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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-21
(54)【発明の名称】心臓血管疾患の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 35/51 20150101AFI20221014BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20221014BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20221014BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20221014BHJP
【ＦＩ】
A61K35/51
A61P9/10
A61K9/08
A61K47/20
A61P9/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509018
(86)(22)【出願日】2020-08-20
(85)【翻訳文提出日】2022-04-07
(86)【国際出願番号】 US2020047094
(87)【国際公開番号】W WO2021034996
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/889,225
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＺＩＰＬＯＣ
(71)【出願人】
【識別番号】510257721
【氏名又は名称】ステムサイト インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＴＥＭＣＹＴＥ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】１３８００ Ｌｉｖｅ Ｏａｋ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂａｌｄｗｉｎ Ｐａｒｋ， ＣＡ ９１７０６， ＵＳＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジョナス
(72)【発明者】
【氏名】リン， シン ゾン
(72)【発明者】
【氏名】ハーン， ホーング－イリ
(72)【発明者】
【氏名】リン， ポー－チョン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB11
4C076CC11
4C076DD55
4C076FF65
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB59
4C087MA16
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA36
(57)【要約】
本発明は、心臓血管疾患の細胞ベースの治療に関する。本発明はまた、神経組織を改善し、心臓血管疾患患者ならびに他の形態の神経学的ストレスまたは損傷に苦しむ患者の行動および神経学的機能を改善するための治療も提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
心臓血管疾患または脳損傷を治療または改善する方法であって、治療または改善を必要とする対象を特定することと、
前記対象に、有効量の、臍帯血（ＵＣＢ）を含む治療用組成物を投与することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記治療用組成物が、血漿枯渇（ＰＤ）ＵＣＢまたは赤血球減少（ＲＣＲ）ＵＣＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記治療用組成物が、凍結防止剤をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記凍結防止剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＰＤ ＵＣＢが、全血ＵＣＢと比較した場合に、赤血球が枯渇していない、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記ＰＤ ＵＣＢが、すべての赤血球体積を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記治療用組成物が、約５体積％～１０体積％の凍結防止剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記治療用組成物が、ＵＣＢを含む保存された組成物を解凍することによって得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項9】
前記解凍のステップが、５分以内に完了する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記解凍のステップが、約３７℃±２℃の間に維持された浴中で前記保存された組成物をインキュベートすることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記保存された組成物が、解凍後に洗浄されず、前記治療用組成物として前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記投与のステップが、前記解凍が完了した後、１～２時間以内に完了する、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記ＵＣＢが、単核細胞を含み、前記単核細胞が、前記対象に、約２～５×１０８単核細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇで投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記治療用組成物が、注入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記治療用組成物が、約５～１０ｍｌ／分で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記対象に、血液脳関門（ＢＢＢ）透過剤組成物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記ＢＢＢ透過剤組成物が、マンニトールを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記心臓血管疾患が、脳卒中または心筋症である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記対象が、ヒト患者である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記投与ステップの前に、前記患者が、４～３２またはそれ以上の国立衛生研究所脳卒中スケール（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ）（ＮＩＨＳＳ）スコアを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記方法が、前記対象に対して４／６よりも大きいＨＬＡ適合検査をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記方法が、前記対象に対して適合性のあるＡＢＯを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記方法が、前記対象に、免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記対象に、前記投与ステップの前に、線維素溶解薬が投与されない、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記線維素溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記心筋症が、虚血性心筋症である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２０日出願された米国仮出願第６２／８８９，２２５号の優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月２０日出願された米国仮出願第６２／８８９，２２５号の優先権を主張する。本出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、患者における脳卒中および心筋症などの心臓血管疾患の細胞ベースの治療に関する。本発明はまた、神経組織を改善し、心臓血管疾患患者ならびに他の形態の神経学的ストレスまたは損傷に苦しむ患者の行動および神経学的機能を改善するための治療も提供する。
【背景技術】
【0003】
心臓血管疾患（ＣＶＤ）は、心臓または血管に関与する一種の疾患である。ＣＶＤには、狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られている）などの冠状動脈疾患（ＣＡＤ）が含まれる。他のＣＶＤには、脳卒中、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、異常な心拍リズム、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、および静脈血栓症が含まれる。心臓血管疾患は、世界の主な死亡原因である。例えば、脳卒中は、２番目に多い死亡原因および身体障害である。世界の６人に１人が脳卒中の影響を受けており、４０秒ごとに米国の誰かが脳卒中を患っている。多くの国での脳卒中治療の費用は、医療予算の５％を超えている（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２０１１，７６，Ｓ８５－Ｓ９０）。高齢化する人口により、脳卒中は、世界中でさらに大きな健康および経済的負担をもたらす。小さな脳卒中は、腕または脚の衰弱などの小さな問題のみをもたらし得るが、より大きな脳卒中は、片側の麻痺または会話困難をもたらし得る。脳卒中患者の３分の２超は、急性脳卒中期に最適な治療を受けたとしても、脳卒中から完全に回復しない（Ｈａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００４，３６３，７６８－７７４）。現在、虚血性脳卒中に対して唯一の利用可能な承認された薬理学的治療が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）である。しかしながら、比較的少数の患者が、この療法に適している。心臓血管疾患を治療するための新しい療法が、必要である。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、いくつかの態様において上述の必要性に対応する。
【0005】
一態様では、本発明は、心臓血管疾患または脳損傷を治療または改善する方法を提供する。この方法は、治療または改善を必要とする対象を特定することと、対象に、有効量の、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）（ＵＣＢ）または臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）（ＣＢ）を含む治療用組成物を投与することと、を含む。
【0006】
治療用組成物は、血漿枯渇（ＰＤ）ＵＣＢまたは赤血球減少（ＲＣＲ）ＵＣＢを含むことができる。いくつかの実施形態において、治療用組成物は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結防止剤をさらに含むことができる。ＰＤ ＵＣＢは、全血ＵＣＢと比較した場合に、赤血球が枯渇していない。例えば、ＰＤ ＵＣＢは、少なくとも５０体積％の赤血球を含むか、またはすべての赤血球体積を含むことができる。治療用組成物は、約５体積％～１５体積％（例えば、５～１０体積％）の凍結防止剤を含むことができる。この組成物は、ＵＣＢおよび上記の凍結防止剤を含む保存された凍結組成物を解凍することによって得ることができる。解凍のステップは、５分などの１～１０分以内に完了することができる。一例では、解凍のステップは、約３７℃～約４１℃、好ましくは約３７℃±２℃の間に維持された浴中で保存された組成物をインキュベートすることを含む。一旦解凍されると、保存された組成物は、洗浄される必要がなく、治療用組成物として対象に直接投与することができる。投与のステップは、解凍が完了してから１～２時間以内に完了することができる。ＵＣＢは、単核細胞を含み、単核細胞は、対象に、約１×１０６細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇで投与される。一例では、単核細胞は、約２～５×１０８単核細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇで投与される。治療用組成物は、約５～１０ｍｌ／分などの約１～２０ｍｌ／分で注入によって投与することができる。この方法は、対象に、血液脳関門（ＢＢＢ）透過剤組成物を投与することをさらに含むことができる。ＢＢＢ透過剤の例は、マンニトールを含む。
【0007】
心臓血管疾患は、脳卒中または心筋症であり得る。脳卒中の例には、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、急性脳卒中、または亜急性脳卒中が含まれる。好ましい実施形態において、対象は、ヒト患者である。投与ステップの前に、患者は、６～１８または８～１６などの４～３２またはそれ以上の国立衛生研究所脳卒中スケール（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃａｌｅ）（ＮＩＨＳＳ）スコアを有し得る。心筋症の例には、虚血性心筋症が含まれる。
【0008】
この方法は、レシピエント－対象をＨＬＡ適合検査することを含み得る。好ましくは、レシピエント対象および選択された臍帯血ユニットまたは複数の臍帯血移植のユニットは、４／６以上のＨＬＡ適合度でなければならない。この方法は、レシピエント対象とドナーとの間のＡＢＯ血液型の不適合性が臍帯血移植の問題として報告されていないため、レシピエント対象をＡＢＯ適合検査することを含んでも含まなくてもよい。つまり、レシピエント対象とドナーとの間のＡＢＯ適合または適合性は、必要ではない。
【0009】
本明細書に記載の方法は、対象に、ヒドロコルチゾンなどの免疫抑制剤を投与することをさらに含むことができる。好ましくは、対象に、細胞を投与する前、投与中、または投与後に、線維素溶解薬が、投与された細胞に損傷を与え得るため、組織プラスミノーゲン活性化因子などの線維素溶解薬が投与されない。
【0010】
本開示はまた、心臓血管疾患または脳損傷を治療するための薬剤の製造における上記の治療用組成物の使用も提供する。
【0011】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】脳卒中患者の臨床試験のタイムラインを示す図である。
【図2】ＵＣＢ注入後のマンニトール併用投与を示す図である。
【図3】ＵＣＢ注入を受けた後の患者別の運動機能改善を示す図である。
【図4A-4C】ＣＢ輸血の１日前（ベースライン）からＣＢ輸血の１２か月後までの神経機能の結果を示す図である。（Ａ）ＮＩＨＳＳ、（Ｂ）バーグバランススコア、および（Ｃ）バーセル指数スコア。
【図5A-5D】脳卒中の２時間後からＣＢ輸血の６か月後までの拡散強調画像（ＤＷＩ）の結果を示す写真である。（ａ）脳卒中の２時間後。（ｂ）ＣＢ輸血の１日後。（ｃ）ＣＢ輸血の３か月後。（ｄ）ＣＢ輸血の６か月後。
【図6A-6D】脳卒中の２時間後からＣＢ輸血の６か月後まで試験されたＴ２画像を示す写真である。（ａ）脳卒中の２時間後。（ｂ）ＣＢ輸血の１日後。（ｃ）ＣＢ輸血の３か月後。（ｄ）ＣＢ輸血の６か月後。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、脳卒中および心臓病などの心臓血管疾患を治療するための方法および組成物を提供する。本発明の特定の態様は、少なくとも部分的に、同種異系ＵＣＢユニットが急性虚血性脳卒中患者を治療するのに安全かつ効果的であるという予期せぬ発見に基づいている。本明細書に開示されるように、ＵＣＢユニットは、幹細胞だけでなく、優れた免疫寛容および免疫調節活性、ならびにＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１０などの高レベルの因子も保有する。したがって、ＵＣＢ製品の注入は、免疫恒常性を回復するだけでなく、急性脳卒中患者の脳の修復を促進し得る。
【0014】
脳卒中
脳卒中は、２番目に多い死亡原因であり、３番目に多い身体障害の原因であり、６人に１人が罹患しており、世界中で大きな健康および経済的負担を示す。毎年１５００万人以上が、脳卒中を患っている。これらの人々のうち、３０～３５％が死亡し、生存の７５％近くが永続的な障害を維持する。
脳卒中は、２番目に多い死亡原因であり、３番目に多い身体障害の原因であり、６人に１人が罹患しており、世界中で大きな健康および経済的負担を示す。毎年１５００万人以上が、脳卒中を患っている。これらの人々のうち、３０～３５％が死亡し、生存の７５％近くが永続的な障害を維持する。
【0015】
脳卒中は、酸素および栄養素を脳に運ぶ血管が血餅によって遮断される（虚血性脳卒中と呼ばれる）または血管が破裂して脳への血流を妨げること（出血性脳卒中と呼ばれる）ときに発生する。それが起こると、脳の一部が必要な血液および酸素を得ることができなくなり、脳細胞が死に至る。脳卒中の約８０％は、虚血性脳卒中である。虚血性脳卒中は、脳への動脈が狭くなったり遮断されたりして、血流が大幅に低減したときに発生する（虚血）。非造影コンピュータ断層撮影（ＣＴ）は、脳卒中が疑われる患者の初期評価のための主要な画像診断法である。脳卒中のＣＴ兆候を説明するために、急性（２４時間未満）、亜急性（２４時間～５日）、および慢性（数週間）の３つの主要な段階が使用される。Ｂｉｒｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｗｅｓｔ Ｊ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ．２０１１ Ｆｅｂ；１２（１）：６７－７６。
【0016】
急性期の現在の治療法には、抗凝固剤、抗血小板剤、および血栓溶解剤が含まれる。このような血栓溶解剤の使用は、脳卒中から３時間以内でなければならず、せいぜい６時間しか効果がない。さらに、血栓溶解剤は、出血率を１５～２０％増加させる。虚血性脳卒中後、１時間あたり約１億２０００万個のニューロンが死に至り、これは、脳機能の３．６年の老化に相当する（Ｌａｋｈａｎ ＳＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；７：９７）。さらに、死んだニューロンは再生することができないため、ニューロンおよび他の細胞を再生する方法を見つけることが重要である。細胞療法は、脳卒中の治療における大躍進をもたらす。例えば、発明者チームは、１５人の慢性虚血性脳卒中患者の治療のために自己造血幹細胞（ＣＤ３４＋）脳移植と組み合わせたＧ－ＣＳＦ注射を使用した。これらの結果は、その実現可能性および安全性を確認した。しかしながら、これらの結果はまた、患者の細胞年齢が改善の程度に有意な影響を与えることも示した。例えば、高齢（６０歳超）の個人からの幹細胞の増殖および分化の能力は、若い人からの幹細胞ほど良くない。
【0017】
本明細書に開示されるように、第Ｉ相臨床研究は、顕著な治療の進歩を示した：同種異系のＰＤ－臍帯血注入は、脳卒中患者を治療するために安全かつ効果的である。
【0018】
心臓病
心臓病または心臓疾患は、いくつかのクラスまたはタイプが存在する疾患（例えば、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、大動脈弁狭窄症（ＡＳ））であり、多くは独自の治療戦略を必要とする。したがって、心臓疾患は、単一の疾患ではないが、異なる発病のメカニズムによって異なる細胞型（例えば、心筋細胞）から生じる一群の障害である。本明細書で使用される場合、心臓病は、以下の非限定的な例を包含する：心不全（例えば、うっ血性心不全）、虚血性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈媒介性心筋症、ストレス誘発性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈誘発性右心室異形成、左心室非圧密、心内膜線維弾性症、大動脈狭窄症、大動脈弁逆流、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流、三尖性狭窄症、三尖弁逆流、先天性障害、遺伝性障害、またはこれらの組み合わせ。
心臓病または心臓疾患は、いくつかのクラスまたはタイプが存在する疾患（例えば、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、大動脈弁狭窄症（ＡＳ））であり、多くは独自の治療戦略を必要とする。したがって、心臓疾患は、単一の疾患ではないが、異なる発病のメカニズムによって異なる細胞型（例えば、心筋細胞）から生じる一群の障害である。本明細書で使用される場合、心臓病は、以下の非限定的な例を包含する：心不全（例えば、うっ血性心不全）、虚血性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈媒介性心筋症、ストレス誘発性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈誘発性右心室異形成、左心室非圧密、心内膜線維弾性症、大動脈狭窄症、大動脈弁逆流、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流、三尖性狭窄症、三尖弁逆流、先天性障害、遺伝性障害、またはこれらの組み合わせ。
【0019】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、対象における心臓病を治療するための方法に関する。この方法は、対象に、臍帯血を含む治療用組成物を投与または提供することを含む。
【0020】
臍帯血
臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）（または臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ））は、出産後に胎盤および付着した臍帯に残る血液であり、造血および遺伝性疾患を治療するために使用することができる幹細胞が含まれるため、定期的に採取される。ＵＣＢは、全血に見出されるすべての要素、つまり、赤血球、白血球、血漿、および血小板で構成されている。
臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）（または臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ））は、出産後に胎盤および付着した臍帯に残る血液であり、造血および遺伝性疾患を治療するために使用することができる幹細胞が含まれるため、定期的に採取される。ＵＣＢは、全血に見出されるすべての要素、つまり、赤血球、白血球、血漿、および血小板で構成されている。
【0021】
本明細書に開示されるように、体積が減少した臍帯血サンプルが、使用される。現在、臍帯血サンプルを減少させ、ＵＣＢユニットを保存するために、赤血球減少（ＲＣＲ）法および血漿枯渇（ＰＤ）法の２つの方法が、使用される。１９９０年代初期に開発された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（２２）：１０１１９－１０１２２；１９９５）、ＲＣＲ法は、高浸透圧溶液（ヘタスターチまたは卵白）で臍帯血を遠心分離し、２１ｍｌの細胞および液体を除くすべてを除去し、４ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加する。Ｓｔｅｍｃｙｔｅで開発されたＰＤ法は、血漿を除去するが、細胞をすべて保持する。ＰＤユニットは、通常、２５ｍｌ／ユニットのＲＣＲユニットと比較して、８０～１２０ｍｌ／ユニットの体積である。ＵＳ８０４８６１９およびＢｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３（１１）：１３４６－１３５７；２００７を参照のこと。このように調製された各方法およびＵＣＢには賛否両論あるが（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ ２３，ｐｐ．４０７－４１５，２０１７）、両方を使用して、本明細書に開示される発明を実施することができる。
【0022】
ＵＣＢユニットを収集して保存するために、血液銀行は、臍帯血にＤＭＳＯを添加して、凍結中、細胞を保護する。ＤＭＳＯは、細胞内の氷生成を低減し、９０％超の細胞が冷凍状態を生き延びることを可能にする。しかしながら、１％超のＤＭＳＯは、体温（３７℃）で血球に毒性がある。そのため、患者へのＤＭＳＯ投与を最小限に抑えるように注意を払う必要があることは、当該技術分野では標準的であり、細胞が３０分を超える時間１％にさらされないように、ＤＭＳＯを、凍結直前に臍帯血に添加し、解凍後すぐに除去する。臍帯血が１％超のＤＭＳＯに３０分以上さらされると、臍帯血細胞が死滅して、凝集する。これにより、臍帯血を静脈内注入すると、心臓の塞栓、胸痛、および他の症状が発生し得る。Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ ２３，ｐｐ．４０７－４１５，２０１７。しかし、本明細書に開示されるように、ＰＤ－ＵＣＢユニットが、その中のＤＭＳＯを除去することなく、急性虚血性脳卒中患者を治療するのに安全かつ効果的であることは予想外であった。
【0023】
ＰＤ－ＵＣＢ
本発明のＰＤ－ＵＣＢ組成物は、ＵＣＢユニットから実質的に枯渇した血漿、およびＵＣＢユニットから枯渇していない赤血球（ＲＢＣ）を有するという独特の特徴を有する。このようなＵＣＢユニットは、血漿枯渇を、造血幹細胞の凍結保存、選択、解凍、および／または移植と組み合わせて、処理後の細胞回復および解凍後の注入細胞の投与量を最大化することによって、優れた臨床転帰を提供するプロセスによって調製され得る。一例では、血漿が枯渇し、ＲＢＣが枯渇していないＵＣＢユニットは、ＵＳ８０４８６１９に記載されるプロセスによって調製され得、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明のＰＤ－ＵＣＢ組成物は、ＵＣＢユニットから実質的に枯渇した血漿、およびＵＣＢユニットから枯渇していない赤血球（ＲＢＣ）を有するという独特の特徴を有する。このようなＵＣＢユニットは、血漿枯渇を、造血幹細胞の凍結保存、選択、解凍、および／または移植と組み合わせて、処理後の細胞回復および解凍後の注入細胞の投与量を最大化することによって、優れた臨床転帰を提供するプロセスによって調製され得る。一例では、血漿が枯渇し、ＲＢＣが枯渇していないＵＣＢユニットは、ＵＳ８０４８６１９に記載されるプロセスによって調製され得、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0024】
簡言すれば、新生児のＵＣＢは、抗凝固剤が入ったマルチバッグ採血バッグなどの収集容器に収集される。収集容器は、典型的には、約０．１～約１００ｍｌの抗凝固剤（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍｌ）を含有する。好ましくは、収集容器は、約２３ｍｌ～約３５ｍｌの抗凝固剤を含有する。抗凝固剤の非限定的な例には、クエン酸塩、リン酸塩、デキストロース、およびアデノシン混合物（ＣＰＤＡ）、クエン酸塩、リン酸塩、およびデキストロース混合物（ＣＰＤ）、ならびに酸、クエン酸塩、およびデキストロース混合物（ＡＣＤ）が含まれる。好ましくは、抗凝固剤は、ＣＰＤＡであり、これは、０．２９９％の無水クエン酸、０．２６３％の二水和クエン酸ナトリウム（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）、０．２２２％の一塩基性リン酸ナトリウム（一水和物）、３．１９％のデキストロース、および０．０２７５％のアデノシンを含み得る。ＣＰＤＡは、等張性であり、中性のｐＨを有するため、血液に対する抗凝固剤の比率は重要ではない。しかしながら、当業者は、収集容器内の抗凝固剤の組成および／または体積が、ドナーから収集された臍帯血の量に依存し得ることを理解するであろう。収集バッグの重量を秤量して、合計重量から抗凝固剤を含む収集バッグの重量を差し引くことによって、ＵＣＢ収集体積を決定することができる。バッグ内の体積は、ＵＣＢの体積および抗凝固剤の体積によって決定される。
【0025】
収集されたＵＣＢは、生後約４８時間までに凍結保存を可能にするために、好ましくは約４３時間以内にＵＣＢ処理実験室に送達され得る。しかしながら、生後約７２時間までの凍結保存でも、許容可能な結果が得られ得る。
【0026】
全臍帯血を、この時点で分析して、全血球計算を決定することができる。抗凝固剤を使用した前処理ヘマトクリット値（すなわち、赤血球の体積パーセント）は、通常、９５％超のサンプルに対して約２０％～約６０％の範囲を有する。赤血球濃度は、通常、約２～約１０×１０６／μｌであり、白血球濃度は、通常、約１～約３０×１０６／ｍｌである。
【0027】
ＵＣＢユニットは、例えば、３バッグ収集血液バッグで遠心分離して、細胞画分を上部血漿画分から分離することができる。上部血漿部分は、２番目のバッグに移すことができ、これを、密封する。場合によっては、残りの大部分の細胞部分が、６０ｃｃ超含有する場合、製品は、それぞれ、独自の収集／移送バッグに、２つの部分（例えば、元のバッグおよび３番目のバッグ）に分割され得る。血漿枯渇後、ＵＣＢユニットのヘマトクリット値（ＨＣＴ）およびＲＢＣ濃度の両方が、全血または赤血球枯渇ユニットと比較して、約１．２～約３倍（平均＝約１．６～約１．８倍；中央値＝約１．７～約１．８倍）増加する。
【0028】
次いで、各収集／移送バッグ内の製品は、滅菌ドッキングデバイスを介して１つの凍結バッグ（例えば、ＣＲＹＯＣＹＴＥバッグ）に移送され得る。通常、ＵＣＢユニットは、血漿が枯渇し、事前に冷却された（つまり、約４℃）凍結防止剤を添加した後、例えば、約７５ｃｃのほぼ最大体積で１つの凍結バッグに凍結保存され得る。しかしながら、一部のＵＣＢユニットは、例えば、ほぼ最大体積の合計が約１５０ｃｃである２つのバッグに分割され得る。
【0029】
次いで、血漿枯渇ＵＣＢ／抗凝固剤混合物を、約４℃に冷却してから、１つ以上の凍結防止剤を添加することができる。典型的には、溶液の形態の凍結防止剤は、ＵＣＢ／抗凝固剤の体積の約２５％～約５０％に等しい量で添加することができる。例えば、血漿枯渇サンプルのＵＣＢ／抗凝固剤の量が６０ｍｌである場合、凍結防止剤溶液の体積は、１５ｍｌであり得る。結果として、ＵＣＢユニットは、一般に、約５体積％～約１５体積％の凍結防止剤、例えば、約５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、または１５体積％の凍結防止剤を含む。好ましい実施形態において、凍結防止剤溶液は、約５０％のＤＭＳＯおよび約５％のＧｅｎｔｒａｎ ４０の混合物（すなわち、約１０：１のＤＭＳＯ対Ｇｅｎｔｒａｎ ４０の比）を含み、約５％～約１０％の最終ＤＭＳＯ濃度を提供する。ＤＭＳＯ／Ｇｅｎｔｒａｎ ４０凍結防止剤溶液は、ローテーター上のアイスパックの間に凍結バッグを備えたシリンジポンプによって毎分約０．７５ｍｌの速度で、ＵＣＢ／抗凝固剤混合物に添加して、約５％～約１０％の最終ＤＭＳＯ濃度にすることができる。抗凝固剤および凍結防止剤の両方を含有する血漿枯渇ＵＣＢユニットは、全血または赤血球枯渇ユニットと比較して、より高いヘマトクリット値（ＨＣＴ）およびＲＢＣ濃度（すなわち、少なくとも約１．６倍）を有し得る。
【0030】
次いで、抗凝固剤および凍結防止剤の両方を含む血漿枯渇ＵＣＢ混合物は、ＵＳ８０４８６１９に記載されている方法および当該技術分野で知られている他の方法で凍結および保存することができる。処理されたＵＣＢユニットは、典型的には、液体窒素（例えば、液相および／または気相）中において、約－１３５℃未満、好ましくは約－１５０℃未満で保存することができる。
【0031】
対象への注入または移植の前に、血漿枯渇ＵＣＢユニットは、本明細書に記載されるように解凍される。解凍されたユニットは、投与前に洗浄されるか、または洗浄されないかのいずれかである。好ましくは、解凍されたユニットは、洗浄されない。特定の例では、解凍された、洗浄されていないユニットは、直接注入によって患者に投与される。他の特定の例では、解凍された、洗浄されていないユニットは、ユニットが、例えば、ヒト血清アルブミンおよびＧｅｎｔｒａｎ（デキストラン）を含む等張液で希釈および／または再構成された後、注入によって患者に投与される。以下の実施例に示すように、解凍後に血漿枯渇ＵＣＢユニットを洗浄しないと、そのようなユニットを移植された患者の臨床転帰が改善される。実際、血小板生着の累積発生率ならびに好中球および血小板の生着の速度は両方とも、洗浄ユニットと比較して増加しており、解凍後の洗浄が実際に造血幹細胞の生着の累積発生率を遅延または減少させることを示す。さらに、解凍後に血漿枯渇ＵＣＢユニットを洗浄しないと、有核細胞のより良好な回復が提供され、それによって洗浄したユニットと比較して、投与される有核細胞（ＴＮＣ）の総投薬量が増加する。
【0032】
ヒト成人末梢血と比較して、ヒト臍帯血は、より豊富な造血原始細胞および多数の内皮原始細胞を含み、これらは、インビトロおよびインビボで強力な複製能力を有する。本明細書に開示されるように、凍結保存された血漿枯渇臍帯血製品のサンプルをアッセイして、Ｒ＆Ｄ Ｈｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １４ Ｐｌｅｘパネルを使用してサイトカインプロファイルを決定した。結果を、表１Ａに示す。表に示されているように、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０のレベルは、ＩＬ－１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインのレベルよりも大幅に高くなっている。ＥＧＦ、ＦＧＦ－塩基性、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＭ－ＣＳＦなどの比較的高いレベルの成長因子（ＧＦ）が、サイトカイン、ＩＬ－１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの成長因子と比較して観察された。ＰＤ ＣＢ製品における大量のＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１０は、発明者らが免疫恒常性を回復するだけでなく、脳卒中患者の損傷した脳神経系の修復を強化することも可能にする。
【表1】
【表2】
【0033】
さらに、臍帯血幹細胞は、増殖して、神経細胞に分化することがわかっており、いくつかの神経変性疾患の治療に効果的であった。脳卒中の場合、臍帯血単核細胞の静脈内注射は、運動能力を回復し、神経保護機能を有し得る。ヒト臍帯血単核細胞の移植後、炎症性因子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２など）のレベルが、抑制された。対照的に、炎症の阻害剤（ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β１など）のレベルが、増加した。その結果、ヒト臍帯血単核細胞の移植後、抗炎症プロセスは、神経細胞の保護効果を達成する。抗炎症効果があることに加えて、臍帯血単核細胞は、損傷した中枢神経系に自発的に移動し、一部は脾臓に移動し得る。したがって、臍帯血単核細胞は、リンパ球の生合成に関与し得、いくつかの研究は、リンパ球が急性脳卒中ラットの神経保護に関連していることが確認している。静脈内投与による急性虚血性脳卒中におけるヒト臍帯血単球（ＨＵＣＢＭ）の第Ｉ相臨床試験が、実施される。本開示は、ＨＵＣＢＭ療法の１２か月後に右片麻痺からほぼ完全に回復した最初の被験者を報告する。
【0034】
用途
本発明は、対象における心臓血管疾患、脳損傷、または神経変性障害を治療または改善するための組成物および方法を提供する。一実施形態において、対象は、脳内または脳の周りの血流の乱れを有する。好ましくは、損傷または障害は、脳虚血である。そのために、本明細書に記載のＵＣＢ細胞を含む治療用組成物は、ＢＢＢ透過剤とともに患者に全身投与される。ＢＢＢ透過剤は、治療用組成物の前に、その後に、またはそれと同時に対象に投与することができる。
本発明は、対象における心臓血管疾患、脳損傷、または神経変性障害を治療または改善するための組成物および方法を提供する。一実施形態において、対象は、脳内または脳の周りの血流の乱れを有する。好ましくは、損傷または障害は、脳虚血である。そのために、本明細書に記載のＵＣＢ細胞を含む治療用組成物は、ＢＢＢ透過剤とともに患者に全身投与される。ＢＢＢ透過剤は、治療用組成物の前に、その後に、またはそれと同時に対象に投与することができる。
【0035】
したがって、有効量のＵＣＢ細胞、および任意に有効量のＢＢＢ透過剤を含む治療用組成物が、本発明の範囲内にある。一実施形態において、ＵＣＢ細胞は、ヒト臍帯血から得られ、体積が減少した臍帯血サンプルを含む。さらなる実施形態において、細胞は、有効量の単核細胞を含む。一実施形態において、組成物は、個体への全身投与を目的としているが、他の投与方法が、企図されている。
【0036】
投与される単核細胞の数は、例えば、単回投与において、例えば、１投与あたり約１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１細胞、少なくとも１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１細胞、または１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１超の細胞であり得る。一実施形態において、単核細胞の有効量は、約１×１０７～１×１０９細胞であり、より好ましくは、約１×１０８～約１×１０９、例えば約２～５×１０８である。別の実施形態において、単核細胞の有効量は、０．０１～２×１０８細胞／ｋｇ、０．０２～１×１０８細胞／ｋｇ、および０．５～５×１０７細胞／ｋｇなどの約０．００１～２×１０８細胞／ｋｇである。
【0037】
本発明はまた、対象における心臓血管疾患、脳損傷、または神経変性障害を治療または改善するための方法も提供する。この方法は、有効量のＵＣＢ細胞および有効量のＢＢＢ透過剤を、状態または疾患を有する個人に投与することを含む。一実施形態において、ＵＣＢ細胞は、体積が低減した臍帯血サンプルを含む。さらなる実施形態において、細胞は、有効量の単核細胞を含む。一実施形態において、単核細胞は、ヒト臍帯血から得られた後に凍結することができ、対象に投与する前に解凍する。
【0038】
静脈内投与の場合、複数のＵＣＢ細胞は、例えば、約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、６０ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、または２００ｍＬ以下を、静脈内注入によって送達することができる。細胞は、任意の医学的に許容可能な期間、注入することができる。例えば、上記の細胞の数を、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０分以下の過程にわたって、投与する、例えば、静脈内または動脈内に注入することができる。
【0039】
ＵＣＢ細胞は、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の乱れを有する個人に、個人における個人の乱れに起因する１つ以上の症状または神経学的欠損、例えば、低酸素損傷または無酸素損傷が発現した後の任意の時点で投与され得る。例えば、ＵＣＢ細胞は、個人が示す最初の症状または神経学的欠損の発症の最初の２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日以内に投与され得る。好ましくは、細胞は、個人における最初の検出可能な症状または神経学的欠損の発症の最初の８、９、または１０日以内に投与される。治療は、未治療の個人における脳梗塞の体積と比較して、脳梗塞の体積の低減をもたらすと企図される。一実施形態において、体積は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％超低減する。
【0040】
上記の組成物および方法を使用して、獣医（非ヒト動物）患者を含む患者を治療して、細胞療法が適用可能な様々な病的状態の症状を緩和することができる。例えば、本発明の細胞は、脳虚血または脳梗塞などの神経学的障害または損傷；ハンチントン病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病などの神経変性疾患；外傷性脳損傷；脊髄損傷；てんかん；テイ・サックス病；リソソーム蓄積症；筋萎縮性側索硬化症；髄膜炎；多発性硬化症およびその他の脱髄性疾患；神経因性疼痛；トゥレット症候群；運動失調、アルコール依存症などの薬物添加；薬剤耐性；薬物依存；うつ；不安；ならびに統合失調症の症状を緩和するために患者に投与され得る。本発明の好ましい実施形態において、細胞は、脳卒中、脳虚血、または脳梗塞の症状を緩和するために投与される。
【0041】
特に、本発明は、患者における遺伝的欠陥、身体的損傷、環境障害、または脳卒中、心臓発作、もしくは心血管疾患による（多くの場合、虚血による）損傷の結果として生じる脳または脊髄の神経学的損傷を治療する方法に関するものである。この方法は、有効な数または量のＵＣＢ細胞を患者に投与することを含み、ＢＢＢ透過剤が患者に同時投与される。本発明の一態様では、ＵＣＢ細胞は、例えば、患者の脳または脊髄に移植され得るか、あるいは、動脈内または静脈内投与などであるがこれらに限定されない全身投与され得る。
【0042】
脳卒中の治療
本発明の組成物および方法は、脳卒中の治療に使用され得る。好ましくは、組成物および方法は、脳卒中の直後から脳卒中の約２８日後（例えば、約８、９、または１０日）まで利用される。１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、使用において、ｔ－ＰＡが制限される脳卒中から３時間後のウィンドウに限定されない。
本発明の組成物および方法は、脳卒中の治療に使用され得る。好ましくは、組成物および方法は、脳卒中の直後から脳卒中の約２８日後（例えば、約８、９、または１０日）まで利用される。１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、使用において、ｔ－ＰＡが制限される脳卒中から３時間後のウィンドウに限定されない。
【0043】
本明細書で提供される方法に従って治療可能な脳卒中は、任意の原因に起因する脳卒中であり得る。一実施形態において、脳卒中は、虚血性脳卒中であり得る。虚血性脳卒中は、血栓性脳卒中または塞栓性脳卒中であり得る。別の実施形態において、脳卒中は、全身性低灌流、すなわち、体のすべての部分への血流の減少に起因し得る、または静脈血栓症に起因するものである。他の実施形態において、虚血性脳卒中は、心臓の細動、例えば、心房細動；発作性心房細動；リウマチ性疾患；僧帽弁または大動脈弁疾患；人工心臓弁；心房または心房の心臓血栓；洞不全症候群；持続的な心房粗動；心筋梗塞；２８％未満の駆出率を伴う慢性心筋梗塞；３０％未満の駆出率を伴う症候性うっ血性心不全；心筋症；心内膜炎、例えば、リブマンサックス心内膜炎、衰弱性心内膜炎、もしくは感染性心内膜炎；乳頭状弾性線維腫；左心房粘液腫；冠状動脈バイパス移植手術；僧帽弁輪部石灰化症；卵円孔開存；心房中隔動脈瘤、血栓のない左心室動脈瘤、僧帽弁狭窄症もしくは心房細動のない心エコー検査での孤立した左心房脳卒中；および／または上行大動脈もしくは近位アーチの複雑なアテロームによって引き起こされる。
【0044】
別の実施形態において、脳卒中は、出血性脳卒中であり得る。出血性脳卒中は、軸内出血（脳内の血液の漏出）によって引き起こされ得る。出血性脳卒中は、軸外出血（頭蓋骨の内側であるが脳の外側の血液）によっても引き起こされ得る。さらに特定の実施形態において、脳卒中は、実質内出血、脳室内出血（心室系の血液）、硬膜下血腫（硬膜と頭蓋骨の間の出血）、硬膜下血腫（硬膜下腔の出血）、またはくも膜下出血（くも膜と軟膜の間）によって引き起こされ得る。ほとんどの出血性脳卒中症候群は、特定の症状（例えば、頭痛、以前の頭部損傷）を有する。他のより多くの実施形態において、出血性脳卒中は、高血圧、外傷、出血障害、アミロイド血管症、違法な薬物使用（例えば、アンフェタミンまたはコカイン）、または血管奇形によって引き起こされるか、またはそれらに関連し得る。
【0045】
本明細書で提供される治療方法は、脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の乱れ、または脳もしくはＣＮＳ内またはその周辺の血流の乱れに起因する神経学的欠損、例えば、脳卒中、例えば、低酸素性損傷または無酸素性損傷を引き起こす、１つ以上の症状の排除、検出可能な改善、重度の低下、または進行遅延をもたらす。特定の実施形態において、症状または神経学的欠損は、片麻痺（体の片側の麻痺）；片麻痺（体の片側の脱力感）；顔の筋力低下；しびれ；感覚の低下；嗅覚、味覚、聴覚、もしくは視覚の変化；嗅覚、味覚、聴覚、もしくは視力の喪失；眼瞼の下垂（眼瞼下垂症）；眼筋の弱化；咽頭反射の低下；飲み込む能力の低下；光に対する瞳孔反射の低下；顔の感覚の低下；バランスの低下；眼振；呼吸数の変化；心拍数の変化；胸鎖乳突筋の衰弱と、頭を片側に向ける能力の低下または能力の低下；舌の弱化；失語症（言語を話すまたは理解することができない）；失行症（随意運動の変化）；視野欠損；記憶障害；半側空間無視または半側空間無視（病変の反対側の視野側の空間への注意の欠如）；混乱した思考；錯乱；性欲過剰行為の発生；病態失認（障害の存在が絶えず認識できないこと）；歩行困難；運動協調の変化；めまい；不均衡；意識失調；頭痛；および／または嘔吐を含む。
【0046】
脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の乱れの重症度、例えば、脳卒中の重症度、または脳卒中の症状および／または脳卒中に起因する神経学的欠損の重症度は、１つ以上の広く容認されている神経機能スケールを使用して評価することができる。例えば、対象の神経機能は、修正ランキンスケール、ＮＩＨ脳卒中スケール、カナダ神経スケール（ＣＮＳ）、グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）、ヘンピスフェリック脳卒中スケール、Ｈｕｎｔ＆Ｈｅｓｓのスケール、マシュー脳卒中スケール、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、オルゴゴゾ脳卒中スケール、オクスフォードシャーコミュニティ脳卒中プロジェクト分類（Ｂａｍｆｏｒｄ）、スカンジナビア脳卒中スケール、日本式昏睡尺度（ＪＣＳ）、バーセルインデックス、および／または日本脳卒中スケール（ＪＳＳ）の１つ以上によって評価され得る。特定の実施形態において、改善は、初期評価後、およびＵＣＢ細胞の１回以上の投与後、１、２、３、４、５、もしくは６日以内、または１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、もしくは１２週間以内に検出可能である。
【0047】
本明細書に開示されるように、健康なドナーからの凍結保存された臍帯血単核細胞は、療法の成功を保証するためのより安定した品質を有する。例えば、以下の実施例に示されているのは、急性虚血性脳卒中を患った４５～８０歳の患者を対象とした第１相試験からの結果である。血漿枯渇で処理した臍帯血ユニットは、ＡＢＯ／Ｒｈの血液型適合度、ＨＬＡ６／６適合度、および総有核細胞（例えば、０．５～５×１０７細胞／ｋｇの間の範囲）に基づいたＳｔｅｍＣｙｔｅの公共の臍帯血バンクから選択された。この研究の主な目的には、１２か月のフォローアップ中の有害事象（ＡＥ）および重篤なＡＥ、ならびに輸血後１００日以内の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれた。二次的な目的には、ＮＩＨＳＳ、バーセル指数、およびバーグバランススケールの変更が含まれた。示された結果は、同一のＡＢＯ／Ｒｈ、ＨＬＡ適合度６／６、および使用可能な２．６３×１０８単核細胞を有する登録された４６歳の男性から示された結果を含んだ。１２か月の観察では、重篤なＡＥまたはＧＶＨＤは見出されなかった。患者のＮＩＨＳＳは、９から１ポイントに改善し、バーグバランススケールは、０から４８ポイントに改善し、バーセル指数は、０から９０ポイントに改善した。これらの結果は、同種異系の臍帯血を使用した後、１２か月以内に患者の片麻痺がほぼ完全に回復したことを示した。
【0048】
心臓病の治療
本発明の組成物および方法は、心臓病の治療にも使用され得る。好ましくは、この組成物および方法は、疾患の発症直後から利用される。
本発明の組成物および方法は、心臓病の治療にも使用され得る。好ましくは、この組成物および方法は、疾患の発症直後から利用される。
【0049】
本開示のいくつかの実施形態は、対象において心筋再生を促進するための方法に関する。この方法は、対象に、本明細書に開示されるように治療用組成物を投与または提供することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される対象における心臓病を治療するかまたは心筋再生を促進するための方法は、任意に、心臓病を有するまたはそれを有すると疑われるものとして対象を特定または選択するプロセスを含む。特定または選択するプロセスは、１つ以上の治療用組成物および治療薬または療法を投与する前に実施することができる。
【0050】
いくつかの実施形態において、心臓病は、心筋梗塞、虚血性心疾患、心不全（例えば、うっ血性心筋症）、虚血性心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、アルコール性心筋症、ウイルス性心筋症、頻脈媒介性心筋症、ストレス誘発性心筋症、アミロイド心筋症、不整脈誘発性右心室異形成、左心室非圧密、心内膜線維弾性症、大動脈狭窄症、大動脈弁逆流、僧帽弁狭窄症、僧帽弁逆流、僧帽弁逸脱症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁狭窄症、肺動脈弁逆流症、三尖性狭窄症、三尖弁逆流、先天性障害、遺伝性障害、またはこれらの組み合わせである。いくつかの特定の実施形態において、心臓病は、心筋梗塞である。いくつかの他の特定の実施形態において、心臓病は、心筋再生が必要とされる虚血性心疾患である。
【0051】
ＢＢＢ透過剤
本明細書で使用される場合、「血液脳関門透過剤」または「ＢＢＢ透過剤」という用語は、血液脳関門を破壊することができる物質である。一実施形態において、破壊は、一時的なものである。ＵＣＢ細胞とともに投与されるＢＢＢ透過剤の量は、ＢＢＢを破壊し、神経栄養性成長因子が増加した量で脳に入るのを可能にし、および／または細胞が脳に入るのを可能にするのに有効な量である。一実施形態において、ＢＢＢは、投与後０～１０日で測定されたときに、神経栄養因子または細胞の脳への侵入の増加を可能にする。
本明細書で使用される場合、「血液脳関門透過剤」または「ＢＢＢ透過剤」という用語は、血液脳関門を破壊することができる物質である。一実施形態において、破壊は、一時的なものである。ＵＣＢ細胞とともに投与されるＢＢＢ透過剤の量は、ＢＢＢを破壊し、神経栄養性成長因子が増加した量で脳に入るのを可能にし、および／または細胞が脳に入るのを可能にするのに有効な量である。一実施形態において、ＢＢＢは、投与後０～１０日で測定されたときに、神経栄養因子または細胞の脳への侵入の増加を可能にする。
【0052】
様々なＢＢＢ透過剤が、当該技術分野で知られている。ＢＢＢ透過剤は、マンニトール、セレポート、脂溶性小分子、グルコース、アミノ酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、コリン、およびプリン塩基ならびにヌクレオシドまたはそれらの誘導体からなる群から選択されるものであり得る。一実施形態において、ＢＢＢ透過剤は、マンニトールである。別の実施形態において、ＢＢＢ透過剤は、セレポートである。マンニトールは、約０．１Ｍ～約１０Ｍ、例えば、約０．５～５Ｍ、または約１．０Ｍ～２．０Ｍの濃度で投与され得る。一実施形態において、マンニトールの濃度は、約１．０７Ｍ（または２０％）である。セレポートは、約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ、例えば、約５～２０μｇ／ｋｇの濃度で投与され得る。一実施形態において、セレポートの濃度は、約９μｇ／ｋｇである。
【0053】
ＢＢＢ透過剤は、ＵＣＢ細胞とほぼ同時に対象に投与されることが企図されているが、ＢＢＢは、細胞とは別の組成物で投与され得る。ＢＢＢ透過剤は、細胞の投与の前、それと同時に、またはその後に投与され得ることが企図される。加えて、本発明の方法は、最初の投与から約１～７２時間後に、さらなる細胞の投与を伴ってまたは伴わずにＢＢＢ透過剤を個人に再投与すること、またはその後、脳卒中の結果に応じて毎日、毎週、毎月、または毎年投与することをさらに含み得ることが企図される。
【0054】
追加の治療薬
本明細書に記載される治療方法は、対象への１つ以上の第２の治療薬の投与をさらに含むことができる。そのような第２の治療薬は、ＵＣＢ細胞の投与前、細胞の投与中、または細胞の投与後に投与することができる。第２の治療薬は、細胞が投与されるより少なく、より多く、または同じ回数投与することができる。
本明細書に記載される治療方法は、対象への１つ以上の第２の治療薬の投与をさらに含むことができる。そのような第２の治療薬は、ＵＣＢ細胞の投与前、細胞の投与中、または細胞の投与後に投与することができる。第２の治療薬は、細胞が投与されるより少なく、より多く、または同じ回数投与することができる。
【0055】
第２の治療薬は、脳またはＣＮＳ内またはその周辺の血流の乱れを有する個人に治療上の利益をもたらす任意の薬剤であり得る。一実施形態において、治療薬は、脳卒中、低酸素損傷または無酸素損傷を治療するために使用される薬剤、例えば、薬物である。特定の実施形態において、第２の治療薬は、神経保護剤である。
【0056】
個人が出血性脳卒中を患う一実施形態において、第２の治療薬は、前記個人の血圧を低下させる治療薬であり得る。いくつかの実施形態において、第２の治療薬は、降圧薬、例えば、β遮断薬または利尿薬、利尿薬とカリウム保持性利尿薬の組み合わせ、β遮断薬と利尿薬の組み合わせ、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿薬、アンジオテンシンＩＩアンタゴニストと利尿薬、および／またはカリウムチャネル遮断薬とＡＣＥ阻害剤の組み合わせであり得る。別の実施形態において、第２の治療薬は、頭蓋内圧を低下させるために投与することができる。より具体的な実施形態において、第２の治療薬は、利尿薬であり得る。
【0057】
有用な追加の治療薬には、抗血小板療法、血栓溶解、一次血管形成術、ヘパリン、硫酸マグネシウム、インスリン、アスピリン、コレステロール低下薬、およびアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）も含まれるが、これらに限定されない。特に、ＡＣＥ阻害剤は、慢性心不全および高リスクの急性心筋梗塞を有する患者を治療するために使用される場合に明確な利点を有する。これは、おそらく、ＡＣＥ阻害剤が、アンジオテンシンＩＩによる炎症性サイトカインの生成を阻害するからである。追加の治療薬および療法の非限定的な列挙には、ＡＣＥ阻害剤、例えば、カプトプリル、エナラプリル、リジノプリル、もしくはキナプリル；アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、例えば、バルサルタン；β遮断薬、例えば、カルベジロール、メトプロロール、およびビソプロロール；血管拡張薬（一酸化窒素を介する）、例えば、ヒドララジン、硝酸イソソルビド、および一硝酸イソソルビド；スタチン、例えば、シンバスタチン、アトロバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、もしくはプラバスタチン；抗凝固薬、例えば、アスピリン、ワルファリン、もしくはヘパリン；または変力薬、例えば、ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、アムリノン、ニトロプルシド、ニトログリセリン、もしくはネシリチド；強心配糖体、例えば、ジゴキシン；抗不整脈薬、例えば、ベラパミルおよびジルチアゼムなどのカルシウムチャネル遮断薬、またはクラスＩＩＩ抗不整脈薬、例えば、アミオダロン、ソタロール、もしくはデフェチリド（ｄｅｆｅｔｉｌｉｄｅ）；利尿薬、例えば、フロセミド、ブメタニド、もしくはトルセミドなどのループ利尿薬、ヒドロクロロチアジドなどのチアジド利尿剤、スピノロラクトンもしくはエプレレノンなどのアルドステロンアンタゴニストが含まれる。あるいはまたはさらに、心臓病の他の処置、例えば、ペースメーカー、除細動器、カウンタパルセイションデバイス（大動脈内バルーンポンプまたは非侵襲性カウンタパルセイション）などの機械的循環補助、心肺補助装置、または左心室補助装置、手術、例えば、心臓移植、心肺移植、もしくは心臓腎移植、または免疫抑制剤、例えば、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオリン、シクロスポリン、シロリムス、タクロリムス、コルチコステロイド抗胸腺細胞グロブリン、例えば、サイモグロブリンもしくはＡＴＧＡＭ、ＯＫＴ３、ＩＬ－２受容体抗体、例えば、バシリキシマブまたはダクリズマブもまた、好適である。
【0058】
投与された細胞が治療される対象に対して自己移植ではない実施形態において、第２の治療薬は、免疫抑制剤であり得る。免疫抑制剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、抗Ｔ細胞受容体抗体（モノクローナルもしくはポリクローナル、またはその抗体断片もしくは誘導体、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、抗ＩＬ－２受容体抗体（例えば、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ）またはダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ）、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤などを含む。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、コルチコステロイド、またはマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１αもしくはＭＩＰ－１βに対する中和抗体であり得る。
【0059】
本明細書に開示される治療用組成物、薬学的製剤、および追加の治療薬または療法は、特定の意図された用途に適した最終的な薬学的調合剤に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、治療用組成物および追加の治療薬または療法は、単一の製剤で投与され得る。いくつかの実施形態において、治療用組成物および追加の治療薬または療法のそれぞれは、別個の製剤で投与される。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、治療用組成物および／または追加の治療薬もしくは療法は、単回用量で対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、治療用組成物および／または追加の治療薬もしくは療法は、複数の投薬量で対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、投薬量は、互いに等しい。いくつかの実施形態において、投薬量は、互いに異なる。いくつかの実施形態において、治療用組成物および／または追加の治療剤もしくは療法は、経時的に徐々に増加する投薬量で対象に投与される。いくつかの実施形態において、治療用組成物および／または追加の治療薬もしくは療法は、経時的に徐々に減少する投薬量で投与される。
【0060】
適合性
本発明の一態様において、ドナー細胞源の適合性は、ドナー細胞とレシピエントとの間のＨＬＡ視差を評価することによって実施することができる。ある特定の態様において、ドナー細胞の移植は、ドナー細胞移植片が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１の６つのＨＬＡ遺伝子座のうちの４つ以上で適合する場合にのみ行われる。
本発明の一態様において、ドナー細胞源の適合性は、ドナー細胞とレシピエントとの間のＨＬＡ視差を評価することによって実施することができる。ある特定の態様において、ドナー細胞の移植は、ドナー細胞移植片が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１の６つのＨＬＡ遺伝子座のうちの４つ以上で適合する場合にのみ行われる。
【0061】
本発明の他の実施形態において、細胞は、現在臨床的に行われている標準的なＨＬＡ適合度を使用して適合され得る。臍帯血に許容される適合度の度合いは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－ＤＲＢ１から選択された４／６遺伝子座であり得る。ＨＬＡ－ＡおよびＨＬＡ－Ｂは、標準的な２段階の補体依存性微小細胞毒性アッセイ、および世界保健機関（ＷＨＯ）のＨＬＡ命名委員会によって定義されたとおりに割り当てられた抗原を使用して分類され得る。ＨＬＡ－ＤＲＢ１タイプは、必要に応じてシークエンシングを行い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅されたＤＮＡと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＳＯＰ）のハイブリダイゼーションによって決定され得る。
【0062】
したがって、本発明の実施形態において、ＨＬＡ ４／６遺伝子座適合性および／または混合リンパ球反応適合性のいずれかと適切に適合されたレシピエントへの臍帯血またはその画分の投与が含まれる。
【0063】
以下の実施例は、いかなる洗浄ステップも実行することなく、本発明の血漿枯渇凍結保存された臍帯血ユニットの解凍および直接注入のための例示的なプロトコルを示す。洗浄することなく直接注入する方法では、洗浄ステップがないために細胞の損失が最小限に抑えられ、再構成のより長い操作を未然に防ぐ。ＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血製品を使用する移植センターから入手可能な臨床データは、ＤＭＳＯ、赤血球、および溶解ヘモグロビンの量が多く、患者によっては臨床的に重要な事象を引き起こし得るものの、洗浄後の注入製品と比較して優れた結果をもたらすことができることを示している。ＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血製品は、赤血球が減少していないため、他の銀行の臍帯血ユニットとは異なり、したがって、ＳｔｅｍＣｙｔｅのプロトコルに従って製品の正しい投与を確実にすることが重要である。
【0064】
製品は希釈されておらず、細胞毒性の高い１０％ＤＭＳＯにさらされているため、解凍から注入までの時間を最小限に抑える必要があり、したがって、解凍の開始から２０分以内に注入を完了させる必要がある。注入中、解凍された製品の粘度により、点滴重力式点滴がうまく機能しない場合がある。注入の有害な遅延を回避するために、大きな（６０ｃｃ以上）シリンジおよび広穿孔（ｗｉｄｅ ｂｏｒｅ）針による点滴プッシュが必要になる場合がある。
【0065】
ＡＢＯ／Ｒｈ不適合である可能性のある大量のＤＭＳＯおよび溶解・無傷の赤血球を含む任意の凍結保存された造血幹細胞製品の投与により予想され得る有害反応の可能性のため、治療／移植センターは、前投薬、患者のモニタリングおよび予想される有害反応のいずれかを治療するための介入に関する独自の内部プロトコルに従う必要がある。治療／移植センターは、ＡＢＯ／Ｒｈ適合検査、ＨＬＡ適合検査、生存率、ＣＢＣ、ＣＤ３４＋細胞の列挙、クローン形成能などを含むがこれに限らず、臍帯血製品の解凍後の検査について独自の内部プロトコルに従うべきである。しかしながら、使用されるプロトコルによっては、ＣＦＵアッセイは、より高い細胞密度を有するＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血ユニットの真の機能的能力を計数するために最適化されない場合がある。移植センターは、解凍後のＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血ユニットのＣＦＵ試験のプロトコルについてＳｔｅｍＣｙｔｅまたはＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに問い合わせることができる。
【0066】
添付されたセグメントは、ＨＬＡまたはＡＢＯ／Ｒｈタイプの同一性検査、ＣＦＵ、ＣＤ３４＋および／ＴＮＣ（総有核細胞）カウント、ならびに微生物検査の目的で使用され得る。サンプリングサイトカプラーは、サンプル検査のためにＣＢＵ凍結バッグまたは最終的な解凍／洗浄されたＣＢＵバッグのいずれかに挿入され得る。サンプリングのために除去された臍帯血の量は、移植施設の判断に委ねられている。臍帯血製品、空の輸液バッグ、および臍帯血製品に接触したすべての備品は、連邦、州、地方、および／または施設の要件に従って生物医学的廃棄物として処分すること。
【0067】
細胞注入後に有害反応が起こり得る。本明細書に記載された副作用のすべてが起こるとは限らないが、もし副作用が起こった場合には、すぐに患者の医師または看護師からの医学的な配慮が必要であり得る。
【0068】
軽度から中等度：
高頻度：吐き気、嘔吐、高血圧、低血圧、徐脈、血色素尿症、震え、スイートクリームコーンまたはニンニクの味（ＤＭＳＯの有効期限から）。
低頻度：頭痛、腹部けいれん、下痢、顔面紅潮、悪寒、発熱、顔面紅潮、胸部圧迫感、めまい、脳症、発作、徐脈、高ビリルビン血症、血清トランスアミナーゼレベルの上昇。
高頻度：吐き気、嘔吐、高血圧、低血圧、徐脈、血色素尿症、震え、スイートクリームコーンまたはニンニクの味（ＤＭＳＯの有効期限から）。
低頻度：頭痛、腹部けいれん、下痢、顔面紅潮、悪寒、発熱、顔面紅潮、胸部圧迫感、めまい、脳症、発作、徐脈、高ビリルビン血症、血清トランスアミナーゼレベルの上昇。
【0069】
重度から生命を脅かすまで：
極めて稀であり（１，４１０人の患者の最大の公表された研究では約０．４％）、通常は自己限定的である：
心臓－徐脈、心臓ブロック、不整脈、ショック、および心停止。
神経学的－脳症（おそらく、２ｇ ＤＭＳＯ／ｋｇレシピエント体重以上に関連し、血漿交換によって治療可能）、発作（おそらく、３．７×１０８有核細胞／ｍｌ以上の非常に高い細胞濃度に関連する；ＳｔｅｍＣｙｔｅの製品は、通常、この濃度の１０分の１である）。
肺－呼吸抑制。
免疫学－アナフィラキシー反応。
腎－高濃度の遊離ヘモグロビンによる急性腎不全（抗ヒスタミン薬およびコルチコステロイドによる前投薬、適切な水分補給、尿中アルカリ化、マンニトール利尿により軽減）。
極めて稀であり（１，４１０人の患者の最大の公表された研究では約０．４％）、通常は自己限定的である：
心臓－徐脈、心臓ブロック、不整脈、ショック、および心停止。
神経学的－脳症（おそらく、２ｇ ＤＭＳＯ／ｋｇレシピエント体重以上に関連し、血漿交換によって治療可能）、発作（おそらく、３．７×１０８有核細胞／ｍｌ以上の非常に高い細胞濃度に関連する；ＳｔｅｍＣｙｔｅの製品は、通常、この濃度の１０分の１である）。
肺－呼吸抑制。
免疫学－アナフィラキシー反応。
腎－高濃度の遊離ヘモグロビンによる急性腎不全（抗ヒスタミン薬およびコルチコステロイドによる前投薬、適切な水分補給、尿中アルカリ化、マンニトール利尿により軽減）。
【0070】
潜在的な副作用の原因は、次のとおりである：
ＤＭＳＯ毒性：
ヒトに対するＤＭＳＯの急性毒性用量は決定されていないが、ＤＭＳＯの静脈内投与で報告されているＬＤ５０値（試験動物の５０％を殺すのに必要なＤＭＳＯの量）は、マウスで３．１～９．２ｇ／ｋｇ、イヌで２．５／ｋｇ、サルで１１ｇ／ｋｇ超である（参照文献１０．１４）。ほとんどの公表された報告は、ＤＭＳＯの投与量を１ｇ／ｋｇレシピエント体重以下に押させている（参照文献１０．８）。典型的なＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットでは、ＤＭＳＯの最大投与量は、７．５（１バッグ）～１５．０ｇ（２バッグ）となるため、腎機能が低下した患者および小柄な患者（１バッグで７ｋｇ未満、２バッグの同時投与で１５．０ｋｇ未満）で、十分な細胞量の確保に問題がない場合は、製品の洗浄が強く推奨される。文献によると、１０％ＤＭＳＯ凍結保存幹細胞製品の推奨注入速度は、１分間に５～２０ｍｌとされており、当社では１分間に５～１０ｍｌの注入速度を推奨している。
ＤＭＳＯ毒性：
ヒトに対するＤＭＳＯの急性毒性用量は決定されていないが、ＤＭＳＯの静脈内投与で報告されているＬＤ５０値（試験動物の５０％を殺すのに必要なＤＭＳＯの量）は、マウスで３．１～９．２ｇ／ｋｇ、イヌで２．５／ｋｇ、サルで１１ｇ／ｋｇ超である（参照文献１０．１４）。ほとんどの公表された報告は、ＤＭＳＯの投与量を１ｇ／ｋｇレシピエント体重以下に押させている（参照文献１０．８）。典型的なＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットでは、ＤＭＳＯの最大投与量は、７．５（１バッグ）～１５．０ｇ（２バッグ）となるため、腎機能が低下した患者および小柄な患者（１バッグで７ｋｇ未満、２バッグの同時投与で１５．０ｋｇ未満）で、十分な細胞量の確保に問題がない場合は、製品の洗浄が強く推奨される。文献によると、１０％ＤＭＳＯ凍結保存幹細胞製品の推奨注入速度は、１分間に５～２０ｍｌとされており、当社では１分間に５～１０ｍｌの注入速度を推奨している。
【0071】
体積過剰：
輸血する最大量は、５～１５ｍｌ／ｋｇ／用量の範囲にすることを強く推奨する。
輸血する最大量は、５～１５ｍｌ／ｋｇ／用量の範囲にすることを強く推奨する。
【0072】
主なＡＢＯ式血液型不適合：
臍帯血移植において、患者とドナーのＡＢＯ式血液型不適合は問題として報告されていないが、主な血液型不適合の場合（例えば、患者が血液型Ｏであり、臍帯血はＯ型でない）、以下の追加情報が提供される。大量の主なＡＢＯ不適合赤血球の輸血が、抗Ａおよび／または抗Ｂの有意な力価を有する患者に輸血反応を引き起こすことが知られているが、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３３：４２７－４２９（１９８２））は、レシピエントの抗Ａおよび抗Ｂヘマグルチニン力価が１：１６以下であれば、ＡＢＯ不適合ＲＢＣのユニットすべてを安全に輸血され得ると述べている。Ｓａｕｅｒ－Ｈｅｉｌｂｏｒｎら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４４：９０７－９１６（２００４）は、ＡＢＯ不適合の末梢血幹細胞および骨髄ユニットの輸血の経験を説明し、ＢＭ成分（ＲＢＣ体積３００～４００ｍｌ）と比較してＰＢＳＣユニット（ＲＢＣ体積７５～１００ｍｌ）のリスクが低いと述べている。ＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットのＲＢＣの量は、約４０～１００ｍｌである（処理後）。この量のＲＢＣが深刻な副作用を引き起こすことは知られていないが、まれに、体温の上昇、脈拍の増加、および筋肉の痛みなどの症状が発生し得る。臍帯血サンプルの溶血のため、暗色または赤色の尿および血漿が予想される。
臍帯血移植において、患者とドナーのＡＢＯ式血液型不適合は問題として報告されていないが、主な血液型不適合の場合（例えば、患者が血液型Ｏであり、臍帯血はＯ型でない）、以下の追加情報が提供される。大量の主なＡＢＯ不適合赤血球の輸血が、抗Ａおよび／または抗Ｂの有意な力価を有する患者に輸血反応を引き起こすことが知られているが、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ３３：４２７－４２９（１９８２））は、レシピエントの抗Ａおよび抗Ｂヘマグルチニン力価が１：１６以下であれば、ＡＢＯ不適合ＲＢＣのユニットすべてを安全に輸血され得ると述べている。Ｓａｕｅｒ－Ｈｅｉｌｂｏｒｎら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４４：９０７－９１６（２００４）は、ＡＢＯ不適合の末梢血幹細胞および骨髄ユニットの輸血の経験を説明し、ＢＭ成分（ＲＢＣ体積３００～４００ｍｌ）と比較してＰＢＳＣユニット（ＲＢＣ体積７５～１００ｍｌ）のリスクが低いと述べている。ＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットのＲＢＣの量は、約４０～１００ｍｌである（処理後）。この量のＲＢＣが深刻な副作用を引き起こすことは知られていないが、まれに、体温の上昇、脈拍の増加、および筋肉の痛みなどの症状が発生し得る。臍帯血サンプルの溶血のため、暗色または赤色の尿および血漿が予想される。
【0073】
ＡＢＯ不適合のＲＢＣを含む幹細胞製品の注入に関する追加の公開された経験を以下に示す：Ｄｉｎｓｍｏｒｅら（Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８３；５４：４４１－４４９）は、それぞれ、６８ｍｌおよび４５ｍｌのＲＢＣを投与された２人の患者が、腎機能障害を伴わずに一過性血色素尿症を発症したと報告した。さらに７人の患者が微熱を発症し、１０人の追加の患者は副作用を経験しなかった。Ｗａｒｋｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．１９８５；４８：８９－１０は、最大２１ｍｌのＲＢＣを含む骨髄製品が、一部の患者で溶血の測定可能な証拠をもたらしたが、臨床的に重症であると判断された反応を示した患者はいなかったと報告した。Ｂｒａｉｎｅら（Ｂｌｏｏｄ １９８２；６０：４２０－４２５）は、最大３８ｍｌのＡＢＯ不適合ＲＢＣを含むユニットの輸血後の２５人の患者のうち１０人に症候性反応を報告した。症状には、一過性の発熱、高血圧、悪寒、血色素尿症、徐脈、および錯乱が含まれた。
【0074】
患者を注意深く監視しながら、注入速度を約５～１０ｍｌ／分にすることを推奨する。Ｓａｕｅｒ－Ｈｅｉｌｂｏｒｎら（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２００４；４４：９０７－９１６）は、患者に解熱剤および／または抗ヒスタミン剤を前投与し、十分に水分補給すべきであると推奨した。他の研究者らはまた、コルチコステロイドも前投与する。副作用は、通常、注入中に発生し、注入を停止すると解消する。しかしながら、一部の反応は、注入の完了後６～７時間で発生する可能性があるため、その期間中は患者を監視する必要がある。重大な副作用は、臍帯血バンクに報告する必要がある。
【0075】
一般的な前投薬レジメンには、十分な水分補給（特に主要なＡＢＯ不適合を伴う）、抗ヒスタミン薬（特に主要なＡＢＯ不適合を伴う）、コルチコステロイド、マンニトール、制吐薬、および解熱薬（特に主要なＡＢＯ不適合を伴う）が含まれる。有害事象に対する一般的な治療的介入には、利尿薬（体液量過剰）、抗けいれん薬（発作）、アトロピン（徐脈）、血漿交換（脳症（ｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ））、Ｏ２（肺うつ病）、および麻薬（ｎｎａｒｃｏｔｉｃ）が含まれる。
【0076】
定義
「臍帯血」または「ＵＣＢ」という用語は、本明細書では、新生児または胎児、最も好ましくは新生児から得られる血液を指し、好ましくは、臍帯または新生児の胎盤から得られる血液を指す。好ましくは、臍帯血は、ヒト新生児から単離される。単核細胞の供給源としての臍帯血の使用は、それが比較的容易に、かつドナーへの外傷なしに得ることができるため有利である。対照的に、ドナーからの骨髄細胞の収集は、外傷的経験である。臍帯血細胞は、必要に応じて、自家移植または同種移植に使用され得る。臍帯血は、好ましくは、臍帯からの直接排液および／または娩出された胎盤の根および膨張した静脈からの針吸引によって得られる。本明細書で使用される場合、「臍帯血細胞」という用語は、臍帯血内に存在する細胞を指す。一実施形態において、臍帯血細胞は、当業者に知られている方法を使用して、臍帯血からさらに単離される単核細胞である。さらなる実施形態において、臍帯血細胞は、患者に投与する前に、さらに拡大および／または分化され得る。
「臍帯血」または「ＵＣＢ」という用語は、本明細書では、新生児または胎児、最も好ましくは新生児から得られる血液を指し、好ましくは、臍帯または新生児の胎盤から得られる血液を指す。好ましくは、臍帯血は、ヒト新生児から単離される。単核細胞の供給源としての臍帯血の使用は、それが比較的容易に、かつドナーへの外傷なしに得ることができるため有利である。対照的に、ドナーからの骨髄細胞の収集は、外傷的経験である。臍帯血細胞は、必要に応じて、自家移植または同種移植に使用され得る。臍帯血は、好ましくは、臍帯からの直接排液および／または娩出された胎盤の根および膨張した静脈からの針吸引によって得られる。本明細書で使用される場合、「臍帯血細胞」という用語は、臍帯血内に存在する細胞を指す。一実施形態において、臍帯血細胞は、当業者に知られている方法を使用して、臍帯血からさらに単離される単核細胞である。さらなる実施形態において、臍帯血細胞は、患者に投与する前に、さらに拡大および／または分化され得る。
【0077】
本明細書で使用される「臍帯血ユニット」および「ＵＣＢユニット」という用語は、単一のドナーから収集される臍帯血の体積を指す。本発明のＵＣＢ組成物は、典型的に、１つのＵＣＢユニットを含むが、複数のＵＣＢユニット、例えば、細胞投薬量をさらに増加させるために患者に投与することができる二重臍帯血ユニットも含み得る。
【0078】
「臍帯血幹細胞」という用語は、出産時に収集されたヒト臍帯血および／またはヒト胎盤血に由来する、造血幹細胞に富む、または造血幹細胞および前駆細胞に富む集団を指す。造血幹細胞、または造血幹細胞と前駆細胞は、他のタイプの造血細胞と比較して、造血幹細胞または造血幹細胞と前駆細胞で増加したレベルで発現される特定のマーカーに対して陽性であり得る。例えば、そのようなマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ ＤＲ、またはそれらの組み合わせであり得る。さらに、造血幹細胞、または造血幹細胞と前駆細胞は、他のタイプの造血細胞と比較して、発現されたマーカーに対して陰性であり得る。例えば、そのようなマーカーは、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態において、造血幹細胞、または造血幹細胞および前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【0079】
「幹細胞」という用語は、無期限に分裂し、特殊な細胞を生じさせる能力を有する任意の細胞を指す。幹細胞は、すべての胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）から発出する。幹細胞の典型的な供給源には、胚、骨髄、末梢血、臍帯血、胎盤血、および脂肪組織が含まれる。幹細胞は、万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）であり、これは、それらが生物体のほとんどの組織を生成し得ることを意味する。例えば、万能性幹細胞は、皮膚、肝臓、血液、筋肉、骨などの細胞を生み出すことができる。対照的に、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または成体幹細胞は、通常、限られた種類の細胞を生み出す。例えば、造血幹細胞は、通常、リンパ系、骨髄系、および赤芽球系の細胞を生み出す。生存細胞は、生きており、しばしば、増殖および分裂が可能である細胞である。当業者は、例えば、トリパンブルー色素を排出する能力によって、生物の生存能力を判定するための方法を承知している。本明細書で使用される幹細胞という用語は、特に断りのない限り、前駆細胞を含む。
【0080】
「有核細胞」とは、核を有する細胞、すなわち染色体ＤＮＡを含む細胞小器官を指す。有核細胞には、例えば、白血球および幹細胞が含まれる。「無核細胞」には、例えば、成体赤血球が含まれる。
【0081】
本明細書で使用される場合、「血漿が実質的に枯渇している」および「血漿が枯渇している」という用語は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える血漿の体積が取り除かれた本発明の臍帯血組成を指す。好ましい実施形態において、血漿は、臍帯血－抗凝固剤混合物を遠心分離し、血漿画分から細胞画分を分離することによって実質的に枯渇させる。実質的な枯渇後に残っている血漿の体積は、典型的には、約０体積％から約３０体積％、好ましくは約１０体積％から約３０体積％である。
【0082】
本明細書で使用される「非赤血球枯渇」および「赤血球が枯渇していない」という用語は、赤血球の体積の約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満が取り除かれた、臍帯血組成を指す。本明細書で使用される場合、「赤血球が実質的に枯渇している」および「赤血球が枯渇している」という用語は、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を超える赤血球の体積が取り除かれた処理された臍帯血ユニットを指す。本発明は、臍帯血ユニットから赤血球を除去するステップを含まないが、当業者は、血漿ユニットを枯渇させるステップおよび／または任意の他の処理ステップが、少容量の赤血球を除去し得ることを理解するであろう。
【0083】
本明細書で使用される場合、「凍結防止剤」という用語は、凍結された時の細胞の生存能力を強化するために使用される薬剤を指す。凍結防止剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ホルムアミド、およびヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、デキストラン（例えば、Ｇｅｎｔｒａｎ ４０）などの低分子量多糖を、凍結防止剤混合物に添加する。好ましい実施形態において、凍結防止剤溶液は、例えば、５０％ＤＭＳＯ対５％Ｇｅｎｔｒａｎ ４０などのＤＭＳＯ対Ｇｅｎｔｒａｎ ４０を約１０：１の比（体積／体積）で含み、これを、臍帯血および抗凝固剤混合物に添加して、約５％～約１０％のＤＭＳＯの最終濃度を得る。
【0084】
細胞に関して本明細書で交換可能に使用される「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」および「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」という用語は、分裂による同じタイプの細胞の数の増加を指す。「分化」という用語は、細胞が特定の機能に特化するようになる発達過程を指し、例えば、細胞は、最初の細胞型のものとは異なる１つ以上の形態学的特徴および／または機能を獲得する。臍帯血幹細胞増殖の方法は当該技術分野で知られている。このような増殖技術には、米国特許第７，３９９，６３３号、ＷＯ／２０１３／０８６４３６、ＷＯ／２０１３／１７９６３３、米国特許出願第２０１８／０３５３５４１号、Ｄｅｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６（２）：２３２－２３６、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｏｄ １１１：３４１５－３４２３、およびＨｉｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１６，４７５－４８２に記載されているものが含まれる。
【0085】
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する病態、または障害に対する素因を、治癒する、軽減する、緩和する、治療する、その発症を遅延する、予防する、または改善する目的での、障害を有する、または障害を発症するリスクがある対象への化合物または薬剤の投与を指す。「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、障害または状態を発症していないが、発症するリスクがあるかまたは発症しやすい対象において障害または状態を発症する可能性を低減することを指す。「改善する」とは、一般に、疾患または障害の徴候または症状の数または重症度の低下を指す。
【0086】
「予防的治療」は、状態の兆候または症状を示さない対象に施される治療を含み、その状態の発症のリスクを減少、予防、または減少させる目的で治療が施される。「治療的治療」は、状態の症状または徴候を示す対象に投与される治療を含み、状態の重症度または進行を軽減する目的で対象に投与される。治療的治療はまた、状態を部分的または完全に解決することができる。
【0087】
薬剤、例えば細胞の「有効量」は、所望の効果、例えば、疾患または疾患に関連する症状の予防または治療を生じさせるのに十分な量である。治療上有効な量の細胞は、個人の年齢および／またはサイズ、ならびに虚血領域のおおよその体積に応じて異なり得る。虚血領域のおおよその体積および位置は、例えば、連続磁気共鳴画像画像またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンによって推定することができる。
【0088】
本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、任意の好適な経路による本発明の組成物の送達を指す。本発明の細胞は、非経口（静脈内および動脈内ならびに他の好適な非経口経路を指すような用語）、冠動脈内、心筋内、髄腔内、脳室内、実質内（脊髄、脳幹、または運動皮質を含む）、嚢内、頭蓋内、線条体内、黒質内、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、または経粘膜投与を含むが、これらに限定されない、いくつかの経路で投与することができ、とりわけ、この用語は、本発明の細胞が必要な最終的な部位に移動することが可能である。好ましくは、患者には、本発明の方法に従って調製された１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の臍帯血ユニットが注入される。二重臍帯血ユニットなどの複数のユニットを、患者に、同時にまたは連続して（例えば、数分間、数時間、または数日間にわたる過程にわたって）投与することができる。
【0089】
投与は、しばしば治療される疾患または状態に依存し、好ましくは、非経口経路を介して、例えば、静脈内に、脳脊髄液に投与することによって、または脳の罹患組織に直接投与することによって行うことができる。脳卒中の場合、好ましい投与経路は、脳卒中の場所に依存するが、罹患組織（ＭＲＩまたは他の画像診断技術を使用して容易に決定され得る）への直接投与であり得るか、または全身投与され得る。本発明の好ましい実施形態において、個々の脳卒中後を治療するための投与経路は、静脈内または動脈内投与を介した全身投与である。
【0090】
本発明の細胞は、無傷の臍帯血またはその画分（このような用語は、高濃度の幹細胞または前駆細胞を含む、その単核画分または単核細胞の画分を含む）の形態で投与することができる。本発明による組成物は、動員剤または分化剤による処理なし（「未処理」、すなわち、臍帯血サンプル内の細胞の分化を促進するためのさらなる処理なし）あるいはニューロンおよび／またはグリアの表現型などの分化した表現型を示す細胞に分化させるために臍帯血サンプル内のある特定の幹および／または前駆細胞を生じさせる分化剤または他の薬剤を用いた処理後（「処理済み」）に使用することができる。
【0091】
「移植する（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」および「移植する（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」および「移植片（ｇｒａｆｔ）」および「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、患者の中枢神経系への損傷の修復（損傷によって引き起こされる認知または行動の欠陥を減らすことができる）、神経変性疾患の治療、または脳卒中、心臓血管疾患、心臓発作もしくは身体的傷害もしくは外傷もしくは遺伝的障害、または脳および／もしくは脊髄に対する環境的傷害によって引き起こされる神経障害の効果の治療など、細胞が好ましい効果を発揮することが意図されている部位に細胞が送達されるプロセスを説明するために使用される。細胞はまた、移植を達成するために、適切な領域への細胞の移動に依存して、上記のような任意の投与様式によって、体の遠隔領域に送達することもできる。好ましくは、細胞は、血液脳関門透過剤で投与することができる。
【0092】
「神経変性疾患」という用語は、中枢神経系への損傷によって引き起こされ、本明細書に記載の細胞の投与によって損傷を軽減および／または緩和することができる疾患を説明するために本明細書で使用される。例示的な神経変性疾患には、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側方硬化症、アルツハイマー病、レット症候群、リソソーム蓄積症（例えば、Ｆｏｌｋｅｒｔｈ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９９，５８：９によって記載される、「白質病」またはグリア／脱髄疾患）、例えば、サンフィリポ病、ゴーシェ病、テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損症）、他の遺伝病、多発性硬化症、虚血、事故、環境傷害などによって引き起こされる脳の損傷および／または外傷、脊髄損傷、失調症、ならびにアルコール症が含まれる。加えて、本発明は、患者における脳卒中または心臓発作の中枢神経系に対する影響、そうでなければ、当該患者の脳内の部位への血流の欠如または虚血によって引き起こされるか、あるいは、脳および／または脊髄への身体的傷害によって起きる影響を軽減および／または解消するために使用され得る。神経変性疾患はまた、例えば、自閉症、および統合失調症のような関連する神経疾患を含む神経発達疾患も含む。
【0093】
「治療用組成物」または薬学的組成物」という用語は、組成物をインビボまたはエクスビボでの診断または治療用途に特に適したものにする、活性薬剤と不活性または活性な担体との組み合わせを指す。
【0094】
本明細書で使用される場合、「治療用細胞」は、患者の状態、疾患、および／または損傷を改善する細胞集団を指す。治療用細胞は、自家（すなわち、患者に由来する）、同種異系（すなわち、患者とは異なる同じ種の個人に由来する）、または異種（すなわち、患者とは異なる種に由来する）であり得る。治療用細胞は、同種（すなわち、単一の細胞型からなる）または異種（すなわち、複数の細胞型からなる）であり得る。「治療用細胞」という用語は、治療的に活性な細胞と、治療的に活性な細胞に分化することができる前駆細胞の両方を含む。
【0095】
「薬学的に許容される」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適した、これらの化合物、材料、組成物および／または剤形を指すように、本明細書で使用される。「薬学的に許容される担体」は、対象に投与された後、または対象において、望ましくない生理学的効果を引き起こさない。薬学的組成物中の担体は、活性成分に適合性があり、それを安定化させることができるという意味においても「許容」されなければならない。１つ以上の可溶化剤を、活性化合物の送達のための薬学的担体として利用することができる。薬学的に許容される担体の例として、限定されないが、剤形として使用可能な組成物を得るための生体適合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられる。他の担体の例として、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【0096】
「対象」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を含む。治療の好ましい対象はヒトである。本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、対象が何らかの形態の治療を受けてきているかまたは現在受けているかに関係なく、交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「対象（複数可）」という用語は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むが、これらに限定されない任意の脊椎動物を指し得る。一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験的な非ヒト動物または疾患モデルとして好適な動物である。
【0097】
「患者」という用語は、本発明による細胞を用いて予防的治療を含む治療が実施される動物、好ましくはヒトを説明するために本明細書で使用される。「ドナー」という用語は、患者に使用するために臍帯血または臍帯血細胞を提供する個体（ヒトを含む動物）を説明するために使用される。
【0098】
本明細書で使用される場合、「心筋症」という用語は、当該技術分野で使用される従来の意味を有する。つまり、一般的に、何らかの理由による、心筋（心臓の筋肉）の機能が低下する。「虚血性心筋症」とは、心筋への不十分な酸素供給に起因する心臓の筋肉の衰弱を指し、一般に、その血液供給の欠如または相対的な不足に起因する。
【0099】
本明細書で使用される場合、「心筋」という用語は、当該技術分野で使用される従来の意味を有する。つまり、一般的に、心臓の筋肉である。対象の心筋への細胞を含む組成物の直接投与は、本発明によって想定され、これは、組成物が、いかなる介在組織（例えば、冠状血管）も横断することなく、投与装置（特に想定される注射カテーテル）から心筋組織に移されることを意味する。「心筋内注射」は、注射による対象の心筋への直接投与を指す。
【0100】
本明細書に開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。文脈上明確に別段の指示のない限り、下限のユニットの１０分の１までの、その範囲の上限と下限との間にある各介在値もまた具体的に開示されることを理解されたい。任意の記載される値または記載される範囲内の介在値と、その記載される範囲内の任意の他の記載される値または介在値との間の各小さい範囲は、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、その範囲に独立して含まれてもまたは除外されてもよく、記載される範囲内に任意の具体的に除外される限界があることを条件として、より小さい範囲にいずれか一方もしくは両方の限界が含まれるか、またはどちらも含まれていない各範囲も本発明に包含される。記載される範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【0101】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容範囲内を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に一部依存する。例えば、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、なおもより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。特に記載されない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。
【実施例】
【0102】
実施例１
この実施例は、いかなる洗浄ステップも実行することなく、本発明の血漿枯渇凍結保存された臍帯血ユニットの解凍および直接注入のためのプロトコルを示す。この実施例および実施例２～３では、ＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血製品が使用されている。
この実施例は、いかなる洗浄ステップも実行することなく、本発明の血漿枯渇凍結保存された臍帯血ユニットの解凍および直接注入のためのプロトコルを示す。この実施例および実施例２～３では、ＳｔｅｍＣｙｔｅの臍帯血製品が使用されている。
【0103】
サンプル／標本
ＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットは、ＤＭＳＯで凍結保存され、－１５０℃未満で保存される。
ＳｔｅｍＣｙｔｅ臍帯血ユニットは、ＤＭＳＯで凍結保存され、－１５０℃未満で保存される。
【0104】
試薬／機器／供給品
●３７℃±２℃の水浴
●止血鉗子またはクランプ
●滅菌水
●水浴内の３７℃の温度を測定するために使用される較正済み温度計
●大きなビニール袋、好ましくは滅菌して密封可能。（例えば、ＺＩＰＬＯＣ）
●液体窒素貯蔵容器
●アルコールワイプス
●複数の６０ｃｃ滅菌シリンジ
●滅菌広穿孔針（１６または１８ゲージ）
●０．９％ＮａＣｌ注射液５００ｍｌ中の１０％Ｇｅｎｔｒａｎ ４０
●５０ｍｌの緩衝希釈液中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２５％１２．５ｇアルブミン５０ｍｌ。
●３７℃±２℃の水浴
●止血鉗子またはクランプ
●滅菌水
●水浴内の３７℃の温度を測定するために使用される較正済み温度計
●大きなビニール袋、好ましくは滅菌して密封可能。（例えば、ＺＩＰＬＯＣ）
●液体窒素貯蔵容器
●アルコールワイプス
●複数の６０ｃｃ滅菌シリンジ
●滅菌広穿孔針（１６または１８ゲージ）
●０．９％ＮａＣｌ注射液５００ｍｌ中の１０％Ｇｅｎｔｒａｎ ４０
●５０ｍｌの緩衝希釈液中のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２５％１２．５ｇアルブミン５０ｍｌ。
【0105】
較正／品質管理
解凍手順は、検証されており、無菌性、実行可能性、およびＴＮＣの最小損失を維持することが示されている。
解凍手順は、検証されており、無菌性、実行可能性、およびＴＮＣの最小損失を維持することが示されている。
【0106】
手順
【表3】
【表4】
【表5】
【表6】
【0107】
凍結保存された血漿枯渇臍帯血製品のサンプルをアッセイして、Ｒ＆Ｄ Ｈｕｍａｎ ＸＬ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １４ Ｐｌｅｘパネルを使用してサイトカインプロファイルを決定した。結果を、上記の表１Ａに示す。結果は、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０のレベルは、ＩＬ－１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインのレベルよりも大幅に高くなっていることを示した。加えて、ＥＧＦ、ＦＧＦ－塩基性、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、およびＧＭ－ＣＳＦである比較的高いレベルのＧＦが、サイトカイン、ＩＬ－１－β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αのＧＦと比較して観察された。したがって、大量のＥＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、およびＩＬ－１０が、ＰＤ ＣＢ製品に検出されたため、ＰＤ ＣＢ製品の注入は、免疫恒常性を回復するだけでなく、急性脳卒中患者の脳の修復を促進し得る。
【0108】
実施例２
この実施例は、急性虚血性脳卒中の成人に対する同種異系ＰＤ－ＵＣＢ注入に関連する第１相臨床試験の設計およびプロトコルを示す。これは、ｔ－ＰＡ療法なしで急性脳卒中を持続する４５～８０歳の患者における多施設共同研究である。下記の試験対象患者基準および除外基準に従って、合計６人の被験者が登録される。被験者には、一連のベースライン神経学的評価、血液検査、およびＭＲＩが施される。臍帯血ユニットは、０．５～５ｘ１０７の全有核細胞／ｋｇの範囲を標的とする、ＡＢＯ／Ｒｈの血液型適合度、ＨＬＡ適合度、および細胞用量に基づいた公共の臍帯血バンクから選択される。
この実施例は、急性虚血性脳卒中の成人に対する同種異系ＰＤ－ＵＣＢ注入に関連する第１相臨床試験の設計およびプロトコルを示す。これは、ｔ－ＰＡ療法なしで急性脳卒中を持続する４５～８０歳の患者における多施設共同研究である。下記の試験対象患者基準および除外基準に従って、合計６人の被験者が登録される。被験者には、一連のベースライン神経学的評価、血液検査、およびＭＲＩが施される。臍帯血ユニットは、０．５～５ｘ１０７の全有核細胞／ｋｇの範囲を標的とする、ＡＢＯ／Ｒｈの血液型適合度、ＨＬＡ適合度、および細胞用量に基づいた公共の臍帯血バンクから選択される。
【0109】
ＳｔｅｍＣｙｔｅ Ｔａｉｗａｎの血漿が枯渇した処理済み臍帯血は、脳卒中後３～１０日の間に単回注入として静脈内投与される。被験者は、注入後６時間監視され、２４時間後にフォローアップされる。その後のフォローアップ電話は、脳卒中後のリハビリテーションおよび機能に関する電話調査を含め、１、６、および１２か月に発生する。９０日間のフォローアップクリニック訪問には、神経学的検査、ＭＲＩ、および血液検査が含まれる。
【0110】
臍帯血ユニットの選択
移植センターからのＨＬＡ適合検査を含む被験者の情報を受け取り次第、検索を行う。それに応じて、急性脳卒中臨床試験の要約検索レポートが作成され、以下の基準を満たす候補ＣＢユニットが含まれる：（１）低解像度ＨＬＡ適合検査で被験者と少なくとも４／６の適合度、（２）被験者とドナーとの間の同一のＡＢＯ／Ｒｈの血液型、および（３）総細胞（ＴＮＣ）の単核数が２～５×１０８である。
移植センターからのＨＬＡ適合検査を含む被験者の情報を受け取り次第、検索を行う。それに応じて、急性脳卒中臨床試験の要約検索レポートが作成され、以下の基準を満たす候補ＣＢユニットが含まれる：（１）低解像度ＨＬＡ適合検査で被験者と少なくとも４／６の適合度、（２）被験者とドナーとの間の同一のＡＢＯ／Ｒｈの血液型、および（３）総細胞（ＴＮＣ）の単核数が２～５×１０８である。
【0111】
ＵＣＢユニット
ＰＤ－ＵＣＢユニットは、Ｓｔｅｍｃｙｔｅから入手した。ユニットは、ＨＩＶ－１／２、ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢｃ、ＣＭＶ ＩｇＭ＋ＩｇＧ、ｓｙｐｈｉｌｉｓ ＲＰＲ、ＨＢＳＡｇ、およびＷＮＶについてスクリーニングされ、陰性であることが試験された。必要に応じて、ＵＣＢ細胞を、被験者のＡＢＯ／ＲｈまたはＨＬＡに適合するように選択された。被験者に同種異系ＵＣＢを投与するために、単回静脈内注入が使用された。投与後、被験者に、８±２時間の間隔をおいて、２０％マンニトール２００ｍｌを３０±１０分間２回静脈内投与した。あるいは、被験者に、２０％マンニトール１００ｍｌ／６０分を４時間ごとに静脈内投与した。どちらも血液脳関門を透過性にするのに効果的であった。
ＰＤ－ＵＣＢユニットは、Ｓｔｅｍｃｙｔｅから入手した。ユニットは、ＨＩＶ－１／２、ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢｃ、ＣＭＶ ＩｇＭ＋ＩｇＧ、ｓｙｐｈｉｌｉｓ ＲＰＲ、ＨＢＳＡｇ、およびＷＮＶについてスクリーニングされ、陰性であることが試験された。必要に応じて、ＵＣＢ細胞を、被験者のＡＢＯ／ＲｈまたはＨＬＡに適合するように選択された。被験者に同種異系ＵＣＢを投与するために、単回静脈内注入が使用された。投与後、被験者に、８±２時間の間隔をおいて、２０％マンニトール２００ｍｌを３０±１０分間２回静脈内投与した。あるいは、被験者に、２０％マンニトール１００ｍｌ／６０分を４時間ごとに静脈内投与した。どちらも血液脳関門を透過性にするのに効果的であった。
【0112】
対象
虚血性脳卒中の成人に対するＵＣＢ注入のこの研究は、それぞれが虚血性脳卒中を経験した６人の成人への単一の同種異系ＵＣＢの静脈内注入の安全性および実現可能性を研究する多施設の第Ｉ相探索的臨床試験であった。この研究は、Ｈｕａｌｉｅｎ Ｔｚｕ Ｃｈｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｕｄｄｈｉｓｔ Ｔｚｕ Ｃｈｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｔａｉｗａｎ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）で実施された。この研究は、各臨床施設の地域の施設内治験審査委員会によって承認された。
虚血性脳卒中の成人に対するＵＣＢ注入のこの研究は、それぞれが虚血性脳卒中を経験した６人の成人への単一の同種異系ＵＣＢの静脈内注入の安全性および実現可能性を研究する多施設の第Ｉ相探索的臨床試験であった。この研究は、Ｈｕａｌｉｅｎ Ｔｚｕ Ｃｈｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｕｄｄｈｉｓｔ Ｔｚｕ Ｃｈｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｔａｉｗａｎ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）で実施された。この研究は、各臨床施設の地域の施設内治験審査委員会によって承認された。
【表7】
【表8】
【0113】
試験期間および進捗状況
試験の各被験者は、試験の開始時から終了までの合計１２か月間追跡される。
試験の各被験者は、試験の開始時から終了までの合計１２か月間追跡される。
【0114】
研究デザインおよび手順
細胞の準備および操作：
一度解凍すると、臍帯血細胞の活性が低下し始めるので、臍帯血の解凍プロセスは、病院の現場で実行する必要がある。液体または血液製品を加温するために医療施設で使用される液体加温器を使用して、細胞を解凍することができる。
細胞の準備および操作：
一度解凍すると、臍帯血細胞の活性が低下し始めるので、臍帯血の解凍プロセスは、病院の現場で実行する必要がある。液体または血液製品を加温するために医療施設で使用される液体加温器を使用して、細胞を解凍することができる。
【0115】
臨床手順
この研究は、個別の方法で実施される第Ｉ相研究である。この研究には、６人の被験者が入院している。四肢片麻痺を示す被験者の場合、脳卒中の発症後９日目にＵＣＢを投与した。被験者に同種異系ＵＣＢ（ＭＮＣ ２～５×１０８を含有する）を投与するために、単回静脈内注入が使用される。投与後、被験者に、８±２時間の間隔をおいて、２０％マンニトール２００ｍｌを３０±１０分間２回静脈内投与する。あるいは、被験者に、２０％マンニトール１００ｍｌ／６０分を４時間ごとに静脈内投与する。
この研究は、個別の方法で実施される第Ｉ相研究である。この研究には、６人の被験者が入院している。四肢片麻痺を示す被験者の場合、脳卒中の発症後９日目にＵＣＢを投与した。被験者に同種異系ＵＣＢ（ＭＮＣ ２～５×１０８を含有する）を投与するために、単回静脈内注入が使用される。投与後、被験者に、８±２時間の間隔をおいて、２０％マンニトール２００ｍｌを３０±１０分間２回静脈内投与する。あるいは、被験者に、２０％マンニトール１００ｍｌ／６０分を４時間ごとに静脈内投与する。
【0116】
以下は、試験および定期検査に参加するための手順である。
１．基本的な情報、健康上の病気の病歴、および投薬の病歴（研究への入院の３か月前までさかのぼる）。
２．バイタルサインの測定。
３．身体検査。
４．以下のための血液検査：
１）組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＡＢＣ複数抗原、組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＤＲ複数抗原、およびＡＢＯ血液型検査（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ血液型判定、ＲＨ（Ｄ）。
２）ＣＢＣ－Ｉ（ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｃｔ、血小板数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）およびＷＢＣ白血球百分率。
３）ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、プロトロンビン時間、ならびにプロトロンビン時間および国際標準化比（ＩＮＲ）。
４）Ｎａ＋（ナトリウム）、Ｋ＋（カリウム）、およびＣｌ＋（塩化物）濃度、血糖値（ａｃまたはｐｃ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｓ－ＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｂ）ＣＲＴＮを含む、血液生化学的検査。
５）赤血球沈降速度（Ｅ．Ｓ．Ｒ）、Ｃ．Ｒ．Ｐ（Ｃ反応性タンパク質）－ネフェロメトリー。
６）ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αを含むサイトカイン。
５．グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）。
６．心電図（ＥＫＧ）。
７．胸部Ｘ線。
８．脳ＭＲＩ。
９．腹部超音波検査。
１０．ＮＩＨＳＳ、バーグバランススケール（ＢＢＳ）、およびバーセル指数（ＢＩ）。
１．基本的な情報、健康上の病気の病歴、および投薬の病歴（研究への入院の３か月前までさかのぼる）。
２．バイタルサインの測定。
３．身体検査。
４．以下のための血液検査：
１）組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＡＢＣ複数抗原、組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＤＲ複数抗原、およびＡＢＯ血液型検査（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ血液型判定、ＲＨ（Ｄ）。
２）ＣＢＣ－Ｉ（ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｃｔ、血小板数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）およびＷＢＣ白血球百分率。
３）ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、プロトロンビン時間、ならびにプロトロンビン時間および国際標準化比（ＩＮＲ）。
４）Ｎａ＋（ナトリウム）、Ｋ＋（カリウム）、およびＣｌ＋（塩化物）濃度、血糖値（ａｃまたはｐｃ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｓ－ＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｂ）ＣＲＴＮを含む、血液生化学的検査。
５）赤血球沈降速度（Ｅ．Ｓ．Ｒ）、Ｃ．Ｒ．Ｐ（Ｃ反応性タンパク質）－ネフェロメトリー。
６）ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αを含むサイトカイン。
５．グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）。
６．心電図（ＥＫＧ）。
７．胸部Ｘ線。
８．脳ＭＲＩ。
９．腹部超音波検査。
１０．ＮＩＨＳＳ、バーグバランススケール（ＢＢＳ）、およびバーセル指数（ＢＩ）。
【0117】
来院１：スクリーニング（以下の活性は病院で実施される）：
被験者を調べて、上記の１０のカテゴリの情報を取得する。それらの中で、ＮＩＨＳＳは、ベースライン／ベースラインを確立するために２４±１時間間隔で２回取得する。
被験者を調べて、上記の１０のカテゴリの情報を取得する。それらの中で、ＮＩＨＳＳは、ベースライン／ベースラインを確立するために２４±１時間間隔で２回取得する。
【0118】
来院２：ヒト臍帯血注入（０日目）
１．被験者の同意書に署名されていることを確認する。
２．組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＡＢＣ複数抗原によると、組織適合検査
ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＤＲ複数抗原、ならびにＡＢＯ血液型検査（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ血液型判定、およびＲＨ（Ｄ））は、適合する臍帯血ユニットを特定する。適合した凍結臍帯血ユニットを、病院に送る。
３．注入前に、被験者のバイタルサインを監視する。
４．上記の手順に従って、院内検査室で凍結臍帯血ユニットを解凍する。
５．臍帯血（約２～５×１０８単球を含む）を、１回の注射で静脈内注射する。マンニトール（２０％マンニトール、２００ｍｌの静脈内、３０±１０分間）を、２回の注射（８時間±２時間の間隔）で被験者に投与する。投与後、バイタルサインは、以下のように監視される：
．注入開始後１５±５分ごとに４回。
．最初のマンニトール注射後１回。
．２回目のマンニトール注射の直前に１回。
．２回目のマンニトール注射後６時間±３０分ごとに４回。
１．被験者の同意書に署名されていることを確認する。
２．組織適合検査ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＡＢＣ複数抗原によると、組織適合検査
ＨＬＡ－ＨＬＡ－ＤＲ複数抗原、ならびにＡＢＯ血液型検査（Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ血液型判定、およびＲＨ（Ｄ））は、適合する臍帯血ユニットを特定する。適合した凍結臍帯血ユニットを、病院に送る。
３．注入前に、被験者のバイタルサインを監視する。
４．上記の手順に従って、院内検査室で凍結臍帯血ユニットを解凍する。
５．臍帯血（約２～５×１０８単球を含む）を、１回の注射で静脈内注射する。マンニトール（２０％マンニトール、２００ｍｌの静脈内、３０±１０分間）を、２回の注射（８時間±２時間の間隔）で被験者に投与する。投与後、バイタルサインは、以下のように監視される：
．注入開始後１５±５分ごとに４回。
．最初のマンニトール注射後１回。
．２回目のマンニトール注射の直前に１回。
．２回目のマンニトール注射後６時間±３０分ごとに４回。
【0119】
来院３：回復期間（ＵＣＢ注入後２４±８時間）
ＵＣＢ注入後２４±８時間で、被験者は、以下について確認される：
１．バイタルサイン
２．ＧＣＳ
３．以下のための血液検査：
１）ＣＢＣ－Ｉ（ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｃｔ、血小板数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）およびＷＢＣ白血球百分率、
３）ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、プロトロンビン時間、ならびにプロトロンビン時間および国際標準化比（ＩＮＲ）、
４）Ｎａ＋（ナトリウム）、Ｋ＋（カリウム）、およびＣｌ＋（塩化物）濃度、血糖値（ａｃまたはｐｃ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｓ－ＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｂ）ＣＲＴＮを含む、血液生化学的検査、
５）赤血球沈降速度（Ｅ．Ｓ．Ｒ）、Ｃ．Ｒ．Ｐ（Ｃ反応性タンパク質）－ネフェロメトリー、ならびに
６）ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αを含むサイトカイン。
４．脳ＭＲＩ、
５．腹部超音波検査、
６．ＮＩＨＳＳ、バーグバランススケール（ＢＢＳ）、およびバーセル指数（ＢＩ）、
７．有害事象を観察および記録し、被験者がＧＶＨＤであるかどうかを評価する、
８．投薬記録を確認する、ならびに
９．被験者の医療記録を確認し、研究用に匿名でデータを記録する。
ＵＣＢ注入後２４±８時間で、被験者は、以下について確認される：
１．バイタルサイン
２．ＧＣＳ
３．以下のための血液検査：
１）ＣＢＣ－Ｉ（ＷＢＣ、ＲＢＣ、Ｈｂ、Ｈｃｔ、血小板数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ）およびＷＢＣ白血球百分率、
３）ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、プロトロンビン時間、ならびにプロトロンビン時間および国際標準化比（ＩＮＲ）、
４）Ｎａ＋（ナトリウム）、Ｋ＋（カリウム）、およびＣｌ＋（塩化物）濃度、血糖値（ａｃまたはｐｃ）、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｓ－ＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｂ）ＣＲＴＮを含む、血液生化学的検査、
５）赤血球沈降速度（Ｅ．Ｓ．Ｒ）、Ｃ．Ｒ．Ｐ（Ｃ反応性タンパク質）－ネフェロメトリー、ならびに
６）ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αを含むサイトカイン。
４．脳ＭＲＩ、
５．腹部超音波検査、
６．ＮＩＨＳＳ、バーグバランススケール（ＢＢＳ）、およびバーセル指数（ＢＩ）、
７．有害事象を観察および記録し、被験者がＧＶＨＤであるかどうかを評価する、
８．投薬記録を確認する、ならびに
９．被験者の医療記録を確認し、研究用に匿名でデータを記録する。
【0120】
来院４：回復期間（ＵＣＢ注入後４８±８時間）
ＵＣＢ注入後４８±８時間で、被験者は、来院３の項目１～３および６～９について再度検査される。
ＵＣＢ注入後４８±８時間で、被験者は、来院３の項目１～３および６～９について再度検査される。
【0121】
来院５：回復期間（ＵＣＢ注入後７２±８時間）
ＵＣＢ注入後７２±８時間で、被験者は、来院３の項目１～３および５～９について再度検査される。
ＵＣＢ注入後７２±８時間で、被験者は、来院３の項目１～３および５～９について再度検査される。
【0122】
来院６：回復期間（ＵＣＢ注入後７±１日または退院の１日前）
被験者は、バイタルサイン、ＧＣＳ、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録も見直される。
被験者は、バイタルサイン、ＧＣＳ、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録も見直される。
【0123】
来院７：観察期間（ＵＣＢ注入後１か月±７日）
被験者は、バイタルサイン、脳ＭＲＩ、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録が見直され、記録される。
被験者は、バイタルサイン、脳ＭＲＩ、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録が見直され、記録される。
【0124】
来院８、９、１０、および１１：観察期間（ＵＣＢ注入後３、６、９、１２か月±７日）：
被験者は、バイタルサイン、来院３の方法と同じ方法で血液検査、腹部超音波検査（ＵＣＢ注入後３および１２か月±７日）、脳ＭＲＩ（ＵＣＢ注入後６および１２か月±７日）、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、および有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録が見直され、記録される。
被験者は、バイタルサイン、来院３の方法と同じ方法で血液検査、腹部超音波検査（ＵＣＢ注入後３および１２か月±７日）、脳ＭＲＩ（ＵＣＢ注入後６および１２か月±７日）、ＮＩＨＳＳ、ＢＢＳ、ＢＩ、および有害事象（ＧＶＨＤを含む）について検査される。被験者の投薬および医療記録が見直され、記録される。
【0125】
実施例３
この実施例は、血漿が実質的に枯渇しているが、赤血球が枯渇していない同種異系ＵＣＢユニットが、急性虚血性脳卒中の成人患者にとって安全かつ効果的であることを示す。
患者の特徴：
１．年齢：４６歳
２．性別：男性
３．脳卒中の設定時間：２０１９年６月３日午後９時
４．ＮＩＨＳＳ：ベースライン８、２４時間後９
５．２０１９年６月６日にＩＣＦに登録し、急性脳卒中研究に登録した
６．Ｄｘ：左片麻痺を伴う右ＭＣＡ／ＡＣＡ梗塞
この実施例は、血漿が実質的に枯渇しているが、赤血球が枯渇していない同種異系ＵＣＢユニットが、急性虚血性脳卒中の成人患者にとって安全かつ効果的であることを示す。
患者の特徴：
１．年齢：４６歳
２．性別：男性
３．脳卒中の設定時間：２０１９年６月３日午後９時
４．ＮＩＨＳＳ：ベースライン８、２４時間後９
５．２０１９年６月６日にＩＣＦに登録し、急性脳卒中研究に登録した
６．Ｄｘ：左片麻痺を伴う右ＭＣＡ／ＡＣＡ梗塞
【0126】
他の身体的病歴：胃潰瘍、高血圧、血液透析（ＨＤ）中の末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を伴う慢性腎疾患（ＣＫＤ）２０１１年以降ＱＷ１、３、５、アンギナ、および副甲状腺機能亢進症ｓ／ｐ部分副甲状腺摘出術。
【0127】
患者のＨＬＡタイプに応じて、適合するＵＣＢユニットが、次のＵＣＢプロファイルで特定された：
１．ＴＷ－０２－０４１９１；
２．２００２年７月２２日にＳｔｅｍＣｙｔｅ Ｔａｉｗａｎによって収集された
３．注入前に１７年間保管された、
４．血漿枯渇法により処理された、
５．ＨＬＡ適合度＝６／６、
６．事前凍結ＴＮＣ＝６５．２８×１０７、および
７．事前凍結ＣＤ３４＝１０５．８×１０４。
１．ＴＷ－０２－０４１９１；
２．２００２年７月２２日にＳｔｅｍＣｙｔｅ Ｔａｉｗａｎによって収集された
３．注入前に１７年間保管された、
４．血漿枯渇法により処理された、
５．ＨＬＡ適合度＝６／６、
６．事前凍結ＴＮＣ＝６５．２８×１０７、および
７．事前凍結ＣＤ３４＝１０５．８×１０４。
【0128】
患者は、脳卒中後８日目に上記の方法でＵＣＢ（２．６３×１０８）を投与された。ＵＣＢ注入は、午前１２時４７分に開始し、午後１３時１３分に終了した。患者の状態は、ＵＣＢ注入中、安定していた。３０分の休憩の後、患者は、４時間ごとに２０％１００ｍｌのマンニトールの静脈内注射を４回投与された（マンニトール１００ｍｌ／６０分、４時間ごとに静脈内投与）。
【0129】
ＵＣＢ注入の２４時間後（脳卒中の発症後約９日）に、患者は、上記の方法で検査された。脳ＭＲＩは、時間が経つにつれて浮腫が最大に進行したことを示した。
【0130】
ＵＣＢ注入後７～１４日で、患者は、運動機能の改善を示した。ＵＣＢ注入から１か月後、患者は、さらにより有意な運動機能の改善を示した。この期間中の関連するＮＩＨＳＳ、ＢＩ、およびＢＢＳの変化を、図３に示す。特に、臍帯血を注入する前の０日目に、患者は、左側麻痺を示した。ＵＣＢの注入から７日後の７日目に、患者の左指は、動かせた。ＵＣＢの注入後１か月で、患者は、左手／指および脚を動かし、拳を作ることができた。患者のＮＩＨＳＳは、９から３．５に低減した。
【0131】
上記の結果は、血漿枯渇法によって処置されたＨＬＡ ６／６適合度を有する同種異系臍帯血を受け取った後、短期間で虚血性脳卒中の成人患者に有意な回復を示した。このような回復は、前例のないものであり、他の臨床試験では観察されていない。
【0132】
患者は、ＣＢ輸血の８日後に退院し、ＮＩＨＳＳ、神経学的機能、およびＭＲＩ検査のために、上記の方法で１、３、６、および１２か月後にフォローアップされた。臍帯血輸血後、患者の神経学的機能は、徐々に改善することが見出された。患者のＮＩＨＳＳは、ベースラインの９ポイントからＣＢ輸血後１２か月の１ポイント（図４Ａ）に改善し、バーグバランススコアは、０ポイントから４８ポイント（図４Ｂ）に改善し、バーセル指数スコアは、０ポイントから９０ポイント（図４Ｃ）に改善した。腹部超音波検査による１２回の観察で脾腫は、認められなかった。不眠症および上気道感染症を含む２つの有害事象が発生し、投薬による治療に成功した。重篤な有害事象は、観察されなかった。脳卒中の２時間後および８日後の拡散強調画像（ＤＷＩ）により、右放射冠の梗塞（白色強度の増加）が明らかになり、３か月後に散乱し、６か月後に消失した（図５Ａ～５Ｄ）。梗塞の２時間後、８日後、３か月後、および６か月後に検出されたＴ２強調画像は、右放射冠の白色強度の増加を示した（図６Ａ～６Ｄ）。
【0133】
脳卒中に対する細胞療法の有効性は、細胞の種類、細胞の起源、細胞数、細胞治療のタイミング、細胞送達の経路を含む要因に依存する。脳卒中の開始後の損傷神経細胞の修復または神経細胞の更新の時間枠は短く、例えば、動物実験に基づいて７２時間以内である。脳卒中の急性期または亜急性期の早期細胞療法は、より良い結果をもたらし得る。上記の患者は、脳卒中の３か月後にＭＲＩ検査から特定された無症状の２回目の脳卒中を経験した。Ｔ２画像は、２回目の脳卒中の領域ではなく、急性期における細胞療法によって治療された１回目の脳卒中の領域においてのみ脳実質およびＣＳＦの先鋭の損失を示す（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【0134】
ＣＢ細胞は、脳卒中の急性期および亜急性期においてより優れた治療可能性を示す。ＣＢ細胞は、再生効果に加えて免疫調節作用および抗炎症作用を持っているため、脳卒中後の炎症反応によって誘発されるさらなる損傷から半影組織を保護することができる。ＣＢ細胞は、脾細胞の表現型を変化させることによって免疫調節活性を発揮することもできる。急性または亜急性期においては、静脈内送達によるＣＢ療法は、全身性免疫調節の修正を考えた神経保護を達成することができる。
【0135】
間充織幹細胞（ＭＳＣ）療法の利点は、実験室で達成および拡大される。ＭＳＣの安全性は、多くの臨床試験で文書化されているが、有効性は、不明である。ドナー幹細胞の質、活性、および発生能は、成功した幹細胞療法のためには重要である。細胞の状態は、ドナーの起源に大きく依存する。自家細胞移植では、障害を有する患者から回収されたドナー細胞は、満足のいく品質、活性、または発生能を有し得ない。自家移植とは異なり、健康なドナーからの同種移植のための凍結保存されたＨＵＣＭＢは、はるかに優れた安定性および品質を備えた代替手段を提供する。
【0136】
脳卒中療法に適切な幹細胞の数は、当業者によって決定され得る。ＭＳＣの静脈内注射のための最小限の獲得は、８億４０００万の単回投与で推奨された（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ ＣＶ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１９；８（９）：９８３－８）。当業者は、細胞数および毒性のリスクおよびベネフィットの考慮が最大のベネフィットおよび最小の細胞投薬量であるべきであることを理解するであろう（Ｓａｒｍａｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｏｋｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；９（４）：３５６－７４）。ＢＢＢを横切る幹細胞の透過性を高めることは、幹細胞の量を減らすのに役立ち得る。そのために、マンニトールを使用して、ＢＢＢを破壊し、幹細胞の末梢送達を促進することができる。この報告された症例の細胞量は、約２億６３００万であったが、細胞注入の３０分後にマンニトールを使用してＢＢＢを開放した。幹細胞の透過性を高めることに加えて、マンニトールは、神経栄養因子および神経成長因子をＢＢＢ全体にまで高めることができる。したがって、本明細書に記載の方法は、ＣＢ細胞の再生に加えて、シナプス形成、未成熟ニューロンの増殖、およびニューロン細胞の移動を含む、移植されたＣＢ細胞のそれらの細胞および他のものからの有益な効果を利用することを可能にする。
【0137】
前述の実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではなく、例示するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、上記の特徴の多数の変形例および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく用いられ得る。そのような変形例は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、そのようなすべての変形例は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書において言及されるすべての参考文献は、その全体が参考により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A-5D】
【図6A-6D】
【国際調査報告】