知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-19
(54)【発明の名称】治療のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221012BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20221012BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20221012BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221012BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20221012BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20221012BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20221012BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20221012BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221012BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221012BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221012BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221012BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221012BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/864 100Z
C07K7/06 ZNA
C07K19/00
A61K38/08
A61K38/16
A61P25/28
A61P25/00
A61P21/00
A61K45/00
A61K48/00
A61K35/76
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509042
(86)(22)【出願日】2020-08-12
(85)【翻訳文提出日】2022-03-30
(86)【国際出願番号】 AU2020050833
(87)【国際公開番号】W WO2021026601
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】2019902892
(32)【優先日】2019-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(31)【優先権主張番号】2020901796
(32)【優先日】2020-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514114910
【氏名又は名称】マッコーリー ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】特許業務法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イットナー，ラルス
(72)【発明者】
【氏名】ケー，ヤジ ダイアナ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA13
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084BA44
4C084DC50
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA151
4C084ZA941
4C084ZC411
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA15
4C087ZA94
4C087ZC41
4H045BA16
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA33
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書に提供されるのは、TDP-43病理に関連する神経変性疾患を治療もしくは予防する、またはその少なくとも1つの症状を改善する方法であって、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなり、随意により、タンパク質不安定化ドメイン配列に連結されたペプチド、または前記ペプチドをコードする核酸分子の有効量を、対象に投与することを含む方法である。また、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチド、該ペプチドをタンパク質不安定化ドメイン配列に連結してなるキメラ分子、および該ペプチドまたはキメラ分子をコードするポリヌクレオチドも提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
TDP-43病理に関連する神経変性疾患を治療もしくは予防する、またはその少なくとも1つの症状を改善するための方法: 当該方法は、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むか、あるいはそれらからなるペプチド、または前記ペプチドをコードする核酸分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【請求項2】
神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)および前頭側頭型認知症(frontotemporal dementia, FTD)から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも1つの症状が、脱抑制、活動亢進、運動障害または筋力低下を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
配列番号1のアミノ酸配列が、より大きな連続したペプチドまたはポリペプチド配列内に提供される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
配列番号1のペプチドまたはその保存的変異体をコードする核酸分子が、配列番号4のヌクレオチド配列または配列番号4の配列と少なくとも約70%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ペプチドまたはポリペプチド配列が、配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むか、またはそれらからなる、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むか、またはそれらからなる、ペプチドまたはポリペプチド配列をコードする核酸分子の投与を含む、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
配列番号2のペプチド、その保存的変異体またはそれと少なくとも約75%同一の配列をコードする核酸分子が、配列番号5のヌクレオチド配列または配列番号5の配列と少なくとも約70%同一のヌクレオチド配列を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
ペプチドが、タンパク質不安定化ドメイン配列を含むか、またはそれに連結されている、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項10】
タンパク質不安定化ドメイン配列がラパマイシン結合タンパク質FKBP12を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
タンパク質不安定化ドメインをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、配列番号1の配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチドをコードする遺伝子構築物を、対象に投与することを含む、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
TDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善のための医薬の製造における、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むか、またはそれらからなるペプチド、または前記ペプチドをコードする核酸分子の使用。
【請求項13】
配列番号1またはその保存的変異体のアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる単離されたペプチド。
【請求項14】
配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含む、またはそれらからなる請求項13に記載のペプチド。
【請求項15】
TDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善に用いるための、請求項13または14に記載のペプチド。
【請求項16】
請求項13または14に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項17】
配列番号4もしくは配列番号5の配列、または配列番号4もしくは配列番号5の配列と少なくとも約70%同一のポリヌクレオチドを含むか、またはこれらからなる、請求項15に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
原文無し
【請求項19】
タンパク質不安定化ドメイン配列に連結された配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれからなるペプチドを含むキメラ分子。
【請求項20】
請求項19に記載のキメラ分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項21】
有効量の請求項20のキメラ分子、または前記キメラ分子をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする被験者に投与することを含む、TDP-43病理に関連する神経変性疾患を治療もしくは予防する、またはその少なくとも1つの症状を改善するための方法。
【請求項22】
請求項16、17または20に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項23】
前記ベクターがAAVベクターである、請求項22に記載のベクター。
【請求項24】
請求項22又は23に記載のベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、TDP-43病理に関連する神経変性疾患を治療又は予防する、又はその少なくとも1つの症状を改善するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、TDP-43病理を特徴とする、またはそれに関連する神経変性疾患の治療および予防のための組成物および方法に関する。本開示はまた、前記神経変性疾患を治療および予防するのに適した、単離されたペプチドおよびキメラ分子、ならびに前記ペプチドおよびキメラ分子をコードする核酸および遺伝子構築物に関する。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脳と脊髄の両方の運動ニューロンに影響を及ぼす運動ニューロン疾患である。ALSは大脳運動皮質の錐体細胞、前脊髄運動ニューロンおよび脳幹運動ニューロンの消失を特徴とする致死的な疾患であり、筋力低下および筋萎縮を引き起こす。ALSは典型的には発症後急速な悪化を示し、しばしば数年以内に死亡に至る。
【0003】
前頭側頭型認知症(FTD)は脳の前頭葉および/または側頭葉への進行性損傷を特徴とし、意思決定能力、挙動および言語の制御の進行性悪化と関連する。FTDは初老期認知症の最も一般的な形態の一つであり、診断後の平均余命の中央値は15年未満である。
【0004】
ALSとFTDは、ともに急速に進行し致命的な神経変性疾患であり、臨床的、遺伝的、病理学的に大きな重複がある。ALSおよびFTDは典型的に、家族性(症例の約10%、定義された遺伝子突然変異が1つ以上関与している)または散発性(症例の約90%、典型的には病因が十分に解明されていない)のいずれかに分類される。この疾患の家族性および散発性の形態は、臨床的に区別できない。ALSとFTDは神経病理学的にニューロンへのTDP-43の沈着を特徴とする。最新の研究は核TDP-43の細胞質への誤った局在化がTDP-43の異常なリン酸化および断片化を含む毒性有害事象を誘発することを示唆しているが(Shenoudaら、2018、Adv Neurobiol 20:239-263)、mRNAプロセシングの間にTDP-43の生理学的核細胞質シャトリングを調節し、疾患における細胞質蓄積を駆動する分子機構は未だ不明である。
【0005】
ALSまたはFTDの治療法はない。予後は不良であり、治療は限られている。これらの消耗性疾患を治療するための新しい方法の開発が明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、TDP-43の異常な細胞質局在化、ならびにALSおよびFTDの病因に寄与するTDP-43の新規な相互作用パートナーとしての14-3-3θの本発明者らの同定に基づく。本発明者らは、病理学的TDP-43が14-3-3θに由来する特異的ペプチドを使用して標的化および除去され得、ALSおよびFTDに関連する機能的欠損を逆転させることを見出した。
【0007】
本開示の第1の局面はTDP-43病理に関連する神経変性疾患の少なくとも1つの症状を治療または予防または改善するための方法を提供し、該方法は、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体、または該ペプチドをコードする核酸分子を含むかまたはそれからなるペプチドの有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【0008】
特定の実施形態では、神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)および前頭側頭型認知症(FTD)から選択される。ALSには家族性ALSと散発性ALSがある。FTDには家族性FTDと散発性FTDがある。少なくとも1つの症状は例えば、脱抑制、活動亢進、運動障害、または筋力低下を含み得る。
【0009】
配列番号1のアミノ酸配列は、より大きな近接のペプチドまたはポリペプチド配列内に提供され得る。例示的な実施形態では、ペプチド配列が配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含んでもよく、またはそれらからなってもよい。
【0010】
配列番号1のペプチドまたはその保存的変異体をコードする核酸分子は、配列番号4のヌクレオチド配列または配列番号4の配列と少なくとも約70%同一のヌクレオチド配列を含み得る。
【0011】
配列番号2のペプチド、その保存的変異体、またはそれと少なくとも約75%同一の配列をコードする核酸分子は、配列番号5のヌクレオチド配列、または配列番号5の配列と少なくとも約70%同一のヌクレオチド配列を含み得る。
【0012】
特定の実施形態において、ペプチドは、タンパク質不安定化ドメイン配列を含むか、またはそれに連結される。例示的な実施形態では、タンパク質不安定化ドメイン配列がラパマイシン結合タンパク質FKBP12を含む。
【0013】
したがって、一実施形態では、この方法がタンパク質不安定化ドメインをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された配列番号1の配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチドをコードする遺伝子構築物を被験者に投与することを含む。
【0014】
本開示の第2の態様は、TDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善のための医薬の製造における、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチド、または前記ペプチドをコードする核酸分子の使用を提供する。
【0015】
本開示の第3の局面は、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなる単離されたペプチドを提供する。
【0016】
ペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むか、またはそれらからなってもよい。
【0017】
本開示の第4の局面は、第3の局面のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0018】
ポリヌクレオチドは、配列番号4または配列番号5の配列、または配列番号4または配列番号5の配列と少なくとも約70%同一のポリヌクレオチドを含むか、またはそれらからなってもよい。
【0019】
第3および第4の局面の例示的な実施形態において、ペプチドまたはポリヌクレオチドは、TDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善において使用するためのものである。
【0020】
本開示の第5の態様は、タンパク質不安定化ドメイン配列に連結された配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチドを含むキメラ分子を提供する。
【0021】
本開示の第6の局面は、第5の局面のキメラ分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0022】
第5および第6の局面の例示的な実施形態において、キメラ分子またはポリヌクレオチドは、TDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善において使用するためのものである。
【0023】
本開示の第7の態様は、第4または第6の態様のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【0024】
ベクターはウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、AAVベクターであってもよい。典型的には、ベクターがTDP-43病理に関連する神経変性疾患の治療もしくは予防、またはその少なくとも1つの症状の改善のための、被験者への投与用である。
【0025】
ベクターはニューロンまたは脳細胞への導入のために、および、ニューロンまたは脳細胞におけるコードされたペプチドまたはキメラ分子の発現を指示するか、または促進するために設計されてもよい。
【0026】
本開示の態様および実施形態は非限定的な例としてのみ、以下の図面を参照して本明細書に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】14-3-3θはTDP-43と相互作用する。N2A細胞(A)とマウス脳(B)からの14-3-3θ/TDP-43複合体の免疫沈降(IP)。対照(ctr)IPは、非特異的結合の不在を確認した。
【図2】共発現は、その非変異型(n=3)と比較して、病原性突然変異を有するTDP-43を有する14-3-3θの有意に増強された免疫沈降(IP)を示す。*** P < 0.001; ** P < 0.01; *P < 0.05。エラーバーは標準誤差(SEM)を示す。
【図3】(A)A315T変異型TDP-43は、単独で発現すると核に局在するが(+MOCK;矢頭)、14-3-3θと一緒に発現すると、A315T-TDP-43は細胞質に共局在する(白矢頭)。(B)NLSまたはNESを欠く(Δ)TDP-43と14-3-3θの共発現は、非変異型と共発現した場合と比べて顕著に増強されたIPを示す(n=3)。****p < 0.0001; *p < 0.05。 エラーバーはSEMを示す。(C)14-3-3θの共発現により、通常核に局在するΔNES TDP-43(黒矢頭)が細胞質内に局在する(白矢頭)。比較のために、ΔNLS TDP-43の細胞質局在および非変異TDP-43の核局在は14-3-3θによって変化しなかった。
【図4】αヘリックス6(ΔF)が除去されない限り、14-3-3θのN末端およびC末端切断変異体はTDP-43で免疫沈降した。αヘリックス7-9(ΔG)の非存在下では、14-3-3θ/TDP-43免疫沈降が増強されたことに注目されたい。
【図5】14-3-3θα-ヘリックス6単独(14-3-3θ-Fx-V5)の共発現は、14-3-3θのGΔ変異体と同様にTDP-43で免疫沈降した。
【図6】14-3-3θ-Fxに対応する14-3-3アイソフォームのαヘリックス6のアラインメント。赤いボックス、14-3-3θに特有の11アミノ酸配列。
【図7】(A)海馬における14-3-3θ-V5のAAV媒介発現は、それぞれ対照(ctr)およびiTDP-43A315TマウスにおけるTDP-43の不溶性および断片化(矢頭)をもたらした。独立した実験からのTDP-43断片レベルの定量化(n=6)。***P < 0.001; *P < 0.05エラーバーは標準誤差を示す。(B)AAV-vec(ベクター)およびAAV-14-3-3θ-V5注射iTDP-43A315Tマウスの海馬CA1地域におけるhTDP-43発現ニューロンの定量。**P < 0.01. エラーバーはSEMを示す。
【図8】(A)C末端変性ドメイン(degeneration domain, DD)およびN末端V5タグ(DD-θFx)を有する14-3-3θのアミノ酸135-164は、Shield1処置で安定化されない限り、一次ニューロンで発現されると自然に分解する。(B)DD-θFxは、一次ニューロン(n=4)において、共表現されたA315T変異ヒト(h)TDP-43のレベルを減少させた。グラフ:左側の列、TDP-43;右側の列、TDP-43 + DD-θFx。**, P < 0.01. エラーバーはSEMを示す。
【図9】(A)ベクター注射されたiTDP-43A315Tマウスの皮質における主に核のhTDP-43は、DD-θFx発現ニューロンにおいて顕著に減少した。(B)出生時からDD-θFxを発現するiTDP-43A315T脳におけるTDP-43レベルの低下(n=3)。mCherryおよびV5は、AAV媒介発現を確認した。iTDP-43A315Tでは、DD-θFxが対照マウスよりも高いことに注意されたい。グラフ:左側の列、P0:iTDP-43+ vec;右側の列、P0:iTDP-43 + DD-θFx。*, P < 0.05. エラーバーはSEMを示す。
【図10】(A)ベクター処置iTDP-43A315Tマウスの脱抑制(上昇した十字迷路における開放アーム時間の増加によって反映されるように)は、DD-θFx発現で有意に減少した(n=8)。(B)ベクター処置iTDP-43A315Tマウスの増加した活性(オープンフィールドを移動したより長い間隔によって反映される)は、DD-θFx発現(n=8)で有意に減少した。(C)ベクター処置iTDP-43A315Tマウスの運動成績の低下(回転棒から落ちるまでの短時間によって反映される)は、DD-θFx発現(n=8)でctrマウスに匹敵した。(D)ベクター処理iTDP-43A315Tマウスの握力低下は、DD-θFx発現で有意に高かった(n=8)。(A)～(D):第1列、P0:ctr + vec;第2列、P0:ctr + DD-θFx;第3列、P0:iTDP-43+ vec;第4列、P0:iTDP-43 + DD-θFx。vec = ベクター。ctr =対照。***P < 0.001; ** P < 0.01; *P < 0.05; ns、有意ではない。エラーバーはSEMを示す。
【図11】(A)mCherry(n=3)と比較して、DD-θFx-V5を発現するiTDP-43A315Tマウスにおける遺伝子導入hTDP-43レベルの減少。グラフ: 左側の列、i.v.:iTDP-43 + vec、右側の列、i.v.:iTDP-43 + DD-θFx。vec = ベクター。*P < 0.05. エラーバーはSEMを示す。(B)vec-およびDD-θFx-発現マウス由来の脳の染色は、海馬(n=6)におけるhTDP-43陽性細胞数の減少を示した。グラフ: 左側の列、i.v.:iTDP-43 + vec、右側の列、i.v.:iTDP-43 + DD-θFx。vec = ベクター。**P < 0.01. エラーバーはSEMを示す。
【図12】ベクター処置iTDP-43A315Tマウスの脱抑制は、DD-θFx発現で有意に改善された(n=6)。最初の列、i.v.:ctr + vec; 2 番目の列、i.v.:ctr + DD-θFx; 3 番目の列、i.v.:iTDP-43 + vec; 4 番目の列、i.v.:iTDP-43 + DD-θFx。vec = ベクター。ctr =対照。***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05. エラーバーは標準誤差(SEM)を示す。
【図13】AAV-DD-θFxを注射したAAV-hTDPマウスおよび対照(n=10)に匹敵する、ベクター処置AAV-hTDP-43マウスにおける減少した反転ワイヤ時間(A)および対応する直線回帰勾配差(B)によって反映される、体力の漸進的減少。B: 第1列、AAV-vec+ AAV-vec;第2列、AAV-vec + AAV-DD-θFx;第3列、AAV-hTDP-43+ AAV-vec;第4列、AAV-hTDP-43 + AAV-DD-θFx。* P < 0.05, **** P < 0.0001. エラーバーはSEMを示す。
【図14】AAV-DD-θFx注射AAV-hTDP-43マウス(n=7)と比較した、AAV-ベクター処置AAV-hTDP-43マウスにおける握力の低下。第1列、AAV-hTDP-43 + AAV-vec雌マウス;第2列、AAV-hTDP-43 + AAV-DD-θFx雌マウス;第3列、AAV-hTDP-43 + AAV-vec雄マウス;第4列、AAV-hTDP-43 + AAV-DD-θFx雄マウス。* P < 0.05. エラーバーはSEMを示す。
【図15】AAV-DD-θFx注射AAV-hTDPマウス(n=3～7)に匹敵する、雌と雄のベクター処置AAV-hTDP-43マウスにおける体重減少で表される前脛骨筋(TA)の萎縮。雌および雄マウスについて:第1列、AAV-vec+ AAV-vec;第2列、AAV-vec + AAV-DD-θFx;第3列、AAV-hTDP-43+ AAV-vec;第4列、AAV-hTDP-43 + AAV-DD-θFx。* P < 0.05, *** P < 0.001. エラーバーはSEMを示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
アミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列識別番号(SEQ ID NO)によって参照される。配列は、配列表に提供される。配列番号1に示されるアミノ酸配列はヒト14-3-3θのαヘリックス6(αF)由来の11アミノ酸モチーフを表し、このモチーフをコードするDNA配列は、配列番号4に示される。配列番号2に示されるアミノ酸配列はヒト14-3-3θのαF由来の30アミノ酸領域を表し、この領域をコードするDNA配列は、配列番号5に示される。ヒト14-3-3θのアミノ酸配列を配列番号3に示す。実施例に記載される試験において使用される他のヌクレオチド配列(プライマー配列を含む)は、配列番号6～20に記載される。
【0029】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、データベース、ウェブサイト、ならびに開示全体を通して言及される他の公開された資料は特に断らない限り、その全体が参照により組み込まれる。用語の定義が複数ある場合には、本節の定義が優先される。URLや他のそのような識別子やアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し、インターネット上の特定の情報が現れてはすぐに消えることがあるが、インターネットを検索することによって同等の情報を見つけることができることが理解される。識別子への言及は、そのような情報の利用可能性および公衆への普及を証明する。
【0030】
冠詞「a」および「an」は本明細書ではその冠詞の文法オブジェクトの1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。例えば、「要素」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
【0031】
本明細書の文脈において、用語「約」は、当業者が同じ機能または結果を達成する文脈において列挙された値と同等であると考える数の範囲を指すと理解される。
【0032】
文脈上別段の要求がない限り、本明細書および後続の特許請求の範囲全体を通して、語「備える/含む」、および「備えている/含んでいる」などの変動は記載された実体(integer)またはステップまたは一群の実体(integers)またはステップを含むことを意味するものと理解されるが、他の実体(integer)またはステップまたは一群の実体(integers)またはステップを除外するものではない。
【0033】
本明細書で使用される「作動可能に結合された」という用語は一方の要素の機能が他方の要素によって制御または影響されるように、2つの要素間の配向または距離にかかわらず、2つの要素間の機能的結合を指す。例えば、プロモーターおよび核酸配列に関する作動可能な連結は、核酸配列の転写および発現がプロモーターの制御下にあるか、またはプロモーターによって駆動されることを意味する。本開示の文脈における別の例において、2つのヌクレオチド配列間の作動可能な結合は、発現されたコードされたペプチドまたはポリペプチド間の物理的結合またはカップリングをもたらし得て、それによってキメラ分子を形成する。
【0034】
用語「任意選択的に」は、本明細書では後述する特徴が存在しても存在しなくてもよいこと、または後述する事象または状況が発生しても発生しなくてもよいことを意味するために使用される。したがって、本明細書は特徴が存在する実施形態と、特徴が存在しない実施形態と、事象または状況が発生する実施形態と、存在しない実施形態とを含み、包含するものと理解される。
【0035】
「ペプチド」とは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸から構成される重合体を意味する。用語「ポリペプチド」はまた、このようなポリマーを指すために使用され、いくつかの例において、ポリペプチドはペプチドよりも長い(すなわち、より多くのアミノ酸残基から構成される)。それにもかかわらず、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【0036】
本明細書中で使用される場合、用語「治療/処置する」、「治療/処置」、「予防する」、「予防」、および文法的等価物は、記載された神経変性疾患を治療する、疾患の確立を予防する、遅らせる、もしくは遅延させる、或いはその他の方法で疾患の進行を予防する、妨げる、遅らせる、もしくは逆転させる、任意のおよびすべての使用をいう。したがって、用語「治療する」および「予防する」などは、それらの最も広い文脈において考慮されるべきである。例えば、治療は、患者が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。疾患が複数の症状を示すか、または複数の症状を特徴とする場合、治療または予防は必ずしも前記症状のすべてを改善、予防、妨害、遅延、または逆転させる必要はないが、前記症状の1つ以上を予防、妨害、遅延、または逆転させることができる。
【0037】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」はその意味の範囲内に、所望の効果を提供するための、薬剤または化合物の非毒性であるが十分な量または用量を含む。必要とされる正確な量または用量は、処置される動物種、対象の年齢、サイズ、体重および全身状態、処置される疾患または症状の重篤度、投与される特定の薬剤、ならびに投与方法などの因子に依存して、対象ごとに変化する。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかし、任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを使用して当業者によって決定され得る。
【0038】
本明細書で使用される「被験者/対象」という用語は哺乳動物を指し、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、パフォーマンスおよびショー動物(例えば、ウマ、家畜、イヌ、ネコ)、コンパニオン動物(例えば、イヌ、ネコ)および捕獲野生動物を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【0039】
TDP-43は、TARDBP遺伝子によってコードされる多機能性RNA/DNA結合タンパク質である。2つのRNA認識モチーフと、タンパク質間相互作用を媒介する大きなC末端グリシンリッチドメイン(GRD)を持っている。Gリッチドメインは、家族性ALSにおける病原性TARDBP突然変異の大多数を含む。しかし、本発明以前には、生理学および疾患におけるTDP-43相互作用の機能的役割についてはほとんど知られていなかった。
【0040】
本明細書に例示されるように、本発明者らは、タンパク質14-3-3θをTDP-43の新規相互作用パートナーとして同定した。TDP-43の病原性変異体は14-3-3θとの相互作用の増加を示し、その結果、TDP-43の細胞質蓄積、不溶性、リン酸化および断片化が生じ、疾患における病理学的変化に似ている。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、14-3-3θとの一過性相互作用が、RNAシャトリング中に細胞質に存在する間にTDP-43を安定化し得ることを示唆する。本発明者らはさらに、14-3-3θが異常なTDP-43立体配座と相互作用し、それらを病理学的変更を受けやすくすることを示唆する。
【0041】
また、本明細書中に例示されるように、本発明者らは、14-3-3θに由来する固有ペプチド配列の使用がマウスの脳からの病理学的TDP-43の除去を媒介し、ALSおよびFTD関連症状を逆転および予防することを実証する。タンパク質不安定化ドメインに結合されたこのペプチド配列の文脈において本明細書中で例示されるが、本開示はタンパク質不安定化ドメインの非存在下でのペプチドの使用を意図する。理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らはペプチドが14-3-3θとTDP-43との間の生理学的および/または病理学的相互作用を妨害し、それによって14-3-3θ/TDP-43複合体の毒性下流効果を防止することを示唆する。
【0042】
1つの局面において、本開示はTDP-43病理に関連する神経変性疾患の少なくとも1つの症状を処置または予防または改善するための方法を提供し、この方法は、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなるペプチド、または前記ペプチドをコードする核酸分子を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【0043】
本開示の実施形態は、TDP-43病理を特徴とする、またはそれ以外に関連するあらゆる神経変性疾患の治療または予防に適用可能である。典型的には、このような疾患が核TDP-43の細胞質蓄積、およびTDP-43の異常なリン酸化および断片化によって特徴付けられるか、または関連している。特定の実施形態では、疾患は筋萎縮性側索硬化症(ALS)または前頭側頭認知症(FTD)である。ALSには家族性ALSと散発性ALSがある。FTDには家族性FTDと散発性FTDがある。
【0044】
神経変性疾患の症状には、本疾患に特徴的な、または関連する行動障害および身体障害がある。したがって、本開示によれば、前記ペプチドをコードするペプチドまたは核酸分子の投与は、神経変性疾患に特徴的または関連する1つ以上の行動的または身体的欠損を改善し得る。このような行動障害および身体障害には、脱抑制、活動亢進、運動障害および筋力低下などがある。
【0045】
TDP-43の多数の病原性変異体は散発性または家族性ALSおよびFTDに関連することが知られており、例えば、A315T、N345K、M337V、G294A、A382TおよびG287S突然変異を含む。しかし、当業者は、本開示の適用範囲がこれらの突然変異の1つ以上を有する個体における神経変性疾患の治療又は予防に限定されないことを認識する。
【0046】
本開示の局面および実施形態に従って使用するためのペプチドRKQTIDNSQGA(配列番号1)は、ヒト14-3-3θ(配列番号3に記載の野生型ヒト14-3-3θのアミノ酸残基138-148に対応する)のαヘリックス6(aF)内に存在する11アミノ酸モチーフである。
【0047】
配列番号1のペプチドの保存的変異体もまた、本明細書中で意図される。保存的変異体は1つ以上の保存的アミノ酸置換を含み、これは、当業者によって十分に理解されるように、類似の特性を有する別のアミノ酸に対する1つのアミノ酸の置換または置換である。例えば、同様に中性のアミノ酸スレオニン(T)に対する中性のアミノ酸セリン(S)の置換は、保存的なアミノ酸置換である。当業者は、TDP-43相互作用に関してペプチドの機能特性を排除しない適切な保存的アミノ酸置換を決定することができる。
【0048】
従って、配列番号1のアミノ酸配列またはその保存的変異体を含むかまたはそれらからなる単離されたペプチドもまた、本明細書中に提供される。本明細書で使用する用語「単離された」、核酸分子を参照して「単離された」とは、ペプチドが由来する細胞からの細胞物質や他の汚染タンパク質を実質的に含まない(したがって、その天然の状態から変化している)こと、または化学的に合成された場合に化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない、したがって、その天然の状態から変化していることを意味する。
【0049】
配列番号1のペプチドまたはその保存的変異体は、より大きな近接のペプチドまたはポリペプチド配列内に提供することができる。配列番号1の配列を含むペプチド配列は、典型的には連続配列として、例えば、約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100残基を含む。例として、本開示に従って使用するための配列番号1のペプチドは、ヒト14-3-3θ(配列番号3)のアミノ酸135～164(配列番号2)またはその一部を含む配列、またはそれと少なくとも約75%同一の配列など、14-3-3θのαFヘリックスの配列の一部として提供することができる。例えば、配列番号1の配列を含むαFヘリックスの配列は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。
【0050】
一実施形態では、ペプチドが配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むか、またはそれらからなってもよい。配列は、配列番号2の配列と約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であり得る。従って、配列番号2のアミノ酸配列、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むかまたはそれらからなる単離されたペプチドもまた、本明細書中に提供される。
【0051】
配列番号1の配列を含むかまたはそれからなるペプチドまたはその保存的変異体は例えば、輸送、細胞認識、標的化、またはタンパク質不安定化もしくは分解のような別の機能を促進するために、1つ以上の他の部分を含み得るか、またはそれに連結され得る。例えば、ペプチドは、中枢神経系のニューロンまたは他の細胞のような1つ以上の特定のタイプへのペプチドの標的化を容易にする細胞標的化部分に連結され得るか、またはそれを含み得る。また、例として、以下にさらに記載されるように、ペプチドは安定性を破壊し、および/またはインビボでの分解を誘導するために、タンパク質不安定化または分解シグナルまたはドメインを含み得るか、またはそれに連結され得る。ペプチドは、当該分野で公知の任意の方法(任意の化学的方法または組換え方法を含む)によって、1つ以上の他の部分に連結され得、適切な場合、分子と1つ以上の他の部分(moieties)との間の共有結合および/または非共有結合の形成を生じる。当該部分は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分であり得る。したがって、本開示はさらに、異種ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に結合した配列RKQTIDNSQGA(配列番号1)またはその保存的変異体を含むキメラペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を提供する。このようなキメラペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は例えば、約15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500または2000残基またはそれ以上までの長さを有し得る。
【0052】
配列番号1のペプチドまたは保存的変異体は、さらなるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質部分のC末端またはN末端に結合され得る。成分分子は例えば、MBS、グルタルアルデヒド、EDC、またはBDBカップリングなどの標準的な化学カップリング技術を使用してコンジュゲートすることができ、または当業者に公知のペプチド合成方法または組換え方法によって連結することができる。
【0053】
本開示の特定の実施形態では、配列番号1の配列またはその保存的変異体を含むペプチドがタンパク質不安定化または分解シグナルを提供する部分に結合されるか、またはそれを含む。例示的な実施形態では、タンパク質不安定化または分解シグナルがタンパク質不安定化または分解ドメイン(便宜上、本明細書では「不安定化ドメイン」と呼ぶ)によって提供される。「不安定化ドメイン」は目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に機能的に結合された場合に、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の安定性を破壊し、場合により分解を誘導することができるタンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸配列を指す。当業者に周知の不安定化ドメインの例には、ユビキチン、PEST配列(プロリン-、グルタミン酸-、セリン-およびスレオニン-リッチ配列)、サイクリン破壊ボックス、アミノ酸の疎水性ストレッチ、およびラパマイシン結合タンパク質FKBP12(pTunerプラスミド、Clontechに見出されるような)が含まれる。適切な不安定化ドメインは、本開示のペプチド配列に組み込まれ得るか、またはリンカーを有するかまたは有さないペプチドのN末端またはC末端に抱合され得る。不安定化ドメインを含むことが所望される実施形態について、当業者は任意の適切な不安定化ドメインが使用されてもよく、本開示の適用範囲は任意の特定の不安定化ドメインへの参照によって限定されないことを理解するのであろう。
【0054】
タンパク質不安定化ドメイン配列に抱合された配列番号1のペプチドまたはその保存的変異体を含むキメラペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質もまた本明細書中に提供される。配列番号2のペプチド、その保存的変異体、またはタンパク質不安定化ドメイン配列に抱合された配列番号2の配列と少なくとも約75%同一の配列を含むキメラペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質もまた、本明細書中に提供される。
【0055】
本明細書中に開示されるペプチドおよびポリペプチドは、化学合成技術、核酸合成技術、ペプチド合成技術および/または組換え技術を含む、当該分野で公知の任意の方法を使用して産生され得る。一例において、配列番号1のペプチドのようなペプチドは、固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミド様式を用いて合成される。他の合成方法には、固相t-Boc合成および液相合成が含まれる。精製は、再結晶、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび例えばアセトニトリル/水勾配分離を使用する逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術のいずれか1つまたは組み合わせによって行うことができる。
【0056】
あるいは、ペプチドおよびポリペプチドが当該分野で周知の組換え方法を使用して産生され得る。ペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸は任意の適切な方法(例えば、RT-PCRまたは本発明のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの合成)によって得られ得る。したがって、以下にさらに記載されるように、本明細書に開示されるキメラペプチドおよびポリペプチドを含む、ペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子もまた、本明細書に提供される。本明細書中に開示されるキメラペプチドおよびポリペプチドを含む、ペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸分子を設計することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【0057】
本明細書中に開示されるペプチド配列のペプチド模倣物もまた意図され、そして本開示によって包含される。本明細書で使用する「ペプチド模倣物」という用語は、それが構造的に基づいているペプチドのTDP-43と相互作用する能力を有する、ペプチド様分子を意味する。このようなペプチド模倣物には、化学修飾ペプチド、非天然アミノ酸を含有するペプチド様分子、およびペプトイドが含まれる(例えば、Goodman and Ro、Peptidomimetics for Drug Design、"Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol。1(edMEWolff; John Wiley & Sons 1995)、pages 803-861参照)。例えば、拘束アミノ酸(constrained amino acid)(例えば、αメチル化アミノ酸、α, αジアルキルグリシン、α-、βまたはγアミノシクロアルカンカルボン酸、α,β不飽和アミノ酸、β,βジメチルまたはβメチルアミノ酸または他のアミノ酸模倣物)、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド成分(例えば、非ペプチド性3ターン模倣物、γターン模倣物、βシート構造の模倣物、またはヘリックス構造の模倣物)、またはアミド結合アイソステレ(例えば、還元アミド結合、メチレンエーテル結合、エチレン結合、チオアミド結合または他のアミドアイソステレ)を含む種々のペプチド模倣物が当技術分野で公知である。ペプチド模倣物を同定するための方法もまた、当該分野で周知であり、そして例えば、潜在的なペプチド模倣物のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを包含する。
【0058】
本開示はまた、本明細書に記載のペプチドおよびキメラペプチドをコードする単離された核酸分子、ならびに前記核酸分子が、典型的にはベクターまたは類似の遺伝子構築物の一部として、それを必要とする被験者に投与される方法を提供する。
【0059】
例えば、配列番号1のペプチドまたはその保存的変異体をコードする核酸分子は、配列番号4に示されるヌクレオチド配列、または配列番号4に示される配列と少なくともまたは約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含み得る。例えば、配列番号2のペプチド、その保存的変異体、または配列番号2の配列と少なくとも約75%の同一性を有する配列をコードする核酸分子は、配列番号5に示されるヌクレオチド配列、または配列番号5に示される配列と少なくともまたは約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含み得る。核酸分子はキメラペプチドまたはキメラポリペプチドが発現されるように、上記のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、選択されたタンパク質不安定化ドメインのヌクレオチド配列をさらに含み得る。
【0060】
本開示はまた、本明細書中に記載される1つ以上のヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。典型的には、ペプチドまたはポリペプチドの発現を可能にするためにヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結される。ベクターはエピソームベクター(すなわち、宿主細胞のゲノムに組み込まれない)であってもよく、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。ベクターは、複製コンピテントであっても、複製欠損であってもよい。例示的ベクターにはプラスミド、コスミド、およびウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルスおよび肝炎ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【0061】
本明細書中に提供されるのは、遺伝子治療における使用のための、適切なベクターにおける本明細書中に記載されるようなペプチド、ポリペプチドまたはキメラペプチドまたはキメラポリペプチドの発現のために使用され得る発現カセットまたは発現構成体を含むポリヌクレオチドである。したがって、特定の実施形態では、本開示の方法が対象のペプチド、ポリペプチド、またはキメラペプチドもしくはキメラポリペプチドがインビボで発現されるように、典型的には異種プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に開示されるペプチドおよびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、必要な対象に投与することを含む。特定の例示的な実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。本明細書中で使用される場合、用語「ウイルスベクター」は任意のウイルスに由来するベクターをいい、そして典型的には、開始点の少なくとも1つのエレメントを含み、そして組換えウイルスまたはビリオンにパッケージングされる能力を有する。ウイルスベクターはベクターが全体または一部欠失されたウイルスの野生型遺伝子を1つ以上有し得るが、ビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要な機能的隣接ITR配列を保持する。従って、ウイルスベクターは典型的にはウイルスの複製およびパッケージング(例えば、機能的ITR)のためにシスにおいて必要とされる配列を少なくとも含む。ITRは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変されてもよい。ベクターおよび/またはビリオンは、インビトロまたはインビボのいずれかで、異種配列を細胞に導入する目的のために利用され得る。
【0062】
特定の実施形態ではベクターがAAVベクター、すなわち、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12またはAAV13を含むがこれらに限定されないアデノ随伴ウイルスに由来するベクター、または例えば、中枢神経系の効率的なインビボ形質導入のために最適化されたものなどの、合成または修飾AAVカプシドタンパク質を使用するベクターである。組換えAAVベクターは、AAVゲノムをカプシド封入したAAVカプシドシェルを含む複製欠損ウイルスを記載する。典型的には、野生型AAV遺伝子の1つ以上、好ましくはrepおよび/またはcap遺伝子の全部または一部が、ゲノムから欠失されている。機能的ITR配列は、ベクターゲノムのrAAVビリオンへのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。
【0063】
AAV ITRは限定されるわけではないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13などを含むいくつかのAAV血清型のいずれからも誘導され得るか、または合成され得る。当業者は、過度の実験を行うことなく選択を行うことができる。AAV ITRは典型的には約145ヌクレオチド長であるが、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、すなわち、ヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換によって改変され得る(それらが機能的であることを条件とする)。さらに、ポリヌクレオチド中のITRは、それらが意図されるように機能する、すなわち、導入遺伝子のレスキュー、複製およびパッケージングを補助する限り、必ずしも同じである必要はなく、あるいは、同じAAV血清型または単離物に由来する必要はない。AAV ITRのヌクレオチド配列は、当該分野で周知である。
【0064】
本開示に従う使用のためのベクターはまた、転写エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含み得る。転写終結シグナルの例にはウシ成長ホルモン(BGH)ポリ(A)、SV40後期ポリ(A)、ウサギβグロビン(RBG)ポリ(A)、チミジンキナーゼ(TK)ポリ(A)配列、およびそれらの任意の変異体などのポリアデニル化シグナル配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、転写終結領域が転写後調節エレメントの下流に位置する。いくつかの実施形態では、転写終結領域がポリアデニル化シグナル配列である。
【0065】
本開示に従う使用のためのベクターはまた、種々の転写後調節エレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、転写後調節エレメントは、ウイルス転写後調節エレメントであり得る。ウイルス転写後調節エレメントの非限定的な例には、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、B型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HBVPRE)、RNA輸送エレメント、およびそれらの任意の変異体が含まれる。
【0066】
本開示は任意の適切な手段による、そして典型的には医薬組成物の形態での、治療を必要とする被験者へのペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターの送達を意図し、この組成物は、1つ以上の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤を含み得る。このような組成物は非経口(例えば、腹腔内、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内)、経口(舌下を含む)、経鼻または局所経路などの任意の便利なまたは適切な経路で投与され得る。適切な濃度の分子が処置されるべき身体中の部位に直接送達されることが必要とされる状況において、投与は、全身性ではなく、局所的であり得る。局所投与は非常に高い局所濃度の分子を必要な部位に送達する能力を提供し、したがって、ベクターおよび分子への身体の他の器官の曝露を回避し、それによって副作用を潜在的に減少させながら、所望の治療または予防効果を達成するのに適している。
【0067】
任意の特定の被験体についての本発明の組成物の特定の用量レベルは、例えば、使用される特定の薬剤の活性、治療される個体の年齢、体重、一般的な健康および食事、投与時間、排泄速度、ならびに任意の他の治療または療法との組み合わせを含む種々の因子に依存することが理解される。単回または複数回の投与を実施することができ、用量レベルおよびパターンは、治療する医師によって選択される。広範囲の用量を適用することができる。患者を考慮すると、例えば、約0.1mg～約1mgの薬剤が、体重1kg/日当たり投与され得る。用量・用法は、最適の治療応答を提供するために調節してよい。例えば、いくつかの分割された用量は、毎日、毎週、毎月、または他の適切な時間隔で投与され得るか、または用量は状況の緊急性によって示されるように、比例的に減少され得る。
【0068】
薬学的に許容される担体または希釈剤の例は、脱塩水または蒸留水; 生理食塩液; ラッカセイ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油又はヤシ油のような植物性油; ポリシロキサン、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、およびメチルフェニルポリソロキサンを含むシリコーン油; 揮発性シリコーン; 流動パラフィン、軟質パラフィン又はスクワランのような鉱油; メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体; 低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール; 低級アラルカノール(aralkanols); 低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコールまたはグリセリン; パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチルのような脂肪酸エステル; ポリビニルピリドン; アガー; カラゲナン; トラガントゴム、アラビアゴム、及び石油ゼリーである。典型的には、単数または複数の担体は組成物の10～99.9重量%を形成する。
【0069】
本発明は、本明細書中に記載されるペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターが所望の治療または予防結果を促進し得る他の適切な薬剤と共投与される、併用療法を意図する。「共投与される」とは、同じ製剤または同じもしくは異なる経路を介する2つの異なる製剤における同時投与、または同じもしくは異なる経路による逐次投与を意味する。「逐次」投与とは、薬剤の投与の間の秒、分、時間または日からの時間差を意味する。投与は、任意の順序であり得る。
【0070】
本明細書における先行公開物(またはそこから派生した情報)または既知の事項への言及は、先行公開物(またはそこから派生した情報)または既知の事項が本明細書に関連する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成することの承認または自認、またはいかなる形の示唆ともみなされず、またみなされるべきものでもない。
【0071】
ここで、本開示は以下の特定の実施例を参照して記載されるが、それらは本開示の範囲をいかなる形でも限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0072】
以下の実施例は本開示を例示するものであり、本明細書全体にわたる本説明の開示の一般的な性質をいかなる形でも限定するものとして解釈されるべきではない。
【0073】
一般的な方法
【0074】
細菌two-hybridスクリーニング。BacterioMatch IIツーハイブリッドシステムを、製造者の指示(Chem-Agilent)に従って実施した。簡潔には、ヒトTDP-43のカルボキシル末端部分(UniProt受託番号Q13148のヒトTDP-43配列のアミノ酸259～415に対応する)をpBT(ベイト)ベクターにクローニングし、ヒト脳cDNA pTRGプラスミドライブラリーから相互作用パートナーを同定するために使用した。タンパク質-タンパク質相互作用パートナーの検出はHIS3レポーター遺伝子の転写活性化に基づいて行い、陽性は二次ストレプトマイシン耐性レポーターによりさらに検証した。全ての増殖および形質転換は、キット内に提供された化学的にコンピテントな細胞を用いて行った。コロニーを、2% TTC/PBS(Sigma)を含む増殖板を37℃で10分間インキュベートすることによって、画像について可視化した。
【0075】
クローニング。点突然変異および切断変異体を、標準的な部位特異的突然変異誘発によって作製した(Ittner et al、2005、生物化学 44: 5749-5754)。14-3-3θのノックダウンは、配列CCGGCAGTTGCTTAGAGACAACCTACTCGAGTAGTTGTCTAAGCAACTGTTTTTG(SEQ ID NO:6)の14-3-3θ MISSION shRNAレンチウイルス(Sigma-Aldich)を用いて実施された。SH-SY5Y 細胞における 14-3-3θ (C-terminal V5-tag) の安定的な過剰発現は、レンチウイルス (クローニングベクター pLenti6/Ubc; Life Technologies) を用いて達成された。すべての14-3-3アイソフォームをpcDNA3.1/myc(Life Technologies)にC末端mycタグでクローニングし、TDP-43野生型/変異体をC末端V5タグでpcDNA3.1/V5(Life Technologies)にクローニングして免疫沈降を行った。
【0076】
アデノ随伴ウイルス。14-3-3θ(V5-tagged)を、プラスミドpAAV-hSyn-EGFP(Addgene、#50465)をバックボーンとして用い、EGFPを除去した上で、ヒトシナプシンプロモーター下のrAAVベクターにクローン化した。mCherry発現のための同じベクターまたは変異体を対照として使用した。rAAV9ベクターのパッケージングを、キャプシドAAV9.PHP.B(Devermanら、2016、Nat Biotechnol 34:204～209)を用いて以前に記載されたように行った(Biら、2017、Nat Commun 8: 473)。2μlのrAAV(1×1013ウイルスゲノム/ml)を、3ヶ月齢の野生型またはiTDP-43A315Tマウス(Keら、2015、Acta Neuropathol 130:661～678)の海馬(-1.94mm AP、1.6mmML、λ由来の1.8mm DV)に注入した。脊髄注射のために、1 ulのrAAV(1×1013ウイルスゲノム/ml)を、凍結麻酔した新生仔の脊髄に直接的に注射した(P0-2)。すべての動物実験は、Macquarie University Animal Ethics Committeeによって承認されている。
【0077】
免疫沈降。免疫沈降は以前に記載されたように行った(Ittnerら、2009, J Biol Chem 284: 20909-20916)。簡単に言うと、293T HEK細胞は、pcDNA3.1/V5中のTDP-43のバリアントおよび/または14-3-3アイソフォーム/バリアントと共トランスフェクションされた。細胞をRIPA緩衝液中で溶解した。等量のタンパク質を1 ulのV5抗体(Life Technologies)と共に一晩インキュベートし、磁気プロテインGビーズ(Life Technologies)を用いて沈殿させた。共免疫沈殿は、マイヤニック体を用いたウエスタンブロットによってさらに確認された。
【0078】
ウエスタンブロット法。ウェスタンブロッティングは以前に記載されたように行った(Keら、2012、PLoS One 7: e35678)。イムノブロッティングに用いた一次抗体は、ヒトTDP-43、c末端TDP-43、pan-TDP-43(Proteintech)、14-3-3θ(Abcam)、V5、myc(Life Technologies)、phospho-TDP-43 S409/410(Cosmobio)、GAPDH(Merck-Millipore)であった。
【0079】
細胞培養および染色。全ての免疫沈降実験は、293T HEK細胞中で行った。細胞を、標準的なプロトコールに従って、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むDMEM中で維持した。SH-SY5Y細胞を、10% FBSを含有するDMEM/F-12中で維持し、14-3-3θ過剰発現またはノックダウンのために使用した。レンチウイルス形質導入により14-3-3θの安定した過剰発現とノックダウンが達成された。免疫細胞化学のために、細胞を4% PFA中で固定し、3%熱不活化ヤギ血清/2% BSAでブロックした。抗体、V5(Sigma)、myc(Life Technologies)および二次Alexa Fluor 488、555(Life Technologies)を使用した。カバーグラスをImmun-Mount(Southern Biotech)にマウントした。
【0080】
顕微鏡検査。全ての細胞培養蛍光画像を、BX51エピ蛍光または共焦点FV10i顕微鏡(Olympus)のいずれかを用いて撮影した。
【0081】
インビトロ複合体アッセイ。HEK293T細胞に全長野生型TDP-43またはF147L/ F149L二重変異を持つTDP-43(共にc末端V5タグ付き)または14-3-3θ(ポリヒスチジンタグ付き)をトランスフェクションした。TDP-43構築物でトランスフェクトした細胞を、EDTAフリー完全プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を補充した免疫沈降緩衝液(IPB)(20mMのTris-HCl(pH 7.8)、150mMの塩化ナトリウム、0.1%(v/v)のNP-40)に溶解し、V5タグTDP-43をマウス抗v5抗体(Life Technologies)でIP処理した(上記のように)。続いて、溶解物をIPBで2回、DNase/RNase緩衝液(DRB)(10mM TrisHCl(pH 7.6)、2.5mM MgCl2および0.5mM CaCl2)で2回洗浄し、DRB中で再構成した。14-3-3θ-HISトランスフェクト細胞をIPB中で溶解し、TALON樹脂(Clontech Laboratories)を介して精製した。簡単には、溶解物をTALON樹脂と共に4℃で2時間インキュベートし、IPBで3回洗浄し、インビトロ相互作用緩衝液(IVIB)(20mM Tris-HCl(pH 7.8)、0.1M塩化ナトリウム、20%(v/v)グリセリン、5mM MgCl2、5mM CaCl2、0.1%(v/v)NP-40、1mM EDTA、0.1mM DTTおよび0.2mM PMSF)で溶出した。RNAおよびDNA消化のために、結合したV5タグ化TDP-43を含有する磁気ビーズ懸濁液を、DNase、RNaseまたは緩衝液(対照)のいずれかと37℃で10分間インキュベートした。消化後、全ての反応混合物を氷冷IPBで1回洗浄し、IVIBに再懸濁した。精製したTDP-43および14-3-3θを、その後、インビトロ相互作用のために4℃で2時間インキュベートした。反応物を通常のIPに従って洗浄し、ウエスタンブロットのために4×サンプル緩衝液中で溶出した。
【0082】
定量的PCR. RNA精製および定量的PCRを、以前に記載されたように行った(Biら、2017、Nat Commun 8: 473)。簡潔には、RNAを、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して、製造業者の指示に従って、マウス皮質脳組織から抽出した。汚染ゲノムDNAを除去するために、RNaseを含まないDNase I(Qiagen)を用いてオンカラムDNA消化を行った。cDNAを、2.5μgの全RNAから、第2鎖cDNA合成キット(Invitrogen)を用いて合成した。mRNAレベルを、Fast SYBR green reaction mix(Invitrogen)および遺伝子特異的プライマー対を使用し、Mx3000リアルタイムPCRサイクラー(Stratagene)を使用して、定量的PCRによって決定した。レベルはハウスキーピング遺伝子Gapdhの倍数変化として表現し、対照組織と比較して倍数差に変換した。これらのプライマーを使用した(5'から3'):
【0083】
14-3-3θ
(F): GCTAAAACGGCTTTTGATGAGG (配列番号7);
(R): GTGCCCTGGATGCCTTTAGTT (配列番号8)
14-3-3β
(F): CTCCAGTCCTCCGCGAAAAT (配列番号9);
(R): GAGAGTTCGTGTCCCTGCTC (配列番号10)
14-3-3γ
(F): GGCGGTCTTCGGTTTCCTTC (配列番号11);
(R): GTTCAGCTCGGTCACGTTCTT (配列番号12)
14-3-3ε
(F): CGCACCCCATTCGTTTAGG (配列番号13);
(R): ATTCTGCTCTTCACCATCACC (配列番号14)
14-3-3ζ
(F): CTACGATCACGTCCAACCCG (配列番号15);
(R): GTCAAACGCTTCTGGCTGC (配列番号16)
14-3-3σ
(F): ACAACCTGACACTGTGGACG (配列番号17);
(R): CCTTTGGAGCAAGAACAGCG (配列番号18)
Gapdh
(F): GTGAAGGTCGGTGTGAAC (配列番号19);
(R): ATCTCCACTTTGCCACTGCAA (配列番号20)
(F): GCTAAAACGGCTTTTGATGAGG (配列番号7);
(R): GTGCCCTGGATGCCTTTAGTT (配列番号8)
14-3-3β
(F): CTCCAGTCCTCCGCGAAAAT (配列番号9);
(R): GAGAGTTCGTGTCCCTGCTC (配列番号10)
14-3-3γ
(F): GGCGGTCTTCGGTTTCCTTC (配列番号11);
(R): GTTCAGCTCGGTCACGTTCTT (配列番号12)
14-3-3ε
(F): CGCACCCCATTCGTTTAGG (配列番号13);
(R): ATTCTGCTCTTCACCATCACC (配列番号14)
14-3-3ζ
(F): CTACGATCACGTCCAACCCG (配列番号15);
(R): GTCAAACGCTTCTGGCTGC (配列番号16)
14-3-3σ
(F): ACAACCTGACACTGTGGACG (配列番号17);
(R): CCTTTGGAGCAAGAACAGCG (配列番号18)
Gapdh
(F): GTGAAGGTCGGTGTGAAC (配列番号19);
(R): ATCTCCACTTTGCCACTGCAA (配列番号20)
【0084】
マウスiTDP-43A315Tマウスは以前に記載されている(Keら、2015、Acta Neuropathol 130: 661-678)。中枢神経におけるドキシサイクリン制御可能(Tet-OFF)プロモーターの制御下で、これらの変異体はヒトA315T変化TDP-43を恒常的に発現した。マウスを、12時間の明/暗サイクルで、食物および水への自由なアクセスで、群飼育した。計時交配(time mated)C57Bl/6マウスをARC Perthから得た。すべての動物実験は、Macquarie University Animal Ethics Committeeによって承認されている。
【0085】
運動試験 - ワイヤ試験は以前に記載されたように行った(van Hummelら、2018、Am J Pathol 188: 1447-1456)。簡単に述べると、マウスをワイヤーメッシュ上に置き、倒置し、脱落するまでの潜時を記録した。グリップ強度は、以前に記載されたように(Am J Pathol 188、1447-1456)、グリップ強度計を用いて最大前腕強度(Chatillon、AMETEK)を測定して行った。
【0086】
免疫組織化学. 抗原回収を含むパラフィン組織切片の染色は、以前に記載されている(van Eersel et al、2015、Neuropathology and Applied Neurobiology 41: 906-925)。染色に使用した一次抗体は、ヒトTDP-43、pan-TDP-43(ProteinTech)、NeuN、mCherry、EGFP(Abcam)、V5(Sigma)に対するものであった。使用した二次抗体は、Alexa-Fluor 488、555および647(Life Technologies)に結合したものであった。
【0087】
統計学的解析. 統計分析は、GraphPad Prism 6.0を用いて行った。2群の比較にはStudentのt検定を用い、多群比較にはANOVAを用いた。
【0088】
実施例1 - TDP-43の新規相互作用パートナーの同定
【0089】
TDP-43のC末端グリシンリッチドメイン(GRD)の新規相互作用パートナーを同定するために、本発明者らは、上記のような細菌ツーハイブリッドスクリーニングを行った。同定された最良の候補(65ヒット中11ヒット)は、14-3-3足場タンパク質ファミリーのメンバーである14-3-3θ(YWHAQ遺伝子によりコードされる)であった。マウスN2a細胞およびマウス脳からの共免疫沈降により、内在性14-3-3θとTDP-43との間の相互作用が確認された(図1)。
【0090】
14-3-3θ/TDP-43相互作用が疾患関連であるかどうかを試験するために、本発明者らは、293T HEK細胞においてTDP-43変異体と共に14-3-3θを発現した。驚くべきことに、14-3-3θは、家族性ALSとFTDに関連する病原性変異体であるA315T突然変異を含む、病原性突然変異に関連するTDP-43変異体と有意に相互作用した(図2参照)。14-3-3θのTDP-43-A315Tとの共発現は顕著な細胞質共局在化をもたらした(図3A)。核局在化(NLS)および核外輸送(NES)配列は、TDP-43の優勢な核局在化を媒介する。興味深いことに、14-3-3θは、TDP-43のNES欠失(ΔNES)およびNLS欠失(ΔNLS)変異体の両方と強力な相互作用を示した(図3B)。TDP-43-ΔNLSの細胞質局在および非突然変異体TDP-43の核局在は14-3-3θによって変化しなかったが、TDP-43-ΔNESは細胞中で発現されると核に厳密に局在し、核凝集体を形成し(Winton et al、2008、J Biol Chem 283:13302-13309)、14-3-3θで同時トランスフェクトされると、ほとんどもっぱら細胞質中に見出された(図3C)。
【0091】
上記の知見は、本発明者らが病原性変異体を含むTDP-43変異体の細胞質局在化を駆動する複合体形成の増強を伴う、14-3-3θとTDP-43との間の新規な相互作用を同定したことを実証する。
【0092】
次いで、本発明者らは、共免疫沈降によってTDP-43との潜在的な相互作用について、14-3-3アイソフォームすべてを試験した。TDP-43は、14-3-3η、14-3-3γおよび14-3-3σアイソフォームと14-3-3θより強く相互作用することが示されたが、14-3-3ε、14-3-3ζおよび14-3-3βと明白な相互作用は示さなかった(データ示さず)。14-3-3σと14-3-3ζアイソフォームはニューロンには多くない。より重要なことには、野生型TDP-43と比較して、14-3-3θのみがTDP-43-A315T及び特にTDP-43-ΔNES変異体と有意に強い相互作用を示したが、他の相互作用するアイソフォームは相互作用の増強を示さなかった(実際、14-3-3σはTDP-43-ΔNESとの相互作用が少なかった)(データは示さず)。したがって、TDP-43の病原性変異体では、14-3-3θとの相互作用だけが変化したのである。
【0093】
実施例2 - TDP-43との結合を媒介する14-3-3θにおける相互作用モチーフ
【0094】
14-3-3 二量体は典型的にはリン酸化型の相互作用相手と相互作用する。しかし、対照的に、TDP-43の場合、本発明者らは、TDP-43のリン酸化模倣変異体が14-3-3θとより少なく相互作用し、非カノニカル型相互作用を支持することを見出した(データは示さず)。
【0095】
構造的には、14-3-3θは9つのαヘリックスをもっており(図4参照)、ヘリックスαC、αE、αGおよびαIが14-3-3θ二量体の標準的なパートナー結合に寄与している。TDP-43の結合を媒介する14-3-3θの相互作用モチーフを同定するために、本発明者らは14-3-3θを段階的に短縮し、この相互作用が14-3-3θの第6のαヘリックス(αF)によって媒介されることを明らかにした(図4)。
【0096】
本発明者らは14-3-3θ(配列番号2に示される30アミノ酸配列;野生型ヒトTDP-43配列のアミノ酸135-164に対応する)のαヘリックス6(αF)のみを含む構築物を作製し、この構築物を「Fx」と名付けた。Fxを発現させるとTDP-43が共沈するが(図5)、既知の14-3-3θ相互作用パートナーであるYES-associated protein(YAP)とFOXO1をプルダウンできない(データなし)ことから、さらに、14-3-3θとTDP-43との間の非カノニカル相互作用を支持された。14-3-3θのαヘリックス6(αF)は、14-3-3θの二量体の対向面に存在し、分子中央のカノニカル相互作用部位とは異なる、他の14-3-3アイソフォームにない10アミノ酸モチーフを持っており(図6)、TDP-43との従来とは異なる相互作用を説明することが可能である。
【0097】
実施例3 - in vivoにおける14-3-3θ発現の増加の効果
【0098】
インビボでの増加した14-3-3θレベルの効果を研究するために、本発明者らは、アデノ随伴ウイルス(AAV)を使用して、3ヶ月齢の非トランスジェニックマウスおよびiTDP-43A315Tマウスの海馬において14-3-3θを発現させた。ニューロン14-3-3θレベルの増加は非トランスジェニックマウスにおいて不溶性TDP-43破片の蓄積をもたらし、iTDP-43A315Tマウスにおいてより多く蓄積した(図7A)。さらに、AAV-14-3-3θ注射iTDP-43A315Tマウスは、対照と比較してhTDP-43発現海馬ニューロンの実質的な減量を示した(図7B)。従って、インビボでの14-3-3θレベルの増加は、疾患様の不溶性並びに内因性およびトランスジェニックTDP-43の断片化を引き起こし、iTDP-43A315Tマウスにおける神経病理学的表現型をさらに悪化させた。
【0099】
本発明者らはまた、ナイーブC57Bl/6マウスの脊髄における14-3-3θの長期AAV媒介過剰発現が、変化した内在性TDP-43および機能的欠損を生じるかどうかを試験した。14-3-3θ過剰発現10カ月後の脊髄の病理組織学的解析では、14-3-3θ過剰発現前角運動ニューロンにおいてTDP-43の細胞質内蓄積が認められたが、非発現またはGFP対照細胞は核内TDP-43のみを呈した(データ示さず)。このように、慢性的に増加した14-3-3θレベルは、運動ニューロンにおけるTDP-43の局在を損ない、機能的な運動障害をもたらした。
【0100】
実施例4 - 14-3-3θ-Fx標的病理学的TDP-43分解
【0101】
14-3-3θとTDP-43の間のユニークな相互作用様式と、TDP-43の異常型に対する14-3-3θの選好性から、本発明者らは14-3-3θが病的TDP-43を治療的に標的とするために使用できるかどうかを探求することにした。本発明者らは、PTunerプラスミド(Clonetech)からのC末端分解ドメイン(DD)および検出のためのN末端V5タグ(本明細書では「DD-θFx」と呼ぶ)に融合した14-3-3θ-Fx(実施例2)を含む構築物を設計した。DD-θFxは、安定化化合物Shield1の存在下でのみ一次ニューロンに蓄積することが示され、ニューロンにおける効率的なDD誘導分解を確認した(図8A)。DD-θFxとA315T変異ヒトTDP-43(hTDP-43)をニューロンで共発現させると、hTDP-43のレベルが有意に低下し、分解が誘導されたことと一致する(図8B)。さらに、iTDP-43A315Tマウスの脳におけるDD-θFxのAAV媒介発現は、遺伝子組換えhTDP-43のDD-θFxに対する相互排他的発現をもたらし(図9A)、TDP-43レベルを低下させた(図9B)。このことは、DD-θFx分解を介したトランスジェニックhTDP-43のクリアランスを示唆している。DD-θFxのターンオーバーはiTDP-43A315Tマウスよりも対照マウスで高く、おそらくiTDP-43A315TマウスにはTDP-43の凝集体が存在するためであると思われた。DD-θFx発現iTDP-43A315Tマウスの機能評価は対照ベクター注射iTDP-43A315Tマウスと比較して、脱抑制が少なく、活動亢進が少なく、運動障害が減少し、筋力が増加したことを示した(図10)。したがって、DD-θFxはニューロンにおいて病原性TDP-43の標的化分解を誘導し、iTDP-43A315Tマウスにおける欠損を予防した。
【0102】
次いで、本発明者らは神経栄養性AAV血清型であるAAV.PHP.B(Devermanら、2016、Nat Biotechnol 34:204-209)を使用し、確立された欠損を有する3ヶ月齢のiTDP-43A315Tマウスにおける中枢神経系ニューロンへのDD-θFx(または対照)の全身送達を可能にした。ウエスタンブロットにより、DD-θFx発現iTDP-43A315Tマウスにおける対照と比較したhTDP-43の減少が確認された(図11A)。これは、2週間以内に中枢神経系全体にわたって、同等かつ再現性のあるDD-θFxおよび対照ベクター発現パターンをもたらした(図11B)。重要なことに、hTDP-43発現ニューロンでは、明白な細胞消失がない状態で32.6±6.6%の減少が観察された。さらに、DD-θFxは残りのニューロンにおいてhTDP-43と共局在し、そのニューロンの多くは弱いトランスジェニックTDP-43染色のみを示した。次に、3ヶ月半齢のiTDP-43A315Tマウス(すなわち、DD-θFx AAV送達の2週間後)を機能的に評価した。この年齢で、未処置のiTDP-43A315Tマウスは重大な障害を示す(Keら、2015 Acta Neuropathol 130:661-678)。特に、DD-θFx発現は、iTDP-43A315Tマウスの脱抑制を改善した(図12)。対照ベクターの発現は、これらのタスクにおけるiTDP-43A315Tマウスの欠損に影響を及ぼさなかった。DD-θFxは、対照マウスの成績に影響を与えなかった。総合すると、ニューロンDD-θFx発現は、iTDP-43A315TマウスのTDP-43レベルを減少させ、確立された機能的欠損を改善した。このデータは、特異的な相互作用ペプチドを用いて病的なTDP-43を標的として除去できることを示唆しており、ALSやFTDを治療する新しい方法の可能性を示唆しています。
【0103】
実施例5 - DD-θFxは、マウスにおけるヒト野生型TDP-43の発現によって誘導される欠損を防止した
【0104】
次いで、本発明者らは、CNSニューロンにおける非突然変異体hTDP-43のAAV媒介発現に基づいて、散発性ALSのマウスモデルにおけるDD-θFx発現の効果を調べた。本発明者らはニューロトロピックAAV9血清型であるAAV.PHP.Bを使用し、ナイーブ新生児C57B1/6マウスにおける側頭静脈注射を介して、CNSニューロンにおける全身送達および均一発現を可能にした(Devermanら、2016、Nat Biotechnol 34:204-209)。DD-θFxの効果を、天然hTDP-43(AAV-hTDP-43)またはAAVベクター単独(AAV-ctr)のいずれかを注射したマウスにおける出生時の同時注射(AAV-DD-θFx)によって調べた。
【0105】
10週齢まで、AAV-hTDP-43およびAAV-ctrは、同等の成績を隔週に反転ワイヤ試験で示し(図13)、同等の強度を示唆した。その後、AAV-hTDP-43を投与されたマウスでは反転ワイヤ試験における成績は漸進的に低下したが、これはマウスを出生時にAAV-DD-θFxで同時処置した場合には完全に予防された(図13)。この結果は、握力の直接評価によって裏付けられ、雄のAAV-hTDP-43マウスはAAV-ctrマウスと比較して握力が有意に減少し、DD-θFxの共処理によって防止された(図14)。同様の傾向が雌マウスでも観察された。さらに、19週齢の雌および雄のAAV-hTDP-43マウスの前脛骨筋重量は、それぞれの対照と比較して有意に減少した(図15)。これらの結果は、DD-θFxがマウスにおける非変異TDP-43発現により誘導される欠損を防止することを実証する。
【符号の説明】
【0106】
[図1]
Input: インプット
N2a cells: N2a細胞
mouse brain: マウス脳
[図2]
Input: インプット
Fold of IP: IPの倍数
[図3]
Fold of IP: IPの倍数
MOCK: モック
[図4、5]
Input: インプット
[図7]
control: 対照
Extraction: 抽出
TDP-43 fragments relative to full-length: 全長と比較したTDP-43断片
neurons: ニューロン
[図8、9、11]
rel hTDP-43 levels: 相対hTDP-43レベル
[図10]
Time in Arm (s): アーム内の時間(s)
closed: 閉鎖
open: 開放
Distance Travelled (m): 移動距離(m)
Time till fall （ｓ）: 落下までの時間(s)
Peak Force (N): 最大力(N)
[図12]
neurons: ニューロン
Time in Area (s): エリア内の時間(s)
closed: 閉鎖
open: 開放
[図13]
Time on Wire （ｓ）: ワイヤ上の時間(s)
Days p.i.: 注射後日数
Linear Regression Slope (>= Day 10 p.i.): 線形回帰傾き(≧注射後10日)
[図14]
Grip Strength: 握力強度
[図15]
TA Muscle Weight (mg): TA筋肉重量
Input: インプット
N2a cells: N2a細胞
mouse brain: マウス脳
[図2]
Input: インプット
Fold of IP: IPの倍数
[図3]
Fold of IP: IPの倍数
MOCK: モック
[図4、5]
Input: インプット
[図7]
control: 対照
Extraction: 抽出
TDP-43 fragments relative to full-length: 全長と比較したTDP-43断片
neurons: ニューロン
[図8、9、11]
rel hTDP-43 levels: 相対hTDP-43レベル
[図10]
Time in Arm (s): アーム内の時間(s)
closed: 閉鎖
open: 開放
Distance Travelled (m): 移動距離(m)
Time till fall （ｓ）: 落下までの時間(s)
Peak Force (N): 最大力(N)
[図12]
neurons: ニューロン
Time in Area (s): エリア内の時間(s)
closed: 閉鎖
open: 開放
[図13]
Time on Wire （ｓ）: ワイヤ上の時間(s)
Days p.i.: 注射後日数
Linear Regression Slope (>= Day 10 p.i.): 線形回帰傾き(≧注射後10日)
[図14]
Grip Strength: 握力強度
[図15]
TA Muscle Weight (mg): TA筋肉重量
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】