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▶ ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-20
(54)【発明の名称】生体分子の検知および検出のための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221013BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20221013BHJP
G01N 27/414 20060101ALI20221013BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12M1/00 A
G01N27/414 301V
G01N27/414 301K
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509046
(86)(22)【出願日】2020-08-24
(85)【翻訳文提出日】2022-04-11
(86)【国際出願番号】 US2020047676
(87)【国際公開番号】W WO2021035221
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/890,251
(32)【優先日】2019-08-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521391748
【氏名又は名称】ユニバーサル シーケンシング テクノロジー コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100095500
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 正和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】ジャン， ペイミン
(72)【発明者】
【氏名】レイ， ミン
(72)【発明者】
【氏名】チュン， キスプ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B029BB20
4B029FA15
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ42
4B063QR06
4B063QR08
4B063QR90
4B063QS36
4B063QX05
(57)【要約】
本発明は、化学検知およびバイオセンシングのためのナノデバイスにおいてＤＮＡナノワイヤに繋がれたメタライゼーションされたポリマーまたは導電性ポリマーを使用して、導電性ナノジャンクションを作製するための方法に関する。本発明は、天然の、合成された、または改変されたもののいずれかの、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド、およびそれらのアナログなどの同定および／またはシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない、生体分子および生化学的反応を検知するためのシステム、デバイスおよび方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体ポリマーの同定、特徴付けまたはシーケンシングのためのシステムであって、前記システムは、ａ． 基材；
ｂ． 前記基材上に互いに隣接して配置された第１の電極および第２の電極によって形成されるナノギャップ；
ｃ． ナノワイヤであって、前記ナノワイヤは、前記ナノギャップに近づくように構成されかつ前記ナノワイヤの一方の末端を前記第１の電極に、および前記ナノワイヤのもう一方の末端を前記第２の電極に結合することによって、前記ナノギャップを橋渡しするように構成される寸法を有し、ここで前記ナノワイヤは、核酸二重鎖セグメントであって、少なくともメタライゼーションされたポリマーセグメントまたは少なくとも導電性ポリマーセグメントが前記核酸二重鎖セグメントの末端において隣接する核酸二重鎖セグメントを含む、ナノワイヤ；
ｄ． 前記ナノワイヤ上の前記核酸二重鎖セグメントに結合するように構成された検知分子であって、前記生体ポリマーと相互作用するかまたは前記生体ポリマーとの生化学的反応を行うように構成された、検知分子；
ｅ． 前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加されるように構成されたバイアス電圧；
ｆ． 前記検知分子の活性によって引きおこされる前記ナノワイヤを通る電流変動を記録するように構成されたデバイス；ならびに
ｇ． 前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するかまたは特徴づけるデータ分析のために構成されたソフトウェア、
を含む、システム。
【請求項2】
前記基材と前記第１の電極および前記第２の電極との間に絶縁層１をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記電極の頂部に誘電性キャップ層をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
ａ． 前記第１の電極および前記第２の電極から、絶縁層２によって分離されたゲート電極；ならびにｂ． 前記ゲート電極に印加されるように構成された基準電圧、
をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記生体ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリサッカリド、前述の生体ポリマーのうちのいずれかのアナログ、前述の生体ポリマーのうちのいずれかの天然の、改変されたもしくは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記検知分子は、天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれかの、核酸プローブ、分子ピンセット、酵素、レセプター、リガンド、抗原および抗体ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼ、前述の酵素のうちのいずれかの天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
前記ＤＮＡポリメラーゼまたは前記酵素は、□２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＸ、ＤＮＡポリメラーゼＹ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶおよびＰｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ □（アルファ）、Ｐｏｌ □（ベータ）、Ｐｏｌ □（シグマ）、Ｐｏｌ □（ラムダ）、Ｐｏｌ □（デルタ）、Ｐｏｌ □□□（エプシロン）、Ｐｏｌ μ（ミュー）、Ｐｏｌ □（イオタ）、Ｐｏｌ □（カッパ）、Ｐｏｌ □（エータ）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、レトロウイルス逆転写酵素、テロメラーゼ、前述の酵素のうちのいずれかの天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項9】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、天然の、改変された、発現されたまたは合成されたもののいずれかの、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、任意のウイルスＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、ＲＮＡポリメラーゼＶ、任意の真核生物ＲＮＡポリメラーゼ、任意の古細菌ＲＮＡポリメラーゼならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載のシステム。
【請求項10】
前記検知分子は、クリック反応を通じて所定の位置において前記ナノワイヤの前記核酸二重鎖セグメントに結合されるように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
２つの前記電極間の前記ナノギャップのサイズまたは距離は、約３ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項12】
前記ナノギャップに面する前記電極の末端表面は、約３ｎｍ～約１ｕｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲の幅、および約３ｎｍ～約１００ｎｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲の高さを有する実質的に矩形である、請求項１に記載のシステム。
【請求項13】
前記ナノギャップは、前記ナノワイヤの長さより幅広い頂部の開口部および前記ナノワイヤの長さより狭い底部の開口部を有するおおよそ逆向き台形の形状を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項14】
前記電極は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、およびイリジウム（Ｉｒ）、銅（Ｃｕ）、ルテニウム（Ｒｅ）、チタン（Ｔｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）ならびにＴｉＮおよびＴａＮのようなそれらの誘導体、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される物質から作製される、請求項１に記載のシステム。
【請求項15】
前記第１の電極および前記第２の電極は、異なる平面にあり、互いに重なって、前記絶縁層によって分離されており、ここで前記ナノギャップのサイズは、前記絶縁層のおおよその厚みによって規定される、請求項１に記載のシステム。
【請求項16】
前記核酸二重鎖セグメントは、ポリマーメタライゼーションまたは分子リソグラフィーマスキングのためのタンパク質フィラメントと適合性であるように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項17】
前記タンパク質フィラメントは、前記核酸二重鎖セグメントに対して相補的な１本鎖核酸配列または前記核酸二重鎖セグメントに対して少なくとも約５０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記核酸二重鎖セグメントは、前記核酸二重鎖セグメントの導電性を増強する改変された核酸塩基を含み、ここで前記改変された核酸塩基は、天然または非天然のいずれかである、請求項１に記載のシステム。
【請求項19】
前記核酸二重鎖セグメントは、前記検知分子の結合のための官能基を有する改変された核酸塩基を含み、ここで前記改変された核酸塩基は、天然または非天然のいずれかである、請求項１に記載のシステム。
【請求項20】
前記官能基は、アジドまたはチオール基である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項21】
前記メタライゼーションされたポリマーセグメントは、ポリマー基材上に、金属粒子をシーディングするおよび／または金属粒子を沈着させることによって作製され、ここで前記ポリマー基材は、前記核酸二重鎖セグメントの一部もしくは伸長部、または前記核酸二重鎖セグメントに繋がれたポリマーであり、ここで前記ポリマーは、導電性、半導電性、もしくは非導電性、またはこれらの組み合わせのいずれかである、請求項１に記載のシステム。
【請求項22】
前記金属粒子は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、およびイリジウム（Ｉｒ）、ならびに前記第１の電極および／または前記第２の電極と同じ金属、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項23】
前記シーディング金属粒子は、金ナノ粒子または銀ナノ粒子のいずれかを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項24】
前記メタライゼーションされたポリマーセグメントは、不動態化単層によって覆われる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項25】
前記ポリマーは、天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、部分的ＤＮＡ二重鎖、部分的ＲＮＡ二重鎖、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡナノ構造体、ペプチドナノ構造体、ＰＮＡナノ構造体、前述の生体ポリマーのうちのいずれかの一部、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項26】
前記核酸二重鎖セグメントは、天然の、非天然の、改変された、または合成されたもののいずれかの、二本鎖ＤＮＡ二重鎖、三本鎖ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡオリガミ構造体、ＤＮＡナノ構造体、ペプチドナノ構造体、ＰＮＡナノ構造体、ＤＮＡおよびＰＮＡ混合ナノ構造体、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される生体ポリマーセグメントによって置き換えられ、ここで前記生体ポリマーセグメントは、前記検知分子の結合のための官能基を有するように構成され、ポリマーメタライゼーションまたは分子リソグラフィーマスキングのためのタンパク質フィラメントと適合性である、請求項１に記載のシステム。
【請求項27】
前記導電性ポリマーセグメントは、導電性ポリマーモノマーを、酵素による、電気化学的な、または化学的な酸化結合体化、またはこれらの組み合わせを通じて、核酸足場または基材上にコーティングすることによって作製される、請求項１に記載のシステム。
【請求項28】
前記導電性ポリマーセグメントは、天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、ポリピロール（ＰＰＹ）、ポリチオフェン（ＰＴ）、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）、ポリ（ｐ－フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリ（アセチレン）（ＰＡＣ）、ポリ（ｐ－フェニレンビニレン）（ＰＰＶ）、ポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（フルオレン）、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、ポリアゼピン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項29】
前記導電性ポリマーは、前記検知分子の結合のために、前記ナノワイヤの中央部または中央部付近で一緒に繋がれた前記核酸二重鎖セグメントを有する前記ナノワイヤ全体を通って延びる、請求項１に記載のシステム。
【請求項30】
複数のナノギャップデバイスは、各々結合されたナノワイヤおよび検知分子を有する単一のナノギャップデバイスの特徴全てを有し、アレイ形式において製作されるように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項31】
前記ナノギャップデバイスの数は、ナノチップ、固体表面上にまたはウェルの中に約１０～約１０９個である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項32】
前記ナノギャップデバイスの数は、約１０４～約１０６である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項33】
生体ポリマーの同定、特徴付けまたはシーケンシングのための方法であって、前記方法は、ａ． 基材を提供する工程；
ｂ． 第１の電極および第２の電極を、前記基材上に互いに隣接して配置することによって、ナノギャップを形成する工程；
ｃ． 前記ナノギャップに匹敵する寸法を有するように構成されたナノワイヤを提供する工程であって、ここで前記ナノワイヤは、その末端において少なくともポリマーセグメントが隣接した核酸二重鎖セグメントを含み、ここで前記ポリマーセグメントは、導電性でありかつ前記核酸二重鎖セグメントに繋がれている、工程；
ｄ． 前記ナノワイヤを、一方の末端において前記第１の電極に、および他方の末端において前記第２の電極に結合させる工程；
ｅ． 検知分子を、前記核酸二重鎖セグメント上の所定の位置に結合させる工程であって、ここで前記検知分子は、前記生体ポリマーと相互作用するかまたは前記生体ポリマーとの生化学的反応を行うように構成されている、工程；
ｆ． バイアス電圧を、前記第１の電極と前記第２の電極との間に印加する工程；
ｇ． 前記検知分子の活性によって引きおこされる前記ナノワイヤを通る電流変動を記録するように構成されたデバイスを提供する工程；ならびに
ｈ． 前記生体ポリマーまたは前記生体ポリマーのサブユニットを同定するかまたは特徴づけるデータ分析のためのソフトウェアを提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項34】
前記基材と前記第１の電極および前記第２の電極との間に絶縁層１を提供する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記電極の頂部に誘電性キャップ層を提供する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
ａ． 前記第１の電極および前記第２の電極から、絶縁層２によって分離されたゲート電極を提供する工程；ならびにｂ． 基準電圧を前記ゲート電極に印加する工程、
をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項37】
前記生体ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリサッカリド、前述の生体ポリマーのうちのいずれかのアナログ、前述の生体ポリマーのうちのいずれかの天然の、改変されたもしくは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項38】
前記検知分子は、天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれかの、核酸プローブ、分子ピンセット、酵素、レセプター、リガンド、抗原および抗体ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項39】
前記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼ、前述の酵素のうちのいずれかの天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記ＤＮＡポリメラーゼまたは前記酵素は、□２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＢ６９ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＸ、ＤＮＡポリメラーゼＹ、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、Ｐｏｌ Ｖ、Ｐｏｌ □（アルファ）、Ｐｏｌ □（ベータ）、Ｐｏｌ □（シグマ）、Ｐｏｌ □（ラムダ）、Ｐｏｌ □（デルタ）、Ｐｏｌ □□□（エプシロン）、Ｐｏｌ ｍ（ミュー）、Ｐｏｌ □（イオタ）、Ｐｏｌ □（カッパ）、Ｐｏｌ □（エータ）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、レトロウイルス逆転写酵素、テロメラーゼ、前述の酵素のうちのいずれかの天然の、変異された、発現されたまたは合成されたもののいずれか、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ＲＮＡポリメラーゼは、天然の、改変された、発現されたまたは合成されたもののいずれかの、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、任意のウイルスＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、ＲＮＡポリメラーゼＶ、任意の真核生物ＲＮＡポリメラーゼ、任意の古細菌ＲＮＡポリメラーゼならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項42】
前記検知分子は、クリック反応を通じて所定の位置において前記ナノワイヤのＤＮＡ二重鎖セグメントに結合されるように構成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項43】
２つの前記電極間の前記ナノギャップのサイズまたは距離は、約３ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲にあるように構成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項44】
前記ナノギャップに面する前記電極の末端表面は、約３ｎｍ～約１ｕｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲の幅、および約３ｎｍ～約１００ｎｍ、好ましくは約５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲の高さを有する実質的に矩形である、請求項３３に記載の方法。
【請求項45】
前記ナノギャップは、前記ナノワイヤの長さより幅広い頂部の開口部および前記ナノワイヤの長さより狭い底部の開口部を有するおおよそ逆向き台形の形状を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項46】
前記電極は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、銅（Ｃｕ）、ルテニウム（Ｒｅ）、チタン（Ｔｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）ならびにＴｉＮおよびＴａＮのようなそれらの誘導体、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される物質から作製される、請求項３３に記載の方法。
【請求項47】
前記核酸二重鎖セグメントは、前記核酸二重鎖セグメントの導電性を増強する改変された核酸塩基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項48】
前記核酸二重鎖セグメントは、前記検知分子の結合のための官能基を有する改変された核酸塩基を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項49】
前記官能基は、アジドまたはチオール基である、請求項３３に記載の方法。
【請求項50】
前記ポリマーセグメントは、導電性ポリマーモノマーを、酵素による、電気化学的な、または化学的な酸化結合体化、またはこれらの組み合わせを通じて、核酸足場または基材にコーティングすることによって作製され、前記核酸足場は、１本鎖核酸配列、２本鎖核酸配列、部分的１本鎖および部分的２本鎖核酸シーケンシング、または中央部の核酸二重鎖の連続部分またはこれらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項51】
前記導電性ポリマーモノマーのコーティングは、前記ナノワイヤが前記電極に結合される前または結合された後のいずれかに作製される、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記ポリマーセグメントは、天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、ポリピロール（ＰＰＹ）、ポリチオフェン（ＰＴ）、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）、ポリ（ｐ－フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリ（アセチレン）（ＰＡＣ）、ポリ（ｐ－フェニレンビニレン）（ＰＰＶ）、ポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（フルオレン）、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、ポリアゼピン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項53】
前記ポリマーセグメントは、前記検知分子の結合のために、前記ナノワイヤの中央部または中央部付近で一緒に繋がれた前記核酸二重鎖を有する前記ナノワイヤ全体を通って延びる、請求項３３に記載の方法。
【請求項54】
工程ｄの後かつ工程ｅの前に、１） 前記核酸二重鎖セグメントまたは前記核酸二重鎖セグメント上の所定の部分と適合性であるように構成されたタンパク質フィラメントを提供する工程；
２）隣接する前記ポリマーセグメントのメタライゼーションのためのマスクとして、前記タンパク質フィラメントを前記核酸二重鎖セグメントに結合させる工程；
３） 前記基材またはテンプレートとして前記ポリマーセグメントを用いた分子リソグラフィーアプローチを使用して、前記ポリマーセグメントをメタライゼーションする工程；および
４） 前記タンパク質フィラメントを前記核酸二重鎖セグメントから除去する工程；
をさらに包含し、ここで前記ポリマーセグメントは、導電性、半導電性または非導電性のいずれかである、請求項３３に記載の方法。
【請求項55】
前記ポリマーセグメントは、前記核酸二重鎖セグメントの連続部分または伸長部である、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記タンパク質フィラメントは、前記核酸二重鎖セグメントに対して相補的な１本鎖核酸配列または前記核酸二重鎖セグメントに対して少なくとも約５０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項57】
前記ポリマーセグメントのメタライゼーションは、前記ポリマー基材上に、金属粒子をシーディングするまたは金属粒子を沈着させることによって作製される、請求項５４に記載の方法。
【請求項58】
前記金属粒子は、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、およびイリジウム（Ｉｒ）、ならびに前記第１の電極および／または前記第２の電極と同じ金属、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記シーディング金属粒子は、金ナノ粒子または銀ナノ粒子のいずれかを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項60】
前記ポリマーは、天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、部分的ＤＮＡ二重鎖、部分的ＲＮＡ二重鎖、または１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡナノ構造体、ペプチドナノ構造体、ＰＮＡナノ構造体、前述の生体ポリマーのうちのいずれかの一部、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項61】
メタライゼーションされた前記ポリマーセグメントは、不動態化単層によって覆われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項62】
前記ポリマーセグメントを、適切に設計された金属粒子シーディングによって、前記核酸二重鎖セグメントをマスクすることなくメタライゼーションする工程をさらに包含し、ここで前記ポリマーセグメントは、導電性、半導電性または非導電性のいずれかである、請求項３３に記載の方法。
【請求項63】
前記核酸二重鎖セグメントは、天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合二重鎖、二本鎖ＤＮＡ二重鎖、三本鎖ＤＮＡ二重鎖、ＤＮＡオリガミ構造体、ＤＮＡナノ構造体、ペプチドナノ構造体、ＰＮＡナノ構造体、ＤＮＡおよびＰＮＡ混合ナノ構造体、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される生体ポリマーセグメントによって置き換えられ、ここで前記生体ポリマーセグメントは、前記検知分子の結合のための官能基を含み、かつポリマーメタライゼーションまたは分子リソグラフィーマスキングのためのタンパク質フィラメントと適合性であるように構成される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２２日出願の米国仮特許出願第６２／８９０，２５１号（その開示全体が、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。
本出願は、２０１９年８月２２日出願の米国仮特許出願第６２／８９０，２５１号（その開示全体が、本明細書に参考として援用される）の優先権を主張する。
【0002】
分野
本発明は、天然の、合成された、または改変されたもののいずれかの、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド、およびそれらのアナログなどの同定および／またはシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない、生体分子および生化学的反応を検知するためのシステム、デバイスおよび方法に関する。より具体的には、本開示は、パターン化導電性ナノジャンクション（ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｎａｎｏｊｕｎｃｔｉｏｎ）が、足場またはテンプレートとしてＤＮＡを使用してナノギャップの中に作製されている実施形態を含む。
本発明は、天然の、合成された、または改変されたもののいずれかの、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカリド、およびそれらのアナログなどの同定および／またはシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない、生体分子および生化学的反応を検知するためのシステム、デバイスおよび方法に関する。より具体的には、本開示は、パターン化導電性ナノジャンクション（ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｎａｎｏｊｕｎｃｔｉｏｎ）が、足場またはテンプレートとしてＤＮＡを使用してナノギャップの中に作製されている実施形態を含む。
【背景技術】
【0003】
背景
電子ナノデバイスは、低コストでの臨床現場でのバイオセンシングに関して大きな潜在能力を有する。７ｎｍ分離能が干渉リソグラフィーによって達成された１が、産業で使用される旧来のトップダウン半導体製作プロセスは、その限界が近づきつつある。他方で、ＤＮＡは、生物学的オペレーティングシステムをÅ精度でナノエレクトロニクスへと組み込むことに関して最も有望かつ適切な物質のうちの１つである。第１に、ＤＮＡは、自己アセンブリによって二次元および三次元両方の予測可能なナノメートルサイズの構造（例えば、２Ｄ ＤＮＡアレイ、ＤＮＡ－切頭八面体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｏｃｔａｈｅｄｒｏｎ）、ＤＮＡオリガミ、および３Ｄ ＤＮＡ）を形成するようにプログラムされ得る２。加えて、精巧な核酸化学は、本発明者らがＤＮＡを調節および改変し、新たなＤＮＡベースの物質を作り出すことを可能にする。このようにして、ＤＮＡは、ナノマシンの「ボトムアップ」構築にとっての選択肢になった。
電子ナノデバイスは、低コストでの臨床現場でのバイオセンシングに関して大きな潜在能力を有する。７ｎｍ分離能が干渉リソグラフィーによって達成された１が、産業で使用される旧来のトップダウン半導体製作プロセスは、その限界が近づきつつある。他方で、ＤＮＡは、生物学的オペレーティングシステムをÅ精度でナノエレクトロニクスへと組み込むことに関して最も有望かつ適切な物質のうちの１つである。第１に、ＤＮＡは、自己アセンブリによって二次元および三次元両方の予測可能なナノメートルサイズの構造（例えば、２Ｄ ＤＮＡアレイ、ＤＮＡ－切頭八面体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｏｃｔａｈｅｄｒｏｎ）、ＤＮＡオリガミ、および３Ｄ ＤＮＡ）を形成するようにプログラムされ得る２。加えて、精巧な核酸化学は、本発明者らがＤＮＡを調節および改変し、新たなＤＮＡベースの物質を作り出すことを可能にする。このようにして、ＤＮＡは、ナノマシンの「ボトムアップ」構築にとっての選択肢になった。
【0004】
ＤＮＡ分子は、隣接する塩基対のπ軌道に縦方向に重なり合うことによって、電子を伝導し得る。長い天然のＤＮＡワイヤが、硬い基材上に沈着された場合には導電性ではなく３，４、短いＤＮＡ分子がそれらを通る電荷輸送を許容する（＜１５塩基対）５ことが観察された。概して、ＡＴ配列は、ＤＮＡにおけるそのＧＣ対応物より導電性が低い６。ＡＴ塩基対は、トンネリングバリア（ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｂａｒｒｉｅｒ）と考えられ、ＧＣ塩基対は電荷移動のホッピング部位と考えられている。水性溶液中では、ポリ（ＣＧ）ｎＤＮＡ二重鎖のコンダクタンス（Ｇ）は、それらの長さ（Ｌ）に伴って減少する８。ポリ（ＣＧ）４は、約１００ｎＳのコンダクタンスを有する（図２，ａ）が、測定可能なコンダクタンスを有するためのポリ（ＣＧ）ｎについての推定値は、１Ｖ未満のバイアスで約ｎ＝１０である（図２，ｂ）。以前の研究は、（ポリＧ－ポリＣ）３０二重鎖が、室温および５０％空気中湿度において２Ｖバイアスの下で１ｎＡ未満のコンダクタンス（約０．５ｎＳ）を有するに過ぎないことを示す（図１）７。従って、ＤＮＡは、ナノエレクトロニクスにとって必要な長さスケールの範囲にわたって十分な電導率を有しない。
【0005】
ＤＮＡナノ構造体の電導率を改善する１つの方法は、ＤＮＡに導電性物質を付加することである。電気的接続のために、上記ナノ構造体は、オーム性電導率（ｏｈｍｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）をより良好に有する。ＤＮＡのメタライゼーションは、導電性ナノワイヤを作製するために有効な方法である。金属（例えば、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、およびロジウム（Ｒｄ）など）は、メタライゼーションしたナノワイヤを形成するために、ＤＮＡ上でメッキされている９。一般に、これらのＤＮＡテンプレート化ナノワイヤは、それらの直径が、良好な電導率のために１０ｎｍより大きい。Ｂｒａｕｎおよび共同研究者らは、２本の金ナノワイヤ間の絶縁ギャップをＤＮＡ基材上に作製する、ＤＮＡ基材上にパターン化するための分子リソグラフィー技術を発明した１０。
【0006】
本発明は、ナノギャップに結合したＤＮＡヘリックスに沿って、金属ナノ粒子または導電性ポリマーモノマーの薄い層をコーティングする、あるいは導電性ポリマー（例えば、ポリアニリン）を結合体化する、あるいは両方の組み合わせによって、ＤＮＡナノナノジャンクションの電導率を増大させる手段および方法を提供する。
【0007】
前置き： 本発明は、テンプレートもしくは基材もしくは足場としてＤＮＡ二重鎖を使用して、導電性ナノワイヤを作製するまたはナノジャンクションを形成するが、本発明者らは、同じ目的のために他の物質を使用する（例えば、ＲＮＡ二重鎖、ポリペプチド鎖、ポリサッカリド鎖、または類似の生体ポリマーまたはこれらの組み合わせ（ＤＮＡ（天然または非天然のいずれでも）との組み合わせを含む）ことを排除しない。本発明の方法の原理は、ナノワイヤ／ナノジャンクション構築物質として使用されるために適切な任意の他の生体ポリマーにあてはまる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0014】
発明の要旨
本発明は、生体分子および生化学的反応を検知するためのナノギャップデバイスをアセンブリする方法を提供する。図３は、トップダウンアプローチにおいて標準的な半導体製作技術を使用して、２つのナノ電極から構成されるナノギャップを製作するスキームを示す。従って、上記ナノギャップは、高収量および低コストで製作され得る。上記ナノギャップを分子ワイヤで橋渡しするために、ボトムアップ分子リソグラフは、図４に示されるように、ナノデバイスアセンブリのプロセス全体を完了させるために適用される。
本発明は、生体分子および生化学的反応を検知するためのナノギャップデバイスをアセンブリする方法を提供する。図３は、トップダウンアプローチにおいて標準的な半導体製作技術を使用して、２つのナノ電極から構成されるナノギャップを製作するスキームを示す。従って、上記ナノギャップは、高収量および低コストで製作され得る。上記ナノギャップを分子ワイヤで橋渡しするために、ボトムアップ分子リソグラフは、図４に示されるように、ナノデバイスアセンブリのプロセス全体を完了させるために適用される。
【0015】
いくつかの実施形態において、上記ナノギャップは、２つの電極を含み、その間の距離は、３ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍ、および最も好ましくは５ｎｍ～３０ｎｍの範囲にある。上記電極の末端表面は、３ｎｍ～１μｍ、好ましくは５ｎｍ～３０ｎｍの範囲の幅、および３ｎｍ～１００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～３０ｎｍに範囲の高さを有する実質的に矩形である。上記電極は、貴金属、例えば、白金（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、パラジウム（Ｐｄ）、ロジウム（Ｒｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、または他の金属（例えば、銅（Ｃｕ）、ルテニウム（Ｒｅ）、チタン（Ｔｉ）、ニオブ（Ｎｂ）、タンタル（Ｔａ）、およびそれらの誘導体（例えば、ＴｉＮ、およびＴａＮなど））を含む。
【0016】
いくつかの実施形態において、上記ナノギャップは、絶縁層によって分離される異なる平面にある２つの電極によって形成される。図６を参照のこと（参考文献ＵＳ６２９９４７１２）。上記絶縁層の厚みは、２ｎｍ～１０００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ～３０ｎｍの範囲にある。絶縁物質は、ＳｉＮｘ、ＳｉＯｘ、ＨｆＯｘ、Ａｌ２Ｏ３、他の金属酸化物、および半導体産業で使用される任意の誘電体からなる群より選択されるが、これらに限定されない。
【0017】
いくつかの実施形態において、ナノジャンクションは、上記ナノギャップをナノワイヤで橋渡しすることによって形成され、次いで、検知分子は、所定の位置において結合される。上記ナノワイヤは、２つのメタライゼーションされたポリマーまたは導電性ポリマー結合体化ナノワイヤセグメントが隣接した半導電性ＤＮＡ二重鎖セグメントを含む。検知分子は、上記ＤＮＡ二重鎖に中央部で結合される。上記結合した検知分子および上記半導電性ＤＮＡ二重鎖は、フォースエフェクトトランジスタ（ｆｏｒｃｅ ｅｆｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）（「ＦＥＴ」という）を構成する。上記検知分子は、そのレセプターまたは基材と相互作用する場合に、そのコンホメーションを変化させる。これは、ＤＮＡに対して力を発揮し、その塩基スタッキングを妨害し、上記ナノワイヤを通って流れる電流の変動を生じる。次いで、電流シグナル（これは、分子事象への応答を表す）が記録され、分子相互作用または反応が、推測される。例えば、上記検知分子がＤＮＡポリメラーゼである場合、それは、電気的シグナルを記録することによって、ＤＮＡプライマーへとヌクレオチドを組み込むポリメラーゼのプロセスをモニターし得る。抗体が上記検知分子として使用される場合、抗原は、このナノジャンクションデバイスを利用して検出され得るか、またはその逆もまた同様である。同様に、レセプターが検知分子として使用される場合、サンプル中のそのリガンドが決定され得るか、またはその逆もまた同様である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
発明の詳細な説明
図３は、トップダウン半導体製作アプローチを使用して２０ｎｍ未満の距離が分離されている２つの電極を含むナノギャップを製作するプロセスを描写する。白金ワイヤ（１０１）は、ＥＢＬによって，窒化ケイ素絶縁層（１０２）でコーティングされたケイ素基材（１０３）上に製作され、次いで、誘電性キャップ層（１０４）が、続いて、ハードマスク（ＨＭ）層（１０５）が沈着される。ナノギャップは、フォトレジスト（１０６）上でのＥＢＬパターン形成、続いて、ＨＭ ＲＩＥ、ＣＡＰ、Ｐｔ ＲＩＥ、およびＨＭ除去によって製作される。
図３は、トップダウン半導体製作アプローチを使用して２０ｎｍ未満の距離が分離されている２つの電極を含むナノギャップを製作するプロセスを描写する。白金ワイヤ（１０１）は、ＥＢＬによって，窒化ケイ素絶縁層（１０２）でコーティングされたケイ素基材（１０３）上に製作され、次いで、誘電性キャップ層（１０４）が、続いて、ハードマスク（ＨＭ）層（１０５）が沈着される。ナノギャップは、フォトレジスト（１０６）上でのＥＢＬパターン形成、続いて、ＨＭ ＲＩＥ、ＣＡＰ、Ｐｔ ＲＩＥ、およびＨＭ除去によって製作される。
【0019】
図４は、上記ナノギャップを有するナノジャンクションのアセンブリのためのボトムアップアプローチを描写する。第１に、ＤＮＡアンカー（２０１）を、ナノギャップ（２０６）を規定する２つの電極（２０７）の側壁に結合する。次いで、ＤＮＡワイヤ（２０２）は、上記ナノギャップを橋渡しして、２つのニックを有する２本鎖ＤＮＡ（２０８）から構成されるナノジャンクションを形成するために、上記ＤＮＡアンカーにハイブリダイズされる。上記ニックは、ライゲーション反応によって閉じられ、半導電性ＤＮＡ二重鎖セグメント（２０９）を生じる。次いで、タンパク質フィラメント（２０５）を付加して、中央部セクション（２１０）をマスクし、続いて、隣接するセグメント上に金属粒子を沈着させ、半導電性セグメントの２つの末端において導電性ワイヤ（２１１）を生成する。上記タンパク質フィラメントを除去した後、上記半導電性ＤＮＡ二重鎖セグメントは、上記検知分子（例えば、酵素、ポリメラーゼ、または抗体（２１２））を結合させるために露出される。このプロセスは、生体分子検知ナノデバイスを作製する方法を提供する。
【0020】
１つの実施形態において、上記ＤＮＡアンカー２０１は、短いオリゴヌクレオチド２０１－ａおよび２０１－ｂのセットであって、それらの配列が異なる末端においてＤＮＡワイヤ２０２にマッチするオリゴヌクレオチドのセットである。プローブ（アンカー）オリゴ２０１－ａは、２０２－ａ、および２０２－ｂの一部の両方にマッチする。同じように、２０１－ｂは、２０２－ｃ、および２０２－ｄの一部の両方にマッチする。上記プローブオリゴ２０１－ａおよび２０１－ｂの配列は、同じであるかまたは異なるかのいずれかである。それらの各々が、それぞれ、ナノギャップを構成する個々の電極に結合される場合、それらは、ＤＮＡワイヤ２０２を捕捉して、ニックを含む二重鎖を形成する。ライゲーション反応の後、完全な二重鎖が形成し、そのうちの中央部は、半導電性セグメント（２０９）を含み、そのうちの残りは、導電性、半導電性または非導電性のいずれかであり得る。２０１に対する２０２のハイブリダイゼーション（捕捉）の相補的要件に起因して、ナノギャップサイズが、アセンブリされた分子ワイヤ２０９の長さにマッチすることを要求する。
【0021】
別の実施形態において、上記ＤＮＡアンカー２０１は、最初にＤＮＡワイヤ２０２に対してハイブリダイズし、ライゲーションによって満たされるニックを有するＤＮＡ二重鎖を形成し、次いで、上記２つの電極に結合して、上記ナノジャンクションを形成する。ジャンクション形成の成功率を増大させるために、上記電極の末端は、上記ＤＮＡ二重鎖の着地（ｌａｎｄｉｎｇ）および結合を促進するために、逆向き台形の幾何学的形状としてテーパー状にされ得る（図５中の図示を参照のこと（参考文献ＵＳ６２／８３３８７０））。
【0022】
ある実施形態において、上記ＤＮＡアンカーは、上記電極への結合のために構成された官能基を含む。上記官能基は、（ａ）ヌクレオシドの糖環上のチオール；（ｂ）ヌクレオシドの核酸塩基上のチオールおよびセレノール；（ｃ）ヌクレオシド上の脂肪族アミン；（ｄ）ヌクレオシド上のカテコール；（ｅ）ＲＸＨおよびＲＸＸＲ（ここでＲは脂肪族または芳香族の基であり；Ｘは、カルコゲンであり、ＳおよびＳｅが好ましい）；ならびに（ｆ）塩基をカルコゲン化したヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。これらの官能基の詳細な説明については、ＵＳ６２／８１２，７３６が参照される。
【0023】
いくつかの実施形態において、第３の電極であるゲート電極が導入され（図５を参照のこと（参考文献ＵＳ６２／８３３８７０））、上記ナノワイヤの電導率を調節するために、基準電圧が印加される。上記ゲート電極は、第２の絶縁層によって、上記第１のおよび上記第２の電極から分離される。
【0024】
別の実施形態において、上記ＤＮＡアンカー２０１および上記ＤＮＡワイヤ２０２は、上記電極に結合する前にハイブリダイズおよびライゲーションされるか、またはＤＮＡ二重鎖２０９の同じ配列を有する予めアセンブリされたＤＮＡ二重鎖によって単に置き換えられる。上記予めアセンブリされたＤＮＡ二重鎖は、上記ナノギャップにおいて２つの電極に結合され、ナノジャンクションを形成し、続いて、中央部セクションへの上記タンパク質フィラメントの結合（マスキング）、側部セクションのメタライゼーション、および最後の検知分子結合が行われる（図４を参照のこと）。繰り返すと、より良好な結合のためにテーパー状の電極末端、または予めアセンブリされたＤＮＡ二重鎖の長さより小さいかもしくはこれに等しいギャップが要求され得る。
【0025】
ある実施形態において、上記ナノワイヤは、一方の末端のみにおいてメタライゼーションまたは結合体化された導電性ポリマーセグメントが隣接する半導電性ＤＮＡ二重鎖セグメントを含む。上記検知分子は、上記半導電性ＤＮＡ二重鎖セグメント上の所定の位置に結合される。
【0026】
いくつかの実施形態において、以前の仮特許出願ＵＳ６２／７９４０９６およびＵＳ６２／８３３８７０において開示される方法を使用して構築された、予めアセンブリされたＤＮＡナノ構造体は、ＤＮＡ二重鎖２０９の代わりに使用され、上記電極に直接結合して、マスキングのためのＤＮＡ／タンパク質フィラメント２０５と適合性の中央部部分を有するナノジャンクションを形成し、続いて、バイオセンシングナノデバイス構築を完成させるために図４における残りの工程が行われる。これらの予めアセンブリされたＤＮＡナノ構造体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：天然の、非天然の、改変されたまたは合成されたもののいずれかの、単一のＤＮＡもしくはＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ＲＮＡ混合二重鎖、二本鎖ＤＮＡ二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）、三本鎖ＤＮＡ二重鎖（ｔｒｉｐｌｅ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘ）、ＤＮＡオリガミ構造体、ＤＮＡナノ構造体、ペプチドナノ構造体、ＰＮＡ（ペプチド核酸）ナノ構造体、ＤＮＡ／ＰＮＡ混合ナノ構造体またはマスキングのためのタンパク質フィラメントと適合性の中央部セクションを有する任意のＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはＰＮＡナノ構造体、あるいはこれらの組み合わせ（ここで上記中央部セクションは、高いＧＣ含有量（約５１％～９５％）を有するかまたは上記ＤＮＡ二重鎖を半導電性もしくは導電性にする改変されたＤＮＡ塩基を有するＤＮＡ二重鎖であり得る）。
【0027】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡワイヤ２０２およびＤＮＡアンカー２０１は、全長に対して相補的であり、その結果、得られるＤＮＡ二重鎖２０９は、その全長において２本鎖になっている。一方、いくつかの他の実施形態において、上記ＤＮＡワイヤ２０２は、ナノギャップサイズより短く、完全に相補的なＤＮＡアンカー２０１ではないので、両方の末端で隣接した１本鎖オリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ二重鎖（２０９）を形成する。ＤＮＡ二重鎖２０９は、全て２本鎖、または末端セグメントが１本鎖である部分的２本鎖であるかのいずれであっても、バイオセンシングナノデバイスを構築するための残りのプロセスは、図４におけるものと同じである。１本鎖または２本鎖のいずれであっても、側方（末端）セグメントのメタライゼーションプロセスは、類似である。
【0028】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ二重鎖２０９の中央部セクションは、所定のヌクレオシド（位置）において官能基を有し、この官能基は、化学反応を行って、他の実体（例えば、検知分子）をワイヤに接続し得る。
【0029】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ二重鎖（２０９）の末端セグメントは、以下に図示されるとおりの構造を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む：
ここでｎ＝３～１００であり；ＲおよびＲ’は、上記で列挙されるとおりの種々の官能基であるが、それらに限定されない。ホスフェート／ホスホロチオエート（ＰＯ／ＰＳ）キメラオリゴデオキシリボヌクレオチドは、自動化ＤＮＡ合成機において合成され得る１１。図４における上記のライゲーションは、ＲとＲ’との間の自律的化学反応、または酵素触媒性プロセスであり得る。
【化1】
【0030】
いくつかの実施形態において、上記フィラメント（２０５）は、その配列と、上記ＤＮＡワイヤ２０２の半導電性中央部セグメント（または上記ＤＮＡ二重鎖２０９の中央部セクション）の配列に対して相補的または類似の（上記核酸二重鎖セグメントに対して少なくとも約５０％配列相同性を有する）１本鎖ＤＮＡ（２０３）、およびタンパク質（例えば、単一のＤＮＡ鎖上に重合され得るＲｅｃＡタンパク質（２０４））を含む１２。上記フィラメントは、相同な２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し得、分子リソグラフィーのためのマスクとして使用され得る１０。いくつかの実施形態において、上記フィラメント２０５は、上記ＤＮＡ二重鎖の末端セグメント上の金属沈着（メッキ）のためにマスク（２１０）として上記ＤＮＡ二重鎖（２０９）の半導電性セクションに結合する。
【0031】
１つの実施形態において、ＤＮＡメタライゼーションの例として、上記金属ナノワイヤ２１１は、先ず、金属チオール共有結合を介してホスホロチオエート上に約１．０ｎｍの銀ナノ粒子をシーディングし、続いて、水で洗浄して、過剰な銀ナノ粒子を除去することによって、調製される。次いで、１：１比でＫＡｕＣｌ４（０．０６Ｍ）と混合したＫＳＣＮ（０．６Ｍ）の溶液を、ナノジャンクション領域に添加し、続いて、その金メッキ溶液と同じ容積のヒドロキノン（２５ｍＭ）を添加する。上記ナノジャンクションは、上記溶液中で６０秒間インキュベートされる。次いで、上記溶液をさっと流し、上記ナノジャンクションを水ですすぐ。結果として、金ナノワイヤが、ＤＮＡジャンクションの２つの側方セグメントにおいて形成される。次に、上記金ワイヤは、非特異的吸着を防止するために、親水性単層、例えば、オリゴ（エチレングリコール）単層を表面上に形成することによって不動態化される。上記フィラメントマスクは、プロテイナーゼＫを使用するタンパク質消化によって除去されて、上記半導電性ＤＮＡセグメントが露出される。
【0032】
いくつかの実施形態において、上記シーディングナノ粒子は、銀の代わりに金である。貴金属（上記第１の電極および／または上記第２の電極と同じかまたは異なるかのいずれでも）は、ナノ粒子指向性無電解メッキ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｌｅｓｓ ｐｌａｔｉｎｇ）によって、上記ＤＮＡナノジャンクション上に沈着される。上記貴金属としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｒｄなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0033】
いくつかの実施形態において、上記メッキプロセスは、規定された位置において異なる金属を特異的に沈着させるための電気化学的プロセスによって行われる。
【0034】
いくつかの実施形態において、上記金属は、ＤＮＡ／タンパク質フィラメントマスク２０５を使用することなく、十分に規定された金属ナノ粒子のシーディングで、ＤＮＡ二重鎖上に沈着される。
【0035】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ二重鎖２０９におけるホスホロチオエート基は、４－ブロモブチルアルデヒドと反応し、以下で示されるように、アルデヒド官能化ホスホロチオエートを生じる：
上記アルデヒドは、金属イオン溶液（例えば、ＡｇＮＯ３溶液）でのシーディングのための還元剤である。他のアルデヒドはまた、ホスホロチオエートを官能化するために使用され得、これは、以下に示されるような構造を有する：
【化2】
【化3】
【0036】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡ二重鎖２０９の末端セグメントのメタライゼーションは、導電性ポリマーを上記ＤＮＡセグメントへと一緒に繋ぐことによって置き換えられ得る。上記ＤＮＡアンカー（２０１）は、その核酸塩基に結合された導電性ポリマー（ＣＰ）のモノマー、またはより一般的にはＤＮＡ二重鎖２０９の１本鎖末端セグメントにカップリングされた導電性ポリマーモノマーを有する。上記モノマーの構造は、以下に示され、これらが挙げられるが、これらに限定されない：
これらのモノマーは、改変されたヌクレオシド（それらの核酸塩基は以下で示されるように、アミンで官能化されている）に結合され得る。
従って、これらの官能化ヌクレオシドは、自動化ＤＮＡ合成機によってＤＮＡオリゴヌクレオチドへと組み込まれ得る。ターピロール－ウリジンホスホルアミダイト（１１）を合成する例は、実施例の節に記載される。上記ホスホルアミダイト（１１）は、自動化ＤＮＡ合成機によって、例えば、ＣＸＡ ＧＸＴ ＡＸＣ ＧＸＣの配列（ここでＸ＝ターピロールモノマーを有するウリジン）を有するＤＮＡへと組み込まれる。上記ＤＮＡは、上記電極への結合のためのアンカーとして使用される。それは上記ＤＮＡワイヤとハイブリダイズして、ナノギャップにおいてナノジャンクションを形成し、それらは一緒にライゲーションされる。上記タンパク質フィラメントマスクは、半導電性セグメントに付加される。次いで、上記ターピロールモノマーが、先行技術のアプローチ１３に従って中性ｐＨの水性溶液中での電気化学的酸化によって重合される。マスクを除去した後、上記ナノジャンクションは、検知分子で官能化される準備ができている。あるいは、上記ターピロールモノマーは、タンパク質フィラメントマスク２０５を使用することなく、ＤＮＡ二重鎖２０９全体に沿って結合および重合される。
【化4】
【化5】
【0037】
いくつかの実施形態において、上記ＣＰモノマーを有するＤＮＡアンカーは、先ず、アミノ官能化ヌクレオシドを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成することによって調製され、次いで、上記ＣＰモノマーは、活性化カルボキシレートとアミンとの反応によってオリゴヌクレオチドへとカップリングされる。
【0038】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡナノジャンクションにおける導電性ポリマーは、先行技術１４，１５に示されている、化学的酸化または酵素による酸化のいずれかによって合成される。
【0039】
いくつかの他の実施形態において、上記導電性ポリマーは、末端セグメントに限定されずＤＮＡ二重鎖２０９全体にわたって繋がれ、ＤＮＡ足場に繋がれた導電性ポリマーを含むナノジャンクション全体を作製する。その一方で、いくつかの官能基（例えば、アジド、チオールおよびその誘導体）は、上記検知分子の結合のためにＤＮＡ二重鎖に沿って予め規定された位置に配置され得る。
【0040】
いくつかの実施形態において、導電性ポリマーモノマーは、タンパク質フィラメントマスクありまたはなしで、水性溶液中でＤＮＡテンプレートまたは足場に結合体化されて、導電性ナノワイヤを先ず形成し、次いで、上記ナノワイヤは、導電性ナノジャンクションを形成するようにナノギャップを橋渡しするために、上記第１のおよび上記第２の電極に結合される。
【0041】
他の実施形態において、第１に、導電性ポリマーモノマーは、タンパク質フィラメントマスクありまたはなしで、水性溶液中でＤＮＡテンプレートまたは足場上に沈着される；第２に、上記ＤＮＡテンプレートまたはナノワイヤは、上記ナノギャップを橋渡しするために、上記第１のおよび上記第２の電極に結合され、第３に、上記導電性ポリマーモノマーは、上記ナノワイヤ電導率を増強するために酸化され、よって導電性ナノジャンクションが形成される。
【0042】
いくつかの実施形態において、上記ナノワイヤまたはその下にあるＤＮＡ（ｉｔｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ ＤＮＡ）またはポリマー足場またはテンプレートは、上記第１のおよび上記第２の電極への結合のために、その末端に官能基（例えば、アジド、アルキン、またはチオール）およびその誘導体を有する。
【0043】
いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡナノワイヤ２０９は、二重鎖、または二重鎖と末端の１本鎖セグメントとの混合物である。いくつかの実施形態において、上記ＤＮＡナノワイヤ２０９は、三重鎖、または二重鎖、三重鎖、および１本鎖セグメントの混合物である。
【0044】
ある実施形態において、導電性ポリマーは、末端においてＤＮＡナノワイヤに繋がれ得、ＤＮＡ－導電性ポリマー結合体化ナノワイヤを形成する。
【0045】
ある実施形態において、メタライゼーションされたＤＮＡナノワイヤセグメントの下にある上記ＤＮＡ足場は、、メタライゼーションされ得かつ上記ＤＮＡ二重鎖ナノワイヤセグメントに繋がれ得る任意のポリマー（このポリマーは、導電性、半導電性または非導電性のいずれかであり、かつこれは天然または非天然のもののいずれかである）によって置き換えられ得る。
【0046】
上記全てにおいて、上記導電性ポリマーは、ポリピロール（ＰＰＹ）、ポリチオフェン（ＰＴ）、ポリアニリン（ＰＡＮＩ）、ポリ（ｐ－フェニレンスルフィド）（ＰＰＳ）、ポリ（アセチレン）（ＰＡＣ）、ポリ（ｐ－フェニレンビニレン）（ＰＰＶ）、ポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）（ＰＥＤＯＴ）、ポリ（フルオレン）、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、ポリアゼピンなどからなる群より選択されるが、これらに限定されない。最初３種のポリマー、ＰＰＹ、ＰＴおよびＰＡＮＩは、相対的な合成のしやすさに起因して好ましい。
【0047】
いくつかの実施形態において、上記検知分子は、天然の、変異された、発現された、または合成されたもののいずれかの、核酸プローブ、分子ピンセット、酵素、レセプター、リガンド、抗原および抗体ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択されるが、これらに限定されない。
【0048】
いくつかの実施形態において、上記検知分子は、天然の、変異された、または合成されたもののいずれかの、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡエキソヌクレアーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡプライマーゼ、リボソーム、スクラーゼ、ラクターゼなどが挙げられるが、これらに限定されない酵素である。
【0049】
いくつかの実施形態において、上記検知分子は、ポリメラーゼファミリー、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに由来する任意のポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されないＤＮＡポリメラーゼである。例えば、ファミリーＡの中のものとしては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｐｏｌ Ｉが挙げられる；ファミリーＢの中のものとしては、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＢ６９が挙げられる；ファミリーＣの中のものとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼのうちのＲＴ（逆転写酵素）ファミリーは、例えば、レトロウイルス逆転写酵素および真核生物テロメラーゼを含む。
【0050】
いくつかの他の実施形態において、上記検知分子は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）；真核生物ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、およびＲＮＡポリメラーゼ Ｖ）；および古細菌ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されないＲＮＡポリメラーゼである。
【化6】
【0051】
いくつかの実施形態において、クリック反応は、検知分子をナノジャンクション上に結合させるために使用される。例として、アセチレンを含むヌクレオシドは、本発明者らのＰＣＴ出願（ＷＯ ２０２０／１５０６９５）に開示される方法に従って、アジドで官能化した検知分子を結合させるために導電性ＤＮＡセグメントへと組み込まれる。それらの構造は、以下に示される。
【0052】
いくつかの実施形態において、複数のナノギャップデバイス（各々、結合したナノワイヤおよび検知分子を有する単一のナノギャップデバイスの特徴全てを有する）は、生体ポリマー検知またはシーケンシングのスループット要件に基づいて、ナノチップ、固体表面上もしくはウェルの中に１０～１０９、好ましくは１０３～１０７またはより好ましくは１０４～１０６のナノギャップデバイスの数でアレイフォーマットにおいて製作され得る。上記アレイ中のナノギャップデバイスは全て、１つのタイプの検知分子または異なるタイプの検知分子で構成される。
【実施例】
【0053】
実施例
エチル ２－（２，５－ジブロモ－１Ｈ－ピロール－イル）アセテート（４）を、以下に示される経路に従って合成する：
第１に、エチル ２－（１Ｈ－ピロール－イル）アセテート（３）を、改変を加えて先行技術（ＷＯ ２０１１／０９４８２３）の手順に従って合成する。適切な溶媒（例えば、水／酢酸（１：２）の共溶媒）中のグリシンエチルエステル（ｅｔｈｙｌ ｇｌｙｃｉｎａｔｅ）（１， １．０当量）および酢酸ナトリウム（１．７当量）の還流溶液に、２，５－ジメトキシテトラヒドロフラン（２， １．０当量）を添加する。上記溶液を、約４時間還流し、水で希釈し、ＮａＨＣＯ３の飽和水性溶液で中和し、ＣＨ２ＣＩ２で抽出する。その有機相を、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、ロータリエバポレーションによって濃縮する。その残渣を、シリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって分離し、所望の化合物３を収率＞５０％で得る。次に、臭素化ピロール４を、文献１６に報告される手順に従って合成する。無水ＤＭＦ中のＮ－ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ， ２．０当量）の溶液を、無水ＴＨＦ中の化合物３（１．０当量）の溶液に０℃で滴下添加した。添加した後、その混合物を３０分間撹拌する。その反応を、完了するまでＴＬＣによってモニターし、水を添加することによって停止させ、クロロホルムで３回抽出する。その合わせた有機溶液を、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、エバポレートして、溶媒を除去する。その残渣を、シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィーによって分離し、所望の生成物を収率＞９０％で得る。
エチル ２－（２，５－ジブロモ－１Ｈ－ピロール－イル）アセテート（４）を、以下に示される経路に従って合成する：
【化7】
【0054】
（１－（（２－（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）ボロン酸（６）を、文献１７に報告される手順に従って合成する。
無水ＴＨＦ中の１－（（２－（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）－１Ｈ－ピロール（５）の溶液に、－７８℃においてアルゴン下で、リチウム２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（ＬｉＴＭＰ）の溶液を滴下添加する。その溶液を、－７８℃で４時間撹拌し、続いて、ホウ酸トリエチル（（ＥｔＯ）３Ｂ）を滴下添加する。その混合物を、さらに１２時間撹拌している間に室温へと加温させる。その反応混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、４０分間撹拌する。その懸濁物を、飽和ＮａＨＣＯ３水性溶液で中和し、２０分間撹拌した。その溶液を、エーテルで３回抽出する。その合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、その溶媒をロータリーエバポレーションによって除去する。その残渣を、シリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって分離して、所望の生成物６を得る。
【化8】
【0055】
２－（１，１”－ビス（（２－（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）－１Ｈ，１’Ｈ，１”Ｈ－［２，２’：５’，２”－ターピロール］－１’－イル）酢酸（８）を、以下に示されるとおりの経路に従って合成する：
第１に、ターピロールエステルを、文献１８に報告される方法に基づいて合成する。上記ターピロールピロールボロン酸６（２．３当量）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１０ ｍｏｌ％）、炭酸ナトリウム（８当量）および塩化カリウム（３当量）を排気し、アルゴンで２回フラッシュする。次いで、脱気したトルエン（２０ｍＬ）、ジブロモピロール４（１当量）、脱気したエタノールおよび水を添加する。その混合物を、９５℃で１８時間加熱し、冷却し、その溶媒を、ロータリーエバポレーションによって除去する。その残渣をクロロホルムで３回抽出し、その合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過する。その溶媒を、ロータリーエバポレーションによって除去する。その残渣を、シリカゲル勾配カラムクロマトグラフィーによって分離して、所望のターピロールエステル７を得、これを、文献１９に報告される温和な加水分解手順に従って、その相当するカルボン酸８へと変換する。そのエステルを、２容積％の水を含むＣＨ３ＣＮ中に溶解する（１０ｍｌ／ｇのエステル）。トリエチルアミン（３当量）を添加し、続いて、ＬｉＢｒ（１０当量）を添加する。その混合物を室温で激しく撹拌し、その生成物を、シリカゲル勾配カラムクロマトグラフィーによって分離する。
【化9】
【0056】
２－（１，１”－ビス（（２－（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）－１Ｈ，１’Ｈ，１”Ｈ－［２，２’：５’，２”－ターピロール］－１’－イル）－Ｎ－（３－（デオキシウリジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）アセトアミド（１０）を、以下に示されるとおりの経路に従って合成する：
０℃においてＤＭＦ中の８（２００ｍｇ， １．０当量）の溶液に、ＨＡＴＵ（２．０当量）およびＤＩＥＡ（３．０当量）を添加し、続いて、５－（３－アミノプロパ－１－イン－１－イル）－デオキシウリジン９（１．１当量）を添加する。その得られた混合物を、ＲＴにおいて１時間撹拌し、次いで、その反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出する。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーションによって濃縮した。その残渣を、シリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって分離し、所望の生成物１０を得る。
【化10】
【0057】
５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２－（１，１”－ビス（（２－（トリメチルシリル）エトキシ）メチル）－１Ｈ，１’Ｈ，１”Ｈ－［２，２’：５’，２”－ターピロール］－１’－イル）－Ｎ－（３－（デオキシウリジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）アセトアミド－３’－Ｏ－（２－カノチル（ｃａｎｎｏｔｈｙｌ）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホルアミダイト（１１）を、以下に示される経路に従って合成する：
第１に、ピリジン（３ｍｌ）中の改変デオキシウリジン１０（１．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（１．３０ｍｍｏｌ）を添加する。その混合物を、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、少量の出発物質の存在を示した。さらなる４，４’－ジメトキシトリチルクロリドを添加して、その反応を完了させる。その混合物を水（５０ｍｌ）の中に注ぎ、塩化メチレンで抽出する（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機相を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。その生成物を、溶離液として塩化メチレン／メタノール（９５：５）の混合物を使用するシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーによって分離する。次いで、そのトリチル化生成物（０．５７ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（０．５７ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（６ｍｌ）中に溶解する。その溶液に、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソピロピルホスホロジアミダイト（０．６６ｍｍｏｌ）を添加する。その溶液を、穏やかに旋回させ、窒素下で室温において１．５時間静置させ、次いで、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。その生成物を、溶離液として酢酸エチル／トリエチルアミン（９８：２）の混合物を使用するクロマトトロン（ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ）上でのシリカゲルクロマトグラフィーによって分離した。化合物１１を、発泡した固体として得る。
【化11】
【0058】
総論：
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、それらの全体において参考として援用される。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明は、種々の実施形態の記載によって例証され、これらの実施形態は、かなり十分に記載されているが、出願の範囲を制限するか何らかの形で限定することは、出願人の意図ではない。さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、その最も広い局面にある発明は、示されて記載される、その具体的な詳細、代表的デバイス、装置および方法、ならびに例証となる例に限定されない。よって、出願人の一般的な発明の概念の趣旨からは逸脱することなく、このような詳細からの逸脱が行われ得る。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文書は、それらの全体において参考として援用される。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明は、種々の実施形態の記載によって例証され、これらの実施形態は、かなり十分に記載されているが、出願の範囲を制限するか何らかの形で限定することは、出願人の意図ではない。さらなる利点および改変は、当業者に容易に明らかである。従って、その最も広い局面にある発明は、示されて記載される、その具体的な詳細、代表的デバイス、装置および方法、ならびに例証となる例に限定されない。よって、出願人の一般的な発明の概念の趣旨からは逸脱することなく、このような詳細からの逸脱が行われ得る。
【化12】
【化13】
【化14】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】