特表 2022-544290 ＫＲＡＳを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞外小胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-17

(54)【発明の名称】ＫＲＡＳを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する細胞外小胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20221007BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20221007BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20221007BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20221007BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20221007BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20221007BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20221007BHJP

   A61K 47/58 20170101ALI20221007BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221007BHJP

   A61K 35/22 20150101ALI20221007BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20221007BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20221007BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20221007BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20221007BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 110Z

C12N5/071 ZNA

A61P35/00

A61P37/02

A61K35/12

A61K47/65

A61K47/60

A61K47/54

A61K47/55

A61K47/58

A61P43/00 105

A61K48/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K31/713

A61K31/7088

A61K38/02

A61K39/395 T

A61K39/395 N

A61P35/02

A61P1/16

A61P11/00

A61P1/04

A61P13/10

A61P13/12

A61P9/00

A61P9/10

A61P9/10 101

A61P19/02

A61P7/00

A61P17/00

A61P25/00

A61K35/22

C07K16/00

C12N15/115 Z

C07K16/46

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022508819

(86)(22)【出願日】2020-08-14

(85)【翻訳文提出日】2022-04-08

(86)【国際出願番号】 US2020046564

(87)【国際公開番号】W WO2021030781

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】62/886,885

(32)【優先日】2019-08-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520170759

【氏名又は名称】コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ブジン， ダリア

(72)【発明者】

【氏名】カメルカル， スシュルト

(72)【発明者】

【氏名】ブティン， アダム ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ブルーム， ウェンディ

(72)【発明者】

【氏名】サティヤナラヤナン， スリラム

(72)【発明者】

【氏名】カウケ， モニーク

(72)【発明者】

【氏名】ユー， ステファニー

(72)【発明者】

【氏名】ボッカー， マイケル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065CA23

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC41

4C076DD41

4C076DD55

4C076DD59

4C076DD60

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE13

4C076EE23

4C076EE41

4C084AA13

4C084AA19

4C084CA53

4C084MA02

4C084MA05

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA361

4C084ZA451

4C084ZA511

4C084ZA591

4C084ZA681

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZA961

4C084ZB071

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC422

4C084ZC751

4C085AA14

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG08

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA36

4C086ZA45

4C086ZA51

4C086ZA59

4C086ZA68

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB33

4C087BB41

4C087BB63

4C087MA02

4C087MA05

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA56

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA36

4C087ZA45

4C087ZA51

4C087ZA59

4C087ZA68

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA12

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045CA40

4H045CA41

4H045DA50

4H045DA86

4H045EA20

(57)【要約】

本開示は、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減及び／または阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む改変された細胞外小胞（例えば、エキソソーム）に関する。改変された細胞外小胞と共に使用され得るＡＳＯも開示される。がんなどの疾患を処置及び／または予防するために、エキソソーム及びＡＳＯを使用するための方法も本明細書において提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物（配列番号１）のヌクレオチド５，５６８～５，６０６の範囲内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む細胞外小胞。

【請求項2】

マクロファージを標的とする、請求項１に記載の細胞外小胞。

【請求項3】

前記連続ヌクレオチド配列が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内の前記核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的である、請求項１または２に記載の細胞外小胞。

【請求項4】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項5】

前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％低減される、請求項４に記載の細胞外小胞。

【請求項6】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、前記ヒト細胞が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを発現する、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項7】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの前記レベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの前記レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％低減される、請求項６に記載の細胞外小胞。

【請求項8】

変異型ＫＲＡＳ転写物の核酸配列の領域に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む細胞外小胞であって、前記ＡＳＯが相補性を示す前記核酸配列の前記領域が、野生型ＫＲＡＳ転写物の対応する領域と比較して変異を含む、前記細胞外小胞。

【請求項9】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における変異型ＫＲＡＳ転写物によりコードされるタンパク質（「変異型ＫＲＡＳタンパク質」）の発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記変異型ＫＲＡＳタンパク質を発現する、請求項８に記載の細胞外小胞。

【請求項10】

前記変異型ＫＲＡＳタンパク質の前記発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における対応する発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項９に記載の細胞外小胞。

【請求項11】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における前記変異型ＫＲＡＳ転写物の発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記変異型ＫＲＡＳ転写物を発現する、請求項８～９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項12】

前記変異型ＫＲＡＳ転写物の前記発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における対応する発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項１１に記載の細胞外小胞。

【請求項13】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳタンパク質を発現する、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項14】

前記野生型ＫＲＡＳタンパク質発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記野生型ＫＲＡＳタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項８に記載の細胞外小胞。

【請求項15】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項16】

野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項１０に記載の細胞外小胞。

【請求項17】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルを低減せず、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項18】

前記ＡＳＯが、ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項19】

前記ＡＳＯが、１つ以上のヌクレオシド類似体を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項20】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４に記載の細胞外小胞。

【請求項21】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、糖修飾されたヌクレオシドである、請求項１４または１５に記載の細胞外小胞。

【請求項22】

前記糖修飾されたヌクレオシドが、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシドである、請求項１６に記載の細胞外小胞。

【請求項23】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、二環式糖を含むヌクレオシドを含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項24】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上がＬＮＡを含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項25】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノＬＮＡ、オキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項26】

前記ＡＳＯが、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項27】

前記連続ヌクレオチド配列が、図１の配列から選択される配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項28】

前記連続ヌクレオチド配列が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内のヌクレオチド配列に完全に相補的である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項29】

前記ＡＳＯが、配列番号４～８５から選択されるヌクレオチド配列を、任意に１つまたは２つのミスマッチと共に含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項30】

前記ＡＳＯが、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬＬ、またはそれらの組み合わせから選択される設計を有し、Ｌがヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）であり、ＤがＤＮＡであり、Ｍが２’－ＭＯＥであり、ｎが４～２４の間の任意の整数（例えば、３～１５）であり得る、請求項１～２４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項31】

前記ＡＳＯが、１４～２０ヌクレオチド長である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項32】

前記連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項33】

前記１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項２７に記載の細胞外小胞。

【請求項34】

少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のヌクレオシド間結合が修飾されている、請求項２７または２８に記載の細胞外小胞。

【請求項35】

前記ＡＳＯにおける前記ヌクレオシド間結合の各々が、ホスホロチオエート結合である、請求項２９に記載の細胞外小胞。

【請求項36】

アンカー部分を更に含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項37】

前記ＡＳＯが前記アンカー部分に連結されている、請求項３１に記載の細胞外小胞。

【請求項38】

外来性の標的化部分を更に含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項39】

前記外来性の標的化部分が、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、化合物、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３に記載の細胞外小胞。

【請求項40】

前記外来性の標的化部分がペプチドを含む、請求項３３または３４に記載の細胞外小胞。

【請求項41】

前記外来性の標的化部分が、マイクロタンパク質、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項42】

前記外来性の標的化部分が、全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、一本鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項43】

前記抗体が一本鎖抗体である、請求項３７に記載の細胞外小胞。

【請求項44】

前記抗体が単一ドメイン抗体である、請求項３７に記載の細胞外小胞。

【請求項45】

前記単一ドメイン抗体が、ナノボディ、ｖＮＡＲ、または両方を含む、請求項３８に記載の細胞外小胞。

【請求項46】

前記外来性の標的化部分が、前記細胞外小胞を肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、脳脊髄液（ＣＳＦ）、筋肉、骨、骨髄、血液、脾臓、リンパ節、胃、食道、横隔膜、膀胱、大腸、膵臓、甲状腺、唾液腺、副腎、下垂体、胸部、皮膚、卵巣、子宮、前立腺、精巣、頸部、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する、請求項３３～４０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項47】

前記外来性の標的化部分が、前記細胞外小胞を腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、血小板、神経細胞、肝細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項48】

前記外来性の標的化部分が腫瘍抗原に結合する、請求項３３～４２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項49】

前記腫瘍抗原が、メソテリン、ＣＤ２２、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ、ＧＲＰ７８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＷＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３に記載の細胞外小胞。

【請求項50】

前記腫瘍抗原がメソテリンである、請求項４４に記載の細胞外小胞。

【請求項51】

前記外来性の標的化部分を前記細胞外小胞に連結している足場部分を含む、請求項３３～４５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項52】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が足場Ｘである、請求項３１～４６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項53】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が足場Ｙである、請求項３１～４６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項54】

前記足場Ｘが、前記細胞外小胞の内腔表面及び／または前記細胞外小胞の外部表面に前記ＡＳＯを係留することができる足場タンパク質である、請求項４８に記載の細胞外小胞。

【請求項55】

前記足場Ｘが、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンβ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンα４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰ輸送タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；それらの機能断片；及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の細胞外小胞。

【請求項56】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が、ＰＴＧＦＲＮタンパク質またはその機能断片である、請求項３１～５０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項57】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が、配列番号３０２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項58】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が、配列番号３０１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３１～５１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項59】

前記足場Ｙが、前記細胞外小胞の内腔表面及び／または前記細胞外小胞の外部表面に前記ＡＳＯを係留することができる足場タンパク質である、請求項４８に記載の細胞外小胞。

【請求項60】

前記足場Ｙが、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、それらの機能断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４８または５４に記載の細胞外小胞。

【請求項61】

前記足場Ｙが、ＢＡＳＰ１タンパク質またはその機能断片である、請求項４８、５４、及び５５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項62】

前記足場Ｙが、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤ及び／または前記ＥＤが、前記細胞外小胞の内腔表面と会合している、請求項４８及び５４～５６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項63】

前記ＮＤが、ミリストイル化により前記細胞外小胞の内腔表面と会合している、請求項５７に記載の細胞外小胞。

【請求項64】

前記ＥＤが、イオン相互作用により前記細胞外小胞の内腔表面と会合している、請求項５７または５８に記載の細胞外小胞。

【請求項65】

前記ＥＤが、配列中に（ｉ）塩基性アミノ酸または（ｉｉ）２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、前記塩基性アミノ酸が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項66】

前記塩基性アミノ酸が、（Ｌｙｓ）ｎであり、ｎが１～１０の間の整数である、請求項６０に記載の細胞外小胞。

【請求項67】

前記ＥＤが、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）；ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５７～６１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項68】

前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６で示されるアミノ酸配列を含み、ＧがＧｌｙを表し、「：」がペプチド結合を表し、前記Ｘ２～前記Ｘ６の各々が独立してアミノ酸であり、前記Ｘ６が塩基性アミノ酸を含む、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項69】

（ｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
（ｉｉ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、
（ｉｉｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、
（ｉｖ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるか、または
（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項６３に記載の細胞外小胞。

【請求項70】

前記ＮＤが、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、
（ｉ）Ｇが、Ｇｌｙを表し、
（ｉｉ）「：」が、ペプチド結合を表し、
（ｉｉｉ）前記Ｘ２が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｉｖ）前記Ｘ３が、アミノ酸であり、
（ｖ）前記Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉ）前記Ｘ５が、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、
（ｖｉｉ）前記Ｘ６が、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項５７～６４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項71】

前記Ｘ３が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項72】

前記ＮＤ及び前記ＥＤが、リンカーにより連結されている、請求項５７～６６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項73】

前記リンカーが１つ以上のアミノ酸を含む、請求項６７に記載の細胞外小胞。

【請求項74】

前記ＮＤが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号４１５）、及び（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５７～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記ＮＤが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６９に記載の細胞外小胞。

【請求項76】

前記ＮＤが、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）を含む、請求項５７～７０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項77】

前記足場Ｙが、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸の長さである、請求項４８及び５４～７１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項78】

前記足場Ｙが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）を含む、請求項４８及び５４～７２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項79】

前記足場Ｙが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）からなる、請求項４８及び５４～７３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項80】

前記足場ＹがＮ末端にＭｅｔを含まない、請求項４８及び５４～７４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項81】

前記足場Ｙが、前記足場タンパク質のＮ末端にミリストイル化されたアミノ酸残基を含む、請求項４８及び５４～７５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項82】

前記足場ＹのＮ末端の前記アミノ酸残基がＧｌｙである、請求項７６に記載の細胞外小胞。

【請求項83】

前記ＡＳＯが、前記細胞外小胞の外部表面で前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結されている、請求項３１～７７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項84】

前記ＡＳＯが、前記細胞外小胞の内腔表面で前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結されている、請求項３１～７８８８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項85】

前記アンカー部分が、ステロール、ＧＭ１、脂質、ビタミン、低分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３１～７９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項86】

前記アンカー部分がコレステロールを含む、請求項３１～８０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項87】

前記アンカー部分が、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、ビタミン（例えば、ビタミンＤ及び／またはビタミンＥ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３１～８１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項88】

前記ＡＳＯが、リンカーにより前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結されている、請求項３１～８２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項89】

前記ＡＳＯが、リンカーにより前記細胞外小胞に連結されている、請求項１～８３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項90】

前記リンカーがポリペプチドである、請求項８３または８４に記載の細胞外小胞。

【請求項91】

前記リンカーが非ポリペプチド部分である、請求項８３または８４に記載の細胞外小胞。

【請求項92】

前記リンカーがエチレングリコールを含む、請求項８３または８４に記載の細胞外小胞。

【請求項93】

前記リンカーが、ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８７に記載の細胞外小胞。

【請求項94】

前記リンカーが、アクリルホスホラミダイト（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾体（例えば、アミノ修飾体Ｃ６、アミノ修飾体Ｃ１２、アミノ修飾体Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾体）、アルキン、５’－ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾体Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオール、またはチオール修飾体Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８３または８４に記載の細胞外小胞。

【請求項95】

前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項８３～８９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項96】

前記リンカーが、（ｉ）マレイミド部分及び（ｉｉ）バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項８３～９０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項97】

前記リンカーが、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項９１に記載の細胞外小胞。

【請求項98】

前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項１～９２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項99】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物（配列番号１）のヌクレオチド５，５６８～５，６０６の範囲内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。

【請求項100】

前記連続ヌクレオチド配列が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内の前記核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的である、請求項９４に記載のＡＳＯ。

【請求項101】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する、請求項９４または９５に記載のＡＳＯ。

【請求項102】

前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項９６に記載のＡＳＯ。

【請求項103】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、前記ヒト細胞が、前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを発現する、請求項９４～９７のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項104】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの前記レベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの前記レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項９８に記載のＡＳＯ。

【請求項105】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現を低減することができ、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳタンパク質を発現する、請求項９４～９９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項106】

前記野生型ＫＲＡＳタンパク質発現が、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記野生型ＫＲＡＳタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項１００に記載のＡＳＯ。

【請求項107】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する、請求項９４～１０１のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項108】

野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される、請求項１０２に記載のＡＳＯ。

【請求項109】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの前記レベルを低減せず、前記ヒト細胞が、前記野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する、請求項９４～９９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項110】

ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である、請求項９４～１０４のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項111】

１つ以上のヌクレオシド類似体を含む、請求項９４～１０５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項112】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）；またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０６に記載のＡＳＯ。

【請求項113】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、糖修飾されたヌクレオシドである、請求項１０６または１０７に記載のＡＳＯ。

【請求項114】

前記糖修飾されたヌクレオシドが、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシドである、請求項１０８に記載のＡＳＯ。

【請求項115】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、二環式糖を含むヌクレオシドを含む、請求項１０６～１０９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項116】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、ＬＮＡを含む、請求項１０６～１１０のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項117】

前記ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上が、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノＬＮＡ、オキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１０６～１１０のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項118】

１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、請求項９４～１１２のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項119】

前記ＡＳＯが、配列番号４～配列番号８５のいずれかを含む、請求項９４～１１３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項120】

前記ＡＳＯが、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬＬ、またはそれらの組み合わせから選択される設計を有し、Ｌがヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）であり、ＤがＤＮＡであり、Ｍが２’－ＭＯＥであり、ｎが４～２４の間の任意の整数（例えば、３～１５）であり得る、請求項９４～１１４のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項121】

前記ＡＳＯが１４～２０ヌクレオチド長である、請求項９４～１１５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項122】

前記連続ヌクレオチド配列が、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項９４～１１６のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項123】

前記１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１１７に記載のＡＳＯ。

【請求項124】

少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のヌクレオシド間結合が修飾されている、請求項１１７または１１８に記載のＡＳＯ。

【請求項125】

前記ＡＳＯにおける前記ヌクレオシド間結合の各々が、ホスホロチオエート結合である、請求項１１９に記載のＡＳＯ。

【請求項126】

前記ＡＳＯが、少なくとも１種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯを含むコンジュゲート。

【請求項127】

前記非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分が、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２１に記載のコンジュゲート。

【請求項128】

請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯまたは請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲートを含む細胞外小胞。

【請求項129】

請求項１～８３及び１０８のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、または補助剤を含む医薬組成物。

【請求項130】

前記薬学的に許容される塩が、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２４に記載の医薬組成物。

【請求項131】

少なくとも１種の追加の治療薬を更に含む、請求項１２４または１２５に記載の医薬組成物。

【請求項132】

前記追加の治療薬が、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストである、請求項１２６に記載の医薬組成物。

【請求項133】

前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストが、化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１２７に記載の医薬組成物。

【請求項134】

前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストが、抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ抗体またはその断片である、請求項１２７または１２８に記載の医薬組成物。

【請求項135】

請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び使用説明書を含むキット。

【請求項136】

請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物、及び使用説明書を含む診断キット。

【請求項137】

細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を阻害または低減する方法であって、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する前記細胞に、請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含み、前記細胞における前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現が、前記投与後に阻害または低減される、前記方法。

【請求項138】

前記ＡＳＯが、前記投与後に前記細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの発現を阻害または低減する、請求項１３２に記載の方法。

【請求項139】

前記ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現が、前記投与後に、前記ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される、請求項１３３に記載の方法。

【請求項140】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質の前記発現が、前記投与後に、前記ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質の前記発現と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減される、請求項１３２～１３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項141】

がんを処置する必要がある対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に有効量の請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項142】

がんを処置する必要がある対象におけるがんを処置するための薬剤の製造における請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項143】

がんを処置する必要がある対象におけるがんの処置に使用するための請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項144】

前記細胞外小胞、前記ＡＳＯ、前記コンジュゲート、または前記医薬組成物が、静脈内に、腫瘍内に、心臓内に、経口的に、非経口的に、クモ膜下腔内に、側脳室内に、肺に、局所的に、または脳室内に投与される、請求項１３２～１３６のいずれか１項に記載の方法、請求項１３７に記載の使用、または請求項１３８に記載の使用のための組成物。

【請求項145】

前記がんが、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、白血病、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、胆管癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、肉腫、黒色腫、神経膠腫（例えば、低悪性度神経膠腫、例えば、グリア芽細胞腫）、中皮腫、肝臓癌、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）、腎臓癌（例えば、乳頭状腎細胞癌（ｐＲＣＣ）及び嫌色素性腎細胞癌）、頭頸部癌、前立腺癌、腺様嚢胞癌（ＡＣＣ）、胸腺癌、甲状腺癌、淡明細胞型腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、神経内分泌腫瘍（例えば、褐色細胞腫／傍神経節腫）、ブドウ膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３６もしくは１３９に記載の方法、請求項１３７もしくは１３９に記載の使用、または請求項１３８もしくは１３９に記載の使用のための組成物。

【請求項146】

線維症を処置する必要がある対象における線維症を処置する方法であって、前記対象に有効量の請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項147】

線維症を処置する必要がある対象における線維症を処置するための薬剤の製造における請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項148】

線維症を処置する必要がある対象における線維症の処置に使用するための請求項１～９３及び１２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項９４～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ、請求項１２１もしくは１２２に記載のコンジュゲート、または請求項１２４～１２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項149】

前記細胞外小胞、前記ＡＳＯ、前記コンジュゲート、または前記医薬組成物が、静脈内に、腫瘍内に、心臓内に、経口的に、非経口的に、クモ膜下腔内に、側脳室内に、肺に、局所的に、または脳室内に投与される、請求項１４１に記載の方法、請求項１４２に記載の使用、または請求項１４３８に記載の使用のための組成物。

【請求項150】

前記線維症が、肝臓線維症（ＮＡＳＨ）、硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックル－ウェルズ症候群）、心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、グリア性瘢痕、動脈壁硬化、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペーロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４１もしくは１４４に記載の方法、請求項１４２もしくは１４４に記載の使用、または請求項１４３もしくは１４４に記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１９年８月１４日に出願の米国仮出願第６２／８８６，８８５号の優先権の恩典を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳ－ＷＥＢ介して電子的に提出された配列表の参照
本出願において提出された電子的に提出された配列表（名称：４０００＿０６２ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：４３２，８９６バイト；及び作成日付：２０２０年８月１４日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、ＫＲＡＳアンタゴニストを含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エキソソームに関する。幾つかの態様では、ＫＲＡＳアンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。本開示のある種の態様では、細胞外小胞は、足場タンパク質を更に含む。

【背景技術】

【0004】

エキソソームは、あらゆる真核細胞により自然に生成される小さな細胞外小胞である。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含む。薬物送達媒体として、ＥＶ、例えば、エキソソームは、多数の疾患領域における新規な処置様式として従来の薬物送達方法に勝る多数の利点を提供する。特に、エキソソームは、異なる種に投与される場合でも、本質的に低い免疫原性を有する。

【0005】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロまたはインビボで標的遺伝子発現を調節する強力な手段として出現した。しかしながら、インビボでのＡＳＯの安定性及び標的化の改善が尚も必要とされている。

【0006】

従って、新規かつより効果的な操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）、特に、疾患に関連する遺伝子（例えば、がんではＫＲＡＳ）の発現を低減することができる治療薬を送達するために使用され得るものが、ＥＶベースの技術の治療用途及び他の用途でのより有効な利用を可能にするために必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物（配列番号１）のヌクレオチド５，５６８～５，６０６の範囲内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む細胞外小胞（ＥＶ）が、本明細書において開示される。ある種の態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内の核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的である。

【0008】

幾つかの態様では、ＥＶは、マクロファージを標的とする。

【0009】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0010】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを発現する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0011】

変異型ＫＲＡＳ転写物の核酸配列の領域に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む細胞外小胞（ＥＶ）も本明細書において開示され、ここで、当該ＡＳＯが相補性を示す当該核酸配列の当該領域は、野生型ＫＲＡＳ転写物の対応する領域と比較して変異を含む。

【0012】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における変異型ＫＲＡＳの転写物によりコードされるタンパク質（「変異型ＫＲＡＳタンパク質」）の発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該変異型ＫＲＡＳタンパク質を発現する。ある種の態様では、変異型ＫＲＡＳタンパク質の発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における対応する発現と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0013】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における変異型ＫＲＡＳ転写物の発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、変異型ＫＲＡＳ転写物を発現する。ある種の態様では、変異型ＫＲＡＳ転写物の発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における対応する発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0014】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶのＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳタンパク質を発現する。ある種の態様では、野生型ＫＲＡＳタンパク質発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0015】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶのＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する。ある種の態様では、野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0016】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶのＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減せず、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する。

【0017】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である。

【0018】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、１つ以上のヌクレオシド類似体を含む。ある種の態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体；またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、糖修飾されたヌクレオシドである。更なる態様では、糖修飾されたヌクレオシドは、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシドである。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、二環式糖を含むヌクレオシドを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、ＬＮＡを含む。更なる態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノＬＮＡ、オキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0019】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。

【0020】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、当該連続ヌクレオチド配列は、図１の配列から選択される配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ある種の態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内のヌクレオチド配列に完全に相補的である。

【0021】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、配列番号４～８５から選択されるヌクレオチド配列を、任意に１つまたは２つのミスマッチと共に含む。

【0022】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬＬ、またはそれらの組み合わせから選択される設計を有し、ここで、Ｌはヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）であり、ＤはＤＮＡであり、Ｍは２’－ＭＯＥであり、ｎは４～２４の間の任意の整数（例えば、３～１５）であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、１４～２０ヌクレオチド長である。

【0023】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、当該連続ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。ある種の態様では、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。幾つかの態様では、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のヌクレオシド間結合が修飾される。ある種の態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド間結合の各々は、ホスホロチオエート結合である。

【0024】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、アンカー部分を更に含む。ある種の態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、アンカー部分に連結される。

【0025】

更なる態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、外来性の標的化部分を更に含む。ある種の態様では、外来性の標的化部分は、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、化合物、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、外来性の標的化部分は、ペプチドを含む。幾つかの態様では、外来性標的化部分は、マイクロタンパク質、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、外来性の標的化部分は、全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、一本鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、抗体は、一本鎖抗体である。ある種の態様では、抗体は、単一ドメイン抗体である。幾つかの態様では、単一ドメイン抗体は、ナノボディ、ｖＮＡＲ、または両方を含む。

【0026】

幾つかの態様では、外来性の標的化部分は、ＥＶを肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、脳脊髄液（ＣＳＦ）、筋肉、骨、骨髄、血液、脾臓、リンパ節、胃、食道、横隔膜、膀胱、大腸、膵臓、甲状腺、唾液腺、副腎、下垂体、胸部、皮膚、卵巣、子宮、前立腺、精巣、頸部、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する。ある種の態様では、外来性の標的化部分は、ＥＶを腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、血小板、神経細胞、肝細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する。

【0027】

幾つかの態様では、外来性の標的化部分は、腫瘍抗原に結合する。ある種の態様では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＣＤ２２、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ、ＧＲＰ７８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＷＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、腫瘍抗原は、メソテリンである。

【0028】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、外来性の標的化部分を細胞外小胞に連結している足場部分を含む。

【0029】

幾つかの態様では、アンカー部分及び／または足場部分は、足場Ｘである。ある種の態様では、アンカー部分及び／または足場部分は、足場Ｙである。

【0030】

幾つかの態様では、足場Ｘは、細胞外小胞の内腔表面及び／または細胞外小胞の外部表面にＡＳＯを係留することができる足場タンパク質である。ある種の態様では、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；ベイシジン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンβ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンα４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰ輸送タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；それらの機能断片；及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0031】

幾つかの態様では、アンカー部分及び／または足場部分は、ＰＴＧＦＲＮタンパク質またはその機能断片である。ある種の態様では、アンカー部分及び／または足場部分は、配列番号３０２に記載のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、アンカー部分及び／または足場部分は、配列番号３０１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一なアミノ酸配列を含む。

【0032】

幾つかの態様では、足場Ｙは、細胞外小胞の内腔表面及び／または細胞外小胞の外部表面にＡＳＯを係留することができる足場タンパク質である。ある種の態様では、足場Ｙは、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、それらの機能断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。幾つかの態様では、足場Ｙは、ＢＡＳＰ１タンパク質またはその機能断片である。

【0033】

幾つかの態様では、足場Ｙは、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、当該ＮＤ及び／または当該ＥＤは、細胞外小胞の内腔表面と会合している。ある種の態様では、ＮＤは、ミリストイル化によりＥＶの内腔表面と会合している。ある種の態様では、ＥＤは、イオン相互作用によりＥＶの内腔表面と会合している。

【0034】

幾つかの態様では、ＥＤは、配列中に（ｉ）塩基性アミノ酸または（ｉｉ）２つ以上の塩基性アミノ酸を含み、ここで、当該塩基性アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある種の態様では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の間の整数である。幾つかの態様では、ＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）；ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0035】

幾つかの態様では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６で示されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＧはＧｌｙを表し、「：」はペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は独立してアミノ酸であり、Ｘ６は塩基性アミノ酸を含む。ある種の態様では、（ｉ）Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、（ｉｉ）Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるか、（ｉｉｉ）Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるか、（ｉｖ）Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるか、または（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである。

【0036】

幾つかの態様では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、（ｉ）ＧはＧｌｙを表し、（ｉｉ）「：」はペプチド結合を表し、（ｉｉｉ）Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、（ｉｖ）Ｘ３はアミノ酸であり、（ｖ）Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸であり、（ｖｉ）Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、（ｖｉｉ）Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸である。ある種の態様では、Ｘ３は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。

【0037】

幾つかの態様では、ＮＤ及びＥＤは、リンカーにより連結されている。ある種の態様では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。

【0038】

幾つかの態様では、ＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号４１５）、及び（ｖｉ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある種の態様では、ＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。更なる態様では、ＮＤは、アミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）を含む。

【0039】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）の足場Ｙは、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００アミノ酸の長さである。

【0040】

幾つかの態様では、足場Ｙは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）を含む。更なる態様では、足場Ｙは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）からなる。

【0041】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）の足場Ｙは、Ｎ末端にＭｅｔを含まない。ある種の態様では、足場Ｙは、足場タンパク質のＮ末端にミリストイル化されたアミノ酸残基を含む。更なる態様では、足場ＹのＮ末端のアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。

【0042】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、細胞外小胞の外部表面でアンカー部分及び／または足場部分に連結される。ある種の態様では、ＡＳＯは、ＥＶの内腔表面でアンカー部分及び／または足場部分に連結される。

【0043】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のアンカー部分は、ステロール、ＧＭ１、脂質、ビタミン、低分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。ある種の態様では、アンカー部分は、コレステロールを含む。幾つかの態様では、アンカー部分は、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、ビタミン（例えば、ビタミンＤ及び／またはビタミンＥ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0044】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）のＡＳＯは、リンカーを介してアンカー部分及び／または足場部分に連結される。幾つかの態様では、ＡＳＯは、リンカーを介して細胞外小胞に連結される。ある種の態様では、リンカーは、ポリペプチドである。他の態様では、リンカーは、非ポリペプチド部分である。更なる態様では、リンカーは、エチレングリコールを含む。ある種の態様では、リンカーは、ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。更に他の態様では、リンカーは、アクリルホスホラミダイト（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾体（例えば、アミノ修飾体Ｃ６、アミノ修飾体Ｃ１２、アミノ修飾体Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾体）、アルキン、５’－ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾体Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオールまたはチオール修飾体Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、リンカーは、切断可能なリンカーである。ある種の態様では、リンカーは、（ｉ）マレイミド部分及び（ｉｉ）バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。幾つかの態様では、リンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。

【0045】

幾つかの態様では、細胞外小胞は、エキソソームである。

【0046】

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物（配列番号１）のヌクレオチド５，５６８～５，６０６の範囲内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）も本明細書において開示される。幾つかの態様では、連続ヌクレオチド配列は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物内の核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補的である。

【0047】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0048】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを発現する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡのレベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0049】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現を低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳタンパク質を発現する。ある種の態様では、野生型ＫＲＡＳタンパク質発現は、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における野生型ＫＲＡＳタンパク質発現と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0050】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する。ある種の態様では、野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルと比較して少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減される。

【0051】

幾つかの態様では、ヒト細胞（例えば、免疫細胞または腫瘍細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡのレベルを低減せず、ここで、当該ヒト細胞は、当該野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを発現する。

【0052】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である。

【0053】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、１つ以上のヌクレオシド類似体を含む。ある種の態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）；またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、糖修飾されたヌクレオシドである。更なる態様では、糖修飾されたヌクレオシドは、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシドである。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、二環式糖を含むヌクレオシドを含む。ある種の態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、ＬＮＡを含む。更なる態様では、ヌクレオシド類似体のうちの１つ以上は、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノＬＮＡ、オキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0054】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４～配列番号８５のいずれか１つを含む。ある種の態様では、ＡＳＯは、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬＬ、またはそれらの組み合わせから選択される設計を有し、ここで、Ｌはヌクレオシド類似体（例えば、ＬＮＡ）であり、ＤはＤＮＡであり、Ｍは２’－ＭＯＥであり、ｎは４～２４の間の任意の整数（例えば、３～１５）であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、１４～２０ヌクレオチド長である。

【0055】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯの連続ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。ある種の態様では、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。更なる態様では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のヌクレオシド間結合が修飾される。幾つかの態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド間結合の各々は、ホスホロチオエート結合である。

【0056】

本開示は、本明細書において開示されるＡＳＯのいずれかを含むコンジュゲートも提供し、ここで、ＡＳＯは、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分に共有結合されている。幾つかの態様では、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0057】

本明細書において開示されるＡＳＯまたはコンジュゲートのいずれかを含む細胞外小胞が本明細書において提供される。

【0058】

本明細書において開示される細胞外小胞（例えば、エキソソーム）、ＡＳＯ、またはコンジュゲート、及び薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、または補助剤を含む医薬組成物も提供される。ある種の態様では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0059】

幾つかの態様では、医薬組成物は、少なくとも１種の追加の治療薬を更に含む。ある種の態様では、追加の治療薬は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストである。幾つかの態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストは、化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。更なる態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄアンタゴニストは、抗ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ抗体またはその断片である。

【0060】

本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物、及び使用説明書を含むキットが本明細書おいて開示される。本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物、及び使用説明書を含む診断キットも開示される。

【0061】

本開示は、細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現を阻害または低減する方法であって、本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質を発現する細胞に投与することを含み、当該細胞における当該ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現が、投与後に阻害または低減される、当該方法を提供する。

【0062】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、投与後に細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの発現を阻害または低減する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの発現は、投与後に、ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの発現と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。

【0063】

幾つかの態様では、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現は、投与後に、ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質発現と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減される。

【0064】

がんを処置する必要がある対象におけるがんを処置する方法であって、有効量の本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を当該対象に投与することを含む、当該方法が本明細書において開示される。がんを処置する必要がある対象におけるがんを処置するための薬剤の製造における本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物の使用も本開示において提供される。本開示は、がんを処置する必要がある対象におけるがんの処置に使用するための細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物も提供する。

【0065】

幾つかの態様では、本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物は、静脈内に、腫瘍内に、心臓内に、経口的に、非経口的に、クモ膜下腔内に、側脳室内に、肺に、局所的に、または脳室内に投与される。幾つかの態様では、本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を用いて処置され得るがんには、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、白血病、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、胆管癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、肉腫、黒色腫、神経膠腫（例えば、低悪性度神経膠腫、例えば、グリア芽細胞腫）、中皮腫、肝臓癌、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）、腎臓癌（例えば、乳頭状腎細胞癌（ｐＲＣＣ）及び嫌色素性腎細胞癌）、頭頸部癌、前立腺癌、腺様嚢胞癌（ＡＣＣ）、胸腺癌、甲状腺癌、淡明細胞型腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、神経内分泌腫瘍（例えば、褐色細胞腫／傍神経節腫）、ブドウ膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0066】

本開示は、線維症を処置する必要がある対象における線維症を処置する方法であって、有効量の本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む、当該方法を更に提供する。線維症を処置する必要がある対象における線維症を処置するための薬剤の製造における本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物のいずれかの使用も本明細書において開示される。線維症を処置する必要がある対象における線維症の処置に使用するための本明細書において開示される細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物のいずれかが更に提供される。

【0067】

幾つかの態様では、本明細書において開示される処置する方法、使用方法、または使用するための組成物は、対象に細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を、静脈内に、腫瘍内に、心臓内に、経口的に、非経口的に、クモ膜下腔内に、側脳室内に、肺に、局所的に、または脳室内に投与することを含む。

【0068】

幾つかの態様では、本開示により処置され得る線維症には、肝臓線維症（ＮＡＳＨ）、硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックル－ウェルズ症候群）、心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、グリア性瘢痕、動脈壁硬化、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペーロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1-1】変異型ＫＲＡＳ転写物を標的とする例示的なＡＳＯを列挙する表を示す。表は、以下の情報（左から右）を含む：（ｉ）ＡＳＯ配列のみについて示される配列番号（１列目）、（ｉｉ）変異型ＫＲＡＳのゲノム配列（配列番号１）上の標的開始位置及び末端位置（それぞれ２列目及び３列目）、（ｉｉｉ）変異型ＫＲＡＳのｍＲＮＡ配列（配列番号３）上の標的開始位置及び末端位置（それぞれ４列目及び５列目）、（ｉｖ）なんらの特定の設計または化学構造も有さないＡＳＯ配列（６列目）、ならびに（ｖ）化学構造を有するＡＳＯ配列。ＡＳＯは５’～３’である（最後の列）。化学構造における記号は、以下の通りである：ＮｂはＬＮＡを意味し、ｄＮはＤＮＡを意味し、５ＭｄＣは ５－メチル－ｄＣを意味し、ＮｍはＭＯＥを意味し、ｓはホスホロチオエートを意味する。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【図1-6】同上。

【図1-7】同上。

【図2A】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｉ）ＡＳＯ－０００７（図２Ａ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2B】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｉｉ）ＡＳＯ－０００８（図２Ｂ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2C】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｉｉｉ）ＡＳＯ－０００９（図２Ｃ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2D】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｉｖ）ＡＳＯ－００２１（図２Ｄ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2E】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｖ）ＡＳＯ－００２２（図２Ｅ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2F】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｖｉ）ＡＳＯ－００２３（図２Ｆ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2G】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｖｉｉ）ＡＳＯ－００３６（図２Ｇ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2H】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｖｉｉｉ）ＡＳＯ－００３７（図２Ｈ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2I】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｉｘ）ＡＳＯ－００３８（図２Ｉ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2J】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｘ）ＡＳＯ－００３９（図２Ｊ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2K】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｘｉ）ＡＳＯ－００５９（図２Ｋ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図2L】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、野生型（丸）及びＧ１２Ｄ変異型（四角）のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のＡＳＯによるノックダウンの阻害曲線を示す。試験されたＡＳＯは、（ｘｉｉ）ＡＳＯ－００７１（図２Ｌ）である。ＡＳＯの各々でのＡＳＯノックダウンは、野生型またはＧ１２Ｄ変異体配列を含有するＤｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミドで形質移入され、ＡＳＯで処理されたマウスＨｅｐａ１－６細胞におけるパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現として示される。対照／モックＡＳＯで処理された対応するＨｅｐａ１－６細胞における野生型及びＧ１２Ｄ変異型のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物のノックダウンに正規化されたパーセントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が示される。

【図3-1】Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定される、本開示に記載される異なるＡＳＯのＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウン効率を示す表を示す。ノックダウン効率は、異なるＡＳＯで形質移入された細胞において観察される野生型またはＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の量として示される。野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現レベルからＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現レベルを減算することによりＡＳＯの選択性も示される（「ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを引いたＫＲＡＳ野生型」と表記された列を参照のこと）。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図4A】本明細書において開示される異なるＡＳＯによる処理の４８時間後の膵癌細胞株におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を示す。試験されたＡＳＯをグラフの右側に示す。図４Ａにおいて、Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合であるＰａｎｃ－１細胞におけるＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を阻害するＡＳＯの能力が評価された。図４Ａ及び図４Ｂの各々について、ＰＣＲアッセイを使用してＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が測定され、ＲＰＳ１３に正規化して示された。

【図4B】本明細書において開示される異なるＡＳＯによる処理の４８時間後の膵癌細胞株におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を示す。試験されたＡＳＯをグラフの右側に示す。図４Ｂにおいて、なんらのＫＲＡＳ変異も含まないＢｘＰＣ－３細胞における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を阻害するＡＳＯの能力が評価された。図４Ａ及び図４Ｂの各々について、ＰＣＲアッセイを使用してＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が測定され、ＲＰＳ１３に正規化して示された。

【図5】Ａ、Ｂ、及びＣは、２種の例示的なＡＳＯ（すなわち、ＡＳＯ－００８２及びＡＳＯ－０００９）の、以下の３種の異なる膵癌細胞株：ＢｘＰＣ－３（ＫＲＡＳ変異なし）（黒丸）、ＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）（三角）、及びＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）（白丸）におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を阻害する能力を示す。細胞が８つの異なる濃度のＡＳＯで処理され、ＡＳＯ形質移入の４８時間後にＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現がｑＰＣＲアッセイを使用して測定された。図５Ａは、ＡＳＯ－００８２での結果を提供する。図５Ｂは、ＡＳＯ－０００９での結果を提供する。図５Ｃは、異なる細胞株におけるＡＳＯのＩＣ５０値を提供する。

【図6】Ａ及びＢは、本明細書において開示される異なる濃度の２種の例示的なＡＳＯ（すなわち、ＡＳＯ－００８２（薄灰色棒）及びＡＳＯ－０００９（黒棒））で形質移入された２種の異なるサル腎臓細胞株（すなわち、それぞれＦｒＨＫ－４及びＣｏｓ－７）におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を示す。スクランブル対照ＡＳＯで形質移入された細胞が、対照として使用された（濃灰色棒、すなわち、各図における最後の２本の棒）。形質移入の４８時間後に、ｑＰＣＲアッセイを使用してＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現が測定された。ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＤＰＨ及び未処理の細胞に正規化して示される。

【図7】Ａ及びＢは、本明細書において開示されるＡＳＯをコンジュゲートするために使用され得る２つの例示的なコレステロール部分の具体例を提供する。図７Ａは、Ｃｈｏｌ２の構造を提供する。図７Ｂは、Ｃｈｏｌ４の構造を提供する。

【図8】Ａ及びＢは、それぞれＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）及びＨＥＰ３Ｂ（ＫＲＡＳ変異なし）膵臓癌細胞の増殖に対する本明細書において開示される例示的なコレステロールがタグ付けされたＡＳＯの効果を示す。図８Ａの上３行及び図８Ｂの上２行は、コレステロールがタグ付けされた異なる濃度のＡＳＯ－０００９（すなわち、０ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、または１，０００ｎＭ）で処理された細胞のコロニー形成を示す。図８Ａの下３行及び図８Ｂの下２行は、コレステロールがタグ付けされたスクランブル対照で処理された細胞での結果を示す。

【図9】Ａ及びＢは、以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯ：（ｉ）ＡＳＯ－０００９、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯのうちの１つを含む表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）で処理されたＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を示す。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現は、未処理の細胞及びＲＰＳ１３に正規化して示される。図９Ａは、以下の濃度のうちの１つでＡＳＯ－０００９を含むＥＶを使用した結果を示す：６，７００ｎＭ；２，２００ｎＭ；７００ｎＭ；２００ｎＭ；及び８０ｎＭ（最初の５本の棒（左から右））。ＥＶ中のＡＳＯの量は、ＥＶ上にＡＳＯをロードした後に測定された。スクランブル対照ＡＳＯを含むＥＶ（「ｓｃｒ」）及び最も高いＡＳＯ濃度の遊離ＡＳＯ－０００９（すなわち、ＥＶの一部でない）（すなわち、６，７００ｎＭ）（「遊離」）が対照として使用された。図９Ｂは、以下の濃度のうちの１つでＡＳＯ－００８２を含むＥＶを使用した結果を示す：４，１００ｎＭ；１，３６７ｎＭ；４５６ｎＭ；１５２ｎＭ；及び５１ｎＭ（最初の５本の棒（左から右））。ＥＶ中のＡＳＯの量は、ＥＶ上にＡＳＯをロードした後に測定された。スクランブル対照ＡＳＯを含むＥＶ（「ｓｃｒ」）及び最も高いＡＳＯ濃度の遊離ＡＳＯ－００８２（「遊離」）（すなわち、４，１００ｎＭ）が対照として使用された。

【図10】以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯ：（ｉ）ＡＳＯ－０００９、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯのうちの１つを含む表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）で処理されたＰａｎｃ８．１３（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を示す。ロード後、ＡＳＯは、以下の濃度のうちの１つでＥＶに存在した：１，６００ｎＭ；５３３．３ｎＭ；１７７．８ｎＭ；５９．３ｎＭ；及び１９．８ｎＭ。対照として、遊離ＡＳＯ－０００９、遊離ＡＳＯ－００８２、及び遊離スクランブル対照ＡＳＯが使用された（全て１，６００ｎＭ）。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現は、未処理の細胞及びＲＰＳ１３に正規化して示される。

【図11】以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯ：（ｉ）ＡＳＯ－０００９、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯのうちの１つを含む表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）で処理されたＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を示す。ロード後、ＡＳＯは、以下の濃度のうちの１つでＥＶに存在した：５００ｎＭ、１６６．７ｎＭ、５５．６ｎＭ、１８．５ｎＭ、及び６．２ｎＭ。遊離ＡＳＯ－０００９、遊離ＡＳＯ－００８２、及び遊離スクランブル対照ＡＳＯが対照として使用された（全て５００ｎＭの濃度）。

【図12】以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯ：（ｉ）ＡＳＯ－０００９、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯのうちの１つを含む表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）で処理されたＡｓＰＣ－１細胞の生存率を示す。ＥＶは、以下の濃度のうちの１つでＫＲＡＳ ＡＳＯを含んだ：３，０００ｎＭ、６００ｎＭ、１２０ｎＭ、２４ｎＭ、及び１ｎＭ。遊離ＡＳＯ－００８２（白色棒）及び遊離ＡＳＯ－０００９（黒灰色棒）が対照として使用された（両方とも３，０００ｎＭの濃度）。生存率は、未処理の細胞または空のＥＶ（すなわち、ＡＳＯを含まない）で処理された細胞における対応する値と比較して異なる処理群で観察された細胞の相対数（ＣＴＧを使用してＡＴＰレベルを測定することにより決定される）として示される。

【図13】Ａ及びＢは、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）の、以下の２種の異なる膵臓癌細胞株：それぞれ、Ｐａｎｃ８．１３（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）及びＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）におけるｐＥＲＫ発現に対する効果を示す。膵臓癌細胞が、以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯのうちの１つを含む表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）で処理された：（ｉ）ＡＳＯ－０００９、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯ。ＥＶに存在するＡＳＯの濃度がｘ軸に沿って示される。空のＥＶ（すなわち、ＡＳＯを含まない表面が操作されたＥＶ；「ＰｒＸのみ」）（１，５００ｎＭまたは５００ｎＭ）及び未処理の細胞が対照として使用された。ｐＥＲＫ発現は、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ２．０での読み取り及び未処理の細胞に正規化して示される。

【図14】本明細書において開示されるＡＳＯの、ＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）（左パネル）及びＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）（右パネル）膵臓癌細胞におけるｐＥＲＫ発現を阻害する能力を示す。膵臓癌細胞が以下のコレステロールがコンジュゲートされたＡＳＯのうちの１つで処理された：（ｉ）ＡＳＯ－０００９（「０００９」）、（ｉｉ）ＡＳＯ－００８２（「００８２」）、または（ｉｉｉ）スクランブル対照ＡＳＯ（「ｓｃｒｍ」）。ＡＳＯは、以下の濃度で使用された：５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭ。形質移入の７２時間後に、ｐＥＲＫ発現が、ウェスタンブロットを使用して測定された。比較のために、ビンキュリン、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質、及び総ＥＲＫの発現も同時に測定された。

【図15A】様々なＣＤ４７－足場Ｘ融合構築物の概略図を示す。図１５Ａは、ＦＬＡＧタグが付けられた（１０８３及び１０８４）またはＦＬＡＧタグが付けられていない（１０８５及び１０８６）全長足場Ｘ（１０８３及び１０８６）または切断型足場Ｘ（１０８４及び１０８５）のいずれかに融合された野生型ＣＤ４７（Ｃ１５Ｓ置換を有する）の細胞外ドメインを含む構築物を示す。

【図15B】様々なＣＤ４７－足場Ｘ融合構築物の概略図を示す。図１５Ｂは、ＦＬＡＧタグが付けられた（１０８７及び１０８８）またはＦＬＡＧタグが付けられていない（１０８９及び１０９０）全長足場Ｘ（１０８７及び１０９０）または切断型足場Ｘ（１０８８及び１０８９）のいずれかに融合されたＶｅｌｃｒｏ（登録商標）－ＣＤ４７の細胞外ドメインを含む構築物を示す。

【図15C】様々なＣＤ４７－足場Ｘ融合構築物の概略図を示す。図１５Ｃは、野生型ＣＤ４７（Ｃ１５Ｓ置換を有する；１１２７及び１１２８）またはＶｅｌｃｒｏ（登録商標）－ＣＤ４７（１１２９及び１１３０）の第１膜貫通ドメインが足場Ｘの膜貫通ドメイン及び第１細胞外モチーフを含む足場Ｘの断片と置き換えられた構築物を示す。

【図15D】様々なＣＤ４７－足場Ｘ融合構築物の概略図を示す。図１５Ｄは、ＦＬＡＧタグが付けられた（１１５８及び１１５９）またはＦＬＡＧタグが付けられていない（１１６０及び１１６１）全長足場Ｘ（１１５８及び１１６１）または切断型足場Ｘ（１１５９及び１１６０）のいずれかに融合された最小「自己」ペプチド（ＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫ；配列番号６００）を含む様々な構築物を示す。

【図16】改変されたエキソソームの表面に発現され得る例示的なマウスＣＤ４７－足場Ｘ融合構築物の発現を、本明細書に記載されるＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯと共に示す。構築物は、ＦＬＡＧタグが付けられた（１９２３及び１９２５）またはＦＬＡＧタグが付けられていない（１９２４及び１９２２）全長足場Ｘ（１９２３及び１９２２）または切断型足場Ｘ（１９２５及び１９２４）のいずれかに融合された野生型マウスＣＤ４７（Ｃ１５Ｓ置換を有する）の細胞外ドメインを含む。

【図17A】任意の他の部分、例えば、生物学的に活性な部分と共に送達され得る、ニューロトロフィン－足場Ｘ融合構築物を使用した、Ｔｒｋｓを標的とする例示的な細胞外小胞（例えば、エキソソーム）の模式図を示す。ニューロトロフィンは、ホモ二量体としてＴｒｋ受容体に結合し、ＥＶが感覚ニューロンを標的とするのを可能にする。

【図17B】（ｉ）向神経性及び（ｉｉ）抗貪食シグナル（例えば、ＣＤ４７及び／またはＣＤ２４）であって、（ｉｉｉ）ＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯと共に送達され得るＥＶの外部表面上の当該抗貪食シグナルを有する例示的な細胞外小胞（例えば、エキソソーム）の模式図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0070】

本開示のある種の態様は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エキソソームを対象とする。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体転写物内の核酸配列に相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。

【0071】

Ｉ．定義
本明細書がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。追加の定義は、発明を実施するための形態の全体を通して記載される。

【0072】

用語「ある（ａ）」または「ある（ａｎ）」を付された物は、その物のうちの１つ以上を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。従って、用語「ある（ａ）」（またはある「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。

【0073】

更に、「及び／または」は、本明細書において使用される場合、２つの指定された特徴または成分の各々の、他方を伴うか、または伴わない具体的な開示とみなされるべきである。従って、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句において使用される用語「及び／または」は、以下の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。

【0074】

態様が用語「含む」を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」及び／または「本質的にからなる」という言葉で記載された別様の類似した態様もまた提供されていると理解されよう。

【0075】

特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供している。

【0076】

単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形態で表される。数値範囲は、その範囲を定義する数値を包括する。特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で左から右へ記載される。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ記載される。本明細書において提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得られ得る本開示の様々な態様を限定するものではない。従って、直下に定義される用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。

【0077】

用語「約」は、「ほぼ」、「大まかに」、「およそ」、または「の範囲で」を意味するように本明細書において使用される。用語「約」が数値の範囲と共に使用される場合、この用語は、記載される数値の上限及び下限を広げることによりその範囲を修正する。一般に、用語「約」は、例えば、１０パーセントの上昇または下降（より高いまたはより低い）の変動で、明示される値の上及び下に数値を修正し得る。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯの投与後の細胞におけるＫＲＡＳタンパク質の発現を少なくとも約６０％低減する」ことが明示される場合、ＫＲＡＳタンパク質の発現が５０％～７０％の範囲で低減されることが含まれる。

【0078】

用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＳＯ）は、ヌクレオチド間結合により互いに共有結合されているヌクレオシド、例えば、天然に存在するヌクレオシドまたはその修飾形態のオリゴマーまたはポリマーを指す。本開示に有用なＡＳＯは、少なくとも１つの非天然ヌクレオシドを含む。ＡＳＯは、当該ＡＳＯが標的核酸配列にハイブリダイズするように、少なくとも部分的に当該標的核酸に相補的である。

【0079】

用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、複数の核酸を包含することを意図する。幾つかの態様では、用語「核酸」または「ヌクレオチド」は、標的配列、例えば、インビボまたはインビトロのプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡを指す。この用語が標的配列の核酸またはヌクレオチドを指す場合、核酸またはヌクレオチドは、細胞内に天然に存在する配列であり得る。他の態様では、「核酸」または「ヌクレオチド」は、本開示のＡＳＯの配列を指す。この用語がＡＳＯの配列を指す場合、核酸またはヌクレオチドは、非天然であり得、すなわち、化学合成され得るか、酵素により生成され得るか、組換えにより生成され得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは、合成または組換えにより生成されるが、天然に存在する配列またはその断片ではない。幾つかの態様では、ＡＳＯの核酸またはヌクレオチドは、それらが自然界で天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含有するため、天然に存在しない。

【0080】

本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分、及び共有結合した基（結合基）、例えば、ホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基を含む配糖体を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの天然に存在するヌクレオチド、ならびに本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも称される、修飾された糖及び／または塩基部分を含む、非天然ヌクレオチドの両方を含む。本明細書において、単一ヌクレオチドは、モノマーまたは単位と称され得る。ある種の態様では、用語「ヌクレオチド類似体」は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾された糖部分を有するヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）の非限定的な例は、本明細書の他箇所で開示される。他の態様では、用語「ヌクレオチド類似体」は、修飾された塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾された核酸塩基部分を有するヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、５－メチル－シトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンが挙げられる。幾つかの態様では、用語「ヌクレオチド」、「単位」、及び「モノマー」は、互換的に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものが、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵなどの塩基及びその類似体の配列であることが理解されるであろう。

【0081】

本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシド」は、糖部分及び塩基部分を含む配糖体を指すために使用され、従って、ＡＳＯのヌクレオチドの間のヌクレオチド間結合により共有結合されているヌクレオチド単位に言及する場合に使用され得る。バイオテクノロジーの分野において、用語「ヌクレオチド」は、多くの場合、核酸モノマーまたは単位を指すために使用される。ＡＳＯとの関係において、用語「ヌクレオチド」は、塩基のみ、すなわち、糖骨格及びヌクレオチド間結合の存在が暗黙的である、シトシン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、グアニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、アデニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）、及びウラシル（ＲＮＡ）を含む核酸塩基配列を指し得る。同様に、ヌクレオシド間結合基のうちの１つ以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合は特に、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」を指し得る。例えば、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を指定する場合でも使用され得る。

【0082】

本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチド長」は、所与の配列におけるヌクレオチド（モノマー）の総数を意味する。例えば、ｔｃａｇｃｔｃｃａａｃｔａｃ （配列番号４）の配列は、１４個のヌクレオチドを有し、従って、配列のヌクレオチド長は、１４である。従って、用語「ヌクレオチド長」は、本明細書において、「ヌクレオチド数」と互換的に使用される。

【0083】

当業者が理解するように、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、５’ヌクレオチド間結合基を含まないが、５’末端基を含み得る。

【0084】

本明細書に記載の化合物は、幾つかの不斉中心を含有し得、光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、例えば、ラセミ化合物、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ化合物またはジアステレオ異性体ラセミ化合物の混合物の形態で存在し得る。幾つかの態様では、不斉中心は、不斉炭素原子であり得る。用語「不斉炭素原子」は、４つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレローグ表示法に従って、不斉炭素原子は、「Ｒ」または「Ｓ」配置であり得る。

【0085】

本明細書で使用する場合、用語「二環式糖」は、４～７員環であって、当該４～７員環の２個の原子を連結して、第２の環を形成し、これにより、二環式構造をもたらす架橋を含む、当該４～７員環を含む修飾された糖部分を指す。幾つかの態様では、架橋は、ＬＮＡヌクレオシドにおいて見られるように、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を連結する（すなわち、２’－４’架橋）。

【0086】

本明細書で使用する場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、通常、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と見なされ得る。しかし、隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）などは、いずれもコード領域の一部ではない。コード領域の境界は、通常、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、及び得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。

【0087】

本明細書で使用する場合、用語「非コード領域」は、コード領域でないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例としては、限定されるものではないが、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）、非コードエキソンなどが挙げられる。エキソンのうちの幾つかは、各転写物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の全体または一部であり得る。非翻訳領域は、転写物の効率的な翻訳に、ならびに転写物の翻訳の速度及び半減期の制御に重要である。

【0088】

ヌクレオチド配列との関係において使用される場合、用語「領域」は、その配列の一部を指す。例えば、語句「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」は、それぞれ、特定のヌクレオチド配列内または当該ヌクレオチド配列の相補体内に位置する、当該ヌクレオチド配列よりも短いが、少なくとも１０ヌクレオチドより長い配列を指す。用語「部分配列（ｓｕｂ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」もヌクレオチド配列の領域を指し得る。

【0089】

ヌクレオチド配列に言及する場合、用語「下流」は、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の３’側に位置することを意味する。ある種の態様では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に存在する。

【0090】

用語「上流」は、参照ヌクレオチド配列の５’側に存在するヌクレオチド配列を指す。

【0091】

本明細書で使用する場合、用語「調節領域」は、連結されたコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼす、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’非コード配列）に存在するヌクレオチド配列を指す。調節領域としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲ、及びステムループ構造が挙げられる。コード領域が真核細胞での発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に存在する。

【0092】

本明細書で使用する場合、用語「転写物」は、ＤＮＡの転写により合成され、プロセシング後にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）になる、すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）及びプロセシングされたｍＲＮＡ自体になる、一次転写物を指し得る。用語「転写物」は、「プレｍＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ」と互換的に使用され得る。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新たに合成された一次転写物は、幾つかの方法で修飾されて、異なるタンパク質及びＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを生成するための成熟した機能的形態に変換される。従って、用語「転写物」は、エキソン、イントロン、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲを含み得る。

【0093】

用語「発現」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成するプロセスを指す。発現としては、限定されるものではないが、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。発現により、「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。更に本明細書に記載される遺伝子産物としては、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングを受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質切断を受けたポリペプチドが挙げられる。

【0094】

２つ以上の核酸の文脈における用語「同一の」または「同一性」パーセントは、同一であるかまたは、なんらの保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部とみなさずに最大の一致について比較及びアラインメント（必要に応じてギャップを導入）された場合に同一である特定の百分率のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査により測定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが、当技術分野において公知である。

【0095】

配列アラインメントアルゴリズムのそのような非限定的な例の１つは、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３－５８７７において改変されているような、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４－２２６８に記載されており、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれているアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２）。ある種の態様では、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが使用され得る。配列をアラインメントするために使用され得る追加の公開されているソフトウェアプログラムは、ＢＬＡＳＴ－２、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）である。ある種の態様では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、及び４０、５０、６０、７０、または９０のギャップの重み、及び１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用して）決定され得る。ある種の代替的態様では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４－４５３ （１９７０））が組み込まれた、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムが、（例えば、ＢＬＯＳＵＭ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、及び１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重み、及び１、２、３、４、５の長さの重みを使用して）２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために使用され得る。あるいは、ある種の態様では、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））を使用して決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用して決定され得る。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによる最大限のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。ある種の態様では、アラインメントソフトウェアのデフォルトのパラメータが使用される。

【0096】

ある種の態様では、第１のヌクレオチド配列の第２のヌクレオチド配列に対する同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アライメントプログラムによりアラインメントされる）において完全な一致と評価されたアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列を超える場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは、第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントより高くなるであろう。

【0097】

ポリヌクレオチド参照配列とアラインメントされている単一のポリヌクレオチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自身の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、小数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられるが、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に整数であることにも留意されたい。

【0098】

本明細書で使用する場合、用語「相同な」及び「相同性」は、用語「同一性」及び「同一の」と互換的である。

【0099】

用語「天然に存在するそのバリアント」は、哺乳動物、例えば、マウス、サル、及びヒトなどの既定の分類群内に自然に存在する、ＫＲＡＳポリペプチド配列またはＫＲＡＳ核酸配列（例えば、転写物）のバリアントを指す。典型的には、ポリヌクレオチドの「天然に存在するバリアント」に言及する場合、この用語は、染色体転座または重複による、染色体位置１２ｐ１２．１（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１２の２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６）で見出されるＫＲＡＳをコードするゲノムＤＮＡの任意のアレルバリアント、及びＲＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡから生じるｍＲＮＡも包含し得る。「天然に存在するバリアント」は、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じるバリアントを含み得る。特定のポリペプチド配列に言及する場合、例えば、この用語は、天然に存在する形態のタンパク質であって、従って、例えば、翻訳時または翻訳後修飾、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質切断、グリコシル化などによりプロセシングされ得る、当該天然に存在する形態のタンパク質も含む。

【0100】

本開示のＡＳＯ（またはその領域）と、本明細書において開示されるものなどの哺乳動物ＫＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ遺伝子）をコードする核酸の標的領域との間の「相補性」の程度を決定する際に、「相補性」（「相同性」または「同一性」とも称される）の程度は、ＡＳＯ（またはその領域）の配列と、それと最適にアラインメントされている標的領域の配列（または標的領域の逆相補体）との間の同一性パーセンテージ（または相同性パーセンテージ）として表現される。百分率は、２つの配列の間で同一であるアラインメントされた塩基の数を計数し、ＡＳＯの連続したモノマーの総数で除算し、１００を乗算することにより計算される。このような比較においてギャップが存在する場合、かかるギャップは、ギャップ内のモノマーの数が本開示のＡＳＯと標的領域との間で異なる領域ではなく、単にミスマッチにすぎないことが好ましい。

【0101】

本明細書で使用する場合、用語「相補体」は、参照配列に相補的な配列を指す。相補性がＤＮＡ複製及び転写の基本原理であることは周知である。相補性が２つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列の間で共有される性質である場合、結果として、それらが互いに逆平行にアラインメントされた場合、配列における各位置のヌクレオチド塩基は、鏡を見て、物を逆に見るように相補的となる。従って、例えば、５’「ＡＴＧＣ」３’の配列の相補体は、３’「ＴＡＣＧ」５’または５’「ＧＣＡＴ」３’と書かれ得る。本明細書で使用する場合、用語「逆相補体」、「逆相補的」、及び「逆相補性」は、用語「相補体」、「相補的」、及び「相補性」と互換的である。幾つかの態様では、用語「相補的」は、ＫＲＡＳ転写物内の連続核酸配列に対する１００％の一致または相補性（すなわち、完全に相補的）を指す。幾つかの態様では、用語「相補的」は、ＫＲＡＳ転写物内の連続核酸配列に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の一致または相補性を指す。

【0102】

２つの別個の核酸またはヌクレオチド配列に言及する場合、用語「対応すること」及び「対応する」は、相同性及び／または機能性に基づいて互いに対応するか、または類似するが、特定の配列のヌクレオチドの番号付けが異なり得る配列の領域を明らかにするために使用され得る。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、選択的スプライシング及び／または他の修飾に基づいて番号付けがそれぞれのアイソフォームで異なり得る、ヌクレオチド配列の類似の部分または保存された部分を有し得る。加えて、核酸またはヌクレオチド配列を特徴付ける場合に、異なる番号付けシステム（例えば、遺伝子転写物及び配列の番号付けを翻訳開始コドンから始めるか、または５’ＵＴＲを含めるか）が用いられ得ることが理解されよう。更に、遺伝子または遺伝子転写物の異なるバリアントの核酸またはヌクレオチド配列が異なり得ることが理解されよう。しかしながら、本明細書で使用する場合、核酸またはヌクレオチド配列相同性及び／または機能性を共有するバリアントの領域は、互いに「対応する」とみなされる。例えば、配列番号１または配列番号３（「参照配列」）のヌクレオチドＸ～Ｙに対応するＫＲＡＳ転写物のヌクレオチド配列は、（図１に示すような）配列番号１または配列番号３のヌクレオチドＸ～Ｙと同一の配列または類似の配列を有するＫＲＡＳ転写物配列（例えば、ＫＲＡＳプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を指し、ここで、Ｘは開始部位であり、Ｙは末端部位である。当業者は、ＫＲＡＳ転写物配列を配列番号１または配列番号３とアラインメントすることにより、ＫＲＡＳ転写物配列における対応するＸ及びＹ残基を同定することができる。

【0103】

用語「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体及び天然に存在するヌクレオチドにおける核酸塩基が、同じ対形成能またはハイブリダイズ能を有することを示すことを意図する。例えば、ヌクレオチドの２－デオキシリボース単位が、アデニンに結合されている場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに結合されたペントース単位を含有する（２－デオキシリボースと異なる）。

【0104】

ＡＳＯ化学の注釈は、以下の通りである。β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドは、ＯｘｙＢにより示され、ここで、Ｂは、ヌクレオチド塩基、例えば、チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５－メチルシトシン（ＭＣ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）を示し、従って、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドとしては、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴ、ＯｘｙＭＣ、ＯｘｙＣ、及びＯｘｙＧが挙げられる。ＤＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡｂにより示され、ここで、小文字のｂは、ヌクレオチド塩基、例えば、チミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５－メチルシトシン（Ｍｃ）、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ）を示し、従って、ＤＮＡヌクレオチドとしては、ＤＮＡａ、ＤＮＡｔ、ＤＮＡ、及びＤＮＡｇが挙げられる。Ｃまたはｃの前の文字Ｍは、５－メチルシトシンを示す。文字「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。

【0105】

本明細書で使用する場合、用語「ＡＳＯ番号」または「ＡＳＯ Ｎｏ．」は、詳細な化学構造の構成要素、例えば、ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）、ヌクレオシド類似体（例えば、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ）、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＭＣ）、及び主鎖構造（例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル）を有するヌクレオチド配列に付与される固有の番号を指す。例えば、ＡＳＯ－０００４は、ＴｂｓＣｂｓＡｂｓｄＧｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＴｓ（５ＭｄＣ）ｓ（５ＭｄＣ）ｓｄＡｓｄＡｓ（５ＭｄＣ）ｓＴｂｓＡｂｓＣｂを指し得、ここで、ＮｂはＬＮＡを意味し、ｄＮはＤＮＡを意味し、５ＭｄＣは ５－メチル－ｄＣを意味し、ＮｍはＭＯＥを意味し、ｓはホスホロチオエートを意味する。

【0106】

「効力」は、特に明記しない限り、通常、μＭ、ｎＭ、またはｐＭでのＩＣ_５０またはＥＣ_５０値として表現される。効力は、パーセント阻害によっても表現され得る。ＩＣ_５０は、治療用分子の半数阻害濃度である。ＥＣ_５０は、ビヒクルまたは対照（例えば、生理食塩水）と比較した治療用分子の半数有効濃度である。機能アッセイにおいて、ＩＣ_５０は、治療用分子の濃度であって、生物学的反応、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現を、当該治療用分子で達成される当該生物学的反応の５０％まで低減する、当該濃度である。機能アッセイにおいて、ＥＣ_５０は、５０％の生物学的反応、例えば、ｍＲＮＡ転写またはタンパク質発現をもたらす治療用分子の濃度である。ＩＣ_５０またはＥＣ_５０は、当該技術分野において公知の任意の数の手段により計算され得る。

【0107】

本明細書で使用する場合、例えば、ＫＲＡＳ遺伝子転写物及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を「阻害する」という用語は、細胞または組織における当該ＫＲＡＳ遺伝子転写物及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減するＡＳＯを指す。幾つかの態様では、用語「阻害する」は、ＫＲＡＳ遺伝子転写物またはＫＲＡＳタンパク質の完全な阻害（１００％の阻害または検出不可能なレベル）を指す。他の態様では、用語「阻害する」は、細胞または組織におけるＫＲＡＳ遺伝子転写物及び／またはＫＲＡＳタンパク質発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害を指す。

【0108】

本明細書で使用する場合、用語「細胞外小胞」または「ＥＶ」は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞には、それらが由来する細胞より小さい直径を有する全ての膜結合型小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）が含まれる。幾つかの態様では、細胞外小胞は、直径が２０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内の様々な高分子ペイロード、細胞外小胞の外部表面に提示された様々な高分子ペイロード、及び／または膜を貫通する様々な高分子ペイロードのいずれかを含み得る。幾つかの態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。ある種の態様では、細胞外小胞は、足場部分を含む。一例として、かつ限定されるものではないが、細胞外小胞としては、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的操作による（例えば、連続押出しまたはアルカリ性溶液での処理による）細胞由来の小胞、小胞化されたオルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接的な形質膜出芽または後期エンドソームの形質膜との融合による）が挙げられる。細胞外小胞は、生きているか、もしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、原核細胞または真核細胞、及び／または培養細胞に由来し得る。幾つかの態様では、細胞外小胞は、１種以上の導入遺伝子産物を発現する細胞により産生される。

【0109】

本明細書で使用する場合、用語「エキソソーム」は、２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞を指す。エキソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含み、幾つかの態様では、直接的な形質膜出芽により、または後期エンドソームの形質膜との融合により細胞（例えば、産生細胞）から生成され得る。ある種の態様では、エキソソームは、足場部分を含む。下記のように、エキソソームは、産生細胞に由来し得、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。幾つかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、１種以上の導入遺伝子産物を発現する細胞により産生される。

【0110】

本明細書で使用する場合、用語「ナノ小胞」は、２０～２５０ｎｍ（例えば、３０～１５０ｎｍ）の直径を有する細胞外小胞を指し、ナノ小胞が操作なしに細胞により生成されないように、直接的または間接的操作により細胞（例えば産生細胞）から生成される。ナノ小胞を生成するための細胞の適切な操作としては、限定されるものではないが、連続押出し、アルカリ性溶液での処理、音波処理、またはそれらの組み合わせが挙げられる。幾つかの態様では、ナノ小胞の産生は、産生細胞の破壊をもたらし得る。幾つかの態様では、本明細書に記載されるナノ小胞の集団は、形質膜からの直接的な出芽または後期エンドソームの形質膜との融合による細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ある種の態様では、ナノ小胞は、足場部分を含む。ナノ小胞は、産生細胞から生じると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。

【0111】

本明細書で使用する場合、用語「表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム」（例えば、足場Ｘにより操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム）は、操作されたＥＶ、例えば、エキソソームの表面が、改変前のＥＶ、例えば、エキソソームの、または天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームの表面と異なるように、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜または表面の組成が改変された当該ＥＶ、例えば、エキソソームを指す。操作は、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面が改変されるように、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面におけるもの、またはＥＶ、例えば、エキソソームの膜におけるものであり得る。例えば、膜が、そのタンパク質組成、脂質組成、低分子組成、炭水化物組成などにおいて改変される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法により改変され得るか、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前にもしくは同時に改変された細胞から産生されることにより改変され得る。具体的には、組成は、遺伝子操作により、または遺伝子操作により事前に改変された細胞から産生されることにより改変され得る。幾つかの態様では、表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出され得るか、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出される部分の係留（結合）点であり得る、外来性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エキソソームが天然に発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の態様では、表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出され得るか、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出される部分の係留（結合）点であり得る、より高発現（例えば、より多数）の天然エキソソームタンパク質（例えば、足場Ｘ）またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0112】

本明細書で使用する場合、用語「内腔が操作されたエキソソーム」（例えば、足場Ｙにより操作されたエキソソーム）は、操作されたＥＶ、例えば、エキソソームの内腔が、改変前のＥＶ、例えば、エキソソームの、または天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームの内腔と異なるように、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜または内腔の組成が改変された当該ＥＶ、例えば、エキソソームを指す。操作は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔が改変されるように、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔または膜における直接的なものであり得る。例えば、膜が、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔が改変されるように、そのタンパク質組成、脂質組成、低分子組成、炭水化物組成などにおいて改変される。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法により、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により事前に改変された細胞から産生されることにより改変され得る。具体的には、組成は、遺伝子操作により、または遺伝子操作により事前に改変された細胞から産生されることにより改変され得る。幾つかの態様では、内腔が操作されたエキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔に露出され得るか、またはＥＶ、例えば、エキソソームの内層に露出される部分の係留（結合）点であり得る、外来性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エキソソームが天然に発現しないタンパク質）またはその断片もしくはバリアントを含む。他の態様では、内腔が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、エキソソームの内腔に露出され得るか、またはエキソソームの内腔に露出される部分の係留（結合）点であり得る、より高発現の天然エキソソームタンパク質（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）またはその断片もしくはバリアントを含む。

【0113】

用語「改変された」は、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソームの文脈において使用される場合、改変されたＥＶ、例えば、エキソソームが天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームと異なるように、ＥＶ、例えば、エキソソーム及び／またはその産生細胞を改変または操作することを指す。幾つかの態様では、本明細書に記載される改変されたＥＶ、例えば、エキソソームは、天然に存在するＥＶ、例えば、エキソソームの膜と比較してタンパク質組成、脂質組成、低分子組成、炭水化物組成などが異なる膜を含む（例えば、膜は、より高密度またはより多数の天然エキソソームタンパク質を含み、及び／または膜は、エキソソームにおいて天然に見出されないタンパク質（例えば、ＡＳＯ）を含む）。ある種の態様では、膜のかかる改変は、ＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、本明細書に記載される表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム）の外部表面を変化させる。ある種の態様では、膜のかかる改変は、ＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、本明細書に記載される内腔が操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム）の内腔を変化させる。

【0114】

本明細書で使用する場合、用語「足場部分」は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面または外部表面のいずれかで関心対象のペイロードまたは任意の他の化合物（例えば、本明細書において開示されるＡＳＯ）をＥＶ、例えば、エキソソームに係留するために使用され得る分子を指す。ある種の態様では、足場部分は、合成分子を含む。幾つかの態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、足場部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームにおいて天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。幾つかの態様では、足場部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームにおいて天然に存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。ある種の態様では、足場部分は、足場Ｘである。幾つかの態様では、足場部分は、足場Ｙである。更なる態様では、足場部分は、足場Ｘ及び足場Ｙの両方を含む。本開示と共に使用され得る他の足場部分の非限定的な例としては、以下が挙げられる：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、別名：膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン（ＭＦＧＥ８）、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ。

【0115】

本明細書で使用する場合、用語「足場Ｘ」は、近年、エキソソームの表面に同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９５，２９０号を参照のこと。足場Ｘタンパク質の非限定的な例としては、以下が挙げられる：プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；ベイシジン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンβ１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンα４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；ＡＴＰ輸送タンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）；及びそれらの機能断片。幾つかの態様では、足場Ｘタンパク質は、タンパク質全体またはその断片（例えば、機能断片、例えば、別の部分をＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面または内腔表面に係留することができる最小断片）であり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、部分（例えば、ＡＳＯ）をエキソソームの外部表面または内腔表面に係留することができる。

【0116】

本明細書で使用する場合、用語「足場Ｙ」は、エキソソームの内腔に新たに同定されたエキソソームタンパク質を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開ＷＯ／２０１９／０９９９４２を参照のこと。足場Ｙタンパク質の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）；ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）；及び脳酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、タンパク質全体またはその断片（例えば、機能断片、例えば、部分をエキソソームの内腔表面に係留することができる最小断片）であり得る。幾つかの態様では、足場Ｙは、部分またはペイロード（例えば、ＡＳＯ）をＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に係留することができる。幾つかの態様では、足場Ｙは、部分またはペイロード（例えば、ＡＳＯ）をＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に係留することができる。

【0117】

本明細書で使用する場合、タンパク質（例えば、治療タンパク質、足場Ｘ、または足場Ｙ）の「断片」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列であって、天然に存在する配列より短いか、Ｎ末端及び／またはＣ末端が欠失しているか、または天然に存在するタンパク質と比較して当該タンパク質の任意の部分が欠失している、当該タンパク質のアミノ酸配列を指す。本明細書で使用する場合、用語「機能断片」は、タンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。従って、幾つかの態様では、足場Ｘタンパク質の機能断片は、部分をＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面または外部表面に係留する能力を保持する。同様に、ある種の態様では、足場Ｙタンパク質の機能断片は、部分をＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面または外部表面に係留する能力を保持する。断片が機能断片であるかどうかは、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び当該断片の例えば、ＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との融合が含まれる、ＥＶ、例えば、エキソソームのタンパク質含有量を決定するための、技術分野において公知の任意の方法により評価され得る。ある種の態様では、足場Ｘタンパク質の機能断片は、天然に存在する足場Ｘタンパク質の能力、例えば、部分を係留する能力のうちの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質の機能断片は、天然に存在する足場Ｙタンパク質の能力、例えば、別の分子を係留する能力のうちの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％を保持する。

【0118】

本明細書で使用する場合、分子（例えば、機能分子、抗原、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）の「バリアント」という用語は、当該技術分野における公知の方法による比較時に、別の分子とある程度の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト、または再構成を含み得る。

【0119】

幾つかの態様では、足場Ｘのバリアントは、全長の成熟したＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰ輸送タンパク質、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、もしくはＡＴＰ輸送タンパク質の断片（例えば、機能断片）に対する少なくとも約７０％の同一性を有するバリアントを含む。幾つかの態様では、ＰＴＧＦＲＮのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０１に記載のＰＴＧＦＲＮとの、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＢＳＧのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０３に記載のＢＳＧとの、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０８に記載のＩＧＳＦ２との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０９に記載のＩＧＳＦ３との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ８のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０４に記載のＩＧＳＦ８との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＩＴＧＢ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０５に記載のＩＴＧＢ１との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＩＴＧＡ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０６に記載のＩＴＧＡ４との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＳＬＣ３Ａ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０７に記載のＳＬＣ３Ａ２との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１０に記載のＡＴＰ１Ａ１との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１１に記載のＡＴＰ１Ａ２との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１２に記載のＡＴＰ１Ａ３との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１３に記載のＡＴＰ１Ａ４との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ｂ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１４に記載のＡＴＰ１Ｂ３との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１５に記載のＡＴＰ２Ｂ１との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１６に記載のＡＴＰ２Ｂ２との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１７に記載のＡＴＰ２Ｂ３との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１８に記載のＡＴＰ２Ｂ４との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、本明細書において開示される足場Ｘタンパク質のバリアントまたは断片のバリアントは、ＥＶ、例えば、エキソソームに特異的に標的化される能力を保持する。幾つかの態様では、足場Ｘは、１つ以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0120】

幾つかの態様では、足場Ｙのバリアントは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片に対する少なくとも７０％の同一性を有するバリアントを含む。幾つかの態様では、ＭＡＲＣＫＳのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号４０１に記載のＭＡＲＣＫＳとの、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＭＡＲＣＫＳＬ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号４０２に記載のＭＡＲＣＫＳＬ１との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、ＢＡＳＰ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号４０３に記載のＢＡＳＰ１との、またはその機能断片との少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質のバリアントまたは断片のバリアントは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に特異的に標的化される能力を保持する。幾つかの態様では、足場Ｙは、１つ以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0121】

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸と置き換えられる場合、置換は保存的とみなされる。別の態様では、アミノ酸の連続配列は、側鎖ファミリーのメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した連続配列と保存的に置き換えられ得る。

【0122】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、当該２つの配列の最適なアラインメントのために導入されなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮した、比較ウィンドウにわたる、配列により共有される完全に一致した位置の数を指す。一致した位置は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が標的及び参照配列の両方で示される任意の位置である。標的配列において示されるギャップは、ギャップがヌクレオチドまたはアミノ酸でないため、計数されない。同様に、参照配列において示されるギャップは、標的配列ヌクレオチドまたはアミノ酸が計数され、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸は計数されないため、計数されない。

【0123】

配列同一性の百分率は、同一のアミノ酸残基または核酸塩基が両方の配列において生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に１００を乗算して、配列相同性の百分率を得ることにより計算される。配列の比較及び２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用及びダウンロードの両方で容易に利用可能なソフトウェアを使用して達成され得る。タンパク質及びヌクレオチド配列のアラインメントのための好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から利用可能である。配列同一性パーセントを決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から利用可能なＢＬＡＳＴプログラム集の一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用されるが、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラム集の一部であり、またｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から利用可能である、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒである。

【0124】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列とアラインメントされている単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、それぞれ、それら自身の配列同一性パーセントを有し得る。配列同一性パーセント値は、小数第１位に丸められることに留意されたい。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられるが、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に整数であることにも留意されたい。

【0125】

当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列アライメントの作成が、もっぱら一次配列データにより駆動される２つの配列間比較に限定されないことを当業者は理解するであろう。配列アラインメントは、多重配列アラインメントにより得られ得る。多重配列アラインメントを生成するための１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇで利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から利用可能なＭＵＳＣＬＥである。代替的にＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから利用可能である。

【0126】

配列アライメントは、配列データを異種の供給源由来のデータ、例えば、構造データ（例えば、タンパク質結晶構造）、機能データ（例えば、変異の位置）、または系統学的データと統合することにより生成され得ることも理解されよう。異種のデータを統合して多重配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで利用可能であり、代替的に例えば、ＥＢＩから利用可能なＴ－Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動または手動のいずれかで管理され得ることも理解されよう。

【0127】

ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、または両方における変化を含有し得る。一態様では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない変化を含有する。別の態様では、ヌクレオチドバリアントは、遺伝コードの縮重に起因するサイレント置換により生成される。他の態様では、５～１０アミノ酸、１～５アミノ酸、または１～２アミノ酸が、任意の組み合わせで置換されているか、欠失しているか、または付加されているバリアント。ポリヌクレオチドバリアントは、種々の理由のために、例えば、特定の宿主での発現のためにコドンを最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを他における、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主におけるコドンに変更する）ために生成され得る。

【0128】

天然に存在するバリアントは、「アレルバリアント」と称され、生物の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの代替型のうちの１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドレベルで異なり得、本開示に含まれる。あるいは、非天然バリアントが、変異誘発技術により、または直接合成により生成され得る。

【0129】

ポリペプチドの特性を改善するか、または変化させるために、タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、バリアントが生成され得る。例えば、生物学的機能を実質的に喪失することなく、１つ以上のアミノ酸が分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から除去され得る。Ｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により、アミノ末端の３、８、または２７アミノ酸残基を除去した後でさえヘパリン結合活性を有するバリアントＫＧＦタンパク質が報告された。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０アミノ酸残基を除去した後に、最高１０倍高い活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0130】

更に、バリアントが、多くの場合、天然に存在するタンパク質の生物活性と同様の生物活性を保持することを十分な証拠が実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１（１９９３）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの大規模な変異解析を実施した。彼らはランダム変異誘発を使用して、バリアント当たり平均２．５アミノ酸のこの分子の全長にわたる変化を有する３，５００種を超える別個のＩＬ－１ａ変異体を作製した。複数の変異が、可能な全てのアミノ酸位で調査された。研究者は、「ほとんどの分子が［結合活性または生物活性］のいずれかにほとんど影響を及ぼさずに改変され得る」ことを発見した。（要約を参照のこと）。実際、調査された３，５００種を超えるヌクレオチド配列のうちの２３種の固有のアミノ酸配列のみが、活性が野生型と顕著に異なるタンパク質をもたらした。

【0131】

上記のように、ポリペプチドバリアントは、例えば、修飾されたポリペプチドを含む。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１６：２７０－７９（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、転移ＲＮＡにより媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、例えば、アルギニル化及びユビキチン化が挙げられる。幾つかの態様では、足場Ｘ及び／または足場Ｙは、任意の都合のよい位置で修飾される。

【0132】

本明細書で使用する場合、用語「連結された」または「コンジュゲートされた」は、互換的に使用され、第１の部分と第２の部分、例えば、それぞれ足場ＸとＡＳＯ、例えば、それぞれ、細胞外小胞内で、または細胞外小胞上に発現している足場部分、例えば、細胞外小胞の内腔表面または外部表面の足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）とＡＳＯとの間で形成される共有結合または非共有結合を指す。

【0133】

用語「カプセル化された」またはこの用語の異なる文法形式（例えば、カプセル化またはカプセル化すること）は、２つの部分を化学的または物理的に連結することなく、第１の部分（例えば、ＡＳＯ）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）の内部に有する状態またはプロセスを指す。幾つかの態様では、用語「カプセル化された」は、「の内腔に」と互換的に使用され得る。第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソーム）への第１の部分（例えば、ＡＳＯ）のカプセル化の非限定的な例は、本明細書の他箇所で開示される。

【0134】

本明細書で使用する場合、用語「産生細胞」は、ＥＶ、例えば、エキソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、インビトロの培養細胞またはインビボの細胞であり得る。産生細胞としては、限定されるものではないが、ＥＶ、例えば、エキソソームを生成するのに効果的であることが公知の細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられる。ある種の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞でない。幾つかの態様では、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、マクロファージ、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。幾つかの態様では、本開示において有用なＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面に露出したＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子上の抗原を保有しないが、その代わりに、足場Ｘ及び／または足場Ｙへの結合により、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔に、またはＥＶ、例えば、エキソソームの表面上に抗原を保有し得る。

【0135】

本明細書で使用する場合、用語「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに「抽出された」及び「抽出すること」は、互換的に使用され、１つ以上の精製プロセス、例えば、所望のＥＶ調製物の選別または濃縮を受けた所望のＥＶの調製の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）を指す。幾つかの態様では、本明細書で使用する場合、単離または精製は、産生細胞を含有する試料からＥＶを取り出す、（例えば、画分を）部分的に取り出すプロセスである。幾つかの態様では、単離されたＥＶ組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さないか、または代替的に、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルまたは量以下である。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、許容可能な量及び／または濃度以上の量及び／または濃度の所望のＥＶを有する。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が取得される出発物質（例えば、産生細胞調製物）と比較して濃縮される。この濃縮は、出発物質と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。幾つかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、残留する生物学的産物を実質的に含まない。幾つかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、任意の混入している生物学的物質を１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％含まない。残留する生物学的産物としては、非生物的物質（化学物質が挙げられる）、または望ましくない核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物が挙げられ得る。残留する生物学的産物を実質的に含まないことは、ＥＶ組成物が、検出可能な産生細胞を含有せず、ＥＶのみが検出可能であることを意味し得る。

【0136】

本明細書で使用する場合、用語「ペイロード」は、ＥＶと接触している標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤を指す。ＥＶ、例えば、エキソソームに含まれ得るペイロードの非限定的な例はＡＳＯである。ＥＶ、例えば、エキソソーム及び／または産生細胞に導入され得るペイロードとしては、薬剤、例えば、ヌクレオチド（例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むか、または転写を阻害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素などのポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、または調節機能を有するＲＮＡ分子、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ）、アミノ酸（例えば、検出可能部分もしくは毒素を含むか、または翻訳を阻害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、及び低分子（例えば、低分子薬物及び毒素）が挙げられる。ある種の態様では、ペイロードは、ＡＳＯを含む。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、天然であるか、または一部もしくは全体が合成により生成されたかどうかにかかわらず、免疫グロブリン及びその断片を包含する。この用語は、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も包含する。「抗体」としては、抗原を特異的に結合及び認識する、免疫グロブリン遺伝子またはその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドも更に挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、対象に導入される場合に、それ自身に対する免疫反応（細胞性または体液性）を誘発する任意の作用物質を指す。抗体という用語の使用は、全長抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組換え抗体、それらの断片を含み、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス／ヒト、マウス／霊長類、霊長類／ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ１）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、ならびにＦｄ断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドを更に含むことを意図する。抗体としては、所望の生物活性を示すか、または機能する限り、二重特異性抗体及び多特異性抗体が挙げられる。

【0137】

用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書において互換的に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される組成物及び方法は、ヒト治療及び獣医学的用途の両方に適用可能である。幾つかの態様では、対象は哺乳動物であり、他の態様では、対象はヒトである。本明細書で使用する場合、「哺乳動物対象」としては、限定されるものではないが、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる、全ての哺乳動物が挙げられる。

【0138】

用語「医薬組成物」は、活性成分の生物活性が有効となるのを可能にする形態であり、組成物が投与される対象に対して許容できないほど有毒である追加の成分を含有しない調製物を指す。かかる組成物は無菌であり得る。

【0139】

本明細書で使用する場合、用語「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」は、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）％濃度で、１０％未満の高分子を含むことを意味する。幾つかの画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％（ｍ／ｖ）未満の高分子を含み得る。

【0140】

本明細書で使用する場合、用語「高分子」は、核酸、夾雑タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。

【0141】

本明細書で使用する場合、用語「従来のエキソソームタンパク質」は、限定されるものではないが、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン（ＭＦＧＥ８）、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、それらの断片、またはそれらに結合するペプチドが含まれる、エキソソームにおいて豊富であることが既に公知のタンパク質を意味する。

【0142】

本明細書で使用する場合、「投与すること」は、本明細書において開示されるＥＶ、例えば、エキソソームを含む組成物を薬学的に許容される経路により対象に投与することを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射及び静脈内注入であり得る。追加の投与経路としては、例えば、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与、及び肺投与が挙げられる。ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与され得る。

【0143】

例えば、本明細書において開示されるＡＳＯまたは細胞外小胞の「有効量」は、具体的に記載される目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、及び記載される目的に関して定型的な方法で決定され得る。

【0144】

本明細書で使用する場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」は、例えば、疾患または状態の重症度の低減；疾患経過の期間の低減；疾患または状態に関連する１つ以上の症状の改善または除去；疾患または状態を必ずしも治療しない、当該疾患または状態を有する対象に対する有益な効果の提供を指す。この用語は、疾患もしくは状態またはそれらの症状の予防または防止も含む。一態様では、「処置する」または「処置」は、造血を誘発する必要がある対象における造血を誘発することを含む。幾つかの態様では、疾患または状態は、造血または造血不全に関連する。ある種の態様では、疾患または状態は、がんである。幾つかの態様では、処置は、がんを有する対象における造血を増強し、ここで、造血の増強は、当該対象における１種以上の免疫細胞の増殖及び／または分化の増加を含む。

【0145】

本明細書で使用する場合、「予防する」または「予防」は、特定の結果の発生または重症度を減少させるか、または低減することを指す。幾つかの態様では、結果を予防することは、予防処置により達成される。幾つかの態様では、本明細書に記載されるＡＳＯを含むＥＶ、例えば、エキソソームが対象に予防投与される。幾つかの態様では、対象は、がんを発症するリスクがある。幾つかの態様では、対象は、造血障害を発症するリスクがある。

【0146】

ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
本開示は、哺乳動物ＫＲＡＳをコードする核酸分子、例えば、ＫＲＡＳ核酸、例えば、ＫＲＡＳプレｍＲＮＡ及びＫＲＡＳ ｍＲＮＡが含まれるＫＲＡＳ転写物、または哺乳動物ＫＲＡＳをコードするかかる核酸分子の天然に存在するバリアントの機能を調節するのに使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いる。本開示の文脈において、用語「ＡＳＯ」は、２つ以上のヌクレオチドの共有結合により形成された分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。

【0147】

本開示のＡＳＯは、約１０～約３０、例えば、１０～２０、１４～２０、１６～２０、または１５～２５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある種の態様では、ＡＳＯは、２０ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１８ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１９ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１７ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１６ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１５ヌクレオチド長である。ＡＳＯの長さに関する更なる開示は、本開示の他箇所で提供される（例えば、セクションＩＩ．Ｃ「ＡＳＯの長さ」を参照のこと）。本明細書で使用する場合、用語「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、及び「オリゴマー」は、用語「ＡＳＯ」と互換的である。本開示に有用なＡＳＯは、天然に存在せず、自然界には見出されない。幾つかの態様では、ＡＳＯは、化学修飾される。

【0148】

配列番号への言及は、特定の核酸塩基配列を含むが、なんらの設計または化学構造全体を含まない。更に、本明細書において開示されるＡＳＯに関連する、示されるいずれの設計も、特に明記しない限り、限定することを意図しない。例えば、請求項（または本明細書）が、配列番号４を参照する場合、それは、ｔｃａｇｃｔｃｃａａｃｔａｃのヌクレオチド配列のみを含む。本明細書において開示される任意のＡＳＯの設計は、例えば、５’末端から１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、及び１４番目のヌクレオチドの各々が修飾されたヌクレオチド、例えば、ＬＮＡであり、他のヌクレオチドの各々が未修飾のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である、配列番号４と書かれ得る。

【0149】

各種の態様では、本開示のＡＳＯは、ＲＮＡ（単位）を含まない。幾つかの態様では、ＡＳＯは、１つ以上のＤＮＡ単位を含む。一態様では、本開示によるＡＳＯは、直鎖状分子であるか、または直鎖状分子として合成される。幾つかの態様では、ＡＳＯは、一本鎖分子であり、例えば、同じＡＳＯ内の対応する領域に相補的な少なくとも３、４、または５連続ヌクレオチドの短い領域（すなわち、二重鎖）を含まず、この点に関して、ＡＳＯは（基本的に）二本鎖ではない。幾つかの態様では、ＡＳＯは、基本的に二本鎖ではない。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡではない。各種の態様では、本開示のＡＳＯは、完全に連続ヌクレオチド領域からなり得る。従って、幾つかの態様では、ＡＳＯは、実質的に自己相補的ではない。

【0150】

他の態様では、本開示は、ＡＳＯの断片を含む。例えば、本開示は、本明細書において開示されるＡＳＯの少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも２つの連続ヌクレオチド、少なくとも３つの連続ヌクレオチド、少なくとも４つの連続ヌクレオチド、少なくとも５つの連続ヌクレオチド、少なくとも６つの連続ヌクレオチド、少なくとも７つの連続ヌクレオチド、少なくとも８つの連続ヌクレオチド、または少なくとも９つの連続ヌクレオチドを含む。本明細書において開示される配列のいずれかの断片は、本開示の一部であると意図される。

【0151】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯとしては、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）またはペプチドがコンジュゲートされたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）が挙げられる。

【0152】

ＩＩ．Ａ．標的
好適には、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を下方調節（例えば、低減または阻害）することができる。この点に関して、本開示のＡＳＯは、典型的には、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、腫瘍細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルの低減によって、ＫＲＡＳタンパク質の間接的な阻害に影響を及ぼし得る。幾つかの態様では、本開示は、ＫＲＡＳプレｍＲＮＡの１つ以上の領域（例えば、イントロン領域、エキソン領域、及び／またはエキソン－イントロンジャンクション領域）を標的とするＡＳＯを対象とする。更なる態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの領域を標的とし得る。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合、用語「ＫＲＡＳ」は、１つ以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）由来のＫＲＡＳを指し得る。また特に明記しない限り、用語「ＫＲＡＳ」は、野生型または（例えば、Ｇ１２Ｄアミノ酸置換を含む）そのバリアント型を指し得る。従って、ある種の態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、細胞（例えば、膵臓癌細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（またはそのコードされるタンパク質）の発現を下方調節することができる。幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、細胞（例えば、膵臓癌細胞）における（例えば、Ｇ１２Ｄ変異を含む）バリアントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（またはそのコードされるタンパク質）の発現を下方調節することができる。幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、細胞（例えば、膵臓癌細胞）における野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び（例えば、Ｇ１２Ｄ変異を含む）バリアントＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（またはそれらのコードされるタンパク質）の両方の発現を下方調節することができる。

【0153】

いずれの理論にも拘束されるものではないが、幾つかの態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現（またはそのコードタンパク質）の下方調節は、細胞生存率、細胞増殖、または両方の減少をもたらす。従って、幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を発現する細胞の生存率、増殖、または両方を減少させることができる。幾つかの態様では、細胞は、異常なＫＲＡＳ活性を発現するか、またはＫＲＡＳ転写物バリアント、例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを含む。幾つかの態様では、細胞の生存率、増殖、または両方は、ＡＳＯで処理されなかった対応する細胞の生存率、増殖、または両方と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。

【0154】

カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）は、ＮＲＡＳ及びＨＲＡＳも含むグアノシン－５－トリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）タンパク質のスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーの主要な役割は、上流の細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、及びＥＲＢＢ２～４）からのシグナルを、下流の増殖及び生存経路、例えば、ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ、及びＲＡＬＧＤＳ－ＲＡに伝達することである。Ａｄｄｅｒｌｅｙ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ４１：７１１－７１６（２０１９）。ｋＲＡＳ変異は、膵臓癌のうちの９０％超、結腸直腸癌のうちの３５～４５％、及び肺癌のうちの約２５％が含まれる、多数の種類のがんに関係付けられている。Ｚｅｉｔｏｕｎｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒｓ ８（４）：４５（２０１６）；Ｔａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ １８（３７）：５１７１－５１８０（２０１２）；及びＲｏｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ １７：３３（２０１８）。ｋＲＡＳ変異は、極めて不良な予後（例えば、膵臓癌における約９％の５年生存率）にも関連し、ＫＲＡＳ変異を有する多数の患者が様々ながん治療に対し抵抗性を示す。Ｄｅｌ Ｒｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ９（５）：６６３０－６６４３（２０１７）。従って、ＫＲＡＳ変異に関連するがんの新規な、かつ改善された処置選択肢が必要である。本明細書に記載されるように、本開示は、異常なＫＲＡＳ活性に関連するがんを処置するために使用され得るＡＳＯ及びかかるＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）を提供する。

【0155】

ＫＲＡＳは、当技術分野において様々な名称で知られている。かかる名称としては、以下が挙げられる：ＫＲＡＳがん原遺伝子、ＧＴＰアーゼ；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２カーステンラット肉腫２ウイルスがん遺伝子ホモログ；ＧＴＰアーゼＫＲａｓ；Ｃ－Ｋｉ－Ｒａｓ；Ｋ－Ｒａｓ２；ＫＲＡＳ２；ＲＡＳＫ２；Ｖ－Ｋｉ－Ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ；カーステンラット肉腫ウイルスがん原遺伝子；細胞形質転換がん原遺伝子；細胞のＣ－Ｋｉ－Ｒａｓ２がん原遺伝子；形質転換タンパク質Ｐ２１；ＰＲ３１０ Ｃ－Ｋ－Ｒａｓがん遺伝子；Ｃ－カーステン－Ｒａｓタンパク質；Ｋ－Ｒａｓ Ｐ２１タンパク質；及びがん遺伝子ＫＲＡＳ２。

【0156】

ヒトＫＲＡＳ遺伝子の配列は、染色体位置１２ｐ１２．１で、及び公開されているＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１２（２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６）の下で見つけることができる。ヒト野生型ＫＲＡＳ転写物のゲノム配列は、ＮＣ＿００００１２の残基２５，２０４，７８９～２５，２５０，９３６の逆相補体に相当する（配列番号８７）。配列番号１に提供されるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄゲノム配列は、ヌクレオチド位置５，５８７でのグアニンからアデニンへの置換を有するという点で配列番号８７と異なる。例示的なＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ配列は、配列番号３におけるヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡにおいて「ｕ」として示されることを除き、配列番号３に提供される。配列番号３に提供されるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡは、ヌクレオチド位置２２５でグアニンからアデニンへの置換を有するという点で野生型ｍＲＮＡ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４９８５．５；配列番号８９）と異なる。ヒトＫＲＡＳタンパク質について配列は、公開されているアクセッション番号：Ｐ０１１１６（標準配列）、Ａ８Ｋ８Ｚ５、Ｂ０ＬＰＦ９、Ｐ０１１１８、及びＱ９６Ｄ１０下で見つけることができ、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0157】

選択的スプライシングにより生じる、ヒト野生型ＫＲＡＳタンパク質（Ｐ０１１１６）の２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム２Ａ（アクセッション番号：Ｐ０１１１６－１；配列番号：９０）が標準配列である。これはＫ－Ｒａｓ４Ａとしても公知である。アイソフォーム２Ｂ（アクセッション番号：Ｐ０１１１６－２；Ｋ－Ｒａｓ４Ｂとしても公知；配列番号８８）は、以下のように標準配列と異なる：（ｉ）１５１－１５３：ＲＶＥ→ＧＶＤ；及び（ｉｉ）１６５－１８９：ＱＹＲＬＫＫＩＳＫＥＥＫＴＰＧＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ→ＫＨＫＥＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ。幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質アイソフォーム２Ａ、アイソフォーム２Ｂ、または両方の発現を低減または阻害し得る。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【0158】

ヒトＫＲＡＳ遺伝子産物の天然のバリアントは、公知である。例えば、ヒトＫＲＡＳタンパク質の天然のバリアントは、以下から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含有し得る：Ｋ５Ｅ、Ｋ５Ｎ、Ｇ１０ＧＧ、Ｇ１０Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｉ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｅ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｖ、Ｖ１４Ｉ、Ｌ１９Ｆ、Ｔ２０Ｍ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ２２Ｈ、Ｑ２２Ｋ、Ｑ２２Ｒ、Ｑ２５Ｈ、Ｎ２６Ｙ、Ｆ２８Ｌ、Ｅ３１Ｋ、Ｄ３３Ｅ、Ｐ３４Ｌ、Ｐ３４Ｑ、Ｐ３４Ｒ、Ｉ３６Ｍ、Ｒ４１Ｋ、Ｄ５７Ｎ、Ｔ５８Ｉ、Ａ５９Ｔ、Ｇ６０Ｄ、Ｇ６０Ｒ、Ｇ６０Ｓ、Ｇ６０Ｖ、Ｑ６１Ａ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｒ、Ｅ６３Ｋ、Ｓ６５Ｎ、Ｒ６８Ｓ、Ｙ７１Ｈ、Ｔ７４Ａ、Ｌ７９Ｉ、Ｒ９７Ｉ、Ｑ９９Ｅ、Ｍ１１１Ｌ、Ｋ１１７Ｎ、Ｋ１１７Ｒ、Ｄ１１９Ｇ、Ｓ１２２Ｆ、Ｔ１４４Ｐ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｖ、Ｋ１４７Ｅ、Ｋ１４７Ｔ、Ｒ１４９Ｋ、Ｌ１５９Ｓ、Ｉ１６３Ｓ、Ｒ１６４Ｑ、Ｉ１８３Ｎ、Ｉ８４Ｍ、またはそれらの組み合わせ。ＫＲＡＳタンパク質アイソフォーム２Ｂに特異的な天然のバリアントは、Ｖ１５２Ｇ、Ｄ１５３Ｖ、Ｆ１５６Ｉ、Ｆ１５６Ｌ、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含有する。本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質のバリアント（例えば、当該技術分野において公知の任意のバリアント及び／または本明細書に記載されるもの）のうちの１つ以上の発現を低減または阻害するように設計され得る。本明細書において実証されるように、幾つかの態様では、本明細書に記載されるＡＳＯは、野生型ＫＲＡＳタンパク質の発現を低減または阻害することができる。幾つかの態様では、変異型ＫＲＡＳは、Ｇ１２Ｄのアミノ酸置換を有する。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、１つ以上の変異型ＫＲＡＳを標的とする。他の態様では、ＡＳＯが標的とする変異型ＫＲＡＳは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ（配列番号２）である。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、Ｇ１２Ｃアミノ酸置換を有する変異型ＫＲＡＳを標的とし得る。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、Ｇ１２Ｖアミノ酸置換を有する変異型ＫＲＡＳを標的とし得る。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、Ｇ１３Ｄ変異体を有する変異型ＫＲＡＳを標的とし得る。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異体が本開示の様々な態様を記載するために使用されるが、本明細書において提供される本開示が、他の変異型ＫＲＡＳ（例えば、上記のもの）に同様に適用され得ることが、当業者にとって明らかである。

【0159】

本明細書で使用する場合、用語「変異型ＫＲＡＳ」及び「ＫＲＡＳバリアント」は、互換的に使用され得、野生型ＫＲＡＳ転写物及び／またはタンパク質（例えば、配列番号８７～９０）と配列が異なるＫＲＡＳを指す。例えば、変異型ＫＲＡＳは、上記の置換のいずれかを含む。従って、用語「変異型ＫＲＡＳ転写物」は、野生型ＫＲＡＳ転写物と比較して１つ以上の変異を含むＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を指す。同様に、用語「変異型ＫＲＡＳタンパク質」は、野生型ＫＲＡＳタンパク質と比較して１つ以上の変異（例えば、上記のもの）を含むＫＲＡＳタンパク質を指す。本明細書で使用する場合、ＡＳＯが「変異型ＫＲＡＳ転写物の核酸配列の領域に相補的」である場合、当該領域は、当該変異型ＫＲＡＳ転写物の特異的な変異／バリアント（例えば、上記のもの）を含む。従って、本明細書において開示されるＡＳＯは、野生型ＫＲＡＳ転写物を特異的に標的とするように設計されなかった。

【0160】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯの標的核酸配列は、ＫＲＡＳプレｍＲＮＡの１つ以上の領域を含む。例えば、（上記の）配列番号１は、配列番号１におけるヌクレオチド「ｔ」が、プレｍＲＮＡにおいて「ｕ」として示されることを除き、ＫＲＡＳ Ｇ１２ＤプレｍＲＮＡ配列と同一である。本明細書で使用する場合、用語「標的核酸配列」は、本明細書において開示されるＡＳＯに相補的な核酸配列を指す。ある種の態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸またはその天然に存在するバリアント、及びそれらに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡのエキソン領域を含む。幾つかの態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸またはその天然に存在するバリアント、及びそれらに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡのイントロンを含む。更なる態様では、標的核酸配列は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸またはその天然に存在するバリアント、及びそれらに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡのエキソン－イントロンジャンクションを含む。幾つかの態様では、例えば、研究または診断において使用される場合、標的核酸は、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的から得られたｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。幾つかの態様では、標的核酸は、ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸またはその天然に存在するバリアントの非翻訳領域、例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または両方を含む。

【0161】

従って、幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１のエキソン領域にハイブリダイズする。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１のイントロン領域にハイブリダイズする。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１のエキソン－イントロンジャンクションにハイブリダイズする。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１の範囲内の領域（例えば、イントロン、エキソン、またはエキソン－イントロンジャンクション）にハイブリダイズし、ここで、当該ＡＳＯは、本明細書における他箇所（例えば、セクションＩＩ．Ｇ）に記載される設計を有する。

【0162】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯの標的核酸配列は、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号３）である。従って、ある種の態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの１つ以上の領域にハイブリダイズし得る。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳタンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム２Ａまたはアイソフォーム２Ｂ）をコードするｍＲＮＡを標的とする。ある種の態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、任意のバリアントが含まれるＫＲＡＳタンパク質の全てのアイソフォーム（例えば、本明細書に記載されるもの）を標的とし得る。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯにより標的とされ得るＫＲＡＳタンパク質は、Ｇ１２Ｄアミノ酸置換を含む。

【0163】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１または配列番号３の範囲内の核酸配列に相補的な連続ヌクレオチド配列（例えば、１０～３０ヌクレオチド長）を含む。

【0164】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物の核酸配列または当該配列の範囲内の領域（「標的領域」）にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、当該核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド５，４６８～５，７０６に相当する。幾つかの態様では、ＡＳＯは、本明細書に記載される設計または本明細書における他箇所で示される化学構造（例えば、図１）のうちの１つを任意に有する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド５，５６８～５，６０６に相当する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド５，５１８～５，６５６に相当する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号１のヌクレオチド５，５６８～５，６０６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する。

【0165】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物の核酸配列または当該配列内の領域（「標的領域」）にハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含み、ここで、当該核酸配列は、配列番号３のヌクレオチド１０６～３４４に相当する。ある種の態様では、ＡＳＯは、本明細書に記載される設計（例えば、セクションＩＩ．Ｇ）または本明細書における他箇所で示される化学構造（例えば、図１）のうちの１つを任意に有する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０６～２４４に相当する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２５６～２９９に相当する。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０６～２４４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する。

【0166】

幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２５に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００４；配列番号４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２６に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００５；配列番号５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２７に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００６；配列番号６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２２８に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００７；配列番号７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２２９に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００８；配列番号８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３０に相当する（例えば、ＡＳＯ－０００９；配列番号９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１０；配列番号１０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１１；配列番号１１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１２；配列番号１２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１３；配列番号１３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１４；配列番号１４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１５；配列番号１５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１６；配列番号１６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２３８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１７；配列番号１７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１８；配列番号１８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００１９；配列番号１９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２０；配列番号２０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２１；配列番号２１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２２９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２２；配列番号２２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２３；配列番号２３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２４；配列番号２４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２５；配列番号２５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２６；配列番号２６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２７；配列番号２７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２８；配列番号２８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００２９；配列番号２９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３０；配列番号３０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３１；配列番号３１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２３９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３２；配列番号３２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３３；配列番号３３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３４；配列番号３４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３５；配列番号３５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３６；配列番号３６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３７；配列番号３７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３８；配列番号３８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００３９；配列番号３９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４０；配列番号４０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４１；配列番号４１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４２；配列番号４２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４３；配列番号４３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４４；配列番号４４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４５；配列番号４５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４６；配列番号４６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４７；配列番号４７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４８；配列番号４８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０９～２２５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００４９；配列番号４９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５０；配列番号５０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５１；配列番号５１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５２；配列番号５２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５３；配列番号５３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２３０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５４；配列番号５４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５５；配列番号５５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５６；配列番号５６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５７；配列番号５７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５８；配列番号５８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００５９；配列番号５９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６０；配列番号６０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６１；配列番号６１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６２；配列番号６２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６３；配列番号６３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２４０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６４；配列番号６４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６５；配列番号６５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０６～２２５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６６；配列番号６６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０７～２２６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６７；配列番号６７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０８～２２７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６８；配列番号６８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０９～２２８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００６９；配列番号６９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７０；配列番号７０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２３０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７１；配列番号７１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２３１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７２；配列番号７２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２３２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７３；配列番号７３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２３３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７４；配列番号７４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７５；配列番号７５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３５に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７６；配列番号７６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３６に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７７；配列番号７７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３７に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７８；配列番号７８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３８に相当する（例えば、ＡＳＯ－００７９；配列番号７９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３９に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８０；配列番号８０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２４０に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８１；配列番号８１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２４１に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８２；配列番号８２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２４２に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８３；配列番号８３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２４３に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８４；配列番号８４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４４に相当する（例えば、ＡＳＯ－００８５；配列番号８５）。

【0167】

幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００４；配列番号４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００５；配列番号５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００６；配列番号６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２２８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００７；配列番号７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２２９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００８；配列番号８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－０００９；配列番号９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１０；配列番号１０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１１；配列番号１１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１２；配列番号１２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１３；配列番号１３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１４；配列番号１４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１５；配列番号１５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１６；配列番号１６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２３８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１７；配列番号１７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１８；配列番号１８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００１９；配列番号１９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２０；配列番号２０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２１；配列番号２１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２２９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２２；配列番号２２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２３；配列番号２３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２４；配列番号２４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２５；配列番号２５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２６；配列番号２６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２７；配列番号２７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２８；配列番号２８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００２９；配列番号２９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３０；配列番号３０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３１；配列番号３１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２３９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３２；配列番号３２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３３；配列番号３３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３４；配列番号３４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３５；配列番号３５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３６；配列番号３６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２２９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３７；配列番号３７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３８；配列番号３８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００３９；配列番号３９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４０；配列番号４０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４１；配列番号４１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４２；配列番号４２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４３；配列番号４３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／

または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４４；配列番号４４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４５；配列番号４５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４６；配列番号４６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２３９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４７；配列番号４７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４８；配列番号４８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０９～２２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００４９；配列番号４９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５０；配列番号５０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２２７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５１；配列番号５１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２２８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５２；配列番号５２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２２９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５３；配列番号５３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２３０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５４；配列番号５４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５５；配列番号５５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５６；配列番号５６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５７；配列番号５７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５８；配列番号５８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００５９；配列番号５９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６０；配列番号６０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２３７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６１；配列番号６１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２３８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６２；配列番号６２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２３９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６３；配列番号６３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２４０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６４；配列番号６４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６５；配列番号６５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０６～２２５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６６；配列番号６６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０７～２２６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６７；配列番号６７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０８～２２７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６８；配列番号６８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２０９～２２８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００６９；配列番号６９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１０～２２９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７０；配列番号７０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１１～２３０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７１；配列番号７１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１２～２３１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７２；配列番号７２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１３～２３２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７３；配列番号７３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１４～２３３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７４；配列番号７４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１５～２３４±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７５；配列番号７５）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１６～２３５±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７６；配列番号７６）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１７～２３６±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７７；配列番号７７）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１８～２３７±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７８；配列番号７８）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２１９～２３８±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００７９；配列番号７９）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２０～２３９±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８０；配列番号８０）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２１～２４０±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８１；配列番号８１）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２２～２４１±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８２；配列番号８２）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２３～２４２±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８３；配列番号８３）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２４～２４３±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８４；配列番号８４）。幾つかの態様では、標的領域は、配列番号３のヌクレオチド２２５～２４４±１０、±２０

、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドの３’末端及び／または５’末端ヌクレオチドに相当する（例えば、ＡＳＯ－００８５；配列番号８５）。

【0168】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、生理的条件、すなわち、インビボ条件下で標的核酸（例えば、ＫＲＡＳ転写物）にハイブリダイズすることができる。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、インビトロで標的核酸（例えば、ＫＲＡＳ転写物）にハイブリダイズすることができる。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、インビトロでストリンジェント条件下で標的核酸（例えば、ＫＲＡＳ転写物）にハイブリダイズすることができる。インビトロでのハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件は、とりわけ、生産的な細胞への取り込み、ＲＮＡへの到達性、温度、会合の自由エネルギー、塩濃度、及び時間に依存する（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）を参照のこと）。一般に、異なる核酸間ではなく、実質的に類似する核酸間のハイブリダイゼーションを可能にするために、高ストリンジェンシーから中程度のストリンジェンシーまでの条件が、インビトロでのハイブリダイゼーションに使用される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５Ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（０．７５Ｍの塩化ナトリウム／０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）中で４０℃にて１時間のハイブリダイゼーション、続いて、１Ｘ ＳＳＣ中で４０℃にて１０回及び１Ｘ ＳＳＣ緩衝液中で室温にて５回の試料の洗浄が挙げられる。インビボでのハイブリダイゼーション条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列とのハイブリダイゼーションを支配する細胞内条件（例えば、生理的ｐＨ及び細胞内イオン条件）からなる。インビボでの条件は、相対的に低いストリンジェンシー条件によりインビトロで模倣され得る。例えば、インビトロでのハイブリダイゼーションは、２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍの塩化ナトリウム／０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ中で３７℃にて実施され得る。４Ｘ ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含有する洗浄溶液が３７℃で使用され得、１Ｘ ＳＳＣ中で４５℃にて最終洗浄される。

【0169】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、１つ以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）由来のＫＲＡＳ転写物を標的とすることができる。従って、幾つかの態様では、ＡＳＯは、ヒト及び他の非ヒト種（例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット）におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡまたはタンパク質の両方の発現を下方調節（例えば、低減または阻害）することができる。幾つかの態様では、本明細書に記載される任意のＡＳＯは、少なくとも１種の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチドに共有結合されたＡＳＯを含むコンジュゲートの一部である。

【0170】

本開示のある種の態様は、本明細書に記載されるＡＳＯを含むコンジュゲートを対象とする。ある種の態様では、コンジュゲートは、少なくとも１種の非ヌクレオチドに共有結合されたＡＳＯを含む。ある種の態様では、コンジュゲートは、少なくとも１種の非ポリヌクレオチド部分に共有結合されたＡＳＯを含む。幾つかの態様では、非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0171】

ＩＩ．Ｂ．ＡＳＯ配列
本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１または配列番号３に相当するヌクレオチド配列の領域の相補体に相当する連続ヌクレオチド配列を含む。

【0172】

ある種の態様では、本開示は、１０～５０ヌクレオチド、例えば、１０～３０、例えば、１０～１５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１０～２５ヌクレオチドの長さのＡＳＯを提供し、ここで、連続ヌクレオチド配列は、ＫＲＡＳ転写物、例えば、配列番号１もしくは配列番号３またはそれらの天然に存在するバリアントの相補体内の領域に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。従って、幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１の配列またはその一部を有する一本鎖核酸分子にハイブリダイズする。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３の配列またはその一部を有する一本鎖核酸分子にハイブリダイズする。

【0173】

ＡＳＯは、哺乳動物ＫＲＡＳタンパク質をコードする核酸の対応する領域に十分に相補的な（完全に相補的な）連続ヌクレオチド配列を含み得る。ＡＳＯは、配列番号１または配列番号３のヌクレオチドＸ～Ｙに相当する核酸配列または当該配列内の領域に十分に相補的な（完全に相補的な）連続ヌクレオチド配列を含み得、ここで、Ｘ及びＹは、図１に示すように、それぞれ開始部位及び末端部位である。

【0174】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号４～８５から選択される配列（すなわち、図１の配列）に対する少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば、約１００％の配列同一性（相同的）を有する。幾つかの態様では、ＡＳＯは、本明細書における他箇所で記載される（例えば、セクションＩＩ．Ｇ）設計または本明細書における他箇所で示される化学構造（例えば、図１）を有する。

【0175】

幾つかの態様では、ＡＳＯ（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号４～８５からなる群から選択される配列のうちの１つまたはその少なくとも１０連続ヌクレオチドの領域から選択されるか、またはそれを含み、ここで、ＡＳＯ（またはその連続ヌクレオチド部分）は、対応するＫＲＡＳ転写物（例えば、配列番号１または配列番号３）と比較される場合に、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを任意に含み得る。

【0176】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４～１７からなる群から選択される配列を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－０００９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１８～３２からなる群から選択される配列を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号１９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００１９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号２９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００２９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３３～４８からなる群から選択される配列を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号３９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００３９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４９～６５からなる群から選択される配列を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号４９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００４９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号５９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００５９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６６～８５からなる群から選択される配列を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号６９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００６９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７５）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７６に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７６）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７７に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７７）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７８に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７８）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号７９に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００７９）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８０に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８０）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８１に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８１）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８２に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８２）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８３に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８３）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８４に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８４）。幾つかの態様では、ＡＳＯは、配列番号８５に記載の配列を含む（例えば、ＡＳＯ－００８５）。

【0177】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、標的核酸配列（例えば、ＫＲＡＳ転写物）に結合し、ＫＲＡＳ転写物の発現を、細胞における正常な（すなわち、対照）発現レベルと比較して少なくとも１０％または２０％、例えば、正常な発現レベル（例えば、ＡＳＯに曝露されなかった細胞における発現レベル）と比較して少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害または低減することができる。

【0178】

ある種の態様では、本開示のＡＳＯは、以下からなる群から選択される少なくとも１つの特性を有する：（ｉ）哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを低減する特性；（ｉｉ）哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳのタンパク質レベルを低減する特性；（ｉｉｉ）がんの１つ以上の症状を低減、改善、または処置する特性、及び（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ。

【0179】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、例えば、インビトロで、細胞がＡＳＯと接触される場合、ＡＳＯと接触していない（例えば、生理食塩水または対照ＡＳＯと接触した）細胞と比較して、標的細胞において、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの発現を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減することができる。本明細書で使用する場合、用語「対照ＡＳＯ」は、本明細書において開示されるＫＲＡＳ転写物に特異的でない（すなわち、ＫＲＡＳ転写物に結合することができない）ＡＳＯを指す。ある種の態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは、野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（配列番号８９）である。ある種の態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ（配列番号３）である。幾つかの態様では、ＡＳＯは、野生型ＫＲＡＳ及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの両方の発現を低減することができる。

【0180】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、例えば、インビトロで、細胞がＡＳＯと接触される場合、ＡＳＯと接触していない（例えば、生理食塩水または対照ＡＳＯと接触した）細胞と比較して、標的細胞において、ＫＲＡＳタンパク質の発現を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減することができる。幾つかの態様では、ＫＲＡＳタンパク質は、野生型ＫＲＡＳタンパク質（配列番号９０（アイソフォーム２Ａ）または配列番号８８（アイソフォーム２Ｂ））である。幾つかの態様では、ＫＲＡＳタンパク質は、Ｇ１２Ｄ変異（配列番号８６（アイソフォーム２Ａ）または配列番号２（アイソフォーム２Ｂ））を含む。ある種の態様では、ＡＳＯは、野生型ＫＲＡＳタンパク質及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳタンパク質の発現を低減することができる。

【0181】

本開示の他箇所で示されるように、幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物発現の阻害における高い効力を示す。本明細書で使用する場合、用語「高い効力」または「非常に強力な」は、本明細書に記載されるＨｅｐａ１－６レポーターアッセイ（実施例４を参照のこと）を使用して測定されるように、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０値でＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の発現を低減することができるＡＳＯを指す。例えば、ある種の態様では、高い効力を有する本開示のＡＳＯは、Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定されるように、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＩＣ５０値でＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を低減することができる。幾つかの態様では、本開示の非常に強力なＡＳＯは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの複数のバリアント、例えば、当技術分野において公知のもの及び／または本明細書に記載されるものの発現を低減することができる。ある種の態様では、非常に強力なＡＳＯは、Ｈｅｐａ１－６レポーターアッセイを使用して測定されるように、例えば、約１０ｎＭ未満のＩＣ５０値で、野生型ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの両方の発現を低減することができる。

【0182】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、それらがハイブリダイズまたは結合する標的に選択性が高い。本明細書で使用する場合、用語「選択性が高い」または「高い選択性」は、特定のＫＲＡＳ転写物に特異的なＡＳＯを指す。例えば、幾つかの態様では、本明細書に記載される選択性が高いＡＳＯは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡに特異的であり、従って、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡの発現を下方調節することが可能であるが、他のＫＲＡＳ ｍＲＮＡ（例えば、野生型）の発現に対する最小限の効果を有する。

【0183】

本明細書において実証されるように、幾つかの態様では、ＫＲＡＳ転写物（またはそのコードされるタンパク質）発現の減少は、標的細胞、例えば、異常なＫＲＡＳ活性を示す腫瘍細胞の生存率及び／または増殖の減少に関連する。従って、ある種の態様では、本開示のＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ）を発現する細胞の生存率及び／または増殖を低減することができる。ある種の態様では、生存率及び／または増殖は、細胞がＡＳＯと接触される場合、ＡＳＯと接触していない（例えば、生理食塩水または対照ＡＳＯと接触した）細胞と比較して、標的細胞において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。

【0184】

また本明細書において実証されるように、幾つかの態様では、ＫＲＡＳ転写物（またはコードされるタンパク質）発現の減少は、ＭＡＰキナーゼ経路に関連するタンパク質の発現の減少に関連する。ある種の態様では、ＭＡＰキナーゼ経路に関連するタンパク質は、リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）である。従って、ある種の態様では、本明細書に記載されるＡＳＯは、ＭＡＰキナーゼ経路に関連するタンパク質（例えば、ｐＥＲＫ）の発現を低減することができる。ある種の態様では、発現は、細胞がＡＳＯと接触される場合、ＡＳＯと接触していない（例えば、生理食塩水または対照ＡＳＯと接触した）細胞と比較して、標的細胞において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。

【0185】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、標的配列にハイブリダイズする際に、１つ、２つ、３つ、または４つ（またはそれ以上）のミスマッチを許容することができ、依然として標的に十分に結合して、所望の効果、すなわち、標的ｍＲＮＡ及び／またはタンパク質の下方調節を示す。ミスマッチは、例えば、ＡＳＯヌクレオチド配列の長さの増加及び／または本明細書における他箇所で開示されるヌクレオチド類似体の数の増加により補償され得る。

【0186】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、標的配列にハイブリダイズする際に、３つ以下のミスマッチを含む。他の態様では、連続ヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする際に、２つ以下のミスマッチを含む。他の態様では、連続ヌクレオチド配列は、標的配列にハイブリダイズする際に、１つ以下のミスマッチを含む。

【0187】

ＩＩ．Ｃ．ＡＳＯの長さ
ＡＳＯは、合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含み得る。ＡＳＯまたは連続ヌクレオチド配列の長さについて範囲が与えられる場合、当該範囲は、当該範囲に示される下限及び上限を含み、例えば、１０から３０（または１０～３０）は、１０及び３０の両方を含むことを理解すべきである。

【0188】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、合計約１４～２０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある種の態様では、本開示のＡＳＯは、１４ヌクレオチド長である。幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯは、１５ヌクレオチド長である。他の態様では、ＡＳＯは、１６ヌクレオチド長である。更なる態様では、本開示で提供されるＡＳＯは、１７ヌクレオチド長である。ある種の態様では、本開示のＡＳＯは、１８ヌクレオチド長である。ある種の態様では、本開示のＡＳＯは、１９ヌクレオチド長である。更に他の態様では、ＡＳＯは、２０ヌクレオチド長である。幾つかの態様では、ＡＳＯは、１４ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１３ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１２ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１１ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、１０ヌクレオチド長である。

【0189】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、約１０～約５０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列、例えば、約１０～約４５、約１０～約４０、約１０または約３５、または約１０～約３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。ある種の態様では、ＡＳＯは、２１ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２２ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２３ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２４ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２５ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２６ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２７ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２８ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、２９ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３０ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３１ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３２ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３３ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３４ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３５ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３６ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３７ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３８ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、３９ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４０ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４１ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４２ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４３ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４４ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４５ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４６ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４７ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４８ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、４９ヌクレオチド長である。ある種の態様では、ＡＳＯは、５０ヌクレオチド長である。

【0190】

ＩＩ．Ｄ．ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体
本開示の一態様では、ＡＳＯは、１つ以上の非天然ヌクレオシド類似体を含む。「ヌクレオシド類似体」は、本明細書で使用する場合、天然ヌクレオシド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの、糖及び／または塩基部分における修飾によるバリアントである。類似体は、オリゴヌクレオチドの文脈において、基本的には単に天然ヌクレオシドに対して「無影響（ｓｉｌｅｎｔ）」であり得るか、またはそれと「等価」であり得、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するために機能する様式に対して機能的影響を及ぼさない。それにもかかわらず、かかる「等価な」類似体は、例えば、それらが製造するのにより容易であるか、もしくはより安価であるか、または保存もしくは製造条件に対してより安定であるか、またはタグもしくは標識となる場合、有用であり得る。しかしながら、幾つかの態様では、類似体は、例えば、標的に対する結合親和性の増加及び／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加及び／または細胞内への輸送の容易さの増加をもたらすことにより、ＡＳＯが発現を阻害するために機能する様式に対して機能的影響を及ぼす。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３により、ならびにスキーム１に記載されている。本開示のＡＳＯは、１つ超、２つ超、３つ超、４つ超、５つ超、６つ超、７つ超、８つ超、９つ超、１０超、１１超、１２超、１３超、１４超、１５超、１６超、１８超、１９超、または２０超のヌクレオシド類似体を含有し得る。幾つかの態様では、ＡＳＯのヌクレオシド類似体は同一である。他の態様では、ＡＳＯのヌクレオシド類似体は異なる。ＡＳＯのヌクレオチド類似体は、以下のヌクレオシド類似体のいずれか１つまたはその組み合わせであり得る。

【0191】

幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体；またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、糖修飾されたヌクレオシドを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、二環式糖を含むヌクレオシドを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、ＬＮＡを含む。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、２’－ＭＯＥを含む。

【0192】

幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、拘束エチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノＬＮＡ、オキシＬＮＡ、チオＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。幾つかの態様では、ＡＳＯは、１つ以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。

【0193】

ＩＩ．Ｄ．１．核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）部分を含む。本開示の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基と異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション時に機能する修飾された核酸塩基も包含する。幾つかの態様では、核酸塩基部分は、核酸塩基を修飾するか、または置き換えることにより修飾される。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチン、ならびに非天然バリアントの両方を指す。かかるバリアントは、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１２） Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ （２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。

【0194】

幾つかの態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾されたプリンまたはピリミジン、例えば、置換プリンまたは置換ピリミジン、例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチル－シトシン、５－チアゾロ（ｔｈｉｏｚｏｌｏ）－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変化させることにより修飾される。

【0195】

核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵにより示され得、各文字は、同等の機能の修飾された核酸塩基を任意に含み得る。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおける核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチル－シトシンから選択される。ＬＮＡギャップマーでは、５－メチル－シトシンＬＮＡヌクレオシドが任意に使用され得る。

【0196】

ＩＩ．Ｄ．２．糖修飾
本開示のＡＳＯは、ＤＮＡ及びＲＮＡにおいて見出されるリボース糖部分と比較して修飾された糖部分、すなわち、糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、主にオリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば、親和性及び／またはヌクレアーゼ耐性を改善する目的で作製されている。

【0197】

かかる修飾としては、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）、または通常、リボース環上のＣ２’炭素とＣ４’炭素との間にビラジカル架橋を有する二環式環（ＬＮＡ）、または通常、Ｃ２’とＣ３’炭素との間の結合を欠く非連結リボース環（例えば、ＵＮＡ）との置き換えによりリボース環状構造が修飾されているものが挙げられる。他の糖修飾されたヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が挙げられる。修飾されたヌクレオシドとしては、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合のように、糖部分が非糖部分と置き換えられているヌクレオシドも挙げられる。

【0198】

糖修飾としては、リボース環の置換基を水素以外の基、またはＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に見出される２’－ＯＨ基に変化させることによりなされる修飾も挙げられる。例えば、置換基は、２’、３’、４’、または５’位に導入され得る。修飾された糖部分を有するヌクレオシドとしては、２’修飾されたヌクレオシド、例えば、２’置換ヌクレオシドも挙げられる。実際、２’置換ヌクレオシドを開発することに大きな焦点が向けられ、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれる場合に、増強されたヌクレオシド耐性及び増強された親和性などの有益な特性を有することが分かっている。

【0199】

ＩＩ．Ｄ．２．ａ ２’修飾されたヌクレオシド
２’糖修飾されたヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）か、または２’連結ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドが挙げられる。例えば、２’修飾された糖は、増強された結合親和性（例えば、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシド）及び／または増加したヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに付与し得る。２’置換修飾されたヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。更なる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３；Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３；及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、２’置換修飾されたヌクレオシドの幾つかの例である。

【化1】

【0200】

ＩＩ．Ｄ．２．ｂ ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、リボース環の立体構造を制限または固定する、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間のリンカー基（ビラジカルまたは架橋と称される）（すなわち、２’－４’架橋）を含む修飾されたヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献において架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも名付けられている。リボースの立体構造の固定は、オリゴヌクレオチドにＬＮＡが組み込まれた場合の相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）に関連する。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することにより定型的に決定され得る。

【0201】

非限定的な例示的ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８に開示されている。

【0202】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯの修飾されたヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは、一般式ＩまたはＩＩの構造を有し：

【化2】

式中、
Ｗは、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－、特に、－Ｏ－から選択され、
Ｂは、核酸塩基または修飾された核酸塩基部分であり、
Ｚは、隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｚ＊は、隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり、
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アジド、ヘテロ環、及びアリールから独立して選択され、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａ、及びＲ^ｂは、本明細書において定義される通りである。

【0203】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－、Ｒ^ａは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。－Ｘ－Ｙ－の幾つかの態様では、Ｒ^ｂは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。－Ｘ－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方または両方は、水素である。－Ｘ－Ｙ－の更なる態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。－Ｘ－Ｙ－の幾つかの態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。－Ｘ－Ｙ－のある種の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの両方が同時にメチルである。

【0204】

幾つかの態様では、－Ｘ－、Ｒ^ａは、水素またはアルキルであり、特に、水素またはメチルである。－Ｘ－の幾つかの態様では、Ｒ^ｂは、水素またはアルキルであり、特に、水素またはメチルである。－Ｘ－の他の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方または両方は、水素である。－Ｘ－のある種の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。－Ｘ－のある種の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。－Ｘ－の他の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの両方が同時にメチルである。

【0205】

幾つかの態様では、－Ｙ－、Ｒ^ａは、水素またはアルキルであり、特に、水素またはメチルである。－Ｙ－のある種の態様では、Ｒ^ｂは、水素またはアルキルであり、特に、水素またはメチルである。－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方または両方は、水素である。－Ｙ－の幾つかの態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方のみが水素である。－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方はメチルであり、他方は水素である。－Ｙ－の幾つかの態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの両方が同時にメチルである。

【0206】

幾つかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、水素及びアルキル、特に、水素及びメチルから独立して選択される。

【0207】

幾つかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。

【0208】

幾つかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、全て同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方は上記記載の通り、特に、アルキル、より具体的にはメチルである。

【0209】

幾つかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、全て同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアジドである。

【0210】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、及びＷＯ２００４／０４６１６０（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、かかるＬＮＡヌクレオシドとしては、β－Ｄ－オキシＬＮＡ及びα－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして当該技術分野において一般に公知であるものが挙げられる。

【0211】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｓ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるチオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。

【0212】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－ＮＨ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０に開示されている。

【0213】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－または－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ００／０４７５９９及びＭｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６に開示されており、かかるＬＮＡヌクレオシドとしては、２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として当該技術分野において一般に公知であるものが挙げられる。

【0214】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、全て同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は、水素であり、他方は、水素ではなく、例えば、アルキル、例えば、メチルである。かかる５’置換されたＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００７／１３４１８１に開示されている。

【0215】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの一方または両方は、水素ではなく、特に、アルキル、例えば、メチルであり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３は、全て同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は、水素であり、他方は、水素ではなく、特に、アルキル、例えば、メチルである。かかるビス修飾されたＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されている。

【0216】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－である（「２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５） ｐｐ．１５６９－８１）。

【0217】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかる６’置換ＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２０１０／０３６６９８及びＷＯ２００７／０９００７１に開示されており、これらは両方が参照により本明細書に組み込まれる。かかる６’置換ＬＮＡヌクレオシドにおいて、Ｒ^ａは、特にＣ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチルである。

【0218】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるＬＮＡヌクレオシドは、環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても当技術分野において公知であり、ＷＯ２００７／０９００７１に開示されている。

【0219】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－である。

【0220】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－である（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０、前掲）。

【0221】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかる６’－メチルＬＮＡヌクレオシドは、ｃＥＴヌクレオシドとしても当該技術分野において公知であり、ＷＯ２００７／０９００７１（β－Ｄ）及びＷＯ２０１０／０３６６９８（α－Ｌ）（これらは両方が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、（Ｓ）－ｃＥＴまたは（Ｒ）－ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであり得る。

【0222】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、式中、Ｒ^ａもＲ^ｂも水素ではなく、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。ある種の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの両方が同時にアルキルであり、特に、両方が同時にメチルである。かかる６’ジ置換ＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００９／００６４７８に開示されている。

【0223】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｓ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかる６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１５６２０２に開示されている。かかる６’置換チオＬＮＡのある種の態様では、Ｒ^ａは、アルキル、特にメチルである。

【0224】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－であり、例えば、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかるビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ２００８／１５４４０１及びＷＯ２００９／０６７６４７（これらは両方が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0225】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｎ（ＯＲ^ａ）－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。幾つかの態様では、Ｒ^ａは、アルキル、例えば、メチルである。かかるＬＮＡヌクレオシドは、Ｎ置換ＬＮＡとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示されている。

【0226】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＮＣＨ_３－である（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０、前掲）。

【0227】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、ＯＮ（Ｒ^ａ）－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、または－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。ある種の態様では、Ｒ^ａは、アルキル、例えば、メチルである。（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０、前掲）。

【0228】

幾つかの態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊は、両方が同時に水素である。他の態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は、水素であり、他方は、アルキル、例えば、メチルである。かかる態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、及びＲ^３は、特に水素であり得、－Ｘ－Ｙ－は、特に、－Ｏ－ＣＨ_２－または－Ｏ－ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３－、例えば、－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり得る。

【0229】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。かかる態様では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えば、メチルであり得る。かかるＬＮＡヌクレオシドは、立体配座固定ヌクレオチド（ＣＲＮ）としても公知であり、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０３６８６８に開示されている。

【0230】

幾つかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は、－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは、酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、及びＲ^５＊は、全て同時に水素である。ある種の態様では、Ｒ^ａは、特にアルキル、例えば、メチルであり得る。かかるＬＮＡヌクレオシドは、ＣＯＣヌクレオチドとしても公知であり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８に開示されている。

【0231】

明記しない限り、ＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ型またはα－Ｌ型ステレオアイソフォームであり得ることが理解されるであろう。

【0232】

ＬＮＡヌクレオシドの特定の例は、スキーム１に示される。

【化3】

【0233】

他箇所で示されるように、本開示の幾つかの態様では、オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである。

【0234】

ＩＩ．Ｅ．ヌクレアーゼにより媒介される分解
ヌクレアーゼにより媒介される分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成する場合に、このような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。

【0235】

幾つかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼにより媒介される標的核酸の分解により機能し得、ここで、本開示のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、及び特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えば、ＲＮアーゼＨを動員することができる。ヌクレアーゼにより媒介されるメカニズムにより機能するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には、少なくとも５つまたは６つのＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、片側または両側が親和性を増強するヌクレオシド、例えば、ギャップマーと隣接するオリゴヌクレオチドである。

【0236】

ＩＩ．Ｆ．ＲＮアーゼＨ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮアーゼＨ活性は、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖である場合に、ＲＮアーゼＨを動員し、相補的ＲＮＡ分子の分解を誘発するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮアーゼＨ活性を決定するためのインビトロでの方法を提供し、これはＲＮアーゼＨを動員する能力を決定するために使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が与えられる時に、そのオリゴヌクレオチドが、試験される修飾されたオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡ単量体のみを含有するオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドにおける全ての単量体間にホスホロチオエート結合を有する当該オリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５により提供される方法を使用する場合に決定された初速度の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％超の初速度（ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される）を有する場合、ＲＮアーゼＨを動員することができるとみなされる。

【0237】

幾つかの態様では、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が与えられる時に、ＲＮアーゼＨ初速度（ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される）が、試験されるオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡ単量体のみを含有し、２’置換を有さないオリゴヌクレオチドであって、当該オリゴヌクレオチドにおける全ての単量体間にホスホロチオエート結合を有する当該オリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５により提供される方法を使用する場合に決定された初速度の２０％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満である場合、本質的にＲＮアーゼＨを動員することができないとみなされる。

【0238】

ＩＩ．Ｇ．ＡＳＯの設計
本開示のＡＳＯは、ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）の形態であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ギャップマーである。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ミックスマーである。幾つかの態様では、ＡＳＯは、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）である。本開示のＡＳＯと共に使用され得るギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）の構成の例は、米国特許出願公開第２０１２／０３２２８５１号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0239】

本明細書で使用する場合、用語「ギャップマー」は、ＲＮアーゼＨを動員するオリゴヌクレオチドの領域（ギャップ）を含み、この領域の５’及び３’が１つ以上の親和性を増強する修飾されたヌクレオシド（隣接部）と隣接しているアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。用語「ＬＮＡギャップマー」は、少なくとも１つの親和性を増強する修飾されたヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。用語「混合ウィングギャップマー」は、隣接領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾されたヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２’置換修飾されたヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド（複数可）を含むＬＮＡギャップマーを指す。

【0240】

「ミックスマー」と称される他の「キメラ」ＡＳＯは、（ｉ）ＲＮアーゼにより認識可能及び切断可能なＤＮＡ単量体またはヌクレオシド類似体単量体、及び（ｉｉ）ＲＮアーゼを動員しないヌクレオシド類似体単量体の交互組成からなる。

【0241】

「トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）」は、非天然ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のみを含む一本鎖ＡＳＯである。

【0242】

幾つかの態様では、一部のヌクレオシド類似体は、標的領域に対するＡＳＯの親和性を増強するだけでなく、ＲＮアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）結合及び切断も媒介する。α－Ｌ－ＬＮＡ単量体は、ＲＮアーゼＨ活性をある程度動員するため、幾つかの態様では、α－Ｌ－ＬＮＡ単量体を含有するＡＳＯのギャップ領域（例えば、本明細書において述べる領域Ｂ）は、ＲＮアーゼＨにより認識可能及び切断可能なより少数の単量体からなり、ミックスマーの構築により多くの柔軟性がもたらされる。

【0243】

ＩＩ．Ｇ．１．ギャップマーの設計
幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、ギャップマーであり、本明細書において領域Ｂ（Ｂ）と称される、ＲＮアーゼＨなどのＲＮアーゼを動員することができる連続したヌクレオチドの区間（例えば、１つ以上のＤＮＡ）を含み、ここで、領域Ｂは、５’側及び３’側の両方が領域Ｂの連続ヌクレオチド区間の５’及び３’側に存在するヌクレオシド類似体の領域と隣接している。これらの領域は、それぞれ領域Ａ（Ａ）及びＣ（Ｃ）と称される。幾つかの態様では、ヌクレオシド類似体は、糖修飾されたヌクレオシド（例えば、高親和性糖修飾されたヌクレオシド）である。ある種の態様では、領域Ａ及びＣの糖修飾されたヌクレオシドは、標的核酸に対するＡＳＯの親和性を増強する（すなわち、親和性を増強する２’糖修飾されたヌクレオシド）。幾つかの態様では、糖修飾されたヌクレオシドは、２’糖修飾されたヌクレオシド、例えば、高親和性２’糖修飾、例えば、ＬＮＡ及び／または２’－ＭＯＥである。

【0244】

ギャップマーにおいて、領域Ｂのほとんどの５’及び３’ヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ領域Ａ及びＣのヌクレオシド類似体（例えば、高親和性糖修飾されたヌクレオシド）に隣接して配置される。幾つかの態様では、領域Ａ及びＣは、領域Ｂから最も遠い末端に（すなわち、領域Ａの５’末端及び領域Ｃの３’末端に）ヌクレオシド類似体を有すると更に定義され得る。

【0245】

幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、式（５’～３’）Ａ－Ｂ－Ｃのヌクレオチド配列を含み、式中、（Ａ）（５’領域または第１のウィング配列）は、少なくとも１つのヌクレオシド類似体（例えば、３～５ＬＮＡ単位）を含み、（Ｂ）は、ＲＮアーゼを動員することができる（相補的ＲＮＡ分子、例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ標的と共に二重鎖が形成される場合に）少なくとも４つの連続ヌクレオシド（例えば、４～２４ＤＮＡ単位）を含み、（Ｃ）（３’領域または第２のウィング配列）は、少なくとも１つのヌクレオシド類似体（例えば、３～５ＬＮＡ単位）を含む。

【0246】

幾つかの態様では、領域Ａは、３～５つのヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡを含み、領域Ｂは、６～２４（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４）ＤＮＡ単位からなり、領域Ｃは、３または４つのヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなる。かかる設計（Ａ－Ｂ－Ｃ）の非限定的な例としては、３－８－３、３－９－３、３－１０－３、３－１１－３、３－１２－３、３－１３－３、３－１４－３、４－９－４、４－１０－４、４－１１－４、４－１２－４、及び５－１０－５が挙げられる。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、またはＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬの設計を有し、ここで、Ｌはヌクレオシド類似体であり、ＤはＤＮＡであり、ｎは４～２４の任意の整数であり得る。幾つかの態様では、ｎは、６～１４の任意の整数であり得る。幾つかの態様では、ｎは、８～１２の任意の整数であり得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤ_ｎＭＭＬＬＬＬＬ、またはＬＬＬＬＬＬＭＤ_ｎＭＬＬＬＬＬの設計を有し、ここで、ＤはＤＮＡであり、ｎは３～１５の任意の整数であり得、ＬはＬＮＡであり、Ｍは２’ＭＯＥである。

【0247】

更なるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１、及びＷＯ２００８／１１３８３２に開示されており、これらの各々は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0248】

ＩＩ．Ｈ．ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されるＡＳＯの単量体は、結合基により連結されている。好適には、各単量体は、結合基により３’側に隣接する単量体に連結されている。

【0249】

当業者は、本開示の文脈において、ＡＳＯの５’末端の単量体が５’結合基を含まないが、５’末端基を含んでいても含んでいなくてもよいことを理解するであろう。

【0250】

幾つかの態様では、連続ヌクレオチド配列は、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。用語「結合基」または「ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを共有結合的に連結することができる基を意味することを意図する。非限定的な例としては、リン酸基及びホスホロチオエート基が挙げられる。

【0251】

本開示のＡＳＯのヌクレオシドまたはその連続ヌクレオシド配列は、結合基により連結されている。好適には、各ヌクレオシドは、結合基により３’側に隣接するヌクレオシドに連結されている。

【0252】

幾つかの態様では、ヌクレオシド間結合は、その通常のホスホジエステルからヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性を示すもの、例えば、ＲＮアーゼＨにより切断可能であり、標的遺伝子の発現の低減におけるアンチセンス阻害の経路も可能にするホスホロチオエートに修飾される。幾つかの態様では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオシド間結合が修飾される。

【0253】

ＩＩＩ．細胞外小胞、例えば、エキソソーム
本明細書において、例えば、哺乳動物細胞、例えば、腫瘍細胞、例えば、膵臓腫瘍細胞におけるＫＲＡＳ転写物（例えば、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ）またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減及び／または阻害することができるＥＶ、例えば、エキソソームが開示される。本開示において有用なＥＶ、例えば、エキソソームは、ＡＳＯ（例えば、本明細書に記載されるＡＳＯ）を産生するように操作されている。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＡＳＯ（例えば、本明細書に記載されるＡＳＯ）を含む。本明細書に記載されるように、幾つかの態様では、ＥＶは、変異型ＫＲＡＳ転写物の核酸配列の領域に相補的なＡＳＯを含み、ここで、当該ＡＳＯが相補性を示す当該核酸配列の当該領域は、野生型ＫＲＡＳ転写物の対応する領域と比較して変異を含む。かかる変異の非限定的な例は、本開示の他箇所で開示される。ある種の態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物の核酸配列の領域に相補的なＡＳＯを含み、ここで、当該領域は、Ｇ１２Ｄ変異／バリアントをコードする。

【0254】

幾つかの態様では、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも１種のＡＳＯを含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも２種のＡＳＯ、例えば、第１のヌクレオチド配列を含む第１のＡＳＯ及び第２のヌクレオチド配列を含む第２のＡＳＯを含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも３種のＡＳＯ、少なくとも４種のＡＳＯ、少なくとも５種のＡＳＯ、少なくとも６種のＡＳＯ、または６種超のＡＳＯを含む。幾つかの態様では、第１のＡＳＯ、第２のＡＳＯ、第３のＡＳＯ、第４のＡＳＯ、第５のＡＳＯ、第６のＡＳＯ、及び／または第ＮのＡＳＯの各々は異なる（例えば、異なる連続ヌクレオチド配列、異なる設計、または本明細書において開示される任意の他の修飾を含む）。

【0255】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、第１のＡＳＯ及び第２のＡＳＯを含み、ここで、当該第１のＡＳＯは、第１の転写物の第１の標的配列に相補的な第１の連続ヌクレオチド配列を含み、当該第２のＡＳＯは、当該第１の転写物の第２の標的配列に相補的な第２のヌクレオチド配列を含む。幾つかの態様では、第１の標的配列は、第２の標的配列と重複しない。幾つかの態様では、第１の標的配列は、転写物の５’ＵＴＲ内の少なくとも１ヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、５’ＵＴＲ内のヌクレオチドを含まない。幾つかの態様では、第１の標的配列は、転写物の３’ＵＴＲ内の少なくとも１ヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、３’ＵＴＲ内のヌクレオチドを含まない。幾つかの態様では、第１の標的配列は、転写物の５’ＵＴＲ内の少なくとも１ヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、３’ＵＴＲ内の少なくとも１ヌクレオチドを含む。

【0256】

幾つかの態様では、第１のＡＳＯは、エキソン－イントロンジャンクション内の配列を標的とし、第２のＡＳＯは、エキソン－イントロンジャンクション内の配列を標的とする。幾つかの態様では、第１のＡＳＯは、エキソン－イントロンジャンクション内の配列を標的とし、第２のＡＳＯは、エキソン内の配列を標的とする。幾つかの態様では、第１のＡＳＯは、エキソン－イントロンジャンクション内の配列を標的とし、第２のＡＳＯは、イントロン内の配列を標的とする。幾つかの態様では、第１のＡＳＯは、エキソン内の配列を標的とし、第２のＡＳＯは、エキソン内の配列を標的とする。幾つかの態様では、第１のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはエキソン内の配列を標的とする。幾つかの態様では、第１のＡＳＯはイントロン内の配列を標的として、第２のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とする。

【0257】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、第１のＡＳＯ及び第２のＡＳＯを含み、ここで、当該第１のＡＳＯは、第１の転写物の第１の標的配列に相補的な第１のヌクレオチド配列を含み、当該第２のＡＳＯは、第２の転写物の第２の標的配列に相補的な第２のヌクレオチド配列を含み、当該第１の転写物は、当該第２の転写物と同一遺伝子の生成物ではない。

【0258】

ある種の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、対象内の特定の細胞または組織を標的とするように操作され得る。例えば、幾つかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶの表面に１種以上の標的化／指向性部分を提示するように改変され得る。本明細書に記載されるように、かかる部分は、ＥＶの特定の細胞または組織への移動を変化させ、及び／または増強することができる。かかるＥＶに関する更なる開示が本開示の他箇所で提供される。

【0259】

本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）により標的とされ得る細胞の非限定的な例としては、以下が挙げられる：腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、骨髄由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ、例えば、単球型ＭＤＳＣまたは顆粒球型ＭＤＳＣ）、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、血小板、神経細胞、肝細胞、造血幹細胞、脂肪細胞、好塩基球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせ。幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、ＫＲＡＳを標的とするＡＳＯを含むエキソソーム）は、腫瘍細胞を標的とする。幾つかの態様では、腫瘍細胞は、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌（例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））、白血病、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、胆管癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、肉腫、黒色腫、神経膠腫（例えば、低悪性度神経膠腫、例えば、グリア芽細胞腫）、中皮腫、肝臓癌、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）、腎臓癌（例えば、乳頭状腎細胞癌（ｐＲＣＣ）及び嫌色素性腎細胞癌）、頭頸部癌、前立腺癌、腺様嚢胞癌（ＡＣＣ）、胸腺癌、甲状腺癌、淡明細胞型腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、神経内分泌腫瘍（例えば、褐色細胞腫／傍神経節腫）、ブドウ膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるがんに由来する。ある種の態様では、腫瘍細胞は、膵臓癌細胞である。ある種の態様では、本開示のＥＶは、マクロファージを標的とする。本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）により標的とされ得る組織の非限定的な例としては、肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、脳脊髄液（ＣＳＦ）、筋肉（例えば、骨格筋、心筋）、骨、骨髄、血液、脾臓、リンパ節、胃、食道、横隔膜、膀胱、大腸、膵臓、甲状腺、唾液腺、副腎、下垂体、胸部、皮膚、卵巣、子宮、前立腺、精巣、頸部、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0260】

上記のように、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソームは、約２０～３００ｎｍの直径を有する細胞外小胞である。ある種の態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、約２０～２９０ｎｍ、２０～２８０ｎｍ、２０～２７０ｎｍ、２０～２６０ｎｍ、２０～２５０ｎｍ、２０～２４０ｎｍ、２０～２３０ｎｍ、２０～２２０ｎｍ、２０～２１０ｎｍ、２０～２００ｎｍ、２０～１９０ｎｍ、２０～１８０ｎｍ、２０～１７０ｎｍ、２０～１６０ｎｍ、２０～１５０ｎｍ、２０～１４０ｎｍ、２０～１３０ｎｍ、２０～１２０ｎｍ、２０～１１０ｎｍ、２０～１００ｎｍ、２０～９０ｎｍ、２０～８０ｎｍ、２０～７０ｎｍ、２０～６０ｎｍ、２０～５０ｎｍ、２０～４０ｎｍ、２０～３０ｎｍ、３０～３００ｎｍ、３０～２９０ｎｍ、３０～２８０ｎｍ、３０～２７０ｎｍ、３０～２６０ｎｍ、３０～２５０ｎｍ、３０～２４０ｎｍ、３０～２３０ｎｍ、３０～２２０ｎｍ、３０～２１０ｎｍ、３０～２００ｎｍ、３０～１９０ｎｍ、３０～１８０ｎｍ、３０～１７０ｎｍ、３０～１６０ｎｍ、３０～１５０ｎｍ、３０～１４０ｎｍ、３０～１３０ｎｍ、３０～１２０ｎｍ、３０～１１０ｎｍ、３０～１００ｎｍ、３０～９０ｎｍ、３０～８０ｎｍ、３０～７０ｎｍ、３０～６０ｎｍ、３０～５０ｎｍ、３０～４０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、４０～２９０ｎｍ、４０～２８０ｎｍ、４０～２７０ｎｍ、４０～２６０ｎｍ、４０～２５０ｎｍ、４０～２４０ｎｍ、４０～２３０ｎｍ、４０～２２０ｎｍ、４０～２１０ｎｍ、４０～２００ｎｍ、４０～１９０ｎｍ、４０～１８０ｎｍ、４０～１７０ｎｍ、４０～１６０ｎｍ、４０～１５０ｎｍ、４０～１４０ｎｍ、４０～１３０ｎｍ、４０～１２０ｎｍ、４０～１１０ｎｍ、４０～１００ｎｍ、４０～９０ｎｍ、４０～８０ｎｍ、４０～７０ｎｍ、４０～６０ｎｍ、４０～５０ｎｍ、５０～３００ｎｍ、５０～２９０ｎｍ、５０～２８０ｎｍ、５０～２７０ｎｍ、５０～２６０ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、５０～２４０ｎｍ、５０～２３０ｎｍ、５０～２２０ｎｍ、５０～２１０ｎｍ、５０～２００ｎｍ、５０～１９０ｎｍ、５０～１８０ｎｍ、５０～１７０ｎｍ、５０～１６０ｎｍ、５０～１５０ｎｍ、５０～１４０ｎｍ、５０～１３０ｎｍ、５０～１２０ｎｍ、５０～１１０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、５０～９０ｎｍ、５０～８０ｎｍ、５０～７０ｎｍ、５０～６０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２９０ｎｍ、６０～２８０ｎｍ、６０～２７０ｎｍ、６０～２６０ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、６０～２４０ｎｍ、６０～２３０ｎｍ、６０～２２０ｎｍ、６０～２１０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、６０～１９０ｎｍ、６０～１８０ｎｍ、６０～１７０ｎｍ、６０～１６０ｎｍ、６０～１５０ｎｍ、６０～１４０ｎｍ、６０～１３０ｎｍ、６０～１２０ｎｍ、６０～１１０ｎｍ、６０～１００ｎｍ、６０～９０ｎｍ、６０～８０ｎｍ、６０～７０ｎｍ、７０～３００ｎｍ、７０～２９０ｎｍ、７０～２８０ｎｍ、７０～２７０ｎｍ、７０～２６０ｎｍ、７０～２５０ｎｍ、７０～２４０ｎｍ、７０～２３０ｎｍ、７０～２２０ｎｍ、７０～２１０ｎｍ、７０～２００ｎｍ、７０～１９０ｎｍ、７０～１８０ｎｍ、７０～１７０ｎｍ、７０～１６０ｎｍ、７０～１５０ｎｍ、７０～１４０ｎｍ、７０～１３０ｎｍ、７０～１２０ｎｍ、７０～１１０ｎｍ、７０～１００ｎｍ、７０～９０ｎｍ、７０～８０ｎｍ、８０～３００ｎｍ、８０～２９０ｎｍ、８０～２８０ｎｍ、８０～２７０ｎｍ、８０～２６０ｎｍ、８０～２５０ｎｍ、８０～２４０ｎｍ、８０～２３０ｎｍ、８０～２２０ｎｍ、８０～２１０ｎｍ、８０～２００ｎｍ、８０～１９０ｎｍ、８０～１８０ｎｍ、８０～１７０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、８０～１５０ｎｍ、８０～１４０ｎｍ、８０～１３０ｎｍ、８０～１２０ｎｍ、８０～１１０ｎｍ、８０～１００ｎｍ、８０～９０ｎｍ、９０～３００ｎｍ、９０～２９０ｎｍ、９０～２８０ｎｍ、９０～２７０ｎｍ、９０～２６０ｎｍ、９０～２５０ｎｍ、９０～２４０ｎｍ、９０～２３０ｎｍ、９０～２２０ｎｍ、９０～２１０ｎｍ、９０～２００ｎｍ、９０～１９０ｎｍ、９０～１８０ｎｍ、９０～１７０ｎｍ、９０～１６０ｎｍ、９０～１５０ｎｍ、９０～１４０ｎｍ、９０～１３０ｎｍ、９０～１２０ｎｍ、９０～１１０ｎｍ、９０～１００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１１０～２９０ｎｍ、１２０～２８０ｎｍ、１３０～２７０ｎｍ、１４０～２６０ｎｍ、１５０～２５０ｎｍ、１６０～２４０ｎｍ、１７０～２３０ｎｍ、１８０～２２０ｎｍ、または１９０～２１０ｎｍの直径を有する。本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソームのサイズは、以下に記載される方法により測定され得る。

【0261】

幾つかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、内部（内腔）表面及び外部表面を含む二重脂質膜（「ＥＶ、例えば、エキソソームの膜」）を含む。ある種の態様では、内部（内腔）表面は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内核（すなわち、内腔）に面する。ある種の態様では、外部表面は、産生細胞または標的細胞のエンドソーム、多胞体、または膜／細胞質と接触し得る。

【0262】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜は、脂質及び脂肪酸を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。

【0263】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜は、内葉及び外葉を含む。内葉及び外葉の組成は、当該技術分野において公知の二重層内分布アッセイにより決定され得る。例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照のこと。幾つかの態様では、外葉の組成は、約７０～９０％のコリンリン脂質、約０～１５％の酸性リン脂質、及び約５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。幾つかの態様では、内葉の組成は、約１５～４０％のコリンリン脂質、約１０～５０％の酸性リン脂質、及び約３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。

【0264】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの膜は、１種以上の多糖、例えば、グリカンを含む。

【0265】

幾つかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、ＡＳＯを含み、ここで、当該ＡＳＯは、ＥＶの外部表面またはＥＶの内腔表面のいずれかで足場部分を介してＥＶに連結される。

【0266】

幾つかの態様では、ＡＳＯを含むＥＶ、例えば、エキソソームは、ＡＳＯとエキソソーム膜との間のリンカーを任意に含むアンカー部分を含む。リンカーの非限定的な例は、本明細書の他箇所で開示される。

【0267】

ＩＩＩ．Ａ．アンカー部分（ＡＭ）
ＡＳＯを本開示のＥＶに係留するために、１種以上のアンカー部分（ＡＭ）が使用され得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、アンカー部分に直接的に、またはリンカーを介して連結される。幾つかの態様では、ＡＳＯは、「反応性基」（ＲＧ；例えば、アミン、チオール、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアジド）と「反応性部分」（ＲＭ；例えば、マレイミド、コハク酸、ＮＨＳ）との間の反応によりアンカー部分またはリンカーの組み合わせに結合され得る。幾つかの可能な合成経路、例えば、以下が想定される：
［ＡＭ］－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ＡＳＯ］

【0268】

アンカー部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームの脂質二重層に挿入され得、これにより、エキソソームへのＡＳＯのローディングが可能となる。現在、極性のＡＳＯの送達媒体としてのエキソソームの商業化における主な障害は、非常に非効率的なローディングである。この障害は、エキソソームにＡＳＯをロードする前に、極性のＡＳＯを修飾することにより克服され得る。従って、本明細書に記載されるように、ＡＳＯの修飾は、エキソソームへのそれらのローディングを促進する。

【0269】

本明細書に記載される修飾された極性のＡＳＯをエキソソームにロードする方法は、例えば、エレクトロポレーションまたはカチオン脂質形質移入による未修飾のＡＳＯのエキソソームへの導入について以前に報告されたローディング効率と比較して、ローディング効率を大幅に改善する。

【0270】

幾つかの態様では、修飾は、ＡＳＯの疎水性を天然（未修飾）のＡＳＯと比較して少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加させる。幾つかの態様では、修飾は、ＡＳＯの疎水性を天然（未修飾）のＡＳＯと比較して少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、または少なくとも約１０桁増加させる。

【0271】

幾つかの態様では、修飾は、ＡＳＯの疎水性を天然（未修飾）のＡＳＯ、例えば、対応する未修飾ＡＳＯと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％増加させる。疎水性の増加は、任意の好適な方法を使用して評価され得る。例えば、疎水性は、水などの水性溶媒での溶解度と比較したオクタノールなどの有機溶媒での溶解度百分率を測定することにより決定され得る。

【0272】

幾つかの態様では、ＡＳＯの疎水性性質を増強するために、アンカー部分がＡＳＯに化学的にコンジュゲートされ得る。代表的な態様では、アンカー部分は、ステロール（例えば、コレステロール）、ＧＭ１、脂質、ビタミン、低分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせである。幾つかの態様では、部分は、脂質である。幾つかの態様では、アンカー部分は、ステロール、例えば、コレステロールである。追加の疎水性部分としては、例えば、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、またはビタミン（例えば、ビタミンＤまたはビタミンＥ）が挙げられる。

【0273】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ＡＳＯの末端に直接コンジュゲートされるか、または１つ以上のリンカーを介してコンジュゲートされるかのいずれかである（すなわち、「末端修飾」）。他の態様では、アンカー部分は、ＡＳＯの他の部分にコンジュゲートされる。

【0274】

幾つかの態様では、ＡＳＯは、検出可能な標識を含み得る。例示的な標識としては、蛍光標識及び／または放射性標識が挙げられる。幾つかの態様では、ＡＳＯが蛍光標識される場合、検出可能な標識は、例えば、Ｃｙ３であり得る。ＡＳＯへの検出可能な標識の付加は、エキソソームを標識する方法及びそれらの体内分布を追跡する方法として使用され得る。他の態様では、検出可能な標識は、例えば、エキソソーム脂質及び／またはエキソソームペプチドを標識することによりエキソソームに直接結合され得る。

【0275】

ＡＳＯの異なる構成要素（すなわち、アンカー部分、リンカー及びリンカーの組み合わせ、ならびにＡＳＯ）は、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホロアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホジエステル、もしくはホスホロチオエート結合、または代替的に任意の、もしくは他の結合により連結され得る。

【0276】

幾つかの態様では、ＡＳＯの異なる構成要素は、二官能性リンカー（すなわち、２つの官能基を含有するリンカー）を使用したリンカー、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｓ－（２－ピリジルジチオ）システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、Ｎ－（４－マレイミドブチルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、Ｎ－（５－アミノペンチル）－イミノ二酢酸などであり得る。

【0277】

ＩＩＩ．Ａ．１．アンカー部分
ＡＳＯをＥＶ、例えば、エキソソームの表面に係留することができる好適なアンカー部分は、以下で詳細に記載されるように、例えば、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、または脂溶性ビタミンを含む。

【0278】

幾つかの態様では、アンカー部分は、脂質であり得る。脂質アンカー部分は、当該技術分野において公知の任意の脂質、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。幾つかの態様では、脂質は、脂肪酸、ホスファチド、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルエタノールアミン）、またはその類似体（例えば、ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ケファリン、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの類似体もしくは一部、例えば、それらの部分的に加水分解された部分）である。ある種の態様では、アンカー部分は、コレステロールである。本開示に有用なコレステロール分子の非限定的な例は、図６Ａ及び６Ｂに提供される。幾つかの態様では、アンカー部分は、図６Ａに示すコレステロールである（本明細書において「Ｃｈｏｌ２」とも称される）。幾つかの態様では、アンカー部分は、図６Ｂに示すコレステロールである（本明細書において「Ｃｈｏｌ４」とも称される）。コレステロールアンカー部分に関する追加の開示が以下で更に提供される。

【0279】

通常、アンカー部分は化学的に結合される。しかしながら、アンカー部分は、酵素によりＡＳＯに結合され得る。幾つかの態様では、細胞培養条件の改変によりアンカー部分をＡＳＯに結合させることができる。例えば、ミリスチン酸が制限された培養培地を使用することにより、より短鎖かつ不飽和の脂肪酸が含まれる幾つかの他の脂肪酸がＮ末端グリシンに結合され得る。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリステートが、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニンまたはチロシン残基に翻訳後に結合されることが報告されている。

【0280】

アンカー部分は、化学的に可能な任意の位置で、例えば、ＡＳＯの５’及び／または３’末端で直接的に、またはリンカーの組み合わせを介して間接的にＡＳＯに結合され得る。一態様では、アンカー部分は、ＡＳＯの３’末端のみにコンジュゲートされる。一態様では、アンカー部分は、ＡＳＯの５’末端のみにコンジュゲートされる。一態様では、アンカー部分は、ＡＳＯの３’末端または５’末端でない位置でコンジュゲートされる。

【0281】

本開示の方法を実施するために使用され得る幾つかの種類の膜アンカーが以下の表に掲示される。

【化4】

【0282】

幾つかの態様では、本開示のアンカー部分は、本明細書において開示される２種類以上のアンカー部分を含み得る。例えば、幾つかの態様では、アンカー部分は、まとめると６～８０個の炭素原子（すなわち、６～８０の等価炭素数（ＥＣＮ））を有する２種の脂質、例えば、リン脂質及び脂肪酸、または２種のリン脂質、または２種の脂肪酸、または脂質及びビタミン、またはコレステロール及びビタミンなど、を含み得る。

【0283】

幾つかの態様では、アンカー部分の組み合わせ、例えば、脂質（例えば、脂肪酸）の組み合わせは、６～８０、８～８０、１０～８０、１２～８０、１４～８０、１６～８０、１８～８０、２０～８０、２２～８０、２４～８０、２６～８０、２８～８０、３０～８０、４～７６、６～７６、８～７６、１０～７６、１２～７６、１４～７６、１６～７６、１８～７６、２０～７６、２２～７６、２４～７６、２６～７６、２８～７６、３０～７６、６～７２、８～７２、１０～７２、１２～７２、１４～７２、１６～７２、１８～７２、２０～７２、２２～７２、２４～７２、２６～７２、２８～７２、３０～７２、６～６８、８～６８、１０～６８、１２～６８、１４～６８、１６～６８、１８～６８、２０～６８、２２～６８、２４～６８、２６～６８、２８～６８、３０～６８、６～６４、８～６４、１０～６４、１２～６４、１４～６４、１６～６４、１８～６４、２０～６４、２２～６４、２４～６４、２６～６４、２８～６４、３０～６４、６～６０、８～６０、１０～６０、１２～５６、１４～５６、１６～５６、１８～５６、２０～５６、２２～５６、２４～５６、２６～５６、２８～５６、３０～５６、６～５２、８～５２、１０～５２、１２～５２、１４～５２、１６～５２、１８～５２、２０～５２、２２～５２、２４～５２、２６～５２、２８～５２、３０～５２、６～４８、８～４８、１０～４８、１２～４８、１４～４８、１６～４８、１８～４８、２０～４８、２２～４８、２４～４８、２６～４８、２８～４８、３０～４８、６～４４、８～４４、１０～４４、１２～４４、１４～４４、１６～４４、１８～４４、２０～４４、２２～４４、２４～４４、２６～４４、２８～４４、３０～４４、６～４０、８～４０、１０～４０、１２～４０、１４～４０、１６～４０、１８～４０、２０～４０、２２～４０、２４～４０、２６～４０、２８～４０、３０～４０、６～３６、８～３６、１０～３６、１２～３６、１４～３６、１６～３６、１８～３６、２０～３６、２２～３６、２４～３６、２６～３６、２８～３６、３０～３６、６～３２、８～３２、１０～３２、１２～３２、１４～３２、１６～３２、１８～３２、２０～３２、２２～３２、２４～３２、２６～３２、２８～３２、または３０～３２のＥＣＮを有する。

【0284】

ＩＩＩ．Ａ．１．ａ．コレステロール及び他のステロール
幾つかの態様では、アンカー部分は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、水酸化ステロイド、セコステロイド、または親油性を有するそれらの類似体を含む。幾つかの態様では、アンカー部分は、ステロール、例えば、植物ステロール、菌類ステロール、または動物ステロールを含む。例示的な動物ステロールとしては、コレステロール及び２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールが挙げられる。例示的な植物ステロールとしては、エルゴステロール（菌類ステロール）、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが挙げられる。幾つかの態様では、ステロールは、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、またはスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化されたステロール（ステロールエステル）、アルキル化されたステロール（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化されたステロール（硫酸ステロール）、またはグリコシド部分に連結されたステロール（ステリルグリコシド）のいずれかとして見出され得、グリコシド部分に連結されたステロールは、それ自体がアシル化され得る（アシル化ステロールグリコシド）。

【0285】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ステロイドを含む。幾つかの態様では、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘコゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン、プロゲステロン、またはコルチゾールから選択される。

【0286】

例えば、ステロールは、ステロールの利用可能な－ＯＨ基でＡＳＯに直接的に、またはリンカーの組み合わせを介してコンジュゲートされ得る。例示的なステロールは、以下に示される一般的な骨格を有する：

【化5】

【0287】

更なる例として、エルゴステロールは、以下の構造を有する：

【化6】

【0288】

コレステロールは、以下の構造を有する：

【化7】

【0289】

従って、幾つかの態様では、ステロールまたはステロイドの遊離－ＯＨ基は、ＡＳＯを当該ステロール（例えば、コレステロール）またはステロイドに直接的に、またはリンカーの組み合わせを介してコンジュゲートするために使用される。

【0290】

ＩＩＩ．Ａ．１．ｂ．脂肪酸
幾つかの態様では、アンカー部分は、脂肪酸である。幾つかの態様では、脂肪酸は、短鎖、中鎖、または長鎖脂肪酸である。幾つかの態様では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。幾つかの態様では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。幾つかの態様では、脂肪酸は、一不飽和脂肪酸である。幾つかの態様では、脂肪酸は、多価不飽和脂肪酸、例えば、ω－３（オメガ－３）またはω－６（オメガ－６）脂肪酸である。

【0291】

幾つかの態様では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_６０鎖を有する。幾つかの態様では、脂質、例えば、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_２８鎖を有する。幾つかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_４０鎖を有する。幾つかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_２～Ｃ_１２鎖またはＣ_４～Ｃ_１２鎖を有する。幾つかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_４～Ｃ_４０鎖を有する。幾つかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_４～Ｃ_４０、Ｃ_２～Ｃ_３８、Ｃ_２～Ｃ_３６、Ｃ_２～Ｃ_３４、Ｃ_２～Ｃ_３２、Ｃ_２～Ｃ_３０、Ｃ_４～Ｃ_３０、Ｃ_２～Ｃ_２８、Ｃ_４～Ｃ_２８、Ｃ_２～Ｃ_２６、Ｃ_４～Ｃ_２６、Ｃ_２～Ｃ_２４、Ｃ_４～Ｃ_２４、Ｃ_６～Ｃ_２４、Ｃ_８～Ｃ_２４、Ｃ_１０～Ｃ_２４、Ｃ_２～Ｃ_２２、Ｃ_４～Ｃ_２２、Ｃ_６～Ｃ_２２、Ｃ_８～Ｃ_２２、Ｃ_１０～Ｃ_２２、Ｃ_２～Ｃ_２０、Ｃ_４～Ｃ_２０、Ｃ_６～Ｃ_２０、Ｃ_８～Ｃ_２０、Ｃ_１０～Ｃ_２０、Ｃ_２～Ｃ_１８、Ｃ_４～Ｃ_１８、Ｃ_６～Ｃ_１８、Ｃ_８～Ｃ_１８、Ｃ_１０～Ｃ_１８、Ｃ_１２～Ｃ_１８、Ｃ_１４～Ｃ_１８、Ｃ_１６～Ｃ_１８、Ｃ_２～Ｃ_１６、Ｃ_４～Ｃ_１６、Ｃ_６～Ｃ_１６、Ｃ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１６、Ｃ_１２～Ｃ_１６、Ｃ_１４～Ｃ_１６、Ｃ_２～Ｃ_１５、Ｃ_４～Ｃ_１５、Ｃ_６～Ｃ_１５、Ｃ_８～Ｃ_１５、Ｃ_９～Ｃ_１５、Ｃ_１０～Ｃ_１５、Ｃ_１１～Ｃ_１５、Ｃ_１２～Ｃ_１５、Ｃ_１３～Ｃ_１５、Ｃ_２～Ｃ_１４、Ｃ_４～Ｃ_１４、Ｃ_６～Ｃ_１４、Ｃ_８～Ｃ_１４、Ｃ_９～Ｃ_１４、Ｃ_１０～Ｃ_１４、Ｃ_１１～Ｃ_１４、Ｃ_１２～Ｃ_１４、Ｃ_２～Ｃ_１３、Ｃ_４～Ｃ_１３、Ｃ_６～Ｃ_１３、Ｃ_７～Ｃ_１３、Ｃ_８～Ｃ_１３、Ｃ_９～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１１～Ｃ_１３、Ｃ_２～Ｃ_１２、Ｃ_４～Ｃ_１２、Ｃ_６～Ｃ_１２、Ｃ_７～Ｃ_１２、Ｃ_８～Ｃ_１２、Ｃ_９～Ｃ_１２、Ｃ_１０～Ｃ_１２、Ｃ_２～Ｃ_１１、Ｃ_４～Ｃ_１１、Ｃ_６～Ｃ_１１、Ｃ_７～Ｃ_１１、Ｃ_８～Ｃ_１１、Ｃ_９～Ｃ_１１、Ｃ_２～Ｃ_１０、Ｃ_４～Ｃ_１０、Ｃ_２～Ｃ_９、Ｃ_４～Ｃ_９、Ｃ_２～Ｃ_８、Ｃ_２～Ｃ_７、Ｃ_４～Ｃ_７、Ｃ_２～Ｃ_６、またはＣ_４～Ｃ_６鎖を有する。幾つかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０、Ｃ_２１、Ｃ_２２、Ｃ_２３、Ｃ_２４、Ｃ_２５、Ｃ_２６、Ｃ_２７、Ｃ_２８、Ｃ_２９、Ｃ_３０、Ｃ_３１、Ｃ_３２、Ｃ_３３、Ｃ_３４、Ｃ_３５、Ｃ_３６、Ｃ_３７、Ｃ_３８、Ｃ_３９、Ｃ_４０、Ｃ_４１、Ｃ_４２、Ｃ_４３、Ｃ_４４、Ｃ_４５、Ｃ_４６、Ｃ_４７、Ｃ_４８、Ｃ_４９、Ｃ_５０、Ｃ_５１、Ｃ_５２、Ｃ_５３、Ｃ_５４、Ｃ_５５、Ｃ_５６、Ｃ_５７、Ｃ_５８、Ｃ_５９、またはＣ_６０鎖を有する。

【0292】

幾つかの態様では、アンカー部分は、２つの脂肪酸を含み、これらの各々は、前述の範囲または炭素原子数のいずれか１つを有する鎖を有する脂肪酸から独立して選択される。幾つかの態様では、脂肪酸のうちの一方は、独立してＣ６～Ｃ２１鎖を有する脂肪酸であり、一方は、独立してＣ１２～Ｃ３６鎖を有する脂肪酸である。幾つかの態様では、各脂肪酸は、独立して、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個の炭素原子の鎖を有する。

【0293】

好適な脂肪酸としては、飽和直鎖脂肪酸、飽和分枝脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、及びポリカルボン酸が挙げられる。幾つかの態様では、かかる脂肪酸は、最高３２個の炭素原子を有する。

【0294】

有用な飽和直鎖脂肪酸の例としては、偶数の炭素原子を有するもの、例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸、及びｎ－ドトリアコンタン酸、ならびに奇数の炭素原子を有するもの、例えば、プロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ウンデカン酸（ｈｅｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘンエイコサン酸．トリコサン酸、ペンタコサン酸、及びヘプタコサン酸が挙げられる。

【0295】

好適な飽和分枝脂肪酸の例としては、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリル酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルステアリン酸（１７－ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、イソアラキン酸、１９－メチル－エイコサン酸、α－エチル－ヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、及びファインオキソコール１８００酸（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．の製品）が挙げられる。好適な飽和奇数炭素分枝脂肪酸としては、イソブチル基で終わるアンテイソ脂肪酸、例えば、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチル－ステアリン酸（１６－ｍｅｔｈｙｌ－ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、１８－メチル－エイコサン酸、２０－メチル－ドコサン酸、２２－メチル－テトラコサン酸、２４－メチル－ヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸が挙げられる。

【0296】

好適な不飽和脂肪酸の例としては、４－デセン酸、カプロレイン酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトオレイン酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、シス－１１－エイコセン酸、セトレイン酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、プニカ酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。

【0297】

好適なヒドロキシ脂肪酸の例としては、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－ｔｒａｎｓ－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロリン酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。

【0298】

好適なポリカルボン酸の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸などが挙げられる。

【0299】

幾つかの態様では、各脂肪酸は、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラッセル酸、プシリン酸、ゲダ酸、セロプラスチン酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンタン酸、またはオクタトリアコンタン酸から独立して選択される。

【0300】

幾つかの態様では、各脂肪酸は、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、γ－リノール酸、ジホモ－γ－リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトオレイン酸、バクセン酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ゴンドイック酸、エルカ酸、ネルボン酸、ミード酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド酸、イワシ酸、ニシン酸、ドコサヘキサエン酸、もしくはテトラコサノールペンタエン酸、または別の一不飽和もしくは多価不飽和脂肪酸から独立して選択される。

【0301】

幾つかの態様では、脂肪酸のうちの一方または両方が必須脂肪酸である。ある種の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮して、開示される治療薬がロードされたエキソソームの治療効果は、かかる脂肪酸を治療薬に含めることにより増加し得る。幾つかの態様では、必須脂肪酸は、リノレン酸、γ－リノレン酸、ジホモ－γ－リノレン酸、アラキドン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸（ｎ－６）、α－リノレン酸、ステアリドン酸、２０：４ｎ－３酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸（ｎ－３）、またはドコサヘキサエン酸からなる群から選択されるｎ－６またはｎ－３必須脂肪酸である。

【0302】

幾つかの態様では、各脂肪酸は、ａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、またはリポ酸から独立して選択される。他の態様では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。脂肪酸の他の例としては、ａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸（ＡＬＡまたはａｌｌ－ｃｉｓ－９，１２，１５－オクタデカトリエン酸）、ステアリドン酸（ＳＴＤまたはａｌｌ－ｃｉｓ－６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥまたはａｌｌ－ｃｉｓ－１１，１４，１７－エイコサトリエン酸）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡまたはａｌｌ－ｃｉｓ－８，１１，１４，１７－エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸、またはａｌｌ－ｃｉｓ－７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたはａｌｌ－ｃｉｓ－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸）、テトラコサペンタエン酸（ａｌｌ－ｃｉｓ－９，１２，１５，１８，２１－ドコサヘキサエン酸）、またはテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸またはａｌｌ－ｃｉｓ－６，９，１２，１５，１８，２１－テトラコセン酸）が挙げられる。幾つかの態様では、脂肪酸は、リポ酸などの中鎖脂肪酸である。

【0303】

脂肪酸鎖は、それらの鎖の長さが大きく異なり、例えば、短鎖～超長鎖のように、鎖長により分類され得る。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、約５個以下の炭素の鎖を有する脂肪酸である（例えば、酪酸）。幾つかの態様では、脂肪酸は、ＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）としては、中鎖トリグリセリドを形成し得る約６～１２個の炭素の鎖を有する脂肪酸が挙げられる。幾つかの態様では、脂肪酸は、ＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）としては、１３～２１個の炭素の鎖を有する脂肪酸が挙げられる。幾つかの態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。幾つかの態様では、脂肪酸は、ＬＣＦＡである。超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）としては、２２個以上の炭素、例えば、２２～６０個、２２～５０個、または２２～４０個の炭素の鎖を有する脂肪酸が挙げられる。幾つかの態様では、脂肪酸は、ＶＬＣＦＡである。

【0304】

ＩＩＩ．Ａ．１．ｃ．リン脂質
幾つかの態様では、アンカー部分は、リン脂質を含む。リン脂質は、全ての細胞膜の主要成分である脂質の種類である。それらは、両親媒性の特徴のために脂質二重層を形成することができる。リン脂質分子の構造は、通常、２本の疎水性脂肪酸の「尾部」及びリン酸基からなる親水性の「頭部」からなる。例えば、リン脂質は、以下の式による脂質であり得る：

【化8】

式中、Ｒ_ｐは、リン脂質部分を表し、Ｒ_１及びＲ_２は、同一であっても異なっていてもよい不飽和を有するか、または有さない脂肪酸部分を表す。

【0305】

リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。

【0306】

特定のリン脂質は、脂質二重層、例えば、エキソソーム膜の脂質二重層への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜の１種以上の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合は、脂質を含有する組成物の１種以上の要素が当該膜に結合するか、または当該膜を貫通するのを可能にし得る。

【0307】

脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。

【0308】

本開示においてアンカー部分として使用するリン脂質は、天然または非天然リン脂質であり得る。分枝形成、酸化、環化、及びアルキンが含まれる修飾及び置換を有する天然種が含まれる非天然リン脂質種も意図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合と置き換えられているアルケニル基）によって官能化され得るか、またはそれに架橋され得る。アルキン基は、適切な反応条件下でアジドに曝露にされると銅触媒環化付加を起こし得る。

【0309】

リン脂質としては、限定されるものではないが、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられる。

【0310】

本明細書において開示されるアンカー部分に使用され得るリン脂質の例としては、以下が挙げられる。
●ホスファチジルエタノールアミン：例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルエタノールアミン、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジエルコイルホスファチジルエタノールアミン；
●ホスファチジルグリセロール：例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルグリセロール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルグリセロール、及びジエルコイルホスファチジルグリセロール；
●ホスファチジルセリン：例えば、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルセリン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルセリン、及びジエルコイルホスファチジルセリン；
●ホスファチジン酸：例えば、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジン酸、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジン酸、及びジエルコイルホスファチジン酸；ならびに
●ホスファチジルイノシトール：例えば、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルイノシトール、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジルイノシトール、及びジエルコイルホスファチジルイノシトール。

【0311】

リン脂質は、対称型または非対称型のものであり得る。本明細書で使用する場合、用語「対称型リン脂質」は、同一の脂肪酸部分及びスフィンゴ脂質を有するグリセロリン脂質を含み、ここで、可変的な脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖は、同等の数の炭素原子を含む。本明細書で使用する場合、用語「非対称型リン脂質」は、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子及び／または不飽和（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）及びスフィンゴ脂質を有するリゾ脂質、グリセロリン脂質を含み、ここで、可変的な脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖は、異なる数の炭素原子を含む（例えば、可変的な脂肪酸部分は、炭化水素鎖より少なくとも２個多くの炭素原子または炭化水素鎖より少なくとも２個少ない炭素原子を含む）。

【0312】

幾つかの態様では、アンカー部分は、少なくとも１種の対称型リン脂質を含む。対称型リン脂質は、以下からなる非限定的な群から選択され得る：
１，２－ジプロピオニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０３：０ ＰＣ）、
１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０４：０ ＰＣ）、
１，２－ジペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０５：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ ＰＣ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ ＰＣ）、
１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ ＰＣ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ ＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ ＰＣ、ＤＵＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ ＰＣ、ＤＭＰＣ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ ＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ ＰＣ、ＤＰＰＣ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（４ＭＥ １６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ ＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）、
１，２－ジノナデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ ＰＣ）、
１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘンアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２１：０ ＰＣ）、
１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２３：０ ＰＣ）、
１，２－ジリグノセロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－Ｔｒａｎｓ）ＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、
１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＡＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（Ｃｉｓ）ＰＣ、ＤＨＡＰＣ）、
１，２－ジネルボノイル（ｄｉｎｅｒｖｏｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（Ｃｉｓ）ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０６：０ ＰＥ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０８：０ ＰＥ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１０：０ ＰＥ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１２：０ ＰＥ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ ＰＥ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１５：０ ＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ ＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１７：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：１ ＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－Ｃｉｓ）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－ｔｒａｎｓ）ＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：２ ＰＥ、ＤＬＰＥ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：３ ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２０：４ ＰＥ、ＤＡＰＥ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２２：６ ＰＥ、ＤＨＡＰＥ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びそれらの任意の組み合わせ。

【0313】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせからなる非限定的な群から選択される少なくとも１種の対称型リン脂質を含む。

【0314】

幾つかの態様では、アンカー部分は、少なくとも１種の非対称型リン脂質を含む。非対称型リン脂質は、以下からなる非限定的な群から選択され得る：
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせ。

【0315】

より顕著なヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み効率、及びより顕著なＲＮＡ干渉効果を得るために、ホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが、アンカー部分として使用され得る。

【0316】

脂質（例えば、リン脂質）及びリンカーの組み合わせまたはＢＡＭ（例えば、ＡＳＯ）の結合部位は、脂質及びリンカーまたはＡＳＯの種類に従って適切に選択され得る。脂質の疎水基以外の任意の位置が、化学結合によりリンカーまたはＡＳＯに連結され得る。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用する場合、連結は、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とリンカーまたはＡＳＯとの間でアミド結合などを形成することによりなされ得る。ホスファチジルグリセロールを使用する場合、連結は、グリセロール残基のヒドロキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間でエステル結合、エーテル結合などを形成することによりなされ得る。ホスファチジルセリンを使用する場合、連結は、セリン残基のアミノ基またはカルボキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間でアミド結合またはエステル結合などを形成することによりなされ得る。ホスファチジン酸を使用する場合、連結は、リン酸残基とリンカーまたはＡＳＯとの間でリン酸エステル結合などを形成することによりなされ得る。ホスファチジルイノシトールを使用する場合、連結は、イノシトール残基のヒドロキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間でエステル結合、エーテル結合などを形成することによりなされ得る。

【0317】

ＩＩＩ．Ａ．１．ｄ．リゾ脂質（例えば、リゾリン脂質）
幾つかの態様では、アンカー部分は、リゾ脂質、例えば、リゾリン脂質を含む。リゾ脂質は、脂肪族アシル鎖のうちの一方または両方が、通常、加水分解により除去された脂質の誘導体である。リゾリン脂質は、脂肪族アシル鎖のうちの一方または両方が加水分解により除去されたリン脂質の誘導体である。

【0318】

幾つかの態様では、アンカー部分は、アシル鎖のうちの一方または両方が加水分解により除去されており、これにより、得られるリゾリン脂質が、１つの脂肪酸アシル鎖を含むか、または脂肪酸アシル鎖を含まない、上記に開示されたリン脂質のいずれかを含む。

【0319】

幾つかの態様では、アンカー部分は、リゾグリセロリン脂質、リゾグリコスフィンゴ脂質、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、またはリゾホスファチジルセリンを含む。

【0320】

幾つかの態様では、アンカー部分は、以下からなる非限定的な群から選択されるリゾ脂質を含む：
１－ヘキサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ リゾＰＣ）、
１－ヘプタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ リゾＰＣ）、
１－オクタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ リゾＰＣ）、
１－ノナノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ リゾＰＣ）、
１－デカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ リゾＰＣ）、
１－ウンデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ リゾＰＣ）、
１－ラウロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ リゾＰＣ）、
１－トリデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ リゾＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ リゾＰＣ）、
１－ペンタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ リゾＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ リゾＰＣ）、
１－ヘプタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ リゾＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ リゾＰＣ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１ リゾＰＣ）、
１－ノナデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ リゾＰＣ）、
１－アラキドイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ リゾＰＣ）、
１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ リゾＰＣ）、
１－リグノセロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ リゾＰＣ）、
１－ヘキサコサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２６：０ リゾＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ リゾＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ リゾＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ リゾＰＥ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ リゾＰＥ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ リゾＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせ。

【0321】

ＩＩＩ．Ａ．１．ｅ．ビタミン
幾つかの態様では、アンカー部分は、親油性ビタミン、例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、またはビタミンＫを含む

【0322】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ビタミンＡを含む。ビタミンＡは、一群の不飽和栄養有機化合物であり、これには、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及び幾つかのプロビタミンＡカロテノイド（とりわけβカロチン）が挙げられる。幾つかの態様では、アンカー部分は、レチノールを含む。幾つかの態様では、アンカー部分は、レチノイドを含む。レチノイドは、ビタミンＡのビタマーであるか、またはビタミンＡに化学的に関連する化合物のクラスである。幾つかの態様では、アンカー部分は、第一世代レチノイド（例えば、レチノール、トレチノイン、イソトレチノイン（ｉｓｏｔｒｅａｔｉｎｏｉｎ）、またはアリトレチノイン）、第二世代レチノイド（例えば、エトレチナートまたはアシトレチン）、第三世代レチノイド（例えば、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、ベキサロテン、またはタザロテン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【化9】

【0323】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ビタミンＥを含む。トコフェロールは、メチル化フェノールのクラスであり、それらの多くがビタミンＥ活性を有する。従って、幾つかの態様では、アンカー部分は、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、δ－トコフェロール、またはそれらの組み合わせを含む。

【化10】

【0324】

トコトリエノールもビタミンＥ活性を有する。トコトリエノールとトコフェロールとの間の重要な化学的構造差は、トコフェロールが飽和側鎖を有するのに対して、トコトリエノールが３つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和イソプレノイド側鎖を有することである。幾つかの態様では、アンカー部分は、α－トコトリエノール、β－トコトリエノール、γ－トコトリエノール、δ－トコトリエノール、またはそれらの組み合わせを含む。トコトリエノールは、以下の式により表され得る：

【化11】

【0325】

幾つかの態様では、アンカー部分は、ビタミンＫを含む。化学的にビタミンＫファミリーは、２－メチル－１，４－ナフトキノン（３－）誘導体を含む。ビタミンＫとしては、２つの天然ビタマー：ビタミンＫ_１及びビタミンＫ_２が挙げられる。ビタミンＫ_１（フィトナジオン、フィロキノン、または（Ｅ）－フィトナジオンとしても公知）の構造は、フィチル基の存在により特徴付けられる。ビタミンＫ_２（メナキノン）の構造は、分子に存在する、６～１３のイソプレニル単位を含有し得るポリイソプレニル側鎖により特徴付けられる。従って、ビタミンＫ_２は、イソプレノイド基の原子からできている異なる長さの炭素側鎖を有する多数の関連する化学的サブタイプからなる。ＭＫ－４は、最も一般的な種類のビタミンＫ_２である。長鎖型、例えば、ＭＫ－７、ＭＫ－８、及びＭＫ－９は、主に発酵食品に含まれる。より長鎖型のビタミンＫ_２、例えば、ＭＫ－１０～ＭＫ－１３は、細菌により合成されるが、それらは吸収されにくく、ほとんど生物学的機能を有さない。天然形のビタミンＫに加えて、多数の合成型のビタミンＫ、例えば、ビタミンＫ_３（メナジオン；２－メチルナフタレン－１，４－ジオン）、ビタミンＫ_４、及びビタミンＫ_５が存在する。

【0326】

従って、幾つかの態様では、アンカー部分は、ビタミンＫ_１、Ｋ_２（例えば、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６、ＭＫ－７、ＭＫ－８、ＭＫ－９、ＭＫ－１０、ＭＫ－１１、ＭＫ－１２、またはＭＫ－１３）、Ｋ_３、Ｋ_４、Ｋ_５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【化12】

【0327】

ＩＶ．Ａ．２．リンカー組み合わせ
幾つかの態様では、ＡＳＯは、切断可能なリンカー及び／または切断可能でないリンカーの任意の組み合わせを含み得るリンカー組み合わせを介して本明細書において開示される疎水性膜アンカー部分に連結される。リンカー組み合わせの主な機能は、アンカー部分または複数のアンカー部分とＢＡＭ標的との間に最適な間隔を提供することである。例えば、ＡＳＯの場合、リンカー組み合わせは、立体障害を低減し、ＡＳＯが標的核酸、例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと相互作用できるように、ＡＳＯを配置するはずである。

【0328】

リンカーは、切断に感受性で有り得（「切断可能なリンカー」）、これにより、生物活性分子の放出を容易にする。従って、幾つかの態様では、本明細書において開示されるリンカー組み合わせは、切断可能なリンカーを含み得る。かかる切断可能なリンカーは、生物活性分子が活性を維持する条件で、例えば、酸により誘発される切断、光誘発性切断、ペプチダーゼにより誘発される切断、エステラーゼにより誘発される切断、及びジスルフィド結合切断に感受性であり得る。あるいは、リンカーは、切断に対して実質的に耐性を示し得る（「切断可能でないリンカー」）。幾つかの態様では、切断可能なリンカーは、スペーサーを含む。幾つかの態様では、スペーサーは、ＰＥＧである。

【0329】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、本明細書において開示される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは、または少なくとも６つ以上の異なるリンカーを含む。幾つかの態様では、リンカー組み合わせにおけるリンカーは、エステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）により連結され得る。

【0330】

幾つかの態様では、リンカーは、アンカー部分とＢＡＭ（例えば、ＡＳＯ）との間の直接的結合である。

【0331】

ＩＩＩ．Ａ．２．ａ．切断可能でないリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、「切断可能でないリンカー」を含む。「切断可能でないリンカーは、本開示の改変された生物活性分子の２つ以上の構成要素（例えば、生物活性分子及びアンカー部分；生物活性分子及び切断可能なリンカー；アンカー部分及び切断可能なリンカー）を安定した共有結合により連結することができる任意の化学部分であり、切断可能なリンカーの上記の分類に入らない。従って、切断可能でないリンカーは、酸により誘発される切断、光誘発性切断、ペプチダーゼにより誘発される切断、エステラーゼにより誘発される切断、及びジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性を示す。

【0332】

更に、切断可能でないとは、リンカーにおける化学結合またはリンカーに隣接する化学結合が、環状ジヌクレオチド及び／または抗体がその活性を消失しない条件で酸、感光性の切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化合物もしくは生理学的化合物により誘発される切断に耐える能力を指す。幾つかの態様では、生物活性分子は、別のリンカー、例えば、自壊性リンカーを介してリンカーに結合される。

【0333】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む切断可能でないリンカーを含む。幾つかの態様では、切断可能でないリンカーは、生物活性分子を切断可能でないリンカーに連結するためのスペーサー単位を含む。

【0334】

幾つかの態様では、１つ以上の切断可能でないリンカーは、互いに連結されたより小さな単位（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、Ｃ２～Ｃ１２アルキルなど）を含む。一態様では、連結は、エステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）または他の連結である。

【0335】

ＩＩＩ．Ａ．２．ｂ．エチレングリコール（ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ）
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、切断可能でないリンカーを含み、ここで、当該切断可能でないリンカーは、式：Ｒ^３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－またはＲ^３－（０－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－を特徴とするポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、Ｒ^３は、水素、メチル、またはエチルであり、ｎは、２～２００の値を有する。幾つかの態様では、切断可能なリンカーは、スペーサーを含む。幾つかの態様では、スペーサーは、ＰＥＧである。

【0336】

幾つかの態様では、ＰＥＧリンカーは、オリゴエチレングリコール、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、またはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーである。

【0337】

幾つかの態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0338】

幾つかの態様では、ｎは、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。

【0339】

幾つかの特定の態様では、ｎは、３～２００、３～２０、１０～３０、または９～４５の値を有する。

【0340】

幾つかの態様では、ＰＥＧは、分枝鎖ＰＥＧである。分枝鎖ＰＥＧは、中心コア基から延びる３～１０本のＰＥＧ鎖を有する。

【0341】

ある種の態様では、ＰＥＧ部分は、単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈において、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の既定の鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは、通常、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離により生成される。特定の式において、単分散ＰＥＧ部分は、略語ｍｄＰＥＧを割り当てられる。

【0342】

幾つかの態様では、ＰＥＧは、Ｓｔａｒ ＰＥＧである。Ｓｔａｒ ＰＥＧは、中心コア基から延びる１０～１００本のＰＥＧ鎖を有する。

【0343】

幾つかの態様では、ＰＥＧは、Ｃｏｍｂ ＰＥＧである。Ｃｏｍｂ ＰＥＧは、通常、ポリマー主鎖上に接ぎ木された複数のＰＥＧ鎖を有する。

【0344】

ある種の態様では、ＰＥＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、具体的には１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的には約１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある種の態様では、ＰＥＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、具体的には３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的には約４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0345】

幾つかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_１００、ＰＥＧ_２００、ＰＥＧ_３００、ＰＥＧ_４００、ＰＥＧ_５００、ＰＥＧ_６００、ＰＥＧ_７００、ＰＥＧ_８００、ＰＥＧ_９００、ＰＥＧ_１０００、ＰＥＧ_１１００、ＰＥＧ_１２００、ＰＥＧ_１３００、ＰＥＧ_１４００、ＰＥＧ_１５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_２６００、ＰＥＧ_２７００、ＰＥＧ_２８００、ＰＥＧ_２９００、またはＰＥＧ_３０００である。特定の一態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_４００である。別の特定の態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_２０００である。

【0346】

幾つかの態様では、本開示のリンカー組み合わせは、幾つかのＰＥＧリンカー、例えば、ＰＥＧ、ＨＥＧ、またはＴＥＧリンカーに挟まれた切断可能なリンカーを含み得る。

【0347】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、（ＨＥＧ）ｎ及び／または（ＴＥＧ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して連結されている。

【0348】

ＩＩＩ．Ａ．２．ｃ．グリセロール及びポリグリセロール（ＰＧ）
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、グリセロール単位、または式（（Ｒ_３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ３は、水素、メチル、またはエチルであり、ｎは、３～２００の値を有するポリグリセロール（ＰＧ）を含む切断可能でないリンカーを含む。幾つかの態様では、ｎは、３～２０の値を有する。幾つかの態様では、ｎは、１０～３０の値を有する。

【0349】

幾つかの態様では、ＰＧリンカーは、ジグリセリン、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、またはヘキサグリセロール（ＨＧ）リンカーである。

【0350】

幾つかの態様では、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0351】

幾つかの態様では、ｎは、２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。

【0352】

これらの態様の幾つかの代替例では、ｎは、９～４５の値を有する。幾つかの態様では、異種部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^５が水素である分枝鎖状ポリグリセロールまたは式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル、またはエチルである。幾つかの態様では、異種部分は、式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^５が水素である超分岐ポリグリセロール、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^６－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^６が水素であるグリセロール鎖、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^７－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現され、Ｒ^７が水素であるグリセロール鎖、または式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）で表現される直鎖状グリセロール鎖であり、Ｒ^３は、水素、メチル、またはエチルである。超分岐グリセロール及びその合成方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１－５４７９；Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０） Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４３，１２９－４１、及びその中で引用される参考文献に記載されている。

【0353】

ある種の態様では、ＰＧは、１００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、具体的には１００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的には約１００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。ある種の態様では、ＰＧは、２００ｇ／ｍｏｌ～３０００ｇ／ｍｏｌ、具体的には３００ｇ／ｍｏｌ～２５００ｇ／ｍｏｌ、より具体的には約４００ｇ／ｍｏｌ～２０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する。

【0354】

幾つかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_１００、ＰＧ_２００、ＰＧ_３００、ＰＧ_４００、ＰＧ_５００、ＰＧ_６００、ＰＧ_７００、ＰＧ_８００、ＰＧ_９００、ＰＧ_１０００、ＰＧ_１１００、ＰＧ_１２００、ＰＧ_１３００、ＰＧ_１４００、ＰＧ_１５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_２６００、ＰＧ_２７００、ＰＧ_２８００、ＰＧ_２９００、またはＰＧ_３０００である。特定の一態様では、ＰＧは、ＰＧ_４００である。別の特定の態様では、ＰＧは、ＰＧ_２０００である。

【0355】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、（グリセロール）ｎ、及び／または（ＨＧ）ｎ、及び／または（ＴＧ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して連結されている。

【0356】

ＩＩＩ．Ａ．２．ｄ．脂肪族（アルキル）リンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、少なくとも１つの脂肪族（アルキル）リンカー、例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、またはＣ２～Ｃ１２アルキル、例えば、Ｃ２～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ６アルキルを含む。

【0357】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、アルキル鎖、例えば、非置換アルキルを含む。幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルレイルアルケニル（ａｌｋｅｎｙｌ Ｒｅｙｌ ａｌｋｅｎｙｌ）、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、またはアルケニルヘテロシクリルアルキニルを含む。

【0358】

これらの構成要素は、任意に置換される。置換基としては、アルコール、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ）、直鎖または分枝鎖アルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ１２アルキル）、アミン、アミノアルキル（例えば、アミノＣ１～Ｃ１２アルキル）、ホスホラミダイト、ホスフェート、ホスホロアミダート、ホスホロジチオエート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）、アミド、アルキルアミド（例えば、アミドＣ１～Ｃ１２アルキル）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハライド、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミド酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート（ｈａｌｏｆｏｒｍａｔｅ）、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アルキルスルホネート、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース）、α，β－不飽和カルボニル、アルキル水銀化合物、またはα，β－不飽和スルホンが挙げられる。

【0359】

用語「アルキル」は、特に明記しない限り、単独で、または別の置換基の一部として、指定の炭素原子数（例えば、Ｃ_１～Ｃ_１０は、１～１０個の炭素原子を意味する）を有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを意味する。典型的には、アルキル基は、１～２４個の炭素原子を有し、例えば、１～１０個の炭素原子、１～８個の炭素原子、または１～６個の炭素原子を有する。「低級アルキル」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキル基である。用語「アルキル」は、二価及び多価ラジカルを含む。例えば、用語「アルキル」は、適切な場合、例えば、式が、アルキル基が二価であることを示す場合、または置換基が連結されて、環を形成する場合、「アルキレン」を含む。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、及びｎ－オクチルのホモログ及びアイソマーが挙げられる。

【0360】

用語「アルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、二価の（ジラジカル）アルキル基を意味し、ここで、アルキルは本明細書において定義される。「アルキレン」は、限定されるものではないが、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－により例示される。典型的には、「アルキレン」基は、１～２４個の炭素原子を有し、例えば、１０個以下の炭素原子（例えば、１～８または１～６個の炭素原子）を有する。「低級アルキレン」基は、１～４個の炭素原子を有するアルキレン基である。

【0361】

用語「アルケニル」は、単独で、または別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルケニル基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する。一態様では、アルケニル基は、２～８個の炭素原子または２～６個の炭素原子及び１～３つの二重結合を有する。例示的なアルケニル基としては、ビニル、２－プロペニル、１－ブタ－３－エニル、クロチル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、２－イソペンテニル、１－ペント－３－エニル、１－ヘキサ－５－エニルなどが挙げられる。

【0362】

用語「アルキニル」は、単独で、または別の置換基の一部として、２～２４個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖または分枝鎖の不飽和またはポリ不飽和炭化水素ラジカルを指す。典型的な「アルキニル」基は、２～１０個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。本開示の一態様では、アルキニル基は、２～６個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。例示的なアルキニル基としては、プロパ－１－イニル、プロパ－２－イニル（すなわち、プロパルギル）、エチニル、及び３－ブチニルが挙げられる。

【0363】

用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、及び「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、それらの通常の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残部に結合されているアルキル基を指す。

【0364】

用語「ヘテロアルキル」は、単独で、または別の用語と組み合わせて、明示される数の炭素原子（例えば、Ｃ_２～Ｃ_１０またはＣ_２～Ｃ_８）及び例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ、及びＰ（一態様では、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる安定した直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを意味し、ここで、窒素、硫黄、及びリン原子は、任意に酸化されており、窒素原子（複数可）は、任意に四級化されている。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置される。ヘテロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３が挙げられる。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３のように、最大２個のヘテロ原子が連続し得る。

【0365】

同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、単独で、または別の置換基の一部として、限定されるものではないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２により例示される、ヘテロアルキルから誘導される二価のラジカルを意味する。典型的には、ヘテロアルキル基は、３～２４個の原子（炭素及び水素を除くヘテロ原子）を有する（３～２４員ヘテロアルキル）。別の例では、ヘテロアルキル基は、合計３～１０個の原子（３～１０員ヘテロアルキル）または３～８個の原子（３～８員ヘテロアルキル）を有する。用語「ヘテロアルキル」は、適切な場合、例えば、式が、ヘテロアルキル基が二価であることを示す場合、または置換基が連結されて、環を形成する場合、「ヘテロアルキレン」を含む。

【0366】

用語「シクロアルキル」は、単独で、または他の用語と組み合わせて、３～２４個の炭素原子を有する、例えば、３～１２個の炭素原子を有する飽和または不飽和の非芳香族炭素環式ラジカルを意味する（例えば、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキルまたはＣ_３～Ｃ_６シクロアルキル）。シクロアルキルの例としては、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。用語「シクロアルキル」は、架橋多環式（例えば、二環式）構造、例えば、ノルボルニル、アダマンチル、及びビシクロ［２．２．１］ヘプチルも含む。「シクロアルキル」基は、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロアリール（例えば、ピリジル）、及び非芳香族（例えば、炭素環式または複素環式）環から選択される少なくとも１つの（例えば、１～３つ）他の環に縮合され得る。「シクロアルキル」基が縮合されたアリール、ヘテロアリール、または複素環を含む場合、「シクロアルキル」基は、炭素環を介して分子の残部に結合している。

【0367】

用語「ヘテロシクロアルキル」、「複素環式」、「ヘテロ環」、または「ヘテロシクリル」は、単独で、または他の用語と組み合わせて、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ、及びＰ（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選択される少なくとも１個かつ最大５個のヘテロ原子であって、窒素、硫黄、及びリン原子は、任意に酸化されており、窒素原子（複数可）は、任意に四級化されている、当該ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、及び硫黄から選択される１～４個のヘテロ原子）を含有する炭素環式非芳香族環（例えば、３～８員環、及び例えば、４員環、５員環、６員環、または７員環）、または少なくとも１個かつ最大１０個（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１～５個のヘテロ原子）のヘテロ原子を、当業者に公知の安定した組み合わせで含有する４～８員環の縮合環系を意味する。例示的なヘテロシクロアルキル基としては、縮合フェニル環が挙げられる。「複素環式」基が縮合アリール、ヘテロアリール、またはシクロアルキル環を含む場合、「複素環式」基は、ヘテロ環を介して分子の残部に結合している。ヘテロ原子は、当該ヘテロ環が分子の残部に結合している位置を占め得る。

【0368】

本開示の例示的なヘテロシクロアルキルまたは複素環基としては、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルＳ－オキシド、チオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ホモモルホリニル、ホモチオモルホリニル、ホモチオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニルＳ－オキシド、テトラヒドロチエニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニルＳ－オキシド、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられる。

【0369】

「アリール」は、単環（例えば、フェニル）を有するか、または他の芳香族もしくは非芳香族環（例えば、１～３つの他の環）に縮合されている５、６、または７員の芳香族炭素環式基を意味する。「アリール」基が（例えば、１，２，３，４－テトラヒドロナフチルにおける）非芳香族環またはヘテロアリール基を含む場合、「アリール」基は、アリール環（例えば、フェニル環）を介して分子の残部に結合している。アリール基は、（例えば、本明細書に記載される１～５つの置換基で）任意に置換されている。１つの例では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する。アリール基の非限定的な例としては、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、キノリン、インダニル、インデニル、ジヒドロナフチル、フルオレニル、テトラリニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキシリル、または６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ａ］シクロヘプテニルが挙げられる。一態様では、アリール基は、フェニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキシリル、及びナフチルから選択される。更に別の態様では、アリール基は、フェニルである。

【0370】

用語「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アリール基またはヘテロアリール基がアルキル基に結合して、ラジカルである－アルキル－アリール及び－アルキル－ヘテロアリールを生じているラジカルを含むことを意図し、ここで、アルキル、アリール、及びヘテロアリールは、本明細書において定義される。例示的な「アリールアルキル」または「アラルキル」基としては、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが挙げられる。

【0371】

「アリールオキシ」は、－Ｏ－アリール基を意味し、ここで、アリールは、本明細書において定義される通りである。１つの例では、アリールオキシル基のアリール部分は、フェニルまたはナフチルである。一態様では、アリールオキシル基のアリール部分は、フェニルである。

【0372】

用語「ヘテロアリール」または「複素環式芳香族」は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、及びＢ（例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳ）から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１～５個のヘテロ原子、例えば、１～３個のヘテロ原子）を含有する５、６、または７員のポリ不飽和芳香族部分を指し、ここで、窒素及び硫黄原子は、任意に酸化されており、窒素原子（複数可）は任意に四級化されている。「ヘテロアリール」基は、単環であってもよく、または他のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環（例えば、１～３つの他の環）に縮合されていてもよい。「ヘテロアリール」基が、縮合されたアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環を含む場合、「ヘテロアリール」基は、ヘテロアリール環を介して分子の残部に結合している。ヘテロアリール基は、炭素原子またはヘテロ原子を介して分子の残部に結合していてもよい。

【0373】

１つの例では、ヘテロアリール基は、４～１０個の炭素原子及びＯ、Ｓ、及びＮから選択される１～５個のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、ピリダジニル、ピラジニル、イソインドリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、イソクロマニル、クロマニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソインドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ピリドピリジル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、プリニル、ベンゾジオキソリル、トリアジニル、プテリジニル、ベンゾチアゾリル、イミダゾピリジル、イミダゾチアゾリル、ジヒドロベンズイソキサジニル、ベンズイソキサジニル、ベンゾオキサジニル、ジヒドロベンズイソチアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロモニル、クロマノニル、ピリジル－Ｎ－オキシド、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロキノリノニル、ジヒドロイソキノリノニル、ジヒドロクマリニル、ジヒドロイソクマリニル、イソインドリノニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリノニル、ピロリルＮ－オキシド、ピリミジニルＮ－オキシド、ピリダジニルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド、キノリニルＮ－オキシド、インドリルＮ－オキシド、インドリニルＮ－オキシド、イソキノリルＮ－オキシド、キナゾリニルＮ－オキシド、キノキサリニルＮ－オキシド、フタラジニルＮ－オキシド、イミダゾリルＮ－オキシド、イソオキサゾリルＮ－オキシド、オキサゾリルＮ－オキシド、チアゾリルＮ－オキシド、インドリジニルＮ－オキシド、インダゾリルＮ－オキシド、ベンゾチアゾリルＮ－オキシド、ベンズイミダゾリルＮ－オキシド、ピロリルＮ－オキシド、オキサジアゾリルＮ－オキシド、チアジアゾリルＮ－オキシド、トリアゾリルＮ－オキシド、テトラゾリルＮ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシドが挙げられる。例示的なヘテロアリール基としては、イミダゾリル、ピラゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、及びピリジルが挙げられる。他の例示的なヘテロアリール基としては、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、ピリジン－４－イル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンズイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。上記のアリール及びヘテロアリール環系の各々の置換基は、以下に記載される許容されるアリール基の置換基の群から選択される。

【0374】

脂肪族リンカーの例としては、以下の構造が挙げられる：
－Ｏ－ＣＯＯ－
－ＮＨ－ＣＯＯ－
－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＨ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－ＣＯ－
－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）_２－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－
－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－（ＣＨ２）_ｎ１－
－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
ｎ１は、１～４０（例えば、２～２０または２～１２）の整数であり、ｎ２は、１～２０（例えば、１～１０または１～６）の整数であり、ｎ３及びｎ４は、同一であっても異なっていてもよく、１～２０（例えば、１～１０または１～６）の整数である。

【0375】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、（Ｃ３）ｎ、（Ｃ４）ｎ、（Ｃ５）ｎ、（Ｃ６）ｎ、（Ｃ７）ｎ、もしくは（Ｃ８）ｎ、またはそれらの組み合わせを含み、ここで、ｎは、１～５０の整数であり、各単位は、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して連結されている。

【0376】

ＩＩＩ．Ａ．３．切断可能なリンカー
幾つかの態様では、本明細書において開示されるＡＳＯの異なる構成要素は、切断可能なリンカーによるリンカーであり得る。切断可能なリンカーという用語は、破壊または切断され得る少なくとも１つの連結または化学結合を含むリンカーを指す。本明細書で使用する場合、切断という用語は、相対的に大きな分子における、２つ以上の相対的により小さな分子を生じる様式での１つ以上の化学結合の破壊を指す。切断は、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、もしくはレダクターゼにより、または例えば、特定の物理化学的条件、例えば、酸化還元環境、ｐＨ、活性酸素種の存在、もしくは特定波長の光により媒介され得る。

【0377】

幾つかの態様では、本明細書で使用する場合、用語「切断可能な」は、例えば、急速に分解可能なリンカー、例えば、ホスホジエステル及びジスルフィドを指し、用語「切断可能でない」は、例えば、より安定した結合、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートを指す。

【0378】

幾つかの態様では、切断可能なリンカーは、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドリンカー、ジスルフィド、イミン、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである。幾つかの態様では、切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。

【0379】

ＩＩＩ．Ａ．３．ａ．酸化還元により切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、酸化還元により切断可能なリンカーを含む。非限定的な例として、切断可能なリンカーの１つの種類は、還元または酸化されると切断される酸化還元により切断可能な連結基である。

【0380】

幾つかの態様では、酸化還元により切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合を含有し、すなわち、それは切断可能なジスルフィドリンカーである。

【0381】

酸化還元により切断可能なリンカーは、例えば、細胞内のメルカプタン、オキシダーゼ、またはレダクターゼにより還元され得る。

【0382】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｂ．活性酸素種（ＲＯＳ）により切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、例えば、活性化好中球などの炎症プロセスにより生成されるスーパーオキシド（Ｏｆ）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの活性酸素種（ＲＯＳ）により切断され得る切断可能なリンカーを含み得る。幾つかの態様では、ＲＯＳにより切断可能なリンカーは、切断可能なチオケタールリンカーである。例えば、米国特許第８，３５４，４５５Ｂ２号（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0383】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｃ．ｐＨ依存的な切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカーは、酸性条件（ｐＨ７未満）で選択的に切断される連結基である酸により切断可能な連結基を含む「酸不安定リンカー」である。

【0384】

非限定的な例として、酸により切断可能な連結基は、酸性環境、例えば、約６．０、５．５、５．０、またはそれ以下で切断される。幾つかの態様では、ｐＨは、約６．５以下である。幾つかの態様では、リンカーは、一般酸として作用し得る酵素などの作用物質、例えば、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）またはホスファターゼにより切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸により切断可能な連結基に切断環境を提供し得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、細胞内の平均ｐＨは、わずかにより低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームも５．５～６．０の範囲の酸性ｐＨを有し、リソソームは、約５．０の更に酸性のｐＨである。従って、ｐＨ依存的な切断可能なリンカーは、場合により、当該技術分野においてエンドソームに不安定なリンカーと称される。

【0385】

酸により切断可能な基は、一般式：－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。別の非限定的な例では、エステル酸素（アルコキシ基）に結合している炭素が、アリール基、置換アルキル基、または三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルまたはｔ－ブチルに結合している場合。酸により切断可能な連結基の例としては、限定されるものではないが、アミン、イミン、アミノエステル、安息香酸イミン、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、ｃｉｓ－アコニテート、ヒドラジド、チオカルバモイル、イミジン、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスク化エンドソーム溶解剤（ｍａｓｋｅｄ ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、シトラコニル基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ジスルフィド結合もｐＨに感受性である。

【0386】

幾つかの態様では、リンカーは、低ｐＨに不安定なヒドラゾン結合を含む。かかる酸不安定結合は、コンジュゲート、例えば、抗体薬物コンジュゲートの分野において広範に使用されている。例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１，１２，１４６０－７；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００８，４，１０２４－３７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００７，６，８３８－５０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００７，３２１，４６２－８；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６，５８，２２９－３６；Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，７７８－８４を参照のこと。

【0387】

ある種の態様では、リンカーは、以下から選択される低ｐＨに不安定な結合を含む：酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）において不安定であり、ジオール及びケトンを形成するケタール；酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）において不安定であり、ジオール及びアルデヒドを形成するアセタール；酸性環境（例えば、７未満、約４超のｐＨ）において不安定であり、アミン及びアルデヒドもしくはケトンを形成するイミンもしくはイミニウム；酸性条件で不安定であるケイ素－酸素－炭素結合；ケイ素－窒素（シラザン）結合；ケイ素－炭素結合（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアマート（無水マレイン酸誘導体及びアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸接触加水分解を受けるように設計された活性カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド）；またはビニルエーテル。

【0388】

更なる例は、米国特許第９，７９０，４９４Ｂ２号及び同８，１３７，６９５Ｂ２号に見出され得、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0389】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｄ．酵素切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、細胞内または細胞外酵素、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼにより切断可能なリンカーを含み得る。リンカー組み合わせにおける特定のリンカーを切断することができる酵素の範囲は、リンカーの特定の結合及び化学構造に依存する。従って、ペプチドリンカーは、例えば、ペプチダーゼにより切断され得、エステル結合を含有するリンカーは、例えば、エステラーゼにより切断され得、アミド結合を含有するリンカーは、例えば、アミダーゼにより切断され得る、などである。

【0390】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｅ．プロテアーゼ切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、プロテアーゼ切断可能なリンカー、すなわち、内因性のプロテアーゼにより切断され得るリンカーを含む。ある種のペプチドのみが細胞内または細胞外で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６－６２９（１９８２）及びＵｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．４３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７－６８４（１９８９）を参照のこと。切断可能なリンカーは、α－アミノ酸単位及びペプチド結合から構成される切断可能な部位を含有し得、ペプチド結合は、化学的には、１つのアミノ酸のカルボン酸ともう１つのアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合である。他のアミド結合、例えば、カルボン酸とリジンのα－アミノ酸基との間の結合は、ペプチド結合ではないと理解され、切断可能でないとみなされる。

【0391】

幾つかの態様では、プロテアーゼにより切断可能なリンカーは、プロテアーゼ、例えば、ネプリライシン（ＣＡＬＬＡまたはＣＤ１０）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、エンドセリン変換酵素、ｓｔｅ２４プロテアーゼ、神経溶解素、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、間質コラゲナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マクロファージエラスターゼ、マトリライシン、ゼラチナーゼ、メプリン、プロコラーゲンＣエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮエンドペプチダーゼ、ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴメタロプロテイナーゼ、ミエリン関連メタロプロテイナーゼ、エナメリシン、腫瘍壊死因子α変換酵素、インスリシン、ナルディライジン、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マグノリシン、ダクチリシン様メタロプロテアーゼ、好中球コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＳＰ２エンドペプチダーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、ウロキナーゼ、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）、トリプシン、キモトリプシン、カルデクリン、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、白血球エラスターゼ、骨髄芽球、キマーゼ、トリプターゼ、グランザイム、角質層キモトリプシン酵素、アクロシン、カリクレイン、補体成分及び補体因子、第２補体活性化経路ｃ３／ｃ５転換酵素、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ、凝固因子、トロンビン、プロテインＣ、ｕ及びｔ型プラスミノーゲン活性化因子、カテプシンＧ、ヘプシン、プロスタシン、肝細胞増殖因子活性化エンドペプチターゼ、スブチリシン／ケキシン型プロタンパク質転換酵素、フューリン、プロタンパク質転換酵素、プロリルペプチダーゼ、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリカミナーゼ、シグナルペプチダーゼ、Ｎ末端求核性アミノヒドロラーゼ、２０ｓプロテアソーム、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼＩａ、ｈｔｒａ２ペプチダーゼ、マトリプターゼ、部位１プロテアーゼ、レグマイン、カテプシン、システインカテプシン、カルパイン、ユビキチンイソペプチダーゼＴ、カスパーゼ、グリコシルホスファチジルイノシトールタンパク質トランスアミダーゼ（ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓａｍｉｄａｓｅ）、腫瘍凝固促進因子、プロホルモンチオールプロテアーゼ、γ－グルタミルヒドロラーゼ、ブレオマイシンヒドロラーゼ、セプラーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＭ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、キモシン、ガストリシン、レニン、ヤプシン、及び／またはマプシン（ｍａｓｐｉｎ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、または任意のＡｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ、またはＡｒｇ－Ｃプロテアーゼ全般の切断部位を含む。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２４）：７０２７－７０３７（２０１７）（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【0392】

幾つかの態様では、切断可能なリンカー構成要素は、１～１０アミノ酸残基を含むペプチドを含む。これらの態様では、ペプチドは、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、これにより、リソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの曝露に際して生物活性分子の放出を促進する（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－７８４）。例示的なペプチドとしては、限定されるものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、及びヘキサペプチドが挙げられる。

【0393】

ペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基及び／または非天然アミノ酸残基を含み得る。用語「天然に存在するアミノ酸」は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを指す。「非天然アミノ酸」（すなわち、天然に存在しないアミノ酸）は、非限定的な例として、ホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノシステイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、β－アラニン、Ｌ－またはＤ－ナフチルアラニン（ｎａｐｈｔｈａｌａｎｉｎｅ）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）などが挙げられる。ペプチドは、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素切断用に設計及び最適化され得る。

【0394】

アミノ酸としては、Ｄ型の天然及び非天然アミノ酸も挙げられる。「Ｄ」は、天然に存在する（「Ｌ」）アミノ酸における配置とは対照的に、「Ｄ」（右旋性）配置を有するアミノ酸を示す。天然及び非天然アミノ酸は、市販品（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）であり得るか、または当該技術分野において公知の方法を使用して合成され得る。

【0395】

例示的なジペプチドとしては、限定されるものではないが、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチル－バリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びβ－アラニン－リジンが挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、限定されるものではないが、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられる。

【0396】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｆ．エステラーゼ切断可能なリンカー
幾つかのリンカーは、エステラーゼにより切断される（「エステラーゼ切断可能なリンカー」）。ある種のエステルのみが、細胞内または細胞外に存在するエステラーゼ及びアミダーゼにより切断され得る。エステルは、カルボン酸及びアルコールの縮合により形成される。単純エステルは、単純アルコール、例えば、脂肪族アルコールならびに低分子環状アルコール及び低分子芳香族アルコールにより生成されるエステルである。エステルベースの切断可能な連結基の例としては、限定されるものではないが、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式：－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。

【0397】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｇ．ホスファターゼ切断可能なリンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、リン酸基を分解させるか、または加水分解する薬剤により切断されるリン酸ベースの切断可能な連結基を含み得る。細胞内でリン酸基を切断する作用物質の例は、細胞内ホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲ_ｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｓ－、または－ＯＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｓ－である。

【0398】

各種の態様では、Ｒ_ｋは、以下のうちのいずれかである：ＮＨ_２、ＢＨ_３、ＣＨ_３、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_６～１０アリール、Ｃ_１～６アルコキシ、及びＣ_６～１０アリールオキシ。幾つかの態様では、Ｃ_１～６アルキル及びＣ_６～１０アリールは、非置換である。更なる非限定的な例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。

【0399】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｈ．光活性化切断可能なリンカー
幾つかの態様では、組み合わせリンカーは、光活性化切断可能なリンカー、例えば、ニトロベンジルリンカーまたはニトロベンジル反応性基を含むリンカーを含む。

【0400】

ＩＩＩ．Ａ．３．ｉ．自壊性リンカー
幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、自壊性リンカーを含む。幾つかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）における自壊性リンカーは、プロテアーゼ切断可能なリンカーの酵素切断後に１，４脱離を起こす。幾つかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）における自壊性リンカーは、プロテアーゼ切断可能なリンカーの酵素切断後に１，６脱離を起こす。幾つかの態様では、自壊性リンカーは、例えば、ｐ－アミノベンジル（ｐＡＢ）誘導体、例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）、ｐ－アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、ｐ－アミノベンジルカーボネート、またはそれらの組み合わせである。

【0401】

ある種の態様では、自壊性リンカーは、芳香族基を含む。幾つかの態様では、芳香族基は、ベンジル、シンナミル、ナフチル、及びビフェニルからなる群から選択される。幾つかの態様では、芳香族基は、複素環式である。他の態様では、芳香族基は、少なくとも１つの置換基を含む。幾つかの態様では、少なくとも１つの置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＯ^３＋、ＮＨＣＯＣＨ_３、Ｎ（ＣＨ_３）_２、ＮＨＣＯＣＦ_３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_８ハロゲン化アルキル、カルボキシレート、スルファート、スルファメート、及びスルホネートからなる群から選択される。他の態様では、芳香族基における少なくとも１個のＣは、Ｎ、Ｏ、またはＣ－Ｒ＊で置換されており、式中、Ｒ＊は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＯ^３＋、ＮＨＣＯＣＨ_３、Ｎ（ＣＨ_３）_２、ＮＨＣＯＣＦ_３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_８ハロゲン化アルキル、カルボキシレート、スルファート、スルファメート、及びスルホネートから独立して選択される。

【0402】

幾つかの態様では、自壊性リンカーは、アミノベンジルカルバメート基（例えば、パラアミノベンジルカルバメート）、アミノベンジルエーテル基、またはアミノベンジルカーボネート基を含む。一態様では、自壊性リンカーは、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）である。

【0403】

ｐＡＢＣは、自壊性の部位特異的プロドラッグ活性化のための最も効果的かつ最も普及しているコネクター結合である（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９－４８０（１９８１）；ＷＯ１９８１／００１１４５；Ｒａｕｔｉｏ ｅｔ ｌａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：２５５－２７０（２００８）；Ｓｉｍｐｌｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １３：５１９－５４７（２００８）を参照のこと）。

【0404】

幾つかの態様では、自壊性リンカーは、生物活性分子（例えば、ＡＳＯ）を、プロテアーゼ切断可能な基質（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ）に連結する。特定の態様では、ｐＡＢＣ自壊性リンカーのカルバメート基は、生物活性分子（例えば、ＡＳＯ）のアミノ基に連結されており、ｐＡＢＣ自壊性リンカーのアミノ基は、プロテアーゼ切断可能な基質に連結されている。

【0405】

アミノベンジル基の芳香環は、芳香環上の水素と置き換わる１つ以上の（例えば、Ｒ_１及び／またはＲ_２）置換基で任意に置換され得、この水素は、置換されない場合に、環を形成している４つの非置換炭素のうちの１個に結合している。本明細書で使用する場合、記号「Ｒ_ｘ」（例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４）は、本明細書に記載される置換基を表す一般的な略語である。

【0406】

置換基は、ｐ－アミノベンジル基の自壊能力を改善し得る（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：２７５９－２７７０（１９９９）；Ｓｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１６０１－１６０８（２０００）も参照のこと）。

【0407】

自壊的脱離は、例えば、１，４脱離、１，６脱離（例えば、ｐＡＢＣ）、１，８脱離（例えば、ｐ－アミノ－シンナミルアルコール）、β－脱離、環化脱離（例えば、４－アミノブタノールエステル及びエチレンジアミン）、環化／ラクトン化、環化／ラクトール化などにより起こり得る。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：１８０２－１８２６（２００８）；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４７５－４８７（２０００）を参照のこと。

【0408】

幾つかの態様では、自壊性リンカーは、例えば、シンナミル、ナフチル、またはビフェニル基を含み得る（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２：７７３－７９０（２０１１）を参照のこと）。幾つかの態様では、自壊性リンカーは、複素環を含む（例えば、米国特許第７，３７５，０７８号；同７，７５４，６８１号を参照のこと）。多数のホモ芳香族（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９（１９８１）；Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：２９７５（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：１１９７（１９７８）；Ａｎｄｒｉａｎｏｍｅｎｊａｎａｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２：１９０３（１９９２）を参照のこと）、及びクマリン（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６：５５３（２０１０）参照のこと）、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール（例えば、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５３３（２００３）を参照のこと）、ピリジン（例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７：４８２５（２００９）を参照のこと）、イミダゾール（例えば、Ｎａｉｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．Ｚ：１２６７（１９９９）；Ｈａｙ ａｎｄ Ｄｅｎｎｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８：８４２５（１９９７）を参照のこと）、及びトリアゾール（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７２：３５９６（２００７）を参照のこと）ベースの、水性条件及び生理的条件下の両方で自壊性である複素環式芳香族基が当技術分野において公知である。米国特許第７，６９１，９６２号；同７，０９１，１８６号；米国特許公開第ＵＳ２００６／０２６９４８０号；同ＵＳ２０１０／００９２４９６号；同ＵＳ２０１０／０１４５０３６号；同ＵＳ２００３／０１３０１８９号；同ＵＳ２００５／０２５６０３０号も参照のこと。

【0409】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるリンカー組み合わせは、２つ以上の自壊性リンカー、例えば、２つ以上のｐＡＢＣ単位を直列に含む。例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８８１５－８８３０（２００１）を参照のこと。幾つかの態様では、本明細書において開示されるリンカー組み合わせは、発蛍光性プローブに連結された自壊性リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルアルコールまたはｐ－カルボキシベンズアルデヒドもしくはグリオキシル酸のヘミチオアミナール誘導体）を含み得る（例えば、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７７－１７８０（２０１０）を参照のこと）。

【0410】

自壊性リンカーにおける置換基が、左から右に記載される慣例的な化学式により特定される場合、それらは、その構造を右から左に記載することにより得られる化学的に同一な置換基を同様に包含する。例えば、「－ＣＨ_２Ｏ－」は、「－ＯＣＨ_２－」とも記載されることを意図する。

【0411】

自壊性リンカーにおける置換基、例えば、上記のようなｐ－アミノベンジル自壊性リンカーにおけるＲ_１及び／またはＲ_２置換基としては、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリールなどが挙げられ得る。本開示の化合物が２つ以上の置換基を含む場合、置換基の各々は独立して選択される。

【0412】

幾つかの特定の態様では、切断可能なペプチドリンカーに結合した自壊性リンカーは、以下の式を有し、組み合わせは以下の式を有する：
－Ａ_ａ－Ｙ_ｙ－
式中、各－Ａ－は、独立してアミノ酸単位であり、ａは、独立して１～１２の整数であり、－Ｙ－は、自壊性スペーサーであり、ｙは、１または２である。幾つかの態様では、－Ａ_ａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドである。幾つかの態様では、－Ａ_ａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びβ－アラニン－リジンからなる群から選択される。幾つかの態様では、－Ａ_ａ－は、バリン－アラニンまたはバリン－シトルリンである。

【0413】

幾つかの態様では、自壊性リンカー－Ｙ_ｙ－は、以下の式を有する：

【化13】

式中、各Ｒ^２は、独立して、Ｃ_１～８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１～８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり、ｍは、０～４の整数である。幾つかの態様では、ｍは、０、１、または２である。幾つかの態様では、ｍは０である。

【0414】

幾つかの態様では、切断可能なリンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。

【0415】

ＩＩＩ．Ａ．４．反応性部分（ＲＭ）
本開示のＡＳＯは、化学合成により、または、それらの構成要素間の化学反応により生成され得る。例えば、幾つかの態様では、反応性基（例えば、マレイミド）を含むアンカー部分は、マレイミド反応基を含むＡＳＯと反応して、本開示の疎水性修飾されたＡＳＯを生じ得、ここで、アンカー部分は、エキソソームの膜の脂質二重層に挿入され得、これにより、ＡＳＯがエキソソームの表面に付着され得る。

【0416】

本開示の疎水性修飾されたＡＳＯの任意の構成要素または構成要素の基は、少なくともＲＧ及び／またはＲＭを含み得、これは、１つの反応または一連の反応により構成要素の結合を可能にして、本開示の疎水性修飾されたＡＳＯを生じる。疎水性修飾されたＡＳＯの生成のための例示的な合成スキームとしては、以下が挙げられる：
［ＡＭ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＭ／ ＋ ／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＧ／ ＋ ／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＭ／ ＋ ／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＧ／ ＋ ／ＲＭ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＭ／ ＋ ／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＧ／ ＋ ／ＲＭ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり、［ＡＳＯ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、［Ｌ］は、リンカーまたはリンカー組み合わせであり、／ＲＭ／は、反応性部分であり、／ＲＧ／は、反応性基である。提供される概略図のいずれかにおいて、ＡＳＯは、例えば、その５’末端または３’末端で結合され得る。

【0417】

ＡＳＯの合成における中間体の生成の例示的な合成スキームとしては、以下が挙げられる：
［ＡＭ］－／ＲＭ／＋ ／ＲＧ／－［Ｌ］→［ＡＭ］－［Ｌ］
［ＡＭ］－／ＲＧ／ ＋ ／ＲＭ／－［Ｌ］→［ＡＭ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＭ／＋ ／ＲＧ／－［Ｌ］→［Ｌ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＧ／ ＋ ／ＲＭ／－［Ｌ］→［Ｌ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＭ／＋ ／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［Ｌ］－／ＲＧ／ ＋／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［Ｌ］－［ＡＳＯ］
式中、［ＡＭ］は、アンカー部分であり、［ＡＳＯ］は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、［Ｌ］は、リンカーまたはリンカー組み合わせであり、／ＲＭ／は、反応性部分であり、／ＲＧ／は、反応性基である。提供される概略図のいずれかにおいて、ＡＳＯは、例えば、その５’末端または３’末端で結合され得る。

【0418】

幾つかの態様では、反応性基「／ＲＧ／」は、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボン酸基、またはアジド基であり得る。これらの反応性基と反応することができる特定の反応性部分「／ＲＭ／」は、以下でより詳細に記載される。

【0419】

［ＡＭ］－（／ＲＭ／）ｎ ＋ （／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］）ｎ→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］

【0420】

本明細書において開示されるアンカー部分、リンカーもしくはリンカー組み合わせ、またはＡＳＯのいずれかは、反応性部分、例えば、アミノ反応性部分（例えば、ＮＨＳエステル、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート、またはアルデヒド）、チオール反応性部分（例えば、アクリレート、マレイミド、またはピリジルジスルフィド）、ヒドロキシ反応性部分（例えば、イソチオシアネート、またはイソシアネート）、カルボン酸反応性部分（例えば、エポキシド）、またはアジド反応性部分（例えば、アルキン）にコンジュゲートされ得る。

【0421】

本明細書において開示される２つの構成要素（例えば、アンカー部分及びＡＳＯ、またはアンカー部分及びリンカー、またはアンカー部分及びリンカー、または２つのリンカー、またはリンカー及びＡＳＯ、または２つのアンカー部分）を共有結合させるために使用され得る例示的な反応性部分としては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｓ－（２－ピリジルジチオ）システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、Ｎ－（４－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、Ｎ－（５－アミノペンチル）イミノ二酢酸、及び１’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホラミダイト）が挙げられる。二官能性リンカー（２つの官能基を含有するリンカー）も使用可能である。

【0422】

幾つかの態様では、アンカー部分、リンカー、またはＡＳＯは、末端オキシアミノ基、例えば、－ＯＮＨ２、ヒドラジノ基、－ＮＨＮＨ２、メルカプト基（すなわち、ＳＨまたはチオール）、またはオレフィン（例えば、ＣＨ＝ＣＨ２）を含み得る。幾つかの態様では、アンカー部分、リンカーまたは、ＡＳＯは、例えば、末端位置に、求電子部分、例えば、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシラート、トシラート、ノシラート、もしくはブロシラート、または活性化カルボン酸エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ホスホラミダイト、もしくはペンタフルオロフェニルエステルを含み得る。幾つかの態様では、共有結合は、リガンドの求核基、例えば、ヒドロキシル、チオール、またはアミノ基を求電子基とカップリングさせることにより形成され得る。

【0423】

本発明は、限定されるものではないが、当技術分野において公知のものが含まれるあらゆる種類の反応性基及び反応性部分に適している。

【0424】

本明細書で使用する場合、用語「保護基」は、限定されるものではないが、ヒドロキシル、アミノ、及びチオール基が含まれる反応性基を、合成手順の間、望ましくない反応から保護することが当技術分野において公知の不安定な化学部分を指す。保護基は、通常、他の反応部位での反応の間、部位を保護するために選択的及び／または直交的に使用され、次いで、基が保護されていない状態にするために、または更なる反応に利用可能にするために、除去され得る。当該技術分野において公知の保護基は、一般に、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。

【0425】

加えて、目的の化合物を得るために、様々な合成ステップが、代替的な順番または順序で実行され得る。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な化学合成変換及び保護基操作方法（保護及び脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにそれらの後続の版に記載されるものなどが挙げられる。

【0426】

追加的または代替的に、当該技術分野において公知の固相法が用いられ得る。自動化合成技術が含まれる好適な固相法は、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）及びＴｏｙ，Ｐ．Ｈ．；Ｌａｍ，Ｙ（ｅｄ．），Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２）に記載されている。

【0427】

幾つかの態様では、反応性基は、以下に記載される反応性部分のうちの２つ以上と代替的に反応することができる。

【0428】

ＩＩＩ．Ａ．４．ａ．アミン反応性部分
幾つかの態様では、反応性部分は、アミン反応性部分である。本明細書で使用する場合、用語「アミン反応性部分」は、アミノ部分を有する反応性基、例えば、一級アミンと反応することができる化学基を指す。例示的なアミン反応性部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート及びアルデヒドである。一級アミンと反応する代替的な反応性部分も当該技術分野において周知である。幾つかの態様では、アミン反応性部分は、アンカー部分、リンカー組み合わせ、または本開示のＡＳＯの末端位置に結合され得る。

【0429】

幾つかの態様では、アミン反応性部分は、ＮＨＳエステルである。通常、ＮＨＳエステル反応性部分は、反応性基の一級アミンと反応して、安定したアミド結合及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を生じる。

【0430】

幾つかの態様では、アミン反応性部分は、ｐ－ニトロフェノール基である。通常、ｐ－ニトロフェノール反応性部分は、反応性基の一級アミンと反応して、安定したカルバメート部分及びｐ－ニトロフェノールを生じる活性カルバメートである。

【0431】

幾つかの態様では、アミン反応性部分は、イソチオシアネートである。通常、イソチオシアネートは、反応性基の一級アミンと反応して、安定したチオ尿素部分を生じる。

【0432】

幾つかの態様では、アミン反応性部分は、イソシアネートである。通常、イソシアネートは、反応性基の一級アミンと反応して、安定した尿素部分を生じる。

【0433】

幾つかの態様では、アミンである、反応性部分は、アルデヒドである。典型的には、アルデヒドは、一級アミンと反応して、シッフ塩基を形成し、これは更に還元されて、還元的アミノ化により共有結合を形成し得る。

【0434】

ＩＩＩ．Ａ．４．ｂ．チオール反応性部分
幾つかの態様では、反応性部分は、チオール反応性部分である。本明細書で使用する場合、用語「チオール反応性部分」は、チオール部分（またはメルカプト基）を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なチオール反応性部分は、アクリレート、マレイミド、及びピリジルジスルフィドである。チオールと反応する代替的な反応性部分も当該技術分野において周知である。幾つかの態様では、チオール反応性部分は、アンカー部分、リンカー組み合わせ、または本開示のＡＳＯの末端位置に結合され得る。

【0435】

幾つかの態様では、チオール反応性部分は、アクリレートである。通常、アクリレートは、アクリレートのカルボニルに対してβ位炭素でチオールと反応して、安定したスルフィド結合を形成する。

【0436】

幾つかの態様では、チオール反応性部分は、マレイミドである。通常、マレイミドは、カルボニルに対してβ位炭素のいずれかでチオールと反応して、安定したスルフィド結合を形成する。

【0437】

幾つかの態様では、チオール反応性部分は、ピリジルジスルフィドである。通常、ピリジルジスルフィドは、ピリジルに対してβ位硫黄原子でチオールと反応して、安定したジスルフィド結合及びピリジン－２－チオンを形成する。

【0438】

ＩＩＩ．Ａ．４．ｃ．ヒドロキシ反応性部分
幾つかの態様では、反応性部分は、ヒドロキシル反応性部分である。本明細書で使用する場合、用語「ヒドロキシル反応性部分」は、ヒドロキシル部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なヒドロキシル反応性部分は、イソチオシアネート及びイソシアネートである。ヒドロキシル部分と反応する代替的な反応性部分も当該技術分野において周知である。幾つかの態様では、ヒドロキシル反応性部分は、アンカー部分、リンカー組み合わせ、または本開示のＡＳＯの末端位置に結合され得る。

【0439】

幾つかの態様では、ヒドロキシル反応性部分は、イソチオシアネートである。通常、イソチオシアネートは、反応性基のヒドロキシルと反応して、安定したカルバモチオエート部分を生じる。

【0440】

幾つかの態様では、アミンである、反応性部分は、イソシアネートである。通常、イソシアネートは、反応性基のヒドロキシルと反応して、安定したカルバメート部分を生じる。

【0441】

ＩＩＩ．Ａ．４．ｄ．カルボン酸反応性部分
幾つかの態様では、反応性部分は、カルボン酸反応性部分である。本明細書で使用する場合、用語「カルボン酸反応性部分」は、カルボン酸部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なカルボン酸反応性部分は、エポキシドである。カルボン酸部分と反応する代替的な反応性部分も当該技術分野において周知である。幾つかの態様では、カルボン酸反応性部分は、アンカー部分、リンカー組み合わせ、または本開示のＡＳＯの末端位置に結合され得る。

【0442】

幾つかの態様では、カルボン酸反応性部分は、エポキシドである。通常、エポキシドは、エポキシドの炭素原子のいずれかで反応性基のカルボン酸と反応して、酢酸２－ヒドロキシエチル部分を形成する。

【0443】

ＩＩＩ．Ａ．４．ｅ．アジド反応性部分
幾つかの態様では、反応性部分は、アジド反応性部分である。本明細書で使用する場合、用語「アジド反応性部分」は、アジド部分を有する反応性基と反応し得る化学基を指す。例示的なアジド反応性部分は、アルキンである。アジド部分と反応する代替的な反応性部分も当該技術分野において周知である。幾つかの態様では、カルボン酸反応性部分は、アンカー部分、リンカー組み合わせ、または本開示のＡＳＯの末端位置に結合され得る。

【0444】

幾つかの態様では、アジド反応性部分は、アルキンである。通常、アルキンは、「クリックケミストリー」とも称される１，３－双極子付加環化反応により反応性基のアジドと反応して、１，２，３－トリアゾール部分を形成する。

【0445】

ＩＩＩ．Ａ．５．具体例及びトポロジー
本開示の特定の態様では、リンカー組み合わせは、以下の式のリンカーからなる：
［アルキルリンカー］ｍ－［ＰＥＧ１］ｎ－［ＰＥＧ２］ｏ
式中、ｍ、ｎ、及びｏは、０または１であり、ｍ、ｎ、またはｏのうちの少なくとも１つは、ゼロではない。かかる式による例示的なリンカー組み合わせは、Ｃ６－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ６－ＨＥＧ、Ｃ６－ＴＥＧ、Ｃ６、ＴＥＧ－ＨＥＧ、ＴＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ８－ＨＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ、及びＣ８である。

【0446】

幾つかの態様では、リンカー組み合わせは、１つ以上の切断可能なリンカーと組み合わされた切断可能でないリンカー（例えば、ＴＥＧまたはＨＥＧ）、例えば、酵素切断可能なリンカー及び自壊性リンカーを含む。

【0447】

特定の態様では、リンカー組み合わせは、以下に示すように、ＴＥＧ（切断可能でないリンカー）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ（切断可能なリンカー）－ｐＡＢ（自壊性リンカー）のリンカー組み合わせを含む。

【化14】

【0448】

アンカー部分及びリンカー組み合わせの特定の組み合わせは、以下の表に示される。

【表2】

【表3】

【0449】

本開示のＡＳＯなどの特定のオリゴヌクレオチドが、以下に例示される。

【化15】

式中、［コレステロール］は、コレステロールアンカー部分であり、［ＴＥＧ］は、切断可能でないＴＥＧリンカーであり、［ＨＥＧ］は、切断可能でないＨＥＧリンカーであり、［ＳＳ］は、酸化還元により切断可能なジスルフィドリンカーであり、［Ｃ６］は、切断可能でないアルキルリンカーであり、［ＳＭａｌ］は、Ｓ－マレイミドであり、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］は、切断可能なバリン－シトルリンリンカーであり、［ｐＡＢ］は、自壊性ｐＡＢリンカーである。幾つかの態様では、本開示のＡＳＯは、１つ以上の構成要素が、例に示されたものと同じ種類の構成要素と置き換えられた、上記で提供された例示的な構造による構造を有する。例えば、［コレステロール］アンカー部分が、本明細書において開示される別のアンカー部分と置換され得るか、［ＴＥＧ］が、本明細書において開示される別の切断可能でないポリマーリンカー（例えば、ＨＥＧ、ＰＥＧ、ＰＧ）と置換され得るか、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］が、別のペプチダーゼ切断可能なリンカーと置換され得るか、または［ｐＡＢ］が、別の自壊性リンカーと置換され得る。

【0450】

ＩＩＩ．Ｂ．足場部分
１種以上の足場部分がＥＶにおいて発現され得る。幾つかの態様では、１種以上の足場部分が、ＡＳＯを本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）に係留するために使用される。他の態様では、１種以上の足場部分が、タンパク質または分子をＥＶに加えてＡＳＯに係留するために使用される。従って、本開示のＥＶは、ＡＳＯを連結するアンカー部分、及びタンパク質または分子、例えば、標的化部分を連結する足場部分を含む。幾つかの態様では、ＡＳＯは、足場部分に連結される。幾つかの態様では、ＥＶは、２種以上の足場部分を含む。幾つかの態様では、第１のＡＳＯは、第１の足場部分に連結され、第２のＡＳＯは、第２の足場部分に連結される。幾つかの態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分は、同じ種類の足場部分であり、例えば、第１及び第２の足場部分は、両方とも足場Ｘタンパク質である。幾つかの態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分は、異なる種類の足場部分であり、例えば、第１の足場部分は、足場Ｙタンパク質であり、第２の足場部分は、足場Ｘタンパク質である。幾つかの態様では、第１の足場部分は、本明細書において開示される足場Ｙである。幾つかの態様では、第１の足場部分は、本明細書において開示される足場Ｘである。幾つかの態様では、第２の足場部分は、本明細書において開示される足場Ｙである。幾つかの態様では、第２の足場部分は、本明細書において開示される足場Ｘである。

【0451】

幾つかの態様では、ＥＶは、ＡＳＯをＥＶ、例えば、エキソソームに（例えば、内腔表面または外部表面のいずれかで）係留することができる１種以上の足場部分を含む。ある種の態様では、足場部分は、ポリペプチド（「足場タンパク質」）である。ある種の態様では、足場タンパク質は、エキソソームタンパク質またはその断片を含む。他の態様では、足場部分は、非ポリペプチド部分である。幾つかの態様では、足場タンパク質としては、様々な膜タンパク質、例えば、エキソソーム膜に豊富に含まれる膜貫通タンパク質、膜内在性タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び周辺タンパク質が挙げられる。それらとしては、様々なＣＤタンパク質、輸送体、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンが挙げられ得る。ある種の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は、足場Ｘを含む。他の態様では、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質）は、足場Ｙを含む。更なる態様では、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質）は、足場Ｘ及び足場Ｙの両方を含む。

【0452】

ＩＩＩ．Ｂ．１．足場Ｘにより操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム
幾つかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、組成が改変された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカン含量を変化させることにより改変され得る。

【0453】

幾つかの態様では、表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、化学的及び／または物理的方法、例えば、ＰＥＧにより誘発される融合及び／または超音波による融合により生成される。他の態様では、表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、遺伝子操作により生成される。遺伝子改変された産生細胞または遺伝子改変された細胞の子孫から産生されたＥＶ、例えば、エキソソームは、改変された膜組成を有し得る。幾つかの態様では、表面が操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、より高密度もしくはより低密度（例えば、より多量）の足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）を有するか、または足場部分のバリアントもしくは断片を含む。

【0454】

例えば、表面が（例えば、足場Ｘにより）操作されたＥＶは、足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）またはそのバリアントもしくは断片をコードする外来性配列で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生され得る。外来性配列から発現された足場部分を含むＥＶは、改変された膜組成を含み得る。

【0455】

足場部分の様々な改変または断片が、本開示の態様に使用され得る。例えば、結合剤を使用して精製され得る表面が操作されたＥＶを生成するために、結合剤に対する増強された親和性を有するように改変された足場部分が使用され得る。ＥＶ及び／または膜により効果的に標的化されるように改変された足場部分が使用され得る。エキソソーム膜への特異的かつ効果的な標的化に必要とされる最小断片を含むように改変された足場部分も使用され得る。

【0456】

足場部分は、融合分子、例えば、足場ＸのＡＳＯとの融合分子として発現されるように操作され得る。例えば、融合分子は、ＡＳＯに連結された本明細書において開示される足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰ輸送体、またはそれらの断片もしくはバリアント）を含み得る。

【0457】

幾つかの態様では、本明細書に記載される表面が（例えば、足場Ｘにより）操作されたＥＶは、当該技術分野において公知のＥＶと比較して優れた特性を示す。例えば、表面が（例えば、足場Ｘにより）操作されたものは、天然に存在するＥＶまたは従来のエキソソームタンパク質を使用して生成されたＥＶと比べてより高度に濃縮された改変されたタンパク質をそれらの表面に含有する。更に、本開示の表面が（例えば、足場Ｘにより）操作されたＥＶは、天然に存在するＥＶまたは従来のエキソソームタンパク質を使用して生成されたＥＶと比べてより高い、より特異的な、またはより制御された生物活性を有し得る。

【0458】

幾つかの態様では、足場Ｘは、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ（ＥＷＩ）モチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２α受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２α受容体関連タンパク質、またはＣＤ３１５とも称され得る。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）の全長アミノ酸配列は、配列番号３０１として表２に示される。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号３０１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号３０１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番号３０１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０１のアミノ酸８５４～８７９）を含有する。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド、すなわち、配列番号３０１のアミノ酸２６～８７９のない配列番号３０１からなる。幾つかの態様では、本開示のために有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびに（ｉ）膜貫通ドメインのＮ末端の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０アミノ酸、（ｉｉ）膜貫通ドメインのＣ末端の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、もしくは少なくとも２５アミノ酸、または（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。

【0459】

幾つかの態様では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は、１つ以上の機能または構造ドメイン（例えば、ＩｇＶ）を欠く。

【0460】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０１のアミノ酸２６～８７９と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０２のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３０２のアミノ酸配列、ならびに配列番号３０２のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【0461】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のアミノ酸配列、ならびに配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【表4】

【0462】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のアミノ酸配列、ならびに配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【0463】

幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３０３により示されるベイシジン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７としても公知である。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、Ｐ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号３０３のアミノ酸１～２１である。配列番号３０３のアミノ酸１３８～３２３は、細胞外ドメインであり、アミノ酸３２４～３４４は、膜貫通ドメインであり、配列番号３０３のアミノ酸３４５～３８５は、細胞質ドメインである。

【0464】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０３のアミノ酸２２～３８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、ＢＳＧポリペプチドの断片は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶ、例えば、配列番号３０３のアミノ酸２２１～３１５を欠く。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３２６、３２７、または３２８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３２６、３２７、または３２８のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３２６、３２７、または３２８のアミノ酸配列、ならびに配列番号３２６、３２７、または３２８のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【0465】

幾つかの態様では、足場Ｘは、ＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ－２）、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質４（ＫＣＴ－４）、ＬＩＲ－Ｄ１、プロスタグランジン調節様タンパク質（ＰＧＲＬ）、またはＣＤ３１６としても公知である、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）を含む。全長ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９６９Ｐ０であり、本明細書において配列番号３０４として示される。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０４のアミノ酸１～２７）、細胞外ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸２８～５７９）、膜貫通ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸５８０～６００）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸６０１～６１３）を有する。

【0466】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０４のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ８タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン（例えば、ＩｇＶ）を欠く。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のアミノ酸配列、ならびに配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【0467】

幾つかの態様では、本開示の足場Ｘは、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ－３）としても公知であり、配列番号３０９のアミノ酸配列として示される、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）を含む。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０９のアミノ酸１～１９）、細胞外ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸２０～１１２４）、膜貫通ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸１１２５～１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸１１４６～１１９４）を有する。

【0468】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０９のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ３タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン（例えば、ＩｇＶ）を欠く。

【0469】

幾つかの態様では、本開示の足場Ｘは、フィブロネクチン受容体サブユニットβ、糖タンパク質ＩＩａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ－４サブユニットβ、またはＣＤ２９としても公知であり、配列番号３０５のアミノ酸配列として示される、インテグリンβ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）を含む。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０５のアミノ酸１～２０）、細胞外ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸２１～７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸７２９～７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸７５２～７９８）を有する。

【0470】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０５のアミノ酸２１～７９８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、ＩＴＧＢ１タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン（例えば、ＩｇＶ）を欠く。

【0471】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチド（配列番号３０６のアミノ酸１～３３）のない配列番号３０６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＩＴＧＡ４タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＩＴＧＡ４タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0472】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３０７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0473】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ１タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0474】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ２タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0475】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ３タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0476】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ４タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0477】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ１タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0478】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ２タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0479】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ３タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0480】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ４タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0481】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドのない配列番号３１８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＩＧＳＦ２タンパク質を含む。幾つかの態様では、ＩＧＳＦ２タンパク質は、１つ以上の機能または構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0482】

他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、２０１９年２月５日に発行された米国特許第ＵＳ１０１９５２９０Ｂ１号（その全体が参照により組み込まれる）に見出され得る。

【0483】

幾つかの態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端からの少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。幾つかの態様では、配列は、天然タンパク質のＣ末端からの少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。幾つかの態様では、配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方からの少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００アミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。幾つかの態様では、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能または構造ドメインを欠く足場部分の断片をコードする。

【0484】

幾つかの態様では、足場部分、例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質に連結される。１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端に連結され得る。１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＣ末端に連結され得る。幾つかの態様では、１つ以上の異種タンパク質は、足場部分のＮ末端及びＣ末端の両方に連結される。幾つかの態様では、異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。幾つかの態様では、異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。

【0485】

幾つかの態様では、足場Ｘは、任意の部分、例えば、ＡＳＯを、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面及び外部表面に同時に連結するために使用され得る。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドが、ＡＳＯを、ＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に加えて内腔内に（例えば、内腔表面に）連結するために使用され得る。従って、ある種の態様では、足場Ｘは、２つの目的、例えば、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面のＡＳＯ及び外部表面のＡＳＯのために使用され得る。幾つかの態様では、足場Ｘは、ＡＳＯをＥＶの内腔表面及び／またはＥＶの外部表面に係留することができる足場タンパク質である。

【0486】

ＩＩＩ．Ｂ．２．足場Ｙにより操作されたＥＶ、例えば、エキソソーム
幾つかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、天然に存在するＥＶの内部空間（すなわち、内腔）と異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面の組成が、天然に存在するエキソソームの組成と異なるタンパク質、脂質、またはグリカン含量を有するように、改変され得る。

【0487】

幾つかの態様では、操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面の組成または含量を変化させる足場部分（例えば、エキソソームタンパク質、例えば、足場Ｙ）または足場部分の改変型もしくは断片をコードする外来性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に発現され得るエキソソームタンパク質の様々な改変型または断片が本開示の態様に使用され得る。

【0488】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面を変化させ得るエキソソームタンパク質としては、限定されるものではないが、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0489】

幾つかの態様では、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９９６６；配列番号４０１）を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、プロテインキナーゼＣ基質、８０ｋＤａタンパク質、軽鎖としても公知である。全長ヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は、３３２アミノ酸長であり、アミノ酸残基１５２～１７６にカルモジュリン結合ドメインを含む。幾つかの態様では、足場Ｙは、ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４９００６；配列番号４０２）を含む。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１及びマクロファージミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質としても公知である。全長ヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、１９５アミノ酸長である。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインをアミノ酸残基８７～１１０に有する。幾つかの態様では、足場Ｙは、ＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ８０７２３；配列番号４０３）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａ神経組織富酸性タンパク質（２２ ｋＤａ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）または神経細胞軸索膜タンパク質（ＮＡＰ－２２）としても公知である。全長のヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（アイソマー１）は、２２７アミノ酸長である。選択的スプライシングにより生成されるアイソマーは、配列番号４０３のアミノ酸８８～１４１を欠損している（アイソマー１）。表７は、本明細書において開示される例示的な足場Ｙ（すなわち、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１タンパク質）の全長の配列を提供する。

【表6】

【0490】

成熟ＢＡＳＰ１タンパク質配列は、配列番号４０３の最初のＭｅｔを欠損しており、従って、配列番号４０３のアミノ酸２～２２７を含有する。同様に、成熟ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質も、それぞれ配列番号４０１及び４０２の最初のＭｅｔを欠く。従って、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、配列番号４０１のアミノ酸２～３３２を含有する。成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、配列番号４０２のアミノ酸２～２２７を含有する。

【0491】

他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４０３のアミノ酸２～２２７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｙは、配列番号４０４～５６７のいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４０３のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４０３のアミノ酸残基１のＭｅｔのない配列番号４０３のアミノ酸配列の他に、１アミノ酸変異、２アミノ酸変異、３アミノ酸変異、４アミノ酸変異、５アミノ酸変異、６アミノ酸変異、または７アミノ酸変異を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４０４～５６７のいずれか１つのアミノ酸配列、ならびに配列番号４０４～５６７のＮ末端及び／またはＣ末端の１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸以上を含む。

【0492】

幾つかの態様では、配列番号４０４～５６７のいずれかのタンパク質配列は、本開示の足場Ｙ（例えば、ＡＳＯに連結された足場部分）となるのに十分である。

【0493】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙは、ＧＸＫＬＳＫＫＫを有するペプチドを含み、ここで、Ｘは、アラニンまたは任意の他のアミノ酸（配列番号４０４）である。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。更なる態様では、本明細書に記載されるエキソソーム（例えば、操作されたエキソソーム）は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を有するペプチドを含み、ここで、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群から選択される任意のアミノ酸であり、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。アミノ酸命名法については、Ａａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５１３（２００２） １４１－１４４を参照のこと。

【0494】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号４０４～５６７のいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0495】

本明細書に記載される足場Ｙにより操作されたＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号４０４～５６７に記載される配列で形質転換された細胞から産生され得る。

【0496】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、ここで、当該ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合している。幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含み、ここで、当該細胞内ドメインは、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、当該ＮＤ及び／またはＥＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合している。本明細書で使用する場合、用語「に会合している」は、膜成分への共有結合を伴わない足場タンパク質とＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面との間の相互作用を指す。例えば、本開示に有用な足場は、例えば、脂質アンカー（例えば、ミリスチン酸）及び／または膜リン脂質の負に荷電した頭部と静電的相互作用する多塩基性ドメインを介してＥＶの内腔表面に会合していてもよい。他の態様では、足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、当該ＮＤは、ＥＶの内腔表面に会合しており、当該ＥＤは、イオン相互作用によりＥＶの内腔表面に会合しており、当該ＥＤは、配列に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続した塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を含む。

【0497】

他の態様では、足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、当該ＮＤは、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合しており、当該ＥＤは、イオン相互作用によりＥＶの内腔表面に会合しており、当該ＥＤは、配列に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続した塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を含む。

【0498】

幾つかの態様では、ＮＤは、脂質化により、例えば、ミリストイル化によりＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合している。幾つかの態様では、ＮＤは、Ｎ末端にＧｌｙを有する。幾つかの態様では、Ｎ末端Ｇｌｙは、ミリストイル化される。

【0499】

幾つかの態様では、ＥＤは、イオン相互作用によりＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合している。幾つかの態様では、ＥＤは、静電的相互作用、特に、静電引力相互作用によりＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に会合している。

【0500】

幾つかの態様では、ＥＤは、（ｉ）塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または（ｉｉ）相互に隣接する２つ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）をポリペプチド配列内に含む。幾つかの態様では、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。幾つかの態様では、塩基性アミノ酸は、（Ｌｙｓ）ｎであり、ここで、ｎは１～１０の間の整数である。

【0501】

他の態様では、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端のリジンに直接連結されている場合、ＥＤは、少なくともリジンを含み、ＮＤは、Ｃ末端にリジンを含み、すなわち、リジンがＥＤのＮ末端に存在し、ＮＤのＣ末端のリジンに融合されている。他の態様では、ＥＤは、ＥＤのＮ末端がリンカー、例えば、１つ以上のアミノ酸を介してＮＤのＣ末端に連結されている場合、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。

【0502】

幾つかの態様では、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）；ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、ＥＤは、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６で示されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は、独立してアミノ酸を表し、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を表す。幾つかの態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択される。幾つかの態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。幾つかの態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択される。幾つかの態様では、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択される。

【0503】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、ここで、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６で示されるアミノ酸配列を含み、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２～Ｘ６の各々は、独立してアミノ酸であり、Ｘ６は、塩基性アミノ酸を含み、ＥＤは、ペプチド結合によりＸ６に連結されており、ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。

【0504】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質のＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表す。

【0505】

幾つかの態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇからなる群から選択される。

【0506】

幾つかの態様では、ＮＤ及びＥＤは、リンカーにより連結される。幾つかの態様では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。幾つかの態様では、用語「リンカー」は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。幾つかの態様では、２つ以上のリンカーが、直列に連結され得る。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を防止／改善する。リンカーは、通常切断されないが、ある種の態様では、かかる切断が所望され得る。従って、幾つかの態様では、リンカーは、リンカーの配列内に存在し得るか、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーと隣接し得る、１つ以上のプロテアーゼ切断可能部位を含み得る。ＮＤ及びＥＤがリンカーにより連結される場合、ＥＤは、少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。

【0507】

幾つかの態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００アミノ酸を含み得る。

【0508】

幾つかの態様では、リンカーは、グリシン／セリンリンカーである。幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍによるグリシン／セリンリンカーであり、式中、ｎは、１～１００の任意の整数であり、ｍは、１～１００の任意の整数である。他の態様では、グリシン／セリンリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚによるものであり、式中、ｘは、１～４の整数であり、ｙは、０または１であり、ｚは、１～５０の整数である。幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｎを含み、式中、ｎは、１～１００の整数であり得る。幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。他の態様では、ペプチドリンカーは、配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み得、式中、ｎは、１～１００の整数である。

【0509】

幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然である。一態様では、ペプチドリンカーは、第１の直鎖状アミノ酸配列を、自然界において自然に連結または遺伝子的に融合されない第２の直鎖状アミノ酸配列に連結または遺伝子的に融合させるアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）非天然ポリペプチドを含み得る。

【0510】

他の態様では、ペプチドリンカーは、非天然アミノ酸を含み得る。更なる他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在しない直鎖状配列で生じる天然に存在するアミノ酸を含み得る。更に他の態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含み得る。

【0511】

本開示は、足場Ｙタンパク質に連結されたＡＳＯを含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エキソソームも提供し、ここで、足場Ｙタンパク質は、ＮＤ－ＥＤを含み、ＮＤは、Ｇ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、Ｇは、Ｇｌｙを表し、「：」は、ペプチド結合を表し、Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ３は、任意のアミノ酸を表し、Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒからなる群から選択されるアミノ酸を表し、Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸を表し、「－」は、任意のリンカーを表し、ＥＤは、（ｉ）ペプチド結合もしくは１つ以上のアミノ酸によりＸ６に連結されている少なくとも２つの連続したリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によりＸ６に直接連結されている少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである。

【0512】

幾つかの態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される。幾つかの態様では、Ｘ３アミノ酸は、Ｌｙｓである。幾つかの態様では、Ｘ４アミノ酸は、ＬｅｕまたはＧｌｕである。幾つかの態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｓｅｒ及びＡｌａからなる群から選択される。幾つかの態様では、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。幾つかの態様では、Ｘ２アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり、Ｘ３アミノ酸は、ＬｙｓまたはＧｌｕであり、Ｘ４アミノ酸は、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕであり、Ｘ５アミノ酸は、ＳｅｒまたはＡｌａであり、Ｘ６アミノ酸は、Ｌｙｓである。幾つかの態様では、「－」リンカーは、ペプチド結合または１つ以上のアミノ酸を含む。

【0513】

幾つかの態様では、足場タンパク質におけるＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）；ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0514】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0515】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質におけるＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号４１５）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫ（配列番号４１６）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫ（配列番号４１７）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫ（配列番号４１８）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、足場タンパク質におけるＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＧ（配列番号４１９）、ＫＫＫＧＹ（配列番号４２０）、ＫＫＫＧＹＮ（配列番号４２１）、ＫＫＫＧＹＮＶ（配列番号４２２）、ＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４２３）、ＫＫＫＧＹＳ（配列番号４２４）、ＫＫＫＧＹＧ（配列番号４２５）、ＫＫＫＧＹＧＧ（配列番号４２６）、ＫＫＫＧＳ（配列番号４２７）、ＫＫＫＧＳＧ（配列番号４２８）、ＫＫＫＧＳＧＳ（配列番号４２９）、ＫＫＫＳ（配列番号４３０）、ＫＫＫＳＧ（配列番号４３１）、ＫＫＫＳＧＧ（配列番号４３２）、ＫＫＫＳＧＧＳ（配列番号４３３）、ＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４３４）、ＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４３５）、ＫＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４３６）、ＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４３７）を含む。

【0516】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0517】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0518】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

【0519】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約５０、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、または少なくとも約３５０アミノ酸の長さである。

【0520】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、約１９０～約２００、約２００～約２１０、約２１０～約２２０、約２２０～約２３０、約２３０～約２４０、約２４０～約２５０、約２５０～約２６０、約２６０～約２７０、約２７０～約２８０、約２８０～約２９０、約２９０～約３００、約３００～約３１０、約３１０～約３２０、約３２０～約３３０、約３３０～約３４０、または約３４０～約３５０アミノ酸の長さである。

【0521】

幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）を含む。

【0522】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）からなる。

【0523】

本開示に有用な足場Ｙタンパク質の非限定的な例は、以下に列挙される。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５６～５６７のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５６～５６７のいずれか１つで記載されるアミノ酸配列からなる。

【0524】

幾つかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端Ｍｅｔを含有しない。幾つかの態様では、足場Ｙタンパク質は、足場タンパク質のＮ末端に、脂質アンカーとして機能する脂質付加されたアミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。幾つかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、Ｇｌｙである。Ｎ末端Ｇｌｙの存在は、Ｎ－ミリストイル化の絶対条件である。幾つかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、合成である。幾つかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。

【0525】

足場タンパク質の非限定的な例は、２０１９年５月２３日に公開されたＷＯ／２０１９／０９９９４２及び２０２０年５月２２日に公開されたＷＯ／２０２０／１０１７４０に見出され得、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0526】

他の態様では、脂質アンカーは、当該技術分野において公知の任意の脂質アンカー、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。珍しい場合では、例えば、ミリスチン酸が制限された培養培地を使用することにより、より短鎖かつ不飽和の脂肪酸が含まれる幾つかの他の脂肪酸がＮ末端グリシンに結合され得る。例えば、ＢＫチャネルにおいて、ミリステートが、ヒドロキシエステル結合を介して内部セリン／トレオニンまたはチロシン残基に翻訳後に結合されることが報告されている。当該技術分野において公知の膜アンカーは、以下の表に示される。

【化16】

【0527】

ＩＩＩ．Ｃ．リンカー
上記のように、本開示の細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エキソソーム及びナノ小胞）は、関心対象の分子（例えば、ＡＳＯ）をＥＶに（例えば、内腔表面または外部表面に）連結する１つ以上のリンカーを含み得る。幾つかの態様では、ＡＳＯは、ＥＶに直接的に、または足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を介して連結される。ある種の態様では、ＡＳＯは、リンカーを介して足場部分に連結される。ある種の態様では、ＡＳＯは、リンカーを介して第２の足場部分に連結される。

【0528】

ある種の態様では、ＡＳＯは、足場Ｘを介してエキソソームの外部表面に連結される。更なる態様では、ＡＳＯは、足場Ｘまたは足場Ｙを介してエキソソームの内腔表面に連結される。リンカーは、当該技術分野において公知の任意の化学部分であり得る。

【0529】

本明細書で使用する場合、用語「リンカー」は、ペプチドもしくはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。幾つかの態様では、２つ以上のリンカーが、直列に連結され得る。複数のリンカーが存在する場合、リンカーの各々は同一であっても異なっていてもよい。一般に、リンカーは、柔軟性を提供するか、または立体障害を防止／改善する。リンカーは、通常切断されないが、ある種の態様では、かかる切断が所望され得る。従って、幾つかの態様では、リンカーは、リンカーの配列内に存在し得るか、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーと隣接し得る、１つ以上のプロテアーゼ切断可能部位を含み得る。

【0530】

幾つかの態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００アミノ酸を含み得る。

【0531】

幾つかの態様では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然である。一態様では、ペプチドリンカーは、第１の直鎖状アミノ酸配列を、自然界において自然に連結または遺伝子的に融合されない第２の直鎖状アミノ酸配列に連結または遺伝子的に融合させるアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然または非天然ペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、付加、置換、または欠失などの変異を含む）非天然ポリペプチドを含み得る。

【0532】

リンカーは、切断に感受性で有り得（「切断可能なリンカー」）、これにより、生物活性分子（例えば、ＡＳＯ）の放出を容易にする。

【0533】

幾つかの態様では、リンカーは、「還元感受性リンカー」である。幾つかの態様では、還元感受性リンカーは、ジスルフィド結合を含有する。幾つかの態様では、リンカーは、「酸不安定リンカー」である。幾つかの態様では、酸不安定リンカーは、ヒドラゾンを含有する。好適な酸不安定リンカーとしては、例えば、ｃｉｓ－アコニット酸リンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも挙げられる。

【0534】

幾つかの態様では、リンカーは、切断可能でないリンカーを含む。

【0535】

幾つかの態様では、リンカーは、アクリルホスホラミダイト（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾体（例えば、アミノ修飾体Ｃ６、アミノ修飾体Ｃ１２、アミノ修飾体Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾体）、アルキン、５’－ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾体Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオール、またはチオール修飾体Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0536】

幾つかの態様では、リンカーは、テルペン、例えば、ネロリドール、ファルネソール、リモネン、リナロール、ゲラニオール、カルボン、フェンコン、もしくはメントール；脂質、例えば、パルミチン酸もしくはミリスチン酸；コレステロール；オレイル；レチニル；コレステリル残基；コール酸；アダマンタン酢酸；１－ピレン酪酸；ジヒドロテストステロン；１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール；ゲラニルオキシヘキシル基；ヘキサデシルグリセロール；ボルネオール；１，３－プロパンジオール；ヘプタデシル基；Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸；Ｏ３－（オレオイル）コレン酸；ジメトキシトリチル；フェノキサジン、マレイミド部分、グルクロニダーゼ型、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８型、葉酸；炭水化物；ビタミンＡ；ビタミンＥ；ビタミンＫ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0537】

ＩＩＩ．Ｄ．標的化部分
幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、標的化部分、例えば、外来性の標的化部分を含む。幾つかの態様では、標的化部分は、ペプチド、抗体もしくはその抗原結合断片、化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、標的化部分は、マイクロタンパク質、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、標的化部分は、全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体、一本鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの態様では、抗体は、一本鎖抗体である。幾つかの態様では、標的化部分として使用され得る抗体は、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲ）である。

【0538】

幾つかの態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、関節、皮膚、腸管、膀胱、膵臓、リンパ節、脾臓、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する。幾つかの態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を腫瘍細胞、腫瘍微小環境、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、神経細胞、肝細胞、クッパー細胞、骨髄細胞系列細胞（例えば、好中球、単球、またはマクロファージ）、造血幹細胞、またはそれらの任意の組み合わせに標的化する。

【0539】

幾つかの態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）を腫瘍細胞に標的化する。いずれか１つの理論にも拘束されるものではないが、幾つかの態様では、標的化部分は、腫瘍細胞に発現される１種以上の腫瘍抗原に結合することにより腫瘍細胞への標的化を促進する。幾つかの態様では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＣＤ２２、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＳＳＸ、ＧＲＰ７８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＷＴ１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0540】

幾つかの態様では、標的化部分は、足場タンパク質によりＥＶ、例えば、エキソソームに連結される。幾つかの態様では、足場タンパク質は、本明細書において開示される任意の足場タンパク質である。幾つかの態様では、足場タンパク質は、足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）である。幾つかの態様では、足場タンパク質は、足場Ｙである。

【0541】

本明細書に記載されるように、幾つかの態様では、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）と共に使用され得る標的化部分は、単一ドメイン抗原結合部分を含む。本明細書で使用する場合、用語「単一ドメイン抗原結合部分」は、標的分子（例えば、ＣＤ３３、メソテリン、または両方）と可逆的に相互作用することができるポリペプチドを指す。本明細書に記載されるように、幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディ）において観察されるものなどの単一の単量体の可変的抗体結合断片を含む。幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、一本鎖抗体、例えば、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）抗体を含む。

【0542】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、抗体に由来する。ある種の態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、ラクダ科抗体に由来する。幾つかの態様では、ラクダ科抗体に由来する単一ドメイン抗原結合部分は、ＶＨＨである。本明細書で使用する場合、「ＶＨＨ」（ナノボディとも称される）は、重鎖抗体の定常領域を欠く単一可変ドメインである。ＶＨＨは、本来サメ及びラクダ科において天然に生成される抗体などの重鎖のみ抗体（ＨｃＡｂ）の抗原結合部分である（例えば、Ｂｅｖｅｒ ａｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｎｌ Ｃｈｅｍ ４０８（２２）：５９８５－６００２（２０１６）（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ラクダ科抗体は、２本の重鎖で構成されるホモ二量体を特徴とし、各重鎖は、単一の重鎖可変領域（ＶＨＨ）及び２つの重鎖定常領域を有する。

【0543】

当該技術分野において公知の任意のＶＨＨが、本明細書において開示される方法において使用され得る。幾つかの態様では、ＶＨＨは、ラクダ科抗体に由来する。幾つかの態様では、ＶＨＨは、ラクダ科抗体の断片である。幾つかの態様では、ＶＨＨは、合成ポリペプチドである。幾つかの態様では、ＶＨＨは、組換えポリペプチドである。幾つかの態様では、ＶＨＨは、ＶＨＨの標的抗原への結合親和性を増強するための１つ以上の変異を含む。幾つかの態様では、ＶＨＨは、ＶＨＨの安定性を増強するための１つ以上の変異を含む。

【0544】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、ｖＮＡＲである。本明細書で使用する場合、「ｖＮＡＲ」は、ＩｇＮＡＲ抗体の可変領域を含むポリペプチドを指す。ＩｇＮＡＲ抗体は、２本の重鎖で構成される重鎖ホモ二量体であり、各重鎖は、重鎖可変領域（ｖＮＡＲ）及び５つの重鎖定常領域を有する。ＩｇＮＡＲは、軟骨魚類及びサメにおいて天然に発現される（例えば、Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：２５－３３（２００３）；及び国際公開第ＷＯ２０１６／０７７８４０Ａ２号（これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。

【0545】

当該技術分野において公知の任意のｖＮＡＲが、本明細書において開示される方法において使用され得る。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、ＩｇＮＡＲに由来する。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、ＩｇＮＡＲに由来する。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、サメＩｇＮＡＲ抗体の断片である。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、合成ポリペプチドである。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、組換えポリペプチドである。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、ｖＮＡＲの標的抗原への結合親和性を増強するための１つ以上の変異を含む。幾つかの態様では、ｖＮＡＲは、ｖＮＡＲの安定性を増強するための１つ以上の変異を含む。

【0546】

幾つかの態様では、本明細書において開示される単一ドメイン抗原結合部分は、従来のヒト抗体及びそのｓｃＦｃ断片より小さく、このことにより、より高濃度の抗原結合部分が表面にロードされたＥＶ（例えば、エキソソーム）の生成を可能にする。例えば、ＶＨＨ及びｖＮＡＲの抗原結合ドメインは、それぞれ約１２～１５ｋＤａの分子量を有する（ＩｇＧの１／１０サイズかつｓｃＦｖのほぼ半分のサイズ）。

【0547】

任意の特定のメカニズムに拘束されるものではないが、本明細書において開示される単一抗原結合部分は、エキソソームを産生する細胞により効率的に発現され、それらは、普通抗体と比較してＥＶ、例えば、エキソソームの内腔及び／または外部表面のより少ない空間を占める。このことは、表面のより高密度の結合部分を可能にする。内部へのローディングについて、このことは、少なくとも２つの利点を提供する。第１に、より高密度の抗原結合部分を有することは、抗原結合部分に結合され得るより高密度の特定のカーゴをロードする能力を可能にする。第２に、抗原結合部分が普通抗体より小さいため、ＥＶに、抗原結合部分により消費される空間がより少ない、より大きなカーゴがロードされ得る。外部へのローディングについて、本明細書において開示されるより小さな抗原結合部分を使用することにより、より高密度のカーゴが抗原結合部分との相互作用により結合されることも可能にする。より高い密度は、ＥＶの標的抗原に対する全体的な指向性を増加させ、ＥＶと標的抗原との間の相互作用の可能性を増加させるのにも役立つ。

【0548】

従って、幾つかの態様では、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡに特異的なＡＳＯを含む）は、表面（例えば、外部表面）に１種以上の単一ドメイン抗原結合部分（例えば、ＶＨＨ及び／またはｖＮＡＲ）を含み、ここで、当該表面上の当該１種以上の単一ドメイン抗原結合部分の濃度は、１つのＥＶ当たり少なくとも約１００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約６００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約７００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約８００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約９００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１２５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４５００コピー、または１つのＥＶ当たり少なくとも約５０００コピーである。

【0549】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨ及び／またはｖＮＡＲは、ＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に局在するタンパク質に融合される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｘタンパク質に融合された少なくとも約１００コピーのＶＨＨをＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｘタンパク質に融合された少なくとも約１０００コピーのＶＨＨをＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｘタンパク質に融合された少なくとも約１００コピーのｖＮＡＲをＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｘタンパク質に融合された少なくとも約１０００コピーのｖＮＡＲをＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面に含む。

【0550】

幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約６００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約７００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約８００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約９００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１１００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１２００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１３００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１４００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１６００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１７００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１８００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１９００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約５０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの外部表面に含む。

【0551】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔（すなわち内部）表面にロードされる。単一ドメイン抗原結合部分は、従来のＩｇＧベースの抗体及びその断片より大幅に小さいため、本明細書において開示される方法は、より高濃度の抗原結合部分がＥＶの内腔表面に局在することを可能にする。このことは、ＥＶ、例えば、エキソソームにカーゴをロードする場合に非常に有益であり得、より高密度のカーゴが単一のＥＶにロードされることを可能にし、抗原結合部分により占められる空間の量を最小限にすると同時に、より大きなカーゴ、例えば、ＡＡＶが内腔表面に会合することを可能にする。従って、幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、本明細書において開示される足場Ｙタンパク質に連結され、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に局在する。

【0552】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分（例えば、ＶＨＨ及び／またはｖＮＡＲ）は、ＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に局在するタンパク質に融合される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｙタンパク質に融合された少なくとも約１００コピーのＶＨＨをＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｙタンパク質に融合された少なくとも約１０００コピーのＶＨＨをＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｙタンパク質に融合された少なくとも約１００コピーのｖＮＡＲをＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｙタンパク質に融合された少なくとも約１０００コピーのｖＮＡＲをＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面に含む。

【0553】

本開示のある種の態様は、高密度の標的化部分をＥＶ、例えば、エキソソームの内腔表面にロードする方法であって、１つ以上の単一ドメイン抗原結合部分をＥＶ足場タンパク質に融合させることを含む、当該方法を対象とする。幾つかの態様では、本明細書において開示される方法は、１つのＥＶ当たり少なくとも約１００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約６００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約７００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約８００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約９００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１２５０コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約１５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約２５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約３５００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４０００コピー、１つのＥＶ当たり少なくとも約４５００コピー、または１つのＥＶ当たり少なくとも約５０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分のＥＶの内腔表面での密度を有するＥＶ、例えば、エキソソームの生成を可能にする。

【0554】

幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約６００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約７００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約８００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約９００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１１００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１２００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１３００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１４００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１６００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１７００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１８００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約１９００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約２７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約３７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４２５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４５００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約４７５０コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶは、少なくとも約５０００コピーの単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨまたはｖＮＡＲをＥＶの内腔表面に含む。

【0555】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約２倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約３倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約４倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約５倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約１０倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約１５倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約２０倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約２５倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約３０倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約３５倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約４０倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約４５倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、同様の技術を使用してＥＶ上にロードされた普通抗体のコピー数と比べて少なくとも約５０倍多いコピーの単一ドメイン抗原結合部分を含む。

【0556】

幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、本明細書において開示される任意の標的抗原に結合し得る。本明細書に記載されるように、幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、メソテリンに結合する。従って、ある種の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＫＲＡＳ転写物（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ）を標的とするＡＳＯ及びメソテリンに結合する単一ドメイン抗原結合部分を含む。幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、ＶＨＨである。幾つかの態様では、単一ドメイン抗原結合部分は、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）である。幾つかの態様では、ＡＳＯは、リンカー（例えば、ＴＥＧリンカー）を介してコレステロールにコンジュゲートされる。幾つかの態様では、ＡＳＯ、単一ドメイン抗原結合部分、または両方が、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に直接付着される。幾つかの態様では、ＡＳＯ、単一ドメイン抗原結合部分、または両方が、足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ）を使用してＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に付着される。

【0557】

ＩＩＩ．Ｄ．１．改変された標的化能力を有するＥＶ（例えば、エキソソーム）
本明細書に記載されるように、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）（例えば、ＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯを含む）は、例えば、免疫親和性リガンドまたは同族受容体リガンドの組み込みにより、その特性（例えば、体内分布）を調整するために操作され得る。例えば、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、それらを特定の細胞型、例えば、膵臓細胞、結腸直腸細胞、肺細胞、子宮細胞、胃細胞、精巣胚細胞、卵巣細胞、食道細胞、膀胱細胞、子宮頚部細胞、皮膚細胞、肝細胞、乳房細胞、前立腺細胞、シュワン細胞、感覚ニューロン、運動ニューロン、髄膜マクロファージ、腫瘍細胞、またはそれらの組み合わせに指向するために操作され得る。ある種の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、それらを膵臓細胞、結腸直腸細胞、肺細胞、及びそれらの組み合わせに指向するために操作される。ある種の態様では、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、それらの特定の区画、例えば、ＣＮＳ（クモ膜下腔内区画での保持を改善するために）または腫瘍微小環境への移行を増強するために操作され得る。

【0558】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、（ｉ）本明細書において開示されるＡＳＯ及び（ｉｉ）体内分布を修飾する薬剤または標的化部分を含む。幾つかの態様では、体内分布を修飾する薬剤または標的化部分は、単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨ及び／またはｖＮＡＲを含む。かかる単一ドメイン抗原結合部分に関する更なる開示は、本開示の他箇所で提供される。本明細書で使用する場合、用語「体内分布を修飾する薬剤」及び「標的化部分」は、互換的に使用され、インビボまたはインビトロでの（例えば、異なる種類の細胞の混合培養における）細胞外小胞（例えば、エキソソーム、ナノ小胞）の分布を修飾することができる薬剤を指す。幾つかの態様では、標的化部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の指向性を変化させ、すなわち、標的化部分は「指向性部分」である。本明細書で使用する場合、用語「指向性部分」は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）で発現される場合、ＥＶの本来の移動を変化させ、及び／または増強する標的化部分を指す。例えば、幾つかの態様では、指向性部分は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）が、特定の細胞、組織、または器官（例えば、膵臓細胞）により取り込まれるのを促進し得る。従って、幾つかの態様では、特に明記しない限り、用語「標的化部分」及び「指向性部分」は、互換的に使用され得る。

【0559】

幾つかの態様では、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、個々の細胞種及び組織における優先的な取り込みを示し、それらの指向性は、それらの表面に標的細胞の表面上の受容体と相互作用するタンパク質を追加することにより誘導され得る。指向性部分は、生体分子、例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、もしくは炭水化物、または合成分子を含み得る。例えば、幾つかの態様では、指向性部分は、親和性リガンド、例えば、抗体（例えば、抗ＣＤ１９ナノボディ、抗ＣＤ２２ナノボディ、抗ＣＬＥＣ９Ａナノボディ、または抗ＣＤ３ナノボディ）、ＶＨＨドメイン、ファージディスプレイペプチド、フィブロネクチンドメイン、ラクダ科ナノボディ、及び／またはｖＮＡＲを含み得る。幾つかの態様では、指向性部分は、例えば、合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、天然リガンド／分子（例えば、ＣＤ４０Ｌ、アルブミン、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９）、及び／または組換えタンパク質（例えば、ＸＴＥＮ）を含み得る。

【0560】

幾つかの態様では、指向性部分は、細胞によるＥＶ（例えば、エキソソーム）の取り込みを増加させ得る。幾つかの態様では、細胞によるＥＶ（例えば、エキソソーム）の取り込みを増加させ得る指向性部分は、リンパ球抗原７５（ＤＥＣ２０５またはＣＤ２０５としても公知）、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（ＣＬＥＣ９Ａ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー６（ＣＬＥＣ６）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（ＤＣＩＲまたはＣＬＥＣ４Ａとしても公知）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３捕捉非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮまたはＣＤ２０９としても公知）、レクチン型酸化ＬＤＬ受容体１（ＬＯＸ－１）、コラーゲン様構造マクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１０メンバーＡ（ＣＬＥＣ１０Ａ）、ＤＣアシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－２（ＣＤ３０３、ＣＬＥＣ４Ｃ）、デクチン２、ＢＳＴ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、ＳＩＧＬＥＣ６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、抗ＣＤ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0561】

幾つかの態様では、膵臓に対する指向性が望ましい場合、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の膵臓内の特定の区画または膵臓細胞に対する指向性を増加させる組織または細胞特異的な標的リガンドを含むように改変され得る。幾つかの態様では、結腸直腸組織に対する指向性が望ましい場合、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の結腸直腸組織内の特定の区画または結腸直腸細胞に対する指向性を増加させる組織または細胞特異的な標的リガンドを含むように改変され得る。幾つかの態様では、肺に対する指向性が望ましい場合、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の肺組織内の特定の区画または肺細胞に対する指向性を増加させる組織または細胞特異的な標的リガンドを含むように改変され得る。

【0562】

幾つかの態様では、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する指向性が望ましい場合、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、ＥＶ、例えば、エキソソームの特定の中枢神経系組織または細胞に対する指向性を増加させる組織または細胞特異的な標的リガンドを含み得る。幾つかの態様では、細胞は、グリア細胞である。幾つかの態様では、グリア細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、ミクログリア細胞、シュワン細胞、サテライトグリア細胞、嗅神経鞘細胞、またはそれらの組み合わせである。幾つかの態様では、細胞は、神経幹細胞である。幾つかの態様では、細胞は、感覚ニューロンである。

【0563】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームのシュワン細胞に対する指向性を増加させる細胞特異的標的化リガンド（すなわち、標的化／指向性部分）は、シュワン細胞表面マーカー、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）、Ｐ７５ＮＴＲ、ＮＣＡＭ、ＰＭＰ２２、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）（例えば、ＴｆＲ１またはＴｆＲ２）、アポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）、ガレクチン１（ＬＧＡＬＳ１）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、グリピカン－１、シンデカン－３、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。幾つかの態様では、細胞特異的指向性部分は、抗体またはその抗原結合性部分、アプタマー、またはシュワン細胞表面に発現される受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）のシュワン細胞に対する指向性を増加させる標的化部分は、トランスフェリン（またはそのバリアント及び／または断片）を含む。本開示に有用であるトランスフェリンの非限定的な例としては、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、オボトランスフェリン、メラノトランスフェリン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。幾つかの態様では、トランスフェリン受容体を標的とし得る指向性部分は、抗トランスフェリン受容体可変新規抗原受容体（ｖＮＡＲ）、例えば、一般的なモチーフ構造（ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－３－ＣＤＲ３－ＦＷ４）を有する結合ドメインを含む。例えば、ＵＳ２０１７／０３４８４１６（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。幾つかの態様では、標的化部分として使用され得るトランスフェリン受容体を標的とする抗体は、ＵＳ２０１９／０２０２９３６に記載されている（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）低親和性抗トランスフェリン受容体抗体を含む。

【0564】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）のＣＮＳへの指向性を増加させる標的化部分は、感覚ニューロンで発現されるリガンドに結合する。例えば、ある種の態様では、標的化部分は、トロポミオシン受容体キナーゼ（Ｔｒｋ）受容体（例えば、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、またはそれらの組み合わせ）に結合する。幾つかの態様では、Ｔｒｋ受容体に結合する標的化部分は、ニューロトロフィンを含む。ニューロトロフィンの非限定的な例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４１５）、ニューロトロフィン－６（ＮＴ－５）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）－２及び他のＦＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－ａ、ＴＧＦ－（３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、ペルセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー形成促進因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン－１、ヘッジホグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミドルシン（ｍｉｄｌｃｉｎｅ）、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、ならびに幹細胞因子（ＳＣＦ）（それらの断片及び／またはバリアントが含まれる）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ８，０５３，５６９；Ｌｅｉｂｒｏｃｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：１４９－１５２（１９８９）；Ｅｒｎｆｏｒｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １：９８３－９９６（１９９０）；Ｉｂａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，２１０５－２１１０，（１９９１）；ＬｅＳａｕｔｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，６５６４－６５６９（１９９５）；Ｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４８，１－１７（１９９７）を参照のこと（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。幾つかの態様では、Ｔｒｋ受容体に結合することができる標的化部分は、例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，２０９０－２０９１，（１９９７）（これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、モノクローナル抗体５Ｃ３、ＭＣ１９２、または両方を含む。幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の感覚ニューロンに対する指向性を増加させる標的化部分は、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）ペプチドを含む。

【0565】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）のＣＮＳに対する指向性を増加させる標的化部分は、運動ニューロンで発現されるリガンドに結合する。かかる標的化部分の非限定的な例としては、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）ペプチド、標的化軸索輸送（ＴＡｘＩ）ペプチド、Ｐ７５Ｒペプチド、Ｔｅｔ－Ｃペプチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１４／００２９４７２７；ＵＳ９，７５７，４７０；ＵＳ９，０５６，８９２；Ｓｅｌｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３：２５１４－２５１９（２０１６）を参照のこと（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。幾つかの態様では、本開示に有用な標的化部分は、表８（以下）に提供されるペプチドＢＢＢシャトルを含む。例えば、Ｏｌｌｅｒ－Ｓａｌｖｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６） Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４５，４６９０－４７０７、及びＪａｆａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １６：５８３－６０５（これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

【表7】

【0566】

幾つかの態様では、腫瘍細胞及び／または腫瘍微小環境に対する指向性が望ましい場合、本明細書に記載されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、腫瘍細胞及び／または腫瘍微小環境で発現される抗原に結合する標的化部分を含むように改変され得る。本開示から明らかであるように、幾つかの態様では、かかる標的化部分は、標的化部分のない対応するＥＶと比較して、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の腫瘍細胞及び／または腫瘍微小環境に対する指向性を増加させる。

【0567】

幾つかの態様では、標的化部分は、メソテリンまたはその断片に結合する抗原結合部分を含む。メソテリンまたはその断片に結合することができる当技術分野において公知の任意の抗原結合部分が本明細書において開示されるＥＶ（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡに特異的なＡＳＯを含むエキソソーム）と共に使用され得る。

【0568】

メソテリンは、肺の中皮細胞において、ならびに低レベルで心臓、胎盤、及び腎臓において発現される膜係留型タンパク質であり、メソテリンは、細胞接着に関与し得る。メソテリンは、中皮腫、卵巣癌、及び一部の扁平上皮細胞癌の腫瘍細胞でも発現され、このことは、メソテリンを腫瘍抗原標的候補にする。メソテリンの配列は、当技術分野において公知である。例えば、ヒトメソテリンの標準アミノ酸配列は、配列番号９１に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｑ１３４２１－１）。ヒトメソテリンの以下の少なくとも３つのアイソフォームが存在し、これらは選択的スプライシングの結果である：（ｉ）アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｑ１３４２１－３；配列番号９２）；（ｉｉ）アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｑ１３４２１－２；配列番号９３）；及び（ｉｉｉ）アイソフォーム４（ＵｎｉＰｒｏｔ識別子：Ｑ１３４２１－４；配列番号９４）。幾つかの態様では、本明細書において開示される標的化部分は、本明細書において開示されるヒトメソテリンタンパク質のうちの１種以上に結合し得る。

【0569】

原理上は、ＡＳＯ及び少なくとも１種の指向性部分を含む本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、指向性部分の存在が、（単独で、または抗貪食シグナル、例えば、ＣＤ４７の存在及び特定の投与経路の使用と組み合わせて）ＥＶ、例えば、エキソソームの所望の標的細胞または組織（例えば、膵臓、結腸直腸組織、または肺）に対する指向性を誘発するため、当該技術分野において公知の任意の好適な投与方法（例えば、静脈内注射または注入）を使用して投与され得る。

【0570】

ある種の態様では、指向性部分は、ＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結される、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結される。指向性は、抗貪食シグナル（例えば、ＣＤ４７及び／またはＣＤ２４）、半減期延長部分（例えば、アルブミンまたはＰＥＧ）、またはそれらの任意の組み合わせの本開示のＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面への結合により更に改善され得る。ある種の態様では、抗貪食シグナルは、ＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に、連結される、例えば、マレイミド部分を介して化学的に連結される。

【0571】

薬物動態、体内分布、ならびに特に所望の組織または解剖学的位置への指向性及びそれらでの保持は、適切な投与経路（例えば、中枢神経系に対する指向性を改善するためのクモ膜下腔内投与または眼内投与）を選択することによっても達成され得る。

【0572】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも２種の異なる指向性部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、３種の異なる指向性部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、４種の異なる指向性部分を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、５種以上の異なる指向性部分を含む。幾つかの態様では、指向性部分の１種以上は、細胞によるＥＶ、例えば、エキソソームの取り込みを増加させる。幾つかの態様では、各指向性部分は、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合される。幾つかの態様では、複数の指向性部分が、同じ足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合され得る。幾つかの態様では、幾つかの指向性部分が、直列に足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合され得る。幾つかの態様では、本明細書において開示される指向性部分またはそれらの組み合わせは、リンカーまたはスペーサーを介して足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合される。幾つかの態様では、リンカーもしくはスペーサーまたはそれらの組み合わせは、本明細書において開示される２つの指向性部分の間に配置される。

【0573】

本開示のＥＶ、例えば、エキソソームを神経系の異なる細胞種に指向することができる指向性部分の非限定的な例は、以下で開示される。

【0574】

ＩＩＩ．Ｅ．抗貪食シグナル
投与されたＥＶ、例えば、エキソソームの身体の免疫系による排除は、投与されたＥＶ、例えば、エキソソーム治療の有効性を低減し得る。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面は、免疫系の細胞、例えば、マクロファージによるＥＶ、例えば、エキソソームの取り込みを制限または阻害するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面は、マクロファージによるＥＶ、例えば、エキソソームの取り込みを阻害する１種以上の表面抗原を発現するように改変される。幾つかの態様では、表面抗原は、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に会合している。

【0575】

本開示に有用である表面抗原としては、限定されるものではないが、細胞を「自己」細胞として標識する抗原が挙げられる。幾つかの態様では、表面抗原は、抗貪食シグナルを含む。幾つかの態様では、抗貪食シグナルは、ＣＤ４７、ＣＤ２４、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。ある種の態様では、抗貪食シグナルは、ＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４を含む。幾つかの態様では、抗貪食シグナルは、ＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４の断片を含む。ある種の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの外部表面にＣＤ４７またはその断片を発現するように改変される。

【0576】

本明細書で使用する場合、白血球表面抗原ＣＤ４７及びインテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）とも称されるＣＤ４７は、身体の多数の細胞上に見出される膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、それが免疫細胞、特に骨髄性細胞に、ＣＤ４７を発現する特定の細胞が外来細胞でないことを伝達するため、多くの場合、「私を食べないで」シグナルと称される。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰＡの受容体であり、この受容体への結合は、未成熟な樹状細胞の成熟を防止し、成熟樹状細胞によるサイトカイン産生を阻害する。ＣＤ４７のＳＩＲＰＧとの相互作用は、細胞間接着を媒介し、スーパー抗原依存的Ｔ細胞媒介増殖を増強し、Ｔ細胞活性化を同時刺激する。ＣＤ４７は、血小板上のＴＨＢＳ１に対する接着受容体として作用することによる細胞接着及びインテグリンの調節の両方における役割を有することも公知である。ＣＤ４７は、（類似性により）海馬における記憶形成及びシナプス可塑性においても重要な役割を果たす。加えて、ＣＤ４７は、膜輸送及び／またはインテグリン依存性シグナル伝達において役割を果たし得、赤血球の早期除去を防止し得、ウイルス感染後に誘発される膜透過性の変化に関与し得る。

【0577】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面上にヒトＣＤ４７を発現するように改変される。ヒトＣＤ４７の標準アミノ酸配列及び様々な公知のアイソフォームは、表９に示される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０８７２２；配列番号６２９～６３２）。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号６２９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号６３０に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号６３１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、配列番号６３２に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片を発現するように改変される。

【表8-1】

【表8-2】

【0578】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面に全長ＣＤ４７を発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面にＣＤ４７の断片を発現するように改変され、ここで、当該断片は、ＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む。マクロファージによるファゴサイトーシスを阻止及び／または阻害する能力を保持するＣＤ４７の任意の断片が、本明細書において開示されるＥＶ、例えば、エキソソームに使用され得る。幾つかの態様では、断片は、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１４１（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１４１）を含む。幾つかの態様では、断片は、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１３５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３５）を含む。幾つかの態様では、断片は、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１３０（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３０）を含む。幾つかの態様では、断片は、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１２５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１２５）を含む。

【0579】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１４１（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１４１）に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１３５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３５）に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１３０（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３０）に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ヒトＣＤ４７標準配列のアミノ酸１９～約１２５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１２５）に対する少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。

【0580】

幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片は、ＣＤ４７及びそのリガンドであるＳＩＲＰαの親和性を増加させるように改変される。幾つかの態様では、ＣＤ４７の断片は、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）－ＣＤ４７を含む（例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２９０：１２６５０－６３（２０１５）（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。幾つかの態様では、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）－ＣＤ４７は、野生型ヒトＣＤ４７配列（配列番号６２９）と比較してＣ１５Ｓ置換を含む。

【0581】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、未改変のＥＶ、例えば、エキソソームより高いレベルでＥＶ、例えば、エキソソームの表面に発現されたＣＤ４７またはその断片を含む。幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片は、足場タンパク質と融合される。本明細書において開示される任意の足場タンパク質が、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面にＣＤ４７またはその断片を発現させるために使用され得る。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、足場Ｘタンパク質のＮ末端に融合されたＣＤ４７の断片を発現するように改変される。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合されたＣＤ４７の断片を発現するように改変される。

【0582】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約２０分子、少なくとも約３０分子、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約７５０、または少なくとも約１０００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約２０分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約３０分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約４０分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約５０分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約１００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約２００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約３００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約４００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約５００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、少なくとも約１０００分子のＣＤ４７をＥＶ、例えば、エキソソームの表面に含む。

【0583】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面でのＣＤ４７またはその断片の発現は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームと比較して、骨髄性細胞によるＥＶ、例えば、エキソソームの取り込みの減少をもたらす。幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームの骨髄性細胞による取り込みは、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームの骨髄性細胞による取り込みと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。

【0584】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面でのＣＤ４７またはその断片の発現は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームと比較して、ＥＶ、例えば、エキソソームの肝臓への局在化の減少をもたらす。幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームの肝臓への局在化は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームの肝臓への局在化と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％減少する。

【0585】

幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームのインビボ半減期は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームのインビボ半減期と比較して増加する。幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームのインビボ半減期は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームのインビボ半減期と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加する。

【0586】

幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームは、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームの循環血液、例えば、血漿中での保持と比較して、循環血液、例えば、血漿中での保持の増加を有する。幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームの循環血液、例えば、血漿中での保持は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エキソソームの循環血液、例えば、血漿中での保持と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加する。

【0587】

幾つかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エキソソームは、ＣＤ４７またはその断片を発現しないエキソソームと比較した場合に、変化した体内分布を有する。幾つかの態様では、変化した体内分布は、内皮細胞、Ｔ細胞への取り込みの増加、または限定されるものではないが、肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、脳脊髄液（ＣＳＦ）、筋肉（例えば、骨格筋、心筋）、骨、骨髄、血液、脾臓、リンパ節、胃、食道、横隔膜、膀胱、大腸、膵臓、甲状腺、唾液腺、副腎、下垂体、胸部、皮膚、卵巣、子宮、前立腺、精巣、頸部、もしくはそれらの任意の組み合わせが含まれる種々の組織における蓄積の増加をもたらす。

【0588】

ＩＶ．操作されたエキソソームの産生のための産生細胞
本開示のＥＶ、例えば、エキソソームは、インビトロで増殖された細胞または対象の体液から産生され得る。エキソソームがインビトロ細胞培養物から産生される場合、様々な産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、及びＭＳＣが使用され得る。ある種の態様では、産生細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。

【0589】

幾つかの態様では、産生細胞は、ヒト胎児腎臓２９３細胞である。多くの場合、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、２９３細胞、またはより不正確にＨＥＫ細胞とも称される、ヒト胎児腎臓２９３細胞は、元々組織培養で増殖されたヒト胎児腎臓細胞に由来する特定の細胞株である。

【0590】

ＨＥＫ２９３細胞は、オランダのライデンのＡｌｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの研究室において、正常ヒト胎児腎臓細胞の培養物の切断されたアデノウイルス５型ＤＮＡでの形質移入により、１９７３年に作製された。細胞は培養され、アデノウイルスにより形質移入された。その後の解析により、ウイルスゲノムのレフトアームから約４．５キロベースを挿入することにより形質転換が引き起こされ、これはヒト１９番染色体に組み込まれたことが示された。

【0591】

ＨＥＫ２９３及び５つの派生細胞株のゲノム及びトランスクリプトームの網羅的研究により、ＨＥＫ２９３のトランスクリプトームがヒト腎臓、副腎、下垂体、及び中枢神経組織のものと比較された。ＨＥＫ２９３パターンは、多数の神経特性を有する副腎細胞のものと最も酷似していた。

【0592】

ＨＥＫ２９３細胞は、複雑な核型を有し、２コピー以上の各染色体を示し、６４の最頻染色体数を有する。それらは、一倍体のヒト配偶子の染色体数の３倍未満の染色体数を有する低三倍体と記載されている。染色体異常としては、合計３コピーのＸ染色体ならびに４コピーの染色体１７及び染色体２２が挙げられる。

【0593】

ＥＶを生成するのに有用なＨＥＫ２９３細胞のバリアントとしては、限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、及びＨＥＫ２９３Ｔが挙げられる。

【0594】

産生細胞は、本明細書に記載されるＥＶを生成するために、ＡＳＯをコードする外来性配列を含むように遺伝子改変され得る。遺伝子改変された産生細胞は、一過性または安定性形質転換により外来性配列を含有し得る。外来性配列は、プラスミドとして形質転換され得る。幾つかの態様では、外来性配列は、ベクターである。外来性配列は、産生細胞のゲノム配列の標的部位またはランダムな部位に安定的に組み込まれ得る。幾つかの態様では、内腔が操作されたエキソソームの生成のために、安定細胞株が作製される。

【0595】

外来性配列は、産生細胞のゲノム配列に挿入され得、エキソソームタンパク質をコードする内因性配列の配列内、その上流（５’末端）、またはその下流（３’末端）に存在し得る。当該技術分野において公知の様々な方法が、産生細胞に外来性配列を導入するために使用され得る。例えば、様々な遺伝子編集方法（例えば、相同組換え、トランスポゾンにより媒介されるシステム、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを使用した方法）を使用して改変された細胞が本開示の範囲内である。

【0596】

外来性配列は、本明細書において開示される足場部分またはその断片もしくはバリアントをコードする配列を含み得る。余分なコピーの足場部分をコードする配列が、本明細書に記載されるエキソソーム（例えば、ＥＶ、例えば、エキソソームの表面または内腔表面により高密度の足場部分を有するエキソソーム）を生成するために導入され得る。足場部分の改変型または断片をコードする外来性配列は、当該足場部分の当該改変型または当該断片を含有する内腔が操作され、及び／または表面が操作されたエキソソームを生成するために導入され得る。

【0597】

幾つかの態様では、産生細胞は、ＡＳＯに連結された足場部分をコードする１種以上のベクターで改変、例えば、形質移入され得る。

【0598】

幾つかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エキソソーム（例えば、表面が操作され、及び／または内腔が操作されたエキソソーム）は、本明細書において開示される全長の成熟足場部分またはＡＳＯに連結された足場部分をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。本明細書に記載される足場部分のいずれかは、プラスミド、ゲノムに挿入された外来性配列、または他の外来性核酸、例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から発現され得る。

【0599】

Ｖ．医薬組成物
本明細書において、所望の純度を有する本開示のＥＶ、例えば、エキソソーム、及び薬学的に許容される担体または賦形剤を、対象への投与に好適な形態で含む医薬組成物が提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法により部分的に決定され得る。従って、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照のこと）。医薬組成物は、一般に、無菌かつＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによる全ての優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）の規定に完全準拠で製剤化される。

【0600】

幾つかの態様では、医薬組成物は、１種以上の治療薬及び本明細書に記載されるエキソソームを含む。ある種の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、薬学的に許容される担体中の１種以上の追加の治療薬と同時投与される。幾つかの態様では、本開示のためのＡＳＯ及び１種以上の追加の治療薬は、同じＥＶで投与され得る。他の態様では、本開示のためのＡＳＯ及び１種以上の追加の治療薬は、異なるＥＶで投与される。例えば、本開示は、ＡＳＯを含むＥＶ及び追加の治療薬を含むＥＶを含む医薬組成物を含む。幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬（複数可）の投与前に投与される。他の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬（複数可）の投与後に投与される。更なる態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、追加の治療薬（複数可）と同時に投与される。

【0601】

許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエント（例えば、動物またはヒト）に対し無毒性であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンが挙げられる抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、またはデキストリンが挙げられる単糖、二糖、及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。

【0602】

キャリアまたは希釈剤の例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。薬学的活性物質のためのかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または化合物が本明細書に記載される細胞外小胞と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的治療薬も組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物は、その意図される投与経路と適合可能となるように製剤化される。ＥＶ、例えば、エキソソームは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路により、または吸入剤として投与され得る。ある種の態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、例えば、注射により静脈内投与される。ＥＶ、例えば、エキソソームは、任意に、ＥＶ、例えば、エキソソームが対象とする疾患、障害、または状態を処置するのに少なくとも部分的に効果的である他の治療薬と組み合わせて投与され得る。

【0603】

溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：無菌の希釈剤、例えば、水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌化合物、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート化合物、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはホスフェート、及び張度の調整のための化合物、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムにより調整され得る。調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多人数用バイアルに入れられ得る。

【0604】

注射用途に好適な医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性である場合）または分散体及び無菌の粉末が挙げられる。静脈内投与に好適なキャリアとしては、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。組成物は、一般に、無菌かつ注射針通過が容易である程度まで流動的である。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散体の場合に必要な粒子サイズを維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗細菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。必要に応じて、等張性化合物、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムが組成物に添加され得る。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に入れることにより引き起こされ得る。

【0605】

無菌注射溶液は、所望される場合、本明細書において列挙されるか、当該技術分野において公知の１種以上の成分と共に、ＥＶ、例えば、エキソソームを有効量で、かつ適切な溶媒中に組み込むことにより調製され得る。一般に、分散体は、ＥＶ、例えば、エキソソームを基本的な分散媒及び任意の所望の他の成分を含有する無菌のビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、調製法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分及び任意の更なる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及びフリーズドライである。ＥＶ、例えば、エキソソームは、ＥＶ、例えば、エキソソームの持続放出またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る、蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与され得る。

【0606】

またエキソソームを含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によるものであってもよい。経粘膜投与用には、透過されるべきバリアに適した浸透剤が製剤中に使用される。かかる浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与用の、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、例えば、鼻内噴霧を使用することにより達成され得る。

【0607】

ある種の態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物は、医薬組成物から恩恵を受ける対象に静脈内投与される。ある種の他の態様では、組成物は、例えば、リンパ管内注射もしくは結節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８（２００８）参照のこと）によりリンパ系に、または筋肉内注射により、皮下投与により、腫瘍内注射により、胸腺または肝臓への直接注入により投与される。

【0608】

ある種の態様では、エキソソームを含む医薬組成物は、懸濁液として投与される。ある種の態様では、医薬組成物は、投与後に貯留物を形成することができる製剤として投与される。ある種の好ましい態様では、貯留物は、ＥＶ、例えば、エキソソームを血行にゆっくりと放出するか、または貯留物形態で残存する。

【0609】

通常、薬学的に許容される組成物は、夾雑物を含まないように高度に精製されており、生体適合性であり、かつ有毒でなく、対象への投与に適している。水がキャリアの構成成分である場合、水は、夾雑物（例えば、エンドトキシン）を含まないように高度に精製及び処理される。

【0610】

薬学的に許容されるキャリアは、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、それらに限定されない。医薬組成物は、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、調味料、乳化剤、沈殿防止剤、及び／または防腐剤を更に含み得る。

【0611】

幾つかの態様では、本明細書に記載される医薬組成物は、薬学的に許容される塩を含む。幾つかの態様では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0612】

本明細書に記載される医薬組成物は、本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソーム及び任意に追加の薬学的活性薬剤または治療薬を含む。追加の治療薬は、生物学的薬剤、低分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。幾つかの態様では、追加の治療薬は、追加のＫＲＡＳアンタゴニストである。幾つかの態様では、ＫＲＡＳアンタゴニストは、本明細書において開示される任意のＫＲＡＳアンタゴニストである。幾つかの態様では、追加のＫＲＡＳアンタゴニストは、抗ＫＲＡＳ抗体である。幾つかの態様では、追加のＫＲＡＳアンタゴニストは、低分子である。幾つかの態様では、追加のＫＲＡＳアンタゴニストは、低分子である。ある種の態様では、追加の治療薬は、抗がん療法である。かかる抗がん療法の非限定的な例としては、外科療法、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0613】

幾つかの態様では、追加のＫＲＡＳアンタゴニストは、ＡＳＯを含む。幾つかの態様では、追加のＫＲＡＳアンタゴニストは、本明細書に記載される任意のＡＳＯを含む。

【0614】

本明細書に記載されるＥＶ、例えば、エキソソームを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。幾つかの態様では、剤形は、静脈内注射のための懸濁液として製剤化される。幾つかの態様では、剤形は、腫瘍内注射のための懸濁液として製剤化される。

【0615】

ある種の態様では、エキソソームの調製物は、残存する複製能のある核酸に損傷を与えるために、放射線照射、例えば、Ｘ線、γ線、β粒子、α粒子、中性子、プロトン、元素核、紫外線に供される。

【0616】

ある種の態様では、エキソソームの調製物は、１ｋＧｙ超、５ｋＧｙ、１０ｋＧｙ、１５ｋＧｙ、２０ｋＧｙ、２５ｋＧｙ、３０ｋＧｙ、３５ｋＧｙ、４０ｋＧｙ、５０ｋＧｙ、６０ｋＧｙ、７０ｋＧｙ、８０ｋＧｙ、９０ｋＧｙ、１００ｋＧｙ、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用してγ線照射に供される。

【0617】

ある種の態様では、エキソソームの調製物は、０．１ｍＳｖ超、０．５ｍＳｖ、１ｍＳｖ、５ｍＳｖ、１０ｍＳｖ、１５ｍＳｖ、２０ｍＳｖ、２５ｍＳｖ、３０ｍＳｖ、３５ｍＳｖ、４０ｍＳｖ、５０ｍＳｖ、６０ｍＳｖ、７０ｍＳｖ、８０ｍＳｖ、９０ｍＳｖ、１００ｍＳｖ、２００ｍＳｖ、３００ｍＳｖ、４００ｍＳｖ、５００ｍＳｖ、６００ｍＳｖ、７００ｍＳｖ、８００ｍＳｖ、９００ｍＳｖ、１０００ｍＳｖ、２０００ｍＳｖ、３０００ｍＳｖ、４０００ｍＳｖ、５０００ｍＳｖ、６０００ｍＳｖ、７０００ｍＳｖ、８０００ｍＳｖ、９０００ｍＳｖ、１００００ｍＳｖ、または１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用してＸ線照射に供される。

【0618】

ＶＩ．キット
また本明細書において、本明細書に記載される１種以上のＥＶ（例えば、エキソソーム）を含むキットも提供される。幾つかの態様では、本明細書に記載される医薬組成物の成分のうちの１つ以上、例えば、本明細書において提供される１種以上のエキソソームが充填された１つ以上の容器、任意の使用説明書を含む医薬パックまたはキットが本明細書において提供される。幾つかの態様では、キットは、本明細書に記載の医薬組成物及び任意の予防薬または治療薬、例えば、本明細書に記載されるものを含有する。幾つかの態様では、キットは、本明細書において開示される任意の方法に従ってＥＶを投与するための説明書を更に含む。幾つかの態様では、キットは、造血に関連する疾患または状態の処置に使用するためのものである。幾つかの態様では、キットは、診断キットである。

【0619】

ＶＩＩ．ＥＶを生成する方法
幾つかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるＥＶを生成する方法も対象とする。幾つかの態様では、本方法は、産生細胞からＥＶ、例えば、エキソソームを得ることであって、当該産生細胞がＥＶ、例えば、エキソソームの１種以上の構成要素（例えば、ＡＳＯ）を含有する、当該得ること；及び任意に得られたＥＶ、例えば、エキソソームを単離することを含む。幾つかの態様では、本方法は、本明細書において開示されるＥＶの１種以上の構成要素（例えば、ＡＳＯ）を導入することにより産生細胞を改変すること；改変された産生細胞から、ＥＶ、例えば、エキソソームを得ること；及び任意に得られたＥＶ、例えば、エキソソームを単離することを含む。更なる態様では、本方法は、産生細胞からＥＶを得ること；得られたＥＶを単離すること；及び単離されたＥＶを改変することを含む。ある種の態様では、本方法は、単離されたＥＶを医薬組成物に製剤化することを更に含む。

【0620】

ＶＩＩ．Ａ．産生細胞を改変する方法
上記のように、幾つかの態様では、ＥＶを生成する方法は、１種以上の部分（例えば、ＡＳＯ）で産生細胞を改変することを含む。ある種の態様では、１種以上の部分は、ＡＳＯを含む。幾つかの態様では、１種以上の部分は、本明細書において開示される足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を更に含む。

【0621】

幾つかの態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある種の態様では、産生細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株の非限定的な例としては、以下が挙げられる：ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株、及びそれらの組み合わせ。ある種の態様では、哺乳動物細胞株には、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。幾つかの態様では、産生細胞は、初代細胞である。ある種の態様では、初代細胞は、初代哺乳動物細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞であり得る。

【0622】

幾つかの態様では、産生細胞は、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）ではない。他の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、Ｋｕｐｆｆｅｒ－Ｂｒｏｗｉｃｚ細胞、または任意のかかる細胞に由来する細胞）ではない。

【0623】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、導入遺伝子またはｍＲＮＡで有り得、形質移入、ウイルス形質導入、エレクトロポレーション、押出し、音波処理、細胞融合、または当業者に公知の他の方法により産生細胞に導入され得る。

【0624】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、形質移入により産生細胞に導入される。幾つかの態様では、１種以上の部分は、合成高分子、例えば、カチオン脂質及びポリマーを使用して好適な産生細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。幾つかの態様では、カチオン脂質は、電荷相互作用により１種以上の部分と複合体を形成する。これらの態様の幾つかでは、正に荷電した複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる。幾つかの他の態様では、カチオン性ポリマーが、産生細胞を形質移入するために使用され得る。これらの態様の幾つかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある種の態様では、化学物質、例えば、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンが、産生細胞に１種以上の部分を導入するために使用され得る。１種以上の部分は、物理的方法、例えば、粒子により媒介される形質移入、「遺伝子銃」、微粒子銃、または粒子衝撃法を使用して産生細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。例えば、β‐ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子が、産生細胞の形質移入効率を評価するために使用され得る。

【0625】

ある種の態様では、１種以上の部分は、ウイルス形質導入により産生細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスが含まれる多数のウイルスが遺伝子導入媒体として使用され得る。ウイルスに媒介される遺伝子導入の媒体には、ＤＮＡウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びヘルペスウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターが含まれる。

【0626】

ある種の態様では、１種以上の部分は、エレクトロポレーションにより産生細胞に導入される。エレクトロポレーションは、一過性に細胞膜に孔を生じさせ、細胞への様々な分子の導入を可能にする。幾つかの態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびにポリペプチド及び非ポリペプチド治療薬が、エレクトロポレーションにより産生細胞に導入され得る。

【0627】

ある種の態様では、１種以上の部分は、マイクロインジェクションにより産生細胞に導入される。幾つかの態様では、ガラスマイクロピペットが、顕微鏡レベルで産生細胞に１種以上の部分を注入するために使用され得る。

【0628】

ある種の態様では、１種以上の部分は、押出しにより産生細胞に導入される。

【0629】

ある種の態様では、１種以上の部分は、音波処理により産生細胞に導入される。幾つかの態様では、産生細胞は、一過性に細胞膜の破壊を引き起こす高強度音波に曝露され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。

【0630】

ある種の態様では、１種以上の部分は、細胞融合により産生細胞に導入される。幾つかの態様では、１種以上の部分は、電気的細胞融合により導入される。他の態様では、産生細胞を融合するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が使用される。更なる態様では、産生細胞を融合するために、センダイウイルスが使用される。

【0631】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、低張圧による溶解により産生細胞に導入される。かかる態様において、産生細胞は、それらを破裂させる低イオン強度緩衝液に曝露され得、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。他の態様では、産生細胞を膨張させ、産生細胞の膜に孔を生じさせるために、低張液に対する制御された透析が使用され得る。その後、産生細胞は、膜の再封鎖を可能にする条件に曝露される。

【0632】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、界面活性剤処理により産生細胞に導入される。ある種の態様では、産生細胞は、孔を生じさせることにより産生細胞の膜を一過性に傷つける弱い界面活性剤で処理され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。産生細胞がロードされた後、界面活性剤は洗い流され、これにより、膜が再封鎖される。

【0633】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより産生細胞に導入される。ある種の態様では、産生細胞は、１種以上の部分の結合時に、受容体及び会合した部分の内部移行を誘発する表面受容体を有する。

【0634】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、濾過により産生細胞に導入される。ある種の態様では、産生細胞及び１種以上の部分は、産生細胞より小さい孔径のフィルターを通して押し出され得、これにより、産生細胞の膜の破壊を一過性に引き起こし、１種以上の部分が産生細胞に入るのを可能にする。

【0635】

幾つかの態様では、産生細胞は、細胞膜の破壊をもたらす数回の凍結融解サイクルに供され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。

【0636】

ＶＩＩ．Ｂ．ＥＶ、例えば、エキソソームを改変する方法
幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームを生成する方法は、１種以上の部分をＥＶに直接導入することにより、単離されたＥＶを改変することを含む。ある種の態様では、１種以上の部分は、ＡＳＯを含む。幾つかの態様では、１種以上の部分は、本明細書において開示される足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を含む。

【0637】

ある種の態様では、１種以上の部分は、形質移入によりＥＶに導入される。幾つかの態様では、１種以上の部分は、合成高分子、例えば、カチオン脂質及びポリマーを使用してＥＶに導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。ある種の態様では、化学物質、例えば、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンが、ＥＶに１種以上の部分を導入するために使用され得る。

【0638】

ある種の態様では、１種以上の部分は、エレクトロポレーションによりＥＶに導入される。幾つかの態様では、ＥＶは、ＥＶ膜に一過性に孔を生じさせる電界に曝露され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。

【0639】

ある種の態様では、１種以上の部分は、マイクロインジェクションによりＥＶに導入される。幾つかの態様では、ガラスマイクロピペットが、顕微鏡レベルでＥＶに１種以上の部分を直接注入するために使用され得る。

【0640】

ある種の態様では、１種以上の部分は、押出しによりＥＶに導入される。

【0641】

ある種の態様では、１種以上の部分は、音波処理によりＥＶに導入される。幾つかの態様では、ＥＶは、一過性にＥＶ膜の破壊を引き起こす高強度音波に曝露され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。

【0642】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、ＥＶの表面にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、当該技術分野において公知の方法により化学的に、または酵素的により達成され得る。

【0643】

幾つかの態様では、ＥＶは、化学的にコンジュゲートされている１種以上の部分を含む。化学的コンジュゲーションは、リンカー使用をした、または使用しない１種以上の部分の別の分子との共有結合形成により達成され得る。かかるコンジュゲートの形成は、当業者の技術の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための様々な技術が公知であり、特定の技術の選択は、コンジュゲートされる物質により左右される。ある種の態様では、ポリペプチドは、ＥＶにコンジュゲートする。幾つかの態様では、非ポリペプチド、例えば脂質、炭水化物、核酸、及び低分子が、ＥＶにコンジュゲートされる。

【0644】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、低張圧による溶解によりＥＶに導入される。かかる態様において、ＥＶは、それらを破裂させる低イオン強度緩衝液に曝露され得、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。他の態様では、ＥＶを膨張させ、ＥＶ膜に孔を生じさせるために、低張液に対する制御された透析が使用され得る。その後、ＥＶは、膜の再封鎖を可能にする条件に曝露される。

【0645】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、界面活性剤処理によりＥＶに導入される。ある種の態様では、細胞外小胞は、孔を生じさせることによりＥＶ膜を一過性に傷つける弱い界面活性剤で処理され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。ＥＶがロードされた後、界面活性剤は洗い流され、これにより、膜が再封鎖される。

【0646】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、受容体により媒介されるエンドサイトーシスによりＥＶに導入される。ある種の態様では、ＥＶは、１種以上の部分の結合時に、受容体及び会合した部分の内部移行を誘発する表面受容体を有する。

【0647】

幾つかの態様では、１種以上の部分は、機械的発射によりＥＶに導入される。ある種の態様では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアなどの重い粒子または帯電粒子に付着した１種以上の部分を照射され得る。これらの態様の幾つかでは、粒子は、それがＥＶ膜を横切るように、機械的または電気的に加速され得る。

【0648】

幾つかの態様では、細胞外小胞は、ＥＶ膜の破壊をもたらす数回の凍結融解サイクルに供され、これにより、１種以上の部分のローディングが可能となる。

【0649】

ＶＩＩ．Ｃ．ＥＶ、例えば、エキソソームを単離する方法
幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶを生成する方法は、産生細胞からＥＶを単離することを含む。ある種の態様では、ＥＶは、産生細胞により細胞培養培地に放出される。ＥＶの全ての既知の単離方法が本明細書における使用に好適とみなされることが意図される。例えば、ＥＶの物理的性質を用いて、それらが培地または他の供給源物質から分離され得、これには、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子篩操作など）、密度（例えば、標準的な遠心分離または勾配遠心分離）、スベドベリ定数（例えば、外力による沈降または外力によらない沈降など）に基づく分離が含まれる。あるいは、または加えて、単離は、１つ以上の生物学的性質に基づき得、これには、表面マーカーを用い得る方法が挙げられる（例えば、沈降の場合、固相への可逆的な結合、ＦＡＣＳ分離、特異的なリガンド結合、非特異的なリガンド結合、親和性精製など）。

【0650】

単離及び濃縮は、通常、連続的な遠心分離が含まれる、一般的な方法及び非選択的な方法でなされ得る。あるいは、単離及び濃縮は、より特異的な方法及び選択的な方法で、例えば、ＥＶまたは産生細胞特異的表面マーカーを使用してなされ得る。例えば、特異的表面マーカーが、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、親和性精製、及びビーズに結合されたリガンドによる磁気分離において使用され得る。

【0651】

幾つかの態様では、サイズ排除クロマトグラフィーがＥＶを単離するために利用され得る。サイズ排除クロマトグラフィー技術は、当技術分野において公知である。例示的な非限定的技術が本明細書において提供される。幾つかの態様では、ボイド容量画分が単離され、関心対象のＥＶを含む。更に幾つかの態様では、当技術分野において一般的に公知であるように、ＥＶは、（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技術によるクロマトグラフ分離後に更に単離され得る。幾つかの態様では、例えば、密度勾配遠心分離が細胞外小胞を更に単離するために利用され得る。ある種の態様では、産生細胞に由来するＥＶを他の起源のＥＶから更に分離することが望ましい場合がある。例えば、産生細胞に由来するＥＶは、産生細胞に特異的な抗原抗体を使用した免疫吸着捕捉により産生細胞に由来しないＥＶから分離され得る。

【0652】

幾つかの態様では、ＥＶの単離は、限定されるものではないが、分画遠心分離、サイズに基づく膜分離、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離が挙げられる方法の組み合わせを含み得る。

【0653】

ＶＩＩＩ．使用する方法
本開示は、疾患または障害を予防及び／または処置する必要がある対象の疾患または障害を予防及び／または処置する方法であって、本明細書において開示される（例えば、本開示のＡＳＯを含む）ＥＶ（例えば、エキソソーム）を当該対象に投与することを含む、当該方法も提供する。本開示は、細胞（例えば、腫瘍細胞）におけるＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減及び／または阻害する（インビトロまたはインビボでの）方法を更に提供する。ある種の態様では、ＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減及び／または阻害するインビトロでの方法は、本明細書において開示されるＥＶ、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を、当該ＫＲＡＳ転写物及び／またはＫＲＡＳタンパク質を発現する細胞に接触させることを含む。ある種の態様では、ＫＲＡＳ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現を低減及び／または阻害するインビボでの方法は、本開示のＥＶ、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物を、投与する必要がある対象に投与することを含む。

【0654】

幾つかの態様では、細胞に接触させること、または対象に投与することは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現の低減及び／または阻害をもたらす。ある種の態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは、ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現と比較して、投与後に少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。幾つかの態様では、ＫＲＡＳタンパク質は、ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＫＲＡＳタンパク質の発現と比較して、投与後に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減される。本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質は、野生型またはそのバリアント（例えば、Ｇ１２Ｄ変異を含む）であり得る。

【0655】

本明細書に記載されるように、幾つかの態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現の低減は、細胞、例えば、異常なＫＲＡＳ活性を示す腫瘍細胞の生存率及び／または増殖の減少をもたらす。ある種の態様では、細胞の生存率及び／または増殖は、本開示のＥＶ、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物で処理されなかった対応する細胞の生存率及び／または増殖と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。

【0656】

幾つかの態様では、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質の発現の減少は、細胞、例えば、異常なＫＲＡＳ活性を示す腫瘍細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路（例えば、ｐＥＲＫ）に関連するタンパク質の発現の減少をもたらす。ある種の態様では、ＭＡＰキナーゼ経路に関連するタンパク質の発現は、本開示のＥＶ、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物で処理されなかった対応する細胞のＭＡＰキナーゼ経路に関連するタンパク質と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。ある種の態様では、タンパク質の発現の低減は、ＭＡＰキナーゼ経路によるシグナル伝達の低減及び／または阻害をもたらす。

【0657】

本明細書に記載されるように、本開示に有用なＡＳＯは、ＫＲＡＳ転写物（例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の１つ以上の領域に特異的にハイブリダイズすることができ、細胞におけるＫＲＡＳタンパク質発現の低減及び／または阻害をもたらす。従って、かかるＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）（例えば、本明細書において開示されるＥＶ）は、ＫＲＡＳタンパク質の発現の増加及び／または異常な活性に関連する任意の疾患または障害を予防及び／または処置するのに有用であり得る。

【0658】

幾つかの態様では、本発明の方法により処置され得る疾患または障害には、がんが含まれる。幾つかの態様では、がんは、固形腫瘍に関連する。幾つかの態様では、がんは、液性腫瘍に関連する。本明細書で使用する場合、用語「固形腫瘍」は、嚢胞または液体領域を有さず、通常、骨、筋肉、及び器官に生じる異常な組織塊を指す。本明細書で使用する場合、用語「液性腫瘍」は、体液（例えば、血液及び骨髄）において生じる腫瘍を指す。ある種の態様では、がんは、ＫＲＡＳタンパク質の発現の増加に関連する。幾つかの態様では、ＫＲＡＳタンパク質は、変異、例えば、Ｇ１２Ｄを含む。

【0659】

本開示により処置され得るがんの非限定的な例としては、結腸直腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、白血病、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、胆管癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣ）、肉腫、黒色腫、神経膠腫（例えば、低悪性度神経膠腫、例えば、グリア芽細胞腫）、中皮腫、肝臓癌、乳癌（例えば、浸潤性乳癌）、腎臓癌（例えば、乳頭状腎細胞癌（ｐＲＣＣ）及び嫌色素性腎細胞癌）、頭頸部癌、前立腺癌、腺様嚢胞癌（ＡＣＣ）、胸腺癌、甲状腺癌、淡明細胞型腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、神経内分泌腫瘍（例えば、褐色細胞腫／傍神経節腫）、ブドウ膜黒色腫、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある種の態様では、がんは、膵臓癌である。幾つかの態様では、がんは、結腸直腸癌である。幾つかの態様では、がんは、肺癌である。

【0660】

がんを有する対象に投与される場合、ある種の態様では、本開示のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、免疫反応を上方調節し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。幾つかの態様では、処置されるがんは、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の腫瘍微小環境への浸潤、またはいわゆる「熱い腫瘍」もしくは「炎症性腫瘍」を特徴とする。幾つかの態様では、処置されるがんは、低レベルもしくは検出不可能なレベルの腫瘍微小環境への白血球浸潤、またはいわゆる「冷たい腫瘍」もしくは「非炎症性腫瘍」を特徴とする。幾つかの態様では、ＥＶは、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」に変えるのに十分な量で、かつ十分な時間投与される。すなわち、上記投与は、白血球（例えば、Ｔ細胞）の腫瘍微小環境への浸潤をもたらす。ある種の態様では、がんには、膀胱癌、子宮頸癌、腎細胞癌、精巣癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌、及び卵巣癌、リンパ腫、肝臓癌、グリア芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、白血病、膵臓癌、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の用語、「遠位腫瘍」または「遠隔腫瘍」は、最初の（原発）腫瘍から遠位器官または遠隔組織、例えば、リンパ節に拡散した腫瘍を指す。幾つかの態様では、本開示のＥＶは、転移拡散後の腫瘍を処置する。

【0661】

幾つかの態様では、本明細書において開示される（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡを標的とするＡＳＯを含む）ＥＶ、例えば、エキソソームの投与は、対象における腫瘍の成長を阻害及び／または低減する。幾つかの態様では、腫瘍の成長（例えば、腫瘍容積または腫瘍重量の増加）は、参照（例えば、ＡＳＯを含有しないＥＶ、例えば、エキソソームの投与後の対応する対象における腫瘍容積）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。

【0662】

幾つかの態様では、本明細書において開示されるＥＶ（例えば、エキソソーム）は、線維症を処置するために使用され得る。処置され得る線維症の非限定的な例としては、肝臓線維症（ＮＡＳＨ）、硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックル－ウェルズ症候群）、心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞、グリア性瘢痕、動脈壁硬化、関節線維症、クローン病、デュピュイトラン拘縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペーロニー病、腎性全身性線維症、進行性塊状線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。ある種の態様では、線維症は、がん（例えば、膵管腺癌（ＰＤＡＣ））に関連する。

【0663】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の循環器系に静脈内投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の静脈に投与される。

【0664】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の循環器系の動脈内に投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の動脈に投与される。

【0665】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、クモ膜下腔内投与により対象に投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、それが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、注射により脊柱管またはクモ膜下腔に投与される。幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、クモ膜下腔内投与により投与され、続いて、胴体に機械的な対流力が加えられる。例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．１２：ｅ１２０３０（２０２０）を参照のこと（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従って、本開示のある種の態様は、ＥＶ、例えば、エキソソームを投与する必要がある対象に投与する方法であって、当該ＥＶ、例えば、エキソソームを当該対象に脊髄内注射により投与し、続いて、当該対象の胴体に機械的な対流力を加えることを含む、当該方法を対象とする。幾つかの態様では、機械的な対流力は、高頻度に胸壁または腰胸椎を振動させる呼吸器クリアランス装置（例えば、Ｓｍａｒｔ ＶｅｓｔまたはＳｍａｒｔ Ｗｒａｐ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＥＤ ＩＮＣ、Ｎｅｗ Ｐｒａｇｕｅ、ＭＮ、ＵＳＡ）を使用して達成される。幾つかの態様では、機械的な対流力、例えば、振動ベストは、クモ膜下腔内に投与されたＥＶ、例えば、エキソソームが神経に沿って更に拡散するのを促進し、これにより、より良好なＥＶ、例えば、エキソソームの神経への送達を可能にする。

【0666】

幾つかの態様では、エキソソームの区画内及び区画間体内分布は、エキソソームの区画への送達後の対象に作用する外因的な体外の力により操作され得る。これは、例えば、身体の区画または身体全体に衝撃、振動、振盪、マッサージを加えることにより機械的な対流を加えることを含む。例えば、クモ膜下腔内投与後に、機械式の振動ジャケットが含まれる幾つかの手段により胸壁振動を加えることにより、中枢神経軸に沿って、または脳神経及び脊髄神経に沿ってエキソソームの体内分布を拡散することができ、これは、薬物を輸送するエキソソームによる神経障害の処置に有用であり得る。

【0667】

幾つかの態様では、振動ジャケットまたは他の同様の手段による外部からの機械的な対流力の印加は、クモ膜下腔の脳脊髄液からエキソソーム及び他の物質を除去し、末梢循環に移動させるために使用され得る。この態様は、内因性の有毒なエキソソーム及び他の有害な高分子、例えば、β－アミロイド、ｔａｕ、αシヌクレイン、ＴＤＰ４３、神経フィラメント、及び過剰な脳脊髄液をクモ膜下腔から排出のために末梢に移動させるのに役立ち得る。

【0668】

幾つかの態様では、脳室内経路により送達されたエキソソームは、腰椎穿刺を同時に組み込み、エキソソーム投与後に追加の液体が脳室に注入される一方で、腰椎穿刺により既に存在する脳脊髄柱のＣＳＦが出て行くことが可能となる脳室腰部灌流を可能にすることにより脳脊髄軸の全体にわたり移動させられる。脳室腰部灌流は、軟膜腫及び他の疾患を処置するために、ＩＣＶ投与されたエキソソームが脳脊髄軸全体に沿って拡散し、クモ膜下腔の全体に及ぶのを可能にし得る。

【0669】

幾つかの態様では、外部からの体外集束超音波、熱エネルギー（加熱）または冷却の適用が、これらの現象に感受性を示すように操作されたエキソソームの区画薬物動態及び薬物放出特性を操作するために使用され得る。

【0670】

幾つかの態様では、常磁性物質を含有するように操作されたエキソソームの区画内挙動及び体内分布が、外部からの磁石または磁界の適用により操作され得る。

【0671】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、対象の１つ以上の腫瘍に腫瘍内に投与される。

【0672】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、鼻腔内投与により対象に投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、局所投与または全身投与のいずれかの形態で鼻を通して吸入され得る。ある種の態様では、ＥＶは、鼻内噴霧として投与される。

【0673】

幾つかの態様では、ＥＶ（例えば、エキソソーム）は、腹腔内投与により対象に投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、好適な液体に注入され、対象の腹膜に注入される。幾つかの態様では、腹腔内投与は、ＥＶのリンパ管への分配をもたらす。幾つかの態様では、腹腔内投与は、ＥＶの胸腺、脾臓、及び／または骨髄への分配をもたらす。幾つかの態様では、腹腔内投与は、ＥＶの１つ以上のリンパ節への分配をもたらす。幾つかの態様では、腹腔内投与は、ＥＶの頸部リンパ節、鼠径リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つ以上への分配をもたらす。幾つかの態様では、腹腔内投与は、ＥＶの膵臓への分配をもたらす。

【0674】

幾つかの態様では、ＥＶ、例えば、エキソソームは、眼周囲投与により対象に投与される。幾つかの態様では、ＥＶは、眼周囲組織に注入される。眼周囲薬物投与としては、結膜下投与、前部テノン嚢下投与、後部テノン嚢下投与、及び眼窩内投与の経路が挙げられる。

【0675】

本開示の実施は、特に明記しない限り、当業者の技能範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用いるであろう。このような技術は、文献において詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５） ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４） Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９８７） Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ （１９８４） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７） Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２^ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。

【0676】

上記で引用された参考文献の全て、及び本明細書において引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0677】

以下の実施例は、例証として提供されるものであり、限定するために提供されるものではない。

【実施例】

【0678】

実施例１：エキソソームの作成
本明細書に記載されるエキソソームを生成するために、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３ＳＦ）を使用する。細胞を、足場Ｘ、足場Ｙ、及び／または関心対象の薬剤に連結されたアンカー部分で安定的に形質移入する。

【0679】

形質移入後、ＨＥＫ細胞を合成培地中で高密度に７日間増殖させる。次いで、馴化細胞培養培地を収集し、室温にて３００～８００×ｇで５分間遠心分離して、細胞及び大きな細片を除去する。培地の上澄みに１０００Ｕ／ＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を補足し、ウォーターバス内で３７℃にて１時間インキュベートする。上澄みを収集し、４℃にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、残存する細胞片及び他の大きな夾雑物を除去する。次いで、上澄みを４℃にて１３３，９００×ｇで３時間にわたり超遠心して、エキソソームをペレット化する。上澄みを廃棄し、残存する培地をチューブの底から全て吸引する。ペレットを、２００～１０００μＬのＰＢＳ（－Ｃａ、－Ｍｇ）中に再懸濁する。

【0680】

エキソソーム集団を更に濃縮するために、ペレットを密度勾配精製（スクロースまたはＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標））により処理する。

【0681】

勾配を、ＳＷ ４１ Ｔｉローターに配置した１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中で４℃にて２００，０００×ｇで１６時間遠心して、エキソソーム画分を分離する。

【0682】

次いで、エキソソームの層を上層から穏やかに取り出し、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中の約３２．５ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間再び超遠心して、精製されたエキソソームをペレット化する。得られるペレットを最小容量のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で保存する。

【0683】

ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配について、等しい容量の１０％、３０％、及び４５％のＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）を用いて３層の無菌の勾配を、ＳＷ ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中に調製する。ペレットをＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配に添加し、４℃にて２００，０００×ｇで１６時間にわたり超遠心して、エキソソーム画分を分離する。次いで、エキソソームの層をチューブの上部約３ｍＬから穏やかに収集する。

【0684】

エキソソーム画分を、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ中の約３２ｍＬのＰＢＳ中に希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間にわたり超遠心して、精製されたエキソソームをペレット化する。次いで、ペレット化されたエキソソームを最小容量（約２００μＬ）のＰＢＳ中に再懸濁し、使用する準備ができるまで４℃で保存する。

【0685】

実施例２：ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質低減のインビトロ分析
本明細書において開示される例示的なＡＳＯは、Ｇ１２Ｄ変異を有するＫＲＡＳタンパク質をコードするＫＲＡＳ転写物を特異的に標的とするように設計された。図１を参照のこと。本開示のＡＳＯを、ウミシイタケルシフェラーゼの上流に野生型（ＷＴ）またはＧ１２ＤアレルのヒトＫＲＡＳ ｍＲＮＡを含有するレポーター細胞株におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質発現をノックダウンする能力について試験する。一般的な細胞毒性を考慮に入れるために、細胞株は、ホタルルシフェラーゼも含有する。ＫＲＡＳに特異的なｓｉＲＮＡを陽性対照として使用する。

【0686】

要約すると、ＷＴまたはＧ１２Ｄ変異体ＫＲＡＳタンパク質を発現するレポーター細胞株を、細胞培養培地で増殖させ、９６ウェルプレート上に播種する。次いで、細胞を本明細書において開示される１種以上のＡＳＯを含む異なる濃度のＥＶ（例えば、エキソソーム）（「ＥＶ－ＡＳＯ」）で処理する。ＥＶ－ＡＳＯ処理の約３日後、細胞を収集し、ＲＮＡ及び／またはタンパク質を細胞から精製する。次いで、細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質発現レベルを、アッセイ、例えば、ｑＰＣＲ及びウェスタンブロットを使用して定量化する。

【0687】

実施例３：ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ／ＫＲＡＳタンパク質低減のインビボ分析
インビボでのＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質レベルの低減における、本明細書において開示される１種以上のＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エキソソーム）の効力を評価するために、腫瘍マウスモデルを使用する。本明細書において開示されるＡＳＯを、様々な投与計画で腫瘍マウスに投与する。マウスを腫瘍成長について定期的にモニタリングする。最終的にマウスを屠殺し、様々な細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ及び／またはＫＲＡＳタンパク質レベルを評価する。

【0688】

実施例４：ＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯの構築及び特徴付け
本開示の操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）を作製する際に、Ｇ１２Ｄ変異を含むＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯを構築した。異なる長さのＡＳＯを作製するために、Ｇ１２Ｄ変異にわたるＡＳＯのＴｉｌｌｉｎｇ法を実行した。これにより、１４、１５、１６、１７、及び２０ヌクレオチド長を有し、参照ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ配列（ＮＭ＿００４９８５．５；配列番号８９）のヌクレオチド２０６～２４５を網羅するＡＳＯが得られた。図１は、構築された例示的なＡＳＯを列挙する表を提供する。

【0689】

構築されたＡＳＯのＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物を阻害する能力を特徴付けるために、ＫＲＡＳレポーター構築物及びＡＳＯの同時形質移入アプローチを使用した。ＫＲＡＳレポーター構築物（Ｄｕａｌ－Ｇｌｏレポータープラスミド）は、ウミシイタケルシフェラーゼの上流に野生型（ＷＴ）またはＧ１２ＤアレルのヒトＫＲＡＳ ｍＲＮＡを含有した。ウミシイタケルシフェラーゼの発現を、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウンのレベルの代用物として使用した。一般的な細胞毒性を考慮に入れるために、ＫＲＡＳレポーター構築物は、ホタルルシフェラーゼも含有した。陽性対照として、２種の異なるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｓｉＲＮＡを使用した（選択的なｓｉＲＮＡ及び非選択的なｓｉＲＮＡ）。

【0690】

次いで、上記のＫＲＡＳレポーター構築物を使用して、本明細書に記載されるＡＳＯと共にＨｅｐａ１－６細胞を形質移入した。細胞を異なる濃度のＡＳＯで形質移入した（使用した最も高い最終ＡＳＯ濃度＝１０ｎＭ）。形質移入の２４時間後、ＷＴまたはＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの発現を、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏアッセイを用いてウミシイタケルシフェラーゼレベルを測定することにより評価した。

【0691】

図２Ａ～２Ｌは、本明細書において開示される１２種の異なる例示的なＡＳＯについて、正規化されたＷＴ及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの発現を示す。（以下の）表１０は、試験された異なるＡＳＯについて、長さ、ＩＣ５０（ｎＭ）値、及びＷＴ対Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現の比率を提供する。図３を参照のこと。示すように、一般的にＡＳＯは、ＷＴ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡと比べてＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの発現のノックダウンにおいてより効果的であった。これらの結果は、本明細書において開示されるＡＳＯが、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ、特にＧ１２Ｄ変異を含むＫＲＡＳ ｍＲＮＡを特異的に標的とすることができることを実証する。

【表9】

【0692】

実施例５：ヒト膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウンの解析
本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳ変異は、膵臓癌が含まれる多数の種類のがんに関連する。従って、本明細書において開示されるＡＳＯが膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を特異的に阻害することができるかどうかを評価するために、様々な膵臓癌細胞株を使用した。

【0693】

要約すると、Ｐａｎｃ－１細胞（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）またはＢｘＰＣ－３細胞（ＫＲＡＳ変異を含まない）を９６ウェルプレートに播種した（５，０００細胞／ウェル）。次いで、約２４時間後、ＲＮＡｉＭＡＸを使用して、細胞を本明細書において開示される（５つの異なる濃度の）例示的なＡＳＯで形質移入した。形質移入の４８時間後に、ｑＰＣＲアッセイを使用して、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現（Ｐａｎｃ－１細胞）または総ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現（ＢｘＰＣ－３細胞）を測定した。

【0694】

図４Ａに示すように、試験された全てのＡＳＯが、用量依存的様式でＰａｎｃ－１細胞におけるＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を減少させることができた。対照的に、試験された多数のＡＳＯが、いずれのＫＲＡＳ変異も含まないＢｘＰＣ－３細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現に対してほとんど効果を有さなかった（図４Ｂを参照のこと）。図５Ａ～５Ｃに示すように、一部のＡＳＯはより強力であった（例えば、ＷＴ及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの両方をノックダウンすることができる）が、他はより選択的であった（例えば、Ｇ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡをノックダウンすることができるが、ＷＴ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡに対する効果をほとんど有さない）。これらの結果は、本明細書において開示されるＡＳＯの特異性及び／または効力を強調し、それらが本明細書において開示される疾患、例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ変異に関連するもの（例えば、膵臓癌）を処置するのに有用であり得ることを示唆する。

【0695】

実施例６：サル腎臓細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡノックダウンの解析
本明細書において開示されるＡＳＯが他の種由来のＫＲＡＳを標的とすることができるかどうか評価するために、サル腎臓細胞を使用した。要約すると、ＦｒＨＫ－４細胞（アカゲザル胎児腎臓細胞）またはＣｏｓ－７（アフリカミドリザル腎臓線維芽細胞様細胞）を、９６ウェルプレートに播種し、異なる濃度のＡＳＯで形質移入し（ＡＳＯ－０００９、ＡＳＯ－００８２、またはスクランブル対照）、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を実施例５に記載したように評価した。

【0696】

図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＡＳＯ－０００９は、ＦｒＨＫ－４細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現に対して効果を有さず、Ｃｏｓ－７細胞における限定的なノックダウンを示した。ＡＳＯ－０００９と比較して、ＡＳＯ－００８２は、ＦｒＨＫ－４及びＣｏｓ－７細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現に対するより大きな効果を有し、Ｃｏｓ－７細胞においてわずかにより強いノックダウンが観察された（図６Ａ及び６Ｂを参照のこと）。しかしながら、ＡＳＯ－００８２は、ヒト細胞と比較して（図５Ｃを参照のこと）、サル腎臓細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現のノックダウン効率が低かった（ＦｒＨＫ－４におけるＩＣ５０＝５０ｎＭ；Ｃｏｓ－７におけるＩＣ５０＝２０ｎＭ）。

【0697】

上記のデータは、実施例５の結果を更に支持し、本明細書において開示される一部のＡＳＯ（例えば、ＡＳＯ－００８２）が非常に強力であり、ＷＴ及びＧ１２Ｄ ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの両方をノックダウンすることができるだけでなく、他の種（例えば、サル）由来のＫＲＡＳ ｍＲＮＡもノックダウンすることができることを実証する。上記の結果は、本明細書において開示される一部のＡＳＯ（例えば、ＡＳＯ－０００９）の選択性も実証する。

【0698】

実施例７：コレステロールでタグ付けされたＡＳＯ
本明細書に記載されるように、ＡＳＯは、アンカー部分を使用して操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）の表面に付着され得る。アンカー部分、例えば、コレステロールは、ＡＳＯの疎水性を増強するのに役立ち得、ＥＶの表面でのより良好な発現を可能にし得る。従って、ＡＳＯのコレステロール部分へのコンジュゲートがＡＳＯの活性に対して何らかの効果を有するかどうかを評価した。特に、ＡＳＯの膵臓癌細胞の増殖を阻害する能力及び膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ発現を阻害する能力に対するコレステロール部分の効果を評価した。図７Ａ及び７Ｂは、本明細書において開示されるＡＳＯにタグ付けするために使用され得る２つの例示的なコレステロール分子の構造を提供する。

【0699】

本明細書において開示されるＡＳＯの細胞増殖に対する効果を評価するために、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯを使用して、以下の２種の異なるヒト膵臓癌細胞株を形質移入した：Ｐａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）及びＨＥＰ３Ｂ（ＫＲＡＳ変異を有さない）細胞。要約すると、細胞を１２ウェルプレート（５００細胞／ウェル）に播種し、次いで、約２４時間後に、細胞を異なる濃度のコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９またはコレステロールがタグ付けされたスクランブル対照ＡＳＯで処理した。次いで、細胞を１６日間培養した（形質移入後の６日目に培地及び処理を新鮮なものと交換した）。形質移入後の１６日目に、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、コロニー形成を定量化した。

【0700】

図８Ａに示すように、Ｐａｎｃ－１細胞が１，０００ｎＭのコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９で形質移入された場合にコロニー形成数が顕著に減少した。対照的に、試験された全ての濃度で、コレステロールがタグ付けされた対照ＡＳＯによる阻害はほとんど観察されなかった。更に、コロニー形成の減少は、上記したように、野生型ＫＲＡＳ転写物を含むＨＥＰ３Ｂ細胞においてより明白でなかった（図８Ｂを参照のこと）。これらの結果は、本明細書において開示されるＡＳＯの効力及び選択性を実証するのに役立つ。

【0701】

コレステロールがタグ付けされたＡＳＯのノックダウン効率を評価するために、ＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）及びＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）細胞を、６ウェルプレート（２００，０００細胞／ウェル）に播種し、本明細書に記載される異なる濃度のコレステロールがタグ付けされたＡＳＯで形質移入した（ＡＳＯ－０００９、ＡＳＯ－００８２、またはスクランブル対照）。次いで、形質移入の７２時間後に、細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用してタンパク質可溶化液を調製し、続いて、ウェスタンブロットを行った。以下のタンパク質の発現を評価した：ビンキュリン（対照）、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ｐＥＲＫ、及び総ＥＲＫ。

【0702】

図１４に示すように、ＡｓＰＣ－１及びＰａｎｃ－１細胞において、対照ＡＳＯと比較して、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－００８２及びコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９でＫＲＡＳ Ｇ１２タンパク質発現が減少した。上記で提供された細胞増殖データと一致して、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－００８２及びコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９で形質移入された細胞においてｐＥＲＫ発現も低減された。

【0703】

まとめると、上記の結果は、コレステロール部分がほとんど影響を及ぼさず、本開示のコレステロールがタグ付けされたＡＳＯが完全に機能的であり、例えば、膵臓癌細胞において増殖を阻害し、ＫＲＡＳ発現をノックダウンすることができることを実証する。

【0704】

実施例８：ＡＳＯを含む操作されたＥＶのノックダウン効率
ＡＳＯがＥＶ（例えば、エキソソーム）を使用して細胞に効果的に送達され得、ＫＲＡＳ発現を阻害し得るかどうかと評価するために、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ（すなわち、ＡＳＯ－０００９、ＡＳＯ－００８２、またはスクランブル対照）を表面が操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）上にロードした。当該技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、本開示の他箇所で記載されるものが、ＥＶにＡＳＯをロードするために使用され得る。次いで、異なる濃度のＥＶを使用して、以下の３種の異なるヒト膵臓癌細胞株を形質移入した：（ｉ）Ｐａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）、（ｉｉ）Ｐａｎｃ８．１３（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）、及び（ｉｉｉ）ＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）細胞。細胞を１日前に９６ウェルプレートに蒔いた（５，０００細胞／ウェル）。コレステロールがタグ付けされた遊離（すなわち、ＥＶの一部でない）ＡＳＯ－０００９及びＡＳＯ－００８２のＡＳＯを対照として使用した。形質移入後の４日目に、ｑＰＣＲを使用してＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現を評価した。

【0705】

それぞれ図９Ａ及び９Ｂに示すように、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９またはコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－００８２を含むＥＶで形質移入された細胞において、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ ｍＲＮＡ発現の顕著なノックダウン（より高濃度で約９０％）が観察された。より高ＥＶ濃度でのノックダウン効率は、遊離ＡＳＯを用いて観察されたものと同様であった。このことは、ＥＶ上へＡＳＯのロードによりＡＳＯの活性が損なわれないことを示唆する。同様の結果が、Ｐａｎｃ８．１３細胞（より高濃度で約８０％のノックダウン）（図１０を参照のこと）及びＡｓＰＣ－１細胞（より高濃度で約５０％のノックダウン）（図１１を参照のこと）の両方で観察された。

【0706】

上記の結果は、本明細書に記載される（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物を標的とするＡＳＯを含む）操作されたＥＶ（例えば、エキソソーム）が、膵臓癌細胞におけるＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現を効果的にノックダウンするために使用され得ることを実証する。

【0707】

実施例９：ＡＳＯを含む操作されたＥＶの細胞増殖に対する効果
本明細書に記載される（例えば、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯを含む）操作されたＥＶを更に特徴付けるために、３Ｄ ＣＴＧアッセイを使用して、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯを含むＥＶで形質移入された細胞の生存率を測定した。要約すると、ＡｓＰＣ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）細胞を、超低接着表面プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：７００７）に播種し、次いで、１日後に異なる濃度の上記の操作されたＥＶで形質移入した。コレステロールがタグ付けされた遊離（すなわち、ＥＶの一部でない）ＡＳＯ－０００９及びＡＳＯ－００８２を対照として使用した。形質移入後の５日目に、培地及びＥＶ処理の両方を新鮮なものに交換した。形質移入後の１０日目に、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標） ３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ９６８３）を使用して細胞の生存率を評価した。

【0708】

前述のコレステロールがタグ付けされたＡＳＯで観察されたように（実施例７を参照のこと）、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９またはコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－００８２を含む操作されたＥＶは、形質移入されたＡｓＰＣ－１細胞の生存率を減少させることもできた（図１２を参照のこと）。

【0709】

上記の結果を確証するために、形質移入されたＰａｎｃ８．１３（Ｇ１２Ｄ変異についてホモ接合）及びＰａｎｃ－１（Ｇ１２Ｄ変異についてヘテロ接合）細胞におけるｐＥＲＫ発現を測定した。要約すると、細胞を９６ウェルプレート（５，０００細胞／ウェル）に播種し、次いで、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ（すなわち、ＡＳＯ－０００９、ＡＳＯ－００８２、及びスクランブル対照）を含む異なる濃度の上記の操作されたＥＶで形質移入した。形質移入後の４日目に、ｐＥＲＫ ａＬＩＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号：ＡＬＳＵ－ＰＡＫＴ－Ｂ５００）を使用して細胞におけるｐＥＲＫ発現を評価した。

【0710】

細胞生存率データと一致して、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－０００９またはコレステロールがタグ付けされたＡＳＯ－００８２を含む操作されたＥＶで形質移入されたＰａｎｃ８．１３及びＰａｎｃ－１細胞は、対照細胞（すなわち、空のＥＶまたはコレステロールがタグ付けされたスクランブル対照ＡＳＯを含むＥＶで形質移入された）と比較して有意に低いレベルのｐＥＲＫ発現を示した（図１３Ａ及び１３Ｂを参照のこと）。

【0711】

まとめると、上記の結果は、本明細書に記載される（例えば、コレステロールがタグ付けされたＡＳＯを含む）ＥＶの、例えば、特定のがん細胞（例えば、膵臓癌細胞）の増殖を低減すること、及びＫＲＡＳ ｍＲＮＡ発現、特にＧ１２Ｄ変異を含むものを阻害することによる潜在的治療能力を実証する。

【0712】

実施例１０：ＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯ及び抗メソテリン標的化部分を含むＥＶの構築及び特徴付け
上記で提供される例に加えて、ＫＲＡＳ転写物を標的とするＡＳＯ及び抗メソテリン標的化部分を含むＥＶ（例えば、エキソソーム）が作製される。幾つかの態様では、抗メソテリン標的化部分が足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片）に融合され、ＥＶ（例えば、エキソソーム）の外部表面に付着される。幾つかの態様では、ＡＳＯがリンカー（例えば、ＴＥＧ）を介してコレステロール分子にタグ付けされ、足場部分を使用してＥＶの表面に（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片を使用してＥＶの外部表面に）連結される。

【0713】

上記のＥＶ（例えば、エキソソーム）は、本開示において記載されるものが含まれる、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して特徴付けられる。例えば、以下の特性のうちの１つ以上が評価される：（ｉ）メソテリン＋細胞に対するＥＶの指向性；（ｉｉ）ＥＶの取り込み；（ｉｉｉ）ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ転写物及び／またはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質のノックダウン；ならびに（ｉｖ）抗腫瘍効力。

【0714】

参照による組み込み
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、及び他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文書が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されている場合と同程度まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0715】

等価物
様々な特定の態様が例示及び記載されたが、上記の明細書は限定するものではない。本発明（複数可）の要旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得ることが理解されよう。本明細書を検討することにより、多数の変形形態が当業者に明らかとなるであろう。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【配列表】

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【国際調査報告】