特表 2022-544851 ハイスループット分析及びソーティング、並びにハイスループット分析及びソーティングためのサンプリングインターフェース及びアセンブリ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-21

(54)【発明の名称】ハイスループット分析及びソーティング、並びにハイスループット分析及びソーティングためのサンプリングインターフェース及びアセンブリ

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20221014BHJP

   G01N 1/00 20060101ALI20221014BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221014BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20221014BHJP

【ＦＩ】

G01N15/14 A

G01N1/00 101G

C12Q1/02

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022512350

(86)(22)【出願日】2020-08-14

(85)【翻訳文提出日】2022-03-08

(86)【国際出願番号】 US2020070413

(87)【国際公開番号】W WO2021035244

(87)【国際公開日】2021-02-25

(31)【優先権主張番号】62/890,142

(32)【優先日】2019-08-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522067558

【氏名又は名称】マイケル・イアノッティ

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・イアノッティ

【テーマコード（参考）】

2G052

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G052AA33

2G052AB16

2G052AB27

2G052AD09

2G052AD29

2G052AD49

2G052BA14

2G052CA04

2G052CA18

2G052CA28

2G052GA09

2G052GA29

2G052HA02

2G052HA12

2G052HC07

2G052HC32

2G052HC42

2G052JA06

2G052JA08

4B029AA07

4B029AA09

4B029BB11

4B029CC01

4B029EA16

4B029EA18

4B029HA05

4B029HA09

4B063QA01

4B063QA05

4B063QA11

4B063QQ08

4B063QS10

4B063QS39

(57)【要約】

細胞ベース療法などのための、選択された細胞又は他の生物学的成分を分析及び／又はソーティングする方法は、プローブの開放端でサンプルをサンプリングして、サンプルを含む流体ストリームを得ることを含む。開放端を有するプローブはまた、流体を前記開放端に輸送する流体供給部と、前記流体ストリームを前記開放端から離れる方向に輸送する流体排出部を有する。次いで、前記方法は、前記流体ストリームをフローサイトメーターに輸送することと、フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析することと；及び／又はそれを少なくとも２つの成分に分離することとを含む。フローサイトメーターに接続されたプローブを有する装置は、この方法をサポートすることができる。前記方法は、特に細胞ベース療法用の細胞を選択するための、複数サンプルの効率的なサンプリングを提供することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分析及び／又はソーティング方法であって、
プローブ内の第１の流体を前記プローブの開放端に輸送することと；
少なくとも１つの第１の成分と少なくとも１つの第２の成分とを含む少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと；
前記少なくとも１つのサンプルと前記第１の流体とを含む流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することと；
前記流体ストリームをフローサイトメーターに輸送することと；
フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析する、及び／又は前記流体ストリームを、少なくとも、前記少なくとも１つの第１の成分を含む第１の分離ストリームと前記少なくとも１つの第２の成分を含む第２の分離ストリームとに、フローサイトメトリーによって分離することとを含むことを特徴とする、分析及び／又はソーティング方法。

【請求項2】

前記流体ストリームが前記フローサイトメーターに輸送されるとき、前記流体ストリームが実質的に気泡を含まない、及び前記流体ストリームが前記フローサイトメーターに輸送されるとき、前記流体ストリームが実質的に気液界面を含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記少なくとも１つのサンプルが、第１の容器に最初に含まれる第１のサンプルと、第２の容器に最初に含まれる第２のサンプルとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の容器がプレート内の第１のウェルであり、前記第２の容器が同一プレート内の第２のウェルである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の容器が第１のプレート内のウェルであり、前記第２の容器が第２のプレート内のウェルである、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つのサンプルが複数のサンプルを含み、サンプルが毎分３０サンプルを超える速度で回収される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の流体が、水若しくはシース液又はフローサイトメトリーに適した他の液体培地である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の流体が、緩衝生理食塩水溶液又は細胞培養培地である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の流体が、リン酸緩衝液を含む緩衝生理食塩水溶液である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つのサンプルが、細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記サンプルの少なくとも一部が、蛍光標識、磁気標識、同位体標識、化学標識、又はそれらの任意の組合せで標識されている、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの第１の成分が標識された成分を含み、前記少なくとも１つの第２の成分が標識されていない成分を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つのサンプルが、白血球、幹細胞、又は循環腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つのサンプルが、Ｔ細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記Ｔ細胞の少なくともいくつかが、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記少なくとも１つのサンプルが、腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記少なくとも１つの第１の成分が、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を含み、前記少なくとも１つの第２の成分が、実質的にＴ細胞受容体及びキメラ抗原受容体を含まないＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の流体を前記プローブの前記開放端に輸送することが、前記第１の流体を第１のポンプでポンピングすることを含み、
前記流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することが、前記流体ストリームを第２のポンプで除去することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記プローブの前記開放端への前記第１の流体の第１の流量を制御することと、同時に、
前記プローブの前記開放端からの前記流体ストリームの第２の流量を制御することとを更に含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記流体ストリームを前記フローサイトメーターに輸送する前、輸送中、又は輸送した後に、前記流体ストリームに第２の流体を添加することを更に含み、
前記第２の流体が、前記第１の流体と同一である又は異なっている、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

分析及び／又はソーティングシステムであって、
プローブと、
フローサイトメーターと、
前記プローブから前記フローサイトメーターに流体を輸送するように構成された、前記プローブと前記フローサイトメーターとの間の接続部とを含み、
前記プローブが、開放端と、前記流体を前記開放端に輸送するように構成された流体供給部と、前記流体ストリームを前記開放端から離れる方向に輸送するように構成された流体排出部とを含むことを特徴とする、分析及び／又はソーティングシステム。

【請求項22】

前記流体供給部と前記流体排出部とが同軸である、請求項２１に記載のシステム。

【請求項23】

前記プローブの、その開放端での幅が、３．３ｍｍ未満である、請求項２１に記載のシステム。

【請求項24】

前記プローブの、その開放端での幅が、１．３ｍｍ未満である、請求項２１に記載のシステム。

【請求項25】

請求項２１に記載のシステムで少なくとも１つのサンプルを分析又はソーティングする方法であって、
前記流体供給部で、前記プローブの前記開放端に流体を輸送することと；
少なくとも１つの第１の成分と少なくとも１つの第２の成分とを含む前記少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと；
前記流体排出部で、前記少なくとも１つのサンプルと前記流体とを含む流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することと；
前記流体ストリームを、前記接続部を通って前記フローサイトメーターに輸送することと、
フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析する、及び／又は前記流体ストリームを、少なくとも、前記少なくとも１つの第１の成分を含む第１の分離ストリームと前記少なくとも１つの第２の成分を含む第２の分離ストリームとに、サイトメトリーソーティングによって分離することとを含むことを特徴とする、方法。

【請求項26】

サンプリング方法であって、
プローブの流体供給部を通じて前記プローブの開放端に流体を輸送することと、
少なくとも１つの第１の成分と少なくとも１つの第２の成分とを含む少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと、
前記プローブの流体排出部を通じて前記プローブの前記開放端から流体ストリームを除去することとを含み、前記流体ストリームが、前記少なくとも１つのサンプルと前記流体とを含み、
（１）前記流体が、生理食塩水溶液又は細胞培養培地である、又は
（２）前記流体が水であり、前記方法が、生理食塩水溶液を前記流体ストリームに添加することを更に含むことを特徴とする、方法。

【請求項27】

前記流体がフローサイトメトリーに適した緩衝生理食塩水シース液である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記流体ストリームが実質的に気泡を含まず、前記流体ストリームが実質的に気液界面を含まない、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記少なくとも１つのサンプルが複数のサンプルを含み、サンプルが毎分３０サンプルを超える速度で回収される、請求項２６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

成分の分析、分離、及び／又は選択の方法は、プローブの開放端でサンプルをサンプリングして、前記サンプルを含む流体ストリームを得ることを含む。前記開放端を備える前記プローブは、流体を前記開放端に輸送する流体供給部と、前記流体ストリームを前記開放端から離れる方向に輸送する流体排出部を有する。次いで、前記方法は、前記流体ストリームをフローサイトメーターに輸送し、フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析する、及び／又はそれを少なくとも２つの成分に分離することを含む。前記サンプルは、例えば、１以上のウェルプレートのウェル、フラスコ、又は区画化された容器などの他の容器に提供される複数のサンプルであることができる。前記サンプルは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、Ｔ細胞受容体療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、及び幹細胞／誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）療法を含む細胞ベース療法などの研究及び療法における使用のための細胞又は他の生物材料のサンプルであることができる。前記サンプルは、ソーティングを促進し得るビーズなどの研究試薬のサンプルであることもできる。前記サンプルは、生物材料と研究試薬との組合せであることもできる。

【背景技術】

【0002】

特許文献１は、フローサイトメトリーにおける迅速処理のために複数サンプルを供給するための装置について教示することを目的としている。前記装置は、サンプルをサンプルループに注入するシリンジを必要とし、次いで、前記サンプルループからフローサイトメーターに前記サンプルを提供する往復バルブを必要とする。約３０サンプル／分のスループット目標を試みるために、前記装置は、約１秒間の吸引、０．８秒間の時間遅延、及び０．２秒間のバルブ切替えを行うことを目的としている。特許文献１は、気泡がフローセルの分析領域などの厄介な領域に留まるという潜在的な問題を回避することを目的とし、気泡がコネクタの接合部で分解及び分散し、サンプル吸引の正確性を損なわせ得ることに更に留意している。特許文献１を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0003】

特許文献２は、ハイスループットフローサイトメトリー用装置を教示することを目的としている。前記装置は、隣接するサンプルの混合を防ぐために、気泡などの分離ガスを使用することによって隣接するサンプルの分離を提供する。プローブとして、前記装置は、好ましくはステンレススチールの針を使用する。特許文献２を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0004】

質量分析及び高速液体クロマトグラフィーの分野において、特許文献３は、開放端を有するサンプリングプローブを開示している。前記サンプリングプローブでは、液体供給導管が第１の流量でプローブの開放端に液体を送達し、液体排出部が第１の流量よりも低い第２の流量で液体を除去する。サンプル材料は、プローブの開放端中に受容される。前記プローブは、質量分析及び高速液体クロマトグラフィーに有用である。特許文献３は、フローサイトメトリーでの応用について言及しておらず、前記プローブから供給される前記液体中の空気又はその他のガスの回避についても言及しておらず、細胞、ウイルス、タンパク質、若しくはその他の生物材料又はビーズなどの研究試薬のソーティング又は選択についても言及していない。特許文献３は、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0005】

また、質量分析及び高速液体クロマトグラフィーの分野において、特許文献４は、開放端を有するサンプリングプローブを開示している。前記サンプリングプローブでは、液体供給導管が第１の流量でプローブの開放端に液体を送達し、排出導管が第１の流量よりも高い第２の流量で液体を除去する。前記サンプルを含むガス流は、前記プローブの前記開放端に受容される。前記プローブは、質量分析や高速液体クロマトグラフィーに有用である。特許文献４は、フローサイトメトリーでの応用について言及しておらず、細胞、ウイルス、タンパク質、その他の生物材料又はビーズなどの研究試薬のソーティング又は選択についても言及しておらず、その方法は、空気又は別のガスをプローブに導入することを必要とし、それによって排気導管内に気液界面を形成する。特許文献４を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0006】

更に、質量分析の分野において、特許文献５は、イオン源に流動接続されたサンプリングインターフェースを開示している。このインターフェースは、プローブの遠位端に流体を提供するための外側毛細管と、プローブの遠位端から流体を除去するための内側毛細管とを有するサンプリングプローブを含む。前記外側毛細管を通る流量は、前記内側毛細管を通る流量に対して一時的に増加させることができ、前記プローブの前記遠位端の前記流体がオーバーフローして、引き抜いた基板に堆積した残留サンプルを洗浄する、及び／又は空気中の物質が前記内部毛細管に伝わることを防ぐ。特許文献５は、フローサイトメトリーでの応用について言及しておらず、前記プローブから供給される前記流体中の空気又はその他のガスの回避についても言及しておらず、細胞、ウイルス、若しくはタンパク質、又はビーズなどの研究試薬のソーティング又は選択についても言及していない。特許文献５を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0007】

前記技術は、気泡を導入することなく、又はシリンジ、ループ、及びバルブの複雑なシステムを使用することなく、フローサイトメトリー又はフローサイトメトリーソーティングの高サンプルスループットを提供する能力を有していない。

【0008】

非特許文献１は、マイクロ流体セルソーティングデバイスの状態について記述し、他のタイプのフローサイトメトリーセルソーティングの詳細と代替を提供している。同文献は、蛍光ラベルベース、ビーズベース、及びラベルフリーソーティングを含むアクティブ及びパッシブソーティング用の分類及び最新の方法について記載している。また、同文献は、方法論ごとに細胞がソーティングされる原理についても記載している。非特許文献１を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0009】

非特許文献２は、癌治療用の様々な細胞ベース治療技術における大きな可能性について論じている。同文献は、ハイスループット調査について簡単に記載しているが、ハイスループットサンプリング又は１以上のサンプルの各種成分のソーティング若しくは選択について論じていない。非特許文献２を、参照によりその全体を本明細書に援用する。細胞ベース療法に関する文献として、非特許文献３を、参照によりその全体を本明細書に援用し、非特許文献４を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【0010】

非特許文献５は、蛍光ソーティング及び磁気ソーティングの速度を比較して、細胞ベース療法のためのハイスループットセルソーティングの重要性に注目している。しかし、同文献は、多数の異なる及び／又は別々のサンプルの処理について特に言及しておらず、ソーティングされる複数のサンプルの吸入における空気又は他のガスの気泡に関する問題についても言及していない。非特許文献５を、参照によりその全体を本明細書に援用する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第６，３１５，９５２号明細書

【特許文献2】米国特許第６，８７８，５５６号明細書

【特許文献3】米国特許第９，６３２，０６６号明細書

【特許文献4】米国特許第１０，０６０，８３８号明細書

【特許文献5】米国特許第１０，１０３，０１５号明細書

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｓｈｉｅｌｄｓ ＩＶ， Ｃ．Ｗ． ｅｔ ａｌ， “Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ｔｏ Ｒａｒｅ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ” Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１５ １５（５）：１２３０－１２４９

【非特許文献2】Ｐｉｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０１８ ９（３）：２５４－２５６

【非特許文献3】Ｒｏｈａａｎ， Ｍ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， “Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ： ａ ｖｉａｂｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎ” Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ ２０１９ ４７４（４）： ４４９－４６１

【非特許文献4】Ｒｏｈａａｎ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， “Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ： ａ ｖｉａｂｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎ” Ｊ． ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８ ６：１０２

【非特許文献5】Ｓｕｔｅｒｍａｓｔｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ， ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｅｒｓｕｓ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ” Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９ ９：２２７， １－９

【発明の概要】

【0013】

分析及び／又はソーティング方法は、流体をプローブの開放端に輸送することと；少なくとも２つの成分を含むサンプルをプローブの前記開放端に回収することと；前記プローブの前記開放端から前記サンプルと前記流体とを含む流体ストリームを除去することと；前記流体ストリームをフローサイトメーターに輸送し、フローサイトメトリーによって前記流体ストリーム中の前記サンプルを分析すること、及び／又は前記流体ストリームを少なくとも２つの成分に分離することとを含む。「フローサイトメトリー」は、懸濁物の流動性を用いる、流体懸濁物中の細胞、粒子、又は分子の集団の１以上の性質の検出、並びに前記１以上の性質に基づく測定及び／又はソーティングを伴う任意のプロセスを意味し得る。前記１以上の性質は、細胞、粒子、又は分子の集団に与えられる１以上の標識、例えば、蛍光、磁気、同位体、又は化学標識に関連し得る。追加的又は代替的に、前記１以上の性質は、例えば、前記性質が細胞、粒子、又は分子のサイズ、形状、密度、結合能力、導電率、又は音響特性である場合には、標識と無関係であり得る。前記方法は、シリンジ、ループ、及びバルブの複雑なシステムを必要としない単純なプローブを使用して、フローサイトメーターに提供されるサンプル、特にフローサイトメーターにハイスループットで提供される複数のサンプル中の空気又は気泡の存在を低減又は回避することができる。「フローサイトメーター」は、懸濁物の流動性を用いる、流体懸濁物中の細胞、粒子、又は分子の集団の１以上の性質、並びに前記１以上の性質に基づく測定及び／又はソーティングに適した任意のデバイスを意味し得る。フローサイトメーターは、蛍光、磁気、同位体、又は化学標識などの標識に関連する１以上の性質を検出することができる。追加的又は代替的に、フローサイトメーターは、例えば、前記性質が細胞、粒子、又は分子のサイズ、形状、密度、結合能力、導電率、又は音響特性である場合には、標識と無関係な１以上の性質を検出することができる。フローサイトメーターを利用する技術の例としては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、及びマイクロ流体免疫磁気セルソーティング（ＭＩＣＳ）が挙げられる。

【0014】

分析及び／又はソーティングシステムは、プローブと、フローサイトメーターと、前記プローブから前記フローサイトメーターに流体を輸送するように構成された接続部とを含む。前記プローブは、開放端と、前記流体を前記開放端に輸送するように構成された流体供給部と、前記流体ストリームを前記開放端から離れる方向に輸送するように構成された流体排出部とを含む。前記システムは、シリンジ、ループ、及びバルブの複雑なシステムを必要としない単純なプローブを使用して、フローサイトメーターに提供されるサンプル、特にフローサイトメーターにハイスループットで提供される複数のサンプル中の気泡の存在を低減又は回避することができる。

【0015】

サンプリング方法は、プローブの流体供給部を通って前記プローブの開放端に流体を輸送することと、サンプルをプローブの前記開放端に回収することと、前記プローブの前記開放端から前記プローブの流体排出部を通じて流体ストリームを除去することを含み、前記流体ストリームは、前記少なくとも１つのサンプル及び前記流体を含む。前記サンプリング方法において、（１）前記流体は、生理食塩水溶液又は細胞培養培地である、又は（２）前記流体は、水であり、前記方法は、生理食塩水溶液を前記流体ストリームに添加することを更に含む。前記方法は、シリンジ、ループ、及びバルブの複雑なシステムを必要としない単純なプローブを使用して、フローサイトメーターに提供されるサンプル、特にフローサイトメーターにハイスループットで提供される複数のサンプル中の気泡の存在を低減又は回避することができる。前記方法はまた、手動又は自動の洗浄工程を追加することなく、サンプリング間に前記プローブを洗浄するため前記プローブを通る流体の一貫したフローを提供することができる。

【0016】

第１の実施形態は、プローブ内の第１の流体をプローブの開放端に輸送することと；少なくとも１つの第１の成分と少なくとも１つの第２の成分とを含む少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと；前記少なくとも１つのサンプルと前記第１の流体とを含む流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することと；前記流体ストリームをフローサイトメーターに輸送し、フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析する、及び／又は前記流体ストリームを、少なくとも、前記少なくとも１つの第１の成分を含む第１の分離ストリームと前記少なくとも１つの第２の成分を含む第２の分離ストリームとに、フローサイトメトリーによって分離することとを含む分析及び／又はソーティング方法を含む。

【0017】

第２の実施形態は、前記流体ストリームが実質的に気泡を含まない、又は前記流体ストリームが実質的に気液界面を含まない、又は前記流体ストリームが実質的に気泡及び気液界面の両方を含まない、第１の実施形態の方法を含む。

【0018】

第３の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが、第１の容器に最初に含まれる第１のサンプルと、第２の容器に最初に含まれる第２のサンプルとを含む、第１及び／又は第２の実施形態の方法を含む。

【0019】

第４の実施形態は、前記第１の容器がプレート内の第１のウェルであり、前記第２の容器が同一プレート内の第２のウェルである、第３の実施形態の方法を含む。

【0020】

第５の実施形態は、前記第１の容器が第１のプレート内のウェルであり、前記第２の容器が第２のプレート内のウェルである、第３の実施形態の方法を含む。更なる実施形態では、前記少なくとも１つのサンプルは、複数の容器に含まれる複数のサンプルを含み、前記複数の容器は、１つのウェルプレート又は複数のウェルプレート内のウェルである。前記容器は、区画化された容器内の区画又は容器のアレイ若しくは集合体であることもできる。

【0021】

第６の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが複数のサンプルを含み、サンプルが毎分３０サンプルを超える速度で回収され、任意に、前記複数のサンプルを回収することが、前記プローブを複数の容器に少なくとも部分的に挿入すること、又は前記複数のサンプルを前記プローブに移すことを含む、任意の先行する実施形態の方法を含む。

【0022】

第７の実施形態は、前記第１の流体が、水若しくはシース液又はフローサイトメトリー又はフローサイトメトリーソーティングに適した他の液体培地である、任意の先行する実施形態の方法を含む。

【0023】

第８の実施形態は、前記第１の流体が、緩衝生理食塩水溶液又は細胞培養培地である、任意の先行する実施形態の方法を含む。

【0024】

第９の実施形態は、前記第１の流体が、リン酸緩衝液を含む緩衝生理食塩水溶液である、第８の実施形態の方法を含む。

【0025】

第１０の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが、細胞を含む、任意の先行する実施形態の方法を含む。

【0026】

第１１の実施形態は、前記サンプルの少なくとも一部が、例えば、蛍光、磁気、同位体、又は化学標識で標識されている、任意の先行する実施形態の方法を含む。他の実施形態では、前記サンプルは標識化されず、分析及び／又はソーティングは、少なくとも１つの他の検出された性質に基づいて行われる。

【0027】

第１２の実施形態は、前記少なくとも１つの第１の成分が標識された成分を含み、前記少なくとも１つの第２の成分が標識されていない成分を含む、第１１の実施形態の方法を含む。

【0028】

第１３の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが、白血球、幹細胞、又は循環腫瘍細胞を含む、先行する実施形態のいずれかの方法を含む。

【0029】

第１４の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが、Ｔ細胞を含む、先行する実施形態のいずれかの方法を含む。

【0030】

第１５の実施形態は、前記Ｔ細胞の少なくともいくつかが、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含む、第１４の実施形態の方法を含む。

【0031】

第１６の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが、腫瘍浸潤リンパ球を含む、先行する実施形態のいずれかの方法を含む。

【0032】

第１７の実施形態は、前記少なくとも１つの第１の成分が、Ｔ細胞受容体又はキメラ抗原受容体を含むＴ細胞を含み、前記少なくとも１つの第２の成分が、実質的にＴ細胞受容体及びキメラ抗原受容体を含まないＴ細胞を含む、第１から第１５の実施形態のいずれかの方法を含む。

【0033】

第１８の実施形態は、前記第１の流体を前記プローブの前記開放端に輸送することが、前記第１の流体を第１のポンプでポンピングすることを含み、前記流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することが、前記流体ストリームを第２のポンプで除去することを含む、先行する実施形態のいずれかの方法を含む。

【0034】

第１９の実施形態は、前記プローブの前記開放端への前記第１の流体の第１の流量を制御し、同時に、前記プローブの前記開放端からの前記流体ストリームの第２の流量を制御することを更に含む、第１８の実施形態の方法を含む。

【0035】

第２０の実施形態は、前記流体ストリームを前記フローサイトメーターに輸送する前、輸送中、又は輸送した後に、前記流体ストリームに第２の流体を添加することを更に含み、前記第２の流体が、前記第１の流体と同一である又は異なっている、任意の先行する実施形態の方法を含む。

【0036】

第２１の実施形態は、プローブと、フローサイトメーターと、前記プローブから前記フローサイトメーターに流体を輸送するように構成された前記プローブと前記フローサイトメーターの間の接続部とを含み、前記プローブが、開放端と、前記流体を前記開放端に輸送するように構成された流体供給部と、前記流体ストリームを前記開放端から離れる方向に前記フローサイトメーターに輸送するように構成された流体排出部とを含む分析及び／又はソーティングシステムを含む。

【0037】

第２２の実施形態は、前記流体供給部と前記流体排出部とが同軸である、第２１の実施形態のシステムを含む。

【0038】

第２３の実施形態は、前記プローブの、その開放端での幅が、３．３ｍｍ未満である、第２１及び／又は第２２の実施形態のシステムを含む。

【0039】

第２４の実施形態は、前記プローブの、その開放端での幅が、１．３ｍｍ未満である、第２１及び／又は第２２の実施形態のシステムを含む。

【0040】

第２５の実施形態は、第２１から第２４の実施形態のいずれかのシステムで少なくとも１つのサンプルをソーティングする方法を含み、前記方法は、前記流体供給部で、前記プローブの前記開放端に流体を輸送することと；少なくとも１つの第１の成分と少なくとも１つの第２の成分とを含む前記少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと；前記流体排出部で、前記少なくとも１つのサンプルと前記流体とを含む流体ストリームを前記プローブの前記開放端から除去することと；前記流体ストリームを前記接続部を通して前記フローサイトメーターに輸送し、フローサイトメトリーによって前記流体ストリームを分析する、及び／又は前記流体ストリームを、少なくとも、前記少なくとも１つの第１の成分を含む第１の分離ストリームと前記少なくとも１つの第２の成分を含む第２の分離ストリームとに、セルソーティングによって分離することとを含む。

【0041】

第２６の実施形態は、プローブの流体供給部を通じて前記プローブの開放端に流体を輸送することと、少なくとも１つのサンプルをプローブの前記開放端に回収することと、前記プローブの流体排出部を通じて前記プローブの前記開放端から流体ストリームを除去することとを含み、前記流体ストリームが、前記少なくとも１つのサンプルと前記流体とを含むサンプリング方法を含む。第２６の実施形態においては、前記流体自体が、生理食塩水溶液又は細胞培養培地であることができる、又は前記流体は水であることができ、生理食塩水溶液が前記流体ストリームに更に添加される。

【0042】

第２７の実施形態は、前記流体がフローサイトメトリーに適した緩衝生理食塩水シース液である、第２６の実施形態の方法を含む。

【0043】

第２８の実施形態は、前記流体ストリームが実質的に気泡を含まず、前記流体ストリームが実質的に気液界面を含まない、第２６及び／又は第２７の実施形態の方法を含む。

【0044】

第２９の実施形態は、前記少なくとも１つのサンプルが複数のサンプルを含み、サンプルが毎分３０サンプルを超える速度で回収され、任意に、前記複数のサンプルを回収することが、前記プローブを複数の容器に少なくとも部分的に挿入すること、又は前記複数のサンプルを前記プローブに移すことを含む、第２６から第２８の実施形態の方法を含む。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】図１は、プローブがサンプルを回収していない状態の、フローサイトメトリーのためのシステムの実施形態を示す。

【図2】図２は、プローブがサンプルを回収している状態の、フローサイトメトリーのためのシステムの実施形態を示す。

【図3】図３は、開放端を有するプローブの実施形態の断面図である。

【図4】図４は、開放端を有するプローブの実施形態の斜視図である。

【図5】図５は、開放端を有し、作動状態にあるプローブの実施形態の断面図である。

【図6】図６は、プローブがサンプルを回収していない状態の、プローブ及びウェルプレートの実施形態を示す。

【図7】図７は、プローブがサンプルを回収している状態の、プローブ及びウェルプレートの実施形態を示す。

【0046】

発明の詳細な説明
図１及び図２は、ウェルプレート５０の存在下でこれらの図に示される分析及び／又はソーティングシステム１０の実施形態を示す。この実施形態では、分析及び／又はソーティングシステム１０は、プローブ１１と、プローブ１１に流体を提供するように構成されたプローブ入力ライン３１と、プローブ１１から流体を除去する及び／又はフローサイトメーター２０に流体を提供するように構成されたプローブ－フローサイトメーターライン３２とを含む。また、この実施形態では、プローブ入力ポンプ４１が、プローブ入力ライン３１を通じてプローブ１１に流体を移動させるように構成され、プローブ－フローサイトメーターポンプ４２が、プローブ－フローサイトメーターライン３２を通じてプローブ１１から離れる方向及び／又はフローサイトメーター２０に流体を移動させるように構成される。この実施形態のオートサンプラー４３は、ウェルプレート５０のウェル５１ａ、５１ｂ、及び５１ｃの間でプローブ１１を移動させるように構成され得る。図１及び図２では、プローブ１１の実施形態は、その開放端が動作中に下向きになるような向きで図示されている。しかし、他の実施形態、例えば、他の方向でも表面張力又は接着などの力によって前記サンプルを保持するほど、ウェル又は他の１以上のサンプル容器が十分に狭い実施形態では、前記プローブの前記開放端を上向き方向、横方向、又は垂直方向に対して斜めの角度に向けることができる。いくつかのかかる実施形態では、前記プローブが上向き方向で、前記１以上のサンプル容器が逆向きである、即ち、１以上のサンプル容器の開放端が下向きであることが特に好ましい場合がある。

【0047】

いくつかの実施形態では、分析及び／又はソーティングシステム１０は、好ましくは、サンプルホルダー、チューブ、カートリッジ、又はマイクロチップ、及び／又はウェルプレートなどのサンプル容器、又は区画化された容器内の区画又は容器のアレイ若しくは集合体に、プローブ１１が向くことができるようにプローブ１１を配向する。図１は、ウェルプレート５０のウェル５１ｃからサンプルを回収するように配向されたプローブ１１を示す。図２は、ウェルプレート５０のウェル５１ｃからサンプルを回収しているプローブ１１を示す。図１及び図２に示される実施形態では、オートサンプラー４３は、ウェルプレート５０内のウェル５１ａ及びウェル５１ｂ内のサンプルの回収のためにプローブ１１を再配置するように構成される。他の実施形態では、オートサンプラー４３は、プローブ１１によるウェル５１ａ及びウェル５１ｂ内のサンプルの回収のためにウェルプレート５０を再配置するように構成することができ、プローブ１１は、静止位置に維持することができる。

【0048】

図３、図４、及び図５は、プローブ１１の実施形態を示す。この実施形態では、プローブ１１は、外壁１０３と、これらの図中、上向きに向けられた外壁１０３の端部にある開放端１０２と、開放端１０２に流体を提供するように構成された流体供給部１０４と、開放端１０２から流体を除去するように構成された流体排出部１０５とを含む。

【0049】

図３、図４、及び図５に示されるプローブ１１の実施形態では、流体供給部１０４は、外壁１０３内のすぐ内側の環状領域であり、流体排出部１０５は、プローブ１１の中央に配された同軸導管である。いくつかの実施形態では、流体排出部１０５の開口部は、開放端１０２まで延びる外壁１０３の全長に亘って軸方向に延びていないことがあり、流動がより生じ易くなるように開放端１０２に、ある程度の空間を残している。他の実施形態では、流体排出部１０５の開口部は、開放端１０２まで延びる外壁１０３の全長に亘って軸方向に延びることができる、又は外壁１０３の全長を超えて、開放端１０２の外に軸方向に延びることができる。

【0050】

他の実施形態では、流体供給部１０４及び流体排出部１０５は、異なる構成を有することができる。例えば、他のいくつかの実施形態では、流体排出部１０５は、外壁１０３のすぐ内側の環状領域であり、流体供給部１０４は、プローブ１１の中央に配された同軸導管である。他の実施形態では、流体供給部１０４は、複数の流体供給導管として設けることができ、及び／又は流体排出部１０５は、複数の流体排出導管として設けることができる。流体供給部１０４及び／又は流体排出部１０５の導管は、図３、図４、及び図５に示されるように平行方向に設けることができ、他の実施形態では、互いに対して斜めの角度で設けることができる。

【0051】

図４及び図５に示されるようなプローブ１１の前記実施形態では、プローブ１１は、流路１０６に沿った流体の流れを提供するように構成される。かかる実施形態では、流体供給部１０４は、流入流路１０６ａに沿ってプローブ１１の開放端１０２に流体を提供することができ、次いで、流体は、開放端流路１０６ｂに沿って開放端１０２を通って流れることができ、次いで、流体は、液体排出部１０５を通じて流出流路１０６ｃに流入することができる。この実施形態又は他の実施形態では、開放端流路１０６ｂは、開放端１０２内に延び、次いで、流体ドーム１０７を形成する、図４及び図５に示されるよりも直接的ではない流路を含むことができる。流体供給部１０４を通る内向きの流体の流れを測定又は制御するために、流体供給部１０４は、流量計及び／又は流量レギュレーターを含むことができる。同様に、しかし独立して、流体排出部１０５を通る外向きの流体の流れを測定又は制御するために、流体排出部１０５は、流量計及び／又は流量レギュレーターを含むことができる。

【0052】

プローブ１１を構成する１以上の材料は、特に限定されない。外壁１０３、流体供給部１０４、及び／又は流体排出部１０５のいずれかは、少なくとも１つの金属、金属合金、プラスチック、ガラス、セラミック、又はそれらの任意の組合せを含むことができ、好ましくはステンレススチール及び／又は医療グレードプラスチックを含む。外壁１０３、流体供給部１０４、及び／又は流体排出部１０５の任意の部分又は全体をコーティングしてもしなくてもよく、好ましくは、疎水性又は親水性コーティングでコーティングされる。いくつかの実施形態では、外壁１０３、流体供給部１０４、及び／又は流体排出部１０５の少なくとも一部は、親水性材料を含むことができる、又は親水性コーティングを備えることができ、それによって、流路１０６に沿って流れる流体及び／又は流体ドーム１０７内の流体との接着効果を提供する。同一又は他の実施形態では、外壁１０３、流体供給部１０４、及び／又は流体排出部１０５の少なくとも一部は、疎水性材料を含むことができる、又は疎水性コーティングを備えることができ、それによって、流体ドーム１０７のための所望のドーム形状をより良く形成するために、流体との接着効果を避けることができる。

【0053】

いくつかの実施形態では、プローブ１１は、過剰な、即ち、オーバーフローしている流体を、開放端１０２から回収するように構成された流体回収導管を更に含むことができる。かかる流体回収導管は、外壁１０３の内部に配することができる、又は外壁１０３上に設けることができる。流体回収導管は、１以上の開口部を含むことができ、好ましくは開口端１０２の近傍に位置する。前記流体回収導管の１以上の開口部は、１以上の環状開口部又は環状配列の複数の開口部であることができる。

【0054】

図６及び図７に示されるいくつかの実施形態では、プローブ１１は、１以上のサンプル容器、好ましくは１以上のウェルプレート５０内の１以上のウェル５１内に少なくとも一部挿入されるように構成することができる。これらの実施形態では、プローブ１１の外幅ｗは、好ましくは、ウェル５１の内側幅ｗ’よりも小さく、それによって、ウェル５１へのプローブ１１の挿入を可能にする。プローブ１１の外幅ｗは、開放端１０２におけるプローブ１１の幅であることができ、又はより好ましくは、ウェル５１の深さより小さい又は略等しい開放端１０２からの軸方向距離におけるプローブ１１の幅であることができる。いくつかの実施形態では、プローブ１１の外幅ｗは、７．０ｍｍ未満、５．０ｍｍ未満、３．３ｍｍ未満、１．７ｍｍ未満、又は１．３ｍｍ未満であることができる。いくつかの実施形態では、プローブ１１の外幅ｗは、プローブ１１の開放端１０２における、又はプローブ１１の開放端１０２から５．０～２５．０ｍｍの軸方向距離における、又はプローブ１１の開放端１０２から６．５～１１．５ｍｍの軸方向距離におけるプローブの幅であることができる。

【0055】

他の実施形態では、プローブ１１は、必ずしもサンプル容器に挿入されるように構成されていなくてもよい。例えば、プローブ１１及び／又は分析及び／又はソーティングシステム１０のいくつかの実施形態は、例えば、自動化されたピペッティングシステムによって、又は個々のウェル内のサンプルに音響エネルギーを向けてサンプルの液滴を吐出させることによって、ウェルプレート内の個々のウェルからプローブ１１の開放端１０２にサンプルを伝達するための装置と共に好適に使用することができる。これらの実施形態では、前記プローブの前記開放端は、上方向、下方向、横方向、又は垂直方向に対して斜めの角度を向くことができる。いくつかのかかる実施形態では、前記プローブの上向き方向で、１以上のサンプル容器が逆向きであることが特に好ましい場合がある。更に他の実施形態では、プローブ１１は、例えば、液滴又は他の少量の１以上のサンプルをプローブ１１の開放端１０２に直接提供する際に、ウェルプレート内のウェルから直接サンプリングすることなく、サンプル又はより好ましくは複数のサンプルを受容するように構成することができる。

【0056】

いくつかの実施形態では、分析及び／又はソーティングシステム１０は、プローブ１１を１つだけ有し、それより多くは有さない。他の実施形態では、分析及び／又はソーティングシステム１０は、複数のプローブを含むことができる。複数のプローブ１１が並行して利用される場合、例えば、オートサンプラー４３が４つのプローブを同時に保持する及び／又は移動させて４つの異なるウェルからサンプル及び／又は流体を並行して回収するように構成される場合など、サンプリング速度はそれに応じて倍増し得る。別の実施形態では、オートサンプラー４３を、２、４、６、８、１６、２０、２４、３０、４８、９６、又はそれ以上のプローブ１１を並列に保持する及び／又は移動させるように構成することができる。

【0057】

特定の実施形態では、図１及び図２に示すように、フローサイトメーター２０は、フローセル２１と、レーザ２２と、少なくとも２つの容器６１ａ及び６１ｂとを含むことができ、これらは、例えば、複数のウェルプレート内のウェル又は同一ウェルプレート内のウェルであることができる。フローサイトメーター２０は、プローブ１１からの流体ストリームの成分をソーティングするように構成されている点を除いて、特に限定されない。特に、フローサイトメーター２０は、サンプルを少なくとも２つの容器６１ａ及び６１ｂにソーティングするように構成される。フローサイトメーター２０に提供される流体ストリームは、フローセル２１に入ることができ、フローセル２１は、流体ストリーム中のサンプルの多くの若しくは大部分の細胞又は他の粒子が別々の液滴で個別に現れるように流体ストリームを調節することができる。特定の実施形態では、このように調節された流体ストリームは、次いで、測定システムを通る。測定システムは、インピーダンス、導電性、サイズ排除、ろ過、音響、熱力学、電磁、質量分析、又は光学システムであることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、測定システムは、流体ストリーム中のサンプル中の蛍光マーカーを励起することができる、レーザ２２から放出されるレーザービームを含むことができる。次いで、検出器は、蛍光の有無によって蛍光マーカーの有無を検出することができる。いくつかの実施形態は、１超のレーザ及び／又は１超の検出器を含む。特定の実施形態では、図１及び図２の実施形態に示されるように、液滴を帯電させ、蛍光マーカーでマーカーされた細胞又は粒子を含む液滴は、それらの電荷によって１つの容器６１ａにソーティングされ、蛍光マーカーでマーカーされていない細胞又は粒子を含む液滴は、別の容器６１ｂにソーティングされる。他の実施形態では、液滴ベースのソーティングを使用せず、これに代えて、蛍光マーカーでマーカーされた細胞又は粒子は、磁気ソレノイドソーティングバルブを使用して流体フローから１つの容器６１ａにソーティングされ、標識されていない細胞又は粒子は、異なる容器にソーティングされる。図１及び図２に更に示されているように、これらの容器は、ウェルプレート、例えば、マイクロプレートの別々のウェルであることができる。いくつかの構成では、フローサイトメーター２０は、サンプルをより大きな容量の容器、チューブ、カートリッジ、又はマイクロチップにソーティングすることができる。

【0058】

他の実施形態では、フローサイトメーターは、サンプルの分析、及び異なる性質を有する、又は様々なパラメータを満たすサンプル内の成分の存在、含量、頻度、及び／又は分布に関するデータの収集のために構成することができる。特に、フローサイトメーターは、標識された生物材料、標識された分析試薬、又は標識された粒子状成分などの標識された成分の存在及び／又は頻度に関するデータを測定及び収集するように構成することができる。いくつかの実施形態では、フローサイトメーター２０は、いずれについても前記したように、分析及びソーティングの両方のために構成することができる。他の実施形態では、フローサイトメーターは、ソーティングせずに分析のみのために構成することができ、サンプルを含む流体ストリームは、分析後に廃棄することができる。

【0059】

更に他の実施形態では、図１及び図２に示されるように、フローサイトメーター２０は、サンプルを少なくとも２つの容器６１ａ及び６１ｂ、又はマイクロ流体ソーティングデバイスによって指定される他の受容点、例えば、複数のウェルプレート内のウェル又は同一ウェルプレート内のウェルにソーティングするように構成されたマイクロ流体ソーティングデバイスである。マイクロ流体ソーティングデバイスは、プローブ１１からの流体ストリームの成分を、成分に提供される任意の蛍光、磁気、同位体、又は化学標識に基づいて、及び／又はサイズ、形状、密度、結合能力、導電率、又は音響特性など標識とは無関係の成分の性質に基づいてソーティングするように構成されることを除き、特に限定されない。マイクロ流体ソーティングデバイスに提供される流体ストリームは、流体ストリーム中のサンプルの多くの若しくは大部分の細胞又は他の粒子が上記の標識及び／又は性質に基づいて個別成分に分離されるように、マイクロ流体ソーティングデバイスによって制御することができる。特定の実施形態では、図１及び図２の実施形態に示されるように、標識及び／又は性質の所定のセットを含む成分は、分離され、１つの容器６１ａにソーティングされ、標識及び／又は性質の所定のセットを有さない成分は、別の容器６１ｂにソーティングされる。これらの容器は、マイクロプレートなどのウェルプレートの別々のウェルであることができる。いくつかの実施形態、例えば、蛍光又は他の光又は放射線に基づく現象に基づく分析又はソーティングを伴わない実施形態では、フローサイトメーター２０としてのマイクロ流体ソーティングデバイスは、レーザ２２を示す図１及び図２の実施形態とは異なり、レーザを含まなくてもよい。

【0060】

いくつかの実施形態では、例えば、図１及び図２に示されるように、分析及び／又はソーティングシステム１０は、プローブ１１に流体を供給するように構成されたプローブ入力ライン３１を含むことができる。プローブ入力ライン３１は、流体ストリームをプローブ１１に輸送するためのその構成を除き、特に限定されない。プローブ入力ライン３１は、剛性、部分的に剛性、又は可撓性であることができる。プローブ入力ライン３１は、それが輸送する流体への空気又はガスの導入を防ぐために、閉鎖密封されたラインであることが好ましい。それは、チューブ、ホース、パイプ、別の要素による導管、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。それは、金属、ガラス、プラスチック、ゴム、又はそれらの任意の組合せ、又は流体をプローブ１１に輸送することができる任意の他の材料又は材料の組合せで作製することができる。好ましくは、プローブ入力ライン３１は、シリコーン又はＰＶＣチューブを含む。いくつかの実施形態では、プローブ入力ライン３１は、バルブ、ジョイント、及び／又はジャンクションを含む又は含まないことができる。好ましくは、プローブ入力ライン３１は、往復バルブを含まない。いくつかの実施形態では、プローブ入力ライン３１は、サンプルループを含む又は含まないことができ、好ましくはサンプルループを含まない。プローブ入力ライン３１は、流体供給部１０４に結合又は一体化されて、流体を流体供給部１０４に提供する。

【0061】

いくつかの実施形態では、例えば、図１及び図２に示されるように、プローブ入力ライン３１は、流体をプローブ１１に供給するように構成されたプローブ入力ポンプ４１を含むことができる、即ち、プローブ入力ポンプ４１が介在することができる。プローブ入力ポンプ４１は、プローブ１１に流体を提供することを除き、特に限定されない。プローブ入力ポンプ４１は、ペリスタルティックポンプ、ダイアフラムポンプ、シリンジポンプ、ギアポンプ、又はマイクロ流体ポンプなどの様々なタイプのラボ用ポンプのいずれかであることができる。好ましくは、プローブ入力ポンプ４１は、マイクロ流体ポンプである。他の実施形態では、流体は、他の方法でプローブ入力ライン３１を通じてプローブ１１に輸送させることができる。例えば、プローブ１１内又はその近傍の真空は、プローブ入力ライン３１の端部又はその近傍の圧力を低下させることができ、それによって、流体源の圧力（例えば、大気圧）が流体を、プローブ入力ライン３１を通じて押し出す。また、力を流体に加えて、例えば、上昇させた流体源からサイフォニングによって、又は重力によって、プローブ入力ライン３１を通じて流体を輸送することもできる。当業者は、ラインを通じて流体を輸送する他の方法が知られており、プローブ入力ライン３１を通じて流体をプローブ１１に輸送するのに適し得ることを理解する。

【0062】

分析及び／又はソーティングシステム１０は、プローブ－フローサイトメーターライン３２を含む。プローブ－フローサイトメーターライン３２は、プローブ１１からフローサイトメーター２０に流体ストリームを輸送するための構成を除き、特に限定されない。プローブ－フローサイトメーターライン３２は、流体排出部１０５に結合又は一体化されて、流体を流体排出部１０５に提供する。プローブ－フローサイトメーターライン３２は、剛性、部分的に剛性、又は可撓性であることができる。プローブ－フローサイトメーターライン３２は、それが輸送する流体ストリームへの空気又はガスの導入を防ぐために、閉鎖密封されたラインであることが好ましい。それは、チューブ、ホース、パイプ、別の要素による導管、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。それは、金属、ガラス、プラスチック、ゴム、又はそれらの任意の組合せ、又は流体ストリームをフローサイトメーター２０に輸送することができる任意の他の材料又は材料の組合せで作製することができる。フローサイトメーターライン３２の１以上の材料は、プローブ入力ライン３１の材料と同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、シリコーン又はＰＶＣチューブを含む。いくつかの実施形態では、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、バルブ、ジョイント、及び／又はジャンクションを含む又は含まないことができる。好ましくは、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、往復バルブを含まない。いくつかの実施形態では、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、サンプルループを含む又は含まないことができ、好ましくはサンプルループを含まない。

【0063】

いくつかの実施形態では、例えば、図１及び図２に示されるように、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、流体ストリームをプローブ１１から引き抜くように構成されたフローサイトメーターポンプ４２を含むことができる、即ち、フローサイトメーターポンプ４２が介在することができる。プローブ－フローサイトメーターポンプ４２は、流体をプローブ１１から引き抜き、それをフローサイトメーター２０に提供することを除き、特に限定されない。プローブ－フローサイトメーターポンプ４２は、ペリスタルティックポンプ、ダイアフラムポンプ、シリンジポンプ、ギアポンプ、又はマイクロ流体ポンプなどの様々なタイプのラボ用ポンプのいずれかであることができる。好ましくは、プローブ－フローサイトメーターポンプ４２は、マイクロ流体ポンプである。プローブ－フローサイトメーターポンプ４２は、プローブ入力ポンプ４１と同一タイプであっても異なるタイプであってもよい。他の実施形態では、流体は、他の方法でプローブ－フローサイトメーターライン３２を通じてプローブ１１からフローサイトメーター２０に輸送させることができる。例えば、フローサイトメーター２０内又はその近傍の真空は、フローサイトメーターライン３２の端部又はその近傍の圧力を低下させることができ、それによって、プローブ１１における圧力（例えば、大気圧）が流体を、プローブ－フローサイトメーターライン３２を通じて押し出す。また、力を流体に加えて、例えば、プローブ１１とフローサイトメーター２０との間の高低差からサイフォニング又は重力によって、プローブ－フローサイトメーターライン３２を通じて流体を輸送することもできる。当業者は、ラインを通じて流体を輸送する他の方法が知られており、プローブ－フローサイトメーターライン３２を通じて流体をプローブ１１からフローサイトメーター２０に輸送するのに適し得ることを理解する。

【0064】

いくつかの実施形態では、例えば、図１及び図２に示されるように、分析及び／又はソーティングシステム１０は、プローブ入力ポンプ４１及びプローブ－フローサイトメーターポンプ４２を制御するための制御システムを更に含むことができる。前記制御システムは、プローブ入力ライン３１及びプローブ－フローサイトメーターライン３２を通る流れをモニターすることができ、これらの２つの流れを互いに対して更にモニターすることができる。前記制御システムは、任意に、プローブ入力ライン３１を通る流れ及びプローブ－フローサイトメーターライン３２を通る流れの一方又は両方をモニターするための１以上の流量計を含むことができる。前記制御システムは、プローブ入力ポンプ４１及び／又はプローブ－フローサイトメーター４２、好ましくは両方のポンプ出力又は他の決定パラメータを調整することができる。前記制御システムは、グラフィカルユーザインターフェイスを含むことができる。前記制御システムは、フローサイトメーター２０の制御システムと統合させる、又はそれと分けることができる。

【0065】

いくつかの実施形態では、例えば、図１及び図２に示されるように、分析及び／又はソーティングシステム１０は、オートサンプラー４３を含むことができる。いくつかの実施形態では、オートサンプラー４３は、プローブ１１を制御可能に保持及び解放するための、且つ複数のサンプル容器とウェルとの間でプローブ１１を移動させるためのホルダーを含む。他の実施形態では、オートサンプラー４３は、プローブ１１に固定的に取り付けられている、又は一体であり、プローブ１１を複数のサンプル容器及び／又はウェルの間で移動させるように構成される。更に他の実施形態では、プローブ１１は、動作中に実質的に固定位置を維持するように構成されすることができ、オートサンプラー４３は、サンプルホルダー、チューブ、及び／又はウェルプレートなどのサンプル容器を制御可能に保持及び解放するための、且つかかるサンプル容器を移動させて、固定位置にあるプローブ１１によるサンプリングのために複数のサンプルを提供するホルダーを含む。オートサンプラー４３は、異なるウェル又は他の容器から、毎分３０回超、好ましくは毎分少なくとも３５回、好ましくは毎分少なくとも４０回、より好ましくは毎分少なくとも４５回、更により好ましくは少なくとも毎分６０回、更に好ましくは毎分約９６回の速度で別々のサンプルを回収するように構成することができる。いくつかの実施形態では、オートサンプラー４３は、毎分１１０回以下の高速度で、異なるウェル又は他の容器から別々のサンプルを回収するように構成することができる。これらのサンプル回収速度の実施形態は、具体的には、プローブ１１が、１以上のサンプル容器、好ましくは１以上のウェルプレート５０内の１以上のウェル５１への少なくとも部分的な挿入のために構成されることができる実施形態であることができる。

【0066】

上記のシステム及び実質的に同様のシステムは、サンプル内の異なる成分の選択及び分離のための方法で使用することができる。

【0067】

１以上のサンプル中の成分を分析、ソーティング、分離、及び／又は選択する方法は、流体をプローブ１１の開放端１０２に輸送することと、少なくとも１つのサンプルをプローブ１１の前記開放端１０２に回収することと、前記少なくとも１つのサンプルと前記流体とを含む流体ストリームを前記プローブ１１の前記開放端１０２から除去することと、前記流体ストリームをフローサイトメーター２０に輸送し、フローサイトメーター２０で前記サンプルの成分を分析及び／又は分離することとを含むことができる。

【0068】

サンプルは、特に限定されない。いくつかの実施形態では、好ましくはプローブ１１による回収の前に、その少なくとも一部を標識することができる。標識化を伴ういくつかの好ましい実施形態では、サンプルは、標識された１以上の生物材料、及び標識されていない１以上の生物材料も含む。標識及び非標識生物材料は、それぞれ独立して、１以上の細胞、細胞断片、ウイルス、ウイルス断片、細胞小器官、エクソソーム又は細胞外小胞及びそれらの断片、タンパク質、核酸、及び／又は炭水化物を含むことができる。タンパク質は、存在する場合、タンパク質複合体、多タンパク質複合体、単一ポリペプチド、オリゴペプチド、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。核酸は、存在する場合、染色体、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸複合体、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。炭水化物は、例えば、糖、オリゴ糖、多糖、炭水化物複合体、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。前記サンプルは、好ましくは、１以上の細胞を含み、これらは、いくつかの実施形態では、免疫細胞、幹細胞、又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）であることができる。サンプルに含まれ得る免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージなどの白血球が挙げられる。特定の実施形態では、ネイティブなＴ細胞又はエンジニアードされたＴ細胞が白血球として好ましく、腫瘍浸潤リンパ球、１以上のキメラ抗原受容体タンパク質を含むＴ細胞、又は癌、感染症、又は自己免疫疾患の診断若しくは治療に適した１以上のＴ細胞受容体タンパク質を含むＴ細胞を含むことができる。他の実施形態では、前記白血球は、ネイティブなＢ細胞又はエンジニアードされたＢ細胞、特に、癌、自己免疫疾患、感染症、又はタンパク質欠乏症の診断若しくは治療に適したエンジニアードされたＢ細胞を含むことができる。更に他の実施形態では、前記白血球は、ネイティブなＮＫ細胞又はエンジニアードされたＮＫ細胞、例えば、キメラ抗原受容体タンパク質を含むＮＫ細胞、特に癌、感染症、又は自己免疫疾患の治療に適したものであることができる。更なる実施形態では、前記白血球は、ネイティブな樹状細胞又はエンジニアードされた樹状細胞、例えば、癌、感染症、炎症性疾患、変性疾患、自己免疫疾患、及び臓器移植の診断若しくは治療に適したエンジニアードされた樹状細胞であることができる。更に別の実施形態では、前記白血球は、ネイティブな単球又はエンジニアードされた単球、例えば、癌、感染症、炎症性疾患、変性疾患、自己免疫疾患、及び臓器移植の診断若しくは治療に適したエンジニアードされた単球であることができる。他の実施形態では、前記白血球は、ネイティブなマクロファージ又はエンジニアードされたマクロファージ、例えば、癌、感染症、炎症性疾患、変性疾患、自己免疫疾患、及び臓器移植の診断若しくは治療に適したエンジニアードされたマクロファージであることができる。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含むことができる。幹細胞を含むサンプルを用いた実施形態は、疾患又は状態の遺伝子操作による修復、又は移植に適した幹細胞を含むことができる。前記幹細胞は、存在する場合、神経変性、糖尿病、多発性硬化症、脳性麻痺、黄斑変性症、心血管疾患、又は筋骨格系疾患の治療に適し得る。ＣＴＣは、限定されるものではないが、固形又は原発性腫瘍から周囲の血管系又はリンパ系に放出されて血流中を循環する腫瘍細胞を含むことができる。ＣＴＣは、癌の検出及び診断に適し得る。前記サンプルが細胞を含む場合、前記細胞は、細菌細胞、植物細胞、酵母又は真菌細胞、又は動物細胞であることができる。特定の実施形態では、前記細胞は、エンジニアードされた又はネイティブな動物細胞であることが好ましく、特定の実施形態では、前記細胞は、エンジニアードされた又はネイティブなヒト細胞であることがより好ましい。前記標識及び非標識の１以上の生物材料は、天然のものでもよいし、又は例えば、変異又は遺伝子工学によって、それらのネイティブな状態から改変されていてもよいし、又は両方のタイプの材料の組合せであってもよい。いくつかの好ましい実施形態では、前記サンプルは、少なくとも１つの改変及び標識された生物材料を含み、好ましくは、１つ以上の改変及び標識された細胞を含む。

【0069】

いくつかの好ましい実施形態では、前記サンプルは、元々又は最初に対象から得られたものである。前記対象は、ヒト対象、別の生物、又は組織サンプル、好ましくはヒト対象又はヒト組織サンプルであることができる。前記対象は、好ましくは、治療を必要とする患者であることができ、又は他の実施形態では、前記対象は、治療を必要とする患者とは異なる個体である。前記サンプルは、最初に、血液サンプル又は組織サンプルとして、好ましくは血液サンプル及び／又は腫瘍、特に腫瘍間質、又は治療を必要とする状態にある他の組織から得られたサンプルとして、前記対象から得ることができる。前記サンプルを最初に前記対象から得た後、血液及び／又は組織の少なくとも１つの成分を前記サンプルとして除去又は単離することができる。前記サンプルとして除去又は単離される成分は、１以上の細胞、細胞断片、ウイルス、ウイルス断片、エクソソーム又は細胞外小胞及びそれらの断片、タンパク質、核酸、又は炭水化物を含むことができる。前記サンプルとして除去又は単離される成分は、好ましくは１以上の細胞、より好ましくは白血球であり、特に、特定の実施形態ではＴ細胞が好ましい。

【0070】

好ましい実施形態では、前記サンプルが除去又は単離されると、改変される、又は別の生物材料を改変するために使用される。改変は、所望の形質を発現させるため、及び／又は所望の構造、好ましくはタンパク質を産生させるために、細胞にＤＮＡ及び／又はＲＮＡを導入することを含む遺伝子工学を含み得る。或いは、前記改変は、所望の形質の発現及び／又は所望の構造の産生を除去又は阻害するという目的を有し得る。特定の好ましい実施形態では、前記除去又は単離されたサンプルは、Ｔ細胞を含み、前記改変は、１以上の受容体タンパク質をコードするＤＮＡを前記Ｔ細胞に提供することを含む。これらの実施形態では、前記受容体タンパク質は、１以上の腫瘍細胞抗原に選択的に結合するように構成されたＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体であることができる。いくつかの実施形態では、前記受容体タンパク質は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体である。

【0071】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）養子細胞療法に関連するいくつかの実施形態では、前記サンプルは、最初に、治療を必要とする患者の血液又は腫瘍から得ることができる。前記サンプルは、Ｔ細胞などのＴＩＬと腫瘍細胞とに分離するためにソーティングすることができる。いくつかの実施形態では、分離されたＴ細胞は、個々の単一細胞として更に単離することができる。Ｔ細胞をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で増殖させ、次いで、前記腫瘍細胞に曝露して、前記腫瘍細胞に対して反応するＴ細胞を同定する。いくつかの実施形態では、反応性Ｔ細胞は、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、及び／又はＣＤ１０７ａ／ＬＡＭＰ－１などであるがこれらに限定されない細胞表面タンパク質の存在によって、反応性について同定及び選択され得る。前記腫瘍細胞に反応性があることを示すＴ細胞を選択し、更に増殖させて、増殖及び生着を促進するためにＩＬ－２処置により前記患者に注入して戻すことができる。

【0072】

他の実施形態では、前記サンプルは、ソーティング若しくは分析に適し得る、又はソーティング若しくは分析方法を容易にするのに適し得る試薬又は粒子状成分を含む。試薬又は粒子状成分は、ビーズを含むことができる。かかる試薬又は粒子状成分は、生物材料の代わりに、又はそれに加えて、前記サンプル中に存在し得る。いくつかの実施形態では、前記試薬又は粒子状成分には、１以上の生物材料が設けられる。例えば、ビーズ表面には、抗体、特に細胞又は他の生物材料を捕捉するように構成された抗体を設けることができる。前記試薬又は粒子状成分、例えばビーズは、標識、例えば蛍光又は磁気標識を含むことができる。かかる標識は、ビーズ内及び／又はビーズの表面上に、直接又は連結基を介して設けることができる。

【0073】

分析、分離、選択、及び／又はソーティングを容易にするために、前記生物材料は、好ましくは選択的方法で、好ましくはプローブ１１による回収の前に標識することができる。前記標識は、化学的、同位体、磁性、又は蛍光型の標識であることができる。いくつかの実施形態では、前記標識は、好ましくは、光学的方法による検出に適した標識、特に蛍光標識、例えばフィコエリスリン（ＰＥ）又はカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、又は増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）などの蛍光タンパク質、又は量子ドットなどのナノ粒子を含む。前記標識はまた、光学標識の代わりに磁気標識を含むことができ、又はいくつかの好ましい実施形態では、光学標識に加えて磁気標識を含むことができる。前記標識化が選択的である場合、前記選択的標識化は、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体などの１以上の腫瘍細胞抗原に結合することができるＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体などの、前記サンプル中の細胞の表面上のタンパク質又は受容体マーカーに対してなど、標的生物材料の存在に対して選択的であることができる。他の実施形態では、前記標識化は、活性化された又は反応性のＴ細胞、例えば、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、及び／又はＣＤ１０７ａ／ＬＡＭＰ－１を示す表面タンパク質マーカーの存在に対して選択的であることができる。標識は、異なるタンパク質の存在、又はタンパク質と別の特性の存在など、各種特性及び／又はマーカーに対する１以上の標識を含むことができる。かかる複数の標識においては、前記標識は同一でも異なっていてもよい。

【0074】

前記プローブ１１の前記開放端１０２で前記サンプルを得るために、流体は、流体供給部１０４から提供され得る。前記流体は、好ましくは液体、より好ましくは生理食塩水、更により好ましくは緩衝生理食塩水である。前記緩衝液は、存在する場合、リン酸緩衝液であることができる。いくつかの実施形態では、前記流体は、フローサイトメトリー用のシース液として適した流体、又はフローサイトメトリー用のシース液を提供する１以上の他の物質と組み合わせることができる流体である。好ましくは、流体供給部１０４を通じて開放端１０２に提供される前記流体自体は、フローサイトメトリー用のシース液として好適である。

【0075】

前記流体は、例えば、プローブ入力ポンプ４１を用いてポンピングすることによって流体供給部１０４に提供することができる。好ましい実施形態では、流体供給部１０４を通る開放端１０２までの流体の流量が調整され、これは、流量計による測定及び／又は流量レギュレーターによる流量制御を含むことができる。流体供給部１０４を通る開放端１０２までの前記流体の前記流量はまた、いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーに適した体積流量である。かかる実施形態では、前記流量は、１０～１０００μＬ／分、特に１０～２０μＬ／分又は１００～１，０００μＬ／分であることができる。流体供給部１０４を通る開放端１０２までの前記流体の前記流量は、プローブ１１の前記開放端１０２から前記流体排出部１０５を通る流体ストリームを除去するための流量よりも大きい、実質的に同一である、又は同一であることができる。いくつかの実施形態では、流体供給部１０４を通る開放端１０２までの前記流体の前記流量は、プローブ１１の前記開放端１０２から前記流体排出部１０５を通る流体ストリームを除去するための流量よりも１％～１０％大きく、より好ましくは、約５％大きい。少なくとも流体排出部１０５を通して除去された前記流体を置き換えるように、流体供給部１０４を通る開放端１０２まで十分な流量を維持することにより、分析及び／又はソーティングシステム１０の前記プローブ１１及びそれを使用する方法は、空気又は他のガスが流体排出部１０５に流入を回避し、それによって、フローサイトメーター２０へのガスの望ましくない存在を回避する。

【0076】

プローブ１１の開放端１０２に到達すると、前記流体は、図５に示されるように流体ドーム１０７を形成することができる。サンプルは、流体ドーム１０７との接触によって開放端１０２に入ることができる。いくつかの実施形態では、前記流体ドーム１０７が、チューブ、フラスコ、又はウェルプレート５０のウェル５１などの１以上のサンプル容器内で、サンプルそのもの、又は前記サンプルの水性懸濁液又は分散液と接触すると、前記サンプルは、前記流体ドーム１０７に入ることができる。他の実施形態では、前記サンプルは、開放端１０２にサンプルの液滴又はスプレーを提供することによって、好ましくはドーム１０７を有する開放端１０２に提供することができる。例えば、前記方法のいくつかの実施形態は、自動化されたピペッティングシステムによって、又は個々のウェル内のサンプルに音響エネルギーを向けて前記サンプルの液滴をプローブ１１の開放端１０２に向けて吐出させることによって、プローブ１１の開放端１０２にサンプルを輸送することができる。いくつかのかかる実施形態、例えば、他の方向でも表面張力又は接着などの力によって前記サンプルを保持するほど、ウェル又は他の１以上のサンプル容器が十分に狭い実施形態では、前記プローブの前記開放端を上向き方向、下向き方向、横方向、又は垂直方向に対して斜めの角度に向けることができる。いくつかのかかる実施形態では、前記プローブが上向き方向で、前記以上のサンプル容器が逆向きであることが特に好ましい場合がある。いくつかの場合には、サンプル及び／又は流体は、ドームを形成することなく前記プローブに引き込まれ得る。

【0077】

前記流体及び前記サンプルを含む流体ストリームは、例えば、プローブ－フローサイトメーターポンプ４２によるポンピングによって、流体排出部１０５を通って開放端１０２から除去することができる。好ましい実施形態では、開放端１０２から出た後、流体排出部１０５を通る前記流体ストリームの前記流量が調節され、これは、流量計による測定及び／又は流量レギュレーターによる流量制御を含むことができる。追加的又は代替的に、センサを使用して、直接又は間接的に流量を測定することができる。例えば、流体供給部１０４を通る流量と流体排出部１０５を通る流量との間のバランスを維持するために、光ベースセンサなどのセンサにより、ドーム１０７のサイズ及び／又は形状を測定することができる。いくつかの実施形態では、プロセッサを使用して、流体供給部１０４を通る流量及び流体排出部１０５を通る流量をモニター及び／又は制御することができる。かかるプロセッサは、存在する場合、１以上の流量計及び／又は光ベースセンサなどの１以上のセンサからのデータを受信することができる。追加的又は代替的に、かかるプロセッサは、存在する場合、１以上のフローレギュレーターを制御するためのデータを提供することができる。開放端１０２から離れる方向において流体排出部１０５を通る前記流体ストリームの前記流量は、いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーに適した体積流量でもある。かかる実施形態では、前記流量は、１０～１０００μＬ／分、特に１０～２０μＬ／分又は１００～１，０００μＬ／分であることができる。開放端１０２から出る流体排出部１０５を通る前記流体ストリームの前記流量は、流体供給部１０４を通って開放端１０２までの前記流体の前記流量より少ない、実質的に同一である、又は同一であることができる。いくつかの実施形態では、開放端１０２から出る流体排出部１０５を通る前記流量は、流体供給部１０４を通って開放端１０２までの流量よりも１％～１０％少なく、より好ましくは、約５％少ない。流体排出部１０５を通る十分に低い流量を維持して、流体供給部１０４を通って開放端１０２に供給された前記サンプル及び前記流体に伴うガス又は空気の流入を防ぐことによって、分析及び／又はソーティングシステム１０の前記プローブ１１及びそれを用いる方法は、フローサイトメーター２０へのガスの望ましくない存在を避けることができる。

【0078】

次いで、前記プローブ１１の開放端１０２から前記プローブ１１の流体排出部１０５を通って除去された前記流体ストリームは、フローサイトメーター２０に輸送される。いくつかの実施形態では、プローブ－フローサイトメーターライン３２が前記流体ストリームを輸送する。プローブ－フローサイトメーターライン３２は、いくつかの実施形態では、ジョイント、ジャンクチャ（ｊｕｎｃｔｕｒｅ）、又はバルブを有さないことができる。他の実施形態では、プローブ－フローサイトメーターライン３２は、少なくとも、ジョイント、ジャンクチャ、又はバルブを含む。前記流体ストリーム中のガスの望ましくない存在を回避するプローブ１１の実施は、いくつかの実施形態では、空気又はガスの気泡がプローブ－フローサイトメーターライン３２に提供されず、空気又はガスの気泡がジョイント、ジャンクチャ、又はバルブ内に不利益に保持されて、プローブ－フローサイトメーターライン３２を通る流体のフローを損なわせることがないので、ジョイント、ジャンクチャ、又はバルブの存在による問題がより少なくなり得ることを意味し得る。

【0079】

前記流体ストリームは、前記プローブ１１の開放端１０２から前記プローブ１１の流体排出部１０５を通ってフローサイトメーター２０に輸送されるので、前記流体ストリームは、更なる１以上の成分を受容する、即ち、それと合一する場合もしない場合もある。いくつかの実施形態では、前記流体ストリームは、追加成分なしに前記フローサイトメーター２０に移動する。他の実施形態では、前記流体ストリームを水で希釈することができる、又は任意に緩衝化された生理食塩水溶液を添加することができる。

【0080】

前記フローサイトメーター２０に入ると、前記流体ストリームは、いくつかの実施形態では、例えば、蛍光活性化セルソーティングによって分離され得る。いくつかの実施形態では、前記分離プロセスは、好ましくは、その中央部分に前記サンプルを含む前記流体ストリームによるシースフローの生成を含む、流体力学的フォーカシングによる前記流体ストリームのフローの制御を含む。他の好ましい実施形態では、前記流体のフローは、その中央部分に前記サンプルを含む前記流体ストリームによるシースフローの生成を強化するために、超音波による音響フォーカシングによって制御することができる。次いで、前記流体ストリームを液滴に分離することができ、その大部分又は全てが、好ましくは、生物材料の１つの細胞又は他の単位を含み、前記液滴は、それぞれ電荷を有する。次いで、液滴中に存在する場合、標識が検出される。いくつかの実施形態において、検出は、液滴に対して、好ましくはレーザービームの形態で電磁エネルギーを与えることを含む。次いで、前記エネルギーは、好ましくは蛍光励起を介して、標識を励起することができる。次いで、カメラ又は他の光検出装置により、蛍光の有無を検出することができ、それによって、前記液滴中の標識サンプルの有無を検出する。次いで、前記流体ストリームの液滴を、前記標識サンプルの検出有無に基づきソーティングすることができる。これは、前記液滴に与えられた電荷によって、少なくとも２つの容器又は他の受容点、例えば、ウェルプレート内のウェル、チューブ、又はフラスコに前記液滴を向けることを含む。他の実施形態では、標識サンプルは、前記標識の検出有無に基づいて、磁気ソレノイドソーティングバルブを使用して流体フローから少なくとも２つの容器にソーティングされる。フローサイトメトリーベースのソーティングのこれら又は他の方法によって、前記サンプルは、少なくとも１つの標識された成分と、少なくとも１つの標識されていない又は異なる標識をされた成分とに分離され得る。特定の実施形態では、標識された成分は、単一又は個々の成分として個々の容器にソーティングされ得る。例えば、前記標識された成分が細胞である場合、単一又は個々の細胞は、その容器内の唯一の標識された成分として、個々の容器にソーティングされる。

【0081】

更に他の実施形態では、図１及び図２に示されるように、フローサイトメトリーによるソーティングは、マイクロ流体ソーティングによって前記サンプルを少なくとも２つの容器６１ａ及び６１ｂ、又はマイクロ流体ソーティングデバイスによって指定される他の受容点、例えば、複数のウェルプレート内のウェル又は同一ウェルプレート内のウェルにソーティングすることを含むことができる。マイクロ流体ソーティングは、プローブ１１からの流体ストリームの成分を、成分に提供される任意の蛍光、磁気、同位体、又は化学標識に基づいて、及び／又はサイズ、形状、密度、結合能力、導電率、又は音響特性など標識とは無関係の成分の性質に基づいてソーティングすることを除き、特に限定されない。マイクロ流体ソーティングは、前記流体ストリーム中の前記サンプルの多くの若しくは大部分の細胞又は他の粒子が上記の標識及び／又は性質に基づいて個別成分に分離されるように、前記流体ストリームを制御することを含み得る。特定の実施形態では、図１及び図２の実施形態に示されるように、標識及び／又は性質の所定のセットを含む成分は、分離され、１つの容器６１ａにソーティングされ、標識及び／又は性質の所定のセットを有さない成分は、別の容器６１ｂにソーティングされる。これらの容器は、マイクロプレートなどのウェルプレートの別々のウェル、又は別々のチューブであることができる。いくつかの実施形態、例えば、蛍光又は他の光又は放射線に基づく現象に基づく分析又はソーティングを伴わない実施形態では、フローサイトメーター２０としてのマイクロ流体ソーティングデバイスは、レーザ２２を示す図１及び図２の実施形態とは異なり、レーザを含まなくてもよい。

【0082】

いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーによるソーティング後、ソーティングされた成分を含む１以上の得られた流体ストリーム、画分、及び／又は容器は、前記サンプルの標識成分について濃縮され得る。これは、標識成分が、回収された他の画分（例えば、１以上の第２の流体ストリーム、画分、及び／又は容器）に対してより多くの数及び／又は量で存在することを意味する。いくつかの場合には、標識成分について濃縮されるということは、標識成分の測定可能又は検出可能な数又は量を意味し得る。例えば、濃縮画分は、画分中の非標識成分に対して、又は元のサンプル中の合計標識成分の量に対して、少なくとも９０、９１、９３、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８％、又はそれ以上の標識成分を含み得る。いくつかの構成では、非標識成分は、１以上の第２の画分に回収され得る。これらは、破棄しても分析してもよい。非標識成分を含む１以上の第２の画分は、実質的に標識成分を含まない又は低減されている。例えば、これらの画分は、標識成分について濃縮された画分に対して、標識成分が１５％、１０％、５％、４％、３％、３％、２％、１％未満、又は含まないことがある。いくつかの場合では、この相対量は、粒子数、質量ベースの量、重量％、標的標識強度などに基づくことができる。量の決定は、吸収、質量分析、クロマトグラフ、セルカウンター、酵素アッセイ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼベースのアッセイ、ＥＬＩＳＡ）、比色アッセイ、蛍光アッセイなどの当技術分野でよく知られた技術を用いて行うことができる。

【0083】

いくつかの実施形態では、前記フローサイトメーター２０で分離した後、前記サンプルから得られた１以上の成分を、治療を必要とする対象に投与するために調製することができる。前記サンプルから得られた前記１以上の成分が細胞を含むいくつかの実施形態では、、前記細胞を培養してもよい。更に、必要に応じて、医薬アジュバントを添加することができ、前記標識を含む特定成分を除去することができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、前記フローサイトメーター２０での分離後、及びいくつかの実施形態では、更なる調製後、前記サンプルから得られた１以上の成分を、治療を必要とする患者に投与することができる。前記患者は、例えば、癌、特に黒色腫、急性リンパ性白血病、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、脳癌、又は乳癌の治療を必要としている場合がある。

【0085】

前記システム及び方法は、例えば、参照によりその全体を本明細書に援用するＰｉｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ ２０１８ ９（３）：２５４－２５６に論じられている、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、キメラ抗体受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、又はそれらの任意の組合せの他の様相を含む、細胞ベース療法に関して更に有用であり得る。

【0086】

他の実施形態では、前記サンプルをフローサイトメーターで分析することができ、異なる性質を有する、又は様々なパラメータを満たすサンプル中の成分の存在、含量、頻度、及び／又は分布に関するデータを収集することができる。特に、前記サンプルを測定することができ、標識された生物材料、標識された分析試薬、又は標識された粒子状成分などの標識された成分の存在及び／又は頻度に関するデータを収集することができる。いくつかの実施形態では、いずれについても前記したが、フローサイトメトリーによる分析をフローサイトメトリーによるソーティングと組み合わせることができる。他の実施形態では、フローサイトメトリーによる分析をソーティングせずに行うことができ、前記サンプルを含む前記流体ストリームは、分析後に廃棄することができる。

【0087】

本明細書における「実施形態」への言及はいずれも、前記実施形態に関して記載される具体的な特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。本明細書中の様々な箇所で記載されるかかる句は、必ずしも全てが同一実施形態に言及している訳ではない。更に、具体的な特徴、構造、又は特性が任意の実施形態に関して記載される場合、前記実施形態の他のものに関してかかる特徴、構造、又は特性を達成することは、当業者の範囲内であるとする。任意の１つの実施形態の特徴を、本明細書に記載の１以上の他の実施形態の特徴と組み合わせて、更なる実施形態とすることができる。

【0088】

本発明について、いくつかの例示的な実施形態を参照しつつ本明細書に記載してきたが、当業者であれば、本発明の原理の精神及び範囲内の他の多くの修正及び実施形態を考案することができる。より具体的には、本発明の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、及び添付の特許請求の範囲内において、本組合せ配置の構成部分及び／又は配置における合理的な変形及び修正が可能である。構成部分及び／又は配置の変形及び修正に加えて、代替の使用法も当業者には明らかである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】