～２４、約１～２０、約１～１５、約１～１０、約１～５、約２～３２、約２～３１、約２～２８、約２～２４、約２～２０、約２～１８、約２～１５、約２～１０、約２～５、約３～３２、約３～２８、約３～２４、約３～２０、約３～１５、約３～１０、約３～５、約４～３２、約４～２８、約４～２４、約４～２０、約４～１５、約４～１０又は約４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大３２個のアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１個；又は最大で１～３２、１～２８、１～２４、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、２～３２、２～３１、２～２８、２～２４、２～２０、２～１８、２～１５、２～１０、２～５、３～３２、３～２８、３～２４、３～２０、３～１５、３～１０、３～５、４～３２、４～２８、４～２４、４～２０、４～１５、４～１０又は４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0058】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％；約２０～９７％、約２５～９７％、約２５～９５％、約３０～９５％、約３０～９０％、約３５～９０％、約３５～８５％、約４０～８５％、約４０～８０％、約４５～７５％、約４５～７０％、約５０～７０％、約５０～６５％若しくは約５５～６５％；又は最大で約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９７％の配列同一性を有するものである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個；又は約１～３２、約１～２８、約１～２４、約１～２０、約１～１５、約１～１０、約１～５、約２～３２、約２～３１、約２～２８、約２～２４、約２～２０、約２～１８、約２～１５、約２～１０、約２～５、約３～３２、約３～２８、約３～２４、約３～２０、約３～１５、約３～１０、約３～５、約４～３２、約４～２８、約４～２４、約４～２０、約４～１５、約４～１０又は約４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大３２個のアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１個；又は最大で１～３２、１～２８、１～２４、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、２～３２、２～３１、２～２８、２～２４、２～２０、２～１８、２～１５、２～１０、２～５、３～３２、３～２８、３～２４、３～２０、３～１５、３～１０、３～５、４～３２、４～２８、４～２４、４～２０、４～１５、４～１０又は４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０１、１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、２８～３６個のアミノ酸、例えば、１８、２９、３０、３１、３２、３３、３５又は３６個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、３０～３４個のアミノ酸からなる。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、３２個のアミノ酸からなる。

【0064】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号５に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号５に対して、少なくとも約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％；約２０～９７％、約２５～９７％、約２５～９５％、約３０～９５％、約３０～９０％、約３５～９０％、約３５～８５％、約４０～８５％、約４０～８０％、約４５～７５％、約４５～７０％、約５０～７０％、約５０～６５％若しくは約５５～６５％；又は最大で約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９７％の配列同一性を有するものである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号５に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0065】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号５に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号５に対して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２個；又は約１～３２、約１～２８、約１～２４、約１～２０、約１～１５、約１～１０、約１～５、約２～３２、約２～３１、約２～２８、約２～２４、約２～２０、約２～１８、約２～１５、約２～１０、約２～５、約３～３２、約３～２８、約３～２４、約３～２０、約３～１５、約３～１０、約３～５、約４～３２、約４～２８、約４～２４、約４～２０、約４～１５、約４～１０又は約４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0066】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号５に対する最大３２個のアミノ酸置換を含む。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号５に対して、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又は３１個；又は最大で１～３２、１～２８、１～２４、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、２～３２、２～３１、２～２８、２～２４、２～２０、２～１８、２～１５、２～１０、２～５、３～３２、３～２８、３～２４、３～２０、３～１５、３～１０、３～５、４～３２、４～２８、４～２４、４～２０、４～１５、４～１０又は４～５個のアミノ酸置換を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号６に示されるアミノ酸配列は、ｓＰＴＨのＮ末端にある。

【0068】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％；約５５～９７％、約６０～９７％、約６０～９５％、約６５～９５％、約６５～９０％、約７０～９０％、約７０～８５％若しくは約８０～８５％；又は最大で約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、若しくは約９７％の配列同一性を有するものである。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、約７５～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、少なくともアミノ酸置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、少なくともアミノ酸置換は、高度に保存的な置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は高度に保存的な置換である。

【0070】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％高い親和性でＰＴＨＲに結合する。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％又は約７０％高い親和性でＰＴＨＲに結合する。

【0071】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％低い親和性でＰＴＨＲに結合する。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％又は約７０％低い親和性でＰＴＨＲに結合する。

【0072】

いくつかの実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも約５％以下低い。例えば、ｓＰＴＨは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約５０％以下、約６０％以下又は約７０％以下低い親和性でＰＴＨＲに結合する。

【0073】

いくつかの実施形態において、本発明によって提供されるｓＰＴＨ又はその変異体は、ｓＰＴＨ又はその変異体の、アセチル化、アミド化、ホルミル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、リン酸化、脱アミド化、プレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニル化など）、ユビキチン化、リボシル化又は硫酸化、又は前述の任意の組み合わせから生じる１つ以上の翻訳後修飾などの翻訳後修飾を含む。

【0074】

本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、アゴニスト（例えば、バイアス型アゴニスト）、逆アゴニスト、又は１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路のアンタゴニストとして機能し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路は、Ｇα_Ｓ－アデニリルシクラーゼ－ｃＡＭＰ－プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）経路（Ｇ_ｓ経路）、Ｇα_ｑ－ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）β－イノシトール三リン酸－細胞質Ｃａ^２＋－プロテインキナーゼＣ経路（Ｇ_ｑ経路）、Ｇα_{１２／１３}－ホスホリパーゼＤ－形質転換タンパク質ＲｈｏＡ経路（Ｇ_{１２／１３}経路）、β－アレスチン－細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）経路（β－アレスチン経路）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達経路は、Ｇα_Ｓ－アデニリルシクラーゼ－ｃＡＭＰ－プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）経路（Ｇ_ｓ経路）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達経路は、Ｇα_ｑ－ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）β－イノシトール三リン酸－細胞質Ｃａ^２＋－プロテインキナーゼＣ経路（Ｇ_ｑ経路）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達経路は、Ｇα_{１２／１３}－ホスホリパーゼＤ－形質転換タンパク質ＲｈｏＡ経路（Ｇ_{１２／１３}経路）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達経路は、β－アレスチン－細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）経路（β－アレスチン経路）を含む。ＰＴＨＲシグナル伝達経路の追加の例は、Ｃｈｅｌｏｈａ ＲＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１（１２）：７１２－２４（２０１５）に記載され、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。

【0075】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路のアゴニストとして機能する。「ＰＴＨＲのアゴニスト」は、結合しＰＴＨＲシグナル伝達を活性化する。本発明によって提供されるＰＴＨＲのアゴニストは、とりわけ、骨量を増加させ、骨形成を増加させ、及び／又は骨粗鬆症を有する又は骨粗鬆症のリスクが増加する対象（例えば、ヒト患者）の骨折を減少させるために使用できる。

【0076】

いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドは、参照ＰＴＨポリペプチド（例えば、ＰＴＨ１～３４）と比較して、改善された活性（例えば、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍又はそれを超える活性）を有する。特定の実施形態において、ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドは、参照ＰＴＨポリペプチド（例えば、ＰＴＨ１～３４）に対する同等又は類似の活性（例えば、約９０、９５、９７、９８、９９又は１００％の活性）を有する。活性の非限定的な例には、例えば、Ｇｓ経路、Ｇｑ経路、Ｇ１２／１３経路、β－アレスチン経路、及びそれらの組み合わせを介したシグナル伝達活性が含まれる。

【0077】

いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドは、参照ＰＴＨポリペプチド（例えば、ＰＴＨ１～３４）と比較して、ＰＴＨＲへのより低い結合定数（Ｋ_Ｄ）値（例えば、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％又はそれ未満）を有する。特定の実施形態において、ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドは、参照ＰＴＨポリペプチド（例えば、ＰＴＨ１～３４）と比較して、同等又は類似のＫ_Ｄ値（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０２％、約１０５％、又は約１１０％）を有する。本明細書で使用される場合、「結合定数」、「平衡解離定数」又は「親和定数」とも呼ばれる「Ｋ_Ｄ」という用語は、２つの分子種（例えば、抗体及び標的タンパク質）間の可逆的会合の程度の尺度であり、実際の結合親和性及び見かけの結合親和性の両方を含む。結合親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴の測定、例えば、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）又は表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）システム及びアッセイを含む、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。結合親和性及び動態を測定するための様々な表面技術を比較する参考文献は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０８：７８－９６（２０１６）であり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0078】

いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドは、１４個を超えるアミノ酸（例えば、３２アミノ酸、３４アミノ酸）を含み、ここで、ポリペプチドのＮ末端の１４アミノ酸は、配列番号６に対応する。

【0079】

ＰＴＨＲのアゴニストであるｓＰＴＨポリペプチドの特定の例には、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０が含まれる。例えば、本明細書の実施例６を参照されたい。

【0080】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１２０、配列番号１３６、配列番号１４３、配列番号１４５及び配列番号１５９からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１４５又は配列番号１５９である。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１３１、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４９、配列番号１５５及び配列番号１５７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１０８、配列番号１１５、配列番号１３１、配列番号１３６、配列番号１４３、配列番号１５５及び配列番号１５７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５８及び配列番号１６０からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、配列番号１０１、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５８及び配列番号１６０からなる群から選択される。

【0081】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路のバイアス型アゴニストとして機能する。「ＰＴＨＲのバイアス型アゴニスト」はＰＴＨＲに結合し、通常は親リガンドによって活性化されるか、又はシグナル伝達の持続時間及び細胞内局在の変化を誘導する、細胞内シグナル伝達応答の別個のサブセットを優先的に活性化する。さらなる説明について、たとえば、Ｃｈｅｌｏｈａ ＲＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１（１２）：７１２－２４（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲバイアス型アゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上の他の経路とは独立して、１つの経路の選択的活性化を誘導する。たとえば、ＰＴＨＲバイアス型アゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上のＧタンパク質共役型シグナル伝達メカニズム（Ｇ_ｓ経路、Ｇ_ｑ経路、Ｇ_{１２／１３}経路、又は前述の任意の組み合わせ）の活性化を誘導することなく、β－アレスチン経路の選択的活性化を誘導する。したがって、ＰＴＨＲバイアス型アゴニストを使用して、同化骨形成を選択的に誘導し、骨粗鬆症を有するか、又は骨粗鬆症のリスクが高い対象（例えば、ヒト患者）における副作用を軽減して治療効果を改善することができる。いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、参照バイアス型アゴニストの変異体である。参照バイアス型アゴニストの非限定的な例には、ＰＴＨ（７－３４）足場上のＤ－Ｔｒｐ１２（１２位のＤ－Ｔｒｐ）及びＴｙｒ３４－ＰＴＨ（７－３４）（３４位のＴｙｒ）が含まれる。たとえば、Ｂｏｈｉｎｃ ＢＮ ａｎｄ Ｇｅｓｔｙ－Ｐａｌｍｅｒ Ｄ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．１２（９）：８５６－６５（２０１２）を参照されたい。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路の逆アゴニストとして機能する。「ＰＴＨＲの逆アゴニスト」は、ＰＴＨＲに結合し、構成的活性型ＰＴＨＲを阻害するか、又は基礎ＰＴＨＲシグナル伝達を低下させることができるポリペプチドである。たとえば、Ｃｈｅｌｏｈａ ＲＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１（１２）：７１２－２４（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲ逆アゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、機能獲得型変異によるＰＴＨＲの過剰活性化を阻害及び／又は逆転させるために使用される。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲ逆アゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上の適応症を処置及び／又は予防するために使用される。適応症の非限定的な例には、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、及び慢性腎疾患が含まれる。たとえば、Ｓａｉｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．４９：２０－２８（２０１８）を参照されたい。

【0083】

いくつかの実施形態において、本発明のｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上のＰＴＨＲシグナル伝達経路のアンタゴニストとして機能する。「ＰＴＨＲのアンタゴニスト」は、ＰＴＨＲに結合し、アゴニスト又は逆アゴニストによるＰＴＨＲシグナル伝達の変化を防ぐポリペプチドである。たとえば、Ｃｈｅｌｏｈａ ＲＷ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１（１２）：７１２－２４（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲアンタゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、ＰＴＨＲの過剰活性化を阻害するために使用される。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲアンタゴニストとして作用するｓＰＴＨポリペプチドは、１つ以上の適応症を処置及び／又は予防するために使用される。適応症の非限定的な例には、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺癌、及び転移性骨疾患が含まれる。たとえば、Ｍｉｒｚａ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＣＲ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ２０１７を参照されたい。

【0084】

いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達は、ルシフェラーゼアッセイによって評価され、これは、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈａｔｔｅｒｓｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １５７（１）：１４１－４９（２０１６）又はＫｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７に従って実施することができる。ＰＴＨＲシグナル伝達に対するｓＰＴＨポリペプチド媒介効果（例えば、アゴニスト活性又は逆アゴニスト活性）は、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイによって評価することができる。たとえば、ルシフェラーゼタグ付きβ－アレスチン及びＹＦＰタグ付きＧＰＣＲを使用する。いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨポリペプチド媒介効果（例えば、逆アゴニスト活性又はアンタゴニスト活性）は、ｃＡＭＰレベルの低下を検出することによって評価される。いくつかの実施形態（例えば、逆アゴニスト活性）において、バックグラウンドｃＡＭＰレベルは、例えば１つ以上の構成的変異を含む、構成的活性型受容体を使用して決定される。構成的変異の非限定的な例には、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症の根底にあるＨ２２３Ｒ、Ｔ４１０Ｐ、若しくはＩ４５８Ｒ又はそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態（例えば、アンタゴニスト活性）において、バックグラウンドｃＡＭＰレベルは、天然リガンドを使用して決定される。アッセイの詳細な説明は、実施例２Ｂ（アンタゴニスト活性）及び実施例２Ｃ（逆アゴニスト活性）に見出すことができる。

【0085】

いくつかの実施形態において、ｓＰＴＨポリペプチドは、異種部分にコンジュゲートされている。「コンジュゲート」という用語は、共有又は非共有相互作用を介して結合することを指す。コンジュゲーションは、適切な連結剤のいずれかを使用することができる。非限定的な例には、ペプチドリンカー、化合物リンカー、及び化学的架橋剤が含まれる。

【0086】

いくつかの実施形態において、異種部分は、治療剤、診断薬、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヘキサデカン酸、ヒドロゲル、ナノ粒子、多量体化ドメイン、及び担体ペプチドである。

【0087】

いくつかの実施形態において、ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、ナノ粒子はポリマーナノ粒子である。いくつかの実施形態において、ポリマーは両親媒性ポリマーである。他の実施形態において、ポリマーは、疎水性又は親水性ポリマーである。ポリマーの非限定的な例には、ポリ（乳酸）－ポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）－ポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）－ｄ－α－トコフェリルポリエチレングリコールコハク酸塩、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）－エチレンオキシドフマル酸塩、ポリ（グリコール酸）－ポリ（エチレングリコール）、ポリカプロラクトン－ポリ（エチレングリコール）、又はそれらの塩が含まれる。いくつかの実施形態において、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）を含む。

【0088】

［融合タンパク質］
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される１つ以上のＳＰＴＨを含む融合タンパク質を提供する。

【0089】

「融合タンパク質」という用語は、合成、半合成、又は組換えの単一タンパク質分子を指す。融合タンパク質は、共有結合（例えば、ペプチド結合）によって結合される２つ以上の異なるタンパク質及び／又はポリペプチドの全部又は一部を含み得る。

【0090】

本発明の融合タンパク質は、当技術分野で周知の通常の方法及び試薬を使用して、組換え又は合成により産生することができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法に従って、適切な宿主細胞（例えば、細菌）において組換えにより産生することができる。たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２；及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は、適切な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））において導入及び発現することができ、発現された融合タンパク質は、通常の方法及び容易に入手可能な試薬を使用して、宿主細胞（例えば、封入体中）から単離／精製することができる。例えば、異なるタンパク質配列（例えば、光応答性ドメイン、異種ペプチド成分）をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、インフレームで一緒に連結することができる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化されたＤＮＡシンセサイザーを含む従来技術によって合成することができる。或いは、核酸断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する核酸断片間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実行でき、その後、アニーリング及び再増幅してキメラ核酸配列を生成できる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照されたい）。

【0091】

［核酸、発現ベクター、発現宿主細胞］
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のＳＰＴＨポリペプチド又は融合タンパク質のいずれか１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＳＰＴＨポリペプチド又は融合タンパク質は、単一のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、本発明のＳＰＴＨポリペプチド又は融合タンパク質は、複数のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＳＰＴＨポリヌクレオチドは、選択された宿主細胞に対してコドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。

【0093】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含む発現ベクターを提供する。

【0094】

「発現ベクター」という用語は、発現ベクターが適切な発現宿主細胞に形質転換されるときに１つ以上のタンパク質を発現させることができる複製可能な核酸を指す。

【0095】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現制御ポリヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド配列、又はその両方をさらに含む。いくつかの実施形態において、発現制御ポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、又はその両方を含む。いくつかの実施形態において、発現制御ポリヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター配列を含む。「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指す。「作動可能に連結された」という用語は、核酸が、それが連結されたエレメント（例えば、プロモーター）の制御下で核酸の発現を可能にするような方法で、組換えポリヌクレオチド、例えば、ベクターに配置されることを意味する。「選択マーカーエレメント」という用語は、人為選択に適した形質を与えるエレメントである。選択可能なマーカーエレメントは、ネガティブ又はポジティブ選択マーカーであり得る。

【0096】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド又は発現ベクターのいずれか１つ以上を含む発現宿主細胞を提供する。

【0097】

「発現宿主細胞」という用語は、ベクターを受け取り、維持し、複製し、及び／又は増幅するのに有用な細胞を指す。

【0098】

発現宿主細胞の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞などの酵母細胞、又はＤＨ５αなどの細菌細胞などが含まれる。

【0099】

［組成物］
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド又は融合タンパク質のいずれか１つを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は医薬組成物である。

【0100】

いくつかの実施形態において、組成物（例えば、医薬組成物）は、薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤又は強壮剤をさらに含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。適切な薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒である。薬学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、希釈剤又は強壮剤の非限定的な例には、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸又はメチオニン）、防腐剤、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物（例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース又はデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）は、適切な投与スケジュール及び経路のために製剤化される。投与経路の非限定的な例には、経口、直腸、粘膜、静脈内、筋肉内、皮下及び局所などが含まれる。いくつかの実施形態において、本発明の組成物（例えば、医薬組成物）は、水溶液又は乾燥製剤（例えば、凍結乾燥）の形態で保存される。

【0102】

いくつかの実施形態において、組成物は、注入（例えば、静脈内注入）によって投与されるように製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、組み合わせ治療として第２の治療剤とともに投与されるように製剤化される。

【0103】

［ｓＰＴＨの作製方法］
ＳＰＴＨポリペプチド、そのコンジュゲート、その融合タンパク質、及び本発明の組成物は、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって産生することができる。いくつかの実施形態において、化学合成の方法が使用される。いくつかの実施形態において、組換え産生／発現の方法が使用される。いくつかの実施形態において、化学合成及び組換え産生／発現の組み合わせが使用される。例えば、ＳＰＴＨポリペプチド成分は、組換えにより産生され、その後、異種部分を化学的にコンジュゲートする。いくつかの実施形態において、本発明の宿主細胞（例えば、本発明のＳＰＴＨポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む）は、適切な条件下で培養されてｓＰＴＨを生成し、これは次に宿主細胞又は培養物上清から単離され、それによりｓＰＴＨを産生する。

【0104】

［ｓＰＴＨを使用する方法］
別の態様において、本発明は、細胞を、有効量の本明細書に記載されるポリペプチド、融合タンパク質又は組成物（例えば、医薬組成物）と接触させることを含む、細胞（例えば、哺乳動物細胞）におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。

【0105】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載される有効量のポリペプチド、融合タンパク質又は組成物（例えば、医薬組成物）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象のＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法を提供する。

【0106】

いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、ＰＴＨＲシグナル伝達のアゴニスト活性（例えば、バイアス型アゴニスト活性）、逆アゴニスト活性、又はアンタゴニスト活性、又は上記の組み合わせを伴う。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、ＰＴＨＲシグナル伝達のアゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、ＰＴＨＲシグナル伝達のバイアス型アゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、ＰＴＨＲシグナル伝達の逆アゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、ＰＴＨＲシグナル伝達のアンタゴニスト活性を伴う。

【0107】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を処置する方法を提供する。

【0108】

いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を処置することは、ＰＴＨＲシグナル伝達のアゴニスト活性（例えば、バイアス型アゴニスト活性）、逆アゴニスト活性、又はアンタゴニスト活性、又は上記の組み合わせを伴う。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を処置することは、ＰＴＨＲシグナル伝達のアゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を処置することは、ＰＴＨＲシグナル伝達のバイアス型アゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を処置することは、ＰＴＨＲシグナル伝達の逆アゴニスト活性を伴う。いくつかの実施形態において、それを必要とする対象を処置することは、ＰＴＨＲシグナル伝達のアンタゴニスト活性を伴う。

【0109】

「対象」又は「患者」という用語は、動物（例えば、哺乳動物）を指す。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は成人である。いくつかの実施形態において、対象は少なくとも５０歳である。いくつかの実施形態において、対象は女性である。いくつかの実施形態において、対象は、閉経周辺期、閉経期、又は閉経後である。いくつかの実施形態において、対象は閉経周辺期である。いくつかの実施形態において、対象は閉経期である。いくつかの実施形態において、対象は閉経後である。

【0110】

本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、ある状態と診断された人、又はそのような状態を発症するリスクのある人であり得る。いくつかの実施形態において、対象はその状態を有する。いくつかの実施形態において、対象はその状態と診断されている。他の実施形態において、対象は、その状態を発症するリスクがある。本発明によって提供される方法によって処置可能な例示的な状態（適応症）には、以下の表４～６又は特許請求の範囲に記載されるもの、又は上記の列挙された実施形態が含まれる。

【0111】

【表7】

【0112】

【表8】

【0113】

【表9】

【0114】

【表10】

【0115】

【表11】

【0116】

いくつかの実施形態において、対象は、調節不全のカルシウムホメオスタシスを有するか、又はそれを発症するリスクがある。

【0117】

いくつかの実施形態において、対象は、骨粗鬆症、ブロムストランド型軟骨異形成、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、オリエ病、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患（disorder）を有するか、又はそれを発症するリスクを有する。

【0118】

いくつかの実施形態において、対象は、低い骨密度を有するか、又はそれを発症するリスクを有する。

【0119】

いくつかの実施形態において、対象は、ブロムストランド型致死性軟骨異形成、オリエ病、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、短指症Ｅ型、副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクを有する。

【0120】

いくつかの実施形態において、対象は、骨粗鬆症を有するか、又はそれを発症するリスクを有する。

【0121】

いくつかの実施形態において、対象は、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺癌、転移性骨疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い。いくつかの実施形態において、副甲状腺機能亢進症は、副甲状腺癌の合併症として発生する。いくつかの実施形態において、転移性骨疾患は、関連する高カルシウム血症を伴って発生する。

【0122】

いくつかの実施形態において、対象は、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、慢性腎疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い。いくつかの実施形態において、慢性腎疾患は、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、又はそれらの組み合わせと関連して、又はその結果として発生する。

【0123】

診断は、当技術分野で公知の任意の方法又は技術によって実施され得る。当業者は、本開示に従って処置される対象が、標準的な試験を受けた可能性があるか、又は検査なしで、疾患又は状態と関連する１つ以上の危険因子の存在に起因する危険性があると特定された可能性があることを理解するであろう。

【0124】

本発明によって提供されるｓＰＴＨ（及び組成物、コンジュゲート（例えば、結合又は他の方法で（例えば、共有結合によって）裏打ちされた異種部分を含む）、及びそれらを含む融合タンパク質；又はそれらをコードする核酸、ベクター、若しくは細胞）は、ＰＴＨＲシグナル伝達を調節するために、例えば、ＰＴＨＲのアゴニストとして、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストとして、ＰＴＨＲの逆アゴニストとして、又はＰＴＨＲのアンタゴニストとして、さまざまな状況で使用できる。ＰＴＨＲシグナル伝達の調節は、インビトロで、細胞内で、又はインビボで、例えば、対象においてあり得る。本発明によって提供される方法によって処置可能な例示的な適応症には、以下の表２～４又は特許請求の範囲に記載されるもの、又は上記の列挙された実施形態が含まれる。

【0125】

これらの方法では、ｓＰＴＨ（組成物、コンジュゲート、融合タンパク質、又は核酸又は細胞）が、適切な手段によって有効量で対象に提供される。「有効量」、「治療有効量」、又は「十分な量」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む対象に投与された場合に、細胞レベル、組織レベル、又は臨床結果での効果を含む有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量を指し、したがって、「有効量」又はその同義語は、それが適用される文脈に依存する。例えば、いくつかの実施形態において、これは、組成物の投与なしで得られる応答と比較して、処置応答を達成するのに十分な量の組成物である。そのような量に対応する本明細書に記載の所与の組成物の量は、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害のタイプ、対象のアイデンティティ（例えば、年齢、性別、体重）又は処置される宿主などの様々な要因に応じて変化するが、それにもかかわらず、当業者が通常の方法で決定することができる。また、本明細書で使用される場合、本開示の組成物の「治療有効量」は、対照と比較して、対象において有益な又は所望の結果をもたらす量である。本明細書で定義されるように、本開示の組成物の治療有効量は、当技術分野で公知の通常の方法により、当業者によって容易に決定され得る。投与レジメン及び投与経路は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。

【0126】

いくつかの実施形態において、量は、カルシウムホメオスタシスを促進すること、骨塩量の低下を増大、維持又は減少させること、骨折のリスクを減少させること、骨折治癒を促進すること、又は前述の組み合わせに有効である。

【0127】

いくつかの実施形態において、有効量は、異化骨吸収を誘導しない。

【0128】

本明細書で使用される「処置」及び「処置すること」は、疾患、病状、又は障害（本明細書に例示される特定の適応症など）を改善、緩和、安定化し（すなわち、悪化させず）、予防又は治癒することを目的とした対象の医学的管理を指す。この用語には、積極的処置（疾患、病状、又は障害を改善することに向けられた処置）、原因処置（関連する疾患、病状、又は障害の原因に向けられた処置）、緩和処置（症状を緩和するために設計された処置）、予防的処置（関連する疾患、病状、又は障害の発症を最小限に抑えるか、又は部分的若しくは完全に阻害することに向けられた処置）；及び補助的処置（別の療法を補うために利用される処置）が含まれる。処置には、検出可能又は検出不可能な、疾患又は状態の程度の減少；疾患又は状態の拡大の予防；疾患又は状態の進行の遅延又は減速；疾患又は状態の改善又は緩和；及び寛解（部分又は完全）も含まれる。疾患又は状態を「改善すること」又は「緩和すること」とは、処置の非存在下での程度又は時間経過と比較して、疾患、障害、又は状態の程度及び／又は望ましくない臨床症状が軽減され、及び／又は進行の時間経過が減速するか又は長くなることを意味する。「処置」はまた、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して生存を延長することを意味し得る。処置が必要な人には、すでにその状態若しくは疾患を有する人、及びその状態若しくは疾患を生じやすい人、又はその状態若しくは疾患を予防すべき人が含まれる。

【0129】

本発明によって提供されるｓＰＴＨ（及びそれらを含むコンジュゲート、融合タンパク質、及び組成物；又はそれらをコードする核酸、ベクター、又は細胞）の特徴又はそれらを使用する方法は、以下の列挙された実施形態の１つ以上を含み得る。

【0130】

実施形態１：副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨＲ）に特異的に結合するポリペプチドであって、ポリペプチドが、合成副甲状腺ホルモン（ｓＰＴＨ）を含む、ポリペプチド。

【0131】

実施形態２：ｓＰＴＨが、
ａ）１～３個の極性残基、及び配列番号６に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも４つの極性残基、少なくとも１つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｃ）少なくとも５つの極性残基、少なくとも２つの荷電残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換；
ｄ）少なくとも５つの極性残基、２位のバリン、及び配列番号７に対する１～１３個のアミノ酸置換；又は
ｅ）少なくとも６つの極性残基、及び配列番号７に対する１～１４個のアミノ酸置換
を含む、１４アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0132】

実施形態３：ｓＰＴＨが、
ａ）最大で１３個の極性残基、及び配列番号８に対する１～３２個のアミノ酸置換；
ｂ）少なくとも１４個の極性残基、２位のバリン、及び配列番号８に対する１～３１個のアミノ酸置換；
ｃ）少なくとも１４個の極性残基、及び配列番号８に対する２２～２８個のアミノ酸置換；又は
ｄ）配列番号８の１～１４位、及び配列番号５に対する１５～３２位の１～１８個のアミノ酸置換
を含む、３２アミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0133】

実施形態４：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0134】

実施形態５：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0135】

実施形態６：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0136】

実施形態７：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大２～３１個のアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0137】

実施形態８：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大２～１８個のアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0138】

実施形態９：ｓＰＴＨが、配列番号９～１０６及び配列番号１０８～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0139】

実施形態１０：ｓＰＴＨが、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0140】

実施形態１１：ｓＰＴＨが、配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0141】

実施形態１２：ｓＰＴＨが、配列番号配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0142】

実施形態１３：ｓＰＴＨが、配列番号配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大２～３１個のアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0143】

実施形態１４：ｓＰＴＨが、配列番号配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列に対して、最大２～１８個のアミノ酸置換を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0144】

実施形態１５：ｓＰＴＨが、配列番号配列番号９、１０、１９、２０、３１、３５、４１、８８、１０１～１０３、１０８、１１５、１２０、１２１、１２９、１３１、１３２、１３４、１３６～１３８、１４０～１４３、１４５、１４７～１５２、１５４、１５５及び１５７～１６０から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0145】

実施形態１６：ｓＰＴＨが、２８～３６個のアミノ酸からなる、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0146】

実施形態１７：ｓＰＴＨが、３０～３４個のアミノ酸からなる、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0147】

実施形態１８：ｓＰＴＨが、３２個のアミノ酸からなる、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0148】

実施形態１９：ｓＰＴＨが、配列番号５に対して、少なくとも約２０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0149】

実施形態２０：ｓＰＴＨが、配列番号５に対して、約５０～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0150】

実施形態２１：ｓＰＴＨが、配列番号５に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0151】

実施形態２２：ｓＰＴＨが、配列番号５に対する２～１８個のアミノ酸置換を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0152】

実施形態２３：ｓＰＴＨが、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0153】

実施形態２４：配列番号６に示されるアミノ酸配列が、ｓＰＴＨのＮ末端にある、実施形態２３に記載のポリペプチド。

【0154】

実施形態２５：ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、少なくとも約５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0155】

実施形態２６：ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択される配列に対して、約７５～９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１９に記載のポリペプチド。

【0156】

実施形態２７：ｓＰＴＨが、配列番号１０２～１０６及び配列番号１３２～１５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0157】

実施形態２８：ｓＰＴＨが、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のポリペプチド。

【0158】

実施形態２９：少なくとも１つのアミノ酸置換が、保存的置換である、実施形態６、１２及び２１のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0159】

実施形態３０：少なくとも１つのアミノ酸置換が、高度に保存的な置換である、実施形態２９に記載のポリペプチド。

【0160】

実施形態３１：アミノ酸置換が、保存的置換である、実施形態２、３、７、８、１３、１４及び２２のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0161】

実施形態３２：アミノ酸置換が、高度に保存的な置換である、実施形態３１に記載のポリペプチド。

【0162】

実施形態３３：ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％高い親和性でＰＴＨＲに結合する、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0163】

実施形態３４：ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも少なくとも約５％低い親和性でＰＴＨＲに結合する、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0164】

実施形態３５：ｓＰＴＨが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドよりも約５％以下低い親和性でＰＴＨＲに結合する、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0165】

実施形態３６：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアゴニストである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0166】

実施形態３７：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストである、実施形態３６に記載のポリペプチド。

【0167】

実施形態３８：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲの逆アゴニストである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0168】

実施形態３９：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアンタゴニストである、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0169】

実施形態４０：ポリペプチドが、異種部分にコンジュゲートされている、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のポリペプチド。

【0170】

実施形態４１：異種部分が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヘキサデカン酸、ヒドロゲル、脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、及び異種ポリペプチド配列、或いはそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態４０に記載のポリペプチド。

【0171】

実施形態４２：ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸－コ－グリコール）酸（ＰＬＧＡ）を含む、実施形態４１に記載のポリペプチド。

【0172】

実施形態４３：異種ポリペプチド配列が、担体ポリペプチドを含む、実施形態４０に記載のポリペプチド。

【0173】

実施形態４４：担体ポリペプチドが、アルブミン又はＦｃポリペプチドである、実施形態４３に記載のポリペプチド。

【0174】

実施形態４５：実施形態１～４４のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。

【0175】

実施形態４６：実施形態１～４４のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態４５に記載の融合タンパク質をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。

【0176】

実施形態４７：実施形態４６のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【0177】

実施形態４８：実施形態４６に記載のポリヌクレオチド又は実施形態４７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【0178】

実施形態４９：実施形態１～４４のいずれか１つに記載のポリペプチド又は実施形態４５に記載の融合タンパク質を含む、組成物。

【0179】

実施形態５０：１つ以上の医薬賦形剤、希釈剤、又は担体をさらに含む、実施形態４９に記載の組成物。

【0180】

実施形態５１：哺乳動物細胞を、有効量の実施形態４９又は５０の組成物と接触させることを含む、哺乳動物細胞におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法。

【0181】

実施形態５２：有効量の実施形態４９又は５０の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を処置する方法。

【0182】

実施形態５３：有効量の実施形態４９又は５０の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＰＴＨＲシグナル伝達を調節する方法。

【0183】

実施形態５４：対象が哺乳動物である、実施形態５２又は５３に記載の方法。

【0184】

実施形態５５：対象がヒトである、実施形態５４に記載の方法。

【0185】

実施形態５６：対象が成人である、実施形態５２～５５のいずれか１つに記載の方法。

【0186】

実施形態５７：対象が少なくとも５０歳である、実施形態５２～５６のいずれか１つに記載の方法。

【0187】

実施形態５８：対象が女性である、実施形態５２～５７のいずれか１つに記載の方法。

【0188】

実施形態５９：対象が、閉経周辺期、閉経期、又は閉経後である、実施形態５８に記載の方法。

【0189】

実施形態６０：対象が、調節不全のカルシウムホメオスタシスを有するか、又はそれを発症するリスクがある、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0190】

実施形態６１：対象が、骨粗鬆症、ブロムストランド型軟骨異形成、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、オリエ病、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクがある、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0191】

実施形態６２：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのアゴニストである、実施形態６１に記載の方法。

【0192】

実施形態６３：ｓＰＴＨが、ＰＴＨＲのバイアス型アゴニストである、実施形態６２に記載の方法。

【0193】

実施形態６４：対象が、低い骨密度を有するか、又はそれを発症するリスクがある、実施形態５２～６３のいずれか１つに記載の方法。

【0194】

実施形態６５：対象が、ブロムストランド型致死性軟骨異形成、オリエ病、歯牙萌出の家族性原発性不全、Ｅｉｋｅｎ症候群、短指症Ｅ型、副甲状腺機能低下症、骨粗鬆症、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクがある、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0195】

実施形態６６：対象が、骨粗鬆症を有するか、又はそれを発症するリスクがある、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0196】

実施形態６７：量が、カルシウムホメオスタシスを促進すること、骨塩量の低下を増大、維持又は減少させること、骨折のリスクを減少させること、骨折治癒を促進すること、又は前述の組み合わせに有効である、実施形態５２～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0197】

実施形態６８：有効量が、異化骨吸収を誘導しない、実施形態５２～６７のいずれか１つに記載の方法。

【0198】

実施形態６９：対象が、高カルシウム血症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺癌、転移性骨疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0199】

実施形態７０：副甲状腺機能亢進症が、副甲状腺癌の合併症として発生する、実施形態６９に記載の方法。

【0200】

実施形態７１：転移性骨疾患が、関連する高カルシウム血症を伴って発生する、実施形態６９又は７０に記載の方法。

【0201】

実施形態７２：対象が、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、副甲状腺機能亢進症、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、慢性腎疾患、及びそれらの組み合わせから選択される疾患を有するか、又はそれを発症するリスクが高い、実施形態５２～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0202】

実施形態７３：慢性腎疾患が、高カルシウム血症、高カルシウム尿症、腎石灰化症、又はそれらの組み合わせと関連して、又はその結果として発生する、実施形態７２に記載の方法。

【実施例】

【0203】

ＰＴＨＲに結合して活性化すると予測される配列は、Ｚｈａｏ ＬＨ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６４，１４８－５３（２０１９）で公開された最近のＣｒｙｏＥＭレポートを含む、ＰＴＨＲの計算モデル及び解明された構造を使用して生成された。天然リガンドと同様の構造を保持しながら、受容体に最適に結合すると予測される配列。配列のファミリーは、表２に記載されているように生成された。

【0204】

実施例１．ペプチドの合成
ペプチドは、当技術分野で公知の２つの方法：細菌からの組換え産生又は化学合成、のうちの１つを使用して産生される。

【0205】

組換え産生の場合、ペプチドのＤＮＡ配列は、細菌産生に適したＤＮＡベクター、例えば、ＰＥＴベクターにコードされている。細菌はプラスミドで形質転換され、適切な増殖培地で増殖される。細菌が対数増殖段階に達すると、プラスミドの翻訳が、例えばＩＰＴＧにより、誘導される。タンパク質は、溶解及び封入体からの回収によって細菌から収集される。

【0206】

固相化学合成につき、標準的な方法は、次のユニフォームリソースロケーター：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３５６４５４４で入手できる、Ｓｔａｗｉｋｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２００２，Ｆｅｂ．Ｃｈａｐｔｅｒ １８．１に記載される。

【0207】

実施例２．アゴニズム、アンタゴニズム、及び逆アゴニズムに関するインビトロでの受容体活性の試験
ＰＴＨＲ活性を測定するために、例えば、Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５７（１）：１４１－４９（２０１６）に記載されるようなｃＡＭＰ蓄積アッセイなどの標準的な方法が使用される。これらのアッセイは、本発明によって提供されるＰＴＨＲ変異体（ｓＰＴＨＲ）をコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して室温で実施される。標準キット、例えば、ＰｒｏｍｅｇａのｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイは、ｃＡＭＰ産生をモニターする均一系生物発光ハイスループットアッセイで細胞内のｃＡＭＰレベルを測定するために使用される（例えば、Ｋｕｍａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓａｙ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．５（２）：２３７－４５（２００７）を参照されたい。アッセイは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）がプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）ホロ酵素活性を刺激し、それによって利用可能なＡＴＰが減少し、結合ルシフェラーゼ反応における光生成が減少するという原理に基づいている。

【0208】

アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施される。細胞はさまざまな濃度のペプチドで処理される。次に、細胞を溶解バッファーで溶解する。ＰＫＡ反応ミックスを加えた後、細胞溶解物を２０分間インキュベートする。次に、Ｋｉｎａｓｅ－Ｇｌｏ試薬を含む現像バッファーを加え、プレートを１０分間インキュベートする。最後に、プレート読み取りルミノメーターを使用して発光を測定する。

【0209】

ａ）アゴニスト活性
産生されたペプチドは、例えば、Ｇａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７（９）：３９３６－４１（１９９６）に記載されるように、ＰＴＨＲを組換えにより発現する細胞株における受容体の活性化について試験される。簡潔には、ＣＯＳ－７細胞は１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養する。細胞にＤＥＡＥ／デキストラン及びＰＴＨＲ ｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡ（１００ｎｇ／ウェル）をトランスフェクトする。受容体アッセイは、トランスフェクションの３日後にインタクトなＣＯＳ－７細胞（５００，０００細胞／ウェル）で実施される。

【0210】

アゴニスト活性を試験するために、細胞をさまざまな濃度のアゴニストペプチドで処理する。次に、ＰＴＨＲ活性化は、本明細書に記載のｃＡＭＰ蓄積アッセイ（例えば、ｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ）を使用して測定される。アゴニストペプチドによるＰＴＨＲの活性化は、細胞内にｃＡＭＰの蓄積をもたらすと予想され、これは、対照又は未処理の細胞よりも高い発光読み取り値として反映される。

【0211】

ｂ）アンタゴニスト活性
産生されたペプチドは、アゴニスト活性のセクションで説明されるように、ＰＴＨＲを組換えにより発現する細胞株における受容体活性化の阻害について試験される。アンタゴニスト活性を試験するために、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（３）：１７９７－８０７（２００５）に記載されるように、１ｎＭの固定濃度の検証済みアゴニスト（例えば、ＰＴＨ１～３４）と一緒に、さまざまな濃度のアンタゴニストペプチドで細胞を処理する。

【0212】

次に、ＰＴＨＲ活性は、本明細書に記載のｃＡＭＰ蓄積アッセイ（例えば、ｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ）を使用して測定される。アンタゴニストペプチドによるＰＴＨＲ活性化の阻害は、細胞内でのｃＡＭＰの蓄積を防ぎ、これは、検証済みのアゴニストで処理された細胞よりも低い発光読み取り値として反映される。

【0213】

ｃ）逆アゴニスト活性
生成されたペプチドは、例えば、Ｓａｉｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１０３（７）：２６６０－６９（２０１８）に記載されるように、ＰＴＨＲの機能獲得型変異体を組換えにより発現する細胞株の基礎受容体活性を低下させることにつき試験される。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養する。細胞は、ＰＴＨＲの機能獲得型変異体（例えば、Ｈ２２３Ｒ）をコードするＤＥＡＥ／デキストラン及びプラスミドＤＮＡ（１００ｎｇ／ウェル）でトランスフェクトされる。受容体アッセイは、トランスフェクションの２日後にインタクトなＨＥＫ２９３細胞（１００，０００細胞／ウェル）で実施される。

【0214】

細胞は、さまざまな濃度の逆アゴニストペプチドで処理される。次に、変異体ＰＴＨＲ活性化は、本明細書に記載のｃＡＭＰ蓄積アッセイ（例えば、ｃＡＭＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ）を使用して測定される。基底変異体ＰＴＨＲ活性の低下は、細胞内のｃＡＭＰの低下につながると予想され、これは、対照又は未処理の細胞よりも低い発光読み取り値として反映される。

【0215】

実施例３．バイアス型アゴニズムに関するインビトロでの受容体活性の試験
ＰＴＨＲのバイアス型β－アレスチンシグナル伝達を試験するために、例えば、Ｗａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００４－２０１７ Ｎｏｖ ２０に記載されるような、β－アレスチン動員を測定する標準的な方法が実施される。標準キットには、たとえば、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ β－アレスチンアッセイが含まれる。β－ガラクトシダーゼのペプチド断片及びβ－アレスチンに融合したβ－ガラクトシダーゼの対応する欠失変異体で、カルボキシル末端に伸長したＰＴＨＲを安定して発現するＣＨＯ細胞株を使用する。このアッセイは、再構成されたβ－ガラクトシダーゼのレベルを、均一系生物発光ハイスループットアッセイで測定する。アッセイは、β－アレスチン動員が活性β－ガラクトシダーゼの再構成をもたらし、これが外因性基質からの生物発光反応を触媒して生物発光の読み取り値を生成するという原理に基づいている。

【0216】

アッセイは、製造元のプロトコルに従って実施される。細胞はさまざまな濃度のペプチドで処理される。次に、細胞を提供された作業検出溶液（Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とともに、暗所で、室温で１時間インキュベートする。最後に、プレート読み取りルミノメーターを使用して発光を測定する。

【0217】

ＰＴＨＲへのβ－アレスチン動員の増加は、細胞内の再構成された活性β－ガラクトシダーゼの増加につながると予想され、これは、対照又は未処理の細胞よりも高い発光読み取り値として反映される。

【0218】

実施例４．インビボでの活性の試験
ペプチドは、骨粗鬆症の標準的な実験室モデル、すなわち卵巣摘出ラットモデルで機能的活性について評価される。このモデルでは、外科的卵巣摘出術後、最初に骨吸収が骨形成を上回り、骨量減少を生じる。その後まもなく、骨の組織修復は定常状態に達し、吸収と形成のバランスがとれる。統計的に有意な骨量減少は、１４日後の近位脛骨骨幹端、６０日後の脊椎体、及び３０日後の大腿骨頸部で見られる（例えば、Ｌｅｌｏｖａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ５８（５）：４２４－３０（２００８）を参照されたい）。

【0219】

ペプチドは、実験用ラットに皮下注射によって毎日投与される（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄｓｓｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ ８９（６）：６７４－７７（２０１８）を参照）。骨密度は、デンシトメトリー及びマイクロコンピューター断層撮影法（ＭｉｃｒｏＣＴ）によって非侵襲的に測定され、組織形態計測、及び３点曲げ、４点曲げ、ねじり試験を含む機械的強度評価により、侵襲的に測定される。

【0220】

ＰＴＨＲを介してシグナル伝達するペプチド（例えば、ＰＴＨＲのアゴニスト又はバイアス型シグナル伝達アゴニスト）は、卵巣摘出ラットの骨量減少の低下を導き、したがって、未処置の対照動物と比較して骨密度及び骨強度を増加させると予想される。

【0221】

実施例５．骨粗鬆症を有するヒト患者の処置
患者は、骨粗鬆症を有するか、又はそのリスクがあると診断され、例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定法によって評価された骨塩量Ｔスコアが－２．５以下且つ－５．０を超える４９～８６歳の閉経後の女性である（Ｍｉｌｌｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ３１６（７）：７２２－３３（２０１６）を参照されたい）。患者は、本明細書に記載のペプチド、例えば、ＰＴＨＲのアゴニスト又はＰＴＨＲのバイアス型シグナル伝達アゴニストによる処置を処方される。

【0222】

ＰＴＨＲアゴニストの投与及び骨密度評価のための方法は、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ＰＤ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ３１６（７）：７２２－３３（２０１６）に記載されている。ペプチドは皮下注射で毎日投与され、患者の骨塩量は、二重エネルギーＸ線吸収測定法によってモニターされる。

【0223】

実施例６．生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイ
合成：ペプチドは、標準的な合成方法を使用してＧｅｎｓｃｒｉｐｔで合成し、ＴＦＡを使用して精製した。ペプチドは凍結乾燥して出荷され、使用前にＤＭＳＯに再懸濁された。

【0224】

ａ）β－アレスチン動員の測定
２００万／ｍＬの密度のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ－３２１６，ＡＴＣＣ，ＶＡ）に、ポリエチレンイミン（０．８μＬ／ウェル）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ）を使用して、ベータ－アレスチン１又はベータ－アレスチン２－Ｒｌｕｃ ｃＤＮＡ（１ｎｇ／ウェル）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）及びＦｌａｇ－ＰＴＨＲ１－ＹＦＰ ｃＤＮＡ（１９９ｎｇ／ウェル）（Ｇｅｎｗｉｚ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの１８～２４時間後、ルシフェラーゼ基質セレンテラジン（ＮａｎｏＬｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＡＺ）を細胞に添加し、５分間のインキュベーション後にベースラインＢＲＥＴ測定を行った。次に、ＰＢＳ（０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋０．１％ＢＳＡ ＦＡＦ）で希釈したペプチドの段階希釈液を細胞に添加し、ＢＲＥＴ信号をハイブリッドマルチモードリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２，ＢｉｏＴｅｋ，ＶＴ）で２分ごとに３０分間測定した。７５個のペプチドがβ－アレスチン動員アッセイで試験された。

【0225】

ｂ）ｃＡＭＰ蓄積の測定
ＣＨＯ－Ｋ１／Ｇａ１５／ＰＴＨＲ１（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ，ＮＪ）細胞を、１０ｃｍのペトリ皿で培養し、細胞培養物のコンフルエンスが８０～８５％に達したときに回収した。細胞懸濁液（５μＬ）を３８４ウェルプレートに３，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を試験サンプル（５μＬ）又はアゴニスト（ＰＴＨ１～３４）で、室温で３０分間処理した。ｃＡＭＰ－ｄ２作業溶液（５μＬ）及び抗ｃＡＭＰ－クリプテート作業溶液（５μＬ）を細胞に添加し、室温で６０分間インキュベートした。アッセイプレートのシグナルは、ＨＴＲＦ適合リーダーであるＰｈｅｒａＳｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ，ＮＣ）で読み取られた。

【0226】

ｃ）結果
ＰＴＨＲ受容体を活性化する能力を決定するために、設計されたペプチドに対してβ－アレスチン動員及びｃＡＭＰ蓄積アッセイを実施した。ＰＴＨ１－３４は、両方のアッセイで陽性対照であった。β－アレスチン１動員アッセイでは、生成された多くのペプチドが、ＰＴＨ１～３４と比較して同様の大きさの応答を誘発することができ（例えば、Ｒ１～１０１、Ｒ１～８１、Ｒ２～１３、Ｒ２～２９、及びＲ２～３６）、一方、２つのペプチドは、β－アレスチン１のより高いレベルの動員を示した（Ｒ２～３８及びＲ２～５２）（図１）。同様に、β－アレスチン２アッセイでは、多くのペプチドが対照ペプチドと同様の活性を示し（例えば、Ｒ２～３４、Ｒ２～３３、Ｒ２～３１、Ｒ２～３０、及びＲ２～４２）、一方、９つのペプチドは、対照と比較して増加した活性を示した（Ｒ２～４８、Ｒ２～５０、Ｒ２～８、Ｒ２～１、Ｒ１～１０１、Ｒ２～２５、Ｒ２～３６、Ｒ１～８１及びＲ２～２９）（図２）。両方のＢ－アレスチンアッセイにおいて、対照ペプチドよりも低い活性を示したペプチドもあった。

【0227】

異なる程度の活性も、ｃＡＭＰ蓄積アッセイで設計されたペプチドについて観察された。このアッセイでは、対照ペプチドと比較して、より多くのペプチドが活性の増加を示し（例えば、Ｒ２～１４、Ｒ２～４０、Ｒ２～４５、Ｒ２～４３、Ｒ２～４４、Ｒ２～２４、Ｒ２～４１、Ｒ２～２２、Ｒ１～４１、Ｒ１～９４、Ｒ２～５１、Ｒ２～４７、Ｒ２～３７、Ｒ１～１０１、及びＲ１～１０３）、一方、いくつかのペプチドは、対照ペプチドと同様の活性を示した（例えば、Ｒ２～３６、Ｒ２～３５、Ｒ１～９６、Ｒ２～２７及びＲ２～２５）（図３）。

【0228】

さらなる詳細については、表７及び８を参照されたい。

【0229】

【表12】

【0230】

【表13】

【0231】

【表14】

【0232】

【表15】

【0233】

【表16】

【0234】

【表17】

【0235】

【表18】

【0236】

ペプチドによる処置は、骨密度低下の軽減、骨折のリスクの低減、及び患者の骨粗鬆症の改善につながることが期待される。

【0237】

「約」、「少なくとも」、「未満」、及び「超」など、この出願でいくつかのパラメータを説明するすべての数値範囲について、説明はまた、必然的に、列挙された値によって制限される任意の範囲を包含することを理解されたい。したがって、例えば、「少なくとも１、２、３、４、又は５」という記載は、とりわけ、１～２、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、３～４、３～５、及び４～５などの範囲も記載する。

【0238】

非特許文献及び参照配列情報など、本明細書で引用されるすべての特許、出願、又は他の参考文献について、それらは、引用される提案と同様に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれることを理解されたい。参照により組み込まれた文書と本出願との間に矛盾が存在する場合、この出願が優先する。遺伝子ＩＤ又はアクセッション番号（典型的にはＮＣＢＩアクセッション番号を参照）などの、この出願で開示される参照遺伝子配列に関連するすべての情報は、例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能的アノテーション、対立遺伝子変異体、及び参照ｍＲＮＡ（例えば、エクソン境界又は応答エレメントを含む）及びタンパク質配列（保存されたドメイン構造など）、並びに化学的参照（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ化合物、ＰｕｂＣｈｅｍ物質、又はＰｕｂＣｈｅｍバイオアッセイエントリー（構造及びアッセイなどのアノテーションを含む））を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0239】

本出願において使用される見出しは、便宜上のものであり、本出願の解釈には影響しない。

【0240】

本発明によって提供される各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えて本発明の他のすべての態様に適用可能であり、限定されないが、従属請求項によって例示され、また、実施例を含む本発明の特定の実施形態及び態様の個々の特徴（例えば、数値範囲及び例示的な実施形態を含む要素）の組み合わせ及び並べ替えを包含する。例えば、実施例に例示されている特定の実験的パラメータは、本発明から逸脱することなく、特許請求される発明において断片的に使用するために適合させることができる。例えば、開示される材料について、これらの化合物の様々な個々の及び集合的な組み合わせ及び並べ替えのそれぞれの特定の参照は明示的に開示されない場合があるが、それぞれが本明細書で具体的に企図及び説明される。したがって、要素Ａ、Ｂ、及びＣのクラス、並びに要素Ｄ、Ｅ、及びＦのクラスが開示され、要素Ａ－Ｄの組み合わせの例が開示される場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれが個別に及び集合的に企図される。したがって、この例では、Ａ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、及びＣ－Ｆの組み合わせはそれぞれ具体的に企図されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されていると見なされるべきである。同様に、これらのサブセット又は組み合わせも具体的に企図され、開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、及びＣ－Ｅのサブグループは具体的に企図されており、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ｄ、Ｅ、及びＦ；並びに例示的組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されていると見なされるべきである。この概念は、物質の組成物の要素及び組成物を作製又は使用する方法のステップを含む、この出願のすべての態様に適用される。

【0241】

本明細書の教示に従って当業者によって認識される本発明の前述の態様は、それらが先行技術に対して新規且つ非自明である限り、任意の組み合わせ又は並べ替えで主張することができる。したがって、ある要素が当業者に公知である１つ以上の参考文献に記載されている限り、それらは、とりわけ、特徴又は特徴の組み合わせの否定的な但し書き又は放棄によって、特許請求された発明から除外され得る。

【0242】

本明細書で引用されたすべての特許、公開された出願及び参考文献の教示は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0243】

例示的な実施形態が特に示され、説明されているが、当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更を行うことができることが理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2022543871000001.app

【国際調査報告】