▶ アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-18
(54)【発明の名称】免疫刺激性多量体型結合分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221011BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221011BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221011BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20221011BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20221011BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221011BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20221011BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20221011BHJP
C07K 14/715 20060101ALI20221011BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221011BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20221011BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221011BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221011BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221011BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221011BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221011BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20221011BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221011BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221011BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/24
C12N15/26
C07K19/00
C07K14/55
C07K14/54
C07K14/715
C07K16/28
C07K16/30
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 E
A61K39/395 T
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509009
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-03-16
(86)【国際出願番号】 US2020046379
(87)【国際公開番号】W WO2021030688
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】62/887,458
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517252624
【氏名又は名称】アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】バリガ ラメシュ
(72)【発明者】
【氏名】ギフォン ティエリー
(72)【発明者】
【氏名】エン ディーン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG03
4B064AG05
4B064AG20
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB17
4C085BB33
4C085BB37
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG08
4C085GG10
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045CA42
4H045DA02
4H045DA04
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、免疫刺激物質を含む改変Ｊ鎖を含む多価の結合分子を提供する。結合分子またはそのサブユニットをコードするポリヌクレオチド、ならびに、当該ポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞も提供する。本開示は、免疫刺激物質を含む改変Ｊ鎖を含む多価の結合分子を作製及び／または使用するための方法をさらに提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二価の結合ユニットまたはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つまたは５つと、改変Ｊ鎖とを含む、多量体型結合分子であって、結合ユニットのそれぞれが、合計で４個または１０個の抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しているＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含み、
前記結合分子の前記抗原結合ドメインのうちの少なくとも３つが、標的抗原に特異的に結合し、かつ
前記改変Ｊ鎖が、（ａ）Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ｂ）免疫刺激物質（「ＩＳＡ」）とを含み、ここで、Ｊ及び前記ＩＳＡが、融合タンパク質として結合している、
前記多量体型結合分子。
【請求項2】
前記ＩＳＡが、サイトカインまたはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントを含む、請求項１に記載の多量体型結合分子。
【請求項3】
前記サイトカインまたはその断片もしくはバリアントが、ＩＬ－１５もしくはＩＬ－２またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントを含む、請求項２に記載の多量体型結合分子。
【請求項4】
前記ＩＳＡが、（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）と、（ｂ）スシドメインを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片、またはＩと結合できるそのバリアント（「Ｒ」）とを含み、ここで、ＪとＩ及びＲのうちの少なくとも１つとが、融合タンパク質として結合しており、Ｉ及びＲが結合してＩＳＡとして機能できる、請求項１～３のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項5】
Ｊが、野生型ヒトＪ鎖であり、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片もしくは機能的バリアントを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項6】
Ｊが、野生型Ｊ鎖に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上含むバリアントＪ鎖またはその断片であり、前記置換、欠失、または挿入が、前記多量体型結合分子の血清中半減期に影響を及ぼすことができ、前記多量体型結合分子が動物に投与されると、１つ以上の前記１アミノ酸の置換、欠失、または挿入以外は同一でありかつ同じ方法で同じ動物種に投与される参照多量体型結合分子と比べて、長い血清中半減期を示す、請求項１～５のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項7】
前記Ｊが、成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む、請求項６に記載の多量体型結合分子。
【請求項8】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されている、請求項７に記載の多量体型結合分子。
【請求項9】
配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸がアラニン（Ａ）で置換されている、請求項８に記載の多量体型結合分子。
【請求項10】
Ｊが、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列（「Ｊ＊」）、または配列番号８６の１～１３７番目のアミノ酸を含む、請求項９に記載の多量体型結合分子。
【請求項11】
Ｊが、野生型Ｊ鎖に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上含むバリアントＪ鎖またはその断片であり、前記置換、欠失、または挿入が前記Ｊ鎖の糖鎖付加を低減する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項12】
前記Ｊが、前記成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の多量体型結合分子。
【請求項13】
配列番号２のＮ４９に対応するアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている、請求項１２に記載の多量体型結合分子。
【請求項14】
Ｉが、配列番号４の成熟ヒトＩＬ－１５アミノ酸配列またはその受容体結合バリアントもしくは受容体結合断片を含む、請求項４～１３のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項15】
前記受容体結合バリアントが、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１つ、ただし１０個以下含み、前記１アミノ酸の挿入、欠失、または置換が、ＩＬ－１５バリアントの、その受容体に対する親和性を低下させる、請求項１４に記載の多量体型結合分子。
【請求項16】
Ｉが、アミノ酸置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個含む、請求項１５に記載の多量体型結合分子。
【請求項17】
前記アミノ酸置換が、配列番号４のＮ１、Ｎ４、Ｄ８、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｎ７２、またはＱ１０８に対応する位置のうちの１つ以上に存在する、請求項１６に記載の多量体型結合分子。
【請求項18】
前記アミノ酸置換が、配列番号４における置換Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ、またはＱ１０８Ｅのうちの１つ以上を含む、請求項１７に記載の多量体型結合分子。
【請求項19】
Ｉが、（ａ）Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ及びＱ１０８Ｅからなる群から選択される位置における１アミノ酸の置換、
（ｂ）Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ及びＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択される位置における２アミノ酸の置換、または
（ｃ）位置Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄにおける３アミノ酸の置換
を除いては配列番号４を含む、請求項１８に記載の多量体型結合分子。
【請求項20】
Ｉが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の多量体型結合分子。
【請求項21】
前記受容体結合バリアントが、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１つ、ただし１０個以下含み、前記１アミノ酸の挿入、欠失、または置換が、ＩＬ－１５バリアントの糖鎖付加を低減する、請求項１４に記載の多量体型結合分子。
【請求項22】
Ｉが、アミノ酸置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個含む、請求項２１に記載の多量体型結合分子。
【請求項23】
前記アミノ酸置換が、配列番号４のＮ７１、Ｓ７３、Ｎ７９、またはＮ１１２に対応する位置のうちの１つ以上に存在する、請求項２２に記載の多量体型結合分子。
【請求項24】
前記アミノ酸置換が、配列番号４における置換Ｎ７１Ｄ、Ｓ７３Ｉ、Ｎ７９Ｄ、またはＮ１１２Ｄのうちの１つ以上を含む、請求項２３に記載の多量体型結合分子。
【請求項25】
Ｉが、Ｎ７１Ｄ、Ｓ７３Ｉ、Ｎ７９Ｄ、及びＮ１１２Ｄからなる群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換を除いては配列番号４を含む、請求項２４に記載の多量体型結合分子。
【請求項26】
Ｉが、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０の２４６～３６１番目のアミノ酸のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の多量体型結合分子。
【請求項27】
Ｒが、配列番号５のアミノ酸配列またはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントもしくは断片を含む、請求項４～２６のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項28】
Ｒが、配列番号５のアミノ酸配列もしくはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントから本質的になるか、またはそれからなる、請求項４～２０のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項29】
Ｊ及びＩが融合タンパク質として結合している、請求項４～２８のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項30】
Ｊ及びＲが融合タンパク質として結合している、請求項４～２８のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項31】
Ｊ、Ｉ、及びＲが融合タンパク質として結合している、請求項４～３０のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項32】
Ｊ、Ｉ、及びＲがリンカーを介して融合されている、請求項３１に記載の多量体型結合分子。
【請求項33】
前記リンカーが同じであるかまたは異なる、請求項３２に記載の多量体型結合分子。
【請求項34】
少なくとも１つのリンカーが、アミノ酸配列【請求項35】
少なくとも１つのリンカーが、アミノ酸配列【請求項36】
ＪがＪ＊であり、前記改変Ｊ鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉ、Ｊ＊－Ｉ－Ｒ、Ｉ－Ｒ－Ｊ＊、Ｒ－Ｉ－Ｊ＊、Ｒ－Ｊ＊－Ｉ、Ｉ－Ｊ＊－Ｒ、Ｉ－Ｊ＊、またはＪ＊－Ｉとして配置されており、ここで、「－」がリンカーである、請求項６～３５のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項37】
前記改変Ｊ鎖が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号７７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の多量体型結合分子。
【請求項38】
前記改変Ｊ鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉとして配置されている、請求項３６に記載の多量体型結合分子。
【請求項39】
前記改変Ｊ鎖が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号７７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の多量体型結合分子。
【請求項40】
前記ＩＳＡがヒトＩＬ－２のバリアント（「ＩＬ２ｖ」）を含み、前記「ＩＬ２ｖ」がＩＬ－２受容体のα－サブユニットに結合しない、請求項１～３のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項41】
前記ＩＬ２ｖが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の多量体型結合分子。
【請求項42】
前記改変Ｊ鎖が配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の多量体型結合分子。
【請求項43】
前記改変Ｊ鎖が抗体の抗原結合ドメインをさらに含み、前記抗原結合ドメインが前記改変Ｊ鎖に融合されている、請求項４～４２のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項44】
前記抗原結合ドメインが、免疫エフェクター細胞上の標的に結合する、請求項４３に記載の多量体型結合分子。
【請求項45】
前記免疫エフェクター細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４４に記載の多量体型結合分子。
【請求項46】
前記抗原結合ドメインが、ＣＤ３エプシロン（ＣＤ３ε）に特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片である、請求項４５に記載の多量体型結合分子。
【請求項47】
前記改変Ｊ鎖が配列番号１９を含む、請求項４６に記載の多量体型結合分子。
【請求項48】
前記多量体型結合分子が、五量体であり、結合ユニットを５つ含み、結合ユニットのそれぞれが、ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項49】
前記多量体型結合分子が、二量体であり、結合ユニットまたはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含み、結合ユニットのそれぞれが、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項50】
前記標的抗原が、Ｔ細胞応答またはＮＫ細胞応答を調節する腫瘍関連抗原または標的を含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項51】
前記標的抗原が、Ｔ細胞応答またはＮＫ細胞応答を調節する標的を含む、請求項５０に記載の多量体型結合分子。
【請求項52】
前記標的が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性を阻害する、請求項５１に記載の多量体型結合分子。
【請求項53】
前記標的が抑制性免疫チェックポイントタンパク質を含み、前記抗原結合ドメインが、前記標的をアンタゴナイズすることによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を刺激する、請求項５２に記載の多量体型結合分子。
【請求項54】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質が、プログラム細胞死－１タンパク質（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド－１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３タンパク質（ＴＩＭ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータータンパク質（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサータンパク質（ＶＩＳＴＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体タンパク質（ＴＩＧＩＴ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体タンパク質（ＫＩＲ）、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、Ｂ７－Ｈ４タンパク質、またはこれらを任意に組み合わせたものを含む、請求項５３に記載の多量体型結合分子。
【請求項55】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ－Ｌ１を含み、前記抗原結合ドメインが、配列番号３３、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３４または配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項５４に記載の多量体型結合分子。
【請求項56】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ－Ｌ１を含み、前記抗原結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、６つの免疫グロブリン相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が抗体のＣＤＲを含み、前記抗体のＣＤＲが、それぞれ配列番号７５及び配列番号７６、配列番号９６及び配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５、配列番号１０６及び配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５、配列番号１１６及び配列番号１１７、配列番号１１８及び配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２６及び配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５、配列番号１５６及び配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９、配列番号１６０及び配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３、配列番号１７４及び配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９、配列番号１８０及び配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１、配列番号１９２及び配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５、配列番号１９６及び配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１、配列番号２０２及び配列番号２０３、配列番号２０４及び配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９、配列番号２１０及び配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３、配列番号２１４及び配列番号２１５、配列番号２１６及び配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９、配列番号２２０及び配列番号２２１、または配列番号２２２及び配列番号２２３であるＶＨ及びＶＬを含み、前記ＨＣＤＲもしくは前記ＬＣＤＲの１つ以上に１アミノ酸置換を含まないか、１個含むか、または２個含む、請求項５４に記載の多量体型結合分子。
【請求項57】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質がＰＤ－Ｌ１を含み、前記抗原結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列が、それぞれ配列番号７５及び配列番号７６、配列番号９６及び配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５、配列番号１０６及び配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５、配列番号１１６及び配列番号１１７、配列番号１１８及び配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２６及び配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５、配列番号１５６及び配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９、配列番号１６０及び配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３、配列番号１７４及び配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９、配列番号１８０及び配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１、配列番号１９２及び配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５、配列番号１９６及び配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１、配列番号２０２及び配列番号２０３、配列番号２０４及び配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９、配列番号２１０及び配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３、配列番号２１４及び配列番号２１５、配列番号２１６及び配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９、配列番号２２０及び配列番号２２１、または配列番号２２２及び配列番号２２３を含む、請求項５４または請求項５６に記載の多量体型結合分子。
【請求項58】
前記標的がＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的を含み、前記抗原結合ドメインが、前記標的をアゴナイズできる、請求項５０または請求項５１に記載の多量体型結合分子。
【請求項59】
前記標的抗原が、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、またはこれらを組み合わせたものを含み、前記抗原結合ドメインが前記標的をアゴナイズできる、請求項５８に記載の多量体型結合分子。
【請求項60】
前記標的抗原がＧＩＴＲを含み、前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号３５及び配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２、または配列番号４３及び配列番号４４であるアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の多量体型結合分子。
【請求項61】
前記標的抗原がＯＸ４０を含み、前記抗原結合ドメインが、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号４５及び配列番号４６または配列番号４７及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の多量体型結合分子。
【請求項62】
前記標的抗原が腫瘍関連抗原を含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項63】
前記腫瘍関連抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソセリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、ＣＤ３３、またはこれらを任意に組み合わせたものを含む、請求項６２に記載の多量体型結合分子。
【請求項64】
前記標的抗原がＣＤ２０を含み、前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号４９及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の多量体型結合分子。
【請求項65】
前記結合分子の前記抗原結合ドメインのうちの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個が、同じ標的抗原に特異的に結合する、請求項１～６４のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項66】
各結合ユニットが、それぞれＩｇＡ Ｃα１ドメイン、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＡ Ｃα２ドメイン、ＩｇＡ Ｃα３ドメイン、及びＩｇＡテールピースドメインを含むＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む、請求項１～４７または４９～６５のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項67】
前記ＩｇＡ重鎖定常領域が、配列番号５３のアミノ酸配列、配列番号５４のアミノ酸配列、またはその任意の多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む、請求項６６に記載の多量体型結合分子。
【請求項68】
各結合ユニットが、それぞれＩｇＭ Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピースドメインを含むＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む、請求項１～４６または４８～６５のいずれか１項に記載の多量体型結合分子。
【請求項69】
ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントのそれぞれが、ＩｇＭ Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピースドメインのＮ末端側に位置するＩｇＭ Ｃμ３ドメイン、ＩｇＭ Ｃμ２ドメイン、ＩｇＭ Ｃμ１ドメイン、またはこれらを任意に組み合わせたものをさらに含む、請求項６８に記載の多量体型結合分子。
【請求項70】
ＩｇＭ重鎖定常領域のそれぞれが、ヒトＩｇＭ定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片であり、配列番号５１のアミノ酸配列、配列番号５２のアミノ酸配列、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む、請求項６８または請求項６９に記載の多量体型結合分子。
【請求項71】
前記多量体型結合分子が、バリアントヒトＩｇＭ定常領域を含み、前記多量体型結合分子のＣＤＣ活性が、配列番号５１のアミノ酸配列、配列番号５２のアミノ酸配列、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含むＩｇＭ重鎖定常領域を含む多量体型結合分子と比べて低下している、請求項６９または７０に記載の多量体型結合分子。
【請求項72】
ＩｇＭ重鎖定常領域のそれぞれが、配列番号５１または配列番号５２のアミノ酸配列のバリアントを含み、前記バリアントが、配列番号５１もしくは配列番号５２の位置Ｐ３１１におけるアミノ酸置換、配列番号５１もしくは配列番号５２の位置Ｐ３１３におけるアミノ酸置換、または配列番号５１もしくは配列番号５２の位置Ｐ３１１及びＰ３１３におけるアミノ酸置換を含む、請求項７１に記載の多量体型結合分子。
【請求項73】
ＩｇＭ重鎖定常領域のそれぞれが、参照ＩｇＭ重鎖定常領域に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上有するバリアントヒトＩｇＭ定常領域であり、前記参照ＩｇＭ重鎖定常領域が、１つ以上の前記１アミノ酸の置換、欠失、または挿入以外は、バリアントＩｇＭ重鎖定常領域と同一であり、前記多量体型結合分子が、対象動物に投与されると、前記参照ＩｇＭ重鎖定常領域を含みかつ同じ方法で同じ動物種に投与される多量体型結合分子と比べて、長い血清中半減期を示す、請求項６９または７０に記載の多量体型結合分子。
【請求項74】
前記バリアントＩｇＭ重鎖定常領域が、配列番号５１または配列番号５２の野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｅ３４５Ａ、Ｓ４０１Ａ、Ｅ４０２Ａ、またはＥ４０３Ａに対応するアミノ酸位置の１つ以上に、アミノ酸置換を含む、請求項７３に記載の多量体型結合分子。
【請求項75】
請求項１～７４のいずれか１項に記載の多量体型結合分子のサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含み、前記サブユニットポリペプチドが、
（ａ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と結合した、ＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域もしくはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む、ＩｇＡ重鎖もしくはＩｇＭ重鎖、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合した抗体軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖、または
（ｃ）（ｉ）Ｊ鎖もしくはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）、
（ｉｉ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質もしくはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）、もしくは
（ｉｉｉ）スシドメインを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片、もしくはＩと結合できるそのバリアント（「Ｒ」）
のうちの２つ以上を含む改変Ｊ鎖であって、ＪとＩ及びＲのうちの少なくとも１つとが、融合タンパク質として結合しており、ＩとＲが結合して免疫刺激複合体として機能できる、前記改変Ｊ鎖、または
（ｄ）これらを任意に組み合わせたもの
を含む、
単離ポリヌクレオチド。
【請求項76】
前記サブユニットポリペプチドが、ＩｇＭ定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを含むＩｇＭ重鎖を含む、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項77】
前記ＩｇＭ定常領域またはその断片もしくはバリアントが、配列番号５１または配列番号５２のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項78】
前記サブユニットポリペプチドが前記抗体軽鎖を含む、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項79】
前記サブユニットポリペプチドが前記改変Ｊ鎖を含む、請求項７５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項80】
前記サブユニットが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項81】
前記サブユニットポリペプチドを２つ、３つ、またはそれ以上コードする核酸配列を２つ、３つ、またはそれ以上含む、請求項７５～８０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項82】
請求項７５～８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項83】
請求項７５～８１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項８２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項84】
請求項８３に記載の宿主細胞を培養することと、前記多量体型結合分子を回収することとを含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の多量体型結合分子の作製のための方法。
【請求項85】
治療の必要な対象に、請求項１～７４のいずれか１項に記載の多量体型結合分子を投与することを含む、がんの治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／８８７，４５８号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本願は、２０１９年８月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／８８７，４５８号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0002】
配列表
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれ、その配列表は、参照により、その全体が援用される。そのＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年８月１３日に作成したものであり、名称は０２２ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇであり、サイズは３５８，８０８バイトである。
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表が含まれ、その配列表は、参照により、その全体が援用される。そのＡＳＣＩＩコピーは、２０２０年８月１３日に作成したものであり、名称は０２２ＷＯ１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇであり、サイズは３５８，８０８バイトである。
【背景技術】
【0003】
背景
ＩｇＡ抗体及びＩｇＭ抗体など、多量体化できる抗体及び抗体様分子は、例えば、イムノオンコロジー及び感染症の分野における有望な薬物候補として頭角を現してきており、特異性の改善、アビディティの改善、及び複数の結合標的に結合する能力を可能にするものである。例えば、米国特許第９，９５１，１３４号（特許文献１）及び同第９，９３８，３４７号（特許文献２）、ならびに国際公開番号ＷＯ２０１６／１４１３０３（特許文献３）、ＷＯ２０１６／１５４５９３（特許文献４）、ＷＯ２０１６／１６８７５８（特許文献５）、ＷＯ２０１７／０５９３８７（特許文献６）、ＷＯ２０１７０５９３８０（特許文献７）、ＷＯ２０１８／０１７８８８（特許文献８）、ＷＯ２０１８／０１７７６３（特許文献９）、ＷＯ２０１８／０１７８８９（特許文献１０）、ＷＯ２０１８／０１７７６１（特許文献１１）、ＷＯ２０１８／１８７７０２（特許文献１２）及びＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１（特許文献１３）（これらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
ＩｇＡ抗体及びＩｇＭ抗体など、多量体化できる抗体及び抗体様分子は、例えば、イムノオンコロジー及び感染症の分野における有望な薬物候補として頭角を現してきており、特異性の改善、アビディティの改善、及び複数の結合標的に結合する能力を可能にするものである。例えば、米国特許第９，９５１，１３４号（特許文献１）及び同第９，９３８，３４７号（特許文献２）、ならびに国際公開番号ＷＯ２０１６／１４１３０３（特許文献３）、ＷＯ２０１６／１５４５９３（特許文献４）、ＷＯ２０１６／１６８７５８（特許文献５）、ＷＯ２０１７／０５９３８７（特許文献６）、ＷＯ２０１７０５９３８０（特許文献７）、ＷＯ２０１８／０１７８８８（特許文献８）、ＷＯ２０１８／０１７７６３（特許文献９）、ＷＯ２０１８／０１７８８９（特許文献１０）、ＷＯ２０１８／０１７７６１（特許文献１１）、ＷＯ２０１８／１８７７０２（特許文献１２）及びＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１（特許文献１３）（これらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【0004】
結合分子、例えば、多量体型の抗体及び抗体様分子は、例えば、エフェクター免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を刺激することによって、がん細胞のような難しい標的に対する免疫応答を増強する追加の部分を含むように操作されることができる。サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１またはＧＭ－ＣＳＦを用いた独立免疫療法は、がん及び感染の治療において、ある程度有効であることが示されているが、臨床転帰は、有効性を得るのに必要とされるサイトカインのうち、標的に導かれなかったサイトカインの血中濃度が高いことと関連する毒性によって限定される場合が多い。
【0005】
ＩＬ－１５は、自然免疫系及び適応免疫系の両方の活性の調節、例えば、侵入した病原体に対するメモリーＴ細胞応答の維持、アポトーシスの阻害、樹状細胞の活性化、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞増殖及び細胞傷害活性の誘導で機能する。例えば、国際公開番号ＷＯ２０１８／１３４７８４（特許文献１４）（参照により、その全体が援用される）を参照されたい。成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ７１０４４．１の２３～１３６番目のアミノ酸）は、成熟カニクイザルＩＬ－１５（配列番号７１（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＨＨ５３９８９．１の４８～１６１番目のアミノ酸）とのアミノ酸配列同一性が約９６％である。成熟ヒトＩＬ－１５及び成熟マウスＩＬ－１５（配列番号７２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ番号ｓｐ｜Ｐ４８３４６．１）の４９～１６２番目のアミノ酸）は、アミノ酸配列同一性が約７０％である。
【0006】
ＩＬ－１５受容体は、種特異的ＩＬ－１５受容体α（「ＩＬ－１５Ｒα」）、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体β（別名ＣＤ１２２）（「β」）、及び複数のサイトカイン受容体に共通する共通γ鎖（別名ＣＤ１３２）（「γ」）という３つのポリペプチドからなる。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９８６２－２９８６９（１９９５）（非特許文献１）を参照されたい。ＩＬ－１５Ｒαは、広範な細胞種によって発現されると考えられるが、β及びγを発現するのは、必ずしも同じ細胞ではない。例えば、国際公開番号ＷＯ２０１８／１３４７８４（特許文献１４）を参照されたい。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上の機能的なＩＬ－１５受容体のβサブユニット及びγサブユニットに結合する前に、ＡＰＣ上に発現したＩＬ－１５受容体αと複合体を形成できる。上記の文献を参照されたい。ＩＬ－１５Ｒαスシドメインは、ＩＬ－１５Ｒαの成分のうち、β受容体サブユニット及びγ受容体サブユニットと結合する前に、ＩＬ－１５と複合体を形成するための必須成分である（例えば、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２７７－８２（２００１）（非特許文献２）を参照されたい）。ヒトスシドメインの配列は、配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２１８０．１の３１～１０７番目のアミノ酸）として示されている。カニクイザルスシドメインの配列は、配列番号７３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＩ４２７８５．１）の４～８０番目のアミノ酸として示されている（ヒト配列とのアミノ酸同一性は９２％）。マウススシドメインの配列は、配列番号７４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号ｓｐ｜Ｑ６０８１９．１）の３４～９８番目のアミノ酸として示されている（ヒト配列との同一性は約８３％）。スシドメイン／ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＩＬ－１５単独の場合と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を極めて強力に刺激することが報告されている（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：１６１２－１９（２００５）（非特許文献３）及びＳｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６０７２－８０（２００６）（非特許文献４）を参照されたい）。
【0007】
抗体のＪ鎖は、ＩｇＭμ重鎖またはＩｇＡα重鎖のＣ末端にある、１８アミノ酸の分泌テールピース（ｔｐ）における最後から２番目のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、五量体のＩｇＭ及び二量体のＩｇＡと結合する１５ｋＤａの酸性ポリペプチドである。ヒトＪ鎖前駆体のアミノ酸配列は、配列番号１として示されており、成熟ヒトＪ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２として示されている。ＩｇＭ結合ユニットの五量体構造へのアセンブルには、ＩｇＭ定常領域のＣμ４ドメイン及びテールピースドメインが関与すると考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）（非特許文献５）を参照されたい。
【0008】
多量体型抗体の設計が進歩しているにもかかわらず、多量体型結合分子を操作することによって、免疫療法を改良するニーズが依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】米国特許第９，９５１，１３４号
【特許文献2】米国特許第９，９３８，３４７号
【特許文献3】ＷＯ２０１６／１４１３０３
【特許文献4】ＷＯ２０１６／１５４５９３
【特許文献5】ＷＯ２０１６／１６８７５８
【特許文献6】ＷＯ２０１７／０５９３８７
【特許文献7】ＷＯ２０１７０５９３８０
【特許文献8】ＷＯ２０１８／０１７８８８
【特許文献9】ＷＯ２０１８／０１７７６３
【特許文献10】ＷＯ２０１８／０１７８８９
【特許文献11】ＷＯ２０１８／０１７７６１
【特許文献12】ＷＯ２０１８／１８７７０２
【特許文献13】ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１
【特許文献14】ＷＯ２０１８／１３４７８４
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９８６２－２９８６９（１９９５）
【非特許文献2】Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２７７－８２（２００１）
【非特許文献3】Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：１６１２－１９（２００５）
【非特許文献4】Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６０７２－８０（２００６）
【非特許文献5】Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）
【発明の概要】
【0011】
概要
本開示は、二価の結合ユニットまたはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つまたは５つと、改変Ｊ鎖とを含む、多量体型結合分子を提供し、その各結合ユニットは、合計で４個または１０個の抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しているＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含み、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３つが、標的抗原に特異的に結合する。示されているように、その改変Ｊ鎖は、（ａ）Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ｂ）免疫刺激物質（「ＩＳＡ」）とを含み、ここで、Ｊ及びＩＳＡは、融合タンパク質として結合している。
本開示は、二価の結合ユニットまたはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つまたは５つと、改変Ｊ鎖とを含む、多量体型結合分子を提供し、その各結合ユニットは、合計で４個または１０個の抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しているＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含み、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３つが、標的抗原に特異的に結合する。示されているように、その改変Ｊ鎖は、（ａ）Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ｂ）免疫刺激物質（「ＩＳＡ」）とを含み、ここで、Ｊ及びＩＳＡは、融合タンパク質として結合している。
【0012】
ある特定の実施形態では、そのＩＳＡは、サイトカイン、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントを含む。例えば、そのサイトカイン、またはその断片もしくはバリアントは、ＩＬ－１５もしくはＩＬ－２またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントを含む。ある特定の実施形態では、そのＩＳＡは、（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）と、（ｂ）スシドメインを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片、またはＩと結合できるそのバリアント（「Ｒ」）とを含み、ここで、ＪとＩ及びＲのうちの少なくとも１つとが、融合タンパク質として結合しており、Ｉ及びＲは結合してＩＳＡとして機能できる。
【0013】
ある特定の実施形態では、Ｊは、野生型ヒトＪ鎖であり、配列番号２のアミノ酸配列、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントを含む。別の実施形態では、Ｊは、野生型Ｊ鎖に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上含むバリアントＪ鎖またはその断片であり、前記置換、欠失、または挿入は、本発明の多量体型結合分子の血清中半減期に影響を及ぼすことができ、その多量体型結合分は動物に投与されると、１つ以上のその１アミノ酸の置換、欠失、または挿入以外は同一でありかつ同じ方法で同じ動物種に投与される参照多量体型結合分子と比べて、長い血清中半減期を示すようなものである。例えば、Ｊは、成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができる。配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換でき、特定の実施形態では、Ｙ１０２は、アラニン（Ａ）で置換できる。ある特定の実施形態では、Ｊは、ヒトＪ鎖のバリアントであり、配列番号３のアミノ酸配列（「Ｊ＊」）、または配列番号８６の１～１３７番目のアミノ酸を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、Ｊは、野生型Ｊ鎖に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上含むバリアントＪ鎖またはその断片であり、前記置換、欠失、または挿入は、そのＪの糖鎖付加を低減する。いくつかの実施形態では、そのＪは、成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｎ４９に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。
【0015】
ある特定の実施形態では、Ｉは、配列番号４の成熟ヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列、またはその受容体結合バリアントもしくは受容体結合断片を含む。受容体結合バリアントは、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１つ、ただし１０個以下含むことができる。ある特定の実施形態では、その１アミノ酸の挿入、欠失、または置換は、ＩＬ－１５バリアントのその受容体に対する親和性を低下させるが、消失はさせない。ある特定の実施形態では、そのバリアントＩは、アミノ酸置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個含むことができる。ある特定の実施形態では、そのアミノ酸置換は、配列番号４のＮ１、Ｎ４、Ｄ８、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｎ７２、またはＱ１０８に対応する位置のうちの１つ以上に存在することができる。例えば、そのアミノ酸置換は、配列番号４における置換Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ、またはＱ１０８Ｅのうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態では、Ｉは、（ａ）Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ、及びＱ１０８Ｅからなる群から選択される位置における、１アミノ酸の置換、（ｂ）Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ及びＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択される位置における、２アミノ酸の置換、または（ｃ）位置Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄにおける、３アミノ酸の置換を除いては配列番号４を含む。ある特定の実施形態では、Ｉは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、その受容体結合バリアントは、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１つ、ただし１０個以下含み、その１アミノ酸の挿入、欠失、または置換は、ＩＬ－１５バリアントの糖鎖付加を低減する。いくつかの実施形態では、Ｉは、アミノ酸置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換は、配列番号４のＮ７１、Ｓ７３、Ｎ７９、またはＮ１１２に対応する位置のうちの１つ以上に存在する。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸置換は、配列番号４における置換Ｎ７１Ｄ、Ｓ７３Ｉ、Ｎ７９Ｄ、またはＮ１１２Ｄのうちの１つ以上含む。いくつかの実施形態では、Ｉは、Ｎ７１Ｄ、Ｓ７３Ｉ、Ｎ７９Ｄ及びＮ１１２Ｄからなる群から選択される位置におけるアミノ酸置換を除いては配列番号４を含む。いくつかの実施形態では、Ｉは、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０の２４６～３６１番目のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【0017】
ある特定の実施形態では、ＩＬ－１５受容体－αのスシドメインであるＲは、配列番号５のアミノ酸配列、またはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態では、Ｒは、配列番号５のアミノ酸配列もしくはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントから本質的になるか、またはそれからなる。
【0018】
ある特定の実施形態では、Ｊ及びＩは、融合タンパク質として結合している。ある特定の実施形態では、Ｊ及びＲが、融合タンパク質として結合している。ある特定の実施形態では、Ｊ、Ｉ、及びＲが、融合タンパク質として結合している。これらの実施形態によると、Ｊ、Ｉ、及び／またはＲは、リンカーを介して融合でき、それらのリンカーは、同じであることも、異なることもできる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、アミノ酸配列
を含むか、その配列から本質的になるか、またはその配列からなる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、アミノ酸配列
を含むか、その配列から本質的になるか、またはその配列からなる。ある特定の実施形態では、Ｊは、Ｊ＊であり、その改変Ｊ鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉ、Ｊ＊－Ｉ－Ｒ、Ｉ－Ｒ－Ｊ＊、Ｒ－Ｉ－Ｊ＊、Ｒ－Ｊ＊－Ｉ、Ｉ－Ｊ＊－Ｒ、Ｉ－Ｊ＊、またはＪ＊－Ｉとして配置でき、ここで、「－」は、リンカーである。ある特定の実施形態では、その改変Ｊ鎖は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号７７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９または配列番号９０のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、その改変Ｊ鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉとして配置されており、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号７７、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、または配列番号９０のアミノ酸配列を含むことができる。
【0019】
別の実施形態では、ＩＳＡは、ヒトＩＬ－２のバリアント、例えば、ヒトＩＬ－２受容体のα－サブユニットに結合しない「ＩＬ２ｖ」を含む。ＩＬ２ｖは、配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＩＬ２ｖを含むある１つの改変Ｊ鎖は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
【0020】
ある特定の実施形態では、本発明で提供するような多量体型結合分子の改変Ｊ鎖は、その改変Ｊ鎖に融合された、抗体の抗原結合ドメインをＩＳＡとともにさらに含むことができる。例えば、その改変Ｊ鎖は、免疫エフェクター細胞上の標的に結合する抗原結合ドメインを含むことができる。ある特定の実施形態では、その免疫エフェクター細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、その抗原結合ドメインは、ＣＤ３エプシロン（ＣＤ３ε）に特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）という抗体断片であることができる。これらの実施形態によると、改変Ｊ鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むことができる。
【0021】
ある特定の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子は、五量体であり、結合ユニットを５つ含み、その各結合ユニットは、ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含む。別の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子は、二量体であり、結合ユニットまたはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含み、その各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を２つ含む。
【0022】
ある特定の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子が結合する標的抗原は、腫瘍関連抗原、またはＴ細胞応答もしくはＮＫ細胞応答を調節する標的である。例えば、その標的抗原は、Ｔ細胞応答またはＮＫ細胞応答を調節する標的を含むことができる。ある特定の実施形態では、その標的は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性を阻害する標的であり、そのような標的を阻害するのが望ましい。例えば、その標的は、抑制性免疫チェックポイントタンパク質であることができ、提供する結合分子の抗原結合ドメインは、その標的をアンタゴナイズすることによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞を刺激する。例えば、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、プログラム細胞死－１タンパク質（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド－１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３タンパク質（ＴＩＭ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータータンパク質（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサータンパク質（ＶＩＳＴＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体タンパク質（ＴＩＧＩＴ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体タンパク質（ＫＩＲ）、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、Ｂ７－Ｈ４タンパク質、またはこれらを任意に組み合わせたものを含む。特定の実施形態では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１である。この実施形態によれば、その抗原結合ドメインは、配列番号３３、配列番号９１、配列番号９２、または配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３４または配列番号９４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むことができる。
【0023】
いくつかの実施形態では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を含み、その抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのＶＨ及びＶＬは、６つの免疫グロブリン相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、そのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は抗体のＣＤＲを含み、抗体のＣＤＲは、それぞれ配列番号７５及び配列番号７６、配列番号９６及び配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５、配列番号１０６及び配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５、配列番号１１６及び配列番号１１７、配列番号１１８及び配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２６及び配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５、配列番号１５６及び配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９、配列番号１６０及び配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３、配列番号１７４及び配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９、配列番号１８０及び配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１、配列番号１９２及び配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５、配列番号１９６及び配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１、配列番号２０２及び配列番号２０３、配列番号２０４及び配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９、配列番号２１０及び配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３、配列番号２１４及び配列番号２１５、配列番号２１６及び配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９、配列番号２２０及び配列番号２２１、または配列番号２２２及び配列番号２２３であるＶＨ及びＶＬを含み、そのＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの１つ以上に１アミノ酸の置換を含まないか、１個含むか、または２個含む。いくつかの実施形態では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を含み、その抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのＶＨ及びＶＬは、６つの免疫グロブリン相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、そのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３は抗体のＣＤＲを含み、抗体のＣＤＲは、それぞれ配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、または配列番号１８６及び配列番号１８７であるＶＨ及びＶＬを含み、そのＨＣＤＲもしくはＬＣＤＲの１つ以上に１アミノ酸の置換を含まないか、１個含むか、または２個含み、たとえば、アミノ酸置換を含まない。
【0024】
いくつかの実施形態では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を含み、その抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのＶＨ及びＶＬは、成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７５及び配列番号７６、配列番号９６及び配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５、配列番号１０６及び配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５、配列番号１１６及び配列番号１１７、配列番号１１８及び配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２６及び配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５、配列番号１５６及び配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９、配列番号１６０及び配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３、配列番号１７４及び配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９、配列番号１８０及び配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１、配列番号１９２及び配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５、配列番号１９６及び配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１、配列番号２０２及び配列番号２０３、配列番号２０４及び配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９、配列番号２１０及び配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３、配列番号２１４及び配列番号２１５、配列番号２１６及び配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９、配列番号２２０及び配列番号２２１、または配列番号２２２及び配列番号２２３を含む。いくつかの実施形態では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を含み、その抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのＶＨ及びＶＬは、成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、成熟ＶＨアミノ酸配列及び成熟ＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、または配列番号１８６及び配列番号１８７を含む。
【0025】
別の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子が結合する標的抗原は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的である。これらの実施形態によると、その抗原結合ドメインは、その標的をアゴナイズできる。例えば、その標的抗原は、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、またはこれらを組み合わせたものであることができる。標的抗原がＧＩＴＲであるこれらの実施形態では、その抗原結合ドメインは例えば重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号３５及び配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２、または配列番号４３及び配列番号４４であるアミノ酸配列を含むことができる。標的抗原がＯＸ４０を含む実施形態では、その抗原結合ドメインは例えば重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４５及び配列番号４６または配列番号４７及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むことができる。
【0026】
別の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子が結合する標的抗原は、腫瘍関連抗原である。その腫瘍関連抗原は例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソセリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、ＣＤ３３、またはこれらを任意に組み合わせたものを含むことができる。特定の態様では、その標的抗原は、ＣＤ２０であり、その抗原結合ドメインは例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４９及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むことができる。
【0027】
ある特定の実施形態では、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個は、同じ標的抗原に特異的に結合する。
【0028】
ある特定の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子の各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含み、そのＩｇＡ重鎖定常領域はそれぞれ、ＩｇＡ Ｃα１ドメイン、ＩｇＡヒンジ、ＩｇＡ Ｃα２ドメイン、ＩｇＡ Ｃα３ドメイン、及びＩｇＡテールピースドメインを含む。ある特定の実施形態では、そのＩｇＡ重鎖定常領域は、配列番号５３、配列番号５４のアミノ酸配列、またはその任意の多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む。
【0029】
ある特定の実施形態では、本開示が提供する多量体型結合分子の各結合ユニットは、ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含み、そのＩｇＭ重鎖定常領域はそれぞれ、ＩｇＭ Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピースドメインを含む。ある特定の実施形態では、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントは、そのＩｇＭ Ｃμ４ドメイン及びＩｇＭテールピースドメインのＮ末端側に位置するＩｇＭ Ｃμ３ドメイン、ＩｇＭ Ｃμ２ドメイン、ＩｇＭ Ｃμ１ドメイン、またはこれらを任意に組み合わせたものをさらに含む。ある特定の実施形態では、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片であり、配列番号５１のアミノ酸配列、配列番号５２のアミノ酸配列、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む。
【0030】
ある特定の実施形態では、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域のバリアント、またはその多量体化型断片であり、配列番号５１、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＩｇＭ重鎖定常領域を含む多量体型結合分子と比べて、その多量体型結合分子のＣＤＣ活性を低下させるバリアントまたは断片である。例えば、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号５１または配列番号５２のアミノ酸配列のバリアントを含むことができ、そのバリアントは、配列番号５１もしくは配列番号５２のＰ３１１の位置におけるアミノ酸置換、配列番号５１もしくは配列番号５２のＰ３１３の位置におけるアミノ酸置換、または配列番号５１もしくは配列番号５２のＰ３１１及びＰ３１３の位置におけるアミノ酸置換を含む。
【0031】
ある特定の実施形態では、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域のバリアントまたはその多量体化型断片であり、前記バリアントまたは断片によって、多量体型結合分子は、対象動物に投与されると、参照ＩｇＭ重鎖定常領域を含みかつ同じ方法で同じ動物種に投与される多量体型結合分子と比べて、長い血清中半減期が付与される。例えば、そのバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、配列番号５１または配列番号５２の野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｅ３４５Ａ、Ｓ４０１Ａ、Ｅ４０２Ａ、またはＥ４０３Ａに対応する１つ以上のアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができる。
【0032】
本開示は、本開示が提供する多量体型結合分子のサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドも提供し、そのサブユニットポリペプチドは、（ａ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と結合した、ＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域、もしくはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む、ＩｇＡ重鎖もしくはＩｇＭ重鎖、（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合した抗体軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖、または（ｃ）（ｉ）Ｊ鎖、もしくはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）、（ｉｉ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、もしくはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）、もしくは（ｉｉｉ）Ｉと結合できるスシドメインまたはそのバリアントを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片（「Ｒ」）、のうちの２つ以上を含む改変Ｊ鎖であって、ＪとＩ及びＲのうちの少なくとも１つとが、融合タンパク質として結合しており、Ｉ及びＲが結合して免疫刺激複合体として機能できる、改変Ｊ鎖、または（ｄ）これらを任意に組み合わせたものを含む。
【0033】
そのポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびにそのポリヌクレオチド及び／またはその発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。本開示は、提供する多量体型結合分子の作製のための方法を提供し、当該方法は、宿主細胞を培養することと、多量体型結合分子を回収することとを含む。
【0034】
本開示はさらに、がんの治療のための方法を提供し、当該方法は、治療の必要な対象に、提供される多量体型結合分子を有効量投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】Ｙ１０２Ａ変異を含む改変ヒトＪ鎖（「Ｊ＊」）が、様々な配向で、ＩＬ－１５（「Ｉ」。円で示されている）、及びＩＬ－１５受容体－αのスシドメイン（「Ｒ」。楕円で示されている）に融合されたものを有する例示的なＩｇＭ五量体を示す。Ｎ末端からＣ末端の方向の構成は、Ｊ＊ＲＩ、ＩＲＪ＊、ＲＪ＊Ｉ、Ｊ＊ＩＲ、ＲＩＪ＊及びＩＪ＊Ｒである。
【図2】ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＩＬ－１５効力アッセイの概略図である。この概略図には、ＰＤ－Ｌ１を発現する単球が示されているが、このアッセイは、単球または他の末梢血単核球上に発現する他の抗原を標的とするのにも適用可能である。
【図3】本発明で提供するような各種のＩＬ－１５－ＩＬ－１５受容体－α（「ＲＩ」）ＩＳＡ化合物のインビトロでの効力を示している。そのデータには、漸増濃度のＲＩ化合物に応答してＫｉ６７陽性となったことによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示したものが示されている。ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＪＨは、ネガティブコントロールとして示されている。
【図4】ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩが、各種のＴ細胞サブセットの増殖に及ぼす作用をＫｉ６７陽性性によって示したものを示している。
【図5-1】図５Ａは、３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトがＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する効力に対して、ＩＬ－１５における単一、二重及び三重の変異が及ぼす作用をＫｉ６７陽性性によって示したものを示している。単一のＩＬ－１５変異が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に及ぼす作用を示している。図５Ｂは、３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトがＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する効力に対して、ＩＬ－１５における単一、二重及び三重の変異が及ぼす作用をＫｉ６７陽性性によって示したものを示している。単一のＩＬ－１５変異が、ＮＫ細胞の増殖に及ぼす作用を示している。
【図5-2】図５Ｃは、３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトがＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する効力に対して、ＩＬ－１５における単一、二重及び三重の変異が及ぼす作用をＫｉ６７陽性性によって示したものを示している。二重及び三重のＩＬ－１５変異が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に及ぼす作用を示している。図５Ｄは、３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトがＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖を誘導する効力に対して、ＩＬ－１５における単一、二重及び三重の変異が及ぼす作用をＫｉ６７陽性性によって示したものを示している。二重及び三重のＩＬ－１５変異が、ＮＫ細胞の増殖に及ぼす作用を示している。
【図6】ｈｕ３Ｃ５＋Ｊ＊ＲＩが、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞上で、ＧＩＴＲ及びＯＸ－４０の発現を、試験した他のＩＳＡ（ＨＲＩ、１５３＋Ｊ＊ＲＩ、ＫＤ－ＲＩまたはｈｕ３Ｃ５＋ＪＨ（ヒト血清アルブミンに融合したＪ鎖）を含む）よりも大きくアップレギュレートさせることを示している。示されているデータは、５ｎＭの各化合物に関するものである。
【図7】ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃２３、ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１４及びＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１２という３つの異なる抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩコンストラクトが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導できることを示している。
【図8-1】図８Ａは、Ｋｉ－６７増殖アッセイにおける、ＣＤ８＋Ｔ細胞（２つの異なるＰＢＭＣドナーの１つ）に対するｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊ＲＩの効力を示しており、「Ｓ」は、抗ＣＤ３ ＳＰ３４抗体のｓｃＦｖ断片である。図８Ｂは、Ｋｉ－６７増殖アッセイにおける、ＣＤ８＋Ｔ細胞（２つの異なるＰＢＭＣドナーの１つ）に対するｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊ＲＩの効力を示しており、「Ｓ」は、抗ＣＤ３ ＳＰ３４抗体のｓｃＦｖ断片である。
【図8-2】図８Ｃは、Ｋｉ－６７増殖アッセイにおける、ＮＫ細胞（２つの異なるＰＢＭＣドナーの１つ）に対するｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊ＲＩの効力を示しており、「Ｓ」は、抗ＣＤ３ ＳＰ３４抗体のｓｃＦｖ断片である。図８Ｄは、Ｋｉ－６７増殖アッセイにおける、ＮＫ細胞（異なるＰＢＭＣドナーの１つ）に対するｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊ＲＩの効力を示しており、「Ｓ」は、抗ＣＤ３ ＳＰ３４抗体のｓｃＦｖ断片である。
【図9】図９Ａ～９Ｄは、ｈＰＤ－Ｌ１－ＣＴ２６マウス有効性モデルにおける、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩによる処置の作用を示している。Ａは、コントロール群（ビヒクル）、ならびに処置群（ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ及び抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ）における平均腫瘍サイズを示している。Ｂは、ビヒクル群における個々の腫瘍サイズを示している。Ｃは、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ群における個々の腫瘍サイズを示している。Ｄは、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ群における個々の腫瘍サイズを示している。
【図10】図１０Ａ～１０Ｄは、腫瘍が拒絶された処置マウス、及びナイーブコントロール群のＣＴ２６腫瘍細胞によるリチャレンジを示している。Ａは、平均腫瘍サイズを示している。Ｂは、３８日目のナイーブ群及び処置群における個々の腫瘍サイズを示している。Ｃ～Ｄは、ナイーブ群及び処置群における個々の腫瘍サイズを示している。
【図11】図１１Ａ～１１Ｄは、薬力学的ＢＡＬＢ／ｃモデルにおける、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの用量依存的な処置の作用を示している。Ａは、処置後の末梢ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示している。Ｂは、処置後の末梢ＮＫ細胞の数を示している。Ｃは、処置後の末梢ＣＤ４ Ｔ細胞の数を示している。Ｄは、処置後の末梢Ｂ細胞の数を示している。
【図12】Ｊ＊ＲＩ糖鎖付加部位の各種変異が、ヒトＣＤ８ Ｔ細胞の増殖に及ぼす作用を示している。
【図14】図１４Ａ～１４Ｆは、インビトロでの効力アッセイにおいて、炎症性サイトカインであるヒトＩＬ－６（Ａ）、ヒトＩＦＮγ（Ｂ）、ヒトＴＮＦα（Ｃ）、カニクイザルＩＬ－６（Ｄ）、カニクイザルＩＦＮγ（Ｅ）またはカニクイザルＴＮＦα（Ｆ）の分泌の欠損が、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩによって誘発されたことを示している。
【図15】図１５Ａ～１５Ｃは、インビトロ殺傷アッセイにおいて、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株で、ヒトのＰＢＭＣ（Ａ）、ＮＫ細胞（Ｂ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）に及ぼした作用をそれぞれ示している。
【図16】ＰＤ－Ｌ１のアラニンスキャニング変異誘発に基づき、３Ｃ５ Ｆａｂが結合する可能性のあるエピトープを示している。
【発明を実施するための形態】
【0036】
詳細な説明
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語が付されたものは、それが１つ以上であることを指すことに留意されたい。例えば、「１つの（ａ）」の付された「結合分子」は、１つ以上の結合分子を表すように理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用できる。
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語が付されたものは、それが１つ以上であることを指すことに留意されたい。例えば、「１つの（ａ）」の付された「結合分子」は、１つ以上の結合分子を表すように理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用できる。
【0037】
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用する場合、示されているその２つの特徴または成分のそれぞれが、もう一方を伴う状態または伴わない状態で、具体的に開示されているものとして解釈するものとする。したがって、「及び／または」という用語は、本明細書では、「Ａ及び／またはＢ」という表現で使用する場合、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ及び／またはＣ」のような表現で使用する場合、Ａ、Ｂ及びＣ、Ａ、ＢまたはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびにＣ（単独）という実施形態のそれぞれを含むように意図されている。
【0038】
別段の定義のない場合、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味である。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによって、当業者は、本開示で使用される多くの用語の一般的な定義を得られる。
【0039】
単位、接頭辞及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で示されている。数値範囲には、その範囲を定める数値が含まれる。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの向きで、左から右に記載されている。本明細書に示されている見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、これらの態様は、本明細書全体を参照することによって得ることができる。したがって、この直後に定義されている用語は、本明細書全体を参照することによって、さらに十分に定義される。
【0040】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語には、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」が含まれるように意図されており、複数の単量体（アミノ酸）が、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直鎖状に連結したもので構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸からなるいずれかの鎖（１本または複数）を指し、所定の長さの生成物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸からなる鎖（１本または複数）を指すために使用する他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと互換的に使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾（限定されるものではないが、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護基／ブロック基による誘導体化が挙げられる）、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾の産物も指すように意図されている。ポリペプチドは、生物起源から取り出すこともできるし、または組換え技術によって作製することもできるが、必ずしも、所定の核酸配列から翻訳されたものであるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含むいずれかの方法で生成できる。
【0041】
本明細書に開示されているようなポリペプチドは、サイズが約３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、７５アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、５００アミノ酸以上、１，０００アミノ酸以上または２，０００アミノ酸以上のものであることができる。ポリペプチドは、所定の三次元構造を有することができるが、必ずしも、所定の三次元構造を有するわけではない。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたポリペプチドといい、所定の三次元構造を有するのではなく、多数の異なるコンホメーションをとることができるポリペプチドは、折り畳まれていないポリペプチドという。本明細書で使用する場合、糖タンパク質という用語は、少なくとも１つの糖鎖部分に結合したタンパク質を指し、その糖鎖部分は、アミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介して、そのタンパク質に結合している。
【0042】
「単離」ポリペプチド、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、その天然の環境においては見られないポリペプチドを意図している。特定の精製レベルが求められるわけではない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然型の環境または天然の環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現させた組換え生成ポリペプチド及び組換え生成タンパク質は、本明細書に開示されている場合、単離されているとみなし、いずれかの好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的な精製を行った天然型ポリペプチドまたは組換えポリペプチドも同様である。
【0043】
本明細書で使用する場合、「非天然ポリペプチド」という用語またはその文法上の派生語のいずれも、「天然」である形態のポリペプチド、あるいは裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定または解釈される可能性がある形態のポリペプチドを明示的に除外する（ただし、上記形態のみを除外する）条件付き定義である。
【0044】
本明細書に開示されている他のポリペプチドは、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体またはバリアント、及びこれらを任意に組み合わせたものである。本明細書に開示されている場合、「断片」、「バリアント」、「誘導体」及び「類似体」という用語には、対応する天然型の抗体またはポリペプチドの特性のうちの少なくともいくつか（例えば、抗原に特異的に結合する特性）を保持するあらゆるポリペプチドが含まれる。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の箇所で論じられている特異的抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解断片及び欠失断片が含まれる。例えば、ポリペプチドのバリアントには、上記のような断片、及びアミノ酸の置換、欠失、または挿入により、アミノ酸配列が改変されたポリペプチドが含まれる。ある特定の態様では、バリアントは、非天然のものであることができる。非天然バリアントは、当該技術分野で知られている変異誘発技法を用いて生成できる。バリアントポリペプチドは、アミノ酸の保存的または非保存的な置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチドには見られない追加的な特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。バリアントポリペプチドは、本明細書では、「ポリペプチド類似体」ともいうことができる。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側鎖の反応によって化学的に誘導体化されたアミノ酸を１つ以上有する該当のポリペプチドも指すことができる。２０個の標準アミノ酸の誘導体を１つ以上含むペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、プロリンを４－ヒドロキシプロリンに置換でき、リジンを５－ヒドロキシリジンに置換でき、ヒスチジンを３－メチルヒスチジンに置換でき、セリンをホモセリンに置換でき、リジンをオルニチンに置換できる。
【0045】
「保存的アミノ酸置換」は、ある１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当該技術分野において定義されており、それらの側鎖としては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、チロシンのフェニルアラニンへの置換は、保存的置換である。ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換によっては、本開示のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体が、その抗体と結合する抗原に結合するのが妨げられない。ヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換のうち、抗原への結合を喪失させない置換を特定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１ １８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２－４１７（１９９７）を参照されたい）。
【0046】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸及び複数の核酸を含むように意図されており、単離核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチドに存在するいずれかの１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を指す。
【0047】
「単離」核酸または「単離」ポリヌクレオチドとは、その天然型の環境から分離されているいずれかの形態の核酸またはポリヌクレオチドを意図している。例えば、ゲル精製ポリヌクレオチド、またはベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離されている」ものとみなされるであろう。また、ポリヌクレオチドセグメント、例えば、クローニング用に制限部位を有するように操作したＰＣＲ産物も、「単離されている」ものとみなす。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞で維持されている組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは生理食塩水などの非天然溶液中の精製ポリヌクレオチド（部分的もしくは実質的に精製されたポリヌクレオチド）が挙げられる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写物であって、天然では見られない、転写物が含まれる。単離ポリヌクレオチドまたは単離核酸にはさらに、合成によって生成されたポリヌクレオチド分子または核酸分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの調節エレメントであることもできるし、または調節エレメントを含むこともできる。
【0048】
本明細書で使用する場合、「非天然ポリヌクレオチド」という用語またはその文法上の派生語のいずれかは、「天然」である形態の核酸もしくはポリヌクレオチド、あるいは裁判官、または行政機関もしくは司法機関によって「天然」であると判定または解釈される可能性がある形態の核酸もしくはポリヌクレオチドを明示的に除外する（ただし、上記形態のみを除外する）条件付き定義である。
【0049】
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、核酸の部分のうち、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部とみなすことができるが、フランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コーディング領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、いずれのベクターも、単一のコード領域を含むこともできるし、または２つ以上のコード領域を含むこともでき、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、別のコード領域に融合されているか、または融合されていない異種コード領域を含むことができる。異種コード領域としては、限定されるものではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊なエレメントまたはモチーフをコードする領域が挙げられる。
【0050】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つ以上のコード領域と機能可能に結合されたプロモーター、及び／または他の転写エレメントもしくは他の翻訳制御エレメントを含むことができる。機能可能な結合とは、遺伝子産物の発現が、調節配列（複数可）の影響下または制御下に置かれるような形で、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、１つ以上の調節配列と結合されている場合である。プロモーター機能による誘導を受けて、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及びその２つのＤＮＡ断片間の連結の性質によって、発現調節配列がその遺伝子産物の発現を指示する能力が妨げられたり、またはそのＤＮＡ鋳型が転写される能力が妨げられたりしない場合には、２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドのコード領域、及びその領域と結合されたプロモーターなど）は、「機能可能に結合している」。すなわち、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができた場合には、そのプロモーター領域は、その核酸と機能可能に結合されていることになる。そのプロモーターは、所定の細胞において、ＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的な転写を指示するように、ポリヌクレオチドと機能可能に結合されていることもできる。
【0051】
当業者には、様々な転写制御領域が知られている。これらの領域としては、限定されるものではないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が挙げられ、限定されるものではないが、サイトメガロウイルスに由来するプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（イントロンＡと組み合わせた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０に由来するプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびにレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなどである。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来する領域、ならびに真核細胞での遺伝子発現を制御できる他の配列が挙げられる。追加の好適な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【0052】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが、当業者に知られている。これらのエレメントとしては、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び終止コドン、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位、すなわちＩＲＥＳ。ＣＩＴＥ配列ともいう）が挙げられる。
【0053】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡまたはリボソームＲＮＡの形態であることができる。
【0054】
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と結合でき、これらのペプチドは、本明細書に開示されているようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を通って伸長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、そのポリペプチドのＮ端に融合されたシグナルペプチドを有することがあり、そのシグナルペプチドが、完全なポリペプチド、すなわち「完全長」ポリペプチドから切断されると、分泌形態、すなわち「成熟」形態のポリペプチドが作られることを当業者は認識している。ある特定の実施形態では、天然型のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンの重鎖シグナルペプチドもしくは軽鎖シグナルペプチドが使用されているか、またはその配列の機能的誘導体のうち、その機能的誘導体と機能可能に結合されているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する機能的誘導体が使用されている。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されていることができる。
【0055】
本明細書で使用する場合、「結合分子」という用語は、その最も広い意味では、結合標的、例えばエピトープ、すなわち抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書にさらに記載されているように、結合分子は、本明細書に記載されている「抗原結合ドメイン」を１つ以上含むことができる。結合分子の非限定的な例は、抗体、または本明細書に詳述されているように、抗原特異的な結合性を保持するその断片である。ある特定の態様では、「結合分子」は、本明細書に詳細に記載されているような抗体または抗体様分子を含む。
【0056】
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」という用語（互換的に使用できる）は、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子の領域のうち、結合標的、例えばエピトープに特異的に結合するために必要または十分である領域を指す。例えば、「Ｆｖ」、例えば、２つの別々のポリペプチドサブユニットまたは一本鎖のいずれかとしての抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域は、「結合ドメイン」であるとみなされる。その他の結合ドメインとしては、限定されるものではないが、ラクダ種に由来する抗体の重鎖可変重鎖（ＶＨＨ）、またはスキャフォールド、例えばフィブロネクチンスキャフォールド内で発現させた６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。本明細書に記載されているような「結合分子」または「抗体」は、「抗原結合ドメイン」を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、またはさらにはそれ以上含むことができる。
【0057】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用できる。抗体（または本明細書に開示されているようなその断片、バリアントもしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ種の場合）、または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における免疫グロブリンの基本構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。別段の記載のない限り、「抗体」という用語には、抗体の小さな抗原結合断片から、フルサイズの抗体、例えば、２つの完全な重鎖と２つの完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖と４つの完全な軽鎖を含むとともに、Ｊ鎖及び／または分泌成分を任意に含むＩｇＡ抗体、１０個または１２個の完全な重鎖と１０個または１２個の完全な軽鎖を含むとともに、Ｊ鎖を任意に含むＩｇＭ抗体、あるいはこれらの機能的断片までに及ぶいずれもが含まれる。
【0058】
「免疫グロブリン」という用語には、生物学的に区別できる様々な広範なクラスのポリペプチドが含まれる。重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中に、いくつかのサブタイプ（例えば、γ１～γ４またはα１～α２）があることは当業者には明らかであろう。この鎖の性質が、抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥとして決定する。免疫グロブリンのサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などは、十分に特徴付けられており、機能の特殊化をもたらすことが知られている。これらの免疫グロブリンのそれぞれの修飾型は、本開示に鑑みれば、当業者には容易に認識可能であり、したがって、それらは、本開示の範囲内である。
【0059】
軽鎖は、カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、κ軽鎖またはλ軽鎖のいずれかと結合できる。概して、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作宿主細胞によって、その免疫グロブリンが発現されると、軽鎖及び重鎖は、互いに共有結合し、その２つの重鎖の「テール」部分は、共有結合であるジスルフィド結合または非共有結合によって、互いに結合する。重鎖では、そのアミノ酸配列は、Ｙ字型構造の分岐部の端部にあるＮ末端から、各鎖の底部にあるＣ末端までに及ぶ。ある特定の抗体（例えばＩｇＧ抗体）の基本構造は、２つの重鎖サブユニット及び２つの軽鎖サブユニットが、ジスルフィド結合を介して共有結合して、「Ｙ字」構造を形成したものを含み、本明細書では、この構造は「Ｈ２Ｌ２構造」または「結合ユニット」ともいう。
【0060】
「結合ユニット」という用語は、本明細書では、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、その抗原結合断片またはその多量体化型断片の部分うち、標準的な「Ｈ２Ｌ２」の免疫グロブリン構造、例えば、２つの重鎖またはその断片と、２つの軽鎖またはその断片に対応する部分を指す目的で使用する。ある特定の態様では、結合ユニットは、例えばラクダ抗体における２つの重鎖に対応することができる。ある特定の態様では、例えば、その結合分子が、二価のＩｇＧ抗体またはその抗原結合断片である場合には、「結合分子」及び「結合ユニット」という用語は、同じ意味である。別の態様では、例えば、その結合分子が、多量体、例えば、二量体のＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、五量体のＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、または六量体のＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体である場合には、その結合分子は、「結合ユニット」を２つ以上含む。ＩｇＡ二量体の場合には２つ、ＩｇＭ五量体の場合には５つ、ＩｇＭ六量体の場合には６つである。結合ユニットは、完全長抗体の重鎖及び軽鎖を含む必要はないが、典型的には二価となり、すなわち、上記で定義したように、「結合ドメイン」を２つ含む。本明細書で使用する場合、本開示で提供するある特定の結合分子は、二量体であり、ＩｇＡ定常領域またはその多量体化型断片を含む二価の結合ユニットを２つ含む。本開示で提供するある特定の結合分子は、「五量体」または「六量体」であり、ＩｇＭ定常領域またはその多量体型断片を含む二価の結合ユニットを５つまたは６つ含む。結合ユニットを２つ以上、例えば、２つ、５つまたは６つ含む結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、本明細書では、「多量体」という。
【0061】
「Ｊ鎖」という用語は、本明細書で使用する場合、いずれかの動物種の天然型配列のＩｇＭ抗体もしくはＩｇＡ抗体のＪ鎖、その機能的断片、その誘導体、及び／またはそのバリアントのいずれをも指し、成熟ヒトＪ鎖（そのアミノ酸配列は、配列番号２として示されている）が含まれる。本明細書には、様々なＪ鎖バリアント及び改変Ｊ鎖誘導体が開示されている。当業者には認識されるように、「機能的断片」または「機能的バリアント」には、ＩｇＭ重鎖定常領域と結合して五量体のＩｇＭ抗体を形成できる、断片及びバリアント（あるいは、ＩｇＡ重鎖定常領域と結合して二量体のＩｇＡ抗体を形成できる、断片及びバリアント）が含まれる。
【0062】
「改変Ｊ鎖」という用語は、本明細書では、天然型配列のＪ鎖ポリペプチドの誘導体のうち、その天然型配列に導入された異種の部分、例えば異種のポリペプチド、例えば外来性の結合ドメインを含む誘導体を指す目的で使用する。この導入は、ペプチドリンカーまたは化学リンカーを介した結合によって、その異種のポリペプチドまたはその他の部分を直接または間接的に融合することを含むいずれかの手段によって行うことができる。「改変ヒトＪ鎖」という用語には、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸配列を含む天然型配列のヒトＪ鎖、またはその機能的断片もしくはその機能的バリアントのうち、異種の部分、例えば異種のポリペプチド、例えば外来性の結合ドメインの導入によって改変されたものが含まれる。ある特定の態様では、その異種部分は、ＩｇＭが効率的に重合して五量体となること、及びそのようなポリマーが標的に結合することを妨げない。例示的な改変Ｊ鎖は、例えば、米国特許第９，９５１，１３４号、米国特許出願公開第２０１９－０１８５５７０号及び米国特許第１０，６１８，９７８号に見ることができ、これらの特許はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0063】
本明細書で使用する場合、「ＩｇＭ由来の結合分子」、「ＩｇＭ様抗体」、「ＩｇＭ様結合ユニット」または「ＩｇＭ様重鎖定常領域」という用語は、抗体由来の結合分子、抗体、結合ユニットまたは重鎖定常領域のバリアントのうち、多量体、例えば六量体を形成するか、またはＪ鎖と結合した状態で五量体を形成する能力をもたらすのに必要な、ＩｇＭ重鎖の構造的な部分を保持したままであるバリアントを指す。ＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子は典型的には、少なくとも、ＩｇＭ定常領域のＣμ４ドメイン及びテールピース（ｔｐ）ドメインを含むが、同じ種または異なる種の他の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧに由来する重鎖定常領域ドメインを含むことができる。ＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子は同様に、１つ以上の定常領域が欠失している抗体断片であることができる。ただし、そのＩｇＭ様抗体が、六量体及び／または五量体を形成できることを条件とする。すなわち、ＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子は、例えばＩｇＭ／ＩｇＧハイブリッド抗体であることもできるし、またはＩｇＭ抗体の「多量体化型断片」であることもできる。
【0064】
本明細書で使用する場合、「ＩｇＡ由来の結合分子」、「ＩｇＡ様抗体」、「ＩｇＡ様結合ユニット」または「ＩｇＡ様重鎖定常領域」という用語は、抗体由来の結合分子、抗体、結合ユニットまたは重鎖定常領域のバリアントのうち、Ｊ鎖と結合した状態の多量体、例えば二量体を形成する能力をもたらすのに必要な、ＩｇＡ重鎖の構造的な部分を保持したままであるバリアントを指す。ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＡ由来の結合分子は典型的には、少なくとも、ＩｇＡ定常領域のＣα３ドメイン及びテールピース（ｔｐ）ドメインを含むが、同じ種または異なる種の他の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧに由来する重鎖定常領域ドメインを含むことができる。ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＡ由来の結合分子は同様に、１つ以上の定常領域が欠失している抗体断片であることができる。ただし、そのＩｇＡ様抗体が、Ｊ鎖と結合した状態の二量体を形成できることを条件とする。すなわち、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＡ由来の結合分子は、例えばＩｇＡ／ＩｇＧハイブリッド抗体であることもできるし、またはＩｇＡ抗体の「多量体化型断片」であることもできる。
【0065】
「結合価」、「二価」、「多価」という用語、及び文法的に同等の表現は、所定の結合分子、例えば、抗体もしくは抗体様分子、または所定の結合ユニットにおける抗原結合ドメインの数を指す。したがって、所定の結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体またはその多量体化型断片においては、「二価」という用語は、２つの抗原結合ドメインの存在を示し、「四価」という用語は、４つの抗原結合ドメインの存在を示し、「六価」という用語は、６つの抗原結合ドメインの存在を示す。各結合ユニットが二価である典型的なＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子は、結合価が１０または１２であることができる。二価または多価の結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、単一特異性を有する（すなわち、その抗原結合ドメインのすべてが、同じである）こともできるし、または二重特異性もしくは多特異性を有する（例えば、２つ以上の抗原結合ドメインが異なり、例えば、同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか、もしくは完全に異なる抗原に結合する）ことができる。
【0066】
「エピトープ」という用語には、抗体または抗体様分子の抗原結合ドメインに特異的に結合できるいずれの分子決定基も含まれる。ある特定の態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、ある特定の態様では、三次元構造特性または所定の荷電特性を有することができる。エピトープは、標的の領域のうち、抗体の抗原結合ドメインが結合する領域である。
【0067】
「標的」という用語は、最も広い意味で使用して、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が結合できる物質を含める。標的は例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質またはその他の分子であることができる。さらに、「標的」は例えば、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が結合できるエピトープを含む細胞、器官または生物であることができる。
【0068】
軽鎖及び重鎖のいずれも、構造的及び機能的相同性の領域に分けられる。「定常」及び「可変」という用語は、機能面で使用される。軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び重鎖の可変領域（ＶＨ）のいずれも、抗原の認識及び特異性を決定する。これに対して、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）は、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体の結合、補体の結合などのような生物学的特性をもたらす。慣例によれば、定常領域ドメインのナンバリングは、抗体の抗原結合部位、すなわちアミノ末端から離れるほど大きくなる。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分は、定常領域であり、実際、ＣＨ３ドメイン（またはＩｇＭの場合にはＣＨ４）は、重鎖のカルボキシ末端を含み、ＣＬドメインは、軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【0069】
「完全長ＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及びテールピースを含むことができる抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）を含むポリペプチドである。
【0070】
上記のように、可変領域（複数可）により、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子が、抗原上のエピトープを選択的に認識して、そのエピトープと特異的に結合することが可能になる。すなわち、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わさって、抗原結合ドメインを形成する。より具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれの上の３つのＣＤＲによって定めることができる。ある特定の抗体は、さらに大きい構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、２つのＨ２Ｌ２結合ユニットと、ジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖とを含む分子を形成でき、このＪ鎖はさらに、分泌成分と結合されていることができ、ＩｇＭは、Ｈ２Ｌ２結合ユニットを５つまたは６つ含むとともに、ジスルフィド結合を介して共有結合したＪ鎖を任意に含む五量体分子または六量体分子を形成できる。
【0071】
抗体の抗原結合ドメイン内に存在する６つの「相補性決定領域」、すなわち「ＣＤＲ」は、短い非連続的なアミノ酸配列であり、抗体が水性環境で三次元構成をとると、結合ドメインを形成するように特異的に配置される。結合ドメインにおける残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域といい、分子間可変性がＣＤＲよりも小さい。フレームワーク領域は主として、βシート立体構造をとり、ＣＤＲは、そのβシート構造をつなぐループを形成し、このループは、場合によっては、その構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間での非共有結合による相互作用によって、ＣＤＲを正しい向きで配置させるスキャフォールドを形成する働きをする。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、標的抗原上のエピトープと相補的な表面を定める。この相補的な表面は、抗体がその同族エピトープに非共有結合するのを促進する。当業者は、いずれの所定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域についても、ＣＤＲ及びフレームワーク領域をそれぞれ構成するアミノ酸を、容易に特定できる。それらのアミノ酸は、様々な異なる方法で定義されているからである。（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－９１７（１９８７）（これらの文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
【0072】
当該技術分野において使用及び／または認められている用語の定義が２つ以上存在する場合、用語の定義には、本明細書で使用する場合、明らかに反対の記載のない限りは、それらの意味がすべて含まれるように意図されている。具体的な例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語を用いて、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を説明することである。これらの具体的な領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）によって説明されてきており、これらの文献は、参照により、本明細書に援用される。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義には、互いに比較した場合の重複するアミノ酸及びアミノ酸サブセットが含まれる。上記にかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指す目的で、いずれかの定義（または当業者に知られている他の定義）を適用することは、別段の指示がない限り、本明細書で定義及び使用されているような用語の範囲内であるように意図されている。上で引用した各参照文献によって定義されているようなＣＤＲを含む適切なアミノ酸は、比較として、下記の表１に示されている。特定のＣＤＲを網羅する正確なアミノ酸数は、そのＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動することになる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を与えられれば、どのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するか、常法によって判断できる。
【0073】
（表１）ＣＤＲの定義＊
＊表１におけるすべてのＣＤＲ定義のナンバリングは、Ｋａｂａｔらが定めた、ナンバリングの慣例に従ったものである（下記を参照されたい）。
【0074】
例えば、ＩＭＧＴの情報システム（ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）（ＩＭＧＴ（登録商標）／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ）を用いて、抗体可変ドメインを解析して、ＣＤＲを含む可変領域セグメントを特定することもできる。（例えば、Ｂｒｏｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３６：Ｗ５０３－５０８，２００８を参照されたい。）
【0075】
Ｋａｂａｔらは、可変領域及び定常領域の配列についても、いずれの抗体にも適用可能であるナンバリングシステムを定義した。当業者は、配列そのもの以外のいずれの実験データにも頼ることなく、あらゆる可変領域配列に、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって定められたナンバリングシステムを指す。ただし、Ｋａｂａｔナンバリングシステムの使用が明示的に述べられていない限り、本開示におけるすべてのアミノ酸配列には、連続的なナンバリングが使用されている。
【0076】
ヒトＩｇＭ定常ドメインのＫａｂａｔナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．“Ｔａｂｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｖ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｃ－Ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｊ－Ｃｈａｉｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，β－２ Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｔｈｙ－１，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ，Ｃ－Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，Ｐｏｓｔ－ｇａｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎ，α－２ Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）に見ることができる。ＩｇＭ定常領域は、順次に（すなわち、１番目のアミノ酸は、定常領域の最初のアミノ酸から開始する）、またはＫａｂａｔナンバリングのスキームを用いることによってナンバリングできる。以下には、ヒトＩｇＭ定常領域の２つのアレルを順次にナンバリングした場合（本明細書では、配列番号５１（アレルＩＧＨＭ＊０３）及び配列番号５２（アレルＩＧＨＭ＊０４）として示されている）と、Ｋａｂａｔシステムによってナンバリングした場合の比較が示されている。下線付きのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔシステムでは考慮されていない（以下で下線が二重に付された「Ｘ」は、セリン（Ｓ）（配列番号５１）またはグリシン（Ｇ）（配列番号５２）であることができる）。
【0077】
ＩｇＭ重鎖における順次的ナンバリング（配列番号５１または配列番号５２）／ＫＡＢＡＴナンバリングの表
【0078】
結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、それらの抗原結合断片、抗原結合バリアントもしくは抗原結合誘導体、及び／またはそれらの多量体化型断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦ）、ＶＬドメインもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製した断片が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｃＦｖ分子は、当該技術分野において知られており、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
【0079】
「特異的に結合する」とは、概して、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアントもしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介して、エピトープに結合すること、ならびにその結合には、抗原結合ドメインとエピトープとの間にかなりの相補性が必要であることを意味する。この定義によれば、結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するときには、そのエピトープに「特異的に結合する」という。「特異性」という用語は、本明細書では、ある特定の結合分子が、ある特定のエピトープに結合する相対的な親和性を定性する目的で使用する。例えば、結合分子「Ａ」は、所定のエピトープに対する特異性が、結合分子「Ｂ」よりも高いとみなすことができ、または結合分子「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対する特異性よりも高い特異性で、エピトープ「Ｃ」に結合するということができる。
【0080】
本明細書に開示されている結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、５×１０－２秒－１、１０－２秒－１、５×１０－３秒－１、１０－３秒－１、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１または１０－７秒－１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、標的抗原と結合するということができる。
【0081】
本明細書で開示されている結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、抗原結合バリアントもしくは抗原結合誘導体は、１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、５×１０４Ｍ－１秒－１、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、５×１０６Ｍ－１秒－１または１０７Ｍ－１秒－１以上の会合速度（ｋ（ｏｎ））で、標的抗原と結合するということができる。
【0082】
結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、参照抗体または参照抗原結合断片の所定のエピトープへの結合をある程度ブロックする範囲で、そのエピトープに優先的に結合する場合には、その参照抗体または参照抗原結合断片のそのエピトープへの結合を競合的に阻害するという。競合的阻害性は、当該技術分野で知られているいずれかの方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって求めることができる。結合分子は、参照抗体または参照抗原結合断片の所定のエピトープへの結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合的に阻害するということができる。
【0083】
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、個々のエピトープと、１つ以上の抗原結合ドメイン、例えば免疫グロブリン分子の抗原結合ドメインとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７～２８ページを参照されたい。本明細書で使用する場合、「アビディティ」という用語は、抗原結合ドメイン集団と抗原との複合体の全体的な安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの文献の２９～３４ページを参照されたい。アビディティは、その集団内の個々の抗原結合ドメインと特異的エピトープとの親和性、及び免疫グロブリンと抗原との結合価の両方に関連する。例えば、二価のモノクローナル抗体と、高度な繰り返しエピトープ構造を有する抗原（ポリマーなど）との相互作用は、アビディティの高い相互作用であろう。二価のモノクローナル抗体と、細胞表面に高密度で存在する受容体との相互作用も、アビディティの高い相互作用であろう。
【0084】
本明細書に開示されているような結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、その交差反応性の観点からも説明または特定できる。本明細書で使用する場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアントもしくは誘導体が、第２の抗原と反応する能力を指し、２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度である。したがって、結合分子は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性を有する。交差反応性エピトープは概して、その誘導エピトープと同じ相補的な構造上の特徴を多く含み、場合によって、実際には、元のエピトープよりも適合性が高くなることもある。
【0085】
結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、抗原に対する結合親和性の観点から説明または特定することもできる。例えば、結合分子は、５×１０－２Ｍ、１０－２Ｍ、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ、５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、１０－５Ｍ、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ、５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、１０－８Ｍ、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ、５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍまたは１０－１５Ｍ以下の解離定数、すなわちＫＤで、抗原に結合することができる。
【0086】
「抗原結合断片」は、一本鎖抗体またはその他の結合ドメインを含め、単独で存在することもできるし、またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖または分泌成分のうちの１つ以上と組み合わさって存在することもできる。可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖または分泌成分のうちの１つ以上とを任意に組み合わせたものを含むことができる抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、トリ及び哺乳動物を含むいずれかの動物起源に由来することができる。その抗体は例えば、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリの抗体であることができる。別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類（例えばサメ）起源であることができる。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含むとともに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックである動物から単離した抗体を含み、後述のように、かつ例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されているように、場合によっては、内在性免疫グロブリンを発現することができ、場合によっては、内在性免疫グロブリンを発現できない。本開示の態様によれば、本発明で提供するようなＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子は、抗体の抗原結合断片、例えばｓｃＦｖ断片を含むことができる。ただし、そのＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、多量体、例えば六量体または五量体を形成できることを条件とする。
【0087】
本明細書で使用する場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、重鎖サブユニットを含む結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン（例えば、アッパーヒンジ領域、ミドルヒンジ領域及び／またはローワーヒンジ領域）、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、テールピース（ｔｐ）、あるいはそれらのバリアントまたは断片のうちの少なくとも１つを含むことができる。例えば、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、以下に限定されないが、１つ以上の抗体アイソタイプ及び／または抗体種のＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはテールピース（ｔｐ）を任意に組み合わせたものを含むことができる。ある特定の態様では、結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはその断片、バリアントもしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４－ｔｐドメイン、またはＣＨ３ドメイン、ＣＨ４－ｔｐドメイン及びＪ鎖を含むことができる。さらに、本開示で使用するための結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、ある特定の定常領域部分、例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部を欠損していることができる。これらのドメイン（例えば重鎖サブユニット）は、元の免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように改変されていることができる。本開示の態様によれば、本発明で提供するようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、ＩｇＭ重鎖定常領域の部分のうち、そのＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、多量体、例えば六量体または五量体を形成可能となるのに十分な部分を含み、例えば、そのＩｇＭ重鎖定常領域としては、ＩｇＭ重鎖定常領域の「多量体化型断片」が挙げられる。
【0088】
本明細書で使用する場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、少なくともＶＬを含み、さらに、ＣＬ（例えばＣκまたはＣλ）ドメインを含むことができる。
【0089】
結合分子、例えば、抗体、抗体様分子、またはその抗原結合断片、抗原結合バリアントもしくは抗原結合誘導体、あるいはその多量体化型断片は、その結合分子が認識するか、または特異的に結合する抗原のエピトープ（複数可）または部分（複数可）の観点から説明または特定することができる。標的抗原の部分のうち、抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する部分は、「エピトープ」、すなわち「抗原決定基」である。標的抗原は、１つのエピトープまたは少なくとも２つのエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、コンホメーション及び種類に応じて、いずれかの数のエピトープを含むことができる。
【0090】
本明細書で使用する場合、「ヒンジ領域」という用語は、重鎖分子の部分のうち、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤの重鎖において、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する部分を含む。このヒンジ領域は、アミノ酸を約２５個含み、フレキシブルであり、それにより、Ｎ末端の２つの抗原結合領域が、独立して移動可能になる。
【0091】
本明細書中で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語には、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合が含まれる。アミノ酸であるシステインは、チオール基を含み、そのチオール基は、第２のチオール基とジスルフィド結合、すなわち架橋を形成できる。
【0092】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性の領域または部位が、第１の種から得たかまたは誘導したものであり、定常領域（インタクトな定常領域、部分的な定常領域または修飾定常領域であることができる）が、第２の種から得たものである抗体を指す。いくつかの実施形態では、標的結合領域または標的結合部位は、ヒト以外の供給源（例えば、マウスまたは霊長類動物）に由来し、定常領域は、ヒトのものである。
【0093】
「多特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内に、２つ以上の異なるエピトープに対する抗原結合ドメインを有する抗体または抗体様分子を指す。カノニカルな抗体構造に追加される他の結合分子は、二重の結合特異性を有するように構築できる。
【0094】
本明細書で使用する場合、「操作抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のいずれか、またはそれらの両方の可変ドメインが、ＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれかにおけるアミノ酸の１つ以上を少なくとも部分的に置き換えることによって改変されている抗体を指す。ある特定の態様では、特異性が既知である抗体に由来するＣＤＲ全体を、異種抗体のフレームワーク領域に移植することができる。フレームワーク領域の由来元である抗体と同じクラスまたは同じサブクラスの抗体から、代替的なＣＤＲを得ることができるが、異なるクラスの抗体、例えば、異なる種に由来する抗体からＣＤＲを得ることもできる。特異性が既知である非ヒト抗体に由来する「ドナー」ＣＤＲが１つ以上、ヒト重鎖フレームワーク領域またはヒト軽鎖フレームワーク領域に移植されている操作抗体は、本明細書では、「ヒト化抗体」という。ある特定の態様では、すべてのＣＤＲが、ドナーの可変領域に由来する完全なＣＤＲに置き換えられているわけではないが、それでも、そのドナーの抗原結合能をレシピエントの可変ドメインに移行できる。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号に示されている説明を踏まえれば、慣用的な実験を行うことによって、機能的な操作抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の技術の範囲内であろう。
【0095】
本明細書で使用する場合、「操作」という用語には、合成手段（例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成、ペプチド、核酸もしくは糖鎖の酵素カップリングもしくは化学カップリング、またはこれらの技法をいくつか組み合わせたもの）による、核酸分子またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
【0096】
本明細書で使用する場合、「連結された」、「融合された」もしくは「融合」という用語、または文法的に同等の他の表現は、互換的に使用できる。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むいずれかの手段によって、２つ以上のエレメントまたは成分をつなぎ合わせることを指す。「インフレーム融合」とは、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳リーディングフレームを維持する形で、２つ以上のポリヌクレオチドＯＲＦをつないで、より長い連続的なＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応するセグメントを２つ以上含む単一のタンパク質である（それらのセグメントは通常、天然では、上記のように接合されることはない）。リーディングフレームは、上記のように、融合されたセグメント全体にわたって連続的になるものの、それらのセグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に離すことができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合することができるが、それらのポリヌクレオチドは、その「融合」ＣＤＲが、連続的なポリペプチドの一部として共翻訳される限りは、免疫グロブリンフレームワーク領域または追加のＣＤＲ領域を少なくとも１つコードするポリヌクレオチドで隔てられていることができる。
【0097】
ポリペプチドとの関連においては、「直線状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおける、アミノ末端からカルボキシル末端方向でのアミノ酸の順序であり、配列内で隣り合うアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造において連続している。あるポリペプチド部分の「アミノ末端側」、すなわち「Ｎ末端側」である別のポリペプチド部分は、連続したポリペプチド鎖において先に現れる部分である。同様に、あるポリペプチド部分の「カルボキシ末端側」、すなわち「Ｃ末端側」である別のポリペプチド部分は、連続したポリペプチド鎖において後に現れる部分である。例えば、典型的な抗体では、可変ドメインは、定常領域の「Ｎ末端側」であり、定常領域は、可変ドメインの「Ｃ末端側」である。
【0098】
本明細書で使用する場合、「発現」という用語は、遺伝子が、生化学物質、例えばポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的存在をいずれかに顕在化させることが含まれ、その顕在化としては、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現及び安定発現の両方が挙げられる。このプロセスには、限定されるものではないが、遺伝子のＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））への転写、及びこのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれる。最終的な望ましい生成物が、生化学物質である場合、発現には、その生化学物質及び任意の前駆体の生成が含まれる。遺伝子の発現により、「遺伝子産物」が作られる。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載されている遺伝子産物には、翻訳後修飾、例えばポリアデニル化が行われた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、糖鎖付加、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質切断などが行われたポリペプチドがさらに含まれる。
【0099】
「治療する」、「治療」、「治療すること」、「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、診断された既存の疾患、病態または障害の症状を治癒、減速、抑制し、及び／または診断された既存の疾患、病態または障害の進行を停止もしくは減速する治療手段を指す。「予防する」、「予防」、「回避する」、「抑止」などの用語は、標的とする未診断の疾患、病態または障害の発現を予防する予防手段を指す。したがって、「治療の必要な対象」には、すでにその障害に罹患した対象、その障害に罹患する傾向のある対象、及びその障害を予防すべき対象を含めることができる。
【0100】
本明細書で使用する場合、「血清中半減期」または「血漿中半減期」という用語は、タンパク質または薬物、例えば、本明細書に記載されているような抗体、抗体様分子またはその断片といった結合分子の血清中濃度または血漿中濃度が、投与後、５０％低下するのに要する時間（例えば、分単位、時間単位または日数単位）を指す。中央コンパートメント、例えば、静脈内送達の場合には血液から、末梢コンパートメント（例えば、組織または器官）への薬物再分布プロセスにより、血漿中濃度が低下する速度であるアルファ半減期、α半減期、ｔ１／２αと、排泄または代謝のプロセスにより低下する速度であるベータ半減期、β半減期、ｔ１／２βという２つの半減期を記載できる。
【0101】
本明細書で使用する場合、「血漿中薬物濃度－時間曲線下面積」または「ＡＵＣ」という用語は、ある用量の薬物を投与した後、身体が実際に薬物に曝露される量を反映するものであり、ｍｇ・ｈ／Ｌで表される。この曲線下面積は、０時点（ｔ０）から無限大時間（∞）まで測定され、身体からの薬物の排出速度及び投与量に左右される。
【0102】
本明細書で使用する場合、「平均滞留時間」、すなわち「ＭＲＴ」という用語は、薬物が体内に留まる時間の長さの平均を指す。
【0103】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後診断または治療が所望されるいずれかの対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物の対象としては、ヒト、飼育動物、家畜動物、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット動物（イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなど）が挙げられる。
【0104】
本明細書で使用する場合、「治療から利益を得られる対象」及び「治療の必要な動物」のような表現は、対象と見込まれるすべてのもののうち、所定の治療剤、例えば、抗原結合ドメインを１つ以上含む結合分子（抗体または抗体様分子など）の投与から利益を得られると思われる対象のサブセットを指す。このような結合分子、例えば、抗体または抗体様分子は、例えば、診断手順、及び／または疾患の治療もしくは予防に使用できる。
【0105】
ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来の結合分子
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答して、Ｂ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、天然においては、血清中に１．５ｍｇ／ｍｌ前後で存在し、半減期は約５日である。ＩｇＭは、五量体または六量体の分子であり、すなわち、結合ユニットを５つまたは６つ含む。ＩｇＭ結合ユニットは典型的には、軽鎖を２つ、及び重鎖を２つ含む。ＩｇＧ重鎖定常領域が、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含むのに対して、ＩｇＭの重鎖（μ鎖）定常領域はさらに、４つ目の定常ドメイン（ＣＨ４）を含むとともに、Ｃ末端の「テールピース」（ｔｐ）を含む。いくつかのヒトアレルが存在するが、ヒトＩｇＭ定常領域は典型的には、配列番号５１（ＩＭＧＴアレルＩＧＨＭ＊０３、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８と同一）または配列番号５２（ＩＭＧＴアレルＩＧＨＭ＊０４、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｓｐ｜Ｐ０１８７１．４と同一）のアミノ酸配列を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号５１または配列番号５２の５番目のアミノ酸のあたりから、１０２番目のアミノ酸のあたりにまでに及び、ヒトＣμ２領域は、配列番号５１または配列番号５２の１１４番目のアミノ酸のあたりから、２０５番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＣμ３領域は、配列番号５１または配列番号５２の２２４番目のアミノ酸のあたりから、３１９番目のアミノ酸のあたりにまで及び、Ｃμ４領域は、配列番号５１または配列番号５２の３２９番目のアミノ酸のあたりから、４３０番目のアミノ酸のあたりにまで及び、テールピースは、配列番号５１または配列番号５２の４３１番目のアミノ酸のあたりから、４５３番目のアミノ酸のあたりにまで及ぶ。
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答して、Ｂ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、天然においては、血清中に１．５ｍｇ／ｍｌ前後で存在し、半減期は約５日である。ＩｇＭは、五量体または六量体の分子であり、すなわち、結合ユニットを５つまたは６つ含む。ＩｇＭ結合ユニットは典型的には、軽鎖を２つ、及び重鎖を２つ含む。ＩｇＧ重鎖定常領域が、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含むのに対して、ＩｇＭの重鎖（μ鎖）定常領域はさらに、４つ目の定常ドメイン（ＣＨ４）を含むとともに、Ｃ末端の「テールピース」（ｔｐ）を含む。いくつかのヒトアレルが存在するが、ヒトＩｇＭ定常領域は典型的には、配列番号５１（ＩＭＧＴアレルＩＧＨＭ＊０３、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｐｉｒ｜｜Ｓ３７７６８と同一）または配列番号５２（ＩＭＧＴアレルＩＧＨＭ＊０４、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｓｐ｜Ｐ０１８７１．４と同一）のアミノ酸配列を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号５１または配列番号５２の５番目のアミノ酸のあたりから、１０２番目のアミノ酸のあたりにまでに及び、ヒトＣμ２領域は、配列番号５１または配列番号５２の１１４番目のアミノ酸のあたりから、２０５番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＣμ３領域は、配列番号５１または配列番号５２の２２４番目のアミノ酸のあたりから、３１９番目のアミノ酸のあたりにまで及び、Ｃμ４領域は、配列番号５１または配列番号５２の３２９番目のアミノ酸のあたりから、４３０番目のアミノ酸のあたりにまで及び、テールピースは、配列番号５１または配列番号５２の４３１番目のアミノ酸のあたりから、４５３番目のアミノ酸のあたりにまで及ぶ。
【0106】
配列にわずかな違いのある他の形態のヒトＩｇＭ定常領域が存在し、その形態としては、限定されるのもではないが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＢ３７８３８．１及びｐｉｒ｜｜ＭＨＨＵが挙げられる。配列番号５１または配列番号５２に対応する位置におけるアミノ酸の置換、挿入及び／または欠失（本開示の他の箇所に記載及び特許請求されている）も同様に、代替的なヒトＩｇＭ配列、及び他の種のＩｇＭ定常領域のアミノ酸配列に導入できる。
【0107】
それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域は、抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖもしくはＶＨＨ、または抗原結合ドメインのサブユニット、例えばＶＨ領域と結合できる。
【0108】
５つのＩｇＭ結合ユニットは、追加の小さいポリペプチド鎖（Ｊ鎖）、またはその機能的断片、機能的バリアントもしくは機能的誘導体と複合体を形成して、五量体のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を形成できる。ヒトＪ鎖の前駆体形態は、配列番号１として示されている。シグナルペプチド（表１０で下線が付されている）は、配列番号１の１番目のアミノ酸から２２番目のアミノ酸のあたりまでに及び、成熟ヒトＪ鎖は、配列番号１の２３番目のアミノ酸のあたりから、１５９番目のアミノ酸のあたりまでに及ぶ。成熟ヒトＪ鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【0109】
例示的なバリアント及び改変Ｊ鎖は、本明細書の別の箇所に示されている。Ｊ鎖がない場合には、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は典型的には、六量体にアセンブルされており、６個の結合ユニットと、最大で１２個の抗原結合ドメインを含む。Ｊ鎖を有する場合には、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は典型的には、五量体にアセンブルされており、５個の結合ユニットと、最大で１０個の抗原結合ドメインを含み、さらには、そのＪ鎖が、例えば、追加の抗原結合ドメイン（複数可）であることができる異種ポリペプチドを１つ以上含む改変Ｊ鎖である場合には、１０個超の抗原結合ドメインを含む。５個または６個のＩｇＭ結合ユニットがアセンブルされて、五量体または六量体のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体となるには、Ｃμ４ドメインとテールピースドメインとの相互作用が必要になると考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）を参照されたい。したがって、本開示で提供する五量体または六量体のＩｇＭ抗体または抗体様分子の定常領域は典型的には、少なくとも、Ｃμ４ドメイン及び／またはテールピースドメイン（本明細書では、総称してＣμ４－ｔｐともいう）を含む。すなわち、ＩｇＭ重鎖定常領域の「多量体化型断片」は、少なくともＣμ４－ｔｐメインを含む。加えて、ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ３ドメインまたはその断片、Ｃμ２ドメインまたはその断片、Ｃμ１ドメインまたはその断片を含むことができる。ある特定の態様では、本発明で提供するような結合分子、例えば、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は、例えば本発明で提供するような完全なＩｇＭ重鎖（μ鎖）定常ドメイン、例えば、配列番号５１もしくは配列番号５２、またはそのバリアント、誘導体もしくは類似体を含むことができる。
【0110】
ある特定の態様では、本開示は、二価の結合ユニットを５つ含む五量体のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を提供し、その各結合ユニットは、それぞれ抗原結合ドメインまたは抗原結合ドメインのサブユニットと結合している、ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む。ある特定の態様では、その２つのＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
【0111】
本発明で提供するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体が、五量体である場合には、そのＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体は典型的には、Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントをさらに含む。ある特定の態様では、そのＪ鎖は、本明細書の他の箇所に記載されているように、そのＪ鎖に結合した異種部分を１つ以上さらに含む改変Ｊ鎖またはそのバリアントである。ある特定の態様では、そのＪ鎖は、本明細書の他の箇所で論じられているように、本発明で提供するＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の血清中半減期に影響を及ぼすように、例えば、その血清中半減期を長くするように変異されていることができる。ある特定の実施形態では、そのＪ鎖は、本開示の他の箇所で論じられているように、糖鎖付加に影響を及ぼすように変異されていることができる。
【0112】
いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、六量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を６つ含む。いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、六量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を６つ含み、その各結合ユニットは、ＩｇＭ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む。
【0113】
ＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｃμ１ドメイン、もしくはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメイン、もしくはその断片もしくはバリアント、Ｃμ３ドメイン、もしくはその断片もしくはバリアント、Ｃμ４ドメイン、もしくはその断片もしくはバリアント、及び／またはテールピース（ｔｐ）、もしくはその断片もしくはバリアントのうちの１つ以上を含むことができる。ただし、その定常領域が、そのＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体において、所望の機能を発揮できること、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と結合して１つ、２つ、もしくはそれ以上の抗原結合ドメインと結合ユニットを形成でき、及び／または他の結合ユニット（五量体の場合にはＪ鎖）と結合して六量体もしくは五量体を形成できることを条件とする。ある特定の実施形態では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域、またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ４ドメイン、またはその断片もしくはバリアント、テールピース（ｔｐ）、またはその断片もしくはバリアント、あるいはＣμ４ドメインとｔｐを組み合わせたもの、またはその断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域、またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ３ドメイン、またはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメイン、またはその断片もしくはバリアント、Ｃμ１ドメイン、またはその断片もしくはバリアント、あるいはこれらを任意に組み合わせたものをさらに含む。
【0114】
いくつかの実施形態では、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは、軽鎖を２つ含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体の結合ユニットは、軽鎖の断片を２つ含む。いくつかの実施形態では、その軽鎖は、κ軽鎖である。いくつかの実施形態では、その軽鎖は、λ軽鎖である。いくつかの実施形態では、各結合ユニットは、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む免疫グロブリン軽鎖を２つ含む。
【0115】
血清中半減期が延長されたＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来の結合分子
本発明で提供する、ある特定の、ＩｇＭ由来の多量体型結合分子は、血清中半減期が長くなるように改変されていることができる。ＩｇＭ由来の結合分子の血清中半減期を延長できる、ＩｇＭ重鎖定常領域の例示的な変異は、国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１に開示されており、この国際公開特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。例えば、本発明で提供するような、ＩｇＭ由来の結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（例えば、配列番号５１または配列番号５２）のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができる。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸」とは、いずれかの種のＩｇＭ定常領域の配列内のアミノ酸のうち、ヒトＩｇＭ定常領域内のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５と相同であるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、配列番号５１または配列番号５２のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸は、いずれかのアミノ酸、例えばアラニンで置換されていることができる。
本発明で提供する、ある特定の、ＩｇＭ由来の多量体型結合分子は、血清中半減期が長くなるように改変されていることができる。ＩｇＭ由来の結合分子の血清中半減期を延長できる、ＩｇＭ重鎖定常領域の例示的な変異は、国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１に開示されており、この国際公開特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。例えば、本発明で提供するような、ＩｇＭ由来の結合分子のバリアントＩｇＭ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域（例えば、配列番号５１または配列番号５２）のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができる。「野生型ヒトＩｇＭ定常領域のアミノ酸Ｓ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸」とは、いずれかの種のＩｇＭ定常領域の配列内のアミノ酸のうち、ヒトＩｇＭ定常領域内のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５と相同であるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、配列番号５１または配列番号５２のＳ４０１、Ｅ４０２、Ｅ４０３、Ｒ３４４及び／またはＥ３４５に対応するアミノ酸は、いずれかのアミノ酸、例えばアラニンで置換されていることができる。
【0116】
ＣＤＣ活性が低下したＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来の結合分子
本発明で提供するような、ある特定の、ＩｇＭ由来の多量体型結合分子は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を低下させる変異以外は同一である対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域を有する参照ＩｇＭ抗体または参照ＩｇＭ様抗体と比べて、補体の存在下で、細胞に対するＣＤＣ活性が低下するように操作されていることができる。これらのＣＤＣ変異は、本明細書に示されているように、Ｎ－結合型糖鎖付加をブロックする変異及び／または血清中半減期を延長させる変異のいずれかと組み合わさっていることができる。「対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域」とは、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす、定常領域における改変（１つまたは複数）以外は、バリアントＩｇＭ定常領域と同一であるヒトＩｇＭ定常領域またはその一部、例えばＣμ３ドメインを意味する。ある特定の態様では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、例えば国際公開番号ＷＯ／２０１８／１８７７０２（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているように、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対して、例えばＣμ３ドメインにアミノ酸置換を１つ以上含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイは、当業者に周知であり、例示的なアッセイは、例えば、国際公開番号ＷＯ／２０１８／１８７７０２に記載されている。
本発明で提供するような、ある特定の、ＩｇＭ由来の多量体型結合分子は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を低下させる変異以外は同一である対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域を有する参照ＩｇＭ抗体または参照ＩｇＭ様抗体と比べて、補体の存在下で、細胞に対するＣＤＣ活性が低下するように操作されていることができる。これらのＣＤＣ変異は、本明細書に示されているように、Ｎ－結合型糖鎖付加をブロックする変異及び／または血清中半減期を延長させる変異のいずれかと組み合わさっていることができる。「対応する参照ヒトＩｇＭ定常領域」とは、ＣＤＣ活性に影響を及ぼす、定常領域における改変（１つまたは複数）以外は、バリアントＩｇＭ定常領域と同一であるヒトＩｇＭ定常領域またはその一部、例えばＣμ３ドメインを意味する。ある特定の態様では、バリアントヒトＩｇＭ定常領域は、例えば国際公開番号ＷＯ／２０１８／１８７７０２（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているように、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対して、例えばＣμ３ドメインにアミノ酸置換を１つ以上含む。ＣＤＣを測定するためのアッセイは、当業者に周知であり、例示的なアッセイは、例えば、国際公開番号ＷＯ／２０１８／１８７７０２に記載されている。
【0117】
ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号２２（ヒトＩｇＭ定常領域のアレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２３（ヒトＩｇＭ定常領域のアレルＩＧＨＭ＊０４）のＬ３１０、Ｐ３１１、Ｐ３１３及び／またはＫ３１５の位置に、アミノ酸置換を含む。ある特定の態様では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号５１または配列番号５２のＰ３１１の位置に、アミノ酸置換を含む。別の態様では、本発明で提供するようなバリアントＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号５１または配列番号５２のＰ３１３の位置に、アミノ酸置換を含む。別の態様では、本発明で提供するようなバリアントＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号５１もしくは配列番号５２のＰ３１１の位置、及び／または配列番号５１もしくは配列番号５２のＰ３１３の位置に、置換を組み合わせたものを含む。これらのプロリン残基は独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、アラニン、セリンまたはグリシンで置換されていることができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号２２または配列番号２３のＫ３１５の位置に、アミノ酸置換を含む。そのリジン残基は独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、グリシンまたはアスパラギン酸で置換されていることができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号２２または配列番号２３のＫ３１５の位置に、アスパラギン酸でのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号２２または配列番号２３のＬ３１０の位置に、アミノ酸置換を含む。そのリジン残基は独立して、いずれかのアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、グリシンまたはアスパラギン酸で置換されていることができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＣ活性を低下させるバリアントヒトＩｇＭ定常領域は、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対応する配列番号２２または配列番号２３のＬ３１０の位置に、アスパラギン酸でのアミノ酸置換を含む。
【0118】
ヒト及びヒト以外のある特定の霊長類動物のＩｇＭ定常領域は典型的には、天然のアスパラギン（Ｎ）－結合型糖鎖付加モチーフまたはＮ－結合型糖鎖付加部位を５つ含む。本明細書で使用する場合、「Ｎ－結合型糖鎖付加モチーフ」は、アミノ酸配列Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔを含むか、またはその配列からなり、この配列中、Ｎは、アスパラギンであり、Ｘ１は、プロリン（Ｐ）以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｓ／Ｔは、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）である。その糖鎖は、アスパラギン残基の窒素原子に付加される。例えば、Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ Ｋ，Ｔａｙｌｏｒ ＭＥ（２００６），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．）．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡを参照されたい。Ｎ－結合型糖鎖付加モチーフは、配列番号２２または配列番号２３のヒトＩｇＭ重鎖定常領域において、４６位（「Ｎ１」）、２０９位（「Ｎ２」）、２７２位（「Ｎ３」）、２７９位（「Ｎ４」）及び４４０位（「Ｎ５」）から始まる状態で存在する。これらの５つのモチーフは、ヒト以外の霊長類動物のＩｇＭ重鎖定常領域において保存されており、その５つのうちの４つは、マウスＩｇＭ重鎖定常領域において保存されている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明で提供するような多量体型結合分子のＩｇＭ重鎖定常領域は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４及びＮ５という５つのＮ－結合型糖鎖付加モチーフを含む。いくつかの実施形態では、それぞれのＩｇＭ重鎖定常領域上のＮ－結合型糖鎖付加モチーフのうちの少なくとも３つ（例えば、Ｎ１、Ｎ２及びＮ３）は、複合体糖鎖によって占められている。
【0119】
ある特定の実施形態では、Ｎ－Ｘ１－Ｓ／Ｔモチーフのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つは、そのモチーフにおける糖鎖付加を防ぐ、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＩｇＭ由来の多量体型結合分子は、モチーフＮ１、モチーフＮ２、モチーフＮ３、モチーフＮ５、またはモチーフＮ１、Ｎ２、Ｎ３もしくはＮ５のうちの２つ以上、３つ以上もしくは４つすべてを任意に組み合わせたものにおける、アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含むことができ、そのアミノ酸の挿入、欠失、または置換は、そのモチーフにおける糖鎖付加を防ぐ。いくつかの実施形態では、そのＩｇＭ定常領域は、配列番号２２（ヒトＩｇＭ定常領域のアレルＩＧＨＭ＊０３）または配列番号２３（ヒトＩｇＭ定常領域のアレルＩＧＨＭ＊０４）の４６位、２０９位、２７２位または４４０位に、野生型ヒトＩｇＭ定常領域に対する置換を１つ以上含む。例えば、米国特許仮出願６２／８９１，２６３号（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【0120】
ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、及びＩｇＡ由来の結合分子
ＩｇＡは、粘膜免疫において重要な役割を果たし、産生される免疫グロブリン全体の約１５％を占める。ＩｇＡは、単量体または多量体であることができ、主として二量体分子を形成するが、三量体、四量体及び／または五量体としてもアセンブルできる。例えば、ｄｅ Ｓｏｕｓａ－Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｆ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ８：５７（２０１９）を参照されたい。
ＩｇＡは、粘膜免疫において重要な役割を果たし、産生される免疫グロブリン全体の約１５％を占める。ＩｇＡは、単量体または多量体であることができ、主として二量体分子を形成するが、三量体、四量体及び／または五量体としてもアセンブルできる。例えば、ｄｅ Ｓｏｕｓａ－Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｆ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ８：５７（２０１９）を参照されたい。
【0121】
いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、二量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を２つ含む。いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、二量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を２つ含み、本明細書に記載されているようなＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、二量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を２つ含み、本明細書に記載されているようなＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアントをさらに含み、その各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、四量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を４つ含む。いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、四量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を４つ含み、本明細書に記載されているようなＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、その多量体型結合分子は、四量体であり、二価の結合ユニット、またはそのバリアントもしくは断片を４つ含み、本明細書に記載されているようなＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアントをさらに含み、その各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む。
【0123】
ある特定の態様では、本開示が提供する多量体型結合分子は、合計で４つの抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しているＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片を含む二量体の結合分子でありる。本発明で提供するように、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ由来の結合分子またはＩｇＡ様抗体は、結合ユニットを２つと、Ｊ鎖、例えば、本明細書の他の箇所に記載されているように、そのＪ鎖に融合されたＩＬ－１５及び／またはＩＬ－１５受容体－αスシドメインを含む改変Ｊ鎖を含む。提供するような各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含む。ある特定の態様では、その多量体型結合分子の抗原結合ドメインの少なくとも３つまたは４つすべては、同じ標的抗原に結合する。ある特定の態様では、その多量体型結合分子の結合ポリペプチドの少なくとも３つまたは４つすべては、同じである。
【0124】
ＩｇＡ由来の二価の結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域を２つ含み、ＩｇＡ由来の二量体の結合分子は、結合ユニットを２つ含む。ＩｇＡは、Ｃα１（あるいはＣＡ１またはＣＨ１）、ヒンジ領域、Ｃα２（あるいはＣＡ２またはＣＨ２）、Ｃα３（あるいはＣＡ３またはＣＨ３）、及びＣ末端の「テールピース」という重鎖定常ドメインを含む。ヒトＩｇＡには、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２という２つのサブタイプがある。ヒトＩｇＡ１定常領域は典型的には、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。ヒトＣα１ドメインは、配列番号５３の６番目のアミノ酸のあたりから、９８番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＩｇＡ１ヒンジ領域は、配列番号５３の１０２番目のアミノ酸のあたりから、１２４番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＣα２ドメインは、配列番号５３の１２５番目のアミノ酸のあたりから、２１９番目のアミノ酸のあたりまでに及び、ヒトＣα３ドメインは、配列番号５３の２２８番目のアミノ酸のあたりから、３３０番目のアミノ酸のあたりにまで及び、テールピースは、配列番号５３の３３１番目のアミノ酸のあたりから、３５２番目のアミノ酸のあたりにまで及ぶ。ヒトＩｇＡ２定常領域は典型的には、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。ヒトＣα１ドメインは、配列番号５４の６番目のアミノ酸のあたりから、９８番目のアミノ酸のあたりまでに及び、ヒトＩｇＡ２ヒンジ領域は、配列番号５４の１０２番目のアミノ酸のあたりから、１１１番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＣα２ドメインは、配列番号５４の１１３番目のアミノ酸あたりから、２０６番目のアミノ酸のあたりにまで及び、ヒトＣα３ドメインは、配列番号５４の２１５番目のアミノ酸のあたりから、３１７番目のアミノ酸のあたりにまで及び、テールピースは、配列番号５４の３１８番目のアミノ酸のあたりから、３４０番目のアミノ酸のあたりにまで及ぶ。
【0125】
２つのＩｇＡ結合ユニットは、２つの追加のポリペプチド鎖、すなわち、Ｊ鎖（配列番号２）及び分泌成分（前駆体は配列番号５５、成熟形態は配列番号５６）と複合体を形成して、本発明で提供するような、ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）由来の二価の分泌型結合分子を形成できる。理論に束縛されることを望まないが、２つのＩｇＡ結合ユニットがアセンブルされて、ＩｇＡ由来の二量体の結合分子になるには、Ｃα３ドメイン及びテールピースドメインが必要と考えられている。例えば、Ｂｒａａｔｈｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４２７５５－４２７６２（２００２）を参照されたい。したがって、本開示で提供する、ＩｇＡ由来の二量体の多量体化型結合分子は典型的には、少なくともＣα３ドメイン及びテールピースドメインを含むＩｇＡ定常領域を含む。同様に、４つのＩｇＡ結合ユニットは、Ｊ鎖を有する四量体の複合体を形成できる。ｓＩｇＡ抗体も、高次の多量体、例えば四量体として形成できる。
【0126】
加えて、ＩｇＡ重鎖定常領域は、Ｃα２ドメインもしくはその断片、ＩｇＡヒンジ領域もしくはその断片、Ｃα１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＡ（もしくはその他の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ）重鎖ドメイン（例えば、ＩｇＧヒンジ領域を含む）を含むことができる。ある特定の態様では、本発明で提供するような結合分子は、完全なＩｇＡ重鎖（α鎖）定常ドメイン（例えば、配列番号５３もしくは配列番号５４）、またはそのバリアント、誘導体もしくは類似体を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片は、ヒトＩｇＡ定常領域である。
【0127】
ある特定の態様では、本発明で提供するような多量体型結合分子の各結合ユニットは、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその多量体化型断片もしくは多量体化型バリアントを２つ含み、そのＩｇＡ重鎖定常領域はそれぞれ、少なくともＩｇＡ Ｃα３ドメイン及びＩｇＡテールピースドメインを含む。ある特定の態様では、そのＩｇＡ重鎖定常領域はそれぞれ、ＩｇＡ Ｃα３ドメイン及びＩｇＡテールピースドメインのＮ末端側に位置するＩｇＡ Ｃα２ドメインをさらに含むことができる。例えば、そのＩｇＡ重鎖定常領域は、配列番号５３の１２５～３５３番目のアミノ酸、または配列番号５４の１１３～３４０番目のアミノ酸を含むことができる。ある特定の態様では、そのＩｇＡ重鎖定常領域はそれぞれ、ＩｇＡ Ｃα２ドメインのＮ末端側に位置するＩｇＡヒンジ領域またはＩｇＧヒンジ領域をさらに含むことができる。例えば、そのＩｇＡ重鎖定常領域は、配列番号５３の１０２～３５３番目のアミノ酸、または配列番号５４の１０２～３４０番目のアミノ酸を含むことができる。ある特定の態様では、そのＩｇＡ重鎖定常領域はそれぞれ、ＩｇＡヒンジ領域のＮ末端側に位置するＩｇＡ Ｃα１ドメインをさらに含むことができる。
【0128】
いくつかの実施形態では、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＡ由来のその他の結合分子の各結合ユニットは、軽鎖を２つ含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＡ由来のその他の結合分子の各結合ユニットは、軽鎖断片を２つ含む。いくつかの実施形態では、その軽鎖は、κ軽鎖である。いくつかの実施形態では、その軽鎖は、λ軽鎖である。いくつかの実施形態では、その軽鎖は、κ－λのキメラ軽鎖である。いくつかの実施形態では、各結合ユニットは、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む免疫グロブリン軽鎖を２つ含む。
【0129】
改変Ｊ鎖及び／またはバリアントＪ鎖
ある特定の態様では、本発明で提供するような五量体のＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、または二量体のＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体のＪ鎖は、例えば、そのＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体が、アセンブルされる能力及びその結合標的（複数可）に結合する能力を妨げずに、１つの異種部分または２つ以上の異種部分、例えばポリペプチドを導入することによって、改変されていることができる。米国特許第９，９５１，１３４号、国際公開番号ＷＯ２０１７／０５９３８７及び国際公開番号ＷＯ２０１７／０５９３８０（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所に記載されているような多特異性のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を含め、本発明で提供するようなＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体は、Ｊ鎖、またはその断片もしくはバリアントに導入された異種部分、例えば異種ポリペプチドをさらに含む改変Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントを含むことができる。ある特定の態様では、異種部分は、Ｊ鎖、またはその断片もしくはバリアントにインフレームで融合されているか、または化学的にコンジュゲートされているペプチドまたはポリペプチドであることができる。例えば、その異種ポリペプチドは、Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントに融合されていることができる。ある特定の態様では、その異種ポリペプチドは、Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントに、リンカー、例えば、少なくとも５つのアミノ酸、ただし、典型的には２５個以下のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の態様では、そのペプチドリンカーは、
からなる。ある特定の態様では、その異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートした化学部分であることができる。Ｊ鎖に結合した異種部分としては、限定されるものではないが、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、そのＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体の半減期を延長できる安定化ペプチド、またはポリマーもしくは細胞毒素のような化学部分を挙げることができる。いくつかの実施形態では、異種部分は、その結合分子の半減期を延長できる安定化ペプチド、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはＨＳＡ結合分子を含む。
ある特定の態様では、本発明で提供するような五量体のＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、または二量体のＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体のＪ鎖は、例えば、そのＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体が、アセンブルされる能力及びその結合標的（複数可）に結合する能力を妨げずに、１つの異種部分または２つ以上の異種部分、例えばポリペプチドを導入することによって、改変されていることができる。米国特許第９，９５１，１３４号、国際公開番号ＷＯ２０１７／０５９３８７及び国際公開番号ＷＯ２０１７／０５９３８０（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所に記載されているような多特異性のＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体を含め、本発明で提供するようなＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体は、Ｊ鎖、またはその断片もしくはバリアントに導入された異種部分、例えば異種ポリペプチドをさらに含む改変Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントを含むことができる。ある特定の態様では、異種部分は、Ｊ鎖、またはその断片もしくはバリアントにインフレームで融合されているか、または化学的にコンジュゲートされているペプチドまたはポリペプチドであることができる。例えば、その異種ポリペプチドは、Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントに融合されていることができる。ある特定の態様では、その異種ポリペプチドは、Ｊ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントに、リンカー、例えば、少なくとも５つのアミノ酸、ただし、典型的には２５個以下のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介して融合されている。ある特定の態様では、そのペプチドリンカーは、
【0130】
いくつかの実施形態では、改変Ｊ鎖は、抗原結合ドメイン、例えば、標的抗原に特異的に結合できるポリペプチドをさらに含むことができる。ある特定の態様では、改変Ｊ鎖と結合した抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所に記載されているように、抗体またはその抗原結合断片であることができる。ある特定の態様では、その抗原結合ドメインは、例えば、ラクダ抗体または軟骨魚類抗体に由来する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗原結合ドメインまたは一本鎖抗原結合ドメインであることができる。その抗原結合ドメインは、Ｊ鎖の機能、または結合されたＩｇＭ抗体もしくはＩｇＡ抗体の機能を妨げずに、その抗原結合ドメインをその結合標的に結合可能にするいずれかの位置で、Ｊ鎖に導入できる。挿入位置としては、限定されるものではないが、Ｃ末端もしくはＣ末端近傍、Ｎ末端もしくはＣ末端近傍、またはＪ鎖の三次元構造に基づき利用可能である内側の位置が挙げられる。ある特定の態様では、その抗原結合ドメインは、配列番号２の成熟ヒトＪ鎖に、配列番号２の９２位のシステイン残基と１０１位のシステイン残基との間で導入することができる。さらなる態様では、その抗原結合ドメインは、配列番号２のヒトＪ鎖に、糖鎖付加部位またはその近傍で導入できる。さらなる態様では、その抗原結合ドメインは、配列番号２のヒトＪ鎖に、そのＣ末端から約１０アミノ酸残基以内、またはそのＮ末端から約１０アミノ酸以内で導入できる。
【0131】
本明細書に詳細に記載されているいくつかの実施形態では、改変Ｊ鎖は、サイトカイン、例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）もしくはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントをさらに含むことができ、ある特定の態様では、そのサイトカイン、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントは、結合または共有結合のいずれかを介して、その受容体の一部分、例えば、ＩＬ－１５受容体－αのスシドメインに結合できる。
【0132】
ある特定の態様では、本発明で提供するようなＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、またはＩｇＭ由来の結合分子のＪ鎖は、本発明で提供するＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＡ様抗体、またはＩｇＭもしくはＩｇＡ由来の結合分子の例えば血清中半減期を改変できるアミノ酸置換を１つ以上含むバリアントＪ鎖である。例えば、ある特定の、アミノ酸の置換、欠失、または挿入は、そのバリアントＪ鎖における１つ以上の１アミノ酸の置換、欠失、または挿入以外は同一でありかつ同じ方法を用いて同じ動物種に投与されるＩｇＭ由来参照結合分子と比べて、対象動物に投与されると長い血清中半減期を示す、ＩｇＭ由来結合分子をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、バリアントＪ鎖は、参照Ｊ鎖に対する、１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ、２つ、３つ、または４つ含むことができる。
【0133】
いくつかの実施形態では、多量体型結合分子は、糖鎖付加を低減させるか、または１つ以上のポリメリックＩｇ受容体（例えば、ｐＩｇＲ、Ｆｃ α－μ受容体（ＦｃαμＲ）またはＦｃ μ受容体（ＦｃμＲ））への結合を低下させるバリアントＪ鎖配列（本明細書に記載されているバリアント配列など）を含むことができる。例えば、国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。ある特定の実施形態では、そのバリアントＪ鎖は、成熟野生型ヒトＪ鎖（配列番号２）のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができる。「成熟野生型ヒトＪ鎖のアミノ酸Ｙ１０２に対応するアミノ酸」とは、いずれかの種のＪ鎖の配列内のアミノ酸のうち、ヒトＪ鎖におけるＹ１０２と相同であるアミノ酸を意味する。国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。配列番号２におけるＹ１０２に対応する位置は、少なくとも４３種の他の種のＪ鎖アミノ酸配列において保存されている。米国特許第９，９５１，１３４号の図４（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい。配列番号２のＹ１０２に対応する位置におけるある特定の変異は、変異体Ｊ鎖を含むＩｇＭ五量体へのある特定の免疫グロブリン受容体、例えば、ヒトもしくはマウスのＦｃαμ受容体、マウスＦｃμ受容体、及び／またはヒトもしくはマウスのポリメリックＩｇ受容体（ｐＩｇ受容体）の結合を阻害できる。配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸に変異を含むＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、及びＩｇＭ由来の結合分子は、動物に投与したときの血清中半減期が、その置換以外は同一でありかつ同じ種に同じ方式で投与される対応する抗体、抗体様分子、または結合分子よりも改善されている。ある特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、いずれかのアミノ酸で置換されていることができる。ある特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、またはアルギニン（Ｒ）で置換されていることができる。特定の態様では、配列番号２のＹ１０２に対応するアミノ酸は、アラニンで置換されていることができる。特定の態様では、そのＪ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントは、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列を含み、このＪ鎖は、「Ｊ＊」という。
【0134】
野生型Ｊ鎖は典型的には、Ｎ－結合型糖鎖付加部位を１つ含む。ある特定の実施形態では、本発明で提供するような多量体型結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能的断片は、例えば、成熟ヒトＪ鎖（配列番号２）またはＪ＊（配列番号３）の４９番目のアミノ酸（モチーフＮ６）に対応するアミノ酸位置から始まるＮ－Ｘ１－Ｓ／Ｔというアスパラギン（Ｎ）－結合型糖鎖付加モチーフ内に変異を含み、このＮは、アスパラギンであり、Ｘ１は、プロリン以外のいずれかのアミノ酸であり、Ｓ／Ｔは、セリンまたはトレオニンであり、この変異により、そのモチーフでの糖鎖付加が防止される。例えば、いくつかの実施形態では、そのＪ鎖は、Ｎ４９に置換を含む（Ｎ４９Ｄなど）。いくつかの実施形態では、そのＪ鎖は、配列番号８６の１～１３７番目のアミノ酸を含む。国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４に示されているように、Ｎ４９での糖鎖付加を防ぐ変異により、本発明で提供するような多量体型結合分子であって、対象動物に投与されると、そのバリアントＪ鎖における上記変異または糖鎖付加を防ぐ変異以外は同一でありかつ同じ方法で同じ動物種に投与される参照多量体型結合分子と比べて、長い血清中半減期を示す、多量体型結合分子がもたらされることができる。
【0135】
例えば、ある特定の実施形態では、本発明で提供するような、Ｊ鎖を含む結合分子のバリアントＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアントは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸Ｎ４９またはアミノ酸Ｓ５１に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含むことができ（ただし、Ｓ５１に対応するアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）で置換されていないことを条件とする）、あるいは、そのバリアントＪ鎖は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸Ｎ４９及びＳ５１の両方に対応するアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、配列番号２または配列番号３のＮ４９に対応する位置は、いずれかのアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。特定の実施形態では、配列番号２または配列番号３のＮ４９に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換されていることができる。別の特定の実施形態では、配列番号２または配列番号３のＮ４９に対応する位置は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されていることができる。いくつかの実施形態では、配列番号２または配列番号３のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）で置換されていることができる。いくつかの実施形態では、配列番号２または配列番号３のＳ５１に対応する位置は、アラニン（Ａ）で置換されている。
【0136】
免疫刺激物質を発現する改変Ｊ鎖を有する多量体型結合分子
本開示は、免疫刺激特性を有する多量体型結合分子を提供する。ある特定の態様では、本開示は、二価のＩｇＡ結合ユニットもしくはＩｇＡ様結合ユニットを２つ、二価のＩｇＭ結合ユニットもしくはＩｇＭ様結合ユニットを５つ、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片と、改変Ｊ鎖とを含む、多量体型結合分子を提供する。各結合ユニットは、２つのＩｇＡ重鎖定常領域もしくは２つのＩｇＭ重鎖定常領域のいずれか、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含み、その定常領域は、合計で４個または１０個の抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しており、それらの抗原結合ドメインは、同じであることも、異なることもできるが、ある特定の態様では、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個が、標的抗原に特異的に結合する。それらの抗原結合ドメインは、同じであることもできるし、または異なることもでき、例えば、同じ標的抗原の異なるエピトープに結合する。
本開示は、免疫刺激特性を有する多量体型結合分子を提供する。ある特定の態様では、本開示は、二価のＩｇＡ結合ユニットもしくはＩｇＡ様結合ユニットを２つ、二価のＩｇＭ結合ユニットもしくはＩｇＭ様結合ユニットを５つ、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片と、改変Ｊ鎖とを含む、多量体型結合分子を提供する。各結合ユニットは、２つのＩｇＡ重鎖定常領域もしくは２つのＩｇＭ重鎖定常領域のいずれか、またはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含み、その定常領域は、合計で４個または１０個の抗原結合ドメインとなるようにそれぞれ抗原結合ドメインと結合しており、それらの抗原結合ドメインは、同じであることも、異なることもできるが、ある特定の態様では、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個が、標的抗原に特異的に結合する。それらの抗原結合ドメインは、同じであることもできるし、または異なることもでき、例えば、同じ標的抗原の異なるエピトープに結合する。
【0137】
提供する多量体型結合分子の改変Ｊ鎖は、（ａ）Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ｂ）免疫刺激物質（「ＩＳＡ」）とを含み、ここで、Ｊ及びＩＳＡは、融合タンパク質として結合している。本明細書で使用する場合、「ＩＳＡ」という用語は、Ｊ鎖に融合された異種部分であって、免疫刺激活性を有する、異種部分を指すこともできるし、または免疫刺激活性を有する多量体型結合分子全体を指すこともできる。ある特定の態様では、ＩＳＡは、サイトカイン、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントを含む。例えば、ＩＳＡは、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアントのいずれかを含むことができる。下記のように、ＩＳＡは、加えて、受容体サブユニットの一部分またはその他の免疫刺激部分を含むことができる。
【0138】
ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαのスシドメインと複合体を形成すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激できる極めて強力なＩＳＡを形成する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ａ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、もしくはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）、及び／または（ｂ）スシドメインを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片、もしくはＩと結合できるそのバリアント（「Ｒ」）とを含む、改変Ｊ鎖を提供し、ＪとＩ及びＲのうちの少なくとも１つとは、融合タンパク質として結合しており、Ｉ及びＲは、結合してＩＳＡとして機能できる。「Ｊ」は、いずれかの種の野生型Ｊ鎖、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含む野生型ヒトＪ鎖、またはその機能的断片もしくは機能的バリアントであることができる。
【0139】
あるいは、「Ｊ」は、国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１に記載されているように、野生型Ｊ鎖に対する１アミノ酸の置換、欠失、または挿入を１つ以上含むバリアントＪ鎖またはその断片であることができ、前記置換、欠失、または挿入は、例えば、Ｊ鎖を含むその多量体型結合分子の血清中半減期に影響を及ぼすことができる。ある特定の態様では、「Ｊ」は、バリアントヒトＪ鎖であり、配列番号３のアミノ酸配列を含み、本明細書では（「Ｊ＊」）ともいう。
【0140】
ある特定の態様では、その免疫刺激物質のインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、またはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）は、配列番号４のアミノ酸配列を含む野生型ヒトＩＬ－１５タンパク質である。野生型ヒトＩＬ－１５を含む改変Ｊ鎖ＩＳＡの非限定的な例は、本明細書に示されており、例えば、配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６である。
【0141】
本発明で提供するような免疫刺激物質（ＩＳＡ）を含む多量体型結合分子は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖及び活性化を効率的に刺激できる。したがって、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子は、例えば、がんまたは感染症を治療するための有効な治療剤として機能できる。しかしながら、ある特定の状況では、エフェクター細胞を十分に増殖させながら、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のような毒性副作用を最小限に抑えるために、エフェクター細胞を刺激する効力を調節する、例えば低下させるのが望ましいこともある。したがって、本開示は、ＩＳＡ活性の効力を調節、例えば、改変または低下させる多量体型結合分子を提供する。ある特定の態様では、「Ｉ」は、ヒトＩＬ－１５の受容体結合バリアントであって、受容体の結合を低下させるが、消失はさせない、バリアントを含む。ある特定の態様では、ヒトＩＬ－１５の受容体結合バリアントは、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個含み、その１アミノ酸の挿入、欠失、または置換は、そのＩＬ－１５バリアントの、その受容体に対する親和性を低下させる。ヒトＩＬ－１５のバリアント型のうち、この目標を達成する型は、国際公開番号ＷＯ２０１８／０７１９１８Ａ１に記載されている。ある特定の態様では、バリアントヒトＩＬ－１５は、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個含むが、１アミノ酸の挿入、欠失、または置換は、１０個以下である。ある特定の態様では、Ｉは、１アミノ酸の置換を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個含むバリアントヒトＩＬ－１５を含む。ある特定の態様では、そのアミノ酸置換は、配列番号４のＮ１、Ｎ４、Ｄ８、Ｄ３０、Ｄ６１、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｎ７２、またはＱ１０８に対応する位置のうちの１つ以上に存在する。ある特定の態様では、そのアミノ酸置換は、配列番号４における置換Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ、またはＱ１０８Ｅのうちの１つ以上を含む。例えば、本発明で提供するある特定の多量体型結合分子では、Ｉは、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ｄ、Ｄ８Ｎ、Ｄ３０Ｎ、Ｄ６１Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ７２Ｄ、及びＱ１０８Ｅからなる群から選択される位置における１アミノ酸の置換、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ及びＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄからなる群から選択される位置における２アミノ酸の置換、あるいは位置Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄにおける３アミノ酸の置換を除いては配列番号４を含む。ある特定の態様では、Ｉは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、または配列番号６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【0142】
実施例に示されているように、Ｊ＊ＲＩの構成の改変Ｊ鎖ＩＳＡを含むとともに、これらの変異のうちの１つ、２つまたは３つを含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭ五量体は依然として、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を誘導できるが、野生型ヒトＩＬ－１５を含む対応するＩＳＡと比べて、その効力は低下している。
【0143】
ある特定の態様では、「Ｒ」は、ヒトＩＬ－１５受容体－αのスシドメインを含む。ある特定の態様では、Ｒは、配列番号５のアミノ酸配列、またはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントもしくは断片を含む。ある特定の態様では、Ｒは、配列番号５のアミノ酸配列もしくはヒトＩＬ－１５と結合できるそのバリアントから本質的になるか、またはそれからなる。
【0144】
ＩＬ－１５と、ＩＬ－１５Ｒαのスシドメインとを含む改変Ｊ鎖ＩＳＡは、いくつかの方法で構成させることができる。典型的には、少なくともＩまたはＲが、融合タンパク質としてＪと結合している。例えば、ＪがＪ＊である場合、その構成は、Ｊ＊Ｉ、ＩＪ＊、Ｊ＊ＲまたはＲＪ＊であることができる。これらの実施形態では、ＩまたはＲは、Ｊ＊に融合されたＲまたはＩと結合できる別のタンパク質サブユニットとして供給できる。ある特定の態様では、Ｉ及びＲの両方が、Ｊ鎖に融合されている。例えば、ＪがＪ＊である場合、その構成は、Ｊ＊ＲＩ、Ｊ＊ＩＲ、ＲＩＪ＊、ＩＲＪ＊、ＩＪ＊ＲまたはＲＪ＊Ｉであることができる。典型的には、異種部分は、Ｊ鎖またはそのバリアントもしくは断片に、アミノ酸からなる小さいフレキシブルな鎖であるリンカー、典型的には、小さいアミノ酸、例えば、グリシン（Ｇ）及び／またはセリン（Ｓ）を含むリンカーを介して融合されている。例示的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、この配列中、ｎは、１～１０の整数である（配列番号２２６）。例えば、そのリンカーは、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２または配列番号８３を含むか、その配列からなるか、またはその配列から本質的になることができる。そのＪ鎖、例えば、ＪまたはＪ＊が、Ｉ及びＲの両方に融合している場合、合計で少なくとも２つのリンカーとなるように、リンカーは典型的には、各エレメントの間に使用されている。その少なくとも２つのリンカーは、同じであることも、異なることもできる。ある特定の態様では、少なくとも１つのリンカーは、アミノ酸配列
を含むか、その配列から本質的になるか、またはその配列からなる。ある特定の態様では、少なくとも１つのリンカーは、アミノ酸配列
を含むか、その配列から本質的になるか、またはその配列からなる。ある特定の態様では、多量体型結合分子は、免疫刺激活性を有する改変Ｊ鎖を含み、その改変Ｊ鎖は、Ｊ＊の変異を含み、その改変Ｊ鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉ、Ｊ＊－Ｉ－Ｒ、Ｉ－Ｒ－Ｊ＊、Ｒ－Ｉ－Ｊ＊、Ｒ－Ｊ＊－Ｉ、Ｉ－Ｊ＊－Ｒ、Ｉ－Ｊ＊、またはＪ＊－Ｉとして配置されており、その配置中、「－」は、リンカーである。ある特定の態様では、その多量体型結合分子の改変Ｊ鎖は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【0145】
ある特定の態様では、その改変Ｊ鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｊ＊－Ｒ－Ｉとして配置されている。本発明で提供するような多量体型結合分子に含めるための、この構成の例示的なＩＳＡは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【0146】
提供する多量体型結合分子の改変Ｊ鎖は、（ａ）Ｊ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）と、（ｂ）免疫刺激物質（「ＩＳＡ」）とを含み、ここで、Ｊ及びＩＳＡは、融合タンパク質として結合している。ある特定の態様では、そのＩＳＡは、サイトカインＩＬ－２またはそのバリアントを含むことができる。野生型ヒトＩＬ－２は、がん免疫療法として使用すると、ヒトにおいて重篤な副作用を引き起こすことがある。したがって、親和性の低い二量体のβ／γ受容体には結合するが、親和性の高い三量体のα／β／γ受容体には結合しない、ＩＬ－２のバリアントが開発されている。そのため、それらのバリアントは、効力が低減されており、毒性副作用のレベルも低い。バリアントの１つであるＩＬ－２ｖが米国特許第９，２６６，９３８号に記載されており、本明細書には、配列番号３１として示されている。ＩＬ－２ｖを含む改変Ｊ鎖ＩＳＡは、本明細書には、配列番号３２として示されている。
【0147】
ある特定の態様では、本発明で提供するような多量体型結合分子の改変Ｊ鎖は、そのＪ鎖に融合された、抗体の抗原結合ドメインをＩＳＡとともにさらに含むことができる。例えば、本発明で提供するＪ＊ＲＩのような改変Ｊ鎖は、バリアントＪ鎖のＮ末端に融合された一本鎖Ｆｖ結合ドメインをさらに含むことができる。このような抗原結合ドメインを用いて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＮＫ細胞のような免疫エフェクター細胞を標的とすることができ、その際、その細胞は、ＩＳＡに応答して、刺激されて増殖できる。したがって、ある特定の態様では、本発明で提供するような改変Ｊ鎖は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＴＬまたはＮＫ細胞の上の標的に結合するｓｃＦｖ抗原結合ドメインをさらに含むことができる。ＮＫ細胞を標的とするのが望ましい場合には、そのｓｃＦｖは、ＣＤ１６を特異的に標的とできる。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を標的とするのが望ましい場合には、そのｓｃＦｖは、ＣＤ３、例えばＣＤ３εを特異的に標的とすることができる。Ｓ－Ｊ＊－Ｒ－Ｉを含む例示的な改変Ｊ鎖が示されており、このＳは、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４のＶＨ領域及びＶＬ領域を含むｓｃＦｖであり、Ｊ＊は、ヒトＪ鎖配列にＹ１０２Ａ変異を含むヒトＪ鎖バリアントであり、Ｉは、ヒトＩＬ－１５であり、Ｒは、ヒトＩＬ－１５受容体－αのスシドメインであり、各「－」は、リンカーを含む。ある特定の態様では、この構成の改変Ｊ鎖は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。他のＣＤ３ε抗原結合ドメインも使用でき、そのドメインとしては、限定されるものではないが、ビシリズマブ、ＯＫＴ３、または国際公開番号ＷＯ２０１８／２０８８６４に開示されているＣＤ３結合物質のＶＨ及びＶＬが挙げられる。
【0148】
改変Ｊ鎖に融合されたサイトカインまたはサイトカインバリアントを含む他のＩＳＡを提供し、当業者は、本開示に基づき、それらを容易に予期するであろう。
【0149】
抗原結合ドメイン
本発明で提供するような多量体型結合分子は、該当とする標的に特異的に結合する結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインと結合した重鎖定常領域を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または１２個含む。ある特定の態様では、その標的は、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官または標的ウイルスである。標的としては、限定されるものではないが、腫瘍抗原、その他の腫瘍標的、免疫チェックポイント阻害剤のようなイムノオンコロジーの標的、感染細胞の表面上に発現するウイルス抗原のような感染症抗原、血液脳関門での輸送に関与する標的抗原、神経変性疾患及び神経炎症性疾患に関与する標的抗原、ならびにこれらを任意に組み合わせたものを挙げることができる。例示的な標的、及びそのような標的に結合する結合ドメインは、本明細書の別の箇所に示されているとともに、例えば、米国特許出願公開第２０１９－０１００５９７号もしくは同第２０１９－０１８５５７０号、国際公開番号ＷＯ／２０１７／１９６８６７、ＷＯ２０１８／０１７８８８、ＷＯ２０１８／０１７８８９、ＷＯ２０１８／０１７７６１、ＷＯ２０１８／０１７７６３、ＷＯ２０１８／１８７７０２、ＷＯ２０１９／１６５３４０、ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１もしくはＷＯ２０２０／０８６７４５Ａ１、または米国特許第９，９５１，１３４号、同第９，９３８，３４７号、同第８，３７７，４３５号、同第９，４５８，２４１号、同第９，４０９，９７６号、同第１０，３５１，６３１号、同第１０，５７０，１９１号、同第１０，６０４，５５９号もしくは同第１０，６１８，９７８号に見ることができる。これらの出願及び／または特許のそれぞれは、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本発明で提供するような多量体型結合分子は、該当とする標的に特異的に結合する結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインと結合した重鎖定常領域を少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または１２個含む。ある特定の態様では、その標的は、標的エピトープ、標的抗原、標的細胞、標的器官または標的ウイルスである。標的としては、限定されるものではないが、腫瘍抗原、その他の腫瘍標的、免疫チェックポイント阻害剤のようなイムノオンコロジーの標的、感染細胞の表面上に発現するウイルス抗原のような感染症抗原、血液脳関門での輸送に関与する標的抗原、神経変性疾患及び神経炎症性疾患に関与する標的抗原、ならびにこれらを任意に組み合わせたものを挙げることができる。例示的な標的、及びそのような標的に結合する結合ドメインは、本明細書の別の箇所に示されているとともに、例えば、米国特許出願公開第２０１９－０１００５９７号もしくは同第２０１９－０１８５５７０号、国際公開番号ＷＯ／２０１７／１９６８６７、ＷＯ２０１８／０１７８８８、ＷＯ２０１８／０１７８８９、ＷＯ２０１８／０１７７６１、ＷＯ２０１８／０１７７６３、ＷＯ２０１８／１８７７０２、ＷＯ２０１９／１６５３４０、ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１もしくはＷＯ２０２０／０８６７４５Ａ１、または米国特許第９，９５１，１３４号、同第９，９３８，３４７号、同第８，３７７，４３５号、同第９，４５８，２４１号、同第９，４０９，９７６号、同第１０，３５１，６３１号、同第１０，５７０，１９１号、同第１０，６０４，５５９号もしくは同第１０，６１８，９７８号に見ることができる。これらの出願及び／または特許のそれぞれは、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0150】
ある特定の態様では、本発明で提供するような多量体型結合分子は、標的抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ含み、その標的抗原は、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはＴ細胞応答もしくはＮＫ細胞応答を調節する標的を含む。
【0151】
ある特定の態様では、その抗原結合ドメインは、Ｔ細胞応答またはＮＫ細胞応答を調節する標的に結合する。例えば、通常の活性状態におけるある特定の標的は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性を阻害することによって、腫瘍の成長を促進でき、これらの標的をアンタゴナイズする抗原結合ドメインは、ＣＤ８＋細胞またはＮＫ細胞の活性を促進できる。このような標的としては、限定されるものではないが、抑制性免疫チェックポイントタンパク質が挙げられる。ある特定の態様では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、プログラム細胞死－１タンパク質（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド－１タンパク質（ＰＤ－Ｌ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３タンパク質（ＴＩＭ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエータータンパク質（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサータンパク質（ＶＩＳＴＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体タンパク質（ＴＩＧＩＴ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体タンパク質（ＫＩＲ）、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、Ｂ７－Ｈ４タンパク質、またはこれらを任意に組み合わせたものを含み、本発明で提供する多量体型結合分子の抗原結合ドメインは、その標的をアンタゴナイズすることによって、免疫エフェクター細胞の活性を促進する。
【0152】
ある特定の態様では、その抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を含む。本開示では、現在、臨床または市場で利用可能な抗体（ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブまたはデュルバルマブなど）を含め、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合して、ＰＤ－Ｌ１を阻害するいずれの抗原結合ドメインも企図されている。ある特定の態様では、その抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１９／０３３８０３１号（参照により、本明細書に援用される）に開示されているヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｈ３Ｃ５の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。そのＶＨは、配列番号３３、配列番号９１、配列番号９２または配列番号９３のアミノ酸配列を含み、そのＶＬは、配列番号３４または配列番号９４のアミノ酸配列を含む。あるいは、そのＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許第８，２１７，１４９号に開示されているような、ファージライブラリー由来の抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０のＶＨ及びＶＬを含むことができ、その抗原結合ドメインは、配列番号７５のＶＨアミノ酸配列及び配列番号７６のＶＬアミノ酸配列を含む。あるいは、そのＰＤ－Ｌ１抗体は、置換を含まない、１個含む、もしくは２個含む、ＣＤＲを含むことができるか、または、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含むことができ、前記ＶＨ配列及びＶＬ配列が、それぞれ配列番号９６及び配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９、配列番号１００及び配列番号１０１、配列番号１０２及び配列番号１０３、配列番号１０４及び配列番号１０５、配列番号１０６及び配列番号１０７、配列番号１０８及び配列番号１０９、配列番号１１０及び配列番号１１１、配列番号１１２及び配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５、配列番号１１６及び配列番号１１７、配列番号１１８及び配列番号１１９、配列番号１２０及び配列番号１２１、配列番号１２２及び配列番号１２３、配列番号１２４及び配列番号１２５、配列番号１２６及び配列番号１２７、配列番号１２８及び配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１、配列番号１３２及び配列番号１３３、配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１５０及び配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３、配列番号１５４及び配列番号１５５、配列番号１５６及び配列番号１５７、配列番号１５８及び配列番号１５９、配列番号１６０及び配列番号１６１、配列番号１６２及び配列番号１６３、配列番号１６４及び配列番号１６５、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、配列番号１７２及び配列番号１７３、配列番号１７４及び配列番号１７５、配列番号１７６及び配列番号１７７、配列番号１７８及び配列番号１７９、配列番号１８０及び配列番号１８１、配列番号１８２及び配列番号１８３、配列番号１８４及び配列番号１８５、配列番号１８６及び配列番号１８７、配列番号１８８及び配列番号１８９、配列番号１９０及び配列番号１９１、配列番号１９２及び配列番号１９３、配列番号１９４及び配列番号１９５、配列番号１９６及び配列番号１９７、配列番号１９８及び配列番号１９９、配列番号２００及び配列番号２０１、配列番号２０２及び配列番号２０３、配列番号２０４及び配列番号２０５、配列番号２０６及び配列番号２０７、配列番号２０８及び配列番号２０９、配列番号２１０及び配列番号２１１、配列番号２１２及び配列番号２１３、配列番号２１４及び配列番号２１５、配列番号２１６及び配列番号２１７、配列番号２１８及び配列番号２１９、配列番号２２０及び配列番号２２１、または配列番号２２２及び配列番号２２３であるＶＨ配列及びＶＬ配列に対して８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、そのＰＤ－Ｌ１抗体は、置換を含まない、１個含む、もしくは２個含む、ＣＤＲを含むことができるか、または、ＶＨ配列及びＶＬ配列を含むことができ、前記ＶＨ配列及びＶＬ配列が、それぞれ配列番号１３４及び配列番号１３５、配列番号１３６及び配列番号１３７、配列番号１３８及び配列番号１３９、配列番号１４０及び配列番号１４１、配列番号１４２及び配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５、配列番号１４６及び配列番号１４７、配列番号１４８及び配列番号１４９、配列番号１６６及び配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、配列番号１７０及び配列番号１７１、または配列番号１８６及び配列番号１８７であるＶＨ配列及びＶＬ配列に対して８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【0153】
ある特定の態様では、その標的は、免疫エフェクター細胞の活性、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性を増強する標的であり、本発明で提供する多量体型結合分子の抗原結合ドメインは、その標的をアゴナイズすることによって、免疫エフェクター活性を刺激する。例えば、ある特定の態様では、標的は、免疫エフェクター細胞に作用するＴＮＦ受容体スーパーファミリー標的を含み、抗原結合ドメインは、その標的をアゴナイズできる。このカテゴリーにおける例示的なＴＮＦｒＳＦ標的としては、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）及びＯＸ４０が挙げられる。これらの標的の両方の発現は、本発明で提供するある特定のＩＳＡによってアップレギュレートされる。例えば、図６を参照されたい。
【0154】
ＧＩＴＲは、Ｔ細胞及び他の免疫細胞の表面上に発現する活性化受容体である。腫瘍抗原への暴露により、Ｔ細胞が活性化すると、その表面上のＧＩＴＲ受容体の数が増加する。ＧＩＴＲは、活性化Ｔ細胞上で共刺激受容体として作用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増強する。また、ＧＩＴＲを介したシグナル伝達により、制御性Ｔ細胞が阻害される。ＧＩＴＲを標的とする多量体型アゴニスト抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３３０３６０Ａ１号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７０８３（参照により、それらの全体は、本明細書に援用される）に開示されている。ある特定の態様では、そのＧＩＴＲ抗原結合ドメインは、いずれの抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体であることもでき、限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１９／０３３０３６０Ａ１号に列挙されているものが挙げられる。ある特定の態様では、その抗ＧＩＴＲ抗原結合ドメインは重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号３５及び配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２、または配列番号４３及び配列番号４４であるアミノ酸配列を含む。
【0155】
ＯＸ４０は、活性化細胞傷害性Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の表面上に発現する活性化受容体である。ＯＸ４０を介したシグナル伝達は、免疫応答において、二重の役割を果たし、Ｔ細胞応答の活性化及び増幅の両方を行う。細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍細胞を認識して、その細胞を攻撃することができる。ＯＸ４０は、細胞傷害性Ｔ細胞上で、そのリガンド（ＯＸ４０Ｌ）に結合し、その結果、Ｔ細胞の産生、機能及び生存を促進する刺激シグナルが生成される。Ｔｒｅｇは、免疫応答を制限するように作用する。ＯＸ４０－ＯＸ４０Ｌシグナル伝達は、ＴｒｅｇがＴ細胞を抑制する能力をブロックするとともに、Ｔｒｅｇの生成を減少させる。ＯＸ４０は、Ｔｒｅｇの免疫抑制作用を阻害し、Ｔｒｅｇの集団を制限することによって、Ｔ細胞活性化の効果をさらに増幅する。ＯＸ４０を標的とする多量体型アゴニスト抗体は、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０３３０３７４号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。ある特定の態様では、そのＯＸ４０抗原結合ドメインは、いずれの抗ＯＸ４０アゴニスト抗体であることもでき、以下に限定されるわけではないが、米国特許出願公開第２０１９／０３３０３７４号に列挙されているものが挙げられる。ある特定の態様では、その抗原結合ドメインは重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４５及び配列番号４６または配列番号４７及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む。
【0156】
ある特定の態様では、その標的は、腫瘍特異的抗原、すなわち、概ねまたは主に、腫瘍もしくはがん細胞のみに発現するか、または成人の正常な健常細胞において、低いレベルもしくは検出不能なレベルのみで発現することがある標的抗原である。ある特定の態様では、その標的は、腫瘍関連抗原、すなわち、健常細胞上及びがん細胞上の両方で発現するが、正常な健常細胞上よりも、がん細胞上の方で、高密度で発現する標的抗原である。例示的な腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原としては、限定されるものではないが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２ともいう）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥｒｂＢ４、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体－１（ＶＥＧＦＲ１）、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ガングリオシドＧＤ２、シグナル伝達リンパ球活性化分子ファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）の自己リガンド受容体、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソセリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）またはＣＤ３３が挙げられる。これらの標的抗原は、文献において、いくつかの異なる名称で記載されているが、これらの周知の治療標的は、オンライン、例えばＥＸＰＡＳＹ．ｏｒｇ．で入手可能なデータベースを用いて容易に特定できることを当業者は理解するであろう。
【0157】
他の腫瘍関連抗原及び／または腫瘍特異的抗原としては、限定されるものではないが、ＤＬＬ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ｃ－Ｍｅｔ、ＩＧＦ－１Ｒ、Ｐａｔｃｈｅｄ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーポリペプチド、ＷＮＴファミリーポリペプチド、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＩＬ－２３、ＩＬ－１７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３、ＣＥＡ、Ｍｕｃ１６、ＰＳＣＡ、ＣＤ４４、ｃ－Ｋｉｔ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、ＢＭＰファミリーポリペプチド、ＢＭＰＲ１ａ、ＢＭＰＲ１ｂ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリータンパク質（ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ１／２など）、ＣＤ４０（ｐ５０）、Ｆａｓ（ＣＤ９５、Ａｐｏ１、ＤＲ２）、ＣＤ３０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４、Ａｐｏ２）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）、ＯＰＧ（ＯＣＩＦ）、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４）、ＬＩＧＨＴＲ（ＨＶＥＭ）、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＥＤＡＲまたはＸＥＤＡＲが挙げられる。
【0158】
その標的抗原が、腫瘍関連抗原を含む、請求項３９に記載の多量体型結合分子。
【0159】
その腫瘍関連抗原が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ５２、ＣＤ３０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ３８、ＧＤ２、ＳＬＡＭＦ７、血小板由来成長因子受容体Ａ（ＰＤＧＦＲＡ）、ＣＤ２２、ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）、ＣＤ１２３、ＭＵＣ－１６、がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ－１）、メソセリン、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２（Ｔｒｏｐ－２）、グリピカン－３（ＧＰＣ－３）、ヒト血液型Ｈタイプ１三糖（Ｇｌｏｂｏ－Ｈ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）、ＣＤ３３、またはこれらを任意に組み合わせたものを含む、請求項５１に記載の多量体型結合分子。
【0160】
ある特定の態様では、その標的抗原は、ＣＤ２０を含む。いずれのＣＤ２０抗原結合ドメインを使用することもできる。例示的な抗原結合ドメインは重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域を含み、ＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号４９及び配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
【0161】
ある特定の態様では、その結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個が、同じ標的抗原に特異的に結合する。ある特定の態様では、その少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または１０個の抗原結合ドメインは、同じである。
【0162】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示は、本発明で提供するような多量体型結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド及び／または非天然ポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、結合分子、結合ユニット、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、または抗原結合ドメインの部分のうち、独立して翻訳できる部分を意味する。例としては、限定されるものではないが、抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨもしくはＶＬ）、本発明で提供するような改変Ｊ鎖を含むＪ鎖、分泌成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／またはそれらの断片、バリアントもしくは誘導体のいずれかが挙げられる。
本開示は、本発明で提供するような多量体型結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離ポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド及び／または非天然ポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、結合分子、結合ユニット、ＩｇＭ抗体、ＩｇＭ様抗体、ＩｇＡ抗体もしくはＩｇＡ様抗体、または抗原結合ドメインの部分のうち、独立して翻訳できる部分を意味する。例としては、限定されるものではないが、抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨもしくはＶＬ）、本発明で提供するような改変Ｊ鎖を含むＪ鎖、分泌成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／またはそれらの断片、バリアントもしくは誘導体のいずれかが挙げられる。
【0163】
ある特定の態様では、本開示は、本発明で提供するいずれかの多量体型結合分子のサブユニットポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを提供し、そのサブユニットポリペプチドは、（ａ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と結合した、ＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域、もしくはその多量体化型バリアントもしくは多量体化型断片を含む、ＩｇＡ重鎖もしくはＩｇＭ重鎖、（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合した抗体軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖、または（ｃ）（ｉ）Ｊ鎖、もしくはその機能的断片もしくは機能的バリアント（「Ｊ」）、（ｉｉ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質、もしくはその受容体結合断片もしくは受容体結合バリアント（「Ｉ」）、（ｉｉｉ）スシドメインを含むインターロイキン－１５受容体－α（ＩＬ－１５Ｒα）断片、もしくはＩと結合できるそのバリアント（「Ｒ」）、もしくは（ｉｖ）インターロイキン－２ｖタンパク質（ＩＬ－２ｖ）、のうちの２つ以上を含む改変Ｊ鎖であって、そのＪと、Ｉ、ＲもしくはＩＬ－２ｖのうちの少なくとも１つが、融合タンパク質として結合しており、ＩとＲが結合して免疫刺激複合体として機能できる、改変Ｊ鎖、または（ｄ）これらを任意に組み合わせたものを含む。
【0164】
ある特定の態様では、そのポリペプチドサブユニットは、ＩｇＭ重鎖定常領域もしくはＩｇＭ様重鎖定常領域またはその多量体化型断片、あるいはＩｇＡ重鎖定常領域もしくはＩｇＡ様重鎖定常領域またはその多量体化型断片を含むことができ、この領域または断片は、いずれも本発明に示されているように、抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、抗原結合ドメインのＶＨ部分に融合できる。ある特定の態様では、そのポリヌクレオチドは、ヒトＩｇＭ重鎖定常領域、ヒトＩｇＭ様重鎖定常領域、ヒトＩｇＡ重鎖定常領域、ヒトＩｇＡ様重鎖定常領域、またはそれらの多量体化型断片、例えば、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４を含むポリペプチドサブユニットをコードでき、このサブユニットのいずれも、抗原結合ドメインまたはそのサブユニット、例えば、ＶＨのＣ末端に融合できる。
【0165】
ある特定の態様では、そのポリペプチドサブユニットは、本明細書の別の箇所に記載されているように、抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分を含むことができる。ある特定の態様では、そのポリペプチドサブユニットは、ＶＬのＣ末端に融合できる、抗体の軽鎖定常領域、例えば、ヒト抗体の軽鎖定常領域、またはその断片を含むことができる。
【0166】
ある特定の態様では、そのポリペプチドサブユニットは、本発明で提供するような、Ｊ鎖、改変Ｊ鎖、またはその任意の機能的断片もしくは機能的バリアントを含むことができる。ある特定の態様では、そのポリペプチドサブユニットは、ヒトＪ鎖またはその機能的断片もしくは機能的バリアント（いずれかの改変Ｊ鎖を含む）を含むことができる。ある特定の態様では、そのＪ鎖は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号３２のアミノ酸配列を含むことができる。
【0167】
ある特定の態様では、本発明で提供するようなポリヌクレオチド、例えば、プラスミドのような発現ベクターは、ポリペプチドサブユニットを１つ、例えば、ＩｇＭ重鎖もしくはＩｇＭ様重鎖、軽鎖またはＪ鎖をコードする核酸配列を含むこともできるし、あるいは本発明で提供するようなＩｇＭ抗体またはＩｇＭ様抗体のポリペプチドサブユニットの２つ以上または３つすべてをコードする核酸配列を２つ以上含むこともできる。あるいは、その３つのポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列は、別々のポリヌクレオチド、例えば別々の発現ベクター上に存在できる。本開示は、このような１つまたは複数の発現ベクターを提供する。本開示は、提供するポリヌクレオチド（複数可）または発現ベクター（複数可）をコードする１つ以上の宿主細胞も提供する。
【0168】
本開示は、ポリヌクレオチドを２つ以上含む組成物をさらに提供し、その２つ以上のポリヌクレオチドは連動して、本発明で提供するような多量体型結合分子をコードできる。
【0169】
本開示は、本発明で提供するような多量体型結合分子、またはその任意のサブユニットをコードする１つのポリヌクレオチドまたは２つ以上のポリヌクレオチド、あるいは本発明で提供するようなＩｇＭ抗体もしくはＩｇＭ様抗体、またはその任意のサブユニットを連動してコードする、本発明で提供するようなポリヌクレオチド組成物、または１つのベクター、２つ、３つもしくは４つ以上のベクターを含む宿主細胞、例えば、原核宿主細胞または真核宿主細胞をさらに提供する。
【0170】
関連する態様では、本開示は、本開示によって提供するような多量体型結合分子を作製する方法を提供し、当該方法は、本発明で提供するような宿主細胞を培養することと、その多量体型結合分子を回収することを含む。
【0171】
使用方法
本開示は、治療の必要な対象における疾患または障害の治療方法をさらに提供し、当該方法は、その対象に、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を治療有効量投与することを含む。「治療上有効な投与量もしくは量」または「有効量」とは、多量体型結合分子の量であって、投与したときに、対象の治療に関連して、免疫療法に対する良好な応答をもたらす、量が意図されている。
本開示は、治療の必要な対象における疾患または障害の治療方法をさらに提供し、当該方法は、その対象に、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を治療有効量投与することを含む。「治療上有効な投与量もしくは量」または「有効量」とは、多量体型結合分子の量であって、投与したときに、対象の治療に関連して、免疫療法に対する良好な応答をもたらす、量が意図されている。
【0172】
がんを治療するための組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、対象の生理的状態、その対象が、ヒトであるか、または動物であるか、他の投与薬、及び治療が予防的なものであるか、または治療的なものであるかを含め、多くの異なる要因に応じて変動する。通常、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含め、ヒト以外の哺乳動物も治療できる。当業者に知られている常法を用いて、治療投与量を漸増・漸減して、安全性及び有効性を最適化できる。
【0173】
治療する対象は、治療の必要ないずれの動物、例えば哺乳動物であることもでき、ある特定の態様では、その対象は、ヒト対象である。
【0174】
最も簡潔な形態では、対象に投与する調製物は、従来の剤形で投与される、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子、またはその多量体型抗原結合断片であり、本明細書の他の箇所に記載されているような医薬品賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせることができる。
【0175】
本開示の組成物は、いずれかの好適な方法によって投与でき、例えば、非経口投与、脳室内投与、経口投与、吸入噴霧による投与、局所投与、直腸内投与、経鼻投与、口腔内投与、膣投与または移植リザーバーによる投与を行うことができる。本明細書で使用する場合、「非経口」という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内及び頭蓋内への注射技法または注入技法が含まれる。
【0176】
医薬組成物及び投与方法
本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を調製し、かつ及びその結合分子をその必要がある対象に投与する方法は、当業者に周知であり、当業者は、本開示に鑑みれば、決定するのは容易である。投与経路は、例えば、腫瘍内経路、経口経路、非経口経路、吸入による経路または局所経路であることができる。本明細書で使用する場合、非経口という用語には、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与または膣投与が含まれる。これらの投与形態が、好適な形態として企図されているが、投与形態の別の例は、注射用溶液、特に、腫瘍内、静脈内または動脈内への注射または点滴用の溶液であろう。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意に、安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。
本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を調製し、かつ及びその結合分子をその必要がある対象に投与する方法は、当業者に周知であり、当業者は、本開示に鑑みれば、決定するのは容易である。投与経路は、例えば、腫瘍内経路、経口経路、非経口経路、吸入による経路または局所経路であることができる。本明細書で使用する場合、非経口という用語には、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与または膣投与が含まれる。これらの投与形態が、好適な形態として企図されているが、投与形態の別の例は、注射用溶液、特に、腫瘍内、静脈内または動脈内への注射または点滴用の溶液であろう。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意に、安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。
【0177】
本明細書で論じられているように、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子は、その必要がある対象の治療のために、薬学的に有効な量で投与できる。この点では、ＩＳＡを含む、開示されている多量体型結合分子は、その活性剤の投与を容易にするとともに、その活性剤の安定性を促すように調合できることは明らかであろう。したがって、医薬組成物は、薬学的に許容される無毒な無菌の担体（生理食塩水など）、無毒性の緩衝剤、保存剤などを含むことができる。本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子の薬学的に有効な量とは、標的への有効な結合をもたらして、治療効果を得るのに十分な量を意味する。好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、例えば２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（２００５）に記載されている。
【0178】
本明細書で提供するある特定の医薬組成物は、許容される剤形で経口投与することができ、このような剤形としては、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤が挙げられる。ある特定の医薬組成物は、点鼻エアゾールまたは経鼻吸入によって投与することもできる。このような組成物は、生理食塩水中の溶液として、ベンジルアルコールもしくはその他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、及び／またはその他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて調製できる。
【0179】
ＩＳＡを含む多量体型結合分子の量であって、担体材料と組み合わせて、単一剤形を作製できる、量は、例えば、治療する対象及び特定の投与方法に応じて変動することになる。その組成物は、１回投与、複数回投与、または一定の期間にわたる注入を行うことができる。投与レジメンも、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）が得られるように調節できる。
【0180】
本開示の範囲に合わせて、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を、治療の必要な対象に、治療効果を得るのに十分な量で投与できる。本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子は、その対象に、本開示の抗体、またはその多量体型抗原結合断片、多量体型抗原結合バリアントもしくは多量体型抗原結合誘導体と、薬学的に許容される従来の担体または希釈剤とを既知の技法に従って組み合わせることによって調製した従来の剤形で投与できる。その薬学的に許容される担体または希釈剤の形態及び特徴は、組み合わせる活性成分の量、投与経路及びその他の周知の変動要因によって決定され得る。
【0181】
本開示は、がんを治療、予防または管理するための医薬の製造に、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子を使用することも提供する。本開示は、がんを治療、予防または管理するための用途用に、本発明で提供するようなＩＳＡを含む多量体型結合分子も提供する。
【0182】
本開示では、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法が使用され、これらの技法は、当該技術分野の技術の範囲内である。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）、Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４、Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９９０）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１６）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、Ｗｏｏｄｗａｒｄ，Ｊ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８５）、Ｐｅｒｂａｌ（１９８８）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｓ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５１－１５５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
【0183】
抗体工学の一般原理は、例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ（２０１２），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）に記載されている。タンパク質工学の一般原理は、例えば、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，ｅｄｓ．（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ（ＣＤＣ Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。免疫学の一般原理は、例えば、Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に記載されている。さらに、当該技術分野で知られている免疫学の標準的な方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｏｎｌｉｎｅ Ｌｉｂｒａｒｙ）、Ｗｉｌｄ，Ｄ．（２０１３），Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）及びＯｓｓｉｐｏｗ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｄｓ．，（２０１４），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）で追うことができる。
【0184】
上記で引用されているすべての参照文献、及び本明細書で引用されるすべての参照文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0185】
下記の実施例は、例示として示されており、限定するものではない。
【実施例】
【0186】
実施例１：ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒαスシドメインを発現する改変Ｊ鎖を有する、ＩｇＭベースの免疫刺激物質（ＩＳＡ）の構築及び特性評価
ＩｇＭベースの免疫刺激物質（ＩＳＡ）を作製するために、融合タンパク質として、成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号４）、及びヒトＩＬ－１５Ｒα（配列番号５）のスシドメインを発現する改変Ｊ鎖を以下のように構築し、特性評価を行った。その改変Ｊ鎖の出発点は、１０２位に、ＹからＡへのアミノ酸置換を含む成熟ヒトＪ鎖バリアント（「Ｙ１０２Ａ」または「Ｊ＊」。このバリアントのアミノ酸配列は、配列番号３として示されている）であった。この置換は、このＪ鎖バリアントを含むＩｇＭ五量体の血清中半減期を長くするものである。国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１を参照されたい。まず、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合ドメインを含むＩｇＭ抗体と、Ｊ＊、成熟ＩＬ－１５（「Ｉ」）及びＩＬ－１５Ｒαスシドメイン（「Ｒ」）という３つのすべてのドメインを様々な配向で含む各種融合タンパク質とをアセンブルした。評価する改変Ｊ鎖には、Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）、Ｊ＊ＩＲ（配列番号２０）、ＩＲＪ＊（配列番号２１）、ＲＩＪ＊（配列番号２２）、ＲＪ＊Ｉ（配列番号２３）及びＩＪ＊Ｒ（配列番号２４）を含めた。図１を参照されたい。加えて、Ｊ＊Ｉ（配列番号２６）またはＩＪ＊（配列番号２５）のみ、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合したヒトＪ鎖（配列番号８４。米国特許第１０，６１８，９７８号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているような「Ｊ１５ＨＳＡ」）を含む融合タンパク質を構築した。米国特許出願公開第２０１９／０３３８０３１号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているように、ヒト化抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ｈ３Ｃ５のＶＨアミノ酸配列（配列番号３３）を含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭ重鎖、及びｈ３Ｃ５のＶＬアミノ酸配列（配列番号３４）を含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭ軽鎖をコードするＤＮＡコンストラクトとともに、これらのＪ鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトを発現させた。これらの抗体が、五量体として適切にアセンブルされたかを評価した。
ＩｇＭベースの免疫刺激物質（ＩＳＡ）を作製するために、融合タンパク質として、成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号４）、及びヒトＩＬ－１５Ｒα（配列番号５）のスシドメインを発現する改変Ｊ鎖を以下のように構築し、特性評価を行った。その改変Ｊ鎖の出発点は、１０２位に、ＹからＡへのアミノ酸置換を含む成熟ヒトＪ鎖バリアント（「Ｙ１０２Ａ」または「Ｊ＊」。このバリアントのアミノ酸配列は、配列番号３として示されている）であった。この置換は、このＪ鎖バリアントを含むＩｇＭ五量体の血清中半減期を長くするものである。国際公開番号ＷＯ２０１９／１６９３１４Ａ１を参照されたい。まず、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合ドメインを含むＩｇＭ抗体と、Ｊ＊、成熟ＩＬ－１５（「Ｉ」）及びＩＬ－１５Ｒαスシドメイン（「Ｒ」）という３つのすべてのドメインを様々な配向で含む各種融合タンパク質とをアセンブルした。評価する改変Ｊ鎖には、Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）、Ｊ＊ＩＲ（配列番号２０）、ＩＲＪ＊（配列番号２１）、ＲＩＪ＊（配列番号２２）、ＲＪ＊Ｉ（配列番号２３）及びＩＪ＊Ｒ（配列番号２４）を含めた。図１を参照されたい。加えて、Ｊ＊Ｉ（配列番号２６）またはＩＪ＊（配列番号２５）のみ、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に融合したヒトＪ鎖（配列番号８４。米国特許第１０，６１８，９７８号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているような「Ｊ１５ＨＳＡ」）を含む融合タンパク質を構築した。米国特許出願公開第２０１９／０３３８０３１号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているように、ヒト化抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ｈ３Ｃ５のＶＨアミノ酸配列（配列番号３３）を含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭ重鎖、及びｈ３Ｃ５のＶＬアミノ酸配列（配列番号３４）を含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭ軽鎖をコードするＤＮＡコンストラクトとともに、これらのＪ鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトを発現させた。これらの抗体が、五量体として適切にアセンブルされたかを評価した。
【0187】
米国特許出願公開第２０１９／０３３８０３１号に記載されているようにして、上記の改変Ｊ鎖を有するＩｇＭ五量体、及び対応するＩｇＧ抗体を構築し、発現させた。
【0188】
ＩｇＭ五量体としての、様々な配向の改変Ｊ鎖の概略図が図１に示されている。Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）において、優れた発現が見られ、ＩｇＭとしてアセンブルされたので、さらなる特性評価用には、Ｊ＊ＲＩを選択した。米国特許第１０，４０７，５０２号に記載されているように、その抗体のＣ末端に融合されたヒトＩＬ－１５Ｒαスシドメイン及びヒトＩＬ－１５を含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体である「ＫＤ－ＲＩ」（重鎖融合タンパク質は、配列番号２９として示されており、軽鎖は、配列番号３０として示されている）と、上記のコンストラクトとを比較した。
【0189】
このＩｇＭコンストラクト及びＩｇＧコンストラクトは、ＥＬＩＳＡによって、表２に示されている結合親和性で、ＰＤ－Ｌ１に結合することが示された。
【0190】
（表２）ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性
【0191】
上記の代わりに、ＩｇＭ重鎖及びＩｇＭ軽鎖がそれぞれ、米国特許第８，２１７，１４９号に開示されている抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（本明細書では、ＶＨは配列番号７５、ＶＬは配列番号７６として示されている）を含む抗ＰＤ－Ｌ１ヒトＩｇＭ五量体として、改変Ｊ鎖Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）をアセンブルした。改変Ｊ鎖Ｊ＊ＲＩを用いて、抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ抗体＃２３（配列番号３９を含むＶＨ、及び配列番号４０を含むＶＬ）、抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ抗体＃１４（配列番号４１を含むＶＨ、及び配列番号４２を含むＶＬ）、抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ抗体＃１２（配列番号４３を含むＶＨ、及び配列番号４４を含むＶＬ）、抗ＣＤ２０ ＩｇＭ抗体１５３（配列番号４９を含むＶＨ、及び配列番号５０を含むＶＬ）を含む追加のＩｇＭ五量体もアセンブルした。最後に、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５受容体αスシドメインがヒト血清アルブミンに融合されているＪ鎖不含のコンストラクト（配列番号２７の「ＨＲＩ」、及び配列番号２８の「ＩＲＨ」）を発現させた。
【0192】
実施例２：ＩｇＭベースのＩＳＡのＫｉ－６７ インビトロ効力アッセイ
実施例１で調製した各種のＩｇＭ Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトのインビトロでの効力をＫｉ－６７増殖アッセイで、以下のようにして評価した。このアッセイでは、ＩＬ－１５に応答した初代細胞（ｈｕＰＢＭＣ、ヒト末梢血単核球）の増殖を測定する。ＩＬ－１５が、その受容体に結合すると、細胞の増殖に至り、その増殖は、いくつかの技法によって可視化でき、その１つは、細胞周期関連タンパク質アッセイである。最も広く用いられている細胞周期関連タンパク質は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期及びＭ期でのみ発現するＫｉ－６７である。細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞及びナチュラルキラーＮＫ細胞（ＩＬ－１５受容体のβ及びγサブユニットを生理的に発現する細胞）の核内のＫｉ－６７タンパク質レベルをフローサイトメトリーによって求めるのが、実際の細胞増殖に対する代替的なアッセイである。そのアッセイの概略が図２に示されている。
実施例１で調製した各種のＩｇＭ Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡコンストラクトのインビトロでの効力をＫｉ－６７増殖アッセイで、以下のようにして評価した。このアッセイでは、ＩＬ－１５に応答した初代細胞（ｈｕＰＢＭＣ、ヒト末梢血単核球）の増殖を測定する。ＩＬ－１５が、その受容体に結合すると、細胞の増殖に至り、その増殖は、いくつかの技法によって可視化でき、その１つは、細胞周期関連タンパク質アッセイである。最も広く用いられている細胞周期関連タンパク質は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期及びＭ期でのみ発現するＫｉ－６７である。細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞及びナチュラルキラーＮＫ細胞（ＩＬ－１５受容体のβ及びγサブユニットを生理的に発現する細胞）の核内のＫｉ－６７タンパク質レベルをフローサイトメトリーによって求めるのが、実際の細胞増殖に対する代替的なアッセイである。そのアッセイの概略が図２に示されている。
【0193】
簡潔に述べると、漸増用量の試験化合物の存在下で、健常なドナーＰＢＭＣを３～５日間インキュベートしてから、Ｔ細胞マーカー及びＮＫ細胞マーカーに対して表面を染色し、Ｋｉ－６７に対して細胞内を染色した。染織した細胞について、フローサイトメーターでデータを取得し、そのフローデータ解析では、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のＫｉ－６７含有量に着目する。その化合物濃度に対する、Ｋｉ－６７陽性のＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞のパーセンテージをグラフ化することによって、ＥＣ５０を求める。
【0194】
プロトコール
ｈｕＰＢＭＣを解凍、計数し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、Ｕ底マイクロタイタープレート（カタログ番号３５１１７７、Ｆａｌｃｏｎ）に、細胞懸濁液を１ウェルあたり１８０μＬ加えた。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０において、実施例１に記載されているようにして作製したＩＳＡ、またはコントロールの用量漸増（１：３の希釈系列）を行い、ｈｕＰＢＭＣを含むウェルに、適切な希釈液２０μＬを加えた。細胞を３～５日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
ｈｕＰＢＭＣを解凍、計数し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、Ｕ底マイクロタイタープレート（カタログ番号３５１１７７、Ｆａｌｃｏｎ）に、細胞懸濁液を１ウェルあたり１８０μＬ加えた。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０において、実施例１に記載されているようにして作製したＩＳＡ、またはコントロールの用量漸増（１：３の希釈系列）を行い、ｈｕＰＢＭＣを含むウェルに、適切な希釈液２０μＬを加えた。細胞を３～５日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
【0195】
続いて、細胞／ＩＳＡ混合物をＶ底プレート（カタログ番号８２．１５８３．００１、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移し、抗ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００４３０）、抗ＣＤ４－Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ－４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００５３２）、抗ＣＤ８ａ ＡＰＣ－Ｆｉｒｅ ７５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３４４７４６）及び抗ＮＫｐ４６ ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３３１９１６）という抗体を含むＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５６）において、表面を３０分、室温で染色した。その細胞を２回洗浄し、固定し、Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（カタログ番号００－５５２３－００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｋｉ６７（抗Ｋｉ－６７ ＡＰＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３５０５１４）及びＦｏｘＰ３（抗ＦｏｘＰ３ ＰＥ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３２０１０８）に対して、細胞内を染色した。最後に、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ－ＤｘＰ８（ＢＤ／Ｃｙｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得した。
【0196】
ＦＡＣＳデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ．）で、以下のようにして解析した。ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－／ＮＫｐ４６＋）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋）のサブセットに、ゲーティングを行い、各集団におけるＫｉ６７陽性細胞のパーセンテージを抗体濃度に対してグラフ化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）で、可変勾配による非線形フィット（４パラメーター）を用いて、生物学的活性のＥＣ５０を計算した。
【0197】
漸増濃度のｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ、ＨＲＩ、ＫＤ－ＲＩ及び１５３ＩｇＭ Ｊ＊ＲＩに応答して、ＣＤ８ Ｔ細胞が増殖したことを示す例示的な結果が、図３及び表３に示されている。ＮＫ細胞の増殖についても、同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【0198】
（表３）ＩＬ－Ａ１５ ＩＳＡに応答したＣＤ８＋の増殖
【0199】
別のアッセイでは、漸増濃度のｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩに応答したＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびに制御性ＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を比較した。図４に示されているように、３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が誘導されたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞の増殖は誘導されなかった。
【0200】
実施例３：受容体結合性が低下されたＩＬ－１５バリアントを含むＩＳＡの評価
ある特定の態様では、例えば、治療用ＩＳＡの毒性副作用の可能性を制御するために、ＩＬ－１５β／γ受容体への結合を低下させることによって、ＩＬ－１５ ＩＳＡの効力を改変するのが望ましい。他の者が以前に、成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号４）において、受容体結合性を低下させる能力のある残基として、９個の残基を特定した。国際公開番号ＷＯ２０１８／０７１９１８Ａ１を参照されたい。この残基には、ＩＬ－１５におけるＮ１Ｄ（配列番号５７）、Ｎ４Ｄ（配列番号５８）、Ｄ８Ｎ（配列番号５９）、Ｄ３０Ｎ（配列番号６０）、Ｄ６１Ｎ（配列番号６１）、Ｅ６４Ｑ（配列番号６２）、Ｎ６５Ｄ（配列番号６３）、Ｎ７２Ｄ（配列番号６４）及びＱ１０８Ｅ（配列番号６５）が含まれる。これらの変異ＩＬ－１５配列を、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６６）及びＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６７）という二重の変異、ならびにＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６８）という三重の変異とともに、改変Ｊ鎖に、Ｊ＊ＲＩという構成で導入して、配列番号７～１８の配列をそれぞれ有する融合タンパク質を得た。９つのすべての変異を有するＩＬ－１５配列を含む改変Ｊ鎖（配列番号７７）も構築した。
ある特定の態様では、例えば、治療用ＩＳＡの毒性副作用の可能性を制御するために、ＩＬ－１５β／γ受容体への結合を低下させることによって、ＩＬ－１５ ＩＳＡの効力を改変するのが望ましい。他の者が以前に、成熟ヒトＩＬ－１５（配列番号４）において、受容体結合性を低下させる能力のある残基として、９個の残基を特定した。国際公開番号ＷＯ２０１８／０７１９１８Ａ１を参照されたい。この残基には、ＩＬ－１５におけるＮ１Ｄ（配列番号５７）、Ｎ４Ｄ（配列番号５８）、Ｄ８Ｎ（配列番号５９）、Ｄ３０Ｎ（配列番号６０）、Ｄ６１Ｎ（配列番号６１）、Ｅ６４Ｑ（配列番号６２）、Ｎ６５Ｄ（配列番号６３）、Ｎ７２Ｄ（配列番号６４）及びＱ１０８Ｅ（配列番号６５）が含まれる。これらの変異ＩＬ－１５配列を、Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６６）及びＮ１Ｄ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６７）という二重の変異、ならびにＤ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ（配列番号６８）という三重の変異とともに、改変Ｊ鎖に、Ｊ＊ＲＩという構成で導入して、配列番号７～１８の配列をそれぞれ有する融合タンパク質を得た。９つのすべての変異を有するＩＬ－１５配列を含む改変Ｊ鎖（配列番号７７）も構築した。
【0201】
単一のＩＬ－１５変異を有する各種のＩＳＡコンストラクトが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力が図５Ａに、ＮＫ細胞の増殖を誘導する能力が図５Ｂに示されており、二重または三重のＩＬ－１５変異を有するＩＳＡコンストラクトが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力が図５Ｃに、ＮＫ細胞の増殖を誘導する能力が図５Ｄに示されている。各種のＩＬ－１５変異を１つ有するＩＳＡでは、受容体活性化の様々な程度の低下が見られた。９つすべての変異を有するコンストラクトは、活性を有さなかった（データは示されていない）。Ｊ＊ＲＩ Ｎ４Ｄ／Ｎ６５Ｄという二重変異体では、ＷＴ ＩＬ－１５を有するコンストラクトと比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖については５０分の１、ＮＫ細胞の増殖については１００分の１への効力低下が見られたのに対して、Ｎ１Ｄ／Ｎ６５Ｄという二重変異体及び三重変異体は、いずれの種類の細胞でも増殖を誘導しなかった。
【0202】
実施例４：ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩは、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞上のＧＩＴＲ及びＯＸ－４０をアップレギュレートする
ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩをＩＳＡとして用いて、ｈｕＰＢＭＣを、示されている５ｎＭの各ＩＳＡとともに５～６日インキュベートした以外は、実施例２に記載されている方法に従って、Ｋｉ－６７増殖アッセイを行い、ＣＤ８ゲーティングを行ったＴ細胞上でのＧＩＴＲ、ＯＸ－４０及びＫｉ－６７の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図６に示されているように、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＩｇＭベースのＩＳＡは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０の発現を、ＨＲＩ、１５３ＩｇＭ Ｊ＊ＲＩ、ＫＤ－ＲＩまたはｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＿ＪＨ（ＩＬ－１５を含まない）よりも大きくアップレギュレートさせた。
ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩをＩＳＡとして用いて、ｈｕＰＢＭＣを、示されている５ｎＭの各ＩＳＡとともに５～６日インキュベートした以外は、実施例２に記載されている方法に従って、Ｋｉ－６７増殖アッセイを行い、ＣＤ８ゲーティングを行ったＴ細胞上でのＧＩＴＲ、ＯＸ－４０及びＫｉ－６７の発現をフローサイトメトリーによって分析した。図６に示されているように、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＩｇＭベースのＩＳＡは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０の発現を、ＨＲＩ、１５３ＩｇＭ Ｊ＊ＲＩ、ＫＤ－ＲＩまたはｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＿ＪＨ（ＩＬ－１５を含まない）よりも大きくアップレギュレートさせた。
【0203】
実施例５：抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡは、Ｋｉ－６７ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、インビトロでの効力を示す
実施例１に記載されているようにして調製した３つの抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡ化合物において、Ｋｉ－６７アッセイで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を試験した。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃２３のＶＨ配列は、配列番号３９として、ＶＬ配列は、配列番号４０として示されている。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１４はそれぞれ、配列番号４１及び配列番号４２として示されている。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１２はそれぞれ、配列番号４３及び配列番号４４として示されている。モノクローナル抗体番号は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７０８３（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているＧＩＴＲ結合物質に対応する。実施例２に記載されているようなヒトＰＢＭＣに対して、Ｋｉ－６７アッセイを行った。結果は、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩと比較したものが、図７に示されている。それらの３つの抗ＧＩＴＲコンストラクトではそれぞれ、抗ＰＤ－Ｌ１コンストラクトの約５～１０分の１のレベルで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する効力が見られた。
実施例１に記載されているようにして調製した３つの抗ＧＩＴＲ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩ ＩＳＡ化合物において、Ｋｉ－６７アッセイで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を試験した。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃２３のＶＨ配列は、配列番号３９として、ＶＬ配列は、配列番号４０として示されている。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１４はそれぞれ、配列番号４１及び配列番号４２として示されている。ＧＩＴＲ ＩｇＭ＿Ｊ＊ＲＩモノクローナル抗体＃１２はそれぞれ、配列番号４３及び配列番号４４として示されている。モノクローナル抗体番号は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０１７０８３（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているＧＩＴＲ結合物質に対応する。実施例２に記載されているようなヒトＰＢＭＣに対して、Ｋｉ－６７アッセイを行った。結果は、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩと比較したものが、図７に示されている。それらの３つの抗ＧＩＴＲコンストラクトではそれぞれ、抗ＰＤ－Ｌ１コンストラクトの約５～１０分の１のレベルで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導する効力が見られた。
【0204】
実施例６：ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊ＲＩは、Ｋｉ－６７ ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、効力が上昇した
次に、本発明者らは、ＩｇＭベースのＩＳＡのＪ＊ＲＩエレメント上に、Ｔ細胞を標的とする抗原結合ドメインを融合すると、効力を上昇させることができるか調べた。Ｎ末端からＣ末端の方向で、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４のＶＨ及びＶＬを含むｓｃＦｖ、Ｊ＊、Ｒ、ならびにＩ（Ｊ＊、Ｒ及びＩは、実施例１に記載されているようなものである）を含む改変Ｊ鎖を構築し（配列番号１９）、この改変Ｊ鎖は、ＩｇＭ ｈ３Ｃ５の重鎖及び軽鎖ときちんとアセンブルされて、五量体を形成したことが示された。Ｋｉ－６７増殖アッセイ（６０時間インキュベート）において、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ａ及び図８Ｂに、２つの異なるＰＢＭＣドナーについて示されている）、またはＣＤ３陰性ＮＫ細胞（図８Ｃ及び図８Ｄに、２つの異なるＰＢＭＣドナーについて示されている）についてゲーティングを行って、上記の五量体を試験した。このコンストラクトでは、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩまたはｈ３Ｃ５ ＩｇＭ Ｊ＊と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖については、効力は中程度であり、ＮＫ細胞の増殖についても、効力は中程度であった。
次に、本発明者らは、ＩｇＭベースのＩＳＡのＪ＊ＲＩエレメント上に、Ｔ細胞を標的とする抗原結合ドメインを融合すると、効力を上昇させることができるか調べた。Ｎ末端からＣ末端の方向で、マウス抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体ＳＰ３４のＶＨ及びＶＬを含むｓｃＦｖ、Ｊ＊、Ｒ、ならびにＩ（Ｊ＊、Ｒ及びＩは、実施例１に記載されているようなものである）を含む改変Ｊ鎖を構築し（配列番号１９）、この改変Ｊ鎖は、ＩｇＭ ｈ３Ｃ５の重鎖及び軽鎖ときちんとアセンブルされて、五量体を形成したことが示された。Ｋｉ－６７増殖アッセイ（６０時間インキュベート）において、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ａ及び図８Ｂに、２つの異なるＰＢＭＣドナーについて示されている）、またはＣＤ３陰性ＮＫ細胞（図８Ｃ及び図８Ｄに、２つの異なるＰＢＭＣドナーについて示されている）についてゲーティングを行って、上記の五量体を試験した。このコンストラクトでは、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋ＳＪ＊、ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ＋Ｊ＊ＲＩまたはｈ３Ｃ５ ＩｇＭ Ｊ＊と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖については、効力は中程度であり、ＮＫ細胞の増殖についても、効力は中程度であった。
【0205】
それらの２つの異なるドナーにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についてのＥＣ５０（ｎＭで表されている）が、表４に示されており、それらの２つの異なるドナーにおけるＮＫ細胞の増殖ついてのＥＣ５０（ＮＭで表されている）が、表５に示されている。
【0206】
（表４）ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についてのＥＣ５０
【0207】
（表５）ＮＫ細胞の増殖ついてのＥＣ５０
【0208】
実施例７：インビボのマウス腫瘍有効性モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１ Ｊ＊ＲＩの効力
改変Ｊ鎖Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）を抗ＰＤ－Ｌ１ヒトＩｇＭ五量体としてアセンブルし、その五量体は、ＩｇＭの重鎖が、配列番号２２４のＶＨアミノ酸配列を含み、その軽鎖が、配列番号２２５のＶＬアミノ酸配列を含むものである（以下、「ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ」という）。標準的な技法を用いて、配列番号７５のＶＨドメイン、及び配列番号７６のＶＬドメインを含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体を作製した。
改変Ｊ鎖Ｊ＊ＲＩ（配列番号６）を抗ＰＤ－Ｌ１ヒトＩｇＭ五量体としてアセンブルし、その五量体は、ＩｇＭの重鎖が、配列番号２２４のＶＨアミノ酸配列を含み、その軽鎖が、配列番号２２５のＶＬアミノ酸配列を含むものである（以下、「ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ」という）。標準的な技法を用いて、配列番号７５のＶＨドメイン、及び配列番号７６のＶＬドメインを含む抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ抗体を作製した。
【0209】
遺伝子操作したマウスモデルで、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの抗腫瘍作用を評価した。マウスのＰＤ－１分子及びＣＴＬＡ－４分子の代わりに、ヒトＰＤ－１分子及びヒトＣＴＬＡ－４分子を発現するＢＡＬＢ／ｃマウス群の左側腹部に、ｍＰＤ－Ｌ１の代わりに、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するマウス大腸癌細胞株ＣＴ－２６を移植した。その腫瘍が６０～１００ｍｍ３に達したら、マウスを１０匹からなる群に無作為に分け、表６に示されているようにして処置した。処置の開始から合計３８日の期間、腫瘍サイズを週に３回測定した。
【0210】
（表６）処置群
＋ｉｐ ＢＩＷ×３：腹腔内に週２回、合計３回注射
＊ｉｐ Ｑ３ｄ×６：腹腔内に週２回、合計３回注射
＃ｉｐ Ｑ２ｄ×３：腹腔内に週２回、合計３回注射
＊ｉｐ Ｑ３ｄ×６：腹腔内に週２回、合計３回注射
＃ｉｐ Ｑ２ｄ×３：腹腔内に週２回、合計３回注射
【0211】
各腫瘍群の平均腫瘍サイズが、図９Ａに示されている。処置群１における個々の腫瘍サイズは、図９Ｂに、処置群２における個々の腫瘍サイズは、図９Ｃに、処置群３における個々の腫瘍サイズは、図９Ｄに示されている。２２日目（エンドポイント：平均腫瘍サイズ１，５００ｍｍ３超）に、群１を殺処分し、３９日目まで、群２及び３をモニタリングした。群１～５における非担癌マウスの数が、表７に示されている。
【0212】
（表７）退縮または非担癌マウス
【0213】
群３～５の非担癌マウス（ｎ＝合計１９匹）、及び１５匹のナイーブマウスの右側腹部に、野生型ＣＴ－２６腫瘍細胞でリチャレンジを行った。腫瘍細胞の成長を最長で４８日間、モニタリングした。各腫瘍群の平均腫瘍サイズが、図１０Ａに示されている。ナイーブマウスにおける個々の腫瘍サイズが、図１０Ｃに示されており、処置マウスにおける個々の腫瘍サイズが、図１０Ｄに示されている。腫瘍は、ナイーブ群では、１５匹中１０匹のマウスで成長したが、ｍ３Ｃ５－Ｊ＊ＲＩ群では、成長は見られなかった（０匹／１９匹）ことから、ｍ３Ｃ５－Ｊ＊ＲＩによる３種類の最初の処置によって誘発された抗腫瘍免疫が、長く継続したことが示された。図１０Ｂは、ナイーブ群と治療群との腫瘍成長差が、統計的に有意であることを示している。（Ｐ＜０．０００１）。
【0214】
実施例８：インビボマウスの薬力学モデルにおける抗ＰＤ－Ｌ１ Ｊ＊ＲＩの効力
ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて、ｍ３Ｃ５－Ｊ＊ＲＩの薬力学的作用を評価した。表８に示されているようにして、５匹のマウスからなる群を処置した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスモデルにおいて、ｍ３Ｃ５－Ｊ＊ＲＩの薬力学的作用を評価した。表８に示されているようにして、５匹のマウスからなる群を処置した。
【0215】
（表８）ＢＡＬＢ／ｃ薬力学的モデルにおける処置群
＃ｉｐ Ｑ２ｄ×３：腹腔内に２日置きに、合計３回注射
【0216】
以下のようにして、末梢血のＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ８細胞及びＣＤ４Ｔ細胞の計数をフローサイトメトリーによって行った。Ｋ２－ＥＤＴＡを用いて、血液を採取し、抗体を用いて、ＣＤ４５（白血球）、ＣＤ３（Ｔ細胞））、ＣＤ４（ＣＤ４ Ｔ細胞）、ＣＤ８（ＣＤ８ Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）及びＣＤ４９ｂ（ＮＫ細胞）に対して染色を行い、フローサイトメーターの機械で、計数ビーズを用いて解析して、細胞の数を評価した。
【0217】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の結果が図１１Ａに、ＮＫ細胞の結果が図１１Ｂに、ＣＤ４＋Ｔ細胞の結果が図１１Ｃに、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の結果が図１１Ｄに示されている。マウスＣＤ８ Ｔ細胞及びマウスＮＫ細胞について、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの用量に依存的な一過性の増加が見られる。ビヒクルのみの場合には、増加は観察されない。ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの増殖作用は、ＣＤ４ Ｔ細胞またはＢ細胞には及ばない。
【0218】
実施例９：糖鎖付加部位を変異させた、ＩＬ－１５バリアントを含むＩＳＡの評価
Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの４つの糖鎖付加部位を除去した影響を評価した。Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの第１の糖鎖付加部位（「Ｎ１」）は、Ｊ＊（配列番号３）の４９位である。Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの他の３つの糖鎖付加部位は、ＩＬ－１５部分において、配列番号４の７１位（「Ｎ２」）、７９位（「Ｎ３）及び１１２（「Ｎ４」）に位置する。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ１～Ｎ４の組み合わせをアスパラギン酸に変異させて、糖鎖付加部位を除去したＪ＊ＲＩ配列を作製した（それぞれ、配列番号８６～９０）。ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ（ＶＨ：配列番号３３、ＶＬ：配列番号３４）＋Ｊ＊ＲＩ Ｎ１Ｄ、Ｎ２Ｄ、Ｎ３Ｄ、Ｎ４ＤまたはＮ１Ｄ／Ｎ２Ｄ／Ｎ３Ｄ／Ｎ４Ｄ変異を作製し、精製して、効力について、実施例２に記載されている方法に従って試験した。その結果は、図１２に示されている。このアッセイでは、変異が１つの場合も、変異を組み合わせた場合も、野生型Ｊ＊ＲＩ配列と比べて、効力の有意な低下はまったく見られなかった。
Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの４つの糖鎖付加部位を除去した影響を評価した。Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの第１の糖鎖付加部位（「Ｎ１」）は、Ｊ＊（配列番号３）の４９位である。Ｊ＊ＲＩ上における、アスパラギンベースの他の３つの糖鎖付加部位は、ＩＬ－１５部分において、配列番号４の７１位（「Ｎ２」）、７９位（「Ｎ３）及び１１２（「Ｎ４」）に位置する。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ１～Ｎ４の組み合わせをアスパラギン酸に変異させて、糖鎖付加部位を除去したＪ＊ＲＩ配列を作製した（それぞれ、配列番号８６～９０）。ｈ３Ｃ５ ＩｇＭ（ＶＨ：配列番号３３、ＶＬ：配列番号３４）＋Ｊ＊ＲＩ Ｎ１Ｄ、Ｎ２Ｄ、Ｎ３Ｄ、Ｎ４ＤまたはＮ１Ｄ／Ｎ２Ｄ／Ｎ３Ｄ／Ｎ４Ｄ変異を作製し、精製して、効力について、実施例２に記載されている方法に従って試験した。その結果は、図１２に示されている。このアッセイでは、変異が１つの場合も、変異を組み合わせた場合も、野生型Ｊ＊ＲＩ配列と比べて、効力の有意な低下はまったく見られなかった。
【0219】
実施例１０：複数の種に由来するＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＤ－Ｌ１ Ｊ＊ＲＩの評価
ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの増殖活性及びサイトカイン放出活性をカニクイザルＰＢＭＣにおいて評価した。このアッセイでは、６つの健常なヒトドナーＰＢＭＣ、及び４つの健常なカニクイザルドナーＰＢＭＣを並行して使用し、漸増用量のｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ、及びＩＬ－１５ ＩＳＡを含まない抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭコントロール「ｍ３ｃ５ ＩｇＭ」（ＶＨ：配列番号２２４、ＶＬ：配列番号２２５）とともに、３日間、実施例２に記載されている方法に従ってインキュベートした。図１３Ａ～１３Ｂには、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩが、ヒト及びカニクイザルのＣＤ８ Ｔ細胞において、同等の増殖活性を有することが示されている。表９は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ８ Ｔ細胞における増殖ＥＣ５０の平均を示している。
ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩの増殖活性及びサイトカイン放出活性をカニクイザルＰＢＭＣにおいて評価した。このアッセイでは、６つの健常なヒトドナーＰＢＭＣ、及び４つの健常なカニクイザルドナーＰＢＭＣを並行して使用し、漸増用量のｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ、及びＩＬ－１５ ＩＳＡを含まない抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＭコントロール「ｍ３ｃ５ ＩｇＭ」（ＶＨ：配列番号２２４、ＶＬ：配列番号２２５）とともに、３日間、実施例２に記載されている方法に従ってインキュベートした。図１３Ａ～１３Ｂには、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩが、ヒト及びカニクイザルのＣＤ８ Ｔ細胞において、同等の増殖活性を有することが示されている。表９は、ヒト及びカニクイザルのＣＤ８ Ｔ細胞における増殖ＥＣ５０の平均を示している。
【0220】
（表９）ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩ及びｈ３Ｃ５ ＩｇＭに応答した、ヒト由来及びカニクイザル由来ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖
【0221】
この増殖アッセイから得た上清を解析して、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａ（ＣＢＡ）アッセイを用いて、サイトカイン濃度を求めた。ヒトＴＨ１／ＴＨ２ サイトカインキットＩＩをメーカーの指示に従って用いて、ヒトサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）の濃度を評価した。非ヒト霊長類ＴＨ１／ＴＨ２キットをメーカーの指示に従って、カニクイザルサイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を評価した。得られた濃度が、ヒトＩＬ－６については図１４Ａに、ヒトＩＦＮγについては図１４Ｂに、ヒトＴＮＦαについては図１４Ｃに、カニクイザルＩＬ－６については図１４Ｄに、カニクイザルＩＦＮγについては図１４Ｅに、カニクイザルＴＮＦαについては図１４Ｆに示されている。他のすべてのサイトカインは、検出限界未満であった。
【0222】
実施例１１：細胞依存性細胞傷害性アッセイにおける抗ＰＤ－Ｌ１ Ｊ＊ＲＩの評価
インビトロ細胞依存性細胞傷害性アッセイを用いて、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩが腫瘍細胞殺傷性を増大させる能力を評価した。ＰＤ－Ｌ１を発現するとともに、操作して、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現するようにしたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃを標的腫瘍細胞として選択した。健常なドナーから得たＰＢＭＣ、精製ＮＫ細胞または精製ＣＤ８ Ｔ細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃと、示されているＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比で共培養した。漸増用量の抗体をその共培養液に加えた。細胞を３日間または６日間インキュベートし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃの殺傷に起因する発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｉｎ．）で読み取った。ＰＭＢＣの結果は図１５Ａに、ＮＫ細胞の結果は図１５Ｂに、ＣＤ８ Ｔ細胞の結果は図１５Ｃに示されている。ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩは、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞がインビトロで腫瘍細胞を殺傷する潜在能力を向上させる。
インビトロ細胞依存性細胞傷害性アッセイを用いて、ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩが腫瘍細胞殺傷性を増大させる能力を評価した。ＰＤ－Ｌ１を発現するとともに、操作して、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現するようにしたヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃを標的腫瘍細胞として選択した。健常なドナーから得たＰＢＭＣ、精製ＮＫ細胞または精製ＣＤ８ Ｔ細胞をＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃと、示されているＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比で共培養した。漸増用量の抗体をその共培養液に加えた。細胞を３日間または６日間インキュベートし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－Ｌｕｃの殺傷に起因する発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｉｎ．）で読み取った。ＰＭＢＣの結果は図１５Ａに、ＮＫ細胞の結果は図１５Ｂに、ＣＤ８ Ｔ細胞の結果は図１５Ｃに示されている。ｍ３ｃ５－Ｊ＊ＲＩは、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞がインビトロで腫瘍細胞を殺傷する潜在能力を向上させる。
【0223】
実施例１２：ヒトＰＤ－Ｌ１上で３Ｃ５が結合するエピトープの評価
アラニンスキャニング変異誘発を用いて、ヒトＰＤ－Ｌ１上で、３Ｃ５ Ｈ２Ｌ２（ＶＨ：配列番号９１、ＶＬ：配列番号９４）抗体が結合するエピトープをマッピングした。ヒトＰＤ－Ｌ１のアラニンスキャンライブラリーを構築することによって、エピトープマッピングを行い、その後、ヒトＰＤ－Ｌ１をＨＥＫ－２９３Ｔ細胞上に発現させた。ＨＥＫ－２９３にトランスフェクションした各ＰＤ－Ｌ１変異型への３Ｃ５ Ｈ２Ｌ２ Ｆ（ａｂ’）２の結合をハイスループットフローサイトメトリーによって評価した。３Ｃ５の結合に重要であることが見出されたＰＤ－Ｌ１アミノ酸は、Ｒ１１３、Ｙ１２３及びＲ１２５であり、ＰＤ－Ｌ１の結晶構造上での、これらのアミノ酸の位置をＺｈａｎｇらが特定したもの（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８（５２）：９０２１５－９０２２４）が、図１６に示されている。
アラニンスキャニング変異誘発を用いて、ヒトＰＤ－Ｌ１上で、３Ｃ５ Ｈ２Ｌ２（ＶＨ：配列番号９１、ＶＬ：配列番号９４）抗体が結合するエピトープをマッピングした。ヒトＰＤ－Ｌ１のアラニンスキャンライブラリーを構築することによって、エピトープマッピングを行い、その後、ヒトＰＤ－Ｌ１をＨＥＫ－２９３Ｔ細胞上に発現させた。ＨＥＫ－２９３にトランスフェクションした各ＰＤ－Ｌ１変異型への３Ｃ５ Ｈ２Ｌ２ Ｆ（ａｂ’）２の結合をハイスループットフローサイトメトリーによって評価した。３Ｃ５の結合に重要であることが見出されたＰＤ－Ｌ１アミノ酸は、Ｒ１１３、Ｙ１２３及びＲ１２５であり、ＰＤ－Ｌ１の結晶構造上での、これらのアミノ酸の位置をＺｈａｎｇらが特定したもの（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７，８（５２）：９０２１５－９０２２４）が、図１６に示されている。
【0224】
（表１０）本開示に示されている配列（シグナルペプチドには下線が付けられており、それ以外のタンパク質は、成熟タンパク質である）
【0225】
（表１１）さらなる抗ＰＤ－Ｌ１のＶＨ配列及びＶＬ配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】