特表 2022-544935 細胞外小胞－ＮＬＲＰ３アンタゴニスト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-24

(54)【発明の名称】細胞外小胞－ＮＬＲＰ３アンタゴニスト

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20221017BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20221017BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20221017BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20221017BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20221017BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221017BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221017BHJP

   A61K 31/341 20060101ALI20221017BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20221017BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z

C12N15/113 140Z

C12N15/115 Z

C12N1/00 Z

C12Q1/02

C12Q1/6813 Z

A61P29/00

A61P1/16

A61P1/04

A61P13/10

A61P13/12

A61P9/10 101

A61P9/00

A61P9/10

A61P17/00

A61P19/02

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

A61P21/00

A61P25/00

A61P3/00

A61K48/00

A61K31/7088

A61K31/341

A61K31/713

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022508817

(86)(22)【出願日】2020-08-14

(85)【翻訳文提出日】2022-03-30

(86)【国際出願番号】 US2020046556

(87)【国際公開番号】W WO2021030773

(87)【国際公開日】2021-02-18

(31)【優先権主張番号】62/886,876

(32)【優先日】2019-08-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/989,541

(32)【優先日】2020-03-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ベルクロ

(71)【出願人】

【識別番号】520170759

【氏名又は名称】コディアック バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リム， ジョアン

(72)【発明者】

【氏名】カーウィン， キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】ブルーム， ウェンディ

(72)【発明者】

【氏名】サティヤナラヤナン， スリラム

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルマ， アジャイ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QA19

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

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4B063QR32

4B063QR35

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4B063QX02

4B065AA99X

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4C084MA66

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4C086NA14

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4C086ZA66

4C086ZA81

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZB11

4C086ZC21

(57)【要約】

本開示はＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞、例えば、エクソソームに関する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。本明細書で提供されているのはまた、エクソソームを生成する方法、及びエクソソームを使用して疾患または障害を治療する及び／または予防する方法である。本開示はＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームに関する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。本開示の特定の態様では、細胞外小胞は足場タンパク質をさらに含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞。

【請求項2】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の細胞外小胞。

【請求項3】

マクロファージ、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、単球、好塩基球、好中球、好酸球、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞を標的とする、請求項１または２に記載の細胞外小胞。

【請求項4】

血清におけるＩＬ－１ベータの発現を低減する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項5】

慢性炎症または自己炎症を治療する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項6】

線維症を治療する、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項7】

前記線維症が、肝線維症（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）、心房線維症、心筋内線維症、古い心筋梗塞、グリア瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュプイトレン収縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペイロニー病、腎性全身性線維症、進行性大規模線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項６に記載の細胞外小胞。

【請求項8】

肝線維症（ＮＡＳＨ）を治療する、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項9】

神経変性疾患を治療する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項10】

前記神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動神経疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項９に記載の細胞外小胞。

【請求項11】

代謝障害／ＣＶＤを治療する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項12】

前記代謝障害／ＣＶＤが、酸－塩基不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復欠損障害、グルコース代謝障害、高乳酸血症、鉄代謝障害、脂質代謝障害、吸収不良症候群、代謝症候群Ｘ、先天性代謝異常、ミトコンドリア病、リン代謝障害、ポルフィリア症、タンパク質恒常性欠乏症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質不均衡、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１１に記載の細胞外小胞。

【請求項13】

急性炎症を治療する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項14】

ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）を治療する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項15】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが小分子である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項16】

前記小分子が、ＭＣＣ９５０、タニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１５に記載の細胞外小胞。

【請求項17】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが式（Ｉ）を含む、請求項１５または１６に記載の細胞外小胞：

【化27】

【請求項18】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがＭＣＣ９５０を含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項19】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項20】

前記ＡＳＯがＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に相補性である長さ１０～３０ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の細胞外小胞。

【請求項21】

前記連続するヌクレオチド配列が前記ＮＬＲＰ３転写物内の前記核酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補性である、請求項２０に記載の細胞外小胞。

【請求項22】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３タンパク質の発現を低減することができ、その際、前記ヒト細胞が前記ＮＬＲＰ３タンパク質を発現する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項23】

前記ＮＬＲＰ３タンパク質発現が前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する、請求項２２に記載の細胞外小胞。

【請求項24】

前記ＡＳＯが、ヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、その際、前記ヒト細胞は前記ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡを発現する、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項25】

前記ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する、請求項２４に記載の細胞外小胞。

【請求項26】

前記ＡＳＯがギャップマー、ミックスマー、またはトータルマーである、請求項１９～２５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項27】

前記ＡＳＯが１以上のヌクレオシド類似体を含む、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項28】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；または二環式ヌクレオシド類似体を含む、請求項２７に記載の細胞外小胞。

【請求項29】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が糖修飾ヌクレオシドである、請求項２７または２８に記載の細胞外小胞。

【請求項30】

前記糖修飾ヌクレオシドが親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項２９に記載の細胞外小胞。

【請求項31】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が二環式糖を含むヌクレオシドを含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項32】

前記ヌクレオシド類似体の１以上がＬＮＡを含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項33】

前記ヌクレオチド類似体の１以上が制約されたエチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－制約された２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項34】

前記ＡＳＯが１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、請求項１９～３３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項35】

前記連続するヌクレオチド配列が（ｉ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）；（ｉｉ）コード領域；または（ｉｉｉ）前記ＮＬＲＰ３転写物の３’ＵＴＲの範囲内の核酸配列に相補性である、請求項２０～３４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項36】

前記連続するヌクレオチド配列が（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１～５３４（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド４４８～２１９３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２１２５～３０３６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３９９０；（ｖ）配列番号３の３９９６～４４５６；（ｖｉ）配列番号３のヌクレオチド１０６～３３４；（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６４８～２１１３；（ｖｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２２５～２９５６；（ｉｘ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３８１０；（ｘ）配列番号３の３９９６～４３７６；（ｘｉ）配列番号３のヌクレオチド１５６～２８４；（ｘｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６９８～２０６３；（ｘｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２７５～２９０６；（ｘｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０３７～３７６０；（ｘｖ）配列番号３の４０４６～４３２６；（ｘｖｉ）配列番号３のヌクレオチド１９６～２４４；（ｘｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド７３８～２００３；（ｘｖｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２３１５～２８６６；（ｘｉｘ）配列番号３のヌクレオチド３０７７～３７２０；または（ｘｘ）配列番号３の４０８６～４２８６を含む核酸配列に相補性である、請求項２０～３５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項37】

前記連続するヌクレオチド配列が（ｉ）配列番号３のヌクレオチド２０６～２３４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド７４８～２０１３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２３２５～２８５６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０８７～３７１０；または（ｖ）配列番号３の４０９６～４２７６の範囲内の核酸配列に相補性である、請求項２０～３６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項38】

前記連続するヌクレオチド配列が図１Ａ及び１Ｂの配列から選択される配列に相補性のヌクレオチド配列を含む、請求項２０～３７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項39】

前記連続するヌクレオチド配列が前記ＮＬＲＰ３の転写物の範囲内のヌクレオチド配列に完全に相補性である、請求項２０～３８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項40】

前記ＡＳＯが１または２のミスマッチを伴う、配列番号１０１～２００から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９～３９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項41】

前記ＡＳＯが図３の設計から成る群から選択される設計を有し、その際、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである、請求項１９～４０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項42】

前記ＡＳＯが１４から２０ヌクレオチドの長さである、請求項１９～４１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項43】

前記連続するヌクレオチド配列が１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項２０～４２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項44】

前記１以上の修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート間結合である、請求項４３に記載の細胞外小胞。

【請求項45】

ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が修飾されている、請求項４３または４４に記載の細胞外小胞。

【請求項46】

前記ＡＳＯにおける前記ヌクレオシド間結合のそれぞれがホスホロチオエート結合である、請求項４５に記載の細胞外小胞。

【請求項47】

アンカー部分をさらに含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項48】

前記ＮＬＲＰ３アンタゴニストが前記アンカー部分に連結されている、請求項４７に記載の細胞外小胞。

【請求項49】

さらに外因性標的指向化部分を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項50】

前記外因性標的指向化部分がペプチド、抗体またはその抗原結合断片、化合物、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４９に記載の細胞外小胞。

【請求項51】

前記外因性標的指向化部分がペプチドを含む、請求項４９または５０に記載の細胞外小胞。

【請求項52】

前記外因性標的指向化部分がマイクロタンパク質、設計されたアンキリン反復タンパク質（ダーピン）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項53】

前記外因性標的指向化部分が完全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項54】

前記抗体が単鎖抗体である、請求項５３に記載の細胞外小胞。

【請求項55】

前記外因性標的指向化部分が肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、関節、皮膚、腸、膀胱、膵臓、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる、請求項４９～５４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項56】

前記外因性標的指向化部分が、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ニューロン、肝細胞、クッパー細胞、造血幹細胞、骨髄系細胞（例えば、好中球、単球、マクロファージ、造血幹細胞、ＭＤＳＣ（例えば、単球ＭＤＳＣまたは顆粒球ＭＤＳＣ））、またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる、請求項４９～５５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項57】

前記ＥＶが前記外因性標的指向化部分を前記ＥＶに連結する足場部分を含む、請求項４９～５６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項58】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が足場Ｘである、請求項４７～５７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項59】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が足場Ｙである、請求項４７～５７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項60】

前記足場Ｘが、前記ＥＶの内腔表面及び／または前記ＥＶの外面に前記ＮＬＲＰ３アンタゴニストを固定することができる足場タンパク質である、請求項５８に記載の細胞外小胞。

【請求項61】

前記足場ＸがプロスタグランジンＦ２受容体負の調節因子（ＰＴＧＦＲＮタンパク質）；バシギン（ＢＳＧタンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー２（ＩＧＳＦ２タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３タンパク質）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８タンパク質）；インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１タンパク質）；インテグリンアルファ－４（ＩＴＧＡ４タンパク質）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２タンパク質）；ＡＴＰ輸送タンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１タンパク質、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質、ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質）；それらの機能的な断片；及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項５８または６０に記載の細胞外小胞。

【請求項62】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分がＰＴＧＦＲＮタンパク質またはその機能的な断片である、請求項４７～６１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項63】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が配列番号２０２に示されるようなアミノ酸配列を含む、請求項４７～６２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項64】

前記アンカー部分及び／または前記足場部分が、配列番号２０１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４７～６３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項65】

前記足場Ｙが前記ＥＶの内腔表面及び／または前記ＥＶの外面に前記ＮＬＲＰ３アンタゴニストを固定することができる足場タンパク質である、請求項５９に記載の細胞外小胞。

【請求項66】

前記足場Ｙがミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳタンパク質）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質）、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１タンパク質）、それらの機能的な断片、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項５９または６５に記載の細胞外小胞。

【請求項67】

前記足場ＹがＢＡＳＰ１タンパク質またはその機能的な断片である、請求項５９、６５及び６６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項68】

前記足場ＹがＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、前記ＮＤ及び／または前記ＥＤが前記ＥＶの内腔表面と会合する、請求項５９、６５～６７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項69】

前記ＮＤがミリストイル化を介してエクソソームの内腔表面と会合する、請求項６８に記載の細胞外小胞。

【請求項70】

前記ＥＤがイオン性相互作用を介してエクソソームの内腔表面と会合する、請求項６８または６９に記載の細胞外小胞。

【請求項71】

前記ＥＤが配列にて（ｉ）塩基性アミノ酸１つまたは（ｉｉ）２以上の塩基性アミノ酸を含み、前記塩基性アミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項６８～７０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項72】

前記塩基性アミノ酸が（Ｌｙｓ）ｎであり、その際、ｎが１～１０の整数である、請求項７１に記載の細胞外小胞。

【請求項73】

前記ＥＤがＬｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号３０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号３０６）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号３０７）、ＲＲＲＲＲ（配列番号３０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号３０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号３１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６８～７２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項74】

前記ＮＤがＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に示されるアミノ酸配列を含み、その際、ＧはＧｌｙを表し；「：」はペプチド結合を表し；Ｘ２からＸ６のそれぞれは独立してアミノ酸であり；Ｘ６は塩基性アミノ酸を含む、請求項６８～７３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項75】

（ｉ）Ｘ２がＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択される；
（ｉｉ）Ｘ４がＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔから成る群から選択される；
（ｉｉｉ）Ｘ５がＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択される；
（ｉｖ）Ｘ６がＬｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓから成る群から選択される；または
（ｖ）（ｉ）～（ｉｖ）の任意の組み合わせである、請求項７４に記載の細胞外小胞。

【請求項76】

前記ＮＤがＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、その際、
（ｉ）ＧはＧｌｙを表し；
（ｉｉ）「：」はペプチド結合を表し；
（ｉｉｉ）Ｘ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸であり；
（ｉｖ）Ｘ３はアミノ酸であり；
（ｖ）Ｘ４はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔから成る群から選択されるアミノ酸であり；
（ｖｉ）Ｘ５はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸であり；かつ
（ｖｉｉ）Ｘ６はＬｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓから成る群から選択されるアミノ酸である、請求項６８～７５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項77】

Ｘ３がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇから成る群から選択される、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項78】

前記ＮＤ及び前記ＥＤがリンカーによって連結される、請求項６８～７７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項79】

前記リンカーが１以上のアミノ酸を含む、請求項７８に記載の細胞外小胞。

【請求項80】

前記ＮＤが（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号３１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号３１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号３１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号３１４）、または（ｖ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号３１５）、またはそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６８～７９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項81】

前記ＮＤが（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号３３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号３３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号３４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号３４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号３４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号３４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号３４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号３４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載の細胞外小胞。

【請求項82】

前記ＮＤがアミノ酸配列ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号３１１）を含む、請求項６８～８１のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項83】

前記足場Ｙが、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０個、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約１６０、少なくとも約１７０、少なくとも約１８０、少なくとも約１９０、または少なくとも約２００のアミノ酸の長さである、請求項５９及び６５～８２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項84】

前記足場Ｙが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号３５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号３５６）を含む、請求項５９及び６５～８３に記載の細胞外小胞。

【請求項85】

前記足場Ｙが、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号３４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号３５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号３５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号３５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号３５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号３５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号３５６）から成る、請求項５９及び６５～８４に記載の細胞外小胞。

【請求項86】

前記足場ＹがＮ末端でＭｅｔを含まない、請求項５９及び６５～８５に記載の細胞外小胞。

【請求項87】

前記足場Ｙが前記足場タンパク質のＮ末端にてミリストイル化アミノ酸残基を含む、請求項５９及び６５～８６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項88】

前記足場ＹのＮ末端におけるアミノ酸残基がＧｌｙである、請求項８７に記載の細胞外小胞。

【請求項89】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが前記ＥＶの外面にて前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結される、請求項４７～８８のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項90】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが前記ＥＶの内腔表面にて前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結される、請求項４７～８９のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項91】

前記アンカー部分がステロール、ＧＭ１、脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４７～９０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項92】

前記アンカー部分がコレステロールを含む、請求項４７～９０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項93】

前記アンカー部分がリン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、ビタミン（例えば、ビタミンＤ及び／またはビタミンＥ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４７～９０のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項94】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがリンカーによって前記アンカー部分及び／または前記足場部分に連結される、請求項４７～９３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項95】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがリンカーによって前記ＥＶに連結される、請求項１～９４のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項96】

前記リンカーがポリペプチドである、請求項９４または９５に記載の細胞外小胞。

【請求項97】

前記リンカーが非ポリペプチド部分である、請求項９４または９５に記載の細胞外小胞。

【請求項98】

前記リンカーがエチレングリコールを含む、請求項９４または９５に記載の細胞外小胞。

【請求項99】

前記リンカーが、ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９８に記載の細胞外小胞。

【請求項100】

前記リンカーがアクリルホスホルアミダイト（例えば、ＡＣＲＹＤＩＴＥ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾因子（例えば、アミノ修飾因子Ｃ６、アミノ修飾因子Ｃ１２、アミノ修飾因子Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾剤）、アルキン、５’ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾因子Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオールまたはチオール修飾因子Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９４または９５に記載の細胞外小胞。

【請求項101】

前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項９４～１００のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項102】

前記リンカーがバリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項１０１に記載の細胞外小胞。

【請求項103】

前記リンカーが（ｉ）マレイミド部分、及び（ｉｉ）バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む、請求項９４～１０２のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項104】

前記ＥＶがエクソソームである、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。

【請求項105】

ＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に相補性である長さ１０～３０ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）。

【請求項106】

前記ＡＳＯの前記連続するヌクレオチド配列が前記ＮＬＲＰ３転写物内の前記核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補性である、請求項１０５に記載のＡＳＯ。

【請求項107】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３タンパク質の発現を低減することができ、その際、前記ヒト細胞が前記ＮＬＲＰ３タンパク質を発現する、請求項１０５または１０６のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項108】

前記ＮＬＲＰ３タンパク質の発現が前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する、請求項１０７に記載のＡＳＯ。

【請求項109】

ヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、その際、前記ヒト細胞は前記ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡを発現する、請求項１０５～１０８のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項110】

前記ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルが、前記ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する、請求項１０９に記載のＡＳＯ。

【請求項111】

ギャップマー、ミックスマー、またはトータルマーである、請求項１０５～１１０のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項112】

１以上のヌクレオシド類似体を含む、請求項１０５～１１１のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項113】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；または二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）を含む、請求項１１２に記載のＡＳＯ。

【請求項114】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が糖修飾ヌクレオシドである、請求項１１２または１１３に記載のＡＳＯ。

【請求項115】

前記糖修飾ヌクレオシドが親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシドである、請求項１１４に記載のＡＳＯ。

【請求項116】

前記ヌクレオシド類似体の１以上が二環式糖を含むヌクレオシドを含む、請求項１１２～１１５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項117】

前記ヌクレオシド類似体の１以上がＬＮＡを含む、請求項１１２～１１６のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項118】

前記ＬＮＡが制約されたエチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－制約された２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１１７に記載のＡＳＯ。

【請求項119】

１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む、請求項１０５～１１８のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項120】

前記ＡＳＯが配列番号１０１～配列番号２００のいずれか１つを含む、請求項１０５～１１９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項121】

前記ＡＳＯが図３の設計から成る群から選択される設計を有し、その際、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである、請求項１０５～１２０のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項122】

前記ＡＳＯが１４～２０ヌクレオチドの長さである、請求項１０５～１２１のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項123】

前記連続するヌクレオチド配列が１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１０５～１２２のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項124】

前記１以上の修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート間結合である、請求項１２３に記載のＡＳＯ。

【請求項125】

ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が修飾されている、請求項１２３または１２４に記載のＡＳＯ。

【請求項126】

前記ＡＳＯにおける前記ヌクレオシド間結合のそれぞれがホスホロチオエート結合である、請求項１２５に記載のＡＳＯ。

【請求項127】

前記ＡＳＯが少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分に共有結合する、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯを含むコンジュゲート。

【請求項128】

前記非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分がタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２７に記載のコンジュゲート。

【請求項129】

請求項１０５～１２８のいずれか１項に記載のＡＳＯまたは請求項１２５もしくは１２６に記載のコンジュゲートを含む細胞外小胞。

【請求項130】

請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、または補助剤とを含む医薬組成物。

【請求項131】

前記薬学的に許容される塩がナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３０に記載の医薬組成物。

【請求項132】

さらに、少なくとも１つの追加の治療剤を含む、請求項１３０または１３１に記載の医薬組成物。

【請求項133】

前記追加の治療剤がＮＬＲＰ３アンタゴニストである、請求項１３５に記載の医薬組成物。

【請求項134】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１３３に記載の医薬組成物。

【請求項135】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが抗ＮＬＲＰ３抗体またはその断片である、請求項１３３または１３４に記載の医薬組成物。

【請求項136】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが小分子である、請求項１３３または１３４に記載の医薬組成物。

【請求項137】

前記小分子が、ＭＣＣ９５０、タニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１３６に記載の医薬組成物。

【請求項138】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストが式（Ｉ）を含む、請求項１３６または１３７に記載の医薬組成物：

【化28】

【請求項139】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがＭＣＣ９５０を含む、請求項１３６～１３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項140】

前記外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１３３または１３４に記載の医薬組成物。

【請求項141】

請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物と、使用説明書とを含む、キット。

【請求項142】

請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物と、使用説明書とを含む、診断用キット。

【請求項143】

細胞にてＮＬＲＰ３タンパク質の発現を阻害する、または低減する方法であって、ＮＬＲＰ３タンパク質を発現している前記細胞に請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含み、その際、前記細胞における前記ＮＬＲＰ３タンパク質の発現は前記投与の後に阻害される、または低減される、前記方法。

【請求項144】

前記ＡＳＯが前記投与の後に前記細胞にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの発現を阻害する、または低減する、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルが前記ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて前記投与の後、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

ＮＬＲＰ３タンパク質の前記発現が前記ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて前記投与の後、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減される、請求項１４３～１４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項147】

疾患または障害の１以上の症状の軽減、改善、または治療を必要とする対象にてそれを行う方法であって、有効量の、請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項148】

疾患または障害の治療を必要とする対象にてそれを行うための薬物の製造における請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項149】

疾患または障害の治療を必要とする対象にてそれを行うことで使用するための請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項150】

前記細胞外小胞、前記ＡＳＯ、前記コンジュゲート、または前記医薬組成物が心臓内に、経口で、非経口で、髄腔内に、脳室内に、肺に、局所で、または心室内に投与される、請求項１４３～１４７のいずれか１項に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項151】

前記疾患または障害が線維症、炎症、神経変性疾患、代謝障害／ＣＶＤ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項152】

前記疾患または障害が線維症を含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項153】

前記疾患または障害が、肝線維症（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）、心房線維症、心筋内線維症、古い心筋梗塞、グリア瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュプイトレン収縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペイロニー病、腎性全身性線維症、進行性大規模線維症、後腹膜線維化症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される線維症を含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項154】

前記疾患または障害が慢性炎症、自己炎症、急性炎症、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項155】

前記疾患または障害が神経変性疾患を含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項156】

前記疾患または障害がアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動神経疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される神経変性疾患を含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項157】

前記疾患または障害が代謝障害／ＣＶＤを含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項158】

前記疾患または障害が、酸－塩基不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復欠損障害、グルコース代謝障害、高乳酸血症、鉄代謝障害、脂質代謝障害、吸収不良症候群、代謝症候群Ｘ、先天性代謝異常、ミトコンドリア病、リン代謝障害、ポルフィリア症、タンパク質恒常性欠乏症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質不均衡、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される代謝障害／ＣＶＤを含む、請求項１４７に記載の方法、請求項１４８に記載の使用、または請求項１４９に記載の使用のための組成物。

【請求項159】

炎症性腎障害の１以上の症状の軽減、改善、または治療を必要とする対象にてそれを行う方法であって、有効量の、請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項160】

炎症性腎障害の治療を必要とする対象にてそれを行うための薬物の製造における請求項１～１０４及び１２９のいずれか１項に記載の細胞外小胞、請求項１０５～１２６のいずれか１項に記載のＡＳＯ、または請求項１２７もしくは１２８に記載のコンジュゲート、または請求項１３０～１４０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項161】

炎症性神経障害が、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー型認知症、筋萎縮性側索硬化症、化学療法誘発性末梢神経障害、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１５９に記載の方法、または請求項１６０に記載の使用。

【請求項162】

前記細胞外小胞または前記ＡＳＯが前記対象にてＭ２マクロファージ極性化を誘導する、請求項１５９に記載の方法または請求項１６０に記載の使用。

【請求項163】

前記細胞外小胞または前記ＡＳＯが神経にて骨髄炎症を軽減する、請求項１５９に記載の方法または請求項１６０に記載の使用。

【請求項164】

前記細胞外小胞または前記ＡＳＯが髄鞘にて骨髄炎症を軽減する、請求項１５９に記載の方法または請求項１６０に記載の使用。

【請求項165】

前記細胞外小胞または前記ＡＳＯが歯根、神経及び／または筋肉の１以上にてマクロファージの流入を減らす、請求項１５９に記載の方法または請求項１６０に記載の使用。

【請求項166】

前記細胞外小胞または前記ＡＳＯが歯根、神経及び／または筋肉の１以上にてマクロファージの食作用を減らす、請求項１５９に記載の方法または請求項１６０に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
本出願とともに提出されたＡＳＣＩＩテキストファイル（名称：４０００＿０５９ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ：３５９，７５０バイト、及び作成日：２０２０年８月１３日）における電子的に提出された配列表の内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１９年８月１４日に出願された米国仮出願第６２／８８６，８７６号、及び２０２０年３月１３日に出願された同第６２／９８９，５４１号の優先権の利益を主張するものであり、これらの各々の内容はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示はＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームに関する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。本開示の特定の態様では、細胞外小胞は足場タンパク質をさらに含む。

【背景技術】

【0004】

エクソソームはすべての真核細胞によって天然に生成される小さな細胞外小胞である。エクソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲む膜を含む。薬物送達ビヒクルとして、ＥＶ、例えば、エクソソームは多くの治療分野における新しい治療法として、従来の薬物送達方法を超える多くの利点を提供する。特に、エクソソームは、異なる種に投与された場合でも本質的に免疫原性が低い。

【0005】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは試験管内または生体内で標的遺伝子の発現を調節する強力な手段として登場してきた。しかしながら、生体内でのＡＳＯの安定性と標的指向化を改善する必要性が残っている。

【0006】

したがって、新しくかつさらに効果的な操作されたＥＶ（例えば、エクソソーム）、特に疾患に関連する遺伝子（例えば、がんの場合はＮ）の発現を低減させることができる治療剤を送達するのに使用できるものは、ＥＶに基づく技術の治療上の使用及びその他の応用をさらに良好に可能にするために必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本開示の特定の態様は外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞を対象とする。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0008】

特定の態様では、細胞外小胞は、マクロファージ、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、単球、好塩基球、好中球、好酸球、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される細胞を標的とする。

【0009】

特定の態様では、細胞外小胞は血清におけるＩＬ－１ベータの発現を低減する。特定の態様では、細胞外小胞は慢性炎症または自己炎症を治療する。

【0010】

特定の態様では、細胞外小胞は線維症を治療する。いくつかの態様では、線維症は、肝線維症（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）、心房線維症、心筋内線維症、古い心筋梗塞、グリア瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュプイトレン収縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペイロニー病、腎性全身性線維症、進行性大規模線維症、後腹膜炎、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。特定の態様では、細胞外小胞は肝線維症（ＮＡＳＨ）を治療する。

【0011】

特定の態様では、細胞外小胞は神経変性疾患を治療する。いくつかの態様では、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動神経疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。

【0012】

特定の態様では、細胞外小胞は代謝障害／ＣＶＤを治療する。いくつかの態様では、代謝障害／ＣＶＤは、酸－塩基不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復欠損障害、グルコース代謝障害、高乳酸血症、鉄代謝障害、脂質代謝障害、吸収不良症候群、代謝症候群Ｘ、先天性代謝異常、ミトコンドリア病、リン代謝障害、ポルフィリア症、タンパク質恒常性欠乏症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質不均衡、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。

【0013】

特定の態様では、細胞外小胞は急性炎症を治療する。特定の態様では、細胞外小胞はＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）を治療する。

【0014】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは小分子である。いくつかの態様では、小分子は、ＭＣＣ９５０、トラニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式（Ｉ）を含む：

【化1】

【0015】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＭＣＣ９５０を含む。

【0016】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に相補性である長さ１０～３０ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列はＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補性である。

【0017】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、ヒト細胞（例えば、免疫細胞）におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現を低減させることができ、その際、ヒト細胞はＮＬＲＰ３タンパク質を発現する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３タンパク質発現はＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0018】

いくつかの態様では、ＡＳＯはヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、その際、ヒト細胞はＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡを発現する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0019】

いくつかの態様では、ＡＳＯはギャップマー、ミキサー、またはトータルマーである。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、または二環式ヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオシドは親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は二環式糖を含むヌクレオシドである。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上はＬＮＡを含む。いくつかの態様では、ヌクレオチド類似体の１以上は、制約されたエチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－制約された２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。

【0020】

いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は（ｉ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、（ｉｉ）コード領域、または（ｉｉｉ）ＮＬＲＰ３転写物の３’ＵＴＲの範囲内の核酸配列に相補性である。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１～５３４（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド４４８～２１９３、（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２１２５～３０３６、（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３９９０、（ｖ）配列番号３の３９９６～４４５６、（ｖｉ）配列番号３のヌクレオチド１０６～３３４、（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６４８～２１１３、（ｖｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２２５～２９５６、（ｉｘ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３８１０、（ｘ）配列番号３の３９９６～４３７６、（ｘｉ）配列番号３のヌクレオチド１５６～２８４、（ｘｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６９８～２０６３、（ｘｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２７５～２９０６、（ｘｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０３７～３７６０、（ｘｖ）配列番号３の４０４６～４３２６、（ｘｖｉ）配列番号３のヌクレオチド１９６～２４４、（ｘｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド７３８～２００３、（ｘｖｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２３１５～２８６６、（ｘｉｘ）配列番号３のヌクレオチド３０７７～３７２０、または（ｘｘ）配列番号３の４０８６～４２８６を含む核酸配列に相補性である。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は（ｉ）配列番号３のヌクレオチド２０６～２３４、（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド７４８－２０１３、（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２３２５～２８５６、（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０８７～３７１０、または（ｖ）配列番号３の４０９６～４２７６の範囲内の核酸配列に相補性である。

【0021】

いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は、図１Ａ及び１Ｂの配列から選択される配列に相補性のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列はＮＬＲＰ３転写物内のヌクレオチド配列に完全に相補性である。いくつかの態様では、ＡＳＯは１または２のミスマッチを伴う、配列番号１０１～２００から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0022】

いくつかの態様では、ＡＳＯは図３の設計から成る群から選択される設計を有し、その際、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである。いくつかの態様では、ＡＳＯは１４～２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様では、１以上の修飾されたヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。いくつかの態様では、ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が修飾されている。いくつかの態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド間結合のそれぞれはホスホロチオエート結合である。

【0023】

いくつかの態様では、細胞外小胞はアンカー部分をさらに含む。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンカー部分に連結されている。

【0024】

いくつかの態様では、細胞外小胞は外因性標的指向化部分をさらに含む。いくつかの態様では、外因性標的指向化部分はペプチド、抗体またはその抗原結合断片、化合物、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、外因性標的指向化部分はペプチドを含む。

【0025】

いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、マイクロタンパク質、設計されたアンキリン反復タンパク質（ダーピン）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0026】

いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、完全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0027】

いくつかの態様では、抗体は単鎖抗体である。

【0028】

いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、関節、皮膚、腸、膀胱、膵臓、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる。

【0029】

いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ニューロン、肝細胞、クッパー細胞、造血幹細胞、骨髄系細胞（例えば、好中球、単球、マクロファージ、造血幹細胞、ＭＤＳＣ（例えば、単球ＭＤＳＣまたは顆粒球ＭＤＳＣ））、またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる。

【0030】

いくつかの態様では、ＥＶは外因性標的指向化部分をＥＶに連結する足場部分を含む。いくつかの態様では、アンカー部分及び／または足場部分は足場Ｘである。いくつかの態様では、アンカー部分及び／または足場部分は足場Ｙである。

【0031】

いくつかの態様では、足場Ｘは、ＥＶの内腔表面及び／またはＥＶの外面に外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストを固定することができる足場タンパク質である。

【0032】

いくつかの態様では、足場Ｙは、ＥＶの内腔表面及び／またはＥＶの外面に外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストを固定することができる足場タンパク質である。

【0033】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＥＶの外面におけるアンカー部分及び／または足場部分に連結されている。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＥＶの内腔表面におけるアンカー部分及び／または足場部分に連結されている。

【0034】

いくつかの態様では、アンカー部分は、ステロール、ＧＭ１、脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、アンカー部分はコレステロールを含む。いくつかの態様では、アンカー部分は、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、ビタミン（例えば、ビタミンＤ及び／またはビタミンＥ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはリンカーによってアンカー部分及び／または足場部分に連結されている。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはリンカーによってＥＶに連結されている。いくつかの態様では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの態様では、リンカーは非ポリペプチド部分である。いくつかの態様では、リンカーはエチレングリコールを含む。いくつかの態様では、リンカーはＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0035】

いくつかの態様では、リンカーは、アクリルホスホルアミダイト（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾因子（例えば、アミノ修飾因子Ｃ６、アミノ修飾因子Ｃ１２、アミノ修飾因子Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾剤）、アルキン、５’ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾剤Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオールまたはチオール修飾剤Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0036】

いくつかの態様では、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの態様では、リンカーは、バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。いくつかの態様では、リンカーは（ｉ）マレイミド部分及び（ｉｉ）バリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。

【0037】

いくつかの態様では、ＥＶはエクソソームである。

【0038】

本開示の特定の態様は、ＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に相補性である長さ１０～３０ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を対象とする。いくつかの態様では、その連続するヌクレオチド配列はＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％相補性である。

【0039】

いくつかの態様では、ＡＳＯはヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３タンパク質の発現を低減することができ、その際、ヒト細胞はＮＬＲＰ３タンパク質を発現する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３タンパク質の発現はＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低減する。

【0040】

特定の態様では、ＡＳＯはヒト細胞（例えば、免疫細胞）にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルを低減することができ、その際、ヒト細胞はＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡを発現する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていないヒト細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００低減する。

【0041】

いくつかの態様では、ＡＳＯはギャップマー、ミックスマー、またはトータルマーである。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、または二環式ヌクレオシド類似体（ＬＮＡ）を含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオシドは親和性を増強する２’糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上は二環式糖を含むヌクレオシドである。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体の１以上はＬＮＡを含む。いくつかの態様では、ＬＮＡは制約されたエチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－制約された２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。

【0042】

いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０１～配列番号２００のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは図３の設計から成る群から選択される設計を有し、その際、大文字は糖修飾ヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡである。いくつかの態様では、ＡＳＯは１４～２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。いくつかの態様では、１以上の修飾されたヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。いくつかの態様では、ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が修飾されている。いくつかの態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド間結合のそれぞれはホスホロチオエート結合である。

【0043】

本開示の特定の態様は、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分に共有結合している、本明細書で開示されているＡＳＯを含むコンジュゲートを対象とする。いくつかの態様では、非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0044】

本開示の特定の態様は、本明細書で開示されているＡＳＯまたは本明細書で開示されているコンジュゲートを含む細胞外小胞を対象とする。

【0045】

本開示の特定の態様は、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、または本明細書で開示されているコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、または補助剤とを含む医薬組成物を対象とする。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、医薬組成物はさらに、少なくとも１つの追加の治療剤を含む。

【0046】

いくつかの態様では、追加の治療剤は外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストである。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは抗ＮＬＲＰ３抗体またはその断片である。いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは小分子である。

【0047】

いくつかの態様では、小分子はＭＣＣ９５０、タニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。

【0048】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式（Ｉ）を含む：

【化2】

【0049】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＭＣＣ９５０を含む。

【0050】

いくつかの態様では、外因性ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。

【0051】

本開示の特定の態様は、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、または本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物と、使用のための説明書とを含むキットを対象とする。

【0052】

本開示の特定の態様は、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、または本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物と、使用のための説明書とを含む診断用キットを対象とする。

【0053】

本開示の特定の態様は、ＮＬＲＰ３タンパク質を発現している細胞に本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物投与することを含む、細胞にてＮＬＲＰ３タンパク質の発現を阻害する、または低減する方法を対象とし、その際、細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現は投与後に阻害される、または低減される。

【0054】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、投与後に細胞にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの発現を阻害する、または低減する。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルは、ＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルと比べて投与後に少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減する。

【0055】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３タンパク質の発現はＡＳＯに曝露されていない細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現と比べて投与後に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減する。

【0056】

本開示の特定の態様は、疾患または障害の１以上の症状の軽減、改善、または治療を必要とする対象にてそれを行う方法であって、有効量の、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。

【0057】

本開示の特定の態様は、疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを行うための薬物の製造での、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物の使用を対象とする。

【0058】

本開示の特定の態様は、疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを行うことで使用するための、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物を対象とする。

【0059】

いくつかの態様では、細胞外小胞、ＡＳＯ、コンジュゲート、または医薬組成物は心臓内に、経口で、非経口で、髄腔内に、脳室内に、肺に、局所で、または心室内に投与される。

【0060】

いくつかの態様では、疾患または障害は、線維症、炎症、神経変性疾患、代謝障害／ＣＶＤ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、疾患または障害は線維症を含む。いくつかの態様では、疾患または障害は、肝線維症（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）、心房線維症、心筋内線維症、古い心筋梗塞、グリア瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュプイトレン収縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペイロニー病、腎性全身性線維症、進行性大規模線維症、後腹膜線維化症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される線維症を含む。

【0061】

いくつかの態様では、疾患または障害は、慢性炎症、自己炎症、急性炎症、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、疾患または障害は神経変性疾患を含む。いくつかの態様では、疾患または障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動神経疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経障害痛及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される神経変性疾患を含む。

【0062】

いくつかの態様では、疾患または障害は代謝障害／ＣＶＤを含む。いくつかの態様では、疾患または障害は、酸－塩基不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復欠損障害、グルコース代謝障害、高乳酸血症、鉄代謝障害、脂質代謝障害、吸収不良症候群、代謝症候群Ｘ、先天性代謝異常、ミトコンドリア病、リン代謝障害、ポルフィリア症、タンパク質恒常性欠乏症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質不均衡、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される代謝障害／ＣＶＤを含む。

【0063】

本開示の特定の態様は、炎症性神経障害の１以上の症状の軽減、改善、または治療を必要とする対象にてそれを行う方法であって、有効量の、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を対象とする。

【0064】

本開示の特定の態様は、炎症性神経障害の治療を必要とする対象においてそれを行うための薬物の製造での、有効量の、本明細書で開示されている細胞外小胞、本明細書で開示されているＡＳＯ、本明細書で開示されているコンジュゲート、または本明細書で開示されている医薬組成物の使用を対象とする。

【0065】

いくつかの態様では、炎症性神経障害は、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー型認知症、筋萎縮性側索硬化症、神経障害性痛、化学療法誘発性末梢神経障害、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、細胞外小胞またはＡＳＯは対象にてＭ２マクロファージ極性化を誘導する。いくつかの態様では、細胞外小胞またはＡＳＯは神経にて骨髄炎症を軽減する。いくつかの態様では、細胞外小胞またはＡＳＯは髄鞘にて骨髄炎症を軽減する。いくつかの態様では、細胞外小胞またはＡＳＯは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上へのマクロファージの流入を減らす。いくつかの態様では、細胞外小胞またはＡＳＯは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上にてマクロファージの食作用を減らす。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1-1】ＮＬＰＲ３転写物を標的とする種々のＡＳＯ配列を収載する表である。表には、次の情報が含まれる（左から右へ）：（ｉ）説明、（ｉｉ）特定の設計または化学構造のないＡＳＯ配列、（ｉｉｉ）ＡＳＯ配列のみに指定された配列番号、（ｉｖ）ヌクレオチド数（ＮＴ）でのＡＳＯの長さ、（ｉｉ）ＮＬＰＲ３転写物配列（配列番号３）上の標的開始及び終了の位置。ＡＳＯは５’から３’である。化学構造における記号は次の通りである：ＮｂはＬＮＡを意味し、ｄＮはＤＮＡを意味し、５ＭｄＣは５－メチル－ｄＣを意味し、ＮｍはＭＯＥを意味し、ｓはホスホロチオエートを意味する。

【図1-2】（続き）

【図1-3】（続き）

【図2A】ヒト単球におけるＩＬ－１β産生のグラフ表示である。ＮＬＲＰ３経路はＬＰＳで３時間、ＡＴＰで３時間処理することによって各試料型で活性化した。次に、示されているように、試料をＭＣＣ９５０の漸増濃度（ｌｏｇ、μＭ）で処理し、ＩＬ－１βレベル（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。

【図2B】ヒトＭ０マクロファージにおけるＩＬ－１β産生のグラフ表示である。ＮＬＲＰ３経路はＬＰＳで３時間、ＡＴＰで３時間処理することによって各試料型で活性化した。次に、示されているように、試料をＭＣＣ９５０の漸増濃度（ｌｏｇ、μＭ）で処理し、ＩＬ－１βレベル（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。

【図2C】マウスＢＭＤＭにおけるＩＬ－１β産生のグラフ表示である。ＮＬＲＰ３経路はＬＰＳで３時間、ＡＴＰで３時間処理することによって各試料型で活性化した。次に、示されているように、試料をＭＣＣ９５０の漸増濃度（ｌｏｇ、μＭ）で処理し、ＩＬ－１βレベル（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。

【図3A】マウスの腹腔内ＬＰＳ負荷の投薬及び試料採取のスケジュールを示す予定表である。

【図3B】漸増量のＭＣＣ９５０の投与後のマウス血清における血清ＩＬ－１βレベルのグラフ表示である。

【図4A】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．１への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4B】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．３への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4C】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．４（図４Ｃ）への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4D】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．８への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4E】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．１１への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4F】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．１６への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4G】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．１９への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4H】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．２１への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4I】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．２９への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4J】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．３３への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4K】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．３５への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4L】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．４１への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4M】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．４３への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4N】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．４８への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4O】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．５５への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4P】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．５９への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4Q】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．６７への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4R】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．７０への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4S】ｍＮＬＲＰ３のＮｏ．７６への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4T】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．８３への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4U】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．８９への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図4V】ｍＮＬＲＰ３のＡＳＯのＮｏ．９８への曝露後のマウスＪ７７４．１細胞におけるマウスＮＬＲＰ３転写物のノックダウン（開始レベルに対するパーセントとして残りのＮＬＲＰ３転写物によって測定される）を示す。

【図5A】ＨＥＫ細胞におけるｍＮＬＲＰ３の発現を駆動するためのＨｉＢｉｔ融合マウスＮＬＲＰ３レポーター構築物の概略図である。

【図5B】ＡＳＯのＮｏ．１６、１９、７０、９８、及び４３への曝露後のＨＥＫ細胞におけるｍＮＬＲＰ３レポーターのノックダウンを示す。

【図6A】ＭＣＣ９５０を使用したＮＬＲＰ３阻害がマウスＢＭＤＭにおけるＩＬ－１ｂ分泌のレベルに及ぼす影響を示す。

【図6B】ＭＣＣ９５０を使用したＮＬＲＰ３阻害がマウスＢＭＤＭにおけるＩＬ－１ｂ分泌のレベルに及ぼす影響を示す。

【図6C】ＬＰＳ、ＡＴＰ、及び種々の濃度での選択されたｍＮＬＲＰ３のＡＳＯによる処理後の、ＢＭＤＭにおけるＩＬ－１ｂ分泌のグラフ表示である。

【図6D】ＬＰＳ、ＡＴＰ、及び種々の濃度での選択されたｍＮＬＲＰ３のＡＳＯによる処理後の、生存率のグラフ表示である。

【図7】［図７Ａ］マウスモデルでのＬＰＳ誘導性（図７Ａ）急性腹膜炎におけるＭＣＣ９５０を使用したＮＬＲＰ３阻害の結果を示す。［図７Ｂ］マウスモデルでのＬＰＳ誘導性（図７Ａ）急性腹膜炎におけるＭＣＣ９５０を使用したＮＬＲＰ３阻害の結果を示す。

【図8】［図８Ａ］ＬＰＳ誘導性急性腹膜炎マウスモデルの治療に使用されるＡＳＯを負荷したエクソソームについての各ＡＳＯ構築物のＮＴＡカウントのグラフ表示である。［図８Ｂ］ＬＰＳ誘導性急性腹膜炎マウスモデルの治療に使用されるＡＳＯを負荷したエクソソームについての各ＡＳＯ構築物のエクソソームあたりのＡＳＯ分子の数のグラフ表示である。［図８Ｃ］ＬＰＳ誘導性急性腹膜炎マウスモデルの治療に使用されるＡＳＯを負荷したエクソソームについての各ＡＳＯ構築物のＡＳＯ濃度のグラフ表示である。

【図9A】血清における（図９Ａ～９Ｂ及び９Ｅ）または腹腔洗浄（図９Ｃ～９Ｅ）によるマウスＮＬＲＰ３を標的とするエクソ・ＡＳＯの投与に続くＩＬ－１β誘導の低減を表すグラフである。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図9D】同上。

【図9E】同上。

【図10A】血清におけるマウスＮＬＲＰ３を標的とするエクソ・ＡＳＯの投与に続くＴＮＦαのレベルを表すグラフである。

【図10B】血清におけるマウスＮＬＲＰ３を標的とするエクソ・ＡＳＯの投与に続くＩＬ－６のレベルを表すグラフである。

【図10C】腹腔洗浄によるマウスＮＬＲＰ３を標的とするエクソ・ＡＳＯの投与に続くＴＮＦαのレベルを表すグラフである。

【図10D】腹腔洗浄によるマウスＮＬＲＰ３を標的とするエクソ・ＡＳＯの投与に続くＩＬ－６のレベルを表すグラフである。

【図11】５ｎＭ及び２０ｎＭの投与でヒトＮＬＲＰ３を標的とする１００の候補ＡＳＯによるＨＥＫレポーター細胞株におけるヒトＮＬＲＰ３発現のノックダウンパーセントを示す散布図である。

【図12A】Ａ～Ｃは、図１１で特定された上位３０のＡＳＯの漸増濃度の投与後のＨｉＢｉｔレポーターＨＥＫ細胞株を使用して測定したＮＬＲＰ３発現への影響を示す折れ線グラフである。

【図12B】同上。

【図12C】同上。

【図13A】２ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭのヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯスクランブル（Ｓｃｒ２）による処理に続く培養初代ヒトＭ０マクロファージについての平均ＩＬ－１β分泌パーセント及び細胞生存率を示す散布図である。

【図13B】２ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭのヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯ １６６４による処理に続く培養初代ヒトＭ０マクロファージについての平均ＩＬ－１β分泌パーセント及び細胞生存率を示す散布図である。

【図13C】２ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭのヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯ ３０９４）による処理に続く培養初代ヒトＭ０マクロファージについての平均ＩＬ－１β分泌パーセント及び細胞生存率を示す散布図である。

【図13D】２ｎＭ、１０ｎＭ、または５０ｎＭのヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯ ２６７２による処理に続く培養初代ヒトＭ０マクロファージについての平均ＩＬ－１β分泌パーセント及び細胞生存率を示す散布図である。

【図13E】特に、２ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【図13F】特に、２ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【図13G】特に、２ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【図13H】特に、１０ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【図13I】特に、１０ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【図13J】特に、１０ｎＭの濃度での各ヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯと接触した同じドナーからの細胞と、混ぜたＡＳＯと接触した細胞とを比較した、培養ヒトＭ２マクロファージにおけるＩＬ－１β分泌パーセントを示す折れ線グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0067】

本開示の特定の態様はＮＬＲＰ３アンタゴニストを含む細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームを対象とする。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物内の核酸配列に相補性である長さ１０～３０ヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列を含む。

【0068】

Ｉ． 定義
本説明がさらに容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して示されている。

【0069】

「ａ」または「ａｎ」実体という用語は、その実体の１以上を指し、例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は１以上のヌクレオチド配列を表すと理解されることに留意されるべきである。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。

【0070】

さらに、本明細書で使用されるときの「及び／または」は、もう一方の特徴または成分を伴った、または伴わない、２つの特定の特徴または成分のそれぞれの特定の開示として解釈される。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用されるとき「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用されるとき「及び／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）のそれぞれを包含するように意図される。

【0071】

本明細書のどこで態様が「含む」という言葉で説明されようと、そうでない場合は「から成る」及び／または「から本質的に成る」という用語で説明される類似の態様も提供されることが理解される。

【0072】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは当業者に本開示で使用される用語の多数の一般的な辞書を提供する。

【0073】

単位、接頭辞、及び記号は国際単位系（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲はその範囲を定義する数を含むものとする。別段の指示がない限り、ヌクレオチド配列は左から右に５’から３’の向きで書かれている。アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって有することができる本開示の種々の態様の制約ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は明細書全体を参照することによってさらに完全に定義される。

【0074】

「約」という用語は、およそ、大まかに、そばに、または領域内で、を意味するように本明細書で使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用されるとき、それは、説明される数値を超える、及びそれ未満の境界を伸展させることによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、例えば、１０％の上下（高いまたは低い）の変動によって明記される値を上回る、及び下回る数値を修飾することができる。例えば、「ＡＳＯは、ＡＳＯの投与後に細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質の発現を少なくとも約６０％低減する」と述べられている場合、ＮＬＲＰ３レベルは５０％～７０％の範囲で低減することを意味する。

【0075】

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＳＯ）という用語は、ヌクレオチド間結合を介して互いに共有結合している、天然に存在するヌクレオシドまたはその修飾形態のようなヌクレオシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。本開示に有用なＡＳＯは少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオシドを含む。ＡＳＯは標的核酸に少なくとも部分的に相補性であるので、ＡＳＯは標的核酸配列とハイブリッド形成する。

【0076】

「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は複数の核酸を包含するように意図される。いくつかの態様では、「核酸」または「ヌクレオチド」という用語は生体内または試験管内での標的配列、例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡを指す。この用語が標的配列における核酸またはヌクレオチドを指す場合、核酸またはヌクレオチドは細胞内で天然に存在する配列であり得る。他の態様では、「核酸」または「ヌクレオチド」は本開示のＡＳＯにおける配列を指す。この用語がＡＳＯにおける配列を指す場合、核酸またはヌクレオチドは天然に存在し得ない、すなわち、化学的に合成され得る、酵素的に生成され得る、組換えにより生成され得る、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、ＡＳＯにおける核酸またはヌクレオチドは、合成でまたは組換えで産生されるが、天然に存在する配列またはその断片ではない。いくつかの態様では、ＡＳＯにおける核酸またはヌクレオチドは、自然界で天然に存在しない少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含有するので、天然には存在しない。

【0077】

本明細書で使用されるとき「ヌクレオチド」という用語は、糖部分と、塩基部分と、ホスフェートまたはホスホロチオエートのヌクレオチド間連結基のような共有連結基（連結基）とを含むグリコシドを指し、ＤＮＡまたはＲＮＡのような天然に存在するヌクレオチド、及び修飾された糖部分及び／または塩基部分を含む、本明細書では「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる天然に存在しないヌクレオチドの双方を対象にする。本明細書では、単一ヌクレオチドは単量体またはユニットと呼ばれ得る。特定の態様では、「ヌクレオチド類似体」という用語は修飾された糖部分を有するヌクレオチドを指す。修飾された糖部分（例えば、ＬＮＡ）を有するヌクレオチドの非限定的な例は本明細書の他の場所に開示されている。他の態様では、「ヌクレオチド類似体」という用語は修飾された核酸塩基部分を有するヌクレオチドを指す。修飾された核酸塩基部分を有するヌクレオチドには、５－メチル－シトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、「ヌクレオチド」、「ユニット」及び「単量体」という用語は相互交換可能に使用される。ヌクレオチドまたは単量体の配列に言及する場合、言及されるのは、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵのような塩基の配列、及びそれらの類似体であることが認識されるであろう。

【0078】

本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、糖部分及び塩基部分を含むグリコシドを指すのに使用されるので、ＡＳＯのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合によって共有結合されるヌクレオチドユニットを指すときに使用することができる。バイオテクノロジーの分野では、「ヌクレオチド」という用語は核酸の単量体またはユニットを指すのに使用されることが多い。ＡＳＯの文脈では、「ヌクレオチド」という用語は、塩基のみ、すなわち、シトシン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、グアニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、アデニン（ＤＮＡ及びＲＮＡ）、チミン（ＤＮＡ）及びウラシル（ＲＮＡ）を含む核酸塩基配列を指すことができ、糖骨格とヌクレオチド間結合の存在が絶対的である。同様に、特にヌクレオチド間連結基の１以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は「ヌクレオシド」を指すことができる。例えば、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合でさえ、「ヌクレオチド」という用語を使用することができる。

【0079】

本明細書で使用されるとき「ヌクレオチドの長さ」という用語は所与の配列におけるヌクレオチド（単量体）の総数を意味する。例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０６の配列（配列番号１０１）は２０ヌクレオチドを有し；したがって、配列のヌクレオチドの長さは２０である。したがって、「ヌクレオチドの長さ」という用語は本明細書では「ヌクレオチド数」と相互交換可能に使用される。

【0080】

当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは５’末端基を含むことができるが、５’ヌクレオチド間連結基を含まない。

【0081】

本明細書に記載されている化合物はいくつかの不斉中心を含有することができ、光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、例えば、ラセミ体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物の形態で存在することができる。いくつかの態様では、不斉中心は不斉炭素原子であり得る。「不斉炭素原子」という用語は４つの異なる置換基を持つ炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレログ条約によれば、不斉炭素原子は「Ｒ」または「Ｓ」の配置にすることができる。

【0082】

本明細書で使用されるとき、「二環式糖」という用語は、４～７員環の２つの原子をつないで第２の環を形成して、二環式構造をもたらす架橋を含む４～７員環を含む修飾糖部分を指す。いくつかの態様では、架橋はＬＮＡヌクレオシドで観察されるように、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を接続する（すなわち、２’－４’架橋）。

【0083】

本明細書で使用されるとき、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンから成るポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は通常、アミノ酸に翻訳されないものの、コード領域の一部と見なすことができるが、隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）などはコード領域の一部ではない。コード領域の境界は通常、得られたポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドンと、得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンとによって決定される。

【0084】

本明細書で使用されるとき「非コード領域」という用語はコード領域ではないヌクレオチド配列を意味する。非コード領域の例には、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、非翻訳領域（「ＵＴＲ」）、非コードエクソンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一部のエクソンは、各転写物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の全体または一部であり得る。非翻訳領域は、転写物を効率的に翻訳し、翻訳速度と転写物の半減期を制御するために重要である。

【0085】

ヌクレオチド配列の文脈で使用される場合の「領域」という用語はその配列の区域を指す。例えば、「ヌクレオチド配列内の領域」または「ヌクレオチド配列の相補体内の領域」という表現は、ヌクレオチド配列より短いが、それぞれ特定のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補体の範囲内に位置する少なくとも１０ヌクレオチドより長い配列を指す。「部分配列（ｓｕｂ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語はヌクレオチド配列の領域を指すこともできる。

【0086】

「下流」という用語はヌクレオチド配列を指す場合、核酸またはヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の３’側に位置することを意味する。特定の態様では、下流のヌクレオチド配列は転写の開始点に続く配列に関係する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは転写開始部位の下流に位置する。

【0087】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。

【0088】

本明細書で使用されるとき、「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または関連するコード領域の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。調節領域には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ＵＴＲ、及びステム・ループ構造を挙げることができる。コード領域が真核細胞での発現を目的としている場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置する。

【0089】

本明細書で使用されるとき「転写物」という用語は、ＤＮＡの転写によって合成され、プロセシング後にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）になる、すなわち、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、及びプロセシングされたｍＲＮＡ自体になる一次転写物を指すことができる。「転写物」という用語は、「プレｍＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ」と相互交換可能に使用することができる。ＤＮＡ鎖が一次転写物に転写された後、新しく合成された一次転写物はいくつかの方法で修飾され、成熟した機能的な形態に変換されて、さまざまなタンパク質やｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのようなＲＮＡを作り出す。したがって、「転写物」という用語には、エクソン、イントロン、５’ＵＴＲ、及び３’ＵＴＲを含めることができる。

【0090】

本明細書で使用されるとき「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。これには、限定しないで、ポリヌクレオチドのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写及びｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が含まれる。発現は「遺伝子産物」を作り出す。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は遺伝子の転写によって生成される核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載されている遺伝子産物にはさらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化もしくはスプライシングによる核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質分解切断によるポリペプチドが含まれる。

【0091】

２以上の核酸の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応について比較した及び並べた（必要に応じてギャップを導入する）ときに、同一である、または同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２以上の配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列比較を得るために使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。

【0092】

配列比較アルゴリズムのそのような非限定的な例の１つはＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４－２２６８に記載され、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３－５８７７で変更され、かつＮＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＸＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２）に組み込まれているアルゴリズムである。特定の態様では、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２．ＢＬＡＳＴ－２，ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０）に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができ、ＡＬＩＧＮ，ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は配列を並べるのに使用することができる追加の公的に利用できるソフトウェアプログラムである。特定の態様では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または９０のギャップ加重及び１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して）決定される。特定の代替の態様では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））のアルゴリズムを組み込んでいるＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを使用して２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定することができる（例えば、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重及び１、２、３、４、５の長さ加重を使用して）。あるいは、特定の態様では、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の同一性パーセントはＭｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。例えば、同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用し、残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを持つＰＡＭ１２０を使用して決定することができる。当業者は、特定の配列比較ソフトウェアによって最大整列のための適切なパラメーターを決定することができる。特定の態様では、配列比較ソフトウェアの初期設定パラメーターが使用される。

【0093】

特定の態様では、第１のヌクレオチド配列の第２のヌクレオチド配列に対する同一性のパーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として算出され、その際、Ｙは第１及び第２の配列の配列比較において同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり（目視検査または特定の配列比較プログラムによって並べたとき）、Ｚは第２の配列における残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第１の配列の第２の配列に対する同一性パーセントは第２の配列の第１の配列に対する同一性パーセントよりも高いであろう。

【0094】

ポリヌクレオチド参照配列と整列する単一のポリヌクレオチド標的配列内のさまざまな領域は、それぞれ、それら自体の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は少数第２位で四捨五入されることが知られている。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられる一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることも知られている。

【0095】

本明細書で使用されるとき、「相同」及び「相同性」という用語は、「同一性」及び「同一」という用語と相互交換可能である。

【0096】

「その天然に存在する変異型」という用語は、例えば、マウス、サル、及びヒトのような哺乳動物のような定義された分類群内に天然に存在するＮＬＲＰ３ポリペプチド配列またはＮＬＲＰ３核酸配列（例えば、転写物）の変異型を指す。通常、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変異型」に言及する場合、その用語はまた、染色体の転座または複製によって染色体位置１ｑ４４にて見いだされる２４７、４１６、１５６～２４７、４４９、１０８でのＮＬＲＰ３をコードするゲノムＤＮＡ（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００００１．１１のヌクレオチド２４７、４１６、１５６～２４７、４４９、１０８）、及びそれに由来するｍＲＮＡのようなＲＮＡの任意の対立遺伝子変異型も包含することができる。「天然に存在する変異型」は、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する変異型も含むことができる。特定のポリペプチド配列に言及する場合、例えば、この用語はまた、タンパク質の天然に存在する形態を含み、したがって、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、グリコシル化、等のような同時修飾または翻訳後修飾によって処理され得る形態を含む。

【0097】

本開示のＡＳＯ（またはその領域）と、本明細書で開示されているもののような哺乳動物ＮＬＲＰ３（例えば、ＮＬＲＰ３遺伝子）をコードする核酸の標的領域との間の「相補性」の程度を決定する際に、「相補性」の程度（また、「相同性」または「同一性」）は、ＡＳＯ（またはその領域）の配列とそれと最もよく整列する標的領域（または標的領域の逆相補体）の配列との間の同一性パーセンテージ（または相同性パーセンテージ）として表される。パーセンテージは２つの配列間で同一である整列した塩基の数を数え、ＡＳＯ内の連続する単量体の総数で割り、１００を掛けることによって算出される。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、本開示のＡＳＯと標的領域との間でギャップ内の単量体の数が異なる領域ではなく、単にミスマッチであることが好ましい。

【0098】

本明細書で使用されるとき「相補体」という用語は参照配列に相補性の配列を示す。相補性は、それが２つのＤＮＡまたはＲＮＡの配列間で共有される特性であるようにＤＮＡの複製及び転写の基本原理であることが周知であるので、互いに逆平行に整列すると、配列の各位置でのヌクレオチド塩基は鏡を見て物事の逆を見るのと同じように相補性であろう。したがって、例えば、５’「ＡＴＧＣ」３’の配列の相補体は、３’「ＴＡＣＧ」５’または５’「ＧＣＡＴ」３’と書くことができる。本明細書で使用されるとき「逆相補体」、「逆相補性の」、及び「逆相補性」という用語は、「相補性」、「相補性の」、及び「相補性」という用語と相互交換可能である。いくつかの態様では、「相補性の」という用語は、ＮＬＲＰ３転写物内の連続する核酸配列に対する１００％の一致または相補性（すなわち、完全に相補性の）を指す。いくつかの態様では、「相補性」という用語は、ＮＬＲＰ３転写物内の連続する核酸配列に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の一致または相補性を指す。

【0099】

特定の配列のヌクレオチドに異なる番号を付けることができるけれども、２つの別個の核酸またはヌクレオチドの配列を参照する場合、「に対応している」及び「に対応する」という用語は、相同性及び／または機能性に基づいて互いに対応するまたは類似する配列の領域を明確にするために使用することができる。例えば、遺伝子転写物の異なるアイソフォームは、その番号付けが選択的スプライシング及び／または他の修飾に基づいてそれぞれのアイソフォームで異なることができるヌクレオチド配列の類似のまたは保存された部分を有することができる。加えて、核酸またはヌクレオチドの配列を特徴づける（例えば、遺伝子転写物、及び翻訳開始コドンから配列の番号付けを開始するかどうか、または５’ＵＴＲを含めるかどうか）ときに、異なる番号付けシステムを使用できることが認識されている。さらに、遺伝子または遺伝子転写物のさまざまな変異型の核酸またはヌクレオチドの配列は変化し得ることが認識されている。しかしながら、本明細書で使用されるとき、核酸またはヌクレオチドの配列の相同性及び／または機能性を共有する変異型の領域は互いに「対応する」と見なされる。例えば、配列番号１（「参照配列」）のヌクレオチドＸからＹに対応するＮＬＲＰ３転写物のヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチドＸからＹと同一の配列または同様の配列を有するＮＬＲＰ３転写物配列、例えば、ＮＬＲＰ３のプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡを指し、その際、Ｘは開始部位であり、Ｙは終止部位である（図１に示されるように）。当業者は、ＮＬＲＰ３転写物配列を配列番号１と整列させることによってＮＬＲＰ３転写物配列における対応するＸ及びＹの残基を特定することができる。

【0100】

「対応するヌクレオチド類似体」及び「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体及び天然に存在するヌクレオチドにおける核酸塩基が同じ対形成またはハイブリッド形成する能力を有することを示すように意図される。例えば、ヌクレオチドの２－デオキシリボース単位がアデニンに連結されている場合、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結されたペントース単位（２－デオキシリボースとは異なる）を含有する。

【0101】

ＡＳＯ化学の注釈は次の通りである：ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオチドはＯｘｙＢによって示され、その際、Ｂはチミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５－メチルシトシン（ＭＣ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）のようなヌクレオチド塩基を指定するので、ＯｘｙＡ、ＯｘｙＴ、ＯｘｙＭＣ、ＯｘｙＣ及びＯｘｙＧが含まれる。ＤＮＡヌクレオチドはＤＮＡｂによって示され、その際、低級塩基ｂはチミン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）、シトシン（Ｃ）、５－メチルシトシン（ＭＣ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）のようなヌクレオチド塩基を指定するので、ＤＮＡａ、ＤＮＡｔ、ＤＮＡ及びＤＮＡｇが含まれる。Ｃまたはｃの前の文字Ｍは５－メチルシトシンを示す。「ｓ」という文字はホスホロチオエートヌクレオチド間結合を示す。

【0102】

「ＡＳＯ番号」または「ＡＳＯ Ｎｏ．」という用語は本明細書で使用されるとき、成分、例えば、ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ）、核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、またはＭＣ）、及び主鎖構造（例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジエステル）の詳細な化学構造を有するヌクレオチド配列に与えられる固有の番号を指す。例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０６はＮＬＲＰ３－２０６（配列番号１０１）を指すことができる。

【0103】

「効力」は通常、特に明記しない限り、ＩＣ_５０またはＥＣ_５０の値としてμＭ、ｎＭ、またはｐＭで表される。効力は阻害率という点で表すこともできる。ＩＣ_５０は治療用分子の阻害濃度の中央値である。ＥＣ_５０はビヒクルまたは対照（例えば、生理食塩水）と比べた治療用分子の有効濃度の中央値である。機能的アッセイでは、ＩＣ_５０は生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写またはタンパク質発現を、治療用分子によって達成される生物学的応答の５０％まで低減する治療用分子の濃度である。機能的アッセイでは、ＥＣ_５０は生物学的応答、例えば、ｍＲＮＡの転写またはタンパク質発現の５０％を生じる治療用分子の濃度である。ＩＣ_５０またはＥＣ_５０は当該技術分野で知られているいくつもの手段によって計算することができる。

【0104】

本明細書で使用されるとき、例えば、ＮＬＲＰ３遺伝子転写物及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現を「阻害する」という用語は、細胞または組織におけるＮＬＲＰ３遺伝子転写物及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現を低減するＡＳＯを指す。いくつかの態様では、「阻害する」という用語はＮＬＲＰ３遺伝子転写物またはＮＬＲＰ３タンパク質の完全な阻害（１００％阻害または検出不可能なレベル）を指す。他の態様では、「阻害する」という用語は、細胞または組織におけるＮＬＲＰ３遺伝子転写物及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の阻害を指す。

【0105】

本明細書で使用されるとき、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は内部空間を囲い込む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞はそれらが由来する細胞よりも小さい直径を有するすべての膜結合小胞（例えば、エクソソーム、ナノ小胞）を含む。いくつかの態様では、細胞外小胞は直径が２０ｎＭ～１０００ｎＭの範囲であり、内部空間（すなわち、内腔）内で、細胞外小胞の外面に表示されて、及び／または膜をまたいでのいずれかで種々の高分子ペイロードを含むことができる。いくつかの態様では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、細胞外小胞は足場部分を含む。例として、かつ限定することなく、細胞外小胞には、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的操作または間接的操作による細胞由来の小胞（例えば、連続押出またはアルカリ溶液での処理による）、小胞化オルガネラ、及び生細胞により産生される小胞（例えば、直接原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合による）が含まれる。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植された組織もしくは器官、原核細胞または真核細胞、及び／または培養された細胞に由来することができる。いくつかの態様では、細胞外小胞は１以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって生成される。

【0106】

本明細書で使用されるとき、「エクソソーム」という用語は直径が２０～３００ｎｍ（例えば、４０～２００ｎｍ）の細胞外小胞を指す。エクソソームは、内部空間（すなわち、内腔）を囲い込む膜を含み、いくつかの態様では、直接の原形質膜出芽によって、または後期エンドソームと原形質膜との融合によって、細胞（例えば、産生細胞）から生成され得る。いくつかの態様では、エクソソームは足場部分を含む。以下に記載されているように、エクソソームは、産生細胞に由来することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、１以上の導入遺伝子産物を発現する細胞によって生成される。

【0107】

本明細書で使用されるとき、「ナノ小胞」という用語は、２０～２５０ｎｍ（例えば、３０～１５０ｎｍ）の直径を持つ細胞外小胞を指し、ナノ小胞が操作なしでは細胞によって産生されないように直接的操作または間接的操作によって細胞（例えば、産生細胞）から生成される。ナノ小胞を産生する細胞の適切な操作には、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ナノ小胞の産生は産生細胞の破壊をもたらすことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されているナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合によって産生細胞から導出される小胞を実質的に含まない。いくつかの態様では、ナノ小胞は足場部分を含む。ナノ小胞は、いったん産生細胞から導出されると、そのサイズ、密度、生化学的パラメーター、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離することができる。

【0108】

本明細書で使用されるとき、「表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム」（例えば、足場Ｘで操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）は、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの表面が操作前のＥＶ、例えば、エクソソームの表面、または天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームの表面と異なるようにその組成で修飾されたＥＶ、例えば、エクソソームの膜または表面を持つＥＶ、例えば、エクソソームを指す。操作することは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面、またはＥＶ、例えば、エクソソームの膜であり得るので、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面が変化する。例えば、膜はタンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成で修飾される。組成は、化学的な、物理的な、または生物学的な方法によって、または化学的な、物理的な、または生物学的な方法によって以前にまたは同時に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、または遺伝子工学によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。いくつかの態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に対して露出することができる、またはＥＶ、例えば、エクソソームの表面で露出された部分に対する固定点（付着）であり得る外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エクソソームが天然に発現しないタンパク質）またはその断片または変異型を含む。いくつかの態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に対して露出することができる、またはＥＶ、例えば、エクソソームの表面で露出された部分に対する固定点（付着）であり得る天然のエクソソームタンパク質（例えば、足場Ｘ）またはその断片または変異型のさらに高い発現（例えば、さらに高い数）を含む。

【0109】

本明細書で使用されるとき、「内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム」（例えば、足場Ｙで操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）は、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームの内腔が操作前のＥＶ、例えば、エクソソームの内腔、または天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームの内腔と異なるようにその組成で修飾されたＥＶ、例えば、エクソソームの膜または内腔を持つＥＶ、例えば、エクソソームを指す。操作することは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔が変化するようにＥＶ、例えば、エクソソームの内腔または膜にて直接的であり得る。例えば、膜はタンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成で修飾されるので、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔が修飾される。組成は、化学的な、物理的な、または生物学的な方法によって、または化学的な、物理的な、または生物学的な方法によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学によって、または遺伝子工学によって以前に修飾された細胞から生成されることによって変化させることができる。いくつかの態様では、内腔操作されたエクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔にて露出することができる、またはＥＶ、例えば、エクソソームの内層で露出された部分に対する固定点（付着）であり得る外因性タンパク質（すなわち、ＥＶ、例えば、エクソソームが天然に発現しないタンパク質）またはその断片または変異型を含む。いくつかの態様では、内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔に対して露出することができる、またはエクソソームの内腔で露出された部分に対する固定点（付着）であり得る天然のエクソソームタンパク質（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）またはその断片または変異型のさらに高い発現を含む。

【0110】

「修飾された」という用語は、本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームの文脈で使用される場合、ＥＶ、例えば、エクソソーム及び／または産生細胞の改変または操作を指すので、修飾されたＥＶ、例えば、エクソソームは天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームとは異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている修飾されたＥＶ、例えば、エクソソームは、天然に存在するＥＶ、例えば、エクソソームの膜と比べて、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物などの組成が異なる膜を含む（例えば、膜は天然のエクソソームタンパク質のさらに高い密度または数を含み、及び／または膜はエクソソームでは天然に見いだされないタンパク質、例えば、ＡＳＯを含む）。特定の態様では、膜へのそのような修飾は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、本明細書に記載されている表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）の外面を変化させる。特定の態様では、膜に対するそのような修飾は、ＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、本明細書に記載されている内腔操作されたＥＶ、例えば、エクソソーム）の内腔を変化させる。

【0111】

本明細書で使用されるとき、「足場部分」という用語は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または外面のいずれかにペイロードまたは目的の他の化合物（例えば、ＡＳＯ）を固定するのに使用することができる分子を指す。特定の態様では、足場部分は合成分子を含む。いくつかの態様では、足場部分は非ポリペプチド部分を含む。他の態様では、足場部分はＥＶ、例えば、エクソソームに天然に存在する脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。いくつかの態様では、足場部分はＥＶ、例えば、エクソソームに天然には存在しない脂質、炭水化物、またはタンパク質を含む。特定の態様では、足場部分は足場Ｘである。いくつかの態様では、足場部分は足場Ｙである。さらなる態様では、足場部分は、足場Ｘ及び足場Ｙの双方を含む。本開示とともに使用することができる他の足場部分の非限定的な例には：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ネプリライシン、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）；エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー１（ＥＮＰＰ１）；ニューロピリン－１（ＮＲＰ１）；ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン（ＭＦＧＥ８）、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂが挙げられる。

【0112】

本明細書で使用されるとき、「足場Ｘ」という用語はエクソソームの表面上で最近同定されているエクソソームタンパク質を指す。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９５，２９０号を参照のこと。足場Ｘタンパク質の非限定的な例には、プロスタグランジンＦ２受容体ネガティブレギュレーター（「ＰＴＧＦＲＮタンパク質」）；バシギン（「ＢＳＧタンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー２（「ＩＧＳＦ２タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（「ＩＧＳＦ３タンパク質」）；免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー８（「ＩＧＳＦ８タンパク質」）；インテグリンベータ１（「ＩＴＧＢ１タンパク質」）；インテグリンアルファ－４（「ＩＴＧＡ４タンパク質」）；４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（「ＳＬＣ３Ａ２タンパク質」）；ＡＴＰ輸送タンパク質のクラス（「ＡＴＰ１Ａ１タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ２タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ３タンパク質」、「ＡＴＰ１Ａ４タンパク質」、「ＡＴＰ１Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質」、「ＡＴＰ２Ｂタンパク質」）及びそれらの機能的な断片が挙げられる。いくつかの態様では、足場Ｘタンパク質は、タンパク質全体またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの外面または内腔表面上に別の部分を固定することができる最小断片）であり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは部分（例えば、ＡＳＯ）をエクソソームの外面または内腔表面に固定することができる。

【0113】

本明細書で使用されるとき、「足場Ｙ」という用語は、エクソソームの内腔内で新たに同定されたエクソソームタンパク質を指す。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開番号ＷＯ／２０１９／０９９９４２を参照のこと。足場Ｙタンパク質の非限定的な例には、ミリストイル化されたアラニンに富むプロテインキナーゼＣ基質（「ＭＡＲＣＫＳタンパク質」）；ミリストイル化されたアラニンに富むプロテインキナーゼＣ基質様１（「ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質」）；脳の酸可溶性タンパク質１（「ＢＡＳＰ１タンパク質」）が挙げられる。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質はタンパク質全体またはその断片（例えば、機能的断片、例えば、エクソソームの内腔表面に部分を固定することができる最小断片）であり得る。いくつかの態様では、足場Ｙは部分（例えば、ＡＳＯ）をＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面に固定することができる。いくつかの態様では、足場Ｙは部分（例えば、ＡＳＯ）をＥＶ、例えば、エクソソームの外面に固定することができる。

【0114】

本明細書中で使用されるとき、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、足場Ｘ、または足場Ｙ）の「断片」という用語は、天然に存在する配列よりも短いタンパク質のアミノ酸配列、天然に存在するタンパク質と比べてＮ及び／またはＣ末端を欠失した、またはタンパク質の一部を欠失したアミノ酸配列を指す。本明細書で使用されるとき、「機能的断片」という用語はタンパク質機能を保持するタンパク質断片を指す。したがって、いくつかの態様では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は部分をＥＶ、例えばエクソソームの内腔表面または外面に固定する能力を保持する。同様に、特定の態様では、足場Ｙタンパク質の機能的断片はＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面または外面に部分を固定する能力を保持する。断片が機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び、例えばＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との断片の融合を含む、ＥＶ、例えば、エクソソームのタンパク質含量を決定するための任意の既知の方法によって評価することができる。特定の態様では、足場Ｘタンパク質の機能的断片は、天然に存在する足場Ｘタンパク質の能力、例えば、部分を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％を保持する。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質の機能的断片は天然に存在する足場Ｙタンパク質の能力、例えば、別の分子を固定する能力の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％を保持する。

【0115】

本明細書で使用されるとき、分子（例えば、機能性分子、抗原、足場Ｘ及び／または足場Ｙ）の「変異型」という用語は、当該技術分野で既知の方法による比較の際に、別の分子と特定の構造的及び機能的同一性を共有する分子を指す。例えば、タンパク質の変異型は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再構成を含むことができる。

【0116】

いくつかの態様では、足場Ｘの変異型は、完全長の成熟したＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送タンパク質、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰ輸送タンパク質の断片（例えば、機能的断片）に対して少なくとも約７０％の同一性を有する変異型を含む。いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮの変異型またはＰＴＧＦＲＮの断片の変異型は、配列番号３０１に係るＰＴＧＦＲＮまたはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＢＳＧの変異型またはＢＳＧの断片の変異型は、配列番号３０３に係るＢＳＧまたはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ２の変異型またはＩＧＳＦ２の断片の変異型は、配列番号３０８に係るＩＧＳＦ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ３の変異型またはＩＧＳＦ３の断片の変異型は、配列番号３０９に係るＩＧＳＦ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ８の変異型またはＩＧＳＦ８の断片の変異型は、配列番号３０４に係るＩＧＳＦ８またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＩＴＧＢ１の変異型またはＩＴＧＢ１の断片の変異型は、配列番号３０５に係るＩＴＧＢ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＩＴＧＡ４の変異型またはＩＴＧＡ４の断片の変異型は、配列番号３０６に係るＩＴＧＡ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＳＬＣ３Ａ２の変異型またはＳＬＣ３Ａ２の断片の変異型は、配列番号３０７に係るＳＬＣ３Ａ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ１の変異型またはＡＴＰ１Ａ１の断片の変異型は、配列番号３１０に係るＡＴＰ１Ａ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ２の変異型またはＡＴＰ１Ａ２の断片の変異型は、配列番号３１１に係るＡＴＰ１Ａ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ３の変異型またはＡＴＰ１Ａ３の断片の変異型は、配列番号３１２に係るＡＴＰ１Ａ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ４の変異型またはＡＴＰ１Ａ４の断片の変異型は、配列番号３１３に係るＡＴＰ１Ａ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ｂ３の変異型またはＡＴＰ１Ｂ３の断片の変異型は、配列番号３１４に係るＡＴＰ１Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ１の変異型またはＡＴＰ２Ｂ１の断片の変異型は、配列番号３１５に係るＡＴＰ２Ｂ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ２の変異型またはＡＴＰ２Ｂ２の断片の変異型は、配列番号３１６に係るＡＴＰ２Ｂ２またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ３の変異型またはＡＴＰ２Ｂ３の断片の変異型は、配列番号３１７に係るＡＴＰ２Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ４の変異型またはＡＴＰ２Ｂ４の断片の変異型は、配列番号３１８に係るＡＴＰ２Ｂ４またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、本明細書で開示されている足場Ｘタンパク質の変異型または足場Ｘタンパク質の断片の変異型は、ＥＶ、例えば、エクソソームに特異的に向けられる能力を保持する。いくつかの態様では、足場Ｘは１以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0117】

いくつかの態様では、足場Ｙの変異型はＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１またはＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片に対して少なくとも７０％の同一性を有する変異型を含む。いくつかの態様では、ＭＡＲＣＫＳの変異型またはＭＡＲＣＫＳの断片の変異型は、配列番号４０１に係るＭＡＲＣＫＳまたはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＭＡＲＣＫＳＬ１の変異型またはＭＡＲＣＫＳＬ１の断片の変異型は、配列番号４０２に係るＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、ＢＡＳＰ１の変異型またはＢＡＳＰ１の断片の変異型は、配列番号４０３に係るＢＡＳＰ１またはその機能的断片と少なくとも約７０％，少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または、少なくとも約９９％の配列同一性を共有する。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質の変異型または足場Ｙタンパク質の断片の変異型はＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面を特異的に向けられる能力を保持する。いくつかの態様では、足場Ｙは１以上の変異、例えば、保存的アミノ酸置換を含む。

【0118】

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換される置換である。塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当該技術分野において定義されている。したがって、ポリペプチドにてアミノ酸が同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸で置換されている場合、その置換は保存的であると見なされる。別の態様では、ひと続きのアミノ酸は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似したひと続きで保守的に置き換えることができる。

【0119】

２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列間の「配列同一性パーセント」または「同一性パーセント」という用語は、２つの配列の最適な配列比較のために導入しなければならない追加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮に入れ、比較ウィンドウ上で配列によって共有される同一の一致位置の数を指す。一致した位置とは、標的配列と参照配列の双方で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が提示されている任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないので、標的配列で提示されるギャップはカウントされない。同様に、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、参照配列に提示されたギャップはカウントされない。

【0120】

「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、双方の配列において同一のアミノ酸残基または核酸塩基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。配列の比較及び２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用及びダウンロード用の双方で容易に入手可能なソフトウェアを使用して達成されてもよい。好適なソフトウェアプログラムは、さまざまな情報源から、タンパク質とヌクレオチドの配列の双方の配列比較に利用できる。配列同一性パーセントを決定するのに好適なプログラムの１つは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴ Ｗｅｂサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なプログラムのＢＬＡＳＴスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのアルゴリズムのいずれかを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するのに使用される一方で、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するのに使用される。他の好適なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であるＮｅｅｄｌｅ，Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ，Ｗａｔｅｒ，ｏｒ Ｍａｔｃｈｅｒであり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）からも入手できる。

【0121】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの参照配列と整列する単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの標的配列内のさまざまな領域は、それぞれ、それら自体の配列同一性パーセントを有することができる。配列同一性パーセント値は少数第２位で四捨五入されることが知られている。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられる一方で、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることも知られている。

【0122】

当業者は、配列同一性パーセントの計算のための配列比較の生成が、一次配列データによって排他的に決定される二元配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列の配列比較は複数の配列の配列比較から導き出すことができる。複数の配列の配列比較を生成するための好適なプログラムの１つは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手できるＣｌｕｓｔａｌＷ２である。もう１つの好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手できるＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２とＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから代替的に入手できる。

【0123】

配列の配列比較は、配列データを、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、または系統発生データのような異種情報源からのデータと統合することによって生成することができることも理解されるであろう。異種データを統合して多重配列の配列比較を生成するのに好適なプログラムはｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手できるＴ－Ｃｏｆｆｅｅであり、例えば、ＥＢＩから代替的に入手できる。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的な配列比較は、自動または手動のいずれかでキュレートされてもよいことも理解されるであろう。

【0124】

ポリヌクレオチド変異型は、コード領域、非コード領域、またはその双方に改変を含有することができる。一態様では、ポリヌクレオチド変異型は、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変化させない改変を含有する。別の態様では、ヌクレオチド変異型は、遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって生成される。他の態様では、５～１０、１～５、または１～２のアミノ酸が任意の組み合わせで置換され、欠失し、または付加されている変異型。種々の理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡのコドンを他の宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に変更する）ポリヌクレオチド変異型を作り出すことができる。

【0125】

天然に存在する変異型は「対立遺伝子変異型」と呼ばれ、生物の染色体上の特定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異型は、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドのレベルのいずれかで変化することができ、本開示に含まれる。あるいは、天然に存在しない変異型は、突然変異誘発技術によって、または直接合成によって作り出すことができる。

【0126】

タンパク質工学及び組換えＤＮＡ技術の既知の方法を使用して、ポリペプチドの特性を改善するまたは改変するために変異型を生成することができる。例えば、生物学的機能を実質的に失うことなく、分泌されたタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１以上のアミノ酸を欠失させることができる。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＲｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４－２９８８（１９９３）は、３、８、または２７のアミノ末端アミノ酸残基を欠失させた後でさえ、ヘパリン結合活性を有する変異型ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンガンマは、このタンパク質のカルボキシ末端から８～１０のアミノ酸残基を欠失させた後、最大１０倍高い活性を示した。（Ｄｏｂｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９－２１６（１９８８）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。

【0127】

さらに、豊富な証拠は、変異型が天然に存在するタンパク質と同様の生物活性を保持することが多いことを実証している。例えば、Ｇａｙｌｅ及び共同研究者（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５－２２１１１，（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ－１ａの広範な突然変異分析を行った。彼らは無作為突然変異誘発を使用して、分子の全長にわたって変異型ごとに平均２．５アミノ酸の変化を示す３，５００を超える個々のＩＬ－１ａ突然変異型を生成した。考えられるすべてのアミノ酸位置で複数の突然変異を調べた。研究者らは、「分子のほとんどは、［結合活性または生物活性］にほとんど影響を与えることなく改変されてもよい」ことを見いだした。（要約を参照）実際、調べた３，５００を超えるヌクレオチド配列のうち２３の固有のアミノ酸配列のみが、野生型とは活性が大幅に異なるタンパク質を作り出した。

【0128】

上記のように、ポリペプチド変異型には、例えば、修飾されたポリペプチドが含まれる。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＭｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６：２７０－７９，（２０１０））、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移－ＲＮＡ介在性付加が挙げられる。いくつかの態様では、足場Ｘ及び／または足場Ｙは任意の好都合な位置で修飾される。

【0129】

本明細書で使用されるとき、「に連結される」または「にコンジュゲートされる」という用語は相互交換可能に使用され、第１の部分と第２の部分、例えば、それぞれ足場ＸとＡＳＯ、例えば、細胞外小胞の中または上に発現される足場部分とＡＳＯ、及び例えば、細胞外小胞の内腔表面内または外面上の、それぞれ足場Ｘ（例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質）とＡＳＯの間にそれぞれ形成される共有結合または非共有結合を指す。

【0130】

「被包された」という用語、またはこの用語の文法的に異なる形態（例えば、被包化、または被包すること）は、２つの部分を化学的にまたは物理的に連結せずに第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム）の内部に第１の部分を有する状態またはプロセスを指す。いくつかの態様では、「被包された」という用語は、「の内腔の中で」と相互交換可能に使用することができる。第１の部分（例えば、ＡＳＯ）を第２の部分（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソーム）に被包する非限定的な例は本明細書の他の場所に開示されている。

【0131】

本明細書で使用されるとき、「産生細胞」という用語は、ＥＶ、例えば、エクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、試験管内で培養された細胞、または生体内での細胞であり得る。産生細胞には、ＥＶ、例えば、エクソソームを生成するのに効果的であることが知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪間葉系幹細胞、及びＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、産生細胞は抗原提示細胞ではない。いくつかの態様では、産生細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、クッパー・ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。いくつかの態様では、本開示で有用なＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面に露出したＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの分子に抗原を運ばないが、代わりに、足場Ｘ及び／または足場Ｙへの結合によってＥＶ、例えば、エクソソームの内腔またはＥＶ、例えば、エクソソームの表面に抗原を運ぶことができる。

【0132】

本明細書で使用されるとき、「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」という用語は相互交換可能に使用され、所望のＥＶ調製物の精製、例えば、選択または濃縮の１以上のプロセスを経験している所望のＥＶの調製（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）の状態を指す。いくつかの態様では、本明細書で使用されるとき単離することまたは精製することは、産生細胞を含有する試料からＥＶを取り出す、部分的に取り出す（例えば、画分）プロセスである。いくつかの態様では、単離されたＥＶ組成物は検出可能な望ましくない活性を有さない、または代わりに、望ましくない活性のレベルもしくは量は許容されるレベルもしくは量である、もしくはそれを下回る。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望のＥＶの量及び／または濃度を有する。他の態様では、単離されたＥＶ組成物は、組成物が得られる出発材料（例えば、産生細胞調製物）と比べて濃縮される。この濃縮は、出発材料と比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は残留する生物学的産物を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離されたＥＶ調製物は、いかなる汚染生物物質も１００％含まない、９９％含まない、９８％含まない、９７％含まない、９６％含まない、９５％含まない、９４％含まない、９３％含まない、９２％含まない、９１％含まない、または９０％含まない。残留生物学的産物は、非生物物質（化学物質を含む）または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的産物を実質的に含まないことはまた、ＥＶ組成物が検出可能な産生細胞を含有しないことと、ＥＶのみが検出可能であることとを意味することができる。

【0133】

本明細書で使用されるとき、「ペイロード」という用語はＥＶと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する薬剤を指す。ＥＶ、例えば、エクソソームに含めることができるペイロードの非限定的な例はＡＳＯである。ＥＶ、例えば、エクソソーム及び／または産生細胞に導入することができるペイロードには、例えば、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含む、または転写を妨害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡの分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのような制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むまたは翻訳を妨害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、小分子（例えば、小分子薬物及び毒素）のような薬剤が挙げられる。特定の態様では、ペイロードはＡＳＯを含む。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、天然であろうと、または部分的にもしくは全体的に合成で作られようと、そうでなかろうと、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質も網羅する。「抗体」はさらに、抗原を特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するフレームワーク領域を含むポリペプチドを含む。本明細書で使用されるとき、「抗原」という用語は、対象に導入されるとそれ自体に対する免疫応答（細胞性または体液性）を引き出す任意の薬剤を指す。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び組換え抗体、それらの断片を含むことを意味し、さらに、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ１）_２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドのような、単鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、マウス－ヒト抗体、マウス－霊長類抗体、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片を含む。抗体は、それらが所望の生物活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。

【0134】

「個体」「対象」「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用され、診断、処置または治療が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載されている組成物及び方法は、ヒトの治療及び獣医学的用途の双方に適用可能である。いくつかの態様では、対象は哺乳動物であり、他の態様では、対象はヒトである。本明細書で使用されるとき、「哺乳動物対象」には、限定しないでヒト、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）を含むすべての哺乳動物が含まれる。

【0135】

「医薬組成物」という用語は、有効成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ組成物が投与される対象に対して許容できない程度に毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は無菌であり得る。

【0136】

本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」という用語は、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）の濃度パーセンテージによる１０％未満の高分子を含むことを意味する。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％（ｍ／ｖ）未満の高分子を含有してもよい。

【0137】

本明細書で使用されるとき、「高分子」という用語は、核酸、混入したタンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。

【0138】

本明細書で使用されるとき、「従来のエクソソームタンパク質」という用語は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクタドヘリン（ＭＦＧＥ８）、ＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、その断片、またはそれに結合するペプチドを含むが、これらに限定されない、エクソソームに富むことが以前に知られているタンパク質を意味する。

【0139】

本明細書で使用されるとき「投与すること」は薬学的に許容される経路を介して本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを含む組成物を対象に与えることを意味する。投与の経路は、例えば、静脈内注射及び静脈内注入のような静脈内投与であり得る。投与の追加経路には、例えば、皮下での、筋肉内での、経口での、経鼻での、及び肺への投与が挙げられる。ＥＶ、例えば、エクソソームは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与することができる。

【0140】

例えば、ＡＳＯまたは細胞外小胞の、本明細書で開示されているような「有効量」は、具体的に述べられた目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記述された目的に関連して経験的なかつ日常的な方法で決定することができる。

【0141】

本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療」または「治療すること」は、例えば、疾患または状態の重症度の減少；疾患の経過期間の短縮；疾患または状態と関連する１つ以上の症状の改善または排除；疾患または状態を伴う対象にとっての有益な効果の提供を指し、必ずしも疾患または状態の治癒を必要としない。この用語はまた、疾患または状態またはその症状の予防または防止も含む。一態様では、「治療すること」または「治療」は、造血の誘導を必要とする対象にてそれを行うことを含む。いくつかの態様では、疾患または状態は造血またはその欠乏に関連する。特定の態様では、疾患または状態はがんである。いくつかの態様では、治療することは、がんを有する対象における造血を増強し、その際、増強された造血は、対象における１以上の免疫細胞の増殖及び／または分化の増加を含む。

【0142】

本明細書で使用されるとき「防止する」または「防止すること」は特定の転帰の発生または重症度を減らすまたは軽減することを指す。いくつかの態様では、転帰を防止することは予防的治療を介して達成される。いくつかの態様では、本明細書に記載されているＡＳＯを含むＥＶ、例えば、エクソソームは予防的に対象に投与される。いくつかの態様では、対象はがんを発症するリスクがある。いくつかの態様では、対象は造血系疾患を発症するリスクがある。

【0143】

ＩＩ． アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
本開示は、哺乳動物ＮＬＲＰ３をコードする核酸分子、例えば、ＮＬＲＰ３核酸、例えば、ＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡを含むＮＬＲＰ３転写物、及びＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ、または哺乳動物ＮＬＲＰ３をコードするそのような核酸分子の天然に存在する変異型の機能を調節するのに使用するためにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を採用する。本開示の文脈における「ＡＳＯ」という用語は、２以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。

【0144】

ＡＳＯは、長さが１０～２０、１４～２０、１６～２０、または１５～２５ヌクレオチドのような約１０～約３０の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、ＡＳＯは２０ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１８ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１９ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１７ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１６ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１５ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１４ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１３ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１２ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１１ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは１０ヌクレオチドの長さである。

【0145】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、長さが約１０～約５０ヌクレオチド、例えば、約１０～約４５、約１０～約４０、約１０または約３５、または約１０～約３０の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、ＡＳＯは２１ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２２ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２３ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２４ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２５ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２６ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２７ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２８ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは２９ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３０ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３１ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３２ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３３ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３４ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３５ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３６ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３７ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３８ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは３９ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４０ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４１ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４２ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４３ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４４ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４５ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４６ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４７ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４８ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは４９ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、ＡＳＯは５０ヌクレオチドの長さである。

【0146】

本明細書で使用されるとき「アンチセンスＡＳＯ」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、及び「オリゴマー」という用語は、「ＡＳＯ」という用語と相互交換可能である。

【0147】

配列番号への言及には、特定の核酸塩基配列が含まれるが、任意の設計または完全な化学構造は含まれない。さらに、本明細書の図に開示されているＡＳＯは、代表的な設計を示すが、別段の指示がない限り、図に示されている特定の設計に限定されない。例えば、特許請求の範囲（または本明細書）が配列番号１０１に言及する場合、それは配列番号１０１のヌクレオチド配列のみを含む。本明細書で開示されている任意のＡＳＯの設計は、配列番号ＸＸとして書くことができ、その際、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、５’末端から１番目のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、及びのＮ番目のヌクレオチドのそれぞれは、修飾されたヌクレオチド、例えば、ＬＮＡであり、かつ他のヌクレオチドはそれぞれ、修飾されていないヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）である。

【0148】

種々の態様では、本開示のＡＳＯはＲＮＡ（ユニット）を含まない。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上のＤＮＡユニットを含む。一態様では、本開示に係るＡＳＯは線形分子である、または線形分子として合成される。いくつかの態様では、ＡＳＯは一本鎖分子であり、例えば、同じＡＳＯ内の同等の領域（すなわち、二本鎖）に相補性である、例えば、少なくとも３、４、または５の連続するヌクレオチドの短い領域を含まない－この点で、ＡＳＯは（本質的に）二本鎖ではない。いくつかの態様では、ＡＳＯは本質的に二本鎖ではない。いくつかの態様では、ＡＳＯはｓｉＲＮＡではない。種々の態様では、本開示のＡＳＯは連続するヌクレオチド領域から完全に成ることができる。したがって、いくつかの態様では、ＡＳＯは実質的に自己相補性ではない。

【0149】

他の態様では、本開示はＡＳＯの断片を含む。例えば、本開示は、本明細書で開示されているＡＳＯの少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも２つの連続するヌクレオチド、少なくとも３つの連続するヌクレオチド、少なくとも４つの連続するヌクレオチド、少なくとも５つの連続するヌクレオチド、少なくとも６つの連続するヌクレオチド、少なくとも７つの連続するヌクレオチド、少なくとも８つを含む。連続するヌクレオチド、または少なくとも９つの連続するヌクレオチドを含む。本明細書で開示されている配列のいずれかの断片は本開示の一部として企図される。

【0150】

ＩＩ．Ａ． 標的
好適には、本開示のＡＳＯは、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡまたはＮＬＲＰ３タンパク質の発現を下方調節する（例えば、減らすまたは除去する）ことができる。この点で、本開示のＡＳＯは通常、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、免疫細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、及び／またはＴ細胞）にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡのレベルの低減を介してＮＬＲＰ３インフラマソームの形成を阻止するのでその活性を遮断することができる。特に、本開示は、ＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡの１以上の領域（例えば、イントロン領域、エクソン領域、及び／またはエクソン・イントロン接合領域）を標的とするＡＳＯを対象とする。別段の指示がない限り、本明細書で使用されるとき「ＮＬＲＰ３」という用語は、１以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＬＲＰ３を指すことができる。

【0151】

ＮＬＲＰ３（ＮＬＲＰ３）はＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３としても知られている。ＮＬＲＰ３／ＮＬＲＰ３の同義語が知られており、それらにはＮＬＲＰ３；Ｃ１ｏｒｆ７；ＣＩＡＳ１；ＮＡＬＰ３；ＰＹＰＡＦ１；ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン、ロイシンリッチ反復及びパイリンドメイン含有３；低温誘導自己炎症性症候群１タンパク質；クリオピン；ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ及びＰＹＤドメイン含有タンパク質３；アンジオテンシン／バソプレシン受容体ＡＩＩ／ＡＶＰ様；キャタピラータンパク質１．１；ＣＬＲ１．１；低温誘導自己炎症性症候群１タンパク質；及びＰＹＲＩＮ含有ＡＰＡＦ１様タンパク質１が含まれる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子の配列は公表されているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＣ＿０００００１．１１：２４７４１６１５６－２４７４４９１０８のもとで見いだすことができる。ヒトＮＬＲＰ３遺伝子は、染色体位置１ｑ４４の２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８に見いだされる。

【0152】

ヒトＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡ転写物の配列（配列番号１）は、染色体１ｑ４４の残基２４７，４１６，１５６～２４７，４４９，１０８の逆相補体に相当する。ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０７９８２１．２）は、配列番号３のヌクレオチド「ｔ」がｍＲＮＡでは「ｕ」として示されていることを除いて配列番号３（表１）で提供される。ヒトＮＬＲＰ３タンパク質の配列は、公表されている受入番号：Ｑ９６Ｐ２０（標準配列、配列番号１；表１）、Ｑ９６Ｐ２０－２（配列番号４）、Ｑ９６Ｐ２０－３（配列番号５）、Ｑ９６Ｐ２０－４（配列番号６）、Ｑ９６Ｐ２０－５（配列番号７）、及びＱ９６Ｐ２０－６（配列番号８）のもとで見いだすことができ、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0153】

ヒトＮＬＲＰ３の遺伝子産物の天然変異型が知られている。例えば、ヒトＮＬＲＰ３タンパク質の天然変異型は、Ｄ２１Ｈ、Ｉ１７４Ｔ、Ｖ２００Ｍ、Ｒ２６２Ｌ、４２６２Ｐ、Ｒ２６２Ｗ、Ｌ２６６Ｈ、Ｄ３０５Ｇ、Ｄ３０５Ｎ、Ｌ３０７Ｐ、Ｑ３０８Ｋ、Ｆ３１１Ｓ、Ｔ３５０Ｍ、Ａ３５４Ｖ、Ｌ３５５Ｐ、Ｅ３５６Ｄ、Ｈ３６０Ｒ、Ｔ４０７Ｐ、Ｔ４３８Ｉ、Ｔ４３８Ｎ、Ａ４４１Ｔ、Ａ４４１Ｖ、Ｒ４９０Ｋ、Ｆ５２５Ｃ、Ｆ５２５Ｌ、Ｇ５７１Ｒ、Ｙ５７２Ｃ、Ｆ５７５Ｓ、Ｅ６２９Ｇ、Ｌ６３４Ｆ、Ｍ６６４Ｔ、Ｑ７０５Ｋ、Ｙ８６１Ｃ、及びＲ９２０Ｑ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１以上のアミノ酸置換を含有することができる。選択的スプライシングから生じるヒトＮＬＲＰ３タンパク質の追加の変異型も当該技術分野で知られている。ＮＬＲＰ３アイソフォーム１（識別子：ＵｎｉＰｒｏｔのＱ９６Ｐ２０－２）は、標準配列（配列番号３）と以下：配列番号３と比べて残基７２１～７７７及び８３６～８９２の欠失のように異なる。ＮＬＲＰ３アイソフォーム３（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－３）の配列は、標準配列（配列番号３）と以下：配列番号３と比べて残基７２０～１０３６の欠失のように異なる。ＮＬＲＰ３アイソフォーム４（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－４）の配列は標準配列（配列番号３）とは以下：配列番号３と比べて残基７２１～７７７の欠失のように異なる。ＮＬＲＰ３アイソフォーム５（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－５）の配列は標準配列（配列番号３）とは以下：配列番号３と比べて残基８３６～８９２の欠失のように異なる。ＮＬＲＰ３アイソフォーム６（識別子：Ｑ９６Ｐ２０－６）の配列は標準配列（配列番号３）とは以下：配列番号３と比べて残基７７６～７９６の欠失のように異なる。したがって、本開示のＡＳＯは、ＮＬＲＰ３の天然変異型タンパク質の発現を減らすまたは阻害するように設計することができる。

【0154】

ＡＳＯの標的核酸配列の例はＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡである。配列番号１は、ヒトＮＬＲＰ３ゲノム配列（すなわち、染色体１ｑ４４のヌクレオチド２４７、４１６、１５６～２４７、４４９、１０８の逆相補体）を表す。配列番号１は、配列番号１のヌクレオチド「ｔ」がプレｍＲＮＡにおいて「ｕ」として示されることを除いてＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡ配列と同一である。特定の態様では、「標的核酸」はＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸または天然に存在するその変異型のイントロン、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡを含む。特定の態様では、「標的核酸」はＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸または天然に存在するその変異型のエクソン領域、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡを含む。さらに他の態様では、「標的核酸」は、ＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸または天然に存在するその変異型のエクソン・イントロン接合部、及びそれに由来するＲＮＡ核酸、例えば、プレｍＲＮＡを含む。いくつかの態様では、例えば、研究または診断において使用される場合、「標的核酸」は、上記のＤＮＡまたはＲＮＡの核酸標的に由来するｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。ＮＬＲＰ３プレｍＲＮＡによってコードされるヒトＮＬＲＰ３タンパク質配列は配列番号３として示される。他の態様では、標的核酸はＮＬＲＰ３タンパク質をコードする核酸または天然に存在するその変異型の非翻訳領域、例えば５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはその双方を含む。

【0155】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１のイントロン内の領域とハイブリッド形成する。特定の態様では、本開示のＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１のエクソン内の領域とハイブリッド形成する。他の態様では、本開示のＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１のエクソン・イントロン接合部内の領域とハイブリッド形成する。いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１内の領域（例えば、イントロン、エクソン、またはエクソン・イントロン接合部）とハイブリッド形成し、その際、ＡＳＯは本明細書の他の場所に記載されているような式：５’Ａ－Ｂ－Ｃ３’に係る設計を有する。

【0156】

いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３タンパク質の特定のアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１）をコードするｍＲＮＡを標的とする。いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３タンパク質のすべてのアイソフォームを標的とする。他の態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３タンパク質の２つのアイソフォーム（例えば、アイソフォーム１とアイソフォーム２、アイソフォーム３とアイソフォーム４、及びアイソフォーム５とアイソフォーム６）を標的とする。

【0157】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１に対応する領域内の核酸配列に相補性である連続するヌクレオチド配列（例えば、長さ１０～３０ヌクレオチド、例えば、長さ２０ヌクレオチド）を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物（「標的領域」）の核酸配列または配列内の領域とハイブリッド形成する隣接ヌクレオチド配列を含み、その際、核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１～５３４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド４４８～２１９３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２１２５～３０３６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３９９０；または（ｖ）配列番号３の３９９６～４４５６に対応し、任意で、ＡＳＯは本明細書（例えば、セクションＩＩ．Ｇ）に記載されている設計の１つまたは本明細書の他の場所に示されている化学構造を有する。

【0158】

いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物の核酸配列またはその配列内の領域（「標的領域」）とハイブリッド形成する連続するヌクレオチド配列を含み、その際、核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１０６～３３４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６４８～２１１３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２２５～２９５６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド２９８７～３８１０；または（ｖ）配列番号３の３９９６～４３７６に対応し、任意で、ＡＳＯは本明細書に記載されている設計の１つまたは本明細書の他の場所に示される化学構造を有する。

【0159】

いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物の核酸配列またはその配列内の領域（「標的領域」）とハイブリッド形成する連続するヌクレオチド配列を含み、その際、核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１５６～２８４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド６９８～２０６３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２２７５～２９０６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０３７～３７６０；または（ｖ）配列番号３の４０４６～４３２６に対応し、任意で、ＡＳＯは本明細書に記載されている設計の１つまたは本明細書の他の場所に示される化学構造を有する。

【0160】

いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物の核酸配列またはその配列内の領域（「標的領域」）とハイブリッド形成する連続するヌクレオチド配列を含み、その際、核酸配列は、（ｉ）配列番号３のヌクレオチド１９６～２４４；（ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド７３８～２００３；（ｉｉｉ）配列番号３のヌクレオチド２３１５～２８６６；（ｉｖ）配列番号３のヌクレオチド３０７７～３７２０；または（ｖ）配列番号３の４０８６～４２８６に対応し、任意で、ＡＳＯは本明細書（例えば、セクションＩＩ．Ｇ）に記載されている設計の１つまたは本明細書の他の場所に示される化学構造を有する。

【0161】

いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２０６～２２５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０６；配列番号１０１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２０８～２２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０８；配列番号１０２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２１４～２３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２１４；配列番号１０３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド７４８～７６７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－７４８；配列番号１０４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８２５～８４４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８２５；配列番号１０５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９２～９１１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９２；配列番号１０６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９８～９１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９８；配列番号１０７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９９～９１８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９９；配列番号１０８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９００～９１９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９００；配列番号１０９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９０２～９２１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９０２；配列番号１１０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９０３～９２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９０３；配列番号１１１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９５４～９７３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９５４；配列番号１１２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６０～９７９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６０；配列番号１１３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６４～９８３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６４；配列番号１１４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６６～９８５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６６；配列番号１１５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６９～９８８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６９；配列番号１１６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９７０～９８９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９７０；配列番号１１７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９７１～９９０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９７１；配列番号１１８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０１６～１０３５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０１６；配列番号１１９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０２１～１０４０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０２１；配列番号１２０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０２８～１０４７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０２８；配列番号１２１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１０３～１１２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１０３；配列番号１２２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１０８～１１２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１０８；配列番号１２３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１１３～１１３２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１１３；配列番号１２４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１５９～１１７８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１５９；配列番号１２５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１７３～１１９２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１７３；配列番号１２６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１９７～１２１６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１９７；配列番号１２７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２０４～１２２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２０４；配列番号１２８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２２７～１２４６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２２７；配列番号１２９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２３２～１２５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２３２；配列番号１３０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２３９～１２５８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２３９；配列番号１３１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４０～１２５９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４０；配列番号１３２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４１～１２６０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４１；配列番号１３３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４２～１２６１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４２；配列番号１３４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３１３～１３３２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３１３；配列番号１３５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３１４～１３３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３１４；配列番号１３６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４１～１３６０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４１；配列番号１３７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４３～１３６２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４３；配列番号１３８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４６～１３６５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４６；配列番号１３９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１４９１～１５１０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１４９１；配列番号１４０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１５６１～１５８０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１５６１；配列番号１４１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１５６８～１５８７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１５６８；配列番号１４２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６６４～１６８３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６６４；配列番号１４３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７０～１６８９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７０；配列番号１４４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７６～１６９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７６；配列番号１４５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７８～１６９７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７８；配列番号１４６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８０～１６９９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８０；配列番号１４７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８１～１７００（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８１；配列番号１４８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８２～１７０１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８２；配列番号１４９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８８～１７０７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８８；配列番号１５０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６９３～１７１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６９３；配列番号１５１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７０４～１７２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７０４；配列番号１５２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７１８～１７３７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７１８；配列番号１５３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７２０～１７３９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７２０；配列番号１５４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７２３～１７４２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７２３；配列番号１５５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１８３７～１８５６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１８３７；配列番号１５６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１９３２～１９５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１９３２；配列番号１５７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１９９３～２０１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１９９３；配列番号１５８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２３２５～２３４４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２３２５；配列番号１５９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２４３２～２４５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２４３２；配列番号１６０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２４７２～２４９１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２４７２；配列番号１６１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２５４３～２５６２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２５４３；配列番号１６２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６３８～２６５７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６３８；配列番号１６３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６３９～２６５８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６３９；配列番号１６４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６６７～２６８６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６６７；配列番号１６５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６７２～２６９１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６７２；配列番号１６６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６９９～２７１８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６９９；配列番号１６７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７５０～２７６９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７５０；配列番号１６８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７５５～２７７４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７５５；配列番号１６９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７６０～２７７９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７６０；配列番号１７０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２８３０～２８４９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２８３０；配列番号１７１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２８３６～２８５５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２８３６；配列番号１７２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３０８７～３１０６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３０８７；配列番号１７３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３０９４～３１１３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３０９４；配列番号１７４）


に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３１０９～３１２８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３１０９；配列番号１７５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３１２０～３１３９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３１２０；配列番号１７６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３２１２～３２３１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３２１２；配列番号１７７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４７６～３４９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４７６；配列番号１７８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８１～３５００（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８１；配列番号１７９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８８～３５０７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８８；配列番号１８０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８９～３５０８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８９；配列番号１８１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４９３～３５１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４９３；配列番号１８２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４９８～３５１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４９８；配列番号１８３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５００～３５１９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５００；配列番号１８４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０２～３５２１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０２；配列番号１８５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０３～３５２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０３；配列番号１８６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０４～３５２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０４；配列番号１８７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０８～３５２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０８；配列番号１８８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５１４～３５３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５１４；配列番号１８９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５６１～３５８０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５６１；配列番号１９０）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５８０～３５９９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５８０；配列番号１９１）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５８５～３６０４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５８５；配列番号１９２）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５９３～３６１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５９３；配列番号１９３）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５９８～３６１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５９８；配列番号１９４）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６５２～３６７１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６５２；配列番号１９５）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６７６～３６９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６７６；配列番号１９６）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６９０～３７０９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６９０；配列番号１９７）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４０９６～４１１５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４０９６；配列番号１９８）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４１０５～４１２４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４１０５；配列番号１９９）に対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４２５６～４２７５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４２５６；配列番号２００）に対応する。

【0162】

いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２０６～２２５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０６；配列番号１０１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２０８～２２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２０８；配列番号１０２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２１４～２３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２１４；配列番号１０３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド７４８～７６７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－７４８；配列番号１０４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８２５～８４４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８２５；配列番号１０５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９２～９１１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９２；配列番号１０６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９８～９１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９８；配列番号１０７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド８９９～９１８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－８９９；配列番号１０８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９００～９１９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９００；配列番号１０９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９０２～９２１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９０２；配列番号１１０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９０３～９２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９０３；配列番号１１１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９５４～９７３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９５４；配列番号１１２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６０～９７９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６０；配列番号１１３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６４～９８３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６４；配列番号１１４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６６～９８５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６６；配列番号１１５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９６９～９８８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９６９；配列番号１１６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９７０～９８９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９７０；配列番号１１７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド９７１～９９０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－９７１；配列番号１１８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０１６～１０３５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０１６；配列番号１１９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０２１～１０４０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０２１；配列番号１２０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１０２８～１０４７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１０２８；配列番号１２１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１０３～１１２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１０３；配列番号１２２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１０８～１１２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１０８；配列番号１２３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１１３～１１３２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１１３；配列番号１２４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１５９～１１７８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１５９；配列番号１２５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１７３～１１９２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１７３；配列番号１２６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１１９７～１２１６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１１９７；配列番号１２７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２０４～１２２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２０４；配列番号１２８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２２７～１２４６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２２７；配列番号１２９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２３２～１２５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２３２；配列番号１３０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２３９～１２５８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２３９；配列番号１３１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４０～１２５９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４０；配列番号１３２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４１～１２６０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４１；配列番号１３３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１２４２～１２６１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１２４２；配列番号１３４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３１３～１３３２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３１３；配列番号１３５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３１４～１３３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３１４；配列番号１３６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４１～１３６０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４１；配列番号１３７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４３～１３６２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４３；配列番号１３８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１３４６～１３６５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１３４６；配列番号１３９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１４９１～１５１０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１４９１；配列番号１４０）に


３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１５６１～１５８０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１５６１；配列番号１４１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１５６８～１５８７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１５６８；配列番号１４２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６６４～１６８３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６６４；配列番号１４３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７０～１６８９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７０；配列番号１４４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７６～１６９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７６；配列番号１４５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６７８～１６９７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６７８；配列番号１４６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８０～１６９９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８０；配列番号１４７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８１～１７００（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８１；配列番号１４８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８２～１７０１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８２；配列番号１４９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６８８～１７０７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６８８；配列番号１５０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１６９３～１７１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１６９３；配列番号１５１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７０４～１７２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７０４；配列番号１５２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７１８～１７３７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７１８；配列番号１５３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７２０～１７３９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７２０；配列番号１５４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１７２３～１７４２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１７２３；配列番号１５５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１８３７～１８５６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１８３７；配列番号１５６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１９３２～１９５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１９３２；配列番号１５７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド１９９３～２０１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－１９９３；配列番号１５８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２３２５～２３４４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２３２５；配列番号１５９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２４３２～２４５１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２４３２；配列番号１６０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２４７２～２４９１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２４７２；配列番号１６１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２５４３～２５６２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２５４３；配列番号１６２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６３８～２６５７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６３８；配列番号１６３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６３９～２６５８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６３９；配列番号１６４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６６７～２６８６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６６７；配列番号１６５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６７２～２６９１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６７２；配列番号１６６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２６９９～２６１８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２６９９；配列番号１６７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７５０～２７６９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７５０；配列番号１６８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７５５～２７７４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７５５；配列番号１６９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２７６０～２７７９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２７６０；配列番号１７０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２８３０～２８４９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２８３０；配列番号１７１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド２８３６～２８５５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－２８３６；配列番号１７２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３０８７～３１０６（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３０８７；配列番号１７３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３０９４～３１１３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３０９４；配列番号１７４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３１０９～３１２８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３１０９；配列番号１７５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３１２０～３１３９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３１２０；配列番号１７６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３２１２～３２３１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３２１２；配列番号１７７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４７６～３４９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４７６；配列番号１７８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８１～３５００（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８１；配列番号１７９）に３’末端及び／または５’


末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８８～３５０７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８８；配列番号１８０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４８９～３５０８（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４８９；配列番号１８１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４９３～３５１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４９３；配列番号１８２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３４９８～３５１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３４９８；配列番号１８３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５００～３５１９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５００；配列番号１８４に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０２～３５２１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０２；配列番号１８５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０３～３５２２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０３；配列番号１８６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０４～３５２３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０４；配列番号１８７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５０８～３５２７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５０８；配列番号１８８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５１４～３５３３（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５１４；配列番号１８９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５６１～３５８０（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５６１；配列番号１９０）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５８０～３５９９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５８０；配列番号１９１）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５８５～３６０４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５８５；配列番号１９２）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５９３～３６１２（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５９３；配列番号１９３）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３５９８～３６１７（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３５９８；配列番号１９４）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６５２～３６７１（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６５２；配列番号１９５）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６７６～３６９５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６７６；配列番号１９６）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド３６９０～３７０９（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－３６９０；配列番号１９７）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４０９６～４１１５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４０９６；配列番号１９８）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４１０５～４１２４（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４１０５；配列番号１９９）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。いくつかの態様では、標的領域は配列番号３のヌクレオチド４２５６～４２７５（例えば、ＡＳＯ－ＮＬＲＰ３－４２５６；配列番号２００）に３’末端及び／または５’末端にて±１０、±２０、±３０、±４０、±５０、±６０、±７０、±８０、または±９０ヌクレオチドに対応する。

【0163】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物（例えば、ゲノム配列、配列番号１）内の複数の標的領域とハイブリッド形成する。いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物内の２つの異なる標的領域とハイブリッド形成する。いくつかの態様では、ＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物内の３つの異なる標的領域とハイブリッド形成する。複数の標的領域とハイブリッド形成する例示的なＡＳＯの配列、及びさまざまな標的領域の開始／終了の位置が図１に提供されている。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３転写物（例えば、ゲノム配列、配列番号１）内の複数の領域とハイブリッド形成するＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物（例えば、ゲノム配列、配列番号１）内の単一領域とハイブリッド形成するＡＳＯと比べてＮＬＲＰ３の発現をさらに強力に減らす（例えば、より低いＥＣ５０を有する）。

【0164】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは生理学的条件下、すなわち、生体内条件下で標的核酸（例えば、ＮＬＲＰ３転写物）とハイブリッド形成することができる。いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは試験管内で標的核酸（例えば、ＮＬＲＰ３転写物）とハイブリッド形成することができる。いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはストリンジェントな条件下、試験管内で標的核酸（例えば、ＮＬＲＰ３転写物）とハイブリッド形成することができる。試験管内でのハイブリッド形成のストリンジェンシーの条件は、とりわけ、産生細胞の取り込み、ＲＮＡのアクセス可能性、温度、結合の自由エネルギー、塩濃度、及び時間に依存する（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００７）を参照のこと）。一般に、高ストリンジェントから中ストリンジェントな条件は、実質的に類似した核酸間のハイブリッド形成を可能にするが、異なる核酸間では可能にしない試験管内ハイブリッド形成に使用される。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例には、５×生理食塩水・クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（０．７５Ｍ塩化ナトリウム／０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）にて４０℃で１時間ハイブリッド形成した後、４０℃で１×ＳＳＣにて試料を１０回洗浄すること及び室温で１×ＳＳＣ緩衝液にて５回洗浄することが含まれる。生体内ハイブリッド形成条件は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列とのハイブリッド形成を支配する細胞内条件（例えば、生理学的ｐＨ及び細胞内イオン条件）から成る。生体内条件は、比較的低ストリンジェントな条件によって試験管内で模倣することができる。例えば、ハイブリッド形成は、３７℃で２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウム／０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳにて試験管内で実施することができる。４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液は３７℃で使用することができ、最終洗浄は４５℃で１×ＳＳＣにて行う。

【0165】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは１以上の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、及びクマ）に由来するＮＬＲＰ３転写物を標的とすることができる。特定の態様では、本明細書で開示されているＡＳＯは、ヒト及び齧歯類（例えば、マウスまたはラット）の双方のＮＬＲＰ３転写物を標的とすることができる。したがって、いくつかの態様では、ＡＳＯはヒト及び齧歯類（例えば、マウスまたはラット）の双方においてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡまたはＮＬＲＰ３タンパク質の発現を下方調節する（例えば、減らすまたは除去する）ことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている任意のＡＳＯは少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチドに共有結合されたＡＳＯを含むコンジュゲートの一部である。

【0166】

本開示の特定の態様は、本明細書で開示されているＡＳＯを含むコンジュゲートを対象とする。特定の態様では、コンジュゲートは少なくとも１つの非ヌクレオチドに共有結合したＡＳＯを含む。特定の態様では、コンジュゲートは少なくとも１つの非ポリヌクレオチド部分に共有結合したＡＳＯを含む。いくつかの態様では、非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0167】

ＩＩ．Ｂ． ＡＳＯ配列
本開示のＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１または配列番号３に対応するヌクレオチド配列の領域の相補体に対応する連続するヌクレオチド配列を含む。

【0168】

特定の態様では、本開示は、長さ１０～３０、例えば１０～１５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、または長さ約２０ヌクレオチドのＡＳＯを提供し、その際、連続するヌクレオチド配列は、ＮＬＲＰ３転写物、例えば、配列番号１または配列番号３または天然に存在するそれらの変異型の相補体の領域に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。したがって、例えば、ＡＳＯは、配列番号１または配列番号３の配列またはその一部を有する一本鎖核酸分子とハイブリッド形成する。

【0169】

ＡＳＯは、哺乳動物ＮＬＰＲ３タンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号１または配列番号３）の同等の領域に完全に相補性（完璧に相補性）である連続するヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯは、配列番号１または配列番号３のヌクレオチドＸ－Ｙに対応する核酸配列またはその配列内の領域に完全に相補性（完璧に相補性）である連続するヌクレオチド配列を含むことができ、その際、Ｘ及びＹは図１に示すように、それぞれ開始部位及び終了部位である。

【0170】

ＡＳＯは、哺乳動物ＮＬＰＲ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ（例えば、配列番号３）の同等の領域に完全に相補性（完璧に相補性）である連続するヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯは、配列番号３のヌクレオチドＸ－Ｙに対応するｍＲＮＡ配列またはその配列内の領域に完全に相補性（完璧に相補性）である連続するヌクレオチド配列を含むことができ、その際、Ｘ及びＹはそれぞれ開始部位及び終了部位である。

【0171】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯのヌクレオチド配列または連続するヌクレオチド配列は、配列番号１０１～２００から選択される配列（すなわち、図１の配列）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、少なくとも約９９％の配列同一性、例えば、約１００％の配列同一性（相同）を有する。いくつかの態様では、ＡＳＯは、本明細書の他の場所に記載されている設計、または本明細書の他の場所に示されている化学構造（例えば、図１）を有する。

【0172】

いくつかの態様では、ＡＳＯ（またはその連続するヌクレオチド部分）は、配列番号１０１～２００またはその少なくとも１０の連続するヌクレオチドの領域から成る群から選択される配列の１つから選択される、またはそれを含み、その際、ＡＳＯ（またはその連続するヌクレオチド部分）は、対応するＮＬＲＰ３転写物と比較したとき任意で１、２、３、または４のミスマッチを含むことができる。

【0173】

いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、または配列番号２００から成る群から選択される配列を含む。

【0174】

いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１０９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１１９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１２９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１３９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１４９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１５９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１６９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１７９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１８９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号１９９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは配列番号２００に記載の配列を含む。

【0175】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは、標的核酸配列（例えば、ＮＬＲＰ３転写物）に結合し、細胞における正常な（すなわち、対照）発現レベルと比べて、ＮＬＲＰ３転写物の発現を少なくとも１０％または２０％阻害する、または低減することができ、例えば、正常な発現レベル（例えば、ＡＳＯに曝されていない細胞における発現レベル）と比べて少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％阻害する、または低減することができる。

【0176】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは、ＡＳＯと接触していない（生理食塩水との接触）細胞と比べて細胞をＡＳＯと接触させると、標的細胞にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡの発現を試験管内で少なくとも２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％低減することができる。

【0177】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、標的配列とハイブリッド形成するとき、１、２、３、または４（またはそれ以上）のミスマッチを許容し、それでも標的に十分に結合して所望の効果、すなわち、標的のｍＲＮＡの及び／またはタンパク質の下方調節を示すことができる。ミスマッチは、例えば、ＡＳＯヌクレオチド配列の長さの増加及び／またはヌクレオチド類似体の数の増加によって相殺することができ、これらは本明細書の他の場所に開示されている。

【0178】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは標的配列とハイブリッド形成するとき３を超えるミスマッチは含まない。他の態様では、連続するヌクレオチド配列は標的配列とハイブリッド形成するとき２を超えるミスマッチは含まない。他の態様では、連続するヌクレオチド配列は標的配列とハイブリッド形成するとき１を超えるミスマッチは含まない。

【0179】

ＩＩ．Ｃ． ＡＳＯの長さ
ＡＳＯは、合計１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の連続するヌクレオチドの長さの連続するヌクレオチド配列を含むことができる。ＡＳＯまたは連続するヌクレオチド配列の長さについて範囲が与えられる場合、その範囲は、例えば１０から３０まで（またはその間の）範囲で提供される下限及び上限の長さを含み、１０及び３０の双方を含むことを理解すべきである。

【0180】

いくつかの態様では、ＡＳＯは、合計約１４～２０、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０連続ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、ＡＳＯは、合計約２０連続ヌクレオチド長の連続するヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１４ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１５ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１６ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１７ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１８ヌクレオチドの長さである。特定の態様では、本開示のＡＳＯは１９ヌクレオチドの長さである。

【0181】

ＩＩ．Ｄ． ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体
本開示の一態様では、ＡＳＯは１以上の天然に存在しないヌクレオシド類似体を含む。本明細書で使用されるとき「ヌクレオシド類似体」は、糖部分及び／または塩基部分の修飾による、ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオシドのような天然ヌクレオシドの変異型である。類似体は、原則として、オリゴヌクレオチドの文脈において天然ヌクレオシドに対して単に「サイレント」または「同等」であってもよく、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するように働く方法に機能的影響を有さない。それにもかかわらず、そのような「同等の」類似体は、例えば、それらが製造がさらに容易もしくは安価である、または保管もしくは製造の条件に対してさらに安定である、またはタグもしくは標識を表す場合に有用であり得る。しかしながら、いくつかの態様では、例えば、標的への結合親和性を高める及び／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性を高める、及び／または細胞への輸送の容易さの増やすことによって、類似体は、ＡＳＯが発現を阻害するように作用する方法に機能的な影響を有するであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びスキーム１に記載されている。本開示のＡＳＯは、１を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、６を超える、７を超える、８を超える、９を超える、１０を超える、１１を超える、１２を超える、１３を超える、１４を超える、１５を超える、１６を超える、１８を超える、１９を超える、または２０を超えるヌクレオシド類似体を含有することができる。いくつかの態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド類似体は同じである。いくつかの態様では、ＡＳＯにおけるヌクレオシド類似体は異なる。ＡＳＯにおけるヌクレオチド類似体は、以下のヌクレオシド類似体のいずれか１つまたは組み合わせであり得る。

【0182】

いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）；２’－アルコキシ－ＲＮＡ；２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ）；２’－アミノ－ＤＮＡ；２’－フルオロ－ＲＮＡ；２’－フルオロ－ＤＮＡ；アラビノ核酸（ＡＮＡ）；２’－フルオロ－ＡＮＡ；二環式ヌクレオシド類似体；またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体は糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体は二環式糖を含むヌクレオシドを含む。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体はＬＮＡを含む。

【0183】

いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体は、制約されたエチルヌクレオシド（ｃＥｔ）、２’，４’－制約された２’－Ｏ－メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、α－Ｌ－ＬＮＡ、β－Ｄ－ＬＮＡ、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、アミノ－ＬＮＡ、オキシ－ＬＮＡ、チオ－ＬＮＡ、及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。いくつかの態様では、ＡＳＯは１以上の５’－メチル－シトシン核酸塩基を含む。

【0184】

ＩＩ．Ｄ．１． 核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリッド形成において水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）の部分を含む。本開示の文脈では、核酸塩基という用語はまた、天然に存在する核酸塩基とは異なってもよいが、核酸ハイブリッド形成中に機能的である修飾された核酸塩基も包含する。いくつかの態様では、核酸塩基部分は核酸塩基を修飾するまたは置換することによって修飾される。この文脈では、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンのような天然に存在する核酸塩基、ならびに天然に存在しない変異型の双方を指す。そのような変異型は、例えば、Ｈｉｒａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１２），Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ，（２００９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１．に記載されている。

【0185】

いくつかの態様では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを、例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジン、例えば、イソシトシン、偽イソシトシン、５－メチル－シトシン、５－チオゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基のような修飾されたプリンまたは修飾されたピリミジンに変更することによって修飾される。

【0186】

核酸塩基部分は対応する各核酸塩基用の文字コード、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵによって示されてもよく、その際、各文字は任意で、同等の機能の修飾された核酸塩基を含んでもよい。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５－メチルシトシンから選択される。任意で、ＬＮＡギャップマーについては、５－メチル－シトシンＬＮＡヌクレオシドが使用されてもよい。

【0187】

ＩＩ．Ｄ．２． 糖修飾
本開示のＡＳＯは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合、糖部分の修飾を有する１以上のヌクレオシドを含むことができる。主に、親和性及び／またはヌクレアーゼ耐性のようなオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを目的として、リボース糖部分が修飾された多数のヌクレオシドが作製されてきた。

【0188】

そのような修飾には、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環による置換によって修飾されるもの（ＨＮＡ）、または通常、リボース環上のＣ２’及びＣ４’炭素の間にビラジカル架橋を有する二環式環による置換によって修飾されるもの（ＬＮＡ）、または通常、Ｃ２’とＣ３’炭素間の結合を欠く非結合リボース環による置換によって修飾されるもの（例えば、ＵＮＡ）が挙げられる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環系核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が挙げられる。修飾されたヌクレオシドにはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ核酸の場合に、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。

【0189】

糖修飾としてはまた、リボース環の置換基を水素以外の基、すなわちＲＮＡヌクレオシドに天然に見られる２’－ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も挙げられる。置換基は、例えば、２’、３’、４’、または５’の位置に導入されてもよい。糖部分が修飾されたヌクレオシドには、２’置換ヌクレオシドのような２’修飾ヌクレオシドも含まれる。実際、２’置換ヌクレオシドの開発に多くの焦点が当てられており、ヌクレオシド耐性の強化や親和性の増強のような、オリゴヌクレオチドに組み込むと、多くの２’置換ヌクレオシドが有益な特性を有することがわかっている。

【0190】

ＩＩ．Ｄ．２．ａ． ２’修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）、または２’結合ビラジカルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’－４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドが含まれる。例えば、２’修飾糖は、増強された結合親和性（例えば、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド）及び／またはオリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性の増加を提供してもよい。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３；Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３；及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１９，９３７を参照のこと。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの図解である。

【化3】

【0191】

ＩＩ．Ｄ．２．ｂ． ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間（すなわち、２’－４’架橋）にリンカー基（ビラジカルまたは架橋と呼ばれる）を含む修飾ヌクレオシドであり、それはリボース環の高次構造を制約するまたはロックする。これらのヌクレオシドはまた、文献では架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれている。リボースの高次構造のロックは、ＬＮＡが相補性のＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合のハイブリッド形成の親和性の向上（二重鎖の安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／相補体二本鎖の融解温度を測定することによって日常的に決定することができる。

【0192】

非限定的な例示的なＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５），ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，３７（４），１２２５－１２３８にて開示されている。

【0193】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯの修飾ヌクレオシドまたはＬＮＡヌクレオシドは式ＩまたはＩＩの一般的な構造を有する：

【化4】

式中、
Ｗは－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ^ａ）－、－Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－、特に－Ｏ－から選択され；
Ｂは核酸塩基または修飾された核酸塩基部分であり；
Ｚは隣接するヌクレオシドまたは５’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｚ＊は隣接するヌクレオシドまたは３’末端基へのヌクレオシド間結合であり；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊は、水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アジド、複素環及びアリールから独立して選択され；かつ
Ｘ、Ｙ、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは本明細書で定義されている通りである。

【0194】

－Ｘ－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｘ－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｘ－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方または双方が水素である。－Ｘ－Ｙ－のさらなる態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方だけが水素である。－Ｘ－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方がメチルであり、他方が水素である。－Ｘ－Ｙ－の特定の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂは双方とも同時にメチルである。

【0195】

－Ｘ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｘ－のいくつかの態様では、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｘ－の他の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方または双方が水素である。－Ｘ－の特定の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方だけが水素である。－Ｘ－の特定の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方がメチルであり、他方が水素である。－Ｘ－の他の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂは双方とも同時にメチルである。

【0196】

－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｙ－の特定の態様では、Ｒ^ｂは水素またはアルキル、特に水素またはメチルである。－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方または双方が水素である。－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方だけが水素である。－Ｙ－の他の態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂの一方がメチルであり、他方が水素である。－Ｙ－のいくつかの態様では、Ｒ^ａとＲ^ｂは双方とも同時にメチルである。

【0197】

いくつかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊は独立して水素及びアルキル、特に水素及びメチルから選択される。

【0198】

いくつかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。

【0199】

いくつかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方は上記で定義された通りであり、特にアルキル、さらに具体的にはメチルである。

【0200】

いくつかの態様では、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて、同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアジドである。

【0201】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、すべて参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、及びＷＯ２００４／０４６１６０にて開示されており、当該技術分野でベータ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシド及びアルファ－Ｌ－オキシＬＮＡヌクレオシドとして一般に知られているものを含む。

【0202】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０にて開示されている。

【0203】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－ＮＨ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０にて開示されている。

【0204】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２－、または－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ００／０４７５９９及びＭｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６にて開示されており、当該技術分野で２’－Ｏ－４’Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として一般に知られているものが含まれる。

【0205】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方はアルキル、例えば、メチルのように水素ではない。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドは参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／１３４１８１に開示されている。

【0206】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、式中、Ｒ^ａ及びＲ^ｂの双方は水素、特にメチルなどのアルキルではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３はすべて同時に水素であり、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方は水素であり、他方は水素、特にアルキル、例えば、メチルではない。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドは参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されている。

【0207】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－（「２’Ｏ－メトキシエチル二環式核酸」、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５），ｐｐ．１５６９－８１）である。

【0208】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドは双方とも参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０３６６９８及びＷＯ２００７／０９００７１に開示されている。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドでは、Ｒ^ａは特にメチルのようなＣ１－Ｃ６アルキルである。

【0209】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野では環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）としても知られており、ＷＯ２００７／０９００７１に開示されている。

【0210】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－である。

【0211】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０，ｏｐ．ｃｉｔ．）である。

【0212】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’－メチルＬＮＡヌクレオシドは、当該技術分野ではｃＥＴヌクレオシドとしても知られており、双方とも参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００７／０９００７１（ベータ－Ｄ）及びＷＯ２０１０／０３６６９８（アルファ－Ｌ）に開示されているように（Ｓ）－ｃＥＴまたは（Ｒ）－ｃＥＴジアステレオ異性体のいずれかであってもよい。

【0213】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、その際、Ｒ^ａもＲ^ｂも水素ではなく、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。特定の態様では、Ｒ^ａ及びＲ^ｂは双方とも同時にアルキルであり、特に双方が同時にメチルである。そのような６’二置換ＬＮＡヌクレオシドは参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／００６４７８に開示されている。

【0214】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｓ－ＣＨＲ^ａ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドは参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１５６２０２に開示されている。そのような６’置換チオＬＮＡの特定の態様では、Ｒ^ａはアルキル、特にメチルである。

【0215】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｃ（＝ＣＨ_２）Ｃ（Ｒ^ａＲ^ｂ）－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドは双方とも参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１５４４０１及びＷＯ２００９／０６７６４７に開示されている。

【0216】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｎ（ＯＲ^ａ）－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。いくつかの態様では、Ｒ^ａはメチルのようなアルキルである。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＮ置換ＬＮＡとしても知られており、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／１５０７２９に開示されている。

【0217】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＮＣＨ_３－（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０ ｏｐ．ｃｉｔ．）である。

【0218】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－はＯＮ（Ｒ^ａ）－－Ｎ（Ｒ^ａ）－Ｏ－、－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、または－ＮＲ^ａ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。特定の態様では、Ｒ^ａはメチルのようなアルキルである。（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ２０１０ ｏｐ．ｃｉｔ．）

【0219】

いくつかの態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊は双方とも同時に水素である。他の態様では、Ｒ^５及びＲ^５＊の一方が水素であり、他方がメチルのようなアルキルである。そのような態様では、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は特に水素であることができ、－Ｘ－Ｙ－は特に－Ｏ－ＣＨ_２－または－Ｏ－ＣＨＣ（Ｒ^ａ）_３－、例えば－Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－であり得る。

【0220】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－であり、例えば、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。そのような態様では、Ｒ^ａは、特にメチルのようなアルキルであり得る。そのようなＬＮＡヌクレオシドは高次構造で制約があるヌクレオチド（ＣＲＮ）としても知られており、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０３６８６８に開示されている。

【0221】

いくつかの態様では、－Ｘ－Ｙ－は－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－Ｏ－ＣＲ^ａＲ^ｂ－、例えば、－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－であり、Ｗは酸素であり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５及びＲ^５＊はすべて同時に水素である。特定の態様では、Ｒ^ａは特にメチルのようなアルキルであり得る。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＣＯＣヌクレオチドとしても知られており、参照によって本明細書に組み込まれるＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８に開示されている。

【0222】

特に明記されていない限り、ＬＮＡヌクレオシドはベータ－Ｄまたはアルファ－Ｌのステレオアイソフォームであってもよいことが認識されるであろう。

【0223】

ＬＮＡヌクレオシドの特定の例をスキーム１に提示する。
スキーム１

【化5】

【0224】

他の場所で説明されているように、本開示のいくつかの態様では、オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡヌクレオシドはベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシドである。

【0225】

ＩＩＩ．Ｅ． ヌクレアーゼが介在する分解
ヌクレアーゼが介在する分解は、相補性ヌクレオチド配列の分解に、そのような配列と二重鎖を形成するときに介在することができるオリゴヌクレオチドを指す。

【0226】

いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼが介在する分解を介して機能してもよく、その際、本開示のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくは、ＲＮＡ分解酵素Ｈのようなエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）を動員することができる。ヌクレアーゼが介在するメカニズムを介して作動するオリゴヌクレオチド設計の例は、通常少なくとも５または６のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマーが片側または両側に隣接しているオリゴヌクレオチドである。

【0227】

ＩＩ．Ｆ． ＲＮＡ分解酵素Ｈの活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮＡ分解酵素Ｈ活性は、相補性ＲＮＡ分子と二重鎖になっているときにＲＮＡ分解酵素Ｈを動員し、相補性ＲＮＡ分子の分解を誘導する能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３は、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を決定するための試験管内方法を提供し、それはＲＮＡ分解酵素Ｈを動員する能力を決定するのに使用されてもよい。通常、相補性の標的核酸配列とともに提供された場合、試験対象の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡ単量体のみを含有し、オリゴヌクレオチド内のすべての単量体間にホスホロチオエート結合を持つオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５によって提供される方法論を使用する場合に決定される初期速度の少なくとも５％の、例えば、少なくとも１０％のまたは２０％を超えるｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるような初期速度を有するのであれば、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ分解酵素Ｈを動員することができると見なされる。

【0228】

いくつかの態様では、相補性の標的核酸配列が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮＡ分解酵素Ｈの初期速度が、試験対象のオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、２’置換のないＤＮＡ単量体のみを含有し、オリゴヌクレオチド内のすべての単量体間にホスホロチオエート結合を持つオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１～９５によって提供される方法論を使用する場合に決定される初期速度の２０％未満、例えば、１０％未満、例えば、５％未満であれば、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ分解酵素Ｈを本質的に動員することができないと見なされる。

【0229】

ＩＩ．Ｇ． ＡＳＯの設計
本開示のＡＳＯは、ヌクレオシド及びヌクレオシド類似体の双方を含むヌクレオチド配列を含むことができ、ギャップマーの形態であり得る。本開示のＡＳＯとともに使用することができるギャップマーの構成の例は、米国特許出願公開第２０１２／０３２２８５１号に記載されている。

【0230】

本明細書で使用されるとき「ギャップマー」という用語は、１以上の親和性増強修飾ヌクレオシド（フランク）が５’及び３’に隣接するＲＮＡ分解酵素Ｈ動員オリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。「ＬＮＡギャップマー」という用語は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。「混合ウィングギャップマー」という用語は、隣接領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシドまたは非ＬＮＡ修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、及び２’－フルオロ－ＡＮＡヌクレオシド（複数可）を含むＬＮＡギャップマーを指す。

【0231】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはミックスマーの形態であり得る。いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはトータルマーの形態であり得る。いくつかの態様では、標的領域に対するＡＳＯの親和性を増強することに加えて、いくつかのヌクレオシド類似体はまた、ＲＮＡ分解酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ）の結合及び切断にも介在する。α－Ｌ－ＬＮＡ単量体はある程度ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を動員するので、いくつかの態様では、α－Ｌ－ＬＮＡ単量体を含有するＡＳＯのギャップ領域（例えば、本明細書で言及される領域Ｂ）は、ＲＮＡ分解酵素Ｈによって認識可能及び切断可能なより少数の単量体から成り、ミックスマー構造のさらなる柔軟性が導入されている。

【0232】

ＩＩ．Ｇ．１． ギャプマーの設計
いくつかの態様では、本開示のＡＳＯはギャップマーであり、本明細書において領域Ｂ（Ｂ）と呼ばれるＲＮＡ分解酵素ＨのようなＲＮＡ分解酵素を動員することができるヌクレオチド（例えば、１以上のＤＮＡ）の連続した区間を含み、その際、領域Ｂは、領域Ｂのヌクレオチドの連続区間に対してヌクレオシド類似体５’及び３’の領域が５’及び３’の双方で隣接している。これらの領域はそれぞれ領域Ａ（Ａ）及びＣ（Ｃ）と呼ばれる。いくつかの態様では、ヌクレオシド類似体は糖修飾ヌクレオシド（例えば、高親和性の糖修飾ヌクレオシド）である。特定の態様では、領域Ａ及びＣの糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するＡＳＯの親和性を増強する（すなわち、親和性増強２’糖修飾ヌクレオシド）。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡ及び／または２’－ＭＯＥのような高親和性２’糖修飾のような２’糖修飾ヌクレオシドである。

【0233】

ギャップマーでは、領域Ｂの５’及び３’のほとんどのヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ領域Ａ及びＣのヌクレオシド類似体（例えば、高親和性糖修飾ヌクレオシド）に隣接して配置される。いくつかの態様では、領域Ａ及びＣはさらに、領域Ｂから最も離れた末端（すなわち、領域Ａの５’末端及び領域Ｃの３’末端）にヌクレオシド類似体を有することによって定義され得る。

【0234】

いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは、式（５’から３’）Ａ－Ｂ－Ｃのヌクレオチド配列を含み、式中、（Ａ）（５’領域または第１のウィング配列）は少なくとも１つのヌクレオシド類似体（例えば、３－５ＬＮＡ単位）を含み；（Ｂ）はＲＮＡ分解酵素を動員することができる（プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ標的のような相補性ＲＮＡ分子と二重鎖で形成された場合）少なくとも４つの連続したヌクレオシド（例えば、４～２４のＤＮＡ単位））を含み；（Ｃ）（３’領域または第２のウィング配列）は、少なくとも１つのヌクレオシド類似体（例えば、３～５のＬＮＡ単位）を含む。

【0235】

いくつかの態様では、領域ＡはＬＮＡのような３～５のヌクレオシド類似体を含み、領域Ｂは６～２４（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４）のＤＮＡ単位から成り、領域ＣはＬＮＡのような３または４のヌクレオシド類似体から成る。このような設計には、（Ａ－Ｂ－Ｃ）３－１４－３、３－１１－３、３－１２－３、３－１３－３、４－９－４、４－１０－４、４－１１－４、４－１２－４、及び５－１０－５が含まれる。いくつかの態様では、ＡＳＯは、ＬＬＬＤ_ｎＬＬＬ、ＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬ、またはＬＬＬＬＬＤ_ｎＬＬＬＬＬの設計を有し、その際、Ｌはヌクレオシド類似体であり、ＤはＤＮＡであり、ｎは４～２４の任意の整数であり得る。いくつかの態様では、ｎは６～１４の任意の整数であり得る。いくつかの態様では、ｎは８～１２の任意の整数であり得る。いくつかの態様では、ＡＳＯはＬＬＬＭＭＤｎＭＭＬＬＬ、ＬＬＬＭＤｎＭＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＭＤｎＭＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＭＤｎＭＬＬＬＬ、ＬＬＬＬＬＬＭＭＤｎＭＭＬＬＬＬＬ、またはＬＬＬＬＬＬＭＤｎＭＬＬＬＬＬの設計を有し、その際、ＤはＤＮＡであり、ｎは３～１５の任意の整数であることができ、ＬはＬＮＡであり、Ｍは２’ＭＯＥである。

【0236】

さらなるギャップマーの設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ２００７／１４６５１１、及びＷＯ２００８／１１３８３２に開示されており、これらのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0237】

ＩＩ．Ｈ． ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されているＡＳＯの単量体は連結基を介して一緒に結合される。好適には、各単量体は連結基を介して３’隣接単量体に連結される。

【0238】

当業者は、本開示の文脈において、ＡＳＯの末端の５’単量体が５’末端基を含んでもよいし、または含まなくてもよいが、５’連結基を含まないことを理解するであろう。

【0239】

いくつかの態様では、連続するヌクレオチド配列は１以上の修飾されたヌクレオシド間結合を含む。「連結基」または「ヌクレオシド間結合」という用語は、２つのヌクレオシドを一緒に共有結合することができる基を意味するように意図される。非限定的な例にはリン酸基及びホスホロチオエート基が挙げられる。

【0240】

本開示のＡＳＯのヌクレオシドまたはその隣接するヌクレオシド配列は連結基を介して一緒に結合される。好適には、各ヌクレオシドは連結基を介して３’隣接ヌクレオシドに連結される。

【0241】

いくつかの態様では、ヌクレオシド間結合は、その通常のホスホジエステルからホスホロチオエートのようなヌクレアーゼ攻撃に対してさらに耐性のあるものに修飾され、それはＲＮＡ分解酵素Ｈによって切断可能であり、標的遺伝子の発現を低減する際のアンチセンス阻害のその経路も可能にする。いくつかの態様では、ヌクレオシド間結合の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が修飾される。

【0242】

ＩＩＩ． 細胞外小胞、例えば、エクソソーム
本明細書で開示されているのは、ＮＬＲＰ３アンタゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームである。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＡＳＯ、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。ＡＳＯは本明細書に記載されている任意のＡＳＯまたはその機能的断片であり得る。特定の態様では、ＡＳＯは標的細胞におけるＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡまたはＮＬＲＰ３タンパク質のレベルを低減する。いくつかの態様では、本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームの投与は、標的細胞におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの形成を減らす、阻止する、または阻害する。

【0243】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは少なくとも１つのＡＳＯを含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、少なくとも２つのＡＳＯ、例えば、第１のヌクレオチド配列を含む第１のＡＳＯ及び第２のヌクレオチド配列を含む第２のＡＳＯを含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、少なくとも３つのＡＳＯ、少なくとも４つのＡＳＯ、少なくとも５つのＡＳＯ、少なくとも６つのＡＳＯ、または６つを超えるＡＳＯを含む。いくつかの態様では、第１のＡＳＯ、第２のＡＳＯ、第３のＡＳＯ、第４のＡＳＯ、第５のＡＳＯ、第６のＡＳＯ、及び／またはＮ番目のＡＳＯのそれぞれが異なる。

【0244】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、第１のＡＳＯ及び第２のＡＳＯを含み、第１のＡＳＯは第１の転写物中の第１の標的配列に相補性である第１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＳＯは第１の転写物の第２の標的配列に相補性である第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、第１の標的配列は第２の標的配列と重複しない。いくつかの態様では、第１の標的配列は転写物の５’ＵＴＲ内にある少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、５’ＵＴＲ内にあるヌクレオチドを含まない。いくつかの態様では、第１の標的配列は転写物の３’ＵＴＲ内にある少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、３’ＵＴＲ内にあるヌクレオチドを含まない。いくつかの態様では、第１の標的配列は転写物の５’ＵＴＲ内にある少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第２の標的配列は、３’ＵＴＲ内にある少なくとも１つのヌクレオチドを含む。

【0245】

いくつかの態様では、第１のＡＳＯはエクソン・イントロン接合部内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはエクソン・イントロン接合部内の配列を標的とする。いくつかの態様では、第１のＡＳＯはエクソン・イントロン接合内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはエクソン内の配列を標的とする。いくつかの態様では、第１のＡＳＯはエクソン・イントロン接合部内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とする。いくつかの態様では、第１のＡＳＯはエクソン内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはエクソン内の配列を標的とする。いくつかの態様では、第１のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはエクソン内の配列を標的とする。いくつかの態様では、第１のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とし、第２のＡＳＯはイントロン内の配列を標的とする。

【0246】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは第１のＡＳＯ及び第２のＡＳＯを含み、その際、第１のＡＳＯは第１の転写物中の第１の標的配列に相補性である第１のヌクレオチド配列を含み、第２のＡＳＯは第２の転写物の第２の標的配列に相補性である第２のヌクレオチド配列を含み、第１の転写物は第２の転写物と同じ遺伝子の産物ではない。

【0247】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは免疫細胞を標的とする。いくつかの態様では、免疫細胞はマクロファージ、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは骨髄系細胞（例えば、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ、例えば、単球ＭＤＳＣまたは顆粒球ＭＤＳＣ）、単球、マクロファージ、造血幹細胞、好塩基球、好中球、または好酸球）、またはそれらの任意の組み合わせを標的とする。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはマクロファージを標的とする。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは樹状細胞を標的とする。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＢ細胞を標的とする。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＴ細胞を標的とする。

【0248】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＮＬＲＰ３インフラマソームによって上方調節される１以上の遺伝子の発現を低減する。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは血清中のＩＬ－１ベータの発現を低減する。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは対象にて炎症を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは慢性炎症の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは自己炎症の治療を必要とする対象にてそれを行う。

【0249】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは線維症の治療を必要とする対象にてそれを行う。過剰なＭ２マクロファージの活性化は、筋線維芽細胞の増殖、ＥＭＴ／ＥｎｄｏＭＴの活性化、及び細胞外マトリックスの沈着を促進するＴＧＦβ及び成長因子の継続的な産生をもたらす。Ｍ２マクロファージは、創傷治癒と線維化促進プロセスの悪化との間の分断点を表す。いくつかの態様では、線維症は、肝線維症（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺線維症、嚢胞性線維症、慢性潰瘍性大腸炎／ＩＢＤ、膀胱線維症、腎臓線維症、ＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）、心房線維症、心筋内線維症、古い心筋梗塞、グリア瘢痕、動脈硬化、関節線維症、クローン病、デュプイトレン収縮、ケロイド線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、ペイロニー病、腎性全身性線維症、進行性大規模線維症、後腹膜線維症、強皮症／全身性硬化症、癒着性関節包炎及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは肝線維症（ＮＡＳＨ）を治療する。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＣＡＰＳ（マックルウェルズ症候群）を治療する。

【0250】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、神経変性疾患を治療する。いくつかの態様では、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、運動神経疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経障害痛、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0251】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは多発性硬化症（ＭＳ）の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、二次性進行性多発性硬化症（ＳＰＭＳ）における持続性髄膜リンパ構造の発生を減らす。

【0252】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはアルツハイマー型認知症の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはアミロイドβの蓄積を減らすことを必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＴａｕの蓄積を減らすことを必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＡβの広がりを減らすことを必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＴａｕの広がりを減らすことを必要とする対象にてそれを行う。

【0253】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは筋萎縮性側索硬化症の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは神経障害痛の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは中枢神経系にて骨髄炎症を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上へのマクロファージの流入を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上にてマクロファージの食作用を減らす。

【0254】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは神経炎症性疾患の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは炎症性神経障害の治療を必要とする対象にてそれを行う。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは神経にて骨髄炎症を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは髄鞘にて骨髄炎症を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上へのマクロファージの流入を減らす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは歯根、神経、及び／または筋肉の１以上にてマクロファージの食作用を減らす。

【0255】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは化学療法が誘導する末梢神経障害（ＣＩＰＮ）の治療を必要とする対象にてそれを行う。

【0256】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは代謝障害／ＣＶＤを治療する。いくつかの態様では、代謝障害／ＣＶＤは、酸－塩基不均衡、代謝性脳疾患、カルシウム代謝障害、ＤＮＡ修復欠損障害、グルコース代謝障害、高乳酸血症、鉄代謝障害、脂質代謝障害、吸収不良症候群、代謝症候群Ｘ、先天性代謝異常、ミトコンドリア病、リン代謝障害、ポルフィリア症、タンパク質恒常性欠乏症、代謝性皮膚疾患、消耗症候群、水電解質不均衡、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0257】

上記に記載されているように、本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームは直径が約２０～３００ｎｍの細胞外小胞である。本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームのサイズは以下に記載されている方法に従って測定することができる。

【0258】

いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、内部（内腔）表面及び外面を含む二脂質膜（「ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜」）を含む。特定の態様では、内部（内腔）表面は、ＥＶ、例えば、エクソソームの内側コア（すなわち、内腔）に面する。特定の態様では、外部表面は、産生細胞または標的細胞のエンドソーム、多小胞体、または膜／細胞質と接触することができる。

【0259】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。

【0260】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は内側のリーフレット及び外側のリーフレットを含む。内側及び外側のリーフレットの組成は、当該技術分野で既知の二層間分布アッセイによって決定することができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照のこと。いくつかの態様では、外側リーフレットの組成は、およそ７０～９０％のコリンリン脂質、およそ０～１５％の酸性リン脂質、及びおよそ５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様では、内側リーフレットの組成は、およそ１５～４０％のコリンリン脂質、およそ１０～５０％の酸性リン脂質、及びおよそ３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。

【0261】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソーム、膜は、グリカンのような１以上の多糖類を含む。

【0262】

いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、ＡＳＯを含み、その際、ＡＳＯはＥＶの外面またはＥＶの内腔表面のいずれかで足場部分を介してＥＶに連結される。

【0263】

いくつかの態様では、ＡＳＯを含むＥＶ、例えば、エクソソームはＡＳＯとエクソソーム膜との間に任意でリンカーを含むアンカー部分を含む。リンカーの非限定的な例は本明細書の他の場所に開示されている。

【0264】

ＩＩＩ．Ａ． ＮＬＲＰ３アンタゴニスト
本開示の特定の態様はＮＬＲＰ３アンタゴニストを含むＥＶ、例えば、エクソソームを対象とする。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＡＳＯ、例えば、本明細書で開示されている任意のＡＳＯである。

【0265】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＭＯ）、またはペプチド結合ホスホロジアミデートモルフォリノオリゴマー（ＰＰＭＯ）である。

【0266】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは小分子である。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３はＭＣＣ９５０、タニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから選択される（例えば、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ １０：１２８，（２０１９）を参照のこと）。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化6】

を含む。

【0267】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＭＣＣ９５０を含む（例えば、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，２４８（２０１５）を参照のこと）。

【0268】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化7】

を含む。

【0269】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはタニラストを含む（例えば、ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０，ｅ８６８９（２０１８）を参照のこと）。

【0270】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化8】

を含む。

【0271】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはオリドニンを含む（例えば、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，２５５０（２０１８）を参照のこと）。

【0272】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化9】

を含む。

【0273】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはＣＹ－０９を含む（例えば、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１４，３２１９－３２３８（２０１７）を参照のこと）。

【0274】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化10】

を含む。

【0275】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはベイ１１－７０８２を含む（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，９７９２－９８０２（２０１０）を参照のこと）。

【0276】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化11】

を含む。

【0277】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストはパルテノリドを含む（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５：９７９２－９８０２（２０１０）を参照のこと）。

【0278】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは式：

【化12】

を含む。

【0279】

いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）を含む（例えば、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８９：１１４２－１１５０（２０１４）を参照のこと）。

【0280】

ＩＩＩ．Ｂ． アンカー部分（ＡＭ）
１以上のアンカー部分（ＡＭ）を使用して、ＡＳＯを本開示のＥＶに固定することができる。いくつかの態様では、ＡＳＯはアンカー部分に直接、またはリンカーを介して連結される。いくつかの態様では、ＡＳＯは、「反応性部分」（ＲＭ；例えば、マレイミド、コハク酸塩、ＮＨＳ）と「反応性基」（ＲＧ；例えば、アミン、チオール、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアジド）の間の反応を介してアンカー部分またはリンカーの組み合わせに結合することができる。いくつかの潜在的な合成経路が想定されている。例えば、次の通りである。
［ＡＭ］－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［リンカー］ｎ－／反応性部分／ ＋ ／反応性基／－［リンカー］ｎ－［ＡＳＯ］

【0281】

アンカー部分はＥＶ、例えば、エクソソームの脂質二重層に挿入することができ、ＡＳＯによるエクソソームの負荷を可能にする。現在、極性ＡＳＯの送達媒体としてのエクソソームの商業化に対する主な障害は非常に非効率的な負荷である。この障害は、極性ＡＳＯをエクソソームに負荷する前に修飾することによって克服することができる。したがって、本明細書に記載されているように、ＡＳＯの修飾はそれらのエクソソームへの負荷を容易にする。

【0282】

本明細書に記載されている修飾された極性ＡＳＯをエクソソームに負荷する方法は、例えば、電気穿孔法またはカチオン性脂質形質移入によって非修飾ＡＳＯをエクソソームに導入するために以前に報告された負荷効率と比べて、負荷効率を大幅に改善する。

【0283】

いくつかの態様では、修飾は、ネイティブ（非修飾）ＡＳＯと比べてＡＳＯの疎水性を少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約倍７、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高める。いくつかの態様では、修飾は、ネイティブ（非修飾）ＡＳＯと比べてＡＳＯの疎水性を少なくとも約１桁、少なくとも約２桁、少なくとも約３桁、少なくとも約４桁、少なくとも約５桁、少なくとも約６桁、少なくとも約７桁、少なくとも約８桁、少なくとも約９桁、または少なくとも約１０桁増やす。

【0284】

いくつかの態様では、修飾は、ネイティブ（非修飾）ＡＳＯ、例えば、対応する非修飾のＡＳＯと比べてＡＳＯの疎水性を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％高める。疎水性の上昇は任意の好適な方法を使用して評価することができる。例えば、疎水性は、水のような水性溶媒への溶解度と比べたとき、オクタノールのような有機溶媒における溶解度のパーセンテージを測定することによって決定することができる。

【0285】

いくつかの態様では、アンカー部分はその疎水性特性を増強するためにＡＳＯに化学的に結合させることができる。例示的な態様では、アンカー部分はステロール（例えば、コレステロール）、ＧＭ１、脂質、ビタミン、小分子、ペプチド、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、該部分は脂質である。いくつかの態様では、アンカー部分はステロール、例えば、コレステロールである。追加の疎水性部分には、例えば、リン脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、またはビタミン（例えば、ビタミンＤまたはビタミンＥ）が挙げられる。

【0286】

いくつかの態様では、アンカー部分は、直接または１以上のリンカーを介してＡＳＯの末端で結合される（すなわち、「末端修飾」）。他の態様では、アンカー部分はＡＳＯの他の部分に結合される。

【0287】

いくつかの態様では、ＡＳＯは検出可能な標識を含むことができる。例示的な標識には蛍光標識及び／または放射性標識が挙げられる。いくつかの態様では、ＡＳＯが蛍光標識される場合、検出可能な標識は、例えば、Ｃｙ３であり得る。検出可能な標識をＡＳＯに付加することは、エクソソームを標識し、それらの生体内分布を追跡する方法として使用することができる。他の態様では、検出可能な標識はエクソソームに直接、例えば、エクソソーム脂質及び／またはエクソソームペプチドを標識することによって結合させることができる。

【0288】

ＡＳＯのさまざまな成分（すなわち、アンカー部分、リンカーとリンカーの組み合わせ、及びＡＳＯ）は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、ホスホルアミデート結合、ホスホトリエステル結合、ホスホロジチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホジエステル結合、またはホスホロチオエート結合、または代わりに、任意のもしくは他の結合によって連結することができる。

【0289】

いくつかの態様では、ＡＳＯのさまざまな成分は、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｓ－（２－ピリジルジチオ）システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、Ｎ－（４－マレイミドブチルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、Ｎ－（５－アミノペンチル）－イミノ二酢酸等のような二官能性リンカー（すなわち、２つの官能基を含むリンカー）を使用するリンカーであり得る。

【0290】

ＩＩＩ．Ｂ．１． アンカー部分
ＥＶ、例えば、エクソソームの表面にＡＳＯを固定することができる好適なアンカー部分は、以下で詳細に説明するように、例えば、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質、リゾリン脂質、脂肪酸、または脂溶性ビタミンを含む。

【0291】

いくつかの態様では、アンカー部分は脂質であり得る。脂質アンカー部分は、当該技術分野で知られている任意の脂質、例えば、パルミチン酸またはグリコシルホスファチジルイノシトールであり得る。いくつかの態様では、脂質は、脂肪酸、ホスファチド、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルエタノールアミン）、またはそれらの類似体（例えば、ホスファチジルコリン、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、セファリン、またはホスファチジルセリンまたはその類似体またはその一部、例えば、その部分的に加水分解された部分）である。

【0292】

一般的に、アンカー部分は化学的に結合される。しかしながら、アンカー部分は酵素的にＡＳＯに結合することができる。いくつかの態様では、細胞培養条件の変更によって、アンカー部分をＡＳＯに結合させることが可能である。例えば、ミリスチン酸が制限されている培地を使用することによって、短鎖及び不飽和を含む他のいくつかの脂肪酸をＮ末端グリシンに結合させることができる。例えば、ＢＫチャネルでは、ミリステートは、ヒドロキシエステル結合を介して、翻訳後に内部のセリン／スレオニンまたはチロシンの残基に結合することが報告されている。

【0293】

アンカー部分は化学的に実行可能な任意の位置、例えば、ＡＳＯの５’及び／または３’末端にて直接ＡＳＯに、またはリンカーの組み合わせを介して間接的にＡＳＯに結合することができる。一態様では、アンカー部分はＡＳＯの３’末端のみに結合される。一態様では、アンカー部分はＡＳＯの５’末端のみに結合される。一態様では、アンカー部分はＡＳＯの３’末端または５’末端ではない位置に結合される。

【0294】

次の表に提示される本開示の方法を実施するために使用することができるいくつかのタイプの膜アンカー：

【表A】

【0295】

いくつかの態様では、本開示のアンカー部分は、本明細書で開示されている２以上のタイプのアンカー部分を含むことができる。例えば、いくつかの態様では、アンカー部分は２つの脂質、例えば、リン脂質と脂肪酸、または２つのリン脂質、または２つの脂肪酸、または脂質とビタミン、またはコレステロールとビタミンなどを含むことができ、まとめるとそれらは６～８０の炭素原子（すなわち、６～８０の等価炭素数（ＥＣＮ））を有する。

【0296】

いくつかの態様では、アンカー部分の組み合わせ、例えば、脂質（例えば、脂肪酸）の組み合わせは、６～８０、８～８０、１０～８０、１２～８０、１４～８０、１６～８０、１８～８０、２０～８０、２２～８０、２４～８０、２６～８０、２８～８０、３０～８０、４～７６、６～７６、８～７６、１０～７６、１２～７６、１４～７６、１６～７６、１８～７６、２０～７６、２２～７６、２４～７６、２６～７６、２８～７６、３０～７６、６～７２、８～７２、１０～７２、１２～７２、１４～７２、１６～７２、１８～７２、２０～７２、２２～７２、２４～７２、２６～７２、２８～７２、３０～７２、６～６８、８～６８、１０～６８、１２～６８、１４～６８、１６～６８、１８～６８、２０～６８、２２～６８、２４～６８、２６～６８、２８～６８、３０～６８、６～６４、８～６４、１０～６４、１２～６４、１４～６４、１６～６４、１８～６４、２０～６４、２２～６４、２４～６４、２６～６４、２８～６４、３０～６４、６～６０、８～６０、１０～６０、１２～５６、１４～５６、１６～５６、１８～５６、２０～５６、２２～５６、２４～５６、２６～５６、２８～５６、３０～５６、６～５２、８～５２、１０～５２、１２～５２、１４～５２、１６～５２、１８～５２、２０～５２、２２～５２、２４～５２、２６～５２、２８～５２、３０～５２、６～４８、８～４８、１０～４８、１２～４８、１４～４８、１６～４８、１８～４８、２０～４８、２２～４８、２４～４８、２６～４８、２８～４８、３０～４８、６～４４、８～４４、１０～４４、１２～４４、１４～４４、１６～４４、１８～４４、２０～４４、２２～４４、２４～４４、２６～４４、２８～４４、３０～４４、６～４０、８～４０、１０～４０、１２～４０、１４～４０、１６～４０、１８～４０、２０～４０、２２～４０、２４～４０、２６～４０、２８～４０、３０～４０、６～３６、８～３６、１０～３６、１２～３６、１４～３６、１６～３６、１８～３６、２０～３６、２２～３６、２４～３６、２６～３６、２８～３６、３０～３６、６～３２、８～３２、１０～３２、１２～３２、１４～３２、１６～３２、１８～３２、２０～３２、２２～３２、２４～３２、２６～３２、２８～３２、または３０～３２のＥＣＮを有する。

【0297】

ＩＩＩ．Ｂ．１．ａ． コレステロール及び他のステロール
いくつかの態様では、アンカー部分は、ステロール、ステロイド、ホパノイド、ヒドロキシステロイド、セコステロイド、または親油性があるそれらの類似体を含む。いくつかの態様では、アンカー部分は、植物ステロール、菌類ステロール、または動物ステロールのようなステロールを含む。例示的な動物ステロールには、コレステロール及び２４Ｓ－ヒドロキシコレステロールが含まれ；例示的な植物ステロールには、エルゴステロール（菌類ステロール）、カンペステロール、シトステロール、及びスチグマステロールが含まれる。いくつかの態様では、ステロールは、エルゴステロール、７－デヒドロコレステロール、コレステロール、２４Ｓ－ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、シクロアルテノール、フコステロール、サリンゴステロール、カンペステロール、β－シトステロール、シトスタノール、コプロスタノール、アベナステロール、またはスチグマステロールから選択される。ステロールは、遊離ステロール、アシル化（ステロールエステル）、アルキル化（ステリルアルキルエーテル）、硫酸化（ステロール硫酸塩）、またはそれ自体がアシル化できるグリコシド部分（ステリルグリコシド）に結合したもの（アシル化ステロールグリコシド）のいずれかとして見いだされてもよい。

【0298】

いくつかの態様では、アンカー部分はステロイドを含む。いくつかの態様では、ステロイドは、ジヒドロテストステロン、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン、プロゲステロン、またはコルチゾールから選択される。

【0299】

例えば、ステロールはステロールの利用可能な－ＯＨ基にて、ＡＳＯに直接、またはリンカーの組み合わせを介して結合されてもよい。例示的なステロールは以下に示す一般的な骨格を有する：

【化13】

【0300】

さらなる例として、エルゴステロールは以下の構造を有する：

【化14】

【0301】

コレステロールは以下の構造を有する：

【化15】

【0302】

したがって、いくつかの実施形態では、ステロールまたはステロイドの遊離－ＯＨ基を使用して、ＡＳＯを直接またはリンカーの組み合わせを介して、ステロール（例えば、コレステロール）またはステロイドに結合する。

【0303】

ＩＩＩ．Ｂ．１．ｂ． 脂肪酸
いくつかの態様では、アンカー部分は脂肪酸である。いくつかの態様では、脂肪酸は短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、または長鎖脂肪酸である。いくつかの態様では、脂肪酸は飽和脂肪酸である。いくつかの態様では、脂肪酸は不飽和脂肪酸である。いくつかの態様では、脂肪酸はモノ不飽和脂肪酸である。いくつかの態様では、脂肪酸は、ω－３（オメガ－３）またはω－６（オメガ－６）脂肪酸のような多価不飽和脂肪酸である。

【0304】

いくつかの態様では、脂質、例えば、脂肪酸はＣ_２～Ｃ_６０の鎖を有する。いくつかの態様では、脂質、例えば、脂肪酸はＣ_２～Ｃ_２８の鎖を有する。いくつかの態様では、脂肪酸はＣ_２～Ｃ_４０の鎖を有する。いくつかの態様では、脂肪酸はＣ_２～Ｃ_１２の鎖またはＣ_４～Ｃ_１２の鎖を有する。いくつかの態様では、脂肪酸はＣ_２～Ｃ_４０の鎖を有する。いくつかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_４～Ｃ_４０、Ｃ_２～Ｃ_３８、Ｃ_２～Ｃ_３６、Ｃ_２～Ｃ_３４、Ｃ_２～Ｃ_３２、Ｃ_２～Ｃ_３０、Ｃ_４～Ｃ_３０、Ｃ_２～Ｃ_２８、Ｃ_４～Ｃ_２８、Ｃ_２～Ｃ_２６、Ｃ_４～Ｃ_２６、Ｃ_２～Ｃ_２４、Ｃ_４～Ｃ_２４、Ｃ_６～Ｃ_２４、Ｃ_８～Ｃ_２４、Ｃ_１０～Ｃ_２４、Ｃ_２～Ｃ_２２、Ｃ_４～Ｃ_２２、Ｃ_６～Ｃ_２２、Ｃ_８～Ｃ_２２、Ｃ_１０～Ｃ_２２、Ｃ_２～Ｃ_２０、Ｃ_４～Ｃ_２０、Ｃ_６～Ｃ_２０、Ｃ_８～Ｃ_２０、Ｃ_１０～Ｃ_２０、Ｃ_２～Ｃ_１８、Ｃ_４～Ｃ_１８、Ｃ_６～Ｃ_１８、Ｃ_８～Ｃ_１８、Ｃ_１０～Ｃ_１８、Ｃ_１２～Ｃ_１８、Ｃ_１４～Ｃ_１８、Ｃ_１６～Ｃ_１８、Ｃ_２～Ｃ_１６、Ｃ_４～Ｃ_１６、Ｃ_６～Ｃ_１６、Ｃ_８～Ｃ_１６、Ｃ_１０～Ｃ_１６、Ｃ_１２～Ｃ_１６、Ｃ_１４～Ｃ_１６、Ｃ_２～Ｃ_１５、Ｃ_４～Ｃ_１５、Ｃ_６～Ｃ_１５、Ｃ_８～Ｃ_１５、Ｃ_９～Ｃ_１５、Ｃ_１０～Ｃ_１５、Ｃ_１１～Ｃ_１５、Ｃ_１２～Ｃ_１５、Ｃ_１３～Ｃ_１５、Ｃ_２～Ｃ_１４、Ｃ_４～Ｃ_１４、Ｃ_６～Ｃ_１４、Ｃ_８～Ｃ_１４、Ｃ_９～Ｃ_１４、Ｃ_１０～Ｃ_１４、Ｃ_１１～Ｃ_１４、Ｃ_１２～Ｃ_１４、Ｃ_２～Ｃ_１３、Ｃ_４～Ｃ_１３、Ｃ_６～Ｃ_１３、Ｃ_７～Ｃ_１３、Ｃ_８～Ｃ_１３、Ｃ_９～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１０～Ｃ_１３、Ｃ_１１～Ｃ_１３、Ｃ_２～Ｃ_１２、Ｃ_４～Ｃ_１２、Ｃ_６～Ｃ_１２、Ｃ_７～Ｃ_１２、Ｃ_８～Ｃ_１２、Ｃ_９～Ｃ_１２、Ｃ_１０～Ｃ_１２、Ｃ_２～Ｃ_１１、Ｃ_４～Ｃ_１１、Ｃ_６～Ｃ_１１、Ｃ_７～Ｃ_１１、Ｃ_８～Ｃ_１１、Ｃ_９～Ｃ_１１、Ｃ_２～Ｃ_１０、Ｃ_４～Ｃ_１０、Ｃ_２～Ｃ_９、Ｃ_４～Ｃ_９、Ｃ_２～Ｃ_８、Ｃ_２～Ｃ_７、Ｃ_４～Ｃ_７、Ｃ_２～Ｃ_６、またはＣ_４～Ｃ_６の鎖を有する。いくつかの態様では、脂肪酸は、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０、Ｃ_２１、Ｃ_２２、Ｃ_２３、Ｃ_２４、Ｃ_２５、Ｃ_２６、Ｃ_２７、Ｃ_２８、Ｃ_２９、Ｃ_３０、Ｃ_３１、Ｃ_３２、Ｃ_３３、Ｃ_３４、Ｃ_３５、Ｃ_３６、Ｃ_３７、Ｃ_３８、Ｃ_３９、Ｃ_４０、Ｃ_４１、Ｃ_４２、Ｃ_４３、Ｃ_４４、Ｃ_４５、Ｃ_４６、Ｃ_４７、Ｃ_４８、Ｃ_４９、Ｃ_５０、Ｃ_５１、Ｃ_５２、Ｃ_５３、Ｃ_５４、Ｃ_５５、Ｃ_５６、Ｃ_５７、Ｃ_５８、Ｃ_５９、またはＣ_６０の鎖を有する。

【0305】

いくつかの態様では、アンカー部分は２つの脂肪酸を含み、それらのそれぞれは、前述の炭素原子の範囲または数のいずれか１つを持つ鎖を有する脂肪酸から独立して選択される。いくつかの態様では、脂肪酸の１つは独立してＣ６～Ｃ２１の鎖を持つ脂肪酸であり、かつ１つは独立してＣ１２～Ｃ３６の鎖を持つ脂肪酸である。いくつかの実施形態では、各脂肪酸は独立して、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７の炭素原子の鎖を有する。

【0306】

好適な脂肪酸には、飽和直鎖脂肪酸、飽和分岐鎖脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒドロキシ脂肪酸、及びポリカルボン酸が挙げられる。いくつかの態様では、そのような脂肪酸は最大３２までの炭素原子を有する。

【0307】

有用な飽和直鎖脂肪酸の例には、例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ヘキサコサン酸、オクタコサン酸、トリアコンタン酸及びｎ－ドトリアコンタン酸のような偶数の炭素原子を有するもの、ならびに例えば、プロピオン酸、ｎ－吉草酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ヘンデカン酸、トリデカン酸、ペンタデカン酸、ヘプタデカン酸、ノナデカン酸、ヘネイコサン酸、トリコサン酸、ペンタコサン酸、及びヘプタコサン酸のような奇数の炭素原子を有するものが挙げられる。

【0308】

好適な飽和分岐鎖脂肪酸の例には、イソ酪酸、イソカプロン酸、イソカプリル酸、イソカプリン酸、イソラウリン酸、１１－メチルドデカン酸、イソミリスチン酸、１３－メチル－テトラデカン酸、イソパルミチン酸、１５－メチル－ヘキサデカン酸、イソステアリン酸、１７－メチルオクタデカン酸、イソアラシン酸、１９－メチル－エイコサン酸、α－エチル－ヘキサン酸、α－ヘキシルデカン酸、α－ヘプチルウンデカン酸、２－デシルテトラデカン酸、２－ウンデシルテトラデカン酸、２－デシルペンタデカン酸、２－ウンデシルペンタデカン酸、及びファインオキソコール１８００酸（Ｎｉｓｓａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄの製品）が挙げられる。好適な飽和奇数炭素分岐鎖脂肪酸には、イソブチル基で終結するアンテイソ脂肪酸、例えば、６－メチル－オクタン酸、８－メチル－デカン酸、１０－メチル－ドデカン酸、１２－メチル－テトラデカン酸、１４－メチル－ヘキサデカン酸、１６－メチル－オクタデカン酸、１８－メチル－エイコサン酸、２０－メチル－ドコサン酸、２２－メチル－テトラコサン酸、２４－メチル－ヘキサコサン酸、及び２６－メチルオクタコサン酸が挙げられる。

【0309】

好適な不飽和脂肪酸の例には、４－デセン酸、カプロル酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ラウロレイン酸、４－テトラデセン酸、５－テトラデセン酸、９－テトラデセン酸、パルミトール酸、６－オクタデセン酸、オレイン酸、９－オクタデセン酸、１１－オクタデセン酸、９－エイコセン酸、シス－１１－エイコセン酸、セトレイン酸、１３－ドコセン酸、１５－テトラコセン酸、１７－ヘキサコセン酸、６，９，１２，１５－ヘキサデカテトラエン酸、リノール酸、リノレン酸、α－エレオステア酸、β－エレオステア酸、プニン酸、６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸、パリナリン酸、５，８，１１，１４－エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７－エイコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸、４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸などが挙げられる。

【0310】

好適なヒドロキシ脂肪酸の例には、α－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシミリスチン酸、α－ヒドロキシパルミチン酸、α－ヒドロキシステアリン酸、ω－ヒドロキシラウリン酸、α－ヒドロキシアラキジン酸、９－ヒドロキシ－１２－オクタデセン酸、リシノール酸、α－ヒドロキシベヘン酸、９－ヒドロキシ－トランス－１０，１２－オクタデカジエン酸、カモレン酸、イプロル酸、９，１０－ジヒドロキシステアリン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸などが挙げられる。

【0311】

好適なポリカルボン酸の例には、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼラン酸、セバシン酸、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸などが挙げられる。

【0312】

いくつかの態様では、各脂肪酸は独立して、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘネイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸、ラセロイン酸、プシル酸、ゲジン酸、セロプラスチック酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンタン酸、またはオクタトリアコンタン酸から選択される。

【0313】

いくつかの態様では、各脂肪酸は独立して、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ－リノール酸、ジホモ－ガンマ－リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、パルミトレイン酸、バクセン酸、パウリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ゴンド酸、エルシン酸、ネルボン酸、ミード酸、アドレニン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド酸、サルジン酸、ヘリン酸、ドコサヘキサエン酸、またはテトラコサノールペンタエン酸、または別のモノ不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸から選択される。

【0314】

いくつかの態様では、脂肪酸の一方または双方は必須脂肪酸である。特定の必須脂肪酸の有益な健康効果を考慮して、開示された治療負荷エクソソームの治療上の利益は、そのような脂肪酸を治療剤に含めることによって増加させてもよい。いくつかの態様では、必須脂肪酸は、リノレン酸、γ－リノレン酸、ジホモ－γ－リノレン酸、アラキドン酸、アドレニン酸、ドコサペンタエンｎ－６酸、α－リノレン酸、ステアリドン酸、２０：４ｎ－３酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエンｎ－３酸、またはドコサヘキサエン酸から成る群から選択されるｎ－６またはｎ－３の必須脂肪酸である。

【0315】

いくつかの態様では、各脂肪酸は独立して、全－シス－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。他の態様では、脂肪酸はエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、またはリポ酸から選択される。脂肪酸の他の例には、全－シス－７，１０，１３－ヘキサデカトリエン酸、α－リノレン酸（ＡＬＡまたは全－シス－９，１２，１５－オクタデカトリエン酸）、ステアリドン酸（ＳＴＤまたは全－シス－６，９，１２，１５－オクタデカテトラエン酸）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥまたは全－シス－１１，１４，１７－エイコサトリエン酸）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡまたは全－シス－８，１１，１４，１７－エイコサテトラエン酸）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、クルパノドン酸または全－シス－７，１０，１３，１６，１９－ドコサペンタエン酸）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡまたは全－シス－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸）、テトラコサペンタエン酸（全－シス－９，１２，１５，１８，２１－ドコサヘキサエン酸）、またはテトラコサヘキサエン酸（ニシン酸または全－シス－６，９，１２，１５，１８，２１－テトラコセン酸）が挙げられる。いくつかの態様では、脂肪酸は、例えば、リポ酸のような中鎖脂肪酸である。

【0316】

脂肪酸鎖は鎖の長さが大きく異なり、鎖の長さに従って、例えば、短いものから非常に長いものまで分類されてもよい。短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、約５以下の炭素の鎖を持つ脂肪酸（例えば、酪酸）である。いくつかの態様では、脂肪酸はＳＣＦＡである。中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）には、中鎖トリグリセリドを形成することができる約６～１２の炭素の鎖を持つ脂肪酸が含まれる。いくつかの態様では、脂肪酸はＭＣＦＡである。長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）には１３～２１の炭素の鎖を持つ脂肪酸が含まれる。いくつかの態様では、脂肪酸はＬＣＦＡである。いくつかの態様では、脂肪酸はＬＣＦＡである。超長鎖脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）には、２２～６０、２２～５０、または２２～４０の炭素のような２２以上の炭素の鎖を持つ脂肪酸が含まれる。いくつかの態様では、脂肪酸はＶＬＣＦＡである。

【0317】

ＩＩＩ．Ｂ．１．ｃ． リン脂質
いくつかの態様では、アンカー部分はリン脂質を含む。リン脂質はすべての細胞膜の主成分である脂質のクラスである。それらは両親媒性の特徴のために脂質二重層を形成することができる。リン脂質分子の構造は一般に、２つの疎水性脂肪酸「尾部」とリン酸基から成る親水性「頭部」とから成る。例えば、リン脂質は次の式に従った脂質であり得る。

【化16】

式中、Ｒ_ｐはリン脂質部分を表し、Ｒ_１及びＲ_２は不飽和を伴う、または伴わない、同じであってもよい、または異なってもよい脂肪酸部分を表す。

【0318】

リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンから成る非限定的な基から選択されてもよい。

【0319】

特定のリン脂質は、脂質二重層、例えば、エクソソーム膜の脂質二重層への融合を促進してもよい。例えば、カチオン性リン脂質は、膜の１以上の負に荷電したリン脂質と相互作用してもよい。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物の１以上の要素が膜に結合する、または膜を通過することを可能にしてもよい。

【0320】

脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸から成る非限定的な基から選択されてもよい。

【0321】

本開示においてアンカー部分として使用するリン脂質は、天然または非天然のリン脂質であり得る。分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を持つ天然種を含む非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１以上のアルキン（例えば、１以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化されてもよく、またはそれに架橋されてもよい。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による付加環化反応を受けてもよい。

【0322】

リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸のようなグリセロリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0323】

本明細書で開示されているアンカー部分で使用することができるリン脂質の例には以下が挙げられる。
・ホスファチジルエタノールアミン：例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジルエタノールアミン、１－オレイル－２－パルミトイルホスファチジルエタノールアミン及びジエルコイルホスファチジルエタノールアミン；
・ホスファチジルグリセロール：例えば、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルグリセロール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルグリセロール及びジエルコイルホスファチジルグリセロール；
・ホスファチジルセリン：例えば、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルセリン、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルセリン及びジエルコイルホスファチジルセリン；
・ホスファチジン酸：例えば、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、１－パルミトイル－２－オレイルホスファチジン酸、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジン酸、及びジエルコイルホスファチジン酸；ならびに
・ホスファチジルイノシトール：例えば、ジラウロイルホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルイノシトール、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール、ジステアロイルホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルイノシトール、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルイノシトール、１－オレイル－２－パルミトイル－ホスファチジルイノシトール及びジエルコイルホスファチジルイノシトール。

【0324】

リン脂質は対称型または非対称型であってもよい。本明細書で使用されるとき、「対称リン脂質」という用語には、一致する脂肪酸部分を有するグリセロリン脂質、及び可変脂肪酸部分とスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が同等の数の炭素原子を含むスフィンゴ脂質が含まれる。本明細書で使用されるとき、「非対称リン脂質」という用語には、リゾ脂質、異なる脂肪酸部分（例えば、異なる数の炭素原子及び／または不飽和（例えば、二重結合）を有する脂肪酸部分）を有するグリセロリン脂質、ならびに可変脂肪酸部分及びスフィンゴシン骨格の炭化水素鎖が異なる数の炭素原子を含む（例えば、可変脂肪酸部分が炭化水素鎖よりも少なくとも２つ多い炭素原子を含む、または炭化水素鎖よりも少なくとも２つ少ない炭素原子を含む）スフィンゴ脂質が含まれる。

【0325】

いくつかの態様では、アンカー部分は少なくとも１つの対称リン脂質を含む。対称リン脂質は、
１，２－ジプロピオニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０３：０ ＰＣ）、
１，２－ジブチリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０４：０ ＰＣ）、
１，２－ペンタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０５：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ ＰＣ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ ＰＣ）、
１，２－ジノナノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ ＰＣ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ ＰＣ）、
１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ ＰＣ、ＤＵＰＣ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ ＰＣ、ＤＭＰＣ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ ＰＣ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ ＰＣ、ＤＰＰＣ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（４ＭＥ １６：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ ＰＣ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ＰＣ、ＤＳＰＣ）、
１，２－ジノナデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ ＰＣ）、
１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ ＰＣ）、
１，２－ジヘンアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２１：０ ＰＣ）、
１，２－ジベヘノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ ＰＣ）、
１，２－ジトリコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２３：０ ＰＣ）、
１，２－ジリグノセロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ ＰＣ）、
１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－シス）ＰＣ）、
１，２－ジミリステライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－シス）ＰＣ）、
１，２－ジパルミテライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジペトロセレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ６－シス）ＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－シス）ＰＣ、ＤＯＰＣ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１（Δ９－トランス）ＰＣ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：２（シス）ＰＣ、ＤＬＰＣ）、
１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：３（シス）ＰＣ、ＤＬｎＰＣ）、
１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：４（シス）ＰＣ、ＤＡＰＣ）、
１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：６（シス）ＰＣ、ＤＨＡＰＣ）、
１，２－ジネルボノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：１（シス）ＰＣ）、
１，２－ジヘキサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０６：０ ＰＥ）、
１，２－ジオクタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（０８：０ ＰＥ）、
１，２－ジデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１０：０ ＰＥ）、
１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１２：０ ＰＥ）、
１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ ＰＥ）、
１，２－ジペンタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１５：０ ＰＥ）、
１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ ＰＥ）、
１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（４ＭＥ １６：０ ＰＥ）、
１，２－ジヘプタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１７：０ ＰＥ）、
１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ）、
１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：１ ＰＥ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－シス）ＰＥ、ＤＯＰＥ）、
１，２－ジエライドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１（Δ９－トランス）ＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：２ ＰＥ、ＤＬＰＥ）、
１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：３ ＰＥ、ＤＬｎＰＥ）、
１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２０：４ ＰＥ、ＤＡＰＥ）、
１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（２２：６ ＰＥ、ＤＨＡＰＥ）、
１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテルＰＣ）、
１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びそれらの任意の組み合わせから成る非限定的な群から選択されてもよい。

【0326】

いくつかの態様では、アンカー部分はＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ジエーテルＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ及びそれらの任意の組み合わせから成る非限定的基から選択される少なくとも１つの対称リン脂質を含む。

【0327】

いくつかの態様では、アンカー部分は少なくとも１つの非対称リン脂質を含む。非対称リン脂質は、
１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１６：０ ＰＣ、ＭＰＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－１８：０ ＰＣ、ＭＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アセチル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－０２：０ ＰＣ）、
１，２－パルミトイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１４：０ ＰＣ、ＰＭＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：０ ＰＣ、ＰＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：１ ＰＣ、ＰＯＰＣ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－１８：２ ＰＣ、ＰＬＰＣ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０－２０：４ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０－２２：６ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１４：０ ＰＣ、ＳＭＰＣ）、
１－ステアロイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１６：０ ＰＣ、ＳＰＰＣ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：１ ＰＣ、ＳＯＰＣ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－１８：２ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２０：４ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０－２２：６ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１４：０ ＰＣ、ＯＭＰＣ）、
１－オレオイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１６：０ ＰＣ、ＯＰＰＣ）、
１－オレオイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１－１８：０ ＰＣ、ＯＳＰＣ）、
１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：１ ＰＥ、ＰＯＰＥ）、
１－パルミトイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－１８：２ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２０：４ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０－２２：６ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：１ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－１８：２ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２０：４ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０－２２：６ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせから成る非限定的な群から選択されてもよい。

【0328】

さらに顕著なヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み効率、及びさらに顕著なＲＮＡ干渉効果を提供するために、アンカー部分としてホスファチジルエタノールアミン、例えば、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、１－パルミトイル－２－オレイル－ホスファチジルエタノールアミン、及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを使用してもよい。

【0329】

脂質（例えば、リン脂質）及びリンカーの組み合わせまたはＢＡＭ、例えば、ＡＳＯの結合部位は、脂質及びリンカーまたはＡＳＯのタイプに従って好適に選択されてもよい。脂質の疎水性基以外の任意の位置は、化学結合によってリンカーまたはＡＳＯに連結されてもよい。例えば、ホスファチジルエタノールアミンを使用する場合、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基とリンカーまたはＡＳＯとの間にアミド結合等を形成することによって連結を行ってもよい。ホスファチジルグリセロールを使用する場合、グリセロール残基のヒドロキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間にエステル結合、エーテル結合などを形成することによって連結を行ってもよい。ホスファチジルセリンを使用する場合、セリン残基のアミノ基またはカルボキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間にアミド結合、エステル結合等を形成することによって連結を行ってもよい。ホスファチジン酸を使用する場合、リン酸残基とリンカーまたはＡＳＯとの間にホスホエステル結合等を形成することによって連結を行ってもよい。ホスファチジルイノシトールを使用する場合、イノシトール残基のヒドロキシル基とリンカーまたはＡＳＯとの間にエステル結合、エーテル結合などを形成することによって連結を行ってもよい。

【0330】

ＩＩＩ．Ｂ．１．ｄ． リゾ脂質（例えば、リゾリン脂質）
いくつかの態様では、アンカー部分はリゾ脂質、例えば、リゾリン脂質を含む。リゾ脂質は、一般に加水分解によって一方または双方の脂肪アシル鎖が取り除かれている脂質の誘導体である。リゾリン脂質は、加水分解によって一方または双方の脂肪アシル鎖が取り除かれているリン脂質の誘導体である。

【0331】

いくつかの態様では、アンカー部分は、一方または双方のアシル鎖が加水分解によって取り除かれている上記で開示されているリン脂質のいずれかを含み、したがって、得られるリゾリン脂質は一方の脂肪酸アシル鎖を含まない、または脂肪酸アシル鎖を含まない。

【0332】

いくつかの態様では、アンカー部分は、リゾグリセロリン脂質、リゾグリコスフィンゴリオピド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトール、またはリゾホスファチジルセリンを含む。

【0333】

いくつかの態様では、アンカー部分は、
１－ヘキサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘプタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－オクタノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ノナノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（０９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－デカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ウンデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１１：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ラウロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－トリデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１３：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ペンタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１５：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘプタデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１７：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ノナデカノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１９：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－アラキドイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２０：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ベヘノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２２：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－リグノセロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２４：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ヘキサコサノイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（２６：０ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、
１－ミリストイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１４：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－パルミトイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１６：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－ステアロイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：０ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－オレオイル－２－ヒドロキシ－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（１８：１ Ｌｙｓｏ ＰＥ）、
１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、及び
それらの任意の組み合わせから成る非限定的な基から選択されるリゾ脂質を含む。

【0334】

ＩＩＩ．Ｂ．１．ｅ． ビタミン
いくつかの態様では、アンカー部分は、親油性ビタミン、例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビタミンＥ、またはビタミンＫを含む。

【0335】

いくつかの態様では、アンカー部分はビタミンＡを含む。ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、及びいくつかのプロビタミンＡカロテノイド（特にベータカロテン）を含む不飽和栄養有機化合物の群である。いくつかの態様では、アンカー部分はレチノールを含む。いくつかの態様では、アンカー部分はレチノイドを含む。レチノイドは、ビタミンＡのビタマーである、またはそれに化学的に関連している化合物の部類である。いくつかの態様では、アンカー部分は、第１世代レチノイド（例えば、レチノール、トレチノイン、イソトリーチノイン、またはアリトレチノイン）、第２世代レチノイド（例えば、エトレチナートまたはアシトレチン）、第３世代レチノイド（例えば、アダパレン、ベキサロテン、またはタザロテン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【表B】

【0336】

いくつかの態様では、アンカー部分はビタミンＥを含む。トコフェロールはメチル化フェノールの部類であり、その多くはビタミンＥ活性を有する。したがって、いくつかの態様では、アンカー部分はアルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、またはそれらの組み合わせを含む。

【化17】

【0337】

トコトリエノールもビタミンＥ活性を有する。トコトリエノールとトコフェロールの間の重要な化学的構造の差異は、トコトリエノールは、トコフェロールの飽和側鎖に対比して３つの炭素－炭素二重結合を持つ不飽和イソプレノイド側鎖を有することである。いくつかの態様では、アンカー部分はアルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、ガンマ－トコトリエノール、デルタ－トコトリエノール、またはそれらの組み合わせを含む。トコトリエノールは以下の式で表すことができる

【化18】

アルファ（α）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ；
ベータ（β）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｍｅ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅ；
ガンマ（γ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｍｅ、Ｒ３＝Ｍｅ；
デルタ（δ）－トコトリエノール：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｍｅ；

【0338】

いくつかの態様では、アンカー部分はビタミンＫを含む。化学的に、ビタミンＫファミリーは２－メチル－１．４－ナフトキノン（３－）誘導体を含む。ビタミンＫには、２つの天然ビタマー：ビタミンＫ_１とビタミンＫ_２が含まれる。ビタミンＫ_１（フィトナジオン、フィロキノン、または（Ｅ）－フィトナジオンとしても知られている）の構造はフィチル基の存在によって特徴づけられる。ビタミンＫ_２（メナキノン）の構造は６～１３のイソプレニル単位を含有することができる分子内に存在するポリイソプレニル側鎖によって特徴づけられる。したがって、ビタミンＫ_２はイソプレノイド原子団でできた炭素側鎖の長さが異なる、いくつかの関連する化学サブタイプから成る。ＭＫ－４はビタミンＫ_２の最も一般的な形態である。ＭＫ－７、ＭＫ－８及びＭＫ－９のようなより長鎖型は発酵食品で主流である。ＭＫ－１０からＭＫ－１３のような長鎖型のビタミンＫ_２は細菌によって合成されるが、それらは十分に吸収されず、生物学的機能をほとんど有さない。天然型のビタミンＫに加えて、ビタミンＫ_３（メナジオン；２－メチルナフタレン－１，４－ジオン）、ビタミンＫ_４、及びビタミンＫ_５のようないくつかの合成型のビタミンＫがある。

【0339】

したがって、いくつかの態様では、アンカー部分はビタミンＫ_１、Ｋ_２（例えば、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６、ＭＫ－７、ＭＫ－８、ＭＫ－９、ＭＫ－１０、ＭＫ－１１、ＭＫ－１２、またはＭＫ－１３）、Ｋ_３、Ｋ_４、Ｋ_５、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【化19】

【0340】

ＩＩＩ．Ｂ．２． リンカーの組み合わせ
いくつかの態様では、ＡＳＯは、切断可能及び／または切断不可のリンカーの任意の組み合わせを含むことができるリンカーの組み合わせを介して、本明細書で開示されている疎水性膜アンカー部分に連結される。リンカーの組み合わせの主な機能は、アンカー部分（単数）または部分（複数）とＢＡＭ標的との間に最適な間隔を提供することである。例えば、ＡＳＯの場合、リンカーの組み合わせは、立体障害を減らし、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡのような標的核酸と相互作用できるようにＡＳＯを配置するはずである。

【0341】

リンカーは切断しやすくてもよく（「切断可能リンカー」）、それによって生物学的に活性がある分子の放出を容易にする。したがって、いくつかの態様では、本明細書で開示されているリンカーの組み合わせは切断可能なリンカーを含むことができる。そのような切断可能なリンカーは、例えば、生物学的に活性がある分子が活性状態を維持する条件下で、酸誘導性の切断、光誘導性の切断、ペプチダーゼ誘導性の切断、エステラーゼ誘導性の切断、及びジスルフィド結合の切断の影響を受けやすい。代わりに、リンカーは、実質的に切断に対して耐性であってもよい（「切断不可のリンカー」）。いくつかの態様では、切断可能なリンカーはスペーサーを含む。いくつかの態様では、スペーサーはＰＥＧである。

【0342】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、本明細書で開示されている少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つ以上の異なるリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーの組み合わせにおけるリンカーは、エステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）によって連結され得る。

【0343】

いくつかの態様では、リンカーは、アンカー部分とＢＡＭ、例えば、ＡＳＯとの間の直接結合である。

【0344】

ＩＩＩ．Ｂ．２．ａ． 切断不可のリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは「切断不可のリンカー」を含む。切断不可のリンカーは、本開示の修飾された生物学的に活性がある分子の２以上の成分（例えば、生物学的に活性がある分子とアンカー部分；生物学的に活性がある分子と切断可能なリンカー；アンカー部分と切断可能なリンカー）を安定した共有方式で連結することができる任意の化学的部分であり、切断可能なリンカーについて上記で収載されたカテゴリーに入らない。したがって、切断不可のリンカーは、酸誘導性の切断、光誘導性の切断、ペプチダーゼ誘導性の切断、エステラーゼ誘導性の切断、及びジスルフィド結合の切断に対して実質的に耐性である。

【0345】

さらに、切断不可とは、環状ジヌクレオチド及び／または抗体がその活性を失わない条件下にてリンカー中またはリンカーに隣接する化学結合の、酸、光解離性切断剤、ペプチダーゼ、エステラーゼ、またはジスルフィド結合を切断する化学的もしくは生理学的な化合物によって誘導される切断に耐える能力を指す。いくつかの態様では、生物学的に活性がある分子は別のリンカー、例えば、自壊牲リンカーを介してリンカーに結合される。

【0346】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、スクシンイミド、またはそれらの任意の組み合わせを含む切断不可のリンカーを含む。いくつかの態様では、切断不可のリンカーは生物学的に活性がある分子を切断不可のリンカーに連結するためのスペーサーユニットを含む。

【0347】

いくつかの態様では、１以上の切断不可のリンカーは、一緒に連結されたさらに小さなユニット（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、Ｃ２～Ｃ１２アルキルなど）を含む。一態様では、結合はエステル結合（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートエステル）または他の結合である。

【0348】

ＩＩＩ．Ｂ．２．ｂ． エチレングリコール（ＨＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ）
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは切断不可のリンカーを含み、その際、切断不可のリンカーは、Ｒ^３が水素、メチルまたはエチルであり、ｎが２～２００の値を有する式Ｒ^３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－またはＲ^３－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－によって特徴づけられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの態様では、リンカーはスペーサーを含み、スペーサーはＰＥＧである。

【0349】

いくつかの態様では、ＰＥＧリンカーは、オリゴエチレングリコール、例えば、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）、ペンタエチレングリコール、またはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）のリンカーである。

【0350】

いくつかの態様では、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0351】

いくつかの態様では、ｎは２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。

【0352】

いくつかの特定の態様では、ｎは３～２００、３～２０、１０～３０、または９～４５の値を有する。

【0353】

いくつかの態様では、ＰＥＧは分岐ＰＥＧである。分岐ＰＥＧは中央のコア基から出ている３～１０のＰＥＧ鎖を有する。

【0354】

特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は単分散ポリエチレングリコールである。本開示の文脈では、単分散ポリエチレングリコール（ｍｄＰＥＧ）は、単一の、定義された鎖長及び分子量を有するＰＥＧである。ｍｄＰＥＧは通常、クロマトグラフィーによる重合混合物からの分離によって生成される。特定の式では、単分散ＰＥＧ部分に略語ｍｄＰＥＧが割り当てられる。

【0355】

いくつかの態様では、ＰＥＧは星型ＰＥＧである。星型ＰＥＧは中央のコア基から出ている１０～１００のＰＥＧ鎖を有する。

【0356】

いくつかの態様では、ＰＥＧは櫛型ＰＥＧである。櫛型ＰＥＧには通常、ポリマー主鎖にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。

【0357】

特定の態様では、ＰＥＧは１００ｇ／モル～３０００ｇ／モル、特に１００ｇ／モル～２５００ｇ／モル、さらに具体的にはおよそ１００ｇ／モル～約２０００ｇ／モルのモル質量を有する。特定の態様では、ＰＥＧは２００ｇ／モル～３０００ｇ／モル、特に３００ｇ／モル～２５００ｇ／モル、さらに具体的にはおよそ４００ｇ／モル～約２０００ｇ／モルのモル質量を有する。

【0358】

いくつかの態様では、ＰＥＧは、ＰＥＧ_１００、ＰＥＧ_２００、ＰＥＧ_３００、ＰＥＧ_４００、ＰＥＧ_５００、ＰＥＧ_６００、ＰＥＧ_７００、ＰＥＧ_８００、ＰＥＧ_９００、ＰＥＧ_１０００、ＰＥＧ_１１００、ＰＥＧ_１２００、ＰＥＧ_１３００、ＰＥＧ_１４００、ＰＥＧ_１５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_１７００、ＰＥＧ_１８００、ＰＥＧ_１９００、ＰＥＧ_２０００、ＰＥＧ_２１００、ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_１６００、ＰＥＧ_{１７００、}ＰＥＧ_{１８００、}ＰＥＧ_{１９００、}ＰＥＧ_{２０００、}ＰＥＧ_{２１００、}ＰＥＧ_２２００、ＰＥＧ_２３００、ＰＥＧ_２４００、ＰＥＧ_２５００、ＰＥＧ_２６００、ＰＥＧ_２７００、ＰＥＧ_２８００、ＰＥＧ_２９００、またはＰＥＧ_３０００である。特定の一態様では、ＰＥＧはＰＥＧ_４００である。別の特定の態様では、ＰＥＧはＰＥＧ_２０００である。

【0359】

いくつかの態様では、本開示のリンカーの組み合わせは、いくつかのＰＥＧリンカー、例えば、ＰＥＧ、ＨＥＧ、またはＴＥＧのリンカーに隣接する切断可能なリンカーを含むことができる。

【0360】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、（ＨＥＧ）ｎ及び／または（ＴＥＧ）ｎを含み、その際、ｎは１～５０の整数であり、各ユニットは、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して接続される。

【0361】

ＩＩＩ．Ｂ．２．ｃ． グリセロール及びポリグリセロール（ＰＧ）
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、Ｒ３は水素、メチルまたはエチルであり、及びｎは３～２００の値を有する式（（Ｒ_３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－）によって記載されるグリセロールユニットまたはポリグリセロール（ＰＧ）を含む切断不可のリンカーを含む。いくつかの態様では、ｎは３～２０の値を有する。いくつかの態様では、ｎは１０～３０の値を有する。

【0362】

いくつかの態様では、ＰＧリンカーは、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール（ＴＧ）、ペンタグリセロール、またはヘキサグリセロール（ＨＧ）のリンカーである。

【0363】

いくつかの態様では、ｎは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７，１８，１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８９、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００の値を有する。

【0364】

いくつかの態様では、ｎは２～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、または１９０～２００である。

【0365】

これらの実施形態のいくつかの代替では、ｎは９～４５の値を有する。いくつかの態様では、該異種の部分は、Ｒ^５が水素である式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明される分岐ポリグリセロール、またはＲ^３が水素、メチルもしくはエチルである式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明される直鎖グリセロール鎖である。いくつかの態様では、異種の部分は、Ｒ^５が水素である式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^５－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明される超分岐ポリグリセロール、またはＲ^６が水素である式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^６－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明されるグリセロール鎖、またはＲ^７が水素である式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＲ^７－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明されるグリセロール鎖、またはＲ^３が水素、メチルまたはエチルである式（Ｒ^３－Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨＯＨ－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－）によって説明される直鎖グリセロール鎖である。超分岐グリセロール及びその合成方法は、Ｏｕｄｓｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７：５４７１－５４７９；Ｗｉｌｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１００，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．４３，１２９－４１及びそこに引用されている参考文献に記載されている。

【0366】

特定の態様では、ＰＧは１００ｇ／モル～３０００ｇ／モル、特に１００ｇ／モル～２５００ｇ／モル、さらに具体的にはおよそ１００ｇ／モル～約２０００ｇ／モルのモル質量を有する。特定の態様では、ＰＧは２００ｇ／モル～３０００ｇ／モル、特に３００ｇ／モル～２５００ｇ／モル、さらに具体的にはおよそ４００ｇ／モル～約２０００ｇ／モルのモル質量を有する。

【0367】

いくつかの態様では、ＰＧは、ＰＧ_１００、ＰＧ_２００、ＰＧ_３００、ＰＧ_４００、ＰＧ_５００、ＰＧ_６００、ＰＧ_７００、ＰＧ_８００、ＰＧ_９００、ＰＧ_１０００、ＰＧ_１１００、ＰＧ_１２００、ＰＧ_１３００、ＰＧ_１４００、ＰＧ_１５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_１６００、ＰＧ_１７００、ＰＧ_１８００、ＰＧ_１９００、ＰＧ_２０００、ＰＧ_２１００、ＰＧ_２２００、ＰＧ_２３００、ＰＧ_２４００、ＰＧ_２５００、ＰＧ_２６００、ＰＧ_２７００、ＰＧ_２８００、ＰＧ_２９００、またはＰＧ_３０００である。特定の一態様では、ＰＧはＰＧ_４００である。別の特定の態様では、ＰＧはＰＧ_２０００である。

【0368】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、（グリセロール）ｎ及び／または（ＨＧ）ｎ及び／または（ＴＧ）ｎを含み、その際、ｎは１～５０の整数であり、各ユニットは、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して接続される。

【0369】

ＩＩＩ．Ｂ．２．ｄ． 脂肪族（アルキル）リンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、少なくとも１つの脂肪族（アルキル）リンカー、例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、またはＣ２－Ｃ１０アルキルまたはＣ２－Ｃ６アルキルのようなＣ２－Ｃ１２アルキルを含む。

【0370】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせはアルキル鎖、例えば、非置換アルキルを含む。いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルレイルアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、またはアルケニルヘテロシクリルアルキニルを含む。

【0371】

任意で、これらの成分は置換される。置換基には、アルコール、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ）、直鎖または分岐鎖のアルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ１２アルキル）、アミン、アミノアルキル（例えば、アミノＣ１－Ｃ１２アルキル）、ホスホルアミダイト、ホスフェート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）、アミド、アルキルアミド（例えば、アミドＣ１－Ｃ１２アルキル）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、エーテル、ハロゲン化スルホニル、イミデートエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロホルメート、カルボジュイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、アルキルハロゲン化物、スルホン酸アルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）、チオエーテル、シアノ、糖（例えば、マンノース、ガラクトース、及びグルコース）、α、β－不飽和カルボニル、アルキル水銀、またはα、β－不飽和スルホンが挙げられる。

【0372】

「アルキル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、表記される炭素原子の数（例えば、Ｃ_１－Ｃ_１０は１～１０の炭素を意味する）を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味する。通常、アルキル基は、１～２４の炭素原子を有し、例えば、１～１０の炭素原子、１～８の炭素原子、または１～６の炭素原子を有する。「低級アルキル」基は１～４の炭素原子を有するアルキル基である。「アルキル」という用語には二価及び多価のラジカルが含まれる。例えば、「アルキル」という用語には、該当する場合には、例えば、式がアルキル基が二価であることを示す場合、または置換基が結合して環を形成する場合、「アルキレン」が含まれる。アルキルラジカルの例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ならびに、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、及びｎ－オクチルの同族体及び異性体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0373】

「アルキレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、二価（ジラジカル）アルキル基を意味し、その際、アルキルは本明細書で定義されている。「アルキレン」は、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－によって例示されるが、これに限定されない。通常、「アルキレン」基は１～２４の炭素原子を有し、例えば、１０以下の炭素原子（例えば、１～８、または１～６の炭素原子）を有する。「低級アルキレン」基は１～４の炭素原子を有するアルキレン基である。

【0374】

「アルケニル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として２～２４の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有する直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルを指す。典型的なアルケニル基は２～１０の炭素原子と少なくとも１つの二重結合を有する。一実施形態では、アルケニル基は２～８の炭素原子または２～６の炭素原子と、１～３の二重結合とを有する。例示的なアルケニル基には、ビニル、２－プロペニル、１－ブタ－３－エニル、クロチル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、２－イソペンテニル、１－ペント－３－エニル、１－ヘキサ－５－エニルなどが挙げられる。

【0375】

「アルキニル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として２～２４の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する直鎖または分枝鎖の不飽和またはポリ不飽和の炭化水素ラジカルを指す。典型的な「アルキニル」基は２～１０の炭素原子と少なくとも１つの三重結合を有する。本開示の一態様では、アルキニル基は２～６の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する。例示的なアルキニル基には、プロパ－１－イニル、プロパ－２－イニル（すなわち、プロパルギル）、エチニル及び３－ブチニルが挙げられる。

【0376】

「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基またはイオウ原子を介して分子の残部に結合されるアルキル基を指す。

【0377】

「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、指定された数の炭素原子（例えば、Ｃ_２－Ｃ_１０、またはＣ_２－Ｃ_８）及び、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰ（一実施形態では、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子から成る安定な直鎖または分岐鎖の炭化水素ラジカルを意味し、その際、窒素原子、イオウ原子及びリン原子は任意で酸化され、窒素原子（複数可）は任意で四級化される。ヘテロ原子（複数可）はヘテロアルキル基の任意の内部位置に配置される。ヘテロアルキル基の例には、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、及び－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３及び－ＣＨ_２－Ｏ－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３のように最大２つのヘテロ原子が連続してもよい。

【0378】

同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－及び－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－によって例示されるが、これらに限定されないようなヘテロアルキルに由来する二価のラジカルを意味する。通常、ヘテロアルキル基は３～２４の原子（水素を除く炭素及びヘテロ原子）（３～２４員環のヘテロアルキル）を有するであろう。別の例では、ヘテロアルキル基は、合計で３～１０の原子（３～１０員環のヘテロアルキル）または３～８の原子（３～８員環のヘテロアルキル）を有する。「ヘテロアルキル」という用語には、該当する場合には、例えば、式がヘテロアルキル基が二価であることを示す場合、または置換基が結合して環を形成する場合、「ヘテロアルキレン」が含まれる。

【0379】

「シクロアルキル」という用語は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて３～２４の炭素原子を有する、例えば、３～１２の炭素原子（例えば、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキルまたはＣ_３－Ｃ_６シクロアルキル）を有する飽和または不飽和の非芳香族炭素環式ラジカルを表す。シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「シクロアルキル」という用語は、例えば、ノルボルニル、アダマンチル及びビシクロ［２．２．１］ヘプチルのような架橋された多環式（例えば、二環式）構造も含む。「シクロアルキル」基は、アリール（例えば、フェニル）、ヘテロアリール（例えば、ピリジル）及び非芳香族（例えば、炭素環式または複素環式）の環から選択される少なくとも１つ（例えば、１～３）の他の環に縮合することができる。「シクロアルキル」基が縮合アリール、ヘテロアリールまたは複素環を含む場合、「シクロアルキル」基は、炭素環を介して分子の残部に結合される。

【0380】

「ヘテロシクロアルキル」、「複素環式」、「複素環」、または「ヘテロシクリル」という用語は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ及びＰから選択される少なくとも１つ及び最大５つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）を含有する炭素環式の非芳香族環（例えば、３～８員環及び例えば、４、５、６または７員環）を表し、その際、窒素原子、イオウ原子及びリン原子は任意で酸化され、窒素原子（複数可）は任意で四級化される（例えば、窒素、酸素及びイオウから選択される１～４のヘテロ原子）、または当業者に知られている安定した組み合わせで少なくとも１つ及び最大１０のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１～５のヘテロ原子）を含有する４～８員環の縮合環系を表す。例示的なヘテロシクロアルキル基には縮合フェニル環が含まれる。「複素環」基が縮合アリール環、ヘテロアリール環またはシクロアルキル環を含む場合、「複素環」基は複素環を介して分子の残部に結合される。ヘテロ原子は複素環が分子の残部に結合される位置を占有することができる。

【0381】

本開示の例示的なヘテロシクロアルキル基または複素環基には、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルＳ－オキシド、チオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ホモモルホリニル、ホモチオモルホリニル、ホモチオモルホリニルＳ，Ｓ－ジオキシド、オキサゾリジノニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピロリル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチエニルＳ－オキシド、テトラヒドロチエニルＳ，Ｓ－ジオキシド、ホモチオモルホリニルＳ－オキシド、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられる。

【0382】

「アリール」とは、単一の環（例えば、フェニル）を有する、または他の芳香族もしくは非芳香族の環（例えば、１～３の他の環）に縮合されている５、６または７員環の芳香族炭素環基を意味する。「アリール」基が非芳香族環（例えば、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル）またはヘテロアリール基を含む場合、「アリール」基はアリール環（例えば、フェニル環）を介して分子の残りの部分に結合される。アリール基は任意で置換される（例えば、本明細書に記載されている１～５の置換基で）。一例では、アリール基は６～１０の炭素原子を有する。アリール基の非限定的な例には、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチル、キノリン、インダニル、インデニル、ジヒドロナフチル、フルオレニル、テトラリニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリルまたは６，７，８，９－テトラヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ａ］シクロヘプテニルが挙げられる。一実施形態では、アリール基はフェニル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソリル及びナフチルから選択される。さらに別の実施形態では、アリール基はフェニルである。

【0383】

「アリールアルキル」または「アラルキル」という用語は、アリール基またはヘテロアリール基がアルキル基に結合してラジカルである－アルキル－アリール及び－アルキル－ヘテロアリールを作り出すラジカルを含むことを意味し、その際、アルキル、アリール及びヘテロアリールは本明細書で定義されている。例示的な「アリールアルキル」基または「アラルキル」基には、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどが挙げられる。

【0384】

「アリールオキシ」とは、基－Ｏ－アリールを意味し、その際、アリールは本明細書で定義されている通りである。一例では、アリールオキシ基のアリール部分はフェニルまたはナフチルである。一実施形態では、アリールオキシ基のアリール部分はフェニルである。

【0385】

「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＢ（例えば、Ｎ、Ｏ及びＳ）から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１～５のヘテロ原子、例えば、１～３のヘテロ原子）を含有する多不飽和の５、６または７員環の芳香族部分を指し、その際、窒素原子及びイオウ原子は任意で酸化され、窒素原子（複数可）は任意で四級化される。「ヘテロアリール」基は、単一の環であり得る、または他のアリール、ヘテロアリール、シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキルの環（例えば、１～３の他の環）に縮合され得る。「ヘテロアリール」基が縮合アリール、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルの環を含む場合、「ヘテロアリール」基はヘテロアリール環を介して分子の残部に結合される。ヘテロアリール基は、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残部に結合することができる。

【0386】

一例では、ヘテロアリール基は、４～１０の炭素原子と、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１～５のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の非限定的な例には、ピリジル、ピリミジニル、キノリニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、ピリダジニル、ピラジニル、イソインドリル、イソキノリル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、イミダゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、フラニル、チエニル、ピロリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソチアゾリル、ナフチリジニル、イソクロマニル、クロマニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソインドリニル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、ピリドピリジル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、プリニル、ベンゾジオキソリル、トリアジニル、プテリジニル、ベンゾチアゾリル、イミダゾピリジル、イミダゾチアゾリル、ジヒドロベンズイソオキサジニル、ベンズイソオキサジニル、ベンゾオキサジニル、ジヒドロベンズイソチアジニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロモニル、クロマノニル、ピリジル－Ｎ－オキシド、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロキノリノニル、ジヒドロイソキノリノニル、ジヒドロクマリニル、ジヒドロイソクマリニル、イソインドリノニル、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリノニル、ピロリルＮ－オキシド、ピリミジニルＮ－オキシド、ピリダジニルＮ－オキシド、ピラジニルＮ－オキシド、キノリニルＮ－オキシド、インドリルＮ－オキシド、インドリニルＮ－オキシド、イソキノリルＮ－オキシド、キナゾリニルＮ－オキシド、キノキサリニルＮ－オキシド、フタラジニルＮ－オキシド、イミダゾリルＮ－オキシド、イソキサゾリルＮ－オキシド、オキサゾリルＮ－オキシド、チアゾリルＮ－オキシド、インドリジニルＮ－オキシド、インダゾリルＮ－オキシド、ベンゾチアゾリルＮ－オキシド、ベンズイミダゾリルＮ－オキシド、ピロリルＮ－オキシド、オキサジアゾリルＮ－オキシド、チアジアゾリルＮ－オキシド、トリアゾリルＮ－オキシド、テトラゾリルＮ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ－オキシド、ベンゾチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシドが挙げられる。例示的なヘテロアリール基には、イミダゾリル、ピラゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、及びピリジルが挙げられる。他の例示的なヘテロアリール基には、１－ピロリル、２－ピロリル、３－ピロリル、３－ピラゾリル、２－イミダゾリル、４－イミダゾリル、ピラジニル、２－オキサゾリル、４－オキサゾリル、２－フェニル－４－オキサゾリル、５－オキサゾリル、３－イソオキサゾリル、４－イソオキサゾリル、５－イソオキサゾリル、２－チアゾリル、４－チアゾリル、５－チアゾリル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、２－ピリジル、３－ピリジル、ピリジン－４－イル、２－ピリミジル、４－ピリミジル、５－ベンゾチアゾリル、プリニル、２－ベンズイミダゾリル、５－インドリル、１－イソキノリル、５－イソキノリル、２－キノキサリニル、５－キノキサリニル、３－キノリル、及び６－キノリルが挙げられる。上記のアリール環系及びヘテロアリール環系の各々に関する置換基は、以下に記載されている許容されるアリール基置換基の群から選択される。

【0387】

脂肪族リンカーの例には以下の構造が挙げられる。
－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－
－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－
－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ１－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ１－ＮＨ－ＣＯ－
－Ｃ（＝Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ１－Ｏ－Ｃ－（＝Ｓ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＨ）－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－
－ＮＨ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ２－ＣＨ_２－ＣＯ－
－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_ｎ４－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）_２－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ３－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ４－
－（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）_ｎ１ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）_ｎ１－
－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－
－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）－
－（ＣＨ２）_ｎ１－Ｃ（Ｏ）Ｏ－
－（ＣＨ２）_ｎ１－
－（ＣＨ２）_ｎ１－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－
ｎ１は１～４０（例えば、２～２０、または２～１２）の整数であり、ｎ２は、１～２０（例えば、１～１０、または１～６）の整数であり、ｎ３及びｎ４は、同じでも異なってもよく、１～２０（例えば、１～１０、または１～６）の整数である。

【0388】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、（Ｃ３）ｎ、（Ｃ４）ｎ、（Ｃ５）ｎ、（Ｃ６）ｎ、（Ｃ７）ｎ、または（Ｃ８）ｎまたはそれらの組み合わせを含み、その際、ｎは１～５０の整数であり、各ユニットは、例えば、リン酸エステルリンカー、ホスホロチオエートエステル結合、またはそれらの組み合わせを介して接続される。

【0389】

ＩＩＩ．Ｂ．３． 切断可能なリンカー
いくつかの態様では、本明細書で開示されているＡＳＯの異なる成分は切断可能なリンカーによるリンカーであり得る。切断可能なリンカーという用語は、破壊できるまたは切断できる少なくとも１つの結合または化学結合を含むリンカーを指す。本明細書で使用されるとき、切断という用語は、２以上の相対的に小さい分子を生成する方法で、相対的に大きい分子内の１以上の化学結合を壊すことを指す。切断には、例えば、ヌクレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、オキシダーゼ、またはレダクターゼが介在してもよく、または特定の物理化学的条件、例えば、酸化還元環境、ｐＨ、活性酸素種の存在、もしくは特定の波長の光が介在してもよい。

【0390】

いくつかの態様では、本明細書で使用されるとき「切断可能」という用語は、例えば、ホスホジエステル及びジスルフィドのような急速に分解可能なリンカーを指す一方で、「切断不可」という用語は、例えば、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートのようなさらに安定な結合を指す。

【0391】

いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、ジヌクレオチドリンカーまたはトリヌクレオチドのリンカー、ジスルフィド、イミン、チオケタール、ｖａｌ－ｃｉｔジペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0392】

いくつかの態様では、切断可能なリンカーはバリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートを含む。

【0393】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ａ． レドックス切断可能なリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせはレドックス切断可能なリンカーを含む。非限定的な例として、切断可能なリンカーの１つのタイプは、還元または酸化の際に切断されるレドックス切断可能な連結基である。

【0394】

いくつかの態様では、レドックス切断可能リンカーは、ジスルフィド結合を含有し、すなわち、それは、ジスルフィド切断可能リンカーである。

【0395】

レドックス切断可能なリンカーは、例えば、細胞内のメルカプタン、オキシダーゼ、またはレダクターゼによって還元することができる。

【0396】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｂ． 活性酸素種（ＲＯＳ）で切断可能なリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、例えば、活性化好中球のような炎症過程によって生成される、スーパーオキシド（Ｏｆ）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような活性酸素種（ＲＯＳ）によって切断されてもよい切断可能なリンカーを含むことができる。いくつかの態様では、ＲＯＳ切断可能リンカーはチオケタール切断可能リンカーである。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５４，４５５Ｂ２を参照のこと。

【0397】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｃ． ｐＨ依存性切断可能リンカー
いくつかの態様では、リンカーは、酸性条件下（ｐＨ＜７）で選択的に切断される連結基である酸切断可能連結基を含む「酸不安定性リンカー」である。

【0398】

非限定的な例として、酸切断可能な連結基は、酸性環境、例えば、約６．０、５．５、５．０以下で切断される。いくつかの態様では、ｐＨは約６．５以下である。いくつかの態様では、リンカーは、一般的な酸、例えば、ペプチダーゼ（基質特異的であってもよい）またはホスファターゼとして作用することができる酵素のような薬剤によって切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームのような特定の低ｐＨ細胞小器官が酸で切断可能な連結基に切断環境を提供することができる。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、細胞の平均ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームも５．５～６．０の範囲の酸性ｐＨを有し、リソソームはさらに酸性のｐＨで約５．０である。したがって、ｐＨ依存性の切断可能なリンカーは当該技術分野ではエンドソームで不安定なリンカーと呼ばれることがある。

【0399】

酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。別の非限定的な例では、エステル酸素（アルコキシ基）に結合した炭素が、例えば、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルのような第三級アルキル基に結合している場合。酸切断可能な連結基の例には、アミン、イミン、アミノエステル、安息香酸イミン、ジオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、アセタール、ビニルエーテル、ヒドラゾン、シス－アコニテート、ヒドラジド、チオカルバモイル、イミジン、アジドメチル－メチルマレイン酸無水物、チオプロピオネート、マスクされたエンドソーム溶解剤、シトラコニル基、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ジスルフィド結合もｐＨの影響を受けやすい。

【0400】

いくつかの態様では、リンカーは低ｐＨに不安定なヒドラゾン結合を含む。このような酸に不安定な結合は、コンジュゲート、例えば抗体薬物コンジュゲートの分野で広く使用されてきた。例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１，１２，１４６０－７；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００８，４，１０２４－３７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００７，６，８３８－５０；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００７，３２１，４６２－８；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６，５８，２２９－３６；Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，７７８－８４を参照のこと。

【0401】

特定の実施形態では、リンカーは、以下：酸性環境（例えば、ｐＨが７未満、約４を超える）で不安定であり、ジオール及びケトンを形成するケタール；酸性環境（例えば、ｐＨが７未満、約４を超える）で不安定であり、ジオール及びアルデヒドを形成するアセタール；酸性環境（例えば、ｐＨが７未満、約４を超える）で不安定であり、アミン及びアルデヒドまたはケトンを形成するイミンまたはイミニウム；酸性条件下で不安定であるケイ素－酸素－炭素結合；ケイ素－窒素（シラザン）結合；ケイ素－炭素結合（例えば、アリールシラン、ビニルシラン、及びアリルシラン）；マレアメート（無水マレイン酸誘導体とアミンから合成されるアミド結合）；オルトエステル；ヒドラゾン；酸触媒による加水分解を受けるように設計された活性化カルボン酸誘導体（例えば、エステル、アミド）；またはビニルエーテルから選択される低ｐＨ不安定性結合を含む。

【0402】

さらなる例は、その内容が全体として参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，４９４Ｂ２号及び同第８，１３７，６９５Ｂ２号に見いだすことができる。

【0403】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｄ． 酵素切断可能なリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、細胞内または細胞外の酵素、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼによって切断可能なリンカーを含むことができる。リンカーの組み合わせにおける特定のリンカーを切断することができる酵素の範囲は、リンカーの特定の結合と化学構造に左右される。したがって、ペプチドリンカーは、例えば、ペプチダーゼによって切断することができ、エステル結合を含有するリンカーは、例えば、エステラーゼによって切断することができ；アミド結合を含有するリンカーは、例えば、アミダーゼによって切断することができる；等である。

【0404】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｅ． プロテアーゼ切断可能なリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせはプロテアーゼ切断可能なリンカー、すなわち、内在性プロテアーゼによって切断され得るリンカーを含む。特定のペプチドのみが細胞の内側または外側で容易に切断される。例えば、Ｔｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６２６－６２９（１９８２）及びＵｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．４３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６７７－６８４（１９８９）を参照のこと。切断可能なリンカーは、α－アミノ酸単位及びペプチド結合で構成される切断可能な部位を含有することができ、ペプチド結合は、化学的には１つのアミノ酸のカルボキシレートと第２のアミノ酸のアミノ基との間のアミド結合である。他のアミド結合、例えば、カルボキシレートとリジンのα－アミノ酸基の間の結合は、ペプチド結合ではないと理解され、切断不可であると見なされる。

【0405】

いくつかの態様では、プロテアーゼ切断可能リンカーは、プロテアーゼ、例えば、ネプリリシン（ＣＡＬＬＡまたはＣＤ１０）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）、ロイコトリエンＡ４ヒドロラーゼ、エンドテリン変換酵素、ｓｔｅ２４プロテアーゼ、ニューロリシン、ミトコンドリア中間ペプチダーゼ、間質性コラゲナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメリシン、マクロファージエラスターゼ、マトリライシン、ゲラチナーゼ、メプリン、プロコラーゲンＣ－エンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ－エンドペプチダーゼ、ＡＤＡＭ及びＡＤＡＭＴメタロプロテイナーゼ、ミエリン関連メタロプロテイナーゼ、エナメリシン、腫瘍壊死因子α変換酵素、インスリシン、ナルジリシン、ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ、マグノリシン、ダクチリシン様メタロプロテアーゼ、好中球コラゲナーゼ、マトリックスメタロペプチダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＳＰ２エンドペプチダーゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、ウロキナーゼ、ヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰα）、トリプシン、キモトリプシン、カルデクリン、膵臓エラスターゼ、膵臓エンドペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、白血球エラスターゼ、骨髄芽細胞、キマーゼ、トリプターゼ、グランザイム、角質層キモトリプシン酵素、アクロシン、カリクレイン、補体成分及び因子、代替補体経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ、凝固因子、トロンビン、プロテインｃ、ｕ及びｔ型プラスミノーゲンアクチベーター、カテプシンＧ、ヘプシン、プロスタシン、肝細胞増殖因子活性化エンドペプチダーゼ、サブチリシン／ケキシン型プロタンパク質コンバターゼ、フリン、プロタンパク質コンバターゼ、プロリルペプチダーゼ、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリカミナーゼ、シグナルペプチダーゼ、ｎ末端求核性アミノヒドロラーゼ、２０代プロテアソーム、γ－グルタミルトランスペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼ、ミトコンドリアエンドペプチダーゼＩａ、ｈｔｒａ２ペプチダーゼ、マトリプターゼ、サイト１プロテアーゼ、レグマイン、カテプシン、システインカテプシン、カルパイン、ユビキチンイソペプチダーゼＴ、カスパーゼ、グリコシルホスファチジルイノシトールタンパク質トランスアミダーゼ、がん凝血促進剤、プロホルモンチオールプロテアーゼ、γ－グルタミルヒドロラーゼ、ブレオマイシンヒドロラーゼ、セプラーゼ、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、カテプシンＭ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、キモシン、ガストリクシン、レニン、ヤプシン及び／またはマプシン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、または一般的に任意のＡｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－ＣまたはＡｒｇ－Ｃプロテアーゼについての切断部位を含む。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７７（２４）：７０２７－７０３７（２０１７）を参照のこと。

【0406】

いくつかの態様では、切断可能なリンカー成分は１～１０のアミノ酸残基を含むペプチドを含む。これらの態様では、ペプチドは、プロテアーゼによるリンカーの切断を可能にし、それによって、リソソーム酵素のような細胞内プロテアーゼへの曝露時に生物学的に活性がある分子の放出を容易にする（Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７７８－７８４）。例示的なペプチドには、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド及びヘキサペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0407】

ペプチドは、天然に存在する及び／または天然に存在しないアミノ酸残基を含んでもよい。「天然に存在するアミノ酸」という用語は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｉｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを指す。「非天然型アミノ酸」（すなわち、アミノ酸が天然に存在しない）には、非限定的な例として、ホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノ－システイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、ベータ－アラニン、Ｌ－またはＤ－ナフトアラニン、オルニチン（「Ｏｒｎ」）等が挙げられる。特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断のためにペプチドを設計する及び最適化することができる。

【0408】

アミノ酸には天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のＤ型も含まれる。「Ｄ－」は、天然に存在する（「Ｌ－」）アミノ酸における配置に対立するものとして、「Ｄ」（右旋性の）配置を有するアミノ酸を示す。天然及び非天然のアミノ酸は、商業的に購入（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）することができ、当該技術分野で既知の方法を用いて合成することができる。

【0409】

例示的なジペプチドには、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチル－バリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン及びベータ－アラニン－リジンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なトリペプチドには、グリシン－バリン－シトルリン（ｇｌｙ－ｖａｌ－ｃｉｔ）及びグリシン－グリシン－グリシン（ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0410】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｆ． エステラーゼ切断可能なリンカー
一部のリンカーは、エステラーゼによって切断される（「エステラーゼ切断可能なリンカー」）。特定のエステルだけが細胞内または細胞外に存在するエステラーゼ及びアミダーゼによって切断され得る。エステルは、カルボン酸及びアルコールの縮合によって形成される。単純エステルは、単純アルコール、例えば、脂肪族アルコール、ならびに小環状及び小芳香族アルコールで生成されるエステルである。エステルに基づく切断可能な連結基の例には、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な連結基は一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。

【0411】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｇ． ホスファターゼ切断可能なリンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断されるリン酸に基づく切断可能な連結基を含むことができる。細胞内リン酸基を切断する薬剤の例は細胞内ホスファターゼのような酵素である。リン酸に基づく連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｓ－、－ＳＰ（Ｓ）（ＯＲ_ｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｒ_ｋ）－Ｓ－、または－ＯＰ（Ｓ）（Ｒ_ｋ）－Ｓ－である。

【0412】

種々の態様では、Ｒ_ｋは、以下：ＮＨ_２、ＢＨ_３、ＣＨ_３、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_６－１０アリール、Ｃ_１－６アルコキシ及びＣ_６－１０アリール－オキシのいずれかである。いくつかの態様では、Ｃ_１－６アルキル及びＣ_６－１０アリールは非置換である。さらなる非限定的な例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－ＳＰ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－ＯＰ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－、または－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。

【0413】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｈ． 光活性化された切断可能なリンカー
いくつかの態様では、組み合わせリンカーは、光活性化された切断可能なリンカー、例えば、ニトロベンジルリンカーまたはニトロベンジル反応性基を含むリンカーを含む。

【0414】

ＩＩＩ．Ｂ．３．ｉ． 自壊型リンカー
いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは自壊型リンカーを含む。いくつかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）における自壊型リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーの酵素的切断後に１，４脱離を受ける。いくつかの態様では、本開示のＥＶ（例えば、エクソソーム）における自壊性リンカーは、本開示の該自壊性リンカーは、プロテアーゼ切断可能リンカーの酵素的切断後に１，６脱離を受ける。いくつかの態様では、自壊型リンカーは、例えば、ｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）、ｐ－アミノベンジルエーテル（ＰＡＢＥ）、ｐ－アミノベンジルカーボネート、またはそれらの組み合わせのようなｐ－アミノベンジル（ｐＡＢ）誘導体である。

【0415】

特定の態様では、自壊型リンカーは芳香族基を含む。いくつかの態様では、芳香族基は、ベンジル、シンナミル、ナフチル、及びビフェニルから成る群から選択される。いくつかの態様では、芳香族基は複素環式である。他の態様では、芳香族基は少なくとも１つの置換基を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＯ^３＋、ＮＨＣＯＣＨ_３、Ｎ（ＣＨ_３）_２、ＮＨＣＯＣＦ_３、アルキル、ハロアルキル、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルハライド、カルボキシレート、サルフェート、スルファメート、及びスルホネートから成る群から選択される。他の態様では、芳香族基の少なくとも１つのＣはＮ、ＯまたはＣ－Ｒ＊で置換され、その際、Ｒ＊はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ＯＨ、メチル、メトキシ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＯ^３＋、ＮＨＣＯＣＨ_３、Ｎ（ＣＨ_３）_２、ＮＨＣＯＣＦ_３、アルキル、ハロアルキル、ハロゲン化Ｃ_１－Ｃ_８アルキルハライド、カルボキシレート、スルフェート、スルファメート、及びスルホネートから独立して選択される。

【0416】

いくつかの態様では、自壊型リンカーは、アミノベンジルカルバメート基（例えば、パラアミノベンジルカルバメート）、アミノベンジルエーテル基、またはアミノベンジルカーボネート基を含む。一態様では、自壊型リンカーはｐ－アミノベンジルカルバメート（ｐＡＢＣ）である。

【0417】

ｐＡＢＣは、自壊型の部位特異的プロドラッグ活性化のための最も効率的で最も普及しているコネクター結合である（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：４７９－４８０（１９８１）；ＷＯ１９８１／００１１４５；Ｒａｕｔｉｏ ｅｔ ｌａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：２５５－２７０（２００８）；Ｓｉｍｐｌｉｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １３：５１９－５４７（２００８）を参照のこと）。

【0418】

いくつかの態様では、自壊型リンカーは生物学的に活性がある分子（例えば、ＡＳＯ）をプロテアーゼ切断可能な基質（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔ）に接続する。特定の態様では、ｐＡＢＣ自壊型リンカーのカルバメート基は、生物学的に活性がある分子（例えば、ＡＳＯ）のアミノ基に接続され、ｐＡＢＣ自壊型リンカーのアミノ基はプロテアーゼ切断可能な基質に接続される。

【0419】

アミノベンジル基の芳香環は、任意で、芳香環上の１以上（例えば、Ｒ_１及び／またはＲ_２）置換基で置換することができ、それは、そうでなければ、環を形成する４つの非置換炭素のうちの１つに結合している水素を置換する。本明細書で使用されるとき、記号「Ｒ_ｘ」（例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４）は、本明細書で記載されているような置換基を表す一般的な略語である。

【0420】

置換基は、ｐ－アミノベンジル基の自壊能力を改善することができる（Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：２７５９－２７７０（１９９９）；Ｓｙｋｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１：１６０１－１６０８（２０００）も参照のこと）。

【0421】

自壊型脱離は、例えば、１，４脱離、１，６脱離（例えば、ｐＡＢＣ）、１，８脱離（例えば、ｐ－アミノ－シンナミルアルコール）、β－脱離、環化－脱離（例えば、、４－アミノブタノールエステル及びエチレンジアミン）、環化／ラクトン化、環化／ラクトル化などを通して生じることができる。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：１８０２－１８２６（２００８）；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４７５－４８７（２０００）を参照のこと。

【0422】

いくつかの態様では、自壊型リンカーは、例えば、シンナミル基、ナフチル基、またはビフェニル基を含むことができる（例えば、Ｂｌｅｎｃｏｗｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．２：７７３－７９０（２０１１）を参照のこと）。いくつかの態様では、自壊型リンカーは複素環を含む（例えば、米国特許第７，３７５，０７８号；同第７，７５４，６８１号を参照のこと）。多数のホモ芳香族（例えば、Ｃａｒｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．２４：４７９（１９８１）；Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：２９７５（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：１１９７（１９７８）；Ａｎｄｒｉａｎｏｍｅｎｊａｎａｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２：１９０３（１９９２））、及びクマリン（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６：５５３（２０１０））、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピロール、ピラゾール（例えば、Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：５５３３（２００３））、ピリジン（例えば、Ｐｅｒｒｙ－Ｆｅｉｇｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７：４８２５（２００９））、イミダゾン（例えば、Ｎａｉｌｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．Ｚ：１２６７（１９９９）；Ｈａｙ ａｎｄ Ｄｅｎｎｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３８：８４２５（１９９７））、及びトリアゾール（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ ａｎｄ Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７２：３５９６（２００７））に基づくヘテロ芳香族基は水性条件下及び生理的条件下双方で自壊型であり、当該技術分野で知られている。米国特許第７，６９１，９６２号；同第７，０９１，１８６号；米国特許公開番号ＵＳ２００６／０２６９４８０；ＵＳ２０１０／００９２４９６；ＵＳ２０１０／０１４５０３６；ＵＳ２００３／０１３０１８９；ＵＳ２００５／０２５６０３０）も参照のこと。

【0423】

いくつかの態様では、本明細書で開示されているリンカーの組み合わせは、タンデムの、例えば、２以上のｐＡＢＣユニットにて１を超える自壊型リンカーを含む。例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６：８８１５－８８３０（２００１）を参照のこと。いくつかの態様では、本明細書で開示されているリンカーの組み合わせは、蛍光発生プローブに連結された自壊型リンカー（例えば、ｐ－アミノベンジルアルコールまたはｐ－カルボキシベンズアルデヒドもしくはグリオキシル酸のヘミチオアミナール誘導体）を含むことができる（例えば、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：１７７７－１７８０（２０１０）を参照のこと）。

【0424】

自壊型リンカーにおける置換基が、左から右へ記述された、それらの従来の化学式によって特定される場合、それらは、構造を右から左へ記述することによって生じることになる化学的に同一な置換基を等しく包含する。例えば、「－ＣＨ_２Ｏ－」は「－ＯＣＨ_２－」も列挙するように意図される。

【0425】

自壊型における置換基、例えば、上記で議論されたようなｐ－アミノベンジル自壊型リンカーにおけるＲ_１及び／またはＲ_２置換基には、例えば、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルアミノ、アルキルチオ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、ヘテロアリールなどを挙げることができる。本開示の化合物が１を超える置換基を含む場合、各置換基は独立して選択される。

【0426】

いくつかの具体的な態様では、自壊型リンカーは切断可能なペプチドリンカーに結合され、以下の式を有し、その組み合わせは、以下の式を有する：
－Ａ_ａ－Ｙ_ｙ－
式中、各－Ａ－は独立してアミノ酸単位であり、ａは独立して１から１２までの整数であり；－Ｙ－は自壊型スペーサーであり、ｙは１または２である。いくつかの態様では、－Ａ_ａ－は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、またはヘキサペプチドである。いくつかの態様では、－Ａ_ａ－は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジン、Ｎ－メチルバリン－シトルリン、シクロヘキシルアラニン－リジン、及びベータ－アラニン－リジンから成る群から選択される。いくつかの態様では、－Ａ_ａ－はバリン－アラニンまたはバリン－シトルリンである。

【0427】

いくつかの態様では、自壊型リンカー－Ｙ_ｙ－は以下の式を有する：

【化20】

式中、各Ｒ^２は独立して、Ｃ_１－８アルキル、－Ｏ－（Ｃ_１－８アルキル）、ハロゲン、ニトロ、またはシアノであり；ｍは０から４までの整数である。いくつかの態様では、ｍは０、１、または２である。いくつかの態様では、ｍは０である。

【0428】

いくつかの態様では、切断可能なリンカーはバリン－アラニン－ｐ－アミノベンジルカルバメートまたはバリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルカルバメートである。

【0429】

ＩＩＩ．Ｂ．４． 反応性部分（ＲＭ）
本開示のＡＳＯは、それらの成分間の化学合成または化学反応のいずれかを介して生成される。例えば、いくつかの態様では、反応性基（例えば、マレイミド）を含むアンカー部分は、マレイミド反応基を含むＡＳＯと反応して、本開示の疎水性に修飾されたＡＳＯを生成することができ、その際、アンカー部分は、エクソソームの膜の脂質二重層に挿入してもよく、それによってエクソソームの表面にＡＳＯを結合させる。

【0430】

本開示の疎水性に修飾されたＡＳＯの任意の成分または成分の群は、少なくともＲＧ及び／またはＲＭを含むことができ、それにより、１つの反応または一連の反応を介した成分の結合を可能にし、本開示の疎水性に修飾されたＡＳＯが得られる。疎水性に修飾されたＡＳＯを生成するための例示的な合成スキーマには：
［ＡＭ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［ＡＭ］－［Ｌ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］→［ＡＭ］－［Ｌ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］が挙げられ、
式中、［ＡＭ］はアンカー部分であり、［ＡＳＯ］はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、［Ｌ］はリンカーまたはリンカーの組み合わせであり、／ＲＭ／は反応性部分であり、／ＲＧ／は反応性基である。提供されている概略図のいずれにおいても、ＡＳＯは、例えば、その５’末端または３’末端を介して結合することができる。

【0431】

ＡＳＯの合成における中間体の生成のための例示的な合成スキーマには：
［ＡＭ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［Ｌ］→［ＡＭ］－［Ｌ］
［ＡＭ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［Ｌ］→［ＡＭ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［Ｌ］→［Ｌ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［Ｌ］→［Ｌ］－［Ｌ］
［Ｌ］－／ＲＭ／＋／ＲＧ／－［ＡＳＯ］→［Ｌ］－［ＡＳＯ］
［Ｌ］－／ＲＧ／＋／ＲＭ／－［ＡＳＯ］→［Ｌ］－［ＡＳＯ］が挙げられ、
式中、［ＡＭ］はアンカー部分であり、［ＡＳＯ］はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、［Ｌ］はリンカーまたはリンカーの組み合わせであり、／ＲＭ／は反応性部分であり、／ＲＧ／は反応性基である。提供されている概略図のいずれにおいても、ＡＳＯは、例えば、その５’末端または３’末端を介して結合することができる。

【0432】

いくつかの態様では、反応性基「／ＲＧ／」は、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボン酸基、またはアジド基であり得る。これらの反応性基と反応することができる特定の反応性部分「／ＲＭ／」は、以下でさらに詳細に説明される。

【0433】

［ＡＭ］－（／ＲＭ／）ｎ＋（／ＲＧ／－［Ｌ］－［ＡＳＯ］）ｎ→［ＡＭ］－［Ｌ］－［ＡＳＯ］

【0434】

本明細書で開示されているアンカー部分、リンカーまたはリンカーの組み合わせ、またはＡＳＯのいずれかは、反応性部分、例えば、アミノ反応性部分（例えば、ＮＨＳ－エステル、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート、またはアルデヒド）、チオール反応性部分（例えば、アクリレート、マレイミド、またはピリジルジスルフィド）、ヒドロキシ反応性部分（例えば、イソチオシアネートまたはイソシアネート）、カルボン酸反応性部分（例えば、エポキシド）、またはアジド反応性部分（例：アルキン）とコンジュゲートすることができる。

【0435】

本明細書で開示されている２つの成分（例えば、アンカー部分とＡＳＯ、またはアンカー部分とリンカー、またはアンカー部分とリンカー、または２つのリンカー、またはリンカーとＡＳＯ、または２つのアンカー部分）を共有結合するのに使用することができる例示的な反応性部分には、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｎ－４－マレイミド酪酸、Ｓ－（２－ピリジルジチオ）システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、Ｎ－（４－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド、Ｎ－［５－（３’－マレイミドプロピルアミド）－１－カルボキシペンチル］イミノ二酢酸、Ｎ－（５－アミノペンチル）イミノ二酢酸、及び１’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト）が挙げられる。二官能性リンカー（２つの官能基を含有するリンカー）も使用できる。

【0436】

いくつかの態様では、アンカー部分、リンカー、またはＡＳＯは、末端オキシアミノ基、例えば、－ＯＮＨ２、ヒドラジノ基、－ＮＨＮＨ２、メルカプト基（すなわち、ＳＨまたはチオール）、またはオレフィン（例えば、ＣＨ＝ＣＨ２）を含むことができる。いくつかの態様では、アンカー部分、リンカー、またはＡＳＯは、求電子製部分、例えば、末端位置にて、例えば、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、またはブロシレート、または活性化カルボン酸エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ホスホルアミダイト、またはペンタフルオロフェニルエステルを含むことができる。いくつかの態様では、共有結合は、リガンドの求核性基、例えば、ヒドロキシル基、チオール基またはアミノ基を求電子性基とカップリングすることによって形成することができる。

【0437】

本発明は、当該技術分野で知られているものを含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の反応性基及び反応性部分に適している。

【0438】

本明細書で使用されるとき「保護基」という用語は、合成手順中の望ましくない反応に対して、ヒドロキシル基、アミノ基及びチオール基を含むが、これらに限定されない反応性基を保護することが当該技術分野で知られている不安定な化学部分を指す。保護基は通常、他の反応部位での反応中に部位を保護するために選択的及び／または直交して使用され、その後、除去されて、保護されていない基をそのまま、またはさらなる反応に利用できるようにすることができる。当該技術分野で知られている保護基は一般に、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。

【0439】

さらに、種々の合成工程を代替の順序または順で実行して、所望の化合物を得ることができる。本明細書に記載されている化合物を合成するのに有用な合成化学変換及び保護基の方法論（保護及び脱保護）は当該技術分野で知られており、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）、及びそれらに続く版に記載されているようなものに含まれる。

【0440】

当該技術分野で知られている固相合成が追加的または代替的に採用されてもよい。自動合成技術を含む好適な固相技術は、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）及びＴｏｙ，Ｐ．Ｈ．；Ｌａｍ，Ｙ（ｅｄ．），Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２）に記載されている。

【0441】

いくつかの態様では、反応性基は、代わりに、以下に記載されている反応性部分の１を超えるものと反応することができる。

【0442】

ＩＩＩ．Ｂ．４．ａ． アミン反応性部分
いくつかの態様では、反応性部分はアミン反応性部分である。本明細書で使用されるとき、「アミン反応性部分」という用語は、アミノ部分を有する反応性基、例えば、第１級アミンと反応することができる化学基を指す。例示的なアミン反応性部分は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ－エステル）、ｐ－ニトロフェノール、イソチオシアネート、イソシアネート、及びアルデヒドである。第１級アミンと反応する代替の反応性部分もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの態様では、アミン反応性部分は、本開示のアンカー部分、リンカーの組み合わせ、またはＡＳＯの末端位置に結合することができる。

【0443】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はＮＨＳ－エステルである。通常、ＮＨＳ－エステル反応性部分は反応性基の第１級アミンと反応して、安定したアミド結合とＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を生成する。

【0444】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はｐ－ニトロフェノール基である。通常、ｐ－ニトロフェノール反応性部分は、反応性基の第１級アミンと反応して安定なカルバメート部分とｐ－ニトロフェノールを生成する活性化カルバメートである。

【0445】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はイソチオシアネートである。通常、イソチオシアネートは反応性基の第１級アミンと反応して、安定したチオ尿素部分を生成する。

【0446】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はイソシアネートである。通常、イソシアネートは反応性基の第１級アミンと反応して、安定した尿素部分を生成する。

【0447】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はアルデヒドである。通常、アルデヒドは第１級アミンと反応してシッフ塩基を形成し、これがさらに還元されて還元的アミノ化を介して共有結合を形成することができる。

【0448】

ＩＩＩ．Ｂ．４．ｂ． チオール反応性部分
いくつかの態様では、反応性部分はチオール反応性部分である。本明細書で使用されるとき、「チオール反応性部分」という用語は、チオール部分（またはメルカプト基）を有する反応性基と反応することができる化学基を指す。例示的なチオール反応性部分は、アクリレート、マレイミド、及びピリジルジスルフィドである。チオールと反応する代替の反応性部分もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの態様では、チオール反応性部分は、本開示のアンカー部分、リンカーの組み合わせ、またはＡＳＯの末端位置に結合することができる。

【0449】

いくつかの態様では、チオール反応性部分はアクリレートである。通常、アクリレートは、アクリレートのカルボニルに対して炭素βでチオールと反応して安定したスルフィド結合を形成する。

【0450】

いくつかの態様では、チオール反応性部分はマレイミドである。通常、マレイミドは、カルボニルに対して炭素βでチオールと反応して安定したスルフィド結合を形成する。

【0451】

いくつかの態様では、チオール反応性部分はピリジルジスルフィドである。通常、ピリジルジスルフィドは、ピリジルに対してイオウ原子βでチオールと反応して、安定したジスルフィド結合とピリジン－２－チオンを形成する。

【0452】

ＩＩＩ．Ｂ．４．ｃ． ヒドロキシ反応性部分
いくつかの態様では、反応性部分はヒドロキシ反応性部分である。本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシル反応性部分」という用語は、ヒドロキシル部分を有する反応性基と反応することができる化学基を指す。例示的なヒドロキシル反応性部分はイソチオシアネート及びイソシアネートである。ヒドロキシル部分と反応する代替の反応性部分もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの態様では、ヒドロキシル反応性部分は、本開示のアンカー部分、リンカーの組み合わせ、またはＡＳＯの末端位置に結合することができる。

【0453】

いくつかの態様では、ヒドロキシル反応性部分はイソチオシアネートである。通常、イソチオシアネートは反応性基のヒドロキシルと反応して、安定したカルバモチオエート部分を生成する。

【0454】

いくつかの態様では、アミン反応性部分はイソシアネートである。通常、イソシアネートは反応性基のヒドロキシルと反応して、安定したカルバメート部分を生成する。

【0455】

ＩＩＩ．Ｂ．４．ｄ． カルボン酸反応性部分
いくつかの態様では、反応性部分はカルボン酸反応性部分である。本明細書で使用されるとき、「カルボン酸反応性部分」という用語は、カルボン酸部分を有する反応性基と反応することができる化学基を指す。例示的なカルボン酸反応性部分はエポキシドである。カルボン酸部分と反応する代替の反応性部分もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの態様では、カルボン酸反応性部分は本開示のアンカー部分、リンカーの組み合わせ、またはＡＳＯの末端位置に結合することができる。

【0456】

いくつかの態様では、カルボン酸反応性部分はエポキシドである。通常、エポキシドはエポキシドの炭素原子のいずれかで反応性基のカルボン酸と反応して、酢酸２－ヒドロキシエチル部分を形成する。

【0457】

ＩＩＩ．Ｂ．４．ｅ． アジド反応性部分
いくつかの態様では、反応性部分はアジド反応性部分である。本明細書で使用されるとき、「アジド反応性部分」という用語は、アジド部分を有する反応性基と反応することができる化学基を指す。例示的なアジド反応性部分はアルキンである。アジド部分と反応する代替の反応性部分もまた、当該技術分野で周知である。いくつかの態様では、カルボン酸反応性部分は本開示のアンカー部分、リンカーの組み合わせ、またはＡＳＯの末端位置に結合することができる。

【0458】

いくつかの態様では、アジド反応性部分はアルキンである。通常、アルキンは、「クリックケミストリー」とも呼ばれる１，３－双極子付加環化反応を介して反応基のアジドと反応して、１，２，３－トリアゾール部分を形成する。

【0459】

ＩＩＩ．Ｂ．５． 具体例及びトポロジー
本開示の具体的な態様では、リンカーの組み合わせは、式
［アルキルリンカー］ｍ－［ＰＥＧ１］ｎ－［ＰＥＧ２］ｏのリンカーから成り、
式中、ｍ、ｎ、及びｏは０または１であり、ｍ、ｎ、またはｏの少なくとも１つはゼロではない。そのような式に係る例示的なリンカーの組み合わせは、Ｃ６－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ６－ＨＥＧ、Ｃ６－ＴＥＧ、Ｃ６、ＴＥＧ－ＨＥＧ、ＴＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ－ＨＥＧ、Ｃ８－ＨＥＧ、Ｃ８－ＴＥＧ、及びＣ８である。

【0460】

いくつかの態様では、リンカーの組み合わせは、１以上の切断可能なリンカー、例えば、酵素的切断可能リンカー及び自壊型リンカーと組み合わせた、切断不可のリンカー（例えば、ＴＥＧまたはＨＥＧ）を含む。

【0461】

特定の態様では、リンカーの組み合わせは、以下に示すように、リンカーの組み合わせＴＥＧ（切断不可のリンカー）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ（切断可能なリンカー）－ｐＡＢ（自壊型リンカー）を含む。

【化21】

【0462】

アンカー部分とリンカーの組み合わせの具体的な組み合わせを以下の表に示す。

【表2】

【表3-1】

【0463】

本開示のＡＳＯのような具体的なオリゴヌクレオチドを以下に例示する。
［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［ＨＥＧ］－［ＡＳＯ］

【化22】

［コレステロール］－［ＳＭａｌ］－［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］－［ｐＡＢ］－［ＡＳＯ］

【化23】

［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］－［Ｃ６］－［ＡＳＯ］

【化24】

［コレステロール］－［ＴＥＧ］－［ＳＳ］－［Ｃ６］－［ＡＳＯ］

【化25】

その際、［コレステロール］はコレステロールアンカー部分であり、［ＴＥＧ］はＴＥＧ切断不可リンカーであり、［ＨＥＧ］はＨＥＧ切断不可リンカーであり、［ＳＳ］はジスルフィドレドックス切断可能リンカーであり、［Ｃ６］はアルキル切断不可リンカーであり、［ＳＭａｌ］はＳ－マレイミドであり、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］はバリン－シトルリン切断可能リンカーであり、［ｐＡＢ］はｐＡＢ自壊型リンカーである。いくつかの態様では、本開示のＡＳＯは、上記に提供された例示的な構造に係る構造を有し、１以上の構成要素が、実施例に示されるものと同じクラスの構成要素によって置き換えられている。例えば、［コレステロール］アンカー部分は、本明細書で開示されている別のアンカー部分によって置換することができ、［ＴＥＧ］は本明細書で開示されている別の高分子切断不可リンカー（例えば、ＨＥＧ、ＰＥＧ、ＰＧ）によって置換することができ、［Ｖａｌ－Ｃｉｔ］は別のペプチダーゼ切断可能リンカーで置き換えることができ、または、［ｐＡＢ］は別の自壊型リンカーによって置換することができる。

【0464】

ＩＩＩ．Ｃ． 足場部分
１以上の足場部分をＥＶで発現させることができる。いくつかの態様では、１以上の足場部分を使用して本開示のＥＶにＡＳＯを固定する。他の態様では、１以上の足場部分を使用して、ＡＳＯに加えてタンパク質または分子をＥＶに固定する。したがって、本開示のＥＶは、ＡＳＯを連結するアンカー部分と、タンパク質または分子、例えば、標的指向化部分を連結する足場部分とを含む。いくつかの態様では、ＡＳＯは足場部分に連結される。いくつかの態様では、ＥＶは１を超える足場部分を含む。いくつかの態様では、第１のＡＳＯは第１の足場部分に連結され、第２のＡＳＯは第２の足場部分に連結される。いくつかの態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分は同じタイプの足場部分であり、例えば、第１及び第２の足場部分は双方とも足場Ｘタンパク質である。いくつかの態様では、第１の足場部分及び第２の足場部分は、異なるタイプの足場部分であり、例えば、第１の足場部分は足場Ｙタンパク質であり、第２の足場部分は足場Ｘタンパク質である。いくつかの態様では、第１の足場部分は本明細書で開示されている足場Ｙである。いくつかの態様では、第１の足場部分は本明細書で開示されている足場Ｘである。いくつかの態様では、第２の足場部分は本明細書で開示されている足場Ｙである。いくつかの態様では、第２の足場部分は本明細書で開示されている足場Ｘである。

【0465】

いくつかの態様では、ＥＶは１以上の足場部分を含み、それは、ＡＳＯをＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、内腔表面または外面のいずれかに）に固定することができる。特定の態様では、足場部分はポリペプチド（「足場タンパク質」）である。特定の態様では、足場タンパク質はエクソソームタンパク質またはその断片を含む。他の態様では、足場部分は非ポリペプチド部分である。いくつかの態様では、足場タンパク質には、エクソソーム膜で濃縮された種々の膜タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質、内在性タンパク質及び周辺タンパク質が含まれる。それらは、種々のＣＤタンパク質、トランスポーター、インテグリン、レクチン、及びカドヘリンを含むことができる。特定の態様では、足場部分（例えば、足場タンパク質）は足場Ｘを含む。他の態様では、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質）は足場Ｙを含む。さらなる態様では、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質）は足場Ｘと足場Ｙの双方を含む。

【0466】

ＩＩＩ．Ｃ．１． 足場Ｘを操作したＦＶ、例えば、エクソソーム
いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームはその組成が改変された膜を含む。例えば、それらの膜組成は、膜のタンパク質、脂質、またはグリカンの含量を変更することによって改変することができる。

【0467】

いくつかの態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは化学物質によって及び／またはＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合のような物理的方法によって生成される。他の態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは遺伝子操作によって生成される。遺伝子操作された産生細胞または遺伝子操作された細胞の子孫から産生されるＥＶ、例えば、エクソソームは改変された膜組成を含有することができる。いくつかの態様では、表面操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、さらに高いまたはさらに低い密度（例えば、さらに高い数）で足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）を有する、または足場部分の変異型もしくは断片を含む。

【0468】

例えば、表面操作されたＥＶ（例えば、足場Ｘ操作されたＥＶ）は、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｘ）またはその変異型または断片をコードする外来性配列で形質転換された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から産生され得る。外来性配列から発現される足場部分を含むＥＶは、改変された膜組成を含むことができる。

【0469】

足場部分の種々の修飾または断片を本開示の態様に使用することができる。例えば、結合剤への親和性が増強されるように修飾された足場部分は、結合剤を使用して精製することができる表面操作されたＥＶを生成するのに使用することができる。さらに効果的にＥＶ及び／または膜に向けられるように修飾された足場部分を使用することができる。エクソソーム膜を特異的にかつ効率的に標的とするのに必要な最小限の断片を含むように修飾された足場部分も使用することができる

【0470】

足場部分は、融合分子、例えば、ＡＳＯに対する足場Ｘの融合分子として発現されるように操作することができる。例えば、融合分子は、ＡＳＯに連結された本明細書に開示されている足場部分（例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはそれらの断片もしくは変異型）を含むことができる。

【0471】

いくつかの態様では、本明細書に記載されている表面が（例えば、足場Ｘ）操作されたＥＶは、当該技術分野で既知のＥＶと比べて優れた特性を示す。例えば、表面が（例えば、足場Ｘで）操作されたものは、天然に存在するＥＶまたは従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されるＥＶよりもそれらの表面で高度に濃縮された修飾タンパク質を含有する。さらに、本開示の表面が（例えば、足場Ｘで）操作されたＥＶは、天然に存在するＥＶまたは従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されるＥＶと比べて、さらに大きな、さらに特異的な、またはさらに制御された生物活性を有することができる。

【0472】

いくつかの態様では、足場ＸはプロスタグランジンＦ２受容体負調節因子（ＰＴＧＦＲＮポリペプチド）を含む。ＰＴＧＦＲＮタンパク質は、ＣＤ９パートナー１（ＣＤ９Ｐ－１）、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質Ｆ（ＥＷＩ－Ｆ）、プロスタグランジンＦ２アルファ受容体調節タンパク質、プロスタグランジンＦ２アルファ受容体関連タンパク質またはＣＤ３１５とも呼ばれる。ヒトＰＴＧＦＲＮタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９Ｐ２Ｂ２）の完全長アミノ酸配列を配列番号３０１として表３に示す。ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチド（配列番号３０１のアミノ酸１～２５）、細胞外ドメイン（配列番号３０１のアミノ酸２６～８３２）、膜貫通ドメイン（配列番３０１のアミノ酸８３３～８５３）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０１のアミノ酸８５４～８７９）を含有する。成熟ＰＴＧＦＲＮポリペプチドは、シグナルペプチドを含まない配列番号３０１、すなわち、配列番号３０１のアミノ酸２６～８７９から成る。いくつかの態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片はＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。他の態様では、本開示に有用なＰＴＧＦＲＮポリペプチド断片は、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの膜貫通ドメインならびに（ｉ）該膜貫通ドメインのＮ末端に少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０のアミノ酸、（ｉｉ）該膜貫通ドメインのＣ末端に少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５のアミノ酸、または（ｉ）及び（ｉｉ）の双方を含む。

【0473】

いくつかの態様では、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドの断片は１以上の機能ドメインまたは構造ドメイン、例えば、ＩｇＶを欠く。

【0474】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０１のアミノ酸２６～８７９に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０２に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて配列番号３０２のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号３０２のアミノ酸配列及び配列番号３０２のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【0475】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは、１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のアミノ酸配列及び配列番号３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、または３１８のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【表3-2】

【0476】

他の態様では、足場Ｘは、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のアミノ酸配列及び配列番号３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２３、または３２５のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【0477】

いくつかの態様では、足場Ｘは配列番号３０３で表されるベイシジン（ＢＳＧタンパク質）を含む。ＢＳＧタンパク質は、５Ｆ７、コラゲナーゼ刺激因子、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼインデューサー（ＥＭＭＰＲＩＮ）、白血球活性化抗原Ｍ６、ＯＫ血液型抗原、腫瘍細胞由来コラゲナーゼ刺激因子（ＴＣＳＦ）、またはＣＤ１４７としても知られている。ヒトＢＳＧタンパク質のＵｎｉｐｒｏｔ番号はＰ３５６１３である。ＢＳＧタンパク質のシグナルペプチドは配列番号３０３のアミノ酸１～２１である。配列番号３０３のアミノ酸１３８～３２３は細胞外ドメインであり、アミノ酸３２４～３４４は膜貫通ドメインであり、配列番号３０３のアミノ酸３４５～３８５は細胞質ドメインである。

【0478】

他の態様では、足場Ｘは配列番号３０３のアミノ酸２２～３８５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＢＳＧポリペプチドの断片は１以上の機能ドメインまたは構造ドメイン、例えば、ＩｇＶ、例えば、配列番号３０３の２２１～３１５を欠く。他の態様では、足場Ｘは配列番号３２６、３２７、または３２８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号３２６、３２７、または３２８のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは配列番号３２６、３２７、または３２８のアミノ酸配列及び配列番号３２６、３２７、または３２８のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【0479】

いくつかの態様では、足場Ｘは、ＣＤ８１パートナー３、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質２（ＥＷＩ－２）、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質４（ＫＣＴ－４）、ＬＩＲ－Ｄ１、プロスタグランジン調節様タンパク質（ＰＧＲＬ）またはＣＤ３１６としても知られる免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩｇＳＦ８またはＩＧＳＦ８タンパク質）を含む。完全長のヒトＩＧＳＦ８タンパク質はＵｎｉｐｒｏｔの受入番号Ｑ９６９Ｐ０であり、本明細書では配列番号３０４として示されている。ヒトＩＧＳＦ８タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０４のアミノ酸１～２７）、細胞外ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸２８～５７９）、膜貫通ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸５８０～６００）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０４のアミノ酸６０１～６１３）を有する。

【0480】

他の態様では、足場Ｘは配列番号３０４のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ８タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。他の態様では、足場Ｘは、配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｘは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、足場Ｘは、配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のアミノ酸配列及び配列番号３３０、３３１、３３２、または３３３のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【0481】

いくつかの態様では、本開示のための足場Ｘは、Ｇｌｕ－Ｔｒｐ－Ｉｌｅ ＥＷＩモチーフ含有タンパク質３（ＥＷＩ－３）としても知られ、配列番号３０９のアミノ酸配列として示されている免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩｇＳＦ３またはＩＧＳＦ３タンパク質）を含む。ヒトＩＧＳＦ３タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０９のアミノ酸１～１９）、細胞外ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸２０～１１２４）、膜貫通ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸１１２５～１１４５）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０９のアミノ酸１１４６～１１９４）を有する。

【0482】

他の態様では、足場Ｘは配列番号３０９のアミノ酸２８～６１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ３タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0483】

いくつかの態様では、本開示のための足場Ｘはフィブロネクチン受容体サブユニットベータ、糖タンパク質ＩＩａ（ＧＰＩＩＡ）、ＶＬＡ－４サブユニットベータ、またはＣＤ２９としても知られ、配列番号３０５のアミノ酸配列として示されているインテグリンベータ－１（ＩＴＧＢ１タンパク質）を含む。ヒトＩＴＧＢ１タンパク質は、シグナルペプチド（配列番号３０５のアミノ酸１～２０）、細胞外ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸２１～７２８）、膜貫通ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸７２９～７５１）、及び細胞質ドメイン（配列番号３０５のアミノ酸７５２～７９８）を有する。

【0484】

他の態様では、足場Ｘは配列番号３０５のアミノ酸２１～７９８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＩＴＧＢ１タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0485】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチド（配列番号３０６のアミノ酸１～３３）を含まない配列番号３０６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＩＴＧＡ４タンパクを含む。いくつかの態様では、ＩＴＧＡ４タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0486】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３０７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＳＬＣ３Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＳＬＣ３Ａ２タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0487】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１０と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ１タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0488】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１１と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ２タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0489】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１２と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ３タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0490】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１３と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ１Ａ４タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ１Ａ４タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0491】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１４と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ１タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0492】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１５と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0493】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１６と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ３タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0494】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＡＴＰ２Ｂ４タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＡＴＰ２Ｂ４タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0495】

他の態様では、足場Ｘは、シグナルペプチドを含まない配列番号３１８と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含むＩＧＳＦ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、ＩＧＳＦ２タンパク質はＩｇＶのような１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く。

【0496】

他の足場Ｘタンパク質の非限定的な例は、その全体が参照によって組み込まれる２０１９年２月５日に発行された米国特許第１０，１９５，２９０ Ｂ１号に見いだすことができる。

【0497】

いくつかの態様では、配列はネイティブタンパク質のＮ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様では、配列はネイティブタンパク質のＣ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。一部の実施形態では、配列はネイティブタンパク質のＮ末端及びＣ末端の双方からの少なくとも５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、または８００のアミノ酸を欠く足場部分の断片をコードする。いくつかの態様では、配列はネイティブタンパク質の１以上の機能ドメインまたは構造ドメインを欠く足場部分の断片をコードする。

【0498】

いくつかの態様では、足場部分、例えば、足場Ｘ、例えば、ＰＴＧＦＲＮタンパク質は１以上の異種タンパク質に連結される。１以上の異種タンパク質は足場部分のＮ末端に連結することができる。１以上の異種タンパク質は足場部分のＣ末端に連結することができる。いくつかの態様では、１以上の異種タンパク質は足場部分のＮ末端及びＣ末端の双方に連結される。いくつかの態様では、異種タンパク質は哺乳動物タンパク質である。いくつかの態様では、異種タンパク質はヒトタンパク質である。

【0499】

いくつかの態様では、足場Ｘを使用して、任意の部分、例えば、ＡＳＯをＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面及び外面に同時に連結することができる。例えば、ＰＴＧＦＲＮポリペプチドを使用してＡＳＯをＥＶ、例えば、エクソソームの外面に加えて、内腔の内側（例えば、内腔表面）に連結することができる。したがって、特定の態様では、二重の目的のために、例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面のＡＳＯ及び外面のＡＳＯのために足場Ｘを使用することができる。いくつかの態様では、足場ＸはＥＶの内腔表面及び／またはＥＶの外面にＡＳＯを固定することができる足場タンパク質である。

【0500】

ＩＩＩ．Ｃ．２． 足場Ｙを操作したＦＶ、例えば、エクソソーム
いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは天然に存在するＥＶのものとは異なる内部空間（すなわち、内腔）を含む。例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面の組成が天然に存在するエクソソームのものとは異なるタンパク質、脂質、またはグリカンの含量を有するようにＥＶを変化させることができる。

【0501】

いくつかの態様では、操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面の組成または含量を変化させる、足場部分（例えば、エクソソームタンパク質、例えば、足場Ｙ）または足場部分の修飾もしくは断片をコードする外来性配列で形質転換された細胞から産生され得る。ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面で発現され得るエクソソームタンパク質の種々の修飾または断片を本開示の態様に使用することができる。

【0502】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面を変化させることができるエクソソームタンパク質には、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）タンパク質、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）タンパク質、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）タンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0503】

いくつかの態様では、足場ＹはＭＡＲＣＫＳタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ２９９６６）を含む。ＭＡＲＣＫＳタンパク質は、プロテインキナーゼＣ基質、８０ｋＤａタンパク質、軽鎖としても知られている。完全長のヒトＭＡＲＣＫＳタンパク質は３３２アミノ酸の長さであり、アミノ酸残基１５２～１７６にカルモジュリン結合ドメインを含む。いくつかの態様では、足場ＹはＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ４９００６）を含む。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質はＭＡＲＣＫＳ様タンパク質１としても知られており、マクロファージのミリストイル化されたアラニンに富むＣキナーゼ基質である。完全長のヒトＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は１９５アミノ酸の長さである。ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は、アミノ酸残基８７～１１０で脂質結合及びカルモジュリン結合に関与するエフェクタードメインを有する。いくつかの態様では、足場ＹはＢＡＳＰ１タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｐ８０７２３）を含む。ＢＡＳＰ１タンパク質は、２２ｋＤａの神経組織に富む酸性タンパク質または神経軸索膜タンパク質ＮＡＰ－２２としても知られている。完全長のヒトＢＡＳＰ１タンパク質配列（異性体１）は２２７アミノ酸の長さである。選択的スプライシングによって生成された異性体は、配列番号４０３からアミノ酸８８～１４１が欠落している（異性体１）。表４は、本明細書で開示されている例示的な足場Ｙの完全長配列（すなわち、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１タンパク質）を提供する。

【表4】

【0504】

成熟ＢＡＳＰ１タンパク質の配列は、配列番号４０３から最初のＭｅｔを欠いているので、配列番号４０３のアミノ酸２～２２７を含有する。同様に、成熟したＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質も、それぞれ配列番号４０１及び４０２からの最初のＭｅｔを欠く。したがって、成熟ＭＡＲＣＫＳタンパク質は配列番号４０１のアミノ酸２～３３２を含有する。成熟ＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質は配列番号４０２のアミノ酸２～２２７を含有する。

【0505】

他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは配列番号４０３のアミノ酸２～２２７と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、足場Ｙは配列番号４０４～５６７のいずれか１つと少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。他の態様では、本開示に有用な足場Ｙは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号４０３のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本開示に有用な足場Ｙは１つのアミノ酸変異、２つのアミノ酸変異、３つのアミノ酸変異、４つのアミノ酸変異、５つのアミノ酸変異、６つのアミノ酸変異、または７つのアミノ酸変異を除いて、配列番号４０３のアミノ酸残基１でのＭｅｔを含まない配列番号４０３のアミノ酸配列を含む。変異は、置換、挿入、欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、本開示に有用な足場Ｙは、配列番号４０４～５６７のいずれか１つのアミノ酸配列ならびに配列番号４０４～５６７のＮ末端及び／またはＣ末端にて１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸長いまたはそれより長いアミノ酸を含む。

【0506】

いくつかの態様では、配列番号４０４～５６７のいずれかのタンパク質配列は本開示のための足場Ｙ（例えば、ＡＳＯに連結された足場部分）であるのに十分である。

【0507】

いくつかの態様では、本開示に有用な足場ＹはＧＸＫＬＳＫＫＫを伴うペプチドを含み、Ｘはアラニンまたは任意の他のアミノ酸（配列番号４０４）である。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）の配列を持つペプチドを含み、その際、各括弧内の位置はアミノ酸を表し、πは（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり、ξは（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）から成る群から選択された任意のアミノ酸であり、（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり；５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でもなく（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。さらなる態様では、本明細書に記載されているエクソソーム（例えば、操作されたエクソソーム）は、（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）の配列を持つペプチドを含み、その際、各括弧内の位置はアミノ酸を表し、πは（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、Φは（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり、かつ（＋）は（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）から成る群から選択される任意のアミノ酸であり；かつ５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でもなく（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。アミノ酸の命名法についてはＡａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５１３（２００２）１４１－１４４を参照のこと。

【0508】

他の態様では、足場Ｘは配列番号４０４～５６７のいずれか１つに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0509】

本明細書に記載されている足場Ｙで操作されたＥＶ、例えば、エクソソームは配列番号４０４～５６７に示される配列で形質転換された細胞から生成することができる。

【0510】

いくつかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は、「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、ＮＤ及び／またはＥＤはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。いくつかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質は細胞内ドメインと膜貫通ドメインと細胞外ドメインとを含み、細胞内ドメインは「Ｎ末端ドメイン」（ＮＤ）及び「エフェクタードメイン」（ＥＤ）を含み、ＮＤ及び／またはＥＤはＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。本明細書で使用される、「と会合する」という用語は、足場タンパク質とＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面との間の相互作用を指し、これは、膜成分への共有結合を伴わない。例えば、本開示に有用な足場はＥＶの内腔表面と、例えば、脂質アンカー（例えば、ミリスチン酸）及び／または膜リン脂質の負に電荷したヘッドと静電相互作用する多塩基ドメインを介して会合することができる。他の態様では、足場Ｙタンパク質はＮ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、その際、ＮＤはＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤはイオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続する塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を順に含む。

【0511】

他の態様では、足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、その際、ＮＤはＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤはイオン相互作用によってＥＶの内腔表面と会合し、ＥＤは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの連続する塩基性アミノ酸、例えば、リジン（Ｌｙｓ）を順に含む。

【0512】

いくつかの態様では、ＮＤは脂質化を介して、例えば、ミリストイル化を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。いくつかの態様では、ＮＤはＮ末端にＧｌｙを有する。いくつかの態様では、Ｎ末端Ｇｌｙはミリストイル化される。

【0513】

いくつかの態様では、ＥＤはイオン相互作用を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。いくつかの態様では、ＥＤは静電相互作用、特に誘引性の静電相互作用を介してＥＶ、例えば、エクソソームの内腔表面と会合する。

【0514】

いくつかの態様では、ＥＤは、（ｉ）塩基性アミノ酸（例えば、リジン）、または（ｉｉ）ポリペプチド配列において互いに隣接する２以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン）を含む。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）である。いくつかの態様では、塩基性アミノ酸は（Ｌｙｓ）ｎであり、その際、ｎは１～１０の整数である。

【0515】

他の態様では、ＥＤのＮ末端がＮＤのＣ末端でリジンに直接連結されている場合、すなわち、リジンがＥＤのＮ末端にあり、ＮＤのＣ末端のリジンに融合されている場合、ＥＤは少なくともリジンを含み、ＮＤはＣ末端にリジンを含む。他の態様では、ＥＤのＮ末端がリンカー、例えば、１以上のアミノ酸によってＮＤのＣ末端に連結されている場合、ＥＤは少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。

【0516】

いくつかの態様では、ＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ｒ、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）、ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＥＤは、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に示されるアミノ酸配列を含み、その際、ＧはＧｌｙを表し；「：」はペプチド結合を表し；Ｘ２からＸ６のそれぞれは、独立してアミノ酸を表し；Ｘ６は塩基性アミノ酸を表す。いくつかの態様では、選択されるＸ６アミノ酸はＬｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓから成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｘ５アミノ酸は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｘ２アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｘ４はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔから成る群から選択される。

【0517】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、Ｎ末端ドメイン（ＮＤ）及びエフェクタードメイン（ＥＤ）を含み、その際、ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６に示されるアミノ酸配列を含み、その際、ＧはＧｌｙを表し；「：」はペプチド結合を表し；Ｘ２からＸ６のそれぞれは、独立してアミノ酸であり；Ｘ６は塩基性アミノ酸を含み、ＥＤはペプチド結合によってＸ６に連結され、ＥＤのＮ末端に少なくとも１つのリジンを含む。

【0518】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質のＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６のアミノ酸配列を含み、その際、ＧはＧｌｙを表し；「：」はペプチド結合を表し；Ｘ２はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ３は任意のアミノ酸を表し；Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、及びＭｅｔから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓから成る群から選択されるアミノ酸を表す。

【0519】

いくつかの態様では、Ｘ３アミノ酸はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、及びＡｒｇから成る群から選択される。

【0520】

いくつかの態様では、ＮＤ及びＥＤはリンカーによって結合される。いくつかの態様では、リンカーは１以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、「リンカー」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの配列（例えば、合成のペプチドまたはポリペプチドの配列）または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーをタンデムに連結することができる。一般に、リンカーは柔軟性を提供する、または立体障害を防止する／改善する。リンカーは通常、切断されないが、特定の態様では、そのような切断が望ましくてもよい。したがって、いくつかの態様では、リンカーは１以上のプロテアーゼ切断可能な部位を含むことができ、それはリンカーの配列内に配置することができ、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接することができる。ＥＤとＮＤがリンカーによって連結されている場合、ＥＤは少なくとも２つのリジン、少なくとも３つのリジン、少なくとも４つのリジン、少なくとも５つのリジン、少なくとも６つのリジン、または少なくとも７つのリジンを含む。

【0521】

いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のアミノ酸を含むことができる。

【0522】

いくつかの態様では、リンカーはグリシン／セリンリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、式［（Ｇｌｙ）ｎ－Ｓｅｒ］ｍに係るグリシン／セリンリンカーであり、式中、ｎは１～１００の任意の整数であり、ｍは１～１００の任意の整数である。いくつかの態様では、グリシン／セリンリンカーは式［（Ｇｌｙ）ｘ－Ｓｅｒｙ］ｚに従い、式中、ｘは１～４の整数であり、ｙは０または１であり、ｚは１～５０の整数である。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは配列Ｇｎを含み、その際、ｎは１～１００の整数であり得る。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは配列（ＧｌｙＡｌａ）ｎを含み、その際、ｎは１～１００の整数である。いくつかの態様では、該ペプチドリンカーは配列（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎを含み、その際、ｎは１～１００の整数である。

【0523】

いくつかの態様では、ペプチドリンカーは合成であり、すなわち天然に存在しない。一態様では、ペプチドリンカーは、天然には連結されない、または自然界では遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖配列にアミノ酸の第１の直鎖配列を連結するまたは遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然に存在するまたは天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態（例えば、付加、置換または欠失のような変異を含む）である天然に存在しないポリペプチドを含むことができる。

【0524】

他の態様では、ペプチドリンカーは天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。さらに他の態様では、ペプチドリンカーは自然界では存在しない直鎖配列で存在する天然に存在するアミノ酸を含むことができる。他の態様では、ペプチドリンカーは天然に存在するポリペプチド配列を含むことができる。

【0525】

本開示はまた、足場Ｙタンパク質に連結されたＡＳＯを含む単離された細胞外小胞（ＥＶ）、例えば、エクソソームをも提供し、その際、足場Ｙタンパク質はＮＤ－ＥＤを含み、ＮＤはＧ：Ｘ２：Ｘ３：Ｘ４：Ｘ５：Ｘ６を含み、その際、ＧはＧｌｙを表し；「：」はペプチド結合を表し；Ｘ２は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ３は任意のアミノ酸を表し；Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、及びＭｅｔから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ５は、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、及びＳｅｒから成る群から選択されるアミノ酸を表し；Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓから成る群から選択されるアミノ酸を表し；「－」は任意のリンカーを表し；ＥＤは、（ｉ）ペプチド結合または１以上のアミノ酸によってＸ６に連結されている少なくとも２つの連続するリジン（Ｌｙｓ）、または（ｉｉ）ペプチド結合によってＸ６に直接連結される少なくとも１つのリジンを含むエフェクタードメインである。

【0526】

いくつかの態様では、Ｘ２アミノ酸はＧｌｙ及びＡｌａから成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｘ３アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様では、Ｘ４アミノ酸はＬｅｕまたはＧｌｕである。いくつかの態様では、Ｘ５アミノ酸はＳｅｒ及びＡｌａから成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｘ６アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様では、Ｘ２アミノ酸はＧｌｙ、Ａｌａ、またはＳｅｒであり；Ｘ３アミノ酸はＬｙｓまたはＧｌｕであり；Ｘ４アミノ酸はＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕであり；Ｘ５アミノ酸はＳｅｒまたはＡｌａであり；Ｘ６アミノ酸はＬｙｓである。いくつかの態様では、「－」リンカーはペプチド結合または１以上のアミノ酸を含む。

【0527】

いくつかの態様では、足場タンパク質におけるＥＤは、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＫ（配列番号４０５）、ＫＫＫＫＫ（配列番号４０６）、Ａｒｇ（Ｒ）、ＲＲ、ＲＲＲ、ＲＲＲＲ（配列番号４０７）、ＲＲＲＲＲ（配列番号４０８）、ＫＲ、ＲＫ、ＫＫＲ、ＫＲＫ、ＲＫＫ、ＫＲＲ、ＲＲＫ、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４０９）、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）（配列番号４１０）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0528】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0529】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質におけるＮＤは、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫ（配列番号４１５）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫ（配列番号４１６）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫ、（配列番号４１７）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫ（配列番号４１８）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ足場タンパク質におけるＥＤは、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＫＫＫＧ（配列番号４１９）、ＫＫＫＧＹ（配列番号４２０）、ＫＫＫＧＹＮ（配列番号４２１）、ＫＫＫＧＹＮＶ（配列番号４２２）、ＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４２３）、ＫＫＫＧＹＳ（配列番号４２４）、ＫＫＫＧＹＧ（配列番号４２５）、ＫＫＫＧＹＧＧ（配列番号４２６）、ＫＫＫＧＳ（配列番号４２７）、ＫＫＫＧＳＧ（配列番号４２８）、ＫＫＫＧＳＧＳ（配列番号４２９）、ＫＫＫＳ（配列番号４３０）、ＫＫＫＳＧ（配列番号４３１）、ＫＫＫＳＧＧ（配列番号４３２）、ＫＫＫＳＧＧＳ（配列番号４３３）、ＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４３４）、ＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４３５）、ＫＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４３６）、ＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４３７）を含む。

【0530】

いくつかの態様では、本開示で有用な足場Ｙのポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫ（配列番号４１１）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫ（配列番号４１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫ（配列番号４１３）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫ（配列番号４１４）、または（ｖ）それらの任意の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。

【0531】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせをから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0532】

いくつかの態様では、本開示で有用な足場Ｙタンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫ（配列番号４３８）、（ｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＳ（配列番号４３９）、（ｉｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号４４０）、（ｉｖ）ＧＡＫＬＳＫＫＳ（配列番号４４１）、（ｖ）ＧＧＫＱＳＫＫＫ（配列番号４４２）、（ｖｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＳ（配列番号４４３）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＫ（配列番号４４４）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＡＫＫＳ（配列番号４４５）、及び（ｉｘ）それらの任意の組み合わせをから成る群から選択されるアミノ酸配列から成る。

【0533】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、少なくとも３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約５０、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３３５、少なくとも約３４０、少なくとも約３４５、または少なくとも約３５０アミノ酸の長さである。

【0534】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０、約１５０～約１６０、約１６０～約１７０、約１７０～約１８０、約１８０～約１９０、約１９０～約２００、約２００～約２１０、約２１０～約２２０、約２２０～約２３０、約２３０～約２４０、約２４０～約２５０、約２５０～約２６０、約２６０～約２７０、約２７０～約２８０、約２８０～約２９０、約２９０～約３００、約３００～約３１０、約３１０～約３２０、約３２０～約３３０、約３３０～約３４０、または約３４０～約３５０のアミノ酸の長さである。

【0535】

いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号８５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４８４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号８５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）を含む。

【0536】

いくつかの態様では、本開示で有用な足場Ｙタンパク質のポリペプチド配列は、（ｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４６）、（ｉｉ）ＧＡＫＬＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４７）、（ｉｉｉ）ＧＧＫＱＳＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４８）、（ｉｖ）ＧＧＫＬＡＫＫＫＫＧＹＮＶＮ（配列番号４４９）、（ｖ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＹＳＧＧ（配列番号４５０）、（ｖｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＧＳＧＧＳ（配列番号４５１）、（ｖｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＫＳＧＧＳＧ（配列番号４５２）、（ｖｉｉｉ）ＧＧＫＬＳＫＫＫＳＧＧＳＧＧ（配列番号４５３）、（ｉｘ）ＧＧＫＬＳＫＫＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４５４）、（ｘ）ＧＧＫＬＳＫＳＧＧＳＧＧＳＶ（配列番号４５５）、または（ｘｉ）ＧＡＫＫＳＫＫＲＦＳＦＫＫＳ（配列番号４５６）から成る。

【0537】

本明細書で開示されている本発明に有用な足場Ｙタンパク質の非限定的な例。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５５～５６７から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、配列番号４１１、４３８、４４６、及び４５５～５６７から選択されるアミノ酸配列から成る。

【0538】

いくつかの態様では、本開示に有用な足場Ｙタンパク質はＮ末端Ｍｅｔを含有しない。いくつかの態様では、足場Ｙタンパク質は、脂質アンカーとして機能する足場タンパク質のＮ末端にて脂質化アミノ酸、例えば、ミリストイル化アミノ酸を含む。いくつかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基はＧｌｙである。Ｎ末端Ｇｌｙの存在はＮ－ミリストイル化の絶対的な要件である。いくつかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は合成である。いくつかの態様では、足場タンパク質のＮ末端のアミノ酸残基は、グリシン類似体、例えば、アリルグリシン、ブチルグリシン、またはプロパルギルグリシンである。

【0539】

ＩＩＩ．Ｄ． 標的指向化部分
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは標的指向化部分、例えば、外因性標的指向化部分を含む。いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、ペプチド、抗体またはそれらの抗原結合断片、化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、標的指向化部分は、マイクロタンパク質、設計されたアンキリン反復タンパク質（ダーピン）、アンチカリン、アドネクチン、アプタマー、ペプチド模倣分子、受容体の天然リガンド、ラクダ科ナノボディ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、完全長抗体、単一ドメイン抗体、重鎖のみ抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体、サメ重鎖のみ抗体（ＶＮＡＲ）、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、抗体は単鎖抗体である。

【0540】

いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、肝臓、心臓、肺、脳、腎臓、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、関節、皮膚、腸、膀胱、膵臓、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる。いくつかの態様では、外因性標的指向化部分は、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ニューロン、肝細胞、クッパー細胞、骨髄系細胞（例えば、好中球、単球、マクロファージ、または、ＭＤＳＣ（例えば、単球ＭＤＳＣまたは顆粒球ＭＤＳＣ））、造血幹細胞またはそれらの任意の組み合わせを標的にしてエクソソームを向かわせる。

【0541】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする。トランスフェリン受容体、例えば、ＴｆＲ１またはＴｆＲ２はトランスフェリンの担体タンパク質である。トランスフェリン受容体は、受容体が介在するエンドサイトーシスを介してトランスフェリン・イオン複合体を内部移行させることによって鉄を移入する。

【0542】

ＴｆＲ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６ＴＦＲ１＿Ｈｕｍａｎを参照）またはトランスフェリン受容体１（分化クラスター７１またはＣＤ７１としても知られている）は、血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞にて発現される。ＴｆＲ１は、例えば、赤血球、単球、肝細胞、腸細胞、赤血球系細胞のような種々の細胞で発現されることが知られており、腫瘍細胞（非小細胞肺癌、結腸癌、及び白血病）のような迅速に分裂している細胞ならびに急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）のような障害の影響を受けた組織にて上方調節される。ＴｆＲ２は主に肝臓と赤血球系細胞で発現され、肺、脾臓、筋肉ではあまり見られず、ＴｆＲ１との４５％の同一性及び６６％の類似性を有する。ＴｆＲ１はジスルフィド結合により７６０残基のホモ二量体を形成し、分子量は９０ｋＤａの膜貫通型受容体である。トランスフェリンに対する親和性は２つの受容体型間で異なり、ＴｆＲ１についての親和性はＴｆＲ２の親和性よりも少なくとも２５～３０倍高い。

【0543】

ＴｆＲ１への結合は、例えば、抗体のような大きな分子の脳への移行を可能にする。一部のＴｆＲ１を標的とする抗体は、鉄の取り込みを妨げることなく、血液脳関門を通過することが示されている。それらの中には、マウス抗ラット－ＴｆＲ抗体ＯＸ２６及びラット抗マウス－ＴｆＲ抗体８Ｄ３がある。抗体－ＴｆＲ相互作用の親和性はＢＢＢの内皮細胞を介したトランスサイトーシス輸送の成功を決定するのに重要である。一価のＴｆＲ相互作用は細胞内選別経路の変化によりＢＢＢ輸送に有利に働く。輸送をリソソームに向け直す二価相互作用の結合力効果。また、ＴｆＲ結合親和性を低減すると、ＴｆＲからの解離が直接促進され、ＴｆＲ結合抗体の脳実質への曝露が増加する。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２１，９４３号を参照のこと。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、トランスフェリンのようなＴｆＲを標的とすることができる、例えば、ＴｆＲ１を標的とすることができるリガンド、またはＴｆＲに特異的に結合することができる抗体もしくは他の結合分子を含むことができる。いくつかの態様では、トランスフェリン受容体を標的とする抗体は、低親和性抗転移受容体抗体である（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９０２０２９３６Ａ１を参照のこと）。

【0544】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、トランスフェリン受容体のリガンド、例えば、特に受入番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、ＸＭ０３９８４７、ＮＭ００２３４３またはＮＭ０１３９００としてＧｅｎＢａｎｋで入手可能なヒトトランスフェリンの全部または一部（例えば、結合部分）、またはその変異型、断片、または派生物を含む。

【0545】

いくつかの態様では、トロピズム部分はトランスフェリン受容体標的指向化部分、すなわち、トランスフェリン受容体に向けられた標的指向化部分を含む。好適なトランスフェリン受容体標的指向化部分には、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、オボトランスフェリン、またはメラノトランスフェリンのようなトランスフェリンまたはトランスフェリン変異型が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェリンは、脊椎動物に見られる非ヘム鉄結合タンパク質のファミリーであり、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、オボトランスフェリン、及びメラノトランスフェリンを含む。血清トランスフェリンは、分子量が約８０ｋＤａの糖タンパク質であり、分岐して複数のアンテナで終結し、それぞれが末端シアル酸残基を持つ２つのＮ結合型多糖鎖を持つ単一のポリペプチド鎖を含む。２つの主要なドメイン、約３３０アミノ酸のＮドメインと約３４０アミノ酸のＣドメインがあり、そのそれぞれが２つのサブドメイン、Ｎ１とＮ２、及びＣ１とＣ２に分割される。トランスフェリンの受容体結合は、グリコシル化にかかわりなく、Ｃドメインを介して発生する。

【0546】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、ヘキサシアロトランスフェリン、ペンタシアロトランスフェリン、テトラシアロトランスフェリン、トリシアロトランスフェリン、ジシアロトランスフェリン、モノシアロトランスフェリン、またはアシアロトランスフェリン、または、アシアロ、モノシアロまたはジシアロトランスフェリンのような糖質欠損トランスフェリン（ＣＤＴ）、またはアシアロトランスフェリンのような糖質を含まないトランスフェリン（ＣＦＴ）のような、しかし、これらに限定されない血清トランスフェリンまたはトランスフェリン変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分は、トランスフェリンのＮ末端ドメイン、トランスフェリンのＣ末端ドメイン、ネイティブのトランスフェリンのグリコシル化、ネイティブ（野生型）トランスフェリンと比べて減少したグリコシル化、グリコシル化なし、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブ、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブ、Ｎドメインにおける少なくとも１つの変異、Ｃドメインにおける少なくとも１つの変異、変異型がネイティブトランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対して弱い結合親和力を有する変異、及び／または変異型がネイティブトランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対してより強い結合親和力を有する変異、または前述の任意の組み合わせを有するトランスフェリン変異型である。

【0547】

いくつかの態様では、トランスフェリン受容体を標的とするトロピズム部分は、抗トラスフェリン受容体可変新規抗原受容体（ｖＮＡＲ）、例えば、一般的なモチーフ構造（ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－３－ＣＤＲ３－ＦＷ４）を持つ結合ドメインを含む。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．２０１７－０３４８４１６を参照のこと。ｖＮＡＲはサメの適応免疫系の重要な成分である。わずか１１ｋＤａで、これら単一ドメイン構造は、動物界で最小のＩｇＧ様タンパク質であり、分子工学及び生物製剤の創薬のための優れたプラットフォームを提供する。ｖＮＡＲの属性には、標的に対する高親和性、発現の容易さ、安定性、溶解性、多重特異性、及び固体組織浸透可能性の増加が挙げられる。Ｕｂａｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０１８）４６（６）：１５５９－１５６５を参照のこと。

【0548】

いくつかの態様では、トロピズム部分はＴｆＲ１に特異的に結合することができるｖＮＡＲドメインを含み、その際、ｖＮＡＲドメインは、ＵＳ２０１７－０３４８４１６の表１における任意の１つのＣＤＲ３ペプチドと組み合わせたＵＳ２０１７－０３４８４１６の表１における任意の１つのＣＤＲ１ペプチドを持つｖＮＡＲ足場を含む、または本質的にそれから成る。

【0549】

いくつかの態様では、標的指向化部分は足場タンパク質によってＥＶ、例えば、エクソソームに連結される。いくつかの態様では、足場タンパク質は本明細書で開示されている任意の足場タンパク質である。いくつかの態様では、足場タンパク質は足場Ｘである。いくつかの態様では、足場タンパク質は足場Ｙである。

【0550】

ＩＩＩ．Ｅ． リンカー
上記の通り、本開示の細胞外小胞（ＥＶ）（例えば、エクソソーム及びナノ小胞）は、目的の分子（例えば、ＡＳＯ）を、ＥＶに（例えば、外面または内腔表面に）連結する１以上のリンカーを含むことができる。いくつかの態様では、ＡＳＯは、直接、または足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を介してＥＶに連結される。いくつかの態様では、ＡＳＯはリンカーによって足場部分に連結される。いくつかの態様では、ＡＳＯはリンカーによって第２の足場部分に連結される。

【0551】

特定の態様では、ＡＳＯは足場Ｘを介してエクソソームの外面に連結される。さらなる態様では、ＡＳＯは足場Ｘまたは足場Ｙを介してエクソソームの内腔表面に連結される。リンカーは当該技術分野で既知の任意の化学部分であり得る。

【0552】

本明細書で使用されるとき、「リンカー」という用語は、ペプチドもしくはポリペプチドの配列（例えば、合成ペプチドもしくはポリペプチドの配列）または非ポリペプチド、例えば、アルキル鎖を指す。いくつかの態様では、２つ以上のリンカーをタンデムに連結することができる。複数のリンカーが存在する場合、各リンカーは同じであり得、または異なり得る。一般に、リンカーは柔軟性を提供する、または立体障害を防止する／改善する。リンカーは通常、切断されないが、特定の態様では、そのような切断が望ましくてもよい。したがって、いくつかの態様では、リンカーはリンカーの配列内に位置する、またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接することができる、１以上のプロテアーゼ切断可能部位を含むことができる。

【0553】

いくつかの実施形態では、リンカー部分はペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００のアミノ酸を含むことができる。

【0554】

いくつかの態様では、ペプチドリンカーは合成であり、すなわち天然に存在しない。一態様では、ペプチドリンカーは、天然に連結されない、または自然界で遺伝的に融合されないアミノ酸の第２の直鎖配列にアミノ酸の第１の直鎖配列を連結する、または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（例えば、天然のペプチドまたは天然に存在しないペプチド）を含む。例えば、一態様では、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾形態である（例えば、付加、置換または欠失のような変異を含む）天然に存在しないポリペプチドを含むことができる。

【0555】

リンカーは切断しやすくてもよく（「切断可能なリンカー」）、それによって生物学的に活性がある分子（例えば、ＡＳＯ）の放出を容易にする。

【0556】

いくつかの態様では、リンカーは「還元感受性リンカー」である。いくつかの態様では、還元感受性リンカーはジスルフィド結合を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーは「酸に不安定なリンカー」である。いくつかの態様では、酸に不安定なリンカーはヒドラゾンを含む。好適な酸不安定性リンカーはまた、例えば、シス－アコニットリンカー、ヒドラジドリンカー、チオカルバモイルリンカー、またはそれらの任意の組み合わせも含む。

【0557】

いくつかの態様では、リンカーは切断不可リンカーを含む。

【0558】

いくつかの態様では、リンカーは、アクリルホスホルアミダイト（例えば、ＡＣＲＹＤＩＴＥ（商標））、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステロール－ＴＥＧ、Ｉ－ＬＩＮＫＥＲ（商標）、アミノ修飾因子（例えば、アミノ修飾因子Ｃ６、アミノ修飾因子Ｃ１２、アミノ修飾因子Ｃ６ ｄＴ、またはＵｎｉ－Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾剤）、アルキン、５’ヘキシニル、５－オクタジイニルｄＵ、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン－ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、またはデスチオビオチン）、チオール修飾（チオール修飾因子Ｃ３ Ｓ－Ｓ、ジチオールまたはチオール修飾因子Ｃ６ Ｓ－Ｓ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0559】

いくつかの態様では、リンカーは、ネロリドール、ファルネソール、リモネン、リナロール、ゲラニオール、カルボン、フェンコン、またはメントールのようなテルペン；パルミチン酸やミリスチン酸のような脂質；コレステロール；オレイル；レチニル；コレステリル残基；コール酸；アダマンタン酢酸；１－ピレン酪酸；ジヒドロテストステロン；１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール；ゲラニルオキシヘキシル基；ヘキサデシルグリセロール；ボルネオール；１，３－プロパンジオール；ヘプタデシル基；Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸；Ｏ３－（オレオイル）コレン酸；ジメトキシトリチル；フェノキサジン、マレイミド部分、グルコリニダーゼタイプ、ＣＬ２Ａ－ＳＮ３８タイプ、葉酸；炭水化物；ビタミンＡ；ビタミンＥ；ビタミンＫ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0560】

ＩＩＩ．Ｆ． トロピズム部分を含む改変されたＥＶ
いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームは、その特性、例えば、生体内分布を調整するように、例えば、免疫親和性リガンドまたは同族受容体リガンドの組み込みを介して表面操作を行うことができる。例えば、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームは、それらを特定の細胞型、例えば、シュワン細胞、感覚ニューロン、運動ニューロン、髄膜マクロファージ、または腫瘍細胞に向けるために表面操作を行うことができ、または、特定のコンパートメント、例えば、ＣＮＳ（髄腔内コンパートメント保持を改善するため）または腫瘍微小環境へのそれらの遊走を高めるために表面操作を行うことができる。

【0561】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、（ｉ）本明細書で開示されているＡＳＯ、及び（ｉｉ）生体内分布改変剤または標的指向化部分を含む。いくつかの態様では、生体内分布改変剤または標的指向化部分は単一ドメイン抗原結合部分、例えば、ＶＨＨ及び／またはｖＮＡＲを含む。ここで使用されるとき、「生体内分布改変剤」及び「標的指向化部分」という用語は相互交換可能に使用され、生体内または試験管内（例えば、異なる種類の細胞の混合培養）にて細胞外小胞（例えば、エクソソーム、ナノ小胞）の分布を改変することができる薬剤を指す。いくつかの態様では、標的指向化部分はＥＶ（例えば、エクソソーム）のトロピズムを変化させる、すなわち、標的部分は「トロピズム部分」である。本明細書で使用されるとき、「トロピズム部分」という用語は、ＥＶ（例えば、エクソソーム）上で発現されると、ＥＶの自然な動きを変化させる及び／または増強する標的指向化部分を指す。例えば、いくつかの態様では、トロピズム部分は特定の細胞、組織、または器官によって取り込まれるようにＥＶ（例えば、エクソソーム）を促すことができる。

【0562】

ＥＶ、例えば、エクソソームは個別の細胞型及び組織にて優先的に取り込みを示し、それらのトロピズムは、標的細胞の表面の受容体と相互作用するタンパク質をそれらの表面に加えることによって指示され得る。トロピズム部分は、タンパク質、ペプチド、脂質、もしくは炭水化物のような生体分子、または合成分子を含むことができる。例えば、いくつかの態様では、トロピズム部分は親和性リガンド、例えば、抗体（例えば、抗ＣＤ１９ナノボディ、抗ＣＤ２２ナノボディ、抗ＣＬＥＣ９Ａナノボディ、または抗ＣＤ３ナノボディ）、ＶＨＨドメイン、ファージディスプレイペプチド、フィブロネクチンドメイン、ラクダ科ナノボディ、及び／またはｖＮＡＲを含むことができる。いくつかの態様では、トロピズム部分は、例えば、合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、天然のリガンド／分子（例えば、ＣＤ４０Ｌ、アルブミン、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ５５、ＣＤ５９）、及び／または組換えタンパク質（例えば、ＸＴＥＮ）を含むことができる。

【0563】

いくつかの態様では、トロピズム部分は細胞によるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みを増加させることができる。いくつかの態様では、細胞によるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みを増加させることができるトロピズム部分は、リンパ球抗原７５（ＤＥＣ２０５またはＣＤ２０５としても知られる）、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（ＣＬＥＣ９Ａ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー６（ＣＬＥＣ６）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（ＤＣＩＲまたはＣＬＥＣ４Ａとしても知られる）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－グラビング非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮまたはＣＤ２０９としても知られる）、レクチン型酸化ＬＤＬ受容体１（ＬＯＸ－１）、コラーゲン構造を持つマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１０メンバーＡ（ＣＬＥＣ１０Ａ））、ＤＣ－アシアロ糖タンパク質受容体（ＤＣ－ＡＳＧＰＲ）、ＤＣ免疫受容体２（ＤＣＩＲ２）、デクチン－１、マクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ＢＤＣＡ－２（ＣＤ３０３、ＣＬＥＣ４Ｃ）、デクチン－２、ＢＳＴ－２（ＣＤ３１７）、ランゲリン、ＣＤ２０６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ３０４、ＸＣＲ１、ＡＸＬ、ＳＩＧＬＥＣ ６、ＣＤ２０９、ＳＩＲＰＡ、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ１８２、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１０、抗ＣＤ３抗体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0564】

いくつかの態様では、中枢神経系へのトロピズムが望ましい場合、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームは、特定の中枢神経系の組織または細胞に対するＥＶ、例えば、エクソソームのトロピズムを高める組織または細胞に特異的な標的リガンドを含むことができる。いくつかの態様では、細胞はグリア細胞である。いくつかの態様では、グリア細胞は、オリゴデンドロサイト、星状細胞、上衣細胞、ミクログリア細胞、シュワン細胞、衛星グリア細胞、嗅覚鞘細胞、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、細胞は神経幹細胞である。いくつかの態様では、シュワン細胞に対するＥＶ、例えば、エクソソームのトロピズムを高める細胞特異的標的リガンドは、シュワン細胞の表面マーカー、例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンタンパク質ゼロ（Ｐ０）、Ｐ７５ＮＴＲ、ＮＣＡＭ、ＰＭＰ２２、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。いくつかの態様では、細胞特異的なトロピズム部分は、シュワン細胞表面で発現される抗体もしくはその抗原結合断片、アプタマー、または受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを含む。

【0565】

いくつかの態様では、生体内分布改変剤または標的指向化部分は、腫瘍細胞上に発現される抗原に結合する抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、生体内分布改変剤または標的指向化部分は、腫瘍微細環境にて発現される抗原に結合する抗原結合部分を含む。いくつかの態様では、生体内分布改変剤または標的指向化部分はメソテリンに結合する抗原結合部分を含む。メソテリンに結合することができる当該技術分野で知られている任意の抗原結合部分を、本明細書で開示されているＥＶで使用することができる。いくつかの態様では、生体内分布改変剤または標的指向化部分はＣＤ３３に結合する抗原結合部分を含む。ＣＤ３に結合することができる当該技術分野で知られる任意の抗原結合部分を、本明細書で開示されているＥＶで使用することができる。特定の態様では、ＣＤ３３に結合する抗原結合部分は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８７７，２９６号に開示されている抗ＣＤ３３結合部分から選択される。

【0566】

原則として、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを、特定の標的細胞または標的組織（例えば、ＣＮＳの細胞または末梢神経のシュワン細胞）に向かわせることができる少なくとも１つのトロピズム部分を含むＥＶ、例えば、エクソソームは、トロピズム部分の存在（単独で、または抗食作用シグナル、例えば、ＣＤ４７の存在及び特定の投与経路の使用との併用で）が所望の標的細胞または標的組織に対するＥＶ、例えば、エクソソームのトロピズムを誘導するので、当該技術分野で既知の任意の好適な投与方法（例えば、静脈内の注射または注入）を使用して投与することができる。

【0567】

特定の態様では、トロピズム部分はマレイミド部分を介してＥＶ、例えば、エクソソームの外面上の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結され、例えば、化学的に連結される。トロピズムは、抗食作用シグナル（例えば、ＣＤ４７及び／またはＣＤ２４）、半減期延長部分（例えば、アルブミンまたはＰＥＧ）、またはそれらの任意の組み合わせを本開示のＥＶ、例えば、エクソソームの外面に結合させることによってさらに改善することができる。特定の態様では、抗食作用シグナルは、例えば、マレイミド部分を介してＥＶ、例えば、エクソソームの外面の足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に連結され、例えば、化学的に連結される。

【0568】

所望の組織または解剖学的位置における薬物動態、生体内分布、特にトロピズム及び保持は、適切な投与経路（例えば、中枢神経系へのトロピズムを改善するための髄腔内投与または眼内投与）を選択することによって達成することもできる。

【0569】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは少なくとも２つの異なるトロピズム部分を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは少なくとも３つの異なるトロピズム部分を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは少なくとも４つの異なるトロピズム部分を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは少なくとも５以上の異なるトロピズム部分を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分の１以上は細胞によるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みを増加させる。いくつかの態様では、各トロピズム部分は、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合される。いくつかの態様では、複数のトロピズム部分を、同じ足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合することができる。いくつかの態様では、いくつかのトロピズム部分を、足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片にタンデムに結合することができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されているトロピズム部分またはその組み合わせはリンカーまたはスペーサーを介して足場部分、例えば、足場Ｘタンパク質またはその断片に結合される。いくつかの態様では、リンカーまたはスペーサーまたはそれらの組み合わせは本明細書で開示されている２つのトロピズム部分の間に挿入される。

【0570】

本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを異なる神経系の細胞型に向けることができるトロピズム部分の非限定的な例を以下に開示する。

【0571】

ＩＩＩ．Ｆ．１． シュワン細胞を標的とするトロピズム部分
いくつかの態様では、トロピズム部分はシュワン細胞を標的とすることができる。いくつかの態様では、トロピズム部分は、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームをシュワン細胞標的例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、アポリポタンパク質Ｄ（ＡｐｏＤ）、ガレクチン１（ＬＧＡＬＳ１）、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、グリピカン１、またはシンデカン３に向ける。いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソームをシュワン細胞に向けるトロピズム部分はトランスフェリン、またはその断片、変異型または誘導体である。

【0572】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を標的とする。トランスフェリン受容体、例えば、ＴｆＲ１またはＴｆＲ２はトランスフェリンの担体タンパク質である。トランスフェリン受容体は、受容体が介在するエンドサイトーシスを介してトランスフェリンイオン複合体を内部移行させることによって鉄を移入する。

【0573】

ＴｆＲ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６ＴＦＲ１＿Ｈｕｍａｎを参照）またはトランスフェリン受容体１（分化クラスター７１またはＣＤ７１としても知られている）は、血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞にて発現される。ＴｆＲ１は、例えば、赤血球、単球、肝細胞、腸細胞、赤血球系細胞のような種々の細胞で発現されることが知られており、腫瘍細胞（非小細胞肺癌、結腸癌、及び白血病）のような迅速に分裂している細胞と同様に急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）のような障害の影響を受けた組織にて上方調節される。ＴｆＲ２は主に肝臓と赤血球系細胞で発現され、肺、脾臓、筋肉ではあまり見られず、ＴｆＲ１との４５％の同一性及び６６％の類似性を有する。ＴｆＲ１はジスルフィド結合により７６０残基のホモ二量体を形成し、分子量は９０ｋＤａの膜貫通型受容体である。トランスフェリンに対する親和性は２つの受容体型間で異なり、ＴｆＲ１についての親和性はＴｆＲ２の親和性よりも少なくとも２５～３０倍高い。

【0574】

ＴｆＲ１への結合は、例えば、抗体のような大きな分子の脳への移行を可能にする。一部のＴｆＲ１を標的とする抗体は、鉄の取り込みを妨げることなく、血液脳関門を通過することが示されている。それらの中には、マウス抗ラット－ＴｆＲ抗体ＯＸ２６及びラット抗マウス－ＴｆＲ抗体８Ｄ３がある。抗体－ＴｆＲ相互作用の親和性は、ＢＢＢの内皮細胞を介したトランスサイトーシス輸送の成功を決定するのに重要である。一価のＴｆＲ相互作用は細胞内選別経路の変化によりＢＢＢ輸送に有利に働く。輸送をリソソームに向け直す二価相互作用の結合力効果。また、ＴｆＲ結合親和性を低減すると、ＴｆＲからの解離が直接促進され、ＴｆＲ結合抗体の脳実質への曝露が増加する。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２１，９４３号を参照のこと。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、トランスフェリンのようなＴｆＲを標的とすることができる、例えば、ＴｆＲ１を標的とすることができるリガンド、またはＴｆＲに特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含むことができる。いくつかの態様では、トランスフェリン受容体を標的とする抗体は、低親和性抗転移受容体抗体である（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ２０１９０２０２９３６Ａ１を参照のこと）。

【0575】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、とりわけ、トランスフェリン受容体のリガンド、例えば、受入番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、ＸＭ０３９８４７、ＮＭ００２３４３またはＮＭ０１３９００としてＧｅｎＢａｎｋで入手可能なヒトトランスフェリンの全部または一部（例えば、結合部分）、またはその変異型、断片、または派生物を含む。

【0576】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、トランスフェリン受容体標的指向化部分、すなわち、トランスフェリン受容体に向けられた標的指向化部分を含む。好適なトランスフェリン受容体標的指向化部分には、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）オボトランスフェリン、またはメラノトランスフェリンのようなトランスフェリンまたはトランスフェリン変異型が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェリンは、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）、オボトランスフェリン、及びメラノトランスフェリンを含む、脊椎動物に見られる非ヘム鉄結合タンパク質のファミリーである。血清トランスフェリンは、分子量が約８０ｋＤａの糖タンパク質であり、分岐して複数のアンテナで終結し、それぞれが末端シアル酸残基を持つ２つのＮ結合型多糖鎖を持つ単一のポリペプチド鎖を含む。２つの主要なドメイン、約３３０アミノ酸のＮドメインと約３４０アミノ酸のＣドメインがあり、それぞれが２つのサブドメイン、Ｎ１とＮ２、及びＣ１とＣ２に分割される。トランスフェリンの受容体結合は、グリコシル化にかかわりなく、Ｃドメインを介して発生する。

【0577】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、ヘキサシアロトランスフェリン、ペンタシアロトランスフェリン、テトラシアロトランスフェリン、トリシアロトランスフェリン、ジシアロトランスフェリン、モノシアロトランスフェリン、またはアシアロトランスフェリン、または、アシアロ、モノシアロまたはジシアロトランスフェリンのような糖質欠損トランスフェリン（ＣＤＴ）、またはアシアロトランスフェリンのような糖質を含まないトランスフェリン（ＣＦＴ）のような、しかし、これらに限定されない血清トランスフェリンまたはトランスフェリン変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分は、トランスフェリンのＮ末端ドメイン、トランスフェリンのＣ末端ドメイン、ネイティブのトランスフェリンのグリコシル化、ネイティブ（野生型）トランスフェリンと比べて減少したグリコシル化、グリコシル化なし、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブ、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブ、Ｎドメインにおける少なくとも１つの変異、Ｃドメインにおける少なくとも１つの変異、変異型がネイティブトランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対して弱い結合親和力を有する変異、及び／または変異型がネイティブトランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対してより強い結合親和力を有する変異、または前述の任意の組み合わせを有するトランスフェリン変異型である。

【0578】

いくつかの態様では、トランスフェリン受容体を標的とするトロピズム部分は、抗トラスフェリン受容体可変新規抗原受容体（ｖＮＡＲ）、例えば、一般的なモチーフ構造（ＦＷ１－ＣＤＲ１－ＦＷ２－３－ＣＤＲ３－ＦＷ４）を持つ結合ドメインを含む。例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．２０１７－０３４８４１６を参照のこと。ｖＮＡＲはサメの適応免疫系の重要な成分である。わずか１１ｋＤａで、これら単一ドメイン構造は、動物界で最小のＩｇＧ様タンパク質であり、分子工学及び生物製剤の創薬のための優れたプラットフォームを提供する。ｖＮＡＲの属性には、標的に対する高親和性、発現の容易さ、安定性、溶解性、多重特異性、及び固体組織浸透可能性の増加が挙げられる。Ｕｂａｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０１８）４６（６）：１５５９－１５６５を参照のこと。

【0579】

いくつかの態様では、トロピズム部分は、ＴｆＲ１に特異的に結合することができるｖＮＡＲドメインを含み、その際、ｖＮＡＲドメインは、ＵＳ２０１７－０３４８４１６の表１における任意の１つのＣＤＲ３ペプチドと組み合わせたＵＳ２０１７－０３４８４１６の表１における任意の１つのＣＤＲ１ペプチドを持つｖＮＡＲ足場を含む、または本質的にそれから成る。

【0580】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はＡｐｏＤを標的とする。主に肝臓で産生される他のリポタンパク質とは異なり、アポリポタンパク質Ｄは主に脳、小脳、及び末梢神経で産生される。ＡｐｏＤは１６９アミノ酸の長さで、２０アミノ酸の分泌ペプチドシグナルを含む。それは２つのグリコシル化部位（アスパルギン４５及び７８）を含有し、成熟タンパク質の分子量は２０から３２ｋＤａまでさまざまである。ＡｐｏＤは、プロゲステロンやプレグネノロンのようなステロイドホルモンを相対的に強い親和性で結合し、エストロゲンには弱い親和性で結合する。アラキドン酸（ＡＡ）はプロゲステロンやプレグネノロンよりもはるかに優れた親和性を持つＡｐｏＤリガンドである。他のＡｐｏＤリガンドには、Ｅ－３－メチル－２－ヘキセン酸、レチノイン酸、スフィンゴミエリン、スフィンゴ脂質が挙げられる。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、ＡｐｏＤを標的とすることができるリガンド、例えば、ＡｐｏＤに特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含む。

【0581】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はガレクチン１を標的とする。ガレクチン－１タンパク質は１３５アミノ酸の長さである。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、ガレクチン１を標的とすることができるリガンド、例えば、ガレクチン１に特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含む。

【0582】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はＰＬＰを標的とする。ＰＬＰはＣＮＳ由来の主要なミエリンタンパク質である。それは、ミエリンの多層構造の形成または維持において重要な役割を担う。ミエリン鞘は、軸索インパルス伝導の効率を大幅に高めるインシュレーターとして機能する神経系に特有の多層膜である。ＰＬＰは、４つの膜貫通セグメント、２つのジスルフィド結合を含有し、脂質（哺乳類では少なくとも６つのパルミチン酸基）を共有結合する２７６～２８０アミノ酸の高度に保存された疎水性タンパク質である。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、ＰＬＰを標的とすることができるリガンド、例えば、ＰＬＰに特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含む。

【0583】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はグリピカン１を標的とする。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はグリピカン１を標的とすることができるリガンド、例えば、グリピカン１に特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含む。いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はシンデカン３を標的とする。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はシンデカン３を標的とすることができるリガンド、例えば、シンデカン３に特異的に結合することができる抗体または他の結合分子を含む。

【0584】

ＩＩＩ．Ｆ．２． 感覚ニューロンを標的とするトロピズム部分
いくつかの態様では、本明細書で開示されているトロピズム部分は本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを感覚ニューロンに向けることができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを感覚ニューロンに向けるトロピズム部分は、Ｔｒｋ受容体、例えば、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、またはそれらの組み合わせを標的とする。

【0585】

Ｔｒｋ（トロポミオシン受容体キナーゼ）受容体は、哺乳類の神経系にてシナプス強度と可塑性を調節するチロシンキナーゼのファミリーである。Ｔｒｋ受容体の一般的なリガンドは、神経系の機能に重要な成長因子のファミリーであるニューロトロフィンである。これらの分子の結合は非常に特異的である。ニューロトロフィンの各タイプは対応するＴｒｋ受容体に対して異なる結合親和性を有する。したがって、いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを感覚ニューロンに向けるトロピズム部分はニューロトロフィンを含む。

【0586】

ニューロトロフィンはホモ二量体としてＴｒｋ受容体に結合する。したがって、いくつかの態様では、トロピズム部分は本明細書で開示されている少なくとも２つのニューロトロフィンを例えば、タンデムにて含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はリンカーを介して足場タンパク質、例えば、タンパク質Ｘに結合される本明細書で開示されている少なくとも２つのニューロトロフィンを、例えば、タンデムで含む。いくつかの態様では、足場タンパク質、例えば、タンパク質Ｘをニューロトロフィン（例えば、ニューロトロフィンホモ二量体）に接続するリンカーは少なくとも１０アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様では、足場タンパク質、例えば、タンパク質Ｘをニューロトロフィン（例えば、ニューロトロフィンホモ二量体）に接続するリンカーは、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約３５アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約４５アミノ酸、または少なくとも約５０アミノ酸の長さを有する。

【0587】

いくつかの態様では、ニューロトロフィンは、ニューロトロフィン前駆体、すなわち、プロニューロトロフィンであり、それは後で切断されて成熟タンパク質を生成する。

【0588】

神経成長因子（ＮＧＦ）はニューロトロフィンファミリーの最初に同定され、おそらく最も特徴的なメンバーである。それは、末梢神経系の感覚ニューロン及び交感神経ニューロンの発達に顕著な影響を有する。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、ＮＧＦと同様の神経栄養活性を有し、主にＣＮＳで発現され、末梢の心臓、肺、骨格筋、坐骨神経で検出されている（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：１４９－１５２（１９８９））。ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）はＮＧＦファミリーの第３のメンバーであり、主に海馬の錐体ニューロンと顆粒ニューロンのサブセットで発現され、小脳、大脳皮質、及び例えば、肝臓や骨格筋のような末梢組織で検出されている（Ｅｒｎｆｏｒｓ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ １：９８３－９９６（１９９０））。ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４１５とも呼ばれる）はニューロトロフィンファミリーの中で最も変化しやすいメンバーである。ニューロトロフィン－６（ＮＴ－５）は硬骨魚に見られ、ｐ７５受容体に結合する。

【0589】

いくつかの態様では、ＴｒｋＢを標的とするニューロトロフィンは、例えば、ＮＴ－４またはＢＤＮＦ、またはそれらの断片、変異型、または誘導体を含む。いくつかの態様では、ＴｒｋＡを標的とするニューロトロフィンは、例えば、ＮＧＦまたはその断片、変異型、または誘導体を含む。いくつかの態様では、ＴｒｋＣを標的とするニューロトロフィンは、例えば、ＮＴ－３またはその断片、変異型、または誘導体を含む。

【0590】

いくつかの態様では、トロピズム部分は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を含む。いくつかの態様では、ＢＤＮＦは、２アミノ酸のカルボキシル切り詰め変異型のようなネイティブＢＤＮＦの変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分はＢＤＮＦの完全長１１９アミノ酸配列（ＨＳＤＰＡＲＲＧＥＬＳＶＣＤＳＩＳＥＷＶＴＡＡＤＫＫＴＡＶＤＭＳＧＧＴＶＴＶＬＥＫＶＰＶＳＫＧＱＬＫＱＹＦＹＥＴＫＣＮＰＭＧＹＴＫＥＧＣＲＧＩＤＫＲＨＷＮＳＱＣＲＴＴＱＳＹＶＲＡＬＴＭＤＳＫＫＲＩＧＷＲＦＩＲＩＤＴＳＣＶＣＴＬＴＩＫＲＧＲ；配列番号１６１）を含む。いくつかの態様では、ＢＤＮＦの１アミノ酸カルボキシ切り詰め変異型（配列番号１６１のアミノ酸１～１１８）が利用される。

【0591】

いくつかの態様では、トロピズム部分はネイティブＢＤＮＦのカルボキシ切り詰め変異型、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるアミノ酸がＢＤＮＦのカルボキシ末端には存在しない変異型を含む。ＢＤＮＦ変異型には、完全な１１９アミノ酸ＢＤＮＦ、切り詰めたカルボキシル末端を持つ１１７または１１８アミノ酸変異型、タンパク質変異型が依然として高い親和性でＴｒｋＢ受容体に結合する限り、切り詰めたアミノ末端を持つ変異型、またはアミノ酸組成で最大約２０％、約３０、または約４０％の変化を持つ変異型が含まれる。

【0592】

いくつかの態様では、トロピズム部分はＢＤＮＦの２アミノ酸カルボキシ切り詰め変異型（配列番号１６１のアミノ酸１～１１７）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はＢＤＮＦの３アミノ酸カルボキシ切り詰め変異型（配列番号１６１のアミノ酸１～１１６）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はＢＤＮＦの４アミノ酸カルボキシ切り詰め変異型（配列番号１６１のアミノ酸１～１１５）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はＢＤＮＦの５アミノ酸カルボキシ切り詰め変異型（配列番号１６１のアミノ酸１～１１４）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分は、配列番号１６１の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるＢＤＮＦ、またはその切り詰め型、例えば、１もしくは２のアミノ酸が切り詰められたカルボキシル末端を持つ１１７もしくは１１８アミノ酸変異型、またはアミノ末端が切り詰められた変異型を含む。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，０５３，５６９Ｂ２を参照のこと。

【0593】

いくつかの態様では、トロピズム部分は神経成長因子（ＮＧＦ）を含む。いくつかの態様では、ＮＧＦは切り詰め変異型のようなネイティブＮＧＦの変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分は生物学的に活性がある７Ｓ ＮＧＦ複合体の唯一の成分であるタンパク質の２６ｋＤａベータサブユニットを含む。いくつかの態様では、トロピズム部分は、ベータＮＧＦの完全長１２０アミノ酸配列（ＳＳＳＨＰＩＦＨＲＧＥＦＳＶＣＤＳＶＳＶＷＶＧＤＫＴＴＡＴＤＩＫＧＫＥＶＭＶＬＧＥＶＮＩＮＮＳＶＦＫＱＹＦＦＥＴＫＣＲＤＰＮＰＶＤＳＧＣＲＧＩＤＳＫＨＷＮＳＹＣＴＴＴＨＴＦＶＫＡＬＴＭＤＧＫＱＡＡＷＲＦＩＲＩＤＴＡＣＶＣＶＬＳＲＫＡＶＲＲＡ；配列番号１６２）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はネイティブＮＧＦのカルボキシ切り詰め変異型、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるアミノ酸がＮＧＦのカルボキシ末端には存在しない変異型を含む。ＮＧＦ変異型には、完全な１２０アミノ酸ＮＧＦ、トロピズム部分が依然として高い親和性でＴｒｋＢ受容体に結合する限り、切り詰めたカルボキシル末端を持つさらに短いアミノ酸変異型、切り詰めたアミノ末端を持つ変異型、またはアミノ酸組成で最大約２０％、約３０、または約４０％の変化を持つ変異型が含まれる。いくつかの態様では、トロピズム部分は、配列番号１６２の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるＮＧＦ、またはその切り詰め型を含む。

【0594】

いくつかの態様では、トロピズム部分はニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）を含む。いくつかの態様では、ＮＴ－３は切り詰め変異型のようなネイティブＮＴ－３の変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分はＮＴ－３の完全長１１９アミノ酸配列（ＹＡＥＨＫＳＨＲＧＥＹＳＶＣＤＳＥＳＬＷＶＴＤＫＳＳＡＩＤＩＲＧＨＱＶＴＶＬＧＥＩＫＴＧＮＳＰＶＫＱＹＦＹＥＴＲＣＫＥＡＲＰＶＫＮＧＣＲＧＩＤＤＫＨＷＮＳＱＣＫＴＳＱＴＹＶＲＡＬＴＳＥＮＮＫＬＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＳＣＶＣＡＬＳＲＫＩＧＲＴ；配列番号１６３）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はネイティブＮＴ－３のカルボキシ切り詰め変異型、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるアミノ酸がＮＴ－３のカルボキシ末端には存在しない変異型を含む。ＮＴ－３変異型には、完全な１１９アミノ酸ＮＴ－３、トロピズム部分が依然として高い親和性でＴｒｋＣ受容体に結合する限り、切り詰めたカルボキシル末端を持つさらに短いアミノ酸変異型、切り詰めたアミノ末端を持つ変異型、またはアミノ酸組成で最大約２０％、約３０、または約４０％の変化を持つ変異型が含まれるいくつかの態様では、トロピズム部分は、配列番号１６３の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるＮＴ－３、またはその切り詰め型を含む。

【0595】

いくつかの態様では、トロピズム部分はニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）を含む。いくつかの態様では、ＮＴ－４は切り詰め変異型のようなネイティブＮＴ－４の変異型である。いくつかの態様では、トロピズム部分は、ＮＴ－４の完全長１３０アミノ酸配列（ＧＶＳＥＴＡＰＡＳＲＲＧＥＬＡＶＣＤＡＶＳＧＷＶＴＤＲＲＴＡＶＤＬＲＧＲＥＶＥＶＬＧＥＶＰＡＡＧＧＳＰＬＲＱＹＦＦＥＴＲＣＫＡＤＮＡＥＥＧＧＰＧＡＧＧＧＧＣＲＧＶＤＲＲＨＷＶＳＥＣＫＡＫＱＳＹＶＲＡＬＴＡＤＡＱＧＲＶＧＷＲＷＩＲＩＤＴＡＣＶＣＴＬＬＳＲＴＧＲＡ；配列番号１６４）を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分はネイティブＮＴ－４のカルボキシ切り詰め変異型、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるアミノ酸がＮＴ－４のカルボキシ末端には存在しない変異型を含む。ＮＴ－４変異型には、完全な１３０アミノ酸ＮＴ－４、トロピズム部分が依然として高い親和性でＴｒｋＢ受容体に結合する限り、切り詰めたカルボキシル末端を持つさらに短いアミノ酸変異型、切り詰めたアミノ末端を持つ変異型、またはアミノ酸組成で最大約２０％、約３０、または約４０％の変化を持つ変異型が含まれる。いくつかの態様では、トロピズム部分は、配列番号１６４の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％同一であるＮＴ－４、またはその切り詰め型を含む。

【0596】

ＮＧＦ及びＮＧＦ関連組換え分子の構造／機能の関係研究は、ＮＧＦ領域２５～３６の変異が他のβヘアピンループ及び非ループ領域とともに、ＮＧＦ／ＮＧＦ受容体相互作用に有意に影響することを示した（Ｉｂａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，２１０５－２１１０，（１９９１））。この領域に由来する小型ペプチドは、モック受容体への結合及び生物学的応答に影響を与えることにおいてＮＧＦを模倣することが実証されている（ＬｅＳａｕｔｅｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，６５６４－６５６９，１９９５）。ＮＧＦのβループ領域に対応する環化ペプチドの二量体は、単量体及び線状ペプチドが不活性である一方で、生存促進及びＮＧＦ阻害活性の双方を有するという点で部分的ＮＧＦアゴニストとして作用することが見いだされた（Ｌｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４８，１－１７，１９９７）。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はそのようなペプチドを含む。

【0597】

環状ペプチドも、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３及びＮＴ－４／５のβループ領域を模倣するように設計され、合成されている。これらの環状ペプチドの特定の単量体、二量体、またはポリマーは、生理学的条件下でニューロトロフィン受容体に結合する三次元構造を有することができる。神経細胞表面受容体に結合し、内部移行されるニューロトロフィンのこれらの構造類似体のすべては、本開示に係る化合物の結合剤Ｂとして機能して、結合した治療部分ＴＭを神経系に送達することができる。したがって、いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分はそのような環状ペプチドまたはそれらの組み合わせを含む。

【0598】

いくつかの態様では、受容体に結合することができ、内部移行されることができる神経細胞表面受容体に対する抗体はまた、Ｔｒｋ受容体に結合するトロピズム部分として役立つこともできる。例えば、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）５Ｃ３は、ヒトｐ１４０ ＴｒｋＡ受容体のＮＧＦドッキング部位に特異的であり、ヒトＴｒｋＢ受容体との交差反応性はない。Ｍａｂ ５Ｃ３とそのＦａｂは試験管内でＮＧＦの効果を模倣し、生体内でヒトＴｒｋ－Ａ陽性腫瘍を画像化する（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３３，２０９０－２０９１，（１９９７））。Ｍａｂ ５Ｃ３可変領域の分子クローニング、組換え、突然変異誘発及びモデリングの研究により、その相補性決定領域（ＣＤＲ）の３以下がＴｒｋＡへの結合に関連していることが示された。組換えＣＤＲ及びＣＤＲ様合成ポリペプチドを用いたアッセイは、それらがインタクトのＭａｂ ５Ｃ３と同様のアゴニスト生物活性を有することを示した。ｐ７５受容体に対するモノクローナル抗体ＭＣ１９２も神経栄養効果を有することが実証されている。したがって、これらの抗体及びそれらの機能的に同等の断片はまた、本開示のトロピズム部分として役立つことができる。

【0599】

いくつかの態様では、非天然アミノ酸または他の有機分子を組み込むことによって合成されるペプチド模倣体もまた、本開示のトロピズム部分に役立つことができる。

【0600】

他のニューロトロフィンは当該技術分野で知られている。したがって、いくつかの態様では、標的部分は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）－２及び他のＦＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－α、ＴＧＦ－（３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリン、ニューレグリン、アルテミン、パーセフィン、インターロイキン、顆粒球コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ、ネトリン、カルジオトロフィン－１、ヘッジホッグ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ミドルカイン、プレイオトロフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ネトリン、サポシン、セマフォリン、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）から成る群から選択されるニューロトロフィンを含む。

【0601】

いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを感覚ニューロンに向けるトロピズム部分は水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）ペプチドを含む。

【0602】

ＩＩＩ．Ｆ．３． 運動ニューロンを標的とするトロピズム部分
いくつかの態様では、本明細書で開示されているトロピズム部分は本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを運動ニューロンに向けることができる。いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームを運動に向けるトロピズム部分は、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）ペプチド、標的軸索移入（ＴＡｘＩ）ペプチド、Ｐ７５Ｒペプチド、またはＴｅｔ－Ｃペプチドを含む。

【0603】

いくつかの態様では、トロピズム部分は狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）ペプチドを含む。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開２０１４－００２９４７２７を参照のこと。いくつかの態様では、ＲＶＧペプチドは、ＲＶＧのアミノ酸残基１７３～２０２（ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ；配列番号６０１）またはその変異型、断片、または誘導体を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分は配列番号６０１の断片である。配列番号６０１のそのような断片は、例えば、配列番号６０１のＮ末端及び／またはＣ末端から欠失させた１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸を有することができる。配列番号６０１に由来する機能的断片は、配列番号６０１からＮ末端及び／またはＣ末端のアミノ酸を順次欠失させ、得られるペプチド断片の機能、例えば、アセチルコリン受容体に結合するペプチド断片の機能及び／または血液脳関門を介して伝わる能力を評価することによって同定され得る。いくつかの態様では、トロピズム部分は配列番号６０１の２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６または１５アミノ酸の長さの断片を含む。いくつかの態様では、トロピズム部分は１５ペプチドの長さに満たない配列番号６０１の断片を含む。

【0604】

ＲＶＧペプチドの「変異型」、例えば、配列番号６０１は構造及び機能が分子全体、またはその断片に実質的に類似している分子を指すことを意味し、すなわち、機能はＢＢＢを通って通過するまたは移行する能力である。ＲＶＧペプチドの変異型は、配列番号６０１の参照アミノ酸とは異なる突然変異または修飾を含有することができる。いくつかの態様では、配列番号６０１の変異型は本明細書で開示されているような配列番号６０１の断片である。いくつかの態様では、ＲＶＧ変異型は配列番号６０１の異なるアイソフォームであり得る、または異なる異性体アミノ酸を含むことができる。変異型は、当該技術分野で周知の方法を使用して単離されるまたは生成される天然に存在する、合成の、組換えの、または化学的に修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。ＲＶＧ変異型には、保存的または非保存的なアミノ酸の変化を含めることができる。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第９，７５７，４７０参照のこと。

【0605】

いくつかの態様では、トロピズム部分は標的軸索移入（ＴＡｘＩ）ペプチドを含む。いくつかの態様では、ＴＡｘＩペプチドは、配列ＳＡＣＱＳＱＳＱＭＲＣＧＧＧ（配列番号６０２）の環化ＴＡｘＩペプチドである。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＳｅｌｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１３：２５１４－２５１９及び米国特許第９，０５６，８９２号を参照のこと。本明細書に記載されているＴＡｘＩ輸送ペプチドは任意の長さであってもよい。通常、輸送ペプチドは、長さが６から５０アミノ酸の間であり、さらに通常、長さが１０から２０アミノ酸の間である。いくつかの態様では、ＴＡｘＩ輸送ペプチドは、アミノ酸配列ＱＳＱＳＱＭＲ（配列番号６０３）、ＡＳＧＡＱＡＲ（配列番号６０４）、ＰＦ、またはＴＳＴＡＰＨＬＲＬＲＬＴＳＲ（配列番号６０５）を含む。任意で、ＴＡｘＩ輸送ペプチドはさらに、送達構築物または担体、例えばリンカーへの組み込みを容易にするための隣接配列を含む。一態様では、ペプチドはシステインに隣接する。いくつかの態様では、ＴＡｘＩ輸送ペプチドはさらに、核への送達を容易にするために選択される追加の配列を含む。例えば、核送達を容易にするペプチドは核局在化シグナル（ＮＬＳ）である。通常、このシグナルは、ＰＰＫＫＲＫＶ（配列番号６０６）のような正に荷電したリジンまたはアルギニンのいくつかの短い配列から成る。一態様では、ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＲＫＶ（配列番号６０７）を有する。

【0606】

いくつかの態様では、本開示のトロピズム部分は、配列番号６０８～６２７及びそれらの任意の組み合わせから選択される配列を有するペプチドＢＢＢシャトルを含む。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＯｌｌｅｒ－Ｓａｌｖｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４５，４６９０－４７０７、及びＪａｆａｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１６：５８３－６０５を参照のこと。

【表C】

【0607】

ＩＩＩ．Ｇ． 抗食作用シグナル
体の免疫系による投与されたＥＶ、例えば、エクソソームのクリアランスは、投与されたＥＶ、例えば、エクソソーム、治療の有効性を低下させ得る。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面は、免疫系の細胞、例えば、マクロファージによるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みを制限または遮断するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面は、マクロファージによるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みを阻害する１以上の表面抗原を発現するように改変される。いくつかの態様では、表面抗原はＥＶ（例えば、エクソソーム）の外面と会合する。

【0608】

本開示で有用な表面抗原には、細胞を「自己」細胞として標識する抗原が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、表面抗原は、抗食作用シグナルを含む。いくつかの態様では、抗食作用シグナルは、ＣＤ４７、ＣＤ２４、それらの断片、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の態様では、抗食作用シグナルはＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４を含む。いくつかの態様では、抗食作用シグナルは、ＣＤ２４、例えば、ヒトＣＤ２４の断片を含む。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの外面上でＣＤ４７またはその断片を発現するように改変される。

【0609】

本明細書で使用されるとき、白血球表面抗原ＣＤ４７及びインテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）とも呼ばれるＣＤ４７は体内の多くの細胞に見られる膜貫通タンパク質である。ＣＤ４７は、ＣＤ４７を発現する特定の細胞が外来細胞ではないことを免疫細胞、特に骨髄細胞に知らせるシグナルであるので、「私を食べないで」シグナルと呼ばれることが多い。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰＡの受容体であり、これに結合することで、未熟樹状細胞の成熟を防ぎ、成熟樹状細胞によるサイトカイン産生を阻害する。ＣＤ４７のＳＩＲＰＧとの相互作用は細胞間接着に介在し、スーパー抗原依存性のＴ細胞介在性増殖を増強し、Ｔ細胞の活性化を共刺激する。ＣＤ４７は、血小板上のＴＨＢＳ１の接着受容体として作用することによる細胞接着と、インテグリンの調節の双方で役割を担うことも知られている。ＣＤ４７はまた、海馬の記憶形成とシナプス可塑性にて重要な役割を担う（類似性による）。加えて、ＣＤ４７は、膜輸送及び／またはインテグリン依存性シグナル伝達にて役割を担い、赤血球の早期崩壊を防ぎ、ウイルス感染後に誘発される膜透過性の変化に関与することができる。

【0610】

いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの外面上でヒトＣＤ４７を発現するように改変される。ヒトＣＤ４７及び種々の既知のアイソフォーム（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ－Ｑ０８７２２）の標準的なアミノ酸配列は本明細書にて配列番号６２９～６３２として提供されている。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、配列番号６２９に示されるアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは配列番号６３０に示すアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは配列番号６３１に示すアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは配列番号６３２に示すアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドを発現するように改変される。

【0611】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの外面上で完全長ＣＤ４７を発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上にＣＤ４７の断片を発現するように改変され、その際、断片はＣＤ４７、例えば、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインを含む。マクロファージによる食作用を遮断する及び／または阻害する能力を保持するＣＤ４７の任意の断片を、本明細書で開示されているＥＶ、例えば、エクソソームで使用することができる。いくつかの態様では、断片は標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１４１（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１４１）を含む。いくつかの態様では、断片は標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１３５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３５）を含む。いくつかの態様では、断片は標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１３０（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３０）を含む。いくつかの態様では、断片は標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１２５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１２５）を含む。

【0612】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１４１（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１４１）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、該ＥＶ、例えば、エクソソームは、標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１３５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３５）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１３０（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１３０）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、標準的なヒトＣＤ４７配列のアミノ酸１９～約１２５（例えば、配列番号６２９のアミノ酸１９～１２５）に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを発現するように改変される。

【0613】

いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片はＣＤ４７及びそのリガンドＳＩＲＰαの親和性を高めるように修飾される。いくつかの態様では、ＣＤ４７の断片は、ベルクロ－ＣＤ４７を含む（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＨｏ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，２９０：１２６５０－６３（２０１５）を参照のこと）。いくつかの態様では、ベルクロ－ＣＤ４７は野生型ヒトＣＤ４７配列（配列番号６２９）と比べてＣ１５Ｓ置換を含む。

【0614】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に改変されていないＥＶ、例えば、エクソソームよりも高いレベルで発現されるＣＤ４７またはその断片を含む。いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片は足場タンパク質と融合される。本明細書で開示されている任意の足場タンパク質を使用してＥＶ、例えば、エクソソームの表面上にＣＤ４７またはその断片を発現させることができる。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは足場Ｘタンパク質のＮ末端に融合されたＣＤ４７の断片を発現するように改変される。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＰＴＧＦＲＮのＮ末端に融合されたＣＤ４７の断片を発現するように改変される。

【0615】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約２０分子、少なくとも約３０分子、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約７５０、または少なくとも約１０００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約２０分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約３０分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約４０分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約５０分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約１００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約２００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約３００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約４００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約５００分子のＣＤ４７を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの表面上に少なくとも約１０００分子のＣＤ４７を含む。

【0616】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上でのＣＤ４７またはその断片の発現は、ＣＤ４７またはその断片を発現していないＥＶ、例えば、エクソソームと比べて骨髄細胞によるＥＶ、例えば、エクソソームの取り込みの低減をもたらす。いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エクソソームの骨髄細胞による取り込みは約ＣＤ４７またはその断片を発現していないＥＶ、例えばエクソソームの骨髄細胞による取り込みと比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減する。

【0617】

いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面上でのＣＤ４７またはその断片の発現は、ＣＤ４７またはその断片を発現していないＥＶ、例えば、エクソソームと比べてＥＶ、例えば、エクソソームの肝臓への局在化の低下をもたらす。いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現しているＥＶ、例えば、エクソソームの肝臓への局在化はＣＤ４７またはその断片を発現していないＥＶ、例えば、エクソソームの肝臓への局在化と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減する。

【0618】

いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現しているＥＶ、例えば、エクソソームの生体内半減期は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エクソソームの生体内半減期と比べて増加する。いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現しているＥＶ、例えば、エクソソームの生体内半減期はＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えばエクソソームの生体内半減期と比べて少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加する。

【0619】

いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現しているＥＶ、例えば、エクソソームの循環、例えば、血漿における滞留は、ＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えば、エクソソームの循環、例えば、血漿における滞留と比べて増加する。いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現するＥＶ、例えば、エクソソームの循環、例えば、血漿における滞留はＣＤ４７またはその断片を発現しないＥＶ、例えばエクソソームの循環、例えば、血漿における滞留と比べて少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増加する。

【0620】

いくつかの態様では、ＣＤ４７またはその断片を発現しているエクソソームはＣＤ４７またはその断片を発現しないエクソソームと比べた場合、変化した生体内分布を有する。いくつかの態様では、変化した生体内分布は内皮細胞、Ｔ細胞への取り込みの増加、または骨格筋、心筋、横隔膜、腎臓、骨髄、中枢神経系、肺、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない種々の組織における蓄積の増加をもたらす。

【0621】

ＩＶ．操作されたエクソソームの生産のための産生細胞
試験管内で増殖した細胞または対象の体液から本開示のＥＶ、例えば、エクソソームを産生することができる。エクソソームが試験管内細胞培養から産生される場合、種々の産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、及びＭＳＣを使用することができる。特定の態様では、産生細胞は、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、クッパー・ブロウィッツ細胞、これらの細胞のいずれかに由来する細胞、またはそれらの任意の組み合わせではない。

【0622】

ヒト胚性腎臓２９３細胞は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ－２９３、２９３細胞、またはそれほど具体的ではなくＨＥＫ細胞とも呼ばれ、組織培養で増殖したヒト胚性腎臓細胞に由来する特定の細胞株である。

【0623】

ＨＥＫ２９３細胞は、オランダのライデンにあるＡｌｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂの研究室にてせん断アデノウイルス５ＤＮＡによる正常ヒト胚性腎臓細胞の培養物の形質移入によって１９７３年に生成された。細胞を培養し、アデノウイルスで形質移入した。その後の分析では、ウイルスゲノムの左腕から約４．５キロベースを挿入することで形質転換がもたらされ、ヒト第１９染色体に組み込まれたことが示された。

【0624】

ＨＥＫ２９３及び５つの派生細胞株のゲノムとトランスクリプトームの包括的な研究では、ＨＥＫ２９３トランスクリプトームをヒトの腎臓、副腎、下垂体、及び中枢神経組織のトランスクリプトームと比較した。ＨＥＫ２９３のパターンは多くのニューロン特性を有する副腎細胞のパターンに最もよく似ていた。

【0625】

ＨＥＫ２９３細胞は複雑な核型を有し、各染色体の２つ以上のコピーを示し、形式染色体数は６４である。それらは、一倍体のヒト配偶子の染色体数の３倍未満を含有する低三倍体として説明されている。染色体異常にはＸ染色体の合計３つのコピーと、第１７染色体及び第２２染色体の４つのコピーとが含まれる。

【0626】

ＥＶの産生に有用なＨＥＫ２９３細胞の変異型には、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、及びＨＥＫ２９３Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。

【0627】

産生細胞は、本明細書に記載されているＥＶを産生するためにＡＳＯをコードする外因性配列を含むように遺伝子操作することができる。遺伝子操作された産生細胞は、一過性のまたは安定した形質転換によって外因性配列を含有することができる。外因性配列はプラスミドとして形質転換され得る。いくつかの態様では、外因性配列はベクターである。外因性配列は、標的部位または無作為部位で産生細胞のゲノム配列に安定して組み込むことができる。いくつかの態様では、安定した細胞株は内腔で操作されたエクソソームの産生のために生成される。

【0628】

外因性配列は、エクソソームタンパク質をコードする内在性配列の上流（５’末端）または下流（３’末端）内に位置する産生細胞のゲノム配列に挿入することができる。当該技術分野で知られている種々の方法を、外因性配列を産生細胞に導入するために使用することができる。例えば、種々の遺伝子編集方法（例えば、相同組換え、トランスポゾン介在システム、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は本開示の範囲内にある。

【0629】

外因性配列は、本明細書で開示されている足場部分またはその断片または変異型をコードする配列を含むことができる。足場部分をコードする配列の追加のコピーを導入して、本明細書に記載されているエクソソーム（例えば、ＥＶ、例えば、エクソソームの表面または内腔表面にてさらに高密度の足場部分を有する）を産生することができる。足場部分の修飾または断片をコードする外因性配列を導入して、足場部分の修飾または断片を含有する内腔が操作された及び／または表面が操作されたエクソソームを産生することができる。

【0630】

いくつかの態様では、ＡＳＯに連結された足場部分をコードする１以上のベクターで産生細胞を改変することができ、例えば、形質移入することができる。

【0631】

いくつかの態様では、本開示のＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、表面が操作された及び／または内腔が操作されたエクソソーム）は、本明細書で開示されている完全長、成熟足場部分またはＡＳＯに連結された足場部分をコードする配列で形質転換された細胞から産生され得る。本明細書に記載されている足場部分のいずれかは、プラスミド、ゲノムまたは他の外因性核酸に挿入された外因性配列、例えば、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から発現され得る。

【0632】

Ｖ．医薬組成物
本明細書で提供されているのは、所望の純度を有する本開示のＥＶ、例えば、エクソソームと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、対象への投与に好適な形態での医薬組成物である。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに使用される特定の方法によってある程度決定され得る。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤がある。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照のこと）。医薬組成物は一般に滅菌して製剤化され、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。

【0633】

いくつかの態様では、医薬組成物は本明細書に記載されている１以上の治療剤及びエクソソームを含む。特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは、薬学的に許容される担体中で１以上の追加の治療剤と同時投与される。いくつかの態様では、ＡＳＯ及び本開示のための１以上のさらなる治療剤は同じＥＶで投与され得る。他の態様では、本開示のためのＡＳＯ及び１以上の追加の治療剤は異なるＥＶで投与される。例えば、本開示は、ＡＳＯを含むＥＶと追加の治療剤を含むＥＶとを含む医薬組成物を含む。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は追加の治療剤（複数可）の投与の前に投与される。他の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は追加の治療剤（複数可）の投与の後に投与される。さらなる態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は追加の治療剤（複数可）と同時に投与される。

【0634】

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、受容者（例えば、動物またはヒト）に対して採用される用量及び濃度で非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。

【0635】

担体または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び化合物の使用は当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または化合物が本明細書に記載されている細胞外小胞と不適合でない限り、組成物におけるその使用が企図される。補助的な治療剤もまた組成物に組み込まれ得る。通常、医薬組成物はその意図される投与経路に適合するように製剤化される。ＥＶ、例えば、エクソソームは、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内の経路または吸入剤によって投与され得る。特定の態様では、エクソソームを含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。ＥＶ、例えば、エクソソームは任意で、ＥＶ、例えば、エクソソームが意図される疾患、障害または状態の治療に少なくとも部分的に有効である他の治療剤と併用して投与され得る。

【0636】

溶液または懸濁液は、以下の成分：水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩のような緩衝液；及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような浸透圧の調整のための化合物を含むことができる。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整することができる。調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから作製された複数回用量バイアルに封入され得る。

【0637】

注射可能な使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末が含まれる。静脈内投与については、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。組成物は一般に、容易な注射可能性が存在する程度まで無菌で流動性である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。所望される場合、等張化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加され得る。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

【0638】

滅菌注射可能溶液は、所望されるように、本明細書に列挙されたまたは当該技術分野で知られている１以上の成分とともにＥＶ、例えば、エクソソームを有効量で、かつ適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。一般に、分散液は、細胞外小胞を、基本的な分散媒と任意の所望の他の成分とを含有する滅菌ビヒクルにＥＶ、例えば、エクソソームを組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から有効成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる真空乾燥及び凍結乾燥である。ＥＶ、例えば、エクソソームはＥＶ、例えば、エクソソームの持続性または拍動性の放出を可能にするような様式で製剤化することができるデポー注射またはインプラント調整物の形態で投与され得る。

【0639】

エクソソームを含む組成物の全身投与は経粘膜手段によることもできる。経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤で使用される。そのような浸透剤は一般に当該技術分野で既知であり、例えば、経粘膜投与のための、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、点鼻剤の使用を介して達成され得る。

【0640】

特定の態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物は、医薬組成物の恩恵を受けるであろう対象に静脈内投与される。特定の他の態様では、組成物は、例えば、リンパ内注射によってリンパ系に、または結節内注射によって（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照のこと）、または筋肉内注射によって、皮下投与によって、胸腺もしくは肝臓への直接注射によって投与される。

【0641】

特定の態様では、エクソソームを含む医薬組成物は液体懸濁液として投与される。特定の態様では、医薬組成物は投与に続いてデポーを形成することができる製剤として投与される。特定の好ましい態様では、デポーはＥＶ、例えば、エクソソームを循環中に徐々に放出する、またはデポー形態のままである。

【0642】

通常、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり、毒性がなく、対象への投与に適している。水が担体の構成要素である場合、水は高度に精製され、例えば、エンドトキシンのような汚染物質がないように処理される。

【0643】

薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物はさらに、滑沢剤、湿潤剤、甘味料、風味増強剤、乳化剤、懸濁剤及び／または保存剤を含むことができる。

【0644】

いくつかの態様では、本明細書に記載されている医薬組成物は薬学的に許容される塩を含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩はナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0645】

本明細書に記載されている医薬組成物は、本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームと、任意で、追加の薬学的に活性がある薬剤または治療剤とを含む。追加の治療剤は生物学的薬剤、小分子薬剤、または核酸薬剤であり得る。いくつかの態様では、追加の治療剤は追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストである。いくつかの態様では、ＮＬＲＰ３アンタゴニストは本明細書で開示されている任意のＮＬＲＰ３アンタゴニストである。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは抗ＮＬＲＰ３抗体である。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは小分子である。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは本明細書で開示されている小分子である。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは、ＭＣＣ９５０、タニラスト、オリドニン、ＣＹ－０９、ベイ１１－７０８２、パルテノリド、３，４－メチレンジオキシ－β－ニトロスチレン（ＭＮＢ）、β－ヒドロキシブチレート（ＢＨＢ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｉ型インターフェロン、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは以下の式を含む：

【0646】

【化26】

【0647】

いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストはＭＣＣ９５０を含む。

【0648】

いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストはＡＳＯを含む。いくつかの態様では、追加のＮＬＲＰ３アンタゴニストは本明細書に記載されている任意のＡＳＯを含む。

【0649】

本明細書に記載されているＥＶ、例えば、エクソソームを含む医薬組成物を含む剤形が提供される。いくつかの態様では、剤形は静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。いくつかの態様では、剤形は腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。

【0650】

特定の態様では、エクソソームの調製物は残存複製能のある核酸に損傷を与えるために、放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝される。

【0651】

特定の態様では、エクソソームの調製物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｋＧｙ、または１００ｋＧｙを超える照射線量を使用するガンマ照射に曝される。

【0652】

特定の態様では、エクソソームの調製物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ｍＳｖ、または１００００ｍＳｖを超える照射線量を使用するＸ線照射に曝される。

【0653】

ＶＩ．キット
本明細書で提供されているのはまた、本明細書に記載されている１以上のエクソソームを含むキットである。いくつかの態様では、本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されている１以上のエクソソームのような本明細書に記載されている医薬組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容器、任意での使用説明書を含む医薬のパックまたはキットである。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載されている医薬組成物、及び本明細書に記載されているもののような任意の予防剤または治療剤を含有する。いくつかの態様では、キットはさらに、本明細書で開示されている任意の方法に従ってＥＶを投与するための説明書を含む。いくつかの態様では、キットは造血に関連する疾患または状態の治療で使用するためのものである。いくつかの態様では、キットは診断用キットである。

【0654】

ＶＩＩ． 使用方法
特定の態様では、本開示は、本明細書で開示されているＥＶ（例えば、エクソソーム）を（例えば、本開示のＡＳＯを含む）対象に投与することを含む、疾患または障害の予防及び／または治療を必要とする対象においてそれを行う方法を提供する。本明細書に記載されているように、本開示に有用なＡＳＯは、ＮＬＲＰ３転写物（例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の１以上の領域と特異的にハイブリッド形成し、細胞におけるＮＬＲＰ３タンパク質発現の低減及び／または阻害をもたらすことができる。したがって、そのようなＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）（例えば、本明細書で開示されているＥＶ）は、ＮＬＲＰ３タンパク質の高い発現に関連する任意の疾患または障害を予防する及び／または治療するのに有用であり得る。

【0655】

いくつかの態様では、本発明の方法で治療することができる疾患または障害は炎症の増加を特徴とする。いくつかの態様では、本開示で治療することができる疾患または障害は線維症を含む。いくつかの態様では、本開示で治療することができる疾患または障害は膵炎を含む。

【0656】

いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの態様では、ＥＶは好適な液体に注入され、対象の静脈中に投与される。いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの態様では、ＥＶは好適な液体に注入され、対象の動脈中に投与される。

【0657】

いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は髄腔内投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は、髄腔内投与によって投与され、その後、機械的対流力が胴体に適用される。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．１２：ｅ１２０３０（２０２０）を参照のこと。したがって、本開示の特定の態様は、髄腔内注射によってＥＶ、例えば、エクソソームを対象に投与し、続いて、対象の胴体に機械的対流力を適用することを含む、ＥＶ、例えば、エクソソームを投与することを必要とする対象にそれを行う方法を対象とする。いくつかの態様では、機械的対流力は、高周波の胸壁または腰椎の振動呼吸クリアランス装置（例えば、Ｓｍａｒｔ ＶｅｓｔまたはＳｍａｒｔ Ｗｒａｐ，ＥＬＥＣＴＲＯＭＥＤ ＩＮＣ，Ｎｅｗ Ｐｒａｇｕｅ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して達成される。いくつかの態様では、機械的対流力、例えば、振動ベストは、髄腔内に投与されたＥＶ、例えば、エクソソームの、神経のさらに下への広がりを促進するので、さらに良好なＥＶ、例えば、エクソソームの神経への送達を可能にする。

【0658】

いくつかの態様では、エクソソームのコンパートメント内及びコンパートメントを介した生体内分布は、エクソソームのコンパートメント送達後に対象に作用する外因性の体外力によって操作することができる。これには、例えば、体のコンパートメントまたは全身の打診、振動、振盪、またはマッサージを適用することによる機械的対流の適用が含まれる。例えば、髄腔内投与に続いて、振動する機械的ジャケットを含むいくつかの手段による胸壁振動の適用は、神経軸に沿って、または脳神経及び脊髄神経に沿ってエクソソームの生体内分布を広げることができ、これは薬物運搬エクソソームによる神経障害の治療に役立ち得る。

【0659】

いくつかの態様では、振動ジャケットまたは他の同様の手段を介した外的な機械的対流力の適用を使用して、髄腔内空間の脳脊髄液から末梢循環に向かってエクソソーム及び他の物質を排除することができる。この態様は、内在性の有毒なエクソソームや、ベータアミロイド、タウ、α－シヌクレイン、ＴＤＰ４３、ニューロフィラメント、及び過剰な脳脊髄液のような他の有害な高分子を排泄のために髄腔内から末梢に排除するのに役立つことができる。

【0660】

いくつかの態様では、脳室内経路を介して送達されるエクソソームは、腰椎穿刺を同時に組み込み、エクソソーム投与後に追加の流体が脳室に注入される一方で、既存の脊髄軸のＣＳＦを外に出すことが腰椎穿刺である脳室腰部灌流を可能にすることによって神経軸全体にわたって移動させることができる。脳室腰部灌流は、軟髄膜の炎症や他の疾患を治療するために、ＩＣＶ投与したエクソソームが神経軸全体に沿って広がり、くも膜下の空間を完全に覆うことを可能にすることができる。

【0661】

いくつかの態様では、外部の体外集束超音波、熱エネルギー（熱）または寒冷の適用を使用して、これらの現象に敏感であるように設計されたエクソソームのコンパートメント薬物動態及び薬物放出特性を操作してもよい。

【0662】

いくつかの態様では、常磁性材料を含有するように設計されたエクソソームのコンパートメント内挙動及び生体内分布は、磁石または磁場の外部適用によって操作することができる。

【0663】

いくつかの態様では、ＥＶは、ＥＶが脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は対象の１以上の腫瘍に腫瘍内投与される。いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ＥＶは局所投与または全身投与のいずれかの形態で鼻を通して吹き込むことができる。特定の態様では、ＥＶは鼻スプレーとして投与される。いくつかの態様では、ＥＶ（例えば、エクソソーム）は腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ＥＶは好適な液体に注入され、対象の腹膜中に注射される。いくつかの態様では、腹腔内投与はリンパ管へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、胸腺、脾臓、及び／または骨髄へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与はＥＶの１以上のリンパ節への分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１以上へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、腹腔内投与は膵臓へのＥＶの分布をもたらす。いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームは眼球周囲投与によって対象に投与される。いくつかの態様では、ｓは眼球周囲組織に注射される。眼球周囲薬物投与には、結膜下、前テノン嚢下、後テノン嚢下、及び眼球後投与の経路が挙げられる。

【0664】

ＶＩＩＩ． ＥＶの製造方法
いくつかの態様では、本開示はまた、本明細書に記載されているＥＶを製造する方法も対象とする。いくつかの態様では、方法は、例えば、産生細胞からＥＶ、例えば、エクソソームを取得し、その際、産生細胞はＥＶ、例えば、エクソソーム（例えば、ＡＳＯ）の１以上の構成成分を含有することと；任意で、得られたＥＶ、例えば、エクソソームを単離することとを含む。いくつかの態様では、方法は本明細書で開示されているＥＶの１以上の構成成分（例えば、ＡＳＯ）を導入することによって産生細胞を改変することと；改変された産生細胞からＥＶ、例えば、エクソソームを得ることと；任意で、得られたＥＶ、例えば、エクソソームを単離することとを含む。さらなる態様では、方法は、産生細胞からＥＶを得することと；得られたＥＶを単離することと；単離されたＥＶを改変することとを含む。特定の態様では、方法はさらに、単離されたＥＶを医薬組成物に製剤化することを含む。

【0665】

ＶＩＩＩ．Ａ． 産生細胞を改変する方法
上記の通り、いくつかの態様では、ＥＶの製造方法は、１以上の部分（例えば、ＡＳＯ）で産生細胞を改変することを含む。特定の態様では、１以上の部分がＡＳＯを含む。いくつかの態様では、１以上の部分はさらに、本明細書で開示されている足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を含む。

【0666】

いくつかの態様では、産生細胞は、哺乳類細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。特定の態様では、産生細胞は哺乳類細胞株である。哺乳類細胞株の非限定的な例には、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ－１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ－６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊膜細胞株、上皮細胞株、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株及びそれらの組み合わせが挙げられる。特定の態様では、哺乳類細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）神経前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊膜細胞、脂肪性間葉系幹細胞、ＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、産生細胞は初代細胞である。特定の態様では、初代細胞は、初代哺乳類細胞、初代植物細胞、初代昆虫細胞、初代真菌細胞、または初代原核細胞であり得る。

【0667】

特定の態様では、産生細胞は、例えば、抗原提示細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のような免疫細胞ではない。他の態様では、産生細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、マスト細胞、好中球、クッパー・ブロウィッツ細胞、または任意のそのような細胞に由来する細胞）ではない。

【0668】

いくつかの態様では、１以上の部分は、導入遺伝子またはｍＲＮＡであることができ、形質移入、ウイルス形質導入、電気穿孔法、押し出し、超音波処理、細胞融合、または当業者に知られている他の方法によって産生細胞に導入され得る。

【0669】

いくつかの態様では、１以上の部分は形質移入によって産生細胞に導入される。いくつかの態様では、１以上の部分は、好適な産生細胞に、合成高分子、例えば、カチオン性脂質及びポリマーを使用して導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。いくつかの態様では、カチオン性脂質は電荷相互作用を介して１以上の部分との複合体を形成する。これらの態様のいくつかでは、正に荷電した複合体は負に荷電した細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞により取り込まれる。いくつかの他の態様では、カチオン性ポリマーを用いて産生細胞に形質移入することができる。これらの態様のいくつかでは、カチオン性ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して１以上の部分を産生細胞に導入することができる。１以上の部分はまた、物理的方法、例えば、粒子介在性形質移入、「遺伝子銃」、バイオリステック法、または粒子衝撃技術（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））を使用して産生細胞に導入することもできる。例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子を使用して産生細胞の形質移入効率を評価することができる。

【0670】

特定の態様では、１以上の部分はウイルス形質導入によって産生細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含む多くのウイルスを、遺伝子導入ビヒクルとして使用することができる。ウイルス介在性遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクター、ならびにレトロウイルスに基づくベクターを含む。

【0671】

特定の態様では、１以上の部分は電気穿孔法によって産生細胞に導入される。電気穿孔法は、細胞膜に一時的な孔を作り出し、細胞中への種々の分子の導入を可能にする。いくつかの態様では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびにポリペプチド及び非ポリペプチドの治療剤は電気穿孔法によって産生細胞に導入され得る。

【0672】

特定の態様では、１以上の部分は微量注入法によって産生細胞に導入される。いくつかの態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して顕微鏡レベルで１以上の部分を産生細胞に注入することができる。

【0673】

いくつかの態様では、１以上の部分は押し出しによって産生細胞に導入される。

【0674】

いくつかの態様では、１以上の部分は超音波処理によって産生細胞に導入される。いくつかの態様では、産生細胞は、高強度音波に曝露され、細胞膜の一時的な破壊を引き起こして、１以上の部分の負荷を可能にする。

【0675】

いくつかの態様では、１以上の部分は細胞融合によって産生細胞に導入される。いくつかの態様では、１以上の部分は電気的細胞融合によって産生細胞に導入される。他の態様では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して産生細胞を融合させる。さらなる態様では、センダイウイルスを使用して産生細胞を融合させる。

【0676】

いくつかの態様では、１以上の部分は低張溶解によって産生細胞に導入される。そのような態様では、産生細胞は低イオン強度緩衝液に曝露され、それらを破裂させて１以上の成分の負荷を可能にすることができる。他の態様では、低張溶液に対する制御透析を使用して産生細胞を膨潤させ、産生細胞の膜に孔を作り出すことができる。産生細胞は、その後、膜の再封鎖を可能にする条件に曝露される。

【0677】

いくつかの態様では、１以上の成分は界面活性剤処理によって産生細胞に導入される。特定の態様では、産生細胞は、孔を作り出すことによって産生細胞膜を一時的に傷つけ、１以上の部分の負荷を可能にする中性界面活性剤で処理される。産生細胞が負荷された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再封鎖する。

【0678】

いくつかの態様では、１以上の部分は受容体介在性エンドサイトーシスによって産生細胞に導入される。特定の態様では、産生細胞は、１以上の部分の結合の際に受容体及び会合した部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。

【0679】

いくつかの態様では、１以上の部分は濾過によって産生細胞に導入される。特定の態様では、産生細胞及び１以上の部分は産生細胞より小さい孔径のフィルターを通され、産生細胞の膜の一時的な破壊を引き起こし、１以上の部分が産生細胞に入れるようにする。

【0680】

いくつかの態様では、産生細胞はいくつかの凍結融解サイクルに曝され、細胞膜破壊を生じ、１以上の部分の負荷を可能にする。

【0681】

ＶＩＩＩ．Ｂ． ＥＶ、例えば、エクソソームを改変する方法
いくつかの態様では、ＥＶ、例えば、エクソソームを生成する方法は、１以上の部分をＥＶに直接導入することによって単離されたＥＶを改変することを含む。特定の態様では、１以上の部分はＡＳＯを含む。いくつかの態様では、１以上の部分は本明細書で開示されている足場部分（例えば、足場Ｘまたは足場Ｙ）を含む。

【0682】

いくつかの態様では、１以上の部分は形質移入によってＥＶに導入される。いくつかの態様では、１以上の部分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用してＥＶに導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。特定の態様では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を使用して１以上の部分をＥＶに導入することができる。

【0683】

いくつかの態様では、１以上の部分は電気穿孔法によってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ＥＶはＥＶ膜に一時的な孔を生じさせる電場に曝露され、１以上の部分の負荷を可能にする。

【0684】

特定の態様では、１以上の部分は微量注入法によってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ガラス製マイクロピペットを使用して１以上の部分を顕微鏡レベルでＥＶに直接注入することができる。

【0685】

いくつかの態様では、１以上の部分は押し出しによってＥＶに導入される。

【0686】

いくつかの態様では、１以上の部分は超音波処理によってＥＶに導入される。いくつかの態様では、ＥＶは高強度音波に曝露され、ＥＶ膜の一時的な破壊を引き起こして、１以上の部分の負荷を可能にする。

【0687】

いくつかの態様では、１以上の部分をＥＶの表面に結合させることができる。複合体化は、当該技術分野で既知の方法により、化学的または酵素的に達成され得る。

【0688】

いくつかの態様では、ＥＶは化学的に結合される１以上の部分を含む。化学的複合体化は、リンカー使用を伴って、または伴わずに、１以上の部分を別の分子に共有結合させることによって達成され得る。そのような複合体の形成は熟練者の技能の範囲内であり、複合体化を達成するための種々の技法が既知であり、特定の技法の選択は複合体化される材料によって導かれる。特定の態様では、ポリペプチドはＥＶに結合される。いくつかの態様では、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子のような非ポリペプチドはＥＶに複合体化される。

【0689】

いくつかの態様では、１以上の部分は低張溶解によってＥＶに導入される。そのような態様では、ＥＶはそれらを破裂させて１以上の部分の負荷を可能にする低イオン強度緩衝液に曝露され得る。他の態様では、低張溶液に対する制御透析を使用して、ＥＶを膨潤させ、ＥＶの膜に孔を作り出すことができる。ＥＶは、その後、膜の再封鎖を可能にする条件に曝露される。

【0690】

いくつかの態様では、１以上の部分は界面活性剤処理によってＥＶに導入される。特定の態様では、細胞外小胞は、孔を作り出すことによってＥＶの膜を一時的に傷つけ、１以上の部分の負荷を可能にする中性界面活性剤で処理される。ＥＶが負荷された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再封鎖する。

【0691】

いくつかの態様では、１以上の部分は、受容体介在性エンドサイトーシスによってＥＶに導入される。特定の態様では、ＥＶは１以上の部分の結合の際に受容体及び会合した部分の内部移行を誘導する表面受容体を有する。

【0692】

いくつかの態様では、１以上の部分は機械焚きによってＥＶに導入される。特定の態様では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアのような重い粒子または荷電粒子に付着された１以上の部分を浴びせられ得る。これらの態様のいくつかでは、粒子は、粒子がＥＶの膜を横断するように機械的または電気的に加速され得る。

【0693】

いくつかの態様では、細胞外小胞は、いくつかの凍結融解サイクルに曝され、ＥＶの膜破壊を生じ、１以上部分の負荷を可能にする。

【0694】

ＶＩＩＩ．Ｃ． ＥＶ、例えば、エクソソームを単離する方法
いくつかの態様では、本明細書で開示されているＥＶを生成する方法は、産生細胞からＥＶを単離することを含む。特定の態様では、ＥＶは産生細胞によって細胞培養培地中に放出される。ＥＶの単離のすべての既知の様式は本明細書での使用に好適であると思われることが企図される。例えば、ＥＶの物理的性質は、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子ふるい等）、密度（例えば、通常遠心分離のまたは勾配遠心分離）、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ定数（例えば、外力を伴うまたは伴わない沈降等）に基づく分離を含む、培地または他の供給源材料からそれらを分離するために採用され得る。代わりにまたはさらに、単離は１以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカーを採用することができる方法（例えば、沈殿、固相への可逆的結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製等）を含む。

【0695】

単離及び濃縮は、通常、連続遠心分離を含む、一般的かつ非選択的様式で行われ得る。あるいは、単離及び濃縮は、ＥＶまたは産生細胞に特異的な表面マーカーを使用することのような、さらに特異的かつ選択的な様式で行われ得る。例えば、特異的表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、アフィニティ精製、及びビーズ結合リガンドによる磁気分離において使用され得る。

【0696】

いくつかの態様では、ＥＶを単離するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技法は、当該技術分野で既知である。例示的で非限定的な技法は本明細書で提供されている。いくつかの態様では、空隙容積画分が単離され、目的のＥＶを含む。さらに、いくつかの態様では、ＥＶはさらに、当該技術分野で一般に知られている（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技術によるクロマトグラフィー分離後に単離され得る。いくつかの態様では、例えば、密度勾配遠心分離を利用して細胞外小胞をさらに単離することができる。特定の態様では、他の起源のＥＶから産生細胞由来のＥＶをさらに分離することが望ましくてもよい。例えば、産生細胞に特異的な抗原抗体を用いた免疫吸着捕捉によって非産生細胞由来のＥＶから産生細胞由来のＥＶを分離することができる。

【0697】

いくつかの態様では、ＥＶの単離は、分画遠心法、サイズに基づく膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離を含むが、これらに限定されない方法の組み合わせを含むことができる。

【0698】

本開示の実践は、別段の指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用し、それらは当該技術分野の技能の範囲内にある。そのような技法は文献で充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４），Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７），Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ （Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４），Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６） Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；）；Ｃｒｏｏｋｅ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ Ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （２００７）、及びｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。

【0699】

上で引用されたすべての参考文献、ならびに本明細書で引用されたすべての参考文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0700】

以下の実施例は、例示として示されており、限定するために示されているものではない。

【実施例】

【0701】

実施例１：ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の低減の試験管内分析
本明細書で開示されている例示的なＡＳＯはＮＬＲＰ３転写物を特異的に標的とするように設計された。図１を参照のこと。レポーターの上流にヒトＮＬＲＰ３コード配列を含有するレポーター細胞株にてＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現をノックダウンする能力について開示されているＡＳＯを調べる。ＮＬＲＰ３特異的ｓｉＲＮＡを陽性対照として使用する。

【0702】

簡単に説明すると、ＮＬＲＰ３を発現しているレポーター細胞株を細胞培養培地で増殖させ、９６ウェルプレートに播種する。次に、本明細書で開示されている１以上のＡＳＯを含む異なる濃度のＥＶ（例えば、エクソソーム）（「ＥＶ－ＡＳＯ」）で細胞を処理する。そのようなＥＶを製造するための方法は本開示の他の場所で提供されている。ＥＶ－ＡＳＯ処理の約３日後に細胞を回収し、ＲＮＡ及び／またはタンパク質を細胞から精製する。次に、細胞内のＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の発現レベルを、ｑＰＣＲ及びウエスタンブロットのようなアッセイを使用して定量化する。

【0703】

実施例２：エクソソームの構築
本明細書に記載されているエクソソームを生成するために、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３ＳＦ）を使用する。目的の薬剤（例えば、抗原、アジュバント、または免疫調節剤）に連結された足場Ｘ、足場Ｙ、及び／またはアンカー部分で安定して細胞に形質移入する。

【0704】

形質移入の際、ＨＥＫ細胞は化学的に定義された培地にて７日間高密度で増殖させる。その後、馴化細胞培養培地を回収し、３００～８００×ｇで室温にて５分間遠心分離して、細胞と大きな破片を除去する。培地の上清に１０００Ｕ／ＬのＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）を加え、これを水槽にて３７℃で１時間インキュベートする。上清を回収し、４℃にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して、残余の細胞残屑及び他の大きな混入物質を除去する。次に、上清を１３３，９００×ｇで４℃にて３時間超遠心分離し、エクソソームを沈殿させる。上清を捨て、残留培地をチューブの底から吸引する。沈殿物を２００～１０００μＬのＰＢＳ（－Ｃａ－Ｍｇ）に再懸濁させる。

【0705】

エクソソーム集団をさらに濃縮するために、沈殿物を密度勾配精製（スクロースまたはＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標））を介して処理した。

【0706】

ＳＷ ４１ Ｔｉローターに配置した１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ内でこの勾配を４℃にて２００，０００×ｇで１６時間遠沈し、エクソソーム画分を分離する。

【0707】

次いで、エクソソーム層を、その最上層から徐々に取り出し、３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブ内にて約３２．５ｍＬのＰＢＳで希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間再び超遠心分離し、精製されたエクソソームを沈殿させる。得られた沈殿物を最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁させ、４℃で保存する。

【0708】

ＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配については、ＳＷ ４１ Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブにて３層無菌勾配を等量の１０％、３０％、及び４５％のＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）にて調製する。沈殿物をこのＯＰＴＩＰＲＥＰ（商標）勾配に加え、４℃にて２００，０００×ｇで１６時間超遠心分離し、エクソソーム画分を分離する。そのエクソソーム層を、次いでチューブの上層約３ｍＬから穏やかに回収する。

【0709】

そのエクソソーム画分を３８．５ｍＬのＵｌｔｒａ－Ｃｌｅａｒ（３４４０５８）チューブにて約３２ｍＬのＰＢＳで希釈し、４℃にて１３３，９００×ｇで３時間超遠心分離し、精製されたエクソソームを沈殿させる。次いで、沈殿させたエクソソームを最小量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁させ、使用の準備が整うまで４℃で保存する。

【0710】

実施例３：ＮＬＲＰ３のＡＳＯの設計
マウス及びヒトのＡＳＯは、ＮＬＲＰ３（遺伝子ＩＤ番号１１４５４８）の発現を標的とするように設計された。標的配列は、ヒトＮＬＲＰ３については参照配列ＮＭ＿００４８９５を使用し、マウスＮＬＲＰ３についてはＮＭ＿１４５８２７．４を使用して選択した。発生期の転写物の全長にわたってＡＳＯのｔｉｌｌｉｎｇを行うことによって、考えられるＡＳＯのリストを各遺伝子に対して生成した。長さが１５、１６、１７、１８、１９、または２０の核酸塩基を有するＡＳＯを生成した。

【0711】

ＡＳＯは、次の特性：すべてのスプライス形態にヒットする必要がある；低い自己二量体化エネルギー（狙いどおりの活性）；ＧＧＧＧモチーフなし（合成の問題を引き起こすことができる）；オリゴにおける３未満のＣｐＧジヌクレオチド（潜在的な免疫刺激）；８塩基未満のパリンドローム配列（潜在的な二量体化及び免疫刺激）；既知のｍｉＲＮＡとｌｎｃＲＮＡ、及び新生と成熟の双方の転写物を含む、任意の遺伝子への的外れのヒットにおける２を超えるミスマッチと１７以下の連続する塩基；反復配列との重複なし；及び一般集団で０．０１ＭＡＦ以上のＳＮＰと重複なし、に基づいて優先順位を付けた。追加の基準には、予測される種の交差反応性（例えば、ヒト、カニクイザル、アカゲザル、ラット、マウスの転写物）；及び成熟転写物における３以下のミスマッチ（ｍｍ）、ｌｎｃ転写物における３以下のｍｍ、ｍｉＲＮＡにおける３以下のｍｍ、及び発生期転写物における３以下のｍｍの的外れ（ＯＴ）のフィルターが含まれた。

【0712】

実施例４：ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質の低減の生体内分析
生体内でＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質のレベルを低減することにおける本明細書で開示されている１以上のＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の効力を評価するために、線維症マウスモデルを使用する。本明細書で開示されているＡＳＯは、種々の投薬計画でマウスに投与されるであろう。マウスは線維症の症状についてモニターされる。最終的にマウスを屠殺し、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質のレベルを種々の細胞で評価する。

【0713】

実施例５：ヒト初代単球及びマクロファージにおける機能的アッセイ
ＮＬＲＰ３経路の活性化はヒトの単球及びマクロファージによるＩＬ－１β産生を誘導する。ヒト全血から単離した単球、ならびに単球を使用して６日間Ｍ－ＣＳＦで成熟させたＭ０マクロファージを使用して実証されたように、ＮＬＲＰ３経路の活性化は２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで３時間刺激した後、５ｍＭのＡＴＰとともに一晩インキュベートすることによって達成することができる。ＩＬ－１β産生の誘導は、ＭＣＣ９５０及び遊離薬物による処理のＩＣ５０値によって阻害することができる（図２Ａ～２Ｂ）。ＩＬ－１β濃度はアルファＬＩＳＡアッセイを使用して決定される。

【0714】

ＮＬＲＰ３経路の活性化後のヒト細胞によるＩＬ－１β産生と同様に、マウス骨髄由来マクロファージもＩＬ－１βを産生するが、それは２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで３時間刺激した後、５ｍＭのＡＴＰとともに３時間インキュベートすることによって達成することができる（図２Ｃ）。

【0715】

実施例６：生体内腹膜炎モデル
腹腔内ＬＰＳ負荷はマウスでＩＬ－１βの産生を誘導し、それは負荷の３時間後に体循環で検出することができる。ＬＰＳ負荷マウスの血清中のＩＬ－１βの誘導は、負荷の１時間前に腹腔内投与されたＭＣＣ９５０で前処理することによって阻害することができる（図３Ａ～３Ｂ）。

【0716】

実施例７：神経炎症におけるＣＮＳマクロファージ抑制とＭ２極性化
神経炎症関連神経障害の治療にて本明細書で開示されている１以上のＡＳＯを含むＥＶ（例えば、エクソソーム）の効力を評価するために、多発性硬化症（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＭ））、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー型認知症、及びその他の炎症性神経障害（実験的自己免疫性神経炎（ＥＡＮ）など）のマウスモデルが使用される。本明細書で開示されているＡＳＯは種々の投薬計画でマウスに投与されるであろう。マウスは、神経炎症を含む疾患の症状についてモニターされる。最終的にマウスを屠殺し、ＮＬＲＰ３ ｍＲＮＡ及び／またはＮＬＲＰ３タンパク質のレベルを種々の細胞で評価する。Ｍ２マクロファージの極性化、ならびにマクロファージの局在化及び活性化もモニターされる。

【0717】

実施例８：マウスモデルでのＮＬＲＰ３の標的とされた低減
マウスＮＬＲＰ３転写物のコンピューターによる解析を使用して１００の候補ＮＬＲＰ３のＡＳＯを生成した。マウスＪ７７４．１細胞を試験管内にて５ｎＭまたは２０ｎＭの各候補ＮＬＲＰ３のＡＳＯで処理した。ＮＬＲＰ３の発現はｑＲＴ－ＰＣＲを使用して測定し、少なくとも５０％のノックダウンを生じる約３０のＡＳＯがさらなる解析に供された。次に、実績の高い上位２２のＡＳＯを、マウスＪ７７４．１細胞にて種々の濃度の７点用量設定に供し、ＮＬＲＰ３の発現をｑＲＴ－ＰＣＲで再度測定した（図４Ａ～４Ｖ）。７点用量設定の後の上位１０候補を以下の表５に収載する。

【表5】

【0718】

ＨＥＫレポーター細胞株にマウスＮＬＲＰ３レポーター構築物（図５Ａ）を形質移入して、実績の上位５つのマウスＡＳＯ（ＡＳＯ番号１６、１９、７０、９８、及び４３、図５Ｂ）の１１の濃度でＮＬＲＰ３ノックダウンをアッセイした。５つのＡＳＯはすべて、ＨＥＫレポーター細胞株でＮＬＲＰ３の用量依存性のノックダウンを示すことができ、ＡＳＯ番号９８が最も強力なノックダウンを有した。

【0719】

骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を使用して、ＮＬＲＰ３のノックダウンがＮＬＲＰ３経路の活性化に対して下流の効果を有するどうかを判定することができる（図６Ａ～６Ｂ）。ＡＳＯ－ＲＮＡｉＭＡＸ複合体の一部として漸増濃度の実績の上位５つのマウスＡＳＯ（ＡＳＯ番号１６、１９、７０、９８、及び４３）でＢＭＤＭに形質移入した。形質移入の２日後、細胞ＢＭＤＭを２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで処理した。３時間後、ＢＭＤＭを５ｍＭのＡＴＰで処理した。ＡＴＰ処理の３時間後、ＩＬ－１β分泌を測定した。陰性対照（未処理のＢＭＤＭ及びＡＳＯなしまたはスクランブルＡＳＯのいずれかで処理したＢＭＤＭ）は高レベルの分泌されたＩＬ－１βを示した（図６Ｃ）。逆に、各マウスＮＬＲＰ３のＡＳＯは調べたすべての用量でＩＬ－１β分泌の低減を誘発した（図６Ｃ）。マウスＮＬＲＰ３のＡＳＯで処理したＢＭＤＭは生存率の上昇も示した（図６Ｄ）。

【0720】

ＭＣＣ９５０小分子ＮＬＲＰ３阻害剤を使用するＮＬＲＰ３経路の阻害は、マウスモデルにおいてＬＰＳ誘発性急性腹膜炎を軽減する（図７Ａ～７Ｂ）。以下の表６のスケジュールに従って、ＭＣＣ９５０、またはＡＳＯ（ＡＳＯ番号１６、１９、７０、及び９８から選択）を負荷したエクソソームの２つの用量をマウスに投与した。ＮＴＡカウント、エクソソームあたりのＡＳＯ分子の数、及び各ＡＳＯ構築物のＡＳＯ濃度を図８Ａ～８Ｃに示す。マウスＮＬＲＰ３を標的とする４つのエクソＡＳＯはすべて、血清にてまたは腹膜洗浄液によって測定されるようにＩＬ－１β誘導を低減した（図９Ａ～９Ｅ）。ＴＮＦ－α及びＩＬ－６は、ＰＢＳで処理された対照と比べて、ＮＬＲＰ３を標的とするエクソＡＳＯによって減少することが見いだされなかった（図１０Ａ～１０Ｃ）。これらのデータはＮＬＲＰ３阻害がＮＬＲＰ３経路に特異的であることを示している。

【表6】

【0721】

実施例９：ヒト細胞におけるＮＬＲＰ３の目的とする低減
ヒトＮＬＲＰ３転写物のコンピューターによる解析を使用して１００の候補ＮＬＲＰ３のＡＳＯを生成した。ＨＥＫレポーター細胞を試験管内にて５ｎＭまたは２０ｎＭの各候補ＮＬＲＰ３のＡＳＯで処理した。処理したＡＳＯの約４分の１は少なくとも５０％のノックダウンをもたらした（図１１）。次に、実績の高い上位３０のＡＳＯを、ＨＥＫレポーター細胞にて種々の濃度の７点用量設定に供し、ＮＬＲＰ３の発現についてアッセイした（図１２Ａ～１２Ｃ）。７点用量設定の後の上位１１候補を以下の表７に収載する。

【表7】

【0722】

全血から分離されたヒト単球を使用して実績上位のＡＳＯをさらに分析した。単離された単球はＭ－ＣＳＦで７～８日間培養した。次に、細胞を播種し、一晩培養した。次に、細胞を０日目にＭＣＣ９５０で処理した、または－２日目にヒトＮＬＲＰ３のＡＳＯを発現するＲＮＡｉＭＡＸ構築物で細胞に形質移入した（またはＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエクソソームに負荷されたＡＳＯで処理した）。０日目（ＭＣＣ９５０処理した細胞のＭＣＣ９５０処理の１時間後）に細胞を２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで処理した。３時間後、細胞を５ｍＭのＡＴＰで処理した。３時間後、アルファＬＩＳＡを使用してＩＬ－１βレベルを測定した。コレステロールタグ付きＡＳＯを、ＰＴＧＦＲＮを過剰発現するエクソソームとともにインキュベートしてエクソソームの表面にＡＳＯを負荷した。

【0723】

３つのｈＮＬＲＰ３のＡＳＯ（３０９４、２６７２、及び１６６４）のそれぞれは、ＩＬ－１β誘導の用量依存性の減少を誘発した（図１３Ａ～１３Ｊ）。ほとんどのドナー細胞集団において、ｈＮＬＲＰ３のＡＳＯは２ｎＭ（図１３Ｅ～１３Ｇ）及び１０ｎＭ（図１３Ｈ～１５Ｊ）にてＡＳＯスクランブル対照と比べてＩＬ－１β分泌を低減した。細胞生存率は２ｎＭ及び１０ｎＭのＡＳＯの低用量で安定したままであったが、細胞生存率は調べた３つのＡＳＯすべて及びスクランブルＡＳＯ対照について５０ｎＭのＡＳＯ最高用量で低減した（図１３Ａ～１３Ｄ）。

【0724】

参照による組み込み
本出願に引用された刊行物、特許、特許出願、及び他の文書はすべて、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、または他の文書があらゆる目的のために参照によって組み込まれるように個別に指示されるのと同じ程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0725】

均等物
種々の具体的な態様が説明され、記載されてきたが、上記明細書は制約的ではない。本発明（複数可）の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解されるであろう。多くの変型は、本明細書を考慮すれば当業者に明らかとなるであろう。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図4O】

【図4P】

【図4Q】

【図4R】

【図4S】

【図4T】

【図4U】

【図4V】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図13I】

【図13J】

【配列表】

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【国際調査報告】