特表 2022-544803 筋肉消耗及び他の状態の治療及び予防に好適な化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-21

(54)【発明の名称】筋肉消耗及び他の状態の治療及び予防に好適な化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 311/16 20060101AFI20221014BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20221014BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20221014BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20221014BHJP

   C07D 407/12 20060101ALI20221014BHJP

   C07D 405/12 20060101ALI20221014BHJP

   C07D 409/12 20060101ALI20221014BHJP

   A61K 31/381 20060101ALI20221014BHJP

   A61K 31/4433 20060101ALI20221014BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20221014BHJP

【ＦＩ】

C07D311/16 101

A61P21/00 ZNA

A61P9/04

A61P35/00

A61P11/00

A61P13/12

A61P3/10

A61P17/02

A61K31/352

C07D407/12 CSP

C07D405/12

C07D409/12

A61K31/381

A61K31/4433

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022510087

(86)(22)【出願日】2020-08-14

(85)【翻訳文提出日】2022-04-08

(86)【国際出願番号】 EP2020072911

(87)【国際公開番号】W WO2021032643

(87)【国際公開日】2021-02-25

(31)【優先権主張番号】19192107.1

(32)【優先日】2019-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522059690

【氏名又は名称】アダムス，フォルカー

(71)【出願人】

【識別番号】522059704

【氏名又は名称】ラベイト，ジークフリート

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アダムス，フォルカー

(72)【発明者】

【氏名】ラベイト，ジークフリート

【テーマコード（参考）】

4C063

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA01

4C063BB07

4C063BB08

4C063BB09

4C063CC79

4C063CC92

4C063DD12

4C063DD75

4C063DD79

4C063EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BA08

4C086BB02

4C086BC17

4C086GA02

4C086GA04

4C086GA08

4C086GA13

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA36

4C086ZA37

4C086ZA59

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZB26

4C086ZC35

(57)【要約】

本発明は、一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものであり、可変要素は、特許請求の範囲及び明細書に記載の通りである。本発明は、筋肉消耗状態の、骨格筋若しくは心筋の萎縮の、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現増加に関連する状態、特にミオパチーの及び他の状態の、治療又は予防に使用するための式Ｉの化合物；医薬品としての使用のための式Ｉの化合物；少なくとも一つの式Ｉの化合物を含む医薬組成物；並びに前記状態を治療する方法に関するものでもある。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩。

【化1】

［式中、
Ｒ^１は、水素又は基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、水素、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、フェニル（フェニルは置換されていないか、又は独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_３－アルコキシから選択される１、２若しくは３個の基を有していてもよい。）、及び環員として独立にＮ、ＮＲ^ｃ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子又はヘテロ基を含む５～１０員ヘテロ芳香環（前記５～１０員ヘテロ芳香環は置換されていないか、又は１、２若しくは３個の基Ｒ^７を有していてもよい。）からなる群から選択され；
Ｒ^２は、水素、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され；
Ｒ^３は、水素、メチル及びフッ素化メチルからなる群から選択され；
Ｒ^４は、水素及びＣ_１－Ｃ_４－アルキルからなる群から選択され；
各Ｒ^５は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１はＮＲ^ａ又はＯであり；
Ｘ^２はＮＲ^ｂ、Ｏ又はＳであり；
Ｙは、酸素原子又は２個の水素原子を表し；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃはそれぞれ独立に、水素及びＣ_１－Ｃ_４－アルキルからなる群から選択され；
ａは０、１、２、３又は４であり；
ｂは０、１、２又は３である。］

【請求項2】

Ｒ^１が水素及び基－ＣＨ_２Ｒ^１ａからなる群から選択され、Ｒ^１ａが、水素、メチル並びに環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む５～６員単環式ヘテロ芳香環からなる群から選択され、前記５～６員単環式ヘテロ芳香環が置換されていないか、又は１個の基Ｒ^７を有しており、Ｒ^７が、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｒ^１が水素及び基－ＣＨ_２Ｒ^１ａからなる群から選択され、Ｒ^１ａが、水素並びに環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む５～６員単環式ヘテロ芳香環からなる群から選択され；Ｒ^１が特に基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａが環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員単環式ヘテロ芳香環である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
ａが０、１又は２であり；
ｂが０又は１である、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^１が基ＣＨ_２－Ｉ′又はＣＨ_２－ＩＩ′から選択される、請求項１に記載の化合物。

【化2】

［式中、
＊は、尿素窒素原子への結合箇所を示し；
各Ｒ^７は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^３はＮＲ^ｃ、Ｏ又はＳであり；
Ｒ^ｃは、水素及びＣ_１－Ｃ_４－アルキルからなる群から選択され；
ｃは０、１、２又は３である。］

【請求項6】

Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
ａが０、１又は２であり；
ｂが０又は１であり；
ｃが０又は１である、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^２が水素であり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
ａが０であり；
ｂが０であり；
ｃが０である、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

下記式Ｉ－Ａ：

【化3】

［式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯであり；
Ｘ^３はＯ又はＳである。］
及びその薬学的に許容される塩に相当する、又は
下記式Ｉ－Ｂ：

【化4】

［式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯである。］及びその薬学的に許容される塩に相当する、又は
下記式Ｉ－Ｃ：

【化5】

［式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯであり；
Ｘ^３はＯ又はＳである。］及びその薬学的に許容される塩に相当する、又は
下記式Ｉ－Ｄ：

【化6】

［式中、
Ｒ^１は水素又はメチルであり；
Ｘ^１はＮＨ又はＯである。］及びその薬学的に許容される塩に相当する、請求項１～７のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物。

【請求項9】

化合物［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート及びその薬学的に許容される塩。

【請求項10】

化合物４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミド及びその薬学的に許容される塩。

【請求項11】

化合物［２－オキソ－２－（２－ピリジルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート及びその薬学的に許容される塩。

【請求項12】

Ｎ－［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］－４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンズアミド、［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－ベンゾエート、及び４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］－ベンズアミドから選択される請求項１に記載の式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩。

【請求項13】

（１－メチル－２－オキソ－２－ウレイド－エチル）４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート及び［１－メチル－２－（メチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートから選択される請求項１に記載の式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩。

【請求項14】

少なくとも一つの請求項１～１３のいずれか１項に記載の一般式Ｉの化合物又は少なくとも一つのその薬学的に許容される塩並びに少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項15】

医薬品としての使用のための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項16】

筋肉消耗状態の治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項17】

次の疾患若しくは状態：
鬱血性心不全、慢性心不全、がん、ドキソルビシンなどの筋毒性物質及び／又は心臓毒性物質によるがん治療、先天性ミオパチー、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性腎疾患、腎不全、糖尿病、重度火傷、加齢性サルコペニア、血液供給低下、一時的若しくは長期的固定、長期機械的人工換気、脱神経、長期無重力状態及び栄養不良
のうちの一つに起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項18】

筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現増加に関連する状態の、特に筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連するミオパチーの治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項19】

前記ミオパチーが、重症疾患ミオパチー、ネマリンミオパチー、炎症性ミオパチー、糖尿病からのミオパチー、肺高血圧からのミオパチー、慢性心不全からのミオパチー、腎不全からのミオパチー及び腫瘍性悪液質からのミオパチーから選択される、請求項１８に記載の使用のための化合物。

【請求項20】

収縮期又は拡張期の機能障害に関連する心臓状態の治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項21】

糖尿病の治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項22】

－駆出率の低下を伴う心不全（ＨＦ－ｒＥＦ）、保存された駆出率を伴う心不全（ＨＦ－ｐＥＦ）、高血圧又は腫瘍悪液質に起因する又はそれに関連する骨格筋若しくは心筋の萎縮；
－ドキソルビシン誘発の筋萎縮及び／又は心臓毒性；
－老化によるサルコペニア及び／又は心筋症；
－慢性腎疾患による筋萎縮；
－機械的人工換気又は鬱血性心不全による横隔膜衰弱；
－先天性ミオパチー、特に先天性（ｃｏｎｇｅｎｅｔｉｃ）筋萎縮；
－糖尿病誘発性筋萎縮；及び／又は
－糖尿病
の治療又は予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。

【請求項23】

請求項１６～２２のいずれか１項に記載の状態を治療又は予防する方法であって、治療又は予防を必要とする対象者に、治療上有効量の請求項１～１３のいずれか１項に記載の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な置換された４－［２－オキソ－クロメン－７－イル）ヘテロメチル］安息香酸化合物、特には本明細書に記載の一般式Ｉの化合物に関する。その化合物は有益な治療特性を有し、筋肉消耗状態の治療及び予防に、並びにミオパチーの治療又は予防に、特には筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現増加に関連するものの治療又は予防に好適である。

【背景技術】

【0002】

筋肉消耗及び筋力低下は、心臓悪液質、心筋梗塞、高血圧、がん、特定の薬剤によるがん治療、糖尿病、腎疾患及び腎不全、遺伝性筋萎縮及び重度感染症などの各種臨床状態下で認められる、並びに固定、長期人工呼吸器、長期無重力状態又は老齢などの特定の疾患に関連しないいくつかの物理的条件下でも認められる衰弱性合併症である。筋肉消耗は、四肢及び呼吸筋の両方で発生する筋肉量の喪失を特徴とする。筋肉の消耗は代表的には、症状及び予後の悪化につながり、回復期を長引かせる。

【0003】

筋肉消耗の基礎となる機序はまだ完全には理解されていない。筋肉の消耗には、オートファゴソーム及びユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）を介した筋肉タンパク質の分解を促進する、いわゆるアトロギン類の活性化が含まれることが知られている。

【0004】

残念ながら、運動トレーニングなど、上記の臨床状態によって開始される筋肉タンパク質の喪失を遮断する信頼性の高い戦略はほとんど知られていない。これらの既知の戦略は、一般に、アトロギンの発現を低下又は不活性化すること、及び／又はそれらのユビキチン化活性を阻害することを目的としている。

【0005】

たとえば、ＷＯ２０１５／０１０１０７Ａ１には、シグナル伝達兼転写活性化因子（Ｓｔａｔ３）の炎症性サイトカイン誘発性（ＩＬ－６誘発性）チロシンリン酸化を阻害することにより、筋力低下及び／又は筋力消耗及び／又は悪液質を軽減するための小分子の使用が記載されている。Ｓｔａｔ３リン酸化の阻害は、特定のアトロギンの発現を上昇させることによって筋肉の成長を遮断することが知られているミオスタチンの発現増加を防ぐものである。

【0006】

筋タンパク質の喪失を遮断するもう一つの有望な戦略は、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）の機能を阻害することである。ＭｕＲＦ１は、筋肉特異的なユビキチンＥ３リガーゼであり、多ユビキチン化された筋肉タンパク質をユビキチンプロテアソーム系に移して分解するための重要なステップを提供すると考えられている。その発現は、多くの臨床状態における筋肉消耗と密接に関連しているが、その遺伝子の不活性化は、筋肉消耗状態に対する部分的な抵抗性をもたらす。過去１５年間の多くの研究が、多くの筋肉関連疾患、すなわちミオパチー、例えば、重病ミオパチー、ネマリンミオパチー、慢性炎症性ミオパチー、糖尿病からのミオパチー、又は筋力低下をもたらす肺高血圧症がＭｕＲＦ１発現の上昇に関連し得ることを明らかにしている。

【0007】

Ｈｏｏｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｍｅｄ．， ２０１５， １９１（１０）， １１２６－１１３８に、ＭｕＲＦ１発現と横隔膜筋線維力喪失及び人工呼吸器を受けている重病患者（重病ミオパチー）で代表的に認められる筋タンパク質分解との間の関連について記載されている。その著者らは、この筋線維力喪失が、機械的人工換気を受けているＭｕＲＦ１－ＫＯマウスで減弱されることを認めており、それによって重症ミオパチーとＭｕＲＦ１発現との関係を明らかにしている。

【0008】

Ｌｉ ａｎｄ Ｇｒａｎｚｉｅｒ， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１５ Ｓｅｐ １５，２４（１８）， ５２１９－５２３３には、解糖系繊維豊富の筋肉がＭｕＲＦ－１を含むタンパク質分解経路を上昇させ、低栄養になり、その結果断面積（ＣＳＡ）が小さくなり、それによって筋力低下が悪化する、ネマリンミオパチーのマウスモデルが記載されている。従って、ＭｕＲＦ１阻害は、特に四頭筋などの解糖系線維豊富な筋肉タイプにおいて、ネマリンミオパチーにおける筋繊維ＣＳＡ及び筋繊維力を保護すると予測される。

【0009】

Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ.， ２００８， ３８４， ４８－５９には、Ｃ５７Ｂｌ６マウスにおける腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の腹腔内注射により、１５０Ｈｚでのヒラメ筋の筋力発達を２５％低下させたことが記載されている。このＴＮＦ－α誘発の筋力低下は、ＭｕＲＦ－１ノックアウト動物で減弱された。従って、ＭｕＲＦ１阻害が、ＴＮＦ－αレベルが高い慢性炎症状態において有用であると予測される。

【0010】

Ｄｅ Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ． Ｍｅｄ．， ２０１１ Ｍａｙ １５、１８３（１０）， １４１１－１４１８には、横隔膜線維ＣＳＡが、対照と比較して肺高血圧（ＰＨ）ラットにおいて大幅に小さいことが記載されている。そのラットデータと一致して、ＰＨ患者についての研究で、対照被験者と比較して、ＣＳＡの大幅な低下及び横隔膜筋線維の収縮性の低下が明らかになっている。その著者らはさらに、横隔膜線維ＣＳＡにおけるこの低下が、Ｅ３－リガーゼであるＭＡＦｂｘ及びＭｕＲＦ－１の発現増加に関連していることを認めている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２０１５／０１０１０７号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｈｏｏｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｍｅｄ．， ２０１５， １９１（１０）， １１２６－１１３８

【非特許文献2】Ｌｉ ａｎｄ Ｇｒａｎｚｉｅｒ， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１５ Ｓｅｐ １５，２４（１８）， ５２１９－５２３３

【非特許文献3】Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ.， ２００８， ３８４， ４８－５９

【非特許文献4】Ｄｅ Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ． Ｍｅｄ．， ２０１１ Ｍａｙ １５、１８３（１０）， １４１１－１４１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

今日までのところ、ＭｕＲＦ１機能の阻害に向けた治療アプローチはごくわずかしか存在しない。

【0014】

たとえば、Ｃａｓｔｉｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２０１３， ６２， １４９５－１５０２には、培養Ｌ６筋管のデキサメタゾン誘発萎縮を防ぐアトロギン－１及びＭｕＲＦ１のアデノウイルスノックダウンが記載されている。

【0015】

Ｅｄｄｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２０１１， ６０， １１３－１１８には、筋肉特異的小分子によるＭｕＲＦ１ユビキチン化の標的阻害が記載されており、それにより、細胞萎縮モデルにおける筋肉消耗が大幅に減少することが記載されている。

【0016】

これらの療法研究は、小分子によるＭｕＲＦ１機能の阻害が筋管の萎縮を防ぐことができることを示しているが、このアプローチは、臨床的に関連する動物モデルなどのイン・ビボ環境に適用されてはいない。したがって、筋肉消耗状態の治療及び／又は予防のための化合物及び方法を提供するという、当技術分野における実質的に満足されていないニーズが未だに存在している。

【0017】

本発明の目的は、筋肉消耗状態又は筋肉状態を改善することで減弱させ得る状態の治療及び／又は予防での使用に好適なさらなる小分子を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0018】

この目的及びさらなる目的は、下記の一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩によって達成される。

【0019】

【化1】

式中、
Ｒ^１は、水素又は基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、水素、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、フェニル（フェニルは置換されていないか、又は独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_３－アルコキシからなる群から選択される１、２若しくは３個の基を有していてもよい。）、及び環員として独立にＮ、ＮＲ^ｃ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子又はヘテロ基を含む５～１０員ヘテロ芳香環（前記５～１０員ヘテロ芳香環は置換されていないか、又は１、２若しくは３個の基Ｒ^７を有していてもよい。）からなる群から選択され；
Ｒ^２は、水素、メチル又はフッ素化メチルであり；
Ｒ^３は、水素、メチル又はフッ素化メチルであり；
Ｒ^４は、水素又はＣ_１－Ｃ_４－アルキルであり；
各Ｒ^５は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７は、独立にハロゲン、シアノ、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ及びＣ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１はＮＲ^ａ又はＯであり；
Ｘ^２はＮＲ^ｂ、Ｏ又はＳであり；
Ｙは、酸素原子（従ってＣ＝ＹがＣ＝Ｏである。）又は２個の水素原子（従って、Ｃ＝ＹがＣＨ_２である。）を表し；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃはそれぞれ独立に、水素及びＣ_１－Ｃ_４－アルキルからなる群から選択され；
ａは０、１、２、３又は４であり；
ｂは０、１、２又は３である。

【0020】

従って本発明は、一般式Ｉの化合物及び式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩に関する。

【0021】

化合物Ｉの薬理特性を考慮すると、本発明は、医薬品としての使用のための一般式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩に関するものでもある。

【0022】

当該新規化合物が、細胞試験で、そして臨床関連動物モデルで筋肉消耗及び収縮不全を減弱する能力を有することが認められた。

【0023】

従って、本発明は、筋肉消耗状態の治療又は予防に使用するための一般式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩に関するものである。

【0024】

本発明は、特に、次の疾患又は状態：鬱血性心不全、慢性心不全、がん、筋毒性物質によるがん治療、先天性ミオパチー、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性腎疾患、腎不全、糖尿病、重度火傷、加齢性サルコペニア、血液供給低下、一時的若しくは長期的固定、長期機械的人工換気、脱神経、長期無重力状態及び栄養不良のうちの一つに起因する骨格筋萎縮又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、一般式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩に関する。

【0025】

さらに、本発明の化合物は、ＭｕＲＦ１のユビキチンＥ３リガーゼ活性及びＭｕＲＦ１のタイチンなどの標的筋肉タンパク質への結合を阻害することによるＭｕＲＦ１機能の強力な阻害剤である。したがって、本発明はさらに、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現増加に関連する状態、特に、ＭｕＲＦ１発現増加に関連するミオパチーの治療又は予防に使用するための、一般式Ｉの化合物又は式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩に関する。

【0026】

一般式Ｉの化合物が、筋肉状態に対する効果に直接関係しない収縮期又は拡張期機能障害に関連する心臓状態において有益な効果を有することも見出された。したがって、本発明はまた、収縮機能障害又は拡張機能障害に関連する心臓状態の治療又は予防に使用するための一般式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩に関する。

【0027】

一般式Ｉの化合物が糖尿病に有益な効果を有することも見出された。したがって、本発明はまた、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の治療又は予防に使用するための一般式Ｉの化合物又はその薬学的に許容される塩に関する。

【0028】

本発明はさらに、少なくとも一つの本明細書に記載の式Ｉの化合物、又は少なくとも一つの式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩を含む医薬品に関する。

【0029】

本発明はさらに、本明細書に記載の一般式Ｉの化合物から選択される化合物、又は少なくとも一つのその薬学的に許容される塩及び少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0030】

本発明はさらに、筋肉消耗状態の治療若しくは予防のための、又は上記で挙げた状態若しくは障害の治療若しくは予防のための医薬品の製造のための本明細書に記載の一般式Ｉの化合物から選択される化合物、又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

【0031】

本発明はさらに、上記で挙げた状態若しくは障害の一つを治療若しくは予防するための方法であって、本明細書に記載の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を、処置を必要とする対象者に対して投与するステップを含む方法に関するものである。

【発明を実施するための形態】

【0032】

「式Ｉの化合物」及び「化合物Ｉ」という用語は、同義語として使用される。

【0033】

「薬学的に許容される塩」という用語は、カチオン性又はアニオン性の塩化合物を指し、対イオンは、無機若しくは有機塩基及び無機若しくは有機酸を含む薬学的に許容される無毒性の塩基若しくは酸から誘導される。本明細書で使用される場合、式Ｉの化合物への言及は、薬学的に許容される塩も含むことを意味することが理解される。

【0034】

式Ｉの化合物が塩基性である場合、塩は、無機酸及び有機酸などの薬学的に許容される無毒性酸から製造することができる。そのような薬学的に許容される酸付加塩には、酢酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イソチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸などがあるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいのは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及び酒石酸である。

【0035】

式Ｉの化合物が酸性である場合、塩は、無機及び有機塩基などの薬学的に許容される無毒性の塩基から製造することができる。薬学的に許容される塩基塩には、アルカリ又はアルカリ土類金属カチオンなどの金属カチオン、並びにアミンなどの塩基から誘導される無毒性塩などがある。好適な金属カチオンの例には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、及びアルミニウムなどがある。好適なアミンの例には、アルギニン、Ｎ，Ｎ′－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、グリシン、リジン、Ｎ－メチルグルカミン、オラミン、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール、及びプロカインなどがある。好ましい薬学的に許容される塩基塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム及びジエタノールアミンである。

【0036】

有用な酸添加及び塩基塩の議論については、例えば、Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， ″Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，″ ６６ Ｊ． Ｐｈａｒｍ． ＳｃＬ １－１９ （１９７７）を参照する。

【0037】

「Ｃ_１－Ｃ_４－アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルを指す。好ましくは、Ｃ_１－Ｃ_４－アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピルから、特にメチル及びエチルから選択される。

【0038】

「Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ－プロピル又はイソプロピルを指す。好ましくは、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキルは、メチル及びエチルから、特にメチルから選択される。

【0039】

「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を指す。好ましくは、ハロゲンは、フッ素及び塩素、特にフッ素である。

【0040】

「フッ素化メチル」という用語は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、好ましくはトリフルオロメチルを指す。

【0041】

「フッ素化メトキシ」という用語は、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、好ましくはトリフルオロメトキシを指す。

【0042】

「Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ」という用語は、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ及びイソプロポキシを指す。好ましくは、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシは、メトキシ及びエトキシから、特にメトキシから選択される。

【0043】

「Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル」という用語は、上記に記載のＣ_１－Ｃ_３－アルキル基を指し、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキルラジカルの水素原子の少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５又は６個の水素原子が、ハロゲン原子によって、好ましくは塩素又はフッ素原子によって、特にフッ素原子によって置き換えられている。Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキルの例には、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２－クロロエチル、２，２－ジクロロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、１－フルオロエチル、１，１－ジフルオロエチル、１，１，２，２－テトラフルオロエチル、ペンタフルオロエチルなどがある。特に、「Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルキル」は、上記に記載のフッ素化メチルから選択され、トリクロロメチル、２，２，２－トリクロロエチル及び２，２，２－トリフルオロエチルから、特にはトリフルオロメチルからも選択される。

【0044】

「Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシ」という用語は、上記に記載のＣ_１－Ｃ_３－アルコキシ基を指し、Ｃ_１－Ｃ_３－アルコキシ基の水素原子の少なくとも一つ、例えば、１、２、３、４、５又は６個の水素原子が、ハロゲン原子、好ましくは塩素又はフッ素原子、特にフッ素原子によって置き換わっている。Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシの例には、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシ、２－クロロエトキシ、２，２－ジクロロエトキシ、２，２，２－トリクロロエトキシ、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、２－フルオロエトキシ、２，２－ジフルオロエトキシ、２，２，２－トリフルオロエトキシ、１－フルオロエトキシ、１，１－ジフルオロエトキシ、１，１，２，２－テトラフルオロエトキシ、ペンタフルオロエトキシなどがある。特に、「Ｃ_１－Ｃ_３－ハロアルコキシ」は、上記に記載のフッ素化メトキシから、トリクロロメトキシ、２，２，２－トリクロロエトキシ及び２，２，２－トリフルオロエトキシから、特にトリフルオロメトキシから選択される。

【0045】

「５～１０員のヘテロ芳香環」という用語は、５～６員の単環式芳香環又は縮合８～１０員の二環式芳香環を指し、単環式又は二環式芳香環は独立にＮ、ＮＲ^ｃ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子又はヘテロ基を含み、Ｒ^ｃは、水素及びＣ_１－Ｃ_４－アルキルからなる群から選択される。そのような５～６員の単環式芳香環の例には、チエニル、フリル、ピロリル、フラザニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、１，２，３－トリアゾリル、１，２，４－トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、１，２，４－トリアジニル、１，３，６－トリアジニルなどがある。そのような８～１０員の二環式芳香環の例には、キノリニル、イソキノリニル、イミダゾピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、シンノリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、インドリル、イソインドリル、アザインドリル、インドリジニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピルジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリルなどがある。

【0046】

これらの所期の使用に関連して、式Ｉ中の可変要素Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、ａ及びｂは特に、以下の意味を有し、これらは、それ自体で及び少なくとも一つの他の若しくはすべてと組み合わせての両方で考慮して、式Ｉの化合物の特別な実施形態を表す。

【0047】

Ｒ^１は、好ましくは、水素又は基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、水素、メチル、フェニル、及び環員としてＮ、ＮＲ^ｃ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～４個のヘテロ原子若しくはヘテロ基を含む５～１０員のヘテロ芳香環からなる群から選択され、５～１０員のヘテロ芳香環は置換されていないか、１、２若しくは３個の基Ｒ^７を有していることができ、Ｒ^ｃ及びＲ^７は、上記の一般的な意味の一つを有するか、特には以下の好ましい意味の一つを有する。

【0048】

より好ましくは、Ｒ^１は、水素及び基－ＣＨ_２Ｒ^１ａからなる群から選択され、Ｒ^１ａは、水素、メチル及び環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む５～６員の単環式ヘテロ芳香環からなる群から選択され、５～６員の単環式ヘテロ芳香環は置換されていないか、１個の基Ｒ^７を有しており、Ｒ^７は、ハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される。

【0049】

特に、Ｒ^１は、水素及び基－ＣＨ_２Ｒ^１ａからなる群から選択され、Ｒ^１ａは、水素及び環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員単環式ヘテロ芳香環からなる群から選択される。

【0050】

詳細には、Ｒ^１は、基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員の単環式ヘテロ芳香環である。具体的には、Ｒ^１は、基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員の単環式ヘテロ芳香環である。非常に具体的には、Ｒ^１は、基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａは、フリル、チエニル、又はピリジルである。

【0051】

別により好ましい実施形態において、Ｒ^１は、水素、メチル、及び基ＣＨ_２－Ｉ′若しくはＣＨ_２－ＩＩ′から選択される。

【0052】

【化2】

式中、^＊は尿素窒素原子への結合点を示し、
Ｘ^３はＮＲ^ｃ、Ｏ又はＳであり；
ｃは０、１、２又は３であり；
Ｒ^７は本明細書に記載の通りである。

【0053】

特に、Ｒ^１は、ＣＨ_２－Ｉ′及びＣＨ_２－ＩＩ′からなる群から選択される。

【0054】

【化3】

式中、^＊は尿素窒素原子への結合点を示し、Ｒ^７、Ｘ^３及びｃは本明細書に記載の通りである。

【0055】

Ｒ^２は好ましくは水素又はメチルである。特にＲ^２は水素である。

【0056】

Ｒ^３は好ましくは水素又はメチルである。特にＲ^３は水素である。

【0057】

Ｒ^４は好ましくはメチル又はエチルである。特にＲ^４はメチルである。

【0058】

好ましくは、各Ｒ^５は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシフッ素からなる群から選択される。より好ましくは、各Ｒ^５は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される。さらにより好ましくは、各Ｒ^５は、独立にフッ素、メチル及びトリフルオロメチルからなる群から選択される。特に、各Ｒ^５は、独立にフッ素及びメチルからなる群から選択される。

【0059】

好ましくは、各Ｒ^６は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシフッ素からなる群から選択される。より好ましくは、各Ｒ^６は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される。さらにより好ましくは、各Ｒ^６は独立に、フッ素、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。特に、各Ｒ^６は独立に、フッ素又はメチルから選択される。

【0060】

Ｘ^１はＮＲ^ａ又はＯである。好ましくは、Ｘ^１はＮＨ又はＯである。

【0061】

好ましくは、Ｘ^２はＯ又はＳである。特に、Ｘ^２はＯである。

【0062】

好ましい実施形態において、Ｙは酸素原子である。別の好ましい実施形態において、Ｙは２個の水素原子を表す。

【0063】

好ましくは、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃはそれぞれ独立に、水素及びＣ_１－Ｃ_３－アルキルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃはそれぞれ独立に、水素及びメチルから選択される。特に、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃは水素である。

【0064】

好ましくは、ａは０、１、２又は３である。より好ましくは、ａは０、１又は２である。特にａは０である。

【0065】

好ましくは、ｂは０、１又は２である。より好ましくは、ｂは０又は１である。特にｂは０である。

【0066】

式ＣＨ_２－Ｉ′の基において、可変要素Ｘ^３、ｃ及びＲ^７は、存在する場合、それら自体及び少なくとも一つの他のもの又はすべてと組み合わせての両方を考慮すると、特に次の意味を有する。

【0067】

好ましくは、各Ｒ^７は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される。より好ましくは、各Ｒ^７は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－ハロアルキルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、各Ｒ^７は独立に、フッ素、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。特に、各Ｒ^７は独立に、フッ素及びメチルから選択される。

【0068】

好ましくは、Ｘ^３はＯ又はＳである。特に、Ｘ^３はＯである。別の特定の実施形態において、Ｘ^３はＳである。

【0069】

好ましくは、ｃは０、１又は２である。より好ましくは、ｃは０又は１である。特にｃは０である。

【0070】

式ＣＨ_２－ＩＩ′の基において、可変要素ｃ及びＲ^７は、存在する場合、それら自体及び少なくとも一つの他のもの又はすべてと組み合わせての両方を考慮すると、特に次の意味を有する。

【0071】

好ましくは、各Ｒ^７は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択される。より好ましくは、各Ｒ^７は、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－ハロアルキルからなる群から選択される。さらにより好ましくは、各Ｒ^７は独立に、フッ素、メチル及びトリフルオロメチルから選択される。特に、各Ｒ^７は独立に、フッ素及びメチルから選択される。

【0072】

好ましくは、ｃは０、１又は２である。より好ましくは、ｃは０又は１である。特にｃは０である。

【0073】

本発明の好ましい実施形態は、
Ｒ^１が水素又は基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａが水素又は環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立に選択される１～３個のヘテロ原子、特に１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素又はメチルであり；
Ｒ^４がＣ_１－Ｃ_２－アルキルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＲ^ａ又はＯであり；
Ｘ^２がＯ又はＳであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
Ｒ^ａが、水素及びＣ_１－Ｃ_３－アルキルからなる群から選択され；
ａが０、１、２又は３であり；
ｏが０、１又は２である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0074】

本発明のより好ましい実施形態は、
Ｒ^１が水素又は基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａが水素又は環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
ａが０であり；
ｂが０である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0075】

本発明の特定の実施形態は、
Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａが、環員としてＮ、Ｏ及びＳからなる群から選択される１個のヘテロ原子を含む置換されていない５～６員単環式ヘテロ芳香環であり；
Ｒ^２が水素であり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
ａが０であり；
ｂが０である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0076】

本発明の別の好ましい実施形態は、
Ｒ^１が水素、メチル又は基ＣＨ_２－Ｉ′若しくはＣＨ_２－ＩＩ′であり；
Ｒ^２が水素及びメチルから選択され；
Ｒ^３が水素及びメチルから選択され；
Ｒ^４がＣ_１－Ｃ_２－アルキルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＲ^ａ又はＯであり；
Ｘ^２がＯ又はＳであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
Ｒ^ａが、水素及びＣ_１－Ｃ_３－アルキルからなる群から選択され；
ａが０、１、２又は３であり；
ｂが０、１又は２であり；
ｃが０、１又は２である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0077】

本発明の別のより好ましい実施形態は、
Ｒ^１が水素、メチル又は基ＣＨ_２－Ｉ′若しくはＣＨ_２－ＩＩ′であり；
Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
ａが０、１又は２であり；
ｂが０又は１であり；
ｃが０又は１である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0078】

本発明のさらにより好ましい実施形態は、
Ｒ^１が水素、メチル又は基ＣＨ_２－Ｉ′又はＣＨ_２－ＩＩ′であり；
Ｒ^２が水素又はメチルであり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
各Ｒ^５が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^６が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
ａが０であり；
ｂが０であり；
ｃが０である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0079】

本発明の別の特定の実施形態は、
Ｒ^１が基ＣＨ_２－Ｉ′又はＣＨ_２－ＩＩ′であり；
Ｒ^２が水素であり；
Ｒ^３が水素であり；
Ｒ^４がメチルであり；
Ｘ^１がＮＨ又はＯであり；
Ｘ^２がＯであり；
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
Ｙが酸素原子又は２個の水素原子を表し；
ａが０であり；
ｂが０であり；
ｃが０である、
一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0080】

実施形態の別の好ましい群は、、基ＣＨ_２－Ｉ′において、
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
ｃが０、１又は２である、
一般式Ｉの化合物に関するものである。

【0081】

実施形態の別の好ましい群は、基ＣＨ_２－ＩＩ′において、
各Ｒ^７が、独立にハロゲン、Ｃ_１－Ｃ_３－アルキル、Ｃ_１－Ｃ_２－ハロアルキル及びＣ_１－Ｃ_２－アルコキシからなる群から選択され；
ｃが０、１又は２である、
一般式Ｉの化合物に関するものである。

【0082】

実施形態のさらにより好ましい群は、基ＣＨ_２－Ｉ′において、
Ｘ^３がＯ又はＳであり；
各Ｒ^７が独立に、フッ素、メチル又はトリフルオロメチルから選択され；
ｃが０又は１である、
一般式Ｉの化合物に関するものである。

【0083】

実施形態のさらにより好ましい群は、基ＣＨ_２－ＩＩ′において、
各Ｒ^７が独立に、フッ素、メチル又はトリフルオロメチルから選択され；
ｃが０又は１である、
一般式Ｉの化合物に関するものである。

【0084】

本発明の特に好ましい実施形態別は、式Ｉ－Ａに相当する一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0085】

【化4】

式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯであり；
Ｘ^３はＯ又はＳである。

【0086】

本発明の別の特に好ましい実施形態別は、式Ｉ－Ｂに相当する一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0087】

【化5】

式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯである。

【0088】

本発明の別の特に好ましい実施形態別は、式Ｉ－Ｃに相当する一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0089】

【化6】

式中、
Ｘ^１はＮＨ又はＯであり；
Ｘ^３はＯ又はＳである。

【0090】

本発明の別の特に好ましい実施形態は、式Ｉ－Ｄに相当する式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に関するものである。

【0091】

【化7】

式中、
Ｒ^１は水素又はメチルから選択され；
Ｘ^１はＮＨ又はＯである。

【0092】

式Ｉの特別に好ましい化合物は、［２－（２－フリルメチルカルバモイル－アミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがフラン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＯであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂがＯである化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。この化合物は、以下においてＭｙｏＭｅｄ－９４６とも称される。

【0093】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、Ｎ－［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］－４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンズアミド（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがフラン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＮＨであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。

【0094】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－ベンゾエート（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがチエン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＯであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。

【0095】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］－ベンズアミド（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがチエン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＮＨであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり及びｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。

【0096】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、［２－オキソ－２－（２－ピリジルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシ－メチル］ベンゾエート（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがピリジン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＯであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。この化合物は、以下においてＭｙｏＭｅｄ－２０３とも称される。

【0097】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミド（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがチエン－２－イルであり、Ｒ^２がＨであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＮＨであり、Ｘ^２がＯであり、Ｙが２個の水素原子を表し（すなわち、Ｃ＝ＹがＣＨ_２である。、ａが０であり及びｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。この化合物は、以下においてＭｙｏＭｅｄ－２０５とも称される。

【0098】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、（１－メチル－２－オキソ－２－ウレイド－エチル）４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（すなわち、Ｒ^１がＨであり、Ｒ^２がメチルであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＯであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。この化合物は、以下においてＭｙｏＭｅｄ－９４６－５とも称される。

【0099】

式Ｉの別の特別に好ましい化合物は、［１－メチル－２－（メチルカルバモイル－アミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－ベンゾエート（すなわち、Ｒ^１が基－ＣＨ_２Ｒ^１ａであり、Ｒ^１ａがＨであり、Ｒ^２がメチルであり、Ｒ^３がＨであり、Ｒ^４がメチルであり、Ｘ^１がＯであり、Ｘ^２がＯであり、ＹがＯであり、ａが０であり、ｂが０である化合物Ｉ）及びその薬学的に許容される塩である。この化合物は、以下においてＭｙｏＭｅｄ－９４６－８とも称される。

【0100】

本発明による化合物Ｉは、文献から公知の方法と同様の方法によって製造することができる。本発明による化合物への重要なアプローチが、図式１に描かれた方法に従って４－ブロモアルキル－置換されたメチルベンゾエート化合物ＩＩとクロメン－２－オン化合物ＩＩＩと反応させて２－オキソクロメン－置換されたメチルベンゾエート化合物ＩＶとし、それを加水分解して中間体の安息香酸化合物Ｖとすることで提供される。

【0101】

図式１：

【0102】

【化8】

【0103】

図式１において、可変要素Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘ^２、ａ及びｂは、上記の意味を有する。

【0104】

図式１のステップａ）において、式（ＩＩ）のブロミドを、求核置換反応に好適な条件下で化合物ＩＩＩのＯＨ、ＳＨ又はＨＮＲ^ｂ基（Ｈ－Ｘ^２－基）と反応させる。当業者は、この種類の求核置換反応に必要な反応条件については熟知している。代表的には、この反応は、塩基存在下で行われる。好適な塩基は、無機又は有機であることができる。好適な無機塩基の例は、アルカリ金属炭酸塩、例えばＬｉ_２ＣＯ_３、Ｎａ_２ＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３又はＣｓ_２ＣＯ_３、アルカリ金属水酸化物、例えばＬｉＯＨ、ＮａＯＨ又はＫＯＨ、又はリン酸塩、例えばＬｉ_３ＰＯ_４、Ｎａ_３ＰＯ_４、Ｋ_３ＰＯ_４又はＣｓ_３ＰＯ_４である。好適な有機塩基の例は、例えば三級アミン、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）など、塩基性Ｎ－複素環、例えばモルホリン、ピリジン、ルチジン、ＤＡＢＣＯ、ＤＢＵ又はＤＢＮ、又はアルコキシレート、例えばナトリウム又はカリウムメタノレート、エタノレート、プロパノレート、イソプロパノレート、ブタノノレート又はｔｅｒｔ－ブタノノレートである。

【0105】

そうして得られた式（ＩＶ）のメチルエステル化合物を、図式１のステップｂ）で、強塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、例えばＬｉＯＨ、ＮａＯＨ又はＫＯＨの存在下にケン化して、式（Ｖ）の安息香酸化合物を生成する。

【0106】

次に、中間体安息香酸化合物Ｖをさらに、図式２に描いた方法に従って、尿素化合物ＶＩａ若しくはＶＩｂと反応させて、本発明による化合物Ｉを生成する。

【0107】

図式２：

【0108】

【化9】

【0109】

図式２において、可変要素Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘ^２、Ｙ、Ｒ^ａ、ａ及びｂは上記の意味を有する。

【0110】

図式２のステップｃ）において、式（Ｖ）の安息香酸中間体を、クロライド基を含む式（ＶＩａ）の尿素化合物と、又はＮ（Ｈ）Ｒ^ａ基を含む式（ＶＩｂ）の尿素化合物と反応させて、式Ｉの相当するエステル又はアミド化合物を形成する。図式２のステップｃ）における、式（Ｖ）の安息香酸中間体の、クロライド基を含む式（ＶＩａ）の尿素化合物との反応を、求核置換反応に好適な条件下で行う。当業者は、これらの種類の反応に必要な反応条件については熟知している。代表的には、この反応は、反応時に形成される酸を中和するために、上記に記載の塩基の存在下で行う。所望の場合、その求核置換反応に好適なブロミド塩又は特にヨージド塩を加えることで、化合物（ＶＩａ）をイン・サイツでさらに活性化することができる。好適なブロミド塩又はヨージド塩は、例えば、アルカリ金属臭化物又はヨウ化物及びテトラアルキルアンモニウム臭化物又はヨウ化物である。例としては、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、臭化テトラブチルアンモニウム及びヨウ化テトラブチルアンモニウムなどがある。

【0111】

図式２のステップｃ）での、式（Ｖ）の安息香酸中間体の、Ｎ（Ｈ）Ｒ^ａ基を含む式（ＶＩｂ）の尿素化合物との反応は、アミド結合形成に好適な条件下で行う。当業者は、これらの種類の反応に必要な反応条件については熟知している。代表的には、そのアミド結合形成は、カップリング試薬の存在下で行う。好適な試薬（活性化剤）は公知であり、例えば、カルボジイミド類、例えばＥＤＣＩ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＥＤＣとも略される）、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）及びＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ベンゾトリアゾール誘導体、例えばＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、ＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＡＴＵ（Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（（Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）及びＨＣＴＵ（１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロテトラフルオロボレート）、ホスホニウム誘導活性化剤、例えばＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、Ｐｙ－ＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）－トリピロリジンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）及びＰｙ－ＢｒＯＰ（ブロモトリピロリジンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、及び他のもの、例えばＣＯＭＵ（（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウム－ヘキサフルオロホスフェート）からなる群から選択される。上記の活性化剤は、互いに組み合わせて用いることもできる。一般に、その活性化剤は、過剰には使用されないその反応物に関して、少なくとも等モル量で使用される。塩基性媒体中では、ベンゾトリアゾール系及びホスホニウム系カップリング試薬が一般に用いられる。あるいは、式（Ｖ）のカルボン酸中間体を最初に、いわゆる活性エステルに変換することができ、それは正式には、活性エステル形成性アルコール、例えばｐ－ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド又はＯＰｆｐ（ペンタフルオロフェノール）とカルボン酸の反応によって得られる。次に、その活性エステルを、カップリング試薬の存在下又は非存在下でアミン３と反応させる。

【0112】

式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、購入することができるか、当業者に公知である方法を用いて合成することができる。

【0113】

式（ＶＩａ）及び（ＶＩｂ）の化合物は、購入することができるか、例えば図式３に描いた手順に従って合成することができる。

【0114】

図式３：

【0115】

【化10】

【0116】

図式３において、可変要素Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^ａは上記の意味を有する。図式３のステップｄ）で、Ｙが酸素原子を表す場合、尿素化合物（ＶＩＩ）を、求核アシル化条件下で酸塩化物（ＶＩＩＩａ）又は（ＶＩＩＩｂ）と反応させる。アシル化反応に好適な反応条件は当業者には公知である。Ｙが２個の水素原子を表す場合、求核置換反応に好適な条件下で行う。当業者は、これらの種類の反応に必要な反応条件を熟知している。所望の場合、化合物（ＶＩＩＩａ）を、上記の方法に従ってイン・サイツでさらに活性化することができる。代表的には、ステップｄ）を、上記に記載の３級アミンなどの塩基存在下で行って、反応中に生成される塩化水素その他の酸を失活させる。

【0117】

一部の特定の場合、適切な保護基を用いて、化合物（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩａ）又は（ＶＩＩＩｂ）中に存在し得る、及びその反応で競合するか、その反応を妨害し得る他の反応性基との副反応を回避することが必要となり得る。これらの場合、アミド結合形成後にこれらの保護基を除去するのに、別の脱保護ステップが必要となる場合がある。好適な保護基及びそのような好適な保護基を用いて異なる置換基を保護及び脱保護する方法は当業者には公知であり、その例は、Ｔ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （３^ｒｄ ｅｄ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ （１９９９）にある。

【0118】

さらに、化合物（ＶＩｃ）は、例えば図式４に描かれた手順に従って、化合物（ＶＩａ）から製造することができる。

【0119】

図式４：

【0120】

【化11】

【0121】

図式４では、可変要素Ｒ^１、Ｒ^２及びＹは上記の意味を有する。図式４のステップｅ）において、尿素化合物（ＶＩａ）を、アジド源、例えばホスホリルアジド、アジ化水素酸又はアジ化ナトリウム、アジドの存在下に、又はＺｗｉｅｒｚａｋ， Ａ． ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ、Ｓｕｌｆｕｒ， ａｎｄ Ｓｉｌｉｃｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ （１９９３）， ７５：１－４， ５１－５４によって記載されたＰＰｈ_３その他のリン試薬とのシュタウディンガー反応を介して、アジド化合物（ＩＸ）とする。代表的には、ステップｅ）を、上記に記載の３級アミンなどの塩基の存在下に行って、反応時に生成する塩酸を失活させる。

【0122】

図式４のステップｆ）で、化合物（ＩＸ）のアジド基を、水素化触媒の存在下に水素で還元するか、水素化物と反応させて、アミン化合物（ＶＩｃ）を得る。この種類の反応に好適な反応条件は、当業者には公知である。

【0123】

別断で断りがなければ、上記の反応は代表的には、有機溶媒、例えば非プロトン性有機溶媒、例えば置換されたアミド、ラクタム及び尿素；例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、テトラメチル尿素、環状エーテル；例えばジオキサン、テトラヒドロフラン、ハロゲン化炭化水素；例えばジクロロメタン、及びこれらの混合物、並びにそれらのＣ_１－Ｃ_６－アルカノール及び／又は水との混合物中で行う。

【0124】

上記で記載の反応は通常、使用される化合物の反応性に応じて、室温～使用される溶媒の沸点の温度で行われる。

【0125】

反応混合物を、従来法で、例えば水と混合し、相を分離し、適切な場合には粗生成物をクロマトグラフィーによって精製することで後処理する。中間体及び最終生成物が固体として得られる場合、その精製は、再結晶又は温浸によって行うこともできる。

【0126】

反応条件、試薬及び合成経路の順序、反応条件と適合しない可能性がある化学官能基の保護、及び製造方法の反応順序における好適な点での脱保護の適切な操作を含む通常の実験は、通常の技術の範囲内である。

【0127】

すでに前述したように、一般式Ｉの化合物が、細胞試験並びに臨床的に関連のある動物モデルで筋肉消耗及び収縮不全を減弱することができることが認められた。

【0128】

したがって、本発明は、筋肉消耗状態の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物に関する。

【0129】

筋肉消耗状態及びミオパチーに関連して本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、状態及び／又は疾患に関連する症状、すなわち筋肉消耗又は筋肉衰弱の治療を指す。

【0130】

筋肉消耗状態及びミオパチーに関連して本明細書で使用される「予防」という用語は、予防処置、すなわち、状態及び／又は疾患に関連する筋肉消耗又は筋肉衰弱を予防又はリスク低下するための治療を指す。

【0131】

本明細書で使用される「筋肉消耗」という用語は、筋肉の質量減少として見ることができる大きさ（断面積の減少）及び筋線維数の減少を指すと理解されるべきであり、それはまた、科学文献及び医学文献で筋萎縮とも称される。

【0132】

本明細書で使用される「ミオパチー」という用語は、筋線維が適切に機能しない筋肉の疾患を指す。これは筋力低下をもたらす。本明細書で使用される「ミオパチー」という用語は、特に、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連するミオパチーを指す。しかしながら、本発明の化合物の効果はその経路に限定されないと考えられる。

【0133】

筋肉消耗は、筋肉タンパク質合成と筋肉タンパク質分解の間のバランスの変化によって引き起こされると考えられている。特に、萎縮時に、筋タンパク質のユビキチン化などの筋タンパク質分解経路が活性化されると考えられている。

【0134】

筋肉消耗は、代表的には、悪液質、例えば心疾患によって引き起こされる悪液質、すなわち心臓悪液質を患う患者で認められる。さらに、筋肉消耗は特に骨格筋に影響を及ぼし、骨格筋の劣化、すなわち骨格筋萎縮をもたらす。しかしながら、筋肉消耗は心筋にも影響を与え得る。

【0135】

したがって、本発明の好ましい実施形態は、心臓悪液質、骨格筋萎縮又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物に関する。

【0136】

心臓悪液質、心臓及び骨格筋の萎縮は、例えば、心筋梗塞を患う患者で認められ、これは代表的には、症状及び予後の悪化につながり、回復期を著しく延長する可能性がある。

【0137】

したがって、本発明の特定の実施形態は、心臓悪液質、骨格筋萎縮又は心臓筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物に関するものであり、当該心臓悪液質、骨格筋萎縮又は心臓筋萎縮は心筋梗塞によって引き起こされる。

【0138】

非常に多くの既知の疾患関連状態があり、心筋萎縮又は骨格筋萎縮及び／又は悪液質を引き起こす、疾患に病気に関連しない多くの身体状態もある。

【0139】

心筋又は骨格筋の萎縮及び／又は悪液質を引き起こす可能性のある疾患関連の状態は、例えば、鬱血性心不全、慢性心不全、心筋梗塞、がん、先天性ミオパチー、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、家族性アミロイド多発神経障害、血液供給低下、ホルモン欠乏症、慢性腎疾患、腎不全、糖尿病、感染症、慢性膵炎及び自己免疫障害である。

【0140】

骨格筋萎縮及び／又は悪液質を引き起こす可能性があり、疾患とは関連性がない身体状態は、例えば、重度火傷、脱神経、一時的若しくは長期の固定、長期機械的人工換気、加齢性サルコペニア、長期無重力、栄養不良及び薬物中毒である。

【0141】

がん治療に使用される特定の化学療法剤は、心臓毒性及び筋毒性を示す。たとえば、各種がん治療で使用される効率的な化学療法薬であるドキソルビシンの使用は、初期及び慢性の心毒性及び筋毒性に関連している（Ｋ．Ｍ． Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ， ２０１７， ８（４５）， ７９４４１－７９４５２； Ｄ．Ｓ． Ｈｙｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｔ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ２０１１， ２０２８， ２０２３－２０２８； Ｔ．Ａ． Ｎｉｓｓｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．， ２０１６， ６， ３２６９５； Ｍ．Ｓ． Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ： Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌｕｒｅ， ２０１９， １２（３）， １－１２）。齧歯類において、ドキソルビシンの単回注射は心筋量及び骨格筋量を減少させ得るものであり、その後機能が顕著に損なわれる。

【0142】

本発明の好ましい実施形態は、次の疾患又は状態：鬱血性心不全、慢性心不全、がん、筋毒性物質によるがん治療、先天性ミオパチー、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性腎疾患、腎不全、糖尿病、重度火傷、加齢性サルコペニア、血液供給低下、一時的若しくは長期的固定、長期機械的人工換気、脱神経、長期無重力状態及び栄養不良の一つに起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物に関するものである。

【0143】

本発明はまた、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の治療又は予防に関する。理論に縛られることを望むものではないが、糖尿病に対するプラスの効果は、筋肉のインスリン感受性を高めるＭｕＲＦ１阻害に基づいていると考えられている。Ｓ． Ｈｉｒｎｅｒらは、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２００８， ３７９， ６６６－６７７で、ＭｕＲＦ１がグリコーゲン貯蔵を枯渇させ、解糖を阻害するのに対し、インスリンは解糖とグリコーゲン貯蔵を上昇させるという意味で、ＭｕＲＦ１とインスリンは拮抗的な形で機能的に関連していると理解することができることを示した。その結果、ＭｕＲＦ１の阻害は、インスリンの必要量を減らし、糖尿病治療のための戦略を構成することができる。

【0144】

本発明は、特に以下のものに関するものである。

【0145】

鬱血性心不全に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0146】

慢性心不全に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0147】

がんに起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0148】

ドキソルビシンなどの筋毒性及び／又は心臓毒性物質によるがん治療に起因する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0149】

先天性ミオパチーに起因する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0150】

ＡＩＤＳに起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0151】

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に起因する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0152】

慢性腎疾患に起因する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0153】

腎不全に起因する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0154】

糖尿病に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0155】

重度火傷に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0156】

老化性サルコペニアに起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0157】

血液供給減少に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0158】

一時的又は長期的固定に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0159】

長期機械的人工換気に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0160】

脱神経に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0161】

長期無重力に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0162】

栄養不良に起因する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0163】

糖尿病の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0164】

本発明は、特に、下記のものに関するものである。

【0165】

心臓悪液質の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0166】

腫瘍悪液質の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0167】

心筋梗塞の治療に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0168】

慢性心不全の治療に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0169】

機械的人工換気からの回復に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0170】

本発明は、具体的には下記のものに関するものである。

【0171】

駆出率の低下を伴う心不全（ＨＦ－ｒＥＦ）に起因又は関連する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0172】

保存された駆出率を伴う心不全（ＨＦ－ｐＥＦ）に起因又は関連する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0173】

高血圧に起因する、又は高血圧に関連する骨格筋又は心筋の萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0174】

腫瘍悪液質に起因又は関連する骨格筋又は心筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0175】

ドキソルビシン誘発の筋萎縮及び／又は心臓毒性の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0176】

老化によるサルコペニア及び／又は心筋症の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0177】

慢性腎疾患による筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0178】

機械的人工換気又は鬱血性心不全による横隔膜衰弱の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0179】

先天性ミオパチー、特に先天性筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0180】

糖尿病誘発性筋萎縮の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0181】

糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の治療又は予防に使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0182】

ＭｕＲＦ１のユビキチンＥ３リガーゼ活性を阻害することで、並びにタイチンなどの標的の筋肉タンパク質へのＭｕＲＦ１の結合を阻害することでＭｕＲＦ１の機能を低下させる能力があるため、式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩は、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連する状態；及び特に、筋肉消耗及びミオパチーを生じさせる不均衡な筋肉タンパク質合成及び筋肉タンパク質分解に関連する、代表的には、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）の発現増加に関連するミオパチーの治療又は予防での使用に好適でもある。

【0183】

したがって、本発明はさらに、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現増加に関連する状態の治療又は予防に使用するための、上記に記載の式Ｉの化合物に関する。

【0184】

特に、本発明はさらに、筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連するミオパチーの治療又は予防に使用するための、上記に記載の式Ｉの化合物に関する。

【0185】

ＭｕＲＦ１発現増加に関連するミオパチーは、例えば、重症ミオパチー、ネマリンミオパチー、炎症性ミオパチー、糖尿病からのミオパチー、肺高血圧症からのミオパチー、慢性心不全時、特にサブタイプである駆出率低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）及び保存された駆出率を伴う心不全（ＨＦｐＥＦ）時に発症するミオパチー、腎不全からのミオパチー、及び腫瘍悪液質からのミオパチーから選択される。

【0186】

ＭｕＲＦ１発現増加と肺高血圧からのミオパチーとの間の関連は、例えば、ｄｕ Ｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ２０１５ Ａｕｇ １４， １１７（５）， ４２４－４３６に記載されている。

【0187】

ＭｕＲＦ１発現増加とアンギオテンシンＩＩによって促進される慢性心不全及び／又は腎不全ミオパチーとの間の関連は、例えば、ｄｕ Ｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ２０１５ Ａｕｇ １４， １１７（５）， ４２４－４３６に記載されている。

【0188】

同様に、Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｅａｒｔ． Ｆａｉｌ．， ２０１５ Ｍａｒ， １７（３）， ２６３－２７２には、ＭｕＲＦ１発現増加と拡張期心不全（ＨＦｐＥＦ）時に発症するミオパチーとの関係が記載されている。

【0189】

ＭｕＲＦ１の上昇が慢性腎不全患者で報告されており、これは筋萎縮と密接に相関している（Ｊ． Ａｎｉｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ， ２０１９， １０（２）， ３２３－３３７； Ｓ．Ｈ． Ｌｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｎｅｐｈｒｏｌ．， ２０１１， ２２（５）， ８２１－８２４）。したがって、ＭｕＲＦ１を低下させる化合物は、慢性腎不全時に骨格筋を保護すると予測される。腎障害及び筋萎縮の概念は、急性ゲンタマイシン誘発腎損傷を用いる動物モデルでもさらに検証されている（Ｊ． Ａｎｉｏｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２０１６， ７９， ５０５－５１６）。

【0190】

ＭｕＲＦ１は、骨格筋の老化時に上昇する（Ｏ． Ｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２０１６， ９８， ２１８－２３０）。これは、サルコペニア（筋原線維の喪失）及び心筋症に寄与すると考えられているミトコンドリア機能障害に関連している（Ｈ．Ｗ． Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ． ２０２０， ２１（３）， ３６７－３８０）。ミトコンドリア機能障害からの救済が、心筋症からのマウスモデルで行われている（Ｙ． Ａ． Ｃｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．， ｅＬｉｆｅ， ２０２０， ９， ５５５１３）。したがって、ミトコンドリア機能を改善し、ＭｕＲＦ１を低下させる化合物は、加齢関連サルコペニア及び心筋症から保護すると予測される。

【0191】

機械的人工換気による横隔膜へのストレス（Ｈ． Ｗ． ｖａｎ Ｈｅｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２００８， ２９４（６）， Ｌ１２６０－８）又は鬱血性心不全（Ｐ． Ｅ． Ｈｏｏｉｊｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．， ２０１５， １９１（１０）， １１２６－１１３８）は、ＭｕＲＦ１（ｖａｎ Ｈｅｅｓ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ； Ｈｏｏｊｉｍａｎ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ．）などのユビキチン及びプロテアソーム系を活性化する。これが単に相関的な知見ではないということは、ボルテゾミブ（ｖａｎ Ｈｅｅｓ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ）によるプロテアソーム系の阻害、又はノックアウトモデル（Ｈｏｏｊｉｍａｎ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ．）を使用することによるＭｕＲＦ１の除去が横隔膜衰弱（Ｈｏｏｊｉｍａｎ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ．）から保護するという所見によって裏付けられる。したがって、ここで記載の化合物は、鬱血性心不全及び重症疾患において横隔膜収縮力を保護すると予測される（ｖａｎ Ｈｅｅｓ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ； Ｈｏｏｊｉｍａｎ， Ｌｏｃ． ｃｉｔ．）。

【0192】

遺伝的筋萎縮は、筋肉組織の著しい喪失と筋力の喪失に関連している。ＭｕＲＦ１の上昇が、これにおいて機械的に関係している（Ｊ． Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２０１３， ４５（１０）， ２２６６－２２７９）。これの具体例として、解糖活性筋肉線維における線維レベルでのＭｕＲＦ１の上昇が、最も萎縮性となる線維及び組織と密接に相関しているネマリンミオパチーを挙げることができる（Ｆ． Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１５， ２４（１８）， ５２１９－５２３３）。

【0193】

糖尿病を含む多くの種類の代謝ストレス状態がＭｕＲＦ１発現を活性化することが示されている（Ｓ． Ｈ． Ｌｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２００４， １８（１）， ３９－５１）。糖尿病（すなわち、マウスのストレプトトジン誘発糖尿病）の動物モデルにおいて、これはＦｏｘｏ－ＭｕＲＦ１シグナル伝達軸を活性化することが示されており、次にこれは筋肉消耗と密接に相関している（Ｂ． Ｔ． Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ， ２０１９， ６８（３）， ５５６－５７０）。

【0194】

重度の肥満は、骨格タンパク質の合成及び分解に影響を与える循環因子（例えば、インスリン及びアミノ酸）の変化を伴う（Ｃ． Ｓ． Ｋａｔｓａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｏｂｅｓｉｔｙ， ２０１１， １９， ４６９－４７５）。インスリン抵抗性は、ユビキチン－プロテアソーム経路の活性化によって筋肉タンパク質の分解を加速する（Ｘ． Ｗａｎｇ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １４７（９）， ４１６０－４１６８）。以前の研究で、体重減少の最大３０％が、肥満における各種ダイエット法を用いた筋肉量の減少が原因である可能性があることが明らかになった（Ｄ． Ｌ． Ｂａｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｂｅｓ． Ｒｅｌａｔ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｏｒｄ．， １９９４， １８， ３５－４０）。

【0195】

したがって、本発明の好ましい実施形態は、重症疾患ミオパチー、ネマリンミオパチー、炎症性ミオパチー、糖尿病からのミオパチー、肺高血圧からのミオパチー、慢性心不全からのミオパチー（特にサブタイプＨＦｒＥＦ及びＨＦｐＥＦ）、腎不全からのミオパチー、腫瘍性悪液質からのミオパチー、機械的人工換気又は鬱血性心不全による横隔膜に対するストレスによる横隔膜衰弱、先天性ミオパチー、特に先天性（ｃｏｎｇｅｎｅｔｉｃ）筋萎縮；加齢性サルコペニア及び心筋症の治療又は予防に使用するための、上記に記載の式Ｉの化合物に関するものである。

【0196】

本発明は特に、下記のものに関するものである。
重症疾患ミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
ネマリンミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
炎症性ミオパチー治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
糖尿病からのミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
肺高血圧からのミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
慢性心不全からのミオパチー、特にサブタイプＨＦｒＥＦ及びＨＦｐＥＦの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
腎不全からのミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物
腫瘍性悪液質からのミオパチーの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
機械的人工換気又は鬱血性心不全による横隔膜に対するストレスによる横隔膜衰弱の治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
先天性ミオパチー、特に先天性（ｃｏｎｇｅｎｅｔｉｃ）筋萎縮の治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
加齢性サルコペニアの治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
加齢性心筋症の治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。
糖尿病の治療又は予防で使用するための、上記に記載の一般式Ｉの化合物。

【0197】

さらに、筋肉の状態に対するそれらの作用とは独立して、化合物Ｉ及びその塩は、収縮期又は拡張期の機能障害に関連する心臓状態において有益な効果を有することが見出された。したがって、本発明はまた、収縮期又は拡張期の機能障害に関連する心臓状態の治療又は予防に使用するための化合物Ｉ及びその塩に関するものである。

【0198】

本発明はさらに、上記に記載の一般式Ｉの化合物から選択される少なくとも一つの化合物又はその少なくとも一つの薬学的に許容される塩及び少なくとも一つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物（すなわち、医薬品）に関する。

【0199】

これらの薬学的に許容される担体は、医薬品形態及び所望の投与方式に従って選択される。

【0200】

本発明の化合物は、非経口（例えば、筋肉、腹腔内、静脈、ＩＣＶ、大槽内注射又は注入、皮下注射、又はインプラント）、経口、舌下、気管内、鼻腔内、局所、経皮、経膣又は直腸投与のための医薬組成物を製造するのに使用することができ、上記の状態又は疾患の予防又は治療のために、従来の医薬担体と混合して単位剤形で動物又はヒトに投与することができる。

【0201】

医薬組成物において、本発明の少なくとも一つの化合物を、単独で、又は一般に無毒性及び／又は薬学的に許容される従来の担体を含む好適な用量単位製剤中、さらなる活性化合物とともに製剤することができる。担体は、活性化合物用のビヒクル、担体、又は媒体として機能する固体、半固体又は液体の材料であり得る。好適な担体は、専門家医薬モノグラフに挙げられている。さらに、製剤は、薬学的に許容される担体又は通常の補助物質、例えば流動促進剤；湿展剤；乳化剤及び懸濁剤；防腐剤；抗酸化剤；抗刺激剤；キレート剤；コーティング助剤；乳濁液安定剤；フィルム形成剤；ゲル形成剤；臭気マスキング剤；味覚矯味剤；樹脂；親水コロイド；溶媒；可溶化剤；中和剤；拡散促進剤；顔料；四級アンモニウム化合物；再脂化及び過脂化剤；軟膏、クリーム又はオイルの原材料；シリコーン誘導体；拡散助剤；安定剤；滅菌剤；坐剤基剤；錠剤助剤、例えば結合剤、充填剤、流動促進剤、崩壊剤又はコーティング剤；推進剤；乾燥剤；乳白剤；増粘剤；ロウ；可塑剤及び白色鉱油を含むことができる。この点での製剤は、たとえば、Ｆｉｅｄｌｅｒ， Ｈ． Ｐ．， Ｌｅｘｉｋｏｎ ｄｅｒ Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ ｆｕｒ Ｐｈａｒｍａｚｉｅ， Ｋｏｓｍｅｔｉｋ ｕｎｄ ａｎｇｒｅｎｚｅｎｄｅ Ｇｅｂｉｅｔｅ ［Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｙ， ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｆｉｅｌｄｓ］， ４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｕｌｅｎｄｏｒｆ：ＥＣＶ－Ｅｄｉｔｉｏ－Ｋａｎｔｏｒ－Ｖｅｒｌａｇ， １９９６に記載の専門知識に基づくものである。

【0202】

好適な単位剤形には、錠剤、ゼラチンカプセル、粉剤、粒剤及び経口摂取用の液剤若しくは懸濁液などの経口投与用の形態、舌下、口腔、気管内又は鼻腔内投与用の形態、エアロゾル、インプラント、皮下、筋肉内又は静脈投与の形態、及び直腸投与の形態などがある。

【0203】

本発明の化合物は、局所投与用のクリーム、軟膏又はローションで使用することができる。

【0204】

固体組成物が錠剤の形態で調製される場合、主成分は、ゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、二酸化ケイ素などの薬学的に許容される担体と混合される。

【0205】

錠剤は、ショ糖、セルロース誘導体又は別の好適な物質でコーティングするか、他の方法で処理して、長期活性又は遅延活性を示し、所定量の活性基礎成分を連続的に放出することができる。

【0206】

ゼラチンカプセルの形態での調製物は、有効成分を増量剤と混合し、得られた混合物を軟又は硬ゼラチンカプセルに入れることによって得られる。

【0207】

シロップ又はエリキシルの形態の調製物、又は滴剤の形態での投与のための調製物は、好ましくはノンカロリーである甘味料、防腐剤としてのメチルパラベン若しくはプロピルパラベン、香味料及び好適な着色剤と共に有効成分を含み得る。

【0208】

水和剤又は粒剤は、分散剤、湿展剤又はポリビニルピロリドンなどの懸濁剤、並びに甘味料又は味覚向上剤と混合された有効成分を含み得る。

【0209】

直腸投与は、直腸温度で溶融する結合剤、例えばココアバター（ｃｏｃｏｂｕｔｔｅｒ）又はポリエチレングリコールを用いて調製される坐剤を使用することで達成される。

【0210】

非経口投与は、水系懸濁液、等張塩溶液、又は薬理的に好適な分散剤及び／又は湿展剤、例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコールを含む滅菌及び注射用溶液を使用することによって行われる。

【0211】

有効成分はまた、好適な場合、１以上の担体又は添加剤とともにマイクロカプセル又はリポソーム／セントロソームとして製剤することもできる。

【0212】

一般式Ｉの化合物及びその薬学的に許容される塩に加えて、本発明の組成物は、上記で示した障害又は疾患の治療に有益であり得るさらなる有効成分を含み得る。

【0213】

したがって、本発明はさらに、複数の有効成分が一緒に存在し、そのうちの少なくとも一つが本発明の化合物である医薬組成物に関する。

【0214】

医薬組成物を製造する場合、本発明による化合物は、任意に、１以上の薬学的に許容される担体と混合又はそれによって希釈される。

【0215】

本発明はさらに、上記に記載の状態、例えば上記に記載の筋肉消耗、又は上記に記載の筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連する状態、特にミオパチー、又は収縮期若しくは拡張期機能障害に関連する心臓の状態、又は糖尿病の治療又は予防のための医薬品の製造のための、上記に記載の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩の使用に関する。

【0216】

前記医薬品の製造に関しては、上記の医薬組成物に関連して提供されている説明を参照する。

【0217】

本発明はまた、上記の状態、例えば筋肉消耗状態、又は上記に記載の筋肉リングフィンガー１（ＭｕＲＦ１）発現の増加に関連する状態、特にミオパチー、収縮期若しくは拡張期機能障害関連の心臓状態、又は糖尿病の治療又は予防方法であって、治療上有効量の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を、処置を必要とする対象者に投与するステップを含む方法に関するものである。

【0218】

同様に、本発明は、長期機械的人工換気、手術、慢性心不全又は原発性筋疾患などのストレス状態時に横隔膜収縮性を保護又は強化する方法であって、治療上有効量の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を、処置を必要とする対象者に投与するステップを含む方法に関するものである。

【0219】

本発明は特に、
鬱血性心不全に起因する骨格筋又は心筋の萎縮及び／又は横隔膜衰弱を治療又は予防する方法；
慢性心不全に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
がんに起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
ドキソルビシンなどの筋毒性及び／又は心臓毒性物質によるがん治療に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
先天性ミオパチーに起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
ＡＩＤＳに起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
慢性腎疾患に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
腎不全に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
糖尿病に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
重度火傷に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
加齢性サルコペニアに起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
血液供給低下に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
一時的若しくは長期的固定に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
長期機械的人工換気に起因する骨格筋又は心筋の萎縮及び／又は横隔膜衰弱を治療又は予防する方法；
脱神経に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
長期無重力状態に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
栄養不良に起因する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法；
糖尿病を治療又は予防する方法；
収縮期又は拡張期の機能障害関連の心臓の状態を治療又は予防する方法であって、
治療上有効量の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を、処置を必要とする対象者に投与するステップを含む方法に関する。

【0220】

本発明は特にさらに、
集中治療時の横隔膜収縮性及び機能の保護などの、重症疾患ミオパチーを治療又は予防する方法；
ネマリンミオパチーを治療又は予防する方法；
炎症性ミオパチーを治療又は予防する方法；
糖尿病からのミオパチーを治療又は予防する方法；
肺高血圧からのミオパチーを治療又は予防する方法；
慢性心不全からのミオパチー、特にサブタイプＨＦｒＥＦ及びＨＦｐＥＦを治療又は予防する方法；
腎不全からのミオパチーを治療又は予防する方法；
腫瘍性悪液質からのミオパチーを治療又は予防する方法であって、
治療上有効量の一般式Ｉの化合物から選択される化合物又はその薬学的に許容される塩を、処置を必要とする対象者に投与するステップを含む方法に関する。

【0221】

本発明は具体的には、下記のものに関する。
駆出率低下を伴う心不全（ＨＦ－ｒＥＦ）に起因は関連する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法。
保存された駆出率（ＨＦ－ｐＥＦ）を伴う心不全に起因又は関連する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法。
高血圧に起因又は関連する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法。
腫瘍悪液質に起因又は関連する骨格筋又は心筋の萎縮を治療又は予防する方法。
ドキソルビシン誘発の筋萎縮及び／又は心臓毒性を治療又は予防する方法。
加齢によるサルコペニア及び／又は心筋症を治療又は予防する方法。
慢性腎疾患による筋萎縮を治療又は予防する方法。
機械的人工換気又は鬱血性心不全による横隔膜衰弱を治療又は予防する方法。
先天性ミオパチー、特に先天性（ｃｏｎｇｅｎｅｔｉｃ）筋萎縮を治療又は予防する方法。
糖尿病誘発筋萎縮を治療又は予防する方法。
糖尿病を治療又は予防する方法。
収縮期又は拡張期の機能障害関連の心臓の状態を治療又は予防する方法。

【0222】

本明細書で使用される「処置を必要とする対象者」という用語は、前述の状態又は疾患の１以上を患う対象者を指すか、前述の状態又は疾患の１以上を発症する可能性が高い対象者を指す。好ましくは、「処置を必要とする対象者」という用語は、哺乳動物、特に人間、生産動物又は家畜を指す。特に、「処置を必要とする対象者」という用語は、人間を指す。

【0223】

本明細書で使用される「有効量」及び「治療上有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床関係者によって求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発する対象化合物の量を意味する。当業者は、現在これらの障害に苦しんでいる患者を治療することによって、又はこれらの障害に苦しんでいる患者を有効量の本発明の化合物で予防的に治療することによって、筋肉消耗状態及び／又はミオパチーに影響を及ぼし得ることが認識される。

【0224】

上記の方法に関連して本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、本明細書に記載の筋肉消耗状態及び／又はミオパチーの進行の減速、中断、停止、制御、又は停止があり得るすべてのプロセスを指すが、これらの状態又は障害のすべての症状の完全な排除、並びに特にそのような状態又は障害の素因がある患者における言及された状態の予防的療法を必ずしも示すものではない。

【0225】

本明細書で使用される「組成物」という用語は、指定された量の指定された成分を含む製品、並びに指定された量の指定された成分の組み合わせに直接又は間接に起因する任意の製品を包含することを意図している。医薬組成物に関連するそのような用語は、有効成分、及び担体を構成する不活性成分を含む製品、並びに直接又は間接に成分のいずれか２以上の組み合わせ、複合体化又は凝集に起因する、又は成分の１以上の解離に起因する、又は成分の１以上の他の種類の反応若しくは相互作用に起因する生成物を包含することを意図している。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物及び薬学的に許容される担体を混合することによって作られる任意の組成物を包含する。

【0226】

「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が製剤の他の成分と適合性でなければならず、その被投与者に有害であってはならないことを意味する。

【0227】

「化合物の投与」及び／又は「化合物を投与する」という用語は、処置を必要とする個体に本発明の化合物又は本発明の化合物のプロドラッグを提供することを意味すると理解されるべきである。

【0228】

ＭｕＲＦ１発現増加に関連する上記の筋肉消耗状態及びミオパチーの治療及び／又は予防において、適切な用量レベルは、一般に、処置を必要とする対象者の体重１ｋｇ当たり約２～５００ｍｇ／日であり、それは単回投与又は複数回投与することができる。好ましくは、用量レベルは、約５～約２５０ｍｇ／ｋｇ／日である。

【0229】

経口投与の場合、組成物は、好ましくは、１０～５０００ミリグラムの有効成分、特に、処置を必要とする対象者への投与量の症候に応じた調節のために５０．０、１００．０、２００．０、５００．０、１０００．０、２０００．０、３０００．０、４０００．０及び５０００．０ミリグラムの有効成分を含む錠剤の形態で提供される。

【0230】

この投与計画は、最適な治療反応を提供するように調節することができる。しかしながら、特定の患者の特定の用量レベル及び投与回数は変動する可能性があり、使用される特定の化合物の活性、代謝安定性及びその化合物の作用の長さ、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の形態及び時刻、排泄速度、併用薬剤、特定の状態の重度、及び療法を受ける宿主などの多様な要素によって決まることは理解されよう。

【0231】

本発明の化合物は、非経口（例えば、筋肉、腹腔内、静脈、ＩＣＶ、大槽内注射又は注入、皮下注射、又はインプラント）、経口、吸入噴霧、経鼻、経膣、直腸、舌下、又は局所投与経路などの従来の投与経路によって投与することができる。

【0232】

本発明による化合物は、他の薬剤と組み合わせての前述の疾患及び状態の治療及び／又は予防方法においてさらに有用である。

【0233】

本発明の化合物は、式Ｉの化合物又は他の薬剤が有用性を有し得る前述の疾患及び状態の治療及び／又は予防において、１以上の他の薬剤と組み合わせて使用することができ、その場合、その薬剤組み合わせは、一緒にすると、どちらかの薬剤単独の場合より安全又は効果的である。そのような他薬剤は、経路によって、したがって一般的に使用される量で、式Ｉの化合物と同時に又は順次に投与することができる。式Ｉの化合物が１以上の他薬剤と同時に使用される場合、そのような他薬剤及び式Ｉの化合物を含む単位剤形での医薬組成物が好ましい。しかしながら、併用療法はまた、式Ｉの化合物及び１以上の他薬剤を、異なる重なったスケジュールで投与する療法も含み得る。１以上の他の有効成分と併用する場合、本発明の化合物及び他の有効成分は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用され得ることもまた想定される。上記の組み合わせは、本発明の化合物と、一つの他の活性化合物との組み合わせだけでなく、２以上の他の活性化合物との組み合わせも含む。

【0234】

本発明の化合物の第２の有効成分に対する重量比は変動し得るものであり、各成分の有効用量によって決まる。一般に、それぞれの有効用量を用いる。したがって、例えば、本発明の化合物を別の薬剤と組み合わせる場合、本発明の化合物の他薬剤に対する重量比は、一般に、約１０００：１～約１：１０００、好ましくは約２００：１～約１：２００の範囲である。本発明の化合物及び他の有効成分との組み合わせもまた、前述の範囲内であるが、各場合で、各有効成分の有効用量を使用すべきである。そのような組み合わせにおいて、本発明の化合物及び他の活性剤は、別個に又は組み合わせて投与され得る。さらに、一つの要素の投与は、他の薬剤の投与の前、同時、又は後であることができる。

【0235】

以下の実施例及び図は、本発明をさらに説明することを意図したものである。

【0236】

略称：
ＡＬＰＨＡ：増幅発光近接ホモジニアスアッセイ；
ＤＳＦ：示差走査蛍光定量法；
ＧＳＴ：グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ；
ＵＢＥ１：組換えヒトＨｉｓ６－ユビキチン活性化酵素；
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；
ＣＤＩ：１，１′－カルボニルジイミダゾール；
ＤＭＥＭ：ダルベッコの改良イーグル培地；
Ｓｈａｍ：生理食塩水処理された；
ＤＥＸ：デキサメタゾン；
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；
ＭＣＴ：モノクロタリン；
ＴＡ：前脛骨筋；
ＴＬ：脛骨の長さ；
ＥＤＬ：長指伸筋；
ＣＳＡ：断面積；
ＬＡＤ：冠動脈左前下行（ｄｅｘｔｅｒｉｏｒ）枝の結紮；
ＭＩ：心筋梗塞；
ＷＢ：ウェスタンブロット；
ＢＷ：体重；
ＣＨＦ：慢性心不全；
ＬＶ：左心室；
ＬＶＥＤＤ：左心室拡張終期径；
ＬＶＥＦ：左心室駆出率；
ＬＶＥＳＤ：左心室収縮終期径；
ＬＶＦＳ：左室内径短縮率；
ＭＲＰＳ－５：ミトコンドリアリボソームタンパク質５；
Ｎｏｘ２：ＮＡＤＰＨオキシダーゼ２；
ＣＳ：クエン酸シンターゼ；
ＳＤＨ：コハク酸デヒドロゲナーゼ；
ＴＯＭ－２０：ミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ２０；
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；
ＡＵ：任意単位。
ＨＰＲＴ：ヒポキサンチン－ホスホリボシル－トランスフェラーゼ；
ＦＲＥＴ：蛍光共鳴エネルギー移動；
ＭＡＦｂｘ：筋萎縮Ｆボックス；
ＣＡＲＰ：心臓アドリアマイシン応答性タンパク質；
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ；
ｅＩＦ２Ｂ－ｄｅｌｔａ：翻訳開始因子ｅＩＦ－２Ｂサブユニットデルタ；
ＡＳ３ＭＴ：亜ヒ酸メチルトランスフェラーゼ；
ＡＴＰＡＦ１：ＡＴＰ合成酵素ミトコンドリアＦ１複合体アセンブリ因子１；
ＧＨＤＣ：ＧＨ３ドメイン含有タンパク質；
ＢＡＸ：アポトーシス調節因子ＢＡＸ。

【図面の簡単な説明】

【0237】

【図1】濃度上昇させていく化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－９４６－５、ＭｙｏＭｅｄ－９４６－８の存在下での培養筋芽細胞における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の放出に基づく細胞毒性試験の結果。

【図2】濃度上昇させていく化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－９４６－５、ＭｙｏＭｅｄ－９４６－８の存在下での培養筋細胞における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の放出に基づく細胞毒性試験の結果。

【図3】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）又はＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝２７）のいずれかを与えたモノクロタリンで処理したｓｈａｍ（ｎ＝２０）及びマウスの身体的特徴。データは、体重増加の障害（図３）、肺鬱血の増加（図４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして心臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された内側断面（図７）によって視覚化された右心室（ＲＶ）肥大（図６）が減弱されることを裏付けている。＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ。

【図4】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）又はＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝２７）のいずれかを与えたモノクロタリンで処理したｓｈａｍ（ｎ＝２０）及びマウスの身体的特徴。データは、体重増加の障害（図３）、肺鬱血の増加（図４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして心臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された内側断面（図７）によって視覚化された右心室（ＲＶ）肥大（図６）が減弱されることを裏付けている。＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ。

【図5】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）又はＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝２７）のいずれかを与えたモノクロタリンで処理したｓｈａｍ（ｎ＝２０）及びマウスの身体的特徴。データは、体重増加の障害（図３）、肺鬱血の増加（図４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして心臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された内側断面（図７）によって視覚化された右心室（ＲＶ）肥大（図６）が減弱されることを裏付けている。＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ。

【図6】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）又はＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝２７）のいずれかを与えたモノクロタリンで処理したｓｈａｍ（ｎ＝２０）及びマウスの身体的特徴。データは、体重増加の障害（図３）、肺鬱血の増加（図４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして心臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された内側断面（図７）によって視覚化された右心室（ＲＶ）肥大（図６）が減弱されることを裏付けている。＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ。

【図7】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）又はＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝２７）のいずれかを与えたモノクロタリンで処理したｓｈａｍ（ｎ＝２０）及びマウスの身体的特徴。データは、体重増加の障害（図３）、肺鬱血の増加（図４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして心臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された内側断面（図７）によって視覚化された右心室（ＲＶ）肥大（図６）が減弱されることを裏付けている。＊Ｐ＜０．０１対Ｓｈａｍ。

【図8】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下又は存在下でのＭＣＴ処理マウスについての長指伸筋（ＥＤＬ）（図８）、ヒラメ筋（図９）、前脛骨筋（ＴＡ）（図１０）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。さらに、ＴＡ筋肉の繊維断面積（ＣＳＡ）も表示しており（図１１）、後者は代表的なＨ＆Ｅ染色によって視覚化されている（図１２）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図9】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下又は存在下でのＭＣＴ処理マウスについての長指伸筋（ＥＤＬ）（図８）、ヒラメ筋（図９）、前脛骨筋（ＴＡ）（図１０）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。さらに、ＴＡ筋肉の繊維断面積（ＣＳＡ）も表示しており（図１１）、後者は代表的なＨ＆Ｅ染色によって視覚化されている（図１２）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図10】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下又は存在下でのＭＣＴ処理マウスについての長指伸筋（ＥＤＬ）（図８）、ヒラメ筋（図９）、前脛骨筋（ＴＡ）（図１０）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。さらに、ＴＡ筋肉の繊維断面積（ＣＳＡ）も表示しており（図１１）、後者は代表的なＨ＆Ｅ染色によって視覚化されている（図１２）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図11】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下又は存在下でのＭＣＴ処理マウスについての長指伸筋（ＥＤＬ）（図８）、ヒラメ筋（図９）、前脛骨筋（ＴＡ）（図１０）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。さらに、ＴＡ筋肉の繊維断面積（ＣＳＡ）も表示しており（図１１）、後者は代表的なＨ＆Ｅ染色によって視覚化されている（図１２）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図12】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下又は存在下でのＭＣＴ処理マウスについての長指伸筋（ＥＤＬ）（図８）、ヒラメ筋（図９）、前脛骨筋（ＴＡ）（図１０）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。さらに、ＴＡ筋肉の繊維断面積（ＣＳＡ）も表示しており（図１１）、後者は代表的なＨ＆Ｅ染色によって視覚化されている（図１２）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図13】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図14】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図15】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図16】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図17】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図18】通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝１０）又はＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６；ｎ＝１０）、ＭｙｏＭｅｄ－２０３（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０３；ｎ＝１０）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５；ｎ＝１０）のいずれかを与えられたモノクロタリン処理されたｓｈａｍ（ｎ＝１０）及びマウスの身体的特徴。データは、平均±平均の標準誤差として提供されている。図１３：＊＊＊ｐ＜０．００１対開始；図１４：＊＊＊ｐ＜０．００１対ｓｈａｍ ＊＊ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ；図１５：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜００１対ｓｈａｍ、§§ｐ＜０．０１、§ｐ＜０．０５対ｓＭＣＴ；図１６～１８：＊Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ。データは、体重増加の障害（図１３）、肺鬱血の増加（図１４）、及び体重に対する心臓重量の増加（ＢＷ）（図１５）によって示されるように、ＭＣＴ処理が、投与された飼料とは無関係に心臓悪液質を誘発したこと、そして右心室（ＲＶ）肥大がＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱されること（図１６～１８）を裏付けている。

【図19】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３及びＭｙｏＭｅｄ－２０５の非存在下（Ｓｈａｍ）又は存在下でのＭＣＴ処理マウスにおける長指伸筋（ＥＤＬ）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。

【図20】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３及びＭｙｏＭｅｄ－２０５の非存在下（Ｓｈａｍ）又は存在下でのＭＣＴ処理マウスにおける前脛骨筋（ＴＡ）の骨格筋湿重量（脛骨の長さに対して正規化；ＴＬ）。

【図21】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５の非存在下（Ｓｈａｍ）又は存在下でのＭＣＴ処理マウスの最大横隔膜力。

【図22】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３及びＭｙｏＭｅｄ－２０５の非存在下（Ｓｈａｍ）又は存在下でのＭＴＣ処理マウスの前脛骨筋組織におけるＭｕＲＦ１の発現。

【図23】ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３及びＭｙｏＭｅｄ－２０５の非存在下（Ｓｈａｍ）又は存在下でのＭＴＣ処理マウスの前脛骨筋組織におけるテレトニンの発現。

【図24】心筋梗塞（ＭＩ）後の駆出率低下した慢性心不全（ＣＨＦ）（ＨＦｒＥＦ）を患うマウスからの横隔膜筋線維束の等尺性収縮（図２４）とさらに等張性収縮（図２５）時に評価した横隔膜機能。それにより、最大横隔膜力（図２６）及び横隔膜ピークパワー（図２７）を求めた。データは、平均±平均の標準誤差として示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＨＦ、§Ｐ＜０．０５、及び§§Ｐ＜０．０１対ＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図25】心筋梗塞（ＭＩ）後の駆出率低下した慢性心不全（ＣＨＦ）（ＨＦｒＥＦ）を患うマウスからの横隔膜筋線維束の等尺性収縮（図２４）とさらに等張性収縮（図２５）時に評価した横隔膜機能。それにより、最大横隔膜力（図２６）及び横隔膜ピークパワー（図２７）を求めた。データは、平均±平均の標準誤差として示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＨＦ、§Ｐ＜０．０５、及び§§Ｐ＜０．０１対ＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図26】心筋梗塞（ＭＩ）後の駆出率低下した慢性心不全（ＣＨＦ）（ＨＦｒＥＦ）を患うマウスからの横隔膜筋線維束の等尺性収縮（図２４）とさらに等張性収縮（図２５）時に評価した横隔膜機能。それにより、最大横隔膜力（図２６）及び横隔膜ピークパワー（図２７）を求めた。データは、平均±平均の標準誤差として示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＨＦ、§Ｐ＜０．０５、及び§§Ｐ＜０．０１対ＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図27】心筋梗塞（ＭＩ）後の駆出率低下した慢性心不全（ＣＨＦ）（ＨＦｒＥＦ）を患うマウスからの横隔膜筋線維束の等尺性収縮（図２４）とさらに等張性収縮（図２５）時に評価した横隔膜機能。それにより、最大横隔膜力（図２６）及び横隔膜ピークパワー（図２７）を求めた。データは、平均±平均の標準誤差として示した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ＣＨＦ、§Ｐ＜０．０５、及び§§Ｐ＜０．０１対ＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図28】等尺性収縮（図２８）及び等張性収縮時に評価したイン・ビトロ骨格筋収縮機能。これにより、短縮速度（図２９）及び力（図３０）を求めた。ＭＣＴ処理されたマウスは、ｓｈａｍと比較して短縮速度及びパワーに約２０％の障害を示す。これらの障害は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたＭＣＴマウスでは本質的に防止される。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図29】等尺性収縮（図２８）及び等張性収縮時に評価したイン・ビトロ骨格筋収縮機能。これにより、短縮速度（図２９）及び力（図３０）を求めた。ＭＣＴ処理されたマウスは、ｓｈａｍと比較して短縮速度及びパワーに約２０％の障害を示す。これらの障害は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたＭＣＴマウスでは本質的に防止される。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図30】等尺性収縮（図２８）及び等張性収縮時に評価したイン・ビトロ骨格筋収縮機能。これにより、短縮速度（図２９）及び力（図３０）を求めた。ＭＣＴ処理されたマウスは、ｓｈａｍと比較して短縮速度及びパワーに約２０％の障害を示す。これらの障害は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたＭＣＴマウスでは本質的に防止される。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図31】通常の飼料（腫瘍）を投与されたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウス及び化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスにおける前脛骨筋（ＴＡ）の筋湿重量。

【図32】Ｂ１６Ｆ１０細胞接種マウス（黒色腫腫瘍細胞モデル）のワイヤーハングテスト、接種後９日、１６日、２３日。腫瘍の増殖は、対照群のマウス（ｓｈａｍ）と比較して、筋肉機能（腫瘍群）に有意な低下をもたらす。この筋肉機能の低下は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたマウスで減弱している。

【図33】ウェスタンブロット分析によって測定されたｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるｅＩＦ２Ｂサブユニットデルタ（図３３）及びＢＡＸ（図３４）の発現レベルと代表的なブロット（図３５）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ＭＣＴ。

【図34】ウェスタンブロット分析によって測定されたｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるｅＩＦ２Ｂサブユニットデルタ（図３３）及びＢＡＸ（図３４）の発現レベルと代表的なブロット（図３５）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ＭＣＴ。

【図35】ウェスタンブロット分析によって測定されたｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるｅＩＦ２Ｂサブユニットデルタ（図３３）及びＢＡＸ（図３４）の発現レベルと代表的なブロット（図３５）。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ；§Ｐ＜０．０１対ＭＣＴ。

【図36】ｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベル及び代表的なウェスタンブロット。ＭＣＴ処理は、ＭｕＲＦ１とＣＡＲＰの発現を増加させるが、これはＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。ＭＡＦＢｘのレベルに変化は検出されない。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図37】ｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるＭＡＦＢｘのタンパク質発現レベル及び代表的なウェスタンブロット。ＭＣＴ処理は、ＭｕＲＦ１とＣＡＲＰの発現を増加させるが、これはＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。ＭＡＦＢｘのレベルに変化は検出されない。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図38】ｓｈａｍ、ＭＣＴ、及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスにおけるＣＡＲＰのタンパク質発現レベル及び代表的なウェスタンブロット。ＭＣＴ処理は、ＭｕＲＦ１とＣＡＲＰの発現を増加させるが、これはＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。ＭＡＦＢｘのレベルに変化は検出されない。＊Ｐ＜０．０５対ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６。

【図39】ｓｈａｍ、ＣＨＦ、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスの横隔膜組織におけるＭＲＰＳ－５のタンパク質発現レベル及び代表的なウェスタンブロット。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図40】ｓｈａｍ、ＣＨＦ、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスの横隔膜組織におけるＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベルと代表的なウェスタンブロット。ＣＨＦは、ＭｕＲＦ１及びＭｕＲＦ２の発現を増加させ、テレトニンの発現を低下させるが、これらの効果は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図41】ｓｈａｍ、ＣＨＦ、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスの横隔膜組織におけるＭｕＲＦ２のタンパク質発現レベルと代表的なウェスタンブロット。ＣＨＦは、ＭｕＲＦ１及びＭｕＲＦ２の発現を増加させ、テレトニンの発現を低下させるが、これらの効果は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図42】ｓｈａｍ、ＣＨＦ、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスの横隔膜組織におけるテレトニンのタンパク質発現レベルと代表的なウェスタンブロット。ＣＨＦは、ＭｕＲＦ１及びＭｕＲＦ２の発現を増加させ、テレトニンの発現を低下させるが、これらの効果は、ＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図43】ウェスタンブロット（ＷＢ）分析（図４３）、Ｎｏｘ２（図４４）、ＬＣ３ Ｉ／ＩＩ（図４６）によって決定されたＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベル、並びに通常の飼料（腫瘍）を与えられた又は化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスの筋肉組織における活性酸素種マーカーであるニトロチロシンのレベル（図４５）。腫瘍の増殖は、ＭｕＲＦ１及びＮｏｘ２のタンパク質発現レベル、並びにニトロチロシンレベルの有意な増加、及び対照群のマウス（ｓｈａｍ）と比較した腫瘍群におけるＬＣ３ Ｉ／ＩＩの発現レベルの有意な低下をもたらす。これらの変化は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）又はＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたマウスで減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図44】ウェスタンブロット（ＷＢ）分析（図４３）、Ｎｏｘ２（図４４）、ＬＣ３ Ｉ／ＩＩ（図４６）によって決定されたＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベル、並びに通常の飼料（腫瘍）を与えられた又は化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスの筋肉組織における活性酸素種マーカーであるニトロチロシンのレベル（図４５）。腫瘍の増殖は、ＭｕＲＦ１及びＮｏｘ２のタンパク質発現レベル、並びにニトロチロシンレベルの有意な増加、及び対照群のマウス（ｓｈａｍ）と比較した腫瘍群におけるＬＣ３ Ｉ／ＩＩの発現レベルの有意な低下をもたらす。これらの変化は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）又はＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたマウスで減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図45】ウェスタンブロット（ＷＢ）分析（図４３）、Ｎｏｘ２（図４４）、ＬＣ３ Ｉ／ＩＩ（図４６）によって決定されたＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベル、並びに通常の飼料（腫瘍）を与えられた又は化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスの筋肉組織における活性酸素種マーカーであるニトロチロシンのレベル（図４５）。腫瘍の増殖は、ＭｕＲＦ１及びＮｏｘ２のタンパク質発現レベル、並びにニトロチロシンレベルの有意な増加、及び対照群のマウス（ｓｈａｍ）と比較した腫瘍群におけるＬＣ３ Ｉ／ＩＩの発現レベルの有意な低下をもたらす。これらの変化は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）又はＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたマウスで減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図46】ウェスタンブロット（ＷＢ）分析（図４３）、Ｎｏｘ２（図４４）、ＬＣ３ Ｉ／ＩＩ（図４６）によって決定されたＭｕＲＦ１のタンパク質発現レベル、並びに通常の飼料（腫瘍）を与えられた又は化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスの筋肉組織における活性酸素種マーカーであるニトロチロシンのレベル（図４５）。腫瘍の増殖は、ＭｕＲＦ１及びＮｏｘ２のタンパク質発現レベル、並びにニトロチロシンレベルの有意な増加、及び対照群のマウス（ｓｈａｍ）と比較した腫瘍群におけるＬＣ３ Ｉ／ＩＩの発現レベルの有意な低下をもたらす。これらの変化は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）又はＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたマウスで減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図47】ｓｈａｍ、慢性心不全（ＣＨＦ）、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスからの横隔膜組織サンプルにおけるクエン酸シンターゼの酵素活性。データは、ｓｈａｍと比較した場合、ＣＨＦにおけるクエン酸シンターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、及びミトコンドリア複合体Ｉ活性の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図48】ｓｈａｍ、慢性心不全（ＣＨＦ）、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスからの横隔膜組織サンプルにおけるコハク酸デヒドロゲナーゼの酵素活性。データは、ｓｈａｍと比較した場合、ＣＨＦにおけるクエン酸シンターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、及びミトコンドリア複合体Ｉ活性の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図49】ｓｈａｍ、慢性心不全（ＣＨＦ）、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスからの横隔膜組織サンプルにおけるミトコンドリア複合体Ｉの酵素活性。データは、ｓｈａｍと比較した場合、ＣＨＦにおけるクエン酸シンターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、及びミトコンドリア複合体Ｉ活性の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図50】ｓｈａｍ、慢性心不全（ＣＨＦ）、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスからの横隔膜組織サンプルにおけるミトコンドリア外膜のミトコンドリアポリン（図５０）及びＴＯＭ－２０（図５１）のタンパク質発現レベル。データは、ｓｈａｍと比較した場合、ＣＨＦにおけるポリン及びＴＯＭ－２０発現の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図51】ｓｈａｍ、慢性心不全（ＣＨＦ）、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウスからの横隔膜組織サンプルにおけるミトコンドリア外膜のミトコンドリアポリン（図５０）及びＴＯＭ－２０（図５１）のタンパク質発現レベル。データは、ｓｈａｍと比較した場合、ＣＨＦにおけるポリン及びＴＯＭ－２０発現の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図52】ｓｈａｍ、通常の飼料（ｓｈｏｗ）（腫瘍）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウス、及び化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスからの筋肉組織サンプルにおけるクエン酸シンターゼの酵素活性。データは、ｓｈａｍと比較した場合、腫瘍群におけるクエン酸シンターゼ及びミトコンドリア複合体Ｉ活性の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６又はＭｙｏＭｅｄ－２０５を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図53】ｓｈａｍ、通常の飼料（ｓｈｏｗ）（腫瘍）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウス、及び化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）若しくはＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５）を与えられたＢ１６Ｆ１０細胞接種マウスからの筋肉組織サンプルにおけるミトコンドリア複合体Ｉの酵素活性。データは、ｓｈａｍと比較した場合、腫瘍群におけるクエン酸シンターゼ及びミトコンドリア複合体Ｉ活性の有意な低下を明らかにしているが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６又はＭｙｏＭｅｄ－２０５を与えられたマウスでは減弱している。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【図54】デキサメタゾン（ＤＥＸ；１０μｍｏｌ／Ｌ）との２４時間のインキュベーション後の、筋管におけるｍＲＮＡレベルでのＭｕＲＦ１の発現。表示されているのは、未処理の細胞（ＤＥＸ）と、０．１μｍｏｌ／Ｌ及び１０μｍｏｌ／ＬのＭｙｏＭｅｄ－９４６化合物で２時間前処理された細胞の倍率変化である。前処理された細胞は、ＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡレベルの低下を示している。＊Ｐ＜０．０５対ＣＯＮ。§Ｐ＜０．０５対ＤＥＸ。

【図55】ＰＢＳ緩衝液中のＭｕＲＦ１中央フラグメント（実線）、ＰＢＳ緩衝液＋１％ＤＭＳＯ中のＭｕＲＦ１中央フラグメント（点線）及びＰＢＳ緩衝液＋１％の１０ｍＭ化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６／ＤＭＳＯ原液（ＭｙｏＭｅｄ－９４６の最終濃度：１００μＭ）中のＭｕＲＦ１中央フラグメント（点線）についての、温度勾配に対する３５０ｎｍでの蛍光シグナルの３３０ｎｍでの蛍光シグナルに対する比としてプロットされた示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）融解曲線。

【図56】ＨＦｐＥＦラットモデル実験の研究計画の模式図。

【図57】ＨＦｐＥＦラットモデル実験における心筋機能心エコー検査及び侵襲的血行動態測定の結果。

【図58】ＨＦｐＥＦラットモデル実験における骨格筋量と機能測定の結果。

【図59】ドキソルビシン誘発筋萎縮及び心臓毒性のマウスモデルにおける悪液質及び身体ストレス結果。

【図60】ドキソルビシン誘発筋萎縮及び心臓毒性のマウスモデルにおける心エコー検査の結果。

【図61】食餌誘発体重減少時の２型糖尿病の肥満マウスにおけるワイヤーハングテスト。ＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理は、筋肉機能の喪失を軽減した。

【図62】ＤＩＯ対照マウスと比較した、ＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウスの６時間絶食後の血糖値。

【図63】ＤＩＯ対照マウスと比較したＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウスの試験第１４日及び第２８日での経口ブドウ糖負荷試験結果。

【図64】ＤＩＯ対照マウスと比較したＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウスの試験第１４日及び第２８日での経口ブドウ糖負荷試験結果。

【図65】ＤＩＯ対照マウスと比較したＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウスのインスリン耐性試験結果。

【0238】

Ｉ．化合物Ｉの合成
分析
化合物は、別断の記載がない限り、４００ＭＨｚ ＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ）でのｄ６－ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）中の^１Ｈ ＮＭＲ及び最終的には^１３Ｃ ＮＭＲによって特性決定した。

【0239】

磁気核共鳴スペクトル特性（ＮＭＲ）は、百万分率（ｐｐｍ）で表される化学シフト（δ）を指す。１Ｈ ＮＭＲスペクトラムにおけるシフトの相対面積は、分子中の特定の機能型についての水素原子の数に相当する。多重度に関するシフトの性質は、一重線（ｓ）、広い一重線（ｓ．ｂｒ．）、二重線（ｄ）、広い二重線（ｄｂｒ．）、三重線（ｔ）、広い三重線（ｔｂｒ．）、四重線（ｑ）、五重線（ｑｕｉｎｔ．）、多重線（ｍ）として示される。

【0240】

化合物はさらに、Ｃ_１８－材料についての高速勾配（エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モード）でのＨＰＬＣ－ＭＳ及び／又はＵＰＬＣ－ＭＳによってさらに特性決定した。別断の記載がない限り、ＥＳＩ ＭＳデータはポジティブモードで記録される。ＭＳデータは、電荷比（ｍ／ｚ）に対する質量として与えられるプロトン化化合物（Ｍ＋Ｈ）^＋を指し、ｚは１である。

【0241】

ＨＰＬＣ－ＭＳ仕様：
ＨＰＬＣ－ＭＳ機器：ＤＡＤ＼ＥＬＳＤ及びＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ＼ＭＳＤ ＶＬ（Ｇ１９５６Ａ）、ＳＬ（Ｇ１９５６Ｂ）質量分析計を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＬＣ／ＭＳＤシステム、又はＤＡＤ＼ＥＬＳＤ及びＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ＼ＭＳＤ ＳＬ（Ｇ６１３０Ａ）、ＳＬ（Ｇ６１４０Ａ）質量分析計を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＬＣ／ＭＳＤシステム。すべてのＬＣ／ＭＳデータは、ポジティブ／ネガティブモード切替を使用して取得した。

【0242】

取得方法：カラム：Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ－Ｃ１８ １．８μｍ ４．６ｘ１５ｍｍ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカートリッジ（ＰＮ８２１９７５－９３２）。移動相：А：アセトニトリル＋０．１％ギ酸；Ｂ：０．１％ギ酸含有水。流量：３ｍＬ／分；注入容量：１μＬ。

【0243】

溶媒勾配：
０～０．０１分１００％Ｂ；
０．０１～１．５分１００％から０％Ｂ、直線勾配；
１．５～１．８分０％Ｂ；
１．８～１．８１分０％から１００％Ｂ。

【0244】

イオン化モード：大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）；
走査範囲：ｍ／ｚ８０－１０００。

【0245】

ＵＰＬＣ－ＭＳ仕様：
ＵＰＬＣ－ＭＳ機器：シングル四重極エレクトロスプレーイオン化質量分析計を備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０；
取得方法：カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；１．７μｍ；２．１ｘ５０ｍｍ；Ｔ＝４０℃。移動相：Ａ：水＋０．１％トリフルオロ酢酸；Ｂ：ＭｅＣＮ＋０．１％トリフルオロ酢酸。流量：１ｍＬ／分；注入容量３μＬ；運転時間３分。

【0246】

溶媒勾配（３分間勾配）：
０～２．３分５％から１００％Ｂ、直線勾配；
２．３～２．５分１００％Ｂ；
２．５～２．６分１００％から５％Ｂ、直線勾配；
２．６分～３．０分１００％Ｂ。

【0247】

別断の断りがない限り、ＥＳＩ ＭＳデータはポジティブモードで記録される。ＭＳデータは、電荷比（ｍ／ｚ）に対する質量として提供されるプロトン化化合物（Ｍ＋Ｈ）^＋を指し、ｚは１である。

【0248】

合成
２．１ 分取ＨＰＬＣ精製
分取ＨＰＬＣ精製は、ＨＰＬＣ（Ｈ_２Ｏ－ＭｅＯＨ又はＨ_２Ｏ－ＣＨ_３ＣＮ；Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ ＯＢＤ分取カラム（１００Å、５μｍ、１９ｍｍＸ１００ｍｍ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ 分取ガードカートリッジ、１００Å、１０μｍ、１９ｍｍＸ１０ｍｍ）を用いるＤＡＤ及び質量検出器を搭載したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムを使用して実施した。原料化合物をＤＭＳＯ ０．７ｍＬに溶かした。流量：３０ｍＬ／分。得られた分画の純度を分析ＬＣＭＳで確認した。溶液の形態でクロマトグラフィーを行った直後に得られたまま、各画分についてスペクトラムを記録した。溶媒をＮ_２気流下に８０℃で留去させた。個々の分画を、クロマトグラフィー後ＬＣＭＳ分析に基づいて合わせた。固体分画をＭｅＯＨ／ＣＨ_３ＣＮ ０．５ｍＬに溶解し、予め秤量したマーク付きバイアルに移した。得られた溶液を、再度Ｎ_２気流下に８０℃で溶媒留去させた。乾燥後、生成物をＬＣ－ＭＳ及び^１Ｈ－ＮＭＲによって最終的に特性決定した。

【0249】

２．２ 中間体
２．２．１：４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］酢酸
７－ヒドロキシ－４－メチルクマリン８０．６ｇ（０．４５８ｍｏｌ）、メチル４－（ブロモメチル）ベンゾエート１１０．１ｇ（０．４８０ｍｏｌ）、及び無水Ｋ_２ＣＯ_３９５ｇ（０．６８６ｍｏｌ）の脱水アセトン（８００ｍＬ）中混合物を３時間加熱還流した。混合物を冷却し、濾過し、濾液を減圧下に濃縮した。残留物をＤＭＳＯ（４５０ｍＬ）に溶解させ、水酸化カリウム水溶液（２００ｍＬ、２０％ＫＯＨ）を加えた。得られた混合物を環境温度で７２時間攪拌した。加水分解終了後、水１リットルを加え、その溶液を１０％塩酸でｐＨ＝１～２の酸性とした。生成した沈殿を濾過し、真空乾燥して、純粋な生成物を得た。４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］酢酸の収率は７５％（１０６ｇ）であった。

【0250】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間：１．１１分。

【0251】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１３．０１（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．０－７．９７（ｍ、２Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０－７．５８（ｍ、２Ｈ）、７．０９－７．０５（ｍ、２Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、５．３４（ｓ、２Ｈ）、２．４０（ｓ、３Ｈ）。

【0252】

２．２．２：２－アミノ－Ｎ－（２－フリルメチルカルバモイル）アセトアミド
２－クロロ－Ｎ－（２－フリルメチル－カルバモイル）アセトアミド１．４６ｇ（６．７４ｍｍｏｌ）及びアジ化ナトリウム９０ｍｇ（ＮａＮ_３、２当量）のエタノール（１５ｍＬ）中混合物を７０℃で終夜攪拌した。冷却して室温とした後、固体を除去し、得られた濾液を減圧下に濃縮した（体積１／３）。残留物をＥｔＯＡｃと水との間で分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、減圧下に溶媒留去した。残留物をＭｅＯＨに溶解させ、Ｐｄ／Ｃをそれに加えた。混合物を脱気し、水素雰囲気下に室温で終夜攪拌した。触媒を除去し、濾液を溶媒留去し、真空乾燥して粗アミンを得て、それをそれ以上精製せずに次のステップで用いた。（Ｘ＝Ｏ ０．８ｇ ６０％；Ｘ＝Ｏ ０．７ｇ ６２％（２ステップから））。

【0253】

２．２．３：２－アミノ－Ｎ－（２－チエニルメチルカルバモイル）アセトアミド
出発材料として２－クロロ－Ｎ－（２－フリルメチル－カルバモイル）アセトアミドに代えて２－クロロ－Ｎ－（２－チエニルメチルカルバモイル）－アセトアミド１．２６ｇ（５．４１ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例２．２．２と同様にして、２－アミノ－Ｎ－（２－チエニルメチルカルバモイル）アセトアミドを製造した。そうして得られた粗２－アミノ－Ｎ－（２－チエニルメチル－カルバモイル）アセトアミドを、それ以上精製せずに次のステップで用いた。収量：０．７ｇ ６２％（２ステップから）。

【0254】

２．３：化合物Ｉ
実施例１
［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－９４６）の合成

【0255】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－酢酸３１０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、２－クロロ－Ｎ－（２－フリルメチルカルバモイル）アセトアミド２２８ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ）、ＮａＩ７５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ １５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＳＯ ６ｍＬに溶解させた。得られたスラリーを室温で７２時間攪拌して反応完了させた。変換はＬＣ－ＭＳによって制御した。次に、反応混合物を水５０ｍＬに投入し、得られた沈殿を濾過し、追加量の水、イソプロピルアルコール及びヘキサンの順で洗浄した。固体生成物を真空乾燥した。［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシ－メチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－９４６）の収率は６１％（２８９ｍｇ）であった。

【0256】

［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－９４６）は、室温で数ヶ月間にわたり貯蔵しても崩壊の痕跡を全く示さなかった（ＮＭＲ及びＬＣ－ＭＳによって確認）。

【0257】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ４９１／４９２（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間：１．４３６分。

【0258】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．５０（ｂｒｓ、１Ｈ、ＮＨ）、７．８５（ｂｒｓ、１Ｈ、ＮＨ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ＋ＣＨ）、７．２２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ）、７．１５（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ＋ＣＨ）、７．０９（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）、６．６０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ＋ＣＨ）、５．９０（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）、５．７８（ｄ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ、ＣＨ）、５．７４（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）、４．８７（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ_２）、４．４４（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ_２）、３．８８（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ、ＮＣＨ_２）、１．９１（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）。

【0259】

ＭｙｏＭｅｄ－９４６のさらなる分析特性決定
化合物の純度及び同一性を、下記のような１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲ及びＵＰＬＣ－ＭＳを用いてさらに評価した。

【0260】

ＮＭＲ分析のためには、ＭｙｏＭｅｄ－９４６２ｍｇを痕跡量のＣＣｌ_４を含むｄ_６－ジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解させた。^１Ｈ－及び^１３Ｃ－スペクトラム並びに^１Ｈ－ＮＭＲピーク割り当てのためのＣＯＳＹ及びＨＳＱＣ ２Ｄ－ＮＭＲスペクトラムを記録した。

【0261】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６＋ＣＣｌ_４）：δ＝１０．６８（ｓ、１Ｈ）、８．３４（ｓ、１Ｈ）、８．０５（ｄ、Ｊ＝７．３７Ｈｚ、２Ｈ）、７．５３－７．４５（ｍ、４Ｈ）、７．１４－６．９１（ｍ、２Ｈ）、６．４０（ｓ、１Ｈ）、６．３０－６．１６（ｍ、２Ｈ）、５．３７（ｓ、２Ｈ）、４．９４（ｓ、２Ｈ）、４．４４－４．２３（ｍ、２Ｈ）、２．４１（ｓ、３Ｈ）。

【0262】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６＋ＣＣｌ_４）：δ＝１６９．０、１６５．１、１６１．０、１６０．０、１５４．６、１５３．３、１５２．５、１５１．８、１４２．３（２Ｃ）、１２９．６（２Ｃ）、１２８．５、１２７．６（２Ｃ）、１２６．６、１１３．５、１１２．６、１１１．４、１１０．４、１０７．０、１０１．８、６９．１、６２．７、３６．０、１８．１。

【0263】

ＵＰＬＣ－ＭＳ分析のためには、少量のＭｙｏＭｅｄ－９４６をアセトニトリル（ＭｅＣＮ）に溶解させ、この溶液３μＬをＣ１８ ＵＰＬＣカラム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；１．７μｍ；２．１×５０ｍｍ）に注入した。使用したＵＰＬＣ－ＭＳシステム及び分析方法は上記の通りであった。

【0264】

ＵＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ＝４９１．１（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間：１．７分。

【0265】

実施例２：
（１－メチル－２－オキソ－２－ウレイド－エチル）４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－９４６－５）の合成

【0266】

２－クロロ－Ｎ－（２－フリルメチル－カルバモイル）アセトアミドに代えてＮ－カルバモイル－２－クロロ－プロパンアミドを用いた以外は、実施例１と同様にして合成を行った。

【0267】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ４３９（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．３８８分。

【0268】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．６３（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．０５－７．９８（ｍ、３Ｈ）、７．７２－７．６８（ｍ、１Ｈ）、７．６８－７．５９（ｍ、２Ｈ）、７．０５－７．０１（ｍ、２Ｈ）、６．２３（ｓ、１Ｈ）、５．３５（ｓ、２Ｈ）、５．２２－５．１４（ｍ、１Ｈ）、２．７０（ｄ、３Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）、１．５０（ｄ、３Ｈ）。

【0269】

実施例３：
［１－メチル－２－（メチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－９４６－８）の合成

【0270】

２－クロロ－Ｎ－（２－フリルメチル－カルバモイル）アセトアミドに代えて２－クロロ－Ｎ－（メチルカルバモイル）プロパンアミドを用いた以外は、実施例１と同様にして合成を行った。

【0271】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ４２５（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．３２７分。

【0272】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．５１（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．０６－７．９７（ｍ、２Ｈ）、７．７３－７．６７（ｍ、１Ｈ）、７．６７－７．５９（ｍ、２Ｈ）、７．５４（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．３３（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．０９－７．０２（ｍ、２Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ）、５．３５（ｓ、２Ｈ）、５．２２－５．１４（ｍ、１Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）、１．５１（ｄ、３Ｈ）。

【0273】

実施例４：
Ｎ－［２－（２－フリルメチルカルバモイルアミノ）－２－オキソ－エチル］－４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンズアミドの合成

【0274】

実施例２．２．２で得られた２－アミノ－Ｎ－（２－フリルメチルカルバモイル）アセトアミド（０．６ｍｍｏｌ）、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－酢酸５５８ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール１０９ｍｇ（ＨＯＡｔ、０．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液を冷却しながら、それにＥＤＣ １２４ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を室温で終夜攪拌した。生成した沈殿を回収し、メタノール、次に水、再度メタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１１０ｍｇを得た。収率：３７％。

【0275】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－Ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．５３（ｓ、１Ｈ）、８．８２（ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．５１（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．７０（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．５６（ｍ、３Ｈ）、７．０６（ｍ、２Ｈ）、６．３７（ｓ、１Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝２．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．２１（ｓ、１Ｈ）、３．５０（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．９９（ｄ、Ｊ＝５．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３８（ｓ、３Ｈ）。

【0276】

実施例５：
［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートの合成

【0277】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－酢酸３１０ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、２－クロロ－Ｎ－（２－チエニルメチルカルバモイル）アセトアミド２５０ｍｇ（１．０５ｍｍｏｌ）、ＮａＩ７５ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ １５５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）の混合物をＤＭＳＯ ６ｍＬに溶解させた。得られたスラリーを室温で７２時間攪拌して反応を完了させた。変換はＬＣ－ＭＳスペクトラムによって制御した。次に、反応混合物を水５０ｍＬに投入し、生成した沈殿を濾過し、追加量の水、イソプロピルアルコール及びヘキサンの順で洗浄した。生成物を真空条件下で乾燥させた。［２－オキソ－２－（２－チエニルメチルカルバモイル－アミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートの収率６１％（３１０ｍｇ）。

【0278】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）：ｍ／ｚ５０７／５０８（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．３９９分。

【0279】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．６７（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．４７（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．０３（ｄ、Ｊ＝８．０、２Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝８．０、１Ｈ）、７．６４（ｄ、Ｊ＝８．０、２Ｈ）、７．３９（ｄ、Ｊ＝４．０、１Ｈ）、７．０８－６．９５（ｍ、４Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ）、５．３５（ｓ、２Ｈ）、４．９２（ｓ、２Ｈ）、４．５２（ｄ、Ｊ＝４．６、２Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）。

【0280】

実施例６：
４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－オキソ－２－（２－チエニルメチル－カルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミド

【0281】

標題化合物を実施例３と同様にして製造した。標題化合物９０ｍｇを得た。収率：３０％。

【0282】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－Ｄ_６、ｐｐｍ）：δ＝１０．５２（ｓ、１Ｈ）、８．８２（ｔ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．６３（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．３９（ｄ、Ｊ＝４．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０７（ｍ、２Ｈ）、６．９８（ｓ、１Ｈ）、６．９５（ｍ、１Ｈ）、６．２１（ｓ、１Ｈ）、５．３１（ｓ、２Ｈ）、４．２３（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．００（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）。

【0283】

実施例７
［２－オキソ－２－（２－ピリジルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－２０３）の合成

【0284】

２－クロロ－Ｎ－（２－ピリジルメチルカルバモイル）アセトアミドの製造：
２－ピリジルメタンアミン（７．８４ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中溶液を攪拌しながら、冷却して－１０℃とし、クロロアセチルイソシアネート（８．６６ｇ、７２．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間攪拌した。沈殿固体を濾過によって回収し、ジクロロメタンで洗浄し（３０ｍＬで２回）、乾燥させて、２－クロロ－Ｎ－（２－ピリジルメチルカルバモイル）アセトアミド１２．０ｇ（５２．７ｍｍｏｌ、収率：７３％）を得た。

【0285】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）：δ＝９．４５（ｓ、１Ｈ）、９．０５（ｓ、１Ｈ）、８．５９（ｓ、１Ｈ）、７．６７（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２４－７．１８（ｍ、１Ｈ）、４．６５（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．１３（ｓ、２Ｈ）。

【0286】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ネガティブモード）ｍ／ｚ２２６（Ｍ－Ｈ）^＋；保持時間０．５６５分。

【0287】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸の製造：
７－ヒドロキシ－４－メチル－クロメン－２－オン（８０．６ｇ、４５８ｍｍｏｌ）のアセトン（１０００ｍＬ）中溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（９４．９ｇ、６８７ｍｍｏｌ）及びメチル４－（ブロモメチル）ベンゾエート（１１０ｇ、４８０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間還流させた。次に、それを冷却して室温とし、濾過した。濾液を減圧下に溶媒留去し、残留物を水（１０００ｍＬ）と混合した。不溶固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させ、ＤＭＳＯ（５００ｍＬ）に溶かした。２０％ＫＯＨ水溶液（１５０ｍＬ）を、得られたメチル４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートの溶液に加え、混合物を室温で終夜攪拌状態に放置した。反応が完了した後、その反応液を水（３０００ｍＬ）に投入し、１０％塩酸でｐＨ１～２となるまで酸性化した。３０分間攪拌後、沈殿固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させて、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸１０６ｇ（３４２ｍｍｏｌ、収率：７５％）を得た。

【0288】

メチル４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート：
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝７．９８（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２－６．９６（ｍ、２Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、５．３２（ｓ、２Ｈ）、３．８５（ｓ、３Ｈ）、２．３８（ｓ、３Ｈ）。

【0289】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸：
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝１２．９９（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１－６．９９（ｍ、２Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、５．３１（ｓ、２Ｈ）、２．３７（ｓ、３Ｈ）。

【0290】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．２４２分。

【0291】

［２－オキソ－２－（２－ピリジルメチルカルバモイルアミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートの製造：
４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸（９．２８ｇ、２９．９ｍｍｏｌ）、２－クロロ－Ｎ－（２－ピリジルメチルカルバモイル）アセトアミド（７．４９ｇ、３２．９ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４．６４ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）、及びＮａＩ（０．９００ｇ、６．００ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１００ｍＬ）中混合物を室温で終夜攪拌し、冷水（５００ｍＬ）に投入した。沈殿固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させて、［２－オキソ－２－（２－ピリジルメチルカルバモイル－アミノ）エチル］４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート（ＭｙｏＭｅｄ－２０３）１３．８ｇ（２７．５ｍｍｏｌ、収率：９２％）を得た。

【0292】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝１０．６５（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．６９（ｂｒｓ、１Ｈ）、８．４７（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．０１（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．７３（ｔ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．６１（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．２８（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．２６－７．２０（ｍ、１Ｈ）、７．０８－６．９７（ｍ、２Ｈ）、６．１９（ｓ、１Ｈ）、５．３３（ｓ、２Ｈ）、４．９１（ｓ、２Ｈ）、４．４６（ｄ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．３６（ｓ、３Ｈ）。

【0293】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ネガティブモード）ｍ／ｚ５０２（Ｍ－Ｈ）^＋；保持時間１．１７６分。

【0294】

実施例８
４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－（２－チエニルメチル－カルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミド（ＭｙｏＭｅｄ－２０５）の合成

【0295】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチル］カーバメートの製造：
ＣＤＩ（４２．８ｇ、２６４ｍｍｏｌ）の脱水アセトニトリル（４００ｍＬ）中懸濁液に、２－チエニルメタンアミン（１４．９ｇ、１３２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を超音波浴中、室温で１時間維持した。次に、水（２．５ｍＬ）を加え、混合物を超音波浴中にさらに３０分間維持した。溶液を脱気した後、Ｎ－ｂｏｃ－エチレンジアアミン（２１．１ｇ、１３２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を５０℃で２時間攪拌した。次に、混合物を冷却して室温とし、減圧下に溶媒留去した。残留物を水（１００ｍＬ）で摩砕し、濾過し、乾燥して、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）－エチル］カーバメート３５．２ｇ（１１８ｍｍｏｌ、８９％）を得た。

【0296】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝７．３５（ｄ、Ｊ＝５．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．９７－６．８８（ｍ、２Ｈ）、６．８３－６．７２（ｍ、１Ｈ）、６．５５－６．３８（ｍ、１Ｈ）、６．０７－５．９３（ｍ、１Ｈ）、４．３４（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．１１－３．００（ｍ、２Ｈ）、２．９９－２．８８（ｍ、２Ｈ）、１．３７（ｓ、９Ｈ）。

【0297】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ３００（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．１５６分。

【0298】

２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチルアンモニウムクロリドの製造：
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）－エチル］カーバメート（１９．５ｇ、６５．１ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン（２００ｍＬ）中溶液に、１０％ジオキサン／ＨＣｌ（５０ｍＬ）を加え、反応塊を室温で２時間攪拌した。沈殿固体を濾取し、真空乾燥して、２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）エチルアンモニウムクロリド１４．３ｇ（６０．６ｍｍｏｌ、９５％）を得た。

【0299】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝８．０８（ｂｒｓ、３Ｈ）、７．３５（ｓ、１Ｈ）、６．９３（ｓ、２Ｈ）、６．７８（ｂｒｓ、１Ｈ）、６．５１（ｂｒｓ、１Ｈ）、４．３８－４．２９（ｍ、２Ｈ）、３．３１－３．１９（ｍ、２Ｈ）、２．８８－２．７４（ｍ、２Ｈ）。

【0300】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ２００（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間０．４２８分。

【0301】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸の製造：
７－ヒドロキシ－４－メチル－クロメン－２－オン（８０．６ｇ、４５８ｍｍｏｌ）のアセトン（１０００ｍＬ）中溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（９４．９ｇ、６８７ｍｍｏｌ）及びメチル４－（ブロモメチル）ベンゾエート（１１０ｇ、４８０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３時間還流させた。次に、それを冷却して室温とし、濾過した。濾液を減圧下に溶媒留去し、残留物を水（１０００ｍＬ）と混合した。不溶固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させ、ＤＭＳＯ（５００ｍＬ）に溶かした。２０％ＫＯＨ水溶液（１５０ｍＬ）を、得られたメチル４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエートの溶液に加え、混合物を室温で終夜攪拌状態のままとした。反応が完了した後、それを水（３０００ｍＬ）に投入し、１０％塩酸でｐＨ１～２となるまで酸性化した。３０分間攪拌後、沈殿固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させて、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸１０６ｇ（３４２ｍｍｏｌ、収率：７５％）を得た。

【0302】

メチル４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］ベンゾエート：
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝７．９８（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．６０（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２－６．９６（ｍ、２Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、５．３２（ｓ、２Ｈ）、３．８５（ｓ、３Ｈ）、２．３８（ｓ、３Ｈ）。

【0303】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸：
^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝１２．９９（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．６７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１－６．９９（ｍ、２Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、５．３１（ｓ、２Ｈ）、２．３７（ｓ、３Ｈ）。

【0304】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．２４２分。

【0305】

４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－（２－チエニル－メチルカルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミドの製造：
４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］安息香酸（１２．６ｇ、４０．６ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（１５０ｍＬ）中溶液に、ＣＤＩ（７．２６ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間攪拌した。次に、２－（２－チエニルメチルカルバモイルアミノ）－エチルアンモニウムクロリド（１０．１ｇ、４２．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４．９０ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）を加え、反応塊を５０℃で１６時間攪拌した。混合物を冷却して室温とした後、水（６００ｍＬ）を加えた。沈殿した固体を濾取し、水、２－プロパノール、及びヘキサンで洗浄し、乾燥させて、４－［（４－メチル－２－オキソ－クロメン－７－イル）オキシメチル］－Ｎ－［２－（２－チエニル－メチルカルバモイルアミノ）エチル］ベンズアミド（ＭｙｏＭｅｄ－２０５）１３．３ｇ（２７．１ｍｍｏｌ、６７％）を得た。

【0306】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ＝８．６１－８．４７（ｍ、１Ｈ）、７．８６（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．７０（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８－７．２７（ｍ、１Ｈ）、７．１２－７．０２（ｍ、２Ｈ）、６．５１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２（ｓ、１Ｈ）、６．１７－６．０６（ｍ、１Ｈ）、５．３０（ｓ、２Ｈ）、４．３６（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２Ｈ）、３．３２－３．１７（ｍ、４Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）。

【0307】

ＨＰＬＣ－ＭＳ（ポジティブモード）ｍ／ｚ４９２（Ｍ＋Ｈ）^＋；保持時間１．２４９分。

【0308】

ＩＩ．生化学アッセイ
ＭｕＲＦ１－タイチン相互作用アッセイ：
ＭｕＲＦ１とタイチンの間の相互作用を阻害する化合物を特定するためにＡＬＰＨＡスクリーンを使用して小分子スクリーニングを行った。このスクリーンは、タイチンＡ１６９と相互作用するＭｕＲＦ１ Ｂボックスコイルドメインを特定したＭｕＲＦ１及びタイチン相互作用の研究に基づいている（たとえば、Ｍｒｏｓｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８， ４７， １０７２２－１０７３０を参照）。このＡＬＰＨＡスクリーンアッセイのプロトタイプが、ＷＯ２００９／０７７６１８に記載されている。

【0309】

手順：
ＷＯ２００９／０７７６１８に記載されているように、これらの相互作用するフラグメントはＧＳＴ及びビオチン融合タンパク質として発現されたことから、それぞれグルタチオンアクセプター及びアビジンドナービーズで複合体形成をモニタリングすることができた。２８０，０００個の化合物（社内ライブラリ、ＥＭＢＬ化学コア施設）の調査により、ＭｕＲＦ１－タイチン相互作用のＫｉ値が５～２５μｍｏｌ／Ｌである合計４０個の分子が特定された。

【0310】

ＭｕＲＦ１ Ｅ３リガーゼ活性の阻害の測定：
次に、７５ｎｍｏｌ／Ｌ ＵＢＥ１（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１μｍｏｌ／Ｌ ＵｂｃＨ５ｃ（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１００μｍｏｌ／Ｌユビキチン、４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１００ｎｍｏｌ／ＬタイチンＡ１６８－１７０と２０～１００μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの化合物とを混合することで、化合物について、タイチン又はＭｕＲＦ１自体（自己ユビキチン化）へのＭｕＲＦ１ Ｅ３リガーゼ活性に対する効果を評価した。２２０ｎｍｏｌ／Ｌ ＭｕＲＦ１を加えることで反応を開始し、次に３７℃で１時間、ＳＤＳ ＰＡＧＥとＭｕＲＦ１及びタイチン特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析を行った。すべての反応が５％ＤＭＳＯも含んでいた。ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－９４６－５、及びＭｙｏＭｅｄ－９４６－８について試験を行い、ユビキチン化パターンに基づいて、ＭｕＲＦ１ Ｅ３リガーゼ活性を有意に阻害することが確認できた。

【0311】

化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６の非存在下及び存在下でのＭｕＲＦ１中央フラグメントの示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）：
ＭｕＲＦ１タンパク質の安定性に対する化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６の効果を、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によってイン・ビトロで測定した。

【0312】

方法：
「ＭｕＲＦ１中央フラグメント」を、既報の方法（Ｍｒｏｓｅｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ， ２００７， ２１， １３８３－１３９２）に従って発現させ、７５μＭ最終濃度でＤＳＦ実験に使用した。化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を、ＤＳＦアッセイ緩衝液としてのＰＢＳで１０ｍＭ ＤＭＳＯ中原液から１００μＭまで希釈して、最終濃度１％ＤＭＳＯとした。室温で１時間前インキュベーションした後、タンパク質水溶液をキャピラリーにしみこませ、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８ ｎａｎｏＤＳＦ装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れた。温度勾配でタンパク質アンフォールディングの際にＬＥＤレーザー励起後に発生した固有のトリプトファン又はチロシン蛍光の変化が、それぞれ３３０ｎｍと３５０ｎｍで検出された。温度勾配における固有タンパク質蛍光の変化を、それぞれ３５０ｎｍと３３０ｎｍでモニタリングした。熱タンパク質アンフォールディング時の３５０／３３０ｎｍの蛍光波長比の一次導関数を用いて、単一及び複数の遷移状態の遷移中点（Ｔｍ）を計算した。

【0313】

結果：
図５５からわかるように、ＰＢＳ中のＭｕＲＦ１中央フラグメントのＴｍは６５．２℃（実線）であり、１％ＤＭＳＯ（破線）の添加によってごくわずかに変化して６５．８℃となった。対照的に、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（点線）の添加により、ＭｕＲＦ１の熱アンフォールディングへの強い効果が観察された。化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６は、５２．５℃の大幅に減少したメインＴｍによって示されるように、ＭｕＲＦ１を不安定化した。

【0314】

ＩＩＩ．生物学的研究
細胞培養実験
マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞（ＣＲＬ－１７７２、ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ（Ｒ） Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、 Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ；Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で培養した。筋管への分化を誘発するために、サブコンフルエントな培養物を、２％のウマ血清を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｅｅｌｚｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に切り替えた。続いて、筋管を、化合物濃度を上げながら（０．１～１０μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯに溶解）又は等容量のＤＭＳＯで２時間前処理した後、１０μｍｏｌ／Ｌデキサメタゾン（ＤＥＸ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｅｅｌｚｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で２４時間処理した。次に、筋管の直径を画像解析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．０、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ， Ｍｕｎｓｔｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって評価した。選択した化合物の細胞毒性を測定するために、筋芽細胞又は筋管を、濃度を上げながら２４時間インキュベートした。続いて、Ｂｅｌｌｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２００８， ３７４， ４８－５５に記載のように、細胞破壊の尺度として、細胞培養上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性の濃度を定量した。図１及び図２からわかるように、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６は、筋芽細胞及び筋管（筋細胞）の両方で低い毒性を示す。

【0315】

動物実験
２．１：肺高血圧マウスモデル：
２．１．１：ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６を使用した試験シリーズ１
この動物実験は、Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ（３５－９１８５．８１／Ｇ－１４１／１３）及びＲｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｅｓｉｄｉｕｍ Ｌｅｉｐｚｉｇ（ＴＶＶ４０／１６）によって承認された。この試験には、１）生理食塩水処理（ｓｈａｍ；ｎ＝２０）；２）モノクロタリン（ＭＣＴ）処理した通常の飼料（ＭＣＴ；ｎ＝２７）；３）ＭＣＴ処理した摂食ＭｕＲＦ１阻害剤飼料（ＭＣＴ＋化合物；ｎ＝２７）を含む三つの群のマウスを含めた。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）にＭＣＴ（６００ｍｇ／ｋｇ）又は同容量の生理食塩水を６週間皮下注射し、その期間で、Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｋ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１３， ８：ｅ６２７０２に記載されているように、ＭＣＴは、肺高血圧による心臓悪液質及びその後に食欲不振ではなくＲＶ機能障害を誘発することが知られている。マウスを１２：１２時間の明暗サイクルで同じ条件に曝露し、飼料及び飲料水は自由に与えた。ＭＣＴ＋化合物群は、ＭＣＴ注射の１週間前に阻害剤飼料の摂取を開始したが、ｓｈａｍ群及びＭＣＴ群には、選択した化合物を添加せずに同じ飼料を与えた。各マウスの体重を毎週記録した。フェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ）及びケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与による深麻酔後、マウスを屠殺した。屠殺時に、心臓と肺を解剖し、洗浄し、乾式ブロットし、秤量し、心臓は４％ＰＢＳ緩衝ホルマリンで固定した。左前脛骨筋（ＴＡ）、ヒラメ筋、長指伸筋（ＥＤＬ）、及び肋骨横隔膜の切片も切り取り、秤量し、４％ＰＢＳ緩衝ホルマリンで固定し、残りの筋肉部分は、分子分析用に、直ちに液体Ｎ_２で凍結した。

【0316】

組織学的評価のために、パラフィン包埋ＴＡ筋肉切片（３μｍ）をＨ＆Ｅで染色し、次に画像ソフトウェア（Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．０， Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ， Ｍｕｎｓｔｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で繊維断面積（ＣＳＡ）を評価した。さらに、心臓の内側断面（３μｍ）をスライドガラスに乗せ、続いてＨ＆Ｅで染色してＲＶ壁の厚さを評価した。

【0317】

図３～５からわかるように、体重増加、肺重量及び心臓重量は、ＭＣＴを与えたマウスとＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えたマウスでほぼ同じであり、これは、化合物摂取とは無関係に両方の群で疾患が進行したことを示している。重要な点として、図６及び７からわかるように、ＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６は、右心室肥大の発症を軽減する。さらに、図８～１２からわかるように、ＭＣＴ処理マウスは骨格筋量の進行性の喪失を示したが、ＭＣＴ＋化合物を与えられたマウスはこの傾向に従わず、保護されました。これはＴＡ筋肉で見られた最も明白な効果である。

【0318】

２．１．２：ＭｕＲＦ１阻害剤ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３及びＭｙｏＭｅｄ－２０５を使用した試験シリーズ２：
試験シリーズ２は、試験シリーズ１と同様に実施した。すなわち、この試験では、三つのマウス群：１）生理食塩水で処理されたマウス（ｓｈａｍ；ｎ＝１０）；２）通常の飼料を与えられたモノクロタリン（ＭＣＴ）処理マウス（ＭＣＴ；ｎ＝１０）；３）ＭｕＲＦ１阻害剤飼料を与えられたＭＣＴ処置マウス（ＭＣＴ＋化合物；各化合物についてｎ＝１０）を含めた。８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＣＴ（６００ｍｇ／ｋｇ）又は同容量の生理食塩水を８週間にわたり週１回皮下注射した。ＭＣＴ＋化合物群は、ＭＣＴ注射の１週間前に阻害剤飼料摂取を開始したが、ｓｈａｍ及びＭＣＴ群には、選択した化合物を添加せずに同じ飼料を与えた。飼料中の化合物濃度は０．１重量％であり、マウス１匹あたりの１日化合物摂取量約３ｍｇとなった。各マウスの体重を毎週記録した。８週間の処理後にマウスを屠殺した。屠殺時に、試験シリーズ１に記載の方法に従って検査及び組織分析を行った。

【0319】

図１３～１５からわかるように、体重増加、肺重量と心臓重量は、ＭＣＴを与えたマウスとＭＣＴ＋化合物を与えたマウスの間で類似しており、それは、化合物摂取とは無関係に両方の群で疾患が進行したことを示唆している。また、この試験シリーズでは、図１６～１８からわかるように、ＭｕＲＦ１阻害剤であるＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＭｙｏＭｅｄ－２０３、及びＭｙｏＭｅｄ－２０５は、右心室肥大の進行を軽減する。さらに、図１９～２１からわかるように、ＭＣＴ処理マウスは骨格筋量の進行性喪失を示したが、ＭＣＴ＋化合物を与えられたマウスはこの傾向に従わず、保護された。これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－２０３で見られた最も顕著な効果である。さらに、ＴＡ筋組織におけるＭｕＲＦ１発現レベルは、ＭＣＴ＋化合物を与えられたマウスで明らかに低下しており、図２２からわかるように、化合物ＭｙｏＭｅｄ－２０５において最も顕著な低下が見られる。ＭｕＲＦ１標的タンパク質であるテレトニンの発現レベルも、図２３からわかるように、ＭＣＴ＋化合物を与えられたマウスでは本質的に正常化されている。

【0320】

２．２：心筋梗塞ＬＡＤマウスモデル：
駆出率（ＨＦｒＥＦ）が低下した心不全を患う心筋梗塞マウスモデルを、以下に記載のように冠動脈左前下行枝（ＬＡＤ）を結紮して急性心筋梗塞（ＭＩ）を誘発し、続いて慢性（収縮性）心不全（ＣＨＦ）を誘発することで発生させた。

【0321】

ＬＡＤ結紮術：
小動物の手術は、ライプツィヒ心臓センターで１２週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスに対して、現場で確立された公知の手順に従って実施した（たとえば、Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１５， １１８， １１－１９；Ｍａｎｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ， ２０１５， ６， ３８１－３９０参照）。すなわち、ＬＡＤ群からのマウスに、ＭＭＦ；メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（５．０ｍｇ／ｋｇ）、フェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔を施した。麻酔マウスを手術台に固定した。胸部の腹側部分を剃毛し、洗浄し、滅菌した。次に、麻酔マウスに挿管し、動物用呼吸器（ＴＳＥ ＧｍｂＨ， Ｓｉｅｍｅｎｓｓｔｒ． ２１， ６１３５２ Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ；ｐｒｏｄｕｃｔ：ｈｔｔｐ：／／ｔｉｎａｔｅｂ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１６／０６／ＴＳＥ＿Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ－Ｃｏｍｐａｃｔ＿２００８０７２４＿ＨＲ．ｐｄｆ）を使用して通常の室内空気で換気した。ＬＡＤ手術では、剣状突起の約１ｃｍ上及び胸骨傍的に約１ｃｍ左で胸郭を、そこで皮膚を切開することで開いた。下にある大胸筋を、胸壁にアクセスするために、それ以上損傷させることなく横に移動させた。肋骨を壊さずに、二つの肋骨の間の肋間筋を、横に動かした。心膜の上に挿入された外科用スプレッダーによって、それにより作られた胸郭内アクセスを広げた。二つの解剖ピンセットを使用して、心膜を外科的に断端で開いた。胸腺が手術野に存在する場合は、大動脈根にアクセスするために手術用綿棒で胸腺を横に押した。フックを使用して心臓を心膜から出して注意深く移動させ、左心房を外科用綿棒で横に置いた。次に、ＬＡＤを５．０ Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸で結紮した（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｔｈｉｃｏｎ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｗｏｕｎｄ－ｃｌｏｓｕｒｅ／ｎｏｎ－ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ－ｓｕｔｕｒｅｓ／ｐｒｏｌｅｎｅ－ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅを参照）。大動脈基部の近くで結紮を行い、冠状動脈前壁の蒼白が認められるまで縫合糸を締めた。結紮後、４．０Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸（会社：Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して、胸壁と皮膚を一つのボタンシームで閉じた。

【0322】

対照として、ｓｈａｍ手術を行った。ｓｈａｍ対照群の場合、従った手順は、５．０プロレン縫合糸を締め付けることなくＬＡＤ周囲に緩く外に出ただけであること以外は、上記とまったく同じとした。

【0323】

手術を抜管により終了し、アチパメゾール（２．５ｍｇ／ｋｇ）及びフルマゼニル（０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔を無効化した。マウスは、目覚めるまで保温マット（ｍａｔｅ）上に置き、その後、動物ケージに戻した。専門スタッフによる上記の全手順の時間は約３０分であった。

【0324】

ＬＡＤ結紮の１週間後、心エコー検査をＭモードで行って、ＭＩを確認した。すなわち、左心室拡張末期（ＬＶＥＤＤ）及び収縮期（ＬＶＥＳＤ）の直径を評価して、左心室（ＬＶ）の短縮率を計算できるようにした（ＬＶＦＳ＝［ＬＶＥＤＤ＿ＬＶＥＳＤＬＶＥＤＤ］×１００）。次に、大きい梗塞を有するマウス（左心室駆出率（ＬＶＥＦ）＜２０％）のみを、二つの群に無作為に割り付け、一つの群には通常の飼料を与え（ＣＨＦ、ｎ＝１１）、第２の群には化合物を補充した飼料を与えた（０．１％の化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ｎ＝１２）。ｓｈａｍ手術された動物には通常の飼料のみを与えた（ｎ＝１５）。９週間後、心エコー検査を再度行った。

【0325】

【表1】

【0326】

動物を屠殺して、機能的及び分子的特性決定のために、組織、特に横隔膜組織を回収した。すべての実験及び手順は、地元の動物研究評議会、ライプツィヒ大学、及びＬａｎｄｅｓｂｅｈｏｒｄｅ Ｓａｃｈｓｅｎ（ＴＶＶ３６／１５）によって承認された。

【0327】

収縮機能：
直接機能評価を提供するために、骨格筋線維束、すなわち、ＭＣＴマウス及びＣＨＦマウスの横隔膜からの線維束の収縮性を次のように測定した。横隔膜からの線維束を単離して、Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ， ２０１７， ３１によって記載の方法に従って、長さ制御レバーシステム（３０１Ｂ， Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ａｕｒｏｒａ， Ｃａｎａｄａ）を用いてイン・ビトロ収縮機能を評価できるようにした。すなわち、筋肉束を、緩衝液で満たされた臓器浴（約２２℃）に垂直に取り付け、最適な長さに設定し、１５分後に１～３００Ｈｚの力－収縮頻度プロトコールで刺激した（６００ｍＡ；５００ミリ秒の列持続時間；０．２５ミリ秒のパルス幅）。次に、筋肉について力－速度プロトコルを行うことで、１５０Ｈｚで３００ミリ秒間刺激した後、外部負荷（最大強縮力の８０～１０％、それぞれ１分間隔）に対して筋肉を短縮させた。長さにおける、そしてトランジェント（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）の直線部分（ＤＭＡソフトウェア、Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での最初の変化の１０ミリ秒後に短縮速度を測定した。Ｌ_ｏ（ｃｍ）と推定筋肉密度（１．０６）の積によって筋肉量（ｇ）を割ることで、力（Ｎ）を筋肉断面積（ＣＳＡ；ｃｍ^２）に対して正規化し、それによってＮ／ｃｍ^２単位での比筋力を計算することができた。短縮速度を至適筋肉長さに対して正規化したが（単位：Ｌ_ｏ／ｓ）、各負荷について、パワーを、短縮速度と比筋力の積として計算した（単位：Ｗ／ｃｍ^２）。

【0328】

図２４から２７からわかるように、慢性心不全マウス（ＣＨＦマウス）の横隔膜筋線維束は、電気刺激時に相対的に弱い力を生じ（図２４）、最大力（図２５及び２６）及びピークパワー（図２７）も低かった。したがって、ｓｈａｍ動物と比較して、対照飼料を与えられたＣＨＦマウスは、１０週目に横隔膜ミオパチーを発症した。化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えることで、そのような梗塞後横隔膜衰弱からマウスを保護した。慢性心不全による横隔膜機能及び横隔膜最大力の喪失は、ＣＨＦマウスの未処理群と比較して、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスで大幅に減らすことができる。これは、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６によるＭｕＲＦ１の選択的阻害が、心筋梗塞によって誘発される駆出率（ＨＦｒＥＦ）の低下を伴う心不全後の横隔膜機能への良い効果に介在することを示している。

【0329】

同様に、図２８～３０からわかるように、ＭＣＴ誘発性肺高血圧を患っているマウスにおける横隔膜の収縮不全（短縮速度及びパワーに関して）も、ＭＣＴマウスに化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６（ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６）を与えたときに実質的に防止された。

【0330】

したがって、まとめると、上記の所見は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６によるＭｕＲＦ１の選択的阻害が、慢性心不全及び心臓悪液質における骨格筋の量（すなわち、質量）及び質（すなわち、収縮機能）の両方への良い効果に介在することを示唆している。

【0331】

腫瘍マウスモデル：
８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスに、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（９×１０^５細胞）又は生理食塩水（ｓｈａｍ、ｎ＝１０）を接種した。腫瘍接種後の最初の３日以内に、Ｂ１６Ｆ１０マウス並びにｓｈａｍのマウスに通常の飼料を与えた。次に、Ｂ１６Ｆ１０マウスを無作為に３群に分け、第１群にはＭｙｏＭｅｄ－９４６飼料（Ｔｕｍｏｒ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ｎ＝１０）を与え、第２群にはＭｙｏＭｅｄ－２０５飼料（Ｔｕｍｏｒ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５、ｎ＝１０）を与え、第３群には、選択化合物を加えなかった以外は同じ飼料を与えた（腫瘍、ｎ＝１０）。飼料中の化合物濃度は０．１重量％であり、マウス１匹あたりの１日化合物摂取量は約３ｍｇとなった。また、ｓｈａｍ群には、選択化合物を加えなかった以外は同じ飼料を与えた。腫瘍接種の９、１６、２３日後に、各マウスでワイヤーハング試験（筋肉機能）を行った。それに関しては、標準的なワイヤーハング構造を床から７０ｃｍの高さのワイヤー（長さ：４０ｃｍ、直径：２．５ｍｍ）とともに用いた。ワイヤーの中央の下に、おがくずが入った大きい箱を置いた。試験のために、マウスを２本の肢でワイヤーに吊るし、吊るした時間を記録した。各動物について、それぞれ最大１８０秒間３回試みた。３回試行後、最大保持力積（ｈｏｌｄｉｎｇ ｉｍｐｌｕｓｅ）を計算した（吊り下げ時間ｘ体重）。

【0332】

腫瘍接種の２５日後にマウスを屠殺した。屠殺時に、検査及び組織分析を上記のように実施した。

【0333】

図３１からわかるように、腫瘍誘発性骨格筋萎縮（ＴＡ筋重量に基づく）は、腫瘍マウスと比較した場合、腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウス及び腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５マウスで少なくともある程度まで弱めることができた。この効果は、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６及びＭｙｏＭｅｄ－２０５（腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６マウス及び腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５マウス）の投与が、通常の飼料を与えた腫瘍マウスと比較して、筋肉機能の喪失を大幅に軽減するワイヤーハングテスト（図３２）でより顕著である。

【0334】

保存された駆出率（ＨＦｐＥＦ）を伴う心不全における心筋及び骨格筋の変化－ラットモデル
試験計画の模式図を図５６に示す。この試験では、ＺＳＦ１ラットを使用した。２０週齢後、ＺＳＦ１ラットは拡張期コンプライアンスを失い、拡張末期容積が増加するため、ヒトＨＦｐＥＦ（拡張期心不全としても知られる）を模倣する。

【0335】

雌のＺＳＦ１痩身型（対照、ｎ＝２５）及びＺＳＦ１肥満型（ｎ＝４０）ラットを試験に含めた。２０週齢で、心エコー検査／侵襲的血行動態測定によってＨＦｐＥＦの発症を確認し、動物の下位集合から組織材料を収集した（対照ｎ＝１０；ＺＳＦ１肥満ｎ＝１０）。残りの対照ラット（対照、ｎ＝１５）はさらに１２週間固定状態（ｓｅｄｅｎｔａｒｙ）に維持したが、残りのＺＳＦ１肥満動物（ｎ＝３０）は次の群：（１）正常な飼料を与えられるラット（ＨＦｐＥＦグループ、ｎ＝１５）又は化合物ＭｙｏＭｅｄ－２０５を補充した飼料を与えられるラット（ＭｙｏＭｅｄ－２０５の０．１％、ＨＦｐＥＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５、ｎ＝１５）に無作為に割り付けた。ラットを１２時間の明暗サイクルで同じ条件に曝露し、飼料と飲料水は自由に摂取させた。無作為化から１２週間後、心エコー検査と侵襲的血行動態測定を実施して、拡張機能障害の程度を明らかにした。続いてラットを屠殺し（深麻酔で胸部を開く）、機能及び分子分析のために骨格筋及び心筋組織を採取した（ホルマリン固定及び液体窒素での急速凍結）。すべての実験と手順は、地元の動物研究評議会、ドレスデン工科大学及びＬａｎｄｅｓｂｅｈｏｒｄｅ Ｓａｃｈｓｅｎ（ＴＶＶ４２／２０１８）によって承認された。

【0336】

心エコー検査
ラットにイソフルラン（１．５～２％）で麻酔を施し、Ｖｅｖｏ３１００システムと２１ＭＨｚトランスデューサー（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃ， Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用して経胸壁心エコー検査を行って、前述のように心機能を評価した（Ｔ． Ｓ． Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．， ２０１５， １７， ２６３－２７２）。収縮機能については、胸骨傍の長軸及び短軸のＢモードとＭモードを乳頭筋のレベルで測定した。左心室の中隔壁の基底中隔セグメントのレベルでの脈波ドップラー（僧帽弁速度の初期（Ｅ）及び心房（Ａ）波の測定のため）及び組織ドップラー（心筋速度（Ｅ′及びＡ′）の測定のため）を使用して、心尖部四腔像で、拡張機能を評価した。機能パラメータ（すなわち、ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）及び１回拍出量（ＳＶ））及び［Ｅ／Ｅ′］と［Ｅ／Ａ］の比率）を、Ｖｅｖｏ ＬＡＢ２．１．０ソフトウェアを使用して取得した。

【0337】

侵襲的血行動態測定
侵襲的血行動態圧力測定は、最終手順として実行した。麻酔を施した（ケタミン、キシラジン）が自発呼吸をしているラットで、左心室の中央に静かに配置したラットＰＶカテーテル（ＳＰＲ－８３８、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）で右頸動脈にカニューレを挿入した。左心室拡張末期圧及び収縮末期圧、最大圧力上昇率（ｄＰ／ｄｔｍａｘ）、最大圧力低下率（ｄＰ／ｄｔｍｉｎ）、及び後にカテーテルの大動脈への引き抜きが続くＬＶ弛緩の時定数（τ）、並びに相性及び平均動脈圧を測定した。上行大動脈で平均動脈圧を測定した。データはＬａｂＣｈａｒｔ８ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に記録した。

【0338】

骨格筋機能
右ＥＤＬと左ヒラメ筋を切開し、フックと力変換器の間のクレブス－ヘンゼライト緩衝液で満たされた臓器浴に垂直に取り付け、出力を連続的に記録してデジタル化した（１２０５Ａ：Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍ－Ｒａｔ， Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）。高出力バイポーラー刺激装置（７０１Ｃ；Ａｕｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）からの最大上電流（７００ｍＡ、５００ｍｓ列持続時間、０．２５ｍｓパルス幅）で筋肉を刺激する白金電極によって、イン・ビトロ筋肉機能を評価した。筋肉束を、生成された最大単収縮力に相当する至適長さ（Ｌｏ）に設定し、その後、浴温度を２５℃に上昇させ、続いて１５分間の熱平衡期間を設けた。次に、力－周波数プロトコールを１、１５、３０、５０、８０、及び１２０Ｈｚで行い、１分間の休止間隔で区切った。５分間の休止期間後、筋肉について、５分間にわたって疲労プロトコールを行った（２秒ごとに４０Ｈｚ）。疲労プロトコール時に生成された力を、発生した最初の力に正規化することで、疲労性の相対的評価を得た。

【0339】

結果：
２０週（無作為化の時点）での動物の特徴
動物を異なる処理群に無作為に割り付ける前にＨＦｐＥＦの発生を検証するために、１０匹のＺＳＦ１痩身及び１０匹のＺＳＦ１肥満動物を心エコー検査、侵襲的血行動態測定、及び骨格筋機能の測定によって分析した。ＺＳＦ１肥満動物は体重の増加（肥満の兆候）を示し、心筋肥大の兆候（脛骨長さに正規化した場合の心臓重量の増加）が明らかであった。拡張機能のマーカーに関しては、比率Ｅ／ｅと左心室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）がＺＳＦ１肥満動物で有意に増加した。拡張機能の障害にもかかわらず、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）は正常（＞６０％）であり、痩身対照ラットと比較した場合でも少し高かった。平均動脈圧（ＭＡＢＰ）に関しては、ＺＳＦ１肥満動物で有意な上昇が見られた。ＭＡＢＰにおけるこの増加は、動物の過緊張状態の兆候であり、それはＨＦｐＥＦ患者からよく知られている特徴である。末梢骨格筋に関しては、ＺＳＦ１肥満動物は筋萎縮と骨格筋機能障害を発症した。要約すると、２０週齢の動物は、ＨＦｐＥＦの診断に従った特徴を生じた。

【0340】

ＨＦｐＥＦにおける心臓パラメータに対するＭｙｏＭｅｄ－２０５処理の影響
心筋機能に対するＭｙｏＭｅｄ－２０５の影響を評価するために、心エコー検査及び侵襲的血行動態測定を実施した。図５７に示すように、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）（図５７Ａ）は、対照ＺＳＦ１痩身動物と比較した場合、未処理ＨＦｐＥＦ動物で有意に減少した。この減少は、ＭｙｏＭｅｄ－２０５による１２週間の処理によって大幅に軽減される。拡張機能のパラメータ、比率Ｅ／ｅ（図５７Ｂ）及びＬＶＥＤＰ（図５７Ｃ）に関して、ＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理は、ＺＳＦ１肥満の未処理動物で見られる増加を減弱させた。ＭｙｏＭｅｄ－２０５の処理効果はＭＡＢＰでは見られなかった（図５７Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理が収縮機能と拡張機能を大幅に改善し、この効果には血圧の調節が介在しないことを示している。

【0341】

骨格筋量及び機能に対するＭｙｏＭｅｄ－２０５処理の影響
骨格量及び骨格筋機能は、異なる処理群への無作為割り付けの時点で、ＺＳＦ１肥満動物ではすでに損なわれていた。本試験では、ＭｙｏＭｅｄ－２０５が骨格筋の量と機能を調節できるか否かを調べた。結果を図５８に示してある。前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉重量の分析（図５８Ａ）により、ＨＦｐＥＦ未処理動物の筋肉湿重量の有意な低下が明らかになった。この筋萎縮はＭｙｏＭｅｄ－２０５によって減弱された。ＥＤＬ（図５８Ｃ）及びヒラメ筋（図５８Ｂ）に関しては、ＨＦｐＥＦの発生は筋肉の湿重量に影響を与えなかった。しかしながら、ＥＤＬ筋では、ＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理により、筋肉重量に小さいが有意な増加があった（図５８Ｃ）。

【0342】

筋萎縮の発症に関して筋重量を測定することに加えて、筋機能の評価は非常に重要である。図５８Ｄに示されるように、処理されなかったＺＳＦ１肥満動物は、ＺＳＦ１痩身対照群と比較した場合、骨格筋機能障害を発症する。絶対比筋力を測定すると、この筋力低下はヒラメ筋において明らかである（図５８Ｄ）。ＨＦｐＥＦ動物をＭｙｏＭｅｄ－２０５で１２週間処理することで、機能喪失が減弱された。

【0343】

結論：
結果は、ＨＦｐＥＦにおいて、ＭｙｏＭｅｄ－２０５が心筋拡張機能障害の発症を減弱させ、骨格筋萎縮及び骨格筋機能障害を減弱させることを示している。

【0344】

２．６：ドキソルビシン誘発性筋萎縮及び心臓毒性
ドキソルビシン（ＤＯＸ）は、各種のがん治療に使用される効率的な化学療法薬である。しかしながら、その使用は、初期及び慢性の心毒性及び筋毒性に関連している。齧歯類では、ドキソルビシンの単回注射は心臓及び骨格筋量を減らし得るものであり、その後、機能が著しく損なわれる。

【0345】

ドキソルビシンで処理されたマウスモデルにおけるＭｙｏＭｅｄ－２０５強化食品の効果を評価した。Ｃ５７ｂｌ／６マウスを動物飼養場で３日間馴致させた後、次のように４群に無作為に分類した：１．対照（プラセボ飼料＋０．９％生理食塩水腹腔内注射）；２．ＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭｙｏＭｅｄ－２０５－飼料、１ｇ／ｋｇのＭｙｏＭｅｄ－２０５を添加した飼料；＋０．９％生理食塩水注射）；３．ＤＯＸ（プラセボ飼料＋ＤＯＸ注射）；４．ＤＯＸ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５（ＭｙｏＭｅｄ－２０５飼料＋ＤＯＸ注射）。初回ＤＯＸ注射の前に、動物にＭｙｏＭｅｄ－２０５飼料又はプラセボのいずれかを７日間前付与した。ＤＯＸ処理は、それぞれ第１０、１２、１６、２５、及び２８日に５回の注射で与え、２５ｍｇ／ｋｇの総投与量であった。動物の体重及び摂餌量を毎日同じ時刻に測定して、摂餌量と体重増加を評価した。心機能を、心エコー検査によって第１９日と第４２日に評価した。図５９に示すように、ＭｙｏＭｅｄ－２０５を与えることで、第４３日までに悪液質消耗及び身体ストレスの特徴を著しく減らすことができた。ＭｙｏＭｅｄ－２０５を与えたマウスは、より高い除脂肪量を有しており（図５９Ａ）、より多い体脂肪を保持し（図５９Ｂ）、そして約１／２の間質性浮腫のない液体を有していた（図５９Ｃ）。＊はｐ＜０．０５対対照を意味し；＄は、ｐ＜０．０５対ＭｙｏＭｅｄ－２０５を意味し；§は、ｐ＜０．０５対ＤＯＸ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５（テューキー事後検定）を意味する。

【0346】

図６０からわかるように、第１５日及び２５ｍｇ／Ｋｇの累積ＤＯＸ投与後の心エコー検査では、心臓毒性及び心不全が示された。すなわち、それぞれ心臓重量の低下（脛骨長さによって補正）（図６０Ｃ）、駆出率の低下（それぞれ、長軸平面図から計算）（図６０Ａ）、及び短縮率の低下（短軸平面図から計算）（図６０Ｂ）である。第４３日までのＭｙｏＭｅｄ－２０５処理が、これを防いだ。要約すると、ＤＯＸ化学療法時のＭｙｏＭｅｄ－２０５の投与は心臓を保護するのに有用である。＊はｐ＜０．０５対対照を意味し；＄は、ｐ＜０．０５対ＭｙｏＭｅｄ－２０５を意味し；§は、ｐ＜０．０５対ＤＯＸ＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５（テューキー事後検定）を意味する。

【0347】

２．７：飼料誘発性体重減少時の２型糖尿病の肥満マウスにおける筋肉機能（ＤＩＯマウスモデル：インスリン抵抗性と肥満を伴う糖尿病）
糖尿病の進行時にミオパチーも発症する糖尿病のマウスモデルにおける化合物摂取の効果を調べた。糖尿病は、ＤＩＯマウスで４か月間、高果糖高脂肪食（ＨＦＤ）によって誘発した。体重増加は２２．２％であった。マウスは空腹時血糖値とインスリン抵抗性の増加を生じた。対照群動物には、通常の齧歯類飼料（通常の飼料）を与えた。その後、３０日間の試験期間中、体重減を誘発した。第１ステップでは、動物に通常の齧歯類飼料を１６日間与えた。次に、第２ステップで、動物には１４日間、低カロリー食を与えた。体重はエンドポイントで平均１２．４％減少した。第１ステップ開始から２日後、飼料にＭｙｏＭｅｄ－２０５（化合物１ｇ／飼料１ｋｇ）を補充した。第１ステップの開始時及び試験期間の第３、７、１４、２１及び２８日に、化合物を与えたマウスと対照マウスについて、ワイヤーハングテストで筋力を比較した。

【0348】

試験計画：ＩＣＲ－ＤＩＯ雄マウスを、それぞれ８～１０匹の動物群に無作為に割り付けた。３つの対照群：肥満のないマウスの対照群（対照；通常食（ＲＤ）；ｎ＝１０）、全試験期間時に高果糖高脂肪飼料を与えられた肥満マウス（ＤＩＯ ＨＦＤ；ｎ＝８）；及び体重減少が始まった肥満マウス（ＤＩＯ対照；ｎ＝８）を含めた。

【0349】

ワイヤーハングテスト：ワイヤーハングテスト（ＷＨＴ）では、床上７０ｃｍの高さのワイヤー（長さ：４０ｃｍ、直径：２．５ｍｍ）を用いる標準のワイヤーハング構造を使用した。ワイヤーの中央の下に、おがくずが入った大きなボックスを置いた。試験のために、マウスを２本の肢でワイヤーに吊るし、マウスが落下する前にワイヤーに保持することができた時間を記録した。各動物について、最大１８０秒間３回試行した。３回の試行の後、最大保持力積を計算した（吊り下げ時間×体重）。

【0350】

結果：

【0351】

【表2】

【0352】

図６１は、ＤＩＯ対照マウスと比較した、ＭｙｏＭｅｄ－２０５処理ＤＩＯマウスのＷＨＴの結果をグラフで表したものである。これからわかるように、ＭｙｏＭｅｄ－２０５は第４週（２８日）までにＤＩＯ対照マウスと比較して筋力を大幅に改善した。筋力もＤＩＯ ＨＦＤマウスと比較して有意に改善され、第４週までに対照（ＲＤ）マウス群と有意差はなかった（図６１では不図示）。

【0353】

２．８：飼料誘発性体重減少時の２型糖尿病の肥満マウスにおけるグルコース及びインスリン調節（ＤＩＯマウスモデル：インスリン抵抗性及び肥満を伴う糖尿病）
実施例２．７と同様にして、ＤＩＯマウスで４か月間にわたり、高果糖高脂肪食（ＨＦＤ）によって糖尿病を誘発した。そのマウスは、空腹時血糖値上昇及びインスリン抵抗性を生じた。対照群動物には、通常の齧歯類飼料（通常飼料）を与えた。その後、３０日間の試験期間中に体重減少が誘発された。第１ステップでは、動物には１６日間にわたって通常の齧歯類飼料を与えた。次に、第２ステップで、動物には１４日間にわたり低カロリー飼料を与えた。第１ステップの開始から２日後、飼料にＭｙｏＭｅｄ－２０３（化合物１ｇ／飼料１ｋｇ）を補充した。

【0354】

試験計画：ＩＣＲ－ＤＩＯ雄マウスを、それぞれ８～１０匹の動物の群に無作為に割り付けた。三つの対照群：肥満のないマウスの対照群（対照；通常食（ＲＤ）；ｎ＝１０）、全研究期間中、高果糖高脂肪食を与えられた肥満マウス（ＤＩＯ ＨＦＤ；ｎ＝８）；体重減少が始まった肥満マウス（ＤＩＯ対照；ｎ＝８）を含めた。

【0355】

血糖値の測定
血糖値の測定を、６時間の絶食後に行った。Ｏｎ Ｃａｌｌ Ｐｌｕｓ血糖計（Ａｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）及び特異的試験紙（ＲＥＦＧ１３３－１１１）を使用して、血糖値を測定した。尾の先端を切開することにより、尾静脈から採血を行った。各アッセイに、血液５～６μＬを使用した。

【0356】

ＭｙｏＭｅｄ－２０３処理動物では、血糖値は処理期間全体を通じてＤＩＯ対照群と比較して有意に低く、試験の第２日及び第２１日に空腹時血糖値が有意に変化した。図６２は、ＭｙｏＭｅｄ－２０３で処理したＤＩＯマウスとＤＩＯ対照マウスとの比較を示している。

【0357】

ブドウ糖負荷試験
経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）では、６時間の絶食後に、１０ｍＬ／ｋｇの投与容量で用量２ｇ／ｋｇのブドウ糖をマウスに経口投与した。グルコース測定は、治療の直前、及びグルコース投与後１５、３０、６０及び１２０分に実施した。試験中の各マウスにおける血糖出力率を説明するＡＵＣを、次の式を使用して計算した。

【0358】

【数1】

【0359】

ＭｙｏＭｅｄ－２０３は、ＯＧＴＴデータによると、１４日間の体重減少及び治療後、肥満マウスで軽度の低血糖効果を示した。この群の動物における血糖値は、ＤＩＯ対照群と比較して、ＯＧＴＴ試験の３０分で低くなる傾向があった。同じことが、グルコース除去を説明するＡＵＣ計算値にも当てはまる。同様の傾向が試験の第２８日で続いており、すべての対照群と比較して１２０分でのグルコースレベルの有意な低下が、ＭｙｏＭｅｄ－２０３処理群で観察され；グルコース排出曲線下の面積計算値も同様に低くなる傾向があった。図６３と図６４は、それぞれＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウスとＤＩＯ対照マウスの第１４日及び第２８日のＯＧＴＴデータを示している。

【0360】

インスリン作用に対する耐性の試験
インスリン耐性試験（ＩＴＴ）の場合、６時間の絶食後、マウスに、体積５ｍＬ／ｋｇで０．７５又は０．６０ＩＵ／ｇの用量で組換えヒトインスリン溶液（Ｌｉｌｌｙ， Ｆｒａｎｃｅ；ＲＥＦ Ｃ６２０００１Ｋ）を腹腔内注射した。グルコース測定は、処理の直前、及びインスリン投与の１５、３０、６０、１２０分後に実施した。血糖出力率の結果を、曲線下面積（ＡＵＣ）として表した。

【0361】

すべての対照群と比較して、インスリン注射後１２０分でＭｙｏＭｅｄ－２０３処理マウスにおいて、グルコースレベルの有意な低下が観察された。図６５は、ＭｙｏＭｅｄ－２０３処理ＤＩＯマウス及びＤＩＯ対照マウスにおけるＩＴＴ結果を示している。

【0362】

組織分析
３．１：プロテオーム及びウェスタンブロット分析：
３．１．１：ＭＣＴマウス：
プロテオーム分析：
ｓｈａｍ、ＭＣＴ及びＭＣＴ＋化合物マウス（群当たりｎ＝３）における冷凍横隔膜サンプルからのタンパク質を液体Ｎ_２下で粉末化した。次に、Ｋｏｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１３， １００５， ３９－５２に記載の方法に従って、バートナウハイムのＤＺＨＫ質量分析コア施設で質量分析を実施した。ＭＣＴ／ｓｈａｍ及びＭＣＴ＋化合物／ＭＣＴについての相対比を求め、異なって発現され、非常に有意である（Ｐ＜０．０１）と思われるヒット（ｈｉｔｓ）のみをウェスタンブロットによってさらに調べた。

【0363】

ウェスタンブロット分析：
ウェスタンブロット分析は、冷凍ＴＡ筋肉サンプルをプロテアーゼ阻害剤混合物（阻害剤ミックスＭ， Ｓｅｒｖａ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ－４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；ｐＨ７．４）又は緩和（ｒｅｌａｘ）緩衝液（９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ、８ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１０ｍｍｏｌ／Ｌクレアチンリン酸；ｐＨ７．４）中で均質化し、超音波処理し、１６，０００×ｇで５分間遠心することからなるものであった。上清のタンパク質濃度を測定し（ＢＣＡアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ， Ｂｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、小分けサンプル（５～２０μｇ）をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ）に移し、次の一次抗体：ＭＡＦｂｘ（１／２０００、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ， Ｓｅｒａｉｎｇ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＭｕＲＦ１（１／１０００、Ｍｙｏｍｅｄｉｘ Ｌｔｄ．， Ｎｅｃｋａｒｇｅｍｕｎｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＡＲＰ（１／５００、Ｍｙｏｍｅｄｉｘ Ｌｔｄ．， Ｎｅｃｋａｒｇｅｍｕｎｄ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＢＡＸ（１／１０００；Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）、及びｅＩＦ２Ｂ－ｄｅｌｔａ（１／２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。続いて、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、比帯域を酵素化学発光（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｂｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって視覚化し、密度測定を１Ｄ走査ソフトウェアパッケージ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＵＳＡ）を使用して定量した。次に、ブロットをローディングコントロールＧＡＰＤＨ（１／３００００；ＨｙＴｅｓｔ Ｌｔｄ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）に対して正規化した。すべてのデータは、ｓｈａｍに対する倍率変化として表されている。

【0364】

ＭＣＴとＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６プロテオームの比較によって示されるように、五つのタンパク質の発現レベルが化合物に特異的に応答することが認められた。これらのタンパク質の発現レベルを表２にまとめている。

【0365】

【表3】

【0366】

これには、ｅＩＦ２Ｂ（デルタサブユニット）の上昇とＢＡＸの低下が含まれ、それは次に、図３３～３５からわかるように、イムノブロッティングによって確認された。ｅＩＦ２Ｂ経路はタンパク質合成の既知の翻訳調節因子である。ｅｌＦ２Ｂは以前に、ＭｕＲＦ１相互作用因子として確認されており、それは、ＭｕＲＦ１がＭＣＴストレス下で翻訳開始因子ｅｌＦ２Ｂの枯渇に介在したことを示唆しているが、これは化合物によって軽減された。さらに、この化合物はアポトーシス促進性調節因子ＢＡＸも調節し、このタンパク質はｓｈａｍと比較してＭＣＴマウスで上昇し、ＭＣＴ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６群では正常化された。ヒト慢性心不全患者では、アポトーシスが骨格筋で増加し、萎縮の程度と密接に相関している（たとえば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ， １９９９， ３３， ９５９－９６５及びＶｅｓｃｏｖｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅａｒｔ， ２０００， ８４， ４３１－４３７）。実際、ＢＡＸは心臓悪液質で上昇し、ＭｕＲＦ１発現の増加に関連していることが以前に指摘されている（たとえば、Ｄａｌｌａ Ｌｉｂｅｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００４， ２８６， Ｃ１３８－１４４及びＲｅｚｋ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１２， ７， ｅ３０２７６）。

【0367】

図３６～３８からさらにわかるように、プロテオーム分析により、ＭＣＴマウスでのＭｕＲＦ１のタンパク質発現の増加が、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６によって防止されることが確認されたが、ＭＡＦＢｘ（別の重要なアトロギンＥ３リガーゼ）では効果が全く観察されなかった。これは、化合物の基礎的機序がＭｕＲＦ１に特異的であるように見えることを示しており、これは予備イン・ビトロ試験に基づいて予想されるものと考えられる。ＭｕＲＦ１は、多数の基質と相互作用することも知られており、一つは特にはＣＡＲＰ（筋肉アンキリン反復タンパク質（ＭＡＲＰ）ファミリーの構成員）であり、それは転写機能を有する核及びサルコメア（タイチン）ベースのタンパク質とされている（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００３， ３３３， ９５１－９６４を参照）。ＣＡＲＰは、ストレス関連状態で上昇することが知られており、収縮不全及び筋萎縮に関連している（たとえば、Ｌａｕｒｅ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００９， ２７６， ６６９－６８４及びＭｏｕｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ ＣｏｌｌＣａｒｄｉｏｌ， ２００９， ５４， ３２５－３３３を参照する）。このような証拠と一致して、ＭＣＴストレスマウスでのＣＡＲＰ発現の増加が観察されるが、この効果はＭｙｏＭｅｄ－９４６を与えられたマウスでは無効になり、このことは、この化合物がＭｕＲＦ１に対する阻害を介してＣＡＲＰ発現を鈍らせる可能性があり、それが次に、筋肉の量及び機能の維持に寄与し得ることを示唆している。

【0368】

３．１．２：ＣＨＦマウス：
ＣＨＦを患うＭｙｏＭｅｄ－９４６処理マウスの観察される生理的変化及び利益の基礎となる分子機序を分析するため、比較定量的プロテオーム分析、並びにｓｈａｍ、ＣＨＦ、及びＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６処理マウスからの横隔膜組織のウェスタンブロット分析を行った。

【0369】

プロテオーム分析：
質量分析に基づくプロテオーム分析を、ＤＺＨＫ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｂａｄ Ｎａｕｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙで実施した。取得したＭＳ生データを、Ａｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジン及びハツカネズミのＵｎｉｐｒｏｔデータベース（２０１７年４月２０日現在）を使用してＭａｘＱｕａｎｔ（１．６．０．１）によって処理した。１％の偽陽性率（ペプチドレベルとタンパク質レベルの両方）で、２６００を超えるタンパク質群が確認された。採用された還元的ジメチル化プロトコール（Ｂｏｅｒｓｅｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ， ２００９， ４， ４８４－４９４を参照）は、標準的な統計的検定を用いて有意差について統計的に質問されたＣＨＦ＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６、ＣＨＦ、及びｓｈａｍ状態からのタンパク質間の一対相対比較定量（比率）を生じた。いくつかのタンパク質が統計的に異なることが確認された（例：ＴＮＮＴ３、Ｔｉｍｍ９、Ｃｃｄｃ５、Ａｄｉ１、Ｐｔｇｅｓ３、及びＮｄｕｆａ３）。化合物摂取を行った及び行わなかったＣＨＦマウスの比較のために複数の仮説検定（ベンジャミニ－ホックバーグ；補正Ｐ＜０．０５）を適用した後、Ｍｒｐｓ５（ミトコンドリアリボソームタンパク質５）、ミトコンドリアリボソームでのタンパク質の開始と伸長を担当するミトコンドリア－サイトゾルシャトルタンパク質のみが、有意に上昇したタンパク質として残り（Ｐ＝０．０２；図４Ａ）、下記に記載のようにウェスタンブロット分析によってさらに調べた。

【0370】

図３９からわかるように、ＣＨＦ試験に含まれるすべての動物の横隔膜のウェスタンブロット分析により、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６摂取によって逆転したｓｈａｍの対照群と比較してＣＨＦ群においてＭｒｐｓ５発現の有意な減少が明らかになった。データは、平均±平均の標準誤差として表される。

【0371】

ウェスタンブロット分析：
ウェスタンブロット分析では、冷凍横隔膜を、プロテアーゼ阻害剤混合物（阻害剤ミックスＭ、Ｓｅｒｖａ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む緩和緩衝液（９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、１２６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、３６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、５０ｍｍｏｌ／ＬＥＧＴＡ、８ｍｍｏｌ／ＬＡＴＰ及び１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸クレアチン、ｐＨ７．４）中で均質化し、超音波処理した。上清のタンパク質濃度を測定し（ビシンコニン酸アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ， Ｂｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、小分けサンプル（５～２０μｇ）をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜に移し、次の一次抗体：ポリン及びテレトニン（両方とも１／１０００、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）、ＭＲＰＳ－５（１／５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）、ＭｕＲＦ１及びＭｕＲＦ２（両方とも１／１０００；Ｍｙｏｍｅｄｉｘ， Ｎｅｃｋａｒｇｅｍｕｎｄ， Ｇｅｒｍａｎｙから市販）、及びＴｏｍ２０（１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４℃で終夜インキュベートした。続いて、膜をセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とともにインキュベートし、比帯域を酵素化学発光（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｂｏｎｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化し、密度測定を一次元走査ソフトウェアパッケージ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）を用いて定量した。測定値は、ローディングコントロールＧＡＰＤＨ（１／３００００；ＨｙＴｅｓｔ Ｌｔｄ， Ｔｕｒｋｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）又はα－チューブリン（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して正規化した。すべてのデータを、ｓｈａｍに対する倍率変化として表す。

【0372】

図４０～４２からわかるように、ＭｕＲＦ１及びＭｕＲＦ２の発現は、ＣＨＦ群で有意に上昇しており、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６による処理によって防止された（図４０及び４１）。ＭｕＲＦ１標的タンパク質であるテレトニンの発現を定量化すると、ＣＨＦ群で発現が低下する傾向（Ｐ＝０．０８）が観察されたが、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６処理群では明らかではなかった（図４２）。

【0373】

Ｂ１６Ｆ１０マウス（腫瘍マウス）：
Ｂ１６Ｆ１０マウスの筋肉組織におけるＭｕＲＦ１、Ｎｏｘ２及びＬＣ３ Ｉ／ＩＩのタンパク質発現を、ＭＣＴ及びＣＨＦマウスについて上記の方法に従って測定した。さらに、活性酸素種マーカーであるニトロチロシンのレベルを測定した。

【0374】

図４３～４６に見られるように、ＭｕＲＦ１発現は腫瘍群で有意に上昇しており、これは化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６及びＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理によって防止された（図４３）。さらに、既知の内因性活性酸素種（ＲＯＳ）であるＮｏｘ２の発現、及びニトロチロシンの組織レベルも、腫瘍マウス群で有意に上昇するが、腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６及び腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５マウス群では、これらの種の量が筋肉組織で大幅に減少している（図４４及び４５）。他方、自己貪食に関与する重要なタンパク質であるＬＣ３ Ｉ／ＩＩの発現レベルは、腫瘍群で低下しており、それは腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－９４６群及び腫瘍＋ＭｙｏＭｅｄ－２０５群では観察されない（図４６）。

【0375】

３．２：酵素活性測定：
３．２．１：ＣＨＦマウス：
プロテオームプロファイリングデータは、ミトコンドリア恒常性が障害されていることを示唆していることから、ＣＨＦマウスの横隔膜組織における主要なミトコンドリア酵素の酵素活性を測定した。

【0376】

横隔膜組織を緩和緩衝液中で均質化し、小分けサンプルを酵素活性測定に使用した。乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２７）、ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ、ＥＣ１．３．５．１）、クエン酸シンターゼ（ＣＳ、ＥＣ２．３．３．１）、β－ヒドロキシアシル－ＣＯＡデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３５）、及びミトコンドリア複合体Ｉについての酵素活性を、過去に詳細に報告されているように分光光度法で測定した（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９７６， ２５１， ２１５５－２１６０； Ｖａｎｄｅｒｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ， １９８５， １５， １３－３１； Ｄｚｅｊａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９９， ２０１， ３３－４０； Ｔａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｈｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９７９， ５７４， ２５８－２６７； Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２０１４， ５９２， ３７６７－３７８２）。酵素活性データは、ｓｈａｍに対する倍率変化として表す。

【0377】

図４７～５１からわかるように、クエン酸シンターゼ（図４７）、コハク酸デヒドロゲナーゼ（図４８）及びミトコンドリア複合体Ｉ（図４９）などのミトコンドリア酵素の酵素活性は、ｓｈａｍと比較した場合に、ＣＨＦ動物の横隔膜において、それぞれ２１、２８、２７％だけ大幅に低下している。クレアチンキナーゼに相違は見られなかった。ミトコンドリアポリン発現（図５０）及びＴＯＭ－２０（図５１）のタンパク質発現によって評価される横隔膜組織におけるミトコンドリアの量も、ＣＨＦマウスで有意に減少した。ミトコンドリア機能に対する効果と一致して、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６による処理は、クエン酸シンターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、及びミトコンドリア複合体Ｉ酵素活性を部分的に改善し（図４７～４９）、ほぼ正常なポリン及びＴＯＭ－２０発現におけるわずかであるが統計的に有意な改善をもたらした（図５０及び５１）。

【0378】

対照的に、解糖及び脂肪酸代謝のための細胞質酵素（解糖：ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ；脂肪酸代謝：β－ヒドロキシアシル－ＣＯＡデヒドロゲナーゼ）を評価した場合、これら三つの群間に差は検出されなかった。

【0379】

３．２．２：Ｂ１６Ｆ１０マウス（腫瘍マウス）：
Ｂ１６Ｆ１０接種マウスの筋肉組織におけるクエン酸シンターゼ及びミトコンドリア複合体Ｉの酵素活性を、ＣＨＦマウスについて上記に記載の方法に従って測定した。

【0380】

図５２及び５３からわかるように、ミトコンドリア酵素クエン酸シンターゼ（図５２）及びミトコンドリア複合体Ｉ（図５３）の酵素活性は、ｓｈａｍと比較した場合、腫瘍群の筋肉組織で有意に低下している。化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６及びＭｙｏＭｅｄ－２０５による処理は、Ｂ１６Ｆ１０接種マウスの筋肉組織におけるクエン酸シンターゼ及びミトコンドリア複合体Ｉ酵素活性を部分的又は完全に回復させる（図５２及び５３）。

【0381】

４．Ｃ２Ｃ１２筋管細胞培養、逆転写ＰＣＲ
Ｃ２Ｃ１２筋管を、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６とともに又はそれなしに、最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌで２０分間インキュベートした。インキュベーション期間後、総ＲＮＡをＣ２Ｃ１２細胞から単離し、ランダムヘキサマー及びＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用して、ｃＤＮＡの小分けサンプルを定量ＲＴ－ＰＣＲに使用した。特定の遺伝子の発現を、ヒポキサンチン－ホスホリボシル－トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）－ｍＲＮＡの発現に対して正規化した。ＭｕＲＦ－１発現の定量のために、以下のプライマー（ＴＩＢ ＭｏｌＢｉｏｌ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）及び条件：ＨＰＲＴ：５′－ＣＴＣＡＴｇｇＡＣＴｇＡＴＴＡＴｇｇＡＣＡｇｇＡＣ－３′（配列番号１）及び５′－ｇＣＡｇｇＴＣＡｇＣＡＡＡｇＡＡＣＴＴＡＴＡｇＣＣ－３′（配列番号２）、６０℃アニーリング；ＭｕＲＦ－１：５′－ｇＡＴｇＴｇＣＡＡｇｇＡＡＣＡＣｇＡＡ－３′（配列番号３）、５′－ＣＣＴＴＣＡＣＣＴｇｇＴｇｇＣＴＡＴＴＣ－３′（配列番号４）、ＬＣ６４０－ｇＣＡＣＡＡｇｇＡｇＣＡＡｇＴＡｇｇＣＡＣＣＴＣＡＣ－ＰＨ（配列番号５）、５′－ｇＣＣＴｇｇＴｇＡｇＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＣＴ－ＦＬ（配列番号６）、５８℃のアニーリングを使用して蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を適用した。ＬＣ６４０は、蛍光色素であるＬＣＲｅｄ６４０を表す。ＦＬはフルオレセインを表す。ＰＨはリン酸基を表す（ポリメラーゼによる望ましくない伸長に対して遊離の３′－ヒドロキシル基をブロックする）。

【0382】

図５４からわかるように、ＭＣＴマウスにおけるＭｕＲＦ１のタンパク質発現の増加が、化合物ＭｙｏＭｅｄ－９４６によって防止された。

【0383】

５．統計解析：
データは平均±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くボンフェローニ事後解析を使用して群を比較し、二元反復測定ＡＮＯＶＡとそれに続くボンフェローニ事後解析を使用して収縮機能を評価した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。有意性はＰ＜０．０５として認めた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【配列表】

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【国際調査報告】