特表 2022-545055 ＰＲＤＭ１４タンパク質の発現をダウンレギュレートする標的化ｓｉＲＮＡ製剤を使用する癌処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-25

(54)【発明の名称】ＰＲＤＭ１４タンパク質の発現をダウンレギュレートする標的化ｓｉＲＮＡ製剤を使用する癌処置

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20221018BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221018BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20221018BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20221018BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20221018BHJP

   C07K 5/12 20060101ALN20221018BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K31/7105

A61K31/7115

A61K31/712

A61K9/127

A61K47/02

A61K45/06

A61K38/12

C12N15/115 Z

C07K5/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502022

(86)(22)【出願日】2020-07-09

(85)【翻訳文提出日】2022-03-08

(86)【国際出願番号】 US2020041473

(87)【国際公開番号】W WO2021007465

(87)【国際公開日】2021-01-14

(31)【優先権主張番号】62/872,084

(32)【優先日】2019-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】322010888

【氏名又は名称】アライズ プレシジョン メディシン，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ブックバインダー，ロニー

(72)【発明者】

【氏名】ニルス，ブラッド

(72)【発明者】

【氏名】ヌネズ，ニコール

(72)【発明者】

【氏名】コギンス，ニコール

(72)【発明者】

【氏名】ヴァイシュ，ナレンドラ ケー．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076DD26A

4C084AA13

4C084AA19

4C084AA23

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA17

4C084BA24

4C084MA24

4C084NA05

4C084NA06

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA15

4H045CA40

4H045EA28

(57)【要約】

【解決手段】ＰＲＤＭ腫瘍性タンパク質遺伝子の発現をダウンレギュレートし、腫瘍成長を阻害する新規なｓｉＲＮＡを含む癌の処置のための医薬製剤。ＰＲＤＭ１４ｍＲＮＡを破壊するために設計され、かつ選択されたｓｉＲＮＡが記載されている。ｓｉＲＮＡは、腫瘍細胞の表面上の受容体に、ｓｉＲＮＡペイロードとのナノ粒子の特異的結合を与える腫瘍特異的な標的化リガンドを装備した１つ以上の標的化薬物送達システムによって送達される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２～２７を含む、癌細胞においてヒトＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するように構成された、単離した二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であって、ここで、ヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびハイブリッドＲＮＡ：ＤＮＡの組み合わせであってもよく、かつ鎖は、１６－３０のヌクレオチド長である、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。

【請求項2】

ｓｉＲＮＡは、部位特異的な塩基修飾を含む１つ以上の化学修飾を含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項3】

前記化学修飾は、以下の
ａ．糖上の２’位置へのＯメチル基の添加と、
ｂ．糖の２’位置へのフッ素原子の添加と、
ｃ．ｓｉＲＮＡガイドアンチセンス鎖の３’末端での硫黄原子の酸素への置換と、の少なくとも１つを含む、請求項２に記載のｓｉＲＮＡ。

【請求項4】

癌細胞においてＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、該医薬組成物は、
ａ．ＰＲＤＭ１４遺伝子発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡと、
ｂ．ｓｉＲＮＡを複合化する担体と、
ｃ．追加の治療薬と、
ｄ．癌細胞特異的な標的化リガンドと、を含む、医薬組成物

【請求項5】

前記担体はリン酸カルシウムベースのものである、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記標的化リガンドは、タンパク質、ペプチド、およびアプタマーの群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記標的化リガンドは、環化ポリペプチドを含む、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記標的化リガンドは、アミノ酸配列ＤＭＰＧＴＶＬＰを含む、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記標的化リガンドは、アミノ酸配列ＤＭＰＧＴＶＬＰを含む環化ポリペプチドを含む、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記担体はリポソーム性である、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項11】

リポソームはペグ化されている、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項12】

追加の治療薬をさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記担体は、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を有するポリペプチド、アセンブリドメイン（ＡＤ）、腫瘍特異的細胞標的化ドメイン（ＣＴＤ）、およびカチオン核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）を含むナノ粒子担体である、請求項４の医薬組成物。

【請求項14】

前記ＣＴＤは、アミノ酸配列ＤＭＰＧＴＶＬＰを含む、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

結合された治療薬を有する薬物結合ドメイン（ＤＢＤ）をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項16】

癌細胞においてＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物の治療上有効な量を投与することによってヒト癌患者を処置する方法であって、該医薬組成物は、
ａ．ＰＲＤＭ１４遺伝子発現をダウンレギュレートする二本鎖ｓｉＲＮＡと、
ｂ．ｓｉＲＮＡと追加の治療薬を複合化する担体と、
ｃ．癌細胞特異的な標的化リガンドと、を含み、
ｄ．ここで、癌細胞型は、乳癌、肺癌、食道癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌、腎癌、生殖細胞癌、血液癌、白血病、頭部癌、頚部癌、および子宮頚癌の群から選択される、方法。

【請求項17】

前記担体はリン酸カルシウムベースのものである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記担体は、
ａ．エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）を有するポリペプチドと、
ｂ．アセンブリドメイン（ＡＤ）と、
ｃ．腫瘍特異的な細胞標的化ドメイン（ＣＴＤ）と、
ｄ．カチオン核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）と、を含むナノ粒子担体である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記ナノ粒子担体は、リポソーム性である、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

癌細胞の成長を抑制するために、ＰＲＤＭ１４の発現を阻害するためにＡＲＩＺ ｓｉＲＮＡを充填された薬物送達システムを含む医薬組成物。

【請求項21】

前記ＡＲＩＺ ｓｉＲＮＡは、
ａ．ＡＲＩＺ－０２２と、
ｂ．ＡＲＩＺ－０２３と、
ｃ．ＡＲＩＺ－０２４と、
ｄ．ＡＲＩＺ－０２５と、
ｅ．ＡＲＩＺ－０２６と、
ｆ．ＡＲＩＺ－０３２と、
ｇ．ＡＲＩＺ－０３３と、
ｈ．ＡＲＩＺ－０３４と、
ｉ．ＡＲＩＺ－０３８と、
ｊ．ＡＲＩＺ－０３９と、
ｋ．ＡＲＩＺ－０４０と、
ｌ．ＡＲＩＺ－０４４と、
ｍ．ＡＲＩＺ－０６１を含む群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医学の分野に属する。特に、本発明は癌処置に関する。

【背景技術】

【0002】

現在の抗癌剤治療の効果は限られている。一般的に使用される抗癌剤は、腫瘍の一時的な寛解をもたらし、患者の寿命を延ばすのに役立つ可能性があるが、ほとんどの場合、治癒的ではない。それらはしばしば癌を完全には排除せず、腫瘍はその後再び出現する可能性がある。低分子化学療法は現在、癌に対して最も広く使われている処置であるが、その作用は大部分が非特異的である。化学療法剤は、正常で健康な細胞および組織に巻き添え被害を引き起こし、深刻なオフターゲット毒作用を有する。結果的に、患者は毒性のため重い副作用に苦しむ。免疫ベースの治療法は、毒性を減少させ、生存率を改善することが期待されていたが、その見込みにもかかわらず、癌治療および良好な長期患者転帰の見通しを少しずつ改善しただけであった。標的化療法および免疫療法は、従来の化学療法の補足手段または代替的手段としてますます使用されているが、癌は一般に適応して急速に耐性を発達させ、標的化療法の効果を逃れるため、そのような療法は一般に長期的な有効性を欠いている。前述の理由で、化学療法、免疫療法、および標的化治療が治癒的であることは稀である。

【0003】

アメリカ癌協会の癌統計センターは、２０１９年に１，７６２，４５０の新しい癌の症例および６０６，８８０の癌による死亡を推定している。癌による高い死亡率は、癌の進行を効果的に未然に防ぐことができる新しい治療法の緊急の必要性を浮き彫りにしている。米国のすべての新しい癌症例の１５％は、女性の乳癌である（Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）。国立衛生研究所によると、これらの乳癌の症例は、毎年５０％以上増加すると予想されており、新しい診断の割合は２０３０年までに年間４４万人の女性を超えると予測されている（Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）。さらに、２０１７年だけでもこの疾患の結果として４０，０００人以上の乳癌の女性が亡くなる（Ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）。これらの驚異的な数字は、この複雑な疾患と戦うための新しい介入の必要性を浮き彫りにしている。アメリカ癌協会によると、ほとんどの乳癌化学療法は非特異的であり、標的化学療法は乳癌症例の３０％未満に適用可能である。さらに、単一点変異などの遺伝的欠陥の遺伝によって発生する乳癌はわずか５％であり、遺伝暗号自体の変更ではなく、遺伝子発現の変更によって引き起こされるエピジェネティクスなどの他の要因によって発生する乳癌の発症および治療についてさらに調査する必要がある。

【0004】

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、細胞内の標的遺伝子を特異的に発現抑制する潜在力を有する。ｓｉＲＮＡ療法の実施を成功させる上での主な障害の１つは、体内の関連する作用部位に有効量のｓｉＲＮＡを送達することが困難なことである。ｓｉＲＮＡは、わずか２１～２３ヌクレオチドの小分子であり、腎臓による体外への排出、ヌクレアーゼやリゾチームなどの内因性酵素による分解、免疫系による攻撃を受けやすい傾向がある。さらに、裸のｓｉＲＮＡの治療活性は、インビボの半減期が非常に短く、体のクリアランスが速いため、利用するのが困難である。従って、成功は、適切なｓｉＲＮＡを一致させて特定の問題のある遺伝子を抑制し、同時に新規ｓｉＲＮＡを標的部位（癌細胞など）に送達する可能性を最大化する送達システムを提供する能力によって推進される。

【0005】

上記を考慮して、癌に関与する遺伝子の発現を調節および阻害し、ｓｉＲＮＡベースの治療の能力および有効性を促進するための分子組成物および方法が必要である。本発明は、このようなニーズなどに対応するものである。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、癌において発現される遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む医薬組成物、およびそのような組成物を使用してそのような遺伝子の発現を発現抑制し、それによって癌性細胞の産生を阻害する方法を含む。本発明の実施形態は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現をノックダウンするように設計されたｓｉＲＮＡが充填された標的化薬物送達システムを含む新しい化学物質を含む。ＰＲＤＭ１４は、ＰＲＤＭ１４タンパク質をコードするマスター調節遺伝子である。ＰＲＤＭ１４の調節異常は、乳癌や肺癌、その他の癌など、いくつかの種類の癌に強く関係している。

【0007】

ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を調節するように設計された、関連する薬物送達システムを含む本発明による新薬の開発は、効果的な長期治療、さらには特定の種類の癌の治療に対する差し迫った利用可能な化学療法と免疫療法は一般的に満たすことができないという必要性、を満たすことが期待される。本発明に係るこれらの新薬は、特定の癌細胞を標的とする補完的な薬物送達システムを使用することによって増強することができる効果的な解決策を提供し、それによって毒性の副作用および健康な細胞および組織への損傷を最小限に抑える。

【0008】

本発明は、一例として、ＰＲＤＭ１４遺伝子の調節異常によって引き起こされる癌の種類を治療するために最適化された特徴の組み合わせを有する製剤中の新規のｓｉＲＮＡを提供する。本発明は、選択された抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ治療ペイロードの、癌細胞特異的標的化リガンドで配列された１つ以上の送達システムへの複合体形成を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本発明は、癌細胞部位に優先的にｓｉＲＮＡを送達するために、ナノ粒子薬物送達ビヒクルと協調してｓｉＲＮＡを含む。ナノ粒子薬物送達システムは、ｓｉＲＮＡを循環中の分解と除去から保護し、標的となる癌細胞へのｓｉＲＮＡの内在化を仲介する。さらに、本発明に係る薬物送達システムは、ナノ粒子表面状で表示された標的化リガンドを含む場合がある。

【0010】

他の実施形態では、本発明に係る薬物送達システムは、非粒子状担体（例えば、アプタマー）を使用して、ｓｉＲＮＡを特定の種類の癌細胞に選択的に標的化する。

【0011】

標的化リガンドは、腫瘍細胞または癌幹細胞の表面上で高度に発現される特有の受容体または他の部分を標的とする。標的化リガンドは、癌細胞を正常な非癌細胞から区別する。リガンドは、タンパク質、ペプチド、アプタマー、または好ましくは高い特異性および親和性で標的化された癌細胞に結合することができる他のクラスの分子であり得る。標的化のアプローチは、癌性細胞を正常な健康な細胞から区別し、癌部位での薬物の優先的な送達と蓄積をもたらし、従って、治療効果を高め、患者への毒性を最小限に抑える。

【0012】

１つ以上の抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡに加えて、薬物送達システムは、化学療法剤、または癌細胞の増殖および拡散を阻害、殺傷、または停止するのを助ける任意のコンパニオンペイロードなどの他の治療薬を組み込むことができる。

【0013】

上記の新規の特徴の組み合わせを提供することにより、本発明は、調節異常のＰＲＤＭ１４によって引き起こされるものを含む特定の癌の治療のための効果的な医薬組成物を提供することによって緊急の必要性を満たす。本発明は、現在の処置オプションの欠点に対処し、特定の癌に苦しむ無数の人々に救済を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、ＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡに対して相補性を有するｓｉＲＮＡペイロードを含むナノ粒子薬物送達システムを含む、本発明の１つの実施形態による例を示す。

【図2】図２は、発明特定事項に係る、アミノ酸配列ＤＭＰＧＴＶＬＰＤを有する環化ペプチド標的化リガンドを含むｓｉＲＮＡ送達システムを示し、これは、乳癌細胞に高い特異性および親和性で結合する。

【図3】図３は、本発明に係る、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡｓを有するトランスフェクション後に乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ－７）の細胞の生存率アッセイ結果を示す。

【図4】図４は、本発明に係る、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後の対照細胞（細胞株ＣＣＤ１１２、正常結腸線維芽細胞）の細胞生存率アッセイの結果を示す。

【図5】図５は、本発明に係る、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後の肺癌細胞（細胞株Ａ５４９）の細胞生存率アッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の実施形態は、ヒトおよび動物の様々な癌を処置するために新規な化学成分を含む。特に、本発明は、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現を発現抑制するように設計されたｓｉＲＮＡを充填された標的化薬物送達システムを含み、それにより癌性増殖を阻害する。

【0016】

第１の態様では、本発明は、ヒトＰＲＤＭ１４遺伝子配列（本明細書に配列番号１、およびＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＮＭ＿０２４５０４として同定されている）の隣接部分に相補的である配列を有する１６－３０ヌクレオチド長である単離されたオリゴリボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0017】

以下の表１は、発明特定事項に係る、ＰＲＤＭ１４遺伝子の発現をダウンレギュレートし、かつ癌成長を阻害するために設計されたｓｉＲＮＡ配列を表記する。ある実施形態では、部位特異的な塩基および骨格の修飾をｓｉＲＮＡに組み込んで、ｓｉＲＮＡを分解および排除から保護し、免疫原性を防ぎ、オフターゲット効果の可能性を最小限に抑えることができる。

【0018】

図１は、ＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡに対して相補性を有するｓｉＲＮＡペイロードを含むナノ粒子薬物送達システムを含む、本発明の１つの実施形態による例を示す。ナノ粒子は、ｓｉＲＮＡのための担体および薬物送達システムとして働く。ナノ粒子は、健康な細胞ではなく、特定の型の癌細胞への親和性を有する標的化剤を含む。いったんナノ粒子が癌細胞と結合すると、ナノ粒子はｓｉＲＮＡを癌細胞へと放出し、その死を引き起こす。ｓｉＲＮＡと標的化剤を有する複数のナノ粒子は、健康な細胞への害を回避する間に標的とされた癌細胞を有効に死滅させるのに十分な投与量で対象に導入される。

【0019】

図２は、発明特定事項に係る、アミノ酸配列ＤＭＰＧＴＶＬＰＤを有する環化ペプチド標的化リガンドを含むｓｉＲＮＡ送達システムを示し、これは、高い特異性および親和性で乳癌細胞に結合する。この抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ ＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０および１１）は、第５の実施形態に関して以下でさらに論じられ、（チオール－マレイミド－ＰＥＧ）リンカーを介して環化標的化リガンドｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）にコンジュゲートされ得る。ｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）は、高い特異性および親和性で乳癌細胞と結合することを実証されたＤＭＰＧＴＶＬＰＤペプチドの環化されたバージョンである。結果として生じたｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）－ＰＥＧ－ＭＡＬ－ｓｉＲＮＡ分子は図２に例示される。

【0020】

ある実施形態では、発明の医薬組成物は、単一のｓｉＲＮＡペイロードを有しても良い。他の実施形態では、医薬組成物は、治療用有効性を増強するために１つのｓｉＲＮＡペイロード以上に含むことがある。まだ他の実施形態では、医薬組成物は、癌治療の有効性を高めるために、ＰＲＤＭ１４以外の標的遺伝子に対して向けられた追加のｓｉＲＮＡをさらに含み得る。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、化学療法剤などの従来の抗癌剤、または治療効果を増強し得る任意の他のコンパニオンペイロードをさらに含み得る。発明特定事項は、腫瘍内注射、皮下注射、静脈内および吸入を含む、対象への医薬組成物の導入のための様々な手段を含む。患者の治療に選ばれる方法は、患者の状態および癌の種類に基づいて決定される。

【0021】

以下の表１に表記されているｓｉＲＮＡは、患者に送達されると、リポソームなどの薬物送達システム、または脂質、シクロデキストリン、キトサン、炭水化物ポリマー、エラスチン様ポリマー（ＥＬＰ）、カルシウムリン酸ポリマー、またはそれらの組み合わせで構成されるナノ粒子を介して増強される場合がある。

【0022】

ｓｉＲＮＡは、コンパニオンペイロードとともに、癌特異的標的化ナノ粒子またはアプタマーなどの他の型の癌標的化薬物送達システムを介して癌細胞に優先的に送達され、正常で健康な細胞の損傷を回避し、裸のｓｉＲＮＡを分解し、循環系のペイロード全体を安定させ、癌細胞へのｓｉＲＮＡの効率的な内在化を仲介する。

【0023】

ｓｉＲＮＡの送達に関連するナノ粒子は、脂質、リポソーム、糖、デキストラン、リン酸カルシウム、キトサン、ペプチド、およびプラスチックポリマーを含むがこれらに限定されない担体材料の組み合わせから組み立てることができる。

【0024】

ある実施形態では、医薬組成物は、正常で健康な細胞よりも癌細胞用のｓｉＲＮＡペイロードの選択性を増強するために癌細胞標的化リガンドをさらに含む。標的化リガンドは、癌細胞表面上で特異的に過剰発現され、癌細胞を正常細胞から相違を示す受容体、または他の部分に結合するために選択されている。ある実施形態では、標的化リガンドは、ポリペプチド、アプタマー、または高い特異性および親和性で標的化された癌細胞に結合することができる他のクラスの分子であり得るが、これらに限定されない。

【0025】

ある実施形態では、標的化リガンドは、ペプチド（例えば、乳癌細胞に高い特異性および親和性で結合するための、線状または環状形態のペプチドＤＭＰＧＴＶＬＰ）であり得るが、これに限定されない。

【0026】

ある実施形態では、ナノ医薬品粒子は、ｓｉＲＮＡとリン酸カルシウム担体材料との複合体形成によって形成される。他の実施形態では、ナノ粒子はエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）から組み立てられることがある。さらに別の実施形態では、薬物送達システムはリポソーム性であってもよい。いくつかの実施形態では、薬物送達システムは、血流中の薬物の寿命を延ばし、免疫系による破壊から薬物送達システムを保護するために、保護層でコーティング（例えば、リポソームのＰＥＧ化）され得る。

【0027】

発明特定事項は、主に、ＰＲＤＭ１４遺伝子の調節異常によって引き起こされる癌の処置に方向付けられているが、他の癌が影響を受ける可能性がある。ある実施形態では、医薬組成物は、乳房、肺、食道、膵臓、卵巣、腎臓、膀胱、腎、生殖細胞、白血病、頭部および頸部、または子宮頚の癌に苦しむ患者を処置するために製剤されることがあるが、それに制限されない。

【0028】

好ましい実施形態では、部位特異的な塩基および骨格修飾を有する抗ＰＲＤＭ１４ｓｉＲＮＡは、化学療法コンパニオンペイロードとともにＥＬＰベースのナノ粒子に複合体化され、ＤＭＰＧＴＶＬＰ標的化リガンドを使用して乳癌細胞を標的化する。

【0029】

以下に提供される表１は、発明特定事項に係るＰＲＤＭ１４発現に対して方向付けられたｓｉＲＮＡ複式のリストであり、ここで、４＝２’ＯＭｅ－Ｕ；ボールド体＝ホスホロチオエート；およびＰ＝ホスフェートである。

【0030】

【表1-1】

【0031】

【表1-2】

【0032】

以下の実施形態は、発明特定事項に係る医薬組成物の予想される使用および有効性を記載している。

【0033】

発明特定事項に係る第１の実施形態では、組成物は、ヒト乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ－７）を死滅させるために本発明に係るｓｉＲＮＡの使用および有効性を説明して記載されている。図３のチャートで示される結果は、インビトロの実験作業を反映する。

【0034】

ＭＣＦ－７癌細胞は、９６ウェルプレート（１，０００個の細胞／ウェル）にプレーティングされ、２４時間後、ＭＣＦ－７癌細胞は、０．３μｌのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して、２０ｎＭのｓｉＲＮＡ（ＡＲＩＺ－０４０（配列番号２２と２３）、ＡＲＩＺ－０４４（配列番号２４と２５）、およびＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１）を含む）でトランスフェクトされた。液体媒体は、２日後に交換され、および４日後、未処理細胞に対するパーセント細胞生存率が決定された。対照として、正常な結腸線維芽細胞細胞（細胞株ＣＣ１１２）は、ｓｉＲＮＡの同じセットで処置された。

【0035】

図３および図４のチャートを参照すると、ＡＲＩＺ－０４０（配列番号２２と２３）、ＡＲＩＺ－００４４（配列番号２４と２５）、およびＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１）を含む様々なｓｉＲＮＡにさらされた後の正常な結腸線維芽細胞（細胞株ＣＣＤ１１２）と比較したＭＣＦ－７乳癌細胞の結果として生じる細胞生存率が示される。

【0036】

したがって、示されるように、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ（ＡＲＩＺ－０４０（配列番号２２と２３）、ＡＲＩＺ－００４４（配列番号２４と２５）、およびＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１））は、スクランブルさられたｓｉＲＮＡ陰性対照と比較して、ＭＣＦ－７乳癌細胞を死滅させるのに効果的であった。結果はさらに、発明特定事項およびこの第１の実施形態に係る抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡが、正常な結腸線維芽細胞の死滅が最小限であったため、癌細胞を特異的に攻撃することを実証している。

【0037】

発明特定事項に係る第２の実施形態では、図５を参照すると、組成物は、ヒト肺癌細胞（細胞Ａ５４９）を死滅させるためのｓｉＲＮＡｓの使用および有効性を説明して記載されている。図４のチャートで示される結果は、インビトロの結果を反映する。

【0038】

Ａ５４９癌細胞は、９６ウェルプレート（１，０００個の細胞／ウェル）にプレーティングされ、２４時間後、Ａ５４９癌細胞は、０．３μｌのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して、２０ｎＭのｓｉＲＮＡｓ（ＡＲＩＺ－０４０（配列番号２２と２３）、ＡＲＩＺ－００４４（配列番号２４と２５）およびＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１））でトランスフェクトされた。液体媒体は、２日後に交換され、および４日後、パーセント細胞の生存率は未処理細胞に対する決定された。

【0039】

図５のチャートは、ＡＲＩＺ－０４０（配列番号２２と２３）、ＡＲＩＺ－００４４（配列番号２４と２５）およびＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１）を含むｓｉＲＮＡにさらされた後に生じるＡ５４９肺癌細胞の細胞生存率を示している。したがって、本発明に係る抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡは、スクランブルされたｓｉＲＮＡ陰性対照と比較してＡ５４９肺癌細胞を死滅させるのに効果的であった。

【0040】

第３の実施形態では、記載された発明特定事項はとりわけ乳癌細胞を対象としている。本発明の第３の実施形態に係る医薬組成物の投与のための潜在的な臨床アナログを説明すると、部位特異的な塩基および骨格修飾を有する抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ（ＡＲＩＺ－０６１（配列番号２６と２７））は、薬物結合ドメインを介して標的とされたナノ粒子に結合した化学療法コンパニオンペイロードと共にＥＬＰベースのナノ粒子に複合体化され、その後、ＤＭＰＧＴＶＬＰ標的化リガンドで乳癌細胞に標的化され得る。

【0041】

第３の実施形態は、腫瘍にｓｉＲＮＡまたは他の薬物を標的化するためのタンパク質ナノ粒子系を含む。送達システムの基本は、ｓｉＲＮＡの核酸に曝露されると自己集合するエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）である。標準的な遺伝子工学技術によって、特異的な標的化ペプチドがＥＬＰのコア構造に融合されている。ＥＬＰは、負電荷を帯びたｓｉＲＮＡの結合のためのカチオン核酸結合ドメイン（ＮＢＤ）と、ナノ粒子への個々のポリペプチド分子の自己集合を制御するアセンブリドメイン（ＡＤ）と、ペプチド標的化リガンドを含む細胞標的化ドメイン（ＣＴＤ）とを含む。ＥＬＰはさらに、より大きな治療効果のためにコンパニオンペイロード（例えば、化学療法剤）を複合化することを可能にする薬物結合ドメイン（ＤＢＤ）を含んでいてもよい。

【0042】

ＥＬＰベースのナノ粒子は、ＣＴＤ内に標的化ペプチドＤＭＰＧＴＶＬＰを含むように操作されたＥＬＰ構築物と、化学療法薬ドキソルビシンを結合する薬物結合ドメインとを用いて形成することができる。ＤＭＰＧＴＶＬＰリガンドは、高い特異性と親和性で乳癌細胞に結合することによって、乳癌細胞を標的とする。ナノ粒子は、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ ＡＲＩＺ－０６１（配列番号２６と２７）および治療上有効な量のドキソルビシンを有する複合体として形成される。設計されたｓｉＲＮＡの効力を評価するために、このようにして生成された薬物製剤は、３００万個の乳房転移性腫瘍細胞を雌マウスに皮下注射し、１０日間にわたって腫瘍を成長させることによって形成された腫瘍を有するヌードマウスに投与される。処置は、薬物製剤の最大５回の注射からなり、各注射は１０マイクロリットルの１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを腫瘍に直ちに、または５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを静脈内に送達する。同様の腫瘍を持つ同数のマウスには、陰性対照として、スクランブルされたｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子が注射される。処置された腫瘍は、４週間の投与後に摘出され、測定され、重量が測定される。腫瘍におけるＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡの発現は、標準的な分析方法を用いてｑＰＣＲにより測定されることになる。腫瘍中のＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、標準的な分析法を用いるウエスタンブロット法により測定されることになる。

【0043】

発明特定事項に係る、抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡ、ＡＲＩＺ－０６１を含有する新規な製剤を投与したマウスの腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡで処置したマウスと比較して大きさと受領が５０％～９０％小さくなる。ＡＲＩＺ－０６１に基づき抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡ製剤で処置したマウスの腫瘍中でのＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡおよびＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、陰性対照と比較して５０％～９０％低下する。

【0044】

第４の実施形態では、記載された発明特定事項は、具体的には肺癌細胞に関するものである。この第４の実施形態は、発明特定事項に係る、ｓｉＲＮＡに影響を及ぼす癌処置用の標的化された自己組織化ナノ粒子薬物送達システムを含んでおり（ＡＲＩＺ－０４４（配列番号２４と２５））、ｓｉＲＮＡは、チオール－マレイミド－ＰＥＧリンカーを介して環状ペプチド標的化リガンドに直接コンジュゲートされ、ナノ粒子は、標的受容体を発現する癌細胞にｓｉＲＮＡペイロードを特異的に送達することが可能である。

【0045】

この第４の実施形態は、ｓｉＲＮＡを抱えるナノ粒子をヒト肺癌腫瘍に対して特異的に標的化するべく、リガンドとして小さなシクロペプチド（シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）－ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ［ＰＥＧ－ＭＡＬ］）（ｃＲＧＤ）に影響を及ぼす。ｃＲＧＤは、インテグリンαｖβ３受容体を特異的に標的とする。この受容体は、ヒトにおいて肺癌腫瘍を含む多くの種類の固形腫瘍上で過剰発現される。ｃ（ＲＧＤ）は、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）を対象とするｓｉＲＮＡにコンジュゲートされる。ＶＥＧＦＲ２は、内皮管の増殖と移動をもたらし、その結果として腫瘍の血管新生と血管成長を促進するシグナル伝達経路に関与する。ｃ（ＲＧＤ）／ｓｉＲＮＡナノ粒子は、ｓｉＲＮＡをＡ５４９肺癌細胞へ運び、インビトロとインビボの両方でＶＥＧＦＲ２遺伝子を発現抑制する。癌を抱えるマウスでは、静脈注射されたｃＲＧＤ－ｓｉＲＮＡ分子は、先天性免疫応答を生じさせず、生体内で腫瘍組織へと分布する。ｓｉＲＮＡを抱えるナノ粒子の静脈内注射は、マウスモデル系における腫瘍成長および血管新生を阻害する。ｃＲＧＤ－ｓｉＲＮＡｓの連続全身送達は、腫瘍中の対応するｍＲＮＡ（４５％～５０％）とタンパク質（４５％～６５％）のダウンレギュレーションのほか、全体的な腫瘍体積の減少（７０％～９０％）をもたらした。

【0046】

ｃ（ＲＧＤ）－ｓｉＲＮＡナノ粒子は、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ ＡＲＩＺ－０４４（配列番号２４と２５）を使用して形成される。ｃ（ＲＧＤ）－ｓｉＲＮＡは、Ａ５４９肺癌腫瘍を抱えるマウスに静脈内注射される。その後、マウスは、処置における任意の有毒作用についてモニタリングされ、治療の有効性を判定するために腫瘍サイズが測定される。腫瘍中のＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡおよびＰＲＤＭ１４タンパク質の発現が、解析される。

【0047】

この第４の実施形態に基づいて、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ（ＡＲＩＺ－０４４（配列番号２４と２５））を有するｃ（ＲＧＤ）－ｓｉＲＮＡナノ粒子で処置されたマウスの腫瘍は、対照の非標的化ｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートしたｃＲＧＤを注射された対照のマウスの腫瘍よりもサイズが７０％～９０％小さくなる。ｃ（ＲＧＤ）誘導性抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡで処置されたマウスのＡ５４９肺癌腫瘍におけるＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡおよびＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、陰性対照と比べて５０％以上減少する。

【0048】

第５の実施形態では、記載される発明特定事項は、特に、乳癌細胞に関する。図２を再び参照すると、この第５の実施形態は、癌処置のための標的化薬物送達システムを含み、このシステムは、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡペイロード（ＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１））を癌細胞に特異的に送達する標的化リガンドを表示するためのカルシウムホスホシリケートナノ担体（ＮａｎｏＪａｃｋｅｔ）を含む。

【0049】

リン酸カルシウムナノ粒子は、治療目的のために、標的化癌細胞にｓｉＲＮＡを送達するための担体ビヒクルとして機能する。本明細書で「ｓｉＲＮＡ ＮａｎｏＪａｃｋｅｔ」と呼ばれるこれらのナノ粒子は、安定しており無毒である。ｓｉＲＮＡ ＮａｎｏＪａｃｋｅｔは、動物モデルにおけるヒト乳癌細胞に対して効果的であることが示されている。ペプチド、抗体、またはアプタマーなどの、腫瘍を特異的に標的とする部分をＮａｎｏＪａｃｋｅｔ表面に結合することによって、治療効果を増大させることができる。

【0050】

抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡ ＡＲＩＺ－０２６（配列番号１０と１１）は、チオール－マレイミド－ＰＥＧリンカーによって環化された標的化リガンドｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）にコンジュゲートされ得る。ｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）は、高い特異性および親和性で乳癌細胞に結合することが示されたＤＭＰＧＴＶＬＰＤペプチドの環化されたバージョンである。結果として生じるｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）－ＰＥＧ－ＭＡＬ－ｓｉＲＮＡ分子を、図２に例示する。ｃ（ＤＭＰＧＴＶＬＰＤ）－ＰＥＧ－ＭＡＬ－ｓｉＲＮＡ分子は、標的化リン酸カルシウムＮａｎｏＪａｃｋｅｔ粒子へと組み立てられる。ｓｉＲＮＡ効力を評価するために、このように生成された薬物製剤は、３００万の乳房転移性腫瘍細胞をメスのマウスに皮下注射し、１０日の期間にわたって腫瘍を増殖させることによって形成された腫瘍を有するヌードマウスに投与される。その処置は薬物製剤の最大５回の注射からなり、各注射は、１０マイクロリットルの１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを腫瘍に、または５ｍｇ／ｋｇを静脈内に送達する。同様の腫瘍を抱える同数のマウスに、陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含むナノ粒子を注射する。４週間の投与後に腫瘍を取り出し、測定し、秤量する。腫瘍におけるＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡの発現を、標準分析法を使用してｑＰＣＲによって測定する。腫瘍におけるＰＲＤＭ１４タンパク質の発現を、標準分析法を使用してウェスタンブロッティングによって測定する。

【0051】

第５の実施形態に係る、抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡを含有する製剤を投与したマウスの腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡで処置したマウスと比較して大きさと重量が５０％～９０％小さくなる。抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡ製剤で処置したマウスの腫瘍中でのＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡおよびＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、陰性対照と比較して５０％～９０％低下する。

【0052】

第６の実施形態では、記載される発明特定事項は、特に、乳癌細胞に関する。この第６の実施形態は、本発明に係る乳癌処置のための標的化薬物送達システムの使用の例証を提供し、このシステムは、アプタマーがヌクレオリン受容体を標的とし、そしてｓｉＲＮＡが癌毒性６量体シード配列（ｓｅｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、アプタマー／ｓｉＲＮＡ製剤を含む。

【0053】

ヌクレオリンは、癌細胞および腫瘍に関連する血管中で過剰発現されることで知られている受容体である。それは、腫瘍形成および血管新生を補助する様々なプロセスに関係している。その過剰発現は、乳癌を含む様々なヒトの癌で実証されている。抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡは、ヌクレオリン受容体に強くかつ特異的に結合するように選択された、ＲＮＡアプタマーを使用して、乳癌細胞を標的とする。

【0054】

ヌクレオリンを特異的に標的とするＲＮＡアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法を使用してＲＮＡライブラリから単離される。このように同定されたアプタマーは、１６ヌクレオチドの「粘着性」３’末端を含むように合成され、そしてアンチセンス（ガイド）鎖の３’末端上の相補的な「粘着性」末端によって、抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡに結合される。ｓｉＲＮＡは、癌毒性６量体シード配列でさらに設計される。

【0055】

ｓｉＲＮＡ効力を評価するために、このように生成されたアプタマー／ｓｉＲＮＡ複合体は、３００万の乳房転移性腫瘍細胞をメスのマウスに皮下注射し、１０日の期間にわたって腫瘍を増殖させることによって形成された腫瘍を有するヌードマウスに投与される。その処置は薬物製剤の最大５回の注射からなり、各注射は、１０マイクロリットルの１ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡを腫瘍に、または５ｍｇ／ｋｇを静脈内に送達する。同様の腫瘍を抱える同数のマウスに、陰性対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ配列を含むアプタマー／ｓｉＲＮＡ複合体を注射する。３週間の投与後に腫瘍を取り出し、測定し、秤量する。腫瘍におけるＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡの発現を、標準分析法を使用してｑＰＣＲによって測定する。腫瘍におけるＰＲＤＭ１４タンパク質の発現を、標準分析法を使用してウェスタンブロッティングによって測定する。

【0056】

発明特定事項に係る、抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡを含有するこの第６の実施形態に係る製剤を投与したマウスの腫瘍は、スクランブルｓｉＲＮＡで処置したマウスと比較して大きさと重量が５０％～９０％小さくなる。抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡ製剤で処置したマウスの腫瘍中でのＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡおよびＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、陰性対照と比較して５０％～９０％低下する。

【0057】

第７の実施形態では、記載された発明特定事項は、乳癌細胞へ特に方向付けられる。第７の実施形態は例示する、癌治療用のサイル療法系、抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡを用いる複雑にされた、含むリポソームのｓｉＲＮＡ／ファージ融合タンパク質担体、と仲間の化学療法のペイロード、複合体ここで、特異的に癌細胞にｓｉＲＮＡペイロードを送達されるために標的化リガンドを表示する。

【0058】

サイル療法ナノ担体は、リポソーム粒子の中へのリン脂質分子を用いる自分で集まるペプチド標的化リガンドを運ぶ景観ファージ融合タンパク質を含む。ナノ粒子は、などの１つ以上薬物ペイロードを囲む、化学療法剤あるいは治療上活性なポリヌクレオチド。ファージ融合タンパク質は異種の標的とするペプチドを表示するファージｐＶＩＩＩコートタンパク質である。ペプチドＶＥＥＧＧＹＩＡＡを表示する景観ファージ融合タンパク質は、ヒトＭＣＦ－７乳癌細胞へ選択的に制限する。これらのナノ粒子は、ＭＣＦ－７乳癌細胞への抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡを標的とし、かつＰＲＤＭ１４を発現抑制するためにてこ入れされる。

【0059】

リポソーム・ベースのｓｉＲＮＡ／ファージ融合タンパク質に標的とされた粒子は、ＶＥＥＧＧＹＩＡＡペプチドを表示し、かつＭＣＦ－７乳癌細胞に抗ＰＲＤＭ１４ ｓｉＲＮＡを送達されるために構築される。ナノ粒子は治療上化学療法剤ドキソルビシンの有効量を含有するために初代ｓｉＲＮＡペイロードに加えて製剤される。このように産生された製剤は、ＭＣＦ－７乳癌腫瘍を運ぶマウスに静脈内に投与される。ｓｉＲＮＡ効能を評価するために、このように産生された薬物製剤は、３００万の乳房転移性腫瘍細胞を用いる雌のマウスを皮下注射し腫瘍が１０日の期間の間増大することを可能にすることにより形成された腫瘍を用いるヌードマウスに投与される。その処置は、薬物製剤の最大５つの注射、腫瘍の中への１のｎｍｏｌ ｓｉＲＮＡを１０マイクロリットル押し流す各注射あるいは５ｍｇ／ｋｇから静脈内でなる。同様の腫瘍を運ぶ等しい数のマウスは、陰性対照として掻き混ぜられたｓｉＲＮＡ配列を含有しているナノ粒子を注入される。腫瘍は４週間の投与の後に削除され、測定され、重要だった。腫瘍中のＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡの発現は標準分析法を使用して、ｑＰＣＲによって測定される。腫瘍中のＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は標準分析法を使用して、ウェスタンブロッティングによって測定される。

【0060】

表Ｉの抗ＰＲＤＭ ｓｉＲＮＡを含有している製剤を投薬されたマウスの腫瘍は、サイズ、および掻き混ぜられたｓｉＲＮＡを用いる処置されたマウスの腫瘍より重量において５０％から９０％小さくなる。抗ＰＲＤＭのｓｉＲＮＡ製剤を用いる処置されたマウスの腫瘍中のＰＲＤＭ１４ ｍＲＮＡとＰＲＤＭ１４タンパク質の発現は、陰性対照と比較して、５０％～９０％還元される。

【0061】

発明特定事項のいくつかの実施形態は前述の詳細な説明で記載されているが、本発明は開示された実施形態に制限されていないが、本発明の範囲から逸脱することなく、多数の再構成、修正、および置換ができることが理解される。

【0062】

本明細書の全体にわたり、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明示された要素、整数、または工程、もしくは要素、整数、または工程の群の包含を示唆するが、任意の他の要素、整数、または工程、もしくは要素、整数、または工程の群の排除を示唆しないことが、理解される。

【0063】

関連するインビトロの実験作業は、記載された実施形態のための結果の評価を裏付ける。

【0064】

本発明の前述の記載された説明は、当業者がその様々な実施形態を作成および使用することを可能にする一方で、当業者は本明細書における特定の実施形態、方法、および例の変形、組み合わせ、および同等物の存在を理解し認識するだろう。従って、本発明は、上記の記載された実施形態、方法、および例によって制限されるべきではなく、特許請求される本発明の範囲および精神の範囲内のすべての実施形態および方法によって限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】