(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-17
(54)【発明の名称】操作された核酸調節エレメントならびにその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20221007BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20221007BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221007BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221007BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221007BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221007BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221007BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20221007BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20221007BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12N7/01
C12N5/10
A61K48/00
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61K35/76
C12N15/13
C12N15/35
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503959
(86)(22)【出願日】2020-07-24
(85)【翻訳文提出日】2022-01-20
(86)【国際出願番号】 US2020043578
(87)【国際公開番号】W WO2021021661
(87)【国際公開日】2021-02-04
(31)【優先権主張番号】63/023,152
(32)【優先日】2020-05-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/879,358
(32)【優先日】2019-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/967,480
(32)【優先日】2020-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520135611
【氏名又は名称】リジェネックスバイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100103182
【弁理士】
【氏名又は名称】日野 真美
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，チュンピン
(72)【発明者】
【氏名】マクドゥーガルド，デヴィン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
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4C084AA13
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4C085BA01
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4C085GG03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZC02
4C087ZC19
(57)【要約】
本発明は、遺伝子発現を増強するように操作された核酸発現カセットに関する。新規なキメラ調節エレメントを含む発現カセットを使用したベクター及び方法を提供する。本発明は、特に、標的細胞への導入遺伝子の送達に有用であり、肝臓指向性及び筋指向性または肝臓指向性及び骨指向性の遺伝子治療に望ましい特性を付与する。さらに、本発明は、直列型エンハンサー／プロモーターエレメントを操作し、例えば、肝臓及び／または筋細胞内で導入遺伝子を発現し、様々な障害を治療するための治療薬を送達する新規な方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）Ｍｉｃ／ＢｉＫＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、ＡｐｏＥエンハンサーの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、またはＭｃｋＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、及びｂ）少なくとも１つのプロモーターがｈＡＡＴであり、前記ｈＡＡＴが、開始コドンが修飾されており（ΔＡＴＧ）、導入遺伝子に作動可能に連結された、少なくとも２つの直列に配置されたプロモーターを含む、複合核酸調節エレメントを含む組み換え発現カセット。
【請求項2】
ＴＢＧプロモーター、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５．１２プロモーター、Ｓｐ７／ＯｓｘプロモーターまたはｍｉｎＳｐ７／Ｏｓｘプロモーターを含む、請求項１に記載の組み換え発現カセット。
【請求項3】
前記核酸調節エレメントが、表１のＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２である、請求項１または２に記載の組み換え発現カセット。
【請求項4】
導入遺伝子に作動可能に連結されたＬＳＰＸ１またはＬＳＰＸ２を含む複合調節エレメントを含む、組み換え発現カセット。
【請求項5】
前記導入遺伝子が、表４Ａ～４Ｄに記載の治療薬のいずれかをコードする遺伝子または核酸である、請求項１～４のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項6】
前記導入遺伝子が、治療用抗体、またはその抗原結合断片をコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項7】
前記複合核酸調節エレメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列のセットを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項9】
さらに、前記発現カセットの両側にＡＡＶのＩＴＲを含む、請求項８に記載のベクター。
【請求項10】
前記カセットが、ＡＡＶカプシドにパッケージングするのに適する、請求項８または９に記載のベクター。
【請求項11】
請求項８～１０のいずれか１項に記載のベクターであって、（１）前記発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列を含む複合核酸調節制御エレメント、ｂ）ポリＡシグナル、ｃ）任意にイントロン、及びｄ）前記複合核酸調節エレメントが作動可能に連結される、１つ以上のＲＮＡまたはタンパク質産物をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む人工ゲノムを含む、前記ベクター。
【請求項12】
請求項８～１１のいずれか１項に記載のベクター、ならびにＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型に由来するカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子。
【請求項13】
ウイルスベクターの送達を含む、導入遺伝子の発現を増強する方法であって、前記ウイルスベクターが、５’から３’の配置で、ａ）複数のＭｉｃ／ＢｉＫエンハンサー配列、ＡｐｏＥエンハンサー配列、またはＭｃｋエンハンサー配列、ｂ）少なくとも１つの肝臓特異的プロモーター及び少なくとも１つの筋特異的プロモーターまたは少なくとも１つの骨特異的プロモーター、ただし、前記３’のプロモーターが、開始コドン修飾を含むもの、ならびにｃ）導入遺伝子を有する核酸発現カセットを含む、前記方法。
【請求項14】
前記核酸発現カセットが、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２の核酸調節エレメントを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ウイルスベクターが、静脈内または筋内に投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
導入遺伝子の発現が、血液循環中でまたは全身的に増強される、請求項１３～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
前記導入遺伝子の発現が、肝臓、骨格筋、心筋または骨において増強される、請求項１３～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
請求項１～７のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項８～１１に記載のベクターまたは請求項１２に記載のｒＡＡＶを含む、ｒＡＡＶの送達による治療方法。
【請求項19】
疾患または障害の治療を必要とする対象におけるその治療方法であって、複数のＭｉｃ／ＢｉＫエンハンサー配列、またはＡｐｏＥエンハンサー配列、またはＭｃｋエンハンサー配列を、１つ以上の肝臓特異的プロモーターの上流に有する発現カセットを含む組み換えＡＡＶ粒子の投与を含む前記方法であり、少なくとも１つの肝臓特異的プロモーターが開始コドン修飾（ΔＡＴＧ）を含み、導入遺伝子に作動可能に連結される、前記方法。
【請求項20】
前記発現カセットが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１に記載の核酸配列を含む、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記導入遺伝子が、表４Ａ～４Ｄから選択される、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記導入遺伝子が、治療用抗体、またはその抗原結合断片をコードする、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記ｒＡＡＶが、静脈内または筋内に投与される、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
以下を含む、組み換えＡＡＶを生成する方法：（ａ）以下を含む宿主細胞を培養すること：
（ｉ）両側にＡＡＶのＩＴＲが配置されたシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、ａ）Ｍｉｃ／ＢｉＫＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、ＡｐｏＥエンハンサーの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、またはＭｃｋＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、及びｂ）少なくとも１つのプロモーターがｈＡＡＴであり、前記ｈＡＡＴが、開始コドンが修飾されており（ΔＡＴＧ）、１つ以上のＲＮＡまたはタンパク質産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された、少なくとも２つの直列に配置されたプロモーターを含む、複合核酸調節エレメントを含む、前記人工ゲノム、
（ｉｉ）ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、培養中の前記宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結された前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、前記トランス発現カセット
（ｉｉｉ）前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを前記ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能、ならびに
（ｂ）前記細胞培養から、前記人工ゲノムをカプシドで包んだ組み換えＡＡＶを回収すること。
【請求項25】
前記複合核酸調節エレメントが、表１のＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
宿主細胞であって、（ｉ）両側にＡＡＶのＩＴＲが配置されたシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、ａ）Ｍｉｃ／ＢｉＫＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、ＡｐｏＥエンハンサーの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、またはＭｃｋＥの１つもしくは２つの直列に配置されたコピー、及びｂ）少なくとも１つのプロモーターがｈＡＡＴであり、前記ｈＡＡＴが、開始コドンが修飾されており（ΔＡＴＧ）、１つ以上のＲＮＡまたはタンパク質産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された、少なくとも２つの直列に配置されたプロモーターを含む、複合核酸調節エレメントを含む、前記人工ゲノム、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、培養中の前記宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結された前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、前記トランス発現カセットを含む、前記宿主細胞。
【請求項27】
前記複合核酸調節エレメントが、表１のＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２である、請求項２６に記載の宿主細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．発明の分野
本発明は、遺伝子発現を増強するように操作された核酸調節エレメント、該調節エレメントの使用方法、及びそれらの使用に関する。標的細胞に送達される導入遺伝子の上流で操作された調節エレメントを使用することにより、所望の特性が付与され、場合によっては、遺伝子治療に望ましい特性が付与される。特に、本発明は、調節エレメントが特定の細胞において導入遺伝子の発現を駆動するように、発現カセットに挿入された異種遺伝子（導入遺伝子）に作動可能に連結された核酸調節エレメントを提供する。従って、本発明はまた、組織を標的とする方法を提供し、特に、該操作された調節エレメントを含む発現カセットは、肝臓及び／または心臓組織を含めた筋肉、または肝臓及び／または骨の組織において、導入遺伝子の発現を改善するとともに、様々な障害の治療のための治療薬を全身的に送達する。さらに、本発明は、直列型エンハンサー／プロモーターエレメントを操作する、ならびに特に肝臓細胞及び／または筋細胞内で導入遺伝子を発現する新規な方法に関する。
本発明は、遺伝子発現を増強するように操作された核酸調節エレメント、該調節エレメントの使用方法、及びそれらの使用に関する。標的細胞に送達される導入遺伝子の上流で操作された調節エレメントを使用することにより、所望の特性が付与され、場合によっては、遺伝子治療に望ましい特性が付与される。特に、本発明は、調節エレメントが特定の細胞において導入遺伝子の発現を駆動するように、発現カセットに挿入された異種遺伝子（導入遺伝子）に作動可能に連結された核酸調節エレメントを提供する。従って、本発明はまた、組織を標的とする方法を提供し、特に、該操作された調節エレメントを含む発現カセットは、肝臓及び／または心臓組織を含めた筋肉、または肝臓及び／または骨の組織において、導入遺伝子の発現を改善するとともに、様々な障害の治療のための治療薬を全身的に送達する。さらに、本発明は、直列型エンハンサー／プロモーターエレメントを操作する、ならびに特に肝臓細胞及び／または筋細胞内で導入遺伝子を発現する新規な方法に関する。
【背景技術】
【0002】
２．背景
遺伝子発現を駆動するための調節エレメントの使用は、非常に複雑である。天然に存在する及び合成の両調節エレメント、例えば、エンハンサー及びプロモーターが、当技術分野で報告されている。異種遺伝子の発現用に操作された複数のエレメントが、個々の異常な、不安定な及び／または競合する転写物を所与の組織環境で産生するかどうかは分かっていない。
遺伝子発現を駆動するための調節エレメントの使用は、非常に複雑である。天然に存在する及び合成の両調節エレメント、例えば、エンハンサー及びプロモーターが、当技術分野で報告されている。異種遺伝子の発現用に操作された複数のエレメントが、個々の異常な、不安定な及び／または競合する転写物を所与の組織環境で産生するかどうかは分かっていない。
【0003】
生産性が高くかつ安定な遺伝子発現ベクターは、遺伝子治療に適し得る。ＡＡＶまたは他のウイルスベクターによって送達される導入遺伝子は、長期の遺伝子発現を提供することを目的とし、ひいては、バイオ医薬的導入遺伝子の全身発現レベルまたは血清半減期を増加させ得る。従って、遺伝子治療のための改善された遺伝子発現系は、バイオ医薬品の、例えば、酵素補充療法での直接注入と比較して、患者にとって大いに有益であろう。ゲノムＤＮＡを運ぶＡＡＶカプシドタンパク質は、標的細胞にＤＮＡを送達するための特定の組織指向性を付与することができるが、その低い免疫原性のため、肝臓の目的の遺伝子をより大量に発現させることが望ましい（Ｐａｓｔｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１１，Ｊｕｌｙ １９９９、印刷前のオンライン版）。
【0004】
従って、バイオ医薬品の肝臓及び心筋を含めた筋肉、または肝臓及び骨での発現が、該タンパク質の血清濃度及び全身送達を高めるために望ましいであろう。肝臓、骨、心筋及び／または骨格筋で生産性の高い組織標的化遺伝子発現及びベクターが依然として必要である。
【発明の概要】
【0005】
３．発明の概要
提供するのは、肝臓において、及び、ある特定の実施形態では、骨格筋を含み、実施形態では、心（ｈｅａｒｔ）もしくは心（ｃａｒｄｉａｃ）筋も含み得る筋肉においても、または骨組織において、遺伝子発現を増強または指示するための複合核酸調節エレメントを含む組み換え発現カセットであり、これは、導入遺伝子に作動可能に連結された少なくとも２つのエンハンサー及び少なくとも２つのプロモーター、特に、表１に記載のものを含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、直列に配置された２つのプロモーターを含み、その下流または３’のプロモーターは、開始コドンが修飾される（例えば、開始コドンが削除される（ΔＡＴＧ））。
提供するのは、肝臓において、及び、ある特定の実施形態では、骨格筋を含み、実施形態では、心（ｈｅａｒｔ）もしくは心（ｃａｒｄｉａｃ）筋も含み得る筋肉においても、または骨組織において、遺伝子発現を増強または指示するための複合核酸調節エレメントを含む組み換え発現カセットであり、これは、導入遺伝子に作動可能に連結された少なくとも２つのエンハンサー及び少なくとも２つのプロモーター、特に、表１に記載のものを含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、直列に配置された２つのプロモーターを含み、その下流または３’のプロモーターは、開始コドンが修飾される（例えば、開始コドンが削除される（ΔＡＴＧ））。
【0006】
提供するのは、直列に配置された２つのプロモーターを含む複合核酸調節エレメントを含む組み換え発現カセットであり、該プロモーターの一方は、ｈＡＡＴプロモーターであり、ある特定の実施形態では、該ｈＡＡＴプロモーターは、該配置内では下流プロモーターであり、開始コドンが修飾され（開始コドンが削除される、すなわち、ΔＡＴＧ）、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、直列に配置された２つのプロモーターを含み、該プロモーターの一方は、ＴＢＧであり、実施形態では、該ＴＢＧプロモーターは、下流プロモーターであり、開始コドンが修飾され（ΔＡＴＧ）、該核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、第二のプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーター、ＴＢＧプロモーター、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｍｉｎＳｐｃ５．１２プロモーター、Ｓｐ７／ＯｓｘプロモーターまたはｍｉｎＳｐ７／Ｏｓｘである。該複合核酸調節エレメントは、さらに、１つ以上のエンハンサーエレメントを含み、これらとしては、ＡｐｏＥエンハンサーの１つまたは２つのコピー（直列に配置された２つのコピーを含む）、Ｍｉｃ／Ｂｉｋｅの１つまたは２つのコピー（直列に配置された２つのコピーを含む）、ＭｃｋＥの１つまたは２つのコピー（直列に配置された２つのコピーを含む）、または直列に配置されたＭｈｃＥ及びＭｃｋＥのコピーが挙げられる。
【0007】
いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、ａ）２つの直列型のＭｉｃ／ＢｉＫＥのコピー、２つの直列型のＡｐｏＥエンハンサーのコピー、２つもしくは３つの直列型のＭｃｋＥのコピー、または直列型の１つのＭｈｃＥのコピーと１つのＭｃｋＥのコピー、ｂ）１つのプロモーターまたは、一実施形態では、直列に配置され、少なくとも１つのプロモーターがｈＡＡＴプロモーターであり（実施形態では、３’プロモーター）、これが、任意に、開始コドンが修飾または削除されている（ΔＡＴＧ）、２つのプロモーターを含み、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、またはＬＴＰ３を含み、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、またはＬＭＴＰ２０を含み、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２を含み、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。該導入遺伝子は、表４Ａ～４Ｄに記載されるがこれらに限定されない治療用タンパク質をコードする遺伝子または核酸のいずれか１つであり得る。ある特定の実施形態では、該導入遺伝子は、完全長重鎖及び軽鎖を有するか、または抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片を有する治療用抗体をコードする。
【0008】
提供するのは、肝臓における遺伝子発現を増強及び／または指示するための複合核酸調節エレメントであり、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列を含む。
【0009】
同様に提供するのは、複数の（例えば、２、３、または４つの）Ｍｉｃ／ＢｉＫエンハンサー配列、Ｍｃｋエンハンサー配列、もしくはＭｈｃＥ配列または１つ以上のＡｐｏＥ（１、２または３つのＡｐｏＥ配列）を、複数の組織特異的プロモーターの上流（すなわち、５’）に含み、任意に、その下流の組織特異的プロモーター（すなわち、導入遺伝子に最も近い組織特異的プロモーター）を含むが、第一の組織特異的プロモーター（すなわち、最も５’側の組織特異的プロモーター）は、開始コドンが修飾（ΔＡＴＧ）されていない発現カセットを含むベクターである。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、標的組織において、導入遺伝子、例えば、治療用抗体、例えば、完全長抗体または抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片を含めた表４Ａ～４Ｄに記載されるがこれらに限定されない導入遺伝子の発現を指示する。いくつかの実施形態では、該ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列を含むまたはそれからなる複合核酸調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列を含むまたはそれからなる複合核酸調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、対象に投与された後、肝臓で発現される。いくつかの実施形態では、該ベクターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の核酸配列を含むまたはそれからなる複合核酸調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、対象に投与された後、肝臓で、筋肉におけるよりも多量に発現される（例えば、ウイルスゲノムあたりの検出タンパク質が多い）。いくつかの実施形態では、該ベクターは、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６の核酸配列を含むまたはそれからなる複合核酸調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、対象に投与された後、肝臓ならびに、骨格筋及び、実施形態では、心筋も含む筋肉の両方で発現される。いくつかの実施形態では、該ベクターは、配列番号３０または配列番号３１の核酸配列を含むまたはそれからなる複合核酸調節エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、該導入遺伝子は、対象に投与された後、肝臓及び骨の両方で発現される。
【0010】
同様に提供するのは、導入遺伝子の発現を増強する方法であり、ウイルスベクターの送達を含み、該ウイルスベクターは、５’から３’の配置で、ａ）Ｍｉｃ／ＢｉＫエンハンサー配列、ＡｐｏＥエンハンサー配列、Ｍｃｋエンハンサー配列、またはＭｈｃエンハンサー配列から選択される、複数の、例えば、２つまたは３つの配列、ｂ）１つ以上の、例えば、２つの肝臓特異的プロモーター、ただし、少なくとも１つの肝臓特異的プロモーター、例えば、１つの肝臓特異的プロモーターが、開始コドン修飾を含むもの、及びｃ）導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、提供するのは、ｒＡＡＶ配列を含む本明細書に記載の操作された発現カセットを組み込んだウイルスベクターである。
【0011】
同様に提供するのは、導入遺伝子の発現を増強する方法であり、ウイルスベクターの送達を含み、該ウイルスベクターは、５’から３’の配置で、ａ）１つ以上の、例えば、２つまたは３つのＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）１つ以上の、例えば、２つの骨特異的プロモーター、例えば、Ｓｐ７またはＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター、ｃ）１つ以上の、例えば、２つの肝臓特異的プロモーター、任意に、少なくとも１つの肝臓特異的プロモーター、例えば、１つの肝臓特異的プロモーターが、開始コドン修飾を含むもの、及びｄ）導入遺伝子を含む核酸発現カセットを含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、提供するのは、ｒＡＡＶを含む本明細書に記載の操作された発現カセットを組み込んだウイルスベクターである。
【0013】
別の態様では、本明細書に記載の核酸発現カセットを含むｒＡＡＶの送達による治療方法も提供する。少なくとも１つの肝臓特異的プロモーターが開始コドン修飾を含む、１つ以上の、例えば、２つの肝臓特異的プロモーターの上流に、複数の、例えば、２つもしくは３つのＭｉｃ／ＢｉＫエンハンサー配列、またはＡｐｏＥエンハンサー配列、またはＭｃｋエンハンサー配列を有し、かつ導入遺伝子を有する発現カセットを含む組み換えＡＡＶ粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療を必要とする対象におけるその治療方法を提供する。同様に提供するのは、１つ以上のＡｐｏＥエンハンサー配列、１つ以上の骨特異的プロモーター、例えば、Ｓｐ７またはＳｐ７／Ｏｓｘプロモーター、少なくとも１つの肝臓特異的プロモーターが開始コドン修飾を含む、１つ以上の肝臓特異的プロモーター、及び導入遺伝子を有する発現カセットを含む組み換えＡＡＶ粒子を投与することを含む、疾患または障害の治療を必要とする対象におけるその治療方法である。
【0014】
同様に提供するのは、導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に記載の複合核酸調節エレメントを含む、ＡＡＶによる発現カセットを含む組み換えＡＡＶベクターを生成する方法である。該方法は、両側にＡＡＶのＩＴＲが配置された人工ゲノムを含み、かつ該導入遺伝子に作動可能に連結された核酸調節エレメント、ならびに培養中の宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセット、ならびに該人工ゲノムの複製及びパッケージングを該ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む該宿主細胞を培養すること、ならびに、該細胞培養から、該人工ゲノムをカプシドで包んだ組み換えＡＡＶを回収することによる。本明細書に記載の組み換えＡＡＶを生成するための宿主細胞もまた提供する。
【0015】
本発明を、以下に、筋（骨格筋及び／または心筋）特異的または骨特異的エンハンサー及びプロモーターを含むまたは含まず、下流のエレメントがそれらの翻訳開始部位で修飾されている、直列型のいくつかの肝臓特異的エンハンサー及びプロモーターに基づいて設計された複合調節エレメントで操作された遺伝子カセットの構造及び機能を記載する例によって説明する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
４．図面の簡単な説明
【図1】組み換え核酸調節エレメント、特に、発現カセットで用いるためのプロモーター及びエンハンサー配列の構造を示す。
【図2】肝臓細胞におけるＧＦＰ発現の指標としての相対蛍光を示す。ＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、及びＬＴＰ３プロモーターを有する構築物のすべてが肝臓特異性を維持している。
【図3】筋細胞におけるＧＦＰ発現の指標としての相対蛍光を示す。二重特異性構築物ＬＭＴＰ６は、筋特異性を維持しているが、ＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、及びＬＴＰ３プロモーターは、筋細胞での発現を促進するとは思われない。
【図5】組み換え核酸調節エレメント、特に、二重特異性プロモーターＬＭＴＰ６の構造を示す。
【図6】肝臓細胞におけるＧＦＰ発現の指標としての相対蛍光を示す。二重特異性構築物ＬＭＴＰ６は、肝臓特異性を維持しているが、ＣＫ８対照プロモーターはサイレントである。
【図7】ＬＭＴＰ６プロモーターによって肝臓細胞で駆動されるＧＦＰ発現の様々な指標を示す。
【図8】Ａ及びＢは、組み換え核酸調節エレメント、特に、発現カセットで用いるためのプロモーター及びエンハンサー配列、特に、肝臓／筋肉（Ａ）及び肝臓／骨（Ｂ）の二重特異性調節エレメントの構造を示す。
【図9】Ａ及びＢは、筋細胞由来の細胞株であるＣ２Ｃ１２において、異なる調節エレメントによって駆動されるＧＦＰ発現を示す。（Ａ）３種の肝臓／筋二重特異性調節エレメント（ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、及びＬＭＰＴ１５）のｅＧＦＰ強度としての活性を、筋特異的プロモーターＳｐｃ５．１２及びｍｉｎＳｐｃ５．１２と比較して示す。肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴ及び陰性対照も示されている。（Ｂ）４種の肝臓／筋二重特異性調節エレメント（ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、及びＬＭＰＴ２０）の活性（ＧＦＰの発現レベル）を、筋特異的プロモーターＣＫ８及び肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴと比較して示す。
【図10】抗血漿カリクレイン抗体（ｐＫａｌ、本明細書では「Ｍａｂ１」と呼ばれる）のＣ２Ｃ１２筋細胞における発現を、異なる調節エレメント、すなわち、ＣＡＧ、ＬＭＴＰ６、及びｈＡＡＴの制御下、該モノクローナル抗体を発現する異なるシスプラスミドで該細胞を形質導入した後に示す。抗体タンパク質を検出するために、形質導入後、これらの細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｆｃ（ＩｇＧ）抗体で処理した。調べたすべての条件下での細胞のコンフルエンシー及び生存率を確認するためにＤＡＰＩ染色が示されている。
【図11A】Ｃ／５７ＢＬ６マウスに、異なる肝臓特異的、肝臓直列及び肝臓・筋調節エレメント（表１参照）によって調節されるｐＫａｌ抗体（Ｍａｂ１）をコードするＡＡＶ８ベクターを２．５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ静脈内注射した際のＭａｂ１の血清発現レベル（μｇ／ｍｌ）。ＣＡＧ（配列番号１７）及びＴＢＧ（配列番号１０）プロモーターを対照として使用した。注射の１、３、５及び７週後の採血からのデータを示す。ＬＳＰＸ１、肝臓特異的プロモーター１（配列番号１）、ＬＳＸＰ２、肝臓特異的プロモーター２（配列番号２）、ＬＴＰ１、肝臓特異的直列型プロモーター１（配列番号３）、ＬＭＴＰ６、肝臓と筋肉の二重特異性直列型プロモーター６（配列番号６）。タンパク質発現レベルは、２週間に一度の血清採取からＥＬＩＳＡによって定量化した。ベクターあたりのマウスＮ＝５。ｘ軸の数字は、ベクター投与後の週数を表す。データは平均＋ＳＥＭを表す。
【図11B】肝臓におけるウイルスゲノムの定量化。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、異なる肝臓特異的、肝臓直列及び肝臓・筋調節エレメント（表１参照、ＣＡＧ（配列番号１７）及びＴＢＧ（配列番号１０）プロモーターを対照として使用した）によって駆動されるＡＡＶ８ベクターを等用量（２．５ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ）静脈内投与した。１群あたりのマウスＮ＝５。ベクターＤＮＡを、ベクター投与の４９日後に採取されたマウス肝臓サンプルにて、ｄｄＰＣＲで分析した。データは平均＋ＳＥＭを表す。
【図12】Ａは、Ｃ／５７ＢＬ６マウスの抗血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）抗体（Ｍａｂ１）の血清発現レベル（μｇ／ｍｌ）を、異なる調節エレメント、すなわち、ＣＡＧ、ＬＭＴＰ６、及びｈＡＡＴの制御下、Ｍａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクター２．５Ｅ１２ｇｃ／ｋｇを静脈内注射した後に示す。ＣＡＧプロモーターを対照として使用した。注射の７、２１、及び３５日後の採血からのデータを示す。Ｂは、異なる調節エレメント、すなわち、ＣＡＧ、ＬＭＴＰ６、及びｈＡＡＴの制御下、Ｍａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクター２．５Ｅ１２ｇｃ／ｋｇをＣ／５７ＢＬ６マウスに静脈内注射した後の肝臓及び心臓の導入遺伝子の発現を示す。定量化は、抗ｐＫａｌ ｍＲＮＡコピーのｄｄＰＣＲ分析で行い、全組織でＧＡＰＤＨに正規化した。
【図13A】マウスへのＡＡＶ８送達後の血清抗カリクレイン（ｐＫａｌ）抗体（Ｍａｂ１）濃度。該ｐＫａｌ抗体発現は、ＣＡＧ、ｈＡＡＴまたはＬＭＴＰ６プロモーターに制御されている。動物は、５ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇの両側注射をＧＡ筋に受けた。血清を２週間に一度採取し、ｐＫａｌ抗体濃度をＥＬＩＳＡで定量化した。
【図13B】デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるＧＡ筋、肝臓及び心臓組織からのベクターゲノムの定量化。
【図13C】肝臓からのｐＫａｌ抗体発現のｍＲＮＡとしての比較。データは、ΔΔＣＴ法によって定量化した相対的な遺伝子発現倍数（ｍＲＮＡレベル）を表す。
【図13D】デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用したＧＡ筋、肝臓及び心臓組織からのＡＡＶ導入遺伝子発現の比較。抗ｐＫａｌ抗体のｍＲＮＡコピーを、全組織でＧＡＰＤＨのｍＲＮＡコピーに正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は、一元配置分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙＨＳＤ事後検定を使用して決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図14】表示されているプロモーターを含む異なる構築物でＨｕｈ－７細胞（肝細胞）を形質導入した後に分泌されたリソソーム酵素のタンパク質前駆体の発現レベルを示す。Ｖ１、導入遺伝子配列をコドン最適化した。Ｖ２、導入遺伝子配列をコドン最適化し、ＣｐＧを枯渇させた。
【図15】ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇによるオープンソースのデータ分析ツールを介した配列データの処理及び分析ならびに標準的な計算及びデータ分類ツールを使用したそれらの開始位置によるリードの最終的な集計のフローチャートを示す。
【図16A】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される肝臓細胞での翻訳開始部位を示す。
【図16B】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される筋細胞での翻訳開始部位を示す。
【図16C】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される筋細胞での翻訳開始部位を示す。
【図16D】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される肝臓細胞での翻訳開始部位を示す。
【図16E】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される筋細胞での翻訳開始部位を示す。
【図16F】プロモーター構築物ならびにＲＡＣＥ及びＮＧＳによって特定される肝臓細胞での翻訳開始部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
５．詳細な説明
本発明者らは、一つには、組織特異性を維持または付与しながら、導入遺伝子発現を改善するのに適した発現カセットにおけるプロモーター配列とエンハンサー配列の独自の組み合わせを提供している。提供するのは、治療で用いるためのｒＡＡＶを含む本明細書に記載の操作された発現カセットを組み込んだベクター、例えば、ウイルスベクター、ならびにそれを生成するための方法及び宿主細胞である。新規な調節エレメント核酸を、潜在的な「ＡＴＧ」開始部位の３’プロモーター配列を枯渇させることにより、直列型プロモーター（すなわち、同じ導入遺伝子の発現を駆動する２つのプロモーター配列）からの導入遺伝子発現を改善する新たな方法によって生成した。このアプローチを、直列型組織特異的プロモーターカセット（例えば、肝臓を標的とするもの）ならびに少なくとも２つの別々の組織集団（例えば、肝臓ならびに骨格筋及び／または心筋、または肝臓及び骨）で二重発現を達成するためのプロモーターカセットからの導入遺伝子発現を改善するために採用した。最終的に、これらの設計は、より堅牢なレベルの導入遺伝子発現、安定性／持続性の改善、及び導入遺伝子産物に対する免疫寛容の誘導を提供することによって、遺伝子導入の治療効果を改善する可能性がある。
本発明者らは、一つには、組織特異性を維持または付与しながら、導入遺伝子発現を改善するのに適した発現カセットにおけるプロモーター配列とエンハンサー配列の独自の組み合わせを提供している。提供するのは、治療で用いるためのｒＡＡＶを含む本明細書に記載の操作された発現カセットを組み込んだベクター、例えば、ウイルスベクター、ならびにそれを生成するための方法及び宿主細胞である。新規な調節エレメント核酸を、潜在的な「ＡＴＧ」開始部位の３’プロモーター配列を枯渇させることにより、直列型プロモーター（すなわち、同じ導入遺伝子の発現を駆動する２つのプロモーター配列）からの導入遺伝子発現を改善する新たな方法によって生成した。このアプローチを、直列型組織特異的プロモーターカセット（例えば、肝臓を標的とするもの）ならびに少なくとも２つの別々の組織集団（例えば、肝臓ならびに骨格筋及び／または心筋、または肝臓及び骨）で二重発現を達成するためのプロモーターカセットからの導入遺伝子発現を改善するために採用した。最終的に、これらの設計は、より堅牢なレベルの導入遺伝子発現、安定性／持続性の改善、及び導入遺伝子産物に対する免疫寛容の誘導を提供することによって、遺伝子導入の治療効果を改善する可能性がある。
【0018】
５．１．定義
「調節エレメント」または「核酸調節エレメント」という用語は、隣接する遺伝子の転写を制御する非コード核酸配列である。シス調節エレメントは、通常、転写因子に結合することによって、遺伝子転写を調節する。これには、本明細書に記載の複数のエンハンサーまたはプロモーターエレメントを含む「複合核酸調節エレメント」が含まれる。
「調節エレメント」または「核酸調節エレメント」という用語は、隣接する遺伝子の転写を制御する非コード核酸配列である。シス調節エレメントは、通常、転写因子に結合することによって、遺伝子転写を調節する。これには、本明細書に記載の複数のエンハンサーまたはプロモーターエレメントを含む「複合核酸調節エレメント」が含まれる。
【0019】
「発現カセット」または「核酸発現カセット」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び／または調節エレメント、イントロン及びポリアデニル化配列が挙げられるがこれらに限定されない、１つ以上の転写制御エレメントを含む核酸分子を指す。該エンハンサー及びプロモーターは、通常、１つ以上の所望の細胞型、組織または器官において（導入）遺伝子発現を指示するように機能する。
【0020】
「作動可能に連結された」及び「～に作動可能に連結された」という用語は、連結されている、通常は隣接しているか、または実質的に隣接している核酸配列であり、必要に応じて、隣接した、リーディングフレーム内にある２つのタンパク質コード領域をつなぐ該核酸配列を指す。しかしながら、エンハンサーは一般に、プロモーターから数キロベース隔てられた場合に機能し、イントロン配列は可変長のものであり得るため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結され、下流のプロモーター及び導入遺伝子と直接隣接していなくてもなお機能し得る。
【0021】
「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」という用語は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ属ウイルス内のＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶであっても、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来する及び／または天然に存在しないカプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を含むカプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであってもよい。後者の例としては、天然に存在するカプシドのアミノ酸配列内にペプチド挿入物または該アミノ酸配列の修飾を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶが挙げられる。
【0022】
「ｒＡＡＶ」という用語は、「組み換えＡＡＶ」を指す。いくつかの実施形態では、組み換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部またはすべてが異種配列で置き換えられたＡＡＶゲノムを有する。
【0023】
「ｒｅｐ－ｃａｐヘルパープラスミド」という用語は、ウイルスのｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子機能を提供し、機能的ｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子配列を欠くｒＡＡＶゲノムからのＡＡＶの生成を補助するプラスミドを指す。
【0024】
「ｃａｐ遺伝子」という用語は、ウイルスのカプシド被覆を形成するまたは形成するのを補助するカプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であり得る。
【0025】
「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ウイルスの複製及び生成に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列を指す。
【0026】
「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のアナログが含まれる。かかるアナログは、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基が挙げられるがこれらに限定されないヌクレオチドアナログを使用して生成され得る。かかるアナログはまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の向上等の分子に有益な属性を与える修飾骨格を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。該核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖の場合も二本鎖の場合もあり、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含んでもよく、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【0027】
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、同義で使用される。本明細書で使用される、対象は、好ましくは、哺乳類、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）または霊長類（例えば、サル及びヒト）、最も好ましくは、ヒトである。
【0028】
「治療薬」または「バイオ医薬品」という用語は、疾患または障害に関連する症状を治療、管理、または改善する際に使用され得る任意の薬剤を指し、該疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能に関連する。本明細書で使用される、「治療有効量」とは、標的疾患または障害の治療または管理において、それに罹患している対象に投与された場合に少なくとも１つの治療効果を提供する薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される生成物の量）を指す。さらに、本発明の薬剤に関する治療有効量は、単独での、または他の治療と組み合わせた場合の薬剤の量が、疾患または障害の治療または管理において少なくとも１つの治療効果を提供することを意味する。
【0029】
「肝臓特異的」または「肝臓指向性」という表現は、核酸エレメントと肝細胞の細胞内環境との相互作用に起因する肝臓（肝）細胞または組織でのそれらの活性を適応させたかかる核酸エレメントを指す。肝臓は、肝臓組織に送達される遺伝子治療及び肝臓での発現が増強した遺伝子カセットがバイオ医薬品（翻訳されたタンパク質）を産生し、これが血液循環に分泌されるという観点から、体内の生物反応器または「貯蔵所」として機能する。従って、バイオ医薬品は、肝臓発現によって、全身的に対象に送達される。いかなる理論にも拘束されるものではないが、バイオ医薬品の肝臓産生（例えば、送達された導入遺伝子によって産生される）は、当該薬剤に免疫寛容を与えることができ、該タンパク質を産生する当該対象の内因性Ｔ細胞は、該タンパク質を自己タンパク質として認識し、自然免疫応答を誘発しない。
【0030】
「骨特異的」または「骨指向性」という表現は、核酸エレメントと骨細胞の細胞内環境との相互作用に起因する様々な細胞型及びコラーゲン性細胞外有機マトリックスを含めた骨細胞（例えば、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞及び骨ライニング細胞）または組織でのそれらの活性を適応させたかかる核酸エレメントを指す。導入遺伝子産物の骨、筋肉及び／または血流への分泌は、様々な経路のｒＡＡＶ投与、例えば、静脈内または筋内投与後に、骨特異的プロモーターが存在する骨での発現に起因して増強され得る。様々な治療薬が、導入遺伝子の骨特異的発現、または導入遺伝子の骨特異的及び肝臓特異的の両発現から恩恵を受ける。バイオ医薬品の骨産生（例えば、送達された導入遺伝子によって産生される）は、等量のタンパク質薬剤を当該宿主に直接注射した場合と比較して、該宿主に当該薬剤に対する免疫寛容の増加もまたもたらし得る。
【0031】
「筋特異的」または「筋指向性」という表現は、核酸エレメントと筋細胞の細胞内環境との相互作用に起因する筋細胞または組織でのそれらの活性を適応させたかかる核酸エレメントを指す。筋細胞は、骨格筋及び心筋を含む。導入遺伝子産物の筋肉、及び／または血流への分泌はまた、様々な経路の投与、例えば、静脈内または筋内投与後に、筋特異的プロモーターが存在する筋内発現に起因して増強され得る。様々な治療薬が、導入遺伝子の筋特異的発現、または導入遺伝子の筋特異的及び肝臓特異的の両発現から恩恵を受ける。バイオ医薬品の筋産生（例えば、送達された導入遺伝子によって産生される）は、等量のタンパク質薬剤を当該宿主に直接注射した場合と比較して、該宿主に当該薬剤に対する免疫寛容の増加もまたもたらし得る。
【0032】
５．２．調節エレメント
１つの態様は、発現カセットにおいて直列型のエレメントの配置に関してキメラである核酸調節エレメントに関する。調節エレメントは、一般に、転写の開始または調節、シグナル伝達時に発現を駆動するための細胞特異的機構との連携、及び下流の遺伝子の発現を増強するための認識部位として、複数の機能を有する。
１つの態様は、発現カセットにおいて直列型のエレメントの配置に関してキメラである核酸調節エレメントに関する。調節エレメントは、一般に、転写の開始または調節、シグナル伝達時に発現を駆動するための細胞特異的機構との連携、及び下流の遺伝子の発現を増強するための認識部位として、複数の機能を有する。
【0033】
提供するのは、肝臓及び筋（骨格筋及び／または心筋）組織または肝臓及び骨組織で導入遺伝子の発現を促進する核酸調節エレメントの組み合わせの配置である。特に、ある特定のエレメントは、直列に配置された個々のエンハンサー及びプロモーターエレメントの２つ以上のコピーで配置され、導入遺伝子に作動可能に連結され、発現、特に組織特異的発現を促進する。個々のプロモーター及びエンハンサーエレメントの例示的な核酸配列を表１に提供する。表１に同様に提供するのは、該個々の直列型プロモーター及びエンハンサーエレメントを含む例示的な複合核酸調節エレメントである。ある特定の実施形態では、下流のプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターであり（ある特定の実施形態では、該ｈＡＡＴプロモーターは、ｈＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーターである）、他のプロモーターは、別のｈＡＡＴプロモーターであるか、またはＴＢＧプロモーターである）。
【0034】
従って、肝臓及び筋特異的発現に関して、提供するのは、プロモーター及び／または他の核酸エレメント、例えば、肝臓発現を促進するエンハンサー、例えば、ＡｐｏＥエンハンサー、Ｍｉｃ／ＢｉＫＥエレメントまたはｈＡＡＴプロモーターを含むまたはそれらからなる核酸調節エレメントである。これらは、単一のコピーとして、または２つ以上のコピーとして直列に含まれ得る。核酸調節エレメントはまた、該肝臓特異的発現を促進する１つ以上のエレメントに加えて、筋特異的発現（骨格筋及び／または心筋を含む）を促進する１つ以上のエレメント、例えば、ＭｃｋＥエレメントの１つ以上のコピー、例えば、２つのコピーを含んでもよく、これは、直列型の２つ以上のコピーとして配置してもよく、ＭｃｋＥエレメントとＭｈｃＥエレメントを直列に配置してもよい。ある特定の実施形態では、あるプロモーターエレメントは、その開始部位を削除され、その部位での翻訳開始が阻止される。好ましくは、該開始コドン修飾を有するエレメントが、該核酸調節エレメントの３’末端または下流末端の、例えば、発現カセットの核酸配列内で導入遺伝子に最も近いエレメントであるプロモーターである。ある特定の実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、ｈＡＡＴプロモーター、実施形態では、下流プロモーターとして開始コドンが修飾された（ΔＡＴＧ）ｈＡＡＴ、及びｈＡＡＴプロモーター、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５．１２プロモーターまたはｍｉｎＳｐｃ５．１２プロモーターである第二のプロモーターを該ｈＡＡＴプロモーターと直列に含む。
【0035】
本明細書に提供する組み換え発現カセットは、ｉ）ａ）直列に配置されたＭｉｃ／ＢｉＫＥの２つのコピーまたは直列に配置されたＡｐｏＥの２つのコピーまたはＡｐｏＥの１つのコピーと直列に配置されたＭｉｃ／ＢｉＫＥの２つのコピー、ｂ）１つのプロモーターまたは、直列型プロモーターの実施形態では、直列に配置され、開始コドンが修飾された（ΔＡＴＧ）ｈＡＡＴの少なくとも１つのコピーを含む２つのプロモーター（ある特定の実施形態では、該ｈＡＡＴプロモーターが下流または３’プロモーターである）を含む複合核酸調節エレメント、及びｉｉ）該複合核酸調節エレメントが作動可能に連結される導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、またはＬＴＰ３を含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。該導入遺伝子は、表４Ａ～４Ｄに記載されるがこれらに限定されない治療用タンパク質をコードする遺伝子または核酸のいずれか１つであり得る。該導入遺伝子はまた、完全長抗体または抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片を含めた治療用抗体もコードし得る。
【0036】
本明細書に提供する組み換え発現カセットは、ｉ）ａ）ＡｐｏＥの１つのコピー、直列に配置されたＭｃｋＥの２つもしくは３つのコピー、直列に配置されたＭｃｋＥ、ＭｈｃＥ、及びＡｐｏＥの各々１つのコピー、または直列に配置されたＭｃｋＥの２つもしくは３つのコピーとＡｐｏＥの１つのコピー、ｂ）開始コドンが修飾された（ΔＡＴＧ）ｈＡＡＴの少なくとも１つのコピーを含む直列に配置されたプロモーターの２つのコピーを含む核酸調節エレメント、及びｉｉ）導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、第二のかつ上流のプロモーターは、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５．１２プロモーターまたはｍｉｎＳｐｃ５．１２プロモーターである。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、またはＬＭＴＰ２０を含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。該導入遺伝子は、表４Ａ～４Ｄに記載されるがこれらに限定されない治療用タンパク質をコードする遺伝子または核酸のいずれか１つであり得る。ある特定の実施形態では、該導入遺伝子は、完全長抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片を含めた治療用抗体である。
【0037】
提供するのは、肝臓における遺伝子発現を増強するための複合核酸調節エレメントであり、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列を含む。同様に含まれるのは、肝臓、及びある特定の実施形態では、同様に筋肉または骨における遺伝子発現を増強する複合調節エレメントであり、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１の核酸配列のうちの１つと、９９％、９５％、９０％、８５％または８０％の配列同一性を有する。
【0038】
従って、肝臓及び骨特異的発現に関して、提供するのは、プロモーター及び／または他の核酸エレメント、例えば、肝臓発現を促進するエンハンサー、例えば、ＡｐｏＥエンハンサー、Ｍｉｃ／ＢｉＫＥエレメントまたはｈＡＡＴプロモーターを含むまたはそれらからなる複合核酸調節エレメントである。これらは、単一のコピーとして、または２つ以上のコピーとして直列に含まれ得る。該核酸調節エレメントはまた、該肝臓特異的発現を促進する１つ以上のエレメントに加えて、骨特異的発現を促進する１つ以上のエレメント、例えば、Ｓｐ７／ＯｓｘまたはｍｉｎＳｐ７／Ｏｓｘエレメントの１つ以上のコピーを含んでもよく、これは、直列型の２つ以上のコピーとして配置されてもよい。ある特定の実施形態では、あるプロモーターエレメントは、その開始コドンを削除され、好ましくは、該開始コドン修飾を有するエレメントが、該核酸調節エレメントの３’の、例えば、導入遺伝子に最も近いエレメントであるプロモーターである。
【0039】
本明細書に提供する組み換え発現カセットは、ｉ）ａ）ＡｐｏＥの１つのコピーまたは直列に配置されたＡｐｏＥの２つのコピー、ｂ）Ｓｐ／ＯｓｘまたはｍｉｎＳｐ７／Ｏｓｘの１つのまたは直列に配置された２つのコピー、ｃ）開始コドンが修飾された（ΔＡＴＧ）ｈＡＡＴの少なくとも１つのコピーを含む、ｈＡＡＴプロモーターの１つのまたは直列に配置された２つのコピーを含む複合核酸調節エレメント、ｉｉ）該複合調節エレメントが作動可能に連結される導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、該核酸調節エレメントは、表１のＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２（配列番号３０または３１）を含む。いくつかの実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結される。該導入遺伝子は、表４Ａ～４Ｄに記載されるがこれらに限定されない治療用タンパク質をコードする遺伝子または核酸のいずれか１つであり得る。ある特定の実施形態では、該導入遺伝子は、完全長抗体またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ断片を含めた治療用抗体である。
【0040】
本明細書に記載の直列型の複合プロモーターは、該プロモーター領域内に好ましい転写開始部位をもたらす。例えば、実施例１０の結果及び表１４を参照されたい。従って、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、直列型または複合核酸調節配列を有し、これは、ｈＡＡＴプロモーター（特に、開始コドン修飾ｈＡＡＴプロモーター）を含み、ｈＡＡＴに見られる活性ＴＴＳ（配列番号１１または配列番号１２のｎｔ３５５～３５９）と重複する転写開始部位ＴＣＴＣＣ（配列番号４３）（ＬＭＴＰ６配列番号６のｎｔ１５４１～１５４５に相当）、または配列番号１１のヌクレオチド１３９～１５７に相当するＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４１）、または配列番号１２のヌクレオチド１３９～１５７に相当するＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４２）を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、直列型または複合調節配列を有し、これは、ＣＫ８プロモーターを含み、配列番号１６のヌクレオチド３７７～３８６に相当するＴＣＡＴＴＣＴＡＣＣ（配列番号４６）に転写開始部位を有し、特に、配列番号１６のヌクレオチド３７７に相当するヌクレオチドまたは配列番号６のヌクレオチド１１３３に相当するヌクレオチドから開始する。
【0041】
本発明の態様では、様々な調節エレメント及びエレメントの組み合わせを使用して、核酸発現カセットを設計及び生成した。これらを表１に記載する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【0042】
５．２．１．エンハンサー
本発明者らは、驚くべきことに、複数のエンハンサーが、直列配置に適していると同時に、１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されることを発見した。これらのエンハンサーは、直列に配置され、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結された場合に、該導入遺伝子の組織特異的発現を促進する。
本発明者らは、驚くべきことに、複数のエンハンサーが、直列配置に適していると同時に、１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されることを発見した。これらのエンハンサーは、直列に配置され、プロモーター及び導入遺伝子に作動可能に連結された場合に、該導入遺伝子の組織特異的発現を促進する。
【0043】
従って、提供するのは、ＡｐｏＥエンハンサー、特に、配列番号９のＡｐｏＥエンハンサーを含むＡｐｏＥの肝制御領域である。
【0044】
従って、提供するのは、単一のコピーまたは直列に配置された２つのコピーのいずれかとしてのアルファ－１ミクログロブリン／ビクニン（アルファ－Ｍｉｃ／Ｂｉｋ）エンハンサー（それぞれ、表１の配列番号７及び８）である。アルファ－Ｍｉｃ／Ｂｉｋのエンハンサー活性は、肝臓細胞に限定されることが分かった（Ｒｏｕｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ １５；２６７（２９）：２０７６５－７３）。
【0045】
従って、提供するのは、マウスの筋クレアチンキナーゼ遺伝子に由来する単一のコピー、または直列に配置された２つもしくは３つのコピーとしての筋特異的エンハンサー（ＭｃｋＥ）核酸エレメント（それぞれ、表１の配列番号１３、１４及び１５）である（Ｊａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｕｓｋｉｎ，Ｊ．Ｎ．，Ｇａｒｔｓｉｄｅ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ Ｈａｕｓｃｈｋａ，Ｓ．Ｄ．Ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｓｃｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：６２－７０，１９８８、及びＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｎ．番号ＡＦ１８８００２．１）。この領域からの２０６ｂｐの断片は、骨格筋エンハンサーとして機能し、心筋細胞に方向依存性の活動を与える。この配列の１１０ｂｐのエンハンサーサブ断片は、骨格筋細胞では高レベルの発現をもたらすが、心筋細胞では不活性である（Ａｍａｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３（５）：２７５３－６４）。
【0046】
同様に提供するのは、さらなる調節エレメントとともに直列に配置されるミオシン重鎖エンハンサー（ＭｈｃＥ）核酸（表１の配列番号２７）である。ミオシンは、体内で最も豊富な組織である筋肉で最も豊富なタンパク質である。骨格筋及び心筋の発現を含めた導入遺伝子の筋産生の増強は、多くの導入遺伝子のバイオ医薬効果に大いに役立つであろう。
【0047】
他のエンハンサーは、当業者に周知である。
【0048】
５．２．２． プロモーター
本発明の別の態様は、肝臓特異的発現、筋特異的発現（骨格筋または心筋特異的発現を含む）または骨特異的発現を付与または増強するように設計されたキメラ調節エレメントを含む核酸発現カセットに関する。本発明は、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、及び任意にイントロンを含めた直列の調節エレメントを操作することを含む。例としては、ＴＢＧプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＣＫ８プロモーター、及びＳｐｃ５－１２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の別の態様は、肝臓特異的発現、筋特異的発現（骨格筋または心筋特異的発現を含む）または骨特異的発現を付与または増強するように設計されたキメラ調節エレメントを含む核酸発現カセットに関する。本発明は、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、及び任意にイントロンを含めた直列の調節エレメントを操作することを含む。例としては、ＴＢＧプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＣＫ８プロモーター、及びＳｐｃ５－１２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
本明細書に提供するプロモーター配列とエンハンサー配列の独自の組み合わせは、組織特異性を維持しながら、導入遺伝子の発現を改善する。新規な調節エレメント核酸を、潜在的な「ＡＴＧ」開始部位の３’プロモーター配列を枯渇させることにより、直列型プロモーター（すなわち、同じ導入遺伝子の発現を駆動する２つのプロモーター配列）からの導入遺伝子発現を改善する方法を使用して生成した。このアプローチを、直列型組織特異的プロモーターカセット（例えば、肝臓を標的とするもの）ならびに２つの別々の組織集団（例えば、肝臓ならびに骨格筋、及びある特定の実施形態では、心筋、ならびに肝臓及び骨）で二重発現を達成するためのプロモーターカセットからの導入遺伝子発現を改善するために採用した。最終的に、これらの設計は、より堅牢なレベルの導入遺伝子発現、安定性／持続性の改善、及び導入遺伝子産物に対する免疫寛容の誘導を提供することによって、遺伝子導入の治療効果を改善することを目的とする。ある特定の態様では、開始コドンが削除されたｈＡＡＴプロモーター（ΔＡＴＧ）が、本明細書に提供する発現カセットで使用される。
【0050】
ＣＡＧプロモーター（配列番号１７）とは、以下の配列から構築されるキメラプロモーターを指す：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント（Ｃ）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター（ニワトリベータ－アクチン遺伝子の最初のエキソン及び最初のイントロン）（Ａ）、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター（Ｇ）。該ＣＡＧプロモーターは、当技術分野では、哺乳類細胞において高レベルの発現を駆動するために頻繁に使用されており、組織特異性に関して非選択的であり、それ故、通常は、汎用プロモーターとして使用される。
【0051】
同様に提供するのは、肝臓特異的発現エレメントと組み合わせて配置され得る骨特異的プロモーターである。例えば、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（配列番号３２）または最小Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（配列番号３３）断片（Ｌｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２８１，６２９７－６３０６，Ｊａｎｕａｒｙ １２，２００６、参照により全体として本明細書に組み込まれる）は、骨特異的発現を促進し、単一のコピーまたは直列に配置された２つ以上のコピーのいずれかとして、本明細書に提供する遺伝子カセットに含まれ得る。
【0052】
同様に提供するのは、ＳＰｃ５－１２プロモーターとして知られる筋特異的合成プロモーターｃ５－１２（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２４１－２４５，ＭＡＲＣＨ １９９９）である。エンハンサーまたは他のプロモーターと直列に配置され、導入遺伝子に作動可能に連結された場合に、該Ｓｐｃ５－１２プロモーターは、該導入遺伝子の筋特異的発現を駆動する。いくつかの実施形態では、該筋特異的プロモーターは、ＳＰｃ５－１２プロモーター（配列番号２８）である。
【0053】
ベクターの長さをさらに縮小するために、調節エレメントは、本明細書に記載のプロモーターのいずれか１つの縮小または短縮型（本明細書では「最小プロモーター」と呼ばれる）であることができる。最小プロモーターは、完全長型の転写活性ドメインを少なくとも含むため、なお発現を駆動することができる。例えば、いくつかの実施形態では、筋特異的プロモーターの転写活性ドメイン、例えば、最小Ｓｐｃ５－１２プロモーター（例えば、配列番号２９）は、さらなる調節エレメントと直列に配置され、治療用タンパク質導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
【0054】
５．２．３．イントロン
本発明の別の態様は、調節カセット内にイントロンを含む核酸発現カセットに関する。いくつかの実施形態では、該イントロン核酸は、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンである（β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、またはβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンとしても知られる。Ｒｅｅｄ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８９）。イントロンを使用すると、真核細胞で効率的なスプライシングがさらに誘導され得る。イントロンの使用は、既に強力なプロモーターに対して発現の増加を示さない可能性もあるが、イントロンの存在は、導入遺伝子の発現レベルを増加させ得、インビボでの発現の持続時間を延長させることもできる。
本発明の別の態様は、調節カセット内にイントロンを含む核酸発現カセットに関する。いくつかの実施形態では、該イントロン核酸は、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンである（β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、またはβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンとしても知られる。Ｒｅｅｄ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９８９）。イントロンを使用すると、真核細胞で効率的なスプライシングがさらに誘導され得る。イントロンの使用は、既に強力なプロモーターに対して発現の増加を示さない可能性もあるが、イントロンの存在は、導入遺伝子の発現レベルを増加させ得、インビボでの発現の持続時間を延長させることもできる。
【0055】
いくつかの実施形態では、該イントロンは、ＶＨ４イントロンである。ＶＨ４イントロン核酸は、以下の表２に示す配列番号１９を含み得る。該コード配列のＶＨ４イントロン５’は、適切なスプライシング、ひいては導入遺伝子の発現を増強し得る。従って、いくつかの実施形態では、イントロンは、導入遺伝子配列の５’末端に結合される。他の実施形態では、該イントロンは、１００ヌクレオチド未満の長さである。
【表2】
【0056】
他の実施形態では、該イントロンは、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンである（β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、またはβ－グロビン／ＩｇＧキメライントロンとしても知られる）（表３、配列番号１８）。当業者に周知の他のイントロン、例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸ分断イントロン１）β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン（表３、配列番号３４）を使用してもよい。
【0057】
当業者に周知の他のイントロンを使用してもよい。
【0058】
５．２．４．他の調節エレメント
５．２．４．１．ポリＡ
本開示の別の態様は、導入遺伝子のコード領域の下流にポリアデニル化（ポリＡ）部位を含む発現カセットに関する。転写の終了をシグナル伝達し、ポリＡテールの合成を指示する任意のポリＡ部位が、本開示のＡＡＶベクターでの使用に適している。例示的なポリＡシグナルは、以下に由来するが、これらに限定されない：ＳＶ４０後期遺伝子、ウサギβ－グロビン遺伝子（配列番号３６）、ウシ成長ホルモン（ＢＰＨ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位、及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｒｉｖｅｒａ－Ｓｏｔｏ，２０１５，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１９（１０２）：４９－５７を参照されたい。１つの実施形態では、該ポリＡシグナルは、表３に示す配列番号３６を含む。
５．２．４．１．ポリＡ
本開示の別の態様は、導入遺伝子のコード領域の下流にポリアデニル化（ポリＡ）部位を含む発現カセットに関する。転写の終了をシグナル伝達し、ポリＡテールの合成を指示する任意のポリＡ部位が、本開示のＡＡＶベクターでの使用に適している。例示的なポリＡシグナルは、以下に由来するが、これらに限定されない：ＳＶ４０後期遺伝子、ウサギβ－グロビン遺伝子（配列番号３６）、ウシ成長ホルモン（ＢＰＨ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位、及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｒｉｖｅｒａ－Ｓｏｔｏ，２０１５，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１９（１０２）：４９－５７を参照されたい。１つの実施形態では、該ポリＡシグナルは、表３に示す配列番号３６を含む。
【表3】
【0059】
５．３．遺伝子送達用ベクター
本発明の別の態様は、直列型核酸調節エレメントの遺伝子操作、及びこれらの核酸配列をベクター発現系に組み込むことに関する。１つの実施形態では、該ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（例えば、Ｇａｏ Ｇ．，ｅｔ ａｌ ２００３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０）：６０８１－６０８６）、レンチウイルスベクター（例えば、Ｍａｔｒａｉ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３，１６９６－７０７）、レトロウイルスベクター（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ，ＪＨ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；８７，５１７３－７）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｂｌｏｏｄ １０３，８０４－１０）、単純ヘルペスウイルスベクター（Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ ９３（２１）：１１３１９－１１３２０、Ｂａｅｚ，ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ １９－Ｕｓｉｎｇ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｅｄ．：Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｇｅｒｌａｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１８：Ｐａｇｅｓ ４４５－４７７）、及びレトロトランスポゾンベースのベクター系（例えば、Ｓｏｉｆｅｒ，２００４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（４）：３７３－３８４）が挙げられるがこれらに限定されないウイルスベクターである。別の実施形態では、該ベクターは、非ウイルスベクターである。ｒＡＡＶベクターは、ベクター粒子のパッケージング能力が限られており（すなわち、約４．７ｋｂ）、機能的ベクターを得るための該導入遺伝子の発現カセットのサイズを抑制している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｌｏｏｄ．１０８：１０７－１５）。導入遺伝子の長さ、及び直列型エンハンサー（複数可）及びプロモーター（複数可）を含む調節核酸配列の長さが、特定の導入遺伝子及び標的組織に適した調節領域を選択する際に考慮される。
本発明の別の態様は、直列型核酸調節エレメントの遺伝子操作、及びこれらの核酸配列をベクター発現系に組み込むことに関する。１つの実施形態では、該ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター（例えば、Ｇａｏ Ｇ．，ｅｔ ａｌ ２００３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０）：６０８１－６０８６）、レンチウイルスベクター（例えば、Ｍａｔｒａｉ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３，１６９６－７０７）、レトロウイルスベクター（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ，ＪＨ，ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；８７，５１７３－７）、アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｂｌｏｏｄ １０３，８０４－１０）、単純ヘルペスウイルスベクター（Ｍａｒｃｏｎｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ ９３（２１）：１１３１９－１１３２０、Ｂａｅｚ，ＭＶ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ １９－Ｕｓｉｎｇ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｅｄ．：Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｇｅｒｌａｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１８：Ｐａｇｅｓ ４４５－４７７）、及びレトロトランスポゾンベースのベクター系（例えば、Ｓｏｉｆｅｒ，２００４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（４）：３７３－３８４）が挙げられるがこれらに限定されないウイルスベクターである。別の実施形態では、該ベクターは、非ウイルスベクターである。ｒＡＡＶベクターは、ベクター粒子のパッケージング能力が限られており（すなわち、約４．７ｋｂ）、機能的ベクターを得るための該導入遺伝子の発現カセットのサイズを抑制している（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｌｏｏｄ．１０８：１０７－１５）。導入遺伝子の長さ、及び直列型エンハンサー（複数可）及びプロモーター（複数可）を含む調節核酸配列の長さが、特定の導入遺伝子及び標的組織に適した調節領域を選択する際に考慮される。
【0060】
本発明の別の態様は、導入遺伝子に作動可能に連結された表１の核酸調節エレメントＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、またはＬＴＰ３を含む発現カセットを含むウイルスベクターに関する。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５の核酸配列を含む核酸調節エレメントを含むか、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５に対して９９％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％同一であり、肝臓において該導入遺伝子の発現を増強する配列を含む核酸調節エレメントを含む。
【0061】
本発明の別の態様は、導入遺伝子に作動可能に連結された表１の核酸調節エレメントＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、またはＬＭＴＰ２０を含む発現カセットを含む組み換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５もしくは配列番号２６の核酸配列を含む核酸調節エレメントを含むか、または配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、もしくは配列番号２５もしくは配列番号２６に対して９９％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％同一であり、肝臓及び筋肉（骨格筋及び／または心筋）において該導入遺伝子の発現を増強する配列を含む核酸調節エレメントを含む。
【0062】
本発明の別の態様は、導入遺伝子に作動可能に連結された表１の核酸調節エレメントＬＢＴＰ１（配列番号３０）またはＬＢＴＰ２（配列番号３１）を含む発現カセットを含む組み換えベクターに関する。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、配列番号３０もしくは配列番号３１の核酸配列を含む核酸調節エレメントを含むか、または配列番号３０もしくは配列番号３１に対して９９％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％同一であり、肝臓及び骨において該導入遺伝子の発現を増強する配列を含む核酸調節エレメントを含む。
【0063】
別の態様では、該発現カセットは、ＡＡＶカプシドにパッケージングするのに適しており、従って、該カセットは、（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）調節制御エレメント、ａ）プロモーター／エンハンサー、例えば、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２のいずれか１つ、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意にイントロン、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子を含む。
【0064】
ある特定の実施形態では、該導入遺伝子は、表４Ａ～４Ｄのものである。無傷または実質的に無傷のｍＡｂを発現するための実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）調節制御エレメント、ａ）プロモーター／エンハンサー、例えば、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２のいずれか１つ、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意にイントロン、ならびに（３）抗Ａβ（例えば、ソラネズマブ、ＧＳＫ９３３７７６、及びレカネマブ）、抗ソルチリン（例えば、ＡＬ－００１）、抗タウ（例えば、ＡＢＢＶ－８Ｅ１２、ＵＣＢ－０１０７、及びＮＩ－１０５）、抗ＳＥＭＡ４Ｄ（例えば、ＶＸ１５／２５０３）、抗アルファシヌクレイン（例えば、プラシネズマブ、ＮＩ－２０２、及びＭＥＤ－１３４１）、抗ＳＯＤ１（例えば、ＮＩ－２０４）、抗ＣＧＲＰ受容体（例えば、エプチネズマブ、フレマネズマブ、またはガルカネズマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ、ラブリズマブ、及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ、トシリズマブ、及びサリルマブ）、抗ＩＬ６（例えば、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、及びゲリリムズマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ５Ｒ（例えば、レスリズマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、ベンラリズマブ及びメポリズマブ）、抗ＩＬ１３（例えば、トラロキヌマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＬ３１ＲＡ（例えば、ネモリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）、抗ＴＳＬＰ（例えば、ネモリズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペンブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デノスマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ランパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）の重鎖Ｆａｂ、任意に、治療用抗体の天然型と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプのアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４またはそれらの修飾Ｆｃ、ならびに抗Ａβ（例えば、ソラネズマブ、ＧＳＫ９３３７７６、及びレカネマブ）、抗ソルチリン（例えば、ＡＬ－００１）、抗タウ（例えば、ＡＢＢＶ－８Ｅ１２、ＵＣＢ－０１０７、及びＮＩ－１０５）、抗ＳＥＭＡ４Ｄ（例えば、ＶＸ１５／２５０３）、抗アルファシヌクレイン（例えば、プラシネズマブ、ＮＩ－２０２、及びＭＥＤ－１３４１）、抗ＳＯＤ１（例えば、ＮＩ－２０４）、抗ＣＧＲＰ受容体（例えば、エプチネズマブ、フレマネズマブ、またはガルカネズマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ、ラブリズマブ、及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ、トシリズマブ、及びサリルマブ）、抗ＩＬ６（例えば、シルツキシマブ、クラザキズマブ、シルクマブ、オロキズマブ、及びゲリリムズマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ５Ｒ（例えば、レスリズマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、ベンラリズマブ及びメポリズマブ）、抗ＩＬ１３（例えば、トラロキヌマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＬ３１ＲＡ（例えば、ネモリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ）、抗ＴＳＬＰ（例えば、ネモリズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペンブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デノスマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ランパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）の軽鎖をコードする核酸配列、ここで、該重鎖（Ｆａｂ及びＦｃ領域）ならびに該軽鎖は、自己切断型フューリン（Ｆ）／Ｆ２Ａもしくはフューリン（Ｆ）／Ｔ２Ａまたは可動性リンカーによって分離され、等量の重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの発現を確保する。
【0065】
様々な実施形態では、該標的組織は、神経組織、骨、腎臓、肝臓、筋肉、心臓、脾臓、肺もしくは内皮組織、または特定の受容体もしくは腫瘍であり得、該調節剤は、特異的にその組織、特に、肝臓及び筋肉または肝臓及び骨を認識し、及び／またはその組織に結合する異種タンパク質またはドメインに由来する。肝臓及び筋肉または肝臓及び骨で発現する導入遺伝子は、全身性の発現と見なされる。これは、肝臓で発現したタンパク質の送達の増強が、血液脳関門を越えてＣＮＳに入ること、及び全身性疾患の神経障害または神経症状を治療するための治療薬の送達を含めた、他の組織への侵入に十分であるためである。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＬＢＴＰ１及びＬＢＴＰ２プロモーターは、特に骨細胞（例えば、骨芽細胞）及び肝臓細胞（肝細胞）において遺伝子治療ベクターの発現を付与することが望まれる遺伝子治療ベクター中の任意の導入遺伝子で特に有用である。その遺伝子治療は、骨の疾患及び障害及び／または骨に影響を与える任意の全身性疾患の症状の治療に使用され得る。例えば、ＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２プロモーターを含む遺伝子治療ベクターは、全身性疾患の骨変形症状、例えば、骨格病変を伴うリソソーム蓄積症の改善に有効であり得る。
【0067】
５．３．１．ＡＡＶ
本発明の別の態様は、ＡＡＶカプシドにパッケージングするのに適した発現カセットに関し、従って、該カセットは、（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）１つ以上のエンハンサー及び１つ以上のプロモーターから本質的になる調節制御エレメント、特に、本明細書に提供する筋・肝特異的または筋・骨特異的核酸調節エレメント、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロン、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子を含む。
本発明の別の態様は、ＡＡＶカプシドにパッケージングするのに適した発現カセットに関し、従って、該カセットは、（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）１つ以上のエンハンサー及び１つ以上のプロモーターから本質的になる調節制御エレメント、特に、本明細書に提供する筋・肝特異的または筋・骨特異的核酸調節エレメント、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロン、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子を含む。
【0068】
該提供する核酸及び方法は、任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子の生成での使用、任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子を含む組成物の生成での使用、または任意の単離された組み換えＡＡＶ粒子の投与を含む、疾患もしくは障害の治療を必要とする対象におけるその治療方法での使用に適している。従って、該ｒＡＡＶは、当技術分野で既知の任意の血清型、修飾もしくは派生物のもの、または当技術分野で既知のそれらの任意の組み合わせ（例えば、２つ以上の血清型を含むｒＡＡＶ粒子の集団、例えば、２つ以上のｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子を含む）でよい。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６もしくは他のｒＡＡＶ粒子、またはそれらの２つ以上の組み合わせである。
【0069】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型の例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のカプシドタンパク質を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型の例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のカプシドタンパク質を含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、参照により全体として組み込まれるＺｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８に記載のＡｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、以下のアミノ酸挿入物のうちの１つを有するカプシドを含む：各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載のＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰ。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載のＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号に開示される任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３に開示される任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１７２６６９に開示される任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として組み込まれるＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０に記載のＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０７０４９１に開示される任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、参照により全体として組み込まれるＰｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８に記載のＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として組み込まれる米国特許第８，６２８，９６６号、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ９，９２３，１２０及びＷＯ２０１６／０４９２３０に開示される任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる以下の特許及び特許出願のいずれかに開示されるＡＡＶカプシドを含む：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる以下の特許及び特許出願のいずれかに開示されるＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
【0073】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、各々の内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１公開の配列番号２参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１公開の配列番号１２３及び８８参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、’３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８公開の配列番号１及び３～６参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９公開の配列番号５～３８参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７公開の配列番号５～３８参照）、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８公開の配列番号８０～２９４参照）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４公開の配列番号１、５～１０参照）に開示されるカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、’０５１公開の配列番号２参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、’３２１公開の配列番号１２３及び８８参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、’３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、’８８８公開の配列番号１及び３～６参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、’６８９公開の配列番号５～３８参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、’９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、’０９７公開の配列番号５～３８参照）、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、’５０８公開の配列番号８０～２９４参照）、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、’９２４公開の配列番号１、５～１０参照）に開示されるＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のカプシドタンパク質を有する。
【0074】
ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列ならびに組み換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国出願公開第２０１５００２３９２４号に教示されている。
【0075】
該提供する方法は、導入遺伝子をコードする組み換えＡＡＶの生成に使用するのに適している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。さらなる実施形態では、本明細書に提供するのは、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ＴＰＰをコードするｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、抗カリクレイン（抗ｐＫａｌ）抗体をコードするｒＡＡＶウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ｐＫａｌ抗体のＦａｂまたは完全長抗体をコードするｒＡＡＶ８ベースまたはｒＡＡＶ９ベースのウイルスベクターである。
【0076】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態では、該シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成及び使用するための方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）参照）。
【0077】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態では、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型に由来する２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【0078】
ある特定の実施形態では、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）が使用され得る。ある特定の実施形態では、自己相補的ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶが使用され得る（例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＷｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４、ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号参照）。
【0079】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９から選択されるＡＡＶカプシド血清型に由来するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－４またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－５またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９またはその派生物、修飾、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。
【0080】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾、もしくはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、精製供給におけるｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対して、少なくとも８０％またはそれを超えて同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有するカプシドタンパク質を含む。
【0082】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、異なるＡＡＶ血清型に由来するウイルスカプシドタンパク質の混合物で構成される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
【0083】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、該シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶのＩＴＲを含む核酸ベクター、ならびに（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６）に由来するカプシドタンパク質で構成されるカプシドを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質で構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質で構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、該シュードタイプＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成及び使用するための方法は、当技術分野で既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）参照）。
【0084】
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。さらなる実施形態では、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型に由来する２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。さらなる実施形態では、該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型に由来する２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
【0085】
いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質、ならびに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型に由来する１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラであるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質、ならびに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型に由来する１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラであるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質、ならびに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５及びＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質のキメラであるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質、ならびに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質のキメラであるＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
【0088】
ｒＡＡＶベクターの作製方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示する分子を作製することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むヌクレオチドを提供すること、及び対応する該カプシドタンパク質で構成されるカプシド被覆を有するｒＡＡＶ粒子を調製するためにパッケージング細胞系を使用することによって作製される。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、本明細書に記載のカプシドタンパク質分子の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、該カプシドタンパク質及び異種タンパク質またはそのドメインに由来する挿入ペプチドの生物学的機能を保持する（または実質的に保持する）。いくつかの実施形態では、該核酸は、該ＡＡＶカプシドタンパク質の特定の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードすると同時に、該ＡＡＶカプシドタンパク質の生物学的機能を保持する（または実質的に保持する）。
本発明の別の態様は、本明細書に開示する分子を作製することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含むヌクレオチドを提供すること、及び対応する該カプシドタンパク質で構成されるカプシド被覆を有するｒＡＡＶ粒子を調製するためにパッケージング細胞系を使用することによって作製される。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、本明細書に記載のカプシドタンパク質分子の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードし、該カプシドタンパク質及び異種タンパク質またはそのドメインに由来する挿入ペプチドの生物学的機能を保持する（または実質的に保持する）。いくつかの実施形態では、該核酸は、該ＡＡＶカプシドタンパク質の特定の配列に対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％、好ましくは、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％の同一性を有する配列をコードすると同時に、該ＡＡＶカプシドタンパク質の生物学的機能を保持する（または実質的に保持する）。
【0089】
該カプシドタンパク質、被覆、及びｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で既知の技術によって生成され得る。いくつかの実施形態では、該ウイルスゲノムは、ベクターへのパッケージングを可能にするための少なくとも１つの逆位末端配列を含む。いくつかの実施形態では、該ウイルスゲノムは、さらに、ｃａｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子の発現及びスプライシングのためのｒｅｐ遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、該ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、パッケージング細胞によって提供され、該ウイルスゲノムには存在しない。
【0090】
いくつかの実施形態では、該カプシドタンパク質をコードする核酸は、既存のカプシド遺伝子の代わりにＡＡＶのＲｅｐ－Ｃａｐヘルパープラスミドにクローニングされる。一緒に宿主細胞に導入される場合、このプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを、カプシド被覆としてのカプシドタンパク質にパッケージングすることを補助する。パッケージング細胞は、ＡＡＶゲノム複製、カプシド組み立て、及びパッケージングを促進するのに必要な遺伝子を有する任意の細胞型であり得る。非限定的な例としては、２９３細胞もしくはその派生物、ＨＥＬＡ細胞、または昆虫細胞が挙げられる。
【0091】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換のための標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って行われる場合もあれば、当技術分野で一般に施行されているように行われる場合も、本明細書に記載の通りに行われる場合もある。前述の技術及び手順は、通常、当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通して引用及び論じられる様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載の通りに行われ得る。例えば、あらゆる目的のため、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。詳しい定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品及び薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験法及び実験技術は、当技術分野で周知の及び一般に使用されるものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、薬剤の調製、処方、及び送達、ならびに患者の治療に使用することができる。ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列、及び組み換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドの作製方法は、例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ７，７９０，４４９、ＵＳ８，３１８，４８０、ＵＳ８，９６２，３３２、及びＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６に教示されている。
【0092】
好ましい実施形態では、該ｒＡＡＶは、以下により詳細に論じる通り、治療的及び予防的用途において使用され得る導入遺伝子送達ベクターを提供する。該ｒＡＡＶベクターはまた、対象の標的細胞内で核酸（導入遺伝子）によってコードされるＲＮＡ及び／またはタンパク質産物の発現に影響を及ぼす上記の調節制御エレメントを含む。
【0093】
特定の実施形態において提供するのは、該調節エレメントの制御下、該導入遺伝子の発現のための、両側にＩＴＲが配置された発現カセットを含むウイルスゲノム、ならびに本明細書に記載の操作されたウイルスカプシドまたは該ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％同一である操作されたウイルスカプシドを含むＡＡＶベクターである。
【0094】
該組み換えアデノウイルスは、Ｅ１を欠失し、Ｅ３を欠失したまたは欠失せず、いずれかの欠失領域に該発現カセットが挿入された第一世代のベクターであり得る。該組み換えアデノウイルスは、Ｅ２及びＥ４領域の完全または部分的な欠失を含む第二世代のベクターであり得る。ヘルパー依存性アデノウイルスは、アデノウイルス逆位末端配列及びパッケージングシグナル（ファイ）のみを保持する。該導入遺伝子は、通常、該パッケージングシグナルと３’ＩＴＲとの間に挿入され、スタッファー配列を含み、または含まず、およそ３６ｋｂの野生型サイズに近いゲノムを維持する。アデノウイルスベクターの生成のための例示的なプロトコルは、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００５，“Ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｌａｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１８－Ｓ２７に見出され得る。
【0095】
該導入遺伝子を標的組織、細胞、または器官に送達するためのｒＡＡＶベクターはまた、本明細書に記載の組織特異的プロモーターの使用と併せて、その特定の標的組織、細胞、または器官、例えば、肝臓及び／または筋肉指向性も有し得る。該構築物は、さらに、該導入遺伝子の発現を増強するイントロン等のさらなる発現制御エレメント（例えば、ニワトリβ－アクチンイントロン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン、ヒト第ＩＸ因子イントロン（例えば、ＦＩＸ分断イントロン１）、β－グロビンスプライスドナー／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプターイントロン、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプターイントロン、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）イントロン、及びハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプターイントロン等のイントロンならびにポリＡシグナル、例えば、ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡシグナル、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル、合成ポリＡ（ＳＰＡ）シグナル、及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡシグナルを含むことができる。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｒｉｖｅｒａ－Ｓｏｔｏ，２０１５，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１９（１０２）：４９－５７を参照されたい。
【0096】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する核酸配列は、例えば、当業者に既知の任意のコドン最適化技術でコドン最適化され得る（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１による総説参照）。
【0097】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＳＰＸ１）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｄ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0098】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＳＰＸ２）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つの直列型ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｄ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）２つの直列型ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｄ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0099】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＴＰ１）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0100】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＴＰ２）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つの直列型ＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0101】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＴＰ３）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つの直列型Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）２つの直列型ＭｃｋＥエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0102】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ６）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つの直列型ＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫ８プロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つの直列型ＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫ８プロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0103】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ１３）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0104】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ１４）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）最小Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｂ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｄ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）最小Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｂ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｃ）ポリＡシグナル、及びｄ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0105】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ１５）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）最小Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）最小Ｓｐｃ５．１２プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0106】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ１８）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫ８プロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫ８プロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル、及びｆ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0107】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ１９）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＣＫ８プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＣＫ８プロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0108】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＭＴＰ２０）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＭｈｃＥエンハンサー、ｃ）ＭｃｋＥエンハンサー、ｄ）ＣＫ８プロモーター、ｅ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｆ）ポリＡシグナル、及びｇ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＭｈｃＥエンハンサー、ｃ）ＭｃｋＥエンハンサー、ｄ）ＣＫ８プロモーター、ｅ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｆ）ポリＡシグナル、及びｇ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0109】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＢＴＰ１）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）最小ＳＰ７／Ｏｓｘプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）最小ＳＰ７／Ｏｓｘプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0110】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む（ＬＢＴＰ２）：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＳＰ７／Ｏｓｘプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子。別の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、以下の成分を含む：（１）該発現カセットの両側にＡＡＶ２逆位末端配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ＳＰ７／Ｏｓｘプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル、及びｅ）任意にヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロン、または他のイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）１つ以上の目的のＲＮＡまたはタンパク質産物を提供する（例えば、コードする）導入遺伝子、例えば、表４Ａ～４Ｄのもの。
【0111】
本明細書に記載の直列型の複合プロモーターは、該プロモーター領域内に好ましい転写開始部位をもたらす。例えば、実施例１０の結果及び表１４を参照されたい。従って、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、直列型または複合核酸調節配列を有し、これは、ｈＡＡＴプロモーター（特に、開始コドン修飾ｈＡＡＴプロモーター）を含み、転写開始部位ＴＣＴＣＣ（配列番号４３）（ＬＭＴＰ６配列番号６のヌクレオチド１５４１～１５４５に相当）、またはｈＡＡＴに見られる活性転写部位（配列番号１１または配列番号１２の３５５～３５９に相当）または配列番号１１のヌクレオチド１３９～１５７に相当するＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４１）、または配列番号１２のヌクレオチド１３９～１５７に相当するＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４２）を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、直列型または複合調節配列を有し、これは、ＣＫ８プロモーターを含み、配列番号１６のヌクレオチド３７７～３８６に相当するＴＣＡＴＴＣＴＡＣＣ（配列番号４６）に転写開始部位を有し、特に、配列番号１６のヌクレオチド３７７に相当するヌクレオチドまたは配列番号６のヌクレオチド１１３３に相当するヌクレオチドから開始する。
【0112】
本明細書に提供するウイルスベクターは、宿主細胞、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターに由来する宿主細胞を含めた哺乳類宿主細胞を使用して製造され得る。非限定的な例としては、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞が挙げられる。典型的には、該宿主細胞は、該導入遺伝子及び関連するエレメント（すなわち、該ベクターゲノム）、ならびに該宿主細胞でウイルスを生成するための遺伝子成分、例えば、複製及びカプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をコードする配列で安定的に形質転換される。ＡＡＶ８カプシドを有する組み換えＡＡＶベクターを生成する方法については、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号の詳細説明のセクションＩＶを参照されたい。該ベクターのゲノムコピーの力価は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定され得る。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ２沈降によって回収され得る。別の方法として、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現系が、ＡＡＶベクターを生成するために使用され得る。総説に関しては、参照により製造技術に関して全体として本明細書に組み込まれるＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：１０４５－１０５４を参照されたい。
【0113】
インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイを使用して、本明細書に記載のベクターからの導入遺伝子発現を測定し、ひいては、例えば、ベクターの効力を示すことができる。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（Ｌｏｎｚａ）、ヒト胚網膜細胞に由来する細胞株、または網膜色素上皮細胞、例えば、網膜色素上皮細胞株ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）が、導入遺伝子発現を評価するために使用され得る。別の方法として、肝臓または筋肉もしくは他の細胞型に由来する細胞株、例えば、限定されないが、ＨｕＨ－７、ＨＥＫ２９３、線維肉腫ＨＴ－１０８０、ＨＫＢ－１１、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞、及びＣＡＰ細胞が使用され得る。発現後、血清半減期、タンパク質の機能活性（例えば、酵素活性または標的への結合）、グリコシル化及びチロシン硫酸化パターンの特定、ならびにタンパク質の特徴を特定するための当技術分野で既知の他のアッセイを含めた該発現産物（遺伝子導入産物）の特徴が特定され得る。
提供するのは、組み換えＡＡＶの製造方法であり、これは、本明細書に記載の組み換えＡＡＶを生成することができる宿主細胞を、導入遺伝子に作動可能に連結された合成プロモーターを含む発現カセットを備えた人工ゲノムを含む該組み換えＡＡＶを生成するのに適した条件下で培養することを含む。特に、該方法は、（１）（ｉ）導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示する複合核酸調節エレメントを含む核酸調節エレメントを含む組み換えシス発現カセットの両側に配置されたＡＡＶのＩＴＲを含む人工ゲノム、（ｉｉ）培養中の宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセット、ならびに（ｉｉｉ）該人工ゲノムの複製及びパッケージングを該ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む該宿主細胞を培養すること、ならびに（２）該細胞培養から、該人工ゲノムをカプシドで包んだ組み換えＡＡＶを回収することを提供する。同様に提供するのは、（ｉ）導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示する複合核酸調節エレメントを含む組み換えシス発現カセットの両側に配置されたＡＡＶのＩＴＲを含む人工ゲノム、（ｉｉ）培養中の宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセット、ならびに任意に、（ｉｉｉ）該人工ゲノムの複製及びパッケージングを該ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む宿主細胞である。特定の実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２である。特定の実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、該人工ゲノムは、表４Ａ～４Ｄに記載の治療薬の１つをコードする導入遺伝子を含む。
提供するのは、組み換えＡＡＶの製造方法であり、これは、本明細書に記載の組み換えＡＡＶを生成することができる宿主細胞を、導入遺伝子に作動可能に連結された合成プロモーターを含む発現カセットを備えた人工ゲノムを含む該組み換えＡＡＶを生成するのに適した条件下で培養することを含む。特に、該方法は、（１）（ｉ）導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示する複合核酸調節エレメントを含む核酸調節エレメントを含む組み換えシス発現カセットの両側に配置されたＡＡＶのＩＴＲを含む人工ゲノム、（ｉｉ）培養中の宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセット、ならびに（ｉｉｉ）該人工ゲノムの複製及びパッケージングを該ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む該宿主細胞を培養すること、ならびに（２）該細胞培養から、該人工ゲノムをカプシドで包んだ組み換えＡＡＶを回収することを提供する。同様に提供するのは、（ｉ）導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示する複合核酸調節エレメントを含む組み換えシス発現カセットの両側に配置されたＡＡＶのＩＴＲを含む人工ゲノム、（ｉｉ）培養中の宿主細胞で、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質の発現を駆動し、ＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をトランスに提供する発現制御エレメントに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、ＡＡＶのＩＴＲを欠くトランス発現カセット、ならびに任意に、（ｉｉｉ）該人工ゲノムの複製及びパッケージングを該ＡＡＶカプシドタンパク質により可能にする十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む宿主細胞である。特定の実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、表１のＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２である。特定の実施形態では、該複合核酸調節エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、または配列番号３１を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、該人工ゲノムは、表４Ａ～４Ｄに記載の治療薬の１つをコードする導入遺伝子を含む。
【0114】
５．４．治療的及び予防的使用
別の態様は、疾患または障害を遅延、予防、治療、及び／または管理するための、及び／またはそれに関連する１つ以上の症状を改善するための、導入遺伝子を本発明のｒＡＡＶベクターを介してそれを必要とする対象に投与することを含む治療に関する。それを必要とする対象としては、該疾患または障害に罹患している対象、またはその素因を有する対象、例えば、該疾患または障害を発症するまたはその再発を有するリスクがある対象が挙げられる。通常、特定の導入遺伝子を運ぶｒＡＡＶは、該導入遺伝子に対応する該対象の天然の遺伝子が、正確な遺伝子産物、または正確な量の遺伝子産物を提供する上で欠陥がある対象における所与の疾患または障害に関して利用される。次いで、該導入遺伝子は、該対象における欠陥のある遺伝子のコピーを提供することができる。
別の態様は、疾患または障害を遅延、予防、治療、及び／または管理するための、及び／またはそれに関連する１つ以上の症状を改善するための、導入遺伝子を本発明のｒＡＡＶベクターを介してそれを必要とする対象に投与することを含む治療に関する。それを必要とする対象としては、該疾患または障害に罹患している対象、またはその素因を有する対象、例えば、該疾患または障害を発症するまたはその再発を有するリスクがある対象が挙げられる。通常、特定の導入遺伝子を運ぶｒＡＡＶは、該導入遺伝子に対応する該対象の天然の遺伝子が、正確な遺伝子産物、または正確な量の遺伝子産物を提供する上で欠陥がある対象における所与の疾患または障害に関して利用される。次いで、該導入遺伝子は、該対象における欠陥のある遺伝子のコピーを提供することができる。
【0115】
通常、該導入遺伝子は、対応する天然の遺伝子に遺伝子変異（複数可）を有する対象に対して、タンパク質機能を戻すｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該ｃＤＮＡは、ゲノム工学、例えば、相同組み換えを介したゲノム編集を行うための関連するＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該導入遺伝子は、治療用ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ、またはスプライシングに影響を及ぼすエレメントをコードする。
【0116】
以下の表４Ａ～４Ｄは、導入遺伝子のリストを提供し、これらは、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターのいずれかにおいて、特に、本明細書に記載の新規な挿入部位において使用され、好ましくは、該導入遺伝子が関連する、表４Ａ～４Ｄにも記載される疾患を治療または予防し得る。本明細書に記載の通り、該ＡＡＶベクターは、該導入遺伝子の送達のために適切な組織を標的として治療的または予防的使用をもたらすために本明細書に記載の通りに操作され得る。適切なＡＡＶ血清型は、ベクターの組織指向性及び形質導入を最適化するために操作するように選択され得る。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表7-1】
【表7-2】
【0117】
１つの例では、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターは、パーキンソン病を治療／予防／管理するのに利用される。別の例では、抗カリクレイン抗体、例えば、ラナデルマブをコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝性血管性浮腫（ＨＡＥ）を治療／予防／管理するのに利用される。さらに別の例では、リソソーム酵素をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶは、ムコ多糖症を治療／予防／管理するのに利用される。一般に、該ｒＡＡＶベクターは、全身投与され、形質導入後、該ベクターによるタンパク質産物の生成は、操作された肝臓特異的及び任意に筋特異的または骨特異的核酸調節エレメントを使用する発現カセットによって増強される。例えば、該ｒＡＡＶベクターは、静脈内、筋内、及び／または腹腔内投与によって提供され得る。
【0118】
表４Ｃ及び４Ｄの治療用抗体に関して、該治療用抗体をコードする導入遺伝子に作動可能に連結された調節配列を含む発現カセットは、好ましくは、肝臓及び／または筋細胞を標的とするためまたはそこでの発現のため、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ９カプシドまたはＡＡＶｒｈ１０カプシドを有する送達用ｒＡＡＶにパッケージングされ得る。
【0119】
いくつかの態様では、本発明のｒＡＡＶは、治療／予防される障害または疾患と関連する標的組織への送達に利用される。特定の組織または細胞型に関連する疾患または障害は、体内の他の組織または細胞型と比較して、該特定の組織もしくは細胞型に大きな影響を及ぼすものであるか、または該障害の作用もしくは症状が該特定の組織もしくは細胞型で現れるものである。導入遺伝子を、それを必要とする対象の標的組織に送達する方法は、該対象に対して、該発現カセットが、導入遺伝子に作動可能に連結された、例えば、表１における核酸調節エレメントＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、ＬＴＰ３、ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、ＬＭＴＰ２０、ＬＢＴＰ１、またはＬＢＴＰ２を含むｒＡＡＶを投与することを含む。
【0120】
標的細胞の形質導入に続いて、該タンパク質産物の発現は、かかる肝臓特異的発現カセットを使用することによって増強される。かかる増強は、以下の非限定的な測定のリストによって測定され得る。例えば、１）サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、組織学的染色、及び液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）に限定されない、当業者に既知のアッセイによるタンパク質力価、２）結合アッセイ、機能アッセイ、酵素アッセイ及び／または基質検出アッセイ等のアッセイによるタンパク質活性、及び／または３）血清半減期または長期発現。導入遺伝子発現の増強は、ヒトの治療に有効でありかつ適すると特定され得る（Ｈｉｎｔｚｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ２０１１：６ ６９－７８）。かかるインビトロ及びインビボでの細胞、血液及び組織の試験を使用した導入遺伝子の定量的及び機能的特性の評価は、ある特定の治療の有効性と相関することが分かっており（Ｈｉｎｔｚｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，２０１１、上記）、本明細書に記載のベクターを用いた導入遺伝子の遺伝子治療に対する応答を評価するために使用される。
【0121】
本発明のｒＡＡＶベクターはまた、オリゴヌクレオチド、薬物、造影剤、無機ナノ粒子、リポソーム、抗体が挙げられるがこれらに限定されない本明細書に記載のキメラ調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子の標的細胞または組織への送達、特に標的送達を促進し得る。該ｒＡＡＶベクターはまた、特に、非コードＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドの標的組織への送達、特に標的送達を促進し得る。
【0122】
該薬剤は、当技術分野で既知の及び／または本明細書に記載の医薬的に許容される組成物として提供され得る。いくつかの実施形態では、該ｒＡＡＶ分子は、単独でまたは他の予防薬及び／または治療薬と組み合わせて投与され得る。
【0123】
本明細書に提供する投薬量及び投与頻度は、治療的に有効及び予防的に有効という用語に包含される。該投薬量及び頻度は、通常は、投与される特定の治療薬または予防薬、疾患の重症度及びタイプ、投与経路、ならびに当該患者の年齢、体重、反応、及び既往歴に応じて患者ごとに特定の要因に応じて変わり、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。適切なレジメンは、かかる要因を考慮することによって及び例えば、文献で報告され、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５６ｔｈ ｅｄ．，２００２）で推奨されている投薬量に従って当業者によって選択され得る。予防薬及び／または治療薬は、繰り返し投与することができる。予防薬または治療薬を投与する時間的レジメン、及びかかる薬剤が別々にまたは混合物として投与されるかどうか等の手順のいくつかの側面が変わることがある。
【0124】
有効となる本発明の薬剤の量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から外挿され得る。本発明の方法で使用される任意の薬剤の場合、該治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得るために動物モデルにおいて策定され得る。かかる情報は、ヒトで有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0125】
予防薬及び／または治療薬、ならびにそれらの組み合わせは、ヒトでの使用の前に適切な動物モデル系で試験され得る。かかる動物モデル系としては、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ等が挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で周知の任意の動物系が使用され得る。かかるモデル系は、広く使用されており、当業者に周知である。いくつかの好ましい実施形態では、ラット、マウス、または霊長類以外の他の小哺乳類に基づくＣＮＳ条件に関する動物モデル系が使用される。
【0126】
本発明の予防薬及び／または治療薬を動物モデルで試験した後、それらを臨床試験で試験し、それらの有効性を確立することができる。臨床試験の確立は、当業者に既知の一般的な方法に従って行われ、本発明の薬剤の最適な投薬量及び投与経路ならびに毒性プロファイルが確立され得る。例えば、臨床試験は、ヒト患者における有効性及び毒性について本発明のｒＡＡＶ分子を試験するように設計され得る。
【0127】
本発明の予防薬及び／または治療薬の毒性及び有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療有効用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な製薬手順によって決定され得る。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す予防薬及び／または治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬及び／または治療薬が使用される場合もあるが、非感染細胞への潜在的な損傷を最小化し、それにより、副作用を減少させるために、かかる薬剤を罹患組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意が払われるべきである。
【0128】
本発明のｒＡＡＶ分子は、通常、所望の治療効果及び／または予防効果を得るために有効な時間及び量で投与される。該細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを、ヒトにおいて使用するための予防薬及び／または治療薬の投薬量の範囲及び／またはスケジュールを策定する際に使用することができる。かかる薬剤の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。該投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変わり得る。
【0129】
患者のためのｒＡＡＶベクターの治療有効投薬量は、通常、濃度約１×１０９～約１×１０１６ゲノムｒＡＡＶベクター、または約１×１０１０～約１×１０１５、約１×１０１２～約１×１０１６、または約１×１０１４～約１×１０１６ＡＡＶゲノムを含む約０．１ｍｌ～約１００ｍｌの溶液である。該導入遺伝子の発現のレベルは、投薬量、頻度、スケジューリング等を決定／調整するために観察され得る。
【0130】
本発明の薬剤の治療有効量または予防有効量での対象の治療は、単回の治療を含むこともできれば、一連の治療を含むこともできる。例えば、本発明の薬剤を含む医薬組成物は、１日１回、１日２回、または１日３回投与され得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、１日１回、１日おき、週１回、週２回、２週間に１回、月１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、年２回、または年１回投与され得る。ある特定の薬剤の有効投薬量、例えば、本発明の二重抗原結合分子を含む薬剤の有効投薬量は、治療の過程で増加または減少し得ることも理解される。
【0131】
本発明の薬剤を投与する方法としては、非経口投与（例えば、注入またはボーラス注射を含めた皮内、筋内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外、及び上皮または皮膚粘膜または粘膜内層（例えば、鼻腔内、経口粘膜、直腸、及び腸粘膜等）を介した吸収によるものが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、該導入遺伝子は、例えば、該導入遺伝子が発現され、血流に分泌される肝臓に貯蔵所を形成することによって、ＣＮＳで発現されることを意図している場合でも、静脈内に投与される。
【0132】
ある特定の実施形態では、本発明の薬剤は、静脈内または筋内に投与され、他の生物学的活性剤と一緒に投与され得る。
【0133】
別の特定の実施形態では、本発明の薬剤は、例えば、該製剤が持続放出をもたらす、ひいては投与された薬剤の半減期を延長する、持続放出製剤で送達され得る。使用に適した制御放出システムとしては、限定されないが、拡散制御、溶媒制御、及び化学的制御システムが挙げられる。拡散制御システムとしては、例えば、分子の放出が拡散障壁を通る透過によって制御されるように、本発明の分子が装置内に封入されたリザーバ装置が挙げられる。一般的なリザーバ装置としては、例えば、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム、及び中空糸が挙げられる。モノリシック（マトリックス）装置は、拡散制御システムのもう一つのタイプであり、二重抗原結合分子は、速度制御マトリックス（例えば、ポリマーマトリックス）に分散または溶解される。本発明の薬剤は、速度制御マトリックス全体を通して均質的に分散され得、放出の速度は、マトリックスを通して拡散によって制御される。モノリシックマトリックス装置で使用するのに適したポリマーとしては、天然に存在するポリマー、合成ポリマー及び合成的に修飾された天然ポリマー、ならびにポリマー誘導体が挙げられる。
【0134】
当業者に既知の任意の技術を使用して、１つ以上の本明細書に記載の薬剤を含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０５５４８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ，”Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：１７９ １８９，１９９６、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ－Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，”ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５０：３７２ ３９７，１９９５、Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏ．Ｉｎｔｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：８５３ ８５４，１９９７、及びＬａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２４：７５９ ７６０，１９９７を参照されたい。これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。１つの実施形態では、ポンプが、制御放出システムで使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０，１９８７、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７，１９８０、及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４，１９８９参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、二重抗原結合分子、またはその抗原結合断片を含む薬剤の制御放出を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３：６１，１９８３参照、同様に、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０，１９８５、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１，１９８９、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７ １：１０５，１９８９）、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／１５１５４号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０２５３号も参照のこと）。さらに別の実施形態では、制御放出システムを治療標的の近傍（例えば、罹患関節）に配置することができ、この結果として、全身用量の一部を必要とするのみである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５ １３８（１９８４）参照）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７ １５３３，１９９０による総説に論じられている。
【0135】
さらに、該ｒＡＡＶは、科学的研究のための導入遺伝子のインビボ送達、例えば、ｍｉＲＮＡでの遺伝子ノックダウン、条件遺伝子欠失用のリコンビナーゼ送達、ＣＲＩＳＰＲでの遺伝子編集等に使用することができる。
【0136】
５．５．医薬組成物及びキット
本発明は、さらに、医薬的に許容される担体及び本発明の薬剤を含む医薬組成物を提供し、該薬剤は、導入遺伝子カセットを含む本発明のｒＡＡＶ分子を含み、該導入遺伝子の発現は、本明細書に記載のキメラ調節エレメントによって駆動される。好ましい実施形態では、該医薬組成物は、ｒＡＡＶを、対象への投与のための医薬的に許容される担体と組み合わせて含む。特定の実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤、または媒体を指す。かかる医薬担体は、滅菌液体、例えば、水及び、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含めた、石油、動物、植物、または合成起源のものを含めた油であり得る。水は、該医薬組成物が静脈内または筋内に投与される場合に一般的な担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射剤用の液体担体として使用され得る。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。医薬的に許容される担体、賦形剤、及び安定剤のさらなる例としては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸、アスコルビン酸を含めた抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン及びゼラチン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、及び他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、当技術分野で既知のＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、上記の成分に加えて、滑沢剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、及び防腐剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態をとり得る。
本発明は、さらに、医薬的に許容される担体及び本発明の薬剤を含む医薬組成物を提供し、該薬剤は、導入遺伝子カセットを含む本発明のｒＡＡＶ分子を含み、該導入遺伝子の発現は、本明細書に記載のキメラ調節エレメントによって駆動される。好ましい実施形態では、該医薬組成物は、ｒＡＡＶを、対象への投与のための医薬的に許容される担体と組み合わせて含む。特定の実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全アジュバント）、賦形剤、または媒体を指す。かかる医薬担体は、滅菌液体、例えば、水及び、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含めた、石油、動物、植物、または合成起源のものを含めた油であり得る。水は、該医薬組成物が静脈内または筋内に投与される場合に一般的な担体である。生理食塩水ならびに水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射剤用の液体担体として使用され得る。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。医薬的に許容される担体、賦形剤、及び安定剤のさらなる例としては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸、アスコルビン酸を含めた抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン及びゼラチン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、及び他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、当技術分野で既知のＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物はまた、上記の成分に加えて、滑沢剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、及び防腐剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形態をとり得る。
【0137】
本発明のある特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明の方法に従って使用するために提供され、該医薬組成物は、治療有効量及び／または予防有効量の本発明の薬剤を医薬的に許容される担体とともに含む。
【0138】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、実質的に純粋である（すなわち、その効果を制限するまたは望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、宿主または対象は、動物、好ましくは、哺乳類、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）及び霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイザル及びヒト）である。好ましい実施形態では、該宿主は、ヒトである。
【0139】
本発明は、上記の方法において使用され得るキットをさらに提供する。１つの実施形態では、キットは、例えば、１つ以上の容器内に、１つ以上の本発明の薬剤を含む。別の実施形態では、キットは、さらに、１つ以上の容器内に、状態の治療に有用な１つ以上の他の予防薬または治療薬を含む。
【0140】
本発明はまた、薬剤または活性剤の量を示す密封容器、例えば、アンプルまたはサシェに包装された本発明の薬剤を提供する。１つの実施形態では、該薬剤は、密封容器において乾燥した滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、例えば、水または生理食塩水で、対象への投与に適した濃度に再構成され得る。通常、該薬剤は、少なくとも５ｍｇ、より多くの場合、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投薬量で密封容器において乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。凍結乾燥した薬剤は、その元の容器において２～８℃の間で保存されるべきであり、該薬剤は、再構成された後１２時間以内、通常は６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与されるべきである。代替的な実施形態では、本発明の薬剤は、薬剤または活性剤の量及び濃度を示す密封容器において液体形態で供給される。通常、該薬剤の液体形態は、密封容器において少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌで供給される。
【0141】
本発明の組成物には、医薬組成物の製造において有用なバルク薬物組成物（例えば、不純または非滅菌組成物）及び医薬組成物（すなわち、対象または患者への投与に適した組成物）が含まれる。バルク薬物組成物は、例えば、予防有効量または治療有効量の本明細書に開示する薬剤またはそれら薬剤と医薬的に許容される担体の組み合わせを含む単位剤形の調製に使用され得る。
【0142】
本発明は、さらに、本発明の薬剤のうちの１つ以上で満たされた１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。また、標的疾患または障害の治療に有用な１つ以上の他の予防薬または治療薬もまた、該医薬パックまたはキットに含まれ得る。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ以上で満たされた１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。かかる容器（複数可）に任意に伴うものは、薬剤またはバイオ医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって規定された形式の掲示である可能性もあり、この掲示は、ヒトへの投与についての製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【0143】
通常、本発明の組成物の成分は、例えば、薬剤または活性剤の量を示す密封容器、例えば、アンプルまたはサシェにおいて、乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々にまたは単位剤形で一緒に混合して供給される。該組成物が注入によって投与される場合、それは、滅菌した医薬グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投薬され得る。該組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【実施例】
【0144】
６．実施例 ６．１．実施例１－直列型プロモーターの構築
６．１．１．肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰＸ）
図１は、任意の導入遺伝子とともに使用するための直列型プロモーターの様々な配置を示す。これらのプロモーター配列は、特に肝細胞内で遺伝子治療ベクターの発現を与えるように合理的に設計されたプロモーターであった。これらエレメントの配列は、一部は、標準的なプロモーター、例えば、ＴＢＧ及びｈＡＡＴプロモーターに由来し、カセットは、標準的な分子生物学の技術を使用してＡＡＶ（シス）プラスミドにクローニングした。例えば、本明細書の実施例で使用したＡｐｏＥ．ｈＡＡＴプロモーターを、図１の通りに構築した。ここでは、１つの肝臓制御領域は、ｈＡＡＴプロモーター配列（配列番号１１）の上流にＡｐｏＥエンハンサー（配列番号９）を含む。以下は、各肝臓特異的プロモーターの説明である。
６．１．１．肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰＸ）
図１は、任意の導入遺伝子とともに使用するための直列型プロモーターの様々な配置を示す。これらのプロモーター配列は、特に肝細胞内で遺伝子治療ベクターの発現を与えるように合理的に設計されたプロモーターであった。これらエレメントの配列は、一部は、標準的なプロモーター、例えば、ＴＢＧ及びｈＡＡＴプロモーターに由来し、カセットは、標準的な分子生物学の技術を使用してＡＡＶ（シス）プラスミドにクローニングした。例えば、本明細書の実施例で使用したＡｐｏＥ．ｈＡＡＴプロモーターを、図１の通りに構築した。ここでは、１つの肝臓制御領域は、ｈＡＡＴプロモーター配列（配列番号１１）の上流にＡｐｏＥエンハンサー（配列番号９）を含む。以下は、各肝臓特異的プロモーターの説明である。
【0145】
ＬＳＰＸ１：この配列は、アルファ－Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサー（ＴＢＧプロモーター由来）の２つのコピー、ＡｐｏＥエンハンサー、及びｈＡＡＴプロモーターを含む。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0146】
ＬＳＰＸ２：このプロモーターには、ＡｐｏＥエンハンサーの２つのコピー及びｈＡＡＴプロモーターを含む。標準的なｈＡＡＴプロモーターカセットは、ＡｐｏＥエンハンサーのコピーを１つ含むのみである。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0147】
６．１．２．肝臓特異的直列型プロモーター（ＬＴＰ）
２つのプロモーター（直列方式）から単一の導入遺伝子を発現させるための新規なアプローチを、３’プロモーターの「ＡＴＧ」配列を枯渇させることによって使用した（図１）。以下のプロモーターカセットは、この戦略を利用して、肝臓から特異的に導入遺伝子を発現させる。
２つのプロモーター（直列方式）から単一の導入遺伝子を発現させるための新規なアプローチを、３’プロモーターの「ＡＴＧ」配列を枯渇させることによって使用した（図１）。以下のプロモーターカセットは、この戦略を利用して、肝臓から特異的に導入遺伝子を発現させる。
【0148】
ＬＴＰ１：この配列は、アルファ－Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサーの２つのコピーとそれに続くＴＢＧプロモーターを含む。ＴＢＧプロモーターの下流は、「ＡＴＧ」配列が枯渇したｈＡＡＴプロモーター配列（すなわち、ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧ）である。理論に拘束されることを望むものではないが、下流のプロモーターからＡＴＧ部位が削除された直接型プロモーターは、２つのｍＲＮＡ転写物の発現、すなわち、宿主細胞の転写機構に応じた各プロモーターによる駆動を可能にするが、タンパク質の翻訳開始は、カセット内のタンパク質コード配列の単一の意図された開始コドンで生じる。この戦略は、タンパク質開始コドンの上流に余分なＡＴＧ部位を含む直列型プロモーターと比較して、より効率的及び堅牢な発現をもたらすはずである。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0149】
ＬＴＰ２：この配列は、アルファ－Ｍｉｃ／Ｂｉｋエンハンサーのさらに上流にＡｐｏＥエンハンサーを含むこと以外はＬＴＰ１（ＴＢＧプロモーターの下流にｈＡＡＴ－ΔＡＴＧを含む）と同様である。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0150】
ＬＴＰ３：この設計は、ＬＴＰ１と同様である（ＴＢＧプロモーターの下流にｈＡＡＴ－ΔＡＴＧを含む）。しかしながら、これは、他のプロモーターエレメントの下流に、キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンの代わりにＡｐｏＥエンハンサーを有する合成イントロンを含む。
【0151】
６．１．３．肝臓／筋二重特異性直列型プロモーター（ＬＭＴＰ）
２つのプロモーター（直列方式）から単一の導入遺伝子を発現させるためのアプローチを、３’プロモーターの「ＡＴＧ」配列を枯渇させることによって使用した（図５及び８Ａ）。以下のプロモーターカセットは、この戦略を利用して、肝臓及び筋肉での二重の導入遺伝子発現を達成する。
２つのプロモーター（直列方式）から単一の導入遺伝子を発現させるためのアプローチを、３’プロモーターの「ＡＴＧ」配列を枯渇させることによって使用した（図５及び８Ａ）。以下のプロモーターカセットは、この戦略を利用して、肝臓及び筋肉での二重の導入遺伝子発現を達成する。
【0152】
ＬＭＴＰ６：これは、肝臓細胞及び筋細胞の両方で発現を示す直列型プロモーターカセットである。これは、ＡｐｏＥエンハンサーに続いて完全なＣＫ８プロモーターカセット（ＣＫ８プロモーター配列の上流にＭｃｋエンハンサー（ＭｃｋＥ）の３つのコピーを含む）を含む。ＣＫ８プロモーターの下流は、ＡＴＧ部位が枯渇したｈＡＡＴプロモーターである。このカセットは、理論的には２つの転写物の発現を可能にする。このＣＫ８プロモーターは、筋細胞型内で転写物を発現するが、ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧは、肝細胞内で転写物を産生する。この場合も、両方の転写物に見られる最初の「ＡＴＧ」開始コドンは、意図された翻訳部位に生じる。
【0153】
ＬＭＴＰ１３：この直列型プロモーターカセットは、肝臓細胞と筋細胞の両方で導入遺伝子を発現するように操作した。これは、ＡｐｏＥエンハンサーに続いて、完全なＳｐｃ５．１２プロモーターカセットを含む。Ｓｐｃ５．１２プロモーターの下流は、ＡＴＧ部位が枯渇したｈＡＡＴプロモーターである。上記の実施例と同様に、カセットＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９、及びＬＭＴＰ２０はすべて、理論的には２つの転写物の発現を可能にする。１つは筋細胞発現に特異的であり、１つは肝臓細胞発現に特異的である。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0154】
ＬＭＴＰ１４：この配列は、ＡＴＧ部位が枯渇したｈＡＡＴプロモーターの上流に、最小Ｓｐｃ５．１２プロモーターを含む。ＶＨ４イントロンは、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0155】
ＬＭＴＰ１５：この配列は、ＡｐｏＥエンハンサーに続いて、最小Ｓｐｃ５．１２プロモーターを含む。ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧは、最小Ｓｐｃ５．１２プロモーターの下流に配置される。ＶＨ４イントロンは、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0156】
ＬＭＴＰ１８：この直列型プロモーター配列は、５’から３’に、Ｍｃｋエンハンサー（ＭｃｋＥ）の１つのコピーの上流にＡｐｏＥエンハンサー、ＣＫ８プロモーター、及び最後にｈＡＡＴ－ΔＡＴＧプロモーターを含むように構築した。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）に配置した。
【0157】
ＬＭＴＰ１９：この直列型プロモーター配列は、５’から３’に、ＣＫ８プロモーターの上流にＡｐｏＥエンハンサー（Ｍｃｋエンハンサーエレメントを欠く）、続いてｈＡＡＴ－ΔＡＴＧプロモーターを含むように構築した。
【0158】
ＬＭＴＰ２０：この直列型プロモーター配列は、５’から３’に、Ｍｃｋエンハンサー（ＭｃｋＥ）の２つのコピーの上流にＡｐｏＥエンハンサー、ＣＫ８プロモーター、その後続いてｈＡＡＴ－ΔＡＴＧプロモーターを含むように構築した。
【0159】
これらの配列エレメントを含むＡＡＶプロウイルス（シス）プラスミドもまた感染性ベクター粒子にパッケージングし、遺伝子治療用の製剤として精製した。
【0160】
６．１．４．肝臓／骨二重特異性直列型プロモーター（ＬＢＴＰ）
骨／肝臓二重特異性直列型プロモーターを設計し、組み換え技術によってシスプラスミドに組み込んだ。図８Ｂを参照されたい。
骨／肝臓二重特異性直列型プロモーターを設計し、組み換え技術によってシスプラスミドに組み込んだ。図８Ｂを参照されたい。
【0161】
ＬＢＴＰ１：骨芽細胞特異的発現を駆動する最小Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター断片は、Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーターの転写活性のある断片であると特定された（Ｌｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２８１，６２９７－６３０６，Ｊａｎｕａｒｙ １２，２００６、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＬＢＴＰ１配列は、５’に肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝臓制御領域、及び３’にＡＴＧトリヌクレオチドが枯渇したｈＡＡＴプロモーター（ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧ）が配置された最小Ｓｐ７プロモーター断片（配列番号３０）の１つのコピーを含み、図１に示す通り、肝細胞特異的発現を駆動する。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）、すなわち、ｈＡＡＴΔＡＴＧの下流に配置した。
【0162】
ＬＢＴＰ２：完全長Ｓｐ７／Ｏｓｘプロモーター（Ｌｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２８１，６２９７－６３０６，Ｊａｎｕａｒｙ １２，２００６、参照により全体として本明細書に組み込まれる）（配列番号３１）は、５’に肝臓特異的ＡｐｏＥエンハンサー／肝臓制御領域、及び３’にＡＴＧ部位が枯渇したｈＡＡＴプロモーター（ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧ）が配置され、図２に示す通り、肝細胞特異的発現を駆動する。理論に拘束されることを望むものではないが、この設計は、２つのｍＲＮＡ転写物の発現を可能にし得る（骨プロモーター及び肝臓プロモーターの各々によって駆動される）。しかしながら、タンパク質の翻訳開始は、タンパク質コード配列の単一の意図された開始コドンでのみ生じる。キメラβ－グロビン／Ｉｇイントロンを、プロモーター配列の下流（３’）、すなわち、ｈＡＡＴ－ΔＡＴＧの下流に配置した。
【0163】
ＬＢＴＰ１及びＬＢＴＰ２プロモーターを含むシスプラスミドを、リソソーム酵素（導入遺伝子）を発現するように構築し、カセット全体の両側にＡＡＶのＩＴＲを配置した。ＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２プロモーターは、特に骨芽細胞及び肝細胞において遺伝子治療ベクターの発現をもたらすと期待されている。これらの配列エレメントを含むＡＡＶプロウイルス（シス）プラスミドを、感染性ベクター粒子にパッケージングし、遺伝子治療用の製剤として精製することができる。
【0164】
６．２．実施例２－肝臓特異的プロモーターによって駆動されるＧＦＰ発現
ＧＦＰに作動可能に連結された汎用ＣＡＧプロモーター（配列番号１７）を使用した構築物を含めた図１に示す８種のＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。簡潔には、Ｈｕｈ－７細胞及びＣ２Ｃ１２細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に維持した。一過性トランスフェクションを、それぞれ、６ウェルプレートにて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰを発現する各ベクタープラスミド１μｇを用いて行った。４８時間のトランスフェクション後、細胞ペレット及び培地を回収し、さらに処理するまで－２０℃で保存した。ＬＴＰ３を除く各構築物は、さらに、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンをプロモーター配列の下流（３’）に含む。様々なベクターの遺伝子発現の結果を表５、図２、図３、及び図４に示す。ＬＳＰＸ１（配列番号１）、ＬＳＰＸ２（配列番号２）、ＬＴＰ１（配列番号３）、ＬＴＰ２（配列番号４）、及びＬＴＰ３（配列番号５）は肝臓特異性を維持している。
ＧＦＰに作動可能に連結された汎用ＣＡＧプロモーター（配列番号１７）を使用した構築物を含めた図１に示す８種のＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトした。簡潔には、Ｈｕｈ－７細胞及びＣ２Ｃ１２細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に維持した。一過性トランスフェクションを、それぞれ、６ウェルプレートにて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰを発現する各ベクタープラスミド１μｇを用いて行った。４８時間のトランスフェクション後、細胞ペレット及び培地を回収し、さらに処理するまで－２０℃で保存した。ＬＴＰ３を除く各構築物は、さらに、ヒトβ－グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンをプロモーター配列の下流（３’）に含む。様々なベクターの遺伝子発現の結果を表５、図２、図３、及び図４に示す。ＬＳＰＸ１（配列番号１）、ＬＳＰＸ２（配列番号２）、ＬＴＰ１（配列番号３）、ＬＴＰ２（配列番号４）、及びＬＴＰ３（配列番号５）は肝臓特異性を維持している。
【表8】
【0165】
６．３．実施例３－直列型肝臓及び筋特異的プロモーターの遺伝子発現の分析
実施例２と同様の実験において、図５に示す発現カセット、図１に示すｈＡＡＴプロモーターカセット、ならびに図には示さず、ＩＴＲが両側に配置されたさらなる対照ＣＡＧプロモーター（配列番号１７）構築物を有する５種のＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトし、遺伝子発現を評価した。
実施例２と同様の実験において、図５に示す発現カセット、図１に示すｈＡＡＴプロモーターカセット、ならびに図には示さず、ＩＴＲが両側に配置されたさらなる対照ＣＡＧプロモーター（配列番号１７）構築物を有する５種のＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びＣ２Ｃ１２細胞にトランスフェクトし、遺伝子発現を評価した。
【0166】
図６は、構築物ＣＡＧ（汎用、配列番号１７）、ｈＡＡＴ（肝臓特異的、配列番号１１）、ＣＫ８（筋特異的、配列番号１６）、及びＬＭＴＰ６（二重特異性、配列番号６）のＧＦＰ遺伝子発現の相対強度を示す。キメライントロンを含むＬＭＴＰ６構築物（ＬＭＴＰ６プラスイントロン）は、イントロンを含まないＬＭＴＰ６と比較して、ＧＦＰ遺伝子発現の増加を示す。図７のＧＦＰ発現の定量的尺度も参照されたい。
【0167】
図３に示す通り、すべての肝臓特異的プロモーターは、筋細胞でのＧＦＰ発現についてはサイレントであるが、対照筋プロモーター（Ｓｐｃ５１２、ＣＫ８）及びＬＭＴＰ６、すなわち、筋肉及び肝臓の両方に対して二重特異性であるプロモーターは、アクティブである。
【0168】
実施例２と同様の他の実験を、ＬＭＴＰ１３（配列番号２１）、ＬＭＴＰ１４（配列番号２２）、ＬＭＴＰ１５（配列番号２３）、ＬＭＴＰ１８（配列番号２４）、ＬＭＴＰ１９（配列番号２５）、ＬＭＴＰ２０（配列番号２６）（図８Ａ）及びそれらが筋細胞由来細胞株であるＣ２Ｃ１２でＧＦＰ発現を駆動する能力（図９Ａ及び９Ｂ）を調べるために行った。肝臓／筋二重特異性プロモーターＬＭＴＰ１３は、筋特異的Ｓｐｃ５．１２及び最小Ｓｐｃ５．１２の両プロモーターと比較して、ＧＦＰ発現を駆動する能力の向上を示す。ＬＭＴＰ１４、ＬＭＴＰ１５、及び最小Ｓｐｃ５．１２プロモーターは、同等のＧＦＰ発現レベルを達成し、陰性対照及び肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターよりも優れている。ＬＭＴＰ６及びＬＭＴＰ２０は、筋特異的ＣＫ８プロモーターよりも優れている。調べたすべてのＬＭＴＰ構築物は、陰性対照及び肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターの両方と比較して、ＧＦＰ発現の増加を示す。
【0169】
６．４．実施例４－抗血漿カリクレイン抗体の発現を駆動する直列型肝臓特異的及び直列型肝臓／筋特異的プロモーターの遺伝子発現の分析
ｐＫａｌ抗体（Ｍａｂ１）の重鎖及び軽鎖配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むｃＤＮＡベースのベクターを構築した。この軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列を、Ｆｕｒｉｎ－Ｆ２Ａリンカー（ＲＫＲＲ（ＧＳＧ）ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）またはＦｕｒｉｎ－Ｔ２ＡリンカーＲＫＲＲ（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）により分離して、バイシストロン性ベクターを創出した。このベクターにはさらに、ある特定の実施形態では、構成的ＣＡＧプロモーターを含めた。
ｐＫａｌ抗体（Ｍａｂ１）の重鎖及び軽鎖配列をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むｃＤＮＡベースのベクターを構築した。この軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列を、Ｆｕｒｉｎ－Ｆ２Ａリンカー（ＲＫＲＲ（ＧＳＧ）ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）またはＦｕｒｉｎ－Ｔ２ＡリンカーＲＫＲＲ（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）により分離して、バイシストロン性ベクターを創出した。このベクターにはさらに、ある特定の実施形態では、構成的ＣＡＧプロモーターを含めた。
【0170】
上記表１は、肝臓特異的発現（ＬＳＰＸ１、ＬＳＰＸ２、ＬＴＰ１、ＬＴＰ２、またはＬＴＰ３、それぞれ、配列番号１～５）、肝臓及び筋肉の発現（ＬＭＴＰ６、ＬＭＴＰ１３、ＬＭＴＰ１５、ＬＭＴＰ１８、ＬＭＴＰ１９またはＬＭＴＰ２０、それぞれ、配列番号６、２１～２６）、肝臓及び骨の発現（ＬＢＴＰ１またはＬＢＴＰ２、それぞれ、配列番号３０～３１）を促進するように発現カセットに組み込まれ、導入遺伝子に作動可能に連結され得る複合核酸調節配列の配列を提供している。提供する他のプロモーター配列は、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７、上記表１）プロモーターを含み、ここでは、肝臓特異的アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーの４つのコピーを、ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターの上流に配置した。
【0171】
ｐＫａｌ Ｍａｂ１を発現するシスプラスミドをＡＡＶにパッケージングし、その後、ｒＡＡＶ粒子をＡＡＶによる形質導入の効力について評価した。各シスプラスミドは、ＣＡＧ（配列番号１７）、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）またはＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって駆動されるマルチシストロンであるＭａｂ１抗体の軽鎖及び重鎖を含んでいた。完全長Ｍａｂ１抗体の軽鎖及び抗体の重鎖の遺伝子は、各抗体鎖の別々の発現を確実にするためにフューリン２Ａリンカーによって分離した。カセット全体の両側にＡＡＶ２のＩＴＲを配置し、そのゲノムをＣ２Ｃ１２細胞への送達のためにＡＡＶ８カプシドに包む（ウェルあたり１Ｅ１０ｖｇ）。抗体タンパク質を検出するために、形質導入後、これらの細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｆｃ（ＩｇＧ）抗体で処理する。ＡＡＶ８．ＣＡＧ．Ｍａｂ１及びＡＡＶ８．ＬＭＴＰ６．Ｍａｂ１感染細胞は、筋細胞で高発現を示すが、ＡＡＶ８．ｈＡＡＴ．Ｍａｂ１感染は、筋細胞での抗体の発現を引き起こさない（図１０）。ＤＡＰＩ（ＤＮＡ）染色で見られるように、細胞はすべての試験ウェルで等しくコンフルエントで生存しているように見えた（図１０）。
【0172】
６．５．実施例５－様々なプロモーターによって駆動されるＡＡＶ８．Ｍａｂ１ベクターで処理したマウスにおける抗体発現及びベクターの生体内分布
チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ、配列番号１０）及びアルファ－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ、配列番号１１）プロモーターは、過去の前臨床及び臨床遺伝子治療試験で、肝臓特異的プロモーターとして広く使用されている。複数のプロモーター及びエンハンサーに由来する設計されたプロモーターカセットのパネルを生成し、ヒト肝臓細胞株であるＨｕｈ７細胞をトランスフェクトすることによってインビトロで調べた。ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）、ＬＳＰＸ１（配列番号１）、ＬＳＰＸ２（配列番号２）、ＬＴＰ１（配列番号３）及びＬＭＴＰ６（配列番号６）を含めたプロモーター候補を選択した。次に、これらのプロモーター候補によって調節されるＭａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクターを生成した。ＣＡＧ及びＴＢＧプロモーターによって調節されるＭａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクターは、それぞれ、ユビキタス及び肝臓特異的プロモーターの対照として機能した。これらのプロモーターの強度及びベクターの生体内分布を、各野生型マウスのベクターゲノムコピーと比較したＭａｂ１タンパク質の発現を測定することによりインビボで調べた。
チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ、配列番号１０）及びアルファ－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ、配列番号１１）プロモーターは、過去の前臨床及び臨床遺伝子治療試験で、肝臓特異的プロモーターとして広く使用されている。複数のプロモーター及びエンハンサーに由来する設計されたプロモーターカセットのパネルを生成し、ヒト肝臓細胞株であるＨｕｈ７細胞をトランスフェクトすることによってインビトロで調べた。ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）、ＬＳＰＸ１（配列番号１）、ＬＳＰＸ２（配列番号２）、ＬＴＰ１（配列番号３）及びＬＭＴＰ６（配列番号６）を含めたプロモーター候補を選択した。次に、これらのプロモーター候補によって調節されるＭａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクターを生成した。ＣＡＧ及びＴＢＧプロモーターによって調節されるＭａｂ１をコードするＡＡＶ８ベクターは、それぞれ、ユビキタス及び肝臓特異的プロモーターの対照として機能した。これらのプロモーターの強度及びベクターの生体内分布を、各野生型マウスのベクターゲノムコピーと比較したＭａｂ１タンパク質の発現を測定することによりインビボで調べた。
【0173】
ベクターを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対して、等用量（２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）にて静脈内に投与した。マウスの血清を２週間に一度採取し、Ｍａｂ１タンパク質発現レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ベクター投与の４９日後に肝臓サンプルを採取した。各サンプル中のウイルスゲノムの存在は、Ｍａｂ１プローブ及びプライマーを使用してＤｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｓｔｉｌｌａ製ＮＡＩＣＡ（商標）システム）により定量化した。グルカゴンのゲノムコピー数もまた各サンプルで同時に測定し、ウイルスゲノムを次に正規化し、細胞あたりのベクターゲノムコピー数として示した（２グルカゴン／細胞と仮定）。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８にて一元配置分散分析を使用して行った。
【0174】
肝臓特異的プロモーターを有するＡＡＶ８ベクターの中で、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）及びＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって駆動されるベクターが、すべての時点で最高量のタンパク質発現をもたらした（図１１Ａ）。それに対して、生体内分布データについては、異なるプロモーターによって駆動されるベクターで処理した動物の肝臓サンプルの細胞あたりのベクターゲノムコピー数に有意差はなかった（図１１Ｂ）。
【0175】
すべての肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーター（配列番号１０）よりも優れており、二重特異性ＬＭＴＰ６プロモーター（配列番号６）は、一貫して血清中で最も高い発現を示す（μｇ／ｍｌ）（図１１Ａ）。
【0176】
６．６．実施例６：静脈内投与後に組織特異的プロモーターによって調節されるＭａｂ１発現の特性評価
ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）またはＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって調節されるＭａｂ１（抗ｐＫａｌ抗体）発現の試験に焦点を合わせ、（実施例５に）類似のインビボ実験を行った。ＡＡＶ８ベクター（２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）を、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝５／群）に対して静脈内投与した。Ｍａｂ１レベルを、マウス血清から様々な時点でＥＬＩＳＡにより定量化した。ＬＭＴＰ６プロモーターによって駆動されるベクターは、抗体濃度の有意な増加を７日目に示した（図１２Ａ）。
ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）またはＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって調節されるＭａｂ１（抗ｐＫａｌ抗体）発現の試験に焦点を合わせ、（実施例５に）類似のインビボ実験を行った。ＡＡＶ８ベクター（２．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ）を、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝５／群）に対して静脈内投与した。Ｍａｂ１レベルを、マウス血清から様々な時点でＥＬＩＳＡにより定量化した。ＬＭＴＰ６プロモーターによって駆動されるベクターは、抗体濃度の有意な増加を７日目に示した（図１２Ａ）。
【0177】
さらに、肝臓及び心臓での導入遺伝子の発現を、全組織でＧＡＰＤＨに正規化したＭａｂ１ ｍＲＮＡコピーのｄｄＰＣＲ分析で定量化した。ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ及びＬＭＴＰ６駆動ベクターは、肝臓において、ＣＡＧと比較して導入遺伝子発現の増加を示した。ＬＭＴＰ６は、心筋において、ＣＡＧプロモーターと同等の発現を示したが、ｈＡＡＴ活性ははるかに低下した（図１２Ｂ）。
【0178】
６．７．実施例７：筋内投与後に組織特異的プロモーターによって調節されるＭａｂ１発現の特性評価
過去の試験では、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）またはＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって調節されるＡＡＶ８によるＭａｂ１の高肝臓駆動発現が特定された。本試験の目的は、腓腹筋（ＧＡ）筋にＭａｂ１ベクターを直接注入した後のＬＭＴＰ６プロモーターの筋駆動発現を特徴づけることであった。動物は、５×１０１０ｖｇの両側注射をＧＡ筋に受けた。血清を２週間に一度採取し、全身Ｍａｂ１濃度を測定した（図１３Ａ）。注射の４９日後に動物を捕獲し、関連組織（肝臓、ＧＡ筋、心臓）を、ベクターの生体内分布及び導入遺伝子発現に関して分析した。
過去の試験では、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ（配列番号３７）またはＬＭＴＰ６（配列番号６）プロモーターによって調節されるＡＡＶ８によるＭａｂ１の高肝臓駆動発現が特定された。本試験の目的は、腓腹筋（ＧＡ）筋にＭａｂ１ベクターを直接注入した後のＬＭＴＰ６プロモーターの筋駆動発現を特徴づけることであった。動物は、５×１０１０ｖｇの両側注射をＧＡ筋に受けた。血清を２週間に一度採取し、全身Ｍａｂ１濃度を測定した（図１３Ａ）。注射の４９日後に動物を捕獲し、関連組織（肝臓、ＧＡ筋、心臓）を、ベクターの生体内分布及び導入遺伝子発現に関して分析した。
【0179】
遺伝子発現がＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ及びＬＭＴＰ６プロモーターによって調節されるベクターは、すべての時点で、ＣＡＧプロモーター駆動発現と比較して、血清中の抗体濃度の有意な増加を示した（図１３Ａ）。本実験では、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴとＬＭＴＰ６に有意差はなかった。ベクター化Ｍａｂ１の細胞あたりのベクターゲノムコピーを、ＧＡ、肝臓及び心臓で検出及び定量化し（図１３Ｂ）、二重筋／肝臓プロモーターであるＬＭＴＰ６ベクターでは、心臓において、顕著に異なる高ゲノム量が検出された。肝臓のＲＮＡ発現の増加はまた、ＧＡ筋に直接注入されたすべての試験ベクターでも４９日目に検出された（参照遺伝子と比較した相対的な遺伝子発現比）（図１３Ｃ）。肝臓、ＧＡ筋、及び心臓の各々からの遺伝子発現（ｍＲＮＡμｇ／ｍＬ）データ（図１３Ｄ）は、筋内投与後の肝臓及び筋組織におけるＬＭＰＴ６の二重特異性を示すが、ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ駆動サンプルは、筋肉においてＬＭＴＰ６及びＣＡＧと比較して減少した。ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴ群とＬＭＴＰ６群の間にも有意差が見られた。
【0180】
６．８．実施例８－酵素の発現を駆動する直列型肝臓特異的及び直列型肝臓／筋特異的プロモーターの遺伝子発現の分析
６．８．１．リソソーム酵素のインビトロ発現
Ｈｕｈ７細胞（肝細胞）を異なるプロモーターによって駆動されるリソソーム酵素で形質導入し、タンパク質前駆体の分泌について調べたこと以外は（実施例４と）同様のインビトロ実験を行った（図１４）。
６．８．１．リソソーム酵素のインビトロ発現
Ｈｕｈ７細胞（肝細胞）を異なるプロモーターによって駆動されるリソソーム酵素で形質導入し、タンパク質前駆体の分泌について調べたこと以外は（実施例４と）同様のインビトロ実験を行った（図１４）。
【0181】
６．８．２．リソソーム酵素のインビボ発現
インビボ試験をＣ５７ＢＬ／６マウスで行い、これら野生型マウスへのＡＡＶ送達で発現されたリソソーム酵素の血清発現及び活性を評価した。０日目に、各動物に、５ｅ１２ＧＣ／ｋｇ体重（最終用量１ｅ１１ＧＣ／動物）のシスプラスミドをＩＶにより投与した。１２週間、すべての動物から血清／血漿を２週間に一度、従って、０、２、４、６、８、１０、１２週で採取（剖検時）。動物は、剖検時にＰＢＳで灌流し、器官から血液を除去した後、サンプルを採取した。各血液サンプルから血清を採取し、リソソーム酵素活性を分析した。インビボで導入遺伝子の発現を駆動する異なるプロモーターを含む各サンプルの生体内分布の分析のため、剖検時に組織も採取した。
インビボ試験をＣ５７ＢＬ／６マウスで行い、これら野生型マウスへのＡＡＶ送達で発現されたリソソーム酵素の血清発現及び活性を評価した。０日目に、各動物に、５ｅ１２ＧＣ／ｋｇ体重（最終用量１ｅ１１ＧＣ／動物）のシスプラスミドをＩＶにより投与した。１２週間、すべての動物から血清／血漿を２週間に一度、従って、０、２、４、６、８、１０、１２週で採取（剖検時）。動物は、剖検時にＰＢＳで灌流し、器官から血液を除去した後、サンプルを採取した。各血液サンプルから血清を採取し、リソソーム酵素活性を分析した。インビボで導入遺伝子の発現を駆動する異なるプロモーターを含む各サンプルの生体内分布の分析のため、剖検時に組織も採取した。
【表9】
【0182】
採取した血清中の酵素活性を調べたところ、ＬＳＰＸ１、ＬＴＰ１、及びＬＭＴＰ６は、８４日目まで、未処置（内因性の血清酵素レベル）またはＴＢＧ１駆動構築物よりも高い活性を有する適切な酵素を発現すると思われる。
【0183】
６．９．実施例９－直列型肝臓及び骨特異的プロモーターの遺伝子発現の分析
６．９．１．ＧＦＰのインビトロトランスフェクション及び発現
実施例２と同様の実験で、ＧＦＰに作動可能に連結された汎用ＣＡＧプロモーターを使用した構築物を含めた図８Ｂに示すＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びｈＦＯＢ１．１９細胞にトランスフェクトする。簡潔には、Ｈｕｈ－７細胞及びｈＦＯＢ１．１９細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に維持する。一過性トランスフェクションを、６ウェルプレートにて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰを発現する各ベクタープラスミド１μｇを用いて行う。４８時間後、トランスフェクションを蛍光顕微鏡検査法で評価し、細胞ペレット及び培地を回収し、さらに処理するまで－２０℃で保存する。
６．９．１．ＧＦＰのインビトロトランスフェクション及び発現
実施例２と同様の実験で、ＧＦＰに作動可能に連結された汎用ＣＡＧプロモーターを使用した構築物を含めた図８Ｂに示すＧＦＰ発現構築物（ＡＡＶシスプラスミド）を、ＨｕＨ７及びｈＦＯＢ１．１９細胞にトランスフェクトする。簡潔には、Ｈｕｈ－７細胞及びｈＦＯＢ１．１９細胞を、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン－ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に維持する。一過性トランスフェクションを、６ウェルプレートにて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＧＦＰを発現する各ベクタープラスミド１μｇを用いて行う。４８時間後、トランスフェクションを蛍光顕微鏡検査法で評価し、細胞ペレット及び培地を回収し、さらに処理するまで－２０℃で保存する。
【0184】
６．９．２．目的の遺伝子のインビトロ形質導入及び発現
抗体、リソソーム酵素または目的の他の遺伝子を発現するシスプラスミドをＡＡＶにパッケージングし、ｒＡＡＶ粒子を、ＡＡＶによる形質導入の効力について評価する。各シスプラスミドは、リソソーム酵素または目的の他の遺伝子、例えば、同じプロモーターによって駆動されるマルチシストロンである抗体の軽鎖及び重鎖を含む。抗体導入遺伝子の例では、完全長抗体の軽鎖及び抗体の重鎖の遺伝子は、各抗体鎖の別々の発現を確実にするためにフューリン２Ａリンカーによって分離する。カセット全体の両側にＡＡＶ２のＩＴＲを配置し、そのゲノムをｈＦＯＢ１．１９細胞への送達のためにＡＡＶ８カプシドに包む。タンパク質を検出するために、形質導入後、これらの細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗導入遺伝子抗体または他の検出方法で処理する。ＡＡＶ８．ＣＡＧ．導入遺伝子、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．導入遺伝子、及び／またはＡＡＶ８．ｈＡＡＴ．導入遺伝子を対照として使用する。細胞のコンフルエンシーと生存率は、ＤＡＰＩ染色を使用して確認する。
抗体、リソソーム酵素または目的の他の遺伝子を発現するシスプラスミドをＡＡＶにパッケージングし、ｒＡＡＶ粒子を、ＡＡＶによる形質導入の効力について評価する。各シスプラスミドは、リソソーム酵素または目的の他の遺伝子、例えば、同じプロモーターによって駆動されるマルチシストロンである抗体の軽鎖及び重鎖を含む。抗体導入遺伝子の例では、完全長抗体の軽鎖及び抗体の重鎖の遺伝子は、各抗体鎖の別々の発現を確実にするためにフューリン２Ａリンカーによって分離する。カセット全体の両側にＡＡＶ２のＩＴＲを配置し、そのゲノムをｈＦＯＢ１．１９細胞への送達のためにＡＡＶ８カプシドに包む。タンパク質を検出するために、形質導入後、これらの細胞をＦＩＴＣコンジュゲート抗導入遺伝子抗体または他の検出方法で処理する。ＡＡＶ８．ＣＡＧ．導入遺伝子、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．導入遺伝子、及び／またはＡＡＶ８．ｈＡＡＴ．導入遺伝子を対照として使用する。細胞のコンフルエンシーと生存率は、ＤＡＰＩ染色を使用して確認する。
【0185】
６．９．３．ベクター化抗体のインビボ発現
マウスに、異なる肝臓特異的、肝臓直列及び肝臓・骨プロモーター（ＬＢＴＰ１及びＬＢＴＰ２）によって調節される治療用抗体（例えば、表４Ｃまたは４Ｄに含まれるもの）をコードする導入遺伝子をコードするｒＡＡＶ８ベクター２．５Ｅ１２ｇｃ／ｋｇまたは１Ｅ１３ｇｃ／ｋｇをＩＶ注射し、この導入遺伝子の血清発現を評価する。ＣＡＧ及びＴＢＧプロモーターを対照として使用する。血清を１週間間隔でマウスから採取する。
マウスに、異なる肝臓特異的、肝臓直列及び肝臓・骨プロモーター（ＬＢＴＰ１及びＬＢＴＰ２）によって調節される治療用抗体（例えば、表４Ｃまたは４Ｄに含まれるもの）をコードする導入遺伝子をコードするｒＡＡＶ８ベクター２．５Ｅ１２ｇｃ／ｋｇまたは１Ｅ１３ｇｃ／ｋｇをＩＶ注射し、この導入遺伝子の血清発現を評価する。ＣＡＧ及びＴＢＧプロモーターを対照として使用する。血清を１週間間隔でマウスから採取する。
【0186】
６．１０．実施例１０－直列型プロモーターによって駆動される遺伝子からのＲＡＣＥ反応生成物からの翻訳開始部位の分析
６．１０．１．ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）産物の生成
異なるプロモーターによって駆動されるＤＮＡ導入遺伝子（高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））を含むプラスミドを、筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２細胞）または肝臓細胞株（Ｈｕｈ７細胞）にトランスフェクトした。全ＲＮＡを、トランスフェクトされた細胞から、トランスフェクションの２～５日後にＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキット（アイテム番号ＲＥＦ ７４０９５５、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマー（ＳＰ１、表７、配列番号３８）及び第２世代ＲＡＣＥキット（カタログ番号０３３５３６２１００１、Ｒｏｃｈｅ）を使用し、標準的な指導法により合成した。ｃＤＮＡの合成後、ホモポリマーＡテールを、組み換えターミナルトランスフェラーゼ及びｄＡＴＰを用いてファーストストランドｃＤＮＡの３’末端に付加した。ｄＡテールｃＤＮＡは、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１７３２６４１００１）を使用し、ＳＰ２及びオリゴｄＴアンカープライマー（表７、それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０）で増幅した。複数の可変長生成物が予想されたため、個々のバンドをゲル抽出で単離せず、その代わりに生成物全体を一緒に精製し、その後配列決定及び分析した。
６．１０．１．ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）産物の生成
異なるプロモーターによって駆動されるＤＮＡ導入遺伝子（高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ））を含むプラスミドを、筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２細胞）または肝臓細胞株（Ｈｕｈ７細胞）にトランスフェクトした。全ＲＮＡを、トランスフェクトされた細胞から、トランスフェクションの２～５日後にＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡキット（アイテム番号ＲＥＦ ７４０９５５、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマー（ＳＰ１、表７、配列番号３８）及び第２世代ＲＡＣＥキット（カタログ番号０３３５３６２１００１、Ｒｏｃｈｅ）を使用し、標準的な指導法により合成した。ｃＤＮＡの合成後、ホモポリマーＡテールを、組み換えターミナルトランスフェラーゼ及びｄＡＴＰを用いてファーストストランドｃＤＮＡの３’末端に付加した。ｄＡテールｃＤＮＡは、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１７３２６４１００１）を使用し、ＳＰ２及びオリゴｄＴアンカープライマー（表７、それぞれ、配列番号３９及び配列番号４０）で増幅した。複数の可変長生成物が予想されたため、個々のバンドをゲル抽出で単離せず、その代わりに生成物全体を一緒に精製し、その後配列決定及び分析した。
【表10】
【0187】
６．１０．２．ＲＡＣＥ生成物の分析：配列決定及びデータ処理
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）反応生成物を、ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺシステム（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）によるＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）プラットフォームでの増幅産物ベースの配列決定に供した。
ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）反応生成物を、ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＥＺシステム（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）によるＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）プラットフォームでの増幅産物ベースの配列決定に供した。
【0188】
得られたファイルタイプｆａｓｔｑ．ｇｚの配列データを、ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇによるオープンソースのデータ分析ツールを介して処理した（Ａｆｇａｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｇａｌａｘｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｅｓ：２０１８ ｕｐｄａｔｅ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６，Ｉｓｓｕｅ Ｗ１，２ Ｊｕｌｙ ２０１８，Ｐａｇｅｓ Ｗ５３７－Ｗ５４４，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ３７９）。図１５を参照されたい。「リード」とは、鋳型の配列を表す途切れのない一連のヌクレオチドを指す。この場合、各リードは、試験サンプルからのＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーを表す。同じ開始部位を有するＲＮＡ転写物の数の測定値は、最も転写的に活性な部位を示す。
【0189】
簡潔には、順方向及び逆方向のリードの終わりにある低クオリティのベースコールを、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを使用して削除した（または「トリミングした」）（Ｂｏｌｇｅｒ，ＡＭ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ １５，１ Ａｕｇｕｓｔ ２０１４，Ｐａｇｅｓ ２１１４－２１２０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ１７０）。ＲＮＡアライメントツールを使用して、参照プラスミド配列に対してペアードドエンドリードをアライメントしてＢＡＭファイルを得、別のツール、Ｓａｍｔｏｏｌｓ ｖｉｅｗを次いで実行し、ＢＡＭファイルからのアライメントされていないリードを削除した（Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＳＡＭｔｏｏｌｓ．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５（１６），ｐｐ．２０７８－２０７９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ３５２）。データの処理を続行するために、ＢＡＭからＳＡＭへのツールを使用してバイナリＢＡＭファイルを表形式のＳＡＭファイルに変換した。その後のデータ操作ステップは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌで行った（Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，上記、Ｌｉ，Ｈ．，２０１１，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＳＮＰ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ｂａｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｑｕａｌｉｔｙ．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２７（８），ｐｐ．１１５７－１１５８，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ０７６、Ｌｉ，Ｈ．，２０１１，“Ａ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ＳＮＰ ｃａｌｌｉｎｇ，ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ．”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２７（２１），ｐｐ．２９８７－２９９３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ５０９）。ＭＡＰＱ値が６０未満かつ長さが２０未満のリードを削除した。リードペアの最初の塩基が参照配列の各遺伝子座とアライメントされた場合の数を表にした。転写開始部位の計算に使用した目的の領域は、５’ＩＴＲの５’末端から開始し、遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）の３００ｂｐ５’で終わるものとして定義した。目的の領域内のアライメント開始部位でのリードの総数を集計し、その領域内での各遺伝子座で開始するリードの数を、その総数で除し、表にした。その領域内で、全リード開始数の１％以上を表す遺伝子座を潜在的な転写開始部位として強調表示した。表８～１４及び図１６Ａ～１６Ｆを参照されたい。
【0190】
６．１０．３．ＲＡＣＥによって決定される転写開始部位（ＴＳＳ）
表８～１１に示す通り、これらのデータは、肝臓及び筋細胞で調べた各プロモーター駆動導入遺伝子（ｅＧＦＰ）の主要及び副次の両転写開始部位（ＴＳＳ）を明らかにした。ヌクレオチド（ｎｔ）の開始番号は、参照プラスミド配列に基づいて（表に）示した。配列を同定した後、その配列を本明細書に記載の個々のプロモーターの配列番号に相関させた。
表８～１１に示す通り、これらのデータは、肝臓及び筋細胞で調べた各プロモーター駆動導入遺伝子（ｅＧＦＰ）の主要及び副次の両転写開始部位（ＴＳＳ）を明らかにした。ヌクレオチド（ｎｔ）の開始番号は、参照プラスミド配列に基づいて（表に）示した。配列を同定した後、その配列を本明細書に記載の個々のプロモーターの配列番号に相関させた。
【0191】
Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｈＡＡＴプロモーターの場合、活性の低いＴＳＳであるにもかかわらず、合計でフィルタリングされたリード全体の３４％を占める主要な転写開始部位がヌクレオチド（ｎｔ）６６０～６７８（表８、灰色で強調表示された行）で特定された。ヌクレオチド６６０～６７８、ＧＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４１）は、ｈＡＡＴのプロモーター配列である配列番号１１のヌクレオチド１３９～１５７、または配列番号１２のｎｔ１３９～１５７にあるＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧ（配列番号４２）、修飾ΔＡＴＧ ｈＡＡＴ配列に相当する。選択的スプライシング部位も観察された。例えば、選択的スプライシング部位は、Ｃ２Ｃ１２のＮＧＳによって、ｈＡＡＴプロモーターによって駆動される遺伝子についても特定された一方で、塩基のスキッピングが生じた（参照プラスミド配列のナンバリングに基づいて、ｎｔ９１９～１０５２、約６７８～８１５、及び６８０～１０５２、データは示さず）。
【表11】
【0192】
Ｈｕｈ７細胞におけるｈＡＡＴプロモーターの主要な転写開始部位は、８７６～８８０、ＴＣＴＣＣ（配列番号４３）で同定され、フィルタリングされたリード全体の５２％を占めた。配列ＴＣＴＣＣ（配列番号４３）は、配列番号１１または配列番号１２のｎｔ３５５～３５９に相当する。表９。
【表12】
【0193】
ＣＫ８プロモーターのＴＳＳは、ｎｔ１０２４～１０３１（ＴＣＡＴＴＣＴＡ、配列番号４４）で検出された。これは、Ｃ２Ｃ１２細胞で活性が高く、筋細胞において（合計で）８１％のリードを生じた。ヌクレオチド１０２４～１０３１（ＴＣＡＴＴＣＴＡ、配列番号４４）は、配列番号１６のｎｔ３７７～３８４に相当する。表１０。
【表13】
【0194】
Ｃ２Ｃ１２細胞でＴＳＳとして同定されたものと同じ部位は、Ｈｕｈ７における１０２５～１０３３（ＣＡＴＴＣＴＡＣＣ、配列番号４５）の部位と相関するが、この部位は、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるプロモーターの転写活性（表１０）と比較した場合、活性が低い（６２％リード、表１１）。ヌクレオチド１０２５～１０３３（ＣＡＴＴＣＴＡＣＣ、配列番号４５）は、配列番号１６のｎｔ３７８～３８６に相当する。
【表14】
【0195】
Ｃ２Ｃ１２細胞でＬＭＴＰ６プロモーターを調べたところ、３つのＴＳＳが同定された：１３２１～１３２４部位は、ＣＫ８の開始部位（全リードの３３％を占める）と相関し、１５０５は、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｈＡＡＴプロモーターと相関し、１７０２～１７３７は、Ｈｕｈ７細胞におけるｈＡＡＴの開始部位と相関する。表１２を参照されたい。
【0196】
１３２１～１３２４の活性筋特異的ＴＳＳは、直列型プロモーター配列のＣＫ８プロモーター部分に見られ、配列番号６のヌクレオチド１１３１～１１３３（ＣＡＴ）に相当する。ヌクレオチド１５０５は、ＬＭＴＰ６直列型プロモーターのｈＡＡＴ部分に位置するが、Ｃ２Ｃ１２細胞ではわずかに活性であり、配列番号６のｎｔ１３１４に相当する。また、１７０２～１７３７で同定される別のわずかに活性なＴＳＳは、配列番号６のｎｔ１５１２～１５４７に相当する。
【表15】
【0197】
Ｈｕｈ７細胞のＬＭＴＰ６プロモーターの場合、主要な開始部位は肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーター（１７３２～１７３６）に位置し、これは、活性が高く、フィルタリングされたリード全体の少なくとも７２％に相当する。２つの副次ＴＴＳは、ｉ）ｈＡＡＴプロモーター上のＴＳＳ（１５１４～１５１６）として、及びｉｉ）ＣＫ８プロモーター上の別のＴＳＳ（１３２４）として同定された。表１３を参照されたい。
【表16】
【0198】
１７３２～１７３６で同定され、Ｈｕｈ７細胞で活性なＬＭＴＰ６プロモーター部位は、ＴＣＴＣＣ（配列番号４３）であり、配列番号６のｎｔ１５４１～１５４５に相当する。１５１４～１５１６で同定され、同様にＨｕｈ７細胞でわずかに活性なＬＭＴＰ６プロモーター部位は、ＣＡＧであり、配列番号６のｎｔ１３２３～１３２５に相当し、１３２４で同定されたＴＳＳは、直列型プロモーター配列のＣＫ８プロモーター上にあり、配列番号６のヌクレオチド１１３３に相当する。
【表17】
【0199】
遺伝子が発現された細胞型に応じて、プロモーターごとに主要及び副次ＴＳＳを同定した。例えば、Ｃ２Ｃ１２（筋）細胞でのＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター駆動遺伝子は、活性が非常に低いいくつかの開始部位を含んでいたが、Ｈｕｈ７（肝臓）細胞で発現した同じプラスミドは、異なるＴＳＳで高活性を示す。表１０及び表１１。ＣＫ８プロモーターは、ＴＳＳに関してはＣ２Ｃ１２細胞及びＨｕｈ７で同様に働いたが、このプロモーターは、予想通り、筋細胞株であるＣ２Ｃ１２でより活性が高かった。
【0200】
興味深いことに、直列型プロモーターであるＬＭＴＰ６は、肝臓細胞においてＬＭＴＰ６配列番号６のｎｔ１５４１～１５４５に主要なＴＳＳを生じ、これは、単一プロモーターのｈＡＡＴの場合の同じＴＳＳと相関する。副次ＴＳＳは、直列型ＬＭＴＰ６及びｈＡＡＴ単独の両方の間で相関するが、相関関係にあるＣＫ８のＴＳＳは副次と見なされた（ｎｔ１３２４、リードの１％のみ）。ＬＭＴＰ６駆動導入遺伝子は、ＣＫ８の単一プロモーターと比較して、Ｃ２Ｃ１２細胞の転写部位とも相関した。Ｃ２Ｃ１２細胞においてＬＭＴＰ６で活性が認められた筋特異的ＴＳＳは、これらの細胞でＣＫ８において同定された主要なＴＳＳと重複する。本明細書に示す転写開始部位の完全性を考慮し、かつ直列型プロモーターにおける余分なＡＴＧ翻訳開始部位を排除して最終タンパク質の異常種の翻訳全体をさらに減少させることにより、本開示の直列型プロモーターは、導入遺伝子の効率的かつ堅牢な発現を提供する。
【0201】
均等物
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に説明されているが、機能的に均等である類型が本発明の範囲内であることが理解される。実際、本明細書に示され、記載されているものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験を超えるものを使用せずに確認することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
本発明は、その具体的な実施形態を参照して詳細に説明されているが、機能的に均等である類型が本発明の範囲内であることが理解される。実際、本明細書に示され、記載されているものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣用的な実験を超えるものを使用せずに確認することができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【0202】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により全体として本明細書に組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【0203】
本明細書の論述は、当技術分野が直面している問題の本質のより良好な理解を提供し、どのようにも先行技術として認めるものとして解釈されるべきではなく、また、本明細書におけるいかなる参考文献の引用も、かかる参考文献が本出願に対する「先行技術」を構成することを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0204】
本明細書で引用される特許出願及び刊行物を含むすべての参考文献は、個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、すべての目的のために参照により全体として組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度まで、すべての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。本発明の多くの改変及び類型が、当業者に明らかになるように、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載の特定の実施形態は、例として提供されているにすぎず、本発明は、かかる特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【国際調査報告】