ホーム > 特許ランキング > 浙江道尓生物科技有限公司
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-25
(54)【発明の名称】抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20221018BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20221018BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221018BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221018BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221018BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221018BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221018BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221018BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221018BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221018BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221018BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20221018BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221018BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20221018BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221018BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20221018BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12P21/02 C
A61K39/395 N
A61K39/395 Y
A61K47/68
A61P35/00
A61P31/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022512455
(86)(22)【出願日】2020-07-06
(85)【翻訳文提出日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 CN2020100462
(87)【国際公開番号】W WO2021031716
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】201910777959.9
(32)【優先日】2019-08-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521309754
【氏名又は名称】浙江道尓生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】姚高峰
(72)【発明者】
【氏名】周振興
(72)【発明者】
【氏名】陳永露
(72)【発明者】
【氏名】楊志愉
(72)【発明者】
【氏名】董佳里
(72)【発明者】
【氏名】温暁芳
(72)【発明者】
【氏名】黄岩山
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4B065AA26X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF31
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB11
4C085CC23
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
特異的にＰＤ－Ｌ１に対抗し、且つＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用をブロックするシングルドメイン抗体、及び、当該シングルドメイン抗体に基づき製造されるヒト化抗体、融合タンパク質、薬物組成物及びその応用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体であって、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３、又は、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３、又は、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３、又は、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３、又は、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３、を含む抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体。
【請求項2】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、更にフレームワーク領域ＦＲをそれぞれ含み、前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示されるＦＲ１～ＦＲ４として、（１’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は
（２’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は
（３’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は
（４’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は
（５’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＦＲ４、又は
（６’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、を含むことを特徴とする請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項3】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、（ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８のいずれかで示されるシングルドメイン抗体、或いは、
（ｂ）アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８のいずれかで示される配列と８０％以上の同一性を有しており、且つ、（ａ）のシングルドメイン抗体の機能を有するシングルドメイン抗体、を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項4】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体はヒト化された抗体であり、好ましくは、そのフレームワーク領域ＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９～６１で示されるＦＲ２、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～６４で示されるＦＲ３、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で示されるＦＲ４、
から選択されるアミノ酸配列のＦＲ１～ＦＲ４を含むことを特徴とする請求項１に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項5】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体はヒト化抗体であり、（ｉ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４のいずれかで示されるシングルドメイン抗体、或いは、
（ｉｉ）アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４のいずれかで示される配列と８０％以上の同一性を有しており、且つ、（ｉ）のシングルドメイン抗体の機能を有するシングルドメイン抗体、を含むことを特徴とする請求項１又は４に記載のシングルドメイン抗体。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体である第１ドメインと、体内半減期を延長する作用及び／又はエフェクター細胞に対する結合作用を有する第２ドメイン、を含む融合タンパク質。
【請求項7】
前記第２ドメインは、好ましくはヒト免疫グロブリンＦｃ領域である免疫グロブリンＦｃ領域、及び／又は、
血清アルブミン又はその断片、血清アルブミンと結合するドメイン、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール－リポソーム複合体或いはそれらの組み合わせ、及び／又は、
Ｔ細胞表面分子に対し親和性を有し、及び／又は、Ｔ細胞上に存在する表面分子と結合可能な分子、を含み、
好ましくは、前記表面分子はＣＤ３を含むことを特徴とする請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれ、前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれ、或いは、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのうちの１又は複数の組み合わせから選択され、前記ＩｇＧは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの１又は複数の組み合わせから選択され、或いは、
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５～４８のいずれかから選択され、或いは、
前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドが設置されており、前記連結ペプチドは、好ましくは、アラニン及び／又はセリン及び／又はグリシンからなる柔軟なポリペプチド鎖から選択され、連結ペプチドの長さは３～３０個のアミノ酸であることが好ましいことを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体をコードするか、請求項６～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９に記載の分離したポリヌクレオチドを含む構造体。
【請求項11】
抗体発現システムであって、請求項１０に記載の構造体、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている請求項９に記載のポリヌクレオチドを含み、好ましくは、前記発現システムは細胞発現システムである抗体発現システム。
【請求項12】
前記抗体の発現に適した条件において、請求項１１に記載の抗体発現システムを利用して発現を行うことにより、前記抗体又は融合タンパク質を発現し、好ましくは、更に、前記抗体又は融合タンパク質を精製・分離することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項６～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項13】
（Ａ）請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び（Ｂ）（Ａ）に連結される機能性分子を含む免疫複合体。
【請求項14】
前記（Ｂ）は、細胞毒素、放射性同位体、生物活性タンパク質、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子又は検出可能マーカー、キメラ抗原受容体技術に基づく細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域、或いはそれらの組み合わせを含み、
好ましくは、前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、腫瘍表面マーカーに結合する抗体又はリガンドであり、或いは、前記腫瘍を抑制する分子は、抗腫瘍サイトカイン又は抗腫瘍毒素であることを特徴とする請求項１２に記載の免疫複合体。
【請求項15】
請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項６～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１３～１４のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む薬物組成物。
【請求項16】
更に、薬学的に許容可能なベクターを含むことを特徴とする請求項１５に記載の薬物組成物。
【請求項17】
請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項６～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１３～１４のいずれか１項に記載の免疫複合体、又は請求項１５～１６のいずれか１項に記載の薬物組成物の、癌の診断、治療又は予防のための製剤、試薬キット又は薬剤キットの製造における使用。
【請求項18】
前記癌は、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌又は鼻咽頭癌、或いはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項６～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１３～１４のいずれか１項に記載の免疫複合体、又は請求項１５～１６のいずれか１項に記載の薬物組成物の、感染性疾患又は慢性炎症性疾患の治療又は予防における使用。
【請求項20】
請求項１～５のいずれか１項に記載のシングルドメイン抗体、又は請求項６～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１３～１４のいずれか１項に記載の免疫複合体、又は請求項１５～１６のいずれか１項に記載の薬物組成物を含む試薬キット又は薬剤キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学分野に関し、特に、抗ヒトＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
プログラム細胞死１リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ １ ｌｉｇａｎｄ １，ＰＤ－Ｌ１）は、最も初期にはＢ７タンパク質ファミリーのメンバー（Ｂ７－Ｈ１と称する）のクローンとされていた（非特許文献１）。ＰＤ－Ｌ１は、Ｉ型膜貫通型タンパク質に属しており、合計２９０のアミノ酸からなる。また、ＩｇＶ様領域を１つ、ＩｇＣ様領域を１つ、膜貫通疎水性領域を１つ、及び３０のアミノ酸からなる細胞内領域を１つ含む。ＰＤ－Ｌ１は、多くの免疫細胞や上皮細胞、腫瘍細胞の表面に広く発現する。ＰＤ－Ｌ１は、プログラム細胞死－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ－１，ＰＤ－１）受容体に結合して負の調節シグナル伝達経路を活性化する。これにより、Ｔ細胞の活性化が抑制されるか、Ｔ細胞アポトーシスが誘発される結果、免疫反応が抑制される（非特許文献２）。腫瘍の進行過程では、癌細胞がＰＤ－Ｌ１の発現を上昇させてＴ細胞のアポトーシスを誘発し、免疫系による癌細胞の除去を回避する結果、疾病の進行が招来される。近年は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とするモノクローナル抗体薬物を利用し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合をブロックすることで、生体内Ｔ細胞の活性化及び増殖を促進して腫瘍細胞を殺傷するとの目的を達成している。この手法は、例えば、黒色腫、リンパ癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、結腸癌といった多くの腫瘍の治療に応用されており、顕著な治療効果を得ている。よって、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路は抗腫瘍薬研究における重要な標的となっている。現在、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路を抑制する抗体薬は臨床で多大な成功を収めており、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＭＳＤ社のＭＫ－３４７５、ロシュ社のＭＰＤＬ３２８０Ａが相次いで上市している。ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路を対象とした抗体薬は、腫瘍治療市場において最も潜在力を有する分野になると思われる。
【0003】
モノクローナル抗体は、癌の検出及び生物学的分子標的治療への応用に成功しており、腫瘍治療に変革をもたらしている。しかし、従来のモノクローナル抗体（約１５０ｋＤ）は分子質量が大きすぎ、組織を貫通しにくいため、腫瘍領域における有効濃度が低くなり、治療効果が不十分である。また、従来の抗体は高い免疫原性を有しており、変性した抗体は元の親和性を発揮することが大変難しい。このほか、完全にヒト化する従来の抗体は、開発サイクルの長さ、生産コストの高さ、安定性の不足といった様々な要因から、臨床における応用及び普及に限界がある。これに対し、その後登場したシングルドメイン抗体は、大人のラクダ体内の重鎖抗体に由来する最小の機能的抗原結合性断片を有しており、高い安定性と、抗原結合における高い親和性を備えている。通常の抗体と比較して、シングルドメイン抗体は多くの固有の性質を有している。
【0004】
１）シングルドメイン抗体のコード配列は、ヒトＶＨファミリー３及び４との相同性が高いため、免疫原性が弱い。
【0005】
２）シングルドメイン抗体は、分子量がわずか１５ｋＤａ程度と小さく、構造がシンプルである。そのため、微生物中で大量に発現させやすく、精製が容易である。
【0006】
シングルドメイン抗体は、固有の性質とコストの低さから応用範囲が大幅に拡大しており、疾病の治療及び診断における価値が顕在化している。しかし、従来技術では、当業者がシングルドメイン抗体をスクリーニングするにあたり依然として困難が存在しており、高
親和性、高特異性であり、且つ産業化の見込みを有するシングルドメイン抗体を獲得することは容易でない。また、３つ相補性決定領域（ＣＤＲ）で抗原との結合作用を発揮する抗体は、６つのＣＤＲ領域で抗原との結合作用を発揮する抗体よりもスクリーニングが遥かに難しい。このことから、現在実際に商品化されている抗体や、前臨床研究中の抗体の主流は依然として分子量の大きなモノクローナル抗体となっている。また、それだけでなく、現在当該分野で獲得されているシングルドメイン抗体には、例えば、その特殊な構造に起因する免疫原性（ＡＤＡ）の問題といった様々な課題が存在している。ＴＡＳ２６６は、ａｎｔｉ－ＤＲ５受容体シングルドメイン抗体であるが、第Ｉ相臨床試験中に深刻な肝毒性が存在したため開発が中止された。また、更なる研究によって、その肝毒性が被験者体内に存在するＡＤＡと密接に関連することが明らかとなった（非特許文献３）。且つ、別のａｎｔｉ－ＴＮＦＲ１ ＶＨＨ抗体（ＧＳＫ１９９５０５７）の第Ｉ相臨床試験でも、被験者体内に存在するＡＤＡによってサイトカインストームが発生したため、臨床試験が中止された（非特許文献４）。単一重鎖抗体（ＶＨＨ）は、軽鎖が存在しない条件で高い親和性及び安定性の維持を実現するために、フレームワーク領域とＣＤＲが一般的なヒト由来抗体とやや異なっている。特に、ＣＤＲ３の構造が大きく異なっている場合が多い。多くの場合、スクリーニングで獲得される高親和性ＶＨＨのＣＤＲ３領域は、アミノ酸の成分と長さがヒト由来抗体の配列と大きく異なっている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。例えば、高親和性ＶＨＨのＣＤＲ３領域は往々にして長さが長い。また、往々にしてＣｙｓが存在し、更にはジスルフィド結合を形成することもある（非特許文献８）。特許文献１では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＰＤＬ１－５６配列におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ３（ＩＭＧＴコードに基づく）がＣｙｓを１つずつ有している。この増加した２つのシステインによってジスルフィド結合のミスマッチ確率が著しく増加し、ミスフォールディングが発生する。且つ、この増加した２つのシステインが形成する一対のジスルフィド結合によってヒト抗体との違いが増大し、免疫原性リスクが増加する恐れがある。周知のように、ヒト由来配列との違いが大きいほど（分かりやすく言えば、ヒト化の度合が低いほど）、潜在的免疫原性は高くなるため、人体に使用したときに、人体における抗ＶＨＨ抗体の発生可能性がより高くなる。バイオ医薬品の免疫原性の度合は、往々にして臨床応用における有効性と安全性を決定付け、臨床向け開発に成功し得るか否かのポイントの一つとなる。本発明の重要な寄与の一つは、高親和性でありながら、ヒト由来抗体の構造に非常に近いＶＨＨ配列をスクリーニングにより獲得したことである。
親和性、高特異性であり、且つ産業化の見込みを有するシングルドメイン抗体を獲得することは容易でない。また、３つ相補性決定領域（ＣＤＲ）で抗原との結合作用を発揮する抗体は、６つのＣＤＲ領域で抗原との結合作用を発揮する抗体よりもスクリーニングが遥かに難しい。このことから、現在実際に商品化されている抗体や、前臨床研究中の抗体の主流は依然として分子量の大きなモノクローナル抗体となっている。また、それだけでなく、現在当該分野で獲得されているシングルドメイン抗体には、例えば、その特殊な構造に起因する免疫原性（ＡＤＡ）の問題といった様々な課題が存在している。ＴＡＳ２６６は、ａｎｔｉ－ＤＲ５受容体シングルドメイン抗体であるが、第Ｉ相臨床試験中に深刻な肝毒性が存在したため開発が中止された。また、更なる研究によって、その肝毒性が被験者体内に存在するＡＤＡと密接に関連することが明らかとなった（非特許文献３）。且つ、別のａｎｔｉ－ＴＮＦＲ１ ＶＨＨ抗体（ＧＳＫ１９９５０５７）の第Ｉ相臨床試験でも、被験者体内に存在するＡＤＡによってサイトカインストームが発生したため、臨床試験が中止された（非特許文献４）。単一重鎖抗体（ＶＨＨ）は、軽鎖が存在しない条件で高い親和性及び安定性の維持を実現するために、フレームワーク領域とＣＤＲが一般的なヒト由来抗体とやや異なっている。特に、ＣＤＲ３の構造が大きく異なっている場合が多い。多くの場合、スクリーニングで獲得される高親和性ＶＨＨのＣＤＲ３領域は、アミノ酸の成分と長さがヒト由来抗体の配列と大きく異なっている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。例えば、高親和性ＶＨＨのＣＤＲ３領域は往々にして長さが長い。また、往々にしてＣｙｓが存在し、更にはジスルフィド結合を形成することもある（非特許文献８）。特許文献１では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＰＤＬ１－５６配列におけるＣＤＲ１及びＣＤＲ３（ＩＭＧＴコードに基づく）がＣｙｓを１つずつ有している。この増加した２つのシステインによってジスルフィド結合のミスマッチ確率が著しく増加し、ミスフォールディングが発生する。且つ、この増加した２つのシステインが形成する一対のジスルフィド結合によってヒト抗体との違いが増大し、免疫原性リスクが増加する恐れがある。周知のように、ヒト由来配列との違いが大きいほど（分かりやすく言えば、ヒト化の度合が低いほど）、潜在的免疫原性は高くなるため、人体に使用したときに、人体における抗ＶＨＨ抗体の発生可能性がより高くなる。バイオ医薬品の免疫原性の度合は、往々にして臨床応用における有効性と安全性を決定付け、臨床向け開発に成功し得るか否かのポイントの一つとなる。本発明の重要な寄与の一つは、高親和性でありながら、ヒト由来抗体の構造に非常に近いＶＨＨ配列をスクリーニングにより獲得したことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開第２０１７／０２０８０１Ａ１号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｄｏｎｇ他，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：１３６５
【非特許文献2】Ｆｒｅｅｍａｎ他，２０００Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７
【非特許文献3】Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｋ．Ｐ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｒ．，Ｂｉｌｉｃ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１５）７５：８８７．
【非特許文献4】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｖｏｌｕｍｅ ３３，Ｎｕｍｂｅｒ ７，Ｐａｇｅ １１９２Ｍ．Ｃ．Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｕ．Ｗｕｒｔｈｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．Ｍｏｒｌｅｙ
【非特許文献5】Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３：４４６－８
【非特許文献6】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ（１９９４）７：１１２９－３５．
【非特許文献7】Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）３４：１１２１－３１
【非特許文献8】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２４（９）：７２７ｔｅｉｎ，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の課題を解決する抗ヒトＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体（ナノ抗体）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、第１の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を提供する。当該抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３、又は、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３、又は、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３、又は、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３、又は、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３、又は、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３、を含む。
【0011】
好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、更にフレームワーク領域ＦＲをそれぞれ含む。前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示されるＦＲ１～ＦＲ４として、（１’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（２’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（３’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（４’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（５’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＦＲ４、又は（６’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＦＲ２、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、を含む。
ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、を含む。
【0012】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、（ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８のいずれかで示されるシングルドメイン抗体、或いは、（ｂ）アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８のいずれかで示される配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上）の同一性を有しており、且つ、（ａ）のシングルドメイン抗体の機能を有するシングルドメイン抗体、を含む。
【0013】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体はヒト化された抗体であり、好ましくは、そのフレームワーク領域ＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９～６１で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２～６４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で示されるＦＲ４、から選択されるアミノ酸配列のＦＲ１～ＦＲ４を含む。
【0014】
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１は、（１）～（６）のいずれかの前記シングルドメイン抗体のＦＲ１となる。
【0015】
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９で示されるＦＲ２は（１）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ２となり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０で示されるＦＲ２は（２）又は（５）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ２となり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１で示されるＦＲ２は、（３）、（４）又は（６）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ２となる。
【0016】
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２で示されるＦＲ３は（１）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ３となり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３で示されるＦＲ３は、（２）、（３）、（５）又は（６）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ３となり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４で示されるＦＲ３は（４）の前記シングルドメイン抗体のＦＲ３となる。
【0017】
別の好ましい例において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５で示されるＦＲ４は（１）～（６）のいずれかの前記シングルドメイン抗体のＦＲ４となる。
【0018】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体はヒト化抗体であり、（ｉ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４のいずれかで示されるシングルドメイン抗体、或いは、（ｉｉ）アミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４のいずれかで示される配列と８０％以上（例えば、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上）の同一性を有しており、且つ、（ｉ）のシングルドメイン抗体の機能を有するシングルドメイン抗体、を含む。
【0019】
本発明は、他の局面において、上述のシングルドメイン抗体である第１ドメインと、体内半減期を延長する作用及び／又はエフェクター細胞に対する結合作用を有する第２ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
【0020】
好ましい例において、前記第２ドメインは、好ましくはヒト免疫グロブリンＦｃ領域である免疫グロブリンＦｃ領域、及び／又は、血清アルブミン（例えば、ヒト由来のＨＳＡ）又はその断片、血清アルブミンと結合するドメイン（例えば、シングルドメイン抗体を含む抗血清アルブミン抗体）、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール－リポソーム複合体或いはそれらの組み合わせ、及び／又は、Ｔ細胞表面分子に対し親和性を有し、及び／又は、Ｔ細胞上に存在する表面分子と結合可能な分子、を含む（ただし、これらに限らない）。好ましくは、前記表面分子はＣＤ３を含む（ただし、これに限らない）。
【0021】
別の好ましい例において、前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれる。前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれる。
【0022】
別の好ましい例において、前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭのうちの１又は複数の組み合わせから選択される。また、前記ＩｇＧは、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のうちの１又は複数の組み合わせから選択される。
【0023】
別の好ましい例において、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５～４８のいずれかから選択される。
【0024】
別の好ましい例において、前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドが設置されている。前記連結ペプチドは、好ましくは、アラニン及び／又はセリン及び／又はグリシンからなる柔軟なポリペプチド鎖から選択され、連結ペプチドの長さは３～３０個の
アミノ酸であることが好ましい。
アミノ酸であることが好ましい。
【0025】
本発明は、他の局面において、上記いずれかのシングルドメイン抗体をコードするか、上記いずれかの融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【0026】
本発明は、他の局面において、前記分離したポリヌクレオチドを含む構造体を提供する。
【0027】
本発明は、他の局面において、抗体発現システムを提供する。前記発現システムは、上記の構造体、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれている上記のポリヌクレオチドを含む。好ましくは、前記発現システムは細胞発現システムである。
【0028】
別の好ましい例において、前記抗体の発現に適した条件において前記抗体発現システムを利用して発現を行うことにより、前記抗体又は融合タンパク質を発現し、好ましくは、更に、上記の抗体又は融合タンパク質を精製・分離することを含む。
【0029】
本発明は、他の局面において、（Ａ）上記いずれかのシングルドメイン抗体、又は上記いずれかの融合タンパク質と、（Ｂ）（Ａ）に連結される（共有結合、カップリング、付着、吸着を含むが、これらに限らない）機能性分子、を含む免疫複合体を提供する。
【0030】
別の好ましい例において、前記（Ｂ）は、細胞毒素、放射性同位体、生物活性タンパク質、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子又は検出可能マーカー、キメラ抗原受容体技術（ＣＡＲ）に基づく細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域、或いはそれらの組み合わせを含む（ただし、これらに限らない）。
【0031】
別の好ましい例において、前記腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、腫瘍表面マーカーに結合する抗体又はリガンドである。或いは、上記の腫瘍を抑制する分子は、抗腫瘍サイトカイン又は抗腫瘍毒素である。
【0032】
別の好ましい例において、前記サイトカインは、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａである（ただし、これらに限らない）。
【0033】
別の好ましい例において、前記検出可能マーカーは、例えば、蛍光マーカー、発色マーカーである（ただし、これらに限らない）。
【0034】
別の好ましい例において、上記の腫瘍表面マーカーに結合する抗体は、ＰＤ－Ｌ１以外のその他の抗原を識別する抗体である。上記のその他の抗原は、例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＨＥＲ２、ＥｐｈＡ２、Ｈｅｒ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＥＡ、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２、葉酸受容体、Ｃｌａｕｄｉｎ ６、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ ３、ＡＳＧＰＲ１又はＣＤＨ１６である（ただし、これらに限らない）。
【0035】
別の好ましい例において、上記の細胞内シグナル領域は、例えば、ＣＤ３ζ鎖、ＦｃεＲＩγチロシン活性化モチーフ、共刺激シグナル分子ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０等の細胞内シグナル領域である（ただし、これらに限らない）。或いは、前記膜貫通領域は、例えばＣＤ８又はＣＤ２８の膜貫通領域である（ただし、これらに限らない）。
【0036】
本発明は、他の局面において、薬物組成物（例えば診断用試薬といった診断用組成物を含む）を提供する。前記薬物組成物は、上記いずれかのシングルドメイン抗体、又は上記い
ずれかの融合タンパク質、又は上記いずれかの免疫複合体を含む。
ずれかの融合タンパク質、又は上記いずれかの免疫複合体を含む。
【0037】
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、更に、薬学的に許容可能なベクターを含む。
【0038】
本発明は、他の局面において、前記シングルドメイン抗体、前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体、又は前記薬物組成物の、癌の診断、治療又は予防のための製剤、試薬キット又は薬剤キットの製造における使用を提供する。
【0039】
別の好ましい例において、前記癌は、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌又は鼻咽頭癌、或いはそれらの組み合わせを含む。
【0040】
本発明は、他の局面において、前記シングルドメイン抗体、又は前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体、又は前記薬物組成物の、感染性疾患又は慢性炎症性疾患の治療又は予防における使用を提供する。
【0041】
本発明は、他の局面において、前記のシングルドメイン抗体、又は前記融合タンパク質、又は前記免疫複合体、又は前記薬物組成物を含む試薬キット又は薬剤キットを提供する。
【0042】
本発明のその他の面は、本文の開示内容から当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【0043】
【発明を実施するための形態】
【0044】
本発明の発明者は、幅広いスクリーニング及び詳細な研究の結果、特異的にＰＤ－Ｌ１に対抗し、且つＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用をブロックするシングルドメイン抗体を開示する。また、更に、前記シングルドメイン抗体に基づき製造されるヒト化抗体及び融合タンパク質を開示するとともに、それらの応用についても開示する。
【0045】
用語
本文中で使用する「プログラム細胞死リガンド１」、「ＰＤ－リガンド１」、「ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤＬ１」、「Ｂ７相同体１」、「Ｂ７－Ｈ１」、「ＣＤ２７４」との用語は互換的に使用可能であり、バリアント、アイソタイプ、ヒトＰＤ－Ｌ１の種相同体、及び、ＰＤ－Ｌ１と共通の少なくとも１つのエピトープを有する類似物を含む。
本文中で使用する「プログラム細胞死リガンド１」、「ＰＤ－リガンド１」、「ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤＬ１」、「Ｂ７相同体１」、「Ｂ７－Ｈ１」、「ＣＤ２７４」との用語は互換的に使用可能であり、バリアント、アイソタイプ、ヒトＰＤ－Ｌ１の種相同体、及び、ＰＤ－Ｌ１と共通の少なくとも１つのエピトープを有する類似物を含む。
【0046】
本文中において、「抗体」又は「免疫グロブリン」との用語は、重鎖抗体であるか通常の４本鎖抗体であるかに関わらず、いずれも一般的な用語として用いられ、全長抗体、その１つの鎖及び全ての部分、ドメイン又は断片（例えば、ＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインといった抗原結合ドメイン又は断片を含むがこれらに限らない）を含む。また、本
文中で使用する「配列」との用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語）は、本文中で更に限定的な解釈を要する場合を除き、一般的に、関連のアミノ酸配列を含むとともに、前記配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むと解釈すべきである。
文中で使用する「配列」との用語（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「単一可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語）は、本文中で更に限定的な解釈を要する場合を除き、一般的に、関連のアミノ酸配列を含むとともに、前記配列をコードする核酸配列又はヌクレオチド配列を含むと解釈すべきである。
【0047】
「モノクローナル抗体」との用語は、単一の分子で構成される抗体分子生成物を意味する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0048】
（ポリペプチド又はタンパク質の）「ドメイン」との用語は、タンパク質の折り畳み構造を意味し、タンパク質の残りの部分とは独立して三次構造を維持可能である。一般的に、ドメインは、タンパク質の単一の機能及び性質を司るものであり、様々な状況において、タンパク質のその他の部分及び／又はドメインの機能を損なうことなく、その他のタンパク質に対して添加、除去又は移植することが可能である。
【0049】
「シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）」との用語は、クローナル抗体における重鎖の可変領域のことであり、１つの重鎖可変領域のみからなるシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）が作製される。この抗体は、完全な機能を有する最小の抗原結合性断片である。通常は、アルパカの免疫血清から軽鎖及び重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を持たない天然の抗体を取得したあと、抗体の重鎖の可変領域をクローニングすることで、１つの重鎖可変領域のみからなるシングルドメイン抗体（ＶＨＨ）を作製する。
【0050】
「シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）」との用語は、当該分野及び以下の部分において、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」とそれぞれ称される４つの「フレームワーク領域」を含む免疫グロブリンドメインを意味する。前記フレームワーク領域は、当該分野及び以下の部分において、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」とそれぞれ称される３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」によって隔てられている。そのため、シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）の一般的な構造又は配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４で表すことができる。シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は抗原結合部位を有しているため、抗原に対する特異性が抗体に付与される。
【0051】
「重鎖シングルドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体断片」、「ＶＨＨ抗体」及び「ナノ抗体」との用語は互換的に使用可能である。
【0052】
「ＩＭＧＴナンバリングシステム」との用語は、ヒト及びその他の脊椎動物の免疫グロブリン（ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に特化した統合情報システムであって、ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）のことである（Ｌａｆｒａｎｃ等，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５ー７７）。ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ）にログインし、抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子を分析することで、可変領域のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＦＲ）及び相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲ）が特定される。免疫グロブリンの可変ドメイン構造内におけるＣＤＲの「位置」は種間において保守的であり、且つ、環と称される構造内に存在している。そのため、構造的特徴に基づき可変ドメイン配列を整列させたナンバリングシステムを使用することで、ＣＤＲとフレームの残基が容易に鑑定される。この情報は、任意の種に由来する免疫グロブリンのＣＤＲ残基を通
常のヒト由来抗体における受容体フレームに移植及び置換するために利用可能である。また、別途説明している場合を除き、本明細書、特許請求の範囲及び図面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、ＣＤＲ領域とＦＲ領域の特定のために、ＩＭＧＴナンバリングシステムの方法に従ってナンバリングしている。
常のヒト由来抗体における受容体フレームに移植及び置換するために利用可能である。また、別途説明している場合を除き、本明細書、特許請求の範囲及び図面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、ＣＤＲ領域とＦＲ領域の特定のために、ＩＭＧＴナンバリングシステムの方法に従ってナンバリングしている。
【0053】
「ヒト化抗体」との用語は、基本的にヒト以外の種に由来する免疫グロブリンの抗原結合部位を有する分子であって、前記分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列をベースとするものを意味する。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインを含んでいてもよいし、可変ドメインの適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでいてもよい。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１又は複数のアミノ酸を置換することで修飾してもよい。例えば、修飾によってヒト免疫グロブリンにいっそう類似させてもよい。ヒト化抗体の形式によっては、全てのＣＤＲ配列を維持している（例えば、アルパカ由来の３つ全てのＣＤＲを含むヒト化シングルドメイン抗体）。また、その他の形式としては、元の抗体から変異した１又は複数のＣＤＲを有するものがある。
【0054】
「タンパク質凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」との用語について：タンパク質の構造は、非共有結合性相互作用及び２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって安定する。非共有結合性相互作用には、イオン間相互作用及び弱いファンデルワールス相互作用が含まれる。イオン間相互作用は、アニオンとカチオンの間に形成されて塩橋を構成し、タンパク質の安定化に寄与する。これらは、タンパク質の二次構造において重要な役割を果たし、例えば、αヘリックス又はβシートや三次構造を形成する。また、特定のタンパク質におけるアミノ酸残基間の相互作用は、当該タンパク質の最終構造において非常に重要である。活性化タンパク質の工業製造でよく見られるように、生体外又は細胞外において、活性化タンパク質が置かれる環境（例えば、ｐＨ、濃度、イオン強度又は温度）が変化すると、アミノ酸間の非共有結合性相互作用に変化が生じる。これにより、１つのタンパク質分子における露出した疎水性部分が別のタンパク質分子における露出した疎水性領域と相互に作用することで、無定形の凝集体、オリゴマー及び高分子量の凝集物が形成される場合がある。凝集物は、活性化タンパク質の安定性に影響を及ぼす。生体内では、凝集物の形成によって免疫系の除去反応が容易に誘発され、薬物の除去が加速するとともに、有機体に免疫リスクをもたらす場合もある。
【0055】
２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、配列間における同一アミノ酸のパーセンテージを意味する。また、「配列類似性」とは、同一の、又は代表的な保守的アミノ酸で置換されたアミノ酸のパーセンテージを意味する。アミノ酸又はヌクレオチド間の配列同一性の度合を評価する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、アミノ酸配列の同一性については、通常は配列解析ソフトを用いて測定する。例えば、ＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴプログラムを用いて同一性を特定可能である。
【0056】
薬剤の「有効量」とは、その適用を受けた細胞又は組織における生理学的変化を引き起こすために必要な量のことである。
【0057】
例えば、薬物組成物のような薬剤の「治療有効量」とは、必須の投与量及び期間において所望の治療又は予防結果を効果的に実現するための量のことである。治療有効量の薬剤は、例えば、疾病による好ましくない作用を除去、低減、遅延、最小化又は予防する。
【0058】
「個体」又は「被験者」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜化した動物（例えば、雌牛、羊、猫、犬、馬）、霊長類（例えば、ヒト及びヒト以外のサルといった霊長類）、イエウサギ及び齧歯類（例えば、マウスやラット）が含まれるがこれらに限らない。好ましくは、前記個体又は被験者はヒトである。
【0059】
「薬物組成物」との用語は、その形式によって内部に含有される活性成分の生物学的活性が有効となり、且つ、当該組成物の適用を受ける被験者に許容不可能な毒性をもたらすその他の成分が含まれていない製剤を意味する。
【0060】
「薬学的に許容可能なベクター」とは、薬物組成物内の活性成分を除く被験者にとって無害の成分を意味する。薬学的に許容可能なベクターには、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤が含まれるが、これらに限らない。
【0061】
「治療／予防」との用語（及び、その語法的変形）は、個体の疾病を変化させ、治そうとする自然なプロセスのことであり、且つ、予防又は臨床病理学の過程で実施される臨床的介入とすることもできる。治療による所望の効果には、疾病の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾病に伴うあらゆる直接的又は間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾病の進行速度の低下、疾病状態の改善又は軽減、及び予後の除去又は改善が含まれるが、これらに限らない。いくつかの実施方案において、本発明の抗体は、疾病の形成遅延又は病症の進行緩和に用いられる。
【0062】
「検出可能マーカー」との用語は、抗体に接続可能であり、検出対象における特定標的の存在有無及び存在量を特定するために用いられるマーカーを意味する。前記「検出可能マーカー」は、酵素、蛍光標識、核種、量子ドット、金コロイド等とすることができるが、これらに限らない。より具体的には、例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、β-Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、又はグルコアミラーゼから選択可能である。
【0063】
本発明において、前記癌又は腫瘍は、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌又は鼻咽頭癌等を含むとともに、それらの組み合わせを含み、且つ、それらの転移性腫瘍又は合併症も含む（但し、これらに限らない）。
【0064】
シングルドメイン抗体
本発明は、第１の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を提供する。前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３、又は、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３、又は、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３、又は、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３、又は、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３、又は、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３、を含む。
本発明は、第１の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体を提供する。前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の相補性決定領域ＣＤＲは、アミノ酸配列で示されるＣＤＲ１～ＣＤＲ３として、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で示されるＣＤＲ３、又は、（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で示されるＣＤＲ３、又は、（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で示されるＣＤＲ３、又は、（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で示されるＣＤＲ３、又は、（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で示されるＣＤＲ３、又は、（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で示されるＣＤＲ３、を含む。
【0065】
本発明で提供する抗ＰＤ－Ｌ１抗原のシングルドメイン抗体は、フレームワーク領域ＦＲを含み得る。前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列で示されるＦＲ１～ＦＲ４として、（１’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（２’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（３’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（４’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（５’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＦＲ４、又は（６’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、を含む。
１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（３’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（４’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、又は（５’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で示されるＦＲ４、又は（６’）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で示されるＦＲ４、を含む。
【0066】
通常、抗体の抗原結合特性は、３つ相補性決定領域ＣＤＲにより決定される。前記ＣＤＲ領域とＦＲ領域は規則的に配列されており、ＦＲ領域が結合反応に直接関与することはない。これらのＣＤＲは環状構造を形成している。ＣＤＲは、これらの間のＦＲが形成するβシートを通じて空間構造内で互いに近接し、抗体の抗原結合部位を構成する。ＣＤＲ領域は免疫学が関心を寄せるタンパク質の配列であり、本発明の抗体のＣＤＲ領域は完全に新規なものである。
【0067】
本発明で提供する抗ＰＤ－Ｌ１抗原のシングルドメイン抗体におけるアミノ酸配列としては、ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８のいずれかで示されるアミノ酸配列、或いは、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３～３８のいずれかと８０％以上の配列同一性を有するものであって、ａ）で限定したアミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列、を含み得る。具体的に、前記ｂ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３～３８のいずれかで示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠損、又は添加を経て得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に対し１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができる）のアミノ酸を添加するか減少させることで得られるものであって、且つ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３～３８のいずれかで示されるアミノ酸からなるポリペプチド断片の機能を有するポリペプチド断片であり、例えば、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合能力を有している。上記ｂ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３～３８のいずれかと８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の相同性を有している。本発明で提供する抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合可能であり、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用をブロック可能である。また、Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２の発現を上昇させることができ、且つ、腫瘍の成長を抑制することも可能である。
【0068】
本発明で提供する抗ＰＤ－Ｌ１抗原のシングルドメイン抗体はヒト化抗体とすることができる。前記ヒト化シングルドメイン抗体は、少なくとも１つの抗体の機能特性を保持可能であり、例えば、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的結合能力、或いは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用をブロックする機能を有している。本発明における特定の相補性決定領域を応用することをベースに、当該分野の技術に基づいて設計されるヒト化抗体はいずれも本発明に含まれるものとする。
【0069】
本発明の好ましい方式において、本発明の発明者は、ラクダ科から入手した天然由来のシングルドメイン抗体をヒト化改変することで、薬物の安全性を更に向上させるとともに、抗体の免疫原性を効果的に低下させた。完全にヒト化した重鎖抗体は、往々にして溶解性に劣り、タンパク質が凝集するとの課題に直面することで、実際の臨床応用が不可能となる。シングルドメイン抗体のヒト化改変に起因する溶解度の低下は、天然由来のモノクローナル抗体では対になっている軽鎖がＶＨドメインから欠如するためと考えられる（Ｆｒ
ｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７Ｎｏｖ ２２；８：１６０３）。これに対し、本発明で得られるフレームワーク領域を改変したヒト化抗体は、高い溶解度を維持したままであるため、実際の臨床応用が可能となる。本発明の具体的実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化シングルドメイン抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４で示される。
ｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７Ｎｏｖ ２２；８：１６０３）。これに対し、本発明で得られるフレームワーク領域を改変したヒト化抗体は、高い溶解度を維持したままであるため、実際の臨床応用が可能となる。本発明の具体的実施形態において、前記抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化シングルドメイン抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４で示される。
【0070】
融合タンパク質
本発明は、第２の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体の第１ドメインと、体内半減期を延長するために用いられ、及び／又は、エフェクター細胞に対する結合作用を有する第２ドメインを含む。前記融合タンパク質は、結合分子とすることができる。前記結合分子は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞と特異的に結合可能である。
本発明は、第２の局面において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の融合タンパク質を提供する。当該融合タンパク質は、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体の第１ドメインと、体内半減期を延長するために用いられ、及び／又は、エフェクター細胞に対する結合作用を有する第２ドメインを含む。前記融合タンパク質は、結合分子とすることができる。前記結合分子は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞と特異的に結合可能である。
【0071】
前記第２ドメインにおいて、体内半減期を延長するために用いられる断片は、血清アルブミン又はその断片、ポリエチレングリコール、血清アルブミンと結合するドメイン（例えば、抗血清アルブミンのシングルドメイン抗体）、ポリエチレングリコール－リポソーム複合体等を含み得る。また、前記第２ドメインにおけるエフェクター細胞に対して結合作用を有する断片は免疫グロブリンＦｃ領域等を含むことができ、好ましくは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域から選択する。前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異が含まれる。前記エフェクター機能には、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性のうちの１又は複数の組み合わせが含まれる。前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等のうちの１又は複数の組み合わせから選択可能である。前記ＩｇＧは、具体的に、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４等のうちの１又は複数の組み合わせから選択可能である。シングルドメイン抗体の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域によって、前記融合タンパク質の二量体化が可能になるとともに、前記融合タンパク質の体内半減期が延長され、且つＦｃ媒介性の関連活性が増大する。本発明の具体的実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とすることができ、より具体的には、野生型ＩｇＧ１のＦｃ配列とすることができる。前記配列には、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を変化させる突然変異を導入可能である。例えば、ａ）Ｆｃ媒介性のＣＤＣ活性を変化させる突然変異、ｂ）Ｆｃ媒介性のＡＤＣＣ活性を変化させる突然変異、或いは、ｃ）Ｆｃ媒介性のＡＤＣＰ活性を変化させる突然変異、を導入可能である。この種の突然変異については、下記の文献に記載されている。
【0072】
Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８，２０：４６０－４７０
Ｅｓｏｈｅ Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００，１６４：４１７８－４１８４
ＲＡＰＨＡＥＬ Ａ．ＣＬＹＮＥＳ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｎｕｍｂｅｒ ４：４４３－４４６
Ｐａｕｌ Ｒ．Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，１７６：３４６－３５６
Ｅｓｏｈｅ Ｅ．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００，１６４：４１７８－４１８４
ＲＡＰＨＡＥＬ Ａ．ＣＬＹＮＥＳ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０００，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｎｕｍｂｅｒ ４：４４３－４４６
Ｐａｕｌ Ｒ．Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６，１７６：３４６－３５６
【0073】
本発明の別の具体的実施形態において、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５～４８のいずれかから選択される。
【0074】
本発明で提供する抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の融合タンパク質において、前記第１ドメインと第２ドメインの間には連結ペプチドを設置可能である。前記連結ペプチドは
、アラニン（Ａ）及び／又はセリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）からなる柔軟なポリペプチド鎖とすることができる。連結ペプチドの長さは３～３０個のアミノ酸とすればよく、好ましくは、３～９個、９～１２個、１２～１６個、１６～２０個とする。本発明の別の具体的実施形態において、連結ペプチドの長さは８個又は１５個とすることができる。
、アラニン（Ａ）及び／又はセリン（Ｓ）及び／又はグリシン（Ｇ）からなる柔軟なポリペプチド鎖とすることができる。連結ペプチドの長さは３～３０個のアミノ酸とすればよく、好ましくは、３～９個、９～１２個、１２～１６個、１６～２０個とする。本発明の別の具体的実施形態において、連結ペプチドの長さは８個又は１５個とすることができる。
【0075】
分離したポリヌクレオチド
本発明は、第３の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体をコードするか、本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ等とすることができる。前記分離したポリヌクレオチドを提供する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、ＤＮＡの自動合成及び／又は組換えＤＮＡ技術等で作製して取得してもよいし、適切な天然源から分離してもよい。
本発明は、第３の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体をコードするか、本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ等とすることができる。前記分離したポリヌクレオチドを提供する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、ＤＮＡの自動合成及び／又は組換えＤＮＡ技術等で作製して取得してもよいし、適切な天然源から分離してもよい。
【0076】
構造体
本発明は、第４の局面において、構造体を提供する。前記構造体は、本発明の第３の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。前記構造体の作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記構造体は、生体外組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、生体内組換え技術等の方法で作製して取得可能であり、より具体的には、前記分離したポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで作製可能である。本発明における発現ベクターは、通常、当該分野において熟知されている市販の各種発現ベクター等のことであり、例えば、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、又はその他のベクターとすることができる。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１又は複数の調節配列を含んでもよい。また、前記調節配列は適切なプロモーター配列を含むことができる。通常、プロモーター配列は、発現されるアミノ酸配列のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。また、調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列を含むことができる。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である
本発明は、第４の局面において、構造体を提供する。前記構造体は、本発明の第３の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。前記構造体の作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記構造体は、生体外組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、生体内組換え技術等の方法で作製して取得可能であり、より具体的には、前記分離したポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで作製可能である。本発明における発現ベクターは、通常、当該分野において熟知されている市販の各種発現ベクター等のことであり、例えば、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、又はその他のベクターとすることができる。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチド配列に操作的に連結される１又は複数の調節配列を含んでもよい。また、前記調節配列は適切なプロモーター配列を含むことができる。通常、プロモーター配列は、発現されるアミノ酸配列のコード配列に操作的に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれのヌクレオチド配列としてもよく、突然変異したもの、切断されたもの、及び雑種プロモーターを含む。且つ、当該宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から取得可能である。また、調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり、宿主細胞により識別されることで転写を終結させる配列を含むことができる。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に連結される。選択された宿主細胞において機能を有するあらゆるターミネーターを本発明に適用可能である
【0077】
通常、適切なベクターは、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、及び１又は複数の選択可能なマーカーを含むことができる。例えば、これらのプロモーターには、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、真核プロモーター（ＣＭＶ主要前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ピキア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターを含む）、及びその他の既知の制御可能な遺伝子が原核又は真核細胞或いはそのウイルス内で発現するプロモーターが含まれ得るが、これらに限らない。マーカー遺伝子は、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型及び性状を提供するために使用可能である。例えば、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、或いは、大腸菌に用いられるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等が含まれ得るが、これらに限らない。前記ポリヌクレオチドを発現する場合には、発現ベクターにエンハンサー配列を含んでもよい。ベクターにエンハンサー配列を挿入すれば、転写が強化される。エンハンサー
はＤＮＡのシスエレメントであり、通常は約１０～３００個の塩基対を有している。エンハンサーがプロモーターに作用することで、遺伝子の転写が強化される。
はＤＮＡのシスエレメントであり、通常は約１０～３００個の塩基対を有している。エンハンサーがプロモーターに作用することで、遺伝子の転写が強化される。
【0078】
発現システム
本発明は、第５の局面において、抗体の発現システムを提供する。前記発現システムは、本発明の第４の局面で提供した構造体、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれている本発明の第３の局面で提供したポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの発現に適用されるあらゆる細胞は、いずれも宿主細胞となり得る。例えば、前記宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、或いは、酵母細胞のような下等真核細胞、或いは、哺乳類細胞のような高等真核細胞とすることができる。具体的には、大腸菌、ストレプトマイセス属、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母、糸状真菌、植物細胞）、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞、或いはＢｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞の動物細胞等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記発現システムを作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。
本発明は、第５の局面において、抗体の発現システムを提供する。前記発現システムは、本発明の第４の局面で提供した構造体、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれている本発明の第３の局面で提供したポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの発現に適用されるあらゆる細胞は、いずれも宿主細胞となり得る。例えば、前記宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、或いは、酵母細胞のような下等真核細胞、或いは、哺乳類細胞のような高等真核細胞とすることができる。具体的には、大腸菌、ストレプトマイセス属、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、真菌細胞（例えば、酵母、糸状真菌、植物細胞）、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞、或いはＢｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞の動物細胞等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。前記発現システムを作製する方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等のうちの１又は複数の組み合わせを含むものとできるが、これらに限らない。
【0079】
免疫複合体
本発明は、第６の局面において、免疫複合体を提供する。前記免疫複合体は、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質を含む。通常、前記免疫複合体は、更に、前記シングルドメイン抗体の融合タンパク質に連結される（共有結合、カップリング、付着、吸着を含むがこれらに限らない）機能性分子を含む。前記機能性分子は、検出可能マーカー、細胞毒素、放射性同位体、生物活性タンパク質、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子等、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。
本発明は、第６の局面において、免疫複合体を提供する。前記免疫複合体は、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質を含む。通常、前記免疫複合体は、更に、前記シングルドメイン抗体の融合タンパク質に連結される（共有結合、カップリング、付着、吸着を含むがこれらに限らない）機能性分子を含む。前記機能性分子は、検出可能マーカー、細胞毒素、放射性同位体、生物活性タンパク質、腫瘍表面マーカーを標的とする分子、腫瘍を抑制する分子、免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子等、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限らない。
【0080】
前記免疫複合体の作製方法は、当業者にとって既知のものとする。例えば、前記シングルドメイン抗体及び／又は融合タンパク質を、直接的に、又は適切な長さのスペーサーを介して機能性分子と連結可能である。連結方式は、化学架橋又は遺伝子工学による融合発現とすればよく、これにより前記免疫複合体が得られる。
【0081】
治療を目的とする場合には、例えば放射性グループのような治療エフェクターグループが適切な場合がある。これらの放射性グループは、放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１ｌｎ、１２３ｌ、１２５ｌ、１３１ｌ、２０１ＴＩ、２１３Ｂｉ）、毒素、或いは、細胞傷害性グループ（例えば、細胞増殖阻害剤）から構成されるか、そのグループを含む。
【0082】
前記免疫複合体は、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、及び検出可能マーカーを含み得る。前記検出可能マーカーには、例えば、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、陽電子放出金属及び非放射性常磁性金属イオンといった蛍光マーカー、発色マーカー、タンパク質マーカーが含まれる（ただし、これらに限らない）。また、１つ以上のマーカーを含んでもよい。検出及び／又は分析及び／又は診断を目的とした抗体を標識するマーカーは、使用する特定の検出／分析／診断技術及び／又は方法（例えば、免疫組織化学染色の（組織）サンプル、フローサイトメトリー技術等）に依存する。当該分野において既知の検出／分析／診断技術及び／又は方法にとって適切なマーカーを当業者は熟知している。
【0083】
本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質は、マーカーグループ（マーカーのポリペプチド）と連結可能であり、その後、例えば診断目的にこれを使用可能である。適切なマーカーグループは、放射性同位体（例えば、上記で提示したもの）、或いは、放射性同位体、放射性核種を含むグループ、蛍光グループ（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光タンパク質、染料、ローダミン、フルオレセイン及びその誘導体（例えばＦＩＴＣ）、アントシアニジンなど）、酵素グループ（例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ）、化学発光グループ、ビオチングループ、金属粒子（例えば、金粒子）、磁性粒子（例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）及び／又は磁気赤鉄鉱（Ｆｅ２Ｏ３）を含む核を有する）、所定のポリペプチドグループ等から選択可能である。
【0084】
前記免疫複合体は、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、及び免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子を含み得る。前記免疫細胞の表面マーカーを標的とする分子は免疫細胞を識別可能であり、本発明の抗体を免疫細胞に到達させる。且つ、本発明の抗体は、免疫細胞を腫瘍細胞にターゲティングすることが可能である。これにより、本発明の抗体の殺傷効果を利用するとともに、免疫細胞による特異的な腫瘍殺傷を誘発する。
【0085】
前記免疫複合体は、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、及び、腫瘍表面マーカーを標的とする少なくとも１つの分子又は腫瘍を抑制する分子を含み得る。上記の腫瘍を抑制する分子は、抗腫瘍サイトカイン又は抗腫瘍毒素である。例えば、前記サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＦＮ－ｂｅｔａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ等とすることができる（ただし、これらに限らない）。また、上記の腫瘍表面マーカーを標的とする分子は、例えば、本発明の抗体と連携して作用し、いっそう精確に腫瘍細胞を標的可能とする。
【0086】
前記免疫複合体は、キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）としてもよい。前記キメラ抗原受容体は免疫細胞に発現可能である。上記の「免疫細胞」及び「免疫エフェクター細胞」は互換的に使用可能であり、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞等を含み、好ましくは、ＮＫ細胞及びＴ細胞とする。前記キメラ抗原受容体は、一般的に、順に連結される細胞外結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含み、前記細胞外結合領域に本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質が含まれる。ＣＡＲ技術に基づく膜貫通領域及び細胞内シグナル領域の設計は、当該分野において公知である。例えば、膜貫通領域には、ＣＤ８、ＣＤ２８等の分子の膜貫通領域を使用し、細胞内シグナル領域には、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のＣＤ３ζ鎖又はＦｃεＲＩγチロシン活性化モチーフ及び共刺激シグナル分子ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＭｙＤ８８、ＣＤ４０等の細胞内シグナル領域を使用する。より具体的に、Ｔ細胞について、細胞内シグナル領域にＩＴＡＭのみが含まれるものは第１世代ＣＡＲ Ｔ細胞である。このキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ－ＴＭ－ＩＴＡＭの形式で連結されて、抗腫瘍細胞傷害性効果を活性化可能である。一方、第２世代ＣＡＲ Ｔ細胞には、ＣＤ２８又はＣＤ１３７（別名４－１ＢＢ）の細胞内シグナル領域が加えられている。このキメラ抗原受容体の各部分は、ｓｃＦｖ－ＴＭ－ＣＤ２８－ＩＴＡＭ又はｓｃＦｖ－ＴＭ－／ＣＤ１３７－ＩＴＡＭの形式で連結される。細胞内シグナル領域に発生するＢ７／ＣＤ２８或いは４－１ＢＢＬ／ＣＤ１３７の共刺激作用によって、Ｔ細胞の持続的増殖が誘発される。且つ、Ｔ細胞によるＩＬ－２やＩＦＮ－γ等のサイトカインの分泌レベルを上昇可能になるとともに、生体内におけるＣＡＲ Ｔのライフサイクル及び抗腫瘍効果が向上する。また、第３世代ＣＡＲ Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体の各部分が、ｓｃＦｖ－ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ１３７－ＩＴＡＭ、或いは、ｓｃＦｖ－ＴＭ－ＣＤ２８－ＣＤ１３４－ＩＴＡＭの形式で連結されて、生体内におけるＣＡＲ Ｔのライフサイクル及び抗腫瘍効果が更に向上する。
【0087】
上記に基づき、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質を利用して製造されるキメラ抗原受容体は、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、ＣＤ８及びＣＤ３ζ、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、ＣＤ８、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζ、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、ＣＤ２８分子の膜貫通領域（ＣＤ２８ａ）、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域（ＣＤ２８ｂ）及びＣＤ３ζ、或いは、本発明のシングルドメイン抗体又は融合タンパク質、ＣＤ２８分子の膜貫通領域、ＣＤ２８分子の細胞内シグナル領域、ＣＤ１３７及びＣＤ３ζ、の順序で連結される細胞外結合領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル領域を含む。
【0088】
当該キメラ抗原受容体を免疫エフェクター細胞の表面に発現させることで、本発明の抗体の殺傷効果を利用するとともに、免疫エフェクター細胞に、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対する高度な特異的細胞傷害性作用を持たせることが可能となる。
【0089】
薬物組成物
本発明は、第７の局面において、本発明の第１の局面で提供した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む薬物組成物を提供する。
本発明は、第７の局面において、本発明の第１の局面で提供した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む薬物組成物を提供する。
【0090】
前記薬物組成物は、更に、当該分野において薬学的に許容可能な各種ベクターを含むことができる。薬学的に許容可能なベクターとは、使用する投与量及び濃度が適用者にとって無害なものであり、具体的には、緩衝剤（例えば、アセテート、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸）、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）、防腐剤（例えば、ベンジルジメチルオクタデシルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸炭化水素基エステル、（例えば、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル又はｐ－ヒドロキシ安息香酸酢酸プロピル）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタンアルコール、ｍ－クレゾール）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン）、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、張度調節剤（例えば、トレハロースや塩化ナトリウム）、糖類（例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、塩対イオン（例えばナトリウム）、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、及び／又は、非イオン界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ、登録商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むものとできるが、これに限らない。また、生体内に適用する製剤は一般的に無菌である。製剤の無菌化を実現する方法は当業者にとって既知のものとし、例えば、滅菌用フィルターによる濾過等の方法で実現すればよい。更に、当業者は、薬物組成物に求められる剤形に応じて適切な薬学的に許容可能なベクターを選択することで、異なる剤形に製造することが可能である。例えば、本発明の薬物組成物は、タブレット、注射剤、凍結乾燥剤等の各種剤形を含み得るが、これらに限らない。
【0091】
前記薬物組成物において、通常、前記融合タンパク質及び免疫複合体の含有量は有効量とする。また、前記有効量に対応する活性成分の含有量は、治療の対象及び特定の投与方式に基づき決定可能である。例えば、薬物組成物の総質量で算出する場合、前記融合タンパク質及び免疫複合体の含有量の範囲は、約０．０１～９９％、０．１～７０％、１～３０
％、０．０１～０．０５％、０．０５～０．１％、０．１～０．３％、０．３～０．５％、０．５～１％、１～３％、３～５％、５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～５０％、５０～７０％又は７０～９９％とすればよい。
％、０．０１～０．０５％、０．０５～０．１％、０．１～０．３％、０．３～０．５％、０．５～１％、１～３％、３～５％、５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～５０％、５０～７０％又は７０～９９％とすればよい。
【0092】
本発明の融合タンパク質、免疫複合体及び薬物組成物は、単一の有効成分として適用してもよいし、併用療法において適用してもよい。即ち、その他の薬剤と併用してもよい。例えば、前記併用療法では、前記融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物をその他の少なくとも１つの抗腫瘍薬と併用することが可能である。また、例えば、前記併用療法では、前記融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物を、その他の腫瘍特異性抗原を標的とする抗体と併用することが可能である。上記のその他の腫瘍特異性抗原を標的とする抗体には、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、又は抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８Ａ２抗体等のうちの１又は複数の組み合わせが含まれる（ただし、これらに限らない）。好ましくは、前記阻害剤はモノクローナル抗体とすることができる。
【0093】
検出用試薬キット
本発明は、第８の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む検出用試薬キットを提供する。前記試薬キットは、必要に応じて、容器、対照物（陰性又は陽性対照）、緩衝剤、助剤等を更に含んでもよく、当業者は、具体的状況に応じてこれらを選択可能である。また、前記試薬キットは、当業者が操作しやすいように、取扱説明書を含んでもよい。
本発明は、第８の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体を含む検出用試薬キットを提供する。前記試薬キットは、必要に応じて、容器、対照物（陰性又は陽性対照）、緩衝剤、助剤等を更に含んでもよく、当業者は、具体的状況に応じてこれらを選択可能である。また、前記試薬キットは、当業者が操作しやすいように、取扱説明書を含んでもよい。
【0094】
本発明は、更に、前記シングルドメイン抗体を利用してＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出する検出方法を提供する。当該検出方法には、定性的検出、定量的検出及び位置特定検出が含まれるが、これらに限らない。具体的に、前記検出方法には、免疫蛍光測定、免疫組織化学及び放射免疫測定等が含まれるが、これらに限らない。
【0095】
サンプル中にＰＤ－Ｌ１タンパク質が存在するか否かを検出する方法には、以下が含まれ得る。即ち、サンプルを本発明のシングルドメイン抗体に接触させて、抗体複合体が形成されたか否かを観察する。そして、抗体複合体が形成されていれば、サンプル中にＰＤ－Ｌ１タンパク質が存在することを意味する。前記サンプルは、細胞及び／又は組織サンプルとすることができる。サンプルは媒体中に固定又は溶解可能であり、上記の固定又は溶解したサンプル中のＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルを検出する。いくつかの実施形態において、検出対象は、細胞保存液中に存在する細胞含有サンプルとすることができる。別のいくつかの実施形態において、前記シングルドメイン抗体には、更に、検出に使用可能であるか、その他の試薬により検出可能な蛍光染料、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、タグ等が組み合わされている。
【0096】
使用
本発明は、第９の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体、又は本発明の第８の局面で提供した薬物組成物の、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に関連する疾病の診断、治療又は予防における使用を提供する。
本発明は、第９の局面において、本発明の第１の局面で提供したシングルドメイン抗体、又は本発明の第２の局面で提供した融合タンパク質、又は本発明の第６の局面で提供した免疫複合体、又は本発明の第８の局面で提供した薬物組成物の、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に関連する疾病の診断、治療又は予防における使用を提供する。
【0097】
本発明で提供する融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物の「治療有効量」は、好ましくは、疾病症状の重大性の低下、疾病の無症状期の頻度及び継続時間の増加、或いは、疾病の苦痛に伴う傷害又は機能喪失の防止をもたらす。例えば、ＰＤ－Ｌ１関連腫瘍の治療（例えば黒色腫を含む）の場合、未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましく
は、細胞の成長又は腫瘍の成長を少なくとも約１０％抑制する。また、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約３０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％抑制する。腫瘍の成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するための動物モデルシステムで評価可能である。或いは、細胞の成長を抑制する能力を検査することで評価してもよい。このような抑制は、当業者にとって公知の実験を通じて生体外で測定可能である。治療有効量の融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物によって、通常は、腫瘍の大きさを縮小することが可能である。或いは、その他の方式で対象の症状を緩和することができる。当業者は、例えば、対象の大きさ、対象の症状の重大性、及び選択した特定の組成物又は投与経路といった実際の状況に応じて適切な治療有効量を選択すればよい。治療の処方（例えば、投与量の決定等）は医師により定められる。また、通常考慮する要因には、治療しようとする疾病、患者の個別の状況、送達部位、適用方法及びその他の要因等が含まれるがこれらに限らない。また、予防有効量とは、必須の投与量及び時間内で効果的に所望の予防効果が実現される量のことである。通常（必然ではない）、予防投与量は疾病の発症前又は疾病の初期に被験者に用いられるため、「予防有効量」は一般的に「治療有効量」よりも低くなる。本発明において、診断、治療及び／又は予防可能なＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に関連する疾病の実施例には、ＰＤ－Ｌ１を発現する全ての癌及び固形腫瘍が含まれ得る。具体的には、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌と鼻咽頭癌を含み得るが、これらに限らない。また、これらの癌は、初期、中期又は末期とすることができ、例えば転移癌とすることができる。
は、細胞の成長又は腫瘍の成長を少なくとも約１０％抑制する。また、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約３０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％抑制する。腫瘍の成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するための動物モデルシステムで評価可能である。或いは、細胞の成長を抑制する能力を検査することで評価してもよい。このような抑制は、当業者にとって公知の実験を通じて生体外で測定可能である。治療有効量の融合タンパク質、免疫複合体、薬物組成物によって、通常は、腫瘍の大きさを縮小することが可能である。或いは、その他の方式で対象の症状を緩和することができる。当業者は、例えば、対象の大きさ、対象の症状の重大性、及び選択した特定の組成物又は投与経路といった実際の状況に応じて適切な治療有効量を選択すればよい。治療の処方（例えば、投与量の決定等）は医師により定められる。また、通常考慮する要因には、治療しようとする疾病、患者の個別の状況、送達部位、適用方法及びその他の要因等が含まれるがこれらに限らない。また、予防有効量とは、必須の投与量及び時間内で効果的に所望の予防効果が実現される量のことである。通常（必然ではない）、予防投与量は疾病の発症前又は疾病の初期に被験者に用いられるため、「予防有効量」は一般的に「治療有効量」よりも低くなる。本発明において、診断、治療及び／又は予防可能なＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に関連する疾病の実施例には、ＰＤ－Ｌ１を発現する全ての癌及び固形腫瘍が含まれ得る。具体的には、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部癌と鼻咽頭癌を含み得るが、これらに限らない。また、これらの癌は、初期、中期又は末期とすることができ、例えば転移癌とすることができる。
【0098】
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書で開示する内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
【0099】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らないと解釈すべきである。また、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。
【0100】
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者により一般的に理解される意味と等しい。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【0101】
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術については、従来の文献で十分に説明されている。
【0102】
実施例１、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体ライブラリの作製
ＰＤＬ１の細胞外領域の配列とヒト血清アルブミンの配列で構成される融合タンパク質Ｐ
ＤＬ１－ＨＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）を１ｍｇと、１ｍｌの完全フロイントアジュバント（シグマ社）を混合して乳化し、健康なアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａｐａｃｏｓ）を免疫した。そして、２１日後に再び免疫し、合計で３回の免疫を行うことで、Ｂ細胞を刺激して抗原特異性のシングルドメイン抗体を発現させた。３回の免疫から１週間後に、真空採血管でアルパカの血液を３０ｍｌ採取し、リンパ球分離溶液（天津市▲ハウ▼洋華科生物科技有限公司）を用いてリンパ球を分離してから、Ｔｒｉｚｏｌ法でトータルＲＮＡを抽出した。次に、逆転写試薬キット（インビトロジェン社）を用い、説明書に従って３μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するとともに、ネステッドＰＣＲを用いてＶＨＨを増幅させた。そして、ターゲットとするＶＨＨ核酸断片を回収し、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）で切断してから、同様に切断したファージディスプレイ用ベクターｐｃｏｍｂ３ｘｓｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド＃６３８９０、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿６３８９０）に挿入するとともに、Ｔ４リガーゼ（タカラ社）を用いてライゲーションした。続いて、ライゲーション産物をエレクトロコンピテントセルＥＲ２７３８に形質転換することで、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体ライブラリを作製した。また、段階希釈プレーティングによって、ライブラリ容量の大きさが１．２５×１０８であることを測定した。且つ、２４個のクローンをランダムに抜き取ってコロニーＰＣＲ検出を行ったところ、結果より、作製したライブラリの挿入率は１００％であることが明らかとなった。
ＰＤＬ１の細胞外領域の配列とヒト血清アルブミンの配列で構成される融合タンパク質Ｐ
ＤＬ１－ＨＳＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）を１ｍｇと、１ｍｌの完全フロイントアジュバント（シグマ社）を混合して乳化し、健康なアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａｐａｃｏｓ）を免疫した。そして、２１日後に再び免疫し、合計で３回の免疫を行うことで、Ｂ細胞を刺激して抗原特異性のシングルドメイン抗体を発現させた。３回の免疫から１週間後に、真空採血管でアルパカの血液を３０ｍｌ採取し、リンパ球分離溶液（天津市▲ハウ▼洋華科生物科技有限公司）を用いてリンパ球を分離してから、Ｔｒｉｚｏｌ法でトータルＲＮＡを抽出した。次に、逆転写試薬キット（インビトロジェン社）を用い、説明書に従って３μｇのトータルＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するとともに、ネステッドＰＣＲを用いてＶＨＨを増幅させた。そして、ターゲットとするＶＨＨ核酸断片を回収し、制限酵素ＳｆｉＩ（ＮＥＢ社）で切断してから、同様に切断したファージディスプレイ用ベクターｐｃｏｍｂ３ｘｓｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ プラスミド＃６３８９０、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿６３８９０）に挿入するとともに、Ｔ４リガーゼ（タカラ社）を用いてライゲーションした。続いて、ライゲーション産物をエレクトロコンピテントセルＥＲ２７３８に形質転換することで、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体ライブラリを作製した。また、段階希釈プレーティングによって、ライブラリ容量の大きさが１．２５×１０８であることを測定した。且つ、２４個のクローンをランダムに抜き取ってコロニーＰＣＲ検出を行ったところ、結果より、作製したライブラリの挿入率は１００％であることが明らかとなった。
【0103】
実施例２、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のスクリーニング及び鑑定
２．１ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のスクリーニング
作製したＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体ライブラリをヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ社）でパッケージングして、ディスプレイライブラリである組換えファージの力価を測定したところ、２．８８×１０１３ＰＦＵ／ｍｌであった。次に、ＰＤＬ１－ＨＳＡを１００ｍＭのＮａＨＣＯ３ ｐ８．２のコーティングバッファで２μｇ／ｍｌまで希釈した。これをＥＬＩＳＡ用プレートに１００μＬ／ウェルで加えてコーティングし、４℃で一晩放置した。２日目に、２００μＬの３％ＢＳＡを加えて３７℃で１ｈブロッキングしたあと、１００μＬの組換えファージを加えて（約２．８８×１０１１ＰＦＵ／ウェル、実施例１で作製したライブラリから取得）、室温で１ｈ作用させた。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中に０．１％ツイン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有）を用いて５回洗浄し、非特異的結合のファージを除去した。次に、洗浄したＥＬＩＳＡウェルを１ｍｌの０．１Ｍ ｇｌｙ－ＨＣｌ １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ２．２）緩衝液で１０分間インキュベートし、溶出してから、１Ｍ ｐＨ ８．０Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。続いて、ファージの力価を測定したところ、力価は５．２５×１０６ＰＦＵ／ｍｌであった。そこで、前記ファージ溶出液を増幅させて測定したところ、力価は１．３×１０１３ＰＦＵ／ｍｌとなった。続いて、ＰＤ－Ｌ１の細胞外領域の配列とヒトＩｇＧ１ ＦＣで構成される融合タンパク質ＰＤＬ１－ＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）をコートタンパク質として、３％オボアルブミン（ＯＶＡ）でブロッキングした。そして、同様のスクリーニング過程で２回目のスクリーニングを行った。２回目のエルトリエーションにおけるファージの力価を測定したところ、結果は２．５４×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
２．１ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のスクリーニング
作製したＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体ライブラリをヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（ＮＥＢ社）でパッケージングして、ディスプレイライブラリである組換えファージの力価を測定したところ、２．８８×１０１３ＰＦＵ／ｍｌであった。次に、ＰＤＬ１－ＨＳＡを１００ｍＭのＮａＨＣＯ３ ｐ８．２のコーティングバッファで２μｇ／ｍｌまで希釈した。これをＥＬＩＳＡ用プレートに１００μＬ／ウェルで加えてコーティングし、４℃で一晩放置した。２日目に、２００μＬの３％ＢＳＡを加えて３７℃で１ｈブロッキングしたあと、１００μＬの組換えファージを加えて（約２．８８×１０１１ＰＦＵ／ウェル、実施例１で作製したライブラリから取得）、室温で１ｈ作用させた。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中に０．１％ツイン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有）を用いて５回洗浄し、非特異的結合のファージを除去した。次に、洗浄したＥＬＩＳＡウェルを１ｍｌの０．１Ｍ ｇｌｙ－ＨＣｌ １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（ｐＨ２．２）緩衝液で１０分間インキュベートし、溶出してから、１Ｍ ｐＨ ８．０Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで中和した。続いて、ファージの力価を測定したところ、力価は５．２５×１０６ＰＦＵ／ｍｌであった。そこで、前記ファージ溶出液を増幅させて測定したところ、力価は１．３×１０１３ＰＦＵ／ｍｌとなった。続いて、ＰＤ－Ｌ１の細胞外領域の配列とヒトＩｇＧ１ ＦＣで構成される融合タンパク質ＰＤＬ１－ＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）をコートタンパク質として、３％オボアルブミン（ＯＶＡ）でブロッキングした。そして、同様のスクリーニング過程で２回目のスクリーニングを行った。２回目のエルトリエーションにおけるファージの力価を測定したところ、結果は２．５４×１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【0104】
２．２ 酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及びＴＥＰＩＴＯＰＥによる二重スクリーニング
２回目のエルトリエーションで溶出したファージの力価測定プレートから３８０個の単クローンを抜き取り、９６ウェルマイクロプレートで培養するとともに、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて感染させ、パッケージングすることで、上清における組換えファージの蓄積を取得した。次に、ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、３％ＢＳＡを用いて室温で１ｈブロッキングした。そして、異なる濃度勾配の
ＰＤ１－ＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）でＥＬＩＳＡを行い、結合曲線をプロットしたところ、ＥＣ９０が２．４μｇ／ｍＬであると算出された。次に、９６ウェルマイクロプレート上で、単クローン組換えファージの上清を４μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣと同等の比率でそれぞれ混合したあと、１００μｌ／ウェルを採取して、ＰＤＬ１－ＨＳＡでコーティングした９６ウェルマイクロプレートでインキュベートした（終濃度２μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣのみを加えたウェルを対照とした）。インキュベートは３７℃で１時間行った。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳで３回洗浄したあと、ＴＭＢ発色試薬（北京康為世紀生物科技有限公司）を加え、室温で５分間インキュベートして発色させた。その後、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだ。対照ウェルのＰＤ１－ＦＣの発色は明らかであったが（ＯＤ４５０ｎｍ値は３．３７５）、ファージ競合陽性クローンウェルの発色は弱いか、ほぼ発色しなかった（ＯＤ４５０ｎｍの数値は０．３未満）。そこで、競合陽性クローンを選別してシーケンシングを行い、反復配列を除去した。そして、取得した高親和性の陽性配列について更に免疫原性分析を行った。ＱＡＭ法に基づく予測ツールＴＥＰＩＴＯＰＥを利用して（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５－５６１）、人体の免疫原性に密接に関わるＤＲＢ１＊０３：０１、ＤＲＢ１＊０７：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１、ＤＲＢ３＊０１：０１、ＤＲＢ３＊０２：０２、ＤＲＢ４＊０１：０１及びＤＲＢ５＊０１：０１等の位置における遺伝子のスコアを算出し、ＣＤＲ３ ＴＥＰＩＴＯＰＥの合計スコアが４よりも高い配列を除去した。これにより、更にスクリーニングを行って、ヒト化度合の高い抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の配列を取得した。本発明で最終的に取得した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体のＣＤＲ３ ＴＥＰＩＴＯＰＥの合計スコアの大部分は＜－２．０であり、同種の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体よりも明らかに低かった。このことは、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体における潜在的免疫原性がより低いことを意味している。
２回目のエルトリエーションで溶出したファージの力価測定プレートから３８０個の単クローンを抜き取り、９６ウェルマイクロプレートで培養するとともに、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて感染させ、パッケージングすることで、上清における組換えファージの蓄積を取得した。次に、ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェルでプレートにコーティングし、３％ＢＳＡを用いて室温で１ｈブロッキングした。そして、異なる濃度勾配の
ＰＤ１－ＦＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）でＥＬＩＳＡを行い、結合曲線をプロットしたところ、ＥＣ９０が２．４μｇ／ｍＬであると算出された。次に、９６ウェルマイクロプレート上で、単クローン組換えファージの上清を４μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣと同等の比率でそれぞれ混合したあと、１００μｌ／ウェルを採取して、ＰＤＬ１－ＨＳＡでコーティングした９６ウェルマイクロプレートでインキュベートした（終濃度２μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣのみを加えたウェルを対照とした）。インキュベートは３７℃で１時間行った。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳで３回洗浄したあと、ＴＭＢ発色試薬（北京康為世紀生物科技有限公司）を加え、室温で５分間インキュベートして発色させた。その後、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだ。対照ウェルのＰＤ１－ＦＣの発色は明らかであったが（ＯＤ４５０ｎｍ値は３．３７５）、ファージ競合陽性クローンウェルの発色は弱いか、ほぼ発色しなかった（ＯＤ４５０ｎｍの数値は０．３未満）。そこで、競合陽性クローンを選別してシーケンシングを行い、反復配列を除去した。そして、取得した高親和性の陽性配列について更に免疫原性分析を行った。ＱＡＭ法に基づく予測ツールＴＥＰＩＴＯＰＥを利用して（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ Ｔ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５－５６１）、人体の免疫原性に密接に関わるＤＲＢ１＊０３：０１、ＤＲＢ１＊０７：０１、ＤＲＢ１＊１５：０１、ＤＲＢ３＊０１：０１、ＤＲＢ３＊０２：０２、ＤＲＢ４＊０１：０１及びＤＲＢ５＊０１：０１等の位置における遺伝子のスコアを算出し、ＣＤＲ３ ＴＥＰＩＴＯＰＥの合計スコアが４よりも高い配列を除去した。これにより、更にスクリーニングを行って、ヒト化度合の高い抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体の配列を取得した。本発明で最終的に取得した抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体のＣＤＲ３ ＴＥＰＩＴＯＰＥの合計スコアの大部分は＜－２．０であり、同種の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体よりも明らかに低かった。このことは、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体における潜在的免疫原性がより低いことを意味している。
【0105】
複数回のスクリーニングの結果、本発明の発明者は、競合強陽性クローンであり、ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの低い６つのＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体の配列を選別した。当該抗体の全長配列は表１ａに示す通りである。表中の下線部分はＣＤＲ領域を示している。
【0106】
【表1a】
【0107】
各抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ領域）は表１ｂに示す通りである。
【0108】
【表1b】
【0109】
ＣＤＲ３ ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは表１ｃに示す通りである。
【0110】
【表1c】
【0111】
実施例３、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体の初期評価及び鑑定
３．１ 宿主大腸菌におけるシングルドメイン抗体の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列プラスミドを鋳型とし、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（通用生物系統（安徽）有限公司）を用いてＰＣＲ増幅を行った。また、配列３’末端にヒスチジンタグのコード配列を組み込んだ。次に、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約６００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、組換え試薬キット（近岸蛋白質科技有限公司）を用いて、制限酵素ＮｄｅＩ（ＮＥＢ社）及びＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社）で切断したｐＥＴ３２ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と組換え連結することで、大腸菌発現プラスミドを作製した。そして、これを大腸菌のコンピテント状態であるＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換し、アンピシリン耐性プレートに塗布し
て、インキュベータにおいて３７℃で一晩培養した。次に、アンピシリン耐性プレート上のクローンを抜き取り、プラスミドのシーケンシングを行うことで、ｐＥＴ３２ａ＋ベクターに対する配列の正確な挿入を特定した。シーケンシングにより特定した大腸菌発現プラスミドを大腸菌発現宿主Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換して、大腸菌発現菌株を作製した。また、アンピシリン耐性プレートから組換えクローンを抜き取り、培養してから、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で一晩発現を誘導した。一晩発現誘導した菌液を超音波破砕し、４℃下において１２０００ｇで１０分間遠心分離したあと上清を取り、Ｎｉカラム（博格隆生物技術有限公司）を用いて精製することで、最終的なタンパク質純度を９０％以上とした。
３．１ 宿主大腸菌におけるシングルドメイン抗体の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列プラスミドを鋳型とし、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（通用生物系統（安徽）有限公司）を用いてＰＣＲ増幅を行った。また、配列３’末端にヒスチジンタグのコード配列を組み込んだ。次に、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約６００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、組換え試薬キット（近岸蛋白質科技有限公司）を用いて、制限酵素ＮｄｅＩ（ＮＥＢ社）及びＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ社）で切断したｐＥＴ３２ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）と組換え連結することで、大腸菌発現プラスミドを作製した。そして、これを大腸菌のコンピテント状態であるＴｏｐ１０Ｆ’に形質転換し、アンピシリン耐性プレートに塗布し
て、インキュベータにおいて３７℃で一晩培養した。次に、アンピシリン耐性プレート上のクローンを抜き取り、プラスミドのシーケンシングを行うことで、ｐＥＴ３２ａ＋ベクターに対する配列の正確な挿入を特定した。シーケンシングにより特定した大腸菌発現プラスミドを大腸菌発現宿主Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換して、大腸菌発現菌株を作製した。また、アンピシリン耐性プレートから組換えクローンを抜き取り、培養してから、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で一晩発現を誘導した。一晩発現誘導した菌液を超音波破砕し、４℃下において１２０００ｇで１０分間遠心分離したあと上清を取り、Ｎｉカラム（博格隆生物技術有限公司）を用いて精製することで、最終的なタンパク質純度を９０％以上とした。
【0112】
３．２ ヒトＰＤ－Ｌ１に対するＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体の特異的結合ヒトＰＤＬ１－ＨＳＡ又はＨＳＡ（シグマ社より購入）を２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ヒスチジンタグを融合した精製後のＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を１μｇ／ｍＬまで希釈したあと、１ウェルあたり１００μＬ、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで洗浄したあと、１：１００００で希釈したＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴによる洗浄後、ＴＭＢ発色試薬（北京康為世紀生物科技有限公司）を加えて発色させ、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【0113】
測定結果は表２に示す通りとなった。結果より、上記でスクリーニングした６つのクローンはヒトＰＤＬ１に特異的に結合することが示された。
【0114】
【表2】
【0115】
３．３ マウスＰＤ－Ｌ１に対するＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体の特異的結合
マウスｍＰＤＬ１－ＨＳＡ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）を２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ヒスチジンタグを融合した精製後のＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を１μｇ／ｍＬまで希釈したあと、１ウェルあたり１００μＬ、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで洗浄したあと、１：１００００で希釈したＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時
間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで洗浄したあとＴＭＢを加えて発色させ、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
マウスｍＰＤＬ１－ＨＳＡ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）を２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ヒスチジンタグを融合した精製後のＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を１μｇ／ｍＬまで希釈したあと、１ウェルあたり１００μＬ、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：５０００で希釈したｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ ｈｉｓ ｔａｇ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を１００μｌ／ウェル加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで洗浄したあと、１：１００００で希釈したＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を１ウェルあたり１００μｌ加え、室温で１時
間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで洗浄したあとＴＭＢを加えて発色させ、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【0116】
結果より、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体に対応するＯＤ値は、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を加えなかったブランク対照群と明らかな差を有さないことが示された。このことは、スクリーニングで取得した６つのクローンがマウスＰＤＬ１に対して結合しないことを意味している。
【0117】
３．４ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１のシングルドメイン抗体タンパク質の競合ＥＬＩＳＡ検出
ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ヒスチジンタグを融合した精製後のＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を段階希釈したあと、４．８μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣと等体積でそれぞれ混合し、１ウェルあたり１００μｌ、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。そして、５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読み、半数阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。ＩＣ５０の数値が小さいほど、抗体の特異性が強いことを意味した。
ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、ヒスチジンタグを融合した精製後のＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体を段階希釈したあと、４．８μｇ／ｍＬのＰＤ１－ＦＣと等体積でそれぞれ混合し、１ウェルあたり１００μｌ、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。そして、５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読み、半数阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出した。ＩＣ５０の数値が小さいほど、抗体の特異性が強いことを意味した。
【0118】
結果は表３に示す通りであった。この結果は、本発明のスクリーニングで取得したシングルドメイン抗体が良好な結合特異性を有することを意味している。
【0119】
【表3】
【0120】
実施例４、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のヒト化
ヒト化の方法については、ＶＨＨヒト化フレームワーク移植法を用いた（Ｖｉｎｃｋｅ Ｃ，Ｌｏｒｉｓ Ｒ，Ｓａｅｒｅｎｓ Ｄ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｓ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｃｏｎｒａｔｈ Ｋ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９；２８４（５）：３２７３－３２８４）。配列相同性に基づき設計を完了したユニバーサルヒト化ＶＨＨフレームワークｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（ＰＤＢ番号：３ＥＡＫ）に基づいて、対応するＣＤＲ領域をＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のＣＤＲ領域に置き換えるとともに、ＦＲ２領域の個々のアミノ酸をヒト化抗体ＤＰ－４７の配列に基づき更にヒト化した。これにより、各Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体について複数種類のヒト化変異体をそれぞれ取得した。そして、可能な限り多くのヒト由来アミノ酸を組み込むとともに、それらの中から、溶解度が高く、凝集体の形成量が少ないヒト化方案を選択した。また、それらの中から、溶解度が高く、凝集体の形成量が少ないヒト化方
案を選択した。且つ、ヒト化したシングルドメイン抗体を実施例３．１に従って発現及び精製した。
ヒト化の方法については、ＶＨＨヒト化フレームワーク移植法を用いた（Ｖｉｎｃｋｅ Ｃ，Ｌｏｒｉｓ Ｒ，Ｓａｅｒｅｎｓ Ｄ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｓ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｃｏｎｒａｔｈ Ｋ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９；２８４（５）：３２７３－３２８４）。配列相同性に基づき設計を完了したユニバーサルヒト化ＶＨＨフレームワークｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（ＰＤＢ番号：３ＥＡＫ）に基づいて、対応するＣＤＲ領域をＡｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体のＣＤＲ領域に置き換えるとともに、ＦＲ２領域の個々のアミノ酸をヒト化抗体ＤＰ－４７の配列に基づき更にヒト化した。これにより、各Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体について複数種類のヒト化変異体をそれぞれ取得した。そして、可能な限り多くのヒト由来アミノ酸を組み込むとともに、それらの中から、溶解度が高く、凝集体の形成量が少ないヒト化方案を選択した。また、それらの中から、溶解度が高く、凝集体の形成量が少ないヒト化方
案を選択した。且つ、ヒト化したシングルドメイン抗体を実施例３．１に従って発現及び精製した。
【0121】
好ましいヒト化後のＶＨＨのアミノ酸配列は、表４ａに示すように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４であった。なお、下線部分はＣＤＲ領域を示している。
【0122】
【表4a】
【0123】
各ヒト化変異体のフレームワーク領域（ＦＲ）及び相補性決定領域（ＣＤＲ領域）は表４ｂに示す通りであった。
【0124】
【表4b】
【0125】
各ヒト化シングルドメイン抗体のヒト化度合（最も近いヒト遺伝子及び対立遺伝子との配列同一性の比較による）は、ＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ（ウェブサイト ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）で分析した。また、文献として、Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ（登録商標） Ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，９０７：３－３７，２０１２を参照すればよい。結果は表４ｃに示す通りであった。
【0126】
【表4c】
【0127】
実施例５、哺乳動物細胞を用いたＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の作製
５．１ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体とＦｃ融合タンパク質（Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ）の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８）とヒト化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４）について、ＣＨＯ細胞のコドンバイアスに基づき、アミノ酸配列を各塩基配列にそれぞれ変換し、遺伝子合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）によって全長ＤＮＡを取得した。次に、各ＤＮＡを鋳型とし、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（安徽通用生物技術有限公司）を用いてＰＣＲ増幅を行った。そして、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約６００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、シグナルペプチド及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を含むｐＣＤＮＡ３．１ベクターと組換え連結することで、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１のシングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ１ Ｆｃとを融合した細胞発現プラスミドを作製した。また、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（バイオミガ社）を用い、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１のシングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ１ Ｆｃとを融合した細胞発現プラスミドを抽出し、プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：３で均一に混合したあと３０ｍｉｎ静置した。その後、これをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に加え、３７℃下において、５％ＣＯ２の振とう培養機内で７日間培養してから、遠心分離後に上清を取得した。続いて、上清をｐＨ７．０に調節したあと、サンプルをＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に加え、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて溶出した。溶出液は、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に予め投入した。そして、１００％の溶出液をコンダクタンス４ｍｓ／ｃｍとなるまで希釈し、ｐＨ５．５に調整したあと、遠心分離にかけた（８０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）。続いて、上清液をｐＨ５．０まで調整してからサンプルをＤＳＰクロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に投入し、０～６０％の溶出液（２０ｍＭ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．
０）を２ｍｌ／ｍｉｎ、１５ｍｉｎで線形溶出した。純度チェックにはＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ分析を使用した。検出器はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ、検出波長は２１４ｎｍ、流動相は１５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＰＢ＋５％イソプロパノール、クロマトグラフィーカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ、動作時間は１５分、カラム温度は２５℃とした。純度はいずれも９５％よりも大きかった。
５．１ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１シングルドメイン抗体とＦｃ融合タンパク質（Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ）の発現及び精製
スクリーニングにより取得した特異的陽性配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３～３８）とヒト化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９～４４）について、ＣＨＯ細胞のコドンバイアスに基づき、アミノ酸配列を各塩基配列にそれぞれ変換し、遺伝子合成（南京金斯瑞生物科技有限公司）によって全長ＤＮＡを取得した。次に、各ＤＮＡを鋳型とし、ハイフィデリティー酵素ＧＶＰ８（安徽通用生物技術有限公司）を用いてＰＣＲ増幅を行った。そして、ＰＣＲ産物を電気泳動し、約６００ｂｐほどの断片をゲルから切断・回収した。続いて、回収したＰＣＲ産物を、シグナルペプチド及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を含むｐＣＤＮＡ３．１ベクターと組換え連結することで、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１のシングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ１ Ｆｃとを融合した細胞発現プラスミドを作製した。また、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（バイオミガ社）を用い、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１のシングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ１ Ｆｃとを融合した細胞発現プラスミドを抽出し、プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を１：３で均一に混合したあと３０ｍｉｎ静置した。その後、これをＨＥＫ２９３Ｆ細胞に加え、３７℃下において、５％ＣＯ２の振とう培養機内で７日間培養してから、遠心分離後に上清を取得した。続いて、上清をｐＨ７．０に調節したあと、サンプルをＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に加え、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて溶出した。溶出液は、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に予め投入した。そして、１００％の溶出液をコンダクタンス４ｍｓ／ｃｍとなるまで希釈し、ｐＨ５．５に調整したあと、遠心分離にかけた（８０００ｒｐｍ、４℃、１０ｍｉｎ）。続いて、上清液をｐＨ５．０まで調整してからサンプルをＤＳＰクロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）に投入し、０～６０％の溶出液（２０ｍＭ ＮａＡｃ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．
０）を２ｍｌ／ｍｉｎ、１５ｍｉｎで線形溶出した。純度チェックにはＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ分析を使用した。検出器はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ、検出波長は２１４ｎｍ、流動相は１５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＰＢ＋５％イソプロパノール、クロマトグラフィーカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ、動作時間は１５分、カラム温度は２５℃とした。純度はいずれも９５％よりも大きかった。
【0128】
実施例６、生体外におけるＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の機能鑑定
６．１ ＰＤ－Ｌ１に対するＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合能力の鑑定ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、１％ＢＳＡを用いてＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。そして、５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだ。結果を表５に示す。
６．１ ＰＤ－Ｌ１に対するＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合能力の鑑定ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、１％ＢＳＡを用いてＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ段階希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：２００００で希釈した１００μｌのＨＲＰ－Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｎｏｖｅｘ社）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。そして、５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだ。結果を表５に示す。
【0129】
【表5】
【0130】
６．２ ＰＤＬ１－ＰＤ１の相互作用に対するａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体Ｆｃ融合タンパク質のブロック効果の鑑定（競合ＥＬＩＳＡ法）
ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、１％ＢＳＡを用い、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ４μｇ／ｍＬの初期濃度から５倍段階希釈したあと、等体積のビオチン標識された４μｇ／ｍＬのｂｉｏ－ＰＤ１－ＦＣとそれぞれ等体積混合した。そして、１００μＬの混合液を９６ウェルマイクロプレートに採取し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：５００００で希釈した１００μＬのＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだところ、結果は表６及び図１の通りとなった。
ＰＤＬ１－ＨＳＡを２００ｎｇ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングし、５％スキムミルクを用いて室温で１時間ブロッキングした。次に、１％ＢＳＡを用い、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ４μｇ／ｍＬの初期濃度から５倍段階希釈したあと、等体積のビオチン標識された４μｇ／ｍＬのｂｉｏ－ＰＤ１－ＦＣとそれぞれ等体積混合した。そして、１００μＬの混合液を９６ウェルマイクロプレートに採取し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、１：５００００で希釈した１００μＬのＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。そして、ＰＢＳＴで３回洗浄したあと、ＴＭＢ基質を加えて３７℃でインキュベートした。５分間インキュベートして発色させたあと、１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍの数値を読んだところ、結果は表６及び図１の通りとなった。
【0131】
【表6】
【0132】
上記の結果は、本発明のシングルドメイン抗体がＰＤＬ１－ＰＤ１の相互作用に対するブロック効果に非常に優れていることを意味している。
【0133】
実施例７、ヒトＴ細胞系におけるＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の機能活性の鑑定
７．１ 細胞検出株の作製
ＣＤ５Ｌ－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ－ＣＤ１４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＮ４２８５７．１）を合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ（タカラ社）を用いて切断したあと、ベクターｐＣＤＮＡ３．１に挿入してｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭを作製した。次に、ヒトＰＤ－Ｌ１を鋳型とし、ハイフィデリティー増幅によりＰＤＬ１断片を取得して、組換え連結によりｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭに挿入することでｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を作製した。続いて、ＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社）にトランスフェクションしてから、Ｇ４１８を用いて１０－１４ｄを選択し、安定細胞系ＣＨＯ－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を産生した。
７．１ 細胞検出株の作製
ＣＤ５Ｌ－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ－ＣＤ１４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＮ４２８５７．１）を合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ（タカラ社）を用いて切断したあと、ベクターｐＣＤＮＡ３．１に挿入してｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭを作製した。次に、ヒトＰＤ－Ｌ１を鋳型とし、ハイフィデリティー増幅によりＰＤＬ１断片を取得して、組換え連結によりｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭに挿入することでｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を作製した。続いて、ＣＨＯ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ社）にトランスフェクションしてから、Ｇ４１８を用いて１０－１４ｄを選択し、安定細胞系ＣＨＯ－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を産生した。
【0134】
ヒトＰＤ１を鋳型とした増幅で取得した断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＢａｍＨＩ（タカラ社）で切断したＰＢ５１３Ｂ１－ｄｕａｌ－ｐｕｒｏベクター（優宝生物社）と組換え連結することで、プラスミドｐＢ－ＰＤ１を作製した。次に、鋳型ｐＧＬ４．３０（優宝生物社）をハイフィデリティー増幅して取得した断片を、ＳｆｉＩ－ＸｂａＩ（タカラ社）で切断したｐＢ－ＰＤ１ベクターと組換え連結することで、ｐＢ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１プラスミドを作製した。プラスミドの作製に成功したあと、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（バイオミガ社）を用いてプラスミドを抽出し、ｊｕｒｋａｔ細胞（中国科学院幹細胞バンク）へのトランスフェクションに用いた。中国特許出願第１０７０２２５７１Ａ号の方法を参照し、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リシンを用いてｊｕｒｋａｔ細胞を処理し、容器に密着した状態にしたあと、リポソームトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、インビトロジェン社）のトランスフェクション解説に基づき、ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクションした。そして、３日目に、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用い、ピューロマイシンを２．５μｇ／ｍｌ含有させて加圧スクリーニングを行った。その後、一定時間置きに培地を補充し、細胞生存率が回復してからピューロマイシンの含有量を４μｇ／ｍ
ｌまで徐々に増加させた。これにより、最終的にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１細胞株を取得した。
ｌまで徐々に増加させた。これにより、最終的にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１細胞株を取得した。
【0135】
７．２ Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－ＦＣ融合タンパク質がＰＤＬ１・ＰＤ１経路をブロックする能力の鑑定
ＣＨＯ－ＣＤ３ＴＭ－ＰＤ－Ｌ１、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ－１細胞を採取してカウントし、細胞密度を４×１０６／ｍｌに調整してから、細胞を９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり２５μｌずつ加えた。本実験では、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質、陽性対照群Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（アストラゼネカ社）、及び５６－Ｆｃ（特許文献１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２から入手）、陰性対照群ｃｈ－１７５Ｄ１０（米国特許第９７５１９３４Ｂ２号から入手）をそれぞれ１％ＢＳＡで段階希釈し、これらの抗体を５０μｌずつ細胞に加えた。抗体の終濃度は、１３０ｎＭ、４３．４ｎＭ、１４．５ｎＭ、４．８２ｎＭ、１．６１ｎＭ、０．５３６ｎＭ、０．１７９ｎＭ、０．０５９５ｎＭとした。そして、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈ共培養したあと、１ウェルあたり１０μｌのルシフェラーゼ基質を加えて、振とう器により２ｍｉｎ振とうしてから数値を読んだ。操作は試薬キットの説明に従った（ルシフェラーゼ検出用試薬キット、Ｌｏｔ：００００３３９７２７、プロメガ社）。
ＣＨＯ－ＣＤ３ＴＭ－ＰＤ－Ｌ１、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ－１細胞を採取してカウントし、細胞密度を４×１０６／ｍｌに調整してから、細胞を９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり２５μｌずつ加えた。本実験では、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質、陽性対照群Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（アストラゼネカ社）、及び５６－Ｆｃ（特許文献１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２から入手）、陰性対照群ｃｈ－１７５Ｄ１０（米国特許第９７５１９３４Ｂ２号から入手）をそれぞれ１％ＢＳＡで段階希釈し、これらの抗体を５０μｌずつ細胞に加えた。抗体の終濃度は、１３０ｎＭ、４３．４ｎＭ、１４．５ｎＭ、４．８２ｎＭ、１．６１ｎＭ、０．５３６ｎＭ、０．１７９ｎＭ、０．０５９５ｎＭとした。そして、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈ共培養したあと、１ウェルあたり１０μｌのルシフェラーゼ基質を加えて、振とう器により２ｍｉｎ振とうしてから数値を読んだ。操作は試薬キットの説明に従った（ルシフェラーゼ検出用試薬キット、Ｌｏｔ：００００３３９７２７、プロメガ社）。
【0136】
図２の結果に示すように、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１抗体を加えた場合には、エフェクター標的細胞表面のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合をブロック可能であり、用量反応曲線を有していた。且つ、特異性を有しており、ｃｈ－１７５Ｄ１０（標的がＣｌａｕｄｉｎ１８．２）はＰＤ－Ｌ１・ＰＤ１経路の結合をブロック不可能であった。
【0137】
また、図２から明らかなように、本発明において最適に取得したＡｎｔｉ－ＰＤＬ１抗体は、エフェクター標的細胞表面のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合に対するブロック能力が陽性対照Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ及び５６－Ｆｃよりも優れていた。
【0138】
実施例８、ＰＢＭＣに対するＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の活性化作用の鑑定
リンパ球分離溶液（天津市▲ハウ▼洋華科生物科技有限公司）を用いて、健康なヒト末梢血からＰＢＭＣを分離した。次に、終濃度５μｇ／ｍｌの組換え抗ＣＤ３モノクローナル抗体（近岸蛋白質科技有限公司、製品番号ＧＭＰ－Ａ０１８）を５０μｌ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングした。また、２μｇ／ｍｌの組換えＣＤ２８モノクローナル抗体（近岸蛋白質科技有限公司、製品番号ＧＭＰ－Ａ０６３）で細胞を２×１０６／ｍｌまで希釈した。続いて、上記のコーティングプレートから上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄した。そして、２００μｌの細胞を各ウェルに加えて、細胞を２４ｈ活性化させたあと、５ｎＭのＤｕｒｖａｌｕｍａｂ（アストラゼネカ社）及び５ｎＭのＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質を加えて刺激した。３日間刺激したあと、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離してから、上清を収集した。そして、取得した上清について、試薬キット（達科為（Ｄａｋｅｗｅ）社から購入）の説明書に従ってサイトカインＩＬ２を検出した。
リンパ球分離溶液（天津市▲ハウ▼洋華科生物科技有限公司）を用いて、健康なヒト末梢血からＰＢＭＣを分離した。次に、終濃度５μｇ／ｍｌの組換え抗ＣＤ３モノクローナル抗体（近岸蛋白質科技有限公司、製品番号ＧＭＰ－Ａ０１８）を５０μｌ／ウェル、４℃で一晩プレートにコーティングした。また、２μｇ／ｍｌの組換えＣＤ２８モノクローナル抗体（近岸蛋白質科技有限公司、製品番号ＧＭＰ－Ａ０６３）で細胞を２×１０６／ｍｌまで希釈した。続いて、上記のコーティングプレートから上清を除去し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳを用いて２回洗浄した。そして、２００μｌの細胞を各ウェルに加えて、細胞を２４ｈ活性化させたあと、５ｎＭのＤｕｒｖａｌｕｍａｂ（アストラゼネカ社）及び５ｎＭのＡｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質を加えて刺激した。３日間刺激したあと、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離してから、上清を収集した。そして、取得した上清について、試薬キット（達科為（Ｄａｋｅｗｅ）社から購入）の説明書に従ってサイトカインＩＬ２を検出した。
【0139】
結果は図３に示す通りであった。抗ＰＤＬ１シングルドメイン抗体融合タンパク質は、ＰＢＭＣのＩＬ２分泌を強化可能であった。且つ、それに伴うＩＬ２の倍率増加は陽性対照Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂよりも明らかに高かった。
【0140】
実施例９、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の腫瘍抑制活性研究
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現したＭＣ３８細胞（ＭＣ３８－ＰＤＬ１）（南京銀河公司）及びヒトの末梢血単核細胞ＰＢＭＣを皮下移植する実験により、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の腫瘍抑制活性研究を実現した。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現したＭＣ３８細胞（ＭＣ３８－ＰＤＬ１）（南京銀河公司）及びヒトの末梢血単核細胞ＰＢＭＣを皮下移植する実験により、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の腫瘍抑制活性研究を実現した。
【0141】
実験は次のように設計した。７～８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右体側部分に、５０％マトリゲル（ＢＤ社から購入）中の３×１０６個のＭＣ３８細胞を皮下移植した。腫瘍の移植から１５日後に、腫瘍の大きさが１００～２５０ｍｍ３となったマウスをランダムに群分けした。各実験群のマウスは４～６匹とした。次に、２人の健康なドナーから採取した１００μｌの混合ＰＢＭＣｓ（５×１０５）を腫瘍内に注射した。そして、ＰＢＭＣｓを移植してから３日後に、皮下注射によって投与量１ｍｇ／ｋｇで抗ＰＤＬ１抗体及びヒトＩｇＧ１ ＦＣをそれぞれ投与したあと、週に１回投与を行った。また、並列群のうちＰＢＳを注射したものを陰性対照とした。腫瘍体積の測定については、ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、下記の公式に従って腫瘍体積を計算した。
【0142】
Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２
【0143】
実験結果は図４に示す通りであった。時間の経過とともに、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃを接種したマウスは、腫瘍の体積が対照群に比べて良好に制御され、顕著な増加は見られなかった。このことは、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃが明らかな腫瘍抑制作用を有することを意味している。
【0144】
実施例１０、Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質の溶解度研究
精製した１００ｍｇのシングルドメイン抗体を限外濾過管（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）で限外濾過した。交換する溶液は５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）又は５ｍＭ 酢酸－ナトリウム（ｐＨ５．５）とし、２５℃、３５００ｇで限外濾過濃縮した。溶液は２回交換し、それ以上濃縮できなくなるまで（２０分遠心分離にかけても体積に明らかな変化が見られなくなるまで）濃縮した。そして、濃縮液を８０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離にかけたあと、タンパク質含有量を測定し、当該濃度を当該条件における溶解度とした。
精製した１００ｍｇのシングルドメイン抗体を限外濾過管（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｔｄ．）で限外濾過した。交換する溶液は５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）又は５ｍＭ 酢酸－ナトリウム（ｐＨ５．５）とし、２５℃、３５００ｇで限外濾過濃縮した。溶液は２回交換し、それ以上濃縮できなくなるまで（２０分遠心分離にかけても体積に明らかな変化が見られなくなるまで）濃縮した。そして、濃縮液を８０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離にかけたあと、タンパク質含有量を測定し、当該濃度を当該条件における溶解度とした。
【0145】
【表7】
【0146】
表７より、本発明において最適に取得したヒト化Ａｎｔｉ－ＰＤＬ１－Ｆｃ融合タンパク質は良好な溶解度を有していた。本実施例におけるＰＤＬ１シングルドメイン抗体は、元のＦＲ２領域の４４位及び４５位の親水性アミノ酸をヒト化することで、一般的なヒト化抗体における非常に保守的な疎水性残基Ｇ及びＬとしたが（表４ａ）、溶解度は影響を受けなかった。
【0147】
以上述べたように、本発明では、従来技術における様々な欠点を効果的に解消し、高度な産業上の利用価値を有する抗体製品を獲得した。
本発明に関する配列を表８にまとめる。
本発明に関する配列を表８にまとめる。
【0148】
【表8】
【0149】
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明したものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範囲を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形可能である。従って、当業者が本発明で開示した精神及び技術思想を逸脱することなく完了するあらゆる等価の補足又は変形は、依然として本発明の特許請求の範囲に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】