知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-21
(54)【発明の名称】抗凝固剤拮抗剤としてのトロンボソーム
(51)【国際特許分類】
A61K 35/19 20150101AFI20221014BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20221014BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221014BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20221014BHJP
A61K 31/195 20060101ALI20221014BHJP
A61K 38/55 20060101ALI20221014BHJP
A61K 38/36 20060101ALI20221014BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20221014BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221014BHJP
【ＦＩ】
A61K35/19 Z
A61P7/04
A61K45/00
A61K31/197
A61K31/195
A61K38/55
A61K38/36
A61K9/08
A61K47/02
A61K47/20
A61K47/26
A61K47/36
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509584
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-03-28
(86)【国際出願番号】 US2020046522
(87)【国際公開番号】W WO2021034716
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/887,985
(32)【優先日】2019-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/065,337
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508180585
【氏名又は名称】セルフィアー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】モスコウィッツ キース アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】イシュラー ブレイデン カール
(72)【発明者】
【氏名】ディッカーソン ウィリアム マシュー
(72)【発明者】
【氏名】リー アンバー ニコル
(72)【発明者】
【氏名】シュー シャン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076CC14
4C076DD25Z
4C076DD26
4C076DD57Z
4C076DD67
4C076EE30
4C076FF12
4C076FF61
4C076GG05
4C076GG06
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA44
4C084DC10
4C084DC34
4C084MA17
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA05
4C084ZA532
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB38
4C087CA04
4C087MA02
4C087MA05
4C087MA17
4C087MA55
4C087MA66
4C087NA10
4C087NA14
4C087ZA53
4C206AA01
4C206FA44
4C206KA01
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA37
4C206NA05
4C206ZA53
(57)【要約】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、
方法。
【請求項2】
対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されている、
方法。
【請求項3】
対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、
方法。
【請求項4】
対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されている、
方法。
【請求項5】
対象を手術のために準備させる方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、
方法。
【請求項6】
対象を手術のために準備させる方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されている、
方法。
【請求項7】
前記手術が、緊急手術である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記手術が、予定された手術である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項9】
前記対象が、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗凝固剤による治療が、停止される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記抗凝固剤による治療が、継続される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
対象における抗凝固剤の効果を改善する方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、
方法。
【請求項13】
対象における抗凝固剤の効果を改善する方法であって、その必要がある前記対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されている、
方法。
【請求項14】
前記抗凝固剤の前記効果が、前記抗凝固剤の過剰摂取の結果である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、抗線溶剤をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗線溶剤が、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、フィブリノゲン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記血小板または血小板誘導体に、前記抗線溶剤が充填される、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記抗凝固剤が、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗凝固剤が、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、チファコギン、第ＶＩＩａｉ因子、ＳＢ２４９４１７、ペグニバコギン（アニバメルセンを含むか、または含まない）、ＴＴＰ８８９、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、ＳＲ２３７８１Ａ、アピキサバン、ベトリキサバン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン、フェンプロクモン、アセノクマロール、インダンジオン、フルインジオン、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記抗凝固剤が、ワルファリンである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記抗凝固剤が、ヘパリンである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記投与の前に、前記対象が、少なくとも４．０のＩＮＲを有した、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記投与の後に、前記対象が、３．０以下のＩＮＲを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記投与の後に、前記対象が、２．０以下のＩＮＲを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記投与の前に、前記対象が、少なくとも３．０のＩＮＲを有した、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記投与の後に、前記対象が、２．０以下のＩＮＲを有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
投与が、局所投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
投与が、非経口投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
投与が、静脈内投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
投与が、筋肉内投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
投与が、髄腔内投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
投与が、皮下投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
投与が、腹腔内投与を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記組成物が、前記投与工程の前に乾燥される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記組成物が、前記乾燥工程の後に再水和される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記組成物が、前記投与工程の前に凍結乾燥される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記組成物が、前記凍結乾燥工程の後に再水和される、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記インキュベーション剤が、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記インキュベーション剤が、担体タンパク質を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記組成物が、１種以上の糖を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
１種以上の糖が、トレハロースを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記１種以上の糖が、ポリスクロースを含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記１種以上の糖が、デキストロースを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記組成物が、有機溶媒を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記血小板または血小板誘導体が、トロンボソームを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／８８７，９８５号および２０２０年８月１３日に出願された米国仮出願第６３／０６５，３３７号の優先権を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／８８７，９８５号および２０２０年８月１３日に出願された米国仮出願第６３／０６５，３３７号の優先権を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本開示は、薬物誘発性凝固障害の治療としてのトロンボソームの使用を説明する役割を果たす。ワルファリン、ヘパリン、およびＮＯＡＣクラスなどの抗凝固薬は、凝固カスケードの様々な血漿因子を阻害し、出血する可能性を増加させる。ここで、トロンボソームが、この阻害を回避または克服して止血を回復させることを実証する。
本開示は、薬物誘発性凝固障害の治療としてのトロンボソームの使用を説明する役割を果たす。ワルファリン、ヘパリン、およびＮＯＡＣクラスなどの抗凝固薬は、凝固カスケードの様々な血漿因子を阻害し、出血する可能性を増加させる。ここで、トロンボソームが、この阻害を回避または克服して止血を回復させることを実証する。
【背景技術】
【0003】
背景
抗凝固薬は、米国成人集団において一般的であり、多種多様な機序を用いて凝血カスケードのセグメントを無効にする。抗凝固剤は、多数の心臓または血栓塞栓性事象を治療するために使用される。例えば、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））は、静脈血栓症およびその延長、肺塞栓症の予防および治療；心房細動および／または心臓弁置換に関連する血栓塞栓合併症の予防および治療；心筋梗塞後の死亡、再発性心筋梗塞、および脳卒中または全身塞栓などの血栓塞栓事象のリスクの低減（例えば、ワルファリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））の処方情報を参照されたい）のために承認されている。別の例として、ヘパリンは、血栓性静脈炎、静脈血栓症、ならびに脳、冠動脈、および網膜血管血栓症の治療のために承認されており、血栓および血栓塞栓性現象の延長を防止する。これはまた、血栓塞栓症の発生を防止するため、ならびに透析および外科的処置、特に血管手術中の凝血を防止するために、予防的に使用される。抗凝固特性を有する他の薬物としては、ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））、アルガトロバン、およびヒルジンを含む、第ＩＩａ因子（トロンビン）を阻害する薬剤（作用機序に応じて、抗ＩＩａ剤、トロンビン阻害剤、または直接的なトロンビン阻害剤とも称される）、ならびにリバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標））、およびフォンダパリヌクス（例えば、ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標））を含む、第Ｘａ因子を阻害する薬剤が挙げられ得る。従来の抗凝固剤としては、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））およびヘパリン／ＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）が挙げられ得る。追加の抗凝固剤としては、ヘパライノイド、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩ因子阻害剤、第ＶＩＩａ因子阻害剤、および組織因子阻害剤が挙げられる。
抗凝固薬は、米国成人集団において一般的であり、多種多様な機序を用いて凝血カスケードのセグメントを無効にする。抗凝固剤は、多数の心臓または血栓塞栓性事象を治療するために使用される。例えば、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））は、静脈血栓症およびその延長、肺塞栓症の予防および治療；心房細動および／または心臓弁置換に関連する血栓塞栓合併症の予防および治療；心筋梗塞後の死亡、再発性心筋梗塞、および脳卒中または全身塞栓などの血栓塞栓事象のリスクの低減（例えば、ワルファリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））の処方情報を参照されたい）のために承認されている。別の例として、ヘパリンは、血栓性静脈炎、静脈血栓症、ならびに脳、冠動脈、および網膜血管血栓症の治療のために承認されており、血栓および血栓塞栓性現象の延長を防止する。これはまた、血栓塞栓症の発生を防止するため、ならびに透析および外科的処置、特に血管手術中の凝血を防止するために、予防的に使用される。抗凝固特性を有する他の薬物としては、ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））、アルガトロバン、およびヒルジンを含む、第ＩＩａ因子（トロンビン）を阻害する薬剤（作用機序に応じて、抗ＩＩａ剤、トロンビン阻害剤、または直接的なトロンビン阻害剤とも称される）、ならびにリバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標））、およびフォンダパリヌクス（例えば、ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標））を含む、第Ｘａ因子を阻害する薬剤が挙げられ得る。従来の抗凝固剤としては、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））およびヘパリン／ＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）が挙げられ得る。追加の抗凝固剤としては、ヘパライノイド、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩ因子阻害剤、第ＶＩＩａ因子阻害剤、および組織因子阻害剤が挙げられる。
【0004】
しかしながら、抗凝固剤は、毎年多数の薬物関連有害事象（ＡＤＥ）に関与しており、これには、全ＡＤＥ入院患者の１０％、および介護施設における年間推定最大３４，０００件のＡＤＥが含まれる。ワルファリンは、６５歳超の成人の全救急病院来院の１７％に関与している。少なくとも２０００人の患者が、ワルファリンによるビタミンＫアンタゴニスト療法の後に、致命的な出血に苦しんでいる。
【0005】
また、ワルファリン拮抗療法は、ビタミンＫを除いて非常に高価であり得、ビタミンＫは、ワルファリンと同等に危険であり得る。例えば、Ｋｃｅｎｔｒａ（プロトロンビン複合体濃縮物；ＰＣＣ）は、１用量当たり約５１００ドルの費用がかかる。
【0006】
ＮＯＡＣは、クマジンと同様の出血リスクを有し、モニタリングすることはできず、緊急手術が必要とされる場合の拮抗状況に対して課題を呈する。
【0007】
これらの薬物に関連する過剰摂取および有害事象は、患者集団に深刻な出血および関連する合併症のリスクをもたらす。したがって、抗凝固剤誘発性凝固障害などの凝固障害の治療に対するニーズが当該技術分野において存在する。
【発明の概要】
【0008】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0010】
いくつかの実施形態では、対象における正常な止血を回復させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、対象における正常な止血を回復させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0012】
いくつかの実施形態では、対象を手術のために準備させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、対象を手術のために準備させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
【0014】
上記の方法のいくつかの実装形態では、対象は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている。いくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、停止され得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、継続され得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0017】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤の効果は、抗凝固剤の過剰摂取の結果であり得る。
【0018】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、およびサプリメントからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ワルファリンであり得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリンであり得る。
【0019】
本明細書の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、投与の前に、対象は、少なくとも４．０のＩＮＲを有し得る。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象は、３．０以下のＩＮＲを有し得る。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象は、２．０以下のＩＮＲを有し得る。
【0020】
本明細書の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、投与の前に、対象は、少なくとも３．０のＩＮＲを有し得る。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象は、２．０以下のＩＮＲを有し得る。
【0021】
本明細書の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。投与は、局所投与を含み得る。投与は、非経口投与を含み得る。投与は、静脈内投与を含み得る。投与は、筋肉内投与を含み得る。投与は、髄腔内投与を含み得る。投与は、皮下投与を含み得る。
投与は、腹腔内投与を含み得る。組成物は、投与工程の前に乾燥され得る。組成物は、乾燥工程の後に再水和され得る。組成物は、投与工程の前に凍結乾燥され得る。組成物は、凍結乾燥工程の後に再水和され得る。インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含み得る。インキュベーション剤は、担体タンパク質を含み得る。緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含み得る。組成物は、１種以上の糖を含み得る。１種以上の糖は、トレハロースを含み得る。１種以上の糖は、ポリスクロースを含み得る。１種以上の糖は、デキストロースを含み得る。組成物は、有機溶媒を含み得る。血小板または血小板誘導体は、トロンボソームを含み得る。
投与は、腹腔内投与を含み得る。組成物は、投与工程の前に乾燥され得る。組成物は、乾燥工程の後に再水和され得る。組成物は、投与工程の前に凍結乾燥され得る。組成物は、凍結乾燥工程の後に再水和され得る。インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含み得る。インキュベーション剤は、担体タンパク質を含み得る。緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含み得る。組成物は、１種以上の糖を含み得る。１種以上の糖は、トレハロースを含み得る。１種以上の糖は、ポリスクロースを含み得る。１種以上の糖は、デキストロースを含み得る。組成物は、有機溶媒を含み得る。血小板または血小板誘導体は、トロンボソームを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】様々なＩＮＲレベルでワルファリン血漿に４００×１０３／μＬのトロンボソームを添加することによって得られたピークトロンビン生成を示す。
【図2】様々なＩＮＲレベルで血漿に４００×１０３／μＬのトロンボソームを添加することによって得られた内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）値を示す。
【図3】ＩＮＲ２ワルファリン血漿中のトロンボソームおよび新鮮な血小板によるピークトロンビン生成を示す。
【図4】３００×１０３／μＬのトロンボソームの添加の結果としての、ＴＥＧアッセイにおけるワルファリン血漿試料のＲ時間に対する効果を示す。
【図5】トロンボソームが、ピークトロンビン生成において用量依存的増加を提供することを示す。これらのデータは、１５０×１０３／μＬの内因性血小板数を有する全血のバックグラウンドにおいて収集した。
【図6】ピークトロンビン生成に対する血小板またはトロンボソームの濃度のプロットを示す。
【図7A】ＩＮＲ－２血漿中のピークトロンビン生成に対する血小板、トロンボソーム、またはそれらの組み合わせの濃度のプロットを示す。
【図7B】４つの異なるバッチのトロンボソームについて、ＩＮＲ－１血漿、ＩＮＲ－２血漿（ワルファリンで処理）、およびＩＮＲ－２血漿（ワルファリンで処理）＋トロンボソーム（１５０×１０３／μＬ）におけるトロンビン生成を示す。
【図8】フロー下での剪断依存性コラーゲン接着アッセイ（Ｔ－ＴＡＳ（登録商標））におけるワルファリン血漿中のトロンボソームによる血栓の生成を示す。
【図9】全血（ＷＢ）中のリバーロキサバンの濃度の増加に伴って増加する血栓の生成までの時間のプロットを示す。
【図10A】トロンボソームの添加によって減少する３ｍＭのリバーロキサバンの存在下での血栓の生成までの時間のプロットを示す。
【図10B】対照血漿中、３ｍＭのリバーロキサバンで処理された血漿中、および３ｍＭのリバーロキサバンおよび３００×１０３／μＬのトロンボソームで処理された血漿中の血栓の生成までの時間のプロットを示す。
【図11】図１１Ａは、Ｒ時間（凝血塊形成の開始）に関して測定した、標準血漿（ＩＮＲ＝１．０）と比較したワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。図１１Ｂは、対数目盛りｘ軸上にプロットした、Ｒ時間に関して測定した、標準血漿（ＩＮＲ＝１．０）と比較したワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。
【図12】図１２Ａは、アルファ角（角度とも称される）に関して、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。図１２Ｂは、対数目盛りｘ軸上にプロットした、アルファ角（角度とも称される）に関して、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。
【図13】最大振幅（ＭＡ）に関して、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。
【図14】対数目盛りｘ軸上にプロットした、最大振幅（ＭＡ）に関して、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を示す。
【図15】トロンボソームを補充された異なるＩＮＲ値を有する試料についてのラグタイムの減少のプロットを示す。
【図16】標識されたパラメータを有する例示的なトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）波形である。
【図17】様々な濃度のトロンボソームを補充したか、または補充していない、ワルファリン血漿の様々なＩＮＲ値についてのＲ時間のプロットである。
【図18】トロンボソームを補充した、および補充していない、様々なＩＮＲレベルの血漿レベルにおける活性化された凝血時間のプロットである。
【図19】全血に対するトロンボソームの効果を示す（正常、ＩＮＲ＝２、ＩＮＲ＝３、およびＩＮＲ＝６．２）。
【図20】図２０Ａは、ＩＮＲが１および２である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。図２０Ｂは、ＩＮＲが３である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。図２０Ｃは、ＩＮＲが１および６である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。
【図21】図２１Ａは、ＩＮＲが１および２である血漿中のトロンボソームの内因性トロンビン産生能に対する効果を示す。図２１Ｂは、ＩＮＲが３である血漿中のトロンボソームの内因性トロンビン産生能に対する効果を示す。図２１Ｃは、ＩＮＲが１および６である血漿中のトロンボソームの内因性トロンビン産生能に対する効果を示す。
【図22A】トロンボソームバッチ１の複製について、ＩＮＲが１、２、３、および６である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果（左）、ならびに０～３０ｎＭの同じデータのズームイン画像（右）を示す。
【図22B】トロンボソームバッチ１の複製について、ＩＮＲが１、２、３、および６である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。
【図22C】トロンボソームバッチ１の複製について、ＩＮＲが１、２、３、および６である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。
【図22D】トロンボソームバッチ２について、ＩＮＲが１、２、３、および６である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果（左）、ならびに０～２．５ｎＭの同じデータのズームイン画像（右）を示す。
【図22E】トロンボソームバッチ３について、ＩＮＲが１、２、および３である血漿中のトロンボソームのピークトロンビン生成に対する効果を示す。
【図23】図２３Ａは、ヘパリンで処理された血漿および血漿のａＰＴＴ値を示す。図２３Ｂは、ＰＰＰ低試薬で開始した、新鮮な血小板またはトロンボソームを添加した、ヘパリンで処理された血漿についてのトロンビン生成を示す。図２３Ｃは、ＰＲＰ試薬で開始した、新鮮な血小板またはトロンボソームを添加した、ヘパリンで処理された血漿についてのトロンビン生成を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
詳細な説明
本発明の実施形態を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、その用語が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等である任意の方法および材料が本発明の実践に使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される方法および／また材料と関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、あらゆる組み込まれた刊行物との矛盾を制御する。
本発明の実施形態を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、その用語が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等である任意の方法および材料が本発明の実践に使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される方法および／また材料と関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、あらゆる組み込まれた刊行物との矛盾を制御する。
【0024】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示的に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「糖」への言及は、１つ以上の糖、および当業者に既知のそれらの同等物への言及を含む。さらに、同等の用語を使用して記載され得る用語の使用は、それらの同等の用語の使用を含む。したがって、例えば、「対象」という用語の使用は、「患者」、「人」、「動物」、「ヒト」、および医学的処置を受ける対象を示すために当該技術分野で使用される他の用語を含むことを理解されたい。
単一の概念を包含するために複数の用語を使用することは、使用されるそれらの用語のみに概念を限定するものとして解釈されるべきではない。
単一の概念を包含するために複数の用語を使用することは、使用されるそれらの用語のみに概念を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0025】
本明細書で使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。さらに、値の範囲が開示される場合、当業者は、開示される範囲内の他のすべての特定の値が、本明細書で各特定の値または範囲を開示する必要なしに、これらの値およびそれらが表す範囲によって本質的に開示されることを理解するであろう。例えば、開示される１～１０の範囲は、１～９、１～５、２～１０、３．１～６、１、２、３、４、５などを含む。さらに、開示される範囲の各々は、範囲のより低い値については最大５％低いこと、および範囲のより高い値については最大５％高いことを含む。例えば、開示される４～１０の範囲は、３．８～１０．５を含む。この概念は、本書では「約」という用語によって捉えられている。
【0026】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「血小板」という用語は、全血小板、断片化された血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームを含み得る。上記の定義内の「血小板」は、例えば、全血中の血小板、血漿中の血小板、選択された血漿タンパク質で任意選択的に補充された緩衝液中の血小板、低温貯蔵された血小板、乾燥された血小板、凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、解凍された凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、再水和された乾燥された血小板、再水和された凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、解凍された凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、または再水和された凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板を含み得る。「血小板」は、ヒトなどの哺乳動物の「血小板」であり得るか、または非ヒト哺乳動物などの「血小板」であり得る。
【0027】
本明細書で使用される場合、「トロンボソーム」（本明細書では、特に実施例および図では、「Ｔｓｏｍｅ」または「Ｔｓ」とも称される場合がある）は、インキュベーション剤（例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれか）で処理され、凍結保存（例えば、凍結乾燥）されている、血小板誘導体である。いくつかの場合では、トロンボソームは、プールされた血小板から調製され得る。トロンボソームは、周囲温度で、乾燥形態で２～３年の貯蔵寿命を有し得、直ちに注入するために数分以内に滅菌水で再水和され得る。トロンボソームの１つの例は、血小板減少性患者における急性出血の治療のための臨床試験にある、ＴＨＲＯＭＢＯＳＯＭＥＳ（登録商標）である。第ＩＩａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、組織因子、もしくは凝血因子（例えば、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第Ｘ因子）のビタミンＫ依存性合成を阻害する薬剤、または抗トロンビン（例えば、抗トロンビンＩＩＩ）を活性化する薬剤は、本開示の目的のための抗凝固剤である。抗凝固剤の他の機序は、既知である。抗凝固剤の非限定的な例としては、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、および低分子量ヘパリン（例えば、ダルテパリン、エノキサパリン、チンザパリン、アルデパリン、ナドロパリン、レベパリン、ダナパロイド）が挙げられる。抗凝固剤の追加の非限定的な例としては、チファコギン、第ＶＩＩａｉ因子、ＳＢ２４９４１７、ペグニバコギン（アニバメルセンを含むか、または含まない）、ＴＴＰ８８９、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、ＳＲ２３７８１Ａ、アピキサバン、ベトリキサバン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン、フェンプロクモン、アセノクマロール、インダンジオン、およびフルインジオンが挙げられる。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、チファコギン、第ＶＩＩａｉ因子、ＳＢ２４９４１７、ペグニバコギン（アニバメルセンを含むか、または含まない）、ＴＴＰ８８９、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、ＳＲ２３７８１Ａ、アピキサバン、ベトリキサバン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン、フェンプロクモン、アセノクマロール、インダンジオン、およびフルインジオンからなる群から選択される。
【0028】
本明細書で使用される場合、「抗凝固剤」は、抗血小板剤を含まない抗血栓剤である。抗血小板剤の例としては、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））、プラスグレルエプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ（登録商標））、チロフィバン（例えば、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標））、およびアブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））が挙げられる。典型的には、Ｐ２Ｙ受容体（例えば、Ｐ２Ｙ１２）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを阻害する薬剤、またはトロンボキサンシンターゼもしくはトロンボキサン受容体に拮抗する薬剤は、抗血小板剤であると見なされる。抗血小板剤の他の機序は、既知である。本明細書で使用される場合、アスピリンは、抗血小板剤であるが、抗凝固剤ではないと見なされる。
【0029】
抗凝固剤の効果の克服は、抗凝固剤の薬理作用により異なる。事前に計画された手術のように、事前に通知されている場合には、抗凝固剤の用量が手術の前に調整され得る場合があるが、そのような用量の減少は、推奨されない場合があり得る。抗凝固剤が迅速に拮抗する必要がある場合（例えば、緊急手術の場合）には、拮抗剤は、典型的には、遅効性であるか、高価であるか、または患者に重大なリスクをもたらす。以下は、市販の抗凝固剤に対する拮抗剤のいくつかの非限定的な例である。
【0030】
ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））－ワルファリンは、複数の凝固因子を生成するために必要な補助因子である肝臓中のビタミンＫの活性を防止するように作用する。ワルファリンの拮抗は、ビタミンＫまたはプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）を投薬することにより行われ得る場合がある。ビタミンＫは、低コストかつ遅効性（２４時間超のＰＯ）であるが、患者において血栓を誘発する重大なリスクをもたらし得、一方ＰＣＣは、およそ５０００ドル／用量で高価である。
【0031】
ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））－ダビガトランは、トロンビンの直接的阻害剤である。
５グラムの用量（２用量間隔で、各２．５グラム）のモノクローナル抗体療法イダルシズマブ（例えば、ＰＲＡＸＢＩＮＤ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、典型的には、数分以内にダビガトランの効果に拮抗し得る。ある卸売価格は、そのような治療の場合、３４８２．５０ドルである。
５グラムの用量（２用量間隔で、各２．５グラム）のモノクローナル抗体療法イダルシズマブ（例えば、ＰＲＡＸＢＩＮＤ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、典型的には、数分以内にダビガトランの効果に拮抗し得る。ある卸売価格は、そのような治療の場合、３４８２．５０ドルである。
【0032】
リバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））－リバーロキサバンは、直接的な第Ｘａ因子阻害剤である。リバーロキサバンは、組換え第Ｘａ因子デコイであるアンデキサネットアルファ（例えば、ＡＮＤＥＸＸＡ（登録商標））によって拮抗される。この治療は、高用量治療の場合、およそ５０，０００ドルの費用がかかる場合がある。
【0033】
アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））－アピキサバンは、直接的な第Ｘａ因子阻害剤である。アピキサバンは、組換え第Ｘａ因子デコイであるアンデキサネットアルファによって拮抗される。この治療は、高用量治療の場合、およそ５０，０００ドルの費用がかかる場合がある。
【0034】
エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標）、ＬＩＸＩＡＮＡ（登録商標））－エドキサバンは、直接的な第Ｘａ因子阻害剤である。エキソキサバンは、承認された拮抗剤を有しない。シラパランタグ（アリパジン）およびアンデキサネットアルファは、適切であることが臨床的に証明されていない。
【0035】
ヘパリンおよび低分子量ヘパリンは、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ）の活性化剤である。ＡＴは、トロンビンおよび第Ｘａ因子などのプロテアーゼを不活性化する。硫酸プロタミンは、負荷電ヘパリンに結合し、ＡＴに対するその作用を防止する、高正荷電ポリペプチドである。硫酸プロタミンは、典型的には、約１．０～約１．５ｍｇ／１００ＩＵの活性ヘパリンで投薬される。
【0036】
血小板由来の製品は、抗凝固薬の治療法としては現在使用されていない。
【0037】
抗凝固薬の治療は、必ずしも標的化された対策ではない。いくつかの新規の抗凝固剤治療、例えば、アンデキサネットアルファ（例えば、ＡＮＤＥＸＸＡ（登録商標））は、ある程度の成功を見たが、高価であり得る。したがって、緊急治療（手術前、外傷など）は、典型的には、出血を回避または緩和するための包括的な予防策である。非限定的な例としては、血漿、赤血球、および抗線溶剤の注入が挙げられる。血小板誘導体（例えば、凍結保存された血小板（例えば、トロンボソーム））は、これらの一般的な治療に対する有効な代替策または補完であり得る。
【0038】
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、トロンボソームは、抗凝固剤によって抑制されるものを超えてトロンビン生成を増強するために凝固促進性負荷電表面を提供することによって、少なくとも部分的に作用し得ると考えられている。
【0039】
出血を制御し、治癒を改善するための製品および方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の製品および方法はまた、抗凝固剤（例えば、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ヘパリン、ＬＭＷＨ、ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標））、フォンダパリヌクス（例えば、ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標）））の活性に対抗するために使用され得る。本明細書に記載の製品および方法は、創傷の閉鎖および治癒を助ける実施形態を対象とする。
【0040】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、患者の表面上または患者の内部の創傷に送達され得る。様々な実施形態では、血小板または血小板誘導体を含む組成物は、接着包帯、圧縮包帯、液体溶液、エアロゾル、マトリックス組成物、およびコーティングされた縫合、または他の医療的閉鎖を含むがこれらに限定されない、選択された形態で適用され得る。実施形態では、血小板誘導体は、患者の表面上の罹患領域の全部または一部のみに投与され得る。他の実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、例えば、血流を介して、全身的に投与され得る。実施形態では、血小板誘導体の適用は、２日間または３日間、好ましくは５～１０日間、または最も好ましくは最大１４日間、止血効果をもたらし得る。
【0041】
いくつかの実施形態は、対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0042】
いくつかの実施形態は、対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0043】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、凝固障害は、抗凝固剤の結果である。
【0044】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0045】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0046】
いくつかの実施形態は、対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0047】
いくつかの実施形態は、対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0048】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0049】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0050】
本明細書に記載の組成物はまた、いくつかの場合では、対象を手術のために準備させるために投与され得る。抗凝固剤を服用している一部の患者にとって、手術の前に抗凝固剤の投与量を低減させることは困難または不可能であり得る（例えば、外傷または他の緊急手術の場合）。抗凝固剤を服用している一部の患者にとって、手術の前に抗凝固剤の投与量を低減させることは不得策である場合がある（例えば、抗凝固剤の投与量が経時的に低減された場合に、患者が血栓性事象（例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、または脳卒中）のリスクに曝される場合）。
【0051】
したがって、いくつかの実施形態は、対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0052】
いくつかの実施形態は、対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0053】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0054】
いくつかの実施形態は、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0055】
いくつかの実施形態では、手術は、緊急手術（例えば、外傷の場合）または予定された手術であり得る。
【0056】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、（例えば、手術の準備において）停止され得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、継続し得る。
【0057】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象はまた、抗凝固剤拮抗剤（例えば、イダルシズマブ、アンデキサネットアルファ、シラパランタグ（アリパジン）、硫酸プロタミン、ビタミンＫ）によって治療され得るか、または治療されない場合がある。いくつかの実施形態では、対象はまた、抗凝固剤拮抗剤によって治療されない。いくつかの実施形態では、対象はまた、抗凝固剤拮抗剤によって治療される。抗凝固剤拮抗剤は、対象に投与される抗凝固剤に基づいて選択され得ることが理解されよう。
【0058】
いくつかの実施形態は、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法を提供し、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0059】
いくつかの実施形態は、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法を提供し、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0060】
いくつかの場合では、抗凝固剤の投与量が不正確であるため、抗凝固剤の効果を改善する必要があり得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗凝固剤の効果は、抗凝固剤の過剰摂取後に改善され得る。いくつかの場合では、別の薬物（例えば、第２の抗凝固剤）との相互作用の可能性のため、抗凝固剤の効果を改善する必要があり得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗凝固剤の効果は、そのうちの少なくとも１つが抗凝固剤である、２つ以上の薬物の誤った投薬後に改善され得る。
【0061】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、抗線溶剤などの活性剤をさらに含み得る。抗線溶剤の非限定的な例としては、ｅ－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、およびフィブリノゲンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体に、抗線溶剤などの活性剤が充填され得る。
【0062】
血液（例えば、対象の血液）の凝血パラメータは、本明細書に記載の方法の間の任意の適切な時点で評価され得る。例えば、血液の１つ以上の凝血パラメータは、例えば、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の必要性を決定するために、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に評価され得る。別の例として、血液の１つ以上の凝血パラメータは、例えば、投与される組成物の有効性を決定するために、組成物の追加の投与が正当であるかどうかを決定するために、または外科的処置を実施することが安全であるかどうかを決定するために、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に評価され得る。
【0063】
したがって、本明細書に記載の方法のうちのいずれかは、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に、血液の１つ以上の凝血パラメータを評価する工程、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に、血液の１つ以上の凝血パラメータを評価する工程、またはその両方を含み得る。
【0064】
任意の適切な方法を使用して、血液の凝血パラメータを評価し得る。方法の非限定的な例としては、プロトロンビン時間アッセイ、国際標準化比（ＩＮＲ）、トロンビン生成（ＴＧＡ；例えば、ピークトロンビン、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、およびラグタイムなどのパラメータを生成するために使用され得る）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、および部分的トロンボプラスチン時間（ＰＴＴまたはａＰＴＴ）が挙げられる。
【0065】
ＩＮＲは、投薬を決定する標準的な方法であり（以下の等式を参照されたい）、式中、「ＰＴ（ｘ）」は、プロトロンビン時間アッセイの結果であり、ＩＳＩ定数は、プロトロンビン時間アッセイで使用される組織因子の製造業者に依存する。
【0066】
ワルファリンは、健全な凝血塊形成に不可欠である４つの主要な血漿タンパク質の合成を阻害する。ワルファリンの治療的維持用量は、典型的には、約２．０～約３．０のＩＮＲを標的とする。トロンボソームは、ワルファリン型薬物の存在下で止血を回復させるための独自の治療法を提示する。ワルファリンの用量は、ワルファリンの量とともに増加する比率であるＩＮＲによって表され得る（１が正常値である）。
【0067】
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に、２．０超（例えば、少なくとも２．２、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．８、少なくとも３．０、少なくとも３．２、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６、少なくとも３．８、少なくとも４．０、少なくとも４．２、少なくとも４．４、少なくとも４．５、少なくとも４．６、少なくとも４．８、または少なくとも５．０）のＩＮＲを有する。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ワルファリンなどの抗凝固剤によって治療されている対象）は、２．０～３．０、例えば、２．２～２．８、例えば、２．４～２．６、例えば、２．５のＩＮＲを有する。
【0068】
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に、より低いＩＮＲ（または正常なＩＮＲ）を有する。例えば、対象は、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に、３．０以下（例えば、２．８未満、２．６未満、２．５未満、２．４未満、２．２未満、２．０未満、１．８未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．２未満、または１．０未満）のＩＮＲを有し得る。
【0069】
トロンビン生成
トロンビン生成アッセイは、蛍光ペプチドのトロンビン酵素切断および蛍光分子の放出の結果として生じる凝固促進剤を介した試料活性化後のトロンビンの産生を測定した。ピークトロンビンは、産生される最大トロンビンの尺度、ラグタイムは、トロンビン産生の開始までの時間、およびＥＴＰは、潜在的に産生される総トロンビンである。
トロンビン生成アッセイは、蛍光ペプチドのトロンビン酵素切断および蛍光分子の放出の結果として生じる凝固促進剤を介した試料活性化後のトロンビンの産生を測定した。ピークトロンビンは、産生される最大トロンビンの尺度、ラグタイムは、トロンビン産生の開始までの時間、およびＥＴＰは、潜在的に産生される総トロンビンである。
【0070】
いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に、約６０ｎＭ～約１７０ｎＭ、例えば、約６５ｎＭ～約１７０ｎＭ、例えば、約６５ｎＭ～約１２０ｎＭ、例えば、約８０ｎＭのピークトロンビンを有し得る。
【0071】
ＴＥＧは、経時的な凝血塊強度のプロットを介して内因性止血を評価する。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は、典型的には、開始試薬として使用される。ＴＥＧ波形（例えば、図１６を参照）は、凝血についての情報を提供し得る複数のパラメータを有する。
Ｒ時間＝反応時間－試験の開始から初期フィブリン形成までの待ち時間。
Ｋ＝動態－初期フィブリン形成の速度、ある特定のレベルの凝血塊強度（例えば、２０ｍｍの振幅）を達成するのにかかる時間
アルファ角＝ＲとＫとの間の線の傾き－凝血魂形成の速度を測定する。
ＭＡ＝最大振幅（ｍｍ）－フィブリン凝血塊の最終的な強度を表す。
Ａ３０＝最大振幅に到達した３０分後の振幅－溶解相の速度を表す。
Ｒ時間＝反応時間－試験の開始から初期フィブリン形成までの待ち時間。
Ｋ＝動態－初期フィブリン形成の速度、ある特定のレベルの凝血塊強度（例えば、２０ｍｍの振幅）を達成するのにかかる時間
アルファ角＝ＲとＫとの間の線の傾き－凝血魂形成の速度を測定する。
ＭＡ＝最大振幅（ｍｍ）－フィブリン凝血塊の最終的な強度を表す。
Ａ３０＝最大振幅に到達した３０分後の振幅－溶解相の速度を表す。
【0072】
凝固性低下状態の血液では、Ｒ時間は増加し、ＭＡは減少する。Ｒ時間は、典型的には、ＭＡよりも広い応答範囲を提供する。
【0073】
総血栓形成分析システム（Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）、ＦＵＪＩＭＯＲＩ ＫＯＧＹＯ ＣＯ．，ＬＴＤ）では、試料は、鉱油を使用して、コラーゲンでコーティングされたマイクロチャネルを通される。圧力の変化は、血栓形成を評価するために使用される。閉塞開始時間は、１０ｋＰａに到達するのにかかる時間であり、閉塞時間は、ＡＲチップ（例えば、Ｚａｃｒｏｓ品目番号、ＴＣ０１０１）を使用して各Ｄ８０ｋＰａに到達するのにかかる時間である。メーカーによれば、ＡＲチップは、主にフィブリンおよび活性化された血小板からなる混合された白色血栓の形成を分析するために使用され得る。これは、コラーゲンおよび組織因子でコーティングされた流路（幅３００μｍ×高さ５０μｍ）を有し、凝血機能および血小板機能を分析するために使用され得る。比較して、ＰＬチップは、主に活性化された血小板からなる血小板血栓の形成を分析するために使用され得る。ＰＬチップは、コラーゲンのみでコーティングされた流路を有し、血小板機能を分析するために使用され得る。
【0074】
ＡＣＴアッセイは、凝血時間（ｔＡＣＴ）を測定するための最も基本的であるが、恐らく最も確かな方法であり、その周囲に凝血塊が形成されるときの磁石の重力に対する抵抗によって決定される。典型的なドナーの血液は、ＣａＣｌ２のみを使用して、約２００～３００秒のｔＡＣＴを有する。
【0075】
いくつかの実施形態は、対象におけるトロンビン生成を増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0076】
いくつかの実施形態は、対象におけるトロンビン生成を増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0077】
いくつかの実施形態は、対象におけるピークトロンビンを増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0078】
いくつかの実施形態は、対象におけるピークトロンビンを増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0079】
いくつかの実施形態では、投与の前に、対象のピークトロンビンは、６６ｎＭ未満（例えば、６４ｎＭ、６２ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭ未満）であった。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象のピークトロンビンは、６６ｎＭ超（例えば、６８ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、または１５０ｎＭ超）である。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象のピークトロンビンは、６６～１６６ｎＭである。ピークトロンビンは、任意の適切な方法によって測定され得る。
【0080】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、対象を治療するのに有効な、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の量を含む、組成物の量である。そのような量の血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、任意の適切な投与量の、対象に投与され得る本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ある用量の血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物は、約１．０×１０７粒子～約１．０×１０１０粒子、例えば、約１．６×１０７粒子（例えば、トロンボソーム）／ｋｇ～約１．０×１０１０粒子／ｋｇ（例えば、約１．６×１０７～約５．１×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約３．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約１．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約５．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約１．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約５．０×１０７粒子／ｋｇ、約５．０×１０７～約１．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．０×１０８～約５．０×１０８粒子／ｋｇ、約５．０×１０８～約１．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．０×１０９～約５．０×１０９粒子／ｋｇ、または約５．０×１０９～約１．０×１０１０粒子／ｋｇ）を含み得る。
【0081】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、局所投与される。いくつかの実施形態では、局所投与は、溶液、クリーム、ゲル、懸濁液、パテ、粒子、または粉末を介した投与を含み得る。いくつかの実施形態では、米国特許出願第１５／７７６，２５５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対応するＰＣＴ公開第Ｗ０２０１７／０４０２３８号（例えば、段落［０１３］～［０６９］）に記載のように、局所投与は、包帯（例えば、接着包帯または圧縮包帯）または医療的閉鎖（例えば、縫合、ステープル）を介した投与を含み得、例えば、血小板誘導体は、その中に埋め込まれ得る。
【0082】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、非経口投与される。
【0083】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与される。
【0084】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内投与される。
【0085】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、髄腔内投与される。
【0086】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、皮下投与される。
【0087】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、腹腔内投与される。
【0088】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、投与工程の前に乾燥される。本方法のいくつかの実施形態では、組成物は、投与工程の前に凍結乾燥される。本方法のいくつかの実施形態では、組成物は、乾燥工程または凍結乾燥工程の後に再水和される。
【0089】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））、アルガトロバン、またはヒルジンなどの抗第Ｉｌａ因子剤；リバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））、アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））、エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標））、またはフォンダパリヌクス（例えば、ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標））などの抗第Ｘａ因子剤；ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））およびヘパリン／ＬＭＷＨ（低分子ヘパリン）などの従来の抗凝固剤；ハーブサプリントなどのサプリメント、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。サプリメントの例としては、ニンニク、補酵素ＣｏＱ１０、グルコサミン、グルコサミン－コンドロイチンスルフェートが挙げられる。ハーブサプリメントの非限定的な例は、ニンニクである。
【0090】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ダビガトラン（例えば、ＰＲＡＤＡＸＡ（登録商標））である。
【0091】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アルガトロバンである。
【0092】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヒルジンである。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、リバーロキサバン（例えば、ＸＡＲＥＬＴＯ（登録商標））である。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アピキサバン（例えば、ＥＬＩＱＵＩＳ（登録商標））である。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、エドキサバン（例えば、ＳＡＶＡＹＳＡ（登録商標））である。
【0096】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、フォンダパリヌクス（例えば、ＡＲＩＸＴＲＡ（登録商標））である。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリンまたは低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。
【0098】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ワルファリン（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））である。
【0099】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、チファコギンである。
【0100】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、第ＶＩＩａｉ因子である。
【0101】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＳＢ２４９４１７である。
【0102】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ペグニバコギン（アニバメルセンを含むか、または含まない）である。
【0103】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＴＴＰ８８９である。
【0104】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、イドラパリヌクスである。
【0105】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、イドラビオタパリヌクスである。
【0106】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＳＲ２３７８１Ａである。
【0107】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アピキサバンである。
【0108】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ベトリキサバンである。
【0109】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、レピルジンである。
【0110】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ビバリルジンである。
【0111】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、キシメラガトランである。
【0112】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、フェンプロクモンである。
【0113】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アセノクマロールである。
【0114】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、インダンジオンである。
【0115】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、フルインジオンである。
【0116】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、サプリメントである。
【0117】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ハーブサプリメントである。
【0118】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物を再水和することは、血小板に水性液体を添加することを含む。いくつかの実施形態では、水性液体は、水である。いくつかの実施形態では、水性液体は、水溶液（例えば、緩衝液）である。いくつかの実施形態では、水性液体は、生理食塩水である。いくつかの実施形態では、水性液体は、懸濁液である。
【0119】
いくつかの実施形態では、再水和された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、４０国際単位（ＩＵ）以上での凝血に関連するすべての個々の因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子）を示す凝固因子レベルを有する。
【0120】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約１０％未満、例えば、約８％未満、例えば、約６％未満、例えば、約４％未満、例えば、約２％未満、例えば、約０．５％未満の血小板膜の架橋を、膜上に存在するタンパク質および／または脂質を介して有する。いくつかの実施形態では、再水和された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約１０％未満、例えば、約８％未満、例えば、約６％未満、例えば、約４％未満、例えば、約２％未満、例えば、約０．５％未満の血小板膜の架橋を、膜上に存在するタンパク質および／または脂質を介して有する。
【0121】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、少なくとも約０．２μｍ（例えば、少なくとも約０．３μｍ、少なくとも約０．４μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約０．６μｍ、少なくとも約０．７μｍ、少なくとも約０．８μｍ、少なくとも約０．９μｍ、少なくとも約１．０μｍ、少なくとも約１．２μｍ、少なくとも約１．５μｍ、少なくとも約２．０μｍ、少なくとも約２．５μｍ、または少なくとも約５．０μｍ）の粒径（例えば、直径、最大寸法）を有する。いくつかの実施形態では、粒径は、約５．０μｍ未満（例えば、約２．５μｍ未満、約２．０μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１．０μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．８μｍ未満、約０．７μｍ未満、約０．６μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、または約０．３μｍ未満）である。いくつかの実施形態では、粒径は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）である。
【0122】
いくつかの実施形態では、少なくとも５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の最大９９％（例えば、最大約９５％、最大約８０％、最大約７５％、最大約７０％、最大約６５％、最大約６０％、最大約５５％、または最大約５０％）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の約５０％～約９９％（例えば、約５５％～約９５％、約６０％～約９０％、約６５％～約８５％、約７０％～約８０％）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲にある。
【0123】
いくつかの実施形態では、血小板は、対象を治療する前に、例えば液体培地中で、単離される。
【0124】
いくつかの実施形態では、血小板は、ドナー由来の血小板である。いくつかの実施形態では、血小板は、アフェレーシス工程を含むプロセスによって得られる。いくつかの実施形態では、血小板は、プールされた血小板である。
【0125】
いくつかの実施形態では、血小板は、複数のドナーからプールされる。複数のドナーからプールされたそのような血小板は、本明細書では、プールされた血小板とも称され得る。いくつかの実施形態では、ドナーは、５人より多い、例えば、１０人より多い、例えば、２０人より多い、例えば、５０人より多い、例えば、最大約１００人のドナーである。いくつかの実施形態では、ドナーは、約５～約１００人、例えば、約１０～約５０人、例えば、約２０～約４０人、例えば、約２５～約３５人である。プールされた血小板は、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを作製するために使用され得る。
【0126】
いくつかの実施形態では、血小板は、インビトロで誘導される。いくつかの実施形態では、血小板は、培養物中で誘導されるか、または調製される。いくつかの実施形態では、血小板の調製は、巨核球の培養物から血小板を誘導または増殖することを含む。いくつかの実施形態では、血小板の調製は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ＰＣＳ）の培養物から血小板（または巨核球）を誘導または増殖することを含む。
【0127】
したがって、いくつかの実施形態では、血小板は、本明細書に記載の対象を治療する前に調製される。いくつかの実施形態では、血小板は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、血小板は、凍結保存される。
【0128】
いくつかの実施形態では、血小板またはプールされた血小板は、インキュベーション剤とのインキュベーションの前に、約６．０～約７．４のｐＨに酸性化され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を約６．５～約６．９のｐＨに酸性化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を約６．６～約６．８のｐＨに酸性化することを含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、プールされた血小板にクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含む溶液を添加することを含む。
【0129】
いくつかの実施形態では、血小板は、インキュベーション剤とのインキュベーションの前に単離される。いくつかの実施形態では、本方法は、遠心分離を使用することによって血小板を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１０００×ｇ～約２０００×ｇの相対的遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１３００×ｇ～約１８００×の相対遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１５００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１分～約６０分間行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１０分～約３０分間行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約３０分間行われる。
【0130】
インキュベーション剤は、任意の適切な成分を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、液体培地を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、および血液もしくは血液製剤中に見出され得るか、または血小板を乾燥させるのに有用であることが既知である任意の他の塩、あるいはこれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含み得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、および血液または血液製剤中に見出され得る任意の他の塩などの１つ以上の塩を含む。例示的な塩としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣ１）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約０．５ｍＭ～約１００ｍＭの１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約０．５ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、約０．５～約２ｍＭ、約２ｍＭ～約９０ｍＭ、約２ｍＭ～約６ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約６０ｍＭ～約９０ｍＭ、約７０～約８５ｍＭ）の１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、または約８０ｍＭの１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびその２つの組み合わせから選択される１つ以上の塩を、約０．５ｍＭ～約２ｍＭの濃度で含む。
【0132】
好ましくは、これらの塩は、全血中に見出されるのとほぼ同じ量で、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物中に存在する。
【0133】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、担体タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、約０．０５％～約１．０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【0134】
インキュベーション剤は、血小板に対して非毒性であり、かつ本明細書に提供されるプロセス中に溶液が曝露される温度で溶液に適切な緩衝能力を提供する、任意の緩衝液であり得る。したがって、緩衝液は、リン酸緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、重炭酸塩／炭酸、例えば、重炭酸ナトリウム緩衝液、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびトリス系緩衝液、例えば、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などの、市販の既知の生体適合性緩衝液のうちのいずれかを含み得る。同様に、これは、以下の緩衝液：プロパン－１，２，３－トリカルボン酸（トリカルバリル酸）；ベンゼンペンタカルボン酸；マレイン酸；２，２－ジメチルコハク酸；ＥＤＴＡ；３，３－ジメチルグルタル酸；ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノ－トリス（ヒドロキシメチル）－メタン（ＢＩＳ－ＴＲＩＳ）；ベンゼンヘキサカルボン酸（メリト酸）；Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ－二酢酸（ＡＤＡ）；ブタン－１，２，３，４－テトラカルボン酸；ピロリン酸；１，１－シクロペンタン二酢酸（３，３－テトラメチレン－グルタル酸）；ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；１，１－シクロヘキサン二酢酸；３－６－エンドメチレン－１，２，３，６－テトラヒドロフタル酸（ＥＭＴＡ；ＥＮＤＣＡ）；イミダゾール；２－（アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＣＨＯＬＡＭＩＮＥ）；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；２－メチルプロパン－１，２，３－トリスカルボン酸（ベータ－メチルトリカルバリル酸）；２－（Ｎ－モルホリノ）プロパン－スルホン酸（ＭＯＰＳ）；リン酸；およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、１つ以上の緩衝液、例えば、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、または重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５～約１００ｍＭの１つ以上の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、１つ以上の緩衝液の約５～約５０ｍＭ（例えば、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ）を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、または約３０ｍＭの１つ以上の緩衝液を含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース、マンノース、デキストロース、およびキシロースを含む、単糖および二糖などの１つ以上の糖を含む。いくつかの実施形態では、糖は、単糖である。いくつかの実施形態では、糖は、二糖である。いくつかの実施形態では、糖は、単糖、二糖、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、糖は、非還元性二糖である。いくつかの実施形態では、糖は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース（例えば、デキストロース）、マンノース、またはキシロースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、トレハロースを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、デンプンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、スクロースおよびエピクロロヒドリンのポリマーであるポリスクロースを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約１０ｍＭ～約１，０００ｍＭの１つ以上の糖を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５０～約５００ｍＭの１つ以上の糖を含む。実施形態では、１つ以上の糖は、１０ｍＭ～５００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の糖は、５０ｍＭ～２００ｍＭの量で存在する。実施形態では、１つ以上の糖は、１００ｍＭ～１５０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の糖は、凍結乾燥剤であり、例えば、いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、トレハロース、ポリスクロース、またはそれらの組み合わせを含む。
【0136】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物は、水または生理食塩水のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、ＤＭＳＯを含み得る。
【0137】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、アルコール（例えば、エタノール）などの有機溶媒を含む。そのようなインキュベーション剤において、溶媒の量は、０．１％～５．０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５．０％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．３％（ｖ／ｖ）～約３．０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
【0138】
いくつかの実施形態では、好適な有機溶媒としては、アルコール、エステル、ケトン、エーテル、ハロゲン化溶媒、炭化水素、ニトリル、グリコール、硝酸アルキル、水、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、好適な有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、ジオキサン（例えば、１，４－ジオキサン）、アセトニトリル、プロピオニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、アニソール、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、エチレングリコール、ニトロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルアミド、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノール、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノール、ＤＭＳＯ、またはそれらの組み合わせを含む。エタノールなどの有機溶媒の存在は、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソーム（例えば、凍結乾燥された血小板誘導体）の処理において有益であり得る。
【0139】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、水性培地の存在下で血小板にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、ＤＭＳＯを含む培地の存在下でインキュベートされる。
【0140】
いくつかの実施形態では、１つ以上の他の成分は、血小板内でインキュベートされ得る。例示的な成分は、インキュベーションプロセス中の血小板凝集および活性化を防止するために、プロスタグランジンＥｌもしくはプロスタシクリン、および／またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡを含み得る。
【0141】
使用され得るインキュベーション剤組成物の非限定的な例を表１～５に示す。
【0142】
（表１）
【0143】
（表２）
【0144】
（表３）
表３．緩衝液Ｂは、例えば、フローサイトメトリーのために血小板をインキュベートする場合に使用され得る。このようなインキュベーションは、暗所で室温で行われ得る。アルブミンは、緩衝液Ｂの任意選択的な成分である。
【0145】
（表４）
【0146】
表４は、別の例示的なインキュベーション剤である。ｐＨは、ＮａＯＨで７．４に調節され得る。アルブミンは、緩衝液Ｂの任意選択的な成分である。
【0147】
（表５）
【0148】
表５は、別の例示的なインキュベーション剤である。
【0149】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、１５～４５℃の異なる温度、または約３７℃で、異なる持続時間、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0150】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、１０，０００血小板／μＬ～１０，０００，０００血小板／μＬ、例えば、５０，０００血小板／μＬ～２，０００，０００血小板／μＬ、例えば、１００，０００血小板／μＬ～５００，０００血小板／μＬ、例えば、１５０，０００血小板／μＬ～３００，０００血小板／μＬ、例えば、２００，０００血小板／μＬの濃度で液体培地を含むインキュベーション剤において懸濁液を形成する。
【0151】
血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、例えば、少なくとも約５分間（例えば、少なくとも約２０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、または少なくとも約４８時間）などの異なる持続時間、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板は、約４８時間以内（例えば、約２０分間以内、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、または約４２時間以内）、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板は、約１０分間～約４８時間（例えば、約２０分間～約３６時間、約３０分間～約２４時間、約１時間～約２０時間、約２時間～約１６時間、約１０分間～約２４時間、約２０分間～約１２時間、約３０分間～約１０時間、または約１時間～約６時間）、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームは、５分間～４８時間、例えば、１０分間～２４時間、例えば、２０分間～１２時間、例えば、３０分間～６時間、例えば、１時間～３時間、例えば、約２時間という期間、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0152】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、異なる温度で、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４℃～４５℃、例えば、１５℃～４２℃で実施される。例えば、実施形態では、インキュベーションは、３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で、１１０～１３０（例えば、１２０）分間、および２４～４８時間もの長さにわたって実施される。いくつかの実施形態では、血小板は、本明細書に開示されるような異なる持続時間、かつ１５～４５℃、または約３７℃の温度で、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0153】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）に、１つ以上の活性剤が充填される。いくつかの実施形態では、血小板に、抗線溶剤が充填され得る。抗線溶剤の非限定的な例としては、ｅ－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、およびフィブリノゲンが挙げられる。
【0154】
血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）に活性剤（例えば、抗線溶剤）を充填することは、任意の適切な方法によって実施され得る。例えば、ＰＣＴ公開番号第Ｗ０２０２０／１１３０９０（Ａ１）号、同第Ｗ０２０２０／１１３１０１（Ａ１）号、同第Ｗ０２０２０／１１３０３５（Ａ１）号、および同第Ｗ０２０２０／１１２９６３（Ａ１）号を参照されたい。一般に、充填は、血小板を抗線溶剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、充填は、活性剤をインキュベーション剤と組み合わせることによって実施され得る。いくつかの実施形態では、充填は、インキュベーション工程とは別個の工程で実施され得る。例えば、充填は、インキュベーション工程の前の工程で実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、活性剤は、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれかにおいて溶液または懸濁液として血小板に供給され得、これは、インキュベーション工程に使用されるインキュベーション剤と同一であり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態では、充填工程は、インキュベーション工程中に実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、活性剤は、（例えば、インキュベーション中に、固体として、または溶液もしくは懸濁液において）インキュベーション剤に添加され得る。いくつかの実施形態では、充填工程は、インキュベーション工程の後の工程において実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれかにおいて溶液または懸濁液として血小板に供給され得、これは、インキュベーション工程に使用されるインキュベーション剤と同一であり得るか、または異なり得る。
【0155】
活性剤は、任意の適切な濃度で血小板に適用され得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、約１μＭ～約１００ｍＭ（例えば、約１μＭ～約１０μｍ、約１μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約１００μＭ、約１μＭ～約５００μＭ、約１μＭ～約１ｍＭ、約１μＭ～約１０ｍＭ、約１μＭ～約２５ｍＭ、約１μＭ～約５０ｍＭ、約１μＭ～約７５ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約５０μＭ～約１００ｍＭ、約１００μＭ～約１００ｍＭ、約５００μＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約２００μＭ～約１ｍＭ、約８００μＭ～約９００μＭ、約４００μＭ～約８００μＭ、約５００μＭ～約７００μＭ、約６００μＭ、約５ｍＭ～約８５ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３５ｍＭ～約６５ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４５ｍＭ～約５５ｍＭ、または約５０ｍＭ）の濃度で（インキュベーション剤または別の溶液もしくは懸濁液の一部として）血小板に適用され得る。
【0156】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、血小板を凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）することを含む。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、血小板を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程から得られた血小板を再水和することをさらに含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、血小板は、療法または機能アッセイに使用する前に、（例えば、トロンボソームを生成するために）低温貯蔵されるか、凍結保存されるか、または凍結乾燥される。
【0158】
５％未満の最終残留水分含有量を達成し得る限り、血小板を乾燥させるための任意の既知の技術が、本開示に従って使用され得る。好ましくは、本技術は、２％未満、例えば、１％、０．５％、または０．１％の最終残留水分含有量を達成する。好適な技術の非限定的な例は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））および噴霧乾燥である。好適な凍結乾燥法を、表Ａに提示する。追加の例示的な凍結乾燥法は、米国特許第７，８１１，５５８号、米国特許第８，４８６，６１７号、および米国特許第８，０９７，４０３号に見出され得る。例示的な噴霧乾燥法は、窒素を乾燥ガスとして、本開示によるインキュベーション剤と組み合わせること、次いで、二流体ノズル構成を有するＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ，ＵＳＡ）製のＧＥＡ Ｍｏｂｉｌｅ Ｍｉｎｏｒ噴霧乾燥機に混合物を導入すること、混合物を１５０℃～１９０℃の範囲の入口温度、６５℃～１００℃の範囲の出口温度、０．５～２．０バールの範囲の原子速度、５～１３ｋｇ／時の範囲の原子速度、６０～１００ｋｇ／時の範囲の窒素使用、および１０～３５分間の実行時間で噴霧することを含む。噴霧乾燥における最終工程は、乾燥混合物を優先的に収集することである。いくつかの実施形態における乾燥組成物は、－２０℃以下～９０℃以上の範囲である温度で、少なくとも６か月間安定である。
【0159】
（表Ａ）例示的な凍結乾燥プロトコル
【0160】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように得られる血小板を乾燥させる工程、例えば、本明細書に開示されるように得られる血小板を凍結乾燥させる工程は、血小板を凍結乾燥剤（例えば、非還元性二糖）とともにインキュベートすることを含む。したがって、いくつかの実施形態では、血小板を調製するための方法は、血小板を凍結乾燥剤とともにインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、糖である。いくつかの実施形態では、糖は、非還元性二糖などの二糖である。
【0161】
いくつかの実施形態では、血小板は、血小板を凍結乾燥剤とともにインキュベートするのに十分な時間、かつ好適な温度で、凍結乾燥剤とともにインキュベートされる。好適な凍結乾燥剤の非限定的な例は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース（例えば、デキストロース）、マンノース、およびキシロースを含む、単糖および二糖などの糖である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤の非限定的な例としては、血清アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプン、およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例示的な凍結乾燥剤としては、高分子量ポリマーが挙げられ得る。「高分子量」とは、約７０ｋＤａ以上かつ最大１，０００，０００ｋＤａの平均分子量を有するポリマーを意味する。非限定的な例は、スクロースおよびエピクロロヒドリンのポリマー（例えば、ポリスクロース）である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、ポリスクロースである。任意の量の高分子量ポリマーが凍結乾燥剤として使用され得るが、約３％～１０％（ｗ／ｖ）、例えば、３～７％、例えば、６％の最終濃度を達成する量が使用されることが好ましい。
【0162】
本明細書に開示される組成物に使用するための例示的な糖は、トレハロースである。糖の同一性にかかわらず、糖は、任意の好適な量で組成物中に存在し得る。例えば、糖は、１ｍＭ～１Ｍの量で存在し得る。実施形態では、糖は、１０ｍＭ～５００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、糖は、２０ｍＭ～２００ｍＭの量で存在する。実施形態では、糖は、４０ｍＭ～１００ｍＭの量で存在する。様々な実施形態では、糖は、上に列挙された範囲内の異なる特定の濃度で存在し、当業者は、本明細書で各々を具体的に列挙する必要なしに、様々な濃度を即座に理解することができる。複数の糖が組成物中に存在する場合、各糖は、上に列挙された範囲および特定の濃度に応じた量で存在し得る。
【0163】
本明細書に提供される組成物を作製するための本明細書に提供されるプロセス内で、凍結乾燥剤の添加は、乾燥の前の最後の工程であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、または他の成分などの組成物の他の成分と同時に、またはその前に添加される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、インキュベーション剤に添加され、完全に混合されて乾燥溶液を形成し、乾燥容器（例えば、ガラスまたはプラスチックの血清バイアル、凍結乾燥バッグ）中に分配され、溶液を乾燥させて乾燥組成物を形成することを可能にする条件に供される。
【0164】
血小板を凍結保護剤とともにインキュベートする工程は、温度と併せて、凍結保護剤が血小板に接触するのに十分な、好ましくは、少なくともある程度まで血小板に組み込まれるのに十分な時間と同程度の長さである、充填に好適な時間、血小板をインキュベートすることを含み得る。実施形態では、インキュベーションは、約１分間～約１８０分間以上行われる。
【0165】
血小板を凍結保護剤とともにインキュベートする工程は、割り当てられた時間の量と併せて選択される場合、インキュベートに好適な温度で、血小板および凍結保護剤をインキュベートすることを含み得る。一般に、組成物は、凍結を上回る温度で、凍結保護剤が血小板に接触するのに少なくとも十分な時間、インキュベートされる。実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、２０℃～４２℃で実施される。例えば、実施形態では、インキュベーションは、１１０～１３０（例えば、１２０）分間、３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で実施される。
【0166】
様々な実施形態では、凍結乾燥バッグは、ガスが、処理中にバッグの少なくとも一部または全部を通過することを可能にするように構成された、ガス透過性バッグである。ガス透過性バッグは、バッグの内部内のガスを、周囲環境に存在する大気ガスと交換することを可能にし得る。ガス透過性バッグは、酸素、窒素、水、空気、水素、および二酸化炭素などのガスに対して透過性であり得、本明細書に提供される組成物においてガス交換が生じることを可能にする。いくつかの実施形態では、ガス透過性バッグは、二酸化炭素がバッグの壁を通って透過することを可能にすることによって、
バッグの内部内に存在する二酸化炭素の一部の除去を可能にする。いくつかの実施形態では、バッグからの二酸化炭素の放出は、バッグ内に収容される組成物の所望のｐＨレベルを維持するのに有利であり得る。
バッグの内部内に存在する二酸化炭素の一部の除去を可能にする。いくつかの実施形態では、バッグからの二酸化炭素の放出は、バッグ内に収容される組成物の所望のｐＨレベルを維持するのに有利であり得る。
【0167】
いくつかの実施形態では、本明細書におけるプロセスの容器は、閉鎖または密封されたガス透過性容器である。いくつかの実施形態では、容器は、閉鎖または密封され、かつその一部がガス透過性である、容器である。いくつかの実施形態では、容器に収容される製品の体積に対する、閉鎖または密封された容器（例えば、バッグ）のガス透過性部分の表面積（以下、「ＳＡ／Ｖ比」と称される）は、本明細書に提供される組成物のｐＨ維持を改善するように調整され得る。例えば、いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、少なくとも約２．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、少なくとも約２．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．９ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．０ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．９ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．０ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．９ｃｍ２／ｍＬ、または少なくとも約５．０ｃｍ２／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、最大約１０．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、最大約９．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．１ｃｍ２／ｍＬ、または最大約４．０ｃｍ２／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、約２．０～約１０．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、約２．１ｃｍ２／ｍＬ～約９．９ｃｍ２／ｍＬ、約２．２ｃｍ２／ｍＬ～約９．８ｃｍ２／ｍＬ、約２．３ｃｍ２／ｍＬ～約９．７ｃｍ２／ｍＬ、約２．４ｃｍ２／ｍＬ～約９．６ｃｍ２／ｍＬ、約２．５ｃｍ２／ｍＬ～約９．５ｃｍ２／ｍＬ、約２．６ｃｍ２／ｍＬ～約９．４ｃｍ２／ｍＬ、約２．７ｃｍ２／ｍＬ～約９．３ｃｍ２／ｍＬ、約２．８ｃｍ２／ｍＬ～約９．２ｃｍ２／ｍＬ、約２．９ｃｍ２／ｍＬ～約９．１ｃｍ２／ｍＬ、約３．０ｃｍ２／ｍＬ～約９．０ｃｍ２／ｍＬ、約３．１ｃｍ２／ｍＬ～約８．９ｃｍ２／ｍＬ、約３．２ｃｍ２／ｍＬ～約８．８ｃｍ２／ｍＬ、約３．３ｃｍ２／ｍＬ～約８．７ｃｍ２／ｍＬ、約３．４ｃｍ２／ｍＬ～約８．６ｃｍ２／ｍＬ、約３．５ｃｍ２／ｍＬ～約８．５ｃｍ２／ｍＬ、約３．６ｃｍ２／ｍＬ～約８．４ｃｍ２／ｍＬ、約３．７ｃｍ２／ｍＬ～約８．３ｃｍ２／ｍＬ、約３．８ｃｍ２／ｍＬ～約８．２ｃｍ２／ｍＬ、約３．９ｃｍ２／ｍＬ～約８．１ｃｍ２／ｍＬ、約４．０ｃｍ２／ｍＬ～約８．０ｃｍ２／ｍＬ、約４．１ｃｍ２／ｍＬ～約７．９ｃｍ２／ｍＬ、約４．２ｃｍ２／ｍＬ～約７．８ｃｍ２／ｍＬ、約４．３ｃｍ２／ｍＬ～約７．７ｃｍ２／ｍＬ、約４．４ｃｍ２／ｍＬ～約７．６ｃｍ２／ｍＬ、約４．５ｃｍ２／ｍＬ～約７．５ｃｍ２／ｍＬ、約４．６ｃｍ２／ｍＬ～約７．４ｃｍ２／ｍＬ、約４．７ｃｍ２／ｍＬ～約７．３ｃｍ２／ｍＬ、約４．８ｃｍ２／ｍＬ～約７．２ｃｍ２／ｍＬ、約４．９ｃｍ２／ｍＬ～約７．１ｃｍ２／ｍＬ、約５．０ｃｍ２／ｍＬ～約６．９ｃｍ２／ｍＬ、約５．１ｃｍ２／ｍＬ～約６．８ｃｍ２／ｍＬ、約５．２ｃｍ２／ｍＬ～約６．７ｃｍ２／ｍＬ、約５．３ｃｍ２／ｍＬ～約６．６ｃｍ２／ｍＬ、約５．４ｃｍ２／ｍＬ～約６．５ｃｍ２／ｍＬ、約５．５ｃｍ２／ｍＬ～約６．４ｃｍ２／ｍＬ、約５．６ｃｍ２／ｍＬ～約６．３ｃｍ２／ｍＬ、約５．７ｃｍ２／ｍＬ～約６．２ｃｍ２／ｍＬ、または約５．８ｃｍ２／ｍＬ～約６．１ｃｍ２／ｍＬの範囲であり得る。
【0168】
ガス透過性の閉鎖された容器（例えば、バッグ）またはその一部は、１つ以上の様々なガス透過性材料で作製され得る。いくつかの実施形態では、ガス透過性バッグは、フルオロポリマー（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）ポリマーなど）、ポリオレフィン（低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）など）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、シリコーン、およびそれらの任意の組み合わせを含む、１つ以上のポリマーから作製され得る。
【0169】
いくつかの実施形態では、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、熱処理を受け得る。加熱は、約２５℃超（例えば、約４０℃超、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃以上）の温度で実施され得る。いくつかの実施形態では、加熱は、約７０℃～約８５℃（例えば、約７５℃～約８５℃、または約７５℃もしくは８０℃）で実行される。加熱の温度は、加熱が実施される時間の長さと併せて選択され得る。任意の好適な時間が使用され得るが、典型的には、凍結乾燥された血小板は、少なくとも１時間、ただし３６時間以下、加熱される。したがって、実施形態では、加熱は、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間実施される。例えば、凍結乾燥された血小板は、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、または３０時間加熱され得る。非限定的な例示的な組み合わせとしては、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を３０℃超の温度で少なくとも３０分間加熱すること、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を５０℃超の温度で少なくとも１０時間加熱すること、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を７５℃超の温度で少なくとも１８時間加熱すること、および乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を８０℃で２４時間加熱することが挙げられる。いくつかの実施形態では、加熱は、キャップ付きバイアルなどの密封された容器内で実施され得る。いくつかの実施形態では、密封された容器は、加熱の前に真空に供される。特にアルブミンまたはポリスクロースなどの凍結保護剤の存在下での熱処理工程は、凍結乾燥された血小板の安定性および貯蔵寿命を改善させることが見出されている。実際に、熱処理工程なしの凍結乾燥保護剤と比較して、血清アルブミンまたはポリスクロースと、凍結乾燥後の熱処理工程との特定の組み合わせで、有利な結果が得られている。凍結保護剤（例えば、スクロース）は、任意の適切な量（例えば、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の質量または体積で約３％～約１０％）で存在し得る。
【0170】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤とのインキュベーションを含むプロセスによって本明細書に開示されるように調製された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、インキュベーションの前に血小板の貯蔵安定性と少なくともほぼ等しい貯蔵安定性を有する。
【0171】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体を投与する前に、血小板または血小板誘導体を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結保存することをさらに含む。
【0172】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程の後に組成物を加熱することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程または加熱工程の後に組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0173】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程の後に組成物を加熱することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程または加熱工程の後に組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0174】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームを投与する前に、血小板、血小板誘導体またはトロンボソームを（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）低温貯蔵することをさらに含む。
【0175】
貯蔵条件は、例えば、標準的な室温貯蔵（例えば、約２０～約３０℃の範囲の温度での貯蔵）または低温貯蔵（例えば、約１～約１０℃の範囲の温度での貯蔵）を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結保存すること、凍結乾燥させること、解凍すること、再水和すること、およびそれらの組み合わせをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）（例えば、トロンボソームを形成するために）乾燥させる（例えば、凍結乾燥させる）ことをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程から得られた組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0176】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む組成物が本明細書に提供され、この組成物は、新鮮な血小板を得るプロセス、任意選択的に血小板をＤＭＳＯ中でインキュベートするプロセス、遠心分離によって血小板を単離するプロセス、血小板をトレハロースおよびエタノールを含むインキュベーション剤中に再懸濁させ、それによって第１の混合物を形成するプロセス、第１の混合物をインキュベートするプロセス、ポリスクロースを第１の混合物と混合し、それによって第２の混合物を形成するプロセス、ならびに第２の混合物を凍結乾燥させて、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む凍結乾燥された組成物を形成するプロセスによって作製されている。
【0177】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む、凍結乾燥された血小板組成物を作製する方法が本明細書に提供され、この方法は、新鮮な血小板を得ることと、任意選択的に血小板をＤＭＳＯ中でインキュベートすることと、遠心分離によって血小板を単離することと、血小板をトレハロースおよびエタノールを含むインキュベーション剤中に再懸濁させ、それによって第１の混合物を形成することと、第１の混合物をインキュベートすることと、ポリスクロースを第１の混合物と混合することと、それによって第２の混合物を形成することと、第２の混合物を凍結乾燥させて、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む凍結乾燥された組成物を形成することと、を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板を作製するためのプロセスが本明細書に提供され、このプロセスは、単離された血小板を、少なくとも１つの糖の存在下で、以下の条件：２０℃～４２℃の温度下で、約１０分間～約１８０分間インキュベートすることと、血小板に少なくとも１つの凍結保護剤を添加することと、血小板を凍結乾燥させることと、を含み、このプロセスは、任意選択的に、インキュベーション工程と添加工程との間に血小板を単離することを含まず、任意選択的に、このプロセスは、血小板を血小板活性化阻害剤に曝露することを含まない。凍結保護剤は、多糖（例えば、ポリスクロース）であり得る。このプロセスは、凍結乾燥された血小板を、７０℃～８０℃の温度で８～２４時間加熱することをさらに含み得る。血小板に少なくとも１つの凍結保護剤を添加する工程は、血小板をエタノールに曝露することをさらに含み得る。少なくとも１つの糖の存在下で単離された血小板をインキュベートする工程は、少なくとも１つの糖の存在下でインキュベートすることを含み得る。少なくとも１つの糖の存在下で単離された血小板をインキュベートする工程は、少なくとも１つの糖の存在下でインキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１００分間～約１５０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１１０分間～約１３０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１２０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、３５℃～４０℃インキュベートすることを含み得る。インキュベートのための条件は、３７℃でインキュベートすることを含み得る。インキュベートのための条件は、３５℃～４０℃で１１０分間～１３０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、３７℃で１２０分間インキュベートすることを含み得る。少なくとも１つの糖は、トレハロース、スクロース、またはトレハロースとスクロースの両方であり得る。少なくとも１つの糖は、トレハロースであり得る。少なくとも１つの糖は、スクロースであり得る。
【0179】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板を調製する方法が本明細書に提供され、この方法は、血小板を提供することと、約１００ｍＭのトレハロースおよび約１％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む塩緩衝液中に血小板を懸濁させて、第１の組成物を作製することと、第１の組成物を約３７℃で約２時間インキュベートすることと、ポリスクロース（例えば、ポリスクロース４００）を約６％（ｗ／ｖ）の最終濃縮物に添加して、第２の組成物を作製することと、第２の組成物を凍結乾燥させて、凍結乾燥された血小板を作製することと、凍結乾燥された血小板を８０℃で２４時間加熱することと、を含む。
【0180】
本明細書に開示される特定の実施形態は、「～からなる」または「～から本質的になる」という言語を使用して、特許請求の範囲にさらに限定され得る。
【0181】
例示的な実施形態
実施形態１は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、方法である。
実施形態１は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、方法である。
【0182】
実施形態２は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって、この組成物が調製されている、方法である。
【0183】
実施形態３は、対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、方法である。
【0184】
実施形態４は、対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって、この組成物が調製されている、方法である。
【0185】
実施形態５は、対象を手術のために準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、方法である。
【0186】
実施形態６は、対象を手術のために準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって、この組成物が調製されている、方法である。
【0187】
実施形態７は、手術が、緊急手術である、実施形態５または６に記載の方法である。
【0188】
実施形態８は、手術が、予定された手術である、実施形態５または６に記載の方法である。
【0189】
実施形態９は、対象が、抗凝固剤によって治療されていたか、または治療されている、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法である。
【0190】
実施形態１０は、抗凝固剤による治療が、停止される、実施形態９に記載の方法である。
【0191】
実施形態１１は、抗凝固剤による治療が、継続される、実施形態９に記載の方法である。
【0192】
実施形態１２は、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、方法である。
【0193】
実施形態１３は、対象における抗凝固剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって、この組成物が調製されている、方法である。
【0194】
実施形態１４は、抗凝固剤の効果が、抗凝固剤の過剰摂取の結果である、実施形態１２または実施形態１３に記載の方法である。
【0195】
実施形態１５は、組成物が、抗線溶剤をさらに含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法である。
【0196】
実施形態１６は、抗線溶剤が、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、フィブリノゲン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１５に記載の方法である。
【0197】
実施形態１７は、血小板または血小板誘導体に、抗線溶剤が充填される、実施形態１５または実施形態１６に記載の方法である。
【0198】
実施形態１８は、抗凝固剤が、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９～１７のいずれか１つに記載の方法である。
【0199】
実施形態１９は、抗凝固剤が、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、低分子量ヘパリン、チファコギン、第ＶＩＩａｉ因子、ＳＢ２４９４１７、ペグニバコギン（アニバメルセンを含むか、または含まない）、ＴＴＰ８８９、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、ＳＲ２３７８１Ａ、アピキサバン、ベトリキサバン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン、フェンプロクモン、アセノクマロール、インダンジオン、フルインジオン、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９～１７のいずれか１つに記載の方法である。
【0200】
実施形態２０は、抗凝固剤が、ワルファリンである、実施形態１８または実施形態１９に記載の方法である。
【0201】
実施形態２１は、抗凝固剤が、ヘパリンである、実施形態１８または実施形態１９に記載の方法である。
【0202】
実施形態２２は、投与の前に、対象が、少なくとも４．０のＩＮＲを有した、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法である。
【0203】
実施形態２３は、投与の後に、対象が、３．０以下のＩＮＲを有する、実施形態２２に記載の方法である。
【0204】
実施形態２４は、投与の後に、対象が、２．０以下のＩＮＲを有する、実施形態２２に記載の方法である。
【0205】
実施形態２５は、投与の前に、対象が、少なくとも３．０のＩＮＲを有した、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法である。
【0206】
実施形態２６は、投与の後に、対象が、２．０以下のＩＮＲを有する、実施形態２５に記載の方法である。
【0207】
実施形態２７は、投与が、局所投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0208】
実施形態２８は、投与が、非経口投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0209】
実施形態２９は、投与が、静脈内投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0210】
実施形態３０は、投与が、筋肉内投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0211】
実施形態３１は、投与が、髄腔内投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0212】
実施形態３２は、投与が、皮下投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0213】
実施形態３３は、投与が、腹腔内投与を含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0214】
実施形態３４は、組成物が、投与工程の前に乾燥される、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法である。
【0215】
実施形態３５は、組成物が、乾燥工程の後に再水和される、実施形態３４に記載の方法である。
【0216】
実施形態３６は、組成物が、投与工程の前に凍結乾燥される。実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法である。
【0217】
実施形態３７は、組成物が、凍結乾燥工程の後に再水和される、実施形態３６に記載の方法である。
【0218】
実施形態３８は、インキュベーション剤が、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法である。
【0219】
実施形態３９は、インキュベーション剤が、担体タンパク質を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法である。
【0220】
実施形態４０は、緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法である。
【0221】
実施形態４１は、組成物が、１種以上の糖を含む、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法である。
【0222】
実施形態４２は、１種以上の糖が、トレハロースを含む、実施形態４１に記載の方法である。
【0223】
実施形態４３は、１種以上の糖が、ポリスクロースを含む、実施形態４１または実施形態４２に記載の方法である。
【0224】
実施形態４４は、１種以上の糖が、デキストロースを含む、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載の方法である。
【0225】
実施形態４５は、組成物が、有機溶媒を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載の方法である。
【0226】
実施形態４６は、血小板または血小板誘導体が、トロンボソームを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法である。
【実施例】
【0227】
実施例１
以下の結果は、一般的な抗凝固薬であるワルファリンを服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソーム製品の影響を実証する。ワルファリンは、ビタミンＫに依存する肝臓における多数の止血性血漿タンパク質の合成を阻害する。
以下の結果は、一般的な抗凝固薬であるワルファリンを服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソーム製品の影響を実証する。ワルファリンは、ビタミンＫに依存する肝臓における多数の止血性血漿タンパク質の合成を阻害する。
【0228】
トロンボソームおよび他の凍結乾燥された血小板製品は、外傷または止血不全の診断の後に患者の血流に注入されるように設計されている。ワルファリンを使用して患者をモデル化する以下の実施例では、トロンボソームを最初に血漿系システムに導入し、続いて実施例２では全血システムを導入して、インビボでの条件により近く模倣した。
【0229】
血漿モデルでは、トロンボソームは、トロンビン生成（ＴＧＡ）およびトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）アッセイにおいて顕著な改善を実証した。
【0230】
血漿モデルに使用される試料を、ワルファリン血漿（供給元：Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、様々なＩＮＲ値で）または多血小板血漿（ＰＲＰ）と、図１～図３に示される濃度で再水和されたトロンボソームを含むかまたは含まない、以下の表６に詳述される対照緩衝液とを、１：１の体積で組み合わせることによって調製した。ワルファリン血漿は、本薬剤を使用する患者から採取された血液から得た。ワルファリンは、止血性タンパク質の生物学的合成を阻害するため、エクスビボで添加することはできない。トロンボソームを、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。
【0231】
（表６）対照緩衝液の組成
【0232】
ＩＮＲが増加するにつれて、トロンビン生成は減少する。すべての用量にわたって、トロンボソームは、ピークトロンビンにおける顕著な改善を実証する。トロンボソームは各用量レベルで上昇を示すため、それらの有効性がワルファリンに関連していないことは明らかである。
【0233】
図１および図２に実証するように、トロンボソームは、実施例３に記載のトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）で評価される、血漿中のワルファリンのモデルにおけるトロンビン生成（凝血能力の尺度）に対して正の影響を有する。
【0234】
多血小板血漿試料の調製
（１）０型ドナーの全血を、クエン酸ナトリウム（ブルートップ）バキュテナーチューブ中に得る。
（２）血液を、１８０×ｇで２０分間、遠心分離する。
（３）緩衝液コートをそのまま残しながら、多血小板血漿を慎重にピペットで移す
（４）血漿試料中の血小板数を計測する。
（５）試料当たりの適切な数の血小板を、選択した血漿に補充する
（１）０型ドナーの全血を、クエン酸ナトリウム（ブルートップ）バキュテナーチューブ中に得る。
（２）血液を、１８０×ｇで２０分間、遠心分離する。
（３）緩衝液コートをそのまま残しながら、多血小板血漿を慎重にピペットで移す
（４）血漿試料中の血小板数を計測する。
（５）試料当たりの適切な数の血小板を、選択した血漿に補充する
【0235】
特に、図１に示すように、ピークトロンビン生成は、４００×１０３／μＬのトロンボソームをワルファリン血漿に添加することによって改善される。ピークトロンビンについての正常範囲を、６６～１６６ｎＭであると決定し、正常な血液状態（ＩＮＲ＝１）でのピークトロンビンの上昇が、合理的なトロンビンレベル外ではないことを示した。同様に、図２は、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ；トロンビン生成アッセイにおける曲線下面積として決定）が、１００×１０３／μＬのトロンボソームをワルファリン血漿に添加することによって改善されることを示す。
【0236】
図３は、ＩＮＲ２ワルファリン血漿中のトロンボソームおよび多血小板血漿（ＰＲＰ）によるピークトロンビン生成を示す。トロンボソームはさらに、血小板よりも多くのトロンビンを生成し、いかなる特定の理論または機序にも拘束されることなく、これは、恐らくトロンボソームの活性化の上昇に起因し得る。これは、追加のトロンビン生成が内因性凝血機序を刺激するため、インビボでの出血の減少が予測される。
【0237】
図４は、血液および血漿の粘弾性特性を測定するシステムである、実施例３に記載のトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）アッセイからのデータを取り上げる。図４にプロットされたＲ時間は、血漿モデルにおける凝血生成の速度と相関する。すべてのワルファリン用量間で、トロンボソームの添加により、Ｒ時間の減少を観察した。特に、３００×１０３／μＬのトロンボソームの添加は、ワルファリン血漿試料のＲ時間を実質的に減少させた（ＴＥＧアッセイ）。正常なＲ時間（約５～１０分）と比較して、トロンボソームの添加は、すべてのＩＮＲレベル間でＲ時間をほぼ完全に補正した。
【0238】
実施例２：全血アッセイ：
血漿中の影響が確立されると、トロンボソームを、ドナーの全血を使用して同様のワルファリンモデルに導入した。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。同等の抗凝固条件を生成するために、実施例３に記載のとおり、Ｏ型ドナーの血液の天然血漿を除去し、ワルファリン血漿で置き換えた。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。図５は、トロンボソームが、ピークトロンビン生成に対する用量依存的効果を提供することを示す。図５では、データは、１５０×１０３／μＬの内因性血小板数を有する全血のバックグラウンドにおいて収集した。図５では、特にＩＮＲ３．０および６．２において、ピークトロンビンの増加を観察した。インビトロでの（ＩＮＲ３での）ピークトロンビンにおけるおよそ５０％の増加は、トロンビン生成が最終的に凝血安定性を決定するため、インビボでの出血を有意に低下させると解釈し得る。
血漿中の影響が確立されると、トロンボソームを、ドナーの全血を使用して同様のワルファリンモデルに導入した。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。同等の抗凝固条件を生成するために、実施例３に記載のとおり、Ｏ型ドナーの血液の天然血漿を除去し、ワルファリン血漿で置き換えた。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。図５は、トロンボソームが、ピークトロンビン生成に対する用量依存的効果を提供することを示す。図５では、データは、１５０×１０３／μＬの内因性血小板数を有する全血のバックグラウンドにおいて収集した。図５では、特にＩＮＲ３．０および６．２において、ピークトロンビンの増加を観察した。インビトロでの（ＩＮＲ３での）ピークトロンビンにおけるおよそ５０％の増加は、トロンビン生成が最終的に凝血安定性を決定するため、インビボでの出血を有意に低下させると解釈し得る。
【0239】
実施例３：手順
全血試料の調製
（１）Ｏ型ドナーの全血を、クエン酸ナトリウム（ブルートップ）バキュテナーチューブ中に得る。
（２）血液を、２０００×ｇで１０分間、遠心分離する。
（３）緩衝液コートをそのまま残しながら、血漿を慎重にピペットで移す
（４）除去された血漿と同等の体積のＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）を添加し、全血を穏やかに再懸濁させる。
（５）血液を、２０００×ｇで１０分間、再び回転させる。
（６）緩衝液コートをそのまま残しながら、上澄みを慎重に除去する。
（７）測定されたヘマトクリットがドナーの新鮮な全血のヘマトクリットと同等になるまで、血液を、ワルファリン血漿、正常な血漿（機能対照）、または自己血漿（プロセス対照）中に増量的に再懸濁させる。
ａ．室温で最大４時間貯蔵する。
（８）任意の試料を実行する直前に、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、１：１の体積で組み合わせる。
全血試料の調製
（１）Ｏ型ドナーの全血を、クエン酸ナトリウム（ブルートップ）バキュテナーチューブ中に得る。
（２）血液を、２０００×ｇで１０分間、遠心分離する。
（３）緩衝液コートをそのまま残しながら、血漿を慎重にピペットで移す
（４）除去された血漿と同等の体積のＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）を添加し、全血を穏やかに再懸濁させる。
（５）血液を、２０００×ｇで１０分間、再び回転させる。
（６）緩衝液コートをそのまま残しながら、上澄みを慎重に除去する。
（７）測定されたヘマトクリットがドナーの新鮮な全血のヘマトクリットと同等になるまで、血液を、ワルファリン血漿、正常な血漿（機能対照）、または自己血漿（プロセス対照）中に増量的に再懸濁させる。
ａ．室温で最大４時間貯蔵する。
（８）任意の試料を実行する直前に、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、１：１の体積で組み合わせる。
【0240】
トロンボエラストグラフィーアッセイ（ＴＥＧ（登録商標）５０００ ＴＨＲＯＭＢＯＥＬＡＳＴＯＧＲＡＰＨ（登録商標）止血アナライザシステム）
（１）ＴＥＧ ５０００アッセイソフトウェアを開き、製造業者のガイドラインに従って機器をセットアップする。
（２）ワルファリン血漿を、３７℃の水浴中で５分間解凍する。
（３）トロンボソームを細胞培養グレードの水で１０分間再水和し、次いで、対照緩衝液で希釈して、６００×１０３／μＬにする。
（４）２０μＬの０．２ＭのＣａＣｌ２を、空の試料カップに添加する。
（５）各試料について、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、血漿とを、１：１の体積で組み合わせる。
（６）３４０μＬの試料をカップに添加し、次いで、カップをデバイスに素早く搭載し、実行を開始する。
（７）実行は、Ｒ時間が決定されるか、または実行がタイムアウトした時点で、完了する。
（１）ＴＥＧ ５０００アッセイソフトウェアを開き、製造業者のガイドラインに従って機器をセットアップする。
（２）ワルファリン血漿を、３７℃の水浴中で５分間解凍する。
（３）トロンボソームを細胞培養グレードの水で１０分間再水和し、次いで、対照緩衝液で希釈して、６００×１０３／μＬにする。
（４）２０μＬの０．２ＭのＣａＣｌ２を、空の試料カップに添加する。
（５）各試料について、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、血漿とを、１：１の体積で組み合わせる。
（６）３４０μＬの試料をカップに添加し、次いで、カップをデバイスに素早く搭載し、実行を開始する。
（７）実行は、Ｒ時間が決定されるか、または実行がタイムアウトした時点で、完了する。
【0241】
トロンビン生成アッセイ（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＡＳＣＥＮＴ（登録商標）上で）
（１）ＣＡＴソフトウェアを開き、機器をセットアップし、ＰＲＰ試薬（組織因子およびいくつかのリン脂質を含む）、キャリブレータ、およびフルオロ緩衝液を製造業者のガイドラインに従って調製する。
（２）ワルファリン血漿または対照血漿を、３７℃の水浴中で５分間解凍する。
（３）トロンボソームを細胞培養グレードの水で１０分間再水和し、次いで、対照緩衝液で希釈して、標的濃度を２倍にする。
（４）各試料について、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、血漿とを、１：１の体積で組み合わせる。
（５）マルチチャネルピペットを使用して、２０μＬのＰＲＰ試薬を各ウェルに添加する。
（６）ウェル当たり８０μＬの試料を添加する。各試料につき１つのキャリブレータウェルを含める。
（７）プレートをトレイに挿入し、フルオロ緩衝液（トロンビンにより切断されると蛍光シグナルを生成する、蛍光標識ペプチドを含む）を活性ウェルに注入する。
（８）プレートを、２０秒間隔で１８０分間読み取り、完全なトロンビン生成プロファイルをキャプチャする。
（１）ＣＡＴソフトウェアを開き、機器をセットアップし、ＰＲＰ試薬（組織因子およびいくつかのリン脂質を含む）、キャリブレータ、およびフルオロ緩衝液を製造業者のガイドラインに従って調製する。
（２）ワルファリン血漿または対照血漿を、３７℃の水浴中で５分間解凍する。
（３）トロンボソームを細胞培養グレードの水で１０分間再水和し、次いで、対照緩衝液で希釈して、標的濃度を２倍にする。
（４）各試料について、トロンボソームを含むかまたは含まない対照緩衝液と、血漿とを、１：１の体積で組み合わせる。
（５）マルチチャネルピペットを使用して、２０μＬのＰＲＰ試薬を各ウェルに添加する。
（６）ウェル当たり８０μＬの試料を添加する。各試料につき１つのキャリブレータウェルを含める。
（７）プレートをトレイに挿入し、フルオロ緩衝液（トロンビンにより切断されると蛍光シグナルを生成する、蛍光標識ペプチドを含む）を活性ウェルに注入する。
（８）プレートを、２０秒間隔で１８０分間読み取り、完全なトロンビン生成プロファイルをキャプチャする。
【0242】
Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）
Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）機器は、製造業者の指示に従って使用するために準備した。ＡＲチップ（Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＣ０１０１）およびＡＲチップカルシウムトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣａＣＴＩ；Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＲ０１０１）を、室温に加温した。３００ｕＬの再水和されたトロンボソームを、１．７ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、３９００ｇ×１０分間でペレットに遠心分離した。トロンボソームペレットを、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ（ＧＫ）プールされた正常なヒト血漿、または自己血小板を含むかもしくは含まない自己血漿中に、ＡｃＴ数（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡｃＴ Ｄｉｆｆ ２ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって決定される約１００，０００～４５０，０００／ｕＬの濃度に再懸濁させた。２０ｕＬのＣａＣＴＩを、ＧＫ血漿中の４８０ｕＬのトロンボソーム試料と、ピペットで穏やかに混合した。試料を充填し、製造業者の指示に従ってＴ－ＴＡＳ（登録商標）上で実行した。
Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）機器は、製造業者の指示に従って使用するために準備した。ＡＲチップ（Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＣ０１０１）およびＡＲチップカルシウムトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣａＣＴＩ；Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＲ０１０１）を、室温に加温した。３００ｕＬの再水和されたトロンボソームを、１．７ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、３９００ｇ×１０分間でペレットに遠心分離した。トロンボソームペレットを、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ（ＧＫ）プールされた正常なヒト血漿、または自己血小板を含むかもしくは含まない自己血漿中に、ＡｃＴ数（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡｃＴ Ｄｉｆｆ ２ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって決定される約１００，０００～４５０，０００／ｕＬの濃度に再懸濁させた。２０ｕＬのＣａＣＴＩを、ＧＫ血漿中の４８０ｕＬのトロンボソーム試料と、ピペットで穏やかに混合した。試料を充填し、製造業者の指示に従ってＴ－ＴＡＳ（登録商標）上で実行した。
【0243】
部分的トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）
ａＰＴＴを測定するためのプロトコルは、以下のとおりである。
ａＰＴＴを測定するためのプロトコルは、以下のとおりである。
【0244】
機器の電源を入れ、製造業者のガイドラインに従って、試薬１、試薬２、凝固対照Ｎ、および凝固対照Ｐを調製する。
【0245】
Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇプールされた正常な血漿を、３７℃の水浴中で５分間解凍する。
【0246】
キュベットストリップを、３７℃で少なくとも３分間予熱するために、インキュベーション領域に配置する。ボールを、各キュベットに分配する。
【0247】
各試料について、一連の濃度のヘパリンおよび／または硫酸プロタミンを含むかまたは含まないＧＫＰを、室温で５分間インキュベートする。
【0248】
５０μＬの試料および５０μＬの試薬１を、各キュベットに分配する。１８０秒のインキュベーションのために、インキュベーションカラムに対応するタイマーを開始する。
【0249】
機器がビープ音を発し始めたら、キュベットを試験カラム領域に移す。
【0250】
フィンピペットを、０．０２５ＭのＣａＣｌ２で１回プライミングする。
【0251】
ピペットキーを押すことによって、フィンピペットを起動する。５０μＬの０．０２５ＭのＣａＣｌ２を、フィンピペットを使用して各キュベットに分配する。
【0252】
実施例４：新鮮な血小板との比較
トロンボソームは、新鮮な血小板よりも優れた様式で、クマジン血漿中のトロンビン生成の特異的な用量依存的回復を誘発する。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。ＩＮＲ３の用量では、トロンボソームは、ピークトロンビンの用量依存的回復を実証する（図６）。さらに、トロンボソームを添加することは、同等の用量の新鮮な血小板よりも有効である。
トロンボソームは、新鮮な血小板よりも優れた様式で、クマジン血漿中のトロンビン生成の特異的な用量依存的回復を誘発する。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。ＩＮＲ３の用量では、トロンボソームは、ピークトロンビンの用量依存的回復を実証する（図６）。さらに、トロンボソームを添加することは、同等の用量の新鮮な血小板よりも有効である。
【0253】
実施例５：新鮮な血小板との組み合わせ
トロンボソームは、血小板と協働して、ワルファリン血漿中のトロンビン生成を増加させる。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。トロンボソームは、より大きな有効性を示すだけでなく、内因性血小板との付加効果も示す（図７Ａ）。トロンボソームは、モデル患者を健全なピークトロンビン範囲（例えば、約６６～１６６ｎＭ）に押し戻し得ることに留意されたい。「両方」の線は、示される量で等しい量の２つの成分を含むことに留意されたい（例えば、ｘ軸上の「５０」値で、ｙ値は、１μＬ当たり５０ｋのＰＲＰからの血小板と、１μＬ当たり５０ｋのトロンボソームとの混合物のピークトロンビンを表す。
トロンボソームは、血小板と協働して、ワルファリン血漿中のトロンビン生成を増加させる。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。トロンボソームは、より大きな有効性を示すだけでなく、内因性血小板との付加効果も示す（図７Ａ）。トロンボソームは、モデル患者を健全なピークトロンビン範囲（例えば、約６６～１６６ｎＭ）に押し戻し得ることに留意されたい。「両方」の線は、示される量で等しい量の２つの成分を含むことに留意されたい（例えば、ｘ軸上の「５０」値で、ｙ値は、１μＬ当たり５０ｋのＰＲＰからの血小板と、１μＬ当たり５０ｋのトロンボソームとの混合物のピークトロンビンを表す。
【0254】
加えて、異なるバッチのトロンボソームはまた、モデル患者（ＩＮＲ＝２、ワルファリンにより治療）を健全なピークトロンビン範囲に押し戻し得る（図７Ｂ）。
【0255】
実施例６：コラーゲン接着
トロンボソームは、フロー下で剪断依存性コラーゲン接着アッセイ（Ｔ－ＴＡＳ（登録商標））を使用して、ワルファリン血漿中のフィブリンに接着し、生成する（図８）。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。
トロンボソームは、フロー下で剪断依存性コラーゲン接着アッセイ（Ｔ－ＴＡＳ（登録商標））を使用して、ワルファリン血漿中のフィブリンに接着し、生成する（図８）。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。
【0256】
実施例７．リバーロキサバン結果
全血中のリバーロキサバン（本明細書ではＲｉｖと称される場合がある）用量反応を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を使用して測定した。ＡＲチップ（コラーゲン＋ＴＦ）を使用した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。ドナーの血小板を、３０７ｋ／μＬで使用した。９ｍＭの用量（薬理学的用量）は、閉塞を阻害するが、すべての血栓形成を阻害するわけではない（図９、表７）。
全血中のリバーロキサバン（本明細書ではＲｉｖと称される場合がある）用量反応を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を使用して測定した。ＡＲチップ（コラーゲン＋ＴＦ）を使用した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。ドナーの血小板を、３０７ｋ／μＬで使用した。９ｍＭの用量（薬理学的用量）は、閉塞を阻害するが、すべての血栓形成を阻害するわけではない（図９、表７）。
【0257】
（表７）
【0258】
トロンボソームは、リバーロキサバン抗凝固化全血中の血栓形成を部分的に回復させる。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、３ｍＭのリバーロキサバンおよび異なる濃度のトロンボソームを使用して、実施例３に従って実行した（図１０Ａ、表８）。「Ｒｉｖなし」の垂直線は、リバーロキサバンが添加されていない試料のおおよその閉塞時間を示す。
【0259】
（表８）
【0260】
同様の実験では、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、リバーロキサバンなし、３ｍＭのリボロキサバン、ならびに３μＭのリボロキサバンおよび３００×１０３／μＬのトロンボソームを用いて、実施例３に従って実行した。経時的な圧力を図１０Ｂに示し、閉塞時間を図１０Ｃに示す。３μＭのリバーロキサバンで処理された多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞時間を６．０４分から２６．０１分に延長したことを示す。３００ｋ／μＬの添加により、時間が減少して１８．０１分に戻った。
【0261】
実施例８．ワルファリン血漿のトロンボエラストグラフィーアッセイ
図１１～図１３に示すように、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を試験し、８５０、４５０、５０、および０ｋ／ｕＬのトロンボソーム濃度で、標準血漿（ＩＮＲ＝１．０）と比較した。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。
図１１～図１３に示すように、ワルファリン血漿（ＩＮＲ＝１．６）中のトロンボソームの効果を試験し、８５０、４５０、５０、および０ｋ／ｕＬのトロンボソーム濃度で、標準血漿（ＩＮＲ＝１．０）と比較した。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。
【0262】
この実験では、＋１７０μＬの血漿を各カップに、＋１７０μＬのトロンボソームまたは対照を各カップに、および＋２０μＬのＣａＣｌ２（ＴＥＧ試薬）を各ウェルに配置した。
【0263】
各実行を、各条件について単一の複製を使用して実施した。計４回実行した。トロンボソーム希釈液を、各実行の少し前に調製し、計数を、各実行を開始した直後に確認した。結果を、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３、および図１４に示す（トロンボソームバッチ４）。
【0264】
実施例９．ラグタイム
トロンボソームは、すべての試験されたトロンボソーム濃度でラグタイムを減少させ、プラトー効果は、過凝固性を実証しない（図１５）。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
トロンボソームは、すべての試験されたトロンボソーム濃度でラグタイムを減少させ、プラトー効果は、過凝固性を実証しない（図１５）。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
【0265】
実施例１０．ＴＥＧ結果
様々な濃度のトロンボソームを添加することにより、ワルファリン血漿中のＲ時間が減少する。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。図１７は、トロンボソームが、様々なＩＮＲ値についてＲ時間を低下させることを示す。プラトーは、２０分のＲ時間の前に見られ、トロンボソームが治療的に有意な結果を生み出し得ることを示唆する。
様々な濃度のトロンボソームを添加することにより、ワルファリン血漿中のＲ時間が減少する。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）アッセイを、実施例３に従って実施した。図１７は、トロンボソームが、様々なＩＮＲ値についてＲ時間を低下させることを示す。プラトーは、２０分のＲ時間の前に見られ、トロンボソームが治療的に有意な結果を生み出し得ることを示唆する。
【0266】
実施例１１．活性化凝血時間
トロンボソームは、ワルファリン血漿中の活性化凝血時間に対する効果を示す。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＭａｘＡｃｔチューブを空にするために、２５μｌのトロンボソームまたは対照緩衝液および２５μｌの０．２ＭのＣａＣｌ２を添加し、続いて全クエン酸血液または血漿（４００μｌ）を添加した。チューブを手で一度振とうし、次いで、ＭａｘＡｃｔ ＡＣＴ機器に挿入し、凝血時間を自動的に記録した。生理学的範囲にトロンボソームを添加することにより、ｔＡＣＴが改善する。正常状態（ＩＮＲ＝１）における変化は観察されなかった。（図１８）。
トロンボソームは、ワルファリン血漿中の活性化凝血時間に対する効果を示す。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＭａｘＡｃｔチューブを空にするために、２５μｌのトロンボソームまたは対照緩衝液および２５μｌの０．２ＭのＣａＣｌ２を添加し、続いて全クエン酸血液または血漿（４００μｌ）を添加した。チューブを手で一度振とうし、次いで、ＭａｘＡｃｔ ＡＣＴ機器に挿入し、凝血時間を自動的に記録した。生理学的範囲にトロンボソームを添加することにより、ｔＡＣＴが改善する。正常状態（ＩＮＲ＝１）における変化は観察されなかった。（図１８）。
【0267】
実施例１２．全血アッセイ
クマジン全血を調製した。実施例３に記載のとおり、ドナーの全血から血漿を除去し、ワルファリンまたは対照血漿で置き換えた。
クマジン全血を調製した。実施例３に記載のとおり、ドナーの全血から血漿を除去し、ワルファリンまたは対照血漿で置き換えた。
【0268】
トロンボソームは、３．０および６．２ＩＮＲ全血中でトロンビン生成を増加させる。トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。トロンボソームは、ピークトロンビンを増加させるが、効果の大きさは小さい。トロンボソームは、正常な血液状態に対して最小限の効果を示す（図１９）。これらの実験では、血小板数は、１５０×１０３／μＬであった（全血のＣＢＣにより測定）。
【0269】
実施例１３．トロンビン生成アッセイ
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。ＴＧＡアッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
【0270】
トロンボソーム（バッチ４）の効果を試験し、１４５０、１１５０、８５０、６５０、４５０、１５０、５０、および０ｋ／ｕＬのトロンボソーム濃度で、標準血漿（ＩＮＲ＝１．０）および上昇したＩＮＲ対照（ＩＮＲ＝２、３、および６）と比較した。様々なＩＮＲ値について得られたピークトロンビン（図２０Ａ～図２０Ｃ）およびトロンビン生成（ＥＴＰ；図２１Ａ～図２１Ｃ）値を、図２０および図２１に示す。
【0271】
ピークトロンビン結果
ＩＮＲ＝１：ピークトロンビンの増加は、約８００ｋのトロンボソームで飽和し、最大トロンボソーム濃度で約１００ｎＭの正常レベルからほぼ２倍になった（図２０Ｃ）。同じロットで試験を繰り返すと、７００ｋのトロンボソームで約１４５ｎＭに大幅に増加し、続いて最高トロンボソーム濃度で１２０ｎＭに減少した（図２０Ａ）。以前の試験は、ピークトロンビンの増加なしまたはわずかな増加のいずれか、続いてより高いトロンボソーム濃度で減少を示した（例えば、図２２Ａ～図２２Ｅを参照されたい）。
ＩＮＲ＝１：ピークトロンビンの増加は、約８００ｋのトロンボソームで飽和し、最大トロンボソーム濃度で約１００ｎＭの正常レベルからほぼ２倍になった（図２０Ｃ）。同じロットで試験を繰り返すと、７００ｋのトロンボソームで約１４５ｎＭに大幅に増加し、続いて最高トロンボソーム濃度で１２０ｎＭに減少した（図２０Ａ）。以前の試験は、ピークトロンビンの増加なしまたはわずかな増加のいずれか、続いてより高いトロンボソーム濃度で減少を示した（例えば、図２２Ａ～図２２Ｅを参照されたい）。
【0272】
ＩＮＲ２：新たに調製されたトロンボソームは、最大トロンボソーム濃度で約１０ｎＭ～約８０ｎＭのピークトロンビンの増加をもたらした（図２０Ａ）。以前の試験は、０～２０ｎＭ～３０～８０ｎＭの範囲で同様の傾向を示した（例えば、図２２Ａ～図２２Ｅを参照されたい）。
【0273】
ＩＮＲ３：新たに調製されたトロンボソームは、最大トロンボソーム濃度でゼロから約４０ｎＭのピークトロンビンの増加をもたらした（図２０Ｂ）。以前の試験は、最大約４０ｎＭ（バッチ１；図２２Ａ～図２２Ｃ）；１～２ｎＭ（バッチ２；図２２Ｄ）；０～１０ｎＭ（バッチ３；図２２Ｅ）と同様の傾向を示した。
【0274】
ＩＮＲ６：新たに調製されたトロンボソームは、最大トロンボソーム濃度でゼロから約２０ｎＭのピークトロンビンの増加をもたらした（図２０Ｃ）。以前の試験は、同様の傾向を示した。（例えば、図２２Ａ～図２２Ｅを参照されたい）。
【0275】
トロンビン生成（ＥＴＰ）結果
ＩＮＲ１：ＥＴＰは、５０～１５０ｋのトロンボソームでわずかに増加し、次いで、より高いトロンボソーム濃度で安定レベルにわずかに減少した（図１７Ａ、図１７Ｃ）。以前の試験は、同様の傾向を示した（図２１Ａ～図２１Ｃ）。ＥＴＰ範囲は、１０００～１６００ｎＭ＊分であった。
ＩＮＲ１：ＥＴＰは、５０～１５０ｋのトロンボソームでわずかに増加し、次いで、より高いトロンボソーム濃度で安定レベルにわずかに減少した（図１７Ａ、図１７Ｃ）。以前の試験は、同様の傾向を示した（図２１Ａ～図２１Ｃ）。ＥＴＰ範囲は、１０００～１６００ｎＭ＊分であった。
【0276】
ＩＮＲ２：ＥＴＰは、最高トロンボソーム濃度で約２００ｎＭ＊分～約８５０ｎＭ＊分に増加した（図２１Ａ）。以前の試験は、２００～４００ｎＭ＊分～５００～９００ｎＭ＊分の範囲で同様の傾向を示した。
【0277】
ＩＮＲ３：ＥＴＰ値は、最高トロンボソーム濃度で約１００ｎＭ＊分～４００ｎＭ＊分に増加した（図２１Ｂ）。以前の試験は、１００～３５０（バッチ１）；１００～２００ｎＭ＊分の範囲で同様の傾向を示した。
【0278】
ＩＮＲ６：ＥＴＰ値は、最高トロンボソーム濃度で約１００ｎＭ＊分～３００ｎＭ＊分に増加した（図２１Ｃ）。以前の試験は、１００ｎＭ＊分～２００ｎＭ＊分の範囲で同様の傾向を示した。
【0279】
実施例１４．新鮮な血小板ではないトロンボソームは、ヘパリン化血漿中のトロンビン生成を回復させる
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和し、ａＰＴＴおよびトロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和し、ａＰＴＴおよびトロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
【0280】
図２３Ａは、ｘ軸に記載されているように、様々な濃度のヘパリンの不在下および存在下におけるＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ血漿（ＧＫＰ）のａＰＴＴを示す。約７０秒での破線は、異常なａＰＴＴの限界を示し、第２の破線は、機器によって測定された最大時間（１２０秒）を示す。ヘパリンで処理された試料中のトロンビン生成も測定した。図２３Ｂは、トロンビン生成を主にリン脂質を含有するＰＰＰ低試薬で開始した場合の、１μＬ当たり５Ｋ（点線）でのトロンボソーム、および５０Ｋ（実線）の血小板またはトロンボソームを含むアフェレーシス単位（ＡＰＵ）を比較した、ＧＫＰ中のトロンビン生成に対するＧＫＰ中の０．１Ｕのヘパリンの効果を示す。図２３Ｃはまた、リン脂質および組織因子の混合物を含有するＰＲＰ試薬によってトロンビン生成が開始されることを除いて、図２３Ｂと同様のトロンビン生成を示す。図２３Ｂおよび図２３Ｃの破線は、対照血漿についてこのアッセイで見られる典型的なトロンビンピーク値を示す。これらのデータは、新鮮な血小板ではなく、トロンボソームが、ヘパリン化血漿中のトロンビン生成を回復させることを示す。
【0281】
実施例１５．硫酸プロタミン中和は、治療用ヘパリン化血漿中のトロンボソーム媒介性トロンビン生成を回復させる
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和し、ａＰＴＴおよびトロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和し、ａＰＴＴおよびトロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
【0282】
図２４Ａは、ｘ軸に記載されているように、ヘパリン（Ｈ）（Ｕ／ｍＬ）および硫酸プロタミン（Ｐ）の不在下および存在下におけるＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ血漿（ＧＫＰ）のａＰＴＴを示す。約７０秒での破線は、異常なａＰＴＴの限界を示し、第２の破線は、機器によって測定された最大時間（１２０秒）を示す。また、硫酸プロタミンを含むおよび含まない、ヘパリンで処理された試料中のトロンビン生成も測定した。図２４Ｂは、トロンビン生成を主にリン脂質を含有するＰＰＰ低試薬で開始した場合の、１μＬ当たり５Ｋ（点線）、５０Ｋ（破線）、および１５０Ｋ（実線）のトロンボソームを有するＧＫＰ中のトロンビン生成に対する、２０μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンによる拮抗前（比較的平坦な線）および拮抗後（曲線）の、２Ｕ／ｍＬのヘパリンの効果を示す。図２４Ｃはまた、リン脂質および組織因子の混合物を含有するＰＲＰ試薬によってトロンビン生成が開始されることを除いて、図２４Ｂと同様のトロンビン生成を示す。図２４Ｂおよび図２４Ｃの破線は、対照血漿についてこのアッセイで見られる典型的なトロンビンピーク値を示す。
【0283】
実施例１６．トロンボソームは、ダビガトランで処理された多血小板血漿中のトロンビン生成を回復させる
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。トロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
トロンボソームを、米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製し、滅菌水の添加により再水和した。トロンビン生成アッセイを、実施例３に記載のとおり実施した。
【0284】
図２５Ａおよび図２５Ｂは、トロンボソームで処理された場合、ダビガトランで処理されたＰＲＰにおいてトロンビン生成が正常に戻ることを示す。ＰＲＰ試薬で刺激したダビガトラン（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で処理されたＰＲＰのトロンビン生成を、１５０ｋ／μＬのトロンボソームで拮抗した。ピークまでの時間は、未処理の１８．８９分からダビガトランで３４．６７分に増加したが、１５０ｋ／μＬのトロンボソームで１８．３３分に戻った。
【0285】
前述の説明は、本発明の好ましい実施形態を対象とするが、他の変形および修正が、当業者には明らかであり、かつ本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく行われ得ることに留意されたい。さらに、本発明の１つの実施形態に関連して記載される特徴は、上記に明示的に記載されていない場合であっても、他の実施形態と併せて使用され得る。さらに、当業者は、上記で考察されるような発明が、異なる順序の工程で、および／または開示されるものとは異なる構成のハードウェア要素を用いて実践され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はこれらの好ましい実施形態に基づいて記載されているが、ある特定の修正、変形、および代替的な構成が、本発明の趣旨および範囲内に留まる一方で、明らかであることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲および境界を決定するために、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図22E】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】