特表 2022-544069 ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ならびにその調製および用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-17

(54)【発明の名称】ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ならびにその調製および用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20221007BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20221007BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221007BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20221007BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

C12N5/10

A61K35/17 Z

A61P35/00

A61P37/04

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506164

(86)(22)【出願日】2020-08-03

(85)【翻訳文提出日】2022-03-04

(86)【国際出願番号】 CN2020106635

(87)【国際公開番号】W WO2021018311

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】201910708725.9

(32)【優先日】2019-08-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520372940

【氏名又は名称】セルラー・バイオメディシン・グループ・エイチケー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ジー，イン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ウェイチー

(72)【発明者】

【氏名】ツイ，フイジュアン

(72)【発明者】

【氏名】ルオ，シャオビン

(72)【発明者】

【氏名】フアン，ジアチー

(72)【発明者】

【氏名】チュー，シーグイ

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ，シン

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ，イーホン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

(57)【要約】

Ｔ記憶幹細胞の割合がＣ１≧５０％を満たす非天然Ｔ集団が提供される。Ｔ細胞集団は、腫瘍抗原標的化ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための方法がさらに提供される。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、増幅率がより高く、表現型、ＩＦＮ－γ放出能、および標的細胞殺傷能がより優れている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非天然型Ｔ細胞集団であって、前記Ｔ細胞集団中のＴ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）のＣ１の割合が、前記Ｔ細胞集団中のＴ細胞の総数によって計算された５０％以上であることを特徴とする、非天然型Ｔ細胞集団。

【請求項2】

前記Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞集団。

【請求項3】

前記Ｔ記憶幹細胞が、ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞集団。

【請求項4】

前記Ｔ細胞集団において、バイオマーカーＣＣＲ７を発現するＣ２の割合が、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上であることを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞集団。

【請求項5】

前記ＣＡＲ－Ｔ細胞が、腫瘍抗原を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のＴ細胞集団。

【請求項6】

細胞調製物であって、前記細胞調製物が、請求項１に記載の非天然型Ｔ細胞集団と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と、を含むことを特徴とする、細胞調製物。

【請求項7】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程、
（ｂ）ＩＬ１５、ＩＬ７およびＩＬ２１の存在下で前記単離されたＴ細胞に対して増幅培養を行って、培養されたＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｃ）前記培養されたＴ細胞に対して操作修飾を行って、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する工程を含むことを特徴とする、方法。

【請求項8】

前記工程（ａ）において、前記単離されたＴ細胞が、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ細胞）、Ｔｎ細胞が豊富な細胞集団、全Ｔ細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記工程（ｂ）において、前記単離されたＴ細胞を増幅のために培養した場合、培養系中のＩＬ１５の濃度が、１～２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７の濃度が、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３～１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ２１の濃度が、１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ｉ）単離されたＴｎ細胞を提供する工程、
（ｉｉ）任意選択で、ＩＬ１５、ＩＬ７およびＩＬ２１の存在下で前記単離されたＴ細胞に対して増幅培養を行って、培養されたＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｉｉｉ）前記Ｔ細胞を修飾して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する工程を含むことを特徴とする、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学の分野に関し、より具体的には、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞ならびにその調製および用途に関する。

【背景技術】

【0002】

免疫療法、特に養子Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療のための臨床試験において強力な有効性および有望性を示している。Ｔ細胞は、抗原認識部分およびＴ細胞活性化領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変され得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞特異性および反応性を再方向付けするためにモノクローナル抗体の抗原結合特性を利用することができ、ＭＨＣ非依存的な様式で標的を標的化することができる。このタイプのＭＨＣ非依存性抗原認識は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞が抗原プロセシングを必要とすることなく抗原を認識することを可能にし、したがって、腫瘍回避の主要なメカニズムが無効にされる。加えて、ＣＡＲは、内因性ＴＣＲのα鎖またはβ鎖と二量体化しない。

【0003】

ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞免疫療法における自己Ｔ細胞の重要な代替資源であり、同種Ｔ細胞の内因性ＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子は、それぞれ、移植片対宿主病および宿主免疫拒絶を予防するためにノックアウトされる。同種ドナー由来のこれらの遺伝子編集細胞は、乳児または複数ラウンドの化学療法を受けた患者など、十分な自己Ｔ細胞を提供することができない患者のために細胞免疫療法の機会を提供する。

【0004】

現在、中国国内外で市場に承認されているユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞製品は存在しない。加えて、当該技術分野におけるユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞に関する研究には、依然として多くの欠陥が存在する。したがって、この分野では、所望の殺傷効果および高い安全性を有する、新しいユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞製品を開発することの緊急の必要性が存在している。

【発明の概要】

【0005】

本発明の目的は、Ｔｓｃｍが富化されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、ならびにその調製および用途を提供することである。

【0006】

本発明の第１の態様において、非天然型Ｔ細胞集団が提供される。Ｔ細胞集団におけるＴ記憶幹細胞（幹細胞様記憶Ｔ細胞、Ｔｓｃｍ）の割合Ｃ１は、Ｔ細胞集団におけるＴ細胞の総数に基づいて計算される５０％以上である。

【0007】

別の好ましい実施形態において、Ｃ１≧６０％、好ましくはＣ１≧７０％、より好ましくはＣ１≧７５％である。

【0008】

別の好ましい実施形態において、Ｃ１は、５０～８５％であり、好ましくは、６０～８０％である。

【0009】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

【0010】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、自己または同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

【0011】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。

【0012】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞において、以下の群から選択される免疫関連遺伝子がノックアウトまたはダウンレギュレートされる：ＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、またはそれらの組み合わせ。

【0013】

別の好ましい実施形態において、Ｔ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）がＣＡＲ－Ｔ細胞であるとき、Ｔ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）の割合Ｃ１は、Ｔ細胞集団中のＣＡＲ－Ｔ細胞の総数に基づいて計算される、５０％以上である。

【0014】

別の好ましい実施形態において、Ｃ１≧６０％、好ましくはＣ１≧７０％、より好ましくはＣ１≧７５％である。

【0015】

別の好ましい実施形態において、Ｃ１は、５０～８５％であり、好ましくは、６０～８０％である。

【0016】

別の好ましい実施形態において、Ｔ記憶幹細胞は、ＣＣＲ７^＋表現型を有する。

【0017】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞集団において、Ｔ細胞Ｃ３の含有量が、細胞集団中の細胞の総数に基づいて計算される、３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、９０％以上、または９５％以上である。

【0018】

別の好ましい実施形態において、Ｃ３は、３０～１００％、より好ましくは７０～９９．９％、さらにより好ましくは８０～９９％である。

【0019】

別の好ましい実施形態において、Ｔ記憶幹細胞は、ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を含む。

【0020】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞集団において、バイオマーカーＣＣＲ７を発現するＣ２の割合は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。

【0021】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性強度Ｑ１（平均蛍光強度ＭＦＩを例としてとる）５００以上、好ましくは１０００以上、より好ましくは３０００以上、さらにより好ましくは４０００以上（例えば、１０００～５０００）である。

【0022】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞集団は、インビトロで拡大されるか、または拡大されない。

【0023】

別の好ましい実施形態において、インビトロ増幅は、細胞培養のために好適な条件下で、培養系におけるＩＬ１５、ＩＬ７およびＩＬ２１（一般にＴｓｃｍ増幅因子と呼ばれる）の存在下で細胞増幅を実施することである。

【0024】

別の好ましい実施形態において、培養システムにおいて、Ｔｓｃｍ増幅因子の濃度は以下を含む：
ＩＬ１５の濃度は１～２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌであり、
ＩＬ７の濃度は０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３～１０ｎｇ／ｍｌであり、かつ／または
ＩＬ２１の濃度は１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌである。

【0025】

別の好ましい実施形態において、培養システムは、血清培養システムおよび無血清培養システムを含む。

【0026】

別の好ましい実施形態において、細胞増幅時間は、０．１～３０日、好ましくは０．５～２５日、より好ましくは１～２０日、さらに最も好ましくは２～１５日、または３～１５日、または５～１５日である。

【0027】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍抗原を標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞である。

【0028】

別の好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（Ｓａｒｃｏｍａ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。

【0029】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現し、キメラ抗原受容体の構造は以下の式Ｉに示され、
Ｌ－ｓｃＦｖ－Ｈ－ＴＭ－Ｃ－ＣＤ３ζ（Ｉ）

【0030】

式中、
各「－」は、独立して連結ペプチドまたはペプチド結合であり、
Ｌは、任意のシグナルペプチド配列であり、
ｓｃＦｖは、腫瘍抗原を標的とする抗体一本鎖可変領域配列であり、
Ｈは、任意のヒンジ領域であり、
ＴＭは、膜貫通ドメインであり、
Ｃは、存在しないか、または共刺激シグナル分子であり、
ＣＤ３ζは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル配列である。

【0031】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡを標的とするユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞である。

【0032】

別の好ましい実施形態において、ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡを標的とする。

【0033】

別の好ましい実施形態において、Ｌは、ＣＤ８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質のシグナルペプチドである。

【0034】

別の好ましい実施形態において、Ｈは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質のヒンジ領域である。

【0035】

別の好ましい実施形態において、ＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通領域である。

【0036】

別の好ましい実施形態において、Ｃは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質の共刺激シグナル分子である。

【0037】

別の好ましい実施形態において、Ｃは、４－１ＢＢに由来する共刺激シグナル分子、および／またはＣＤ２８に由来する共刺激シグナル分子を含む。

【0038】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に由来する。

【0039】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞集団は、本発明の第３の態様に記載される方法によって調製される。

【0040】

本発明の第２の態様において、細胞調製物が提供され、この細胞調製物は、本発明の第１の態様に従う非天然のＴ細胞集団、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。

【0041】

本発明の第３の態様において、以下の工程、
（ａ）単離されたＴ細胞を提供する工程、
（ｂ）ＩＬ１５、ＩＬ７およびＩＬ２１の存在下で単離されたＴ細胞に対して増幅培養を行って、培養されたＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｃ）培養されたＴ細胞に対して操作修飾を行って、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する工程を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法が提供される。

【0042】

別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、単離されたＴ細胞は、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ細胞）、Ｔｎ細胞が豊富な細胞集団、全Ｔ細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0043】

別の好ましい実施形態において、単離されたＴ細胞は、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ細胞）またはＴｎ細胞が豊富な細胞集団である。

【0044】

別の好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、自己または同種異系Ｔ細胞を含む。

【0045】

別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）において、単離されたＴ細胞を増幅のために培養する場合、培養系中のＩＬ１５の濃度は、１～２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７の濃度は、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは３～１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ２１の濃度は、１～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは３～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５～２０ｎｇ／ｍｌである。

【0046】

別の好ましい実施形態において、本方法は、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために使用される。

【0047】

別の好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍抗原ＢＣＭＡを標的とする。

【0048】

別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、Ｔ細胞は、ヒト末梢血、好ましくは末梢血単核細胞から単離される。

【0049】

別の好ましい実施形態において、単離されたＴ細胞は、全Ｔ細胞およびナイーブＴ細胞（Ｔｎ細胞）を含む。

【0050】

別の好ましい実施形態において、ナイーブＴ細胞は、ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋Ｔ細胞である。

【0051】

別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）では、増幅培養は、ＡＩＭ－Ｖ培地中で実施される。

【0052】

別の好ましい実施形態において、工程（ｂ）では、培養系は、ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｉｐ、またはそれらの組み合わせをさらに含み、好ましくは、ＦＢＳの濃度は５～２０％である。

【0053】

別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）では、医薬は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞ヌクレオフェクション、およびレンチウイルス形質導入を含む。

【0054】

別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）では、医薬は、以下の工程、
（１）ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズを用いて、培養したＴ細胞を活性化し、次に磁気ビーズを除去して活性化Ｔ細胞を得る工程、
（２）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用して活性化Ｔ細胞に対してヌクレオフェクションを行い、Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子および／またはＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトし、それによって核トランスフェクトＴ細胞を得る工程、ならびに
（３）ＣＡＲ発現カセットを含有するウイルスベクターを用いて核トランスフェクトされたＴ細胞を形質導入して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する工程を含む。

【0055】

本発明の第４の態様において、以下の工程、
（ｉ）単離されたＴｎ細胞を提供する工程、
（ｉｉ）任意選択で、ＩＬ１５、ＩＬ７およびＩＬ２１の存在下で単離されたＴ細胞に対して増幅培養を行って、培養されたＴ細胞を得る工程、ならびに
（ｉｉｉ）Ｔ細胞を修飾して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する工程を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法が提供される。

【0056】

本発明の第５の態様において、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞集団（特にＣＡＲ－Ｔ細胞）、または本発明の第２の態様に記載の細胞調製物の使用が、がんまたは腫瘍を予防および／または治療するための医薬の調製のために提供される。

【0057】

別の好ましい実施形態において、腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0058】

別の好ましい実施形態において、血液腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、びまん性Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0059】

別の好ましい実施形態において、固形腫瘍は、胃がん、胃がん、腹腔転移、肝臓がん、白血病、腎臓腫瘍、肺がん、小腸がん、骨がん、前立腺がん、結腸直腸がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、リンパ腫、鼻咽頭がん、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠腫、子宮内膜がん、精巣がん、結腸直腸がん、尿路腫瘍、甲状腺がん、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0060】

別の好ましい実施形態において、固形腫瘍は、卵巣がん、中皮腫、肺がん、膵臓がん、乳がん、肝臓がん、子宮内膜がん、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0061】

本発明の第６の態様において、がんまたは腫瘍を予防および／または治療するための、本発明の第１の態様に記載のＴ細胞集団、または本発明の第２の態様に記載の細胞調製物の使用が提供される。

【0062】

本発明の第７の態様において、適切な量の本発明の第１の態様に記載のＴ細胞集団または本発明の第２の態様に記載の細胞を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患を治療するための方法が提供される。

【0063】

別の好ましい実施形態において、疾患は、がんまたは腫瘍である。

【0064】

本発明の範囲内で、上記の本発明の技術的特徴および以下に（例えば、実施形態において）具体的に記載される技術的特徴は、互いに組み合わせることができ、それによって、新しいかまたは好ましい技術的解決策を形成することができることが理解されるべきである。スペースの制限により、本明細書ではそれは繰り返されない。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】フロー染色によって検出されたユニバーサルＴ細胞におけるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍの遺伝子ノックアウトおよび精製割合を示す。

【図2】フロー染色によって検出されたユニバーサルＴ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲの形質導入割合を示す。

【図3】ＢＣＭＡ発現標的細胞とのユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養後のＩＦＮ－γ放出のＥＬＩＳＡ検出を示す。

【図4】フローサイトメトリーによってＰＢＭＣから単離したナイーブＴ細胞の表現型および純度を示す。

【図5】３つのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の速度を示す。

【図6】ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の３つのタイプにおける種々のＴ細胞サブタイプの割合およびＣＣＲ７の発現を示す。

【図7】フローサイトメトリーによって検出された３つのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲトランスフェクション効率を示す。

【図8】３つのタイプのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＢＣＭＡ発現標的細胞の共培養後のＩＦＮ－γの放出を示す。

【図9】ＢＣＭＡ発現標的細胞に対する３つのタイプのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷率を示す。

【図10】異なる条件下で培養したＴ細胞におけるＴｓｃｍ細胞の富化および細胞増殖を示す。

【図11】異なる条件下で培養したＴ細胞のＢＣＭＡ ＣＡＲ形質導入割合を示す。

【図12】異なる条件下で培養したＴ細胞のＢＣＭＡ ＣＡＲ形質導入後のＩＦＮ－γ放出を示す。

【図13】３つのタイプのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ Ｔｓｃｍ細胞の富化を示す。

【0066】

本発明の添付図面で使用される標識について、それらの具体的な意味は以下の通りである。

【0067】

モック：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクションを伴わないＴ細胞、モック＋ＣＡＲ：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクションを伴わないＢＣＭＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞、ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲによって形質導入されたＴ細胞、ダブルＫＯ：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクション後のＴＲＡＣおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトを有するＴ細胞、ダブルＫＯ＋ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲを用いたダブルＫＯ細胞によって形質導入されたＴ細胞、ＢＣＭＡ ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲを用いて形質導入された従来の自己ＣＡＲ－Ｔ細胞、１°Ｕ ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲによって形質導入された第１世代のユニバーサルＴ細胞、および２°Ｕ ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲを用いて形質導入された第２世代のユニバーサルＴ細胞。

【発明を実施するための形態】

【0068】

広範かつ詳細な研究の後、本発明者らは、Ｔ細胞がＴ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）増幅に有利である条件下で培養されるとき、調製されたＴｓｃｍ富化ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、第１世代の細胞と比較して、より良好な標的細胞の増幅率、表現型、ＩＦＮ－γ放出能力および殺傷能力を示すことを予想外に初めて見出した。本発明のＴｓｃｍ富化Ｔ細胞（特に第２世代ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞）に基づいて、異なる標的に対する高度に活性なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製することができる。したがって、本発明はこれに基づいて完成された。

【0069】

具体的には、ユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性をさらに向上させるために、Ｔ細胞を、Ｔｓｃｍ富化ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の新たな第２世代が調製されるように、Ｔ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）の増幅に有利な条件下で培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞の増殖、表現型、および殺傷の点で、第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに良好である。これは、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、さらに最適化されたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ産物であることを示す。

【0070】

典型的には、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体は、内因性ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子を同時にノックアウトするためのヌクレオフェクションによってＴ細胞に送達され得る。精製後、高純度ＴＲＡＣおよびＢ２ＭダブルノックアウトユニバーサルＴ細胞を調製することができる。次いで、Ｔ細胞に、第１世代のユニバーサルＢＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するように、レンチウイルス形質導入によって、ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を導入する。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞を効果的に殺傷することができる。それらの活性は、遺伝子編集を伴わない自己ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様である。

【0071】

用語
本開示を容易に理解できるように、特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書に別段の明記がない限り、以下の各用語は、以下に提供される意味を有する。追加の定義は、本出願全体を通して説明されている。

【0072】

「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成の許容誤差範囲内の値または組成物を指し得る。これは、値または組成物の測定または決定方法に部分的に依存する。

【0073】

「投与」という用語は、当業者に知られている様々な方法および送達システムのいずれか１つを使用して、本発明の産物の被験体への物理的導入を指し、これには、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入によるものが含まれる。

【0074】

「抗体」（Ａｂ）という用語には、免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。抗原に特異的に結合することができ、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖、またはその抗原結合部分を含む。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在される相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され得る超可変領域にさらに細分化され得る。各ＶＨまたはＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含有し、これらは、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖内の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。

【0075】

本出願におけるアミノ酸の名称は、国際的に受け入れられている単一の英語の文字によって識別され、これらのアミノ酸の名称の対応する３文字の略語は、以下の通りであることが理解されるべきである。Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ）。

【0076】

ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞
ユニバーサルＴ細胞は、Ｔ細胞免疫療法における自己Ｔ細胞の重要な代替リソースである。移植片対宿主病および宿主免疫拒絶をそれぞれ予防するために、同種Ｔ細胞の内因性ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトすることができる。同種ドナー由来のこれらの遺伝子編集細胞は、乳児などの十分な自己Ｔ細胞を提供できない患者、および複数ラウンドの化学療法を受けた患者に細胞免疫療法の機会を提供することができる。これらの細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードするレンチウイルスベクターによってさらに修飾されて、同種異系ＣＡＲ／ＴＣＲ Ｔ細胞を生成することができる。

【0077】

本発明において、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体は、内因性ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子を同時にノックアウトするヌクレオフェクションによってＴ細胞に送達されている。加えて、レンチウイルス形質導入を使用してＢＣＭＡ ＣＡＲ発現を導入して、既製のＢＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞を効果的に殺傷することができる。それらの活性は、遺伝子編集を伴わない自己ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様である。

【0078】

ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の活性をさらに高めるために、同種異系ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）から遺伝子編集を行っている。加えて、Ｔ記憶幹細胞（Ｔｓｃｍ）の増幅を誘導する特殊な培養条件を用いて、Ｔｓｃｍを富化した第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、増幅、表現型、ＩＦＮ－γ放出能、および標的細胞の殺傷の点で、従来の第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりも顕著に優れている。

【0079】

Ｔｎ細胞
Ｔｎ細胞、すなわち、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）は、プライミングされていないＴ細胞としても知られている。これらは胸腺において成熟し、次いで末梢リンパ組織に移動し、そこで抗原刺激への曝露の前に比較的静止している。

【0080】

Ｔｓｃｍ細胞
Ｔｓｃｍ細胞は、幹細胞記憶Ｔ細胞（Ｔｓｃｍ）としても知られているＴ記憶幹細胞を表す。

【0081】

ＢＣＭＡ
ＢＣＭＡは、ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳＦ１７としても知られているＢ細胞成熟抗原である。これは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。そのリガンドは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。

【0082】

ＢＣＭＡのＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬへの結合は、ＮＦ－κＢ活性化を引き起こし、Ｂｃｌ－ｘＬ、またはＢｃｌ－２およびＭｃｌ－１などの特定の抗アポトーシスＢｃｌ－２メンバーのアップレギュレーションを誘導する。ＢＣＭＡとそのリガンドの間の相互作用は、人体環境の安定したバランスを維持するために、様々な局面からの体液性免疫、ならびにＢ細胞の増殖および分化を調節する。

【0083】

ＢＣＭＡ発現はＢ細胞系統に限定される。これは、形質芽球、形質細胞、および成熟Ｂ細胞のサブセット上で発現する。これは、末端Ｂ細胞の分化時に増加し、ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞、およびＢ細胞胚中心および他の臓器などのほとんどのＢ細胞では発現しない。ＢＣＭＡの発現は、骨髄における長寿命の固着（ｓｅｓｓｉｌｅ）形質細胞にとって重要であることが報告されている。したがって、ＢＣＭＡ欠損マウスは、骨髄内の形質細胞が減少しているが、脾臓内の形質細胞レベルは影響を受けない。成熟Ｂ細胞は、ＢＣＭＡノックアウトマウスにおいて、正常に形質細胞に分化する。ＢＣＭＡノックアウトマウスは正常かつ健康に見え、正常数のＢ細胞を有するが、それらの形質細胞は長期間生存することができない。

【0084】

ＢＣＭＡはまた、多発性骨髄腫および形質細胞白血病などの悪性形質細胞において高度に発現される。ＢＣＭＡはまた、ホジキンリンパ腫患者からのＨＲＳ細胞においても検出されている。米国において、血液悪性腫瘍は全悪性腫瘍の約１０％を占め、骨髄腫は全血液悪性腫瘍の１５％を占める。ＢＣＭＡの発現は、多発性骨髄腫における疾患進行と関連していることが文献に報告されている。ＢＣＭＡ遺伝子は骨髄腫試料中で高度に発現しているが、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、および急性Ｔ細胞リンパ性白血病では非常に発現が低い。Ｂ細胞リンパ腫は、ＢＣＭＡリガンドＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬを過剰発現するマウスモデルにおいて顕著に増加する。ＢＣＭＡに結合するリガンドは、ＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞の増殖および生存を調節することが示されてきた。ＢＣＭＡの、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬへの結合は、悪性形質細胞が生存することを可能にする。したがって、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞の枯渇およびＢＣＭＡリガンドと受容体との間の相互作用の破壊は、多発性骨髄腫または他のＢＣＭＡ陽性Ｂ系統悪性リンパ腫についての治療転帰を改善することができる。

【0085】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明のＣＡＲは、腫瘍抗原を標的とする任意の種類の抗原結合ドメインを含み得る。

【0086】

本発明において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも称される）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。本明細書における共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子を含む細胞内ドメインの一部を指す。共刺激分子は、抗原受容体またはリガンドではなく、抗原に対する効率的なリンパ球応答に必要とされる細胞表面分子である。

【0087】

リンカーは、細胞外ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間、または細胞質ドメインとＣＡＲの膜貫通ドメインとの間に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、概して、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外または細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。リンカーは、０～３００アミノ酸、好ましくは２～１００アミノ酸、および最も好ましくは３～５０アミノ酸を含み得る。

【0088】

本発明の好ましい実施形態において、本発明によって提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞において発現される場合、抗原結合特異性に基づく抗原認識が可能である。これが同族抗原に結合するとき、これは、腫瘍細胞が増殖しないか、死滅させられるか、または他の方法で影響を受けるように、腫瘍細胞に影響を与える。これは、患者の腫瘍負荷の軽減または排除につながる可能性がある。抗原結合ドメインは、好ましくは、共刺激分子およびζ鎖のうちの１つ以上からの細胞内ドメインに融合される。好ましくは、抗原結合ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの組み合わせによって形成される細胞内ドメインに融合される。

【0089】

本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」および「単鎖抗体フラグメント」は、両方とも、抗原結合活性を有する、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、または単一のＦｖフラグメントを指す。Ｆｖ抗体は、抗体重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域は含まず、これは、すべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。典型的には、Ｆｖ抗体はまた、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含有し、抗原結合のために必要とされる構造を形成することができる。抗原結合ドメインは通常、ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）である。ｓｃＦｖのサイズは、概して、完全抗体の１／６である。一本鎖抗体は、好ましくは、１つのヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸鎖配列である。本発明の好ましいモードとして、ｓｃＦｖは、ＢＣＭＡを特異的に認識する抗体、好ましくは一本鎖抗体を含んでもよい。

【0090】

ヒンジ領域および膜貫通領域（膜貫通ドメイン）に関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ内のドメインのうちの１つと自然に会合する。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、このようなドメインが、同じかまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けるために、アミノ酸置換によって、選択または修飾されてもよく、それによって、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑える。

【0091】

本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含み得る。

【0092】

遺伝子サイレンシング方法
現在、一般的に使用されている遺伝子サイレンシング方法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＲＮＡ干渉技術、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ）、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられ、中でもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、最適な用途の見込みおよび効果を有する。

【0093】

ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、原核生物特有の天然免疫系である。これは、ウイルスまたは異物プラスミドに対して使用される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、直接ＲＮＡ媒介性ゲノム編集のためのツールとして、多くの真核生物および原核生物に成功裏に適用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの開発は、ＤＮＡ配列を編集し標的遺伝子の発現レベルを調節する能力に革命をもたらし、それによって、生物の正確なゲノム編集のための強力なツールを提供した。簡略化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡの２つの部分から構成される。作用機序は、ｓｇＲＮＡがそのＣａｓ９ハンドルを通じてＣａｓ９タンパク質とＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体を形成すること、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体中のｓｇＲＮＡの塩基相補性ペアリング配列領域が、塩基相補性ペアリング原理に基づいて標的遺伝子の標的配列とペアリングされること、次いで、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡ配列を切断するために独自のエンドヌクレアーゼ活性を利用することである。従来のゲノム編集技術と比較して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、使いやすさ、シンプルさ、低コスト、プログラマビリティ、および複数の遺伝子を同時に編集する能力といういくつかの明確な利点を有する。

【0094】

ベクター
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を含有することが知られているベクターから遺伝子を得ること、または標準的な技術を使用して遺伝子を含有する細胞および組織から遺伝子を直接単離することなどの、当該技術分野で既知の組換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を合成的に産生することができる。

【0095】

本発明はまた、本発明の発現カセットが挿入されるベクターを提供する。レンチウイルス等のレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期的で安定的な組み込みおよび娘細胞内でのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子移入を達成するために好適なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入することができるため、マウス白血病ウイルスなどの発がん性レトロウイルスに由来するベクターよりも利点がある。また、これらは、免疫原性が低いという利点もある。

【0096】

手短に概要を述べると、本発明の発現カセットまたは核酸配列は、典型的には、プロモーターに作用可能に連結され、発現ベクターに組み込まれる。ベクターは、真核細胞における複製および組み込みのために好適である。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳終結因子、初期配列、ならびに所望の核酸配列の発現を調節するために使用することができるプロモーターを含有する。本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルに基づく核酸免疫化および遺伝子治療においても使用され得る。遺伝子送達の方法は、当該分野において既知である。以下の文書、例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照することができる。別の実施形態において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。

【0097】

核酸は、様々なタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングされ得る。本明細書における特定の目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。

【0098】

さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供することができる。ウイルスベクター技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、および他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして使用できるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、および１つ以上の選択可能なマーカー（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）を含有する。

【0099】

哺乳動物細胞への遺伝子導入のために、いくつかのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該技術分野において既知の技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはインビトロで対象細胞に送達することができる。当該技術分野において既知の多くのレトロウイルス系が存在する。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。当該分野において、既知の多くのアデノウイルスベクターが存在する。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。

【0100】

エンハンサーなどの追加のプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節することができる。典型的には、これらは、開始部位の上流の３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、最近、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されてきた。プロモーター要素間の間隔は、要素が互いに反転または移動したときにプロモーター機能を維持することができるように、しばしば適応性がある。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ｂｐ増加させることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協調的または独立して作用して、転写を開始し得る。

【0101】

好適なプロモーターの例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作用可能に結合した任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス前初期プロモーター、Ｒｕｓｅ肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列も本明細書で使用され得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として考慮される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が所望されるときに、誘導性プロモーターに作用可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、またはそのような発現が所望されないときに発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入された発現ベクターはまた、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染されることが求められる細胞の集団からの発現細胞の識別および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子およびレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有してもよい。別の態様において、選択可能なマーカーは、単一のＤＮＡ上に保持されてもよく、共形質導入手順において使用されてもよい。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞におけるそれらの発現を可能にするために適切な調節配列に隣接することができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

【0103】

レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を識別し、調節配列の機能性を評価するために使用される。典型的には、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないか、またはレシピエント生物または組織によって発現され、ポリペプチドをコードする遺伝子であり、加えて、ポリペプチドの発現は、酵素活性などのいくつかの容易に検出可能な特性によって明確に示される。ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現は、適切な時点で測定され得る。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、および緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ，ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。好適な発現系は周知であり、既知の技術を使用して調製することができるか、または商業的に入手することができる。典型的には、レポーター遺伝子発現の最高レベルを示す最小５の隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして識別される。プロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する作用物質の能力を評価するために使用することができる。

【0104】

遺伝子を細胞に導入しそこで発現するための方法は、当該技術分野において既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野で既知の任意の方法、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞によって、宿主細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。

【0105】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子爆撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含有する細胞を産生する方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に対して参照がなされ得る。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

【0106】

目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞に遺伝子を挿入する最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および同第５，５８５，３６２号への参照がなされ得る。

【0107】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおよびインビボ送達ビヒクルとしての使用のための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0108】

非ウイルス送達系が使用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用は、（インビトロ、エキソビボ、またはインビボで）宿主細胞に核酸を導入するために考慮され得る。別の態様において、核酸は、脂質と会合することができる。脂質に付随した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームの脂質二重層内に散在され、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に付したリンカー分子を介してリポソームに結合され、リポソームに閉じ込められ、リポソームと複合体化され、脂質含有溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質に付随され、特定の懸濁液として脂質に含有され、ミセルに含有され、またはミセルと複合体化され、またはそれ以外の場合、脂質に付随され得る。組成物に付随する脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターは、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして二重層構造中に存在してもよく、または「崩壊した」構造を有してもよい。これらはまた、単純に溶液中に分散させることができ、場合によっては、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する。脂質は脂肪物質である。これらは、特定の天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。例えば、脂質は、脂肪滴を含み得る。これらは、細胞質内、および長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどを含むそのような化合物中に天然に存在し得る。

【0109】

本発明の好ましい実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。

【0110】

調製
本発明は、本発明の第１の態様を含むＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを提供する。一実施形態において、調製物は、液体調製物である。好ましくは、調製物は、注射剤である。好ましくは、調製物中のＣＡＲ－Ｔ細胞の濃度は１×１０^３～１×１０^８細胞／ｍｌであり、より好ましくは１×１０^４～１×１０^７細胞／ｍｌである。

【0111】

一実施形態において、調製物は、中性緩衝生理食塩水、硫酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および保存剤を含み得る。本発明の調製物は、静脈内投与のために好ましく製剤化される。

【0112】

治療用途
本発明は、本発明の第１の態様に記載されるＣＡＲ－Ｔ細胞の治療用途を含む。形質導入されたＴ細胞は、腫瘍細胞マーカーＢＣＭＡを標的とし、Ｔ細胞を相乗的に活性化し、Ｔ細胞免疫応答を引き起こし、それによって、腫瘍細胞に対する殺傷効率を著しく向上させることができる。

【0113】

上記に鑑み、本発明はさらに、哺乳動物における標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、哺乳動物に本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与する工程を含む。

【0114】

一実施形態において、本発明は、細胞治療方法のクラスを含む。患者の自己Ｔ細胞（または同種ドナー）を単離し、活性化し、遺伝子改変して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生し、次いでこれは、患者に注射される。このように、移植片対宿主病のリスクは極めて低くなり得る。抗原は、ＭＨＣを含まない方法でＴ細胞によって認識される。加えて、１つのＣＡＲ－Ｔは、同じ抗原を発現するすべてのがんを治療することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞はインビボで複製することができ、持続的な腫瘍制御をもたらすことができる長期持続性をもたらす。

【0115】

一実施形態において、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞は、長期間、堅牢なインビボＴ細胞増殖を受けることができる。加えて、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が、ＣＡＲ内の抗原結合ドメインに特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法手順の一部であり得る。例えば、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞に対する特異的免疫応答を誘導することができる。

【0116】

本明細書に開示されるデータは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、ヒンジおよび膜貫通領域、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを具体的に開示するが、本発明は、構築物の各構成要素に対する任意の数のバリエーションを含むと解釈されるべきである。

【0117】

治療され得るがんとしては、血管新生していない、または実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに血管新生している腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫など）を含んでもよく、または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲを用いて治療されるがんの種類としては、がん腫、芽細胞腫および肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ系悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、肉腫、がん腫および黒色腫が挙げられる。がんには、成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。

【0118】

血液がんは、血液または骨髄のがんであり得る。血液がん（または造血性がん）の例としては、急性白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤血球性白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病）、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および進行性の型）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストロームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、毛細胞白血病、および骨髄異形成を含む白血病が挙げられる。

【0119】

固形腫瘍は、典型的には嚢胞または液体の領域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。異なる型の固形腫瘍は、それらを形成する細胞型（肉腫、がん腫、およびリンパ腫など）にちなんで命名される。肉腫およびがん腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、および卵巣がんが挙げられる。

【0120】

本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞はまた、哺乳動物のエキソビボ免疫化および／またはインビボ療法のためのワクチンの一種として使用され得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

【0121】

エキソビボ免疫については、細胞を哺乳動物に投与する前に、ｉ）細胞を拡大すること、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、および／またはｉｉｉ）細胞を凍結保存することのうちの少なくとも１つをインビトロで行う。

【0122】

エキソビボ手順は、当技術分野において周知であり、以下に詳細に説明する。簡潔に述べると、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離し、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するベクターを用いて遺伝子組換え（例えば、インビトロで形質導入またはトランスフェクト）する。ＣＡＲ修飾細胞は、治療的利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントは、ヒトであってもよく、ＣＡＲ修飾細胞は、レシピエントに対して自己由来であり得る。任意選択で、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、または異種であり得る。

【0123】

細胞ベースのワクチンをエキソビボ免疫のために使用することに加えて、本発明は、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するためのインビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。

【0124】

本発明は、腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明による治療有効量のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を投与することを含む、方法を提供する。

【0125】

本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、単独で、あるいは、希釈剤および／またはＩＬ－２、ＩＬ－１７もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物として、投与することができる。簡潔に述べると、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される、担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載の標的細胞集団を含み得る。このような組成物には、中性緩衝生理食塩水、硫酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および保存剤が含まれ得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために調製される。

【0126】

本発明の医薬組成物は、治療される（または予防される）疾患に適切な方法で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の型および重症度などの要因によって決定され得るが、適切な用量は、臨床試験によって決定され得る。

【0127】

「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」、または「治療量」に言及する場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師によって決定することができ、それは、患者（被験体）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の程度、および状態における個人差を考慮に入れるべきである。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、一般に、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重（範囲内のすべての整数値を含む）の用量で投与され得ることが示され得る。Ｔ細胞組成物は、これらの用量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において周知の注入技術を使用することによって投与され得る（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８）。個々の患者に対する最適な投与量および治療レジメンは、疾患の兆候について患者を監視し、次いでそれに応じて治療を調整することによって、医療分野の当業者によって容易に決定することができる。

【0128】

組成物の対象への投与は、噴霧、注射、嚥下、注入、インプラント、および移植を含む任意の都合の良い方法で実施することができる。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊椎内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、または腹腔内で患者に投与することができる。一実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することができる。

【0129】

本発明のいくつかの実施形態において、活性化および増幅された細胞は、本明細書に記載の方法または当該技術分野で既知の他の方法を使用して、任意の数の関連する治療様式と組み合わせて、Ｔ細胞を治療レベルまで拡大し（例えば、前に、同時に、または後に）、患者に投与することができる。このような処置様式としては、以下の薬剤を用いる処置が挙げられるが、これらに限定されず、この薬剤は、抗ウイルス療法において使用され得、シドフォビルおよびインターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃとしても知られる）、ＭＳ患者のためのナタリズマブ療法、乾癬患者のためのエルフェズマブ、またはＰＭＬ患者のための他の処置であり得る。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体または他の免疫療法剤と組み合わせて使用され得る。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン等の化学療法剤、外部ビーム放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと組み合わせて（例えば、前に、同時に、または後に）投与され、次いで患者に投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法、続いて末梢血幹細胞移植による標準治療を受け得る。いくつかの実施形態において、移植後、被験体は、本発明の拡大した免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態において、増幅細胞は、手術の前または後に投与される。

【0130】

患者に投与される上記治療の用量は、治療される状態の正確な性質および治療のレシピエントによって異なり得る。ヒト投与用の用量比は、当該技術分野で許容される慣行に従って実施され得る。典型的には、本発明の１×１０^６～１×１０^１０修飾Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ２０細胞）は、例えば、静脈内注入によって、各治療または各治療過程で患者に投与され得る。

【0131】

本発明の主な利点は以下の通りであり、
（ａ）本発明は、Ｔｓｃｍ富化された第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を提供し、これは、第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好な増殖速度、表現型、ＩＦＮ－γ放出能力および標的細胞に対する殺傷能力を示す。本発明のＴｓｃｍ富化Ｔ細胞（特に第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞）に基づいて、異なる標的に対する高度に活性なユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製することができる。
（ｂ）本発明はまた、腫瘍標的（例えば、ＢＣＭＡのＣ－ＣＡＲ０８８を標的とするユニバーサルＴ細胞）を標的とするユニバーサルＴ細胞を調製し、これは、対応する腫瘍標的（例えば、ＢＣＭＡ腫瘍抗原）を発現する標的細胞を特異的に認識および殺傷することができる。
（ｃ）本発明は、Ｔｓｃｍ富化Ｔ細胞を作製する方法を提供し、この方法は、Ｔｓｃｍ富化Ｔ細胞集団、特にユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞集団を効率的に調製することができる。

【0132】

本発明を、特定の実施形態と併せて以下にさらに説明する。これらの実施形態は、本発明を例証するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するために使用されるものではないことが理解されるべきである。特定の実験条件を伴わない以下の実施形態の実験方法については、従来の実験条件に従って、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるように、または製造業者によって示唆されるように行った。本明細書で使用されるパーセンテージおよび部は、別段の指示がない限り、重量である。

【実施例】

【0133】

一般的な実験方法
１．ＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルスの調製
本発明において、ＢＣＭＡは、腫瘍細胞を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための代表的な腫瘍関連特異的標的として使用される。

【0134】

０日目に、５×１０^６ ２９３Ｔ細胞を、ポリリジンで前処理した１０ｍｌのＤＭＥＭ培地を含有する１０ｃｍのディッシュに配置した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。１日目に、トランスフェクション試薬を調製した。リポフェクタミン３０００試薬４５．５μｌをＯＭＥＭに合計５００μｌ添加し、次いで室温で５分間インキュベートした。別のＯＭＥＭを、全容量５００μｌで調製し、次いで、１０．７μｇのＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルスベクター、３４μｇのＰＲＰ２プラスミド、１．８μｇのＰＲＰ３プラスミド、２．３μｇのＰＲＭ２プラスミド、および３６．４μｌのＰ３０００試薬を添加した。２つの試薬を混合し、１．５ｍｌのチューブに添加し、室温で１５分間インキュベートした。すべてのトランスフェクション試薬を２９３Ｔ細胞培養液に添加し、細胞を３７℃で６時間インキュベートした。完全培地を廃棄し、次いで、１０ｍｌのあらかじめ温めたＤＭＥＭ培地を細胞に添加した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。３日目に、培養上清を１５ｍｌのチューブに移し、２０００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。次に、１ｍｌごとの上清を１．５ｍｌのチューブに慎重に分取し、後で使用するために－８０℃で貯蔵した。

【0135】

２．抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体を用いるＴ細胞の刺激（３日目）
５μｇ／ｍｌのフィブロネクチンおよび５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を含有するＰＢＳ５００μｌを２４ウェルプレートのウェルに添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳを除去し、ウェルを１ｍｌのＰＢＳで２回完全に洗浄した。プレートはＴ細胞刺激の準備ができていた。Ｔ細胞数を計数し、５×１０^６個のＴ細胞を各ウェルに添加し、室温で５分間、１００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を２．５ｍｌのＡＩＭ－Ｖ培地中に再懸濁し、次いで抗ＣＤ３抗体をコーティングしたプレートに移した。次いで、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。

【0136】

３．ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズによるＴ細胞の活性化
Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＨｕｍａｎＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズで活性化し、ＡＩＭ－Ｖ培地中の細胞と１：１の比で混合した。７２時間後、磁気ビーズを除去した。

【0137】

４．細胞培養
Ｔｓｃｍ細胞培養：１０％ ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｉｐ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１５、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ７、および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ２１を含有するＡＩＭ－Ｖ培地中で、約１×１０^６細胞／ｍｌの密度で細胞培養を実行した。

【0138】

従来のＴ細胞培養：１０％ ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｉｐ、および２００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ２を補充したＡＩＭ－Ｖ培地で１０^６細胞／ｍｌの密度で細胞培養を行った。

【0139】

５．Ｔ細胞ヌクレオフェクション（０日目）
ＰＣＲチューブ内で、９０ｐｍｏｌのＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ抗ＴＲＡＣ（ＡＧＡ ＧＵＣ ＵＣＵ ＣＡＧ ＣＵＧ ＧＵＡ ＣＡＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＵ ＧＣＵ、配列番号１）を、９０ｐｍｏｌのＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃＲＮＡ（ＡＧＣ ＡＵＡ ＧＣＡ ＡＧＵ ＵＡＡ ＡＡＵ ＡＡＧ ＧＣＵ ＡＧＵ ＣＣＧ ＵＵＡ ＵＣＡ ＡＣＵ ＵＧＡ ＡＡＡ ＧＵＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＡＧＵ ＣＧＧ ＵＧＣ ＵＵＵ Ｕ、配列番号２）と混合した。

【0140】

別のＰＣＲチューブにおいて、９０ｐｍｏｌのＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｒＲＮＡ抗Ｂ２Ｍ（ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＣＧ ＡＧＡ ＣＡＵ ＣＵＧ ＵＵＵ ＵＡＧ ＡＧＣ ＵＡＵ ＧＣＵ、配列番号３）を、９０ｐｍｏｌのＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔｒａｃＲＮＡと混合した。

【0141】

上記チューブを９５℃で５分間、次いで３７℃で２５分間インキュベートした。反応後、２つの試薬を試験管内で十分に混合した。９μｇのＣａｓ９タンパク質を添加し、次いで室温で１０分間インキュベートした。１×１０^６個の活性化Ｔ細胞を１００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。上清を除去し、細胞を、１６．４μｌのＰ３緩衝液および３．６μｌの補充緩衝液を含有する２０μｌのヌクレオフェクション緩衝液中に再懸濁した。工程１２で調製したＣａｓ９ ＲＮＰ複合体を添加し、次いで十分に混合した。サンプルをヌクレオフェクションのためにストリップに移し、Ｔ細胞をヌクレオフェクションプログラムＣＡ１３７でトランスフェクトした。トランスフェクションプロセスが完了した後、８０μｌのＡＩＭ－Ｖ培地をストリップに添加し、次いで試料を２４ウェルプレート中のウェルに移し、最終総体積１ｍｌに達するようにＡＩＭ－Ｖ培地を添加した。次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベートして、ウイルス形質導入の準備をした。

【0142】

６．Ｔ細胞のＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルス形質導入。
調製した凍結ＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルス上清を、３７℃の水浴中で完全に解凍するまで解凍した。１ｍｌのＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルス上清をＴ細胞培養物に移し、最終総体積２ｍｌの培養培地に到達させ、硫酸プロタミンを添加して最終濃度１μｇ／ｍｌに到達させ、これを５回上下にピペッティングすることにより混合した。細胞を２０００ｇで２時間、３２℃で遠心分離した後、プレートを３７℃のインキュベーターに移し、一晩培養した。１日目に上清１．５ｍｌを慎重に取り出し、次いで、新鮮なＡＩＭ－Ｖ培地１．５ｍｌを添加した。細胞増殖条件に応じて、培地を変更して、少なくとも１×１０^６細胞／ｍｌの細胞密度を維持した。

【0143】

７．Ｔ細胞精製（通常、６～８日目）
４×１０^６Ｔ細胞を１．５ｍｌのチューブに移し、１００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、２％ＦＢＳを含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。２μｌのビオチン－コンジュゲート抗ＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃおよび２μｌのビオチン－コンジュゲート抗ＣＤ３抗体を試料に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。４μｌのビオチン単離混合物を試料に添加し、室温で１５分間インキュベートした。５μｌの急速球（ｒａｐｉｄｓｐｈｅｒｅｓ）を添加し、試料を室温で１０分間インキュベートした。試料を５ｍｌのチューブに移し、次いで１．９ｍｌのＡＩＭ－Ｖ培地を添加した。チューブをマグネット上に５分間配置した。上清を新しいチューブに移し、マグネット上に５分間置いた。Ｔ細胞を含有する上清を、２４ウェルプレートのウェルに移した。

【0144】

８．ＦＡＣＳ分析
（ａ）．１×１０^５Ｔ細胞を１．５ｍｌのチューブに移し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、次いで、９００μｌのＰＢＳを添加し、次いで、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＢＣＭＡ Ｆｃキメラタンパク質を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。９００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞をＰＢＳ（１：１０００Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｑｕａ ｏｒａｎｇｅ染色色素を含有する）中で再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。９００μｌのＰＢＳを添加した後、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、２．５μｌのＡＰＣ－Ｃｙ７－コンジュゲート抗ＣＤ３抗体、および２．５μｌのＶ６０５－コンジュゲート抗ＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃ抗体および１００μｌのＰＢＳ中の１；１００ＡＰＣコンジュゲート抗ＢＣＭＡ Ｆｃキメラタンパク質抗体を含有するＰＢＳ中に再懸濁し、次いで氷上で３０分間インキュベートした。９００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞は、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、試料は、ＦＡＣＳ分析のために５ｍｌのチューブに移した。

【0145】

Ｔ細胞集団は、まず、ＦＳＣおよびＳＳＣによってグループ化した。Ａｑｕａ ｏｒａｎｇｅチャネルを生細胞と死細胞を区別するために使用し、ＡＰＣチャネルを使用してＢＣＭＡ－ＣＡＲ陽性細胞を区別するために使用した。ＣＤ３およびＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃを使用して、ＣＤ３とＨＬＡ Ａ／Ｂ／ＣダブルノックアウトＴ細胞を区別した。

【0146】

（ｂ）．１×１０^５Ｔ細胞を１．５ｍｌのチューブに移し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、次いで、９００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ（１：１０００Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ａｑｕａ ｏｒａｎｇｅ染色色素を含有する）中に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。９００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、２．５μｌのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＣＲ７抗体を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、２．５μｌのＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、２．５μｌのＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ８抗体、および２．５μｌのＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３抗体を添加し、次いで氷上で３０分間インキュベートした。９００μｌのＰＢＳを添加し、１５００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。細胞は、３００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、試料は、ＦＡＣＳ分析のために５ｍｌのチューブに移した。

【0147】

９．ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒトＩＦＮ－γ Ｍａｂで１日、事前にコーティングした。ヒトＩＦＮ－γ Ｍａｂを１×ＰＢＳで希釈（１：１０００）して１μｇ／ｍＬにし、１００μｌの抗体を各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡプレートをシーリングフィルムで密封し、４℃で一晩保存した。ＥＬＩＳＡプレート内の液体を速やかに除去し、次いで、１００μｌのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、シーリングフィルムで密封し、室温で３０分間静置した。プレートを洗浄した：プレート内の液体を速やかに除去し、ピペットを用いてウェル当たり２００μｌで洗浄緩衝液を添加し、プレートを前述の手順で再度洗浄した。ヒトＩＦＮ－γビオチン標識Ｍａｂを調製し、アッセイ緩衝液（１：５００）で希釈し、ウェル当たり５０μｌでＥＬＩＳＡプレートに添加した。ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ標準もまた、８つの勾配濃度（単位ｐｇ／ｍｌ）、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、および０で調製した。

【0148】

試料および標準物質を、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加した。次に、試料および標準物質を所望の濃度までアッセイ緩衝液で希釈し、シーリングフィルムで密封し、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄した：プレート内の液体を速やかに除去し、ピペットを用いてウェル当たり２００μｌで洗浄緩衝液を添加し、プレートを４回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを調製し、アッセイバッファー（１：５０００）で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートのウェルごとに１００μｌを添加し、シーリングフィルムで密封し、室温で３０分間インキュベートした。プレートを洗浄した：プレート内の液体を速やかに除去し、ピペットを用いてウェル当たり２００μｌで洗浄緩衝液を添加し、プレートを２回洗浄した。ＴＭＢ基質を３０分前に室温まで温め、ＥＬＩＳＡプレートのウェル当たり１００μｌを添加した。室温で５～１０分間の反応後、５０μｌ／ウェルで停止溶液を添加した。４５０ｎｍの波長での吸光度をマイクロプレートリーダーで検出した。標準品の濃度およびＯＤ値に従って標準曲線を生成し、テスト試料のＩＦＮ－γ濃度を試料のＯＤ値に従って計算した。

【0149】

１０．細胞殺傷のＲＴＣＡリアルタイム分析
１日目：ＲＴＣＡ ＭＰのオペレーティングソフトウェアを入力し、実験情報を入力した。ＲＴＣＡ用の９６ウェルＥプレート培養プレートを取り出し、５０μｌのＦ１２完全培地をプレートの各ウェルに添加し、気泡を回避した。プレートをＲＴＣＡ装置に追加し、操作ソフトウェアはセルを追加する前にバックグラウンドを読み取った。読み取り値が正常であることを確認した。培養したＡ５４９およびＡ５４９－ＢＣＭＡ細胞をトリプシン処理し、ＡＯ／ＰＩ細胞生存率キットを用いて、生存細胞をカウントし、続いて遠心分離を行った。これらの２つのタイプの腫瘍細胞を、Ｆ１２完全培地中で４×１０^５細胞／ｍｌに到達するように再懸濁した。実験プロトコルに従って、バックグラウンドを読み取った後、Ｅプレートの各ウェルに、５０μｌの細胞懸濁液（すなわち、２×１０^４個のＡ５４９細胞またはＡ５４９－ＢＣＭＡ細胞）を添加した。対照群、すなわち、Ｔ細胞をその後添加せずに腫瘍細胞単独として含めた３つのウェルとともに、各実験群に３つの複製ウェルを設定した。プレートを、細胞が均等に接着することを可能にするために、３０分間、清潔なベンチに置いた。次いで、プレートをＲＴＣＡ機器に配置し、操作ソフトウェアは、細胞インデックスの変化を記録し始めた。これは、１５分に１回の読み取りとして設定し、総録画時間を４日超とした。

【0150】

２日目：Ｔ細胞を計数し、遠心分離後、Ｔ細胞をＴ細胞培地に再懸濁し、以下のように異なる濃度に希釈した：１×１０^５／ｍｌ、５×１０^４／ｍｌ、２．５×１０^４／ｍｌ、および１．２５×１０^４／ｍｌ。ＲＴＣＡソフトウェア記録を一時停止し、Ｅプレートを器具からクリーンベンチに取り出し、Ａ５４９細胞の培養ウェルに１００μｌの１×１０^５／ｍｌのＴ細胞懸濁液を添加し、すなわち、Ｔ細胞対標的細胞の最終比率は０．５：１であり、Ａ５４９－ＢＣＭＡ細胞の培養ウェルに１×１０^５／ｍｌ、５×１０^４／ｍｌ、２．５×１０^４／ｍｌ、１．２５×１０^４／ｍｌの１００μｌのＴ細胞懸濁液を添加し、すなわち、Ｔ細胞対標的細胞の最終比率は、それぞれ０．５：１、０．２５：１、０．１２５：１、および０．０６２５：１である。ＥプレートをＲＴＣＡ器具に戻し、細胞指標を、設定された終了時間に達するまで１５分ごとに読み取った。実験後、データ解析を行った。一般に、Ｔ細胞添加前の最終時点を参照として使用し、Ｔ細胞を含まない腫瘍細胞単独の読み取り値を１００％として設定し、Ｔ細胞の添加後の腫瘍細胞指数の変化を殺傷曲線に変換した。

【0151】

実施形態１ ユニバーサルＴ細胞におけるＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子ノックアウトならびに精製率の分析
ＴＲＡＣのノックアウトは、細胞表面上のＣＤ３発現の消失をもたらし得、Ｂ２Ｍのノックアウトは、細胞表面上のＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃ発現の消失をもたらし得る。したがって、遺伝子編集されたＴ細胞を抗ＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃ抗体および抗ＣＤ３抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行い、ＴＲＡＣおよびＢ２Ｍのノックアウト率を調べた。

【0152】

結果を図１に示す。ＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子のダブルノックアウト効率は、Ｃａｓ９ ＲＮＰおよびＢＣＭＡ ＣＡＲ形質導入を用いる遺伝子編集後７日目にＴ細胞において８１．２％であった。精製後、ダブルノックアウト細胞は８１．４％から９９．４％に富化された。しかし、ＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃゲートラインの下には、低いＨＬＡ Ａ／Ｂ／Ｃ発現を有する少数のＴ細胞が存在した。

【0153】

実施形態２ ＢＣＭＡ ＣＡＲのユニバーサルＴ細胞形質導入の効率
ＢＣＭＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞のフローサイトメトリー分析を７日目に実施した。

【0154】

結果を図２に示し、ＢＣＭＡ ＣＡＲ形質導入効率は、異なる群間で類似していた（モック：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクションを伴わないＴ細胞、モック＋ＣＡＲ：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクションを伴わないがＢＣＭＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞、ＣＡＲ：ＢＣＭＡ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞、ダブルＫＯ：Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオフェクション後のＴＲＡＣおよびＢ２Ｍのダブルノックアウトを有するＴ細胞、ダブルＫＯ＋ＣＡＲ：上記ダブルＫＯ細胞をＢＣＭＡ ＣＡＲで形質導入することにより得られたＴ細胞）。

【0155】

以上の結果は、ヌクレオフェクションの遺伝子編集プロセスがＣＡＲの形質導入効率に影響を及ぼさないことを示す。

【0156】

実施形態３ 標的細胞に対するユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性
上記の異なるＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞と、ＢＣＭＡ抗原を発現する標的Ａ５４９－ＢＣＭＡ細胞との共培養後の上清中のＩＦＮ－γのレベルをＥＬＩＳＡにより検出した。

【0157】

結果を図３に示し、ダブルＫＯ＋ＣＡＲ、標的細胞に関して遺伝子編集されたＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性、すなわちＩＦＮ－γを放出する能力は、他の未編集の従来のＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様である。

【0158】

上記の結果は、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞および自己ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が類似していることを示す。

【0159】

実施形態４ 第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
末梢血からナイーブＴ細胞（Ｔｎ）を富化し、フローサイトメトリー分析を行ってＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）を富化する効率を調べた。

【0160】

４．１ 末梢血からのＴｎ細胞の富化
その方法は以下の通りである。サイトカインを含まないＡＩＭ－Ｖ培地を使用してヒトＰＢＭＣを解凍し、次いで細胞を計数した。細胞を遠心分離し（３００ｇ、５分）、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで５ｍｌチューブ中に再懸濁した。ビオチン単離カクテルおよび抗ＴＣＲγ／δ抗体を添加し、室温で５分間インキュベートした。ｒａｐｉｄＳｐｈｅｒｅｓを添加し、室温で３分間インキュベートした。サイトカインを含まないＡＩＭ－Ｖ培地を添加して２．５ｍｌに到達させ、チューブを磁気スタンド上に３分間置いた。上清を新しい５ｍｌチューブに移し、３分間磁気スタンド上に置いた。Ｔｎ細胞含有上清を新しい１５ｍｌチューブに移し、続いて細胞計数を行った。

【0161】

結果を図４に示す。富化および精製の後、Ｔｎの割合はＰＢＭＣの５４．８％から９７．３％に増加された。必要に応じて、富化および精製されたＴｎ細胞をさらに拡大および培養することができる。例えば、拡大は、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｉｐ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１５、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ７、および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ２１を含有するＡＩＭ－Ｖ培地中で、約１０^６細胞／ｍｌで行うことができる。

【0162】

４．２ 第２世代ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
従来のＴ細胞を、４．１で調製した高精製Ｔｎ細胞に置き換えたことを除き、実施形態１～３を繰り返した。

【0163】

４．１で調製した高精製Ｔｎ細胞については、ＴＲＡＣ遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子をノックアウトした後、細胞にレンチウイルスを形質導入してＢＣＭＡ ＣＡＲを導入し、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。

【0164】

４．３ 直接拡大法による第２世代ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製（Ｔｎの富化操作は省略）
第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための別の方法は、以下の通りである。

【0165】

末梢血から富化した全Ｔ細胞（全Ｔ細胞）から開始して、細胞の拡大および培養のプロセスを、好適な条件下（例えば、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｉｐ、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ１５、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ７、および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ２１を含むＡＩＭ－Ｖ培地中）で、約１０^６細胞／ｍｌの密度で実施した。これにより、Ｔｎ富化されたＴ細胞の集団が得られた（これらの条件下において、Ｔｎ細胞はより優先的かつ効率的に拡大する）。

【0166】

続く遺伝子ノックアウト（ＴＲＡＣおよび／またはＢ２Ｍのノックアウトなど）、レンチウイルス形質導入、および他の工程をさらに実施して、Ｔｓｃｍ富化ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、すなわち、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。

【0167】

実施形態５ 第２世代ユニバーサルＴ細胞の拡大効率
実施形態４．２で調製した第２世代のユニバーサルＴ細胞を計数した。

【0168】

結果を図５に示し、第２世代のユニバーサルＴ細胞の増殖効率は他の２種類のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高い。７日後、これらの細胞の相対増殖率は１６倍に達し、他の２種類のＣＡＲから得られた３～４倍よりもはるかに高かった。これは、第２世代のユニバーサルＴ細胞を調製するための培養条件が、ＣＡＲを調製するための従来の条件よりもＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖のためにより有利であることを示す。

【0169】

実施形態６ 第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物における種々のＴ細胞サブタイプの割合
フローサイトメトリー表現型分析は、実施形態４．２で調製された第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物に対して実施した。

【0170】

結果を図６に示すと、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物におけるＴｓｃｍの割合は７０％近くであり、第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物（約３０％）および自己ＣＡＲ－Ｔ細胞（約２０％）よりもはるかに高い。

【0171】

意外なことに、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞において、ｄｅ／弱分化細胞のバイオマーカーＣＣＲ７の割合は、７６％まで高かった。加えて、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞のＭＦＩ値は４５３４に達し、これは、第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物および自己ＣＡＲ－Ｔ細胞の対応するＭＦＩ値よりもはるかに高かった。

【0172】

上記の結果は、本発明における第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するための条件が、高い割合のｄｅ／弱分化ＣＡＲ－Ｔ細胞、すなわち、Ｔｓｃｍ富化ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生を誘導するだけでなく、産生されたＣＡＲ－Ｔ細胞がより高い生存能および殺傷活性を有することを可能にすることを示す。

【0173】

実施形態７ 第２世代のユニバーサルＴ細胞におけるＢＣＭＡ ＣＡＲの形質導入の効率
実施形態４．２で調製した第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物を、ＣＡＲ発現率のフロー分析に供した。

【0174】

結果を図７に示す。第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物においてＢＣＭＡ ＣＡＲの割合は８３．４％に達し、第１世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞産物（６０．８％）および自己ＣＡＲ－Ｔ細胞（６０．２％）よりも高かった。

【0175】

上記の結果は、本発明によって調製される第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲの形質導入率は減少しないが、増加することを示す。

【0176】

実施形態８ 標的細胞に対する第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性
上記の異なるＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＢＣＭＡ抗原を発現するＡ５４９－ＢＣＭＡ細胞との共培養後の上清中のＩＦＮ－γのレベルをＥＬＩＳＡによって検出した。

【0177】

結果を図８に示す。標的細胞に対する第２世代のＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の反応性、すなわち、ＩＦＮ－γを放出する能力は、第１世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞および自己ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも有意に高かった。

【0178】

加えて、異なるエフェクター細胞：標的細胞比（１：２～１：１６）において、第２世代ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞に対する反応性は、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞のものよりも有意に良好である。これは、本発明の第２世代ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、対応する標的部位（腫瘍抗原、例えば、ＢＣＭＡまたは他の標的部位など）を有する標的細胞に対して、より有意な反応性を有することを示唆する。

【0179】

実施形態９ 標的細胞に対する第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力
ＲＴＣＡプラットフォームを使用した場合、上記３つのＢＣＡＭ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の死滅を４日間監視した。

【0180】

結果を図９に示し、上述したＩＦＮ－γ放出実験の結果を繰り返して、第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞は標的細胞に最良の殺傷力を有する。

【0181】

図９の左パネルの細胞溶解曲線は、第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞よりも標的細胞の殺傷においてより有効であることを示す。本明細書に示される結果は、１：８としての標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の比率の例である。しかしながら、同じ結論は、１：２、１：４、１：１６の他のケースについても適用される（データは示されていない）。

【0182】

図９の右パネルのＫＴ８０グラフは、標的細胞の８０％を殺傷するために必要な時間のグラフである。標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の異なる比率の下で、第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の８０％を殺傷するために要する時間は、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞のものよりも有意に低いことが見て取れる。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の数および標的細胞の数が１：８であった場合、第２世代のユニバーサル細胞が標的細胞の８０％を殺傷するために約７０時間を要したのに対し、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞が同様の結果を得るためには約１００時間を要し、これは第２世代のＣＡＲ－Ｔ細胞の約１．５倍の長さであった。

【0183】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の数が標的細胞よりもはるかに少ない場合（１：１６）、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞の８０％を殺傷するという目的さえ達成できず、第２世代のユニバーサルＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみがこの殺傷目的を達成することができる。

【0184】

上記の結果は、第２世代のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞が、他の２つのタイプのＣＡＲ－Ｔ細胞よりも標的細胞の殺傷に有効であり、これは、標的細胞が多数存在する場合に特に顕著であることを示す。

【0185】

実施形態１０
本実施形態において、Ｔ細胞を異なる条件下で拡大のために培養したが、添加したサイトカインが実施形態４と比較して変化したことを除いて、他の培養条件は同じのままであった。

【0186】

図１０～１３に示すように、異なる条件下、特に異なるサイトカインの存在下で、Ｔ細胞を培養し、ＩＬ１、ＩＬ７、およびＩＬ２１を添加することにより、Ｔｓｃｍ細胞の富化を有意に増加させ、細胞増殖を促進し、ＢＣＭＡ ＣＡＲ形質導入率を増加させ、ＩＦＮ－γ放出を増加させることができた。

【0187】

本明細書に言及されるすべての文書は、各文書が個別に参照により本明細書に組み込まれるかのように、本出願に参照により組み込まれる。加えて、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は、本発明に対して様々な変更または修正を行うことができることが理解されるべきである。これらの等価物はまた、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定される範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【手続補正書】

【提出日】2022-03-07

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2022544069000001.app

【国際調査報告】