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特表2022-545171エンドトキシン検出のための混合領域を備えたカートリッジ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-26
(54)【発明の名称】エンドトキシン検出のための混合領域を備えたカートリッジ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/579 20060101AFI20221019BHJP
G01N 21/03 20060101ALI20221019BHJP
【ＦＩ】
G01N33/579
G01N21/03 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022505586
(86)(22)【出願日】2020-08-13
(85)【翻訳文提出日】2022-01-27
(86)【国際出願番号】 US2020046049
(87)【国際公開番号】W WO2021034581
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/889,747
(32)【優先日】2019-08-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512190365
【氏名又は名称】ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】サンド， ジェラルド
(72)【発明者】
【氏名】スタンボ， キャンディス
(72)【発明者】
【氏名】グランディソン， エイドリアン
(72)【発明者】
【氏名】タデッセ， レーベン
(72)【発明者】
【氏名】ソーニー， プジャ
(72)【発明者】
【氏名】ハリス， ウィル
(72)【発明者】
【氏名】バートン， ルパート
【テーマコード（参考）】
2G057
【Ｆターム（参考）】
2G057AA01
2G057AB01
2G057AB03
2G057AC01
2G057BA01
2G057BB01
2G057BB06
2G057BD06
2G057CA01
2G057DA04
2G057GA04
(57)【要約】
本発明は、エンドトキシンを含む、微生物汚染物質の検出及び／又は定量化に有用な方法、組成物及びデバイスを対象とする。実施形態において、吸収度に基づくアッセイでは、携帯型リーダ／デバイスと組み合わせて有用な乾燥組成物を含むカートリッジが提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジであって、ａ．光学的サンプルウェル、流体入口ポート及び前記流体入口ポートと前記光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備する、ハウジングと、
ｂ．前記ハウジングに付随し、前記流体入口ポート、前記導管及び前記光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、
ｃ．血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された前記導管に沿って配置された混合領域と、を具備する、カートリッジ。
【請求項2】
前記ハウジングは、４つの光学的サンプルウェルを含み、前記４つの光学的サンプルウェルの２つが、前記光学的サンプルウェル内で乾燥させられた前記微生物汚染物質を代表する作用物質を含むように構成される、請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項3】
前記混合領域内で乾燥させられた発色基質をさらに含む、請求項１又は２に記載のカートリッジ。
【請求項4】
前記ハウジングは、互いに機械的に接続されたカバー区分と下部区分とを具備する、請求項１～３のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項5】
前記ハウジングは、前記下部区分に機械的に接続されたマニホールド区分をさらに具備し、前記乾燥組成物は、前記マニホールド区分の混合部分上で乾燥させられる、請求項４に記載のカートリッジ。
【請求項6】
前記混合部分は、その上で乾燥させられた前記発色基質をさらに含む、請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項7】
前記マニホールド区分は、前記マニホールド区分のサンプルウェル部分上で乾燥させられた前記微生物汚染物質を代表する前記作用物質をさらに含む、請求項５又は６に記載のカートリッジ。
【請求項8】
前記混合領域は、その中に含まれる磁気攪拌要素を具備する、請求項１～７のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項9】
前記導管は、前記流体入口ポートと前記混合領域との間に配置される、吸引領域と流体制限器とを具備する、請求項１～８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項10】
前記血球溶解物は、リムルス変形細胞溶解物である、請求項１～９のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項11】
前記微生物汚染物質を代表する前記作用物質は、細菌エンドトキシンである、請求項２に記載のカートリッジ。
【請求項12】
前記ポンプ機構は、３位置シリンジであり、第１の位置が、真空を生成して、前記サンプルを前記吸引領域内へ導入し、第２の位置が、前記吸引領域から前記流体制限器を通過して前記混合領域への輸送を提供し、第３の位置が、前記混合領域から前記サンプルウェルへの輸送を提供する、請求項９～１１のいずれかに記載のカートリッジ。
【請求項13】
サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジであって、ａ．カバー区分、前記カバー区分に機械的に接続された下部区分及び前記下部区分に機械的に接続されたマニホールド区分を具備する、ハウジングであって、
ｉ．前記下部区分は、２つの光学的サンプルウェル、流体入口ポート及び前記流体入口ポートと前記光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備し、
ｉｉ．前記導管は、吸引領域、流体制限器、及び混合領域を具備し、
ｉｉｉ．前記マニホールド区分は、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された混合部分を具備し、前記混合部分は、前記導管の前記混合領域に対応する、ハウジングと、
ｂ．前記ハウジングに付随し、前記流体入口ポート、前記導管及び前記２つの光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、を具備する、カートリッジ。
【請求項14】
前記下部区分は、４つの光学的サンプルウェルを具備し、前記４つの光学的サンプルウェルの２つが、前記光学的サンプルウェル内で乾燥させられた前記微生物汚染物質を代表する作用物質を含むように構成される、請求項１３に記載のカートリッジ。
【請求項15】
前記マニホールド区分は、前記マニホールド区分のサンプルウェル部分上で乾燥させられた前記微生物汚染物質を代表する前記作用物質をさらに含む、請求項１４に記載のカートリッジ。
【請求項16】
前記マニホールド区分の前記混合部分上で乾燥させられた発色基質をさらに含む、請求項１３～１５のいずれかに記載のカートリッジ。
【請求項17】
前記ポンプ機構は、前記下部区分に統合され、前記ポンプ機構は、３位置シリンジであり、第１の位置が、真空を生成して、前記サンプルを前記吸引領域内へ導入し、第２の位置が、前記吸引領域から前記流体制限器を通過して前記混合領域への輸送を提供し、第３の位置が、前記混合領域から前記サンプルウェルへの輸送を提供する、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項18】
前記血球溶解物は、リムルス変形細胞溶解物である、請求項１３～１７のいずれかに記載のカートリッジ。
【請求項19】
前記作用物質は、細菌エンドトキシンである、請求項１４～１８のいずれかに記載のカートリッジ。
【請求項20】
サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法であって、ａ．前記サンプルを、請求項３に記載のカートリッジの前記流体入口ポート内へ導入し、前記サンプルを前記導管へ伝達すること、
ｂ．前記サンプルを前記導管の前記混合領域内へ伝達すること、
ｃ．混合サンプルを生成するために、前記サンプルを前記血球溶解物及び前記発色基質と混合すること、
ｄ．前記混合サンプルを前記混合領域から前記サンプルウェルへ伝達すること、及び
ｅ．前記光学的サンプルウェル内の前記混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、前記光学的特性の変化が、前記サンプル中の前記微生物汚染物質の存在を示す、方法。
【請求項21】
前記光学的特性を前記測定することは、事前選択された波長における光の吸収度の変化である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記事前選択された波長における光の吸収度の変化は、検量線と比較される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記検量線は、保存検量線である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記サンプルを前記導入することは、前記サンプルを前記流体入口ポート及び前記導管内へ導入するために、前記ポンプ機構を介して真空を生成することを含む、請求項２０～２３のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
前記伝達することは、前記ポンプ機構を介して、前記サンプルを混合領域から前記光学的サンプルウェルへ輸送することを含む、請求項２０～２４のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法であって、ａ．前記サンプルを、請求項１６に記載のカートリッジの前記流体入口ポート内へ導入し、前記サンプルを前記吸引領域へ伝達すること、
ｂ．前記サンプルを前記吸引領域から前記流体制限器を通過して前記混合領域へ伝達すること、
ｃ．混合サンプルを生成するために、前記サンプルを前記血球溶解物及び前記発色基質と混合すること、
ｄ．前記混合サンプルを前記光学的サンプルウェルへ伝達すること、及び
ｅ．前記光学的サンプルウェル内の前記混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、前記光学的特性の変化が、前記サンプル中の前記微生物汚染物質の存在を示す、方法。
【請求項27】
前記光学的特性を前記測定することは、事前選択された波長における光の吸収度の変化である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記事前選択された波長における光の吸収度の変化は、検量線と比較される、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記検量線は、保存検量線である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記サンプルを前記導入することは、前記サンプルを前記流体入口ポート及び前記吸引領域内へ導入するために、前記ポンプ機構を介して真空を生成することを含み、ｂ）において前記伝達することは、前記ポンプ機構を介して、前記サンプルを前記吸引領域から前記混合領域へ輸送することを含み、ｄ）において前記伝達することは、前記ポンプ機構を介して、前記混合サンプルを前記混合領域から前記光学的サンプルウェルへ輸送することを含む、請求項２６～２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エンドトキシンを含む、微生物汚染物質の検出及び／又は定量化に有用な方法、組成物及びデバイスを対象とする。実施形態において、吸収度に基づくアッセイでは、携帯型リーダ／デバイスと組み合わせて有用な乾燥組成物を好適に含むカートリッジが提供される。
【背景技術】
【0002】
グラム陽性菌、グラム陰性菌、酵母、菌類、及びかびによる汚染を含む微生物汚染は、深刻な疾患を引き起こし得、人間が死ぬ場合すらある。製薬、医療デバイス、及び食品業界では、米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）又は環境保護庁により課される基準等の特定の基準を満たすために、このような微生物汚染物質の存在に関する、頻繁で、正確、且つ繊細な試験を要することが多い。
【0003】
好適には、様々な状況で容易に使用可能な小型の携帯型デバイスにより、微生物汚染物質の存在に対して、サンプルを分析する便利で迅速な方法が必要とされている。本発明は、これらのニーズを満たすものである。
【発明の概要】
【0004】
実施形態において、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジが本明細書に提供され、該カートリッジは、光学的サンプルウェル、流体入口ポート、及び流体入口ポートと光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備するハウジングと、ハウジングに付随し、流体入口ポート、導管及び光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された導管に沿って配置された混合領域と、を具備する。
【0005】
さらなる実施形態において、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジが本明細書に提供され、該カートリッジは、カバー区分、カバー区分に機械的に接続された下部区分、及び下部区分に機械的に接続されたマニホールド区分を具備するハウジングであって、下部区分は、２つの光学的サンプルウェル、流体入口ポート、及び流体入口ポートと光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備し、導管は、吸引領域、流体制限器、及び混合領域を具備し、マニホールド区分は、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された混合部分を具備し、混合部分は、導管の混合領域に対応する、ハウジングと、該ハウジングに付随し、流体入口ポート、導管及び２つの光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、を具備する。
【0006】
さらに、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法が本明細書に提供され、該方法は、サンプルを、本明細書に記載するカートリッジの流体入口ポート内へ導入し、サンプルを導管へ伝達すること、サンプルを導管の混合領域内へ伝達すること、混合サンプルを生成するために、サンプルを血球溶解物及び発色基質と混合すること、混合サンプルを混合領域からサンプルウェルへ伝達すること、及び光学的サンプルウェル内の混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、光学的特性の変化が、サンプル中の微生物汚染物質の存在を示す。
【0007】
さらなる実施形態において、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法が本明細書に提供され、該方法は、サンプルを、本明細書に記載するカートリッジの流体入口ポート内へ導入し、サンプルを吸引領域へ伝達すること、サンプルを吸引領域から流体制限器を通過して混合領域へ伝達すること、混合サンプルを生成するために、サンプルを血球溶解物及び発色基質と混合すること、混合サンプルを光学的サンプルウェルへ伝達すること、及び光学的サンプルウェル内の混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、光学的特性の変化が、サンプル中の微生物汚染物質の存在を示す。
【0008】
さらなる実施形態、該実施形態の特徴、及び利点は、様々な実施形態の構造や作用と同様に、添付図面に準拠して、以下詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1B】同上。
【図1C】同上。
【図1D】同上。
【図1E】同上。
【図1F】同上。
【図1G】同上。
【図2B】同上。
【図2C】同上。
【図2D】同上。
【図3B】同上。
【図4B】同上。
【図5C】同上。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書に図示及び説明する特定の実装は例であり、本出願の範囲をそれ以外の形で限定することを何ら意図するものではないことを理解されたい。
【0011】
本明細書に参照される公開特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、及び科学文献は、各々が参照により組み込まれるように具体的且つ個別に記載されるとみなした場合と同じ程度に、完全な形で参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用する参照文献と本明細書の特定の教示との間にいかなる形でも矛盾がある場合は、後者の内容を優先して解決されるものとする。同様に、当技術分野で理解される単語又は語句の定義と、本明細書で具体的に記載される単語又は語句の定義との間にいかなる形で矛盾がある場合は、後者の内容を優先して解決されるものとする。
【0012】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、記載内容がそれ以外であると明白に指示しない限り、それらが言及する用語の複数形も具体的に包含する。本明細書において、用語「約」は、近似的に、～の範囲内、大まかに、又は前後を意味するために使用される。用語「約」が数値範囲とともに使用される場合、記載数値の上下に境界を延ばすことで、その範囲を修正する。一般的に、本明細書において、用語「約」は、記載数値の上下２０％の変動内で数値を修正するために使用される。
【0013】
本明細書で使用する技術的及び科学的な用語は、別途定義しない限り、本出願の関連分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本明細書では、当業者に公知の様々な方法論及び材料に言及する。
【0014】
微生物汚染物質に関する試験
試験サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を検出するために、様々なアッセイが開発されてきた。多くの場合、甲殻類、例えば、カブトガニの血リンパから調製された血球溶解物が利用される。これらのアッセイは、典型的に、血球溶解物が微生物汚染物質に露出される場合に生じる凝固カスケードを様々な方法で利用する。血球溶解物の例には、リムルスポリフェムス、タキプレウスギガス、タキプレウストリデンタトゥス、及びカルシノスコルピウスロタンディカウダのカブトガニの血リンパから生成される変形細胞溶解物（ＡＬ）が含まれる。リムルス、タキプレウス、及びカルシノスコルピウス種の血リンパから生成される変形細胞溶解物を、それぞれリムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）、タキプレウス変形細胞溶解物（ＴＡＬ）、及びカルシノスコルピウス変形細胞溶解物（ＣＡＬ）と称する。
試験サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を検出するために、様々なアッセイが開発されてきた。多くの場合、甲殻類、例えば、カブトガニの血リンパから調製された血球溶解物が利用される。これらのアッセイは、典型的に、血球溶解物が微生物汚染物質に露出される場合に生じる凝固カスケードを様々な方法で利用する。血球溶解物の例には、リムルスポリフェムス、タキプレウスギガス、タキプレウストリデンタトゥス、及びカルシノスコルピウスロタンディカウダのカブトガニの血リンパから生成される変形細胞溶解物（ＡＬ）が含まれる。リムルス、タキプレウス、及びカルシノスコルピウス種の血リンパから生成される変形細胞溶解物を、それぞれリムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）、タキプレウス変形細胞溶解物（ＴＡＬ）、及びカルシノスコルピウス変形細胞溶解物（ＣＡＬ）と称する。
【0015】
ＬＡＬを使用するアッセイには、例えば、ゲルクロットアッセイ、エンドポイント比濁アッセイ、カイネティック比濁アッセイ、及びエンドポイント発色アッセイ（Ｐｒｉｏｒ（１９９０）、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｔｅｓｔ」、ＣＲＣ ＰＲＥＳＳ ２８－３４）が含まれる。しかしながら、これらのアッセイには、試薬の費用、アッセイの速度、及び感度範囲の制限を含む１つ以上の瑕疵を抱えている。さらに、これらのアッセイの典型的な要件として、試験施設へ送られるサンプルを、試験対象のサンプルの供給源から除去する。
【0016】
エンドトキシン検出のためのカートリッジ
実施形態において、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジが本明細書に提供される。本明細書に記載の様々なカートリッジ、デバイス及び方法を使用して試験可能なサンプルは、生物学的プロセス、又は医薬製剤等からの液体サンプルを含み、大規模又は小規模のプロセスであり得る。
実施形態において、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジが本明細書に提供される。本明細書に記載の様々なカートリッジ、デバイス及び方法を使用して試験可能なサンプルは、生物学的プロセス、又は医薬製剤等からの液体サンプルを含み、大規模又は小規模のプロセスであり得る。
【0017】
図１Ａに示す通り、実施形態において、カートリッジ１００は、カートリッジに対して構造上の支持を提供するハウジング１０２を具備する。本明細書で使用する「カートリッジ」は、微生物汚染物質の存在及び／又は量に関して試験されるサンプルを受けて保持するための自立型の要素を意味する。
【0018】
ハウジング１０２は、様々なプラスチック又はガラスを含む任意の好適な材料から作製することができる。ハウジング１０２は、単一部の材料から作製可能で、又は本明細書に記載の通り、別個の部分、又はハウジング１０２、このため、カートリッジ１００全体を作成するためにともに結合される区分を具備可能である。
【0019】
ハウジング１０２は、光学的サンプルウェル１０４を具備する。図１Ｆは、ハウジング１０２の上面と下面との間の容器又はアンプルの形状である、光学的サンプルウェル１０４の側面図を示す。光学的サンプルウェル１０４は、好適には、プラスチック又はガラス材料から構成され、好適には、光学的に透明又は透過性であり、光が光学的サンプルウェルの下部及び上部を通過することを可能にし、これによって、光が光学的サンプルウェル内に収容されたサンプルに接触することを可能にする。実施形態において、光学的サンプルウェル１０４、並びにハウジング１０２の残部は、黄色に着色されたガラス又は高分子から作製することができ、好適には、約４００ｎｍ～約４５０ｎｍ（すなわち、４０５ｎｍ）の光が通過することを阻止するものの、他の波長が通過することも可能にする。このような実施形態は、光学的サンプルウェル１０４を通過する光の量を低減させ、クロストークを低減させ、迷光を低減させることによって、本明細書に記載する方法の感度を増大させる。光学的ウェル１０４は、好適には、外壁を有するシリンダ形状であって、上面及び下面は、ウェルの上部及び下部として、好適には、ハウジング１０２の様々な要素から形成される。
【0020】
カートリッジ１００のハウジング１０２はまた、流体入口ポート１０６及び導管１０８をさらに具備する。流体入口ポート１０６は、好適には、ハウジング１０２の長い又は細い区間１１９の端部で管材、スリット、孔又は他の好適な開口部であり、流体入口ポート１０６の内側には、導管１０８が収容されており、流体入口ポートは、サンプルに接触するために使用される。流体入口ポート１０６は、サンプルがサンプル導入方向１１４（図１Ｆ）へ上方に流体入口ポート内へ引き込まれることを可能にするように設計される。導管１０８は、流体入口ポート１０６及び光学的サンプルウェル１０４を流体的に接続する。すなわち、導管１０８は、流体入口ポート１０６の先端と光学的サンプルウェル１０４との間に管状又はマイクロ流体の接続を提供し、ポート内へ引き込まれた後、導管１０８を通過して光学的サンプルウェル１０４内へ液体サンプルを伝達可能にする。実施形態において、導管１０８は、ハウジング１０２の表面に切り込まれたチャネルとして形成可能で、又はポリ（スチレン）等の様々な高分子から管材又はマイクロ管材として形成可能である。
【0021】
実施形態において、導管１０８は、好適には、流体入口１０６への導入後に流体サンプルを保持するために使用可能な第１の区分を具備する。図１Ｆ及び図１Ｇに示す通り、サンプルをサンプル導入方向１１４の流体入口ポート１０６内へ導入時に、サンプルは、吸引領域１４０、すなわち、導管１０８内の初期位置へ進み、サンプルは、さらに導管１０８へ伝達する前に、その位置で保持及び維持される。好適には、吸引領域１４０は、約０．０５μＬ～約５００μＬの体積を有し、カートリッジ内へ導入後に、サンプルに対して初期体積の容器として使用される。この吸引領域１４０は、カートリッジが、試験サンプルに挿入され、所望の体積が初期に、後の試験用にサンプル入口ポート１０６に引き込まれる場合、カートリッジのユーザにより嵌入可能である。典型的な実施形態において、吸引領域１４０の体積は、約１０μＬ～約２００μＬ、より好適には、約３０μＬ～約１００μＬ、約３０μＬ～約８０μＬ、約３０μＬ～約５０μＬ、又は約３０μＬ、約４０μＬ、若しくは約５０μＬである。
【0022】
カートリッジ１００は、好適には、導管１０８に沿って配置された混合領域１４２をさらに具備する。混合領域１４２は、好適には、流体制限器１４４により、サンプル入口ポート１０６及び吸引領域１４０（具備されれば）から分離される。混合領域１４２は、血球溶解物を含む乾燥組成物を含む（典型的な実施形態において、好適に含む）ように構成される。本明細書に記載の通り、混合領域は、微生物汚染物質を含むと考えられるサンプルが、サンプルを、血球溶解物を含む乾燥組成物と混合可能なように、導入される、導管１０８の部分を提供する。本明細書に記載の通り、混合領域１４２はまた、発色基質をさらに含む。このため、混合領域１４２は、試験サンプルが、血球溶解物及び発色基質の両方、好適には、両方とも乾燥させられた状態で（別個の構成要素として乾燥又は同一の乾燥組成物においてともに乾燥させられる状態のいずれかで）、その後、血球溶解物及び発色基質と混合されるサンプルと接触可能である、領域を提供する。様々な機構は、液体試験サンプル、血球溶解物及び発色基質を混合するために使用可能で、例えば、攪拌子、攪拌棒、又は小さい磁気ビーズ若しくは球等の磁気攪拌要素１４６（図１Ｇを参照）を具備可能である。例えば、カートリッジ１００が、リーダ又は他の好適な機構に設置される場合、磁石は、混合領域１４２の下方、上方又は周りに設置可能で、磁気攪拌要素１４６は、混合領域内で回転、並進又はそれ以外の方法で移動され、試験サンプルを攪拌・移動し、サンプルを、乾燥させられた（又はそれ以外では混合領域に付加された）構成要素と混合する。他の混合機構は、タッピング機構、攪拌又は振動機構、超音波機構等を含む、外部又は内部のいずれかの様々な攪拌器を具備可能である。典型的な実施形態において、混合領域１４２の体積は、約１０μＬ～約２００μＬ、より好適には、約３０μＬ～約１００μＬ、約３０μＬ～約８０μＬ、約３０μＬ～約５０μＬ、又は約３０μＬ、約４０μＬ、若しくは約５０μＬである。
【0023】
典型的な実施形態において、流体制限器１４４は、吸引領域１４０と混合領域１４２との間に配置され、サンプル入口ポート１０６／吸引領域１４０と、さらに下流の混合領域１４２との間の流れを低減する任意の好適な機構又は構造体であり得る。実施形態において、流体制限器１４４は、導管１０８内に設置されたプラスチック製の部分若しくは要素であり、又は導管１０８の部分であり得、或いは他の実施形態においては、単に、サンプル入口ポート１０６に入る流体がさらに導管１０８に沿って進むのを遅らせ、その代わりに、流体サンプルが吸引領域１４０内で回収され得る方法として作用する、導管１０８の絞りであり得る。実施形態において、流体制限器１４４は、吸引領域と混合領域との間で緩衝器として作用する。実施形態において、流体制限器１４４は、オン・オフに切替不能ではあるが、むしろ、様々な構成要素を導管に沿って適切に充填可能にするため、流体の移動を遅らせる機構を提供することを理由として、バルブではない。しかしながら、さらなる実施形態において、バルブ構造体は、導管１０８に付加可能で、導管の長さに沿って任意の様々な構成要素間の流体の流れを制御する。
【0024】
実施形態において、カートリッジ１００は、ハウジング１０２に付随するポンプ機構１１０をさらに具備する。ポンプ機構１１０は、好適には、３位置シリンジ（１位置、２位置、４位置、５位置等のシリンジも使用可能）であって、バレル１１８（図１Ｇ及び図３Ａを参照）と、バレル内で摺動可能なプランジャ１１６と、を含む。ポンプ機構１１０は、好適な機構（例：のり、接着剤、機械的なバンド、ラップ、又はステープル等）を介して、ハウジング１０２に直接取り付け可能で、又はハウジング１０２の一体部分として（例えば、ハウジングの下部区分１８６の部分として）作製された要素であり得る。ポンプ機構１１０は、流体入口ポート１０６、導管１０８及び光学的サンプルウェル１０４に流体的に接続され、それにより、ポンプ機構１１０を作動すると、本明細書に記載の通り、例えば、１１４がサンプル導入方向を示す図１Ｆに示す通り、サンプルを流体入口ポート１０６内へ、その後、導管１０８内へ、さらにはサンプルウェル１０４内へ引き込むことができる。
【0025】
典型的な実施形態において、ポンプ機構１１０は、好適には３位置シリンジであって、サンプルを、流体入口ポート１０６と導管１０８に、好適には、吸引領域１４０へ伝達させるが、流体制限器１４４内、上方又は周りを通過させない第１の位置に移動する。例えば、３位置シリンジによって真空を生成して、サンプルを流体入口ポート１０６内へ、その後、導管１０８及び吸引領域１４０内へ導入又は引き込むことができる。ポンプ機構１１０は、好適には、吸引領域１４０から、流体制限器１４４を通過して混合領域１４２にサンプルの輸送を提供する、第２の位置に移動する。サンプルを様々な乾燥構成要素と混合後に、ポンプ機構１００は、好適には、混合サンプルが、光学的サンプルウェル１０４に（再度、導管１０８の別の区分を通過して）輸送される、第３の位置に移動する。
【0026】
サンプルを流体入口ポート１０６内へ、その後、導管１０８内へ導入又は引き込み、好適には、ポンプ機構１１０が第１の位置にある状態でサンプルを吸引領域１４０内に維持することで、サンプリングの場所（例：組立てライン、工場、施設、サンプル槽、又は貯蔵タンク）でサンプルを有するカートリッジ１００を作製し、その後、準備が整った状態で検出又は測定前に維持することが可能になる。この設計の利点は、サンプルの測定前に、サンプルをカートリッジ１００内で一定期間（好適には、数分（例：１０～３０分）から最長約１～２時間、又はそれ以上）にわたって保持することができ、このため、サンプル品質を損なう恐れがなく、複数の異なるサンプルを得ることが可能になることである。さらに、サンプルを得た後にさらなる動作が必要な場合、これらの動作を実施し、その後、サンプルを分析することができる。
【0027】
実施形態において、流体入口ポート１０６の先端からサンプルウェル１０４までの長さを含み得る導管１０８の長さは、約１ｃｍ～約１５ｃｍ、より好適には、約１ｃｍ～約１０ｃｍ又は約１ｃｍ～約５ｃｍ程度である。導管１０８は、導管１０８の全長が約５ｍｍ～約５０ｍｍ程度の状態で、長さ約０．２ｍｍ～約１０ｍｍの程度である吸引領域１４０及び混合領域１４２（所望であれば、他の領域又は区分も同様に）を具備可能である。導管１０８の直径又は断面幅は、好適には、約０．１ｍｍ～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約０．８ｍｍ、又は約０．１ｍｍ、約０．２ｍｍ、約０．３、約０．４ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．６ｍｍ、約０．７ｍｍ又は約０．８ｍｍの程度である。約０．５ｍｍ程度の導管１０８の断面幅を使用すると、ウィッキングの低減と、サンプル損失防止の一助となる。実施形態において、流体制限器１４４は、好適には、流体を、約０．０５ｍｍ～約１ｍｍの直径を通過して、制限器上方又は内を通過させる。実施形態において、導管１０８は、屈曲又は折曲げパターン（又は導管１０８の長さを最大にしながら表面積を最小にする他の類似の配向）を含むことができ、他の実施形態では、導管１０８は、流体入口ポートの先端からサンプルウェルまで略直線チャネルであり得る。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０、又はそれ以上の導管等、２つ以上の導管が存在することができる。約０．２ｍｍ～約１ｍｍ程度の長さを有する導管１０８の区分を使用することで、本明細書に記載のデバイス／リーダを含めて、サンプルが分析のために読み取られている間に、ウィッキング、エアポケットの形成、及びサンプルの損失を低減させる一助となる。
【0028】
測定及び分析の前に導管１０８内で維持可能なサンプルの大きさは、好適には、約２５μｌ～約２００μｌ、より好適には、約５０μｌ～約１５０μｌ、約５０μｌ～約１００μｌ、約５０μｌ～約８０μｌ、又は約４０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、若しくは約１００μｌ程度である。実施形態において、カートリッジ１００内に収容可能な全体積は、好適には、約５０μｌ～約１５０μｌ、約５０μｌ～約１００μｌ、約５０μｌ～約８０μｌ、又は約４０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、若しくは約１００μｌである。
【0029】
実施形態において、ハウジング１０２は、好適には、４つの光学的サンプルウェル１０４を具備し、４つの光学的サンプルウェルの２つは、光学的サンプルウェル内で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含む（かつ、好適に含む）ように構成される。他の実施形態において、ハウジング１０２は、２つの光学的サンプルウェル１０４を具備し得、２つの光学的サンプルウェルの１つは、光学的サンプルウェル内で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含む（かつ、好適に含む）ように構成される。
【0030】
光学的サンプルウェル１０４の大きさ、このため、好適には、ウェルと維持可能な体積は、ウェル壁の高さ、及びウェルの上部及び下部の直径により決定される。好適には、光学的サンプルウェル１０４は、約１００μｍ～約２０ｍｍ、より好適には、約１００μｍ～約１０ｍｍ又は約１００μｍ～約５ｍｍの程度の高さ、及び約１００μｍ～約２０ｍｍ、より好適には、約１００μｍ～約１０ｍｍ又は約１００μｍ～約５ｍｍの程度の直径を有する。実施形態において、光学的サンプルウェル１０４は、好適には、サンプルの約１μｌ～約５ｍＬ、又は約１μｌ～約１ｍＬ若しくは約１μｌ～約５００μＬ、約１μｌ～約５０μＬ、約１μｌ～約２０μＬ、約１μｌ～約１０μＬ、若しくは約１μｌ、約２μｌ、約３μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約６μｌ、約７μｌ、約８μｌ、約９μｌ、約１０μｌ、約１１μｌ、約１２μｌ、約１３μｌ、約１４μｌ、若しくは約１５μｌを保持する。
【0031】
本明細書に記載の通り、好適には、混合領域１４２は、血球溶解物を含む乾燥組成物を含む。本明細書で使用する「乾燥組成物」は、乾燥ケーク、粉末、結晶、又はフィルムを形成するために、凍結乾燥、冷凍乾燥、又はガラス化される物質を含む。冷凍乾燥又はガラス化の方法は、当業では公知である。乾燥組成物は、好適には、混合領域１４２上に（すなわち、領域の側面に）乾燥され、或いは本明細書に記載の通り、マニホールド区分１８８上で乾燥させられるものとして提供可能であり、或いは混合領域とともに／内に含まれるフリーペレットの形態であり得、或いは所望／必要に応じて、混合領域に付加可能である。
【0032】
本明細書で使用する用語「血球溶解物」は、（ｉ）甲殻類若しくは昆虫からの抽出、及び／又は（ｉｉ）ホストからの抽出後の生体外培養によって得られる、血球、例えば、変形細胞及び血リンパ細胞の溶解及び／又は膜透過化によって生成されるいかなる溶解物、又はその一部分若しくは成分を意味する。Ｃａ２＋イオノフォア等の膜透過化剤との接触によって血リンパ細胞から押し出された（すなわち、溶解以外によって押し出された）、又は細胞溶解なしのそれ以外の他の形で抽出された血球細胞物質も、血球溶解物であるとみなされる。
【0033】
典型的な血球溶解物は、甲殻類、例えば、カブトガニ又はイチョウガニの血液から調製された変形細胞溶解物である。本明細書で使用する用語「変形細胞溶解物」は、甲殻類、例えば、カブトガニから抽出された変形細胞からの細胞内容物の溶解、押出し、又は抽出によって生成されるいかなる溶解物、又はその一部分若しくは成分を意味すると理解される。変形細胞溶解物は、酵素カスケードの少なくとも１つの成分を含み、且つ／或いは、酵母又はかびによって生成されるエンドトキシン、例えば、グラム陰性菌エンドトキシン及び／又はグルカン、例えば、（１→３）－β－Ｄグルカンの存在下で凝固をもたらす。典型的な変形細胞溶解物は、リムルス属、例えば、リムルスポリフェムス、タキプレウス属、例えば、タキプレウスギガス及びタキプレウストリデンタトゥス、並びにカルシノスコルピウス属、例えば、カルシノスコルピウスロタンディカウダに属するカニを含むカブトガニから導出可能である。
【0034】
リムルス変形細胞溶解物（ＬＡＬ）は、その感度、特異性、及びサンプル中に存在しうる他の成分による干渉の回避のための相対的な容易さを理由に、多くの細菌エンドトキシンアッセイにおいて最適な変形細胞溶解物として用いられる。ＬＡＬは、細菌エンドトキシンを含むサンプル、及びオプションとして、特定のＬＡＬ基質と組み合わせられる場合、サンプル中のエンドトキシンと反応して、ゲル等の検出可能な生成物、混濁度の増大、又は合成発色基質の場合は着色された若しくは発光する生成物をもたらす。生成物は、例えば、目視又は光検出器の使用のいずれかによって検出され得る。
【0035】
細菌エンドトキシンがＬＡＬに接触した場合、エンドトキシンは、当業分野でＣ因子経路と称される一連の酵素反応を開始し、これらの酵素反応は、Ｃ因子、Ｂ因子、及びプロ凝固酵素と称される３つのセリンプロテアーゼ酵素前駆体を伴うことができる。エンドトキシンに露出されると、エンドトキシン感受性因子であるＣ因子が活性化される。その後、活性化されたＣ因子は、加水分解してＢ因子を活性化し、その結果、活性化されたＢ因子は、プロ凝固酵素を活性化して凝固酵素を生成する。その後、凝固酵素は、無脊椎動物のフィブリノゲン様の凝固性タンパクであるコアグロゲンの特有の箇所、例えば、Ａｒｇ１８－Ｔｈｒ１９及びＡｒｇ４６－Ｇｌｙ４７を加水分解して、コアギュリンゲルを生成する。米国特許第５，６０５，８０６号等を参照されたい。
【0036】
エンドトキシンに対する血球溶解物の感度を高めるための方法には、例えば、無制限に、未精製血球溶解物の経年劣化、ｐＨの調整、二価カチオンの濃度の調整、コアグロゲンの濃度の調整、クロロホルム抽出、並びに血清アルブミン、生体適合緩衝剤、及び／又は生物学的洗剤の添加が含まれる。
【0037】
例えば、実施形態において、本明細書に記載する乾燥組成物で使用するための血球溶解物は、コアグロゲンを実質上含まない精製血球溶解物であり得る。別の実施形態において、コアグロゲンを実質上含まない血球溶解物は、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬである。当業者であれば、本開示の解釈時に、様々な量のコアグロゲンが低減すると、その結果、発色アッセイ、例えば、ＬＡＬアッセイにおける速度、感度、及び／又は分離のレベルが増大することが理解されよう。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認された血球溶解物中の総タンパクに対して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、又は０．５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有する血球溶解物を指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認されたＬＡＬ中の総タンパクに対して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、又は０．５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認されたＬＡＬ中の総タンパクに対して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、又は０．５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有する精製ＬＡＬを指す。
【0038】
いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認された血球溶解物中の総タンパクに対して、１０％未満又は５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有する血球溶解物を指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認されたＬＡＬ中の総タンパクに対して、１０％未満又は５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、タンパク染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定され、ウエスタンブロットにより確認されたＬＡＬ中の総タンパクに対して、１０％未満又は５％未満（ｗｔ／ｗｔ）のコアグロゲンを有する精製ＬＡＬを指す。
【0039】
いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」という用語は、約２０μｇ／μＬ未満、約１５μｇ／μＬ未満、約１０μｇ／μＬ未満、約５μｇ／μＬ未満、約４μｇ／μＬ未満、約３μｇ／μＬ未満、約２μｇ／μＬ未満、又は約１μｇ／μＬ未満の濃度のコアグロゲンを有する血球溶解物を指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」は、約２０μｇ／μＬ未満、約１５μｇ／μＬ未満、約１０μｇ／μＬ未満、約５μｇ／μＬ未満、約４μｇ／μＬ未満、約３μｇ／μＬ未満、約２μｇ／μＬ未満、又は約１μｇ／μＬ未満の濃度のコアグロゲンを有するＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、用語「実質上含まない」という用語は、約２０μｇ／μＬ未満、約１５μｇ／μＬ未満、約１０μｇ／μＬ未満、約５μｇ／μＬ未満、約４μｇ／μＬ未満、約３μｇ／μＬ未満、約２μｇ／μＬ未満、又は約１μｇ／μＬ未満の濃度のコアグロゲンを有する精製ＬＡＬを指す。
【0040】
コアグロゲンを実質上含まない典型的なＬＡＬは、米国特許出願第２０１８／０２０８９６４号及び２０１８／００３８８６４号に記載され、両方の開示は、完全な形で参照により本明細書に組み込まれる。
【0041】
血球溶解物、例えば、ＬＡＬからコアグロゲンを除去するために、異なる方法を使用可能なことが、当業者には理解されよう。これらの方法は各々、効率、精製速度、コスト、及び労力に関して異なることがあるが、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態において、血球溶解物、例えば、ＬＡＬは、コアグロゲンを実質上含まず、該組成物は、（ａ）リムルスポリフェムスからの溶解変形細胞から導出された溶液を取得すること、（ｂ）（ａ）からの溶液を緩衝剤と組み合わせること、（ｃ）保持液を生成するために、（ｂ）からの組合せを、２０ｋＤａ～５０ｋＤａのメンブレンフィルタを使用する連続タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）にかけること、及び（ｄ）上澄み液を生成するために、（ｃ）からの保持液を２０，０００×ｇ超で２５分超にわたって遠心分離すること、を含む方法によって作られ、該上澄み液が、コアグロゲンを実質上含まない精製ＬＡＬである。
【0042】
いくつかの実施形態において、血球溶解物は、精製されたリムルス変形細胞溶解物である。コアグロゲンを実質上含まない用語「精製されたリムルス変形細胞溶解物」（又は「精製ＬＡＬ」）は、ＬＡＬの外観を曇らせる成分を除去するためにさらに処理された、上記記載のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを指す。実施形態において、精製ＬＡＬは、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを遠心分離することで生成される。いくつかの実施形態において、用語「精製ＬＡＬ」は、酵素を損傷することなく、ＬＡＬを目に見えて透明にするのに十分な期間にわたって、１８００ｇ超（すなわち、１８００×重力）、２２００ｇ超、２６００ｇ超、３０００ｇ超、３４００ｇ超、３８００ｇ超、４２００ｇ超、４６００ｇ超、５０００ｇ超、５４００ｇ超、５８００ｇ超、６０００ｇ超、６１００ｇ超、又は６２００ｇ超で遠心分離されたＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、用語「精製ＬＡＬ」は、酵素を損傷することなく、ＬＡＬを目に見えて透明にするのに十分な期間にわたって、１８００～８０００ｇ、２２００ｇ～７６００ｇ、２６００ｇ～７２００ｇ、３０００ｇ～７２００ｇ、３４００ｇ～７２００ｇ、３８００ｇ～７２００ｇ、４２００ｇ～７２００ｇ、４６００ｇ～７２００ｇ、５０００ｇ～７２００ｇ、５４００ｇ～７２００ｇ、５８００ｇ～７２００ｇ、又は６１００ｇ～７２００ｇで遠心分離されたＬＡＬを指す。
【0043】
いくつかの実施形態において、コアグロゲンを実質上含まない用語「精製されたリムルス変形細胞溶解物」（又は「精製ＬＡＬ」）は、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを２０，０００×ｇ超、２２，０００×ｇ超、２４，０００×ｇ超、２５，０００×ｇ超、２６，０００×ｇ超、２８，０００×ｇ超、３０，０００×ｇ超、３５，０００×ｇ超、４０，０００×ｇ超、４５，０００×ｇ超、又は５０，０００×ｇ超で遠心分離することで、ＬＡＬの外観を曇らせる成分を除去するためにさらに処理された、上記記載のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬは、２０，０００～５０，０００×ｇ、２０，０００～４０，０００×ｇ、２５，０００～５０，０００×ｇ、２５，０００～４０，０００×ｇ、又は３０，０００～４０，０００×ｇ超で遠心分離される。いくつかの実施形態において、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬは、２０分超、３０分超、４０分超、又は６０分超にわたって遠心分離される。いくつかの実施形態において、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬは、２０～１２０分、２０～９０分、２０～６０分、２０～４０分、又は約３０分にわたって遠心分離される。
【0044】
いくつかの実施形態において、用語「精製ＬＡＬ」は、３分超、４分超、５分超、６分超、７分超、８分超、９分超、又は１０分超にわたって遠心分離されたＬＡＬを指す。いくつかの実施形態において、用語「精製ＬＡＬ」は、３分～３０分、４分～２５分、４分～２０分、５分～１５分、又は５分～１０分にわたって遠心分離されたＬＡＬを指す。遠心分離速度をより遅くすると、遠心分離時間をより長く必要とする場合があり、それに応じて、時間及び／又は速度を調整することで、ＬＡＬの視覚的な曇りが低減されることが、当業者には理解されよう。いくつかの実施形態において、用語「精製ＬＡＬ」は、約３分～約１０分にわたって約５０００ｇ～約７０００ｇで、又は５分にわたって約６１２０ｇで遠心分離されたコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを指す。実施形態において、コアグロゲンを実質上含まない精製ＬＡＬは、リムルスポリフェムスからの溶解変形細胞から導出された溶液を２，０００ｒｐｍ（９８０ｇ）で８分にわたって４℃で遠心分離することで作られる。精製ＬＡＬは、遠心分離後の上澄み液中に確認される。いくつかの実施形態において、その結果得られる上澄み液を、その後、緩衝剤と組み合わせ、その結果得られる上澄み液及び緩衝剤の組合せを、その後、保持液を生成するために、３０ｋＤａのメンブレンフィルタを使用するタンジェンシャルフローフィルトレーションにかけて、上澄み液を生成するために、保持液を５，０００ｒｐｍ（６１２０ｇ）で５分にわたって４℃で遠心分離して、この上澄み液を、コアグロゲンを実質上含まない精製ＬＡＬとする。実施形態において、リムルスポリフェムスからの溶解変形細胞から導出された溶液は、複数のリムルスポリフェムス溶解変形細胞のプールである。
【0045】
いくつかの実施形態において、血球溶解物は、リムルスポリフェムスからの溶解変形細胞から導出された溶液を取得することで取得される。いくつかの実施形態において、該溶液を、その後、緩衝剤と組み合わせ、その結果得られる溶液及び緩衝剤の組合せを、その後、保持液を生成するために、２０ｋＤａ～５０ｋＤａのメンブレンフィルタを使用する連続タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）にかけて、上澄み液を生成するために、保持液を２０，０００×ｇ超で２５分超にわたって４℃で遠心分離して、この上澄み液を、コアグロゲンを実質上含まない精製ＬＡＬとする。実施形態において、溶解物は、リムルスポリフェムスからの溶解変形細胞又は複数のリムルスポリフェムス溶解変形細胞のプールから導出される。いくつかの実施形態において、連続ＴＦＦは、少なくとも４つのダイアフィルトレーション体積（ＤＶ）を含む。いくつかの実施形態において、連続ＴＦＦは、少なくとも５つのダイアフィルトレーション体積を含む。いくつかの実施形態において、連続ＴＦＦは、少なくとも６つのダイアフィルトレーション体積を含む。いくつかの実施形態において、連続ＴＦＦは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５個のダイアフィルトレーション体積を含む。
【0046】
本明細書に記載のカートリッジ、方法、及び組成物では、血球溶解物の凝固酵素によって切断される任意の発色基質を使用可能である。米国特許第５，３１０，６５７号は、例えば、式Ｒ１－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ａ４－Ｂ－Ｒ２を有する典型的な発色基質を記載しており、ここでＲ１は、水素、ブロッキング芳香族炭化水素、又はアシル基を表し、Ａ１は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、又はＬｅｕから選択されたＬ又はＤアミノ酸を表し、Ａ２は、Ｇｌｕ又はＡｓｐを表し、Ａ３は、Ａｌａ又はＣｙｓを表し、Ａ４は、Ａｒｇを表し、Ｂは、エステル及びアミドから選択された連鎖を表し、Ｒ２は、Ｂ連鎖を通過してアルギニンのＣカルボキシル末端に共有結合で取り付けられる発色又は発光発生基を表し、発光発生又は発色部分は、発色基質の残部から切断されて、クロモゲン又はフルオロゲンを生成することが可能である。典型的な発色基質は、コンセンサス配列、酢酸－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有し、ここでｐＮＡは、パラニトロアニリン基を表す。米国特許第４，１８８，２６４号は、配列Ｒ１－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｒ２のＬアミノ酸からなる構造を有するペプチド基質を記載しており、ここでＲ１は、Ｎ末端修飾アミノ酸を表し、Ｒ２は、酵素加水分解により解放されて、着色化合物ＨＲ２を発生可能な基である。米国特許第４，５１０，２４１号は、配列内でＧｌｙ部分がＡｌａ又はＣｙｓに置き換えられている理由で、以前の基質とは異なる発色ペプチド基質を開示している。その代わりとして、発色基質は、フルオロフォア、例えば、７－アミノ－４－メチルクマリン、７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン、及び４－メトキシ－２－ナフチルアミンを含み得る。
【0047】
様々な濃度の発色基質を使用可能である。いくつかの実施形態において、発色基質の濃度は、０．１ｇ／ｌ～０．５ｇ／ｌ、０．１ｇ／ｌ～０．４ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌ～０．４ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌ～０．３ｇ／ｌ、又は０．２ｇ／ｌ～０．２５ｇ／ｌである。
【0048】
アッセイの抑制又は促進は、試験サンプル中の物質が血球溶解物の反応と干渉する場合に生じる。抑制の結果、反応時間がより長くなり、試験サンプル中に実際に存在し得るものよりも微生物汚染レベルが低いことを示す。促進の結果、反応時間がより短くなり、試験サンプル中に実際に存在し得るものよりも微生物汚染レベルが高いことを示す。
【0049】
様々な乾燥組成物内で乾燥可能な血球溶解物、発色基質、及び／又は微生物汚染物質を代表する作用物質の典型的な量は、本明細書に記載されており、又はそれ以外では、当業者であれば容易に判定することができる。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約３０％～５０％の比の血球溶解物及び１０％～３０％の比の発色基質（ｖ／ｖ）が提供されるような量の成分を含む。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約３５％～約４５％の比の血球溶解物及び１５％～２５％の比の発色基質、又は約４０％の比の血球溶解物及び２０％の比の発色基質（ｗｔ／ｗｔ）が提供されるような量の成分を含む。他の実施形態において、乾燥組成物は、約３０％～５０％の比のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び１０％～３０％の比の発色基質（ｖ／ｖ）が提供されるような量の成分を含む。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約３５％～約４５％の比のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び１５％～２５％の比の発色基質、又は約４０％の比のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び２０％の比の発色基質（ｗｔ／ｗｔ）が提供されるような量の成分を含む。他の実施形態において、乾燥組成物は、約３０％～５０％の比の精製ＬＡＬ及び１０％～３０％の比の発色基質（ｖ／ｖ）が提供されるような量の成分を含む。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約３５％～約４５％の比の精製ＬＡＬ及び１５％～２５％の比の発色基質、又は約４０％の比の精製ＬＡＬ及び２０％の比の発色基質（ｗｔ／ｗｔ）が提供されるような量の成分を含む。
【0050】
いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約１μｇ～約５０μｇの血球溶解物及び約０．１μｇ～５μｇの発色基質、約１μｇ～約３０μｇの血球溶解物及び約０．５μｇ～４．０μｇの発色基質、又は約２μｇ～約２０μｇの血球溶解物及び約１．０μｇ～約３．０μｇの発色基質、又は約４μｇ～約２５μｇの血球溶解物及び約１．０μｇ～約２μｇの発色基質を含む。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約１μｇ～約５０μｇのコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び約０．１μｇ～約５μｇの発色基質、又は約１μｇ～約３０μｇのコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び約０．５μｇ～約５μｇの発色基質、又は約２μｇ～約２０μｇのコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び約１．０μｇ～約３．０μｇの発色基質、又は約１μｇ～約３０μｇのコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び約１．０μｇ～約２．０μｇの発色基質を含み、発色基質はＡｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約４μｇ～約２５μｇのコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ及び約１μｇ～約１．５μｇの発色基質を含み、発色基質はＡｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約１μｇ～約５０μｇの精製ＬＡＬ及び約０．１μｇ～約５μｇの発色基質、又は約１μｇ～約３０μｇの精製ＬＡＬ及び約０．５μｇ～約５μｇの発色基質、又は約２μｇ～約２０μｇの精製ＬＡＬ及び約１．０μｇ～約３．０μｇの発色基質、又は約１μｇ～約３０μｇの精製ＬＡＬ及び約１．０μｇ～約２．０μｇの発色基質を含み、発色基質はＡｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。いくつかの実施形態において、乾燥組成物は、約４μｇ～約２５μｇの精製ＬＡＬ及び約１μｇ～約１．５μｇの発色基質を含み、発色基質はＡｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡである。
【0051】
いくつかの実施形態において、微生物汚染物質制御は、約０．１ＥＵ／ｍｌ～１ＥＵ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、微生物汚染物質は、約０．１ＥＵ／ｍｌ～１ＥＵ／ｍｌの濃度の細菌エンドトキシンであり、１μｌ～１０μｌを使用する。
【0052】
好適な実施形態において、約１０％～約６０％の血球溶解物若しくは約２０％～約５０％の血球溶解物若しくは約３０％～約４０％の血球溶解物、又は約１０％～約６０％のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ若しくは約２０％～約５０％のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ若しくは約３０％～約４０％のコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを含む製剤を、冷凍乾燥させて乾燥組成物を得る。いくつかの実施形態において、約１０％～約６０％の精製ＬＡＬ又は約２０％～約５０％の精製ＬＡＬ又は約３０％～約４０％の精製ＬＡＬを含む製剤を、冷凍乾燥させる。冷凍乾燥させられる血球溶解物、コアグロゲンを実質上含まないＬＡＬ製剤、又は精製ＬＡＬ製剤の体積は、一般的に、約１μＬ～約１０μＬ程度である。さらなる実施形態において、該製剤は、約２０％～約３０％又は約２５％～約３０％の血球溶解物又はコアグロゲンを実質上含まないＬＡＬを含むことができ、堆積体積は、約３μＬ～約１０μＬ、又は約３μＬ～約８μＬ、又は約３．５μＬ～約７μＬである。さらなる実施形態において、該製剤は、約２０％～約３０％又は約２５％～約３０％の精製ＬＡＬを含むことができ、堆積体積は、約３μＬ～約１０μＬ、又は約３μＬ～約８μＬ、又は約３．５μＬ～約７μＬである。
【0053】
カートリッジ１００はまた、ｐＨ試験紙又はサンプルのｐＨを直接判定するために使用可能な他の好適な化合物又は組成物等のｐＨ指示薬を含むことができる。ｐＨ指示薬は、光学的サンプルウェル１０４に直接付随し得るが、カートリッジ１００の配向によって、導管１０８にも付随し得る。いずれの実施形態においても、ｐＨ指示薬は、サンプルのｐＨを測定するために容易に使用可能である。カートリッジ１００はまた、貯蔵及び自動データ収集等を容易にするために、カートリッジを識別するのに有用なバーコードを含むことができる。
【0054】
追加の実施形態において、例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示す通り、ハウジング１０２は、４つの光学的サンプルウェルを含むが、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等、他の又は追加の数の光学的サンプルウェルを利用することもできる。本明細書に記載の通り、実施形態において、４つの光学的サンプルウェルの２つは、光学的サンプルウェル上で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質をさらに含み、この作用物質は、様々な基質、溶解物等と同様に、本明細書に記載する方法が正確に機能していることを検証するための対照として作用することができる。他の実施形態において、ハウジング１０２は、２つの光学的サンプルウェルを含むことができ、一方のサンプルウェルは対照として、他方は試験ウェルとして作用し、又は４、６、８、１０、１２、１４個等の光学的サンプルウェルを含むことができ、光学的サンプルウェルの一部（例：２、４、６、８個等）は対照として機能し、他の光学的サンプルウェルは試験ウェルとして機能する。
【0055】
抑制又は促進の欠如を検証するために、対照用の光学的サンプルウェルは、好適には、測定すべき微生物汚染物質を代表する既知量の作用物質で「スパイク」される。好適には、微生物汚染物質のスパイクの結果、サンプル中の最終微生物汚染物質濃度が、ログベースで、検量線における微生物汚染物質濃度の最高標準と最低標準との間の中間点に近づく。例えば、検量線が５０エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ～０．００５ＥＵ／ｍＬに及ぶアッセイにおいて、サンプルをスパイクして、約０．５ＥＵ／ｍＬの最終微生物汚染物質濃度を含むことができる。検量線が１ＥＵ／ｍＬ～０．０１ＥＵ／ｍＬに及ぶアッセイにおいて、微生物汚染物質によるスパイクの結果、約０．１ＥＵ／ｍＬの最終微生物汚染物質濃度を得ることができる。
【0056】
好適には、「スパイク」又は既知量の測定対象の微生物汚染物質を代表する作用物質が、光学的サンプルウェル上で乾燥させられる。スパイクされたサンプル（複数含む）は、スパイクされていないサンプル又は試験サンプルと並行して分析される。その後、結果得られるスパイクされていないサンプル中の微生物汚染物質濃度、及びスパイクされたサンプル中で回収された微生物汚染物質が計算及び比較される。回収された微生物汚染物質は、好適には、約５０％～２００％の範囲内でスパイクの既知濃度に等しい。サンプル（又は希釈液）が反応を抑制又は促進することが確認されたら、該サンプルは、抑制又は促進が解消されるまで、さらなる希釈液を必要とすることがある。最初は、サンプルの１０倍の希釈液を試験することで、抑制又は促進を検査することが望ましい場合がある。
【0057】
追加の実施形態において、混合領域１４２中の乾燥組成物は、本明細書に記載するカートリッジを追加の反応に使用可能なように、他の様々な試薬／反応物質を含むことができる。このような実施形態において、冷凍乾燥又はガラス化された乾燥組成物として所定の量の所望の反応物質（例：緩衝剤、酵素、安定剤等）が含まれている混合領域１４２へサンプルを導入することができると、エンドトキシン検出以外に様々な追加の試験の機会のためのプラットホームが提供される。
【0058】
実施形態において、図１Ｆに示す通り、ハウジング１０２は、サンプル遮断機構、好適には、光学的サンプルウェル１０４内のサンプル体積の充填及び維持の一助となる液体不透過性膜１２１を含む。本明細書で使用する「液体不透過性膜」は、空気が基質を通過することを可能にするが、液体はほとんど通さず、好適には、いかなる液体も膜を通過させない基質を指す。このような膜の例には、例えば、ポリ（プロピレン）膜、ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）膜、他のフルオロポリマー等を含む様々なゴム及びポリマーが含まれる。好適には、液体不透過性膜１２１は、光学的サンプルウェル１０４に流体的に接続されており、それにより、光学的サンプルウェルを充填する液体サンプルは、液体不透過性膜に接触し、液体不透過性膜に当たると流れを停止し、このため、光学的サンプルウェルの各々の中のサンプルの体積（複数含む）を同じ（又は同じ体積の約１～１０％の範囲内）になるように維持し、その結果、サンプル同士を互いに比較することができる。
【0059】
実施形態において、図１Ｃ～図１Ｅに示す通り、カートリッジ１００は、ハウジング１０２を具備し、好適には、カートリッジ１００を形成するように互いに機械的に接続された３つの個々の区分、例えばカバー区分１８４、下部区分１８６及びマニホールド区分１８８から作製される。ともに接続された３つの区分を利用することで、カートリッジ１００の様々な部分をより容易に作製し、並びに組み立てることが可能になる。例えば、導管１０８、流体入口ポート１０６、並びに光学的サンプルウェル１０４を構成するチャネル、マイクロチャネル又は管材は、下部区分１８６に事前に形成又は配置することができ、その後、カバー区分１８４及びマニホールド区分１８８とともに接続して、完成したカートリッジ１００を形成することができる。
【0060】
カートリッジ１００の区分を機械的に接続する方法には、様々な接着剤若しくはのり、レーザ溶接、超音波溶接、機械式ねじ、又は自己嵌合式コネクタ、並びにバンド又はクリップが含まれる。追加の実施形態において、２つの区分間の機械的接続は、熱溶融又は熱接合により実施することができる。実施形態において、ハウジング１０２の様々な区分（１８４、１８６、１８８）を射出成形し、その後、互いに熱接合又は溶融接合することができ、それによって、好適には、導管１０８、光学的サンプルウェル１０４、及び流体入口ポート１０６を封じることができる。さらなる実施形態において、ハウジング１０２のカバー区分１８４、下部区分１８６及びマニホールド区分１８８のうちの１つ又は全部は、不透明なプラスチックを使用して作製可能で、それにより、測定中にハウジングを通過する望ましくない光を低減させ、クロストークを低減させる。
【0061】
実施形態において、図１Ａ～図１Ｅに示す通り、本明細書に提供されるのは、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジ１００であって、該カートリッジは、カバー区分１８４、カバー区分１８４に機械的に接続された下部区分１８６及び下部区分１８６に機械的に接続されたマニホールド区分１８８を具備するハウジング１０２を具備する。
【0062】
【0063】
カバー区分１８４は、好適には、様々な構成要素を接続するための様々な切欠き及び接続点（図１Ｃを参照）を含み、好適には、透明なプラスチック又は高分子組成物から構成される。
【0064】
下部区分１８６は、好適には、４つの光学的サンプルウェル１０４と、流体入口ポート１０６と、流体入口ポート及び光学的サンプルウェルを流体的に接続する導管１０８と、を具備するプラスチック要素である。図１Ｆを参照されたい。導管１０８は、好適には、下部区分１８６の構造体内に形成された切欠き又はチャネルであるが、他の実施形態において、下部区分に付加されるマイクロ流体チャネル又は管材であり得る。図１Ｆ～図１Ｇは、導管１０８が下部区分１８６の１つの側面に沿って連続的に通過し、導管内に、吸引領域１４０、流体制限器１４４、及び混合領域１４２を含む、下部区分１８６の１つの実施形態を示す。導管１０８のこの単一平面の実施形態は、導管１０８の構成要素のすべてが同一平面に存在する図１Ｇにさらに示され得る。図２Ａ及び図２Ｂはまた、導管１０８が流体入口ポート１０６からサンプルウェル１０４にわたって、下部区分１８６の全長を通過する、この平面の実施形態を示す。図２Ｂは、導管１０８を通過した、下部区分１８６の断面を示す。図２Ａに示すサンプルウェル１０４は、本質的に、サンプルウェルの側壁であり、ウェルの上部及び下部は、それぞれカバー区分１８４及びマニホールド区分１８８により提供される。図２Ａは、導管１０８の長さに沿った、吸引領域１４０、流体制限器１４４及び混合領域１４２の典型的な位置を示す。
【0065】
別の実施形態において、図１Ｄに示す通り、下部区分１８６は、下部区分の１つの側面上で開始し、その後、下部区分１８６を通過して、他の側面まで横断する導管１０８を具備可能である。例えば、図２Ｃ及び図２Ｄに示す通り、導管は、サンプル入口ポート１０６に接続された、下部区分１８６の「上部」で開始する。導管１０８は、その後、第１の貫通孔２０６での下部区分１８６を通過して、下部区分１８６の「下部」側面まで、さらに、サンプルウェル１０４に接続する前に、第２の貫通孔２０６で後退し、下部区分の「上部」側面まで横断する。この「通過」はまた、図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｄで見ることができる。図２Ｃは、下部区分１８６の「上部」の吸引領域１４０及び流体制限器１４４の位置を示す。混合領域１４２は、図２Ｄに示す断面で、下部区分１８６の下方で見ることができる。
【0066】
カートリッジ１００のマニホールド区分１８８は、好適には、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された混合部分５２０を具備し、混合部分５２０は、導管１０８の混合領域１４２に対応する。すなわち、マニホールド区分１８８の混合部分５２０は、該区分が接続されて、カートリッジを形成する場合、下部区分１８６内の導管１０８の混合領域１４２に一致する。好適な実施形態において、マニホールド区分１８８はまた、サンプルウェル部分５０４を具備する。
【0067】
図３Ａは、下部区分１８６を示し、導管１０８は、下部区分１８６の１つの側面に沿って、サンプル入口ポート１０６からサンプルウェル１０４まで、ハウジング１０２の長い又は細い区間１１９の長さを通る単一チャネルである。図３Ａは、下部区分１８６の図を示し、導管１０８は、下部区分１８６内に形成されたチャネルである。図５Ａは、図３Ａの切欠き３０２で下部区分１８６内に装入するであろうマニホールド区分１８８の実施形態を示す。図５Ａに示すマニホールド区分１８８は、好適には、カバー区分１８４と下部区分１８６とともに接続される場合、サンプルウェル１０４の「下部」を形成する、サンプルウェル部分５０４を具備する。
【0068】
図３Ｂは、導管１０８が第１及び第２の貫通孔２０６を介して、下部区分を通過して横断する、下部区分１８６の別の実施形態を示す。図３Ｂに記載の通り、導管１０８は、下部区分１８６内に形成されたチャネルとして開始し、その後、第１の貫通孔２０６を介して通過する。図３Ｂは、図５Ｂ記載のマニホールド区分１８８がその中に配置可能な切欠き３０４を示す。図５Ｂのマニホールド区分１８８は、好適には、カバー区分１８４及び下部区分１８６、並びに下部区分１８６の混合領域１４２に対応する（すなわち、合致する）混合部分５２０とともに接続される場合、サンプルウェル１０４の「下部」を形成する、サンプルウェル部分５０４を具備する（図１Ｂ、図１Ｅ、図２Ｄ及び図３Ｂを参照）。図１Ｅはまた、完全なカートリッジ１００を形成するために、カバー区分１８４及び下部区分１８６に接続される前の、図５Ｂからのマニホールド１８８を示す（マニホールド区分１８８が好適に装入するカートリッジの「下部」の図を示す図１Ｂも参照）。
【0069】
図４Ａ及び図４Ｂは、典型的なカバー区分１８４を示し、図４Ａのカバー区分が単一チャネル導管１０８と嵌合し、図５Ｂのカバー区分が下部区分を通過する導管１０８と嵌合する。レーザ溶接４０２が生じ得る典型的な領域を示す。
【0070】
本明細書に記載の通り、カートリッジ１００は、好適には、ハウジング１０２に付随し、流体入口ポート１０６、導管１０８及び（２つの）光学的サンプルウェル１０４に流体的に接続されたポンプ機構１１０を具備する。いずれかの設計により、ポンプ機構１１０は、好適には、図３Ａ及び図３Ｂに示す通り、下部区分１８６へ一体型となる（すなわち、下部区分１８６の部分をなす）。実施形態において、ポンプ機構は、３位置シリンジであって、第１の位置が、真空を生成して、サンプルを吸引領域１４０内へ導入し、第２の位置が、吸引領域１４０から流体制限器１４４を通過して混合領域１４２への輸送を提供し、第３の位置が、混合領域１４２からサンプルウェル１０４への輸送を提供する。
【0071】
好適には、典型的な実施形態と図に示す通り、下部区分１８６は、４つの光学的サンプルウェルを具備し、４つの光学的サンプルウェルの２つが、光学的サンプルウェル内で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含むように構成される。実施形態において、マニホールド区分１８８は、好適には、マニホールド区分のサンプルウェル部分５０４上で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含む（図５Ａ又は図５Ｂ）。実施形態において、マニホールド区分１８８は、カートリッジの要素が接続される場合、マニホールドが構成要素の両方を混合領域１４２に提供するように、マニホールド区分１８８の混合部分５２０上で乾燥させられた発色基質をさらに含む。好適な実施形態において、血球溶解物は、リムルス変形細胞溶解物であり、サンプルウェル内の作用物質は、細菌エンドトキシンである。
【0072】
このため、実施形態において、マニホールド区分１８８は、好適には、本明細書に記載のアッセイに有用な乾燥構成要素のすべてで作製される。好適には、マニホールド１８８のサンプルウェル部分５０４は、その上で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含み、マニホールド区分１８８の混合部分５２０は、その上で乾燥させられた混合領域１４２に提供される血球溶解物及び発色基質の両方を含む。マニホールド区分１８８は、このため、カートリッジの別個に提供された要素であり得、取外し・置き換え可能なもので、所望であれば、カートリッジの再利用を可能にする。
【0073】
マニホールド区分１８８はまた、レンズ５０２を具備可能で、混合領域１４２に流入及び／又はそこから流出するサンプル流体の監視を可能にする。このレンズ５０２は、レーザ又は他の光に基づいた機構により光学的に監視可能で、分析処置の間、流体サンプルの位置及び配置を確認する。
【0074】
検出方法
さらに、本明細書に提供されるのは、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法である。実施形態において、該方法は、好適には、サンプルを本明細書に記載のカートリッジの流体入口ポート内へ導入することを含む。例えば、サンプルは、容器内に保持され得、或いは反応プロセス若しくはバッチ、又は薬剤溶液から直接引かれ得る。好適には、サンプルを、ポンプ機構１１０、好適には、３位置シリンジを介して真空を生成することで、サンプル導入方向１１４を介して導入し、サンプルを流体入口ポート１０６内へ導入する。サンプルはまた、さらに好適には、ポンプ機構により生成される真空により、この初期プロセスにおいて導管１０８へ伝達される。好適には、サンプルは、導管１０８の吸引領域１４０へ伝達される。
さらに、本明細書に提供されるのは、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法である。実施形態において、該方法は、好適には、サンプルを本明細書に記載のカートリッジの流体入口ポート内へ導入することを含む。例えば、サンプルは、容器内に保持され得、或いは反応プロセス若しくはバッチ、又は薬剤溶液から直接引かれ得る。好適には、サンプルを、ポンプ機構１１０、好適には、３位置シリンジを介して真空を生成することで、サンプル導入方向１１４を介して導入し、サンプルを流体入口ポート１０６内へ導入する。サンプルはまた、さらに好適には、ポンプ機構により生成される真空により、この初期プロセスにおいて導管１０８へ伝達される。好適には、サンプルは、導管１０８の吸引領域１４０へ伝達される。
【0075】
その後、ポンプ機構１１０は、好適には、３位置シリンジであって、第２の位置に配置され、サンプルを導管１０８（好適には、吸引領域１４０）から導管１０８の混合領域１４２まで伝達する。実施形態において、この伝達は、吸引領域１４０から流体制限器１４４を通過して混合領域１４２まで生じる。
【0076】
該サンプルは、その後、好適には、混合サンプルを生成するために、血球溶解物及び発色基質と混合される。本明細書に記載の通り、この混合は、好適には、例えば、磁石により混合領域内で、要素を回転又は並進させることで、磁気混合要素１４６により生じる。混合サンプルは、その後、混合領域から光学的サンプルウェル１０４まで伝達される。好適には、サンプルの伝達又は輸送は、光学的サンプルウェルに流体的に接続される、液体不透過性膜１２１により停止される。本明細書に記載の通り、該輸送を停止することで、光学的サンプルウェルの各々が、体積を略均一として充填可能で（体積が互いの約１０％以内、好適には、約５％、又は約１％以内で変化するように）、光学的サンプルウェル間の比較を可能にする。
【0077】
方法は、光学的サンプルウェル内のサンプルの光学的特性を測定することをさらに含む。微生物汚染物質の存在を検出する方法において、光学的特性の変化が、サンプル中の微生物汚染物質の存在を示す。
【0078】
本明細書に記載の通り、光学的特性は、好適には、事前選択された光の波長におけるサンプルの吸収度であって、光学的特性の変化は、吸収度の変化である。測定される光学的特性は、特定の波長における吸収度、特定の波長における透過度、特定の波長における蛍光性、又は光学的密度の変化（例：増大又は減少）であり得る。例えば、光学的特性は、約２００ｎｍ～約７００ｎｍの範囲内、より好適には、約３５０ｎｍ～約４５０ｎｍの範囲内、若しくは約４００ｎｍ～約４１０ｎｍ、又は約４０５ｎｍの波長における吸収度又は透過度の変化であり得る。
【0079】
本明細書に記載の通り、カートリッジ１００のカバー区分１８４、下部区分１８６及びマニホールド区分１８８を封止又は接続するための典型的な機構には、レーザ溶接及び超音波溶接が含まれる。好適には、これらの区分の１つ以上は、少量（例：０．５～１０重量％、好適には、２～５重量％）のカーボンブラックを含有するポリスチレン等の高分子材料から作製される。該区分の１つ以上にカーボンブラックを含有することで、該区分をともにレーザ溶接することが可能になる。レーザ溶接を実施する方法は、例えば、開示が完全な形で参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｌｉｅｎの「Ｌａｓｅｒ Ｗｅｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃｓ」、Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、ドイツ（２０１２）に開示されているように、当業分野では公知である。レーザ溶接を使用することで、液体不透過性膜の熱に起因する劣化に関係する問題が緩和される。
【0080】
超音波溶接の方法は、例えば、開示が完全な形で参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈｏｈの「Ｗｅｌｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃｓ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ」、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ １４：２０９－２１７（１９７６）に開示されているように、当業分野では公知である。超音波溶接を使用することで、液体不透過性膜の熱に起因する劣化に関係する問題が緩和される。
【0081】
典型的な実施形態において、光学的サンプルウェル１０４内にサンプルを含む、本明細書に記載のカートリッジ１００は、図６に示す等により、測定デバイス又はリーダデバイス６００内へ挿入可能である。図６のリーダデバイス６００は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に記載のカートリッジの読み取り又は分析の方法を含めて、本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。カートリッジ１００は、好適には、サンプルの光学的特性の測定が実施可能なように、リーダデバイス６００に挿入可能である。図示の通り、リーダデバイス６００は、好適には、手持ち式又は容易に携帯可能なデバイスであり、様々な研究室又は臨床環境に採用可能で、簡便なタッチスクリーンコマンドを介して容易に操作・制御することができる。リーダデバイス６００の典型的な構成要素は、約３５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、若しくは約４００ｎｍ～約４１０ｎｍ、又は約４０５ｎｍの波長の光を生成可能な光源、好適には、ＬＥＤ光源を含むことができる。さらに、リーダデバイス６００内には、ライトパネル（例えば、ライトガイド、鏡、プリズム等）が含まれ、光学的サンプルウェル１０４の各々に照明を提供して、検出器、好適には、フォトダイオードのアレイにより読み取り可能な信号チャネルを提供する。正しい光の強度及び波長が提供されているか否かを判定するための対照として、さらなる基準チャネルが提供される。リーダデバイス６００はまた、例えば、サンプルの温度を、好適には、約２５℃～約４０℃に維持するために加熱器を具備可能で、酵素反応を容易にする。典型的な加熱器は、ポリイミド、例えば、デュポンカプトン（ＤＵＰＯＮＴ ＫＡＰＴＯＮ）（登録商標）、及びシリコーンゴムの可撓性フィルムから作製可能である。吸収量の判定及び／又は定量化を実行するためのコンピュータ回路等のリーダデバイス６００の他の様々な構成要素は、当業分野では公知であり、このようなデバイス内へ容易に組み込むことができる。
【0082】
カートリッジ１００をリーダデバイス６００内に挿入すると、加熱器により加熱を行い、所望の酵素反応を容易にすることができる。サンプルを含む光学的サンプルウェル１０４を介して、光が提供され、検出器、好適には、フォトダイオードで吸収度が読み取られる。その後、様々な光学的サンプルウェルからの吸収度が比較され、好適には、光学的サンプルウェルのうちの１つ以上が、微生物汚染物質を含む対照として作用する。その後、例えば、標準較正検量線に対して、サンプル中の量と対照中の量を比較することで、サンプル中のエンドトキシンの存在及び／又は量を判定可能である。当業者であれば、既知量のエンドトキシンの吸収度を使用して、このような標準較正検量線を容易に作製可能である。追加の実施形態において、リーダデバイス６００には、試験サンプル中のエンドトキシンの量を判定するために、オペレータが使用可能な保存（すなわち、リーダデバイスに保持され、当初提供される）検量線、又は所定の検量線も提供可能である。このような保存検量線又は所定の検量線は、様々なエンドトキシンに対して提供可能で、必要に応じて、ユーザが、例えば、保守データベースから検量線をダウンロードすること等によって更新可能である。複数のカートリッジ１００をリーダデバイス６００内へ挿入し、同時に読み取ることができ、多くの異なるサンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は数量を同時に判定可能にする。
追加の典型的な実施形態
追加の典型的な実施形態
【0083】
実施形態は、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジであって、光学的サンプルウェル、流体入口ポート及び流体入口ポートと光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備する、ハウジングと、ハウジングに付随し、流体入口ポート、導管及び光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された導管に沿って配置された混合領域と、を具備する、カートリッジである。
【0084】
実施形態２は、ハウジングが、４つの光学的サンプルウェルを具備し、４つの光学的サンプルウェルの２つが、光学的サンプルウェル内で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含むように構成される、実施形態１に記載のカートリッジを具備する。
【0085】
実施形態３は、混合領域内で乾燥させられた発色基質をさらに含む、実施形態１又は２に記載のカートリッジを具備する。
【0086】
実施形態４は、ハウジングが、互いに機械的に接続されたカバー区分と下部区分とを具備する、実施形態１～３のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0087】
実施形態５は、ハウジングが、下部区分に機械的に接続されたマニホールド区分をさらに具備し、乾燥組成物が、マニホールド区分の混合部分上で乾燥させられる、実施形態４に記載のカートリッジを具備する。
【0088】
実施形態６は、混合部分が、その上で乾燥させられた発色基質をさらに含む、実施形態５に記載のカートリッジを具備する。
【0089】
実施形態７は、マニホールド区分が、マニホールド区分のサンプルウェル部分上で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質をさらに含む、実施形態５又は６に記載のカートリッジを具備する。
【0090】
実施形態８は、混合領域が、その中に含まれる磁気攪拌要素を具備する、実施形態１～７のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0091】
実施形態９は、導管が、流体入口ポートと混合領域との間に配置される、吸引領域と流体制限器とを具備する、実施形態１～８のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0092】
実施形態１０は、血球溶解物が、リムルス変形細胞溶解物である、実施形態１～９のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0093】
実施形態１１は、微生物汚染物質を代表する作用物質が、細菌エンドトキシンである、実施形態２に記載のカートリッジを具備する。
【0094】
実施形態１２は、ポンプ機構が、３位置シリンジであり、第１の位置が、真空を生成して、サンプルを吸引領域内へ導入し、第２の位置が、吸引領域から流体制限器を通過して混合領域への輸送を提供し、第３の位置が、混合領域からサンプルウェルへの輸送を提供する、実施形態９～１１のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0095】
実施形態１３は、サンプル中の微生物汚染物質の存在及び／又は量を判定するためのカートリッジであって、カバー区分、カバー区分に機械的に接続された下部区分及び下部区分に機械的に接続されたマニホールド区分を具備する、ハウジングであって、下部区分が、２つの光学的サンプルウェル、流体入口ポート、及び流体入口ポートと光学的サンプルウェルとを流体的に接続する導管を具備し、導管が、吸引領域、流体制限器及び混合領域を具備し、マニホールド区分が、血球溶解物を含む乾燥組成物を含むように構成された混合部分を具備し、混合部分が、導管の混合領域に対応する、ハウジングと、ハウジングに付随し、流体入口ポート、導管及び２つの光学的サンプルウェルに流体的に接続されたポンプ機構と、を具備する、カートリッジである。
【0096】
実施形態１４は、下部区分が、４つの光学的サンプルウェルを具備し、４つの光学的サンプルウェルの２つが、光学的サンプルウェル内で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質を含むように構成される、実施形態１３に記載のカートリッジを具備する。
【0097】
実施形態１５は、マニホールド区分が、マニホールド区分のサンプルウェル部分上で乾燥させられた微生物汚染物質を代表する作用物質をさらに含む、実施形態１４に記載のカートリッジを具備する。
【0098】
実施形態１６は、マニホールド区分の混合部分上で乾燥させられた発色基質をさらに含む、請求項１３～１５のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0099】
実施形態１７は、ポンプ機構が、下部区分に統合され、ポンプ機構が、３位置シリンジであり、第１の位置が、真空を生成して、サンプルを吸引領域内へ導入し、第２の位置が、吸引領域から流体制限器を通過して混合領域への輸送を提供し、第３の位置が、混合領域からサンプルウェルへの輸送を提供する、請求項１３～１６のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0100】
実施形態１８は、血球溶解物が、リムルス変形細胞溶解物である、実施形態１３～１７のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0101】
実施形態１９は、作用物質が、細菌エンドトキシンである、実施形態１４～１８のいずれかに記載のカートリッジを具備する。
【0102】
実施形態２０は、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法であって、サンプルを、実施形態３に記載のカートリッジの流体入口ポート内へ導入し、サンプルを導管へ伝達すること、サンプルを導管の混合領域内へ伝達すること、混合サンプルを生成するために、サンプルを血球溶解物及び発色基質と混合すること、混合サンプルを混合領域からサンプルウェルへ伝達すること、及び光学的サンプルウェル内の混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、光学的特性の変化が、サンプル中の微生物汚染物質の存在を示す、方法である。
【0103】
実施形態２１は、光学的特性を測定することが、事前選択された波長における光の吸収度の変化である、実施形態２０に記載の方法を含む。
【0104】
実施形態２２は、事前選択された波長における光の吸収度の変化が、検量線と比較される、実施形態２１に記載の方法を含む。
【0105】
実施形態２３は、検量線が、保存検量線である、実施形態２２に記載の方法を含む。
【0106】
実施形態２４は、サンプルを導入することが、サンプルを流体入口ポート及び導管内へ導入するために、ポンプ機構を介して真空を生成することを含む、実施形態２０～２３のいずれかに記載の方法。
【0107】
実施形態２５は、伝達することが、ポンプ機構を介して、サンプルを混合領域から光学的サンプルウェルへ輸送することを含む、実施形態２０～２４のいずれかに記載の方法。
【0108】
実施形態２６は、サンプル中の微生物汚染物質の存在を検出するための方法であって、サンプルを、実施形態１６に記載のカートリッジの流体入口ポート内へ導入し、サンプルを吸引領域へ伝達すること、サンプルを吸引領域から流体制限器を通過して混合領域へ伝達すること、混合サンプルを生成するために、サンプルを血球溶解物及び発色基質と混合すること、混合サンプルを光学的サンプルウェルへ伝達すること、及び光学的サンプルウェル内の混合サンプルの光学的特性を測定すること、を含み、光学的特性の変化が、サンプル中の微生物汚染物質の存在を示す、方法である。
【0109】
実施形態２７は、光学的特性を測定することが、事前選択された波長における光の吸収度の変化である、実施形態２６に記載の方法を含む。
【0110】
実施形態２８は、事前選択された波長における光の吸収度の変化が、検量線と比較される、実施形態２７に記載の方法を含む。
【0111】
実施形態２９は、検量線が、保存検量線である、実施形態２８に記載の方法を含む。
【0112】
実施形態３０は、サンプルを導入することが、サンプルを流体入口ポート及び吸引領域内へ導入するために、ポンプ機構を介して真空を生成することを含み、ｂ）において伝達することが、ポンプ機構を介して、サンプルを吸引領域から混合領域へ輸送することを含み、ｄ）において伝達することが、ポンプ機構を介して、混合サンプルを混合領域から光学的サンプルウェルへ輸送することを含む、実施形態２６～２９のいずれかに記載の方法を含む。
【0113】
本実施形態のいずれかの範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び用途に他の好適な修正及び適合を加えることができることが、関連技術の当業者には容易に明らかである。
【0114】
特定の実施形態について本明細書に図示及び説明をしたが、特許請求の範囲又は項目は、説明及び図示される部分の特定の形態又は配列に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において、例示的な実施形態を開示しており、特定の用語を用いたが、これらの用語は、限定の目的ではなく、一般的且つ記述的な意味でのみ使用される。上記の教示を鑑みて、実施形態の修正及び変更が可能である。したがって、具体的に記載したもの以外の方法でも実施形態を実施可能であることを理解されたい。
【0115】
本明細書に記載のすべての公報、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の公報、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に指摘された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【国際調査報告】