特表 2022-544416 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の下流生成物を精製するプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-18

(54)【発明の名称】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の下流生成物を精製するプロセス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20221011BHJP

   C07H 21/02 20060101ALI20221011BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z

C07H21/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022509126

(86)(22)【出願日】2020-08-13

(85)【翻訳文提出日】2022-02-14

(86)【国際出願番号】 US2020046069

(87)【国際公開番号】W WO2021030533

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】62/886,840

(32)【優先日】2019-08-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513084469

【氏名又は名称】モデルナティエックス インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100195796

【弁理士】

【氏名又は名称】塩尻 一尋

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・シャマシュキン

(72)【発明者】

【氏名】マシュー・スコット

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・ウォジェハウスキー

【テーマコード（参考）】

4C057

【Ｆターム（参考）】

4C057BB01

4C057BB02

4C057DD01

4C057MM02

(57)【要約】

本明細書では、いくつかの実施形態において、変性オリゴｄＴクロマトグラフィーを用いて低塩分ＲＮＡ組成物を精製する方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下、
（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む混合物を脱塩して、２０ｍＭ未満の塩濃度を有する低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、
（ｂ）前記低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡを産生することと、
（ｃ）前記変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び少なくとも５０ｍＭの濃度の塩を含む組成物を産生することと、
（ｄ）（ｃ）で産生された前記組成物の前記変性ＲＮＡを４０℃未満の温度でオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、
（ｅ）前記オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることと、
を含む、方法。

【請求項2】

以下、
（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む混合物を脱塩して、２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、
（ｂ）前記低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡを産生することと、
（ｃ）前記変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び少なくとも５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む組成物を産生することと、
（ｄ）（ｃ）で産生された前記組成物の前記変性ＲＮＡを４０℃未満の温度でオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、
（ｅ）前記オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることと、
を含む、方法。

【請求項3】

（ａ）の前記混合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応物である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

（ａ）及び／または（ｃ）の前記塩はＮａＣｌを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記高塩分緩衝液は、１００ｍＭ～１０００ｍＭの塩濃度及び／または５ｍＳ／ｃｍ～８５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記脱塩は、前記ＲＮＡを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させることと、前記ＨＩＣ樹脂から前記ＲＮＡを溶出させて、前記低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記低塩分ＲＮＡ組成物は、１～２０ｍＭの塩濃度及び／または０．１～２ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＨＩＣ樹脂は、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）Ｒ１５０ビーズ樹脂である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

（ｂ）の前記加熱は１分未満で行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

（ｂ）の前記加熱は少なくとも１０秒間で行われる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ｂ）の前記加熱は、１０～６０、１０～３０、２０～４０、または３０～６０秒間で行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

（ｂ）の前記加熱は６０℃～９０℃の温度で行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記低塩分ＲＮＡ組成物は、変性剤分子の存在下で加熱される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記変性剤分子は、ジメチルスルホキシド、グアニジン、または尿素である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記変性ＲＮＡを含む組成物を６０℃未満の温度にインライン冷却することを、（ｂ）と（ｃ）との間にさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記変性ＲＮＡを含む組成物を４０℃未満の温度にインライン冷却することを、（ｂ）と（ｃ）との間にさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記変性ＲＮＡを含む組成物をブレークタンクに保管することを、（ｂ）と（ｃ）との間にさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記変性ＲＮＡを含む組成物は、２～８℃で１～５日間、前記ブレークタンクに保管される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

（ｃ）の前記インライン混合は１分未満で行われる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

（ｃ）で産生された前記変性ＲＮＡを含む組成物は、５０～５００ｍＭの塩濃度及び／または５～８５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

（ｃ）の前記組成物における全ＲＮＡのうちの少なくとも９０％が、変性ＲＮＡを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

（ｄ）の前記結合は４℃～２５℃の温度で行われる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

（ｄ）の前記結合は２０分未満で行われる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記オリゴｄＴ樹脂は、ポリｄＴで誘導体化された、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記オリゴｄＴ樹脂から溶出された前記ＲＮＡは、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを少なくとも９０％含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記オリゴｄＴ樹脂から溶出された前記ＲＮＡは、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを少なくとも９５％含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記インライン混合は、前記混合物を前記オリゴｄＴ樹脂上に結合させることと並行して行われる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＲＮＡの二次構造が、（ｂ）の前後で、紫外線検出を用いてモニターされる、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

（ｂ）中の前記ＲＮＡの変性が、紫外線検出を用いてモニターされる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

以下、
高塩分緩衝液を、変性リボ核酸（ＲＮＡ）を含む低塩分変性ＲＮＡ組成物とインラインで混合して、変性ＲＮＡを含む高塩分組成物を産生することと、
前記変性ＲＮＡをオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、
を含む方法。

【請求項31】

前記インライン混合は、前記変性ＲＮＡを前記オリゴｄＴ樹脂に結合させる前に、１分未満で行われる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記高塩分緩衝液は、少なくとも１００ｍＭの塩濃度及び／または少なくとも１０ｍＳ／ｃｍの導電性を有する、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

前記高塩分緩衝液は、１００ｍＭ～１０００ｍＭの塩濃度であるＮａＣｌを有する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記低塩分変性ＲＮＡ組成物は、２０ｍＭ未満の塩濃度及び／または２ｍＳ／ｃｍ未満を有する、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記低塩分変性ＲＮＡ組成物は、１～２０ｍＭの塩濃度及び／または０．１～２ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記高塩分組成物は、５０～５００ｍＭの塩濃度及び／または５～８５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項３０～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記高塩分組成物中の前記変性ＲＮＡは、前記高塩分組成物における全ＲＮＡのうちの少なくとも９０％を占める、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記結合は２０分未満で行われる、請求項３０～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記結合は４０℃未満の温度で行われる、請求項３０～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記結合は４℃～２５℃の温度で行われる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記オリゴｄＴ樹脂は、ポリｄＴで誘導体化された、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂である、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを低塩分緩衝液中で溶出させることをさらに含む、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記オリゴｄＴ樹脂から溶出された前記ＲＮＡは、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを少なくとも９０％含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記オリゴｄＴ樹脂から溶出された前記ＲＮＡは、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを少なくとも９５％含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

高塩分緩衝液とのインライン混合の前に、ＲＮＡ及び２０ｍＭ未満の塩濃度を含む組成物を、６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡ組成物を産生すること、をさらに含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

高塩分緩衝液とのインライン混合の前に、ＲＮＡを含み、２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する組成物を、６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡ組成物を産生すること、をさらに含む、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記加熱は１分未満で行われる、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

前記加熱は少なくとも１０秒間で行われる、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記加熱は、１０～６０、１０～３０、２０～４０、または３０～６０秒間で行われる、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記加熱は６０℃～９０℃の温度で行われる、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

高塩分緩衝液とのインライン混合の前に、ＲＮＡを含む混合物を脱塩して、２０ｍＭ未満の塩濃度を有するＲＮＡ組成物を産生することと、
前記２０ｍＭ未満の塩濃度を有するＲＮＡ組成物を、６０℃より高い温度に加熱して、前記変性ＲＮＡ組成物を産生することと、
をさらに含む、請求項３０～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記混合物はｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応物である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記脱塩は、前記ＲＮＡを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させることと、前記ＨＩＣ樹脂から前記ＲＮＡを溶出させて、ＲＮＡ組成物を産生することと、を含む、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

前記ＨＩＣ樹脂は、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）Ｒ１５０ビーズ樹脂である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ＲＮＡの二次構造が、前記組成物の前記加熱中に、紫外線検出を用いてモニターされる、請求項３０～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＲＮＡの変性が、前記組成物の前記加熱中に、紫外線検出を用いてモニターされる、請求項３０～５５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年８月１４日に出願された米国仮出願第６２／８８６，８４０号の利益を主張するものであり、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）では、バクテリオファージＤＮＡ依存性リボ核酸（ＲＮＡ）ポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７）を用いて、鋳型指向性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を合成する。ＩＶＴ反応における問題により、例えば、完全に失敗することがある（例えば、転写物が生成しない）か、または転写物のサイズが不正確（例えば、予想よりも短いもしくは長い）になることがある。ＩＶＴ反応に関連する特定の問題としては、例えば、反応中に産生される、アボーティブ（切断型）転写物、ランオン転写物、ポリＡ鎖バリアント／３´不均質性（ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙ－Ａ ｔａｉｌｅｄ ｍＲＮＡ）の割合の低さを含む）、変異転写物、及び／または二本鎖夾雑物が挙げられる。ＩＶＴ反応に起因するこれらの問題に対応するための機序の１つは、反応完了後にｍＲＮＡ生成物を精製することである。

【発明の概要】

【0003】

本開示は、いくつかの実施形態において、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応物から高収率かつ高純度で単離する方法を提供する。これまでのｍＲＮＡ精製は、周囲オリゴｄＴ（ａｍｂｉｅｎｔ ｏｌｉｇｏ－ｄＴ）を単独で、または逆相ＨＰＬＣと組み合わせて用いることを中心としてきた。しかしながら、これらの精製方法では、鎖含有ｍＲＮＡ純度の割合が低くなるか（周囲オリゴｄＴ単独）、または、大規模の場合コストが法外に高くなる（周囲オリゴｄＴと逆相ＨＰＬＣとの併用）。そのため、新規なｍＲＮＡ精製方法が必要とされている。驚くべきことに、本明細書の研究は、高塩分緩衝液と、変性ＲＮＡを含む低塩分組成物をインライン混合すると、ポリＡ鎖を含有するｍＲＮＡの相対的な収率が著しく向上することを示している。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて単離されたｍＲＮＡのうちの少なくとも９５％がポリＡ鎖を有する。つまり、ポリＡ鎖含有ＲＮＡ種のこの百分率は、逆相クロマトグラフィー等の従来のＲＮＡ精製方法を用いて精製された百分率よりも高い。理論に束縛されるものではないが、高塩分緩衝液との急速なインライン混合の前にＲＮＡを変性させることで、ＲＮＡに付随する不純物の除去が容易になり、ＲＮＡがオリゴｄＴ樹脂に高い選択性をもって結合しやすくなる、と考えられている。さらに、本明細書で提供される方法は、いくつかの実施形態において、容易に拡張可能であり（例えば、少なくとも１リットルのカラム体積を有するカラムを用いた精製）、かつ費用対効果が高い。

【0004】

したがって、本開示の態様は、変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び塩（例えば、少なくとも５０ｍＭの濃度）を含む組成物を産生することと、組成物の変性ＲＮＡを（例えば、４０℃未満の温度で）オリゴｄＴ樹脂に結合させることと、オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させる（例えば、そのうちの少なくとも９５％はポリＡ鎖を有するｍＲＮＡである）ことと、を含む方法を提供する。

【0005】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡを含む混合物（例えば、ＩＶＴ反応混合物）を脱塩して、２０ｍＭ未満の塩濃度を有する低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、（ｂ）低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡを産生することと、（ｃ）変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び少なくとも５０ｍＭの濃度の塩を含む組成物を産生することと、（ｄ）（ｃ）で産生された組成物の変性ＲＮＡを４０℃未満の温度でオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、（ｅ）オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることと、を含む。

【0006】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）ＲＮＡを含む混合物（例えば、ＩＶＴ反応混合物）を脱塩して、２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、（ｂ）低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡを産生することと、（ｃ）変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び少なくとも５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む組成物を産生することと、（ｄ）（ｃ）で産生された組成物の変性ＲＮＡを４０℃未満の温度でオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、（ｅ）オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることと、を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む混合物は、希釈されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応物である。ＲＮＡを含む他の混合物を使用してもよい。

【0007】

いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液の塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。他の塩を使用してもよい。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、１００ｍＭ～１０００ｍＭの塩濃度を有する。例えば、高塩分緩衝液は、５０ｍＭ～４５０ｍＭ、５０ｍＭ～４００ｍＭ、５０ｍＭ～３５０ｍＭ、５０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～４５０ｍＭ、１００ｍＭ～４００ｍＭ、１００ｍＭ～３５０ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～２５０ｍＭ、１００ｍＭ～２００ｍＭ、１００ｍＭ～１５０ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～４５０ｍＭ、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、１５０ｍＭ～２５０ｍＭ、１５０ｍＭ～２００ｍＭ、２００ｍＭ～５００ｍＭ、２００ｍＭ～４５０ｍＭ、２００ｍＭ～４００ｍＭ、２００ｍＭ～３５０ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ、または２００ｍＭ～２５０ｍＭの塩濃度を有し得る。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、５ｍＳ／ｃｍ～８５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。例えば、高塩分緩衝液は、５ｍＳ／ｃｍ～１０ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～１５ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～２５ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～５０ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～６０ｍＳ／ｃｍ、５ｍＳ／ｃｍ～７０ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ～２０ｍＳ／ｃｍ、１５ｍＳ／ｃｍ～２５ｍＳ／ｃｍ、２０ｍＳ／ｃｍ～３０ｍＳ／ｃｍ、２５ｍＳ／ｃｍ～３５ｍＳ／ｃｍ、３０ｍＳ／ｃｍ～４０ｍＳ／ｃｍ、３５ｍＳ／ｃｍ～４５ｍＳ／ｃｍ、４０ｍＳ／ｃｍ～５０ｍＳ／ｃｍ、４５ｍＳ／ｃｍ～５５ｍＳ／ｃｍ、５０ｍＳ／ｃｍ～６０ｍＳ／ｃｍ、５５ｍＳ／ｃｍ～６５ｍＳ／ｃｍ、６０ｍＳ／ｃｍ～７０ｍＳ／ｃｍ、６５ｍＳ／ｃｍ～７５ｍＳ／ｃｍ、７０ｍＳ／ｃｍ～８０ｍＳ／ｃｍ、または７５ｍＳ／ｃｍ～８５ｍＳ／ｃｍの導電率を有し得る。

【0008】

いくつかの実施形態では、脱塩は、粗混合物からのＲＮＡを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させることと、ＨＩＣ樹脂からＲＮＡを低塩分緩衝液で溶出させて、低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、（例えば、２０００オングストロームの細孔を有する）（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）Ｒ１５０ビーズ樹脂である。

【0009】

いくつかの実施形態では、加熱工程（複数可）は、１分以下、または１分未満（例えば、１０～６０秒、１０～５０秒、１０～４０秒、１０～３０秒、１０～２０秒、２０～６０秒、２０～５０秒、２０～４０秒、２０～３０秒、３０～６０秒、３０～５０秒、３０～４０秒、４０～６０秒、４０～５０秒、または５０～６０秒）で行われる（実装される）。いくつかの実施形態では、加熱工程（複数可）は、少なくとも１０秒間行われる（実装される）。

【0010】

いくつかの実施形態では、加熱工程（複数可）は、６０℃～９０℃（例えば、６０℃～８０℃、６０℃～７０℃、６５℃～９０℃、６５℃～８０℃、６５℃～７０℃、７０℃～９０℃、７０℃～８０℃、７５℃～９０℃、７５℃～８０℃、８０℃～９０℃、または８５℃～９０℃）の温度で行われる（実装される）。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡの二次構造が、加熱工程（例えば、ＲＮＡを変性させるように意図された加熱工程）の間に、例えば、紫外線検出を用いてモニターされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの変性が、加熱工程（例えば、ＲＮＡを変性させるように意図された加熱工程）の間に、例えば、紫外線検出を用いてモニターされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの変性は、加熱工程（例えば、ＲＮＡを変性させるように意図された加熱工程）の前後に、ＲＮＡのハイパークロミティーの紫外線測定値を収集することによりモニターされる。

【0012】

いくつかの実施形態では、組成物中の全ＲＮＡのうちの少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）が、変性ＲＮＡを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、ジメチルスルホキシド、グアニジン、または尿素等の変性剤分子の存在下で加熱される。

【0014】

いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合は、１分以下、または１分未満（例えば、１０～６０秒、１０～５０秒、１０～４０秒、１０～３０秒、１０～２０秒、２０～６０秒、２０～５０秒、２０～４０秒、２０～３０秒、３０～６０秒、３０～５０秒、３０～４０秒、４０～６０秒、４０～５０秒、または５０～６０秒）で行われる（実装される）。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合は、ｄＴ樹脂と接触させる前に行われる。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合は、組成物をｄＴ樹脂と接触させることと並行して（例えば、同時に）行われる。理論に束縛されるものではないが、短時間でのインライン混合により、ｄＴ樹脂に接触させる前に変性ＲＮＡが折り畳まれること、及び／または不純物と結びつくことが妨げられると考えられている。

【0015】

いくつかの実施形態では、インライン混合は、変性ＲＮＡを含む組成物を、６０℃未満（例えば、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、または５℃未満）の温度にインライン冷却することを含む。いくつかの実施形態では、インライン混合は、変性ＲＮＡを含む組成物を、６０℃未満かつ４℃超の温度にインライン冷却することを含む。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物は、変性後にブレークタンクに保管される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物は、変性及びインライン冷却の後、ブレークタンクに保管される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物は、２～８℃（例えば、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃）で１～５日間（例えば、１、２、３、４または５日間）、ブレークタンクに保管される。

【0016】

いくつかの実施形態では、組成物の変性ＲＮＡのオリゴｄＴ樹脂への結合は、４℃～２５℃（例えば、４℃～２０℃、４℃～１５℃、または４℃～１０℃）の温度で行われる（実装される）。

【0017】

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂は、（例えば、ポリｄＴで誘導体化された、例えば、２０００オングストロームの細孔を有する）（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂である。

【0018】

いくつかの実施形態では、組成物の変性ＲＮＡのオリゴｄＴ樹脂への結合は、２０分以下、または２０分未満（例えば、５分～２０分、５分～１５分、５分～１０分、１０分～２０分、１０分～１５分、または１５分～２０分）で行われる（実装される）。

【0019】

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、少なくとも９０％のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを含む。例えば、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、少なくとも９５％のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを含む。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】変性オリゴｄＴ樹脂を用いてｍＲＮＡを精製する方法の例を概略的に表している。

【図2】塩濃度が異なる状況における異なる長さのＲＮＡ分子２種の融解曲線を示すグラフを表している。

【図3】変性ｄＴクロマトグラフィーを用いてＲＮＡを精製する装置の例を概略的に表している。

【図4】ＲＮＡ純度に対する種々のＩＶＴ反応物精製ストラテジーの効果を、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡの割合で評価して示すグラフを表している。

【図5】ＩＶＴ反応により産生されたＲＮＡを精製するプロセスの例を概略的に表している。

【図6】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製されたｍＲＮＡの代表的なクロマトグラムを表している。

【発明を実施するための形態】

【0021】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を産生するための強力なプラットフォームである。それにもかかわらず、ＩＶＴ反応では、所望のＲＮＡ生成物（複数可）が産生されるほかに、著しいレベルで不純物も生成する。それらの不純物が一因となり、所望のＲＮＡ生成物（複数可）の精製が課題となることが明らかにされている。本明細書において、いくつかの実施形態では、大規模ＩＶＴ反応からＲＮＡ不純物を除去する、効率的かつ費用対効果の高い方法が提供される。これらの方法は、ＲＮＡ変性を伴う、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）等の脱塩プロセスを含むものであり、高純度のｍＲＮＡ個体群を高収率で単離することを可能にする。予想外にも、本方法に組み込まれたインライン（連続混和）混合プロセスにより、変性ｍＲＮＡのオリゴｄＴ樹脂への高親和性結合がさらに促進された。変性ＲＮＡと高塩分溶液の迅速な混合を可能にするインライン混合プロセスは、変性ＲＮＡが不純物と結びつく（例えば、ハイブリダイズする）のを防ぐのに不可欠である一方、変性ＲＮＡ組成物が、オリゴｄＴ樹脂への変性ＲＮＡの結合を最大化するのに最適な高塩濃度を含むことを確実にするものでもあることがわかった。

【0022】

したがって、本明細書に記載されているように、本開示は、ＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ反応によって産生されたｍＲＮＡ）を含む混合物を精製する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、変性リボ核酸（ＲＮＡ）を含む低塩分変性ＲＮＡ組成物と高塩分緩衝液とをインライン混合して、変性ＲＮＡを含む高塩分組成物を産生することと、その後に（例えば、直ちに）変性ＲＮＡをオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、を含む。他の態様では、本方法は、（ａ）リボ核酸（ＲＮＡ）を含む混合物を脱塩して、２０ｍＭ未満の塩濃度を有する低塩分ＲＮＡ組成物を産生することと、（ｂ）低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃より高い温度に加熱して、変性ＲＮＡを産生することと、（ｃ）変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合して、変性ＲＮＡ及び少なくとも５０ｍＭの濃度の塩を含む組成物を産生することと、（ｄ）（ｃ）で産生された組成物の変性ＲＮＡを４０℃未満の温度でオリゴｄＴ樹脂に結合させることと、（ｅ）オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることと、を含む。

【0023】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応混合物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて精製または単離される混合物またはＲＮＡ組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応によって産生される。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、プロモーターを含有する直鎖鋳型ＤＮＡ、ヌクレオシド三リン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びマグネシウムイオンを含む緩衝系、ならびにＲＮＡポリメラーゼを必要とする。転写反応に用いられる厳密な条件は、特定の用途に必要なＲＮＡの量に依存する。ＩＶＴ反応は、鋳型ＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼならびにＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含むヌクレオシド三リン酸（またはヌクレオチドアナログ）とともに転写緩衝液中でインキュベートすることにより実施され得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用するためのＲＮＡポリメラーゼは、「ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｖａｒｉａｎｔｓ」と題されたＷＯ２０１９／０３６６８２に記載されている通りである。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、大量流加ＩＶＴ反応、連続流加ＩＶＴ反応、または回分ＩＶＴ反応である。いくつかの実施形態では、５′キャップ構造を有するＲＮＡ転写物が、この反応から産生される。

【0024】

鋳型ＤＮＡは、目的のポリペプチド（例えば、抗原ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されることがある。鋳型ＤＮＡは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３′末端に、ポリアデニル（ポリＡ）鎖をコードするヌクレオチド配列も含み得る。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡはＩＶＴ反応の生成物である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ポリＡ鎖に連結された、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

【0026】

「ポリＡ鎖」とは、目的のポリペプチドをコードする領域の下流（例えば、３′非翻訳領域の直下）にある、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有するＲＮＡ領域である。ポリＡ鎖は、１０～３００のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリＡ鎖は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または３００のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ鎖は、５０～２５０のアデノシン一リン酸を含有する。いくつかの実施形態では、ポリＡ鎖は、１０未満（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９）のアデノシン一リン酸を含有し得る。

【0027】

いくつかの実施形態では、鎖含有ＲＮＡの割合（ポリＡ鎖を含むＲＮＡ転写物の割合）は、ＩＶＴ反応後に５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超である。本明細書で使用する場合、鎖含有ＲＮＡの割合とは、一般に、３′ポリＡ鎖を含有する転写ＲＮＡ生成物の相対的な存在量を指す。いくつかの実施形態では、鎖含有ＲＮＡの割合（３′ポリＡ鎖を含む転写ＲＮＡ生成物の割合）は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％超である。いくつかの実施形態では、鎖含有ＲＮＡの割合は、９０％、９５％、９７％、または９９％超である。いくつかの実施形態では、鎖含有ＲＮＡの割合（３′ポリＡ鎖を含む転写ＲＮＡ生成物の割合）は、２０～１００％、２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、２５～７５％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、４５～６０％、５５～７０％、６０～８０％、６０～１００％、７５～１００％、５０～９５％、７５～９５％、８０～１００％、８０～９０％、９０～９５％、９５～１００％、９０～９９％、または９５～９９％である。

【0028】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは化学修飾されてなく、アデノシン、グアノシン、シチジン及びウリジンからなる標準的リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、標準的ヌクレオシド残基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ中に存在するもののような標準的デオキシリボヌクレオシド（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）であり、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、用語「修飾」及び「修飾された」は、リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドのアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）に関する、それらの核酸塩基の位置、パターン、割合、または個体群のうちの少なくとも１つにおける修飾を指す。ＲＮＡは自然発生、非自然発生である修飾を含み得るか、または、ＲＮＡは自然発生修飾と非自然発生修飾との組み合わせを含み得る。ＲＮＡは、例えば、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合（例えば、連結するリン酸への、リン酸ジエステル結合への、もしくはリン酸ジエステル骨格への）における任意の有用な修飾を含み得る。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドを含む。「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）もしくはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせた糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、Ｎ１－エチルプソイドウリジン、２－チオウリジン、４′－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５－メトキシウリジン及び２′－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、上述した修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４以上）の組み合わせを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡの修飾核酸塩基は、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（ψ）、α－チオ－グアノシン及びα－チオ－アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、上述した修飾核酸塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４以上）の組み合わせを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、プソイドウリジン（ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２－チオウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２′－Ｏ－メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２′－Ｏ－メチルウリジン及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、Ｎ６－メチル－アデノシン（ｍ６Ａ）及び５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。

【0033】

ＲＮＡは、約１％～約１００％（全体のヌクレオチド含有率に対してか、１つまたは複数のタイプのヌクレオチド、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのどれか１つまたは複数に対してのいずれか）、または任意の間の百分率（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）における修飾ヌクレオチドを含有し得る。残りの割合は全て、非修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在で占められることが理解されるであろう。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡはキャップアナログを含む。ＲＮＡキャップアナログは、一般に、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳効率を高める。従来のキャップアナログとしては、ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＧ、及びｍ２，２，７ＧｐｐｐＧが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡキャップアナログは、ジヌクレオチドキャップ、トリヌクレオチドキャップ、またはテトラヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、キャップアナログは、トリヌクレオチドキャップである。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＵ、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ、ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、及びＧＵＵから選択される配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列、ｍ^７ＧｐｐｐＡｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＡｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＣｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＵｐＧ、及びｍ^７ＧｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵｐＧ、及びｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵｐＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、及びｍ^７Ｇ_{３′ＯＭｅ}ｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＵから選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、トリヌクレオチドキャップは、以下の配列、ｍ^７ＧｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＡ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７Ｇｐ
ｐｐＣ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、ｍ^７ＧｐｐｐＧ_{２′ＯＭｅ}ｐＵ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＡ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＣ、ｍ^７ＧｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＧ、及びｍ^７ＧｐｐｐＵ_{２′ＯＭｅ}ｐＵから選択される配列を含む。

【0036】

本明細書で使用する場合、キャップ含有ＲＮＡ（ｃａｐｐｅｄ ＲＮＡ）の割合は、一般に、５′末端に組み込まれたキャップアナログを含有する転写ＲＮＡ生成物の相対的な存在量を指す。いくつかの実施形態では、キャップアナログは、ＲＮＡキャップアナログである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡキャップアナログは、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、またはテトラヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、キャップ含有ＲＮＡの割合（５′キャップアナログを含む転写ＲＮＡ生成物の割合）は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％超である。いくつかの実施形態では、キャップ含有ＲＮＡの割合は、９０％、９５％、９７％、または９９％超である。いくつかの実施形態では、キャップ含有ＲＮＡの割合は、２０～１００％、２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、２５～７５％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、４５～６０％、５５～７０％、６０～８０％、６０～１００％、７５～１００％、５０～９５％、７５～９５％、８０～１００％、８０～９０％、９０～９５％、９５～１００％、９０～９９％、または９５～９９％の間である。

【0037】

ＲＮＡは任意のサイズまたは長さであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの長さは、５０～２５０、２００～５００、４００～５０００、４００～４０００、４００～３０００、４００～２０００、４００～１０００、５００～５０００、５００～１５００、７５０～２０００、１０００～１５００、１２５０～２０００、１５００～２０００、１７５０～２５００、２０００～３０００、２５００～３５００、３０００～４０００、３５００～４５００、または４０００～５０００ヌクレオチドである。

【0038】

ＲＮＡを含む混合物の脱塩
いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物（例えば、２０ｍＭ未満の総塩濃度を有する）を産生するために、ＲＮＡを含む混合物が脱塩される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む混合物（例えば、ＩＶＴ反応により産生された混合物）は、ＲＮＡ変性及び／または高塩分緩衝液とのインライン混合の前に脱塩される。

【0039】

いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、硫酸塩、リン酸塩、及び／または塩化物塩を含む。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、及び／または硫酸カルシウムを含む。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または１ｍＭ未満の総塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、１～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～５ｍＭ、５～２０ｍＭ、５～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、１０～１５ｍＭ、または１５～２０ｍＭの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、２．５ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満、１．５ｍＳ／ｃｍ未満、１ｍＳ／ｃｍ未満、または０．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率になる。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、０．１～２．５ｍＳ／ｃｍ、０．１～２ｍＳ／ｃｍ、０．５～２ｍＳ／ｃｍ、０．５～１ｍＳ／ｃｍ、１～２ｍＳ／ｃｍ、１～１．５ｍＳ／ｃｍ、または１～１．２５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む混合物の脱塩は、ＲＮＡを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂に結合させ、ＨＩＣ樹脂からＲＮＡを溶出させて、低塩分ＲＮＡ組成物を産生することにより達成される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、ＲＮＡが樹脂に結合する前に緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、水または緩衝液を用いてＨＩＣ樹脂から溶出される。

【0041】

本明細書で説明される方法は、任意のＨＩＣ樹脂を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、ブチル、ｔ－ブチル、メチル、及び／またはエチル官能基を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＨＰ樹脂、ＣａｐｔｏＰｈｅｎｙｌ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） ６樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標） Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ樹脂、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標） ＥＭＤ Ｐｒｏｐｙｌ樹脂、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標） ＥＭＤ Ｐｈｅｎｙｌ樹脂、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（商標） Ｍｅｔｈｙｌ樹脂、ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｂｕｔｙｌ ＦＦ、ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｏｃｔｙｌ ＦＦ、またはＴｏｓｏｈ Ｈｅｘｙｌである。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）Ｒ１５０ビーズ樹脂である。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む混合物の脱塩は、水での混合物の希釈（例えば、１０倍水希釈）、水への混合物のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、または周囲オリゴｄＴ（すなわち、天然、非変性ＲＮＡ条件下）により達成される。

【0043】

変性ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ組成物（例えば、低塩分ＲＮＡ組成物）は変性される。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、高塩分緩衝液とのインライン混合及びその後の変性ＲＮＡとオリゴｄＴ樹脂との結合の前（例えば、直前）に変性される。

【0044】

ＲＮＡは、任意の方法を用いて変性され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、低塩分ＲＮＡ組成物を、６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７０℃、６５℃～８５℃、６５℃～７５℃、７０℃～９０℃、７０℃～８０℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、または７５℃～９５℃に加熱することにより変性される。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、２分未満、９０秒未満、１分未満、５０秒未満、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満加熱される。いくつかの実施形態では、低塩分ＲＮＡ組成物は、５～９０秒、５～６０秒、５～３０秒、５～１５秒、１０～６０秒、１０～３０秒、２０～６０秒、２０～４０秒、３０～９０秒、３０～６０秒、４０～９０秒、４０～６０秒、６０～１２０秒、６０～９０秒、または９０～１２０秒間加熱される。いくつかの実施形態では、高塩分ＲＮＡ組成物は、変性剤分子（例えば、ＲＮＡを不安定化または変性させる化学的小分子）の存在下で加熱される。変性剤分子としては、ジメチルスルホキシド（例えば、０．０５～１％ ｖ／ｖ、０．１～０．５％ ｖ／ｖ、０．０５～０．５％ ｖ／ｖ、または０．２５～０．７５％ ｖ／ｖの濃度）、グアニジン（例えば、５０～２５０ｍＭ、１００～５００ｍＭ、２５０～１０００ｍＭ、１～８Ｍ、２～６Ｍ、３～５Ｍ、または５～８Ｍの濃度）、または尿素（例えば、５０～２５０ｍＭ、１００～５００ｍＭ、２５０～１０００ｍＭ、１～８Ｍ、２～６Ｍ、３～５Ｍ、または５～８Ｍの濃度）を挙げることができる。

【0045】

いくつかの実施形態では、変性プロセス（例えば、低塩分ＲＮＡ組成物を６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７０℃、６５℃～８５℃、６５℃～７５℃、７０℃～９０℃、７０℃～８０℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、または７５℃～９５℃に加熱する）における、ＲＮＡ組成物中の変性ＲＮＡの相対量変化は、ハイパークロミシティー曲線（例えば、分光学的融解曲線）により測定される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡの相対量変化は、組成物中の全ＲＮＡの二次構造における変化を測定することにより（例えば、紫外線吸収の変化を測定することにより）測定される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡの相対量変化は、変性プロセス（例えば、低塩分ＲＮＡ組成物を、６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７０℃、６５℃～８５℃、６５℃～７５℃、７０℃～９０℃、７０℃～８０℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、または７５℃～９５℃に加熱すること）の前後に、組成物中の全ＲＮＡの二次構造における変化をモニターすることにより（例えば、紫外線吸収の変化を測定することにより）測定される。

【0046】

いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物中の全ＲＮＡのうちの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％が、変性ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物中の全ＲＮＡのうちの少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）が、変性ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物中の全ＲＮＡのうちの５０～７０％、４５～６０％、５５～７０％、６０～８０％、６０～１００％、７５～１００％、５０～９５％、７５～９５％、８０～１００％、８０～９０％、９０～９５％、９５～１００％、９０～９９％、または９５～９９％が、変性ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物中の変性ＲＮＡの相対量は、ハイパークロミシティー曲線（例えば、分光学的融解曲線）により測定される。ハイパークロミシティー（加熱中に構造を失うと同時に吸光係数の増加を示す、ＲＮＡ等の核酸の性質）は、分光光度計を用いて（例えば、加熱によるＲＮＡの変性中に）測定され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの吸光係数は、２０５ｎｍ、２２０ｎｍ、２６０ｎｍ、または２００～３００ｎｍで測定される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物中の変性ＲＮＡの相対量は、Ｓ．Ｊ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｄ．Ｈ． Ｔｕｒｎｅｒ， “Ｏｐｔｉｃａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４６８ （２００９） ３７１－３８７、またはＧｒｕｅｎｗｅｄｅｌ， Ｄ．Ｗ．， “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ”， Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｐａｇｅｓ ４１４７－４１５２に記載されているような方法を用いて測定される。

【0047】

いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物は、高塩分緩衝液との混合及び／またはオリゴｄＴ樹脂上への負荷の前に、ブレークタンク（すなわち、変性ＲＮＡ組成物を保持することができる保管容器）に保管される。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、ＲＮＡが最大３日間変性したままであるように、変性ＲＮＡ組成物を保管することができる。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物は、ブレークタンク内で低塩分濃度（例えば、１～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～５ｍＭ、５～２０ｍＭ、５～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、１０～１５ｍＭまたは１５～２０ｍＭ 塩）で維持される。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、ＲＮＡが１～６時間、２～１２時間、５～１５時間、１２～２４時間、１２～３６時間、１～２日間、１～３日間、または２～３日間、変性したままであるように、変性ＲＮＡ組成物を保管することができる。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、１５℃～３０℃、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃に維持される。

【0048】

インライン混合
いくつかの実施形態では、インライン混合は、第１連続流溶液と第２連続流溶液とを混合することを指す。いくつかの実施形態では、第１及び第２連続流は、独立したポンプ（例えば、独立した蠕動運動型ポンプ）により制御される。いくつかの実施形態では、インライン混合は、流動制御条件、例えば、流動パラメータ（例えば、流量、温度）が少なくとも１つのポンプシステムを備える流動調整デバイスにより制御されるプロセス流動条件に依存する。いくつかの実施形態では、第１連続流は、高塩分緩衝液（例えば、少なくとも５０ｍＭ 塩を含む）であり、第２連続流は、脱塩（例えば、低塩分）及び／または変性ＲＮＡを含む組成物である。

【0049】

インライン混合は、典型的には、変性ＲＮＡを含む組成物をオリゴｄＴ樹脂に結合させる直前に行われる。いくつかの実施形態では、インライン混合は、２分未満、９０秒未満、１分未満、５０秒未満、４０秒未満、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満で行われる。いくつかの実施形態では、インライン混合は、５～９０秒、５～６０秒、５～３０秒、５～１５秒、１０～６０秒、１０～３０秒、２０～６０秒、２０～４０秒、３０～９０秒、３０～６０秒、４０～９０秒、４０～６０秒、６０～１２０秒、６０～９０秒、または９０～１２０秒で行われる。いくつかの実施形態では、インライン混合は、変性ＲＮＡを含む組成物をオリゴｄＴ樹脂に結合させる前に、５～９０秒、５～６０秒、５～３０秒、５～１５秒、１０～６０秒、１０～３０秒、２０～６０秒、２０～４０秒、３０～９０秒、３０～６０秒、４０～９０秒、４０～６０秒、６０～１２０秒、６０～９０秒、または９０～１２０秒で行われる。いくつかの実施形態では、インライン混合は、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃の温度で行われる。

【0050】

いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液（例えば、ＲＮＡ組成物とインライン混合され得る）は、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭ、少なくとも８０ｍＭ、少なくとも９０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２５０ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも６００ｍＭ、少なくとも７００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも９００ｍＭ、または少なくとも１０００ｍＭの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、５０～５００ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、５０～１００ｍＭ、５０～７５ｍＭ、６０～１５０ｍＭ、７５～５００ｍＭ、７５～２００ｍＭ、１００～５００ｍＭ、１００～２５０ｍＭ、１５０～３５０ｍＭ、２００～４００ｍＭ、２５０～５００ｍＭ、３００～４００ｍＭ、３５０～４５０ｍＭ、４００～５００ｍＭ、４００～６００ｍＭ、５００～７００ｍＭ、５００～７５０ｍＭ、７００～１０００ｍＭ、７５０～９００ｍＭ、または８５０～１０００ｍＭの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、１～２Ｍ、２～３Ｍ、３～４Ｍ、または４～５Ｍの塩濃度を含む。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、少なくとも６ｍＳ／ｃｍ、少なくとも７ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８ｍＳ／ｃｍ、少なくとも９ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１２ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、５～１０ｍＳ／ｃｍ、５～１５ｍＳ／ｃｍ、５～７ｍＳ／ｃｍ、６～９ｍＳ／ｃｍ、８～１０ｍＳ／ｃｍ、９～１２ｍＳ／ｃｍ、または１０～１５ｍＳ／ｃｍの導電率を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合すると、変性ＲＮＡ及び少なくとも５０ｍＭの濃度の塩を含む組成物が産生される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合すると、変性ＲＮＡ及び５０～５００ｍＭ、５０～２５０ｍＭ、５０～１００ｍＭ、５０～７５ｍＭ、６０～１５０ｍＭ、７５～５００ｍＭ、７５～２００ｍＭ、１００～５００ｍＭ、１００～２５０ｍＭ、１５０～３５０ｍＭ、２００～４００ｍＭ、２５０～５００ｍＭ、３００～４００ｍＭ、３５０～４５０ｍＭ、４００～５００ｍＭ、４００～６００ｍＭ、５００～７００ｍＭ、５００～７５０ｍＭ、７００～１０００ｍＭ、７５０～９００ｍＭ、または８５０～１０００ｍＭの濃度の塩を含む組成物が産生される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合すると、変性ＲＮＡ及び２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率を有する塩を含む組成物が産生される。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物を高塩分緩衝液とインライン混合すると、変性ＲＮＡ及び２～５ｍＳ／ｃｍ、２～７ｍＳ／ｃｍ、５～１０ｍＳ／ｃｍ、５～１５ｍＳ／ｃｍ、５～７ｍＳ／ｃｍ、６～９ｍＳ／ｃｍ、８～１０ｍＳ／ｃｍ、９～１２ｍＳ／ｃｍ、または１０～１５ｍＳ／ｃｍの導電率を有する塩を含む組成物が産生される。

【0052】

いくつかの実施形態では、緩衝液（例えば、低塩分または高塩分緩衝液）は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌ、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、またはＮａ_３ＰＯ_４を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液（例えば、低塩分または高塩分緩衝液）は、任意のナトリウム、カリウム、マグネシウム、リン酸塩、塩化物の供給源、または任意の他の塩イオン供給源を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液（例えば、低塩分または高塩分緩衝液）は、ｐＨを一貫して維持するために、緩衝剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液（例えば、低塩分または高塩分緩衝液）は、中性ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液（例えば、低塩分または高塩分緩衝液）は、約６、約６．５、約７、約７．４、約８、または約６～８のｐＨを含む。本明細書で使用する緩衝剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、コハク酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸、グルタミン酸、マレイン酸塩、カコジル酸塩、２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ′－２－エタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシ－プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス－（ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）－プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－２－ヒドロキシエチル－ピペラジン－Ｎ－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－トリス－（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ′－（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］グリシン（トリシン）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（ビシン）、［（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］－１－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、及びビス［２－ヒドロキシエチル］イミノトリス－［ヒドロキシメチル］メタン（ビス－トリス）が挙げられる。本明細書で使用する溶液の他の緩衝液組成、緩衝液濃度、及び追加の構成成分は、当業者には明白であろう。

【0053】

いくつかの実施形態では、インライン混合は、変性ＲＮＡを含む組成物を、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃の温度にインライン冷却することを含む。いくつかの実施形態では、インライン混合は、変性ＲＮＡを含む組成物を、６０℃、５５℃、５０℃、４５℃、４０℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、または５℃未満の温度にインライン冷却することを含む。いくつかの実施形態では、インライン冷却は、変性ＲＮＡ及び低塩分緩衝液を含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合と同時に行われる。いくつかの実施形態では、インライン冷却の間、変性ＲＮＡを含む組成物は、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、５ｍＭ未満、または１ｍＭ未満の総塩濃度に維持される。いくつかの実施形態では、インライン冷却の間、変性ＲＮＡを含む組成物は、１～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～５ｍＭ、５～２０ｍＭ、５～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、１０～１５ｍＭ、または１５～２０ｍＭの総塩濃度に維持される。いくつかの実施形態では、インライン冷却は、変性ＲＮＡ及び低塩分緩衝液を含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合と同時に行われる。いくつかの実施形態では、インライン冷却の間、変性ＲＮＡを含む組成物は、２．５ｍＳ／ｃｍ未満、２ｍＳ／ｃｍ未満、１．５ｍＳ／ｃｍ未満、１ｍＳ／ｃｍ未満、または０．５ｍＳ／ｃｍ未満に維持される。いくつかの実施形態では、インライン冷却は、変性ＲＮＡ及び低塩分緩衝液を含む組成物と高塩分緩衝液とのインライン混合と同時に行われる。いくつかの実施形態では、インライン冷却の間、変性ＲＮＡを含む組成物は、０．１～２．５ｍＳ／ｃｍ、０．１～２ｍＳ／ｃｍ、０．５～２ｍＳ／ｃｍ、０．５～１ｍＳ／ｃｍ、１～２ｍＳ／ｃｍ、１～１．５ｍＳ／ｃｍ、または１～１．２５ｍＳ／ｃｍに維持される。

【0054】

オリゴｄＴ樹脂
本明細書の方法は、変性ＲＮＡを含む組成物をオリゴｄＴ樹脂に結合させる（すなわち、接触させる）ことに関与する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、低塩分変性ＲＮＡ組成物を高塩分緩衝液とインライン混合した後に、変性ＲＮＡを含む組成物をオリゴｄＴ樹脂に結合させることを含む。

【0055】

本明細書に記載の方法では、任意のオリゴｄＴ樹脂を使用し得る。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂は、ポリｄＴで誘導体化された、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂である。いくつかの実施形態では、ポリｄＴは、５～２００、１０～５０、１０～１００、５０～２００、１００～１５０、または１２５～２００のチミジン及び／またはウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ポリｄＴは、２０チミジンの長さを含む。いくつかの実施形態では、ポリｄＴは、ビーズ樹脂に直接連結される。いくつかの実施形態では、ポリｄＴは、リンカーを介してビーズ樹脂に連結される。

【0056】

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂は、ＲＮＡが樹脂に結合する前に、緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂は、ＲＮＡが樹脂に結合した後に緩衝液で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄工程は、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の緩衝液を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡのオリゴｄＴ樹脂への結合は、４０℃未満の温度で行われる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのオリゴｄＴ樹脂への結合は、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃の温度で行われる。

【0058】

いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物は、２０分未満、１８分未満、１５分未満、１２分未満、１０分未満、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満、５分未満、４分未満、３分未満、２分未満、または１分未満の総滞留時間で、オリゴｄＴ樹脂に結合するか、または接触する。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡを含む組成物は、１～２、１～５、２～５、２～１０、５～２０、５～１０、５～１５、８～１５、１０～１５、１２～２０、または１５～２０分の総滞留時間で、オリゴｄＴ樹脂に結合するか、または接触する。

【0059】

いくつかの実施形態では、本方法は、オリゴｄＴ樹脂からＲＮＡを溶出させることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、水または緩衝液（例えば、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ８．０の緩衝液）を用いてＨＩＣ樹脂から溶出される。

【0060】

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％のポリＡ鎖含有ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、約２０～１００％、２０～９０％、２０～８０％、２０～７０％、２０～６０％、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、２５～７５％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、４５～６０％、５５～７０％、６０～８０％、６０～１００％、７５～１００％、５０～９５％、７５～９５％、８０～１００％、８０～９０％、９０～９５％、９５～１００％、９０～９９％、または９５～９９％のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ樹脂から溶出されたＲＮＡは、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡを含む。

【0061】

装置
本開示のいくつかの態様は、変性ｄＴクロマトグラフィーを用いてＲＮＡを精製する装置を提供する。いくつかの実施形態では、装置は、オリゴｄＴ樹脂が充填されたカラムを備え、該カラムは、入口及び出口を有する。いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つのポンプシステムを備える流動調整デバイスであり、該ポンプシステムは、混合される２種以上の溶液の流量及び温度等の流動パラメータを制御するための流動制御条件（例えば、プロセス流動条件）下で、２種以上の溶液を連続混和させて混合することを可能にする。いくつかの実施形態では、装置は、カラム入口の上流において、脱塩ＲＮＡを送出する第１連続流であって、脱塩ＲＮＡの流動が第１ポンプにより制御され、第１流が、予熱器とその後段にある冷却器とを含む変性チャンバ内に入る第１連続流と、高塩分緩衝液を送出する第２流であって、高塩分緩衝液の流動が第２ポンプにより制御される第２流と、２種の連続流が合流して、脱塩ＲＮＡと高塩分緩衝液がインライン混合されるチャンバと、を備える。

【0062】

いくつかの実施形態では、装置は、ポリｄＴで誘導体化された、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂を含む、オリゴｄＴ樹脂を備える。

【0063】

いくつかの実施形態では、カラム（例えば、オリゴｄＴ樹脂が充填されたカラム）は、１～１０ｍＬ、１～５ｍＬ、５～２５ｍＬ、１０～１００ｍＬ、２５～１５０ｍＬ、５０～１００ｍＬ、７５～１５０ｍＬ、１００～２００ｍＬ、１００～５００ｍＬ、２５０～１０００ｍＬ、５００～１５００ｍＬ、またはそれ以上のカラム体積を有する。いくつかの実施形態では、カラム（例えば、オリゴｄＴ樹脂が充填されたカラム）は、約１ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２５ｍＬ、約５０ｍＬ、約１００ｍＬ、約２５０ｍＬ、約５００ｍＬ、約７５０ｍＬ、約１０００ｍＬ、約１５００ｍＬ、約２０００ｍＬ、またはそれ以上のカラム体積を有する。

【0064】

いくつかの実施形態では、予熱器により脱塩ＲＮＡが６０℃より高い温度に加熱されて、変性ＲＮＡ組成物が産生される。いくつかの実施形態では、予熱器は、６０℃～９０℃、６０℃～８０℃、６０℃～７０℃、６５℃～８５℃、６５℃～７５℃、７０℃～９０℃、７０℃～８０℃、６５℃～７０℃、７０℃～７５℃、または７５℃～９５℃に維持される。

【0065】

いくつかの実施形態では、冷却器により変性ＲＮＡ組成物が３０℃未満の温度に冷却される。いくつかの実施形態では、冷却器は、１５℃～３０℃、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃に維持される。

【0066】

いくつかの実施形態では、装置は、ブレークタンク（すなわち、変性ＲＮＡ組成物を保持することができる保管容器）をさらに備える。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、ＲＮＡが最大３日間変性したままであるように、変性ＲＮＡ組成物を保管することができる。いくつかの実施形態では、変性ＲＮＡ組成物は、ブレークタンク内で低塩分濃度（例えば、１～２０ｍＭ、１～１５ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～５ｍＭ、５～２０ｍＭ、５～１０ｍＭ、１０～２０ｍＭ、１０～１５ｍＭまたは１５～２０ｍＭ 塩）で維持される。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、ＲＮＡが１～６時間、２～１２時間、５～１５時間、１２～２４時間、１２～３６時間、１～２日間、１～３日間、または２～３日間、変性したままであるように、変性ＲＮＡ組成物を保管することができる。いくつかの実施形態では、ブレークタンクは、１５℃～３０℃、４℃～３０℃、４℃～２５℃、４℃～２０℃、４℃～１５℃、４℃～１０℃、４℃～８℃、１０℃～３０℃、１０℃～２５℃、１０℃～２０℃、１０℃～１５℃、または１５℃～２５℃に維持される。

【0067】

いくつかの実施形態では、装置は、少なくとも１つの紫外線（ＵＶ）検出モジュールをさらに備える。いくつかの実施形態では、ＵＶ検出モジュールは、変性プロセスの間（例えば、ＲＮＡを変性するように意図された加熱工程の間）に、ＵＶ光を用いてＲＮＡを検出するように配置される。いくつかの実施形態では、ＵＶ検出モジュールは、変性プロセスの後（例えば、ＲＮＡを変性するように意図された加熱工程の後）に、ＵＶ光を用いてＲＮＡを検出するように配置される。いくつかの実施形態では、装置は、２つのＵＶモジュールを備える。いくつかの実施形態では、装置は、変性プロセスの前（例えば、ＲＮＡを変性するように意図された加熱工程の前）に、ＵＶ光を用いてＲＮＡを検出するように配置された第１ＵＶモジュールと、変性プロセスの後（例えば、ＲＮＡを変性するように意図された加熱工程の後）に、ＵＶ光を用いてＲＮＡを検出するように配置された第２ＵＶモジュール、を備える。

【0068】

いくつかの実施形態では、装置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を用いて産生された脱塩ＲＮＡを処理するために使用される。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの塩濃度を有する。いくつかの実施形態では、高塩分緩衝液は、５０ｍＭ～５００ｍＭの塩濃度であるＮａＣｌを有する。

【実施例】

【0069】

実施例１．変性ｄＴ（ｄｄＴ）クロマトグラフィー
図１に記載されているように、変性により、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ反応により産生された完全長ＲＮＡ生成物（複数可））に対するオリゴｄＴクロマトグラフィーの選択性が改善される。ＲＮＡ組成物の変性は、ＲＮＡ溶液を６０℃～９０℃の範囲にある温度で１０～６０秒間加熱することにより達成することができる。この変性プロセスにより、ＲＮＡの二次及び高次構造が破壊され、その結果、ｍＲＮＡと任意の非共有結合性不純物との間のあらゆる相互作用がなくなる。また、変性により、非共有結合的に結合しているＩＶＴ関連不純物も解離する。次いで変性ＲＮＡを、オリゴｄＴ樹脂、例えば、ポリｄＴで誘導体化された、２０００オングストロームの細孔を有する（ポリ）スチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）ビーズ樹脂、に選択的に結合させることができ、不純物を洗い流し、変性ＲＮＡから分離し得る。

【0070】

ｍＲＮＡの変性は、塩濃度が融解転移温度中間点（Ｔｍ）に及ぼす影響を検討することにより調べた（図２）。ＵＶ融解曲線は、２種類の異なる長さ（８５０ヌクレオチド（ｎｔ）及び４０００ｎｔ）のｍＲＮＡコンストラクトを用いて得た。コンストラクトは、水、１００ｍＭ 酢酸トリエチルアミン ｐＨ７．０、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ７．０で０．０３５ｍｇ／ｍＬに希釈した。温度は１℃／分で４℃から９０℃まで昇温させた。ハイパークロミシティー（加熱中に構造を失うと同時に吸光係数の増加を示す、核酸の性質）は、Ｃａｒｙ－３００分光光度計（２６０ｎｍ）を用いて、加熱中に測定した。融解転移中間点は、得られたハイパークロミシティー曲線から推定し、媒質のイオン強度が高くなるにつれて上がることを認めた。したがって、塩濃度が低くなるほど変性効率が高くなる。融解転移点は、ｍＲＮＡの長さに影響されなかった。

【0071】

次いで、ＩＶＴ反応を用いて調製したテストｍＲＮＡ（長さ２５２５ｎｔ）を精製する実験を行って、本明細書に記載されている通りの変性オリゴｄＴ法が、代替的な精製手法と比較した場合、最適なＲＮＡ精製手法となることを実証した。変性オリゴｄＴ実験に使用した装置の概略を図３に示す。

【0072】

これらの異なる手法の結果を図４に示し、以下で説明する。任意の精製手法を行う前では、ＩＶＴ反応物が含む全ＲＮＡのうち６９．１％が、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡであった。得られたＩＶＴ溶液をＨＩＣ樹脂で脱塩した場合、鎖含有純度に変化は見られなかった。周囲オリゴｄＴ樹脂（すなわち、ｍＲＮＡを脱塩及び変性させないが、周囲温度で高塩分緩衝液中のオリゴｄＴカラム上へ負荷する）では、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡは８５．３％になり、鎖含有純度が中程度に向上した。しかしながら、ＨＩＣ樹脂を用いた精製（混合物の脱塩のため）に続いて、連続的変性オリゴｄＴ（オリゴｄＴカラム上に負荷しながら、変性ＲＮＡを高塩分緩衝液とインライン混合することを含む）を行うと、特に周囲オリゴｄＴと比較して、鎖含有純度が著しく向上し、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡは９４．９％に達した。驚くべきことに、ＨＩＣで脱塩して熱変性させたｍＲＮＡをブレークタンクに保管すると（２℃～８℃で３日間）、その後オリゴｄＴへ負荷している間に塩緩衝液とインライン混合させて以来、ｍＲＮＡの変性特性は保存され続けて、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡは同様に９５．５％となった。しかしながら、ブレークタンクにおける変性ｍＲＮＡの保管中に塩分調整を行うと、インライン混合による塩分調整と比較して、鎖含有純度は９１．６％に低下した。このことは、高塩分緩衝液中で保管する間に、不純物が完全長ｍＲＮＡにゆっくりと結びつくことを指し示している。

【0073】

したがって、オリゴｄＴ樹脂上に負荷する直前に、変性ＲＮＡを高塩分緩衝液とインライン混合することで、完全長生成物が不純物と再度ハイブリダイズすることを防ぎ、その結果、高純度（全ＲＮＡの約９５％がポリＡ鎖を含む）になることが見出された。

【0074】

同様の結果が、連続的（すなわち、変性後、変性ＲＮＡを高塩分緩衝液とインライン混合し、その直後にオリゴｄＴ樹脂に結合させる）変性オリゴｄＴの間、オリゴｄＴ樹脂が過負荷または低容量であった場合に見られた（データは示していない）。

【0075】

さらに、周囲オリゴｄＴと変性オリゴｄＴとの比較を実施した。テストｍＲＮＡ（長さ２３６９ｎｔ）は、流加ＩＶＴを用いて産生した。純度は、鎖含有ｍＲＮＡの割合で測定した。ＩＶＴ後、全ＲＮＡは、鎖含有ｍＲＮＡを６４％含んでいた。次いで、全ＲＮＡを周囲オリゴｄＴを用いて精製したところ、鎖含有ｍＲＮＡが７３％得られ、その後、２つの異なるサンプルに分けた。第１サンプルは、周囲ｄＴを用いて２度目の精製を行ったところ、７７％の鎖含有ｍＲＮＡが得られ、第１周囲ｄＴ精製工程よりもわずかに改善された。第２サンプルは、２回目の周囲ｄＴの代わりに変性オリゴｄＴを用いて精製し、得られた生成物の９７％が鎖含有であった。この実験のさらなるデータを表１に示す。

【表1】

【0076】

実施例２．ＨＩＣ及び変性オリゴｄＴを用いた精製
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）後、ＲＮＡ供給物は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて脱塩してもよい。ＨＩＣ樹脂により、さらに残留タンパク質及び残留未消化ＤＮＡを除去することができる。

【0077】

２５２５ｎｔのｍＲＮＡを産生したＩＶＴ反応物を、ＨＩＣカラム上に負荷する前に、１００Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅとインキュベートし、ＥＤＴＡ処理を行ってから、希釈した（４倍）。ＨＩＣ樹脂は、ＰＯＲＯＳ（商標）Ｒ１５０、２０００Å細孔型（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とした。ビーズの開けた細孔構造により、例えば、２０００ｎｔを超えるような大きいｍＲＮＡコンストラクトに対する結合容量が高くなる。ＩＶＴ後の水中のＲＮＡ負荷濃度は１～２ｍｇ／ｍＬであり、ＲＮＡ負荷量目標値は、樹脂ｍＬ当たり５ｍｇ ｍＲＮＡとした。滞留時間／流速は、３～５分（１５０ｃｍ／ｈｒ）であった。ＨＩＣパラメータの概要を表２に示す。

【表2】

【0078】

図６に示すように、ＨＩＣでは、未反応ＮＴＰ、酵素、消化されたＤＮＡ、及びＩＶＴ緩衝液塩を貫流させる一方、全ｍＲＮＡを分離することができる。不可逆的に結合したＲＮＡ、タンパク質、及びＤＮＡはカラムに保持される。次いで、分離したＲＮＡをＨＩＣ樹脂から水を用いて溶出させ、未消化ＤＮＡは選択的にカラム上に保持させた。

【0079】

粗ＩＶＴ供給物からのｍＲＮＡコンストラクト（１９５６ｎｔ）に対するＲ１５０樹脂の動的結合容量（ＤＢＣ）は、おおよそ５ｍｇ／ｍＬであり、ＨＩＣ精製は、予想外ではあるが、中程度の純度向上をもたらした。

【0080】

ＨＩＣ脱塩工程の後、溶出したＲＮＡを１分間６０℃に加熱し、１５～３０℃に冷却し、変性ＲＮＡを１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の緩衝液とインライン混合し、変性ＲＮＡをオリゴｄＴカラム上に負荷することにより、溶出したＲＮＡをインラインで変性させた（図５を参照のこと）。滞留時間／流速は、１ｍｇ／ｍＬ負荷で２分であった。ＨＩＣパラメータの概要を表３に示す。

【表3】

【0081】

実施例３．ＨＩＣ及び変性オリゴｄＴを用いた精製
本実施例では、長さ１９５６ヌクレオチド（ｎｔ）のテストｍＲＮＡをＩＶＴを用いて生成し、次いで、ＨＩＣに続く変性オリゴｄＴ（ｄｄＴ）プロセスを用いて処理した。表４に示すように、ＨＩＣと変性オリゴｄＴプロセスを組み合わせることで、周囲オリゴｄＴに続く逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣクロマトグラフィーと比較して同等以上の純度が得られた。両プロセスとも、ｄＴクロマトグラフィー単独（中央列）よりも優れて機能した。

【表4】

【0082】

実験は、異なるサイズ（２９９２ｎｔ、２４９７ｎｔ、６５８ｎｔ、１１０５ｎｔ、７８４ｎｔ、及び９１３ｎｔ）のｍＲＮＡコンストラクトを用いて繰り返した。以下の表５及び表６に示すように、単一のｄＴクロマトグラフィー精製工程では、より長いコンストラクト（長さ＞２０００ｎｔのもの）に対して望ましい純度が得られない。ＨＩＣに続いて変性オリゴｄＴを用いると、より長いコンストラクトに関して９６～９７％で鎖含有ｍＲＮＡが得られた。

【表5】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0083】

ＨＩＣに続く変性オリゴｄＴ（ｄｄＴ）を含む精製プロセスを、異なる長さ（２８７２ｎｔ、２８５２ｎｔ、６９２ｎｔ、２３９９ｎｔ、１７７２ｎｔ、及び１００７ｎｔ）の６つのさらなるコンストラクトを用いて繰り返した。その結果が示すところによれば、ＨＩＣとｄｄＴの組み合わせにより、特により長いコンストラクトで高い純度が得られ、ｄｄＴ後のポリＡ鎖含有ｍＲＮＡは、９５～９９％であった（表７及び表８を参照のこと）。

【表7】

【表8-1】

【表8-2】

【0084】

さらなる追加実験により、ＨＩＣと変性オリゴｄＴの組み合わせは、大容量（ＩＶＴ反応で産生された２５４５ｎｔのｍＲＮＡを用いた１リットルカラム）にスケールアップできることが実証された。表９に示すように、精製プロセスでは、ポリＡ鎖含有ｍＲＮＡの純度が高くなった（トリス－ＲＰ及びＭＰ法の両方で評価）。

【表9】

【0085】

本明細書に開示される全ての参照、特許及び特許出願は、各々が引用される主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては文書全体を包含する場合がある。

【0086】

本明細書及び特許請求の範囲において本明細書で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないと明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0087】

また、そうでないと明確に示されない限り、２つ以上の工程または行為を含む本明細書で主張される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解するべきである。

【0088】

上記の本明細書においてだけでなく、特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」などのような全ての移行句は、非制限、すなわち、含むが限定されないことを意味するものと理解されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句だけは、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３に記載されているように、それぞれ、制限または半ば制限された移行句であるものとする。

【0089】

数値に先行する「約（ａｂｏｕｔ）」及び「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。

【0090】

値の範囲が提供される場合は、その範囲の上限と下限との間の各々の値は、本明細書において具体的に企図及び記載される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】