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特表2022-544942小児患者における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は腎機能障害を診断する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-24
(54)【発明の名称】小児患者における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は腎機能障害を診断する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20221017BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 B ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509024
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-03-17
(86)【国際出願番号】 EP2020072916
(87)【国際公開番号】W WO2021028582
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】19191968.7
(32)【優先日】2019-08-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514122524
【氏名又は名称】シュピーンゴテック ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】アンドレアス ベルクマン
(72)【発明者】
【氏名】サスキア デ ビルト
(57)【要約】
本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含む、方法である。
【選択図】なし
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含む、方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記プロ－エンケファリン又は断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である、方法。
【請求項2】
対象における腎機能を診断又はモニタリングするための方法であって、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定することを含み、
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の低下が前記対象の腎機能の改善と相関する、又は
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の増加が前記対象の腎機能の悪化と相関し、
前記プロ－エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が１人の患者で複数回行われ、
対象が小児である、方法。
【請求項3】
前記対象が、１８歳以下、より好ましくは１４歳以下、さらにより好ましくは１２歳以下、さらにより好ましくは８歳以下、さらにより好ましくは５歳以下、さらにより好ましくは２歳以下、最も好ましくは１歳以下の小児である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記小児が重症の病気である、請求項１～３に記載の方法。
【請求項5】
前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその断片のアミノ酸配列内の領域に結合するバインダーの少なくとも１つを使用することによって免疫反応性分析物のレベルを測定すること、及び（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測する関連付けを行うこと
を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つのバインダーが、配列番号１、２、５、６、８、９、１０及び１１を含む群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合し、好ましくは前記少なくとも１つのバインダーが、配列番号１、２、５、６、８及び９を含む群から選択されるアミノ酸配列をもつ領域に結合し、好ましくは前記少なくとも１つのバインダーが、配列番号６に結合する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
プロ－エンケファリンのレベルがイムノアッセイで測定され、前記バインダーが、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体又は抗体断片である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）であるプロ－エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つのバインダーを含むアッセイが使用され、前記領域のそれぞれが少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定するためのアッセイが使用され、前記アッセイのアッセイ感度が、健常な対象のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を定量でき、１５ｐｍｏｌ／Ｌ未満である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択され得る、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
ベータトレースタンパク質（ＢＴＰ）、シスタチンＣ、ＫＩＭ－１、ＴＩＭＰ－２、ＩＧＦＢＰ－７、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＮＧＡＬ、クレアチニンクリアランス、血清クレアチニン（ＳＣｒ）、尿素、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ＩＩＩ［ＰＲＩＳＭ－ＩＩＩ］スコア、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ２［ＰＩＭ－ＩＩ］スコア及びアパッチスコアを含む群から選択される、追加として少なくとも１つの臨床パラメーターが測定される、請求項１～１０に記載の方法。
【請求項12】
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が１人の患者で複数回行われる、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記モニタリングが、とられた予防及び／又は治療措置に対する前記対象の反応を評価するために行われる、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記対象をリスク群に層別化するために使用される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法を実行するためのポイント・オブ・ケア装置。
【請求項16】
アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記プロ－エンケファリン又は断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記プロ－エンケファリン又は断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
【0002】
本発明のさらなる主題は、対象における腎機能を診断又はモニタリングするための方法であって、
前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定することを含み、
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の低下が対象の腎機能の改善と相関する、又は
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の増加が対象の腎機能の悪化と相関し、
前記プロ－エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が１人の患者で複数回行われ、
対象が小児である
方法である。
前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定することを含み、
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の低下が対象の腎機能の改善と相関する、又は
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の増加が対象の腎機能の悪化と相関し、
前記プロ－エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が１人の患者で複数回行われ、
対象が小児である
方法である。
【背景技術】
【0003】
急性腎障害（ＡＫＩ）は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の低下、尿素及び他の窒素老廃物の保持、及び細胞外容量と電解質の異常調節をもたらす腎機能の急激な喪失と定義される。ＡＫＩという用語は、腎機能障害を腎機能の障害の個別所見ではなく連続的所見としてより明確に規定するので、急性腎不全に代わって広く用いられるようになった。急性腎障害（ＡＫＩ）は、重症児における頻繁で重篤な合併症であり、報告されている発症率は、一般病棟では最大５％、小児集中治療室（ＰＩＣＵ）では最大３５％である（Zwiers et al. 2015. Critical Care 19: 181）。急性腎障害はさらに、死亡率、ＩＣＵ滞在期間の延長及び機械的人工換気の延長に関する独立したリスク因子であることが示されている（Alkandari et al. 2011. Crit Care 15: R146）。現在のＡＫＩ診断のコンセンサス基準は、血清クレアチニン（ＳＣｒ）及び尿量の変化に基づいている（Akcan-Arikan et al. 2007. Kidney International 71: 1028-1035）。しかし、ＳＣｒは腎尿細管細胞損傷よりむしろ糸球体機能の指標であり、それは典型的にはＩＣＵ患者のＡＫＩの初期段階に生じる（Andreoli 2009. Pediatr Nephrol 24:253-63）。さらに、ＳＣｒは腎機能に関連しない要因に影響され、新生児では出生直後の母体のレベルを反映する（Schwartz and Furth 2007. Pediatr Nephrol 22:1839-1848; Arant 1987. Pediatr Nephrol 1:308-13）。まとめると、ＳＣｒは特に小児においてＡＫＩを診断するためには、遅発性であまり感度が高くないマーカーと考えられるようになってきている。「腎機能（kidney function）」及び「腎機能（renal function）」という用語は、本明細書を通して同義的に使用される。同様に、「腎不全（kidney failure）」及び「腎不全（renal failure）」という用語は、本明細書を通して同義的に使用される。尿細管細胞の損傷を検出する他のバイオマーカーとしては、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、腎傷害分子１（ＫＩＭ－１）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質２（ＴＩＭＰ－２）及びインスリン様成長因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ－７）が提案されている。しかし、それらのマーカーは糸球体濾過機能を反映せず、併存症、炎症、測定のタイミング及び選択したカットオフ値の影響を受ける可能性がある（Kim et al.2017.Ann Lab Med 37: 388-397; Ostermann et al. 2012.Critical Care 16:233）。
【0004】
糸球体濾過率（ＧＦＲ）は、様々なパラメーターを含む式を用いて推定することも、糸球体で濾過される機能性バイオマーカーを介して決定することもできる。上述のように、ＧＦＲを推定するための最も一般的に使用される検査は、ＳＣｒ濃度に基づくが、多くの限界が認識されている。民族、体重、及び性別によるクレアチニンの生成量の違いのほかに、クレアチニンの能動的な腎分泌（総クリアランスの最大１０％～２０％）が算出に影響する（Shemesh et al. 1985. Kidney Int 285:830-838）。このため、特に腎機能が低下している患者においてＧＦＲを過大評価することになる（Miller and Winkler 1938. J Clin Invest 1938;171: 31-40）。まとめると、ＧＦＲを評価するための従来のクレアチニンベースの方法は、感度が低く、遅発性で、不正確である。
【0005】
糸球体でのみ濾過されるヨード造影剤であるイオヘキソールの血漿中クリアランスは、真のＧＦＲを測定するための現在のゴールドスタンダードであるイヌリンのクリアランスと同等の正確さでＧＦＲを測定できることが示されている。しかし、これらの方法は時間がかかり、その測定にも手間がかかるため、臨床診療では頻繁にしか使用されない。
【0006】
小児ではクレアチニンと身長を用いたＳｃｈｗａｒｔｚらの式が最もよく使用されている（Schwartz et al. 1987. Pediatr Clin North Am 34:571-590）。しかし、この方法は１歳未満の小児に対しては検証されておらず、倫理的な問題から小規模なコホートでしか調べられていない。そのうえ、ほとんどの小児の研究で用いられる年齢間隔は広く、１歳未満では身長は腎臓の発達に相関しない。腎機能の成熟は、胎児の器官形成時に始まり、幼児期までに完了する動的な過程である。ＧＦＲの発達的増加は、正常な腎形成の存在に依存し、この過程は妊娠９週目に始まり、妊娠３６週目までに完了し、出生後に腎血流及び腎内血流の変化が続く。ＧＦＲは、正期産児では１．７３ｍ2あたり毎分約２～４ｍｌであるが、早期産児では１．７３ｍ2あたり毎分０．６～０．８ｍｌ／分と低い場合がある。ＧＦＲは、生後２週間で急速に増加し、その後、８～１２ヶ月で成人値に達するまで徐々に増加する。同様に、尿細管分泌は出生時には未熟であり、生後１年間で成人の能力に達する（Boer et al. 2010. Pediatr Nephrol 25:2107-2113; Kearns et al. 2003. N Engl J Med 349:1157-1167）。クレアチニンは、１年目に腎臓が成熟するにつれ急速に低下し、１年目の終わりには筋肉量が増加してクレアチニン産生が高くなるのでわずかに増加する（Boer et al.2010. Pediatr Nephrol 25:2107-2113）。
【0007】
プロエンケファリンＡは、内因性オピオイドであるエンケファリンファミリーの前駆体である。これはプロホルモンであり、タンパク質分解によりプロセスされて、メチオニン－エンケファリン（Ｍｅｔ－Ｅｎｋ）及びロイシン－エンケファリン（Ｌｅｕ－Ｅｎｋ）のようないくつかの活性型ペンタペプチドを、他のいくつかのペプチド断片（エンケリチン及びＣ末端伸長Ｍｅｔ－Ｅｎｋペプチド）とともに形成する。成熟したエンケファリンにくわえて、他のペプチドも生成され、そのうちの１つは安定したプロエンケファリンペプチド１１９～１５９である。プロエンケファリンは成熟したエンケファリンの主な供給源であるため、血漿／血清中のそのペプチド断片のレベルは、全身のエンケファリン合成の代用的な測定値として役立ちうる（Ernst et al., 2006. Peptides 27: 1835-1840）。エンケファリンは広く分泌されて、局所的に発現しているオピオイド受容体、特にδオピオイド受容体に作用する。また、これらのオピオイド受容体は広く発現しており、腎臓で最も高い密度が見られる（Denning et al.2008.Peptides 29 (1): 83-921）。受容体に結合した後のエンケファリンの生物学的な効果としては、侵害受容、麻酔、及び心血管調節が挙げられる（Holaday 1983. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 23: 541-594）。これらのδオピオイドアゴニストは、ナトリウム利尿及び利尿を刺激する（Sezen et al. 1998. J. Pharmacol. Exp. Ther. 287 (1): 238-245）。濃度の上昇が有害な事象と関連することを示す研究がいくつかあるが、その関連性は概して腎機能の変化に比例している。実際に、濃度の上昇は、敗血症（Marino et al. 2015. J Nephrol 28:717-724）、心不全（Ng et al. 2017. J. Am. Coll. Cardiol. 69 (1): 56-69; Matsue et al. 2017. J. Card. Fail. 23 (3): 231-239）、心臓手術（Shah et al. 2015. Clin. Nephrol. 83 (1):29-35）、及び心筋梗塞（Ng et al. 2014. J. Am. Coll. Cardiol. 63 (3) (2014) 280-289）を含むいくつかの集団において腎機能の低下と関連している。
【0008】
血漿中のメチオニン－エンケファリン（Ｍｅｔ－Ｅｎｋ）レベル及び分子量がより大きいＭｅｔ－Ｅｎｋ（Ｃ末端伸長Ｍｅｔ－Ｅｎｋペプチド）は、ヒトの新生児の出生時に測定されている（Martinez et al. 1991. Biol Neonate 60:102-107）。新生児のＭｅｔ－Ｅｎｋ免疫反応性レベルは、成人の血漿中のレベルに比べて１５倍と有意に高かった。対照的に、Ｍｅｔ－Ｅｎｋの総免疫反応性として測定して、高分子量型のＭｅｔ－Ｅｎｋは新生児と成人のレベルの間で統計的な差はなかった。
【0009】
プロ－エンケファリン及びその断片、特にプロ－エンケファリン１１９～１５９（ＭＲ－ＰＥＮＫ、配列番号６）のレベルが、健康な状態の成人と比較して、小児の血漿中で有意に増加していることは、本発明の驚くべき発見であった。さらに、プロ－エンケファリン及びその断片、特にプロ－エンケファリン１１９～１５９（ＭＲ－ＰＥＮＫ、配列番号６）は、腎機能が正常な小児と比較して、腎機能障害をもつ小児で有意に増加している。
【0010】
プロ－エンケファリン、プロエンケファリン及びＰＥＮＫという用語は、本明細書を通して同義的に使用されている。
【0011】
本発明によるリスクは、ＲＩＦＬＥ基準で定義されたリスクと相関する。ＲＩＦＬＥ分類は推定クレアチニンクリアランス（ｅＣＣｌ）及び尿量の減少の程度に基づいて、重症度が増加する腎機能障害の３つのレベル、すなわち「Ｒｉｓｋ（Ｒ）」、「Ｉｎｊｕｒｙ（Ｉ）」、及び「Ｆａｉｌｕｒｅ（Ｆ）」からなる（表１）。「Ｒ」、「Ｉ」及び「Ｆ」にくわえて、次の２つのレベルの有害な臨床転帰がある。４週間を超えて続く腎不全を意味する「Ｌｏｓｓ（Ｌ）」及び３か月を超えて続く腎不全を意味する「Ｅｎｄ－ｓｔａｇｅ（Ｅ）」。ＲＩＦＬＥ基準とは異なり、ｐＲＩＦＬＥ基準では、ＳＣｒやＧＦＲの変化ではなくｅＣＣｌの減少のみがグレードの決定に用いられる。さらに、ｅＣＣｌはＳｃｈｗａｒｔｚ式を用いて推定され、これは患者の身長及びＳＣｒレベル及び年齢調整定数（Schwartz et al. 1987. Pediatr Clin North Am 34:571-590）を組み込んでいるが、成人ＲＩＦＬＥ分類よりも長い期間の尿量にも依存している。さらに、小児に対する追加基準（ＡＫＩＮ／ＫＤＩＧＯ）が存在する（表１）。ＫＤＩＧＯガイドラインは、小児のＡＫＩの定義についてはｐＲＩＦＬＥを参照しており、後者は、月齢１か月を超える小児に対して使用されているもののままである（Thomas et al. 2015. Kidney International 87: 62-73）。
【0012】
【表1】
【発明の概要】
【0013】
本発明の主題は、健常児及び病児における腎機能及び機能不全のマーカーとしてのプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその断片の使用及びその臨床的有用性である。本発明の主題は、小児の腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は小児の腎機能障害を診断する、又は病児の有害事象のリスクを予測するための方法である。
【0014】
また、本発明の主題は、病児における腎機能、機能不全及び予後値の診断のためのＰＥＮＫ又はその断片の予後予測能及び診断能の提供であった。
【0015】
驚くべきことに、ＰＥＮＫ又はその断片は、小児における腎臓、その機能、機能不全、有害事象のリスク及び予後並びに治療又は介入の成功のモニタリングのための強力で非常に重要なバイオマーカーであることが示された。
【0016】
本発明によれば、前記プロ－エンケファリン又はその断片は、１つの特定の実施形態では、Ｌｅｕ－エンケファリンでもなく、Ｍｅｔ－エンケファリンでもない。別の特定の実施形態では、前記プロエンケファリン断片は、中間領域プロ－エンケファリン（ＭＲ－ＰＥＮＫ；配列番号６）又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片である。
【0017】
さらに、本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって免疫反応性分析物のレベルを測定すること、及び
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって免疫反応性分析物のレベルを測定すること、及び
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
【0018】
これは、体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合するバインダーが本発明の方法で使用される場合、「前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること」という用語は、「前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって免疫反応性分析物のレベルを測定すること」と同等であることを意味ずる。特定の実施形態では、体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）のアミノ酸配列内の領域に結合するバインダーが本発明の方法で使用される。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される前記バインダーは、体液中のｌｅｕ－エンケファリン又はｍｅｔ－エンケファリンのアミノ酸配列内の領域に結合しない。本発明の別の特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、中間領域プロ－エンケファリン（ＭＲ－ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸を有するその断片に結合する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図2】図２：健常児における生後年齢の線形関数としてのプロエンケファリンＡ １１９～１５９（ＰＥＮＫ）の基準パーセンタイル。正方形は、我々の健常コホートにおけるすべての健常患者（ｎ＝１００）のすべての実測ＰＥＮＫ濃度（１４５試料）を表す。ＰＥＮＫの基準パーセンタイルは、２．５パーセンタイル（一点鎖線、下）、２５パーセンタイル（破線、下）、５０パーセンタイル（実線）、７５パーセンタイル（破線、上）及び９７．５パーセンタイル（一点鎖線、上）で示されている。
【図3】図３：挿管後の最初の４８時間における非ＡＫＩと比較したＡＫＩの重症患者のＰＥＮＫ濃度。血漿ＰＥＮＫレベルは、挿管後の５時間枠で中央値と四分位範囲として提示した。アウトカムは、時間枠ごと各患者、１つの試料を、挿管後４８時間以内に「ＡＫＩなし」（緑）又は「ＡＫＩ」（赤）に層別化される。各時間枠の上の括弧内の数字は、各カテゴリーの患者数を表す。＊＊：ｐ＜．０１；＊＊＊：ｐ＜．００１；ｎ．ｓ．：統計的に有意ではない（ｐ＞．０５）。
【図4】図４：健常児及び様々なレベルのＡＫＩをもつ病児におけるＰＥＮＫ濃度。１００名の健常児（１４５試料）及びサンプリング時にＲＩＦＬＥスコアに基づく様々な程度のＡＫＩをもつ９１名の重症児（試料総数５６１：ＡＫＩなし４２２、Ｒｉｓｋ８６、Ｉｎｊｕｒｅ２８、Ｆａｉｌｕｒｅ２５）における９５％信頼区間でのＰＥＮＫ濃度中央値の概要。対応するＲＩＦＬＥスコアがないため１７個のＰＥＮＫ試料は使用されず。重症児の統計的有意性は、全試験期間中の９１名の重症児のすべての試料（５６１試料）及び採血時の対応するＲＩＦＬＥステージを用いて、反復サンプリング及びすべての共変量（ＲＩＦＬＥスコア、性別、生後年齢、挿管後の時間、昇圧薬の使用及び診断カテゴリー）について補正した線形混合モデル解析からの推定限界平均値の結果に基づく。重症児の推定限界平均値と健常児の平均ＰＥＮＫ濃度（１４５試料）との間の差はスチューデントのｔ検定を用いて決定した。＊＊：ｐ＜．０１；＊＊＊：ｐ＜．００１；ｎ．ｓ：統計的に有意ではない（ｐ＞．０５）。
【図5A】図５Ａ～Ｅ：ＡＫＩ診断のためのＰＥＮＫ、シスタチンＣ及びＢＴＰの性能。挿管後の５つの時間枠：Ａ（０～６時間）、Ｂ（６～１２時間）、Ｃ（１２～２４時間）、Ｄ（２４～３６時間）及びＥ（３６～４８時間）での採血時のＡＫＩとの関連についての、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。各バイオマーカーの各時間枠におけるＡＵＲＯＣ値、信頼区間及び試料数の一覧を表７に示す。
【図5B】図５Ａ～Ｅ：ＡＫＩ診断のためのＰＥＮＫ、シスタチンＣ及びＢＴＰの性能。挿管後の５つの時間枠：Ａ（０～６時間）、Ｂ（６～１２時間）、Ｃ（１２～２４時間）、Ｄ（２４～３６時間）及びＥ（３６～４８時間）での採血時のＡＫＩとの関連についての、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。各バイオマーカーの各時間枠におけるＡＵＲＯＣ値、信頼区間及び試料数の一覧を表７に示す。
【図5C】図５Ａ～Ｅ：ＡＫＩ診断のためのＰＥＮＫ、シスタチンＣ及びＢＴＰの性能。挿管後の５つの時間枠：Ａ（０～６時間）、Ｂ（６～１２時間）、Ｃ（１２～２４時間）、Ｄ（２４～３６時間）及びＥ（３６～４８時間）での採血時のＡＫＩとの関連についての、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。各バイオマーカーの各時間枠におけるＡＵＲＯＣ値、信頼区間及び試料数の一覧を表７に示す。
【図5D】図５Ａ～Ｅ：ＡＫＩ診断のためのＰＥＮＫ、シスタチンＣ及びＢＴＰの性能。挿管後の５つの時間枠：Ａ（０～６時間）、Ｂ（６～１２時間）、Ｃ（１２～２４時間）、Ｄ（２４～３６時間）及びＥ（３６～４８時間）での採血時のＡＫＩとの関連についての、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。各バイオマーカーの各時間枠におけるＡＵＲＯＣ値、信頼区間及び試料数の一覧を表７に示す。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書で使用されると「対象」いう用語は、生きているヒト又は非ヒト生物を指す。好ましくは、本明細書において対象はヒト対象である。対象は、別段の記載がない限り、健康でも、病気があってもよい。
【0021】
本明細書で使用されると「小児」いう用語は、１８歳以下、より好ましくは１４歳以下、さらにより好ましくは１２歳以下、さらにより好ましくは８歳以下、さらにより好ましくは５歳以下、さらにより好ましくは２歳以下、最も好ましくは１歳以下である対象を指す。
【0022】
特定の実施形態では、前記小児は新生児である。新生児とは、生後２８日以内の小児を指し、早産児、正期産児、過期産児が該当する。
【0023】
「重症患者」という用語は、集中的なモニタリングとケアを必要とする、実際の又は潜在的な生命を脅かす健康問題のリスクが高い患者と定義される。それらの患者は、心血管の不安定さ（高血圧／低血圧）、致死となりうる心不整脈、気道若しくは呼吸器の障害（人工呼吸器のサポートなど）、急性腎不全、又は多臓器不全の累積的影響（現在ではより一般的に多臓器不全症候群と呼ばれる）に対するサポートを必要とする可能性がある。
【0024】
本発明の特定の実施形態では、それらの患者は、心血管の不安定さ（高血圧］／低血圧）、致死となりうる心不整脈、気道若しくは呼吸器の障害（人工呼吸器のサポートなど）、又は多臓器不全の累積的影響（現在ではより一般的に多臓器不全症候群と呼ばれる）に対するサポートを必要とする可能性があることが理解されるべきである。
【0025】
「上昇したレベル」という用語は、一定の閾値を超えたレベルを意味する。「上昇した」レベルという用語は、基準レベルとみなされている値を超えるレベルを意味する。
【0026】
本発明の文脈における「診断すること」という用語は、対象の疾患又は臨床状態の認識及び（早期）検出に関し、鑑別診断を含む場合もある。
【0027】
本発明の文脈における「予測すること」とは、対象（例えば患者）の病的状態がどのように進むことになるかを予測することを意味する。これには、前記対象の回復の可能性や有害な転帰の可能性の推定が含まれうる。
【0028】
本発明の文脈における「モニタリングすること」という用語は、対象の疾患及び／又は病態生理的状態の発症を制御することを指す。
【0029】
本発明の文脈における「治療又は介入の成功をモニタリングすること」という用語は、前記患者の治療的処置の制御及び／又は調整を指す。
【0030】
治療又は介入の成功を予測又はモニタリングすることは、例えば、プロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の測定を用いて、腎代替療法の成功を予測又はモニタリングすることでありうる。
【0031】
治療又は介入の成功を予測又はモニタリングすることは、例えば、プロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の測定を用いて、腎代替療法を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療の成功を予測又はモニタリングすることでありうる。
【0032】
治療又は介入の成功を予測又はモニタリングすることは、例えば、ＰＥＮＫ又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の測定を用いて、腎代替療法及び／又は薬剤介入の前後の腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測又はモニタリングすることでありうる。
【0033】
体液は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択される。本発明の１つの実施形態では、体液は、全血、血漿、及び血清を含む群から選択される。
【0034】
プロ－エンケファリン又はその断片の測定は対象の腎機能を表す。プロ－エンケファリン又はその断片の濃度の一定の閾値レベルを超える増加は腎機能の低下を示す。追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン又はその断片の相対的な変化は、対象の腎機能の改善（プロ－エンケファリン又はその断片の減少）及び悪化（プロ－エンケファリン又はその断片の増加）と相関する。
【0035】
プロ－エンケファリン又はその断片は腎機能障害を診断し、一定の閾値を超える上昇したレベルは前記対象の腎機能障害を予測又は診断する。追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン又はその断片の相対的な変化は、対象の腎機能の改善（プロ－エンケファリン又はその断片の減少）及び悪化（プロ－エンケファリン又はその断片の増加）と相関する。
【0036】
プロ－エンケファリン又はその断片は、腎機能／機能不全診断及び追跡検査のためのその他のマーカー（ＮＧＡＬ、血中クレアチニン、クレアチニンクリアランス、シスタチンＣ、尿素）と比較して優れている。優れているとは、特異度がより高く、感度がより高く、臨床評価項目への相関がより良好であることを意味する。
【0037】
前記プロ－エンケファリン又はその断片のレベルを、疾患のある対象（小児）における有害事象のリスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと。この面において、プロ－エンケファリン又はその断片は、上記の臨床マーカーよりも優れている。
【0038】
腎機能は、ＧＦＲ、クレアチニンクリアランス、ＳＣｒ、検尿、血中尿素窒素又は尿量で測定することができる。腎機能障害とは、腎機能の低下、例えば腎不全を意味する。
【0039】
疾患のある対象（小児）は、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、急性腎臓病（ＡＫＤ）又はＡＫＩから選択される疾患に罹患しているか、又は罹患するリスクがありうる。
【0040】
腎臓の構造と機能に影響を及ぼす疾患は、その期間に応じて急性又は慢性とみなすことができる。
【0041】
ＡＫＤは、＜３か月の腎臓の構造的損傷及び、ＡＫＩにも見られる機能的基準、又は＜３か月の１．７３ｍ2あたり＜６０ｍｌ／分のＧＦＲ、若しくはＧＦＲの＞３５％の低下、又は＜３か月の血清クレアチニン（ＳＣｒ）の＞５０％の上昇を特徴とする（Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36）。
【0042】
ＡＫＩは、数ある急性腎臓病及び障害のうちの１つであり、他の急性又は慢性の腎臓病及び障害を伴って、又は伴わずに発症しうる（Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36）。
【0043】
ＡＫＩは、ＧＦＲの低下及び腎不全を含む腎機能の低下と定義されている。ＡＫＩの診断の基準とＡＫＩの重症度のステージは、ＳＣｒ及び尿量の変化に基づいている。ＡＫＩでは、構造的な基準は必要ない（存在する可能性はある）が、７日以内にＳＣｒが５０％増加する、又は０．３ｍｇ／ｄｌ（２６．５μｍｏｌ／ｌ）増加する、又は乏尿が見られる。ＡＫＤは、外傷、脳卒中、敗血症、ＳＩＲＳ、敗血症性ショック、呼吸不全、心不全（例えば急性及び心筋梗塞後の心不全）、先天性横隔膜ヘルニア、局所及び全身性細菌感染及びウイルス感染、自己免疫疾患、熱傷、手術、がん、肝疾患、肺疾患のある患者、並びにカルシニューリン阻害剤（例えばシクロスポリン）、抗生物質（例えばアミノグリコシド又はバンコマイシン）及び抗がん剤（例えばシスプラチン）などの腎毒性物質を投与されている患者で発生しうる。
【0044】
ＣＫＤは、＞３か月の間１．７３ｍ2当たり６０ｍｌ／分未満のＧＦＲ及び＞３か月の間の腎障害を特徴とする（Kidney International Supplements, 2013; Vol.3: 19-62）。
【0045】
腎不全はＣＫＤの１つのステージであり、ＧＦＲ＜１５ｍｌ／分／１．７３ｍ2体表面積、又はＲＲＴを必要とすることと定義される。
【0046】
ＡＫＤ、ＡＫＩ及びＣＫＤの定義（KDIGO Clinical Practice Guideline for Acute Kidney Injury 2012 Vol 2 (1)による）を表２にまとめる。
【表2】
【0047】
＜２歳の小児では、腎障害及び腎機能の低下を詳細に描写し、ステージに分けるＧＦＲ閾値は、年齢に応じて調整する必要がある（KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease）。
【0048】
本発明の好ましい実施形態では、疾患のある対象（小児）は、腎不全、呼吸不全、先天性横隔膜ヘルニア、心不全、ＳＩＲＳ、敗血症、敗血症性ショック又は他の重い病気から選択される疾患に罹患していることがある。
【0049】
腎機能を補助又は代替する治療又は介入には、限定されないが、血液透析、腹膜透析、血液濾過及び腎移植を含む腎代替療法のさまざまな方法が含まれうる。
【0050】
また、腎機能を補助又は代替する治療又は介入には、薬剤介入、腎臓を補助する措置並びに腎毒性薬物の適応及び／又は中止が含まれうる。
【0051】
有害事象は、腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化又は腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡（小児ＲＩＦＬＥ基準（Akcan-Arikan et al. 2007. Kidney International 71: 1028-1035）による）を含む群から選択されうる。
【0052】
本発明の１つの実施形態では、プロ－エンケファリンの断片という用語には、Ｌｅｕ－エンケファリン及びＭｅｔ－エンケファリンも含まれることがを理解されるべきである。
【0053】
本発明による主題は、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルが、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に対する少なくとも１つのバインダーを使用することによって測定される方法である。本発明の１つの実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体、抗体断片又は非Ｉｇ－スキャホールドを含む群から選択される。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。特定の実施形態では、前記バインダーは、エンケファリンペプチドであるｍｅｔ－エンケファリン配列番号３、及びｌｅｕ－エンケファリン配列番号４に結合しない。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８、９、１０及び１１を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８及び９を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の非常に具体的な実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロエンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ、配列番号６に結合する。
【0054】
プロ－エンケファリンは以下の配列を有する。
配列番号１（プロ－エンケファリン１～２４３）
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＩＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＲＹＧＧＦＭＫＫＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＫＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳＫＲＹＧＧＦＭＲＧＬＫＲＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱＫＲＹＧＧＦＭＲＲＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱＫＲＹＧＧＦＬＫＲＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭＲＦ
配列番号１（プロ－エンケファリン１～２４３）
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＩＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＲＹＧＧＦＭＫＫＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡＫＲＹＧＧＦＭＫＫＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳＫＲＹＧＧＦＭＲＧＬＫＲＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱＫＲＹＧＧＦＭＲＲＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱＫＲＹＧＧＦＬＫＲＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭＲＦ
【0055】
体液中で測定できるプロ－エンケファリンの断片は、例えば、以下の断片の群から選択されうる。
配列番号２（シンエンケファリン（Ｓｙｎｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、プロ－エンケファリン１～７３）
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＩＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡ
配列番号３（Ｍｅｔ－エンケファリン）
ＹＧＧＦＭ
配列番号４（Ｌｅｕ－エンケファリン）
ＹＧＧＦＬ
配列番号５（プロ－エンケファリン９０～１０９）
ＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡ
配列番号６：（プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロ－エンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ）
ＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳ
配列番号７（Ｍｅｔ－エンケファリン－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）
ＹＧＧＦＭＲＧＬ
配列番号８（プロ－エンケファリン１７２～１８３）
ＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱ
配列番号９（プロ－エンケファリン１９３～２０３）
ＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱ
配列番号１０（プロ－エンケファリン２１３～２３４）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥ
配列番号１１（プロ－エンケファリン２１３～２４１）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭ
配列番号１２（Ｍｅｔ－エンケファリン－Ａｒｇ－Ｐｈｅ）
ＹＧＧＦＭＲＦ
配列番号２（シンエンケファリン（Ｓｙｎｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、プロ－エンケファリン１～７３）
ＥＣＳＱＤＣＡＴＣＳＹＲＬＶＲＰＡＤＩＮＦＬＡＣＶＭＥＣＥＧＫＬＰＳＬＫＩＷＥＴＣＫＥＬＬＱＬＳＫＰＥＬＰＱＤＧＴＳＴＬＲＥＮＳＫＰＥＥＳＨＬＬＡ
配列番号３（Ｍｅｔ－エンケファリン）
ＹＧＧＦＭ
配列番号４（Ｌｅｕ－エンケファリン）
ＹＧＧＦＬ
配列番号５（プロ－エンケファリン９０～１０９）
ＭＤＥＬＹＰＭＥＰＥＥＥＡＮＧＳＥＩＬＡ
配列番号６：（プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロ－エンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ）
ＤＡＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫＥＬＬＥＴＧＤＮＲＥＲＳＨＨＱＤＧＳＤＮＥＥＥＶＳ
配列番号７（Ｍｅｔ－エンケファリン－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）
ＹＧＧＦＭＲＧＬ
配列番号８（プロ－エンケファリン１７２～１８３）
ＳＰＱＬＥＤＥＡＫＥＬＱ
配列番号９（プロ－エンケファリン１９３～２０３）
ＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱ
配列番号１０（プロ－エンケファリン２１３～２３４）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥ
配列番号１１（プロ－エンケファリン２１３～２４１）
ＦＡＥＡＬＰＳＤＥＥＧＥＳＹＳＫＥＶＰＥＭＥＫＲＹＧＧＦＭ
配列番号１２（Ｍｅｔ－エンケファリン－Ａｒｇ－Ｐｈｅ）
ＹＧＧＦＭＲＦ
【0056】
Ｌｅｕ－エンケファリン及びＭｅｔ－エンケファリンを含むプロ－エンケファリン又はその断片のレベルを決定することは、Ｌｅｕ－エンケファリン及びＭｅｔ－エンケファリンを含むプロ－エンケファリン又はその断片に対する免疫反応性を決定することを意味しうる。Ｌｅｕ－エンケファリン及びＭｅｔ－エンケファリンを含むプロ－エンケファリン又はその断片の測定に使用されるバインダーは、結合する領域によっては、上記に示された分子のうち２つ以上に結合する場合がある。このことは当業者に明らかである。
【0057】
したがって、本発明によれば、上記のペプチド及びペプチド断片のいずれかのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダー（すなわち、配列１～１２のいずれかに記載のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）及び断片）を使用することによる免疫反応性分析物のレベルが、前記対象から得られた体液中で測定され、臨床的に関連のある特定の実施形態に関連付けられる。
【0058】
本発明による方法のより具体的な実施形態では、ＭＲ－ＰＥＮＫのレベルが測定される（配列番号６：プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロ－エンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ）。より具体的な実施形態では、免疫反応性分析物のレベルは、ＭＲ－ＰＥＮＫに結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって測定され、臨床的に関連のある特定の実施形態に対する本発明による上記実施形態、例えば、
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
に関連付けられ、
前記閾値は１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象は小児である。
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
に関連付けられ、
前記閾値は１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象は小児である。
【0059】
代替的に、上記分析物のいずれかのレベルは、他の分析方法、例えば質量分析法によって測定することができる。
【0060】
したがって、本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・免疫反応性分析物のレベルを、前記対象から得られた体液中の配列番号１～１２のプロ－エンケファリンペプチド及び断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって測定すること、及び
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
・免疫反応性分析物のレベルを、前記対象から得られた体液中の配列番号１～１２のプロ－エンケファリンペプチド及び断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって測定すること、及び
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である
方法である。
【0061】
特定の実施形態では、免疫反応性分析物のレベルは、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーを使用することによって測定される。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。特定の実施形態では、前記バインダーは、エンケファリンペプチドである配列番号３のＭｅｔ－エンケファリン及び配列番号４のＬｅｕ－エンケファリンに結合しない。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８、９、１０及び１１を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８及び９を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の非常に具体的な実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロ－エンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ（配列番号６）に結合する。前述のバインダーは、前記対象から得られた体液中の前記ペプチドに結合する。
【0062】
本発明の１つの実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体、抗体断片又は非Ｉｇ－スキャホールドを含む群から選択される。
【0063】
特定の実施形態では、プロ－エンケファリン又はその断片のレベルは、プロ－エンケファリン又はその断片に結合する抗体又は抗体の断片を用いたイムノアッセイで測定される。プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定するのに有用でありうるイムノアッセイは、実施例１で概説されるようなステップを含みうる。閾値と値はすべて、実施例１に従って使用される試験とキャリブレーションとの相関関係で見られる必要がある。当業者であれば、閾値の絶対値が、使用されるキャリブレーションに影響されうることを知っていであろう。これは、本明細書に示されているすべての値や閾値は、本明細書（実施例１）で使用されるキャリブレーションの文脈で理解されるべきであることを意味する。
【0064】
本発明によれば、プロ－エンケファリンに対する診断用バインダーは、抗体、例えば、典型的な完全長の免疫グロブリンであるＩｇＧ、又は重鎖及び軽鎖の少なくともＦ可変ドメインを化学結合抗体（断片抗原結合）として含む抗体断片、例えば、限定されないが、Ｆａｂミニボディを含むＦａｂ－断片、一本鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグをもつ一価のＦａｂ抗体、例えばＦａｂ－Ｖ５Ｓｘ２；ＣＨ3ドメインと二量体化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；二価のＦａｂ又は多価のＦａｂ、例えば異種ドメインを活用した多量化によって形成されたもの、例えばｄＨＬＸドメインの二量化によって形成されたもの、例えばＦａｂ－ｄＨＬＸ－ＦＳｘ２；Ｆ（ａｂ’）２－断片、ｓｃＦｖ－断片、多量体化された多価又は／及び多重特異性ｓｃＦｖ－断片、二価及び／又は二重特異性ダイアボディ、ＢＩＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）、三官能性抗体、多価抗体、例えばＧとは異なるクラスに由来するもの；単一ドメインの抗体、例えばラクダ類又は魚類の免疫グロブリンに由来するナノボディからなる群より選択される。
【0065】
特定の実施形態では、プロ－エンケファリン又はその断片のレベルは、プロ－エンケファリン又はその断片に結合するアプタマー、詳しく後述する非Ｉｇスキャホールドを含む群から選択されるバインダーを使用したアッセイで測定される。
【0066】
プロ－エンケファリン又はその断片のレベルを測定するために使用できるバインダーは、プロ－エンケファリンに対する親和定数が、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは１０8Ｍ-1であり、好ましい親和定数は１０9Ｍ-1より大きく、最も好ましくは１０10Ｍ-1より大きい。当業者は、より高い投与量の化合物を適用することによって、親和性の低さを補うことが考えられうることを知っており、この手段は本発明の範囲外とはならないであろう。結合親和性は、例えば、Ｂｉａｆｆｉｎ、カッセル、ドイツ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｆｆｉｎ．ｃｏｍ／ｄｅ／）においてサービス分析として提供されているビアコア法を用いて測定することができる。
【0067】
抗体にくわえて、標的分子を複合化するバイオポリマースキャフォールドは当該技術分野において周知であり、高度な標的特異性を持つバイオポリマーの生成に使用されてきた。その例は、アプタマー、スピーゲルマー、アンチカリン及びコノトキシンである。非Ｉｇスキャホールドはタンパク質スキャホールドであってもよく、リガンドや抗原に結合できるので抗体模倣物として使用することができる。非Ｉｇスキャホールドは、以下を含む群から選択することができる。テトラネクチンベースの非Ｉｇスキャホールド（例えば米国特許出願公開第２０１０／００２８９９５号に記載）、フィブロネクチンスキャホールド（例えば欧州特許第１２６６０２５号に記載）、リポカリンベースのスキャホールド（例えば国際公開第２０１１／１５４４２０号に記載）、ユビキチンスキャホールド（例えば国際公開第２０１１／０７３２１４号に記載）、トランスフェリンスキャホールドの運搬（例えば米国特許出願公開第２００４／００２３３３４号に記載）、プロテインＡスキャホールド（例えば欧州特許第２２３１８６０号に記載）、アンキリン反復ベースのスキャホールド（例えば国際公開第２０１０／０６０７４８号に記載）、マイクロタンパク質、好ましくはシスチンノットを形成するマイクロタンパク質のスキャホールド（例えば欧州特許第２３１４３０８号に記載）、Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインベースのスキャホールド（例えば国際公開第２０１１／０２３６８５号に記載）、ＥＧＦＲ－Ａドメインベースのスキャホールド（例えば国際公開第２００５／０４０２２９号に記載）、クニッツドメインベースのスキャホールド（例えば欧州特許第１９４１８６７号に記載）。
【0068】
閾値レベルは、対象を、腎臓病／機能不全がある若しくは有害事象のリスクがあると診断された対象の群、又は腎臓病／機能不全がある若しくは有害事象のリスクがあると診断されていない対象の群に割り付けることを可能にするレベルである。したがって、閾値レベルは、腎臓病／機能不全がある若しくは有害事象のリスクがあると診断された対象、又は腎臓病／機能不全がある若しくは有害事象のリスクがあると診断されていない対象の群を区別できるものとする。閾値レベルをどのようにして決定できるかは、当該技術分野において公知である。閾値レベルは予め決められた値であり、例えば特異度及び／又は感度の観点から慣用的な要件を満たすように設定される。それらの要件は様々である。例えば、感度又は特異度は、それぞれある特定の限界、例えば、８０％、９０％、９５％又は９８％に設定されなければならない。
【0069】
診断及び／又は予後予測ための検査の感度及び特異度は、単に検査の分析の「質」だけでなく、何をもって異常な結果とするかの定義にも依存する。実際、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は典型的に、「参照群」（見かけ上、健康で、かつ／又は腎不全の兆候や症状がない）及び「疾患」集団（すなわち腎不全の患者）における変数の値をその相対的な頻度に対してプロットすることによって計算される。任意の特定のマーカーについて、疾患をもつ対象ともたない対象のマーカーレベルの分布はおそらく重なることになる。そのような状況下では、検査は１００％の精度で正常と疾患を完全に鑑別できず、重複領域は検査で正常と疾患を鑑別できない領域を示す。閾値が選択され、それを超えれば（又はそれ未満であれば）（疾患でマーカーがどのように変化するかによって異なる）検査が異常とみなされ、それ未満であれば検査が正常であるとみなされる。ＲＯＣ曲線下面積は、知覚された測定値が状態の正しい識別を可能にすることになる確率の尺度である。ＲＯＣ曲線は、検査結果が必ずしも正確な数値を示していない場合でも使用することができる。結果をランク付けすることができる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」試料の検査の結果は、程度に応じてランク付けすることができうる（例えば１＝低い、２＝正常、及び３＝高い）。このランキングは、「参照」群の結果と相関させることができ、ＲＯＣ曲線を作成することができる。これらの方法は当該技術分野において周知である（例えばHanley et al.1982.Radiology 143: 29-36を参照）。好ましくは、ＲＯＣ曲線は、約０．５より大きい、より好ましくは約０．７より大きい、さらにより好ましくは約０．８より大きい、さらにより好ましくは約０．８５より大きい、最も好ましくは約０．９より大きいＡＵＣをもたらす。この文脈における「約」とは、所定の測定値の±５％を指す。
【0070】
参照群は、例えば疾患の兆候や症状がない健康な集団であることができる。本発明のさらなる態様では、参照群は、腎機能障害の徴候及び症状も、腎機能の悪化もなく、疾患又は障害、特に非重症疾患又はそれに対する介入（例えば鼠径ヘルニア修復、整形外科手術、気管支鏡検査、高ビリルビン血症、睡眠時無呼吸試験）、又は重い疾患（例えば呼吸不全、先天性横隔膜ヘルニア、心不全、ＳＩＲＳ、敗血症、敗血症性ショック若しくは他の重い病気）を患う対象の集団でありうる。参照群は複数の対象から構成されうる。
【0071】
ＲＯＣ曲線の横軸は（１－特異度）を表し、偽陽性の率とともに増加する。曲線の縦軸は感度を表し、真陽性の率とともに増加する。したがって、選択された特定のカットオフ閾値に対して、（１－特異度）の値を決定でき、対応する感度を得ることができる。ＲＯＣ曲線下の面積は、測定されたマーカーレベルが疾患又は状態の正確な識別を可能にすることになる確率の尺度である。したがって、ＲＯＣ曲線下の面積を使用して、検査の有効性を判断ることができる。
【0072】
さらに、閾値レベルは、例えばカプランマイヤー分析からも得ることができ、そこでは、集団における疾患の発生が心血管マーカーの四分位群と相関している。この分析によれば、心血管マーカーのレベルが７５パーセンタイルを超える対象は、本発明による疾患に罹患する有意に高いリスクを有する。この結果は、古典的な危険因子を完全に調整したコックス回帰分析によってさらに支持される。他のすべての対象と比べて最も高い四分位群は、本発明による疾患に罹患するリスクの増加と非常に有意に関連している。
【0073】
他の好ましい閾値は、例えば、正常な集団の９０、９５又は９９パーセンタイルである。７５パーセンタイルよりも高いパーセンタイルを使用することによって、識別される偽陽性の対象の数を減らすが、まだリスクが増加しているにもかかわらず、中程度のリスクの対象を識別しそこなう可能性がある。したがって、「偽陽性」を識別することを犠牲にして、リスクのある対象のほとんどを識別することがより適切であると考えられるか、又は中程度のリスクの対象をいくらか見逃すことを犠牲にして、主に高リスクの対象を識別することがより適切であると考えられるかに応じて、閾値を採用することができうる。
【0074】
例えば、７５パーセンタイル、より好ましくは９０パーセンタイル、さらにより好ましくは９５パーセンタイル、最も好ましくは９９パーセンタイルの値を正常範囲の上限に使用することができる。
【0075】
閾値レベルは、年齢、性別又は亜母集団などの様々な生理学的パラメーター、並びに本明細書で言及されているプロ－エンケファリン及びその断片の測定に使用される手段によって異なりうる。
【0076】
本発明の特定の実施形態では、前記閾値レベルは年齢に依存する。実施例に示されるように、ＭＲ－ＰＥＮＫの値は、対象の年齢に応じた複数の閾値の使用を明らかにした。対象の年齢が上がるにつれて閾値は減少した。
【0077】
本発明の１つの実施形態では、対象を年齢群に分けることができ、特定の閾値がそれらの年齢群のそれぞれに割り当てられる。
【0078】
本発明の１つの実施形態では、小児におけるプロ－エンケファリン又はその断片の閾値は１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【0079】
プロ－エンケファリン又はその断片の閾値は、特定の年齢間隔でグループに分けてもよい。代替として、小児の年齢に応じて連続的な閾値を適用してもよい。例えば、年齢間隔が１歳以下の小児に対して、閾値を２５０～１０００ｐｍｏｌ／、好ましくは４００～６５０ｐｍｏｌ／Ｌに設定することができる。
【0080】
１つの特定の実施形態では、プロエンケファリン又はその断片のレベルはイムノアッセイで測定され、前記バインダーが、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体又は抗体断片である。
【0081】
１つの特定の実施形態では、使用されるアッセイは、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）であるプロ－エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つのバインダーを含み、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0082】
本発明の１つの実施形態では、試料中のプロ－エンケファリン又は断片を測定するためのアッセイは、健常児のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を定量することができ、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、好ましくは＜１０ｐｍｏｌ／Ｌ、最も好ましくは＜６ｐｍｏｌ／Ｌである。
【0083】
本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、前記対象が小児である方法における、前記対象から得られた体液中の配列番号１～１２のペプチド及び断片を含む群から選択されるペプチドのアミノ酸配列内の領域に結合する少なくとも１つのバインダーの使用である。
【0084】
本発明の１つの実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体、抗体断片又は非Ｉｇスキャホールドを含む群から選択される。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。特定の実施形態では、前記バインダーは、エンケファリンペプチドであるｍｅｔ－エンケファリン（配列番号３）及びｌｅｕ－エンケファリン（配列番号４）に結合しない。特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８、９、１０及び１１を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の特定の実施形態では、前記少なくとも１つのバインダーは、配列番号１、２、５、６、８及び９を含む群から選択される配列をもつ領域に結合する。別の非常に具体的な実施形態では、前記バインダーは、プロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロ－エンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ（配列番号６）に結合する。
【0085】
より具体的な実施形態では、少なくとも１つのバインダーは、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン１１９～１５９、中間領域プロエンケファリン断片、ＭＲ－ＰＥＮＫ（配列番号６）のアミノ酸配列、より具体的にはアミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及び／又はアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）内の領域に結合し、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0086】
したがって、本発明の方法によれば、上記バインダーの免疫反応性のレベルが、前記対象から得られた体液中で測定される。免疫反応性のレベルは、そのような分析物に対するバインダーの結合反応によって、定量的、半定量的、又は定性的に決定される分析物の濃度を意味し、好ましくは、バインダーは、分析物に対する結合の親和定数が少なくとも１０8Ｍ-1であり、バインダーは抗体でも抗体断片でも非Ｉｇスキャホールドでもよく、結合反応はイムノアッセイである。
【0087】
ＰＥＮＫ及びその断片、特にＭＲ－ＰＥＮＫを使用する本発明の方法は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするために先行技術に従って使用される方法及びバイオマーカーよりもはるかに優れている。
【0088】
また、本発明の主題は、（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）血液透析、腹膜透析、血液濾過及び前述の実施形態のいずれかによる腎移植を含むがこれらに限定されない腎代替療法の様々な方法を含む腎機能を補助又は代替する治療又は介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを、単独で、又は他の予後的に有用な検査又は臨床パラメーターと組み合わせて使用し、以下の選択肢、
・「健康な」又は「健康にみえる」対象の集団の所定の試料のアンサンブルにおいて、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルの中央値との比較、
・「健康な」又は「健康にみえる」対象の集団の所定の試料のアンサンブルにおいて、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルの分位との比較、
・コックス比例ハザード分析に基づく、又はＮＲＩ（純再分類改善度（Net Reclassification Index））やＩＤＩ（統合識別改善度（Integrated Discrimination Index））などのリスク指標を使用することによる計算
から選択することができ、
前記対象が小児である
方法である。
・「健康な」又は「健康にみえる」対象の集団の所定の試料のアンサンブルにおいて、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルの中央値との比較、
・「健康な」又は「健康にみえる」対象の集団の所定の試料のアンサンブルにおいて、前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルの分位との比較、
・コックス比例ハザード分析に基づく、又はＮＲＩ（純再分類改善度（Net Reclassification Index））やＩＤＩ（統合識別改善度（Integrated Discrimination Index））などのリスク指標を使用することによる計算
から選択することができ、
前記対象が小児である
方法である。
【0089】
測定されうる前記さらに少なくとも１つの臨床パラメーターは、ベータトレースタンパク質（ＢＴＰ）、シスタチンＣ、ＫＩＭ－１、ＴＩＭＰ－２、ＩＧＦＢＰ－７、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＮＧＡＬ、クレアチニンクリアランス、血清クレアチニン（ＳＣｒ）、尿素、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ＩＩＩ［ＰＲＩＳＭ－ＩＩＩ］スコア、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ２［ＰＩＭ－ＩＩ］スコア及びアパッチスコアを含む群から選択される。
【0090】
本発明の１つの実施形態では、前記方法は、前記対象の機能若しくは機能不全若しくはリスクをモニターするために、又は腎臓及び／若しくは疾患の治療の経過をモニターするために複数回行われる。１つの特定の実施形態では、前記モニタリングは、とられた予防及び／又は治療措置に対する前記対象の反応を評価するために行われる。
【0091】
本発明の１つの実施形態では、本発明の方法は前記対象をリスク群に層別化するために使用される。
【0092】
さらに、本発明の主題は、試料中のプロ－エンケファリン及びプロエンケファリン断片を測定するための、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）であるプロ－エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つのバインダーを含むアッセイであり、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0093】
本発明の１つの実施形態では、そのアッセイは、いわゆるＰＯＣ検査（ポイント・オブ・ケア）、すなわち、完全に自動化されたアッセイシステムを必要とせず、患者の近くで１時間未満以内に検査できる検査技術でありうる。この技術の１つの例は、イムノクロマト検査技術である。
【0094】
本発明の１つの実施形態では、そのようなアッセイは、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光標識、好ましくは完全に自動化されたアッセイを含むが、それらに限定されない任意の種類の検出技術を使用したサンドイッチイムノアッセイである。本発明の１つの実施形態では、そのようなアッセイは酵素標識サンドイッチアッセイである。自動化又は完全に自動化されたアッセイの例には、以下のシステムの１つに使用できるアッセイが含まれる。ロシュElecsys（登録商標）、アボットArchitect（登録商標）、シーメンスCentauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、Biomerieux Vidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）。
【0095】
多種多様なイムノアッセイが知られており、本発明のアッセイ及び方法に使用することができ、それらには、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）、均一系競合的酵素免疫分析法（homogeneous enzyme-multiplied immunoassays）（「ＥＭＩＴ」）、酵素結合免疫吸着法（「ＥＬＩＳＡ」）、アポ酵素再活性化免疫測定法（apoenzyme reactivation immunoassay）（「ＡＲＩＳ」）、ディップスティック免疫測定法及びイムノクロマトグラフィーアッセイが含まれる。
【0096】
本発明の１つの実施形態では、前記２つのバインダーのうちの少なくとも１つは検出のために標識される。
【0097】
好ましい検出方法には、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光－及び蛍光－イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、Ｌｕｍｉｎｅｘベースのビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイなどの様々な形式のイムノアッセイ、及び例えばイムノクロマトストリップテストなどの迅速なテスト形式が含まれる。
【0098】
好ましい実施形態では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。
【0099】
アッセイは、均一系アッセイ、不均一系アッセイ、競合的アッセイ及び非競合的アッセイであることができる。１つの実施形態では、アッセイはサンドイッチアッセイの形態であり、非競合的イムノアッセイであり、検出及び／又は定量される分子が第１の抗体及び第２の抗体に結合している。第１の抗体は、固相、例えばビーズ、ウェル若しくは他の容器の表面、チップ又はストリップに結合していてもよく、第２の抗体は、例えば色素、放射性同位元素、又は反応性若しくは触媒活性のある部分で標識された抗体である。次いで、分析物に結合した標識抗体の量は適切な方法で測定される。「サンドイッチアッセイ」に関わる一般的な構成及び手順は、確立されており、当業者に周知である。
【0100】
別の実施形態では、アッセイは２つの捕捉分子、好ましくは抗体を含み、それらはともに液体反応混合物中に分散して存在し、第１の標識成分は第１の捕捉分子に結合し、前記第１の標識成分は蛍光－若しくは化学発光－消光又は増幅に基づく標識系の一部であり、前記マーキング（marking）系の第２の標識成分は、第２の捕捉分子に結合し、その結果、両捕捉分子が分析物に結合すると、測定可能なシグナルが生じ、試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体の検出が可能になる。
【0101】
別の実施形態では、前記標識系は、希土類クリプテート又は希土類キレートと、蛍光色素又は化学発光色素、特にシアニンタイプの色素との組み合わせを含む。
【0102】
本発明の文脈において、蛍光に基づくアッセイは色素の使用を含み、その色素は例えば以下を含む群から選択することができる。ＦＡＭ（５－又は６－カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、フルオレセイン－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＩＲＤ－７００／８００、シアニン色素、例えばＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７、キサンテン、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＴＥＴ、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（dimethodyfluorescein）（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシ－ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、５－カルボキシローダミン－６Ｇ（Ｒ６Ｇ５）、６－カルボキシローダミン－６Ｇ（ＲＧ６）、ローダミン、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ローダミン１１０、ＢＯＤＩＰＹ色素、例えばＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、オレゴングリーン、クマリン、例えばウンベリフェロン、ベンズイミド、例えばヘキスト３３２５８、フェナントリジン、例えばテキサスレッド、Yakima Yellow、アレクサフルオル、ＰＥＴ、エチジウムブロマイド、アクリジニウム色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、及び同種のもの。
【0103】
本発明の文脈において、化学発光に基づくアッセイは、（Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p.518-562、５５１～５６２ページの引用を含め、参照により本明細書に援用される）の化学発光材料について記載されている物理的原理に基づく色素の使用を含む。化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、ステロイド標識、例えばイソルミノール標識、及び同種のものであることができる。好ましい化学発光色素はアクリジニウムエステルである。
【0104】
本明細書で言及される場合、「アッセイ」又は「診断アッセイ」は、診断の分野で適用されるどのタイプのものでもあることができる。そのようなアッセイは、検出すべき分析物が１つ又は複数の捕捉プローブに、ある特定の親和性で結合することに基づきうる。捕捉分子と標的分子又は目的の分子との相互作用については、親和定数が１０8Ｍ-1より大きいことが好ましい。
【0105】
本発明の文脈において、「バインダー分子」は、試料から標的分子又は目的の分子、すなわち分析物（すなわち本発明の文脈ではＰＥＮＫ及びその断片）を結合するのに使用できる分子である。したがって、バインダー分子は、空間的にも、表面電荷、疎水性、親水性、ルイス・ドナー及び／又はアクセプターの有無などの表面特性の観点からも、標的分子や目的の分子と特異的に結合するように適切に形成されていなければならない。これにより、結合は、例えば、捕捉分子と標標的分子又は目的の分子との間のイオン、ファンデルワールス、パイ－パイ、シグマ－パイ、疎水性若しくは水素結合相互作用、又は前述の相互作用のうちの２つ以上の組み合わせによって媒介されうる。本発明の文脈において、バインダー分子は、例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、抗体、ペプチド、又は糖タンパク質を含む群から選択することができる。好ましくは、バインダー分子は抗体であり、例えば標的又は目的の分子に充分な親和性をもつその断片、組換え抗体又は組換え抗体断片、及び前記抗体の化学的かつ／又は生化学的に修飾された誘導体、又はその少なくとも１２個のアミノ酸の長さをもつバリアント鎖に由来する断片が含まれる。
【0106】
化学発光標識は、アクリジニウムエステル標識、ステロイド標識、例えばイソルミノール標識、及び同種のものであることができる。
【0107】
酵素標識は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、酸性ホスファターゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などであることができる。
【0108】
本発明の１つの実施形態では、前記２つのバインダーのうちの少なくとも１つは、磁性粒子として固相及びポリスチレン表面に結合している。
【0109】
本発明による試料中のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を測定するためのアッセイの１つの実施形態では、そのようなアッセイはサンドイッチアッセイであり、好ましくは完全に自動化されたアッセイである。完全に自動化されたＥＬＩＳＡでもよく、手動のものでもよい。いわゆるＰＯＣ検査（ポイント・オブ・ケア）であってもよい。自動化又は完全に自動化されたアッセイの例としては、以下のシステムの１つに使用できるアッセイが挙げられる。ロシュElecsys（登録商標）、アボットArchitect（登録商標）、シーメンスCentauer（登録商標）、Brahms Kryptor（登録商標）、Biomerieux Vidas（登録商標）、Alere Triage（登録商標）、Ortho Vitros（登録商標）。検査フォーマットの例は上に示されている。
【0110】
本発明による試料中のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を測定するためのアッセイの１つの実施形態では、前記２つのバインダーのうちの少なくとも１つは検出のために標識されている。標識の例は上に示されている。
【0111】
本発明による試料中のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を測定するためのアッセイの１つの実施形態では、前記２つのバインダーのうちの少なくとも１つは固相に結合している。固相の例は上に示されている。
【0112】
本発明による試料中のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を測定するためのアッセイの１つの実施形態では、前記標識は、化学発光標識、酵素標識、蛍光標識、放射性ヨウ素標識を含む群から選択される。本発明のさらなる対象は本発明のアッセイを含むキットであり、前記アッセイの構成要素は１つ又は複数の容器に入っていてよい。
【0113】
１つの実施形態では、本発明の主題は、本発明による方法を実行するためのポイント・オブ・ケア装置であり、前記ポイント・オブ・ケア装置は、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）又はアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）のいずれかに対する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含み、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0114】
１つの実施形態では、本発明の主題は、本発明による方法を実行するためのポイント・オブ・ケア装置であり、前記ポイント・オブ・ケア装置は、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含み、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0115】
１つの実施形態では、本発明の主題は、本発明による方法を実行するためのキットであり、前記ポイント・オブ・ケア装置は、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）又はアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）のいずれかに対する少なくとも１つの抗体又は抗体断片を含み、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0116】
１つの実施形態では、本発明の主題は、本発明による方法を実行するためのキットであり、前記ポイント・オブ・ケア装置は、アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含み、前記領域のそれぞれは少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む。
【0117】
上記に関連して、以下の連続した番号を付した実施形態は、本発明のさらに具体的な態様を提供する。
１．（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記プロ－エンケファリン又は断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である方法。
１．（ａ）対象における腎機能を診断若しくはモニタリングする、又は（ｂ）対象における腎機能障害を診断する、又は（ｃ）腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能の悪化若しくは腎不全、腎機能の喪失及び末期腎臓病を含む腎機能障害による死亡を含む群から選択される、疾患のある対象における有害事象のリスクを予測若しくはモニタリングする、又は（ｄ）治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングするための方法であって、
・前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定すること、並びに
（ａ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記プロ－エンケファリン若しくはその断片のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測し、前記治療若しくは介入が腎代替療法であってもよく、腎代替を受けた患者におけるヒアルロン酸による治療であってもよく、若しくは前記治療若しくは介入の成功を予測若しくはモニタリングすることが、腎代替療法及び／若しくは薬剤介入の前後に腎機能が損なわれた患者の腎機能の回復を予測若しくはモニタリングすることであってもよい関連付けを行うこと
を含み、
前記プロ－エンケファリン又は断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
前記閾値が１５０～１２９０ｐｍｏｌ／Ｌの範囲にあり、
前記対象が小児である方法。
【0118】
２．対象における腎機能を診断又はモニタリングするための方法であって、
前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定することを含み、
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の低下が対象の腎機能の改善と相関する、又は
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の増加が対象の腎機能の悪化と相関し、
前記プロ－エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が、１人の患者で複数回行われ、
対象が小児である
方法。
前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定することを含み、
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の低下が対象の腎機能の改善と相関する、又は
追跡検査測定の間、プロ－エンケファリン及びその断片の相対的な変化の増加が対象の腎機能の悪化と相関し、
前記プロ－エンケファリン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１を含む群から選択され、
プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が、１人の患者で複数回行われ、
対象が小児である
方法。
【0119】
３．前記対象が、１８歳以下、より好ましくは１４歳以下、さらにより好ましくは１２歳以下、さらにより好ましくは８歳以下、さらにより好ましくは５歳以下、さらにより好ましくは２歳以下、最も好ましくは１歳以下の小児である実施形態１及び２に記載の方法。
【0120】
４．前記小児が重症の病気である実施形態１～３に記載の方法。
【0121】
５．前記対象から得られた体液中のプロ－エンケファリン（ＰＥＮＫ）又はその断片のアミノ酸配列内の領域に結合するバインダーの少なくとも１つを使用することによって免疫反応性分析物のレベルを測定すること、及び
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測する関連付けを行うこと
を含む実施形態１～４のいずれかに記載の方法。
（ａ）前記免疫反応性分析物のレベルを対象の腎機能と相互に関連付けること、又は
（ｂ）前記免疫反応性分析物のレベルを腎機能障害と相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記対象の腎機能障害を予測若しくは診断する関連付けを行うこと、又は
（ｃ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象の有害事象の前記リスクと相互に関連付けることであって、一定の閾値を超える上昇したレベルが前記有害事象のリスクの増大を予測する関連付けを行うこと、又は
（ｄ）前記免疫反応性分析物のレベルを、疾患のある対象における治療若しくは介入の成功と相互に関連付けることであって、一定の閾値未満のレベルが治療若しくは介入の成功を予測する関連付けを行うこと
を含む実施形態１～４のいずれかに記載の方法。
【0122】
６．前記少なくとも１つのバインダーが配列番号１、２、５、６、８、９、１０及び１１を含む群から選択されるアミノ酸配列内の領域に結合する、好ましくは前記少なくとも１つのバインダーが配列番号１、２、５、６、８及び９を含む群から選択されるアミノ酸配列をもつ領域に結合する、好ましくは前記少なくとも１つのバインダーが配列番号６に結合する実施形態１～５のいずれかに記載の方法。
【0123】
７．プロ－エンケファリンのレベルがイムノアッセイで測定され、前記バインダーが、プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片に結合する抗体又は抗体断片である実施形態１～６のいずれかに記載の方法。
【0124】
８．アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）であるプロ－エンケファリンの領域内の２つの異なる領域に結合する２つのバインダーを含むアッセイが使用され、前記領域のそれぞれが少なくとも４又は５つのアミノ酸を含む実施形態１～７のいずれかに記載の方法。
【0125】
９．プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片のレベルを測定するためのアッセイが使用され、前記アッセイのアッセイ感度が、健常な対象のプロ－エンケファリン又はプロエンケファリン断片を定量でき、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌである実施形態１～８のいずれかに記載の方法。
【0126】
１０．前記体液が、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び唾液を含む群から選択されうる実施形態１～９のいずれかに記載の方法。
【0127】
１１．ベータトレースタンパク質（ＢＴＰ）、シスタチンＣ、ＫＩＭ－１、ＴＩＭＰ－２、ＩＧＦＢＰ－７、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、ＮＧＡＬ、クレアチニンクリアランス、血清クレアチニン（ＳＣｒ）、尿素、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ＩＩＩ［ＰＲＩＳＭ－ＩＩＩ］スコア、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ２［ＰＩＭ－ＩＩ］スコア及びアパッチスコアを含む群から選択されるさらに少なくとも１つの臨床パラメーターが測定される実施形態１～１０に記載の方法。
【0128】
１２．プロ－エンケファリン又は少なくとも５つのアミノ酸からなるその断片の前記測定が１人の患者で複数回行われる実施形態１～１１のいずれかに記載の方法。
【0129】
１３．前記モニタリングが、とられた予防及び／又は治療措置に対する前記対象の反応を評価するために行われる実施形態１～１２のいずれかに記載の方法。
【0130】
１４．前記対象をリスク群に層別化するために使用される実施形態１～１３のいずれかに記載の方法。
【0131】
１５．アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む、実施形態１～１４のいずれかに記載の方法を実行するためのポイント・オブ・ケア装置。
【0132】
１６．アミノ酸１３３～１４０（ＬＫＥＬＬＥＴＧ、配列番号１３）及びアミノ酸１５２～１５９（ＳＤＮＥＥＥＶＳ、配列番号１４）に対する少なくとも２つの抗体又は抗体断片を含む実施形態１～１５のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【実施例】
【0133】
実施例１
抗体の開発
ペプチド
ペプチドを合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）。
抗体の開発
ペプチド
ペプチドを合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）。
【0134】
免疫用ペプチド／複合体
免疫用ペプチド（表３）は、ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させるために、Ｎ末端にシステイン残基を追加して合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）。ペプチドはＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ボン、ドイツ）を使用することによってＢＳＡに共有結合させた。カップリングの手順はＰｅｒｂｉｏ社のマニュアルに従って行った。
免疫用ペプチド（表３）は、ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させるために、Ｎ末端にシステイン残基を追加して合成した（ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ベルリン、ドイツ）。ペプチドはＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ボン、ドイツ）を使用することによってＢＳＡに共有結合させた。カップリングの手順はＰｅｒｂｉｏ社のマニュアルに従って行った。
【表3】
【0135】
抗体を以下の方法に従って作製した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目と１４日目に１００μｇのペプチド－ＢＳＡ複合体（１００μｌの完全フロイントアジュバントで乳化）、２１日目と２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバントで乳化）を免疫した。融合実験を行う３日前に、１００μｌの生理食塩水に溶かした５０μｇの複合体を、腹腔内に１回及び静脈内に１回注射した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目と１４日目に１００μｇのペプチド－ＢＳＡ複合体（１００μｌの完全フロイントアジュバントで乳化）、２１日目と２８日目に５０μｇ（１００μｌの不完全フロイントアジュバントで乳化）を免疫した。融合実験を行う３日前に、１００μｌの生理食塩水に溶かした５０μｇの複合体を、腹腔内に１回及び静脈内に１回注射した。
【0136】
免疫したマウスの脾細胞と骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を１ｍｌの５０％ポリエチレングリコールを用いて３７℃で３０秒間融合させた。洗浄後、細胞を９６ウェルの細胞培養プレートに播いた。ハイブリッドクローンを、ＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培養培地に２０％のウシ胎仔血清とＨＡＴサプリメントを加えたもの）で培養することによって選択した。２週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に交換し、３回継代した後、通常の細胞培養培地に戻す。
【0137】
融合の３週間後に細胞培養上清を抗原特異的ＩｇＧ抗体の一次スクリーニングした。陽性と判定された微小培養物を増殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験の後、選択した培養物を、限界希釈法を用いて再びクローン化し、アイソタイプを決定した（Lane, R.D. 1985 J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler, B. et al. 1996. Horm. Metab. Res. 28: 11-15）。
【0138】
モノクローナル抗体作製
抗体を標準的な抗体作製法（Marx et al. 1997. ATLA 25, 121）で作製し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づく抗体の純度は９５％以上であった。
抗体を標準的な抗体作製法（Marx et al. 1997. ATLA 25, 121）で作製し、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づく抗体の純度は９５％以上であった。
【0139】
抗体の標識及びコーティング
抗体をすべて、以下の手順に従ってアクリジニウムエステルで標識した。
標識化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）の抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ－エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ、ドイツ）（欧州特許第０３５３９７１号）と混ぜ、室温で２０分間インキュベートした。標識抗体を、Ｂｉｏ－Ｓｉｌ ＳＥＣ ４００－５（バイオ・ラッドラボラトリーズ社（Inc）、米国）のゲルろ過ＨＰＬＣで精製した。精製した標識抗体を（３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ－ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）で希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり約８００．０００相対発光単位（ＲＬＵ）の標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光をＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ）を使用することによって測定した。
抗体をすべて、以下の手順に従ってアクリジニウムエステルで標識した。
標識化合物（トレーサー）：１００μｇ（１００μｌ）の抗体（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのアクリジニウムＮＨＳ－エステル（アセトニトリル中１ｍｇ／ｍｌ、ＩｎＶｅｎｔ ＧｍｂＨ、ドイツ）（欧州特許第０３５３９７１号）と混ぜ、室温で２０分間インキュベートした。標識抗体を、Ｂｉｏ－Ｓｉｌ ＳＥＣ ４００－５（バイオ・ラッドラボラトリーズ社（Inc）、米国）のゲルろ過ＨＰＬＣで精製した。精製した標識抗体を（３００ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｎａ－ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌウシ血清アルブミン、ｐＨ７．０）で希釈した。最終濃度は、２００μｌあたり約８００．０００相対発光単位（ＲＬＵ）の標識化合物（約２０ｎｇの標識抗体）であった。アクリジニウムエステルの化学発光をＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ ９５３（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ）を使用することによって測定した。
【0140】
固相抗体（コーティング抗体）：ポリスチレンチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ、オーストリア）に抗体（１．５μｇ抗体／０．３ｍｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．８）をコーティングした（室温で１８時間）。５％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、チューブをＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄し、真空乾燥させた。
【0141】
抗体の特異性
抗体の交差反応性は以下のようにして測定した。１μｇのペプチドを３００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４でポリスチレンチューブにピペッティングし、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを５回（各１ｍｌ）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の５％ＢＳＡで洗浄した。各標識抗体を加え（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３００μｌ、８００．０００ＲＬＵ／３００μｌ）、室温で２時間インキュベートした。５回洗浄（各１ｍｌの洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％トリトンＸ－１００））を行い、残った発光（標識抗体）をＡｕｔｏＬｕｍａｔルミノメーター９５３で定量した。合成ＭＲ－ＰＥＮＫペプチドを参照物質（１００％）として使用した。
抗体の交差反応性は以下のようにして測定した。１μｇのペプチドを３００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４でポリスチレンチューブにピペッティングし、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、チューブを５回（各１ｍｌ）、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の５％ＢＳＡで洗浄した。各標識抗体を加え（ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の３００μｌ、８００．０００ＲＬＵ／３００μｌ）、室温で２時間インキュベートした。５回洗浄（各１ｍｌの洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％トリトンＸ－１００））を行い、残った発光（標識抗体）をＡｕｔｏＬｕｍａｔルミノメーター９５３で定量した。合成ＭＲ－ＰＥＮＫペプチドを参照物質（１００％）として使用した。
【0142】
異なる抗体の交差反応性を表４に示す。
【表4】
【0143】
すべての抗体がＭＲ－ＰＥＮＫペプチドに結合し、免疫に使用されたペプチドと同等であった。ＮＴ－ＭＲ－ＰＥＮＫ－抗体（ＥＥＤＤＳＬＡＮＳＳＤＬＬＫと１０％の交差反応）を除き、個々の抗体の免疫に使用されていないＭＲ－ＰＥＮＫ断片との交差反応を示した抗体はなかった。
【0144】
プロ－エンケファリンのイムノアッセイ
５０μｌの試料（又はキャリブレーター）を、コーティングしたチューブにピペッティングし、標識抗体（２００ｕｌ）を加えた後、チューブを１８～２５℃で２時間インキュベートした。洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％トリトンＸ－１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって結合していないトレーサーを取り除いた。チューブに結合した標識抗体を、ルミノメーター９５３を使用して測定した。固定濃度１０００ｐｍｏｌ／のＭＲ－ＰＥＮＫを使用すること。様々な抗体の組み合わせの、シグナル（１０００ｐｍｏｌ ＭＲ－ＰＥＮＫ／ｌでのＲＬＵ）対ノイズ（ＭＲ－ＰＥＮＫなしでのＲＬＵ）の比を表５に示す。抗体はすべて、他のいずれの抗体ともサンドイッチ複合体を形成することができた。驚くべきことに、ＭＲ－ＭＲ－ＰＥＮＫ－抗体とＣＴ－ＭＲ－ＰＥＮＫ－抗体を組み合わせることによって、最も強いＳ／Ｎ比（最高感度）を得ることができた。続いて、この抗体の組み合わせを使用して、さらなる研究のためのＭＲ－ＰＥＮＫ－イムノアッセイを行った。ＭＲ－ＭＲ－ＰＥＮＫ抗体はチューブコーティング抗体として使用し、ＣＴ－ＭＲ－ＰＥＮＫ抗体は標識抗体として使用した。
５０μｌの試料（又はキャリブレーター）を、コーティングしたチューブにピペッティングし、標識抗体（２００ｕｌ）を加えた後、チューブを１８～２５℃で２時間インキュベートした。洗浄溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％トリトンＸ－１００）で５回（各１ｍｌ）洗浄することによって結合していないトレーサーを取り除いた。チューブに結合した標識抗体を、ルミノメーター９５３を使用して測定した。固定濃度１０００ｐｍｏｌ／のＭＲ－ＰＥＮＫを使用すること。様々な抗体の組み合わせの、シグナル（１０００ｐｍｏｌ ＭＲ－ＰＥＮＫ／ｌでのＲＬＵ）対ノイズ（ＭＲ－ＰＥＮＫなしでのＲＬＵ）の比を表５に示す。抗体はすべて、他のいずれの抗体ともサンドイッチ複合体を形成することができた。驚くべきことに、ＭＲ－ＭＲ－ＰＥＮＫ－抗体とＣＴ－ＭＲ－ＰＥＮＫ－抗体を組み合わせることによって、最も強いＳ／Ｎ比（最高感度）を得ることができた。続いて、この抗体の組み合わせを使用して、さらなる研究のためのＭＲ－ＰＥＮＫ－イムノアッセイを行った。ＭＲ－ＭＲ－ＰＥＮＫ抗体はチューブコーティング抗体として使用し、ＣＴ－ＭＲ－ＰＥＮＫ抗体は標識抗体として使用した。
【表5】
【0145】
キャリブレーション
２０ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭ アマスタチン、１００μＭ ロイペプチン、ｐＨ８．０で、合成ＭＲ－ＰＥＮＫを希釈した希釈物を使用してアッセイをキャリブレーションした。図１は、典型的なプロ－エンケファリンの投与量／シグナル曲線を示す。アッセイ感度はキャリブレーター０（ＭＲ‐ＰＥＮＫ無添加）＋２ＳＤ）５．５ｐｍｏｌ／Ｌの２０回測定であった。
２０ｍＭ Ｋ2ＰＯ4、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、５０μＭ アマスタチン、１００μＭ ロイペプチン、ｐＨ８．０で、合成ＭＲ－ＰＥＮＫを希釈した希釈物を使用してアッセイをキャリブレーションした。図１は、典型的なプロ－エンケファリンの投与量／シグナル曲線を示す。アッセイ感度はキャリブレーター０（ＭＲ‐ＰＥＮＫ無添加）＋２ＳＤ）５．５ｐｍｏｌ／Ｌの２０回測定であった。
【0146】
実施例２
１歳未満の小児における急性腎障害のバイオマーカーとしてのプロエンケファリンＡ１１９～１５９の基準値及び性能
１歳未満の小児における急性腎障害のバイオマーカーとしてのプロエンケファリンＡ１１９～１５９の基準値及び性能
【0147】
序論
急性腎障害（ＡＫＩ）は入院中の小児によく見られ、小児病棟及び小児集中治療室（ＰＩＣＵ）での有病率は５～５１％1-3の範囲である。ＡＫＩは独立して罹患率や死亡率と関連しており、その原因の一部は、腎排泄された薬物4-6を含む血漿中の（毒性のある）溶質の蓄積にあると考えられている。
急性腎障害（ＡＫＩ）は入院中の小児によく見られ、小児病棟及び小児集中治療室（ＰＩＣＵ）での有病率は５～５１％1-3の範囲である。ＡＫＩは独立して罹患率や死亡率と関連しており、その原因の一部は、腎排泄された薬物4-6を含む血漿中の（毒性のある）溶質の蓄積にあると考えられている。
【0148】
ほとんどのＰＩＣＵでは、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の代用マーカーとして血清クレアチニン濃度（ＳＣｒ）を用いてＡＫＩを診断する。ＳＣｒは、ＧＦＲの安価で低侵襲かつ迅速な推定を可能にするが、幼児のＧＦＲのバイオマーカーとして次のようないくつかの欠点がある。ＡＫＩ後の増加が遅れること、尿細管分泌に起因してＧＦＲを過大評価する可能性があること、産生が筋肉量に依存すること、及び胎盤移行7-10により生後数日の母体のＧＦＲを反映すること。
【0149】
シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）及びβ－トレースタンパク質（ＢＴＰ）のような他のバイオマーカーは、機能的なマーカー11-13としてＧＦＲを正確に推定する。ＣｙｓＣは重症患者においてＡＫＩをＳＣｒ14よりも最大で２日早く検出するが、濃度は炎症及び年齢15,16に影響される。ＢＴＰは年齢、人種又は性別による影響は少ないが、他のバイオマーカー11,17に比べて正確さで劣る。これらの機能的なバイオマーカーにくわえて、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）及び腎損傷分子‐１（ＫＩＭ‐１）のような尿細管損傷の尿バイオマーカーが迅速なＡＫＩ検出のために提案されているが、両者はいくつかの病態生理学的因子14,15,18による影響を受ける。したがって、これらのバイオマーカーはいずれも、ＡＫＩの診断のための正確で、内因性でかつ強力なバイオマーカーとして機能するのに限界がある。
【0150】
プロエンケファリンＡ １１９～１５９（ＰＥＮＫ）は、エンケファリンペプチド19とともに、プレプロエンケファリンＡから切断された内因性の単量体ペプチドである。エンケファリンはオピオイド受容体に結合し、中枢神経系、腎臓、筋肉、肺、腸及び心臓20などで生成される。腎臓はオピオイド受容体の密度が最も高いので、エンケファリンは腎機能21の調節に関与している。さらに、ＰＥＮＫは理想的なＧＦＲバイオマーカーとしての特徴を備えている。それは内因性であり、その分子サイズ（４．５ｋＤａ）が小さいため糸球体で自由にろ過され、既知の尿細管処理又は腎外クリアランスがなく、血漿タンパク質に結合せず、炎症及び他の腎外性の因子22とは無関係に様々な病的状態で安定した産生を示す。
【0151】
これまで、健康な成人及び疾患のある成人におけるＰＥＮＫに関する研究は、腎機能のマーカーとしてＰＥＮＫを支持している。ＰＥＮＫはＡＫＩの初期指標であり、独立して将来の腎機能の障害を予測し、心臓手術後及び敗血症の患者22-32において推定ＧＦＲ及び実測ＧＦＲと高い相関を示す。
【0152】
現在、小児におけるＰＥＮＫのデータは不足している。小児集団では、小児の腎機能は特に生後１年9で急速に変化しているので、バイオマーカー研究は年齢調整した基準値33を明らかにすることに焦点を当てるべきである33。したがって、ＰＥＮＫ濃度に対する年齢の影響を知ることは重要である。本研究の目的は、０～１歳の健康な小児におけるＰＥＮＫの基準値を決定し、重症児におけるＡＫＩ時のＰＥＮＫ濃度の変化を特定し、ＰＥＮＫをＧＦＲ及びＡＫＩに関する他の血漿バイオマーカーと比較することである。
【0153】
材料及び方法
概要
この前向きコホート研究は、重症児におけるＡＫＩバイオマーカーに関する研究プロジェクト（Ｓｏｐｈｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、助成番号６３３）34-37の一部である。そのプロジェクトの主な目的は、０～１歳の健常児におけるＡＫＩバイオマーカーの基準値を確立し、重症児におけるＡＫＩの予測能力を明らかにすることである。
概要
この前向きコホート研究は、重症児におけるＡＫＩバイオマーカーに関する研究プロジェクト（Ｓｏｐｈｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、助成番号６３３）34-37の一部である。そのプロジェクトの主な目的は、０～１歳の健常児におけるＡＫＩバイオマーカーの基準値を確立し、重症児におけるＡＫＩの予測能力を明らかにすることである。
【0154】
設定
０～１歳の腎臓の（前）病理病変がない健康な、満期産児及び機械的な人工呼吸にサポートされている重症児を対象とした。腎疾患の既往がある児、急速に死亡が予想される児、又はＥＣＭＯ治療を受けている児は除外した。除外基準、収集患者データ、試料収集及び試料分析などの詳細は、これまでの文献34-37に見ることができる。本研究は、Ｅｒａｓｍｕｓメディカルセンター医療倫理委員会の承認を得た。すべての試験対象の両親及び／又は介護者から繰り延べインフォームドコンセントを得た。
０～１歳の腎臓の（前）病理病変がない健康な、満期産児及び機械的な人工呼吸にサポートされている重症児を対象とした。腎疾患の既往がある児、急速に死亡が予想される児、又はＥＣＭＯ治療を受けている児は除外した。除外基準、収集患者データ、試料収集及び試料分析などの詳細は、これまでの文献34-37に見ることができる。本研究は、Ｅｒａｓｍｕｓメディカルセンター医療倫理委員会の承認を得た。すべての試験対象の両親及び／又は介護者から繰り延べインフォームドコンセントを得た。
【0155】
患者の臨床データ
各対象の人口統計学的パラメーター（性別、診断名、生後年齢、民族、体重）を収集した。くわえて、重症患者について、在胎期間、出生体重、重症度スコア（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ［ＰＲＩＳＭ－ＩＩＩ］スコア、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ［ＰＩＭ－ＩＩ］スコア）、機械的人工呼吸、昇圧剤治療、入院期間及び死亡率を収集した。
各対象の人口統計学的パラメーター（性別、診断名、生後年齢、民族、体重）を収集した。くわえて、重症患者について、在胎期間、出生体重、重症度スコア（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ［ＰＲＩＳＭ－ＩＩＩ］スコア、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ［ＰＩＭ－ＩＩ］スコア）、機械的人工呼吸、昇圧剤治療、入院期間及び死亡率を収集した。
【0156】
試料の収集と分析
血液試料は、留置動脈ライン、毛細血管又は静脈穿刺によって採取した。健常児では、手術やその他の医療処置の前に少なくとも１つの試料を得た。重症患者では、本試験への組み入れ後７日目までに複数の血液試料を採取した。血漿試料は、過去の研究34-36にあるＳＣｒ（酵素アッセイ）、ＣｙｓＣ（イムノアッセイ）及びＢＴＰ（タンパク質アッセイ）について測定した。ＰＥＮＫは、市販のダブルモノクローナルサンドイッチイムノアッセイ（ｓｐｈｉｎｇｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ヘニングスドルフ、ドイツ）38を使用して測定した。
血液試料は、留置動脈ライン、毛細血管又は静脈穿刺によって採取した。健常児では、手術やその他の医療処置の前に少なくとも１つの試料を得た。重症患者では、本試験への組み入れ後７日目までに複数の血液試料を採取した。血漿試料は、過去の研究34-36にあるＳＣｒ（酵素アッセイ）、ＣｙｓＣ（イムノアッセイ）及びＢＴＰ（タンパク質アッセイ）について測定した。ＰＥＮＫは、市販のダブルモノクローナルサンドイッチイムノアッセイ（ｓｐｈｉｎｇｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ヘニングスドルフ、ドイツ）38を使用して測定した。
【0157】
ＡＫＩ診断
健常児はＡＫＩを発症していないとみなし、文献9から引用した年齢調整済みＳＣｒのｚスコアで比較対照した。ＳＣｒのｚスコアが－２から＋２の間であれば正常とみなし、この範囲外のｚスコアをもつ患者は除外した。
健常児はＡＫＩを発症していないとみなし、文献9から引用した年齢調整済みＳＣｒのｚスコアで比較対照した。ＳＣｒのｚスコアが－２から＋２の間であれば正常とみなし、この範囲外のｚスコアをもつ患者は除外した。
【0158】
重症患者は、年齢調整したＳＣｒ基準値9に基づき、挿管の４８時間以内に達した最も高いＲＩＦＬＥスコア39によって２つの小群（ＡＫＩと非ＡＫＩ）に分類した。ＳＣｒの増加が１５０％未満の患者を非ＡＫＩとし、１５０～２００％、２００～３００％及び３００％超の患者をそれぞれＲｉｓｋ、Ｉｎｊｕｒｙ、Ｆａｉｌｕｒｅに分類した39。ＰＥＮＫ分析に充分な量の血漿試料がない患者や、挿管の４８時間以内の試料がない患者は除外した。さらに、入院中に腎機能が変化することがあるので、重症患者の動的な腎機能を考慮するために、採血時のＲＩＦＬＥスコアを用いて混合モデル解析及び受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を行った。
【0159】
統計解析
連続データは、その分布パターンに応じて、平均値又は中央値を９５％信頼区間（ＣＩ）値又は四分位範囲（ＩＱＲ）とともに表示した。カテゴリー変数はパーセンテージ（％）の割合で表す。
連続データは、その分布パターンに応じて、平均値又は中央値を９５％信頼区間（ＣＩ）値又は四分位範囲（ＩＱＲ）とともに表示した。カテゴリー変数はパーセンテージ（％）の割合で表す。
【0160】
ＰＥＮＫの基準値は，Ｒ40の位置、尺度、形状の一般化加法モデル（Generalized Additive Models for Location, Scale and Shape）（ＧＡＭＬＳＳ）パッケージを使用して健常児で算出した。赤池情報量規準（ＡＩＣ）値を使用して、これらの基準値に最適なモデルを決定し、ＰＥＮＫ濃度の年齢に関連したパターンを特定した。これらの基準値を、正規分布に従うｚスコアに変換し、次に重症コホートの混合モデル解析に使用した。
【0161】
重症児では、連続変数に対するマン・ホイットニーのＵ検定とカテゴリー変数に対するピアソンのカイ二乗検定を用いて、ベースラインと臨床的特徴をＡＫＩと非ＡＫＩ小群の間で比較した。複数のカテゴリーのカテゴリーデータをクラスカル・ウォリス検定とボンフェローニ調整ｐ値による事後ダン検定を用いて比較してカテゴリー間の差を評価した。
【0162】
混合モデル解析
重症患者では、ＰＥＮＫ濃度の試料の数が様々であった。したがって、線形混合モデル解析を用いて、全試験期間中の全試料を用いて反復測定と独立変数を説明した。この解析を用いて、健常児と、様々な重症度のＡＫＩをもつ重症児との間でＰＥＮＫが有意に異なるかどうかを明らかにした。従属変数（ＰＥＮＫ濃度）をｚスコアに変換して、モデル残差のほぼ正規分布を確実にした。このモデルにおける独立変数は、採血時のＲＩＦＬＥスコア、性別、生後年齢、挿管後の時間、昇圧薬の使用及び従属変数に対する影響の可能性に基づく診断カテゴリーであった。対象内相関を説明するためにランダム切片を含めた。結果は、欠側データ及び独立変数の影響を調整したアウトカムの予測値（ＰＥＮＫ ｚスコア）である推定限界平均値を用いて提示した。これらの推定限界平均値をｚスコア式の逆を用いて逆変換し、ＰＥＮＫ中央値及びその９５％ＣＩの推定予測を出す。重症児におけるＰＥＮＫ ｚスコアの推定限界平均値をスチューデントのＴ検定を用いて健常児と比較した。
重症患者では、ＰＥＮＫ濃度の試料の数が様々であった。したがって、線形混合モデル解析を用いて、全試験期間中の全試料を用いて反復測定と独立変数を説明した。この解析を用いて、健常児と、様々な重症度のＡＫＩをもつ重症児との間でＰＥＮＫが有意に異なるかどうかを明らかにした。従属変数（ＰＥＮＫ濃度）をｚスコアに変換して、モデル残差のほぼ正規分布を確実にした。このモデルにおける独立変数は、採血時のＲＩＦＬＥスコア、性別、生後年齢、挿管後の時間、昇圧薬の使用及び従属変数に対する影響の可能性に基づく診断カテゴリーであった。対象内相関を説明するためにランダム切片を含めた。結果は、欠側データ及び独立変数の影響を調整したアウトカムの予測値（ＰＥＮＫ ｚスコア）である推定限界平均値を用いて提示した。これらの推定限界平均値をｚスコア式の逆を用いて逆変換し、ＰＥＮＫ中央値及びその９５％ＣＩの推定予測を出す。重症児におけるＰＥＮＫ ｚスコアの推定限界平均値をスチューデントのＴ検定を用いて健常児と比較した。
【0163】
探索的解析 － ＰＥＮＫ及び他のバイオマーカーとＡＫＩ診断との関連
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、挿管後の様々な時間枠（０～６時間、６～１２時間、１２～２４時間、２４～３６時間及び３６～４８時間）で、バイオマーカー濃度とＡＫＩの関連を評価した。この解析では、各時間枠内患者１人につき最初の試料のみを含めて、欠測値を除いて反復サンプリングを補正した。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）及びその９５％ＣＩを、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対し決定した。ＡＫＩ診断はＳＣｒに基づいていたので、このバイオマーカーは含めなかった。
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、挿管後の様々な時間枠（０～６時間、６～１２時間、１２～２４時間、２４～３６時間及び３６～４８時間）で、バイオマーカー濃度とＡＫＩの関連を評価した。この解析では、各時間枠内患者１人につき最初の試料のみを含めて、欠測値を除いて反復サンプリングを補正した。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）及びその９５％ＣＩを、ＰＥＮＫ、ＣｙｓＣ及びＢＴＰに対し決定した。ＡＫＩ診断はＳＣｒに基づいていたので、このバイオマーカーは含めなかった。
【0164】
統計解析は、ＳＰＳＳ統計バージョン２５．０（ＩＢＭ、シカゴ、イリノイ州、米国）、グラフパッドプリズム バージョン５．０３（グラフパッドソフトウェア社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国））及びＲバージョン３．５．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０１３）を用いて行った。両側ｐ値０．０５を統計的有意性の限界とした。
【0165】
結果
健常児
当初登録された健常児１１６名のうち、ＰＥＮＫの測定に充分な血漿試料で入手可能でなかったこと、又はＳＣｒのｚ－スコアが予め定義された範囲外であったことから、１６名を除外した。残りの１００名の小児患者の特徴を表１に示す。
健常児
当初登録された健常児１１６名のうち、ＰＥＮＫの測定に充分な血漿試料で入手可能でなかったこと、又はＳＣｒのｚ－スコアが予め定義された範囲外であったことから、１６名を除外した。残りの１００名の小児患者の特徴を表１に示す。
【0166】
健常児において、ＰＥＮＫと最初の１年間の年齢との間に明確な関連性は存在しなかった。わずか０．９５２のＡＩＣ差から示されるように、年齢を共変量として含むＧＡＭＬＳＳモデルは、年齢を含まないモデルに比べて、ほんのわずかに良い結果が得られた。したがって、最初の１年間はＰＥＮＫ濃度がＢｏｘ－Ｃｏｘ変換後に正規分布すると仮定したＧＡＭＬＳＳモデルを使用した。ＰＥＮＫのｚスコアは、ＧＡＭＬＳＳモデルから得られた以下の式で計算した。
【数1】
【0167】
ＰＥＮＫ濃度は合計１４５個の試料で測定した。図２に示されるように、ここから得られたＰＥＮＫ濃度の中央値は、５１７．３ｐｍｏｌ／Ｌ（９５％ＣＩ ４８８．９～５４７．４、２．５及び９７．５パーセンタイルはそれぞれ２６５．２ｐｍｏｌ／Ｌ及び１０１７．１ｐｍｏｌ／Ｌ）であった。
【0168】
重症児 － 患者の特徴
前述の研究の重症児１０１名のうち、１０名を除外した。６名の患者はＰＥＮＫの分析に必要な血漿量が不充分であり、４名の患者は挿管の４８時間以内の試料がなく、９１名の重症児が残った。全患者、ＡＫＩ及び非ＡＫＩ小群の患者の特徴を表６に示す。
前述の研究の重症児１０１名のうち、１０名を除外した。６名の患者はＰＥＮＫの分析に必要な血漿量が不充分であり、４名の患者は挿管の４８時間以内の試料がなく、９１名の重症児が残った。全患者、ＡＫＩ及び非ＡＫＩ小群の患者の特徴を表６に示す。
【0169】
挿管後４８時間以内に、４０人の患者（４４％）がＡＫＩ小群に分類され、最高ＲＩＦＬＥスコアでＲｉｓｋ、Ｉｎｊｕｒｙ、Ｆａｉｌｕｒｅがそれぞれ２０、１１、９例であった。非ＡＫＩとＡＫＩ小群間で性別、年齢、民族性及び体重に有意差はなかった。疾患重症度スコア、入院期間及び死亡率はＡＫＩ小群で高かったが、差は統計的に有意ではなかった（表６）。
【表6-1】
【表6-2】
【0170】
重症児 － ＰＥＮＫ濃度
重症児のＰＥＮＫについて、合計５７８個の血漿試料を分析した。非ＡＫＩ小群の初期ＰＥＮＫ濃度の中央値（ＩＱＲ）は４１６．５（３１６．４～５５７．６）ｐｍｏｌ／Ｌであったのに対し、ＡＫＩ患者では６６９．４（４３４．３～９８２．３）ｐｍｏｌ／Ｌであった（ｐ＜．００１）。挿管後４８時間までの時間枠では、ＰＥＮＫ濃度はＡＫＩ小群で有意に高かった（挿管後３６－４８時間（ｐ＝０．１２３）を除いて、すべての時間枠でｐ＜．０１）（図３）。
重症児のＰＥＮＫについて、合計５７８個の血漿試料を分析した。非ＡＫＩ小群の初期ＰＥＮＫ濃度の中央値（ＩＱＲ）は４１６．５（３１６．４～５５７．６）ｐｍｏｌ／Ｌであったのに対し、ＡＫＩ患者では６６９．４（４３４．３～９８２．３）ｐｍｏｌ／Ｌであった（ｐ＜．００１）。挿管後４８時間までの時間枠では、ＰＥＮＫ濃度はＡＫＩ小群で有意に高かった（挿管後３６－４８時間（ｐ＝０．１２３）を除いて、すべての時間枠でｐ＜．０１）（図３）。
【0171】
重症児 － 混合モデル解析
最終モデルに含まれる共変量のうち、ＰＥＮＫ濃度に有意な影響を示したのは年齢のみであった。重症児におけるＰＥＮＫの予測値（逆変換した推定限界平均値）の概要を図４に示し、健常児の濃度と比較する。ＰＥＮＫ濃度の中央値は、健常児（５１７．３ｐｍｏｌ／ｌ［９５％ＣＩ ４８８．９～５４７．４］、ｐ＜．００１）と比較して、ＡＫＩを伴わない重症児（４３２．２ｐｍｏｌ／ｌ［９５％ＣＩ ３９８．２～４６９．２］）で有意に低かった。ＡＫＩを発症した重症患者は、健常児（最高ＲＩＦＬＥスコアがＲｉｓｋの患者を除く）及びＡＫＩを発症していない重症患者と比較して、ＰＥＮＫ濃度の中央値が有意に高かった（Ｒｉｓｋ ５０７．９ｐｍｏｌ／Ｌ［９５％ＣＩ ４５４．３～５６７．９］、Ｉｎｊｕｒｙ ７０４．０ｐｍｏｌ／Ｌ［５９５．８～８３２．３］、Ｆａｉｌｕｒｅ ９３０．５ｐｍｏｌ／Ｌ［７６３．２－～１１３５．２］、Ｒｉｓｋ（ｐ＝０．７４６）を除くすべての小群間で健常児に対してｐ＜．０１）。
最終モデルに含まれる共変量のうち、ＰＥＮＫ濃度に有意な影響を示したのは年齢のみであった。重症児におけるＰＥＮＫの予測値（逆変換した推定限界平均値）の概要を図４に示し、健常児の濃度と比較する。ＰＥＮＫ濃度の中央値は、健常児（５１７．３ｐｍｏｌ／ｌ［９５％ＣＩ ４８８．９～５４７．４］、ｐ＜．００１）と比較して、ＡＫＩを伴わない重症児（４３２．２ｐｍｏｌ／ｌ［９５％ＣＩ ３９８．２～４６９．２］）で有意に低かった。ＡＫＩを発症した重症患者は、健常児（最高ＲＩＦＬＥスコアがＲｉｓｋの患者を除く）及びＡＫＩを発症していない重症患者と比較して、ＰＥＮＫ濃度の中央値が有意に高かった（Ｒｉｓｋ ５０７．９ｐｍｏｌ／Ｌ［９５％ＣＩ ４５４．３～５６７．９］、Ｉｎｊｕｒｙ ７０４．０ｐｍｏｌ／Ｌ［５９５．８～８３２．３］、Ｆａｉｌｕｒｅ ９３０．５ｐｍｏｌ／Ｌ［７６３．２－～１１３５．２］、Ｒｉｓｋ（ｐ＝０．７４６）を除くすべての小群間で健常児に対してｐ＜．０１）。
【0172】
重症児 － 他のバイオマーカーとの相関
ＰＥＮＫと他のバイオマーカーのＡＫＩ診断への関連を比較するために、挿管後の５つの時間枠でＲＯＣ曲線を作成した（図５Ａ～Ｅ）。ＰＥＮＫによるＡＫＩのＡＵＲＯＣは挿管後４８時間までで１枠を除くすべての時間枠で最も高く、ＣｙｓＣはＡＫＩと２番目に高い相関を示した。１２～２４時間の時間枠でのみ、ＰＥＮＫはＢＴＰより低いＡＵＲＯＣを示した。各バイオマーカーのＡＵＲＯＣ値、９５％ＣＩ及び試料数の一覧を表７に示す。
ＰＥＮＫと他のバイオマーカーのＡＫＩ診断への関連を比較するために、挿管後の５つの時間枠でＲＯＣ曲線を作成した（図５Ａ～Ｅ）。ＰＥＮＫによるＡＫＩのＡＵＲＯＣは挿管後４８時間までで１枠を除くすべての時間枠で最も高く、ＣｙｓＣはＡＫＩと２番目に高い相関を示した。１２～２４時間の時間枠でのみ、ＰＥＮＫはＢＴＰより低いＡＵＲＯＣを示した。各バイオマーカーのＡＵＲＯＣ値、９５％ＣＩ及び試料数の一覧を表７に示す。
【表7】
【0173】
考察
小児のＡＫＩのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫに関する初めてのデータを提示する。成人では、このバイオマーカーはＧＦＲ、ＡＫＩ、腎機能22,24,26,28の低下と強く相関し、有望な結果が示されている。本研究では、０～１歳の健常児におけるこのバイオマーカーの基準値を示す。小児では非常に高い濃度であるにもかかわらず、ＰＥＮＫの濃度は、ＡＫＩを発症した重症児と発症していない重症児とを明確に区別する。さらに、本データは、頻繁に使用されている他のＡＫＩバイオマーカーよりも優れている可能性を示唆している。
小児のＡＫＩのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫに関する初めてのデータを提示する。成人では、このバイオマーカーはＧＦＲ、ＡＫＩ、腎機能22,24,26,28の低下と強く相関し、有望な結果が示されている。本研究では、０～１歳の健常児におけるこのバイオマーカーの基準値を示す。小児では非常に高い濃度であるにもかかわらず、ＰＥＮＫの濃度は、ＡＫＩを発症した重症児と発症していない重症児とを明確に区別する。さらに、本データは、頻繁に使用されている他のＡＫＩバイオマーカーよりも優れている可能性を示唆している。
【0174】
小児のバイオマーカー開発では、正常値の年齢に応じた変化を無視することは、小児33では正確に機能しないことにつながる可能性があるので、年齢に応じた基準値が重要である。本研究では、１歳までの小児のＰＥＮＫの基準値が、成人健常者の１０倍を超えるので（中央値４５ｐｍｏｌ／Ｌ、９９パーセンタイル８０ｐｍｏｌ／Ｌ）26、この重要性は明らかである。さらに、ＰＥＮＫの我々の基準値は、ＳＣｒ9及び（程度は低いが）ＣｙｓＣ16,41とは対照的に、最初の１年間は年齢に応じた変化を示さなかった。それでもなお、ＰＥＮＫの基準値を成人と小児で比較すると、ＰＥＮＫ濃度が小児期に低下することは明らかであり、これは、ＢＴＰに関する我々の以前の研究34でも見られ、成人42と比較して最初の１年間を通して（わずかに）高い基準値を示した。
【0175】
これらのより高い濃度は、幼児では生後１年間43を通して腎機能が成熟するので、クリアランス（絶対値）が低いことで説明できうる。しかし、幼児のＧＦＲは成人健常者のＧＦＲに比べて１０倍も低くはないので、エンケファリンの生成は小児で増加する可能性がある。また、ＰＥＮＫと同じ前駆体に由来する別の内因性オピオイドであるＭｅｔ－エンケファリンの濃度も、小児では成人44に比べて１０倍を超えて高かった。さらに、１２名の小児モヤモヤ病患者（１～１６歳）では、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＰＥＮＫ濃度が高かったが、ＣＳＦ中の濃度は血清ＰＥＮＫ濃度45を反映していなかった。
【0176】
健常児ではこのようにＰＥＮＫ濃度の中央値が高いにもかかわらず、重症児のＡＫＩとの関連は顕著である。これは、ＰＥＮＫが２４名の敗血症集中治療患者25で測定されたＧＦＲと高い相関を示し、１０１名の敗血症患者26の別のコホートでＲＩＦＬＥステージと独立して関連した成人の報告と一致する。本研究では、反復サンプリングと共変量を補正しても、ＡＫＩがより重症であるほどＰＥＮＫ濃度も有意に上昇した。これは小児におけるＡＫＩのバイオマーカーとしてＰＥＮＫを用いた初めてのデータであるので、他のバイオマーカーとの比較が重要である。他のバイオマーカーと比較して、ＰＥＮＫは成人においてクレアチニンクリアランスと比較してＧＦＲとの相関性が高く（Ｒ2はそれぞれ、０．９１対０．６８）25、ＮＧＡＬよりもＡＫＩの予測値が高かった（ＡＵＲＯＣはそれぞれ、０．７３対０．６８）24。小児では、ＣｙｓＣ及びＢＴＰがＡＫＩの診断のバイオマーカー41,46,47のなかで最良とみなされているが、我々の探索的解析ではＰＥＮＫがＡＫＩと最も高い関連を示した。さらに、この集団における比較的軽度のＡＫＩとの高い関連性は、ＣｙｓＣと比較してＰＥＮＫの感度が高く、ＡＫＩの早期スクリーニングにより適したバイオマーカーになることを示唆すると思われる。これらの有望な結果は、小児ＡＫＩにおけるＰＥＮＫの診断可能性のさらなる検討を必要とする。
【0177】
興味深いことに、ＡＫＩがない重症患者ではＰＥＮＫ濃度は、健常児の基準値と比較して低かった。これは、重症時のいくつかの病態生理学的過程によって説明される可能性がある。心拍出量や腎灌流の増加によりよって腎クリアランスが上昇することがあり、これは「過大腎クリアランス」と呼ばれる現象で、成人48及び小児49において文献で充分に裏付けられている。さらに、重症患者の血漿中のＰＥＮＫ濃度は、大量の輸液負荷及び浮腫によって希釈される可能性がある。このパターンが本研究の他のすべての血漿バイオマーカー（ＳＣｒ、ＣｙｓＣ、及びＢＴＰ）で見られたという事実は、その可能性を支持している（データは示されていない）。
【0178】
本研究において、複数の患者は直接リクルートされておらず、入院の数日後のＰＥＮＫ濃度しかないので、入院後４８時間よりも、挿管後最初の４８時間のＡＫＩを評価項目として使用した。それにより、以前の報告36よりもわずかに多いＡＫＩ患者となった。これらの追加患者はほとんど、軽度で一時的なＳＣｒの増加を示した。この軽度のＡＫＩ患者の増加により、ＡＫＩ小群と非ＡＫＩ小群のハードエンドポイントの差が、入院後のＡＫＩをアウトカム4-6、36として用いた場合に我々のグループや他のグループが示したものよりもあまり顕著ではない結果になった可能性がある。
【0179】
また、本研究にはいくつかの限界がある。このコホートに含まれるのは１歳までの小児であり、他の小児年齢群への外挿には限界がある。さらに、ＳＣｒ及び／又はＣｙｓＣを用いた小児のＧＦＲの計算式が１歳未満の小児50,51では検証されていないこと、ＧＦＲのゴールドスタンダード測定が行われていないこと、並びに大多数の患者が挿管前36にＡＫＩの兆候を示していたことから、小児におけるＧＦＲのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫも、ＡＫＩの予測能力も検証することができなかった。そして、尿量に関する詳細な情報が病院の記録から得られなかった。それがあれば、ＫＤＩＧＯ基準52を用いることによって、より確実なＡＫＩの診断が可能であったと思われる。ＡＫＩに対する新たなバイオマーカーとしてのＰＥＮＫについての今回の結果は有望ではあるものの、小児のＰＥＮＫに関する今後の研究では、小児の全年齢範囲にわたるＰＥＮＫの基準値を特定して、（長期的な）年齢に関連したパターンを明らかにすることに焦点を当てるべきである。さらに、この集団におけるＧＦＲとＡＫＩに対する新しいバイオマーカーとしてＰＥＮＫを確立するために、成人23,27,38で行われたのと同じように、（重症の）小児でＧＦＲの測定値とＰＥＮＫ濃度の追加比較を行うべきである。
【0180】
結論
この研究は、小児におけるＡＫＩのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫに関する初めてのデータである。ＰＥＮＫの濃度は、生後１年間は安定しているようであるが、個人間のばらつきが大きく、基準値は成人よりも小児の方がかなり高い。それでも、小児のＡＫＩを診断するためのこのバイオマーカーの結果は非常に有望である。ＰＥＮＫはＡＫＩの診断と最も強い関連性を示し、現在利用可能で最良と考えられている他の血漿バイオマーカーよりも優れていた。進行中の研究により、このバイオマーカーが単独で、又は他のマーカーと組み合わせて、ＡＫＩの小児の診断と治療を向上させる可能性があるかどうかを検証しなければならない。
この研究は、小児におけるＡＫＩのバイオマーカーとしてのＰＥＮＫに関する初めてのデータである。ＰＥＮＫの濃度は、生後１年間は安定しているようであるが、個人間のばらつきが大きく、基準値は成人よりも小児の方がかなり高い。それでも、小児のＡＫＩを診断するためのこのバイオマーカーの結果は非常に有望である。ＰＥＮＫはＡＫＩの診断と最も強い関連性を示し、現在利用可能で最良と考えられている他の血漿バイオマーカーよりも優れていた。進行中の研究により、このバイオマーカーが単独で、又は他のマーカーと組み合わせて、ＡＫＩの小児の診断と治療を向上させる可能性があるかどうかを検証しなければならない。
【0181】
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【0182】
実施例３
健常児のＰＥＮＫ
既知の腎障害がない健常児（ｎ＝３８、５５．３％女児、平均［範囲］年齢１１．３［１－２０］歳、ＳＣｒ４９．７［２３～９８］μｍｏｌ／Ｌ）をＭＲ－ＰＥＮＫアッセイを使用して測定した。
健常児のＰＥＮＫ
既知の腎障害がない健常児（ｎ＝３８、５５．３％女児、平均［範囲］年齢１１．３［１－２０］歳、ＳＣｒ４９．７［２３～９８］μｍｏｌ／Ｌ）をＭＲ－ＰＥＮＫアッセイを使用して測定した。
【0183】
ＰＥＮＫのレベルは年齢に応じて減少した（図６）。ＰＥＮＫと年齢の間には強い相関関係があった（ｒ＝－０．８６、ｐ＜０．０００１）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】