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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-21
(54)【発明の名称】改善された単鎖可変断片のための材料及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20221014BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221014BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221014BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221014BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221014BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221014BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221014BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221014BHJP
C07K 16/42 20060101ALI20221014BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221014BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221014BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K16/42
A61K39/395 N
A61K47/68
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022507875
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-02-08
(86)【国際出願番号】 US2020046303
(87)【国際公開番号】W WO2021030657
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】62/946,877
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/946,882
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/887,524
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/946,865
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/946,897
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/887,514
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/946,886
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/887,519
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/887,529
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/887,527
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149010
【弁理士】
【氏名又は名称】星川 亮
(72)【発明者】
【氏名】ルオ，ジンチュエン
(72)【発明者】
【氏名】ブーシェ，ローレン
(72)【発明者】
【氏名】フェルトカムプ，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ディーム，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】アームストロング，アンソニー，エー．
(72)【発明者】
【氏名】テプリャコフ，アレクセイ
(72)【発明者】
【氏名】フアン，チチ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA10
4B064CA11
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C085AA14
4C085CC23
4C085EE01
4H045AA11
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
(57)【要約】
改善された単鎖可変断片のための材料及び方法が開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合、及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
【請求項2】
ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含む単離されたｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓを含むか、
ｂ）前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又は
ｃ）前記ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置に前記ＶＨ Ｃｙｓを含み、前記ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置に前記ＶＬ Ｃｙｓを含み、前記Ｌが、前記第１のＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓを含み、前記ＶＨ Ｃｙｓ及び前記第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、前記ＶＬ Ｃｙｓ及び前記第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、単離されたｓｃＦｖ。
【請求項3】
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記ＶＬ Ｃｙｓとの間の距離が、約７Å～約９Åである、請求項１又は２に記載のｓｃＦｖ。
【請求項4】
前記ＶＨ Ｃｙｓが、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項5】
前記ＶＬ Ｃｙｓが、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項6】
ａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、ｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｑ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｒ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｓ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｔ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｕ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｖ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｗ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４０にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｘ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｙ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｚ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ａａ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｂｂ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｃｃ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４３にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｄｄ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｅｅ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｆｆ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｇｇ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４２にあるか、
ｈｈ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｉｉ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、
ｊｊ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ４６にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあるか、
ｋｋ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３にあるか、
ｌｌ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ５にあるか、
ｍｍ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ３９にあるか、
ｎｎ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ４５にあるか、
ｏｏ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１００にあるか、又は
ｐｐ）前記ＶＨ ＣｙｓがＨ１０５にあり、前記ＶＬ ＣｙｓがＬ１０２にあり、残基番号付けがＣｈｏｔｈｉａに従う、請求項１～５のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項7】
前記Ｌが、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項8】
前記Ｉｇヒンジ領域が、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する、請求項７に記載のｓｃＦｖ。
【請求項9】
前記Ｉｇヒンジ領域が、前記ヒトＩｇヒンジ領域に由来する、請求項８に記載のｓｃＦｖ。
【請求項10】
前記ヒトＩｇヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項９に記載のｓｃＦｖ。
【請求項11】
前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｙは、１～３の整数である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項12】
前記Ｌが、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である、請求項１１に記載のｓｃＦｖ。
【請求項13】
前記Ｌが、前記アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項14】
前記Ｌが、約１４～約１９アミノ酸、例えば、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、又は約１９アミノ酸を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項15】
前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項16】
前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、請求項１５に記載のｓｃＦｖ。
【請求項17】
前記Ｌが、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である、請求項１６に記載のｓｃＦｖ。
【請求項18】
前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項19】
前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項20】
前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項21】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項22】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項23】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項24】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項25】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項26】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項27】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項28】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項29】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項30】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項31】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項32】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項33】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項34】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項35】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項36】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項37】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項38】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項39】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項40】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項41】
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、ａ）前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ｂ）前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
ｃ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）前記ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖ。
【請求項42】
前記Ｌが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２１～４１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項43】
前記Ｌが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項２１～４１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項44】
前記Ｌが、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２１～４１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項45】
前記ｓｃＦｖが、第２の分子に共役される、請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖ。
【請求項46】
前記第２の分子が、半減期延長部分である、請求項４５に記載のｓｃＦｖ。
【請求項47】
前記半減期延長部分が、免疫グロブリン（Ｉｇ）、前記Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、前記Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミン結合ドメイン又はポリエチレングリコールである、請求項４６に記載のｓｃＦｖ。
【請求項48】
前記第２の分子が、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識である、請求項４５に記載のｓｃＦｖ。
【請求項49】
前記第２の分子が、抗体又はその断片である、請求項４８に記載のｓｃＦｖ。
【請求項50】
前記ｓｃＦｖ及び前記抗体又は前記その断片が、異なる抗原に結合している、請求項４９に記載のｓｃＦｖ。
【請求項51】
前記第２の分子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項４５に記載のｓｃＦｖ。
【請求項52】
請求項１～５１のいずれか一項に記載のｓｃＦｖと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項53】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項54】
請求項５３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項55】
請求項５４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項56】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを産生する方法であって、前記ｓｃＦｖが産生される条件で請求項５５に記載の宿主細胞を培養することと、前記ｓｃＦｖを精製することと、を含む、方法。
【請求項57】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項59】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖに結合する、抗イディオタイプ抗体。
【請求項60】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、キット。
【請求項61】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、多重特異性分子。
【請求項62】
前記多重特異性分子が、抗体又は抗体断片を含む、請求項６１に記載の多重特異性分子。
【請求項63】
前記多重特異性タンパク質が、Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片を含む、請求項６１に記載の多重特異性分子。
【請求項64】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、Ｆｃ領域を含む、請求項６３に記載の多重特異性タンパク質。
【請求項65】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ２ドメインを含む、請求項６３に記載の多重特異性分子。
【請求項66】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＣＨ３ドメインを含む、請求項６３に記載の多重特異性分子。
【請求項67】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含む、請求項６３に記載の多重特異性分子。
【請求項68】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ヒンジの少なくとも一部分、前記ＣＨ２ドメイン及び前記ＣＨ３ドメインを含む、請求項６３に記載の多重特異性分子。
【請求項69】
前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記ヒンジと、前記ＣＨ２ドメインと、前記ＣＨ３ドメインと、を含む、請求項６３に記載の多重特異性分子。
【請求項70】
前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＮ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役される、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項71】
前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ定常領域のＣ末端又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片のＮ末端に共役される、請求項６３～６９のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項72】
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項６３～７１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項73】
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する少なくとも１つの変異を含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項74】
前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する前記少なくとも１つの変異が、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７３に記載の多重特異性分子。
【請求項75】
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の前記断片が、前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する少なくとも１つの変異を含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項76】
前記多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する前記少なくとも１つの変異が、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７５に記載の多重特異性分子。
【請求項77】
ＦｃγＲが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ若しくはＦｃγＲＩＩＩ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項78】
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記多重特異性分子の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項79】
前記多重特異性分子の前記半減期を調節する前記少なくとも１つの変異が、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項７８に記載の多重特異性分子。
【請求項80】
前記Ｉｇ定常領域又は前記Ｉｇ定常領域の断片が、前記ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項81】
前記ＣＨ３ドメインにおける前記少なくとも１つの変異が、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けが、ＥＵインデックスに従う、請求項８０に記載の多重特異性分子。
【請求項82】
前記多重特異性分子が、二重特異性である、請求項６１～８１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項83】
前記多重特異性分子が、三重特異性である、請求項６１～８１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項84】
前記多重特異性分子が、四重特異性である、請求項６１～８１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。
【請求項85】
請求項６１～８４のいずれか一項に記載の多重特異性分子及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項86】
請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖを含む、異種分子。
【請求項87】
前記ｓｃＦｖが、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識に共役される、請求項８６に記載の異種分子。
【請求項88】
前記第２のタンパク質が、抗体又はその断片である、請求項８７に記載の異種分子。
【請求項89】
前記第２のタンパク質が、代替スカフォールドである、請求項８７に記載の異種分子。
【請求項90】
前記第２のタンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はその断片である、請求項８７に記載の異種分子。
【請求項91】
前記異種分子が、単一特異性である、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の異種分子。
【請求項92】
前記異種分子が、多重特異性である、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の異種分子。
【請求項93】
前記異種分子が、二重特異性である、請求項９２に記載の異種分子。
【請求項94】
前記異種分子が、三重特異性である、請求項９２に記載の異種分子。
【請求項95】
前記異種分子が、四重特異性である、請求項９２に記載の異種分子。
【請求項96】
請求項８６～９５のいずれか一項に記載の異種分子と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項97】
安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
【請求項98】
安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
【請求項99】
安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれらを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むように前記ＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むように前記ＶＬを操作することと、
前記ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成し、前記ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、前記安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセス。
【請求項100】
前記安定化ｓｃＦｖが、請求項１～４４のいずれか一項に記載のｓｃＦｖである、請求項９７～９９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項101】
前記安定化ｓｃＦｖが、前記ジスルフィド結合を欠いている対照ｓｃＦｖと比較した場合、同等の親和性で抗原に結合する、請求項９７～１００のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項102】
安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、ａ）ＶＨ、Ｌ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｖ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にｉＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉ．前記ＶＨがＨ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉ．前記ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３でＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｖｉｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ｘｘｘｉｘ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ｘｌ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ｘｌｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ｘｌｉｉ．前記ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、前記ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従う、提供することと、
ｂ）前記Ｌが、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含むことと、
ｃ）宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現させて、前記安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセス。
【請求項103】
前記宿主細胞が、原核細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項104】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項105】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
【請求項106】
抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
【請求項107】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと、第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖ。
【請求項108】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）のための手段と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。
【請求項109】
抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子。
【請求項110】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合（ＶＬ）のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合と、を含む、多重特異性分子。
【請求項111】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結のための手段（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
【請求項112】
抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
【請求項113】
重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、前記ｓｃＦｖが、ａ）構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
ｂ）構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
ｃ）前記構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと前記第１のＬ Ｃｙｓとの間の前記第１のジスルフィド結合及び前記構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと前記第２のＬ Ｃｙｓとの間の前記第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子。
【請求項114】
請求項１０５～１１３のいずれか一項に記載のｓｃＦｖをコードするための手段。
【請求項115】
前記１１４のベクターを複製するための手段。
【請求項116】
ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む組成物。
【請求項117】
ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む組成物。
【請求項118】
前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項１１６又は１１７に記載の組成物。
【請求項119】
ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む多重特異性分子。
【請求項120】
ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む多重特異性分子。
【請求項121】
前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項１１９又は１２０に記載の多重特異性分子。
【請求項122】
ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む異種分子。
【請求項123】
ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む異種分子。
【請求項124】
前記手段が、ＶＨとＬとの間、ＶＬと前記Ｌとの間、又は前記ＶＨと前記Ｌとの間及び前記ＶＬと前記Ｌとの間にジスルフィド結合を形成することを含む、請求項１２２又は１２３に記載の異種分子。
【請求項125】
請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の組成物を産生するための手段。
【請求項126】
請求項１１９～１２１のいずれか一項に記載の多重特異性分子を産生するための手段。
【請求項127】
請求項１２２～１２４のいずれか一項に記載の異種分子を産生するための手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８９７号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８８６号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８８２号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８７７号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８６５号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２９号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２７号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２４号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５１９号、及び２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５１４号の利益を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８９７号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８８６号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８８２号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８７７号、２０１９年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／９４６，８６５号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２９号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２７号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５２４号、２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５１９号、及び２０１９年８月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８８７，５１４号の利益を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（配列表）
本出願は、２５８，７２４バイトのサイズを有する２０２０年８月５日に作成された「１４６２０－２２７－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ」という表題のテキスト形式として、本出願とともに提出された配列表を参照することによって組み込まれる。
本出願は、２５８，７２４バイトのサイズを有する２０２０年８月５日に作成された「１４６２０－２２７－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔ」という表題のテキスト形式として、本出願とともに提出された配列表を参照することによって組み込まれる。
【0003】
（発明の分野）
改善された単鎖可変断片のための材料及び方法が開示される。
改善された単鎖可変断片のための材料及び方法が開示される。
【背景技術】
【0004】
抗原結合一本鎖可変断片（single chain variable fragments、ｓｃＦｖ）は、治療薬、撮像剤、診断薬として、又は多重特異性分子などの異種分子の一部として広く利用され得るモジュールである。ｓｃＦｖの課題の１つは、低い安定性及び凝集化傾向である（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０５：９８９－１０１０；Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４７：７７３－７８９；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２１（１ Ｐｔ １）：１２７－１３０，Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２：３３１－３３２；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５－７３３）において再調査されている。
【0005】
したがって、多重特異性分子及び異種分子に任意に組み込まれ得る改善されたｓｃＦｖ設計が必要とされている。
【0006】
（概要）
一態様では、本開示は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、リンカー（Ｌ）、及び軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬＣｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
一態様では、本開示は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、リンカー（Ｌ）、及び軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬＣｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
【0007】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含む単離されたｓｃＦｖであって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、ｓｃＦｖを提供する。
【0008】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0009】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0010】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0011】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0012】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0013】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0014】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0015】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0016】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0017】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0018】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0019】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0020】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0021】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0022】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0023】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0024】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0025】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0026】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0027】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0028】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0029】
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖと、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【0030】
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖを含むポリヌクレオチドを提供する。
【0031】
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0032】
本開示はまた、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0033】
本開示はまた、ｓｐＦｖが産生される条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、ｓｐＦｖを精製することと、を含む、本開示のｓｐＦｖを産生する方法を提供する。
【0034】
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖに結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【0035】
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖを含むキットを提供する。
【0036】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
【0037】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、多重特異性分子を提供する。
【0038】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0039】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0040】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0041】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0042】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0043】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0044】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0045】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0046】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0047】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0048】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0049】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0050】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0051】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0052】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0053】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0054】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0055】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0056】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0057】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0058】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0059】
本開示はまた、本明細書で提供される多重特異性分子と、医薬的許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0060】
更に別の態様では、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
【0061】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、異種分子を提供する。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、異種分子を提供する。
【0062】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0063】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0064】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0065】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0066】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0067】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0068】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0069】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0070】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0071】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0072】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0073】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0074】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0075】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0076】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0077】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0078】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0079】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0080】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0081】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0082】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ、及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、異種分子を提供する。
【0083】
本開示はまた、本開示の異種分子と、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
【0084】
更に別の態様では、本開示は、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
抗原結合ドメインを形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0085】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0086】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれらを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成し、ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれらを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成し、ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0087】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
ＶＨ、Ｌ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従い、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供することと、
宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させて、安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセスを提供する。
ＶＨ、Ｌ及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従い、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドを提供することと、
宿主細胞内でポリヌクレオチドを発現させて、安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセスを提供する。
【0088】
更に別の態様では、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）、連結（Ｌ）のための手段及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
【0089】
本開示はまた、抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
【0090】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
【0091】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）、連結（Ｌ）、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
【0092】
本開示はまた、抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
【0093】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合（ＶＬ）のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
【0094】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）と、連結（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
【0095】
本開示はまた、抗原結合のための手段と、リンカー（Ｌ）と、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出抗原結合手段システインＣｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
【0096】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）と、リンカー（Ｌ）と、抗原結合のための手段と、を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出抗原結合手段Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
【0097】
本開示はまた、本明細書で提供されるｓｃＦｖをコードするための手段を提供する。
【0098】
本開示はまた、本明細書で提供されるベクターを複製するための手段を提供する。
【0099】
本開示はまた、ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む組成物を提供する。
【0100】
本開示はまた、ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む組成物を提供する。
【0101】
本開示はまた、ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む多重特異性分子を提供する。
【0102】
本開示はまた、ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む多重特異性分子を提供する。
【0103】
本開示はまた、ｓｃＦｖを安定化するための手段を含む異種分子を提供する。
【0104】
本開示はまた、ｓｃＦｖの熱安定性を増加させるための手段を含む異種分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】安定化ｓｃＦｖ（ｓｐＦｖ）の例示的な設計を示す。ＶＬ及びＶＨは、ステープル配列ＣＰＰＣ（配列番号１）を含む図中で破線として示される可動性リンカーによって接続され、「ＳＳ」はリンカー及びアンカーポイントのステープル配列間のジスルフィド結合を示す。
【図2】ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向におけるｓｐＦｖのアンカーポイント選択のグラフ図を示す。生殖細胞系ヒト抗体のＦｖ（ｐＭＥＳｄｂ ｉｄ ５Ｉ１９、ＧＬｋ１）を、製図及び例示的な距離測定のために使用した。破線で示される距離は、Åの残基のＣβ原子間である。所望の距離を有する構造的に保存されたフレームワーク位置を、Ｃｙｓへの変異のためのアンカーポイントとして選択した。ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向のためのアンカーポイントは、ＶＬについてのＣｈｏｔｈｉａ位置４２（図中のＫ４２）及びＶＨについての１０５位置（図中のＱ１０５）であった。Ｃ末端ＶＬ残基（Ｋ１０７）及びＮ末端ＶＨ残基（Ｑ１）も示している。
【図3】ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向におけるｓｐＦｖについてのアンカーポイント選択のグラフ図を示す。生殖細胞系ヒト抗体のＦｖ（ｐｄｂ ｉｄ ５Ｉ１９、ＧＬｋ１）を、製図及び例示的な距離測定のために使用した。破線で示される距離は、Åの残基のＣβ原子間である。所望の距離を有する構造的に保存されたフレームワーク位置を、Ｃｙｓへの変異のためのアンカーポイントとして選択した。ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向のためのアンカーポイントは、ＶＨ（図中のＫ４３）についてのＣｈｏｔｈｉａ位置４３及びＶＬについての位置１００（図中のＱ１００）であった。Ｃ末端ＶＨ残基（Ｓ１１４）及びＮ末端ＶＬ残基（Ｄ１）も示している。
【図4】マウス２重鎖ＩｇＧ２ａ（ｐｄｂ ｉｄ １ｉｇｔ）ヒンジＣＰＰＣ（配列番号１）中の２つのＣｙｓ残基間のＣβ（Ｃｙｓ１）－Ｃβ（Ｃｙｓ２）距離のグラフ図を示す。図において、距離はオングストロームで示している。
【図5】ヒトＩｇＧ（ｐｄｂ ｉｄ ５ｄｋ３）ヒンジＣＰＰＣ（配列番号１）の２つの重鎖中の２つのＣｙｓ残基間のＣβ（Ｃｙｓ１）－Ｃβ（Ｃｙｓ２）距離のグラフ図を示す。図において、距離はオングストロームで示している。
【図6】灰色で強調表示され、アミノ酸アラインメントの下で１及び２として番号付けされた選択されたＶＬアンカーポイントを示す。ＶＬ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って番号付けされる。ＶＬアンカーポイント１（Ｃｈｏｔｈｉａ位置４２）をＶＬ－リンカー－ＶＨ配向でｓｐＦｖに使用し、ＶＬアンカーポイント２（Ｃｈｏｔｈｉａ位置１００）をＶＨ－リンカー－ＶＬ配向でｓｐＦｖに使用した。ＧＬｋ１ＶＬ：配列番号５６、ＧＬｋ２ＶＬ：配列番号５７、ＣＡＴ２２００ＶＬ：配列番号５８；ＣＡＴ２２００ｂＶＬ：配列番号５９。
【図7】灰色で強調表示され、アミノ酸アラインメントの下で１及び２として番号付けされた選択されたＶＨアンカーポイントを示す。ＶＨ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って番号付けされる。ＶＨアンカーポイント１（Ｃｈｏｔｈｉａ位置１０５）をＶＬ－リンカー－ＶＨ配向でｓｐＦｖに使用し、ＶＨアンカーポイント２（Ｃｈｏｔｈｉａ位置４３）をＶＨ－リンカー－ＶＬ配向でｓｐＦｖに使用した。Ｇｌｋ１ＶＨ：配列番号６０；ＧＬｋ２ＶＨ：配列番号６１、ＣＡＴ２２００ａＶＨ：配列番号６２。
【図8】ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨの構造を示す。ＶＨ及びＶＬアンカーポイントとリンカーとの間のステープルの形成は、構造から明らかである。
【図9】ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。ＶＨ及びＶＬアンカーポイントとリンカーとの間のステープルの形成は、構造から明らかである。
【図10】ＧＬｋ２ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。ＶＨ及びＶＬアンカーポイントとリンカーとの間のステープルの形成は、構造から明らかである。
【図11】ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。ＶＨ及びＶＬアンカーポイントとリンカーとの間のステープルの形成は、構造から明らかである。
【図12】ＩＬ－１７Ａに結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（下部）と比較した非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬ（上部）の比較を示す。
【図13】ＩＬ－１７Ａに結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨ（下部）と比較した非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬ（上部）の構造の正面図の比較を示す。
【図14】ＩＬ－１７Ａに結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ（下部）と比較した非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬ（上部）の構造の背面図の比較を示す。
【図15A】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。
【図15B】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。
【図15C】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。
【図15D】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、アイソタイプ対照抗体を示す。
【図15E】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15F】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15G】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15H】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15I】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントに由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15J】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントに由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１を示す。
【図15K】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。Ｆｃ領域にタンパク質Ａ変異を含まない、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１又はＢ２１Ｍを示す。
【図15L】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。Ｆｃ領域にタンパク質Ａ変異を含まない、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＥＤＢｍＡｂ１又はＢ２１Ｍを示す。
【図15M】ステープル処理されたｓｃＦｖに融合した抗体の概略図を示す。ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するステープル処理されたｓｃＦｖに融合した２：１ヘテロ二量体、ＭＳＬＮｍＡｂ１を示す。
【図16A】２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイの結果を例証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４５６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化と、ＣＯＶＡ１４８２、それらのそれぞれの対照分子ＣＯＶＡ１４６２及びＣＯＶＡ１４８６、並びに組換えヒトＬＩＧＨＴとの比較である。
【図16B】２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイの結果を例証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４８２、並びにＬＴＢＲｍＡｂ１のより低い親和性のバリアントを含有する二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１０７及びＣＯＶＡ１４１０８、並びにＣＯＶＡ１４８６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化の比較。
【図16C】２：１の二重特異性抗体を使用したＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイの結果を例証するグラフを示す。ＣＯＶＡ１４８２及びＣＯＶＡ１４１３３（タンパク質Ａ変異を含まない構築物）、並びにそれらのそれぞれの対照分子ＣＯＶＡ１４８６及びＣＯＶＡ１４１３６によるＴＡＡ依存性ＬＴＢＲ活性化の比較。
【図17】共培養実験後のＡ３７５細胞に対するＩＣＡＭ－１の低サイトメトリー染色の結果を示す。ＣＯＶＡ１４８２及びその対照分子ＣＯＶＡ１４８６を組換えヒトＬＩＧＨＴと比較する。
【図18A】ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を例証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＲＡＮＴＥＳの濃度である。
【図18B】ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を例証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＩＬ－６の濃度である。
【図18C】ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を例証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＩＬ－８の濃度である。
【図18D】ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４４０と比較して、抗ＥＤＢ／抗ＬＴＢＲ二重特異性抗体ＣＯＶＡ１４１３３で処理した共培養物の上清中のサイトカインの測定を例証するグラフを示す。アッセイは、ＭＳＤプラットフォームを使用して行われる。ヒトＭＩＰ－３ｂの濃度である。
【図19A】Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／ＣＨＯＫ１ＭＳＬＮ又はＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／Ｈ２２６共培養細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性によるＬＴＢＲ活性化を示す。Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲの活性化である。ＣＯＶＡ１４１４６（２：１ ＭＳＬＮｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）を、ＬＩＧＨＴ及びアイソタイプ対照２：１構築物ＣＯＶＡ１４８６と比較する。
【図19B】Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／ＣＨＯＫ１ＭＳＬＮ又はＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／Ｈ２２６共培養細胞アッセイにおけるＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性によるＬＴＢＲ活性化を示す。Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーター／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲの活性化時に分泌されたＲＡＮＴＥＳの濃度である。ＣＯＶＡ１４１４６（２：１ ＭＳＬＮｍＡｂ１×ＬＴＢＲｍＡｂ１）を、ＬＩＧＨＴ及びアイソタイプ対照２：１構築物ＣＯＶＡ１４８６と比較する。
【0106】
（詳細な記述）
開示される方法は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことを理解されたい。
開示される方法は、本開示の一部を形成する、添付の図面に関連してなされる以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。開示される方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法に限定されないこと、更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を例によって説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことを理解されたい。
【0107】
本明細書に引用するすべての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。
【0108】
リストが提示される場合、特に指定しない限り、そのリストの各個々の要素及びそのリストのすべての組み合わせは別個の実施形態であることを、理解されたい。例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣ」として提示される実施形態のリストは、実施形態「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ又はＣ」、「Ｂ又はＣ」、又は「Ａ、Ｂ、又はＣ」を含むと解釈されるべきである。
【0109】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特にその内容が明確に指示していない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及には、２つ又は３つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【0110】
移行句「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」は、特許用語においてそれらの一般的に受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的及び新しい特徴に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。句「備える／含む（comprising）」（又はその同等語）に関して記載される実施形態はまた、実施形態として、「からなる」及び「から本質的になる」に関して独立して記載されるものを提供する。
【0111】
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う１つの標準偏差又は５％までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
【0112】
「代替スカフォールド」は、立体構造の許容度が高い可変ドメインに会合する構造化コアを含有する単鎖タンパク質フレームワークを指す。可変ドメインは、スカフォールドの完全性を損なうことなく導入される多型を許容するため、可変ドメインは、特異的抗原に結合するように遺伝子操作及び選択され得る。
【0113】
「抗体依存性細胞傷害」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」、又は「ＡＤＣＣ」は、エフェクター細胞で発現されるＦｃガンマ受容体（Fc gamma receptors、ＦｃγＲ）によって、抗体被覆標的細胞の、ナチュラルキラー細胞（natural killer、ＮＫ）、単球、マクロファージ及び好中球などの溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存する、細胞死を誘導する機序である。
【0114】
「抗体依存性細胞食作用」又は「ＡＤＣＰ」は、マクロファージ又は樹状細胞などの食細胞による取り込みによって抗体被覆標的細胞を排除する機序を指す。
【0115】
「抗原」は、免疫応答を媒介することができるいずれかの分子（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、それらの部分、又はそれらの組み合わせ）を指す。例示的な免疫応答には、抗体産生、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞などの免疫細胞の活性化が含まれる。
【0116】
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の一部を意味する。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素により入手可能なポリペプチド、又は遺伝子組換えされたポリペプチドであってもよく、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの、抗体のＣＤＲを模倣したアミノ酸残基からなる最小の認識単位、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３に結合した免疫グロブリンの一部、抗原に結合した代替スカフォールド、並びに断片に結合した抗原を含む多重特異性タンパク質を含む。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結されて、ＶＨ／ＶＬドメインが、分子内で、又はＶＨ及びＶＬドメインが別々の単鎖によって発現される場合には分子間で対形成して、単鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又は抗原などの一価の抗原結合ドメイン又は二重特異性抗体を形成する様々な種類の単鎖抗体の設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を操作するために単一特異性であっても多重特異性であってもよい他の抗体、タンパク質、抗原結合断片又は代替スカフォールドに共役されてもよい。
【0117】
「抗体」は、広義に意図され、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性、三重特異性、四重特異性などの多重特異性抗体、二量体の、四量体の、若しくは多量体の抗体、単鎖抗体、抗体ドメイン、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。
【0118】
「二重特異性」は、同じ抗原内の２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに特異的に結合する分子（抗体など）を意味する。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの、他の種（ホモログ）の同じ抗原に対して交差反応性を有し得るか、あるいは２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【0119】
「キメラ抗原受容体」、すなわち「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞上にリガンド又は抗原特異性を移植する操作されたＴ細胞受容体（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞又はこれらの組み合わせ）を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られている。ＣＡＲは、抗原、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインに結合することができる細胞外ドメインを含む。ＣＡＲ細胞内ドメインは、細胞内の生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られているポリペプチドを含む。膜貫通ドメインは、細胞膜に及ぶことが知られており、細胞外ドメイン及びシグナル伝達ドメインを結合するように機能し得る任意のペプチド又はポリペプチドを含む。キメラ抗原受容体は、任意で、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして機能するヒンジドメインを含んでもよい。
【0120】
「補体依存性細胞傷害」、すなわち「ＣＤＣ」は、標的結合タンパク質のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、そのような補体成分Ｃ１ｑが次に補体カスケードを活性化して標的細胞の細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機序を指す。補体の活性化はまた、標的細胞表面上への補体成分の沈着を生じさせ得、白血球への補体受容体（例えば、ＣＲ３）の結合によって、ＣＤＣを容易にする。
【0121】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、抗原に結合する抗体領域である。ＶＨには３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）が存在し、ＶＬには３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－２５０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）ａｎｄ ＡｂＭ（Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６）Ｊ Ｂｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３：８００－８１５））などの、様々な記述を使用して定義することができる。様々な記述と可変領域の番号付けとの対応が記載されている（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７；、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３０９：６５７－６７０；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース；ウェブリソース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇを参照のこと）。ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＬＣによるａｂＹｓｉｓなどの利用可能なプログラムを使用して、ＣＤＲを描写することができる。本明細書で使用する場合、用語「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」は、明細書で別途明示的に記載のない限り、上述したＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、又はＡｂＭの方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。
【0122】
「減少」、「低下」又は「低減」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合、低減された応答を媒介する試験分子の能力（すなわち、下流効果）を指す。例示的な応答には、タンパク質のその抗原又は受容体への結合、増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又はＡＤＣＰなどのＦｃγＲ又は増強されたＦｃエフェクター機能への増強された結合が含まれる。減少は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答における統計的に有意な差、又は約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくは３０倍以上の減少、例えば、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００倍以上の減少であり得る。
【0123】
「増強」、「促進」又は「増加」は、一般に、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合、より大きな応答を媒介する試験分子の能力（すなわち、下流効果）を指す。例示的な応答は、タンパク質の、その抗原又は受容体への結合、増強されたＦｃγＲへの結合、又は増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＰなどの増強されたＦｃエフェクター機能である。増強は、試験分子と対照（又はビヒクル）との間の測定された応答における統計的に有意な差、又は、約１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０若しくは３０倍以上、例えば、５００、６００、７００、８００、９００若しくは１０００倍以上の増加であり得る。
【0124】
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドの翻訳を導くために生体系又は再構成された生体系において利用することができるベクターを指す。
【0125】
「異種」は、自然界では互いに対して同じ関係で見出されることのない２つ又は３つ以上のポリペプチド又は２つ又は３つ以上のポリヌクレオチドを指す。
【0126】
「異種ポリヌクレオチド」は、自然界では互いに対して同じ関係で見出されることのない２つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。
【0127】
「異種ペプチド」は、自然界では互いに対して同じ関係で見出されることのない２つ又は３つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドを指す。
【0128】
「ヒト抗体」は、ヒト対象に投与されるときに、免疫応答が最小になるように最適化された抗体を指す。ヒト抗体の可変領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、当該定常領域もヒト免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。このような例示的な系は、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばマウス又はラットを含む。「ヒト抗体」は、典型的には、ヒト抗体及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を得るために使用した系の違い、フレームワーク若しくはＣＤＲへの体細胞変異の導入若しくは置換の意図的な導入、又はこれらの両方により、ヒトで発現した免疫グロブリンと比較したときにアミノ酸の違いを含有する。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７－８６に記載されるヒトフレームワーク配列解析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－３９６及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
【0129】
「ヒト化抗体」は、少なくとも１つのＣＤＲが非ヒト種に由来し、少なくとも１つのフレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワークに置換を含むことができるため、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子配列の厳密なコピーではない場合がある。
【0130】
「単離された」は、組換え細胞などの、分子が産生される系の他の成分から実質的に分離及び／又は精製された分子（本開示のｓｃＦｖ又は本開示のｓｃＦｖを含む異種タンパク質）の均質な集団、並びに、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離された」は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない分子を指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離された分子を包含する。
【0131】
「調節」は、対照又はビヒクルによって媒介される応答と比較した場合、対照増強された応答又は低減された応答を媒介する試験分子の能力の増強又は減少のいずれか（すなわち、下流効果）を指す。
【0132】
「モノクローナル抗体」は、抗体分子の実質的に均質な集団から得られた抗体、すなわち、可能性のある周知の変化、例えば、抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去、又はアミノ酸の異性化若しくは脱アミド化、メチオニンの酸化、又はアスパラギン若しくはグルタミンの脱アミド化などの翻訳後改変を除いて同一である集団を構成する個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、典型的には、１つの抗原性エピトープに結合する。二重特異性モノクローナル抗体は、２つの異なる抗原性エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性であってよく、又は、二重特異性などの多重特異性であってよく、一価、二価、又は多価であってよい。
【0133】
「多重特異性」は、２つ又は３つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ又は３つ以上の異なるエピトープに結合する分子を指す。多重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、カニクイザル（ｃｙｎｏ）又はチンパンジーなどの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る、あるいは、２つ又は３つ以上の異なる抗原間で共有されているエピトープに結合し得る。
【0134】
「ポリヌクレオチド」は、糖－リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合しているヌクレオチド鎖を含む分子を指す。ｃＤＮＡは、ポリヌクレオチドの典型例である。
【0135】
本明細書では互換的に使用される「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、各々がペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸残基からなる１つ又は２つ以上のポリペプチドを含む分子を指す。タンパク質は、単量体であってもよく、又は２つ若しくは３つ以上のサブユニットのタンパク質複合体であってもよく、サブユニットは同一であるか又は異なる。５０個未満のアミノ酸からなる小分子ポリペプチドは、「ペプチド」と称され得る。タンパク質は、異種融合タンパク質、糖タンパク質、又はリン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、シトルリン化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化又はビオチン化などの翻訳後改変によって修飾されたタンパク質であり得る。
【0136】
「組換え体」は、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、ウイルス、及び他の巨大分子を指す。
【0137】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ、ＶＬ、及びＶＨとＶＬとの間のリンカーを含む単鎖タンパク質を指す。ｓｃＦｖは、例えばＶＨ及びＶＬのＮ末端からＣ末端の順序に関して、いずれかの配向で、ＶＬ及びＶＨ可変領域を有し得る。したがって、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向にあってもＶＨ－リンカー－ＶＬ配向にあってもよい。ＶＨ、ＶＬ及びリンカー間にジスルフィド結合を含むように、ｓｃＦｖを操作してもよい。
【0138】
「特異的に結合する（Specifically binds）」、「特異的結合（specific binding）」、「特異的に結合する（specifically binding）」又は「結合する（binds）」は、抗体が他の抗原に対するよりも高い親和性で抗原又は抗原内のエピトープに結合するｓｃＦｖなどのタンパク質を指す。典型的には、ｓｃＦｖなどのタンパク質は、約１×１０－６Ｍ以下、約１×１０－７Ｍ以下、約５×１０－８Ｍ以下、約１×１０－８Ｍ以下、約１×１０－９Ｍ以下、約１×１０－１０Ｍ以下、約１×１０－１１Ｍ以下、又は約１×１０－１２Ｍ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合し、典型的には、ＫＤは、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対する結合についてのそのＫＤよりも少なくとも１００倍小さい。
【0139】
「ステープル処理された単鎖Ｆｖ」又は「ｓｐＦｖ」は、ＶＨとリンカーとの間又はＶＬとリンカーとの間の１つ又は２つ以上のジスルフィド結合を含むｓｃＦｖを指す。典型的には、ｓｐＦｖは、ＶＨとリンカーとの間の１つのジスルフィド結合、ＶＬとリンカーとの間の１つのジスルフィド結合、又はＶＨとリンカーとの間及びＶＬとリンカーとの間の２つのジスルフィド結合を含み得る。ＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合を含むｓｃＦｖ分子は、「ｓｐＦｖ」から除外される。
【0140】
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」としては、あらゆる脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが挙げられる。用語「対象」及び「患者」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【0141】
「治療有効量」は、必要な投薬量及び期間で所望の治療結果を得るための有効量を指す。治療的に有効な量は、個体の病態、年齢、性別、及び体重などの要因、並びに個体において所望の応答を引き出す治療薬又は治療薬の組み合わせの能力によって様々であってよい。
【0142】
疾患又は障害の「治療する」、「治療している」又は「治療」は、以下のうちの１つ又は２つ以上を達成することを指す：障害の重篤度及び／若しくは期間を低減する、治療される障害に特徴的な症状の悪化を阻害する、以前に障害を有していた対象における障害の再発を制限若しくは予防する、又は以前に障害について症候性であった対象における症状の再発を制限若しくは予防する。
【0143】
「三重特異性」は、同じ抗原内の３つの異なる抗原、又は３つの異なるエピトープに特異的に結合する、分子（抗体など）を指す。三重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓなどの、他の種（ホモログ）の同じ抗原に対して交差反応性を有し得るか、あるいは３つ又は４つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。
【0144】
「バリアント」、「変異体」又は「変化」は、１つ又は２つ以上の改変、例えば、１つ又は２つ以上の置換、挿入又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【0145】
本明細書全体を通して、抗体定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
【0146】
Ｉｇ定常領域の変異は、以下のように称される。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖは、１つの免疫グロブリン定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を指す。Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗは、第１のＩｇ定常領域におけるＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ変異、並びに第２のＩｇ定常領域におけるＴ３９４Ｗ変異を指す。
【0147】
可変領域の番号付けは、別途明示的に記載のない限り、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0148】
「ＶＨシステイン」、すなわち「ＶＨ Ｃｙｓ」は、ＶＨフレームワークに存在するＣｙｓ残基を指す。
【0149】
「ＶＬシステイン」、すなわち「ＶＬ Ｃｙｓ」は、ＶＬフレームワークに存在するＣｙｓ残基を指す。
【0150】
「安定化」は、熱安定性であることを指す非加熱ｓｃＦｖ試料と比較した場合、ｈＫ２と同等の結合を保持するｓｃＦｖを指す。
【0151】
「改善された安定性」は、ＳｐＦｖに導入されたジスルフィド結合及びＣｙｓ残基を欠く親ｓｃＦｖと比較した場合、上昇した融点（Ｔｍ）を有する本開示のｓｐＦｖを指す。上昇したＴｍは、２℃以上、例えば、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃又は１５℃の上昇であり得る。
【0152】
「アンカーポイント」は、ｓｃＦｖ構造全体に悪影響を及ぼさずにＣｙｓに変異誘発され得、ｓｃＦｖリンカーに存在するＣｙｓとジスルフィド結合を形成することができるｓｃＦｖ Ｖｈ又はＶＬフレームワークＣｙｓ残基を指す。
【0153】
「ステープル」は、アンカー点Ｃｙｓとジスルフィド結合を形成することができる１つ又は２つのＣｙｓ残基を含有するｓｃＦｖリンカーを指す。
【0154】
「表面露出」は、タンパク質の表面に少なくとも部分的に露出され、溶媒にアクセス可能である、例えば、重水素化にアクセス可能である、アミノ酸残基を指す。一次配列又はタンパク質に基づく残基の表面アクセス可能性を予測するためのアルゴリズムは、当該技術分野で周知である。代替的に、表面露出残基は、タンパク質の結晶構造から特定され得る。
【0155】
「ＬＴＢＲ」は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであるアポトーシス及びサイトカイン放出に関与するリンパ毒素に対する細胞表面受容体であるポリペプチドを指す。ＬＴＢＲはまた、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー３（tumor necrosis factor receptor superfamily member 3、ＴＮＦＲＳＦ３）」と称され得る。ＬＴＢＲは、上皮及び骨髄系列の細胞を含む多くの細胞型の表面上に発現される。ＬＴＢＲは、リンパ毒素膜形態（リンパ毒素－アルファ及びリンパ毒素－ベータの複合体）に特異的に結合することができる。ＬＴＢＲの活性化は、ＴＲＡＦ３及びＴＲＡＦ５を介してアポトーシスを誘発することができ、インターロイキン８の放出につながり得る。記載されない限り、好ましくは、ＬＴＢＲはヒトＬＴＢＲである。ヒトＬＴＢＲアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ３６９４１により提供される。
【0156】
「ＥＤＢ」又は「エクストラドメインＢ」は、フィブロネクチンプレｍＲＮＡのスプライシングパターンに基づいてフィブロネクチン分子に含まれ得るフィブロネクチンのドメインを指す。エクストラドメインＢは、９１個のアミノ酸残基を含む完全なフィブロネクチン（fibronectin、ＦＮ）ＩＩＩ型反復である。一般に、ＥＤＢは、正常な成人組織では検出不能であるが、細胞外マトリックス中の胎児組織及び腫瘍組織においてより大きな発現を示し、血管新生プロセス中に新血管系の周りに蓄積するため、ＥＤＢが可能性のあるマーカー及び血管新生の標的となる。記載されない限り、好ましくは、ＥＤＢはヒトＥＤＢである。フィブロネクチンアイソフォームアミノ酸配列を含有するヒトＥＤＢは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０２７５１により提供される。
【0157】
「フィブロネクチン」は、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質であるポリペプチドを指す。フィブロネクチンは、インテグリンと称される膜貫通受容体タンパク質に結合し得る。フィブロネクチンはまた、コラーゲン、フィブリン、及びヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの他の細胞外マトリックスタンパク質に結合し得る。フィブロネクチンは、一対のジスルフィド結合によって連結された２つのほぼ同一の単量体からなるタンパク質二量体として存在し得る。フィブロネクチンは単一の遺伝子から産生されるが、フィブロネクチンプレｍＲＮＡ分子の代替スプライシングにより、フィブロネクチンのいくつかのアイソフォームが創出され、そのうちの１つがＥＤＢフィブロネクチンである。フィブロネクチンは、細胞接着、成長、遊走、及び分化において役割を果たすことができ、創傷治癒及び胚発生などのプロセスにとって重要であり得る。ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は、エクストラドメインＢを含有するＵｎｉＰｒｏｔ数Ｐ０２７５１、並びにＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１２６３３３７（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１２６３３３８（アイソフォームｃ）、ＮＰ＿００１２６３３３９（アイソフォームｄ）、ＮＰ＿００１２６３３４０（アイソフォームｅ）、及びＮＰ＿００１２６３３４１（アイソフォームｆ）、ＮＰ＿００１２９３０５８（アイソフォーム８）、ＮＰ＿００１２９３０５９（アイソフォーム９）、ＮＰ＿００１２９３０６０（アイソフォーム１０）、ＮＰ＿００１２９３０６１（アイソフォーム１１）、及びＮＰ＿００２０１７（アイソフォーム３）により提供される。
【0158】
５．１組成物
本開示は、安定化ｓｃＦｖ分子（本明細書ではｓｐＦｖ（ステープル処理されたＦｖ）、ｓｐＦｖを含む異種及び多重特異性分子、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。本開示は、少なくとも部分的に、ＶＨ及び／又はＶＬ（本明細書ではＶＨアンカーポイント又はＶＬアンカーポイントと称される）並びにフレキシブルリンカー（本明細書ではステープルと称される）の特定に基づいており、これは、ｓｃＦｖにおけるリンカーと可変ドメインとの間のジスルフィド結合の形成をもたらすシステイン残基に操作され得る。本明細書に記載の「ステープル処理」戦略は、安定性が改善されたｓｃＦｖとの構造的同一性を提供するすべてのＶＨ／ＶＬドメイン及び既存のｓｃＦｖ分子に広く適用可能である。本明細書に記載のｓｐＦｖは、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）、Ｔ細胞リダイレクト分子、二重及び多重特異性分子を含む任意の異種タンパク質、二重特異性又は多重特異性フォーマットに共役され得、治療用、診断的及び検出分子として使用され得る。
本開示は、安定化ｓｃＦｖ分子（本明細書ではｓｐＦｖ（ステープル処理されたＦｖ）、ｓｐＦｖを含む異種及び多重特異性分子、それらをコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。本開示は、少なくとも部分的に、ＶＨ及び／又はＶＬ（本明細書ではＶＨアンカーポイント又はＶＬアンカーポイントと称される）並びにフレキシブルリンカー（本明細書ではステープルと称される）の特定に基づいており、これは、ｓｃＦｖにおけるリンカーと可変ドメインとの間のジスルフィド結合の形成をもたらすシステイン残基に操作され得る。本明細書に記載の「ステープル処理」戦略は、安定性が改善されたｓｃＦｖとの構造的同一性を提供するすべてのＶＨ／ＶＬドメイン及び既存のｓｃＦｖ分子に広く適用可能である。本明細書に記載のｓｐＦｖは、キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）、Ｔ細胞リダイレクト分子、二重及び多重特異性分子を含む任意の異種タンパク質、二重特異性又は多重特異性フォーマットに共役され得、治療用、診断的及び検出分子として使用され得る。
【0159】
本開示のｓｐＦｖ
本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、ｓｃＦｖを提供する。
【0160】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含む単離されたｓｃＦｖであって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、ｓｃＦｖを提供する。ジスルフィド結合は、典型的には、本開示のｓｃＦｖの発現中に形成される。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、ｓｃＦｖを提供する。ジスルフィド結合は、典型的には、本開示のｓｃＦｖの発現中に形成される。
【0161】
特定の実施例は、２つのジスルフィド結合を有するｓｐＦｖを開示しているが、リンカーＣｙｓとＶＨ Ｃｙｓ又はＶＬ Ｃｙｓのいずれかとの間に形成される１つのジスルフィド結合を有するｓｐＦｖを作製及び利用することができ、「ハーフアンカード」分子を生成することができることが容易に想定される。アンカー位置は、１つ又は２つのジスルフィド結合を有するｓｐＦｖで同じである。リンカーＣｙｓ位置は、アンカー点によるジスルフィド結合形成の距離及び幾何学的要件を満たす限り、ハーフアンカード分子において変化し得る。ハーフアンカードｓｐＦｖは、２つのジスルフィド結合で安定化されたＶＬ／ＶＨ対と同様のＶＬ／ＶＨ相対移動を抑制することが予想され、したがって、安定化する。
【0162】
本開示のｓｐＦｖは、ジスルフィド結合を欠く親ｓｃＦｖと比較した場合、熱安定性の増加を示した。一般に、ｓｐＦｖのＴｍは、ジスルフィド結合を欠く親ｓｃＦｖと比較した場合、親ｓｃＦｖのＴｍに関係なく、約１０℃高かった。安定性は、一般的に、熱安定性又は機械的安定性であり得る。熱安定性は、示差熱熱量測定（differential thermal calorimetry、ＤＳＣ）スキャンが加熱されたタンパク質試料（６０℃に加熱された試料など）を使用して行われるＤＳＣを使用し、続いて、２状態又は非２状態遷移を使用して得られた熱溶融プロファイルによって、評価され得る。非２状態遷移の場合、ＶＬ及びＶＨドメインの融解Ｔｍに対応する２つの遷移（Ｔｍ１及びＴｍ２）が、それぞれ記録される。
【0163】
いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約７Å～約９Åである。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約７Åである。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約８Åである。いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約９Åである。
【0164】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にある。
【0166】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にある。
【0167】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にある。
【0168】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にある。
【0169】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にある。
【0170】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にある。
【0171】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0172】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0173】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0174】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0175】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0176】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0177】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0178】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0180】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0181】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0182】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0184】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0185】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0186】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0187】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0188】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0189】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0190】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0191】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0192】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0193】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0194】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0196】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0197】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0198】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0199】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0200】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0201】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0202】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0203】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0204】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0205】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0206】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0207】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0208】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0209】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0210】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0211】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0212】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0213】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0214】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0215】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0216】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0217】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0218】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0219】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0220】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0221】
ＶＨ及びＶＬ領域の残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0222】
Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けは、周知である。Ｋａｂａｔ若しくはＩＭＧＴ番号付け、又は連続番号付けなどの他の番号付けシステムを使用して、ＶＨ及びＶＬ残基の位置を番号付けすることができる。表１は、例示的なＶＨ、ＧＬｋ１ ＶＨに対するＣｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ及び連続番号付け間の対応を示す（配列番号６０）。表２は、例示的なＶＬ、ＧＬｋ１ ＶＬに対するＣｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ及び連続番号付け間の対応を示す（配列番号５６）。
【0223】
【表1-1】
【0224】
【表1-2】
【0225】
【表2】
【0226】
いくつかの実施形態では、Ｌは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む。
【0227】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。例示的な非ヒトＩｇヒンジ領域は、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ及びサルなどの非ヒト霊長類由来のものである。
【0228】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0229】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＥアイソタイプである。
【0230】
Ｉｇヒンジ領域は、一般に、残基２１６を含み、ヒトＩｇＧの残基２３０で終結すると定義され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。場合によっては、約残基２３１～約残基２３７までの下部ヒンジ領域も、ヒンジに含まれ得る。したがって、ＩｇＧ１ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号６３）を、又は下部ヒンジが含まれる場合には、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号６４）を含み得る。他のＩｇアイソタイプのヒンジ領域は、周知であり、それらのアミノ酸配列は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｗｅｂサイトで得られ得る。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号６５）を含む。
【0231】
Ｌは、Ｉｇヒンジ領域アミノ酸配列の少なくとも一部分又は操作されたＩｇヒンジ領域の少なくとも一部分を含む場合に、それらの例におけるＩｇヒンジ領域「に由来する」連続アミノ酸配列を含む。操作されたＩｇヒンジ領域は、野生型Ｉｇヒンジと比較した場合、１つ又は２つ以上の変異を含む。導入され得る例示的な変異は、であり、ＬにおけるＣｙｓの数を１つ若しくは２つに低減させるＣｙｓ残基の置換、Ｐｒｏ残基の置換、又は保存的置換などの任意の保存的修飾であり得る。
【0232】
「保存的改変」は、アミノ酸改変を含む抗体の結合特性に著しく影響を与えること又は変化させることがないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び含硫黄側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング変異誘発について以前に記載されているように（（ＭａｃＬｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ ６４３：５５－６７、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３５：１－２４）、ポリペプチド内のいずれかの天然残基もアラニンで置換され得る。アミノ酸置換は、既知の方法、例えば、ＰＣＲ変異誘発（米国特許第４，６８３，１９５号）により行うことができる。得られた変異体ヒンジは、本開示のｓｐＦｖ構築物に組み込まれ、既知のアッセイ及び本明細書に記載のアッセイを使用して、安定性及び抗原への結合などのそれらの特性について試験され得る。
【0233】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）又はチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｙは、１～３の整数である。Ｐｒｏは、剛性を提供するリンカーに含まれ得る。Ｇｌｙは、最大の柔軟性を可能にするリンカーに含まれ得る。Ｃｙｓ及びＭｅｔを除いて、任意の他のアミノ酸も、Ｌにおいて使用され得る。
【0234】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である。
【0235】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＣを含む。
【0237】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＣを含む。
【0238】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＣを含む。
【0239】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＰＣ（配列番号１）を含む。
【0240】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＰＣ（配列番号２８）を含む。
【0241】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＧＣ（配列番号２９）を含む。
【0242】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＧＣ（配列番号３０）を含む。
【0243】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＰＧ（配列番号３１）を含む。
【0244】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＳＣ（配列番号３２）を含む。
【0245】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＳＣ（配列番号３３）を含む。
【0246】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＳＣ（配列番号３４）を含む。
【0247】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＧＣ（配列番号３５）を含む。
【0248】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）を含む。
【0249】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）を含む。
【0250】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）を含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）を含む。
【0252】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）を含む。
【0253】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）を含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）を含む。
【0255】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）を含む。
【0256】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）を含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）を含む。
【0258】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）を含む。
【0259】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）を含む。
【0260】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）を含む。
【0261】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）を含む。
【0262】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）を含む。
【0263】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）を含む。
【0264】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む。
【0265】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４～１９個のアミノ酸を含む。
【0266】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４個のアミノ酸を含む。
【0267】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１５個のアミノ酸を含む。
【0268】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１６個のアミノ酸を含む。
【0269】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１７個のアミノ酸を含む。
【0270】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１８個のアミノ酸を含む。
【0271】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１９個のアミノ酸を含む。
【0272】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又は、Ｔｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0273】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0274】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0275】
一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含む。
【0276】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0277】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0278】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0279】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0281】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0282】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0283】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0284】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0285】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0286】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0287】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0288】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0289】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0290】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0291】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0292】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0293】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0294】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0295】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0296】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0297】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0298】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0299】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0300】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0301】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0302】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0303】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0304】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖであって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある、ｓｃＦｖを提供する。
【0305】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0306】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0307】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0308】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0309】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0310】
本開示のｓｐＦｖを含む異種分子
本開示のｓｐＦｖは、当技術分野で周知のように、ジスルフィド結合を欠く非安定化ｓｃＦｖと同様に、第２の分子に共役され得る。例示的な第２の分子は、本明細書に開示され、半減期延長部分、造影剤、治療薬、様々な抗体形式及びその断片、抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域、免疫グロブリン重鎖／軽鎖又はそれらの断片、多重特異性分子並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
本開示のｓｐＦｖは、当技術分野で周知のように、ジスルフィド結合を欠く非安定化ｓｃＦｖと同様に、第２の分子に共役され得る。例示的な第２の分子は、本明細書に開示され、半減期延長部分、造影剤、治療薬、様々な抗体形式及びその断片、抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域、免疫グロブリン重鎖／軽鎖又はそれらの断片、多重特異性分子並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。
【0311】
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む異種分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、異種分子を提供する。
【0312】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、異種分子を提供する。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含み、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含み、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、異種分子を提供する。
【0313】
いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約７Å～約９Åである。
【0314】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0315】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0316】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0317】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0318】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0319】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0320】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0321】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0322】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0323】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0324】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0325】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0326】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0327】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0328】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0329】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0330】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0331】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0332】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0333】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0334】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0335】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0336】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0337】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0338】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0339】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0340】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0341】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0342】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0343】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0344】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0345】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0346】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0347】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0348】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0349】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0350】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0351】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0352】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0353】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にある。
【0354】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にある。
【0355】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にある。
【0356】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にある。
【0357】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にある。
【0358】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にある。
【0359】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にある。
【0360】
ＶＨ及びＶＬ領域の残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0361】
いくつかの実施形態では、Ｌは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む。
【0362】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。例示的な非ヒトＩｇヒンジ領域は、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ及びサルなどの非ヒト霊長類由来のものである。
【0363】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0364】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ又はＩｇＥアイソタイプである。
【0365】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｙは、１～３の整数である。Ｐｒｏは、剛性を提供するリンカーに含まれ得る。Ｇｌｙは、最大の柔軟性を可能にするリンカーに含まれ得る。Ｃｙｓ及びＭｅｔを除いて、任意の他のアミノ酸も、Ｌにおいて使用され得る。
【0366】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である。
【0367】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む。
【0368】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４～１９個のアミノ酸を含む。
【0369】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４個のアミノ酸を含む。
【0370】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１５個のアミノ酸を含む。
【0371】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１６個のアミノ酸を含む。
【0372】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１７個のアミノ酸を含む。
【0373】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１８個のアミノ酸を含む。
【0374】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１９個のアミノ酸を含む。
【0375】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0376】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0377】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0378】
一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含む。
【0379】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0380】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0381】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0382】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0383】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0384】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0385】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0386】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0387】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0388】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0389】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、異種分子を提供する。
【0390】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0391】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0392】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0393】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0394】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0395】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0396】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0397】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0398】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0399】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0400】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0401】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む異種分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0402】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0403】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0404】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【0405】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0406】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0407】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤、又は検出可能な標識に共役される。
【0408】
いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、半減期延長部分である。
【0409】
いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、抗体又はその断片である。
【0410】
いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、抗原結合断片である。
【0411】
いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、治療用分子である。
【0412】
本開示のｓｐＦｖ及び半減期延長部分を含む異種分子
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、半減期延長部分に共役される。
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、半減期延長部分に共役される。
【0413】
半減期延長部分は、免疫グロブリン（Ｉｇ）、Ｉｇの断片、Ｉｇ定常領域、Ｉｇ定常領域の断片、Ｆｃ領域、トランスフェリン、アルブミン、アルブミンバリアント、アルブミン結合ドメイン又はポリエチレングリコールである。ヒトＩｇのアミノ酸配列は周知であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む。
【0414】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ又はＩｇの断片に共役される。
【0415】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｆｃ領域に共役される。
【0416】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、トランスフェリンに共役される。
【0417】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、アルブミンに共役される。
【0418】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、アルブミン結合タンパク質に共役される。
【0419】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）に共役される。例示的なＰＥＧ分子は、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００である。
【0420】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、脂肪酸又は脂肪酸エステルに共役される。例示的な脂肪酸及び脂肪酸エステルは、所望の特性のために、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、ステアリン酸塩、アラキジン酸塩、ベヘン酸塩、オレイン酸塩、アラキドン酸塩、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ又は多糖類）である。
【0421】
半減期延長部分は、本開示のｓｐＦｖとの直接融合であり得、標準的なクローニング及び発現技術によって生成され得る。代替的に、周知の化学カップリング方法を使用して、組換え技術によって産生された本開示のｓｐＦｖにその部分を結合させることができる。
【0422】
本開示のｓｐＦｖ及び細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識を含む異種分子
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖを含む異種分子であって、本開示のｓｐＦｖが、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識に共役される、異種分子を提供する。
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖを含む異種分子であって、本開示のｓｐＦｖが、第２のタンパク質、ポリヌクレオチド、治療薬、細胞傷害性薬剤又は検出可能な標識に共役される、異種分子を提供する。
【0423】
本開示のｓｐＦｖを含む異種分子を使用して、インビトロ又はインビボで、治療薬を指示するか、ｓｐＦｖが結合する抗原を発現する細胞を死滅させるのを媒介するか、可視化するか、特定するか、又は精製してもよい。
【0424】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は細胞毒性剤でもある。
【0425】
検出可能な標識は、本開示のｓｐＦｖと共役させた場合に、ｓｐＦｖを、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能なものとすることができる組成物を含む。
【0426】
例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート（scintillates）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
【0427】
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
【0428】
例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、１９Ｆ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、６０Ｃｏ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９０Ｓｒ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１５Ｉｎ、１２３１、１２４１、１２５Ｉ、１３１１、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ、２２６Ｒａ、２２５Ａｃ、及び２２７Ａｃが挙げられる。
【0429】
例示的な金属原子は、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、臭素、クリプトン、ルビジウム、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、ヨウ素、キセノン、セシウム、バリウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、プラチナ、金、水銀、タリウム、鉛、ビスマス、フランシウム、ラジウム、アクチニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビニウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、トリウム、プロトアクチニウム、ウラン、ネプツニウム、プルトニウム、アメリシウム、キュリウム、バークリウム、カリホルニウム、アインスタイニウム、フェルミウム、メンデレビウム、ノーベリウム、又はローレンシウム原子などの、２０を超える原子番号を有する金属である。
【0430】
いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
【0431】
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
【0432】
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
【0433】
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
【0434】
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
【0435】
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
【0436】
いくつかの実施形態では、金属原子は、原子番号５３（すなわち、ヨウ素）～原子番号８３（すなわち、ビスマス）を有する金属であり得る。
【0437】
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
【0438】
金属原子は、＋１、＋２、又は＋３の酸化状態の形態の金属イオン、例えば、Ｂａ２＋、Ｂｉ３＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、Ｃｒ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｒ６＋、Ｃｏ２＋、Ｃｏ３＋、Ｃｕ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋、Ｇａ３＋、Ｇｄ３＋、Ａｕ＋、Ａｕ３＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆ３＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ４＋、Ｍｎ７＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎｉ３＋、Ａｇ＋、Ｓｒ２＋、Ｓｎ２＋、Ｓｎ４＋、及びＺｎ２＋であり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
【0439】
好適な色素としては、例えば、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
【0440】
好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ、ＮＩＲ）（７００～９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
【0441】
検出可能な標識に共役した本開示のｓｃＦｖを含む異種分子は、造影剤として使用され得る。
【0442】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、若しくはその断片）、又は放射性同位体（すなわち、放射性複合体）である。
【0443】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞毒性剤は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞毒性又は細胞増殖抑制作用を引き起こし得る。
【0444】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、アレウリテス・フォルディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンなどの酵素活性を有する毒素がある。
【0445】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅなどの放射性核種である。
【0446】
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞の分裂に干渉し、抗癌活性及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤部位は、ペプチド薬剤部位のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号を参照されたい）、又は抗体内に操作された任意のシステインを介して、本発明の抗体に結合され得る。
【0447】
検出可能な標識へのコンジュゲーションは、既知の方法を使用して行われ得る。
【0448】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
【0449】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本開示のｓｐＦｖに共役される。
【0450】
検出可能な標識又は細胞毒性剤は、既知の方法を使用して、本開示のｓｐＦｖに直接的に、又は間接的に連結され得る。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ－スクシミジル－ベンゾエートの誘導体、ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）、及びビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
【0451】
本開示のｓｐＦｖ及び免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はそれらの断片を含む異種分子
本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役されて、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、食作用又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含む抗体様特性を付与し得る。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載の半減期延長部分としても機能する。本開示のｓｐＦｖはまた、標準的な方法を使用して全長抗体に操作され得る。本開示のｓｐＦｖを含む全長抗体は、本明細書に記載されるように、更に操作され得る。
本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役されて、Ｆｃエフェクター機能Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、食作用又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションを含む抗体様特性を付与し得る。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、本明細書に記載の半減期延長部分としても機能する。本開示のｓｐＦｖはまた、標準的な方法を使用して全長抗体に操作され得る。本開示のｓｐＦｖを含む全長抗体は、本明細書に記載されるように、更に操作され得る。
【0452】
免疫グロブリン重鎖定常領域は、サブドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。ＣＨ１ドメインは、ＥＵインデックスに従って、重鎖上の残基１１８～２１５、ＣＨ２ドメイン残基２３１～３４０及びＣＨ３ドメイン残基３４１～４４７に及ぶ。場合によっては、残基３４１は、ＣＨ２ドメイン残基と呼ばれる。ヒンジは、一般に、残基２１６を含み、ヒトＩｇＧ１の２３０で終了するとして定義されるが、本明細書に記載されるように、約残基２３１～約残基２３７の下部ヒンジ領域を含み得る。Ｉｇ Ｆｃ領域は、Ｉｇ定常領域の少なくともＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、したがって、Ｉｇ重鎖定常領域の少なくとも約２３１～４４７の領域を含む。
【0453】
本発明はまた、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役された本開示のｓｐＦｖを提供する。
【0454】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、重鎖定常領域である。
【0455】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、軽鎖定常領域である。
【0456】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、Ｆｃ領域を含む。
【0457】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメインを含む。
【0458】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
【0459】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0460】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ヒンジの一部分は、Ｉｇヒンジの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を指す。
【0461】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0462】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域のＮ末端又はＩｇ定常領域の断片に共役される。
【0463】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域のＣ末端又はＩｇ定常領域の断片に共役される。
【0464】
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役された本開示のｓｐＦｖは、いくつかの既知のアッセイを使用してそれらの機能性について評価され得る。標的抗原への結合は、本明細書に記載の方法を使用して評価され得る。Ｆｃ領域などのＩｇ定常ドメイン又はＩｇ定常領域の断片によって付与される変更された特性は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ若しくはＦｃＲｎなどの受容体の可溶性形態を使用して、又は、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ若しくはＡＤＣＰを測定する細胞ベースのアッセイを使用して、Ｆｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイされ得る。
【0465】
ＡＤＣＣ活性は、本開示のｓｐＦｖが結合する抗原を発現する細胞を標的細胞として及びＮＫ細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロアッセイを使用して評価され得る。細胞溶解は、溶解した細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光染料又は天然細胞内タンパク質）の放出によって検出され得る。例示的なアッセイでは、標的細胞を、４つのエフェクター細胞に対する１つの標的細胞の比で使用される。標的細胞はＢＡＴＤＡで予め標識し、エフェクター細胞及び試験抗体と組み合わせる。サンプルを２時間インキュベートし、上清に放出したＢＡＴＤＡを測定することにより、細胞溶解を測定した。０．６７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による最大の細胞傷害に対してデータを正規化し、また任意の抗体の非存在下における標的細胞からのＢＡＴＤＡの自然放出によって最小対照を求める。
【0466】
ＡＤＣＰは、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として、並びに本開示のｓｐＦｖが結合する抗原を発現するいずれかの細胞を標的細胞として及びＧＦＰ又は別の標識分子を発現するように操作された標的細胞として単球由来マクロファージを使用することによって評価され得る。例示的なアッセイでは、エフェクター：標的細胞比は、例えば４：１とすることができる。エフェクター細胞は、本発明の抗体を添加し又は添加せずに、標的細胞とともに４時間インキュベートしてよい。インキュベーション後、細胞は、アクターゼを用いて剥離できる。マクロファージは、蛍光標識に結合した抗ＣＤ１１ｂ抗体及び抗ＣＤ１４抗体により識別され得るが、貪食作用の割合は、標準的な方法を用いて、ＣＤ１１＋及びＣＤ１４＋マクロファージにおけるＧＦＰ蛍光の割合（％）に基づいて決定され得る。
【0467】
細胞のＣＤＣは、例えば、Ｄａｕｄｉ細胞を、ＲＰＭＩ－Ｂ（１％のＢＳＡを補給したＲＰＭＩ）に１×１０５細胞／ウェル（５０μＬ／ウェル）でプレーティングし、５０μＬの試験タンパク質を０～１００μｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加し、反応を室温で１５分間インキュベートし、１１μＬのプールしたヒト血清をウェルに添加し、反応を３７℃で４５分間インキュベートすることによって測定され得る。溶解した細胞の割合（％）は、標準法を使用して、ＦＡＣＳアッセイにおけるヨウ化プロピジウム染色細胞の％として検出され得る。
【0468】
本開示のｓｐＦｖ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はその断片を含む異種分子
本開示のｓｐＦｖは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＣＡＲの断片に共役され得る。したがって、本開示のｓｐＦｖを含むＣＡＲは、その細胞外ドメインとして、本開示の１つ又は２つ以上のｓｃＦｖ分子を含む単一特異性又は多重特異性であり得る。
本開示のｓｐＦｖは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＣＡＲの断片に共役され得る。したがって、本開示のｓｐＦｖを含むＣＡＲは、その細胞外ドメインとして、本開示の１つ又は２つ以上のｓｃＦｖ分子を含む単一特異性又は多重特異性であり得る。
【0469】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、遺伝子操作された受容体である。これらの操作された受容体は、当該技術分野で既知の技術に従って、Ｔ細胞を含む免疫細胞に容易に挿入し、それらによって発現させることができる。ＣＡＲによって、単一の受容体は、特定の抗原を認識し、その抗原に結合したときに、免疫細胞を活性化して、その抗原を担持する細胞を攻撃及び破壊するようにプログラミングすることができる。これらの抗原が腫瘍細胞上に存在する場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、腫瘍細胞を標的とし、それを殺傷することができる。
【0470】
ＣＡＲは、典型的には、抗原ａｄ、任意のリンカー、膜貫通ドメイン、並びに共刺激ドメイン及び／又はシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。
【0471】
ＣＡＲの細胞外ドメインは、本開示のｓｃＦｖなどの所望の抗原に結合する任意のポリペプチドを含有してもよい。ＣＡＲはまた、タンデムに配置され、リンカー配列によって分離され得る２つ又は３つ以上の所望の抗原に結合するように操作されてもよい。例えば、本開示の１つ又は２つ以上のｓｃＦｖ、ドメイン抗体、ラマＶＨＨ抗体又は他のＶＨのみの抗体断片を、リンカーを介してタンデムに構成して、二重特異性又は多重特異性ＣＡＲを生成してもよい。
【0472】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、若しくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤＩ ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦＩ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒ ａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ Ｉｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤＩ ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／又はＮＫＧ２Ｃに由来し得る。
【0473】
ＣＡＲの細胞内共刺激ドメインは、１つ又は２つ以上の共刺激分子の細胞内ドメインに由来し得る。共刺激分子は、抗原への結合時にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な第２のシグナルを提供する、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の周知の細胞表面分子である。ＣＡＲに使用され得る例示的な共刺激ドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０の細胞内ドメインである。
【0474】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ６６ｄ又はＣＤ３９のシグナル伝達ドメインに由来し得る。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害性活性（細胞傷害性因子のＣＡＲ結合標的細胞への放出、又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合後に誘発される他の細胞応答を含む）を誘発するために、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージの、免疫エフェクター細胞の内部への形質導入に関与するＣＡＲポリペプチドの一部を指す。
【0475】
細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置付けされるＣＡＲ内の任意のリンカーは、約２～１００アミノ酸長のポリペプチドであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動するように、グリシン及びセリンなどの柔軟性残基を含み得るか、又は残基で構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合、より長いリンカーを使用することができる。リンカーは、開裂可能であっても開裂不可能であってもよい。例示的な切断可能なリンカーは、２Ａを含む。
【0476】
例示的なＣＡＲは、本開示のｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。別の例示的なＣＡＲは、本開示のｓｃＦｖ、ＣＤ８又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、４１ＢＢ又はＯＸ４０共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0477】
ＣＡＲは、標準的な分子生物学的技術によって生成される。
【0478】
本開示のｓｐＦｖは、第２の分子に直接、又はリンカーを介して共役され得る。例示的なリンカーは、免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖アイソタイプ、Ｇｌｙリッチリンカー、Ｇｌｙ及びＳｅｒ含有リンカー、Ｇｌｙ及びＡｌａ含有リンカー、Ａｌａ及びＳｅｒ含有リンカー並びにＰｒｏ含有リンカーに由来する免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＬ又はＣＨ１の部分を含む。リンカーに含まれ得る例示的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＨｉｓである。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含む様々な非タンパク質性ポリマーは、リンカーとしての使用を見出され得る。例示的なリンカーは、例えば、国際公開第２０１９／０６０６９５号に記載されている。
【0479】
いくつかの実施形態では、異種分子は、単一特異性である。
【0480】
いくつかの実施形態では、異種分子は、多重特異性である。
【0481】
いくつかの実施形態では、異種分子は、二重特異性である。
【0482】
いくつかの実施形態では、異種分子は、三重特異性である。
【0483】
いくつかの実施形態では、異種分子は、四重特異性である。
【0484】
本開示のｓｐＦｖを含む多重特異性分子
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
本開示はまた、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカー（Ｌ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む多重特異性分子であって、ｓｃＦｖが、
構造的に保存された表面露出ＶＨシステイン（Ｃｙｓ）と第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合、
構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、又は
構造的に保存された表面露出ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間の第１のジスルフィド結合及び構造的に保存された表面露出ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間の第２のジスルフィド結合、を含む、多重特異性分子を提供する。
【0485】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙを含むか、
ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第２のＬ Ｃｙを含むか、又は
ＶＨが、構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置でＶＨ Ｃｙｓを含み、ＶＬが、構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置でＶＬ Ｃｙｓを含み、Ｌが、第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含み、ＶＨ Ｃｙｓ及び第１のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができ、ＶＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓが、ジスルフィド結合を形成することができる、多重特異性分子を提供する。
【0486】
いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、約７Å～約９Åである。
【0487】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0488】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0489】
いくつかの実施形態では、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、又は
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあり、
本明細書において、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５であり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、又は
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあり、
本明細書において、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0490】
いくつかの実施形態では、Ｌは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む。
【0491】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0492】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0493】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである。
【0494】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｙは、１～３の整数である。
【0495】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である。
【0496】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む。
【0497】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４～約１９個のアミノ酸、例えば、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個又は約１９個のアミノ酸を含む。
【0498】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0499】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0500】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0501】
一部の実施形態では、Ｌは、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含む。
【0502】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0503】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0504】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0505】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0506】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0507】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0508】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0509】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0510】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0511】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0512】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある、多重特異性分子を提供する。
【0513】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0514】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0515】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0516】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0517】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0518】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0519】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0520】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0521】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0522】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0523】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0524】
本開示はまた、ＶＨ、Ｌ及びＶＬを含むｓｃＦｖを含む多重特異性分子であって、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖが、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0525】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0526】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0527】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0528】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、抗体又は抗体断片を含む。
【0529】
いくつかの実施形態では、多重特異性タンパク質は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む。
【0530】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、Ｆｃ領域を含む。
【0531】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域は、ＣＨ２ドメインを含む。
【0532】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインを含む。
【0533】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0534】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。
【0535】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域の断片は、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【0536】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域のＮ末端又はＩｇ定常領域の断片のＮ末端に共役される。
【0537】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、Ｉｇ定常領域のＣ末端又はＩｇ定常領域の断片のＣ末端に共役される。
【0538】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである。
【0539】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する少なくとも１つの変異を含む。
【0540】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を低減する少なくとも１つの変異は、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、Ｋ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ及びＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0541】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する少なくとも１つの変異を含む。
【0542】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子のＦｃγＲへの結合を増強する少なくとも１つの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0543】
いくつかの実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＩである。
【0544】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、多重特異性分子の半減期を調節する少なくとも１つの変異を含む。
【0545】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子の半減期を調節する少なくとも１つの変異は、Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0546】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＣＨ３ドメインに少なくとも１つの変異を含む。
【0547】
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインの少なくとも１つの変異は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｓ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｉ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｖ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３６６Ａ／Ｋ４０９Ｆ、Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗからなる群から選択され、残基番号付けは、ＥＵインデックスに従う。
【0548】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、二重特異性である。
【0549】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、三重特異性である。
【0550】
いくつかの実施形態では、多重特異性分子は、四重特異性である。
【0551】
５．２本開示のｓｐＦｖを含む多重特異性タンパク質の生成
本開示のｓｐＦｖは、既知の組換え技術、発現及び精製プロトコルを使用して、任意の既知の形式の多重特異性分子に操作され得る。
本開示のｓｐＦｖは、既知の組換え技術、発現及び精製プロトコルを使用して、任意の既知の形式の多重特異性分子に操作され得る。
【0552】
本開示のｓｐＦｖは、２つの半分の分子の安定性を促進するＣＨ３ドメインに１つ又は２つ以上の変異を有する全長多重特異性抗体に操作され得る。これらの多重特異性抗体を、Ｆａｂアーム交換を使用するか、又は様々な鎖の共発現によって、インビトロで生成することができる。インビトロＦａｂアーム交換の場合、２つの単一特異性二価抗体は、ＣＨ３ドメインに１つ又は２つ以上の置換を有するように操作され、抗体は、ヒンジ領域のシステインにジスルフィド結合異性化を施すのに十分な還元条件下で一緒にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートを用いることができる。
【0553】
使用され得るＣＨ３変異としては、ノブインホール変異（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、静電マッチ変異（Ｃｈｕｇａｉ、Ａｍｇｅｎ、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｏｎｃｏｍｅｄ）、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）、及び他の非対称変異（例えば、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）などの技術が挙げられる。
【0554】
ノブインホール変異は、例えば、国際公開第１９９６／０２７０１１号に開示されており、小さい側鎖（ホール）を有するアミノ酸が第１のＣＨ３領域に導入され、大きな側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が第２のＣＨ３領域に導入され、第１のＣＨ３領域と第２のＣＨ３領域との間に優先的な相互作用をもたらす、ＣＨ３領域の界面上の変異が含まれる。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３領域変異は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである。
【0555】
重鎖ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、同第２００９／０１８２１２７号、同第２０１０／０２８６３７号、又は同第２０１１／０１２３５３２号に記載のように、第１のＣＨ３領域上の正に荷電した残基及び第２のＣＨ３領域上の負に荷電した残基を置換することにより、静電相互作用を使用することによって促進され得る。
【0556】
重鎖ヘテロ二量体化を促進するために使用することができる他の非対称変異は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は同第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗである。
【0557】
ＳＥＥＤボディ変異は、米国特許出願公開第２００７／０２８７１７０号に記載のように、選択されたＩｇＧ残基をＩｇＡ残基と置換して、重鎖ヘテロ二量体化を促進することを伴う。
【0558】
使用され得る他の例示的な変異は、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号及び米国特許出願公開第２０１８／０１１８８４９号に記載のＲ４０９Ｄ＿Ｋ３７０Ｅ／Ｄ３９９Ｋ＿Ｅ３５７Ｋ、Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｋ／Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｅ、Ｌ３５１Ｋ／Ｙ３４９Ｄ、Ｌ３５１Ｋ／Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｅ３５６Ｋ、Ｋ２５３Ｅ＿Ｄ２８２Ｋ＿Ｋ３２２Ｄ／Ｄ２３９Ｋ＿Ｅ２４０Ｋ＿Ｋ２９２Ｄ、Ｋ３９２Ｄ＿Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３５６Ｋ＿Ｄ３９９Ｋである。
【0559】
Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）変異（Ｇｅｎｍａｂ）は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３０３３５６号に開示されており、Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、野生型／Ｆ４０５Ｌ＿Ｒ４０９Ｋ、Ｔ３５０Ｉ＿Ｋ３７０Ｔ＿Ｆ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、Ｋ３７０Ｗ／Ｋ４０９Ｒ、Ｄ３９９ＡＦＧＨＩＬＭＮＲＳＴＶＷＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｔ３６６ＡＤＥＦＧＨＩＬＭＱＶＹ／Ｋ４０９Ｒ、Ｌ３６８ＡＤＥＧＨＮＲＳＴＶＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｄ３９９ＦＨＫＲＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ、Ｆ４０５ＩＫＬＳＴＶＷ／Ｋ４０９ＡＧＲＨ及びＹ４０７ＬＷＱ／Ｋ４０９ＡＧＲＨの変異が含まれる。
【0560】
本開示のｓｐＦｖが組み込まれ得る追加の二重特異性又は多重特異性構造には、二重可変ドメイン免疫グロブリン（Dual Variable Domain、ＤＶＤ）（国際公開第２００９／１３４７７６号、ＤＶＤは、ＶＨ１－リンカー－ＶＨ２－ＣＨ構造を有する重鎖と、ＶＬ１－リンカー－ＶＬ２－ＣＬ構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意である）、ロイシンジッパー又はコラーゲン二量化ドメインなどの、異なる特異性を有する２つの抗体アームを結合するための様々な二量化ドメインを含む構造（国際公開第２０１２／０２２８１１号、米国特許第５，９３２，４４８号、米国特許第６，８３３，４４１号）、一緒に共役された２つ又は３つ以上のドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ、ラクダ科抗体及び操作されたラクダ科抗体などの重鎖のみ抗体、二重標的（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、２ｉｎ１抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、二重親和性再標的技術（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及び二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）、二重活性又はＢｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、二価二重特異性（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が含まれる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【0561】
本開示のｓｃＦｖはまた、３つのポリペプチド鎖を含む多重特異性タンパク質に操作され得る。そのような設計では、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、本開示のｓｃＦｖの形態にある。例示的な設計としては、（「１」が第１の抗原結合ドメインを示し、「２」が第２の抗原結合ドメインを示し、「３」が第３の抗原結合ドメインを示す）を含む：
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計１：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計２：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計３：鎖Ａ）ｓｃＦｖ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
設計４：鎖Ａ）ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖ１、鎖Ｂ）ＶＬ２－ＣＬ、鎖Ｃ）ＶＨ２－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
【0562】
ＣＨ３操作は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ）に記載のＬ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗの変異などの設計１～４に組み込まれ得る。
【0563】
５．３アイソタイプ、アロタイプ及びＦｃ操作
多重特異性分子又は本開示の異種分子中に存在するＦｃ領域などのＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであり得る。
多重特異性分子又は本開示の異種分子中に存在するＦｃ領域などのＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプ又はアイソタイプのものであり得る。
【0564】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ１アイソタイプである。
【0565】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ２アイソタイプである。
【0566】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ３アイソタイプである。
【0567】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、ＩｇＧ４アイソタイプである。
【0568】
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片は、任意のアロタイプであり得る。アロタイプは結合又はＦｃ媒介性エフェクター機能などのＩｇ定常領域の特性に影響を与えないことが予想される。その断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－６０８）。その断片のＩｇ定常領域を含む治療用タンパク質が宿主において免疫応答を誘導する程度は、Ｉｇ定常領域のアロタイプによって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２２１）。Ｉｇ定常領域のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表３は、選択ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アロタイプを示す。
【0569】
【表3】
【0570】
Ｃ末端リジン（C-terminal lysine、ＣＴＬ）は、Ｉｇ定常領域から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０８：４０４－４１２）。製造中、米国特許出願公開第２０１４／０２７３０９２号に記載のとおり、細胞外Ｚｎ２＋、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡ－Ｆｅ３＋の濃度を制御することによって、ＣＴＬの除去を、最大レベル未満に制御することができる。タンパク質のＣＴＬ含量を、既知の方法を使用して測定することができる。
【0571】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域に共役された本開示のｓｐＦｖは、約１０％～約９０％のＣ末端リジン含有量を有する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含有量は約２０％～約８０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含有量は、約４０％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含有量は、約５５％～約７０％である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端リジン含有量は約６０％である。
【0572】
Ｆｃ領域変異は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及び／又はＡＤＣＰ及び／又は薬物動態特性などのそのエフェクター機能を調節するために、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む本開示の多重特異性分子又は異種分子に対して行われ得る。このことは、変異をＦｃに導入して、変異Ｆｃの、活性化ＦｃγＲｓ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ、及び／又はＦｃＲｎへの結合を制御することにより達成可能である。
【0573】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に少なくとも１つの変異を含む。
【0574】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｆｃ領域にある。
【0575】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｆｃ領域に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の変異を含む。
【0576】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、ＦｃＲｎへの抗体の結合を調節するＦｃ領域中の少なくとも１つの変異を含む。
【0577】
半減期（例えば、ＦｃＲｎへの結合）を調節するように変異され得るＦｃの位置としては、位置２５０、２５２、２５３、２５４、２５６、２５７、３０７、３７６、３８０、４２８、４３４及び４３５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで行われることができる例示的な変異は、変異Ｔ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｉ２５３Ａ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｐ２５７Ｉ、Ｔ３０７Ａ、Ｄ３７６Ｖ、Ｅ３８０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ｓ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、Ｈ４３５Ａ、及びＨ４３５Ｒである。抗体の半減期を増加させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ及びＴ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａである。半減期を低減させるように行われ得る例示的な単独で又は組み合わせでの変異は、変異Ｈ４３５Ａ、Ｐ２５７Ｉ／Ｎ４３４Ｈ、Ｄ３７６Ｖ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ、Ｔ３０８Ｐ／Ｎ４３４Ａ及びＨ４３５Ｒである。
【0578】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｆｃ領域にＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異を含む。
【0579】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、タンパク質の活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させる及び／又はＣ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）若しくは食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を低減させる、Ｆｃ領域における少なくとも１つの変異を含む。
【0580】
本開示の多重特異性分子又は異種分子の、活性化ＦｃγＲへの結合を低減させた後に、エフェクター機能を低減させるように変異され得るｆｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１及び３６５が挙げられる。単独で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４における変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低下した本開示の多重特異性分子又は異種分子をもたらす例示的な変異の組み合わせは、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、すべてのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及びＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６－ｄｅｌｅｔｅｄ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７～２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１～４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。
【0581】
ＣＤＣを低減させた本開示の多重特異性分子又は異種分子をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。
【0582】
周知のＳ２２８Ｐ変異をＩｇＧ４抗体に加えて、ＩｇＧ４の安定性を増強することができる。
【0583】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓからなる群から選択されるＦｃ領域に少なくとも１つの変異を含む。
【0584】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｆｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｄ２６５Ｓ変異を含む。
【0585】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、Ｆｃ領域にＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異を含む。
【0586】
いくつかの実施形態では、本開示の多重特異性分子又は異種分子は、本開示の多重特異性分子又は異種分子のＦｃγＲへの結合を増強する、及び／又は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は食作用（ＡＤＣＰ）などのＦｃエフェクター機能を増強するＦｃ領域に少なくとも１つの変異を含む。
【0587】
本開示の多重特異性分子又は異種分子の活性化ＦｃγＲへの結合を増加させる、及び／又は、Ｆｃエフェクター機能を増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２３６、２３９、２４３、２５６，２９０，２９２、２９８、３００、３０５、３１２、３２６、３３０、３３２、３３３、３３４、３４５、３６０、３３９、３７８、３９６又は４３０（ＥＵインデックスに従った残基番号付け）が挙げられる。単一で又は組み合わせて行われ得る例示的な変異は、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｌ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３３０Ｋ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｔ及びＰ３９６Ｌである。ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰが増加したタンパク質をもたらす例示的な組み合わせの変異は、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ及びＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅである。
【0588】
ＣＤＣを増強させるように変異され得るＦｃ位置としては、位置２６７、２６８、３２４、３２６、３３３、３４５及び４３０が挙げられる。単一で又は組み合わせで行われ得る例示的な変異は、Ｓ２６７Ｅ、Ｆ１２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３４５Ｋ、Ｅ３４５Ｑ、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ３４５Ｙ、Ｅ４３０Ｓ、Ｅ４３０Ｆ及びＥ４３０Ｔである。ＣＤＣを増加させた本開示の多重特異性分子又は異種分子をもたらす例示的な組み合わせでの変異は、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ、Ｓ２６７Ｅ／Ｓ３２４Ｔ及びＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔである。
【0589】
本明細書に記載の特異性変異は、配列番号６６、６７及び６８それぞれのＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４野生型アミノ酸配列と比較した場合の変異である。
【0590】
配列番号６６、野生型ＩｇＧ１
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0591】
配列番号６７；野生型ＩｇＧ２
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0592】
配列番号６８；野生型ＩｇＧ４
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【0593】
本開示の多重特異性分子又は異種分子のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合は、フローサイトメトリーを使用して、各受容体を発現するように操作された細胞において評価され得る。例示の結合アッセイでは、９６ウェルプレート中１ウェル当たり２ｘ１０５個の細胞を播種し、ＢＳＡ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）中で４℃で３０分間ブロックした。細胞を、４℃で１．５時間氷上で、試験本開示の試験多重特異性分子又は試験異種分子とともにインキュベートする。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ－ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で４５分間、インキュベートする。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、その後、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁する。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によって、それぞれＢ２及びＢ４チャンネルを使用して検出する。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを決定する。解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用する。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットする。非線形回帰分析を実行する。
【0594】
５．４糖鎖工学
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役された本開示の多重特異性分子又は異種分子のＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域オリゴ糖成分の断片を操作することによって増強され得る。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、公知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に結合した二分岐複合体型オリゴ糖由来のコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変化させることなく改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介して、本開示の多重特異性分子又は異種分子のＡＤＣＣを増強させる。このような多重特異性分子又は異種分子は、培地のオスモル濃度の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２４９－２６５，２０１２）、変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７７：２６７３３－２６７４０）、変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の宿主細胞株としての適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＭＡｂｓ；２：４０５－４１５）、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３）、特異的に１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８）、あるいはβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ又は強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質のキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６）などの、Ｆｃオリゴ糖の二分岐複合型を有する比較的高いフコース非修飾免疫グロブリンの発現の成功につながると報告された異なる方法を使用して達成され得る。
Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に共役された本開示の多重特異性分子又は異種分子のＡＤＣＣを媒介する能力は、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域オリゴ糖成分の断片を操作することによって増強され得る。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ－グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、公知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態である。操作されていないＣＨＯ細胞により産生され得るＩｇ定常領域含有タンパク質は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片に結合した二分岐複合体型オリゴ糖由来のコアフコースの除去は、抗原結合又はＣＤＣ活性を変化させることなく改善されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を介して、本開示の多重特異性分子又は異種分子のＡＤＣＣを増強させる。このような多重特異性分子又は異種分子は、培地のオスモル濃度の制御（Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２４９－２６５，２０１２）、変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７７：２６７３３－２６７４０）、変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の宿主細胞株としての適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＭＡｂｓ；２：４０５－４１５）、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の宿主細胞株としての適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３）、特異的に１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対する低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８８：９０１－９０８）、あるいはβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩ又は強力なアルファ－マンノシダーゼＩ阻害物質のキフネンシンの共発現（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：５０３２－５０３６）などの、Ｆｃオリゴ糖の二分岐複合型を有する比較的高いフコース非修飾免疫グロブリンの発現の成功につながると報告された異なる方法を使用して達成され得る。
【0595】
いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む本開示の多重特異性分子又は異種分子は、約１％～約１５％、例えば、約１５％、１４％、１３％、１２％、１１％ １０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％のフコース含量を有する二分岐グリカン構造を有する。いくつかの実施形態では、Ｉｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む本開示の多重特異性分子又は異種分子は、約５０％、４０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、又は２０％のフコース含有量を有するグリカン構造を有する。
【0596】
「フコース含有量」は、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコース単糖類の量を指す。フコースの相対量は、フコース含有構造の全糖構造に対する割合である。これらは、複数の方法、例えば、１）国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されるように、Ｎ－グリコシダーゼＦ処理試料のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（例えば、複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ構造及び高マンノース構造）の使用、２）Ａｓｎ２９７グリカンの酵素放出、その後の誘導体化、並びに蛍光検出を備えたＨＰＬＣ（ＵＰＬＣ）及び／又はＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による検出／定量化、３）第１のＧｌｃＮＡｃ単糖類と第２のＧｌｃＮＡｃ単糖類との間を切断し、フコースを第１のＧｌｃＮＡｃに付加されたままにさせる、Ｅｎｄｏ Ｓ又は他の酵素によるＡｓｎ２９７グリカンの処理を伴うか又はこの処理なしでの、天然又は還元ｍＡｂのインタクトプロテイン分析、４）酵素消化（例えば、トリプシン又はエンドペプチダーゼＬｙｓ－Ｃ）によるｍＡｂの構成ペプチドへの消化、その後のＨＰＬＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ－ＭＳ）による分離、検出及び定量、５）Ａｓｎ ２９７にＰＮＧａｓｅ Ｆを有する特異的な酵素脱グリコシル化により、ｍＡｂタンパク質からｍＡｂオリゴ糖を分離すること、により特性決定及び定量化可能である。このように放出されるオリゴ糖は、フルオロフォアで標識し、実測された質量の理論上の質量との比較によるマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析によるグリカン構造の細かな特性評価、イオン交換ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｃ）によるシアル化の程度の決定、順相ＨＰＬＣ（ＧｌｙｃｏＳｅｐ Ｎ）による親水性基準に準拠するオリゴ糖型の分離及び定量、並びに高性能キャピラリー電気泳動－レーザー誘起蛍光（ＨＰＣＥ－ＬＩＦ）によるオリゴ糖の分離及び定量、を可能にする様々な補足的技術によって分離及び特定することができる。
【0597】
「低フコース」又は「低フコース含有量」は、約１％～１５％のフコース含有量を有するＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む、本開示の多重特異性分子又は異種分子を指す。
【0598】
「通常のフコース」又は「通常のフコース含有量」は、約５０％超、典型的には約８０％超又は８５％超のフコース含有量を有するＩｇ定常領域又はＩｇ定常領域の断片を含む、本開示の多重特異性分子又は異種分子を指す。
【0599】
５．５抗イディオタイプ抗体
抗イディオタイプ抗体は、本開示のｓｐＦｖに特異的に結合する抗体である。
抗イディオタイプ抗体は、本開示のｓｐＦｖに特異的に結合する抗体である。
【0600】
本発明はまた、本開示のｓｐＦｖに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【0601】
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、本開示のｓｐＦｖにおけるジスルフィド結合に結合する。
【0602】
いくつかの実施形態では、抗イディオタイプ抗体は、本開示のｓｐＦｖの抗原結合ドメインに結合する。
【0603】
５．６ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0604】
本開示はまた、本開示のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0605】
いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現のためのベクター、原核生物発現のためのベクター、真核生物発現のためのベクター、トランスポゾン系ベクター、又は所与の細胞若しくは生物への本開示のポリヌクレオチドの導入に好適な任意の他のベクターであり得る。本開示のｓｐＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ｓｐＦｖの発現を促進する発現ベクターの制御配列に作動可能に連結され得る。このような調節エレメントには、転写プロモータ、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクターはまた、複製起点、他の５’若しくは３’隣接非転写配列、５’若しくは３’非翻訳配列（必要なリボソーム結合部位など）、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は選択マーカーなどの１つ又は２つ以上の非転写要素を含み得る。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡであってもよい。ｓｐＦｖ発現を駆動するプロモータは、強い、弱い、組織特異性、誘導性又は発生特異性プロモータであり得る。使用され得る例示的なプロモータは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（hypoxanthine phosphoribosyl transferase、ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどである。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で恒常的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータとしては、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）最初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（Mouse Mammary Tumor Virus、ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus、ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma Virus、ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。メタロチオネイン促進剤、テトラサイクリン誘導性プロモータ、ドキシサイクリン誘導性プロモータ、タンパク質キナーゼＲ ２’，５’－オリゴアデニル酸シンセターゼ、Ｍｘ遺伝子及びＡＤＡＲ１などの１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答要素（interferon-stimulated response element、ＩＳＲＥ）を含有するなどの誘導性プロモータ。本開示のベクターはまた、１つ又は２つ以上の内部リボソーム進入部位（Internal Ribosome Entry Site、ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を増強させるのに有益であり得る。本開示のベクターは、環状であっても線形であってもよい。これらは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能的な複製系を含有するように調製され得る。複製系は、例えば、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、２μプラスミド、λ、ウシパピローマウイルスなどに由来していてよい。発現ベクターは、一過性の発現のため、安定な発現のため、又はそれらの両方のために設計され得る。発現ベクターは、構成的発現又は誘導性発現のために作製され得る。
【0606】
使用され得る例示的なベクターは、細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）並びにｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）である。追加のベクターとしては、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのバクテリオファージベクターを使用することができる。例示的な植物発現ベクターとしては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ０１．２、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１．３、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。例示的な動物発現ベクターとしては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。
【0607】
本開示はまた、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0608】
「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、後続世代においてある特定の修飾が生じ得るために、そのような後代は、親細胞に同一ではない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってもよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌（Escherichia coli）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、並びにサルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、及び様々なシュードモナス属（ｋ）の種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス属（Saccharomyces）（例えば、Ｓ．セレヴィシエ（S.cerevisiae））及びピキア属（Pichia）である。例示的な真核細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであってもよい。哺乳類真核細胞としては、不死化細胞株（例えばハイブリドーマ）又は骨髄腫細胞株（例えばＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＣＲＬ－１５８１）、ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）マウス細胞株）が挙げられる。例示的なヒト骨髄腫細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ－ＴＩＢ－１９６）である。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６１）、又はＤＧ４４などの、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来するものが挙げられる。
【0609】
本開示はまた、ｓｐＦｖが産生される条件下で本開示の宿主細胞を培養することと、宿主細胞により産生されたｓｐＦｖを回収することと、を含む、本開示のｓｐＦｖを産生する方法を提供する。ｓｃＦｖを作製し、それらを精製する方法は既知である。一旦合成されると（化学的に又は組換えで）、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従って、本開示のｓｃＦｖを精製することができる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。本開示のｓｃＦｖは、実質的に純粋であってもよく、例えば、細胞残屑、対象タンパク質以外の巨大分子などの汚染物質を含まない、例えば、少なくとも約８０％～８５％の純度、少なくとも約８５％～９０％の純度、少なくとも約９０％～９５％の純度、又は少なくとも約９８％～９９％の純度、又はそれ以上の純度であってもよい。
【0610】
本開示のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学的方法を使用してベクターに組み込まれ得る。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を使用して行われる。
【0611】
５．７医薬組成物及び投与
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。治療用途のために、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子は、薬学的に許容される担体中の活性成分として、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子の有効量を含有する医薬組成物として調製され得る。「担体」は、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。それらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのような医薬製剤中の本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。
本開示はまた、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。治療用途のために、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子は、薬学的に許容される担体中の活性成分として、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子の有効量を含有する医薬組成物として調製され得る。「担体」は、本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いてよい。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。それらは、従来周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌され得る。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含み得る。そのような医薬製剤中の本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子の濃度は、約０．５重量％未満から通常少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１－１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８－９８９を参照されたい。
【0612】
本開示のｓｐＦｖ、ｓｐＦｖを含む異種分子又はｓｐＦｖを含む多重特異性分子投与方法は、当該技術分野において周知のように、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内若しくは皮下、経粘膜（経口、鼻腔内、膣内、直腸）、又は当業者に理解される他の手段などの任意の好適な経路であり得る。
【0613】
５．８本開示のｓｐＦｖを調製するためのプロセス
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合部位を形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合部位を形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0614】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬを提供することと、
第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたＬを提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0615】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
抗原結合部位を形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を及びＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
抗原結合部位を形成する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供することと、
第１のＬ Ｃｙｓ及び第２のＬ Ｃｙｓを含むか、又はそれを含むように操作されたリンカー（Ｌ）を提供することと、
構造的に保存された表面露出ＶＨフレームワーク残基位置にＶＨ Ｃｙｓを含むようにＶＨを操作することと、
構造的に保存された表面露出ＶＬフレームワーク残基位置にＶＬ Ｃｙｓを含むようにＶＬを操作することと、
ＶＨ Ｃｙｓと第１のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を及びＶＬ Ｃｙｓと第２のＬ Ｃｙｓとの間にジスルフィド結合を形成して、安定化ｓｃＦｖを調製することと、を含む、プロセスを提供する。
【0616】
ジスルフィド結合は、典型的には、ｓｃＦｖの発現中に形成される。
【0617】
抗原結合ドメインを形成するｓｃＦｖの任意の既知のＶＨ／ＶＬ対は、本開示の安定化ｓｃＦｖに操作され得る。代替的に、対象の抗原結合ＶＨ／ＶＬ対は、既知の方法を使用して新規に特定され得、得られたＶＨ／ＶＬ対は、ｓｐＦｖ形式に操作され得る。
【0618】
例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ法を使用して、対象の抗原に結合し、得られたＶＨ／ＶＬ対がｓｐＦｖとして操作され得る、ＶＨ／ＶＬ対を特定することができる。代替的に、自身のゲノムにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座位を担持するマウス、ラット又はニワトリなどのトランスジェニック動物を使用して、抗原結合断片を生成することができ、これらは、例えば、米国特許第６，１５０，５８４号、国際公開第１９９９／４５９６２号、同第２００２／０６６６３０号、同第２００２／４３４７８号、同第２００２／０４３４７８号、及び同第１９９０／０４０３６号に記載されている。このような動物の内在的な免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組換えを使用して、導入染色体（transchromosome）を使用して、又はミニ遺伝子を使用して、少なくとも１つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を動物のゲノムに挿入してもよい。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ＿ｃｏｍ）、Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｈａｒｂｏｕｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＿ｃｏｍ）、Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（ＯＭＴ）（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｏｍｔｉｎｃ＿ｎｅｔ）、ＫｙＭａｂ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｋｙｍａｂ＿ｃｏｍ）、Ｔｒｉａｎｎｉ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｔｒｉａｎｎｉ＿ｃｏｍ）及びＡｂｌｅｘｉｓ（ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ａｂｌｅｘｉｓ＿ｃｏｍ）などの企業は、上記の技術を使用して、選択抗原を標的としたヒト抗体を提供するべく取り組んでいる場合がある。ファージディスプレイをまた、使用して、ｓｐＦｖとして操作され得る抗原結合断片を生成し得る。
【0619】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ヒト化である。いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、ヒトである。いくつかの実施形態では、本開示のｓｐＦｖは、非ヒトである。
【0620】
いくつかの実施形態では、ＶＨ ＣｙｓとＶＬ Ｃｙｓとの間の距離は、安定化ｓｃＦｖ中で約７Å～約９Åである。
【0621】
いくつかの実施形態では、ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ４０、Ｈ４３、Ｈ４６又はＨ１０５にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0622】
いくつかの実施形態では、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３、Ｌ５、Ｌ３９、Ｌ４２、Ｌ４５、Ｌ１００又はＬ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0623】
いくつかの実施形態では、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、又は
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４０にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４３にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ４６にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ３９にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ４５にあるか、
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１００にあるか、又は
ＶＨ Ｃｙｓは、Ｈ１０５にあり、ＶＬ Ｃｙｓは、Ｌ１０２にあり、残基番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。
【0624】
いくつかの実施形態では、Ｌは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域に由来する連続アミノ酸配列を含む。
【0625】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒト又は非ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0626】
いくつかの実施形態では、Ｉｇヒンジ領域は、ヒトＩｇヒンジ領域に由来する。
【0627】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである。
【0628】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２３）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｙは、１～３の整数である。
【0629】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列Ｃ（Ｘ）ｙＣ（配列番号２４）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＰｒｏであり、ｙは、１～３の整数である。
【0630】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列ＣＰＣ、ＣＧＣ、ＣＳＣ、ＣＰＰＣ（配列番号１）、ＣＧＰＣ（配列番号２８）、ＣＰＧＣ（配列番号２９）、ＣＧＧＣ（配列番号３０）、ＣＳＰＧ（配列番号３１）、ＣＰＳＣ（配列番号３２）、ＣＳＳＣ（配列番号３３）、ＣＧＳＣ（配列番号３４）、ＣＳＧＣ（配列番号３５）、ＣＰＰＰＣ（配列番号３６）、ＣＧＰＰＣ（配列番号３７）、ＣＰＧＰＣ（配列番号３８）、ＣＰＰＧＣ（配列番号３９）、ＣＧＧＰＣ（配列番号４０）、ＣＰＧＧＣ（配列番号４１）、ＣＧＧＧＣ（配列番号４２）、ＣＳＰＰＣ（配列番号４３）、ＣＰＳＰＣ（配列番号４４）、ＣＰＰＳＣ（配列番号４５）、ＣＳＳＰＣ（配列番号４６）、ＣＰＳＳＣ（配列番号４７）、ＣＳＳＳＣ（配列番号４８）、ＣＧＳＰＣ（配列番号４９）、ＣＰＧＳＣ（配列番号５０）、ＣＳＧＰＣ（配列番号５１）又はＣＰＳＧＣ（配列番号５２）を含む。
【0631】
いくつかの実施形態では、Ｌは、約１４～約１９個のアミノ酸、例えば、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個又は約１９個のアミノ酸を含む。
【0632】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２５）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0633】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２６）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＴｙｒであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0634】
いくつかの実施形態では、Ｌは、アミノ酸配列（Ｘ）ｍＣ（Ｘ）ｙＣ（Ｘ）ｎ（配列番号２７）を含み、式中、Ｘは、Ｇｌｙ又はＰｒｏであり、ｍは、６～９の整数であり、ｙは、１～３の整数であり、ｎは、４～６の整数である。
【0635】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号２、３、４、５、６、又は７のアミノ酸配列を含む。
【0636】
いくつかの実施形態では、本開示の安定化ｓｐＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0637】
いくつかの実施形態では、本開示の安定化ｓｐＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0638】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0639】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0640】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0641】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0642】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0643】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ５にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0644】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0645】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ４５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0646】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
ＶＨは、Ｈ３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３９にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＬ－Ｌ－ＶＨ配向にある。
【0647】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0648】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0649】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0650】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４３にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0651】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0652】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0653】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0654】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４０にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0655】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１００にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0656】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0657】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ５にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0658】
いくつかの実施形態では、
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
ＶＨは、Ｈ４６にＣｙｓを含み、
ＶＬは、Ｌ３にＣｙｓを含み、
Ｌは、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含み、
ｓｃＦｖは、ＶＨ－Ｌ－ＶＬ配向にある。
【0659】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0660】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0661】
いくつかの実施形態では、Ｌは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【0662】
いくつかの実施形態では、本開示の安定化ｓｐＦｖは、ジスルフィド結合を欠いている親ｓｃＦｖと比較した場合、同等の親和性で抗原に結合する。
【0663】
本開示はまた、安定化ｓｃＦｖを調製するためのプロセスであって、
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従い、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、提供することと、
ポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させて、安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセスを提供する。
ＶＨ、Ｌ、及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを提供することであって、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４０にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４３にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ４６にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ３９にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ４５にＣｙｓを含むか、
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１００にＣｙｓを含むか、又は
ＶＨが、Ｈ１０５にＣｙｓを含み、ＶＬが、Ｌ１０２にＣｙｓを含み、残基番号付けが、Ｃｈｏｔｈｉａに従い、
Ｌが、配列番号２、３、４、５、６又は７のアミノ酸配列を含む、提供することと、
ポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させて、安定化ｓｃＦｖを産生することと、を含む、プロセスを提供する。
【0664】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。
【0665】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。
【0666】
本明細書にて開示した実施形態のいくつかを更に説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示を目的とするものであって、本開示の実施形態を制限するものではない。
【実施例】
【0667】
６．１実施例１：安定化ｓｃＦｖの設計
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、２つの可変ドメインＶＬ及びＶＨを介してその標的抗原を認識する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ又はＶＨ－リンカー－ＶＬの配向のいずれかにおける可撓性リンカーとのＶＬ及びＶＨの遺伝子融合としてＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）によって最初に設計された。可撓性リンカーは、典型的には、（ＧＧＧＧＳ）ｎ；ｎ＝１～４（配列番号２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）などのグリシン－セリンリンカーの３つ又は４つの反復である。ｓｃＦｖは、抗原結合特異性及び主にその親ｍＡｂの親和性を再現する。これらのｓｃＦｖ分子には、検出／診断試薬として、又は二重、多重特異性治療薬（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡｂ ９：１８２－２１２）又はＣＡＲ－Ｔ治療薬（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２１（１ Ｐｔ １）：１２７－１３０、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２：３３１－３３２、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５－７３３）などのより精巧な分子を作製するための構成要素としての広い用途が見出されている。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、２つの可変ドメインＶＬ及びＶＨを介してその標的抗原を認識する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ又はＶＨ－リンカー－ＶＬの配向のいずれかにおける可撓性リンカーとのＶＬ及びＶＨの遺伝子融合としてＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）によって最初に設計された。可撓性リンカーは、典型的には、（ＧＧＧＧＳ）ｎ；ｎ＝１～４（配列番号２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５）などのグリシン－セリンリンカーの３つ又は４つの反復である。ｓｃＦｖは、抗原結合特異性及び主にその親ｍＡｂの親和性を再現する。これらのｓｃＦｖ分子には、検出／診断試薬として、又は二重、多重特異性治療薬（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡｂ ９：１８２－２１２）又はＣＡＲ－Ｔ治療薬（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２１（１ Ｐｔ １）：１２７－１３０、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２：３３１－３３２、Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５：７２５－７３３）などのより精巧な分子を作製するための構成要素としての広い用途が見出されている。
【0668】
ｓｃＦｖ分子の課題の１つは、安定性が低く、凝集する傾向を有する（Ｗｏｒｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０５：９８９－１０１０、Ｒｏｔｈｌｉｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４７：７７３－７８９で概観されている）。それらの特性を改善するために多くの戦略が試みられている（Ａｒｎｄ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１２：２２１－２２８、Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６２：５８０－５９３、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １２：１－１１、Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ ａｎｄ Ｔｅｓｓｉｅｒ（２０１２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ３：２６３－２８６、Ａｓｉａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｍｕｎ ４：２９０１、Ｇｉｌ ａｎｄ Ｓｃｈｒｕｍ（２０１３）Ａｄｖ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｔｅｃｃｃｈｎｏｌ ４：７３－８４、Ｔｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｔｅｓｓｉｅｒ（２０１５）Ａｎｎｕ ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １７：１９１－２１６）。これらの戦略には、追加の二量体化モチーフなどを使用して、異なる実験方法を使用してＶＬ／ＶＨドメインの安定性及び／又は界面相互作用を改善する、ＶＬ／ＶＨドメイン間にジスルフィド結合を導入することが含まれる。重要な困難は、これらの戦略のほとんどが、ＶＨ／ＶＬ対に特異的であることが多く、他のＶＨ／ＶＬ対に容易に移送され得ないことである。場合により、操作は、ＶＬ／ＶＨ構造及びｓｃＦｖ特性に悪影響を及ぼし得る。最近、Ｚｈａｎｇらは、抗アフラトキシンＢ１ ｓｃＦｖ（Ｈ４）のＶＨの４４位とＶＬの位置１００との間にジスルフィドを導入し、その結合親和性を維持しながら、ｓｃＦｖの有意な安定化を首尾よく達成した（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １２：１－１１）。しかしながら、選択された２つの位置間の距離及び角度の制限のため、他のＶＬ／ＶＨ対に適用される場合、ＶＬ／ＶＨ間ジスルフィドは、結合に必要とされることが多い２つのドメイン間の相対的な配向を制限し／歪ませ得る。
【0669】
Ｆａｂ断片の重鎖と軽鎖との間の界面は、ＶＨ／ＶＬ及びＣＨ１／ＣＬ相互作用を含む。２つの独立した相互作用セットは、相乗的安定化効果をもたらす。更に、Ｖ／Ｃ接合部はまた、いくらかの安定化効果に寄与する。比較すると、ｓｃＦｖにおいて、ＶＨ／ＶＬ界面は、ＶＨ／ＶＬ相互作用のみによって維持される。リンカーは、その長さが二量体及びオリゴマー形成のためのｓｃＦｖ間相互作用を促進するように短く設計されている場合を除いて、可撓性で非限定的であるように設計されている。リンカーの長さ及び性質は、十分に長い場合、ｓｃＦｖの安定性にほとんど寄与しないことが知られている。
【0670】
６．１．１「ステープル処理」設計
本明細書の目的は、安定化ｓｃＦｖを設計して生成するが、ｓｃＦｖを形成するＶＨとＶＬとの間の相対的な動きに悪影響を及ぼさないようにすることであった。これは、ＶＨとリンカーとの間及びＶＬとリンカーとの間のジスルフィド結合を操作することによってｓｃＦｖを安定化することにより達成された。制限（すなわち、ジスルフィド結合）は、適切に位置付けされる場合、上記のＣＨ１／ＣＬ及びＶ／Ｃ相互作用によってもたらされる相乗効果の役割を果たす。この目的のために、ＶＨ及びＶＬに１つずつ、２つの構造的に保存された表面露出フレームワーク位置（アンカーポイント）を特定し、これらは、典型的な予測された抗原結合部位と重複せず、システイン（Ｃｙｓ）残基に変異したものであった。その後、２つの位置が、Ｃｙｓ位置に対する柔軟なリンカーにおいて選択された。リンカーＣｙｓ残基間の距離及び位置が、リンカーＣｙｓと各アンカーポイントとの間のジスルフィド結合の形成を促進する様式で設計された場合、ＶＨ及びＶＬは、ジスルフィド結合の非存在下での係留と比較して、より堅固に係留され得る。このスキームは、ＣＰＰＣ配列（配列番号１）を含有する例示的なリンカーを有する図１に示されている。可撓性リンカーとアンカーポイントとの間にジスルフィド結合を形成する概念は、本明細書では「ステープル処理」と称される。得られた「ステープル処理された」ｓｃＦｖ分子は、本明細書ではｓｐＦｖ（「ステープル処理されたＦｖ」）と称される。
本明細書の目的は、安定化ｓｃＦｖを設計して生成するが、ｓｃＦｖを形成するＶＨとＶＬとの間の相対的な動きに悪影響を及ぼさないようにすることであった。これは、ＶＨとリンカーとの間及びＶＬとリンカーとの間のジスルフィド結合を操作することによってｓｃＦｖを安定化することにより達成された。制限（すなわち、ジスルフィド結合）は、適切に位置付けされる場合、上記のＣＨ１／ＣＬ及びＶ／Ｃ相互作用によってもたらされる相乗効果の役割を果たす。この目的のために、ＶＨ及びＶＬに１つずつ、２つの構造的に保存された表面露出フレームワーク位置（アンカーポイント）を特定し、これらは、典型的な予測された抗原結合部位と重複せず、システイン（Ｃｙｓ）残基に変異したものであった。その後、２つの位置が、Ｃｙｓ位置に対する柔軟なリンカーにおいて選択された。リンカーＣｙｓ残基間の距離及び位置が、リンカーＣｙｓと各アンカーポイントとの間のジスルフィド結合の形成を促進する様式で設計された場合、ＶＨ及びＶＬは、ジスルフィド結合の非存在下での係留と比較して、より堅固に係留され得る。このスキームは、ＣＰＰＣ配列（配列番号１）を含有する例示的なリンカーを有する図１に示されている。可撓性リンカーとアンカーポイントとの間にジスルフィド結合を形成する概念は、本明細書では「ステープル処理」と称される。得られた「ステープル処理された」ｓｃＦｖ分子は、本明細書ではｓｐＦｖ（「ステープル処理されたＦｖ」）と称される。
【0671】
６．１．２アンカーポイントの選択、ステープル配列の設計及びリンカー
広く適用可能であるステープル処理スキームでは、アンカーポイントが構造的に保存され、ＶＬ及びＶＨの両方の表面に露出され、Ｃｙｓ残基に対する変異はＶＬ及びＶＨのフォールディング又は抗原への結合に影響を与えないことが重要である。ＶＬ及びＶＨ ドメインのアンカーポイント並びにＮ及びＣ末端の距離及び幾何学的形状もまた、適切なジスルフィド形成の重要な考慮事項である。
広く適用可能であるステープル処理スキームでは、アンカーポイントが構造的に保存され、ＶＬ及びＶＨの両方の表面に露出され、Ｃｙｓ残基に対する変異はＶＬ及びＶＨのフォールディング又は抗原への結合に影響を与えないことが重要である。ＶＬ及びＶＨ ドメインのアンカーポイント並びにＮ及びＣ末端の距離及び幾何学的形状もまた、適切なジスルフィド形成の重要な考慮事項である。
【0672】
アンカーポイントは、ＶＬ－リンカー－ＶＨ及びＶＨ－リンカー－ＶＬ配向におけるｓｐＦｖのために別々に選択された。ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の場合、ＶＬ中のＣｈｏｔｈｉａ位置４２及びＶＨのＣｈｏｔｈｉａ位置１０５が、アンカーポイントとして選択された。ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向におけるｓｐＦｖの選択されたアンカーポイントのグラフ図を、図２においてヒト生殖細胞系抗体（以下、ｐｄｂ ＩＤ ５Ｉ１９，ＧＬｋ１）のＦｖ内に示す。ＧＬｋ１において、ＶＬ Ｃｈｏｔｈｉａ位置４２は、リジン（Ｋ）及びＶＨ Ｃｈｏｔｈｉａ位置１０５グルタミン（Ｑ）である。ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向の場合、ＶＬ中のＣｈｏｔｈｉａ位置１００及びＶＨのＣｈｏｔｈｉａ位置４３が、アンカーポイントとして選択された。図３は、ヒト生殖細胞系抗体（ｐｄｂ ＩＤ ５Ｉ１９，ＧＬｋ１）のＦｖ内のＶＨ－リンカー－ＶＬ配向における ｓｐＦｖについての選択されたアンカーポイントのグラフ図を示す。ＧＬｋ１において、ＶＬ Ｃｈｏｔｈｉａ位置１００は、グルタミン（Ｑ）であり、ＶＨ Ｃｈｏｔｈｉａ位置４３は、リジン（Ｋ）である。選択されたアンカーポイントは構造的に保存され、ジオメトリはカッパ又はラムダ軽鎖のいずれかを含有する抗体において非常に類似していた。アンカーポイントの対間の距離は、約７Å（ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向について）～約９Å（ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向について）の範囲であった。
【0673】
ＶＨ及びＶＬを接続するリンカー内に埋め込まれたステープル配列は、ｓｐＦｖ中のアンカーポイント間の距離と同様の長さであるように設計された。ステープル配列の初期の例として、ＣＰＰＣ（配列番号１）は、この配列がヒトＩｇＧ１ヒンジにおいて並びにいくつかのげっ歯類ＩｇＧにおいて天然に生じるために、可能なステープル配列として選択された。ヒト及びマウスＩｇＧ分子のヒンジの構造は、マウスＩｇＧヒンジ（図４）及びヒトＩｇＧ（図５）におけるＣβ（ｃｙｓ１）－Ｃβ（ｃｙｓ２）距離が約７Å～９Åの範囲であることを示した。この範囲は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ及びＶＨ－リンカー－ＶＬ配向の両方の２つのアンカーポイント間の距離と非常に類似しているため、ＣＰＰＣ（配列番号１）ステープル配列は、ステープル処理のための正しい幾何学的形状を提供する可能性を有し、すなわち、適切なジスルフィド結合を、アンカーポイントに効率的及び正しく形成する。一般に、ステープル配列は、２つのＣｙｓ残基を有するように設計された。適切なステープル処理のために、ステープル配列のＮ末端Ｃｙｓは、ｓｐＦｖ Ｎ末端ドメインアンカーポイントとジスルフィド結合を形成し、ステープル配列のＣ末端Ｃｙｓは、ｓｐＦｖ Ｃ末端ドメインアンカーポイントとのジスルフィド結合を形成した。
【0674】
したがって、ＶＨ及びＶＬを接続するリンカーは、ステープル配列並びにＮ末端及びＣ末端の両方の接続配列を含むように設計されて、リンカーを延長して、ＶＨ及びＶＬの内皮折り畳みを可能にし、かつステープル配列の適切な位置付けを促進するのに十分なリンカー長を提供する。
【0675】
ＶＬ－リンカー－ＶＨ設計では、ＶＬアンカーポイント（Ｋ４２）、ＶＨアンカーポイント（Ｑ１０５）、ＶＬのＣ末端（Ｋ１０７）及びＶＨのＮ末端（Ｑ１）間の距離を、図２に示す。ＶＨ－リンカー－ＶＬ設計では、ＶＬアンカーポイント（Ｑ１００）、ＶＨアンカーポイント（Ｋ４３）、ＶＨのＣ末端（Ｓ１１４）及びＶＬのＮ末端（Ｄ１）間の距離を、図３に示す。モデリングは、これらの距離が約１４～１９個の残基のリンカー長によって広げられ得、４個の残基のステープル配列が、約６～９個の残基のＮ末端リンカー伸長及び約４～６個の残基のＣ末端リンカー伸長に隣接していることを示唆した。したがって、設計されたリンカー長は、ｎ＋４＋ｍとして表され得、式中、ｎ＝６～９個の残基及びｍ＝４～６個の残基であり、４は、ＣＰＰＣ（配列番号１）ステープル配列の長さを示す。ｎ及びｍ個の残基は、グリシン又はセリン、又は他のアミノ酸残基であり得る。これらのリンカーの長さは、クランブリングを可能するには短すぎるが、ステープル処理を可能にするに十分な長さであり、十分に柔軟であると予想される。
【0676】
６．２実施例２：ｓｐＦｖの生成及び特性評価
ステープル処理設計を評価するために、３つのヒト抗体を選択して、ｓｃＦｖ及び対応するｓｐＦｖ：合成ファージ抗体ライブラリＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－３９６）からのカッパ軽鎖を有する２つの抗体（ＧＬｋ１及びＧＬｋ２）及び論文（Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９４：９０５－９２１）から得られたラムダ含有抗体（ＣＡＴ２２００）を生成した。ＣＡＴ２２００について、Ｔ２８Ｇ変異を親ＶＨに導入して、変異体（ＣＡＴ２２００ ａ）を生成して、その標的ＩＬ－１７とのその相互作用のいくつかを低減させた。更に、Ｓ４２Ｑ変異（Ｃｈｏｔｈｉａ）を親ＣＡＴ２２００ ＶＬに操作し、Ｔ２８Ｇ ＶＨと対にしてＣＡＴ２２００ｂを生成した。ＧＬｋ１、ＧＬｋ２、ＣＡＴ２２００ａ及びＣＡＴ２２００ｂのＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を、それぞれ図６及び図７に示す。ＶＨドメインアミノ酸配列は、ＢＡＴ２２００ａとＣＡＴ２２００ｂとの間で同一である。ＧＬｋ１ＶＨは、ヒトＩＧＨＶ２－２３＊０１ ＧＬｋ２ＶＨ対ヒトＩＧＨＶ５－５１、ＣＡＴ２２００ＶＨ対ヒトＩＧＨＶ２－２３＊０１に最も近い。ＧＬｋ１ＶＬは、ヒトＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＧＬｋ２ＶＬ対ヒトＩＧＫＶ３－２０＊０１、及びＣＡＴ２２００ＶＬ対ヒトＩＧＬＶ ６－５７＊０１に最も近い。
ステープル処理設計を評価するために、３つのヒト抗体を選択して、ｓｃＦｖ及び対応するｓｐＦｖ：合成ファージ抗体ライブラリＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５－３９６）からのカッパ軽鎖を有する２つの抗体（ＧＬｋ１及びＧＬｋ２）及び論文（Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９４：９０５－９２１）から得られたラムダ含有抗体（ＣＡＴ２２００）を生成した。ＣＡＴ２２００について、Ｔ２８Ｇ変異を親ＶＨに導入して、変異体（ＣＡＴ２２００ ａ）を生成して、その標的ＩＬ－１７とのその相互作用のいくつかを低減させた。更に、Ｓ４２Ｑ変異（Ｃｈｏｔｈｉａ）を親ＣＡＴ２２００ ＶＬに操作し、Ｔ２８Ｇ ＶＨと対にしてＣＡＴ２２００ｂを生成した。ＧＬｋ１、ＧＬｋ２、ＣＡＴ２２００ａ及びＣＡＴ２２００ｂのＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を、それぞれ図６及び図７に示す。ＶＨドメインアミノ酸配列は、ＢＡＴ２２００ａとＣＡＴ２２００ｂとの間で同一である。ＧＬｋ１ＶＨは、ヒトＩＧＨＶ２－２３＊０１ ＧＬｋ２ＶＨ対ヒトＩＧＨＶ５－５１、ＣＡＴ２２００ＶＨ対ヒトＩＧＨＶ２－２３＊０１に最も近い。ＧＬｋ１ＶＬは、ヒトＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＧＬｋ２ＶＬ対ヒトＩＧＫＶ３－２０＊０１、及びＣＡＴ２２００ＶＬ対ヒトＩＧＬＶ ６－５７＊０１に最も近い。
【0677】
すべてのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子を生成し、ＶＬ－リンカー－ＶＨ及びＶＨ－リンカー－ＶＬ配向の両方で発現させた。ｓｃＦｖ構築物の場合、標準（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２）リンカーを使用した。ｓｐＦｖの場合、上記のｎ及びｍ範囲内の異なるリンカー長を使用した。ＧＬｋ１ ｓｐＦｖの場合、両方の配向について９－４－５リンカーを使用した。ＧＬｋ２ ｓｐＦｖの場合、９－４－５及び６－４－６リンカー長を、それぞれＶＬ－ＶＨ及びＶＨ－ＶＬ配向に使用した。ＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖの場合、ＶＬ－ＶＨ分子を、それぞれ８－４－４及び９－４－４リンカーで作製し、ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬを、９－４－４リンカーで作製した。表４は、生成された分子及びそれらのリンカー配列を示す。表５は、生成された分子のアミノ酸配列を示す。
【0678】
【表4】
【0679】
【表5-1】
【0680】
【表5-2】
【0681】
ＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨを除くすべてのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子は、ＣＭＶプロモータ駆動哺乳動物発現ベクターにクローニングされた。これらの構築物を、製造元プロトコルを使用してＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトし、細胞を５日間培養した。各タンパク質を、ＡＫＴＡＸＰＲＥＳＳシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、１ｍｌのＨｉｓ－ＴＲＡＰＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で清澄化した上清から精製した。カラムを０～１００％の勾配の溶出緩衝液（洗浄緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール）で調製して、緩く結合したニッケルを除去し、次いで、ＤＰＢＳで再平衡化した。透明化した上清を、最初に５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５及び２０ｍＭのイミダゾールに対して適合させ、次いで、４℃、０．８ｍＬ／分で１ｍＬのＨｉｓＴＲＡＰ ＨＰカラムにロードした。次いで、安定したベースラインが得られるまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。次いで、カラムを２０ＣＶの洗浄緩衝液で更に洗浄し、溶出緩衝液で単一の注入ループに溶出し、２６／１０ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラムで１倍ＤＰＢＳ中で脱塩し、画分を収集した。次いで、精製したタンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した。Ｇｌｋ２ ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質を、熱安定性測定（ＤＳＣ及びＮａｎｏＤＳＦ）ためにＤＰＢＳ及び他の研究のために２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５及び１００ｍＭのＮａＣｌ中で透析した。他のｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質を、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０及び１００ｍＭのＮａＣｌ中で透析した。
【0682】
ＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨは、ベンダーから購入した。濃度は、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２中、０．７７ｍｇ／ｍＬであった。ＩＬ－１７の変異体（Ｋ７０Ｑ Ａ１３２Ｑ Ｃ１０６Ｓ変異を有する１２－１３２、以下簡略化のためにＩＬ－１７）（配列番号２２）を、Ａｃｃｅｌａｇｅｎ（ＣＡ）から購入した。タンパク質が、それらの独自の再折り畳みプロトコル後の大腸菌包封入体から再び折り畳まれ、２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０中１．５０ｍｇ／ｍＬで提供される。
【0683】
配列番号２２（ＩＬ－１７Ａ変異体）
ＭＮＳＥＤＫＮＦＰＲＴＶＭＶＮＬＮＩＨＮＲＮＴＮＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲＳＴＳＰＷＮＬＨＲＮＥＤＰＥＲＹＰＳＶＩＷＥＡＱＣＲＨＬＧＣＩＮＡＤＧＮＶＤＹＨＭＮＳＶＰＩＱＱＥＩＬＶＬＲＲＥＰＰＨＳＰＮＳＦＲＬＥＫＩＬＶＳＶＧＣＴＣＶＴＰＩＶＨＨＶＱ
ＭＮＳＥＤＫＮＦＰＲＴＶＭＶＮＬＮＩＨＮＲＮＴＮＴＮＰＫＲＳＳＤＹＹＮＲＳＴＳＰＷＮＬＨＲＮＥＤＰＥＲＹＰＳＶＩＷＥＡＱＣＲＨＬＧＣＩＮＡＤＧＮＶＤＹＨＭＮＳＶＰＩＱＱＥＩＬＶＬＲＲＥＰＰＨＳＰＮＳＦＲＬＥＫＩＬＶＳＶＧＣＴＣＶＴＰＩＶＨＨＶＱ
【0684】
６．２．１生成されたｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子の熱安定性
ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子の熱安定性を、示差熱熱量測定（ＤＳＣ）によって調査した。ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質を、ＧＬｋ１については１倍ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ＧＬｋ２についてはＣＡＴ２２００ａ／ＣＡＴ２２００ｂ又はＭＥＳ（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）に対して一晩透析した。次いで、透析緩衝液は、０．２２マイクロメートルで濾過され、参照溶液として、及びＤＳＣ実験における緩衝液緩衝ブランクのために使用された。タンパク質を、濾過した緩衝液中で約０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、各タンパク質又は緩衝液試料４００μＬを９６ディープウェルプレート（ＭｉｃｒｏＬｉｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、０７－２１００）にロードし、実験の過程にわたってオートサンプラードロワー内で４℃に保持した。オートサンプラー（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたＭｉｃｒｏＣａｌキャピラリーＤＳＣを使用して、ＤＳＣ実験を行った。ＤＳＣスキャンは、２５～９５℃で試料再スキャンなしの６０℃／ｈのスキャン速度で行った。フィードバックを選択せず、フィルタリング期間を１５秒に設定した。各試料後、細胞を１０％のＣｏｎｔｒａｄ－７０溶液で洗浄し、緩衝液－緩衝液ブランクを実行した。Ｄａｔａ解析を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－キャピラリーＤＳＣ自動分析アドオン（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたＯｒｉｇｉｎ ７．０を使用して行った。ベースライン範囲及びタイプを手動で選択し、次いで、減算した。以前のバッファブランクを試料曲線から減算した後、濃度依存性正規化を行った。熱融解プロファイルを、２状態及び非２状態遷移の両方を使用して解析した。２状態フィット（１つの遷移）は、実験曲線とは十分に一致しなかった。したがって、２つの遷移（Ｔｍ１及びＴｍ２）を、非２状態フィットを手動で行うことによって計算した。Ｔｍデータを表６に報告する。すべてのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質のＤＳＣプロファイルは、非２状態遷移によってのみ適合され得る歪度を示した。したがって、各ｓｃＦｖ又はｓｐＦｖについて、２つの遷移（Ｔｍ１及びＴｍ２）が報告された（表６）。ほぼ間違いなく、これらの２つの遷移は、それぞれＶＬ及びＶＨドメインの融解Ｔｍに対応する。一般に、Ｔｍ１又はＴｍ２のいずれかについてのｓｃＦｖとｓｐＦｖとの間の違いの比較時に、開始ｓｃＦｖのＴｍに関係なく、ステープル処理によって約１０℃の増加がある。例外が１つだけあり、すなわち、ＧＬｋ２ ｓｃＦｖとｓｐＦｖ（ＶＨ－ＶＬ配向）との差が、約７℃である。これは、ステープル処理の幾何学的形状にわずかなひずみを引き起こし得るより短い６＋４＋６リンカーに起因する可能性が高い。ΔＴｍ１（ＶＬ）及びΔＴｍ２（ＶＨ）がほぼ同一であったという事実は、ステープル処理が、ＶＬ／ＶＨ相互作用を強化することに加えて、それ自体のドメインの安定化につながることを示唆している。代替的に、より強いＶＨ／ＶＬ相互作用は、安定化効果をＶＬ／ＶＨドメインの安定化に伝達する。要約すると、本明細書に記載されているステープル処理は、ｓｃＦｖの安定性を大幅に増加させる。
ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子の熱安定性を、示差熱熱量測定（ＤＳＣ）によって調査した。ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質を、ＧＬｋ１については１倍ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ＧＬｋ２についてはＣＡＴ２２００ａ／ＣＡＴ２２００ｂ又はＭＥＳ（２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ）に対して一晩透析した。次いで、透析緩衝液は、０．２２マイクロメートルで濾過され、参照溶液として、及びＤＳＣ実験における緩衝液緩衝ブランクのために使用された。タンパク質を、濾過した緩衝液中で約０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、各タンパク質又は緩衝液試料４００μＬを９６ディープウェルプレート（ＭｉｃｒｏＬｉｔｅｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、０７－２１００）にロードし、実験の過程にわたってオートサンプラードロワー内で４℃に保持した。オートサンプラー（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたＭｉｃｒｏＣａｌキャピラリーＤＳＣを使用して、ＤＳＣ実験を行った。ＤＳＣスキャンは、２５～９５℃で試料再スキャンなしの６０℃／ｈのスキャン速度で行った。フィードバックを選択せず、フィルタリング期間を１５秒に設定した。各試料後、細胞を１０％のＣｏｎｔｒａｄ－７０溶液で洗浄し、緩衝液－緩衝液ブランクを実行した。Ｄａｔａ解析を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－キャピラリーＤＳＣ自動分析アドオン（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いたＯｒｉｇｉｎ ７．０を使用して行った。ベースライン範囲及びタイプを手動で選択し、次いで、減算した。以前のバッファブランクを試料曲線から減算した後、濃度依存性正規化を行った。熱融解プロファイルを、２状態及び非２状態遷移の両方を使用して解析した。２状態フィット（１つの遷移）は、実験曲線とは十分に一致しなかった。したがって、２つの遷移（Ｔｍ１及びＴｍ２）を、非２状態フィットを手動で行うことによって計算した。Ｔｍデータを表６に報告する。すべてのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質のＤＳＣプロファイルは、非２状態遷移によってのみ適合され得る歪度を示した。したがって、各ｓｃＦｖ又はｓｐＦｖについて、２つの遷移（Ｔｍ１及びＴｍ２）が報告された（表６）。ほぼ間違いなく、これらの２つの遷移は、それぞれＶＬ及びＶＨドメインの融解Ｔｍに対応する。一般に、Ｔｍ１又はＴｍ２のいずれかについてのｓｃＦｖとｓｐＦｖとの間の違いの比較時に、開始ｓｃＦｖのＴｍに関係なく、ステープル処理によって約１０℃の増加がある。例外が１つだけあり、すなわち、ＧＬｋ２ ｓｃＦｖとｓｐＦｖ（ＶＨ－ＶＬ配向）との差が、約７℃である。これは、ステープル処理の幾何学的形状にわずかなひずみを引き起こし得るより短い６＋４＋６リンカーに起因する可能性が高い。ΔＴｍ１（ＶＬ）及びΔＴｍ２（ＶＨ）がほぼ同一であったという事実は、ステープル処理が、ＶＬ／ＶＨ相互作用を強化することに加えて、それ自体のドメインの安定化につながることを示唆している。代替的に、より強いＶＨ／ＶＬ相互作用は、安定化効果をＶＬ／ＶＨドメインの安定化に伝達する。要約すると、本明細書に記載されているステープル処理は、ｓｃＦｖの安定性を大幅に増加させる。
【0685】
【表6】
【0686】
ＣＡＴ２２００ ｓｐＦｖを、ＩＬ－１７へのその結合について試験した。結合は、ＣＡＴ２２００ ｓｃＦｖｓと比較した場合に同等であった。
【0687】
６．３実施例３：生成されたｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子の結晶化による適切なステープル処理の検証
タンパク質をそれぞれの緩衝液で濃縮した：ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で８．６７ｍｇ／ｍｌ、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で５ｍｇ／ｍｌ、ＧＬｋ２ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ中で８．６６ｍｇ／ｍｌ、ｃａｔ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ。結晶化を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボットを使用してＣｏｒｎｉｎｇ ３５５０結晶トレイ中シッティングドロップフォーマットで各タンパク質について設定した。各ウェルは、１００ｎｌのタンパク質及び１００ｎｌのリザーバ溶液を含み、２０℃で７０μｌのリザーバに対してインキュベートされた。リザーバ溶液は、ＩＨ１及びＩＨ２カスタム条件、並びにＰＥＧ Ｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。いくつかの初期条件は、最適化試行でリザーバ成分を変化させることによって精巧化された。回折品質の結晶が、ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質のいくつかについて得られた。表７は、使用した条件の概要を示す。結晶を、２０％グリセロールを補足した母液中に数秒間浸し、液体窒素中で瞬間冷凍した。Ｘ線データを、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂでＩＭＣＡ－ＣＡＴ Ｂｅａｍｌｉｎｅ １７ＩＤで収集した。
タンパク質をそれぞれの緩衝液で濃縮した：ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で８．６７ｍｇ／ｍｌ、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で５ｍｇ／ｍｌ、ＧＬｋ２ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ中で８．６６ｍｇ／ｍｌ、ｃａｔ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬは、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、１００ｍＭのＮａＣｌ。結晶化を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボットを使用してＣｏｒｎｉｎｇ ３５５０結晶トレイ中シッティングドロップフォーマットで各タンパク質について設定した。各ウェルは、１００ｎｌのタンパク質及び１００ｎｌのリザーバ溶液を含み、２０℃で７０μｌのリザーバに対してインキュベートされた。リザーバ溶液は、ＩＨ１及びＩＨ２カスタム条件、並びにＰＥＧ Ｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎ ＨＴ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）である。いくつかの初期条件は、最適化試行でリザーバ成分を変化させることによって精巧化された。回折品質の結晶が、ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖタンパク質のいくつかについて得られた。表７は、使用した条件の概要を示す。結晶を、２０％グリセロールを補足した母液中に数秒間浸し、液体窒素中で瞬間冷凍した。Ｘ線データを、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂでＩＭＣＡ－ＣＡＴ Ｂｅａｍｌｉｎｅ １７ＩＤで収集した。
【0688】
【表7】
【0689】
６．３．１ＩＬ－１７と複合したＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ及びＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨの結晶化
ＩＬ－１７／ＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ複合体は、３３３μＬのＩＬ１７（配列番号２２）（１．５ｍｇ／ｍｌ）を１．７４ｍｌのＣａｔ２２００ａ ｓｃＦｖ（０．６９ｍｇ／ｍＬ）と混合し、４℃で３時間インキュベートすることによって生成した。混合物を、１０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ濃縮器で約４００μＬに濃縮し、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにロードした。複合体に対応する画分をプールし、１５０μＬの体積まで濃縮した。試料を希釈し、４回濃縮した（３５０μＬ ５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を添加し、１５０μＬ足らずの濃度にした）。体積を約１０５μＬにし、濃度を２．６９ｍｇ／ｍＬと決定した。社内で事前に考案した緩衝液及び沈殿物条件のセットである８０μＬリザーバに対してＣｏｒｎｉｎｇ３５５０プレートにおいて１５０ｎＬのタンパク質＋１５０ｎＬのリザーバを有するＭｏｓｑｕｉｔｏ結晶化ロボットを使用して、結晶化をシッティングドロップ方式で設定した。プレートを、２０℃でインキュベートした。条件（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、２５％のＰＥＧ３Ｋ、０．２ＭのＡｍアセテート）の１つにより、非常に小さな結晶が産生された。これらを収集し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｓｅｅｄビーズチューブ中１００μＬの２７％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭの酢酸アンモニウム、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５においてＨａｍｐｔｏｎシードビーズを使用して結晶化シードに変換した。
ＩＬ－１７／ＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ複合体は、３３３μＬのＩＬ１７（配列番号２２）（１．５ｍｇ／ｍｌ）を１．７４ｍｌのＣａｔ２２００ａ ｓｃＦｖ（０．６９ｍｇ／ｍＬ）と混合し、４℃で３時間インキュベートすることによって生成した。混合物を、１０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ濃縮器で約４００μＬに濃縮し、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにロードした。複合体に対応する画分をプールし、１５０μＬの体積まで濃縮した。試料を希釈し、４回濃縮した（３５０μＬ ５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を添加し、１５０μＬ足らずの濃度にした）。体積を約１０５μＬにし、濃度を２．６９ｍｇ／ｍＬと決定した。社内で事前に考案した緩衝液及び沈殿物条件のセットである８０μＬリザーバに対してＣｏｒｎｉｎｇ３５５０プレートにおいて１５０ｎＬのタンパク質＋１５０ｎＬのリザーバを有するＭｏｓｑｕｉｔｏ結晶化ロボットを使用して、結晶化をシッティングドロップ方式で設定した。プレートを、２０℃でインキュベートした。条件（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、２５％のＰＥＧ３Ｋ、０．２ＭのＡｍアセテート）の１つにより、非常に小さな結晶が産生された。これらを収集し、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｓｅｅｄビーズチューブ中１００μＬの２７％ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭの酢酸アンモニウム、１００ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５においてＨａｍｐｔｏｎシードビーズを使用して結晶化シードに変換した。
【0690】
回折品質の結晶は、上記のシード（１５０ｎＬのタンパク質＋１００ｎＬのリザーバ＋５０μＬのシード）の添加を除いて、同じ手順で得られた。結晶を、０．１ＭのＴｒｉｓ ８．５、１８％のＰＥＧ３Ｋ、０．２ＭのＬｉＳＯ４から成長し、合成母液（０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１０％のＰＥＧ３３５０、０．２ＭのＬｉＳＯ４及び２０％のグリセロール）に移し、液体窒素中で急速凍結した。Ｘ線回折データを、Ａｒｇｏｎｎｅ国立研究所のＩＭＣＡ－ＣＡＴ ＩＤ１７で収集した。
【0691】
ＩＬ－１７－ＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨ複合体を、１６７μｌのＩＬ－１７（２５０μｇ）を１５４μｌのＭＳＣＷ２７４（２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５での４６７μｇ）と混合して、４℃で一晩インキュベートすることによって生成した。混合物を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ濃縮器中で約１００μＬまで濃縮し、次いで、希釈を繰り返し、５回濃縮（約１５０μＬまで濃縮）し、３５０μＬ ５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を加えた。最終体積は、１００μＬであり、複合体の濃度は、６．０ｍｇ／ｍｌであるように決定された。結晶化を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏロボットを使用してシッティングドロップにおけるｓｃＦｖ／ＩＬ－１７複合体の場合と同様に設定した。シッティングドロップは、１５０ｎＬのタンパク質＋１２０ｎＬのリザーバ＋３０ｎＬのシード（上記のｓｃＦｖ／ＩＬ－１７）からなる。リザーバ溶液は、様々なＰＥＧ３３５０濃度及び塩の条件のセットであった。結晶化プレートを、２０℃でインキュベートした。小さい結晶が、１５．５％のＰＥＧ３３５０、０．４ＭのＮａＨ２ＰＯ４から得られた。結晶を、１６％のＰＥＧ３３５０、０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０％のグリセロール、及び急速凍結のＬＮ２中に移した。Ｘ線回折データを、Ａｒｇｏｎｎｅ国立研究所のＩＭＣＡ－ＣＡＴ ＩＤ１７で収集した。
【0692】
すべてのＸ線回折データをＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６（Ｐｔ．２）：１２５－１３２、Ｍｏｎｓｅｌｌｉｅｒ ａｎｄ Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ（２００６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６２：５８０－５９３）及びＣＣＰ４（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎ．（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５３：２４０－２５５）で処理した。すべての結晶構造は、ｓｃＦｖ ＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ／ＩＬ－１７複合体を除いて、ＭＯＥ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）で生成された相同性モデルを用いたＰｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ（２００１）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５７（Ｐｔ １０）：１３７３－１３８２）を使用して分子置換（ＭＲ）によって解析され、これに対してｐｄｂ ｉｄ ２ｖｘｓ（Ｇｅｒｈａｒｄｔ）の構造（Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９４：９０５－９２１）が、探索モデルとして使用された。構造モデルは、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔ １１（Ｐｔ １）：５３－５５）で精巧化され、Ｃｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６（Ｐｔ ４）：４８６－５０１）で手動で調整された。分子グラフィック図は、ＰｙＭｏｌ（ｗｗｗ＿ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ＿ｃｏｍ）で生成された。
【0693】
６．３．２構造
未結合ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子使用の構造を、図８、図９、図１０及び図１１に示す。図８は、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨの構造を示す。図９は、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。図１０は、ＧＬｋ２ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。図１１は、ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。構造は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインの両方を互いに対してパッキングする典型的なＦｖ構造と一致していた。一般に、リンカー残基の大部分は、電子密度マップで順序付けられ、解決された。ステープルとアンカーポイントとの間のジスルフィド結合は、一般に、ＶＬ－ＶＨ配向の両方で良好に順序付けられた。非結合ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ構造に加えて、抗原結合に対する任意の構造的影響を明らかにすることも試みた。ＣＡＴ２２００ ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖバリアント分子は、その同族標的ＩＬ－１７と複合して結晶化した。結晶化したＣＡＴ２２００バリアントのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖの場合、構造は、結合した標的の有無に関係なく、ほぼ同一である（図１２、図１３、図１４）。図１２は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの比較を示す。図１３は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造の正面図の比較を示す。図１４は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造の背面図の比較を示す。構造は、ステープルの配向又は有無に関係なく、同一であった。構造の対間のすべての一致するＣα原子についてのｒｍｓｄは、非常に小さい（非結合ｓｐＦｖ－ＶＨ－ＶＬと抗原結合ｓｃＦｖ－ＶＬ－ＶＨとの間で０．４１Å（図１２）、非結合ｓｐＦｖ－ＶＨ－ＶＬとｓｐＦｖ－ＶＬ－ＶＨとの間で０．４６Å（図１３及び図１４のそれぞれ）、及び結合ｓｃＦｖと結合ｓｐＦｖとの間で０．３７Å）。構造的証拠によって、ステープル処理が設計されたものとして機能することが示されている。また、ステープル処理は、ＶＬ及びＶＨドメイン構造又は相対ＶＬ／ＶＨパッキングに影響を与えない。
未結合ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ分子使用の構造を、図８、図９、図１０及び図１１に示す。図８は、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨの構造を示す。図９は、ＧＬｋ１ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。図１０は、ＧＬｋ２ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。図１１は、ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造を示す。構造は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインの両方を互いに対してパッキングする典型的なＦｖ構造と一致していた。一般に、リンカー残基の大部分は、電子密度マップで順序付けられ、解決された。ステープルとアンカーポイントとの間のジスルフィド結合は、一般に、ＶＬ－ＶＨ配向の両方で良好に順序付けられた。非結合ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖ構造に加えて、抗原結合に対する任意の構造的影響を明らかにすることも試みた。ＣＡＴ２２００ ｓｃＦｖ及びｓｐＦｖバリアント分子は、その同族標的ＩＬ－１７と複合して結晶化した。結晶化したＣＡＴ２２００バリアントのｓｃＦｖ及びｓｐＦｖの場合、構造は、結合した標的の有無に関係なく、ほぼ同一である（図１２、図１３、図１４）。図１２は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの比較を示す。図１３は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造の正面図の比較を示す。図１４は、ＩＬ－１７に結合したＣＡＴ２２００ａ ｓｐＦｖ ＶＬ－ＶＨと比較した、非結合ＣＡＴ２２００ｂ ｓｐＦｖ ＶＨ－ＶＬの構造の背面図の比較を示す。構造は、ステープルの配向又は有無に関係なく、同一であった。構造の対間のすべての一致するＣα原子についてのｒｍｓｄは、非常に小さい（非結合ｓｐＦｖ－ＶＨ－ＶＬと抗原結合ｓｃＦｖ－ＶＬ－ＶＨとの間で０．４１Å（図１２）、非結合ｓｐＦｖ－ＶＨ－ＶＬとｓｐＦｖ－ＶＬ－ＶＨとの間で０．４６Å（図１３及び図１４のそれぞれ）、及び結合ｓｃＦｖと結合ｓｐＦｖとの間で０．３７Å）。構造的証拠によって、ステープル処理が設計されたものとして機能することが示されている。また、ステープル処理は、ＶＬ及びＶＨドメイン構造又は相対ＶＬ／ＶＨパッキングに影響を与えない。
【0694】
６．４実施例４：追加のアンカーポイントの設計
実施例１に記載のアプローチを使用して、ステープル処理のための任意の追加のアンカーポイントを識別した。以下のアンカーポイントが識別された。
実施例１に記載のアプローチを使用して、ステープル処理のための任意の追加のアンカーポイントを識別した。以下のアンカーポイントが識別された。
【0695】
ＶＬ－リンカー－ＶＨ配向の場合：ＶＬ Ｃｈｏｔｈｉａ位置４２、４５及び３９、並びにＶＨ Ｃｈｏｔｈｉａ位置１０５、５及び３。図６では、ＧＬｋ１ＶＬ上のＶＬ残基は、Ｋ４２、Ｋ４５、Ｋ３９であり、ＧＬｋ１上のＶＨ残基は、Ｑ１０５、Ｌ５、及びＱ３である。ステープルは、示された位置のうちのいずれかの間に形成される。
【0696】
ＶＨ－リンカー－ＶＬ配向（ＶＨ Ｃｈｏｔｈｉａ位置４３、４０及び４６、ＶＬ Ｃｈｏｔｈｉａ位置１０２、５及び３）の場合、ステープルはそれらの位置のうちのいずれかの間に形成される。
【0697】
この実施例に記載のアンカーポイントを有するｓｐＦｖは、本明細書に記載のアッセイ及び実施例２を使用して、ステープルの形成及びそれらの熱安定性についてクローニングされ、発現され、試験される。
【0698】
６．５実施例５：部分的ステープル処理
構築物は、ＶＨとリンカーとの間又はＶＬとリンカーとの間のいずれかで、１つのステープルを含有するように生成及び発現される。生成された構築物は、本明細書に記載の方法を使用して発現され、精製され、分析される。
構築物は、ＶＨとリンカーとの間又はＶＬとリンカーとの間のいずれかで、１つのステープルを含有するように生成及び発現される。生成された構築物は、本明細書に記載の方法を使用して発現され、精製され、分析される。
【0699】
６．６実施例６：ｓｐＦｖを含む多重特異性構築物
本明細書で提供されるｓｐＦｖ構造を組み込んだ例示的な多重特異性結合分子を、本実施例で構築及び試験した。具体的には、二重特異性抗体及び対照分子は、表８に示す標的結合分子由来であり、無血清／動物成分不含培地で、ＣＨＯ懸濁培養液中で一過性に発現し、ＡＫＴＡ ＰＵＲＥ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の分取サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）によって精製した。重鎖は、ヘテロ二量体化を促進するｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）変異を含んでいた（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）：６１７－２１（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１）：２６－３５（１９９７）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７－８１（１９９８））。抗体は、Ｆｃ受容体相互作用を低減する野生型ＩｇＧ１と比較した場合、７つのＦｃ変異－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのセットを含むＩｇＧ１シグマＦｃを含有していた（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１７））。
本明細書で提供されるｓｐＦｖ構造を組み込んだ例示的な多重特異性結合分子を、本実施例で構築及び試験した。具体的には、二重特異性抗体及び対照分子は、表８に示す標的結合分子由来であり、無血清／動物成分不含培地で、ＣＨＯ懸濁培養液中で一過性に発現し、ＡＫＴＡ ＰＵＲＥ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の分取サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatography、ＳＥＣ）によって精製した。重鎖は、ヘテロ二量体化を促進するｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ（ＫｉＨ）変異を含んでいた（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）：６１７－２１（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１）：２６－３５（１９９７）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７－８１（１９９８））。抗体は、Ｆｃ受容体相互作用を低減する野生型ＩｇＧ１と比較した場合、７つのＦｃ変異－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓのセットを含むＩｇＧ１シグマＦｃを含有していた（Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１７））。
【0700】
二重特異性抗体は、ＩｇＧ１シグマ変異及びＫｉＨ変異により生成された。
【0701】
【表8】
【0702】
表８における配列は、以下のとおりである。
配列番号６９（ＶＨ ＢＨＡ１０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号６９（ＶＨ ＢＨＡ１０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0703】
配列番号７０（ＶＬ ＢＨＡ１０）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0704】
配列番号７１（ＶＨ Ｌ１９）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0705】
配列番号７２（ＶＬ Ｌ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0706】
配列番号７３（ＶＨ Ｂ２１Ｍ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0707】
配列番号７４（ＶＬ Ｂ２１Ｍ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0708】
配列番号７５（ＶＨ ＭＳＬＮｍＡｂ１）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳ
【0709】
配列番号７６（ＶＬ ＭＳＬＮｍＡｂ１）
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫ
【0710】
タンパク質濃度が、２８０ｎｍでの吸光度測定によって決定され（ＯＤ２８０）、精製収率が決定された。分析ＳＥＣを、Ｔｈｅｒｍｏ ＶＡＮＱＵＩＳＨ ＨＰＬＣシステムにおけるＢｉｏ ＳＥＣ－５カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、５μｍの粒子サイズ、３００Å）を使用して行った。１０μｌの精製タンパク質をカラムに充填し、溶出をＯＤ２８０によって記録した。
【0711】
表９は、本実施例に記載の二重特異性抗体及び対照分子の構造的特性の概要を示す。ボールド体の分子は、本発明による例示的な分子であり、他のものは、異なる態様の対照である。表１０は、実施例９で論じられるように、ＬＴＢＲ及びメソテリン（細胞外マトリックスに存在しない腫瘍関連抗原）を標的とする別の匹敵する二重特異性抗体の構造的特性を示す。
【0712】
【表9】
【0713】
【表10】
【0714】
上に列挙した２：１の化学量論（すべてのＩｇＧ１シグマ、すべてのＫｉＨ変異あり）を有する非対称抗体を以下のように生成した。
ｉ．ＣＯＶＡ１４８４は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号７８、配列番号７９を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号８０）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成した（図１５Ａ）。
ｉ．ＣＯＶＡ１４８４は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号７８、配列番号７９を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号８０）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成した（図１５Ａ）。
【0715】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0716】
配列番号７８（ＨＣ Ｂ２１Ｍ Ｎ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0717】
配列番号７９（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0718】
配列番号８０（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0719】
配列番号８１［ＬＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0720】
ｉｉ．ＣＯＶＡ１４８５は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号８２）融合（配列番号８３、配列番号７９を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号８０）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成した（図１５Ｂ）。
【0721】
配列番号８２［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0722】
配列番号８３（ＨＣＢ ２１Ｍ Ｎ末端ステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0723】
配列番号７９（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0724】
配列番号８０（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0725】
配列番号８１［ＬＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0726】
ｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４８６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号８４、配列番号７９を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号８０）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成した（図１５Ｃ）。
【0727】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
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【0728】
配列番号８４（ＨＣ Ｂ２１Ｍ Ｃ末端ステープル処理ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0729】
配列番号７９（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0730】
配列番号８０（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0731】
配列番号８１［ＬＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0732】
ｉｖ．ＣＯＶＡ１４８７は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号８２）融合（配列番号８５、配列番号７９を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号８０）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成した（図１５Ｄ）。
【0733】
配列番号８２［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0734】
配列番号８５（ＨＣ Ｂ２１Ｍ Ｃステープル処理ＢＨＡ（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0735】
配列番号７９（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0736】
配列番号８０（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0737】
配列番号８１［ＬＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0738】
ｖ．ＣＯＶＡ１４８０は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号８６、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｅ）。
【0739】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0740】
配列番号８６（ＨＣ Ｌ１９ Ｎステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0741】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
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【0742】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
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【0743】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
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【0744】
ｖｉ．ＣＯＶＡ１４８１は、Ｎ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号８２）融合（配列番号９０、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｆ）。
【0745】
配列番号８２［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0746】
配列番号９０（ＨＣ Ｌ１９ Ｎステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0747】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0748】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0749】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0750】
ｖｉｉ．ＣＯＶＡ１４８２は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号９１、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｇ）。
【0751】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0752】
配列番号９１（ＨＣ Ｌ１９ Ｃステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0753】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
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【0754】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0755】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
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ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0756】
ｖｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４８３は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ配向配列番号８２）融合（配列番号９２、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｈ）。
【0757】
配列番号８２［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）］
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0758】
配列番号９２（ＨＣ Ｌ１９ Ｃステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＬ－ＶＨ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＣＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＳＧＧＳＧＧＣＰＰＣＧＳＧＧＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＣＧＴＴＶＴＶＳＳ
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【0759】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0760】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0761】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0762】
ｉｘ．ＣＯＶＡ１４１０７は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向、ＶＬ３ Ｙ３６Ｆ＿Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ配列番号９３）融合（配列番号９４、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｉ）。
【0763】
配列番号９３［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＬ３＿Ｙ３６Ｆ＿Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0764】
配列番号９４（ＨＣ Ｌ１９ Ｃステープル処理（ＶＬ３＿Ｙ３６Ｆ Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0765】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0766】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0767】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
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【0768】
ｘ．ＣＯＶＡ１４１０８は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向、ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ配列番号９５）融合（配列番号９６、配列番号８７を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｊ）。
【0769】
配列番号９５［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0770】
配列番号９６（ＨＣ Ｌ１９ Ｃステープル処理（ＶＨ＿ＣＤＲ１＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ １ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0771】
配列番号８７（ｐＡ変異ありのＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
ＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0772】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0773】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
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ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0774】
ｘｉ．ＣＯＶＡ１４１３３は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号９７、配列番号９８を含む）を担持する抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８９）との共発現によって生成した（図１５Ｋ）。
【0775】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0776】
配列番号９７（ＨＣ Ｌ１９ Ｃステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
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【0777】
配列番号９８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓノブ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0778】
配列番号８８（ＨＣ Ｌ１９ ＩｇＧ１ｓホール）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0779】
配列番号８９（ＬＣ Ｌ１９）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0780】
ｘｉｉ．ＣＯＶＡ１４１３６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号９９、配列番号１００を含む）を担持する抗ＲＳＶ Ｂ２１Ｍ抗体重鎖の抗ＥＤＢ抗体ＥＤＢｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号８１）との共発現によって生成ｓひた（図１５Ｌ）。
【0781】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0782】
配列番号９９（ＨＣ Ｂ２１Ｍ Ｃステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異なし）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0783】
配列番号１００（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓノブ）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0784】
配列番号８０（ＨＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＩＴＬＫＥＳＧＰＴＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＨＩＹＷＤＤＤＫＲＹＮＰＳＬＫＳＲＬＴＩＴＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＬＹＧＦＴＹＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0785】
配列番号８１［ＬＣ Ｂ２１Ｍ（ＲＳＶ）］
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＳＶＤＹＮＧＩＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＰＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＩＩＥＤＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0786】
ｘｉｉｉ．ＣＯＶＡ１４１４６は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号１０１、配列番号１０２を含む）を担持する抗メソテリン抗体ＭＳＬＮｍＡｂ１重鎖の抗メソテリン抗体ＭＳＬＮｍＡｂ１の重鎖（ＨＣ、配列番号８８）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号１０４）との共発現によって生成した（図１５Ｍ）。
【0787】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0788】
配列番号１０１（ＭＳＬＮｍＡｂ１ ＨＣ Ｃステープル処理ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0789】
配列番号１０２（ＭＳＬＮｍＡｂ１ ＨＣ、ＩｇＧ１ｓ、ノブ、ｐＡ変異あり）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0790】
配列番号１０３（ＨＣ ＭＳＬＮｍＡｂ１ ＩｇＧ１ｓホール）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹＷＧＳＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0791】
配列番号１０４（ＬＣ ＭＬＳＮｍＡｂ１）
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＥＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＧＲＦＳＧＳＧＳＧＮＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＤＡＴＹＹＣＱＱＷＳＫＨＰＬＴＦＧＳＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0792】
上記のすべての構築物を、高収率及び高純度で発現及び精製することができ（下の表１１を参照されたい）、本明細書で提供されるｓｐＦｖを組み込んだ二重特異性構築物が良好な生物物理学的特性を有することが示されている。
【0793】
【表11】
【0794】
６．７実施例７：ＥＤＢ依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体がＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを活性化することができることを示すために、化合物の活性を、ＥＤＢ含有フィブロネクチン（ＥＤＢ＋フィブロネクチン）の存在下又は非存在下でのＡ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。ＮＦ－κＢシグナル伝達は、細胞発生及び免疫ホメオスタシスの調節において中心的役割を果たす。腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）又はＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー（例えば、ＬＴＢＲ）を介したＮＦ－κＢの活性化は、それらのそれぞれのリガンドとの関与時に発生する。Ａ５４９肺上皮細胞株は、ＬＴＢＲを自然に発現し、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター構築物は、Ａ５４９肺上皮細胞株のゲノムに安定的に組み込まれる。刺激剤による活性化に続いて、内因性ＮＦ－κＢ転写因子は、ＤＮＡ応答要素に結合して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。
ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体がＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを活性化することができることを示すために、化合物の活性を、ＥＤＢ含有フィブロネクチン（ＥＤＢ＋フィブロネクチン）の存在下又は非存在下でのＡ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。ＮＦ－κＢシグナル伝達は、細胞発生及び免疫ホメオスタシスの調節において中心的役割を果たす。腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）又はＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー（例えば、ＬＴＢＲ）を介したＮＦ－κＢの活性化は、それらのそれぞれのリガンドとの関与時に発生する。Ａ５４９肺上皮細胞株は、ＬＴＢＲを自然に発現し、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター構築物は、Ａ５４９肺上皮細胞株のゲノムに安定的に組み込まれる。刺激剤による活性化に続いて、内因性ＮＦ－κＢ転写因子は、ＤＮＡ応答要素に結合して、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。
【0795】
ＬＴＢＲのＥＤＢ依存性活性化を実証するために、高結合９６ウェルμＣｌｅａｒ平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ；Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）に、１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えＥＤＢフィブロネクチンドメイン７－Ｂ－８－９（ＥＤＢ、配列番号１０５）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えフィブロネクチンドメイン７－８－９（ＥＤＢ－、配列番号１０６）（これらの配列を、以下に列挙している）を一晩コーティングした。
【0796】
配列番号１０５（フィブロネクチンドメイン７Ｂ８９）
ＰＬＳＰＰＴＮＬＨＬＥＡＮＰＤＴＧＶＬＴＶＳＷＥＲＳＴＴＰＤＩＴＧＹＲＩＴＴＴＰＴＮＧＱＱＧＮＳＬＥＥＶＶＨＡＤＱＳＳＣＴＦＤＮＬＳＰＧＬＥＹＮＶＳＶＹＴＶＫＤＤＫＥＳＶＰＩＳＤＴＩＩＰＥＶＰＱＬＴＤＬＳＦＶＤＩＴＤＳＳＩＧＬＲＷＴＰＬＮＳＳＴＩＩＧＹＲＩＴＶＶＡＡＧＥＧＩＰＩＦＥＤＦＶＤＳＳＶＧＹＹＴＶＴＧＬＥＰＧＩＤＹＤＩＳＶＩＴＬＩＮＧＧＥＳＡＰＴＴＬＴＱＱＴＡＶＰＰＰＴＤＬＲＦＴＮＩＧＰＤＴＭＲＶＴＷＡＰＰＰＳＩＤＬＴＮＦＬＶＲＹＳＰＶＫＮＥＥＤＶＡＥＬＳＩＳＰＳＤＮＡＶＶＬＴＮＬＬＰＧＴＥＹＶＶＳＶＳＳＶＹＥＱＨＥＳＴＰＬＲＧＲＱＫＴＧＬＤＳＰＴＧＩＤＦＳＤＩＴＡＮＳＦＴＶＨＷＩＡＰＲＡＴＩＴＧＹＲＩＲＨＨＰＥＨＦＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＬＴＰＧＴＥＹＶＶＳＩＶＡＬＮＧＲＥＥＳＰＬＬＩＧＱＱＳＴＨＨＨＨＨＨ
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【0797】
配列番号１０６（フィブロネクチンドメイン７８９）
ＰＬＳＰＰＴＮＬＨＬＥＡＮＰＤＴＧＶＬＴＶＳＷＥＲＳＴＴＰＤＩＴＧＹＲＩＴＴＴＰＴＮＧＱＱＧＮＳＬＥＥＶＶＨＡＤＱＳＳＣＴＦＤＮＬＳＰＧＬＥＹＮＶＳＶＹＴＶＫＤＤＫＥＳＶＰＩＳＤＴＩＩＰＡＶＰＰＰＴＤＬＲＦＴＮＩＧＰＤＴＭＲＶＴＷＡＰＰＰＳＩＤＬＴＮＦＬＶＲＹＳＰＶＫＮＥＥＤＶＡＥＬＳＩＳＰＳＤＮＡＶＶＬＴＮＬＬＰＧＴＥＹＶＶＳＶＳＳＶＹＥＱＨＥＳＴＰＬＲＧＲＱＫＴＧＬＤＳＰＴＧＩＤＦＳＤＩＴＡＮＳＦＴＶＨＷＩＡＰＲＡＴＩＴＧＹＲＩＲＨＨＰＥＨＦＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＬＴＰＧＴＥＹＶＶＳＩＶＡＬＮＧＲＥＥＳＰＬＬＩＧＱＱＳＴＨＨＨＨＨＨ
ＰＬＳＰＰＴＮＬＨＬＥＡＮＰＤＴＧＶＬＴＶＳＷＥＲＳＴＴＰＤＩＴＧＹＲＩＴＴＴＰＴＮＧＱＱＧＮＳＬＥＥＶＶＨＡＤＱＳＳＣＴＦＤＮＬＳＰＧＬＥＹＮＶＳＶＹＴＶＫＤＤＫＥＳＶＰＩＳＤＴＩＩＰＡＶＰＰＰＴＤＬＲＦＴＮＩＧＰＤＴＭＲＶＴＷＡＰＰＰＳＩＤＬＴＮＦＬＶＲＹＳＰＶＫＮＥＥＤＶＡＥＬＳＩＳＰＳＤＮＡＶＶＬＴＮＬＬＰＧＴＥＹＶＶＳＶＳＳＶＹＥＱＨＥＳＴＰＬＲＧＲＱＫＴＧＬＤＳＰＴＧＩＤＦＳＤＩＴＡＮＳＦＴＶＨＷＩＡＰＲＡＴＩＴＧＹＲＩＲＨＨＰＥＨＦＳＧＲＰＲＥＤＲＶＰＨＳＲＮＳＩＴＬＴＮＬＴＰＧＴＥＹＶＶＳＩＶＡＬＮＧＲＥＥＳＰＬＬＩＧＱＱＳＴＨＨＨＨＨＨ
【0798】
一晩インキュベートした後、コーティングされたプレートをＰＢＳで洗浄し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）で３７℃で２時間ブロックした。試験される化合物の１：５希釈系列を、２倍濃度ストックとしてアッセイ培地で調製した（試験した最終濃度は、２００ｎＭ～２．６ｐＭの範囲であった）。ブロッキング溶液を吸引によって除去した後、５０μｌの希釈した化合物をプレブロックされたプレートに添加した。５０μｌのＡ５４９細胞懸濁液（細胞懸濁液の濃度＝０．４Ｍｉｏ細胞／ｍｌアッセイ培地）を、各ウェルに添加した（２０，０００細胞／ウェル）。Ａ５４９細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＥＤＴＡを使用することによって細胞培養フラスコから予め分離され、次いでアッセイ培地で移植された。細胞を化合物とともに３７℃／５％ＣＯ２で１８～２０時間インキュベートした。
【0799】
１８時間インキュベートした後、ＢＩＯ－ＧＬＯルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、ＴＥＣＡＮ Ｍ １０００Ｐｒｏ機器を使用して、５００ミリ秒の積分時間で測定した。得られた相対光単位（ＲＬＵ）から、ＬＴＢＲシグナル伝達の誘導倍率を以下のように計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ刺激済み細胞／平均ＲＬＵ未刺激細胞（未刺激細胞を試験される各プレートにおいて対照として含めた）。
【0800】
標準偏差を含む用量応答曲線を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍを使用してプロットし、該当する場合は、非線形フィットを適用した（対数（アゴニスト）対応答（可変勾配－３パラメータ））。データを適合させるために、ｘ値（化合物の濃度）を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍのｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）関数を使用して変換した。
【0801】
ＣＯＶＡ１４８２を、ＣＯＶＡ１４５６と同じＡ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイで比較した。ＣＯＶＡ１４８２は、ｓｃＦｖに使用される安定化方法においてのみ、ＣＯＶＡ１４５６と異なる。ＬＴＢＲｍＡｂ１にも由来するＣＯＶＡ１４８２中のｓｃＦｖは、本明細書に記載のステープル処理されたプラットフォームを使用して安定化され（すなわち、ＶＨ／リンカー及びＶＬリンカージスルフィド結合を介して安定化され）、ＣＯＶＡ１４５６は、ＶＨとＶＬとの間で安定化されたジスルフィドである（すなわち、ＶＨ／ＶＬジスルフィド結合を介して安定化される）。図１６Ａは、ＣＯＶＡ１４８２及びＣＯＶＡ１４５６の両方がＥＤＢ依存的な方法でＬＴＢＲを強力に活性化したことを示した。対応するアイソタイプ対照ＣＯＶＡ１４８６及びＣＯＶＡ１４６２は、ＬＴＢＲを活性化しなかった（図１６Ａ）。これらの結果は、多重特異性分子へのｓｐＦｖの組み込みが多重特異性分子の活性に悪影響を及ぼさなかったことを示している。２：１二重特異性ＥＤＢ／ＬＴＢＲ抗体（ＣＯＶＡ１４８２又はＣＯＶＡ１４５６）は、このレポーターアッセイにおいてＮＦ－κＢシグナル伝達を誘導する際に効力の増加を示した。同じ実験設定を有するいくつかのアッセイにわたってＣＯＶＡ１４８２について計算された平均ＥＣ５０は、約３０ｐＭ±１０ｐＭであり、対照１：１ヘテロ二量体構築物は、アッセイにおいて約３ｎＭ（ここには示されていないデータ）のＥＣ５０を示し、２：１二重特異性が１：１二重特異性よりも１００倍強力であり得ることを示す。これは、ＴＡＡへの２つの結合部位で達成されたＬＴＢＲ結合部位のクラスタリングの増加によって説明することができる。
【0802】
ＬＴＢＲをＴＡＡ依存的に活性化するためのそのような二重特異性抗体の能力へのＬＴＢＲに対する親和性の効果を研究するために、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｃＦｖ断片のより低い親和性バリアント（配列番号１０７、ＫＤ≒６０ｎＭ及び配列番号１０８、ＫＤ≒６００ｎＭ）を生成し、２：１二重特異性ＣＯＶＡ１４１０７及びＣＯＶＡ１４１０８を構築するために使用した（表９を参照されたい）。
【0803】
配列番号１０７［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＬ３＿Ｙ３６Ｆ＿Ｓ４９Ｙ＿Ｆ８７Ｙ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
【0804】
配列番号１０８［ステープル処理ｓｃＦｖ（ＶＨ＿ＣＤＲ １＿Ｙ３３Ａ）ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＡＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
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【0805】
生成された二重特異体を、Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイで試験して、ＬＴＢＲの活性化に対する親和性の効果を確認した。図１６Ｂは、ＬＴＢＲに対するより低い親和性が、このアッセイにおいてＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化するための二重特異体の能力の低下に対応したことを示した。データはまた、多重特異性分子へのｓｐＦｖの組み込みが分子の活性に悪影響を及ぼさなかったことを実証した。
【0806】
実施例６で述べたように、タンパク質Ａ（抗体の精製に使用される）への結合を抑制する変異（国際公開第２０１０／１５１７９２号）を、所望のヘテロ二量体の精製を促進するために、いくつかの構築物のＦｃに導入した。ＣＯＶＡ１４１３３をこれらの変異なしで生成し、その活性は、ＣＯＶＡ １４８２と比較して、Ｆｃ領域の変異が二重特異体の活性に影響を与えなかったことを示した。ＣＯＶＡ１４１３３及びＣＯＶＡ１４８２並びにそれらのそれぞれのアイソタイプ対照ＣＯＶＡ１４１３６及びＣＯＶＡ１４８６を、Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーターアッセイにおいて比較した。図１６Ｃは、ＣＯＶＡ１４１３３がＣＯＶＡ１４８２と同様の効率を有するＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化し、Ｆｃにおける変異がＬＴＢＲを活性化する二重特異性の能力に影響を及ぼさず、ｓｐＦｖの機能に影響を及ぼさなかったことを実証することを示した。
【0807】
結論として、ＣＯＶＡ１４１３３はＴＡＡ依存的様式でＬＴＢＲを活性化する優れた能力を有することが示された。
【0808】
６．８実施例８：ＥＤＢ依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養細胞アッセイ
ＥＤＢ＋フィブロネクチン（ＷＩ３８ＶＡ細胞による細胞外マトリックスにおいて産生及び堆積された（Ｚａｒｄｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，６，２３３７－４２（１９８７））の存在下でのＬＴＢＲの活性化が、サイトカイン及びケモカインの放出、及びＡ３７５細胞上の接着分子ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーション、及びｓｐＦｖの組み込みが活性に悪影響を及ぼさないことをもたらすかどうかを検証するために、Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養アッセイを行った。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ７５．１（商標））細胞を、５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で成長培地（ＭＥＭ ｗ／ｏグルタミン＋１０％の熱不活性化ＦＢＳ＋０．１ｍＭのＮＥＡＡ＋２ｍＭのＬ－Ｇｌｎ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム）で４８時間インキュベートした。試験される化合物の１：５希釈系列を、２倍濃度ストックとしてアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）中で調製した（試験した最終濃度は４０ｎＭ～０．５ｐＭの範囲であった）。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ細胞との共培養におけるインキュベーションの前に、Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６１９（商標））をＣＥＬＬＴＲＡＣＥバイオレット（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識した。標識するために、ＰＢＳ中５％のＦＢＳにおいて１０×１０６細胞／ｍｌ及び２．５μＭＣＴＶの濃度を有する細胞懸濁液を、光から保護しながら、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．４×１０６細胞／ｍｌの密度でアッセイ培地に再懸濁させた。４８時間のＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ培養を含む、プレートから培養培地の慎重な除去に続いて、５０μｌのＡ３７５細胞懸濁液（２０，０００細胞／ウェル、ＣＴＶ＋又はＣＴＶ－）を各ウェルに添加した。５０μｌの連続希釈化合物（ウェル当たりの最終容量１００）μｌ）を、細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
ＥＤＢ＋フィブロネクチン（ＷＩ３８ＶＡ細胞による細胞外マトリックスにおいて産生及び堆積された（Ｚａｒｄｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，６，２３３７－４２（１９８７））の存在下でのＬＴＢＲの活性化が、サイトカイン及びケモカインの放出、及びＡ３７５細胞上の接着分子ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーション、及びｓｐＦｖの組み込みが活性に悪影響を及ぼさないことをもたらすかどうかを検証するために、Ａ３７５／ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ共培養アッセイを行った。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ７５．１（商標））細胞を、５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ２で成長培地（ＭＥＭ ｗ／ｏグルタミン＋１０％の熱不活性化ＦＢＳ＋０．１ｍＭのＮＥＡＡ＋２ｍＭのＬ－Ｇｌｎ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム）で４８時間インキュベートした。試験される化合物の１：５希釈系列を、２倍濃度ストックとしてアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％熱不活性化ＦＢＳ）中で調製した（試験した最終濃度は４０ｎＭ～０．５ｐＭの範囲であった）。ＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ細胞との共培養におけるインキュベーションの前に、Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６１９（商標））をＣＥＬＬＴＲＡＣＥバイオレット（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識した。標識するために、ＰＢＳ中５％のＦＢＳにおいて１０×１０６細胞／ｍｌ及び２．５μＭＣＴＶの濃度を有する細胞懸濁液を、光から保護しながら、室温で５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、０．４×１０６細胞／ｍｌの密度でアッセイ培地に再懸濁させた。４８時間のＷＩ３８ＶＡ亜系統２ＲＡ培養を含む、プレートから培養培地の慎重な除去に続いて、５０μｌのＡ３７５細胞懸濁液（２０，０００細胞／ウェル、ＣＴＶ＋又はＣＴＶ－）を各ウェルに添加した。５０μｌの連続希釈化合物（ウェル当たりの最終容量１００）μｌ）を、細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【0809】
２４時間インキュベートした後、上清を遠心分離によって透明化し、ＭＳＤアッセイを使用してサイトカイン及びケモカインの測定のために保存した。細胞を、フローサイトメトリーによってＩＣＡＭ－１測定のために更に処理した。
【0810】
６．８．１フローサイトメトリーによるＩＣＡＭ－１の検出
９６ウェルプレートに残っているいずれの培地も注意深く除去し、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離させ、ＤｅｅｐＷｅｌｌ ９６ウェルプレートに移し（３通りに１つウェルでプールした）、洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３）に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートに移した。抗体、すなわち、標識された抗ヒトＩＣＡＭ－１ ＰＥ（クローン１Ｈ４、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）又は標識されたアイソタイプ対照抗体ＰＥ（ＭＰＣ－１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能近ＩＲ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、単一染色又は組み合わせ染色を、表１２に示すように希釈した。
９６ウェルプレートに残っているいずれの培地も注意深く除去し、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで剥離させ、ＤｅｅｐＷｅｌｌ ９６ウェルプレートに移し（３通りに１つウェルでプールした）、洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＦＢＳ＋０．１％のＮａＮ３）に再懸濁し、丸底９６ウェルプレートに移した。抗体、すなわち、標識された抗ヒトＩＣＡＭ－１ ＰＥ（クローン１Ｈ４、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）又は標識されたアイソタイプ対照抗体ＰＥ（ＭＰＣ－１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能近ＩＲ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、単一染色又は組み合わせ染色を、表１２に示すように希釈した。
【0811】
【表12】
【0812】
細胞を４℃で４分間４００×ｇで遠心分離し、上清を廃棄し、５０μｌの抗体溶液を表１２に記載するように調製した。細胞及び抗体を、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１２０μｌを各ウェルに添加し、次いで、細胞を４℃で４分間４００×ｇで遠心分離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離し、９０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。次いで、細胞を、ＰＢＳ中の３．７％のホルマリン溶液９０μｌを添加することによって固定し、暗所において氷上で１５分間インキュベートした。固定後、細胞を、４℃で４分間４００ｘｇで遠心分離し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。細胞を、スクリーンモードで高流量でＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔ機器を使用して測定し、４９μｌ／ウェルを取得した。データは、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７００．２Ａ）を使用して解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。
【0813】
６．８．２ＭＳＤプラットフォームを使用した処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下にあることが知られているいくつかのサイトカインを、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定した。ここでは、測定されたサイトカインのいくつかの例を列挙している。
■ＲＡＮＴＥＳ：Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用、
■Ｉ－ＴＡＣ、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、
■ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、及び
■ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－３ａ、ＳＤＦ－１ａ：５－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下にあることが知られているいくつかのサイトカインを、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定した。ここでは、測定されたサイトカインのいくつかの例を列挙している。
■ＲＡＮＴＥＳ：Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用、
■Ｉ－ＴＡＣ、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、
■ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３ｂ：３－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用、及び
■ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ、ＭＩＰ－３ａ、ＳＤＦ－１ａ：５－ＰＬＥＸサイトカイン放出アッセイ（ＭＳＤ）を使用
【0814】
処理された細胞の上清中のサイトカインの濃度を、製造業者の指示に従ってＭＳＤプラットフォームを使用して測定した。簡単に説明すると、プロトコルは以下のステップを含んだ：
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを含んだ。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを含んだ。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。
【0815】
６．８．３アッセイプロトコル：
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
【0816】
データを、ＭＥＳＯＳＣＡＬＥソフトウェア（ＭＳＤ探索作業ベンチプログラムｖ ４．０．１２．１）を使用して解析し、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍを使用してプロットした。
【0817】
６．８．４結果－フローサイトメトリーによるＩＣＡＭ－１の検出
ＮＦ－κＢシグナル伝達は細胞の表面上のＩＣＡＭ－１の上方調節につながる可能性があることが、以前に示された（ｄａ Ｓｉｌｖａ Ａｎｔｕｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：５７６，（２０１８））。したがって、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性体との共培養インキュベーションの後のＡ３７５細胞の表面上のＩＣＡＭ－１発現のレベルを測定した。一例として、図１７は、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性ＣＯＶＡ １４８２とのインキュベーション後のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを示し、ＬＴＢＲ結合ｓｐＦｖの機能性を実証している。アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６は、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを引き起こさなかった。これらの発見は、ＥＤＢへの結合を介してＬＴＢＲ ｓｃＦｖをクラスター化する能力が、ＬＴＢＲ活性化のための前提条件であり、結果として、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションであることを示した。
ＮＦ－κＢシグナル伝達は細胞の表面上のＩＣＡＭ－１の上方調節につながる可能性があることが、以前に示された（ｄａ Ｓｉｌｖａ Ａｎｔｕｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９：５７６，（２０１８））。したがって、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性体との共培養インキュベーションの後のＡ３７５細胞の表面上のＩＣＡＭ－１発現のレベルを測定した。一例として、図１７は、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異性ＣＯＶＡ １４８２とのインキュベーション後のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを示し、ＬＴＢＲ結合ｓｐＦｖの機能性を実証している。アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６は、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションを引き起こさなかった。これらの発見は、ＥＤＢへの結合を介してＬＴＢＲ ｓｃＦｖをクラスター化する能力が、ＬＴＢＲ活性化のための前提条件であり、結果として、ＩＣＡＭ－１のアップレギュレーションであることを示した。
【0818】
６．８．５結果－処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＬＴＢＲ活性化の結果として発現されるいくつかのサイトカイン及びケモカインを、上記のように、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体及び対照分子で処理した共培養の上清中で測定した。図１８Ａ～図１８Ｄは、ＣＯＶＡ１４１３３によるＬＴＢＲの活性化によってアップレギュレートされたサイトカインの４つの代表的な例（図１８Ａ：ＲＡＮＴＥＳ、図１８Ｂ：ＩＬ－６、図１８Ｃ：ＩＬ－８及び図１８Ｄ：ＭＩＰ－３ｂ）を示す。ＣＯＶＡ１４１３６における標的化されていないＬＴＢＲｍＡｂ１由来ｓｃＦｖは、ＬＴＢＲを活性化せず、結果として、上清中のサイトカインの濃度は、バックグラウンドを超えて増加しなかった。バックグラウンドは、Ｂ２１Ｍ抗体又はＣＯＶＡ１４４０（２（ｍＡｂ）Ｂ２１Ｍアイソタイプ対照ｍＡｂ）で達成されたレベルで表された（プロット内の単一濃度として示された）。結果は、ＬＴＢＲ結合ｓｐＦｖがインビトロで機能的であることを示している。
ＬＴＢＲ活性化の結果として発現されるいくつかのサイトカイン及びケモカインを、上記のように、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体及び対照分子で処理した共培養の上清中で測定した。図１８Ａ～図１８Ｄは、ＣＯＶＡ１４１３３によるＬＴＢＲの活性化によってアップレギュレートされたサイトカインの４つの代表的な例（図１８Ａ：ＲＡＮＴＥＳ、図１８Ｂ：ＩＬ－６、図１８Ｃ：ＩＬ－８及び図１８Ｄ：ＭＩＰ－３ｂ）を示す。ＣＯＶＡ１４１３６における標的化されていないＬＴＢＲｍＡｂ１由来ｓｃＦｖは、ＬＴＢＲを活性化せず、結果として、上清中のサイトカインの濃度は、バックグラウンドを超えて増加しなかった。バックグラウンドは、Ｂ２１Ｍ抗体又はＣＯＶＡ１４４０（２（ｍＡｂ）Ｂ２１Ｍアイソタイプ対照ｍＡｂ）で達成されたレベルで表された（プロット内の単一濃度として示された）。結果は、ＬＴＢＲ結合ｓｐＦｖがインビトロで機能的であることを示している。
【0819】
まとめると、ＬＴＢＲ活性化時のＩＣＡＭ－１のアップレギュレーション及びサイトカイン分泌により、ＬＴＢＲ活性化が有し得る細胞に対する予想される効果が確認された。
【0820】
この例では、本明細書で提供される分子は、ＬＴＢＲの効率的な腫瘍関連抗原（ここでは、ＥＤＢ含有フィブロネクチン）依存性活性化を達成したことが実証された。
【0821】
６．９実施例９：メソテリン依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－Ａ５４９ ＮＦ－κＢレポーター細胞及びＣＨＯＫ１－ｈｕＭＳＬＮ又はＨ２２６を用いた共培養細胞アッセイ
実施例７及び８では、本明細書で提供されるｓｐＦｖ構造、標的化ＥＤＢ（細胞外マトリックス中の腫瘍関連抗原）及びＬＴＢＲを含む二重特異性抗体が、活性化ＬＴＢＲを腫瘍抗原依存的な方法で非常に効率的にＬＴＢＲを活性化したことが実証された。その場所（細胞外マトリックス又は腫瘍細胞の細胞表面に堆積される）にもかかわらず、この発見が任意の腫瘍抗原に当てはまるかどうかを確認するために、二重特異性２：１抗体標的化メソテリン（ＭＳＬＮ）、異なるタイプの腫瘍で発現される腫瘍関連抗原（Ｈａｓｓａｎ ａｎｄ Ｈｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：４６－５３（２００８））及びＬＴＢＲを、実施例６に記載されるように設計及び産生した。ＣＯＶＡ１４１４６は、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｐＦｖ断片に融合される、抗メソテリン抗体（ＭＳＬＮｍＡｂ１）からなる２：１ ＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性抗体である。ＬＴＢＲ二重特異性抗体標的化ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び腫瘍細胞の細胞表面に存在する腫瘍関連抗原（例えば、メソテリン）が腫瘍依存的な方法でＬＴＢＲを効率的に活性化することができるかどうかを示すために、共培養細胞アッセイを使用した。使用した共培養アッセイは、Ａ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ（実施例７に記載）及びＨ２２６細胞（中皮腫細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２６）（メソテリンを発現することが知られている（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃ．Ｔｈｅｒ．１：５９５－６００（２００２））及びＬＴＢＲであった。
実施例７及び８では、本明細書で提供されるｓｐＦｖ構造、標的化ＥＤＢ（細胞外マトリックス中の腫瘍関連抗原）及びＬＴＢＲを含む二重特異性抗体が、活性化ＬＴＢＲを腫瘍抗原依存的な方法で非常に効率的にＬＴＢＲを活性化したことが実証された。その場所（細胞外マトリックス又は腫瘍細胞の細胞表面に堆積される）にもかかわらず、この発見が任意の腫瘍抗原に当てはまるかどうかを確認するために、二重特異性２：１抗体標的化メソテリン（ＭＳＬＮ）、異なるタイプの腫瘍で発現される腫瘍関連抗原（Ｈａｓｓａｎ ａｎｄ Ｈｏ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：４６－５３（２００８））及びＬＴＢＲを、実施例６に記載されるように設計及び産生した。ＣＯＶＡ１４１４６は、ＬＴＢＲｍＡｂ１に由来するｓｐＦｖ断片に融合される、抗メソテリン抗体（ＭＳＬＮｍＡｂ１）からなる２：１ ＭＳＬＮ／ＬＴＢＲ二重特異性抗体である。ＬＴＢＲ二重特異性抗体標的化ＬＴＢＲ二重特異性抗体及び腫瘍細胞の細胞表面に存在する腫瘍関連抗原（例えば、メソテリン）が腫瘍依存的な方法でＬＴＢＲを効率的に活性化することができるかどうかを示すために、共培養細胞アッセイを使用した。使用した共培養アッセイは、Ａ５４９細胞ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞アッセイ（実施例７に記載）及びＨ２２６細胞（中皮腫細胞株、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２６）（メソテリンを発現することが知られている（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃ．Ｔｈｅｒ．１：５９５－６００（２００２））及びＬＴＢＲであった。
【0822】
６．９．１Ｈ２２６細胞の調製
Ｈ２２６細胞（メソテリンの約２００，０００個のコピー及びＬＴＢＲの１０，０００個のコピーを発現する）懸濁液のウェル当たり１０，０００個の細胞（７５μｌのアッセイ培地、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、それらの成長培地（ＭＥＭ＋２ｍＭのグルタミン＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ＋１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及びＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのＮａ－ピルビン酸塩のそれぞれ）において３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートして、細胞がプレートに付着することを可能にした。
Ｈ２２６細胞（メソテリンの約２００，０００個のコピー及びＬＴＢＲの１０，０００個のコピーを発現する）懸濁液のウェル当たり１０，０００個の細胞（７５μｌのアッセイ培地、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）を９６ウェル組織培養プレートに播種し、それらの成長培地（ＭＥＭ＋２ｍＭのグルタミン＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ＋１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及びＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１ｍＭのＮａ－ピルビン酸塩のそれぞれ）において３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートして、細胞がプレートに付着することを可能にした。
【0823】
６．９．２化合物の調製
化合物を１００ｎＭ～１．３ｐＭの濃度範囲で試験した。化合物の４倍１：５連続希釈を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）中で調製し、使用するまで４℃で保存した。
化合物を１００ｎＭ～１．３ｐＭの濃度範囲で試験した。化合物の４倍１：５連続希釈を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）中で調製し、使用するまで４℃で保存した。
【0824】
６．９．３Ａ５４９レポーター細胞の調製及び添加
Ａ５４９レポーター細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＥＤＴＡで細胞培養フラスコから分離し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）に移した。Ｈ２２６細胞を含むプレートにウェル当たり合計２０，０００個のＡ５４９レポーター細胞を添加した後、５０μＬの予備希釈した化合物を各ウェルに添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。
Ａ５４９レポーター細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ／ＥＤＴＡで細胞培養フラスコから分離し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ－ＨＩ）に移した。Ｈ２２６細胞を含むプレートにウェル当たり合計２０，０００個のＡ５４９レポーター細胞を添加した後、５０μＬの予備希釈した化合物を各ウェルに添加し、３７℃／５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。
【0825】
６．９．４処理された共培養物中の発光の測定
２０時間のインキュベーションの後、ＢＩＯ－ＧＬＯルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の指示に従って使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、ＴＥＣＡＮ Ｍ １０００Ｐｒｏ機器を使用して、５００ミリ秒の積分時間で測定した。得られた相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ，ＲＬＵ）から、ＬＴＢＲシグナル伝達の誘導倍率を以下のように計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ刺激済み細胞／平均ＲＬＵ未刺激細胞（未刺激細胞を試験される各プレートにおいて対照として含めた）。
２０時間のインキュベーションの後、ＢＩＯ－ＧＬＯルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者の指示に従って使用して、ルシフェラーゼ活性を検出した。発光は、ＴＥＣＡＮ Ｍ １０００Ｐｒｏ機器を使用して、５００ミリ秒の積分時間で測定した。得られた相対光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ，ＲＬＵ）から、ＬＴＢＲシグナル伝達の誘導倍率を以下のように計算した：誘導倍率＝ＲＬＵ刺激済み細胞／平均ＲＬＵ未刺激細胞（未刺激細胞を試験される各プレートにおいて対照として含めた）。
【0826】
標準偏差を含む用量応答曲線を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍを使用してプロットし、該当する場合は、非線形フィットを適用した（対数（アゴニスト）対応答（可変勾配－３パラメータ））。データを適合させるために、ｘ値（化合物の濃度）を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍのｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）関数を使用して変換した。
【0827】
６．９．５ＭＳＤプラットフォームを使用した処理細胞の上清中のサイトカイン測定
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下であることが知られているいくつかのサイトカインは、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定され得る。一例として、Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用したＲＡＮＴＥＳの測定のための方法が本明細書に記載されている。
ＮＦ－κＢシグナル伝達の制御下であることが知られているいくつかのサイトカインは、ＭＳＤプラットフォーム及びマルチプレックスＭＳＤプレートを使用して測定され得る。一例として、Ｒ－Ｐｌｅｘ抗体セットヒトＲＡＮＴＥＳ（ＭＳＤ）を使用したＲＡＮＴＥＳの測定のための方法が本明細書に記載されている。
【0828】
処理された細胞の上清中のＲＡＮＴＥＳの濃度を、製造業者の指示に従ってＭＳＤプラットフォームを使用して測定した。簡単に説明すると、プロトコルは以下のステップを含んだ：
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを含んだ。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。
（１）プレートの調製は、提供されたプレートをリンカー結合捕捉抗体でコーティングすることを含んだ。プレートを２～８℃で一晩振盪しながらインキュベートした。翌日、プレートを、プレートワッシャ（Ｂｉｏｔｅｋ；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用してＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）で洗浄した。
（２）較正物質標準及び検出抗体溶液を調製した。
（３）材料の利用可能性に応じて、上清を１：３又は１：５に希釈した。
【0829】
６．９．６アッセイプロトコル：
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
○ステップ１：試料又は較正物質標準をプレートに添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。
○ステップ２：プレートを洗浄し、検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間振盪しながらインキュベートした。
○ステップ３：プレートを洗浄し、２ｘリード緩衝液Ｔを添加した。プレートをＭＳＤ機器で分析した。
【0830】
データを、ＭＥＳＯＳＣＡＬＥソフトウェア（ＭＳＤ探索作業ベンチプログラムｖ ４．０．１２．１）を使用して解析し、ＧＲＡＰＨＰＡＤ Ｐｒｉｓｍを使用してプロットした。
【0831】
６．９．７結果－Ａ５４９レポーター細胞／Ｈ２２６共培養アッセイにおけるＬＴＢＲのメソテリン依存性活性化
Ａ５４９レポーター細胞及びＨ２２６細胞を用いた共培養アッセイを行って、その広い発現（Ｌｕｋａｓｈｅｖ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１９）：９６１７－２４（２００６）のために、ＬＴＢＲ及びメソテリン（腫瘍細胞の細胞表面上の他の腫瘍関連抗原、例えば、ＥＧＦＲ）が腫瘍細胞の細胞表面上で共発現されると予想される場合に、ＣＯＶＡ１４１４６がより生理的なシステムにおいてＬＴＢＲを活性化することができるかどうかを検証した。図１９Ａでは、これらの条件下でＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化しなかったことが示された。処理された細胞の上清中に分泌されたＲＡＮＴＥＳの濃度を測定して、ＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化することができないことを確認した。予想通りに、図１９Ｂは、ＲＡＮＴＥＳが、アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６で処理された細胞と同じ程度までＣＯＶＡ１４１４６で処理された細胞によって分泌されたことを示し、ＬＴＢＲがこれらの条件下で活性化できないことが確認された。
Ａ５４９レポーター細胞及びＨ２２６細胞を用いた共培養アッセイを行って、その広い発現（Ｌｕｋａｓｈｅｖ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６６（１９）：９６１７－２４（２００６）のために、ＬＴＢＲ及びメソテリン（腫瘍細胞の細胞表面上の他の腫瘍関連抗原、例えば、ＥＧＦＲ）が腫瘍細胞の細胞表面上で共発現されると予想される場合に、ＣＯＶＡ１４１４６がより生理的なシステムにおいてＬＴＢＲを活性化することができるかどうかを検証した。図１９Ａでは、これらの条件下でＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化しなかったことが示された。処理された細胞の上清中に分泌されたＲＡＮＴＥＳの濃度を測定して、ＣＯＶＡ１４１４６がＬＴＢＲを効率的に活性化することができないことを確認した。予想通りに、図１９Ｂは、ＲＡＮＴＥＳが、アイソタイプ対照分子ＣＯＶＡ１４８６で処理された細胞と同じ程度までＣＯＶＡ１４１４６で処理された細胞によって分泌されたことを示し、ＬＴＢＲがこれらの条件下で活性化できないことが確認された。
【0832】
６．１０実施例１０：細胞外マトリックスに存在するＬＴＢＲ及び他のＴＡＡに特異的に結合する二重特異性抗体
上記の例は、ＬＴＢＲ及びＴＡＡを標的とする二重特異性抗体が細胞外マトリックスで発現されたことを実証し、その場合、フィブロネクチンのＥＤＢは、ＥＤＢを発現する腫瘍組織においてＬＴＢＲを選択的に活性化することができる。この実施例は、これが、そのようなＴＡＡの２つ以上の例、すなわち、テネイシンＣのドメインＡ２、及びフィブロネクチンのエクストラドメインＡを提供することにより、細胞外マトリックス中に存在するＬＴＢＲ及び別のＴＡＡを標的とする二重特異性抗体により一般的に適用可能であることを実証した。
上記の例は、ＬＴＢＲ及びＴＡＡを標的とする二重特異性抗体が細胞外マトリックスで発現されたことを実証し、その場合、フィブロネクチンのＥＤＢは、ＥＤＢを発現する腫瘍組織においてＬＴＢＲを選択的に活性化することができる。この実施例は、これが、そのようなＴＡＡの２つ以上の例、すなわち、テネイシンＣのドメインＡ２、及びフィブロネクチンのエクストラドメインＡを提供することにより、細胞外マトリックス中に存在するＬＴＢＲ及び別のＴＡＡを標的とする二重特異性抗体により一般的に適用可能であることを実証した。
【0833】
一般に、上記の実施例に記載の方法に従って、細胞外マトリックスに存在するＬＴＢＲ及び他のＴＡＡに結合する更なる二重特異性抗体、すなわち、テネイシンＣのドメインＡ２（ＴｎＣＡ２）又はフィブロネクチンのエクストラドメインＡ（extra domain A、ＥＤＡ）を調製した。これらのＴＡＡの配列は、例えば、
－ＴｎＣＡ２：ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２４８２１．３、
－ＥＤＡ：ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７５１に記載されている。
－ＴｎＣＡ２：ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２４８２１．３、
－ＥＤＡ：ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７５１に記載されている。
【0834】
更に、これらのＴＡＡに対する抗体は、例えば、以前に以下に記載されている：
－ＴｎＣＡ２：国際公開第２０１１／０２０７８３号、
－ＥＤＡ：欧州特許第２１４２５６７。
－ＴｎＣＡ２：国際公開第２０１１／０２０７８３号、
－ＥＤＡ：欧州特許第２１４２５６７。
【0835】
本実施例に使用されるこれらの標的に対する結合ドメインの例示的な配列（本発明の多重特異性結合分子を作成するためにＬＴＢＲ ｓｃＦｖと組み合わせることによる）は、以下のように提供される：
－ＴｎＣＡ２：配列番号１０９のＶＨ及び配列番号１１０のＶＬ、
－ＥＤＡ：配列番号１１１のＶＨ及び配列番号１１２のＶＬＶ。
－ＴｎＣＡ２：配列番号１０９のＶＨ及び配列番号１１０のＶＬ、
－ＥＤＡ：配列番号１１１のＶＨ及び配列番号１１２のＶＬＶ。
【0836】
これらの配列は、以下のとおりである。
配列番号１０９（抗ＴｎＣＡ２ Ａｂ ２Ｂ１０のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＹＧＹＡＹＹＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１０９（抗ＴｎＣＡ２ Ａｂ ２Ｂ１０のＶＨ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＹＧＹＡＹＹＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【0837】
配列番号１１０（抗ＴｎＣＡ２ Ａｂ ２Ｂ１０のＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＧＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＧＬＱＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＧＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＧＬＱＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0838】
配列番号１１１（抗ＥＤＡ Ａｂ Ｆ８のＶＨ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0839】
配列番号１１２（抗ＥＤＡ Ａｂ Ｆ８のＶＬ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＰＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＭＲＧＲＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＭＰＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＭＲＧＲＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【0840】
ＬＴＢＲ及びこれらのＴＡＡに結合する二重特異性抗体を調製し、実施例７に記載されるのと同様の手順に従って、ＴＡＡ依存性インビトロＬＴＢＲ活性化－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＬＴＢＲのＴＡＡ特異的活性化について試験した。
【0841】
２：１化学量論を有する非対称抗体は、以下のように生成された：
ＣＯＶＡ１４１９８は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号：７７）融合（配列番号１１３、配列番号１１４を含む）を担持する抗ＥＤＡ抗体重鎖の抗ＥＤＡ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号１１５）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号１１６）との共発現によって生成された。
ＣＯＶＡ１４１９８は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号：７７）融合（配列番号１１３、配列番号１１４を含む）を担持する抗ＥＤＡ抗体重鎖の抗ＥＤＡ抗体の重鎖（ＨＣ、配列番号１１５）及び軽鎖（ＬＣ；配列番号１１６）との共発現によって生成された。
【0842】
配列を以下に列挙する。
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＴＹＹＬＨＷＶＲＱＡＰＧＣＧＬＥＷＭＧＷＩＹＰＧＮＶＨＡＱＹＮＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＷＥＧＦＰＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＣＰＰＣＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＩＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＳＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＤＴＹＰＦＴＦＧＣＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
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【0843】
配列番号１１３（ＢＨＡ１０ステープル処理（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖ Ｃ末端融合、ＩｇＧ１シグマ、ノブ変異を有するＦ８ ＨＣ）
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【0844】
配列番号１１４（Ｆ８ ＨＣ、ＩｇＧ１シグマ、ノブ変異）
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【0845】
配列番号１１５（Ｆ８ ＨＣ、ＩｇＧ１シグマ及びホール変異）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＬＦＴＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＴＨＬＹＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0846】
配列番号１１６（Ｆ８ ＬＣ）
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【0847】
ＣＯＶＡ１４２０２は、Ｃ末端ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ配向配列番号７７）融合（配列番号１１７、配列番号１１８を含む）を担持するテネイシンＣ抗体重鎖の抗ドメインＡ２のテネイシンＣ抗体の抗ドメインＡ２の重鎖（ＨＣ、配列番号１１９）及び軽鎖（ＬＣ、配列番号１２０）との共発現によって生成された。配列を以下に列挙する。
【0848】
配列番号７７［ステープル処理ｓｃＦｖ ＢＨＡ１０（ＶＨ－ＶＬ）］
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【0849】
配列番号１１７（ＢＨＡ１０ステープル処理（ＶＨ－ＶＬ）ｓｃＦｖ Ｃ末端融合、ＩｇＧ１シグマ、ノブ変異を有する２Ｂ１０ ＨＣ）
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【0850】
配列番号１１８（２Ｂ１０ ＨＣ、ＩｇＧ１シグマ、ノブ変異）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＹＧＹＡＹＹＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
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【0851】
配列番号１１９（２Ｂ１０ ＨＣ、ＩｇＧ１シグマ及びホール変異）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＹＧＹＡＹＹＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＹＧＹＡＹＹＧＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0852】
配列番号１２０（２Ｂ１０ ＬＣ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＧＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＧＬＱＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＧＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＧＬＱＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【0853】
ＬＴＢＲのＴＡＡ依存性活性化を実証するために、高結合９６ウェルμＣｌｅａｒ平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）に以下を一晩コーティングした：
－１５０ｎｇ／ウェルの組換えドメインＡ２含有（Ａ２＋）テネイシンＣドメインＡ１－Ａ２－Ａ３（ＴｎＣＡ２＋、配列番号１２１）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えテネイシンドメインＡ１－Ａ３（すなわち、Ａ２－として示されるドメインＡ２を欠いている）（ＴｎＣＡ２－、配列番号１２２）。又は
－１５０ｎｇ／ウェルの組換えＥＤＡ含有（ＥＤＡ＋）フィブロネクチンドメイン１１－Ａ－１２（ＥＤＡ＋、配列番号１２３）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えフィブロネクチンドメイン１１－１２（すなわち、ＥＤＡ－として示されるＥＤＡを欠いている）（ＥＤＡ－、配列番号１２４）。
－１５０ｎｇ／ウェルの組換えドメインＡ２含有（Ａ２＋）テネイシンＣドメインＡ１－Ａ２－Ａ３（ＴｎＣＡ２＋、配列番号１２１）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えテネイシンドメインＡ１－Ａ３（すなわち、Ａ２－として示されるドメインＡ２を欠いている）（ＴｎＣＡ２－、配列番号１２２）。又は
－１５０ｎｇ／ウェルの組換えＥＤＡ含有（ＥＤＡ＋）フィブロネクチンドメイン１１－Ａ－１２（ＥＤＡ＋、配列番号１２３）又は１５０ｎｇ／ウェルのヒト組換えフィブロネクチンドメイン１１－１２（すなわち、ＥＤＡ－として示されるＥＤＡを欠いている）（ＥＤＡ－、配列番号１２４）。
【0854】
上記の配列は以下のとおりである。
配列番号１２１（精製のための（Ｈｉｓ）６タグを含む、ＨｕテネイシンＣドメインＡ１－Ａ２－Ａ３）
ＥＱＡＰＥＬＥＮＬＴＶＴＥＶＧＷＤＧＬＲＬＮＷＴＡＡＤＱＡＹＥＨＦＩＩＱＶＱＥＡＮＫＶＥＡＡＲＮＬＴＶＰＧＳＬＲＡＶＤＩＰＧＬＫＡＡＴＰＹＴＶＳＩＹＧＶＩＱＧＹＲＴＰＶＬＳＡＥＡＳＴＧＥＴＰＮＬＧＥＶＶＶＡＥＶＧＷＤＡＬＫＬＮＷＴＡＰＥＧＡＹＥＹＦＦＩＱＶＱＥＡＤＴＶＥＡＡＱＮＬＴＶＰＧＧＬＲＳＴＤＬＰＧＬＫＡＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴＱＤＦＳＴＴＰＬＳＶＥＶＬＴＥＥＶＰＤＭＧＮＬＴＶＴＥＶＳＷＤＡＬＲＬＮＷＴＴＰＤＧＴＹＤＱＦＴＩＱＶＱＥＡＤＱＶＥＥＡＨＮＬＴＶＰＧＳＬＲＳＭＥＩＰＧＬＲＡＧＴＰＹＴＶＴＬＨＧＥＶＲＧＨＳＴＲＰＬＡＶＥＶＶＴＨＨＨＨＨＨ
配列番号１２１（精製のための（Ｈｉｓ）６タグを含む、ＨｕテネイシンＣドメインＡ１－Ａ２－Ａ３）
ＥＱＡＰＥＬＥＮＬＴＶＴＥＶＧＷＤＧＬＲＬＮＷＴＡＡＤＱＡＹＥＨＦＩＩＱＶＱＥＡＮＫＶＥＡＡＲＮＬＴＶＰＧＳＬＲＡＶＤＩＰＧＬＫＡＡＴＰＹＴＶＳＩＹＧＶＩＱＧＹＲＴＰＶＬＳＡＥＡＳＴＧＥＴＰＮＬＧＥＶＶＶＡＥＶＧＷＤＡＬＫＬＮＷＴＡＰＥＧＡＹＥＹＦＦＩＱＶＱＥＡＤＴＶＥＡＡＱＮＬＴＶＰＧＧＬＲＳＴＤＬＰＧＬＫＡＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＴＱＤＦＳＴＴＰＬＳＶＥＶＬＴＥＥＶＰＤＭＧＮＬＴＶＴＥＶＳＷＤＡＬＲＬＮＷＴＴＰＤＧＴＹＤＱＦＴＩＱＶＱＥＡＤＱＶＥＥＡＨＮＬＴＶＰＧＳＬＲＳＭＥＩＰＧＬＲＡＧＴＰＹＴＶＴＬＨＧＥＶＲＧＨＳＴＲＰＬＡＶＥＶＶＴＨＨＨＨＨＨ
【0855】
配列番号１２２（精製のための（Ｈｉｓ）６を含む、ＨｕテネイシンＣドメインＡ１－Ａ３）
ＥＱＡＰＥＬＥＮＬＴＶＴＥＶＧＷＤＧＬＲＬＮＷＴＡＡＤＱＡＹＥＨＦＩＩＱＶＱＥＡＮＫＶＥＡＡＲＮＬＴＶＰＧＳＬＲＡＶＤＩＰＧＬＫＡＡＴＰＹＴＶＳＩＹＧＶＩＱＧＹＲＴＰＶＬＳＡＥＥＥＶＰＤＭＧＮＬＴＶＴＥＶＳＷＤＡＬＲＬＮＷＴＴＰＤＧＴＹＤＱＦＴＩＱＶＱＥＡＤＱＶＥＥＡＨＮＬＴＶＰＧＳＬＲＳＭＥＩＰＧＬＲＡＧＴＰＹＴＶＴＬＨＧＥＶＲＧＨＳＴＲＰＬＡＶＥＶＶＴＨＨＨＨＨＨ
ＥＱＡＰＥＬＥＮＬＴＶＴＥＶＧＷＤＧＬＲＬＮＷＴＡＡＤＱＡＹＥＨＦＩＩＱＶＱＥＡＮＫＶＥＡＡＲＮＬＴＶＰＧＳＬＲＡＶＤＩＰＧＬＫＡＡＴＰＹＴＶＳＩＹＧＶＩＱＧＹＲＴＰＶＬＳＡＥＥＥＶＰＤＭＧＮＬＴＶＴＥＶＳＷＤＡＬＲＬＮＷＴＴＰＤＧＴＹＤＱＦＴＩＱＶＱＥＡＤＱＶＥＥＡＨＮＬＴＶＰＧＳＬＲＳＭＥＩＰＧＬＲＡＧＴＰＹＴＶＴＬＨＧＥＶＲＧＨＳＴＲＰＬＡＶＥＶＶＴＨＨＨＨＨＨ
【0856】
配列番号１２３（精製のための（Ｈｉｓ）６タグを含む、Ｈｕフィブロネクチンドメイン１１－Ａ－１２）
ＥＩＤＫＰＳＱＭＱＶＴＤＶＱＤＮＳＩＳＶＫＷＬＰＳＳＳＰＶＴＧＹＲＶＴＴＴＰＫＮＧＰＧＰＴＫＴＫＴＡＧＰＤＱＴＥＭＴＩＥＧＬＱＰＴＶＥＹＶＶＳＶＹＡＱＮＰＳＧＥＳＱＰＬＶＱＴＡＶＴＮＩＤＲＰＫＧＬＡＦＴＤＶＤＶＤＳＩＫＩＡＷＥＳＰＱＧＱＶＳＲＹＲＶＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶＳＶＶＡＬＨＤＤＭＥＳＱＰＬＩＧＴＱＳＴＡＩＰＡＰＴＤＬＫＦＴＱＶＴＰＴＳＬＳＡＱＷＴＰＰＮＶＱＬＴＧＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥＩＮＬＡＰＤＳＳＳＶＶＶＳＧＬＭＶＡＴＫＹＥＶＳＶＹＡＬＫＤＴＬＴＳＲＰＡＱＧＶＶＴＴＬＥＨＨＨＨＨＨ
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【0857】
配列番号１２４（精製のための（Ｈｉｓ）６タグを含む、Ｈｕフィブロネクチンドメイン１１－１２）
ＥＩＤＫＰＳＱＭＱＶＴＤＶＱＤＮＳＩＳＶＫＷＬＰＳＳＳＰＶＴＧＹＲＶＴＴＴＰＫＮＧＰＧＰＴＫＴＫＴＡＧＰＤＱＴＥＭＴＩＥＧＬＱＰＴＶＥＹＶＶＳＶＹＡＱＮＰＳＧＥＳＱＰＬＶＱＴＡＶＴＴＩＰＡＰＴＤＬＫＦＴＱＶＴＰＴＳＬＳＡＱＷＴＰＰＮＶＱＬＴＧＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥＩＮＬＡＰＤＳＳＳＶＶＶＳＧＬＭＶＡＴＫＹＥＶＳＶＹＡＬＫＤＴＬＴＳＲＰＡＱＧＶＶＴＴＬＥＨＨＨＨＨＨ
ＥＩＤＫＰＳＱＭＱＶＴＤＶＱＤＮＳＩＳＶＫＷＬＰＳＳＳＰＶＴＧＹＲＶＴＴＴＰＫＮＧＰＧＰＴＫＴＫＴＡＧＰＤＱＴＥＭＴＩＥＧＬＱＰＴＶＥＹＶＶＳＶＹＡＱＮＰＳＧＥＳＱＰＬＶＱＴＡＶＴＴＩＰＡＰＴＤＬＫＦＴＱＶＴＰＴＳＬＳＡＱＷＴＰＰＮＶＱＬＴＧＹＲＶＲＶＴＰＫＥＫＴＧＰＭＫＥＩＮＬＡＰＤＳＳＳＶＶＶＳＧＬＭＶＡＴＫＹＥＶＳＶＹＡＬＫＤＴＬＴＳＲＰＡＱＧＶＶＴＴＬＥＨＨＨＨＨＨ
【0858】
これらのアッセイの結果は、ＥＤＢ／ＬＴＢＲ二重特異体について上記に示された結果と同じであり、すなわち、それらは、主に、それぞれの二重特異性結合分子によって標的とされた細胞外マトリックスの腫瘍抗原の存在下でＬＴＢＲの活性化を示した（表１３）。
【0859】
【表13】
【0860】
特に、ＴｎＣＡ２／ＬＴＢＲ二重特異性結合分子は、ＬＴＢＲを活性化し、したがって、ＴｎＣＡ２抗原の存在下で強く、ＮＦ－κＢシグナル伝達を誘発し、ＥＤＡ／ＬＴＢＲ二重特異性結合分子は、ＬＴＢＲを活性化し、したがって、ＥＤＡ抗原の存在下で強く、ＮＦ－κＢシグナル伝達を誘発することができる。それぞれのＴＡＡが存在しない場合、これらの二重特異性は、ＬＴＢＲを活性化しないか、又は最小限にのみ活性化した。
【0861】
この実施例は、本明細書に提供される多重特異性結合分子を介してＬＴＢＲを活性化するアプローチ、例えば、細胞外マトリックスに関連するＬＴＢＲ及び腫瘍関連抗原の両方への結合が、それ以上試験された細胞外マトリックスの３つの異なる腫瘍関連抗原すべてに対して機能し、したがって、細胞外マトリックスに存在する腫瘍関連抗原には一般に適用可能であることを実証した。本実施例はまた、ｓｐＦｖを組み込んだ分子が機能的であることを実証した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図15I】
【図15J】
【図15K】
【図15L】
【図15M】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図19A】
【図19B】
【配列表】
【国際調査報告】