特表 2022-545226 神経学的疾患のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-26

(54)【発明の名称】神経学的疾患のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20221019BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20221019BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20221019BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20221019BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221019BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221019BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221019BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20221019BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20221019BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/30 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20221019BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20221019BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20221019BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K14/705 ZNA

C07K19/00

C12N15/10 200Z

C12N15/12

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/869 Z

C12N7/01

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61P43/00 111

A61P25/02

A61P25/00

A61P13/02

A61P25/04

A61P25/28

A61P25/16

A61P1/00

A61P25/22

A61P25/30

A61P25/24

A61P9/10

A61P1/02

A61P9/06

A61K38/16

A61P11/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022510971

(86)(22)【出願日】2020-08-21

(85)【翻訳文提出日】2022-03-22

(86)【国際出願番号】 US2020047503

(87)【国際公開番号】W WO2021035179

(87)【国際公開日】2021-02-25

(31)【優先権主張番号】62/889,963

(32)【優先日】2019-08-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518090029

【氏名又は名称】コーダ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ラウ， アンソニー ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】キーファー， オリオン ピー． ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】マキンソン， ステファニー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA02

4C084BA22

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA01

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4C084ZA08

4C084ZA12

4C084ZA15

4C084ZA16

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4C084ZA66

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4C086AA01

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4C086MA56

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4C086NA14

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4C086ZA12

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4C086ZA36

4C086ZA59

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4C086ZA81

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4C087AA02

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA08

4C087ZA12

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA20

4C087ZA36

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA81

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA45

4H045DA50

4H045EA21

4H045FA74

(57)【要約】

操作された受容体、操作された受容体をコードするポリヌクレオチド、および操作された受容体をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを使用して、細胞の活性を調節するための組成物および方法が提供される。これらの組成物および方法は、例えば、疾患の治療または神経回路の研究における、ニューロンの活性の調節に特定の用途を見出す。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

操作された受容体であって、
ａ．ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）に由来し、ヒトグリシン受容体α１サブユニットからのＣｙｓ－ループドメインを含むリガンド結合ドメインと、
ｂ．前記ヒトグリシン受容体α１サブユニットに由来するイオン孔ドメインと、を含み、
前記リガンド結合ドメインが、（ｉ）Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換、または（ｉｉ）Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲの前記アミノ酸残基に対応し、
前記操作された受容体が、キメラリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）受容体である、操作された受容体。

【請求項1】

前記操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に前記二つのアミノ酸置換、またはＬ１３１Ｅの前記アミノ酸置換をさらに含み、前記アミノ酸残基が、α７－ｎＡＣｈＲの前記アミノ酸残基に対応する、請求項１に記載の操作された受容体。

【請求項2】

前記リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換を含む、請求項１または１．１に記載の操作された受容体。

【請求項3】

前記リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換を含む、請求項１、１．１、または２のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項3】

前記操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項4】

前記リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含む、請求項１または１．１に記載の操作された受容体。

【請求項4】

前記操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項5】

前記Ｃｙｓ－ループドメインが、配列番号２のアミノ酸１６６～１７２を含む、請求項１～４．１のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項6】

前記Ｃｙｓ－ループドメインが、配列番号２のアミノ酸１６６～１８０を含む、請求項１～４．１のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項7】

前記受容体が、前記ヒトグリシン受容体α１サブユニットからのβ１～２ループドメインを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項8】

前記β１～２ループドメインが、配列番号２のアミノ酸８１～８４を含む、請求項７に記載の操作された受容体。

【請求項8】

前記操作された受容体が、配列番号５８～６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項9】

アセチルコリンに対する前記操作された受容体の効力が、アセチルコリンに対する前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも低い、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項10】

アセチルコリンに対する前記操作された受容体の効力が、アセチルコリンに対する前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも２倍低い、請求項９に記載の操作された受容体。

【請求項11】

非天然リガンドに対する前記操作された受容体の効力が、前記非天然リガンドに対する前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力とほぼ同じである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項12】

非天然リガンドに対する前記操作された受容体の効力が、前記非天然リガンドに対する前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも高い、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項13】

前記非天然リガンドに対する前記操作された受容体の効力が、前記非天然リガンドに対する前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも２倍高い、請求項１２に記載の操作された受容体。

【請求項14】

前記効力を決定することが、ＥＣ５０を決定することを含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項15】

非天然リガンドの存在下での前記操作された受容体の有効性が、前記非天然リガンドの存在下での前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも高い、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項16】

非天然リガンドの存在下での前記操作された受容体の有効性が、前記非天然リガンドの存在下での前記ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも少なくとも２倍高い、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項17】

前記有効性を決定することが、前記非天然リガンドの存在下でインビトロで前記操作された受容体を通過する電流の量を決定することを含む、請求項１５～１６のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項18】

前記非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＴＣ－６９８７、ＡＢＴ－１２６、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の操作された受容体。

【請求項19】

前記非天然リガンドが、ＡＢＴ－１２６、ＲＧ３４８７、およびＡＰＮ－１１２５からなる群から選択される、請求項１８に記載の操作された受容体。

【請求項20】

前記非天然リガンドがＴＣ－５６１９である、請求項１８に記載の操作された受容体。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項22】

前記ポリヌクレオチドが、前記操作された受容体をコードする前記核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項23】

前記プロモーターが、調節可能なプロモーターである、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項24】

前記調節可能なプロモーターが、興奮性細胞中で活性である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項25】

前記興奮性細胞が、ニューロンまたは筋細胞である、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項26】

前記興奮性細胞が、ニューロンである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項27】

請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項28】

前記ベクターがプラスミド、またはウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。

【請求項29】

前記ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター１（ＨＳＶ－１）からなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。

【請求項30】

前記ウイルスベクターが、ＡＶＶベクターであり、前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ５もしくはそのバリアント、ＡＡＶ６もしくはそのバリアント、またはＡＡＶ９もしくはそのバリアントである、請求項２９に記載のベクター。

【請求項31】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。

【請求項32】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクター、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。

【請求項33】

ニューロンにおいて操作された受容体を作製する方法であって、前記ニューロンを、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１に記載の組成物、または請求項３２に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項34】

前記ニューロンが、末梢神経系のニューロンである、請求項３３に記載の方法または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項35】

前記ニューロンが、中枢神経系のニューロンである、請求項３３もしくは３４に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項36】

前記ニューロンが、侵害受容性ニューロンである、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項37】

前記ニューロンが、非侵害受容性ニューロンである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項38】

前記ニューロンが、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項39】

前記ニューロンが、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項40】

前記ニューロンが、Ａβ求心性線維である、請求項３９に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項41】

Ａβ求心性線維が、損傷Ａβ求心性線維である、請求項４０に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項42】

Ａβ求心性線維が、非損傷Ａβ求心性線維である、請求項４０に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項43】

前記ニューロンが、神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項44】

前記ニューロンが、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１．１を発現しない、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項45】

前記接触工程が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記接触工程が、対象においてインビボで実施される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記接触工程が、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記接触工程が、インビトロまたはエクスビボで実施される、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記接触工程が、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、電気穿孔、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記操作された受容体が、前記ニューロンの細胞表面に局在化することができる、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

（ａ）前記ニューロンを請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１に記載の組成物、または請求項３２に記載の医薬組成物と接触させることと、（ｂ）前記ニューロンを前記操作された受容体の非天然リガンドと接触させることと、を含む、ニューロンの活性を阻害する方法。

【請求項51】

前記ニューロンが、末梢神経系のニューロンである、請求項５１に記載の方法。

【請求項51】

前記ニューロンが、中枢神経系のニューロンである、請求項５１に記載の方法。

【請求項52】

前記ニューロンが、侵害受容性ニューロンである、請求項５１～５１．２のいずれかに記載の方法。

【請求項53】

前記ニューロンが、非侵害受容性ニューロンである、請求項５１～５１．２のいずれかに記載の方法。

【請求項54】

前記ニューロンが、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ニューロンが、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ニューロンが、Ａβ求心性線維である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

Ａβ求心性線維が、損傷Ａβ求心性線維である、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

Ａβ求心性線維が、非損傷Ａβ求心性線維である、請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

前記ニューロンが、神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記ニューロンが、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１．１を発現しない、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

接触工程（ａ）が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

接触工程（ｂ）が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、請求項５１～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

接触工程（ａ）および／または（ｂ）が、対象においてインビボで実施される、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

接触工程（ａ）が、前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、または前記医薬組成物を前記対象に投与することを含み、および／または接触工程（ｂ）が、前記非天然リガンドを前記対象に投与することを含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

接触工程（ａ）および／または（ｂ）が、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、電気穿孔、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む、請求項５１～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記操作された受容体が、前記ニューロンの細胞表面に局在化することができる、請求項５１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

それを必要とする対象における神経学的障害の発症を治療および／または遅延する方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１に記載の組成物、または請求項３２に記載の医薬組成物を投与することと、
ｂ．前記操作された受容体の非天然リガンドを前記対象に投与することと、を含む、方法。

【請求項68】

前記対象が、工程（ａ）の後に前記非天然リガンドを投与される、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記対象が、工程（ａ）と同時に前記非天然リガンドを投与される、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

前記神経学的障害が、発作障害、運動障害、摂食障害、脊髄損傷、神経因性膀胱、異痛症、痙縮性障害、そう痒症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、依存症、不安症、うつ病、記憶損失、認知症、睡眠時無呼吸、脳卒中、ナルコレプシー、尿失禁、本態性振戦、三叉神経痛、口腔灼熱症候群、または心房細動である、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記神経学的障害が、異痛症である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記非天然リガンドが、経口、皮下、局所的、または静脈内に投与される、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記非天然リガンドが経口投与される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、皮下、経口、髄腔内、局所的、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記対象が三叉神経痛を患い、前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、前記対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記対象が神経障害性疼痛を患い、前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、前記対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記対象がヒトである、請求項６７～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記治療有効量が、前記神経学的障害の徴候および／または症状の重症度を軽減させる、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記治療有効量が、前記神経学的障害の徴候および／または症状の発症を遅延させる、請求項６７～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記治療有効量が、前記神経学的障害の徴候および／または症状を除去する、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記神経学的障害の前記徴候が、神経損傷、神経萎縮、および／または発作である、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記神経損傷が、末梢神経損傷である、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

８５．前記神経学的障害の前記症状が、疼痛である、請求項８０～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

それを必要とする対象における疼痛の発症を治療および／または遅延させる方法であって、
ａ．前記対象に、治療有効量の請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作された受容体、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のベクター、請求項３１に記載の組成物、または請求項３２に記載の医薬組成物を投与することと、
ｂ．前記操作された受容体の非天然リガンドを前記対象に投与することと、を含む、方法。

【請求項87】

前記対象が、工程（ａ）の後に前記非天然リガンドを投与される、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記対象が、工程（ａ）と同時に前記非天然リガンドを投与される、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

前記非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記非天然リガンドが、経口、皮下、局所的、または静脈内に投与される、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記非天然リガンドが経口投与される、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、皮下、経口、髄腔内、局所的、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される、請求項８６～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記対象が三叉神経痛を患い、前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、前記対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される、請求項８６～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記対象が神経障害性疼痛を患い、前記操作された受容体、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記組成物、または前記医薬組成物が、前記対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される、請求項８６～９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記対象がヒトである、請求項８６～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記疼痛が、神経障害性疼痛である、請求項８５～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記疼痛が、化学療法に関連する、化学療法によって引き起こされる、または化学療法から生じる、請求項８５～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記疼痛が、外傷に関連する、外傷によって引き起こされる、または外傷から生じる、請求項８５～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記対象が異痛症を患う、請求項８５～９９のいずれかに記載の方法。

【請求項101】

前記疼痛が、医療処置後に現れる、請求項８５～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記疼痛が、出産もしくは帝王切開に関連する、出産もしくは帝王切開によって引き起こされる、または出産もしくは帝王切開から生じる、請求項８５～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記疼痛が、偏頭痛に関連する、偏頭痛によって引き起こされる、または偏頭痛から生じる、請求項８５～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記治療有効量は、前記対象の疼痛を一過性に軽減する、前記対象の疼痛を永久に軽減する、前記対象の疼痛の発症を予防する、および／または前記対象の疼痛を除去する、請求項８５～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

工程（ａ）および（ｂ）が、前記対象の疼痛が現れる前に実施される、請求項８５～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１９年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／８８９，９６３号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は「ＳＷＣＨ０２９０１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」である。テキストファイルは２００ｋｂで、２０２０年８月２１日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【0003】

本開示は、細胞の活性を調節し、疾患を治療するための、操作された受容体、および操作された受容体および小分子リガンドの使用に関する。

【背景技術】

【0004】

難治性の神経学的疾患は、異常に作用するニューロンと関連していることが多い。これらの状態を治療するための治療法を開発する試みは、疾患に関連する扱いやすい標的タンパク質の欠乏によって妨げられている。例えば、緩和されない慢性疼痛は、米国および世界中で重大な健康問題である。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの報告書によると、１億１，６００万人のアメリカ人が数週間から数年間持続する痛みに苦しみ、その結果、年間コストが５億６，０００万ドルを超えると見積もられている。慢性疼痛患者に対する適切な長期治療はなく、社会と個人の双方にとって大きな負担につながっている。痛みはしばしば障害を生じさせ、障害がなかったとしても、生活の質に多大な影響を与える。注意深く、十分に訓練された医師、オピオイドへの即座のアクセス、アジュバント鎮痛薬の使用、患者管理の鎮痛剤の利用可能性、および神経ブロックやＩＴポンプなどの手技のエビデンスに基づく使用など、ケア提供の状況が最適である場合でも、痛みの治療はしばしば失敗する。

【0005】

慢性疼痛に対して最も一般的に使用される療法は、オピオイド鎮痛薬および非ステロイド性抗炎症薬の適用であるが、これらの薬剤は依存症につながる可能性があり、薬物依存、耐性、呼吸抑制、鎮静、認知不全、幻覚、および他の全身性の副作用などの副作用を引き起こす可能性がある。医薬品の幅広い使用にもかかわらず、疼痛緩和におけるその有効性の成功率は著しく低い。様々な薬剤を用いた大規模な無作為化試験では、二人または三人の患者のうち一人のみが、少なくとも５０％の疼痛緩和を達成することが見出された（Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，２００５）。最も開発された薬理学的治療を使用した追跡研究では、同じ結果が見出され、痛みに対する薬剤の有効性に改善がなかったことを示している（Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ，１５０（３）：５７３－８１，２０１０）。

【0006】

痛みの治療のためのより侵襲的な選択肢には、神経ブロックおよび電気刺激が含まれる。神経ブロックは、脳への疼痛信号を中断するために通常脊髄に局所麻酔注射をするもので、その効果は数週間から数か月までしか持続しない。神経ブロックは、ほとんどの場合、推奨される治療選択肢ではない（Ｍａｉｌｉｓ ａｎｄ Ｔａｅｎｚｅｒ，Ｐａｉｎ Ｒｅｓ Ｍａｎａｇ．１７（３）：１５０－１５８，２０１２）。電気刺激は、疼痛信号を遮断するために電流を供給することを伴う。効果は神経ブロックよりも長く続くことがあるが、リード線自体の転位、感染、破損、または電池の消耗という問題が生じる。一つのレビューによると、神経障害に対して電気刺激を受けた患者の４０％が、装置に伴うこれらの問題のうち一つまたは複数を経験した（Ｗｏｌｔｅｒ、２０１４）。

【0007】

痛みを管理する最も侵襲的で最も望ましくない方法は、痛みを引き起こす神経またはその部分の完全な外科的除去である。この選択肢は、患者が前者および他の低侵襲性の治療法を使い果たし、効果がなくなった場合にのみ推奨される。高周波神経焼灼療法は、熱を使用して問題のある神経を破壊し、神経ブロックよりも長い疼痛緩和を提供する。しかし、ある研究では、慢性腰仙神経根痛に対するＤＲＧの部分高周波病変において、対照群と治療群との間に差異は見出されなかった（Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。疼痛神経を外科的に除去するための他の外科手術方法は、同様の欠点に悩まされ、感覚障害もしくは運動障害を含む重篤な副作用を長期的に有するか、または他の場所で疼痛を引き起こす。
神経学的障害を治療する方法は、安全で、効率的で、費用効果が高いものであるべきである。遺伝子治療は、疼痛の管理を含む、様々な神経学的疾患に対する非侵襲的な治療選択肢を提供する可能性がある。しかしながら、これまで遺伝子治療方法は、神経学的疾患の治療において広く使用されていない。本開示は、これらのニーズに対処する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｆｉｎｎｅｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ，１５０（３）：５７３－８１，２０１０

【非特許文献2】Ｍａｉｌｉｓ ａｎｄ Ｔａｅｎｚｅｒ，Ｐａｉｎ Ｒｅｓ Ｍａｎａｇ．１７（３）：１５０－１５８，２０１２

【図面の簡単な説明】

【0009】

開示は、添付図面と併せて読み取った場合、以下の詳細な説明から最も理解される。特許または出願ファイルは、カラーで実行される図面を少なくとも一つ含む。本特許またはカラーの図面を含む特許出願公報の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて、官庁から提供される。一般的な慣行によれば、図面の様々な特徴は実寸でないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小している。図面には、以下の図が含まれる。

【0010】

【図1A-B】図１Ａ～図１Ｇは、アセチルコリンまたは示された非天然リガンドのいずれかの様々な用量による刺激後の、示された二重アミノ酸置換を含む、操作されたキメラ受容体配列番号３３の変異体におけるＹＦＰ蛍光のクエンチの割合のヒートマップを示す。リガンド用量は、各チャートの上部にわたって記載される。ボックスの中の数字は、観測されたクエンチの絶対量を示す。濃青色＝ＹＦＰレポーターの最大クエンチ８０％。水色＝３０～８０％のクエンチ。白色＝１０～３０％。オレンジ色＝０～１０％のクエンチ。負の値は、刺激アーチファクトによる負のクエンチを有する非応答を表す。配列番号２９は、陰性対照として使用される非応答キメラである。非天然リガンド名の略語：ａｂｔ：ＡＢＴ－１２６、ａｃｈ：アセチルコリン、ａｐｎ：ＡＰＮ－１１２５；ａｚｄ：ＡＺＤ－０３２８；ｂｒｄ：ＴＣ－５６１９；ｆａｃ：ＲＧ３４８７；ｔｃ６：ＴＣ－６９８７。

【図1C-D】同上。

【図1E-F】同上。

【図1G】同上。

【0011】

【図2】図２Ａ～図２Ｂは、アセチルコリンならびに非天然リガンドＲＧ－３４８７（ＳＡ－２、合成アゴニスト－２）に対する、ＨＥＫ２９３細胞で発現された、ＣＲ－１１（化学物質誘発性受容体－１１、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体）の濃度反応曲線を示す。応答を、手動パッチクランプ電気生理学を使用して評価した。電流を、最大応答に対して一に正規化した。データ点を通る実線は、ヒルの式で得られる最適なものであり、各リガンドに対するＥＣ_５０は、濃度反応曲線から推定される。図２Ａは、アセチルコリンに対する野生型およびＣＲ－１１受容体の濃度反応曲線を示す。図２Ｂは、ＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）に対する野生型およびＣＲ－１１受容体の濃度反応曲線を示す。

【0012】

【図3】図３は、ＣＲ－１１（化学物質誘発性受容体－１１、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体）を発現するレンチウイルスで形質導入された成体ラットＤＲＧニューロンにおけるＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）によって誘導された例示的な塩化物電流を示す。

【0013】

【図4A】図４Ａは、異なる電流（５０ｐＡ～７００ｐＡ）を注入したときの、ＣＲ－１１（配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体）を発現する形質導入ＤＲＧニューロン、または対照ＤＲＧニューロン（ＣＲ－１１発現なし）の誘発活動電位を示す。上のパネルは、制御ＤＧＦニューロンの誘発活動電位を示す。左下のパネルは、３μＭのＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）の存在下でＣＲ－１１を発現する形質導入ＤＲＧニューロンの誘発活動電位を示す。右下のパネルは、ＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）が洗浄された後の、ＣＲ－１１を発現する形質導入ＤＲＧニューロンの誘発活動電位を示す。

【図4B】図４Ｂは、指示されたリガンドの非存在下または存在下で、ＣＲ－１１を発現する対照ＤＲＧニューロンおよび形質導入ＤＲＧニューロンの基電流値（活動電位を引き出すために必要とされる電流）を示す。

【0014】

【図5】図５は、配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化した、操作された受容体を発現するＨＡタグ陽性細胞の割合（「平均ＨＡタグ％」）、および配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化した、操作された受容体を発現するα－ブンガロトキシン陽性細胞の割合（「正規化ＡＢ ％」）を示す。図５はまた、抗ＨＡ抗体（「平均ＨＡ ＭＦＩ」）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた蛍光標識α－ブンガロトキシン（「正規化ＡＢ ＭＦＩ」）を使用して評価した、配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化された、操作された受容体を発現する細胞の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値を示す。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0015】

本開示は、ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）に由来し、ヒトグリシン受容体α１サブユニットに由来するＣｙｓループドメインを含むリガンド結合ドメインと、ヒトグリシン受容体α１サブユニットに由来するイオン孔ドメインとを含む、操作された受容体を提供する。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、キメラリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）受容体である。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、（ｉ）Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基における二つのアミノ酸置換、または（ｉｉ）Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸残基に対応する。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対アのミノ酸残基における二つのアミノ酸置換、またはＬ１３１Ｅのアミノ酸置換をさらに含み、アミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸残基に対応する。

【0016】

いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換をさらに含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換をさらに含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ－ループドメインは、配列番号２のアミノ酸１６６～１７２を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ－ループドメインは、配列番号２のアミノ酸１６６～１８０を含む。いくつかの実施形態では、受容体は、ヒトグリシン受容体α１サブユニットからのβ１－２ループドメインを含む。いくつかの実施形態では、β１－２ループドメインは、配列番号２のアミノ酸８１～８４を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号５８～６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、および配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、アセチルコリンに対する操作された受容体の効力は、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも低い。いくつかの実施形態では、アセチルコリンに対する操作された受容体の効力は、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力の少なくとも２倍低い。いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力とほぼ同じである。

【0020】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも高い。いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態では、効力を決定することは、ＥＣ５０を決定することを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドの存在下での操作された受容体の有効性は、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも高い。いくつかの実施形態では、非天然リガンドの存在下における操作された受容体の有効性は、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも少なくとも２倍高い。いくつかの実施形態では、有効性を決定することは、非天然リガンドの存在下で、インビトロで操作された受容体を通過する電流の量を決定することを含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、ＡＺＤ－０３２８、ＴＣ－６９８７、ＡＢＴ－１２６、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、ＡＢＴ－１２６、ＲＧ３４８７、およびＡＰＮ－１１２５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、ＴＣ－５６１９である。

【0023】

本開示は、本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、操作された受容体をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節可能なプロモーターは、興奮性細胞で活性である。いくつかの実施形態では、興奮性細胞はニューロンまたは筋細胞である。いくつかの実施形態では、興奮性細胞はニューロンである。

【0024】

本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター－１（ＨＳＶ－１）からなる群から選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＶＶベクターであり、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５もしくはそのバリアント、ＡＡＶ６もしくはそのバリアント、またはＡＡＶ９もしくはそのバリアントである。

【0025】

本開示は、本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つ、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、または本明細書に開示されるベクターのいずれか一つを含む組成物を提供する。本開示はさらに、本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つ、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、または本明細書に開示されるベクターのいずれか一つ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

【0026】

本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、本明細書に開示されるベクターのいずれか一つ、本明細書に開示される組成物のいずれか一つ、または本明細書に開示される医薬組成物のいずれか一つとニューロンを接触させることを含む、ニューロンにおいて操作された受容体を産生する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、末梢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、中枢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは侵害受容ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは非侵害受容ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、ニューロンは、Ａβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、Ａβ求心性線維は、損傷したＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、Ａβ求心性線維は、損傷を受けていないＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、ニューロンが神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１．１を発現しない。

【0027】

いくつかの実施形態では、接触工程は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程は、対象においてインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程は、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、接触工程は、インビトロまたはエクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程は、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、エレクトロポレーション、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、ニューロンの細胞表面に局在化することができる。

【0028】

本開示は、（ａ）ニューロンを本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つ、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、本明細書に開示されるベクターのいずれか一つ、本明細書に開示される組成物のいずれか一つ、または本明細書に開示される医薬組成物のいずれか一つと接触させること、および（ｂ）ニューロンを操作された受容体の非天然リガンドと接触させることを含む、ニューロンの活性を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、末梢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、中枢神経系のニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは侵害受容ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは非侵害受容ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、ニューロンは、Ａβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、Ａβ求心性線維は、損傷したＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、Ａβ求心性線維は、損傷を受けていないＡβ求心性線維である。いくつかの実施形態では、ニューロンは、神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する。いくつかの実施形態では、ニューロンは、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１．１を発現しない。

【0029】

いくつかの実施形態では、接触工程（ａ）は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程（ｂ）は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程（ａ）および／または（ｂ）は、対象においてインビボで実施される。いくつかの実施形態では、接触工程（ａ）は、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含み、および／または接触工程（ｂ）は、非天然リガンドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、接触工程（ａ）および／または（ｂ）は、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、エレクトロポレーション、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、ニューロンの細胞表面に局在化することができる。

【0030】

本開示は、それを必要とする対象における神経学的障害の発症を治療および／または遅延する方法を提供し、本明細書に開示される操作された受容体のうちのいずれか一つ、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、本明細書に開示されるベクターのいずれか一つ、本明細書に開示される組成物のいずれか一つ、または本明細書に開示される医薬組成物のいずれか一つの治療有効量を対象に投与することと、操作された受容体の非天然リガンドを対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象は、工程（ａ）の後に非天然リガンドを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、工程（ａ）と同時に非天然リガンドを投与される。

【0031】

いくつかの実施形態では、神経学的障害とは、発作障害、運動障害、摂食障害、脊髄損傷、神経因性膀胱、異痛症、痙縮性障害、そう痒症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、依存症、不安症、うつ病、記憶損失、認知症、睡眠時無呼吸、脳卒中、ナルコレプシー、尿失禁、本態性振戦、三叉神経痛、口腔灼熱症候群、または心房細動である。いくつかの実施形態では、神経学的障害は異痛症である。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される。

【0032】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、経口、皮下、局所、または静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、経口投与される。いくつかの実施形態では、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、皮下、経口、髄腔内、局所、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される。いくつかの実施形態では、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、三叉神経痛に罹患し、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、神経障害性疼痛に罹患し、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0033】

いくつかの実施形態では、治療有効量は、神経学的障害の徴候および／または症状の重症度を軽減する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、神経学的障害の徴候および／または症状の発症を遅らせる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、神経学的障害の徴候および／または症状を除去する。いくつかの実施形態では、神経学的障害の徴候は、神経損傷、神経萎縮、および／または発作である。いくつかの実施形態では、神経損傷は、末梢神経損傷である。いくつかの実施形態では、神経学的障害の症状は、疼痛である。

【0034】

本開示は、それを必要とする対象における疼痛の発症を治療および／または遅延する方法を提供し、本明細書に開示される操作された受容体のうちのいずれか一つ、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれか一つ、本明細書に開示されるベクターのいずれか一つ、本明細書に開示の組成物のいずれか一つ、または本明細書に開示される医薬組成物のいずれか一つの治療有効量を対象に投与することと、操作された受容体の非天然リガンドを対象に投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、対象は、工程（ａ）の後に非天然リガンドを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、工程（ａ）と同時に非天然リガンドを投与される。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される。

【0035】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、経口、皮下、局所、または静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、非天然リガンドは、経口投与される。いくつかの実施形態では、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、皮下、経口、髄腔内、局所、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される。いくつかの実施形態では、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される。

【0036】

いくつかの実施形態では、対象は、三叉神経痛に罹患し、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、神経障害性疼痛に罹患し、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物は、対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される。

【0037】

いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、疼痛は神経障害性疼痛である。いくつかの実施形態では、疼痛は、化学療法に関連するか、化学療法によって引き起こされるか、または化学療法から生じる。いくつかの実施形態では、疼痛は、外傷に関連するか、外傷によって引き起こされるか、または外傷から生じる。いくつかの実施形態では、対象は異痛症に罹患している。いくつかの実施形態では、疼痛は、医療処置後に現れる。いくつかの実施形態では、疼痛は、出産もしくは帝王切開に関連するか、出産もしくは帝王切開によって引き起こされるか、または出産もしくは帝王切開から生じる。いくつかの実施形態では、疼痛は、偏頭痛に関連するか、偏頭痛によって引き起こされるか、または偏頭痛から生じる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象の疼痛を一時的に軽減し、対象の疼痛を永続的に軽減し、対象の疼痛の発症を防止し、および／または対象の疼痛を除去する。いくつかの実施形態では、工程（ａ）および（ｂ）は、対象の疼痛が現れる前に実施される。

【発明を実施するための形態】

【0038】

Ａ．概要
操作されたリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）受容体、操作されたＬＧＩＣ受容体をコードするポリヌクレオチド、および操作されたＬＧＩＣ受容体をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを使用して、細胞の活性を調節するための組成物および方法が提供される。これらの組成物および方法は、例えば、疾患の治療または神経回路の研究における、ニューロンの活性の調節に特定の用途を見出す。さらに、主題の方法を実践する際に使用するその試薬、装置、およびキットが提供される。

【0039】

特に、本開示は、公知の薬物、リガンド、および／または結合剤に結合し、それに応答してシグナルを送る操作された受容体を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された受容体は、公知のアゴニスト結合剤に対する親和性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された受容体は、拮抗薬または調節因子結合剤に対する親和性を示し、拮抗薬および／または調節因子剤に対して、それらがアゴニスト剤であるかのように応答する。本開示はさらに、それを必要とする対象における神経学的疾患を治療する方法を提供する。本開示は、野生型内因性受容体とは異なる様式で公知の薬物に応答する、操作された受容体を利用することによって、公知の薬物が使用され得る臨床適応症の数を増加させる。

【0040】

本方法および組成物を記載する前に、本開示は、当然のことながら変化し得るので、記載される特定の方法または組成物に限定されないことが理解されよう。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

【0041】

値の範囲が提供されている場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載範囲内の任意の記載値または介在値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または介在値との間のより小さな各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、その範囲内に含まれても除外されてもよく、いずれかまたは両方の限度が、より小さな範囲に含まれている、または含まれていない各範囲も、記載範囲内の任意の特に除外された限度を条件として、本開示内に包含される。記載範囲が、限度の一方または両方を含む場合、それらに含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。

【0042】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本開示の実施または試験に使用することができるが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料がこれから説明される。本明細書で言及される全ての刊行物は、その刊行物が引用されるものに関連する方法および／または材料を開示および記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限り、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することが理解される。

【0043】

本開示を読んだ当業者には明らかであろうように、本明細書に説明および図示される個々の実施形態の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、または組み合わされてもよい、別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。

【0044】

本明細書中で考察された刊行物は、本出願の出願日以前にその開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本開示が先行開示によって、かかる公表に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公表日は、個別に確認する必要のある実際の公表日とは異なる場合がある。

【0045】

Ｂ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が別途明確に指示しない限り、複数形の参照を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「ペプチド」への言及は、一つまたは複数のペプチドおよびその均等物、例えば、当業者に公知のポリペプチドなどを含む。

【0046】

本明細書で使用される場合、別段の示唆がない限り、用語「および／または」は、本開示において、「および」または「または」のいずれかに使用される。

【0047】

本明細書全体を通して、文脈が別途要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、指定された要素もしくは整数、または要素もしくは整数のグループを含むが、他の要素もしくは整数、またはは要素もしくは整数のグループの除外しないことを指す。さらに、本明細書全体を通しての数値範囲の記載は、特に、その間のすべての整数および小数点を含む。

【0048】

本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈が要求されない限り、語句「から本質的になる」は、主題の開示の基本的および新規の特性に実質的に影響を与えない、指定された材料または工程に記述された組成物、方法、またはキットの範囲の制限を指す。例えば、開示された配列「から本質的になる」リガンド結合ドメインは、配列の境界部で、例えば、列挙された結合アミノ酸残基よりも約５残基、４残基、３残基、２残基、もしくは約１残基少ない、または列挙された結合アミノ酸残基よりも約１残基、２残基、３残基、４残基、もしくは５残基多い、開示された配列のアミノ酸配列の±約５残基のアミノ酸配列を有する。

【0049】

本明細書全体を通して、文脈上別段の解釈が要求されない限り、語句「からなる」は、特許請求の範囲で特定されていない任意の要素、工程、または成分を、組成物、方法、またはキットから除外することを意味する。例えば、開示された配列「からなる」リガンド結合ドメインは、開示されたアミノ酸配列のみからなる。

【0050】

本出願で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、等価物として使用される。本出願で使用される任意の数字は、約／およその有無に関わらず、当業者によって認識される任意の通常の変動をカバーすることを意味する。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別段の記載がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向（より大きいまたは小さい）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下の範囲の値を指す（このような値が１００％を超える可能性がある場合を除く）。

【0051】

本明細書で使用される場合、用語「単離」は、通常伴う構成要素から実質的にまたは本質的に遊離している材料が、その天然状態で見出される材料を意味する。いくつかの実施形態では、用語「取得」または「導出」は、単離と同義で使用される。

【0052】

用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書では、哺乳類などの脊椎動物を指すために互換的に使用される。哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジー）、またはヒトであってもよい。インビボで取得された、またはインビトロで培養された対象の組織、細胞、またはその誘導体も包含される。ヒト対象は、成人、十代の若者、子供（２～１４歳）、幼児（１か月～２４か月）、または新生児（１か月未満）であり得る。いくつかの実施形態では、成人は、約６５歳以上、または約６０歳以上の高齢者である。いくつかの実施形態では、対象は、妊娠女性または妊娠を意図する女性である。

【0053】

用語「試料」は、分析に供される生物学的材料の体積および／または質量を指す。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料、細胞試料、流体試料などを含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象（例えば、ヒト対象）から採取されるか、または当該対象によって提供される。いくつかの実施形態では、試料は、任意の内臓、癌性、前癌性、または非癌性腫瘍、脳、皮膚、毛髪（毛根を含む）、眼、筋肉、骨髄、軟骨、白色脂肪組織、および／または褐色脂肪組織から採取された組織のいくつかを含む。いくつかの実施形態では、流体試料は、口腔スワブ、血液、臍帯血、唾液、精液、尿、腹水、胸水、脊髄液、肺洗浄液、涙、汗、およびこれに類するものを含む。当業者であれば、いくつかの実施形態では、「試料」は、供給源（例えば、対象）から直接取得されるという点で、「一次試料」であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、「試料」は、例えば、特定の潜在的汚染成分を除去し、特定の成分を単離し、および／または特定の対象成分を精製するために一次試料を処理する結果である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞または細胞集団（例えば、神経細胞）である。細胞試料は、対象から直接導出されてもよく（例えば、一次試料）、または細胞株であってもよい。細胞株は、非哺乳類細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞、および／または細菌細胞）または哺乳類細胞（例えば、不死化細胞株）を含み得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」とは、生理学的結果に影響を与えるために、組成物（例えば、操作された受容体および／または結合剤）を対象および／または細胞集団に送達することを指す。特定の実施形態では、治療は、一つまたは複数の疾患症状の改善（例えば、軽減、向上、または治療）をもたらす。改善は、観察可能または測定可能な改善であってもよく、または対象の一般的な幸福感の改善であってもよい。疾患の治療は、疾患症状の重症度の軽減を指し得る。いくつかの実施形態では、治療は、疾患の発症前のレベルと同等のレベルまでの疾患症状の重症度の軽減を指す場合がある。いくつかの実施形態では、治療は、疾患症状の短期（例えば、一時性または急性）および／または長期（例えば、持続性または慢性）の軽減を指し得る。いくつかの実施形態では、治療は、疾患症状の寛解を指し得る。いくつかの実施形態では、治療は、特定の疾患を発症するリスクがある対象に、疾患の発症を防止するために行う予防的治療を指し得る。疾患の発症の防止は、疾患の症状の完全な防止、疾患の発症の遅延、その後に発症した疾患における症状の重症度の緩和、または疾患の発症の可能性の低減を指す場合がある。

【0055】

本明細書で使用される場合、「管理」または「制御」は、特定の疾患に罹患する個体の生活の質を改善するために、本明細書で企図される組成物または方法の使用を指す。特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、疼痛に罹患する対象に鎮痛を提供する。

【0056】

「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な組成物の量である。治療有効量は、限定されるものではないが、対象の病態および年齢、性別、および体重などの要因に応じて変化し得る。概して、治療有効量は、治療上有益な効果が、組成物の任意の毒性または有害効果に優るものである。「治療有効量」は、対象を治療するために有効な組成物の量を含む。

【0057】

「増加」は、参照または対照レベルと比較して、少なくとも５％の値の増加（例えば、結合親和性の増加、生理学的応答の増加、治療効果の増加など）を指す。例えば、増加は、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上の増加を含み得る。増加はまた、参照または対照レベルよりも１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）高い増加を意味する。

【0058】

「減少」、「軽減」、「縮小」、またはその同義語は、参照または対照レベルと比較して、少なくとも５％の値の減少（例えば、結合親和性の減少、生理学的応答の減少、治療効果の減少、対象における疼痛の減少など）を指す。例えば、減少は、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００％またはそれ以上の減少を含み得る。減少はまた、参照または対照レベルよりも１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）低い減少を意味する。

【0059】

「維持」、または「保持」、または「持続」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる効果に匹敵する生理学的および／または治療効果を一般的に指す。同等の応答とは、参照応答と有意差がないか、または測定可能な差異ではない応答である。

【0060】

用語「参照」または「対照」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載される組成物で治療されていない対象もしくは試料、またはビヒクル対照で治療された対象もしくは試料における特定の生理学的および／または治療効果の値を指す。いくつかの実施形態では、参照レベルは、本明細書に記載される組成物（例えば、ベースラインレベル）の投与前に、対象または試料において測定される特定の生理学的および／または治療効果の値を指す。

【0061】

本明細書で使用される場合、「リガンド」は、別のより大きな分子に結合する分子を指す。いくつかの実施形態では、リガンドは、受容体に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドの受容体への結合は、受容体の機能を変化させ、その機能を活性化または抑制する。いくつかの実施形態では、リガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）のような受容体へのリガンドの結合は、イオンチャネルの開通または閉通をもたらす。

【0062】

「受容体－リガンド結合」および「リガンド結合」は本明細書では互換的に使用され、受容体（例えば、ＬＧＩＣ）とリガンドとの間の物理的相互作用を指す。本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、内因性または天然由来のリガンドを指し得る。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、神経伝達物質（例えば、λ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アセチルコリン、セロトニンなど）、およびシグナル伝達中間体（例えば、ホスファチジルイノシトール４，５－ビスリン酸（ＰＩＰ_２））、アミノ酸（例えば、グリシン）、またはヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ）を指す。いくつかの実施形態では、リガンドは、非天然、すなわち、合成または非天然由来のリガンド（例えば、結合剤）を指す場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは小分子を指す。リガンド結合は、当技術分野で公知の様々な方法（例えば、放射性標識リガンドとの会合の検出）によって測定することができる。

【0063】

「結合親和性」は概して、受容体の単一結合部位とリガンドとの間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。別段の示唆が無い限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、受容体およびリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋ_ｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の共通の方法によって測定することができる。

【0064】

「特異的結合親和性」または「特異的結合」という用語は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して互換的に使用され、例えば、受容体およびリガンドなどの対の分子種の間で生じる結合を指す。二つの種の相互作用が非共有結合性複合体を産生する場合、発生する結合は典型的には、静電、水素結合、または親油性相互作用の結果である。様々な実施形態において、一つまたは複数の種間の特異的結合は直接的である。一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合（非特異的結合）の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍以上である。

【0065】

「シグナル伝達」とは、受容体へのリガンド結合の結果として（例えば、本明細書に記載の操作された受容体への結合剤結合の結果として）の生化学的または生理学的応答の生成を指す。

【0066】

用語「野生型」または「天然」は、当業者によって理解される当分野の用語であり、変異型またはバリアント形態から区別される、自然界で生じる生物、株、遺伝子、タンパク質、または特徴の典型的な形態を意味する。例えば、野生型タンパク質は、自然界で生じるタンパク質の典型的な形態である。

【0067】

用語「非天然」、「バリアント」、および「変異体」は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して互換的に使用され、天然または野生型の組成物の変異体、例えば、天然または野生型の配列と１００％未満の配列同一性を有するバリアントポリペプチドを指す。

【0068】

アミノ酸修飾は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入であってもよい。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的置換（保存的変異、保存的置換、または保存的変化とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、およびサイズ）を有する異なるアミノ酸へと変化させる、タンパク質におけるアミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、「保存的変化」は、アミノ酸残基を別の生物学的に類似した残基に置換することを指す。保存的変化の例としては、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの一つの疎水性残基の別のものへの置換、またはアルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置換など、一つの極性残基の別のものへの置換が挙げられる。保存的置換のその他の例示的な例には、以下の変化が含まれる：アラニンをセリンに；アルギニンをリジンに；アスパラギンをグルタミンまたはヒスチジンに；アスパラギン酸をグルタミン酸に；システインをセリンに；グルタミンをアスパラギンに；グルタミン酸をアスパラギン酸に；グリシンをプラリネ（ｐｒａｌｉｎｅ）に；ヒスチジンをアスパラギンまたはグルタミンに；イソロイシンをロイシンまたはバリンに；ロイシンをバリンまたはイソロイシンに；リジンをアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸に；メチオニンをロイシンまたはイソロイシンに；フェニルアラニンをチロシン、ロイシンまたはメチオニンに；セリンをトレオニンに；スレオニンをセリンに；トリプトファンをチロシンに；チロシンをリプトファンまたはフェニルアラニンに；バリンをイソロイシンまたはロイシンになど。

【0069】

用語「親」または「開始剤」は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して互換的に使用され、新規の特性を有する操作された組成物を生成するために、変異、改変、または誘導体化される初期組成物またはタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、親タンパク質はキメラタンパク質である。

【0070】

用語「操作された」は、本明細書および特許請求の範囲全体を通して使用され、親組成物または誘導体化されたタンパク質とは異なる特性を有する非天然の組成物またはタンパク質を指す。

【0071】

概して、「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術には、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。二つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することができる。核酸配列またはアミノ酸配列にかかわらず、二つの配列の同一性パーセントは、二つの整列した配列間の完全な一致の数を、短い配列の長さで割って、１００を乗じたものである。同一性パーセントは、例えば、国立衛生研究所から入手可能なバージョン２．２．９を含む高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによっても決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ Ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されるように、アライメント法に基づく。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一性を、二つの配列のうち短い方の記号の総数で割った、同一の整列した記号（概してヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として定義する。プログラムは、比較されるタンパク質の全長にわたって同一性パーセントを決定するのに使用され得る。デフォルトパラメータは、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで短いクエリ配列の検索を最適化するように提供されている。また、プログラムは、ＳＥＧフィルタを使用して、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるクエリ配列のセグメントをマスクオフすることもできる。所望の程度の配列同一性の範囲は、約８０％～１００％であり、介在する整数値である。典型的には、開示される配列と請求される配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。

【0072】

本明細書で使用される場合、「実質的に同一」とは、８５％以上、例えば、９０％以上、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有することを指し、ここで、組成物の活性は、配列同一性の差異をもたらす配列の修飾によって変化しない。

【0073】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、動作可能に連結された核酸の転写を指示する一つまたは複数の核酸制御配列を指す。プロモーターは、ＴＡＴＡ要素などの転写開始部位近くの核酸配列を含んでもよい。プロモーターはまた、転写因子によって結合され得るシス作用ポリヌクレオチド配列を含んでもよい。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発達条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発達調節下で活性なプロモーターである。用語「動作可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモーター、または転写因子結合部位のアレイなど）と第二の核酸配列との間の機能的連結を指し、ここで発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

【0074】

本明細書で使用される場合、用語「ウイルス（ｖｉｒｕｓ）ベクター」、「ウイルス（ｖｉｒａｌ）ベクター」、または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージされた核酸（例えば、ＡＡＶ発現カセット）を含む。本開示の例示的なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。

【0075】

本明細書で使用される場合、「ニューロン活性」、「ニューロンの活性」、「ニューロン発火」、およびその変形および同義語は、ニューロンの刺激または興奮から生じる電気活性を指す。いくつかの実施形態では、ニューロン活性は、自動または手動パッチクランプ技術を使用して測定される。いくつかの実施形態では、ニューロンの活性を決定することは、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）、抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）、および／またはニューロンの活動電位を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ニューロンの活性のレベルは、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）、抑制性シナプス後電位（ＩＰＳＰ）、および／または活動電位に依存する、または影響を受ける。

【0076】

本明細書で使用される場合、「神経学的疾患」または「神経学的障害」は、神経系の疾患または障害を指す。いくつかの実施形態では、神経学的疾患は、脳、脊髄、神経、または神経系の任意の構成要素における構造的、生化学的、および／または電気的異常と関連するか、それらによって引き起こされるか、またはそれらの結果として生じる。

【0077】

本明細書で使用される場合、疾患の「徴候」は、疾患の病態を示すとみなされる身体的または精神的特徴を指す。いくつかの実施形態では、徴候は疾患の客観的兆候である。いくつかの実施形態では、徴候は、医師などの患者以外の人物によって客観的に評価、検査、観察、または測定される。

【0078】

本明細書で使用される場合、疾患の「症状」は、疾患の病態、特に患者に明らかであるこのような特徴を示すとみなされる、身体的または精神的特徴を指す。いくつかの実施形態では、症状は、患者によって主観的に評価される。例えば、いくつかの実施形態では、症状は疼痛である。

【0079】

本明細書で使用される場合、「効力」は、ＬＧＩＣなどのタンパク質の特定のレベルの活性を産生するために必要なリガンドの量を指す。いくつかの実施形態では、ＬＧＩＣなどのタンパク質の活性は、イオンチャネルの開閉を指す。いくつかの実施形態では、効力を決定することは、特定の条件下でのリガンドに対する、ＬＧＩＣなどのタンパク質の最大有効濃度の半分（ＥＣ５０）を決定することを含む。ＥＣ５０は、特定の曝露時間後にベースラインと最大値の中間の応答を誘導するリガンドの濃度を指す。

【0080】

本明細書で使用される場合、「有効性」は、リガンドの存在下でのＬＧＩＣなどのタンパク質の活性の尺度を指す。いくつかの実施形態では、有効性は、リガンドの特定の濃度の存在下でなど、特定の条件下でＬＧＩＣを通過する電流の量を指す。いくつかの実施形態では、有効性を決定することは、受容体を通過する電流の量および／または受容体の基電流を決定することを含む。

【0081】

本明細書で使用される場合、「応答性」は、リガンドの存在下でのＬＧＩＣなどのタンパク質の全体的な機能の尺度を指す。応答性を決定することは、効力、有効性、およびタンパク質の細胞内局在化などの一つまたは複数の要因の決定および検討を含み得る。

【0082】

Ｃ．操作された受容体
本開示は、操作された受容体、操作された受容体変異体、およびそれらの使用のための方法を対象とする。本明細書で使用される場合、用語「受容体」は、細胞の表面上に位置し、細胞へのおよび／または細胞からのシグナル伝達を媒介することができる任意のタンパク質を指す。用語「操作された受容体」は、本明細書では、対応する親受容体と物理的および／または機能的に異なるように実験的に変更された受容体を指すために使用される。いくつかの実施形態では、親受容体は、野生型受容体である。用語「野生型受容体」は、本明細書では、自然界に存在するタンパク質のポリペプチド配列と同一のポリペプチド配列を有する受容体を指すために使用される。野生型受容体は、ヒトに天然に存在する受容体、ならびに他の真核生物、例えば、原生生物、真菌、植物または動物、例えば、酵母、昆虫、線虫、海綿動物、哺乳類、非哺乳類脊椎動物に天然に存在するオルソログを含む。いくつかの実施形態では、親受容体は、非天然受容体である。すなわち、天然では発生しない受容体、例えば、野生型受容体から操作される受容体である。例えば、親受容体は、一つの野生型受容体からの一つまたは複数のサブユニットと、第二の野生型受容体からの一つまたは複数のサブユニットとを含む、操作された受容体であってもよい。したがって、得られたタンパク質は、二つ以上の野生型受容体からのサブユニットからなる。したがって、いくつかの実施形態では、親受容体はキメラ受容体である。本開示の操作された受容体としては、例えば、親受容体、親受容体変異体、およびスイッチ受容体が挙げられる。

【0083】

いくつかの態様では、本開示の操作された受容体は、対応する親受容体に対する少なくとも一つのアミノ酸変異、例えば、野生型受容体の一つまたは複数のドメインにおける一つまたは複数の変異を含む。「アミノ酸変異」とは、対応する親配列、例えば、アミノ酸置換、欠失、および／または挿入に対するアミノ酸配列の任意の差異を意味する。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、対応する親受容体と、約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、またはそれ以下の配列同一性を共有し、それらの間にある全ての値および部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、親受容体変異体は、対応する親受容体と８５％以上、例えば、９０％以上または９５％以上、例えば、対応する親受容体と約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有し、それらの間にある全ての値および部分範囲を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体（例えば、親受容体変異体）は、エラープローンＰＣＲによって生成される。

【0084】

いくつかの実施形態では、アミノ酸変異は、対応する親受容体に対する機能喪失型アミノ酸変異である。「機能喪失型」アミノ酸変異は、例えば、親受容体への内因性リガンドの結合と比較して、操作された受容体への内因性リガンドの結合を減少させることによって、または対応する親受容体への結合剤の結合に応答して典型的には活性化される、操作された受容体の下流のシグナル伝達経路の活性を減少させることによって、親受容体と比較して、操作された受容体の機能を減少させる、実質的に低下させる、または消失させる一つまたは複数の変異を指す。

【0085】

いくつかの実施形態では、アミノ酸変異は、対応する親受容体に対する機能獲得型アミノ酸変異である。「機能獲得型」アミノ酸変異は、例えば、親受容体への内因性リガンドの結合と比較して、結合剤に対する操作された受容体の親和性を変更もしくは増強させることによって、または対応する親受容体への内因性リガンドの結合と比較して、操作された受容体への結合剤の結合に応答して活性化される、シグナル伝達経路の活性を変更もしくは増強させることによって、親受容体と比較して、操作された受容体の機能を改変する一つまたは複数の変異を指す。いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、結合剤に対する操作された受容体の親和性の増加をもたらす。特定の実施形態では、機能獲得型変異は、アゴニスト結合剤に対する操作された受容体の親和性の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、操作された受容体に結合すると、アゴニスト結合剤として作用する拮抗薬結合剤をもたらす（例えば、アンタゴニストシグナル伝達経路の代わりにアゴニストシグナル伝達経路の活性化をもたらす）。いくつかの実施形態では、機能獲得型変異は、操作された受容体に結合するとアゴニスト結合剤として作用する調節因子結合剤をもたらす。いくつかの実施形態では、本開示の主題の操作された受容体は、対応する親受容体と比較して一つまたは複数の機能喪失型アミノ酸変異と、一つまたは複数の機能獲得型アミノ酸変異とを含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、機能喪失型変異および機能獲得型変異は、同じ残基にあり、すなわち同じ変異である。他の実施形態では、機能喪失型変異および機能獲得型変異は、異なるアミノ酸残基における変異である。いくつかの実施形態では、機能喪失型変異および／または機能獲得型変異を含む、主題の操作された受容体は、対応する親受容体、例えば、野生型受容体または非天然受容体と、約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、またはそれ以下の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、主題の操作された受容体は、対応する親受容体と、８５％以上の配列同一性、例えば、８５％、９０％、または９５％以上の配列同一性、いくつかの場合では、９６％、９７％、９８％以上の配列同一性、例えば９９％または９９．５％以上の配列同一性を共有し、その間にある全ての値および部分範囲を含む。

【0087】

いくつかの態様では、本開示の操作された受容体は、例えば、一つまたは複数のアミノ酸配列を有する一つの野生型受容体からのサブユニット、例えば、第二の野生型受容体からのサブユニットなど、一つまたは複数のアミノ酸配列の組み合わせによって産生される受容体を含む。言い換えれば、操作された受容体は、互いに異種であるアミノ酸配列を含み、ここで、「異種」とは、自然界では一緒に発生しないことを意味する。かかる受容体は、本明細書では「キメラ受容体」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、本開示の操作された受容体が生成される親受容体として機能する。

【0088】

いくつかの実施形態では、親受容体変異体は、アゴニスト結合剤に対する親和性の増加を示す。いくつかの実施形態では、野生型受容体に結合するとき、拮抗薬または調節因子として機能するリガンドまたは結合剤は、親受容体変異体に結合するとき、アゴニストとして機能する。

【0089】

いくつかの実施形態では、操作された受容体は、「リガンド依存性イオンチャネル」またはＬＧＩＣである。ＬＧＩＣは、特定のリガンド（例えば、化学剤または結合剤）による活性化時にイオンの通過を可能にする膜貫通タンパク質の大きな群を指す。ＬＧＩＣは、リガンド結合ドメインおよび膜貫通イオン孔ドメインの少なくとも二つのドメインから構成される。ＬＧＩＣへのリガンド結合は、ＬＧＩＣの活性化およびイオン孔の開放をもたらす。リガンド結合は、特定の一つまたは複数のイオンに対するチャネルの透過性に急激な変化を生じさせる。事実上、イオンが不活性または閉鎖状態にある時にチャネルを通過することはできないが、リガンド結合時に最大１０^７イオン／秒が通過できる。いくつかの実施形態では、ＬＧＩＣは、細胞外リガンド（例えば、神経伝達物質）に応答し、イオンのサイトゾルへの流入を促進する。いくつかの実施形態では、ＬＧＩＣは、細胞内リガンド（例えば、ＡＴＰなどにおけるヌクレオチド、およびＰＩＰ_２などのシグナル伝達中間体）に応答し、細胞外環境へのサイトゾルからのイオンの流出を促進する。重要なことに、ＬＧＩＣの活性化は、細胞膜を横切るイオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｌ^－など）の輸送をもたらし、リガンド自体の輸送をもたらさない。

【0090】

ＬＧＩＣ受容体は、複数のサブユニットから構成され、ホモマー受容体またはヘテロマー受容体のいずれかであり得る。ホモマー受容体は、すべて同じタイプであるサブユニットからなる。ヘテロマー受容体は、少なくとも一つのサブユニットが、受容体内に含まれる少なくとも一つの他のサブユニットとは異なるサブユニットからなる。例えば、グリシン受容体は、５つのサブユニットからなり、四つのアイソフォーム（α_１～α_４）があるα－サブユニットと、一つの公知のアイソフォームがあるβ－サブユニットの二つのタイプがある。例示的なホモマーＧｌｙＲは、５つのα_１－ＧｌｙＲサブユニットからなるＧｌｙＲである。同様に、ホモマーＧＡＢＡ_Ａ受容体は、β_３－ＧＡＢＡ_Ａサブユニットからなり得、ｎＡｃｈＲ受容体は、α_７－ｎＡｃｈＲサブユニットからなり得る。例示的なヘテロマーＧｌｙＲは、一つまたは複数のα－サブユニットと、一つまたは複数のβ－サブユニット（例えば、α_１β－ＧｌｙＲ）とからなってもよい。ＬＧＩＣ受容体のサブユニットの例を表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0091】

特定の実施形態での使用に適したＬＧＩＣのファミリーの例示的な例には、限定されないが、グリシン受容体（ＧｌｙＲ）などのＣｙｓループ受容体、セロトニン受容体（例えば、５－ＨＴ３受容体）、λ－アミノ酪酸Ａ（ＧＡＢＡ－Ａ）受容体、およびニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡｃｈＲ）、ならびに酸感受性（プロトン依存性）イオンチャネル（ＡＳＩＣ）、上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＩＰ３受容体、Ｐ２Ｘ受容体、リアノジン受容体、および亜鉛活性化チャネル（ＺＡＣ）が挙げられる。

【0092】

本明細書に記載される方法での使用に適したＬＧＩＣの特定の非限定的な例には、以下が含まれる。ＨＴＲ３Ａ；ＨＴＲ３Ｂ；ＨＴＲ３Ｃ；ＨＴＲ３Ｄ；ＨＴＲ３Ｅ；ＡＳＩＣ１；ＡＳＩＣ２；ＡＳＩＣ３；ＳＣＮＮ１Ａ；ＳＣＮＮ１Ｂ；ＳＣＮＮ１Ｄ；ＳＣＮＮ１Ｇ；ＧＡＢＲＡ１；ＧＡＢＲＡ２；ＧＡＢＲＡ３；ＧＡＢＲＡ４；ＧＡＢＲＡ５；ＧＡＢＲＡ６；ＧＡＢＲＢ１；ＧＡＢＲＢ２；ＧＡＢＲＢ３；ＧＡＢＲＧ１；ＧＡＢＲＧ２；ＧＡＢＲＧ３；ＧＡＢＲＤ；ＧＡＢＲＥ；ＧＡＢＲＱ；ＧＡＢＲＰ；ＧＡＢＲＲ１；ＧＡＢＲＲ２；ＧＡＢＲＲ３；ＧＬＲＡ１；ＧＬＲＡ２；ＧＬＲＡ３；ＧＬＲＡ４；ＧＬＲＢ；ＧＲＩＡ１；ＧＲＩＡ２；ＧＲＩＡ３；ＧＲＩＡ４；ＧＲＩＤ１；ＧＲＩＤ２；ＧＲＩＫ１；ＧＲＩＫ２；ＧＲＩＫ３；ＧＲＩＫ４；ＧＲＩＫ５；ＧＲＩＮ１；ＧＲＩＮ２Ａ；ＧＲＩＮ２Ｂ；ＧＲＩＮ２Ｃ；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＧＲＩＮ３Ａ；ＧＲＩＮ３Ｂ；ＩＴＰＲ１；ＩＴＰＲ２；ＩＴＰＲ３；ＣＨＲＮＡ１；ＣＨＲＮＡ２；ＣＨＲＮＡ３；ＣＨＲＮＡ４；ＣＨＲＮＡ５；ＣＨＲＮＡ６；ＣＨＲＮＡ７；ＣＨＲＮＡ９；ＣＨＲＮＡ１０；ＣＨＲＮＢ１；ＣＨＲＮＢ２；ＣＨＲＮＢ３；ＣＨＲＮＢ４；ＣＨＲＮＧ；ＣＨＲＮＤ；ＣＨＲＮＥ；Ｐ２ＲＸ１；Ｐ２ＲＸ２；Ｐ２ＲＸ３；Ｐ２ＲＸ４；Ｐ２ＲＸ５；Ｐ２ＲＸ６；Ｐ２ＲＸ７；ＲＹＲ１；ＲＹＲ２；ＲＹＲ３；およびＺＡＣＮ。

【0093】

ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＭ８、およびＰ２Ｘ_２は、構造的特徴とゲート原理を共有する大規模なＬＧＩＣファミリーのメンバーである。例えば、ＴＲＰＶ１と同様に、ＴＲＰＶ４も熱によってトリガーされるが、カプサイシンによってはトリガーされず、Ｐ２Ｘ_３は、ＡＴＰによってトリガーされるが、Ｐ２Ｘ_２よりも急速に脱感作する。したがって、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＭ８、およびＰ２Ｘ_２は、特定の実施形態での使用に適したＬＧＩＣの非限定的な例である。

【0094】

一実施形態では、操作された受容体は、ＴＲＰＶ１もしくはＴＲＰＭ８受容体またはその変異タンパク質である。ＴＲＰＶ１およびＴＲＰＭ８は、末梢神経系の侵害受容ニューロンによって発現されるバニロイドおよびメントール受容体である。両方のチャネルは、非選択性、ナトリウム透過性およびカルシウム透過性のホモ四量体として機能すると考えられる。さらに、両方のチャネルおよびそれらの主なアゴニスト、それぞれカプサイシンおよびメントールなどの冷感性化合物は、中枢神経系に実質的に存在しない。カプサイシンならびにメントールおよびイシリンを含むいくつかの冷感性化合物は、感光性遮断基のための潜在的なアクセプタ部位を含有する。感光性遮断基とこのようなアクセプタとの関連は、光が活性リガンドを放出することによって間接的なトリガーとして作用する、リガンド依存性イオンチャネルをもたらす。

【0095】

一実施形態では、操作された受容体は、Ｐ２Ｘ_２受容体またはその変異タンパク質である。Ｐ２Ｘ_２は、その脱感作の遅い速度によって区別される、ＡＴＰ依存性の非選択的陽イオンチャネルである。Ｐ２Ｘ_２は、脱分極電流の選択的にアドレス指定可能な供給源として使用されてもよく、天然アゴニストを完全に欠く操作されたチャネル－リガンドの組み合わせの生成のためのプラットフォームを提示してもよい。

【0096】

本開示の操作された受容体の生成における使用を見いだす野生型ＬＧＩＣ受容体の配列の非限定的な例には、以下が含まれる。配列では、シグナルペプチドは斜体で、リガンド結合ドメインは太字で、イオン孔ドメインは下線で示される：

【0097】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＧＬＲＡ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１４６０４０．１（配列番号１）によってコードされるヒトアルファ１グリシン受容体（ＧｌｙＲα１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１３９５１２．１、配列番号２）である。

【化1】

【0098】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＣＨＲＮＡ７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００７４６．５（配列番号３）によってコードされるヒトニコチン性コリン作動性受容体アルファ７サブユニット（α７－ｎＡｃｈＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００７３７．１、配列番号４）である。

【化2】

【0099】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＨＴＲ３Ａ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２１３６２１．３（配列番号５）によってコードされるヒト５－ヒドロキシトリプタミン受容体３Ａ（５ＨＴ３Ａ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿９９８７８６．２、配列番号６）である。

【化3】

【0100】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＨＴＲ３Ｂ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６０２８．４（配列番号５６）によってコードされるヒト５－ヒドロキシトリプタミン受容体３Ｂ（５ＨＴ３Ｂ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６０１９．１、配列番号５７）である。

【化4】

【0101】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＧＡＢＲＢ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００８１４．５（配列番号７）によってコードされるヒトガンマ－アミノ酪酸受容体Ａ（ＧＡＢＡ－Ａ）、サブユニットベータ－３（ＧＡＢＡ－Ａ β３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００８０５．１、配列番号８）である。

【化5】

【0102】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＧＡＢＲＲ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０４２．４（配列番号９）によってコードされるヒトＧＡＢＡ－Ａ、サブユニットｒｈｏ１（ρ１）（ＧＡＢＡ－Ａ ρ１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２０３３．２、配列番号１０）である。

【化6】

【0103】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＧＡＢＲＲ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２０４３．４（配列番号１１）によってコードされるヒトＧＡＢＡ－Ａ、サブユニットｒｈｏ２（ρ２）（ＧＡＢＡ－Ａ ρ２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２０３４．３、配列番号１２）である。

【化7】

【0104】

いくつかの実施形態では、野生型ＬＧＩＣ受容体は、ＧＡＢＲＲ３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１０５５８０．２（配列番号１３）によってコードされるヒトＧＡＢＡ－Ａ、サブユニットｒｈｏ３（ρ３）（ＧＡＢＡ－Ａ ρ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０９９０５０．１、配列番号１４）である。

【化8】

【0105】

いくつかの態様では、主題の操作された受容体はキメラ受容体である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、少なくとも第一のＬＧＩＣからのリガンド結合ドメイン配列、および少なくとも第二のＬＧＩＣからのイオン孔伝導ドメイン配列、またはより単純に、「イオン孔ドメイン配列」を含む。いくつかの実施形態では、第一および第二のＬＧＩＣは、Ｃｙｓ－ループ受容体である。Ｃｙｓ－ループ受容体のリガンド結合ドメイン配列およびイオン孔ドメイン配列は、当技術分野で周知であり、公開されているソフトウェア、例えば、ＰｕｂＭｅｄ、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｕｎｉｐｒｏｔなどの使用によって、文献から容易に特定することができる。上述の配列では、リガンド結合ドメインは太字で、イオン孔ドメインは下線で示される。

【0106】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体のリガンド結合ドメインは、ヒトグリシン受容体のリガンド結合ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトグリシン受容体は、ヒトＧｌｙＲα１（配列番号２）である。いくつかのこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＧｌｙＲα１のおおよそのアミノ酸２９～２３５、例えば、配列番号２のアミノ酸２９～２３５、アミノ酸２９～２４０、アミノ酸２９～２４６、アミノ酸２９～２４８、アミノ酸２９～２５０、またはアミノ酸２９～２５２を含む。特定のこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸２９～２３５から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２９～２４０から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２９～２４６から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２９～２４８から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２９～２５０から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２９～２５２から本質的になる。いくつかの実施形態では、イオン孔ドメイン配列は、ヒトＧｌｙＲα１以外のＣｙｓ－ループ受容体由来である。

【0107】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体のリガンド結合ドメインは、ヒトニコチン性コリン作動性受容体のリガンド結合ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトニコチン性コリン作動性受容体は、ヒトα７－ＡＣｈＲである。いくつかのこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のおおよそのアミノ酸２３～２２０、例えば、配列番号４のアミノ酸２３～２２０、アミノ酸２３～２２６、アミノ酸２３～２２９、アミノ酸２３～２３０、いくつかの事例では、アミノ酸２３～２３１を含む。特定のこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸２３～２２０から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３～２２６から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３～２２９から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３～２３０から本質的になり、または配列番号４のアミノ酸２３～２３１から本質的になる。いくつかの実施形態では、イオン孔ドメイン配列は、ヒトα７－ｎＡＣｈＲ以外のＣｙｓ－ループ受容体由来である。

【0108】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体のリガンド結合ドメインは、ヒトセロトニン受容体のリガンド結合ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトセロトニン受容体は、ヒト５ＨＴ３Ａまたは５ＨＴ３Ｂである。いくつかのこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、５ＨＴ３Ａ（配列番号６）のおおよそのアミノ酸２３～２４７、例えば、配列番号６のアミノ酸２３～２４０、アミノ酸３０～２４５、アミノ酸２３～２４７、アミノ酸２３～２５０、いくつかの事例では、アミノ酸３０～２５５を含む。特定の実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号６のアミノ酸２３～２４０から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２３～２４５から本質的になり、配列番号６のアミノ酸３０～２４７から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２３～２５０から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２３～２５５から本質的になる。いくつかのこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、５ＨＴ３Ｂ（配列番号５７）のおおよそのアミノ酸２１～２３９、例えば、配列番号５７のアミノ酸２１～２３２、アミノ酸２１～２３５、アミノ酸２１～２４０、アミノ酸２１～２４５、いくつかの事例では、アミノ酸２１～２４７を含む。特定の実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号５７のアミノ酸２１～２３９から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２１～２３２から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２１～２３５から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２１～２４０から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２１～２４５から本質的になる。いくつかの実施形態では、イオン孔ドメイン配列は、ヒト５－ヒドロキシトリプタミン受容体３以外のＣｙｓ－ループ受容体由来である。

【0109】

いくつかの実施形態では、キメラ受容体のリガンド結合ドメインは、ヒトＧＡＢＡ受容体のリガンド結合ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＢＡ受容体は、ヒトＧＡＢＡ－Ａ β３である。いくつかのこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、ＧＡＢＡ－Ａ β３（配列番号８）のおおよそのアミノ酸２６～２４５、例えば、配列番号８のアミノ酸２６～２４０、アミノ酸２６～２４５、アミノ酸２６～２４８、アミノ酸２６～２５０、いくつかの事例では、アミノ酸２６～２５５を含む。特定のこうした実施形態では、リガンド結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸２６～２４０から本質的になり、配列番号８のアミノ酸２６～２４５から本質的になり、配列番号８のアミノ酸２６～２４８から本質的になり、配列番号８のアミノ酸２６～２５０から本質的になり、または配列番号８のアミノ酸２６～２５５から本質的になる。いくつかの実施形態では、イオン孔ドメイン配列は、ヒトＧＡＢＡ－Ａ以外のＣｙｓ－ループ受容体由来である。

【0110】

いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインが融合されたイオン孔ドメインは、陰イオンを伝導し、例えば、それはヒトグリシン受容体またはヒトセロトニン受容体のイオン孔ドメイン配列を含む。他の実施形態では、リガンド結合ドメインが融合されたイオン伝導孔ドメインは、陽イオンを伝導し、例えば、それはヒトアセチルコリン受容体またはヒトガンマ－アミノ酪酸受容体Ａのイオン孔ドメイン配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、イオン孔ドメインは、ヒトグリシン受容体のイオン孔ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトグリシン受容体は、ヒトＧｌｙＲα１である。いくつかのこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、ＧｌｙＲα１（配列番号２）のおおよそのアミノ酸２４５～４５７、例えば、配列番号２のアミノ酸２４０～４５７、アミノ酸２４５～４５７、アミノ酸２４８～４５７、アミノ酸２４９～４５７、アミノ酸２５０～４５７、アミノ酸２５５～４５７、またはアミノ酸２６０～４５７を含む。特定のこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、配列番号２のアミノ酸２４５～４５７から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２４８～４５７から本質的になり、配列番号２のアミノ酸２４９～４５７から本質的になり、または配列番号２のアミノ酸２５０～４５７から本質的になる。

【0112】

いくつかの実施形態では、イオン孔ドメインは、ヒトニコチン性コリン作動性受容体のイオン孔ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトニコチン性コリン作動性受容体は、ヒトα７－ＡＣｈＲである。いくつかのこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のおおよそのアミノ酸２３０～５０２、例えば、アミノ酸２２７～５０２、アミノ酸２３０～５０２、アミノ酸２３１～５０２、アミノ酸２３２～５０２、またはアミノ酸２３５～５０２を含む。特定のこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、配列番号４のアミノ酸２２７～５０２から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３０～５０２から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３１～５０２から本質的になり、配列番号４のアミノ酸２３２～５０２から本質的になり、または配列番号４のアミノ酸２３５～５０２から本質的になる。

【0113】

いくつかの実施形態では、イオン孔ドメインは、ヒトセロトニン受容体のイオン孔ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトセロトニン受容体は、ヒト５ＨＴ３Ａまたは５ＨＴ３Ｂである。いくつかのこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、５ＨＴ３Ａ（配列番号６）のおおよそのアミノ酸２４８～５１６、例えば、配列番号６のアミノ酸２４０～５１６、アミノ酸２４５～５１６、アミノ酸２４８～５１６、アミノ酸２５０～５１６、またはアミノ酸２５５～５１６を含む。特定のこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、配列番号６のアミノ酸２４０～５１６から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２４５～５１６から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２４８～５１６から本質的になり、配列番号６のアミノ酸２５０～５１６から本質的になり、またはアミノ酸２５３～５１６から本質的になる。いくつかのこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、５ＨＴ３Ｂ（配列番号５７）のおおよそのアミノ酸２４０～４４１、例えば、配列番号５７のアミノ酸２３０～４４１、アミノ酸２３５～４４１、アミノ酸２４０～４４１、アミノ酸２４５～４４１、またはアミノ酸２５０～４４１を含む。特定のこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、配列番号５７のアミノ酸２３０～４４１から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２３５～４４１から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２４０～４４１から本質的になり、配列番号５７のアミノ酸２４５～４４１から本質的になり、またはアミノ酸２５０～４４１から本質的になる。

【0114】

いくつかの実施形態では、イオン孔ドメインは、ヒトＧＡＢＡ受容体のイオン孔ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＢＡ受容体は、ヒトＧＡＢＡ－Ａ β３である。いくつかのこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、ＧＡＢＡ－Ａ β３（配列番号８）のおおよそのアミノ酸２４６～４７３、例えば、配列番号８のアミノ酸２４０～４７３、アミノ酸２４５～４７３、アミノ酸２４７～４７３、アミノ酸２５０～４７３、またはアミノ酸２５３～４７３を含む。特定のこうした実施形態では、イオン孔ドメインは、配列番号８のアミノ酸２４０～４７３、配列番号８のアミノ酸２４５～４７３、配列番号８のアミノ酸２４７～４７３、配列番号８のアミノ酸２５０～４７３、または配列番号８のアミノ酸２５３～４７３から本質的になる。

【0115】

いくつかの実施形態では、主題のキメラリガンド依存性イオンチャネルのイオン孔ドメインは、イオン孔ドメインのＭ２－Ｍ３リンカードメインに対して異種であるＭ２－Ｍ３リンカードメインを含む。「Ｍ２－Ｍ３リンカードメイン」または「Ｍ２－Ｍ３リンカー」とは、受容体の膜貫通ドメイン２（Ｍ２）のＣ末端にそのアミノ（Ｎ）末端が隣接し、かつ受容体の膜貫通ドメイン３（Ｍ３）のＮ末端にそのカルボキシ（Ｃ）末端が隣接している、ＬＧＩＣのイオン孔ドメイン内の配列を意味する。ＬＧＩＣのＭ２－Ｍ３リンカーは、当技術分野から、および／または公開されている任意のタンパク質分析ツール、例えば、Ｅｘｐａｓｙ、ｕｎｉＰｒｏｔなどを使用することによって容易に決定され得る。典型的には、キメラ受容体のイオン孔ドメインが異種のＭ２－Ｍ３リンカーを含む場合、Ｍ２－Ｍ３リンカーは、キメラ受容体のリガンド結合ドメインと同じ受容体に由来する。例えば、主題のリガンド依存性イオンチャネルが、ＡＣｈＲ由来のリガンド結合ドメインと、ＧｌｙＲ由来のイオン孔ドメインとを含む場合、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、代わりにＡＣｈＲに由来するものとなるＭ２－Ｍ３リンカーを除いて、ＧｌｙＲ由来のイオン孔ドメイン配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、イオン孔ドメインは、ＧｌｙＲα１由来であり、Ｍ２－Ｍ３リンカーは、α７－ｎＡＣｈＲ由来である。いくつかの実施形態では、ＧｌｙＲα１から除去されるＭ２－Ｍ３リンカー配列は、ＧｌｙＲα１（配列番号２）のおおよそのアミノ酸２９３～３１１、例えば、アミノ酸３０４～３１０、２９３～３０６、２９８～３１０、３０５～３１１などである。いくつかのこうした実施形態では、挿入されるＭ２－Ｍ３リンカーは、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のおおよそのアミノ酸２８１～２９５、例えば、アミノ酸２９０～２９５、２８１～２９０、２８１～２９５、２８７～２９２などであるか、またはα７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸２８１～２９５に対して約９５％以上の同一性を有する配列である。

【0116】

いくつかの実施形態では、主題のキメラリガンド依存性イオンチャネルのリガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメインのＣｙｓループ配列に対して異種であるＣｙｓ－ループドメイン配列を含む。「Ｃｙｓ－ループドメイン配列」または「Ｃｙｓ－ループは配列」とは、Ｎ末端およびＣ末端でシステインに隣接するループ構造を形成する、Ｃｙｓ－ループＬＧＩＣのリガンド結合ドメイン内のドメインを意味する。理論に拘束されることを意図するものではないが、リガンドのリガンド結合ドメインに結合に伴い、Ｃｙｓ－ループは構造的にＭ２－Ｍ３ループに近接して移動すると考えられており、この移動は、細胞外ドメインにおけるリガンド結合の生物物理学的翻訳を媒介して、イオン孔ドメインにおけるシグナル伝達をする（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍａｒｔ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ ２００９：３１（４）に概説）。内因性Ｃｙｓ－ループ配列を異種Ｃｙｓ－ループ配列で置換することにより、ＬＧＩＣの導電率を１．５倍以上、例えば、少なくとも２倍、３倍、または４倍、いくつかの事例では、少なくとも５倍、または６倍、および特定の用量では、少なくとも７倍、８倍、９倍、または１０倍増加させてもよい。Ｃｙｓ－ループ受容体のＣｙｓ－ループドメインは、当技術分野から、および／または公開されている任意のタンパク質分析ツール、例えば、Ｅｘｐａｓｙ、ｕｎｉＰｒｏｔなどを使用することによって容易に決定され得る。典型的には、キメラ受容体のリガンド結合ドメインが異種のＣｙｓ－ループ配列を含む場合、Ｃｙｓ－ループ配列は、キメラ受容体のイオン孔ドメインと同じ受容体に由来する。例えば、主題のキメラリガンド依存性イオンチャネルが、ＡＣｈＲ由来のリガンド結合ドメインと、ＧｌｙＲ由来のイオン孔ドメインとを含む場合、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、代わりにＧｌｙＲに由来するものであるＣｙｓ－ループドメインの配列を除いて、ＡＣｈＲ由来のリガンド結合ドメイン配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、α７－ｎＡＣｈＲ由来であり、Ｃｙｓ－ループ配列は、ＧｌｙＲα１由来である。いくつかのこうした実施形態では、α７－ＡＣｈＲから除去されるＣｙｓ－ループ配列は、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のおおよそのアミノ酸１５０～１６４、例えば、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸１５０～１５７である。いくつかのこうした実施形態では、挿入されるＣｙｓループ配列は、ＧｌｙＲα１（配列番号２）のおおよそのアミノ酸１６６～１８０、例えば、ＧｌｙＲα１のアミノ酸１６６～１７２、またはＧｌｙＲα１のアミノ酸１６６～１８０に対して約９５％以上の同一性を有する配列である。

【0117】

いくつかの実施形態では、主題のキメラリガンド依存性イオンチャネルのリガンド結合ドメインは、リガンド結合ドメインのβ１－２ループドメイン配列に対して異種であるβ１－２ループドメイン配列を含む。「β１－２ループドメイン配列」、または「β１－２ループ、またはβ１－β２ループ」とは、Ｃｙｓ－ループＬＧＩＣのリガンド結合ドメイン内の、そのＮ末端にβ１シートのＣ末端、そのＣ末端にβ２シートのＮ末端が隣接するドメインを意味する。理論に拘束されることを意図するものではないが、β１－２ループは、細胞外ドメインにおけるイオン孔ドメインへのリガンド結合の生物物理学的翻訳およびその後のシグナル伝達（すなわち、ＧｌｙＲの場合の塩化物流入）を媒介するのに役立つと考えられる。リガンドの結合に伴い、β１－２ループは、Ｃｙｓ－ループと共に、Ｍ２－Ｍ３ループに近接して、細胞外ドメインにおけるリガンド結合の生物物理学的翻訳を媒介し、Ｍ２－Ｍ３ループが存在するイオン孔ドメインにおけるシグナル伝達をすると考えられる（上記Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍａｒｔに概説）。内因性β１－２ループ配列を異種β１－２ループ配列で置換することにより、ＬＧＩＣの導電率を１．５倍以上、例えば、少なくとも２倍、３倍、または４倍、いくつかの事例では、少なくとも５倍、または６倍、および特定の用量では、少なくとも７倍、８倍、９倍、または１０倍増加させてもよい。Ｃｙｓ－ループ受容体のβ１－２ループは、当技術分野から、および／または公開されている任意のタンパク質分析ツール、例えば、Ｅｘｐａｓｙ、ｕｎｉＰｒｏｔなどを使用することによって容易に決定され得る。典型的には、キメラ受容体のリガンド結合ドメインが異種のβ１－２ループ配列を含む場合、β１－２ループ配列は、キメラ受容体のイオン孔ドメインと同じ受容体に由来する。例えば、主題のキメラリガンド依存性イオンチャネルが、ＡＣｈＲ由来のリガンド結合ドメインと、ＧｌｙＲ由来のイオン孔ドメインとを含む場合、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、代わりにＧｌｙＲに由来するものであるβ１－２ループドメインの配列を除いて、ＡＣｈＲ由来のリガンド結合ドメイン配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、α７－ｎＡＣｈＲ由来であり、β１－２ループ配列は、ＧｌｙＲα１由来である。いくつかの実施形態では、α７－ＡＣｈＲから除去されるβ１－２ループ配列は、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のおおよそのアミノ酸６７～７０、例えば、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸６７～７０、６６～７１、または６４～７２である。いくつかの実施形態では、挿入されるβ１－２ループ配列は、ＧｌｙＲα１（配列番号２）のおおよそのアミノ酸７９～８５、例えば、ＧｌｙＲα１のアミノ酸８１～８４、７９～８５、もしくは８１～８４、またはＧｌｙＲα１のアミノ酸７９～８５に対して約９５％以上の同一性を有する配列である。

【0118】

本開示のキメラＬＧＩＣ受容体の配列の非限定的な例としては、配列番号１５～配列番号５２として本明細書に開示される配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体またはそれをコードするポリヌクレオチドは、本明細書における配列番号１５～配列番号５２に提供される配列に対して８５％以上の配列同一性、例えば、配列番号１５～配列番号５２に提供される配列に対して、９０％以上、９３％以上、または９５％以上、すなわち約９６％、約９７％、約９８％、約９８％、約９９％、または約１００％の配列同一性を有する。配列では、シグナルペプチドは斜体で、リガンド結合ドメインは太字で、イオン孔ドメインは下線で示される。

【0119】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラ（Ｒ２２９ジャンクション）である：

【化9】

【0120】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１（Ｒ２２８ジャンクション）キメラである：

【化10】

【0121】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１（Ｖ２２４ジャンクション）キメラである：

【化11】

【0122】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１（Ｙ２３３ジャンクション）キメラである：

【化12】

【0123】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、α７－ｎＡＣｈＲ Ｍ２－Ｍ３リンカー（小文字）を含むヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラ（Ｒ２２９ジャンクション）である：

【化13-1】

【化13-2】

【0124】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ＧｌｙＲα１ Ｃｙｓ－ループ配列（小文字）を含むヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラである：いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、配列番号３３に対して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0125】

【化14】

【0126】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ＧｌｙＲα１ β１－２ループ配列（小文字）を含むヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラである：

【化15】

【0127】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ＧｌｙＲα１ β１－２ループ配列（小文字）およびＣｙｓ－ループ配列（小文字）を含むヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラである：

【化16】

【0128】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトα７－ｎＡＣｈＲ Ｍ２－Ｍ３リンカー（小文字）を含むヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ＧｌｙＲα１ β１－２ループ配列（小文字）を含むヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラである：

【化17】

【0129】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトα７－ｎＡＣｈＲ Ｍ２－Ｍ３リンカー（小文字）を含むヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ＧｌｙＲα１ Ｃｙｓ－ループ配列（小文字）を含むヒトα７－ＡＣｈＲシグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＣＨＲＮＡ７／ＧＬＲＡ１キメラである：

【化18】

【0130】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒト５ＨＴ３Ａセロトニン受容体シグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＨＴＲ３Ａ／ＧＬＲＡ１キメラ（Ｒ２４１ジャンクション）である：

【化19】

【0131】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒト５ＨＴ３Ａセロトニン受容体シグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＨＴＲ３Ａ／ＧＬＲＡ１キメラ（Ｖ２３６ジャンクション）である：

【化20】

【0132】

いくつかの実施形態では、キメラＬＧＩＣ受容体は、ヒトＧｌｙＲα１イオン孔ドメイン（下線）に融合された、ヒトＧＡＢＡ－Ａ β３シグナルペプチド（斜体）およびリガンド結合ドメイン（太字）を含む、ＧＡＢＲＢ３／ＧＬＲＡ１キメラ（Ｙ２４５ジャンクション）である：

【化21】

【0133】

上述のように、いくつかの態様では、主題の操作された受容体は、操作された受容体に対するリガンドの効力を、非変異親受容体のその効力と比較して、変化させる少なくとも一つのアミノ酸変異を含む。換言すると、一つまたは複数のアミノ酸変異、例えば、機能喪失型変異または機能獲得型変異は、非変異親受容体の応答性と比較して、操作された受容体のリガンドに対する応答性を変える。いくつかのこうした実施形態では、一つまたは複数の変異は、操作された受容体のリガンド結合ドメイン内にある。いくつかの実施形態では、操作された受容体のリガンド結合ドメインがＣｙｓ－ループ受容体タンパク質である場合と同様に、一つまたは複数のアミノ酸変異は、Ｗ７７、Ｙ９４、Ｒ１０１、Ｗ１０８、Ｙ１１５、Ｔ１２８、Ｎ１２９、Ｖ１３０、Ｌ１３１、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１５１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｓ１８８、Ｙ１９０、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７からなる群から選択されるα７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）の残基に対応する残基における置換である。いくつかの実施形態では、一つの残基が置換されている。いくつかの実施形態では、２、３、４、または５個以上の残基が置換されており、例えば、６、７、８、９または１０個の残基が置換されている。特定の実施形態では、残基は、Ｗ７７、Ｒ１０１、Ｙ１１５、Ｎ１２９、Ｌ１３１、Ｓ１７０、Ｓ１７２、およびＳ１８８からなる群から選択される、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）の残基に対応する。特定の実施形態では、一つまたは複数の置換は、α７－ｎＡＣｈＲ配列内にある。

【0134】

いくつかの実施形態では、一つまたは複数の置換は、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、５０倍以上、または１００倍、アセチルコリンおよび非天然リガンドに対する操作された受容体の応答性を低下させる。特定の実施形態では、一つまたは複数の置換は、α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１Ｉ、Ｒ１０１Ｓ、Ｒ１０１Ｄ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｔ、Ｔ１２８Ｍ、Ｔ１２８Ｒ、Ｔ１２８Ｉ、Ｎ１２９Ｉ、Ｎ１２９Ｖ、Ｎ１２９Ｐ、Ｎ１２９Ｗ、Ｎ１２９Ｔ、Ｎ１２９Ｄ、Ｎ１２９Ｅ、Ｌ１３１Ｅ、Ｌ１３１Ｐ、Ｌ１３１Ｔ、Ｌ１３１Ｄ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ１４１Ｓ、Ｌ１４１Ｒ、Ｗ１７１Ｆ、Ｗ１７１Ｈ、Ｓ１７２Ｆ、Ｓ１７２Ｙ、Ｓ１７２Ｒ、Ｓ１７２Ｄ、Ｃ２１２Ａ、Ｃ２１２Ｌ、またはＣ２１３Ｐに対応する置換である。他の事例では、一つまたは複数の置換は、操作された受容体に対するアセチルコリンの効力を選択的に減少させる。言い換えれば、一つまたは複数の置換は、操作された受容体のアセチルコリンに対する応答性を低下させる一方で、非天然リガンドに対する応答性を本質的に維持し、またはそうでなければ、それが非天然リガンドに対する操作された受容体の応答性を低下させるよりも２倍以上、例えば、３倍、４倍、５倍以上、場合によっては、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍以上、アセチルコリンに対する操作された受容体の応答性を低下させる。例示的な置換としては、すなわち、α７－ｎＡＣｈＲのＬ１３１Ｅ、Ｌ１３１Ｓ、Ｌ１３１Ｔ、Ｌ１３１Ｄ、またはＳ１７２Ｄに対応する置換が挙げられる。さらに他の実施形態では、一つまたは複数の置換は、操作された受容体上の非天然リガンドの効力を選択的に低下させる。言い換えれば、一つまたは複数の置換は、操作された受容体の非天然リガンドに対する応答性を低下させる一方で、アセチルコリンに対する応答性を本質的に維持し、またはそうでなければ、それがアセチルコリンに対する操作された受容体の応答性を低下させるよりも２倍以上、例えば、３倍、５倍以上、場合によっては、１０倍、２０倍、または５０倍以上、非天然リガンドに対する操作された受容体の応答性を低下させる。例示的な置換としては、α７－ｎＡＣｈＲのＷ７７Ｍ、Ｙ１１５Ｗ、Ｓ１７２Ｔ、またはＳ１７２Ｃに対応する置換を含む。特定の実施形態では、一つまたは複数の置換は、α７－ｎＡＣｈＲ配列内にある。特定の実施形態では、非天然リガンドは、ＡＺＤ－０３２８、ＴＣ６９８７、ＡＢＴ－１２６、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７から選択される。

【0135】

他の実施形態では、一つまたは複数の置換は、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、５０倍以上、または１００倍、アセチルコリンおよび／または非天然リガンドに対する操作された受容体の応答性を増加させる。例示的な置換の例としては、Ｌ１３１Ｎ、Ｌ１４１Ｗ、Ｓ１７０Ｇ、Ｓ１７０Ａ、Ｓ１７０Ｌ、Ｓ１７０Ｉ、Ｓ１７０Ｖ、Ｓ１７０Ｐ、Ｓ１７０Ｆ、Ｓ１７０Ｍ、Ｓ１７０Ｔ、Ｓ１７０Ｃ、Ｓ１７２Ｔ、Ｓ１７２Ｃ、Ｓ１８８Ｉ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｍ、Ｓ１８８Ｑ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８ＰまたはＳ１８８Ｗに対応する置換を含む。いくつかの事例では、一つまたは複数の置換は、アセチルコリンおよび非天然リガンドの両方の効力を増加させ、例えば、α７－ｎＡＣｈＲのＬ１３１Ｎ、Ｓ１７０Ｇ、Ｓ１７０Ａ、Ｓ１７０Ｌ、Ｓ１７０Ｉ、Ｓ１７０Ｖ、Ｓ１７０Ｐ、Ｓ１７０Ｆ、Ｓ１７０Ｍ、Ｓ１７０Ｔ、Ｓ１７０Ｃ、Ｓ１７２Ｔ、Ｓ１８８Ｉ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１８８Ｆ、Ｓ１８８Ｍ、Ｓ１８８Ｑ、およびＳ１８８Ｔに対応する置換である。他の事例では、一つまたは複数の置換は、操作された受容体に対するアセチルコリンの効力を選択的に増加させる。言い換えれば、一つまたは複数の置換、例えば、α７－ｎＡＣｈＲのＬ１４１Ｗ、Ｓ１７２Ｔ、Ｓ１７２Ｃ、Ｓ１８８Ｐ、またはＳ１８８Ｗに対応する置換は、それが操作された受容体の非天然リガンドに対する応答性を増加させるよりも、２倍以上、例えば、３倍、４倍、または５倍、いくつかの事例では、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍、操作された受容体のアセチルコリンに対する応答性を増加させる。特定の実施形態では、一つまたは複数の置換は、α７－ｎＡＣｈＲ配列内にある。特定の実施形態では、非天然リガンドは、ＡＺＤ－０３２８、ＴＣ６９８７、ＡＢＴ－１２６、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７から選択される。さらに他の事例では、一つまたは複数の置換は、操作された受容体に対する非天然リガンドの効力を選択的に増加させる。言い換えれば、一つまたは複数の置換は、それが操作された受容体のアセチルコリンに対する応答性を増加させるよりも、２倍以上、例えば、３倍、５倍以上、いくつかの事例では、１０倍、２０倍、または５０倍以上、操作された受容体の非天然リガンドに対する応答性を増加させる。

【0136】

いくつかの実施形態では、対象の操作された受容体において変異されるアミノ酸残基は、野生型ａ７ ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のＲ２７、Ｅ４１、Ｑ７９、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｇ１７５、Ｙ２１０、Ｐ２１６、Ｙ２１７、またはＤ２１９に対応するアミノ酸ではない。いくつかの実施形態では、主題の操作された受容体において変異されるアミノ酸残基は、野生型ａ７ ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のＲ２７、Ｅ４１、Ｑ７９、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｇ１７５、Ｙ２１０、Ｐ２１６、Ｙ２１７、またはＤ２１９に対応するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、置換は、野生型α７ ｎＡＣｈＲにおけるＷ７７Ｆ、Ｗ７７Ｙ、Ｗ７７Ｍ、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｑ、Ｑ７９Ｓ、Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ｍ、Ｌ１３１Ｎ、Ｌ１３１Ｑ、Ｌ１３１Ｖ、Ｌ１３１Ｆ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｇ１７５Ｋ、Ｇ１７５Ａ、Ｇ１７５Ｆ、Ｇ１７５Ｈ、Ｇ１７５Ｍ、Ｇ１７５Ｒ、Ｇ１７５Ｓ、Ｇ１７５Ｖ、Ｙ２１０Ｆ、Ｐ２１６Ｉ、Ｙ２１７Ｆ、またはＤ２１９Ａに対応する置換ではない。いくつかの実施形態では、置換は、野生型α７ ｎＡＣｈＲにおけるＷ７７Ｆ、Ｗ７７Ｙ、Ｗ７７Ｍ、Ｑ７９Ａ、Ｑ７９Ｑ、Ｑ７９Ｓ、Ｑ７９Ｇ、Ｙ１１５Ｆ、Ｌ１３１Ａ、Ｌ１３１Ｇ、Ｌ１３１Ｍ、Ｌ１３１Ｎ、Ｌ１３１Ｑ、Ｌ１３１Ｖ、Ｌ１３１Ｆ、Ｑ１３９Ｇ、Ｑ１３９Ｌ、Ｇ１７５Ｋ、Ｇ１７５Ａ、Ｇ１７５Ｆ、Ｇ１７５Ｈ、Ｇ１７５Ｍ、Ｇ１７５Ｒ、Ｇ１７５Ｓ、Ｇ１７５Ｖ、Ｙ２１０Ｆ、Ｐ２１６Ｉ、Ｙ２１７Ｆ、またはＤ２１９Ａに対応する置換である。いくつかの実施形態では、かかる置換が操作された受容体内に存在する場合、本明細書に記載されるアミノ酸変異のうちの一つまたは複数と組み合わせて存在する。

【0137】

例えば、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）の残基Ｙ９４、Ｙ１１５、Ｙ１５１、およびＹ１９０は、天然リガンドアセチルコリンの結合を媒介することが見出されている。これらの残基での変異は、アセチルコリンの結合を低減し、したがって機能喪失型変異である。対照的に、α７－ｎＡＣｈＲの残基Ｗ７７、Ｙ１１５、Ｎ１２９、Ｖ１３０、Ｌ１３１、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７は、非天然リガンドＡＺＤ０３２８のこの受容体への結合を媒介し、これらの残基の変異は、この受容体に対するＡＺＤ０３２８および／または他のリガンドの親和性を増加させる可能性があり、したがって、機能獲得型変異であり得る。いくつかの実施形態では、主題の操作された受容体は、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のリガンド結合ドメイン領域、またはα７－ｎＡＣｈＲのリガンド結合ドメイン領域を含むキメラ受容体のリガンド結合ドメインの一つまたは複数のアミノ酸残基に変異を含み、一つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｗ７７、Ｙ９４、Ｙ１１５、Ｎ１２９、Ｖ１３０、Ｌ１３１、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１５１、Ｓ１７０、Ｙ１９０、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７からなる群から選択される。特定の実施形態では、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のリガンド結合ドメイン領域、またはα７－ｎＡＣｈＲのリガンド結合ドメイン領域を含むキメラ受容体のリガンド結合ドメインの一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、Ｗ７７、Ｙ９４、Ｙ１１５、Ｎ１２９、Ｖ１３０、Ｌ１３１、Ｑ１３９、Ｌ１４１、Ｙ１５１、Ｓ１７０、Ｙ１９０、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７からなる群から選択される一つまたは複数のアミノ酸残基での置換である。

【0138】

別の例として、α７－ｎＡＣｈＲ（配列番号４）のＹ１１５、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｃ２１２、およびＹ２１７の残基は、アセチルコリンおよび／またはニコチンの結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数での変異は、アセチルコリンおよび／またはニコチンの結合を減少させることが見出された。α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｙ１１５、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｓ１８８、Ｙ２１０、およびＹ２１７は、非天然リガンドＡＢＴ１２６の結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数の変異は、ＡＢＴ１２６および／または他のリガンドのα７－ｎＡＣｈＲに対する親和性を増加させることが予期される。α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｙ１１５、Ｔ１２８、Ｎ１２９、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７は、非天然リガンドＴＣ６９８７の結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数の変異は、ＴＣ６９８７および／または他のリガンドのα７－ｎＡＣｈＲに対する親和性を増加させることが予期される。α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｎ１２０、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｙ２１０、およびＹ２１７は、非天然リガンドファシニクリン／ＲＧ３４８７の結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数の変異は、ファシニクリン／ＲＧ３４８７および／または他のリガンドのα７－ｎＡＣｈＲに対する親和性を増加させることが予期される。いくつかの実施形態では、主題の操作された受容体は、α７－ｎＡＣｈＲのリガンド結合ドメイン領域、またはα７－ｎＡＣｈＲのリガンド結合ドメイン領域を含むキメラ受容体のリガンド結合ドメインの一つまたは複数のアミノ酸残基に変異を含み、一つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｒ１０１、Ｙ１１５、Ｔ１２８、Ｎ１２０、Ｎ１２９、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｓ１８８、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３、およびＹ２１７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基は、アセチルコリンおよび／またはニコチンのα７－ｎＡＣｈＲへの結合を変化させ、アミノ酸は、α７－ｎＡＣｈＲのＹ１１５、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｃ２１２、およびＹ２１７からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｃ２１２およびＳ１７０から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ＡＢＴ１２６のα７－ｎＡＣｈＲへの結合を変化させ、一つまたは複数のアミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｙ１１５、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｓ１８８、Ｙ２１０、およびＹ２１７からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｒ１０１、Ｓ１８８、およびＹ２１０から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ＴＣ６９８７のα７－ｎＡＣｈＲへの結合を変化させ、一つまたは複数のアミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｙ１１５、Ｔ１２８、Ｎ１２９、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｙ２１０、Ｃ２１２、Ｃ２１３およびＹ２１７からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｒ１０１、Ｔ１２８、Ｎ１２９、Ｙ２１０およびＣ２１３から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、ファシニクリン／ＲＧ３４８７のα７－ｎＡＣｈＲへの結合を変化させ、一つまたは複数のアミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのＲ１０１、Ｎ１２０、Ｌ１３１、Ｌ１４１、Ｓ１７０、Ｗ１７１、Ｓ１７２、Ｙ２１０、およびＹ２１７からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｙ２１０、Ｒ１０１、およびＮ１２９から選択される。

【0139】

別の例として、５ＨＴ３（配列番号６）の残基Ｗ８５、Ｒ８７、Ｙ１３６、Ｙ１３８、Ｇ１４６、Ｎ１４７、Ｙ１４８、Ｋ１４９、Ｓ１７７、Ｓ１７８、Ｌ１７９、Ｙ２２８、およびＹ２２９が、セロトニンの結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数での変異が、セロトニンの５ＨＴ３への結合を減少させることが見出された。５ＨＴ３のＤ６４、Ｉ６６、Ｗ８５、Ｒ８７、Ｙ８９、Ｎ１２３、Ｇ１４６、Ｙ１４８、Ｔ１７６、Ｓ１７７、Ｓ１７８、Ｗ１９０、Ｒ１９１、Ｆ２２１、Ｅ２２４、Ｙ２２８、Ｙ２２９、およびＥ２３１は、非天然リガンドシランセトロンの結合を媒介し、これらの残基のうちの一つまたは複数の変異が、シランセトロンおよび／または他のリガンドの５ＨＴ３に対する親和性を増加させることが予測される。いくつかの実施形態では、主題の操作された受容体は、５ＨＴ３Ａのリガンド結合ドメイン領域、または５ＨＴ３のリガンド結合ドメイン領域を含むキメラ受容体のリガンド結合ドメインの一つまたは複数のアミノ酸残基に変異を含み、一つまたは複数のアミノ酸残基は、Ｄ６４、Ｉ６６、Ｗ８５、Ｒ８７、Ｙ８９、Ｎ１２３、Ｙ１３６、Ｙ１３８、Ｇ１４６、Ｎ１４７、Ｙ１４８、Ｋ１４９、Ｔ１７６、Ｓ１７７、Ｓ１７８、Ｌ１７９、Ｗ１９０、Ｒ１９１、Ｆ２２１、Ｅ２２４、Ｙ２２８、Ｙ２２９、およびＥ２３１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、セロトニンの５ＨＴ３への結合を変化させ、アミノ酸は、５ＨＴ３ＡのＷ８５、Ｒ８７、Ｙ１３６、Ｙ１３８、Ｇ１４６、Ｎ１４７、Ｙ１４８、Ｋ１４９、Ｓ１７７、Ｓ１７８、Ｌ１７９、Ｙ２２８、およびＹ２２９からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｙ１３６、Ｙ１３８、Ｎ１４７、Ｋ１４９、およびＬ１７９から選択される。いくつかの実施形態では、一つまたは複数のアミノ酸残基における変異は、シランセトロンの５ＨＴ３への結合を変化させ、一つまたは複数のアミノ酸残基は、５ＨＴ３ＡのＤ６４、Ｉ６６、Ｗ８５、Ｒ８７、Ｙ８９、Ｎ１２３、Ｇ１４６、Ｙ１４８、Ｔ１７６、Ｓ１７７、Ｓ１７８、Ｗ１９０、Ｒ１９１、Ｆ２２１、Ｅ２２４、Ｙ２２８、Ｙ２２９、およびＥ２３１からなる群から選択される。特定のこうした実施形態では、アミノ酸は、Ｄ６４、Ｉ６６、Ｙ８９、Ｎ１２３、Ｔ１７６、Ｗ１９０、Ｒ１９１、Ｆ２２１、Ｅ２２４、およびＥ２３１から選択される。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＬＧＩＣの活性を調節するリガンドの能力に影響を及ぼす一つまたは複数の変異は、ＬＧＩＣのイオン孔ドメイン内に位置する。例えば、セロトニン受容体５ＨＴ３Ａの残基Ｔ２７９は、リガンドがチャネルの活性を調節する方法を媒介し、その結果、この残基の、例えばセリン（Ｔ２７９Ｓ）への変異が、拮抗的である（すなわち、ＬＧＩＣの活性を減少させる）効果をアゴニスト性（すなわち、チャネルの活性を促進する）に変換させる。いくつかの実施形態では、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、ヒト５ＨＴ３Ａ（配列番号６）のイオン孔ドメイン、または５ＨＴ３Ａのイオン孔ドメインを含むキメラＬＧＩＣ受容体のイオン孔ドメインの一つまたは複数のアミノ酸残基における変異を含み、ここで、置換は、配列番号６の２７９に対応するアミノ酸内にある。特定の実施形態では、置換は、配列番号６に対するＴ２７９Ｓ置換である。

【0141】

本開示は、親受容体と比較して、アミノ酸置換などの二つ以上の変異を有する操作された受容体を提供する。いくつかの実施形態では、親受容体はキメラ受容体である。いくつかの実施形態では、親受容体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された受容体は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む親受容体と比較して、二つのアミノ酸置換を含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、二つのアミノ酸置換は、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基にある。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、リガンド結合ドメインは、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、アセチルコリンに対する操作された受容体の効力は、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも低い。いくつかの実施形態では、アセチルコリンに対する操作された受容体の効力は、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも約１．５倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍、それらの間にある全ての部分範囲および値を含む）低い。

【0144】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力とほぼ同じである。いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも高い。いくつかの実施形態では、非天然リガンドに対する操作された受容体の効力は、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも約１．５倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍、それらの間にある全ての部分範囲および値を含む）高い。いくつかの実施形態では、効力を決定することは、ＥＣ５０を決定することを含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、非天然リガンドの存在下での操作された受容体の有効性は、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも高い。いくつかの実施形態では、非天然リガンドの存在下での操作された受容体の有効性は、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも少なくとも約１．５倍（例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１２倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、または約１００倍、それらの間にある全ての部分範囲および値を含む）高い。いくつかの実施形態では、有効性を決定することは、非天然リガンドの存在下で、インビトロで操作された受容体を通過する電流の量を決定することを含む。

【0146】

いくつかの態様では、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、一つまたは複数の非脱感作変異を含む。リガンド依存性イオンチャネルの文脈で使用される場合、「脱感作」とは、アゴニストの長時間の存在下でのイオン流量の進行的な減少を指す。これにより、リガンドに対するニューロンの応答性が漸進的に失われる。非脱感作変異とは、ＬＧＩＣがリガンドに対して脱感作され、それによってニューロンがリガンドに対してより応答性が弱くなる、または非応答性になることを防ぐアミノ酸変異を意味する。非脱感作変異は、変異を担持するＬＧＩＣをニューロンに導入し、リガンドへの長時間の曝露中に経時的な電流の流れを分析することによって容易に特定することができる。ＬＧＩＣが非脱感作変異を含まない場合、電流は、長時間の曝露中にピークから定常状態まで回復するが、ＬＧＩＣが非脱感作変異を含む場合、電流は、リガンドへの曝露期間中、ピーク流量に留まる。脱感作をもたらす例示的なアミノ酸変異としては、ヒトＧｌｙＲα１におけるＶ３２２Ｌ変異（シグナルペプチドを除去するためのプロタンパク質のＶ２９４Ｌポストプロセシング）、およびヒトＧＡＢＡ－Ａ受容体ＧＡＢＲＢ３におけるＬ３２１Ｖ変異（シグナルペプチドを除去するためのプロタンパク質のＬ２９６Ｖポストプロセシング）が挙げられる。いくつかの実施形態では、脱感作変異は、ＬＧＩＣのＣ末端でまたはその近傍のアミノ酸残基の脱感作配列、例えば、ＧＡＢＡＲ１によりコードされるタンパク質のＣ末端に由来するＩＤＲＬＳＲＩＡＦＰＬＬＦＧＩＦＮＬＶＹＷＡＴＹＬＮＲＥＰＱＬ（配列番号５３）に対して９０％以上の同一性を有する配列との置換、例えば、ＧＡＢＲＲ１中の残基４５５～４７９のＩＤＲＬＳＲＩＡＦＰＬＬＦＧＩＦＮＬＶＹＷＡＴＹＬＮＲＥＰＱＬ（配列番号５３）との置換である。ＬＧＩＣ脱感作、ＬＧＩＣの脱感作を測定する方法、および非脱感作の変異は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｇｉｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１５ Ａｐｒ ２０，６：６８２９，ａｎｄ Ｋｅｒａｍｉｄａｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１３ Ａｐｒ；７０（７）：１２４１－５３を参照のこと。当該全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

いくつかの態様では、主題のリガンド依存性イオンチャネルは、一つまたは複数の変換変異を含む。変換変異とは、ＬＧＩＣのイオン孔ドメインの透過性を変化させ、それが非天然イオン、すなわち自然通過を許さないイオンの伝導を許容するようになる変異を意味する。いくつかの事例では、変異は、透過性を陽イオンから陰イオンへと変換し、例えば、ヒトα７－ｎＡＣｈＲ（ＣＨＲＮＡ７）（ＥＫＩＳＬＧＩＴＶＬＬＳＬＴＶＦＭＬＬＶＡＥ、配列番号５４）中のアミノ酸残基２６０～２８１、または別の陽イオン透過性ＬＧＩＣ中の対応するアミノ酸をペプチド配列ＰＡＫＩＧＬＧＩＴＶＬＬＳＬＴＦＭＳＧＶＡＮ（配列番号５５）で置換する。いくつかの場合では、変異が、透過性を陰イオンから陽イオンへと変換し、例えば、ＧＬＲＡ１のアミノ酸残基２７９もしくは別の陰イオン透過性ＬＧＩＣ中の対応するアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）への置換（ＧＬＲＡ１のＡ２９３Ｅ置換により、ＬＧＩＣを陰イオン透過性からカルシウム透過性に変換する）、またはＧＬＲＡ１のアミノ酸残基２７８もしくは別の陰イオン透過性ＬＧＩＣ中の対応するアミノ酸の欠失、ＧＬＲＡ１のアミノ酸残基２７９もしくは別の陰イオン透過性ＬＧＩＣ中の対応するアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）への置換、およびＧＬＲＡ１のアミノ酸残基２９３もしくは別の陰イオン透過性ＬＧＩＣ中の対応するアミノ酸のバリン（Ｖ）への置換（ＧＬＲＡ１のＰ２７８Δ、Ａ２７９Ｅ、Ｔ２９３Ｖにより、ＬＧＩＣを陰イオン透過性から陽イオン透過性に変換する）が挙げられる。

【0148】

本明細書に記載されるものを超える追加の操作された受容体は、インビトロスクリーニングおよび検証方法によって容易に特定することができる。いくつかの実施形態では、親受容体変異体のライブラリは、限定された数の親受容体から生成される。親受容体は、エラープローンＰＣＲを含む当技術分野で公知の方法を使用して変異させることができる。いくつかの実施形態では、親受容体変異体のライブラリは、次いで酵母または哺乳類細胞にトランスフェクトされ、ハイスループットでスクリーニングされて、機能的受容体を特定する（例えば、結合剤またはリガンドに応答してシグナル伝達することができる親受容体変異体を特定する）。いくつかの実施形態では、この一次スクリーニングで識別された機能的親受容体変異体は、次いで哺乳類細胞中で発現され、例えば、本明細書に記載のプレートリーダーおよび／または電気生理学アッセイによって、結合剤またはリガンドに対する応答性についてスクリーニングされる。次いで、アゴニスト結合剤に対する増加した結合親和性を示すか、または二次スクリーニングにおけるアゴニストとしての拮抗薬または調節因子結合剤の使用を可能にするいずれかの親受容体変異体を選択し、さらにインビトロおよび／またはインビボでの検証および特徴解析アッセイを実施することができる。かかるスクリーニングアッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００７）ＰＮＡＳ，１０４，５１６３－５１６８；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｒｏｔｈ，Ｂ．Ｌ．（２００９）Ｆｒｏｎｔ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２，１６；Ｄｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．５，５６１－５７３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｎ ６３，２７－３９；Ｇｕｅｔｔｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＮＡＳ １０６，１９１９７－１９２０２；Ｅｌｌｅｆｓｏｎ Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１）：９７－１０１；Ｍａｒａｎｈａｏ ＡＣ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ．（２０１７）ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０；６（１）：１０８－１１９；Ｔａｌｗａｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ；８（３）：ｅ５８４７９；Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０；２：１７；Ｌｙｎａｇｈ ａｎｄ Ｌｙｎｃｈ，（２０１０），Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１４：２８５（２０），１４８９０－１４８９７；Ｉｓｌａｍ Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１；７（１２）：１６４７－１６５７；ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｅｕｒｏｎ．８：５８（３）：３６２－３７３を参照されたい。

【0149】

Ｄ．結合剤
用語「結合剤」または「薬剤」は、本明細書において互換的に使用され、哺乳類細胞上の公知の作用機序を有する外因性薬物または化合物を指す（例えば、受容体のアゴニスト、拮抗薬、または調節因子として作用することが知られている）。結合剤は、タンパク質、脂質、核酸、および／または小分子を含み得る。いくつかの実施形態では、結合剤は、特定の疾患（例えば、神経学的疾患）の治療における臨床使用のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている薬物または化合物を含む。いくつかの実施形態では、結合剤には、ＦＤＡによって臨床使用のために承認されていないが、一つまたは複数の臨床試験で試験された、一つまたは複数の臨床試験で現在試験されている、および／または一つまたは複数の臨床試験で試験されると予想される薬物または化合物が含まれる。いくつかの実施形態では、結合剤は、臨床使用のためにＦＤＡによって承認されていないが、実験室研究で日常的に使用される薬物または化合物を含む。いくつかの実施形態では、結合剤は、前述の薬剤の一つの類似体である。特定の実施形態では、結合剤は、表２～９の薬剤のいずれか一つから選択される。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＡＺＤ０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＡＱＷ－０５１、カンナビジオール、シランセトロン、ＰＨ－３９９７３３、ファシニクリン／ＲＧ３４８７／ＭＥＭ－３４５４、ＴＣ－６９８７、ＡＰＮ－１１２５、およびＴＣ－５６１９／ＡＴ－１０１からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＡＢＴ－１２６、ＡＺＤ－０３２８、ＡＰＮ－１１２５、ＲＧ３４８７、ＴＣ－６９８７、およびＴＣ－５６１９からなる群から選択される。

【0150】

特定の実施形態では、結合剤は、例えば、そのＲまたはＳエナンチオマーのいずれかにおいて化合物式２～７のうちの一つによって記載されるようなシランセトロンの類似体である。

【化22】

【0151】

いくつかの実施形態では、結合剤は、アゴニストとして作用する。本明細書で使用される場合、用語「アゴニスト」は、シグナル伝達応答を誘発するリガンドまたは結合剤を指す。いくつかの実施形態では、結合剤は、拮抗薬として作用する。拮抗薬という用語は本明細書では、シグナル伝達応答を阻害する薬剤を指すために使用される。

【0152】

いくつかの実施形態では、結合剤は、抗不安剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、抗精神病剤、制吐剤、向知性剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、または抗寄生虫剤である。

【表2】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表4-1】

【表4-2】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0153】

Ｅ．ポリヌクレオチド
様々な例示的な実施形態では、本開示は、部分的には、ポリヌクレオチド、ＬＧＩＣを含む操作された受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのサブユニットおよび変異タンパク質、ならびに融合ポリペプチド、ウイルスベクターポリヌクレオチド、ならびにそれらを含む組成物を企図する。

【0154】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、公知または未知の任意の機能を実施することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、結合分析から定義される座位（一つの座位）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、一つまたは複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾されてもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドには、限定されるものではないが、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態の、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチドの長さ、ならびにすべての中間長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この文脈における「中間長さ」は、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３など、引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、典型的には、バリアントは、別段の記載がない限り、参照配列の少なくとも一つの生物学的活性を維持する。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、エキソンなどを含むポリヌクレオチド配列を指し得る。特定の実施形態では、用語「遺伝子」は、ポリヌクレオチド配列がポリペプチドをコードするゲノム配列と同一であるか否かにかかわらず、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指す。

【0156】

本明細書で使用される場合、「シス作用配列」、「シス作用調節配列」、または「シス作用ヌクレオチド配列」、または等価物は、遺伝子の発現、例えば、転写および／または翻訳に関連するポリヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、シス作用配列は、転写を抑制または減少させるポリペプチドのための結合部位、または転写抑制に寄与する転写因子結合部位と関連するポリヌクレオチド配列であるため、転写を調節する。ポリヌクレオチド配列の発現を調節し、主題の操作された受容体の発現を調節するために本開示のポリヌクレオチドに動作可能に連結され得るシス作用配列の例は、当技術分野で周知であり、プロモーター配列（例えば、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＳＹＮ、ＣａｍＫＩＩ、ＴＲＰＶ１）、コザック配列、エンハンサー、転写後調節要素、ｍｉＲＮＡ結合要素、およびポリアデニル化配列などの要素を含む。

【0157】

一つの非限定的な例として、プロモーター配列は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で結合され、バックグラウンドを上回って検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’方向）に延びる。プロモーター配列内に、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出される。真核生物プロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。様々なプロモーターを使用して、本発明の様々なベクターを駆動してもよい。例えば、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター、すなわち、外部適用剤の非存在下で活性なプロモーター、例えば、ＣＭＶ ＩＥ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、アクチンプロモーターであってもよい。プロモーターは、誘導性プロモーター、すなわち、細胞への薬剤の適用時にその活性が制御されるプロモーター、例えば、ドキシサイクリン、テトオンまたはテトオフプロモーター、エストロゲン受容体プロモーターなどであってもよい。プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、特定のタイプの細胞上で活性であるプロモーターであってもよい。

【0158】

いくつかの実施形態では、プロモーターは興奮性細胞において活性である。「興奮性細胞」とは、膜電位の変化によって活性化される細胞、例えば、ニューロンまたは筋細胞、例えば、背根神経節、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンを意味する。本発明のポリヌクレオチド組成物で使用が見出される興奮性細胞で活性なプロモーターとしては、ニューロンプロモーター、例えばシナプシン（ＳＹＮ）、ＴＲＰＶ１、Ｎａ_ｖ１．７、Ｎａ_ｖ１．８、Ｎａ_ｖ１．９、ＣａｍＫＩＩ、ＮＳＥ、およびアドビリンプロモーター；筋細胞プロモーター、例えばデスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、および心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）プロモーター；ならびにユビキタス作用プロモーター、例えばＣＡＧ、ＣＢＡ、Ｅ１Ｆａ、Ｕｂｃ、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーターが挙げられる。

【0159】

本明細書で使用される場合、「誘導性発現のための調節要素」は、発現されるポリヌクレオチドに動作可能に結合され、かつ、それに動作可能に結合されたポリヌクレオチドの発現を増加（オン）または減少（オフ）するように、要素を結合する分子の存在または不在に応答する、プロモーター、エンハンサー、またはそれらの機能的断片であるポリヌクレオチド配列を指す。誘導性発現のための例示的な調節要素としては、以下に限定されないが、テトラサイクリン応答性プロモーター、エクジソン応答性プロモーター、クメート応答性プロモーター、グルココルチコイド応答性プロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、ＲＵ－４８６応答性プロモーター、ＰＰＡＲ－γプロモーター、およびペルオキシド誘導性プロモーターが挙げられる。

【0160】

「一過性発現のための調節因子」は、ポリヌクレオチドヌクレオチド配列を短期または一時的に発現するために使用することができるポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、一過性発現のための一つまたは複数の調節要素を使用して、ポリヌクレオチドの持続時間を制限することができる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド発現の好ましい持続時間は、分、時間、または日数の順序である。一過性発現のための例示的調節要素には、以下に限定されないが、ヌクレアーゼ標的部位、リコンビナーゼ認識部位、および抑制性ＲＮＡ標的部位が含まれる。さらに、ある程度、特定の実施形態では、誘導性発現のための調節因子はまた、ポリヌクレオチド発現の持続時間の制御に寄与し得る。

【0161】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または以下に定義される厳しい条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも一つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」は、一つまたは複数のヌクレオチドが、付加もしくは欠失されたか、または修飾されたか、または異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドを含む。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む特定の変化が、参照ポリヌクレオチドに対して行われてもよく、それによって、改変ポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当技術分野で周知である。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の参照配列に対して、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し、典型的には、バリアントは、別段の記載がない限り、参照配列の少なくとも一つの生物学的活性を維持する。

【0162】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、厳しい条件下で標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳しい条件」下でハイブリダイズするには、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。概して、厳しい条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。標的配列は概して過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。

【0163】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」、または例えば、「５０％同一の配列」を含む記述は、比較ウィンドウにわたってヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに配列が同一である範囲を指す。したがって、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウにわたって二つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）、または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列に存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果を１００倍して、配列同一性の割合を得ることにより、計算されてもよい。二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を記述するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む、長さが少なくとも１２個、多くの場合１５～１８個、多くの場合少なくとも２５個のモノマー単位である。二つのポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）二つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列のいくつかのみ）、および（２）二つのポリヌクレオチド間で分散する配列を含む場合があるため、二つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、二つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」上で比較して、配列類似性の局所領域を識別および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、二つの配列が最適に整列された後、配列が同じ数の連続した位置の基準配列と比較される、少なくとも６つの連続した位置、通常は約５０～約１００、より通常には約１００～約１５０の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、二つの配列の最適な整列のために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成される最適なアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い割合の相同性をもたらす）によって実施され得る。参照は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に開示されているようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに対してもなされ得る。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ １９．３に見出すことができる。

【0164】

本明細書で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態で、それに隣接している配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常は断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態では、「単離ポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または自然界には存在せず、人工的に作製された他のポリヌクレオチドを指す。

【0165】

ポリヌクレオチドの方向を記述する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向で注釈付けされ得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５’から３’鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と指定される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、用語「逆方向」は、３’から５’方向に書かれた５’から３’の配列、または５’から３’方向に書かれた３’から５’の配列を指す。

【0166】

用語「隣接する」は、配列に対して上流ポリヌクレオチド配列および／または下流ポイルヌクレオチド配列、すなわち、５’および／または３’の間にあるポリヌクレオチド配列を指す。例えば、二つの他の要素（例えば、ＩＴＲ）に「隣接する」配列は、一方の要素が配列に対して５’に位置し、他方が配列に対して３’に位置することを示すが、それらの間に介在する配列が存在してもよい。

【0167】

用語「相補的」および「相補性」は、塩基対合規則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、一連のヌクレオチド）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、しばしば、左に５’末端、右に３’末端、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’の逆相補体として記述される。その逆補体と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分的」であり得る。または、核酸の間には、「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」または「完全な（ｔｏｔａｌ）」相補性があり得る。

【0168】

本明細書で使用される場合、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ポリヌクレオチドから一つまたは複数のＲＮＡを発現するのに十分であるベクターなどのより大きなポリヌクレオチド内のポリヌクレオチド配列を指す。発現されたＲＮＡはタンパク質に翻訳されてもよく、ガイドＲＮＡまたは阻害ＲＮＡとして機能して、切断および／または分解のために他のポリヌクレオチド配列を標的としてもよい。一実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の対象のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の対象のポリヌクレオチドに動作可能に結合された一つまたは複数の発現制御配列を含有する。ポリヌクレオチドには、対象のポリヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用される場合、用語「対象のポリヌクレオチド」は、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本明細書に企図される阻害性ポリヌクレオチド、例えばＬＧＩＣ、ならびにそのサブユニットおよび変異タンパク質の転写のテンプレートとして機能するポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、対象のポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ活性および／またはクロマチンリモデリングまたはエピジェネティック修飾活性などの一つまたは複数の酵素活性を有するポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする。

【0169】

ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の核酸カセットを含み得る。本開示の好ましい実施形態では、核酸カセットは、操作された受容体、例えば、ＬＧＩＣ、またはそのサブユニットもしくは変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合された一つまたは複数の発現制御配列（例えば、神経細胞で動作可能なプロモーターまたはエンハンサー）を含む。カセットは、単一のユニットとして、他のポリヌクレオチド配列、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターから除去または挿入されてもよい。

【0170】

一実施形態では、本明細書に企図されるポリヌクレオチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個以上の核酸カセットを含み、それらの任意の数または組み合わせは、同一または反対の方向であってもよい。

【0171】

さらに、遺伝子コードの縮退の結果として、本明細書に企図されるポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することを、当業者であれば理解するであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の違いにより変化するポリヌクレオチドは、本開示によって特に意図され、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドである。一実施形態では、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの一つまたは複数の変異の結果として改変される内因性ポリヌクレオチド配列である。

【0172】

Ｆ．ベクター
本開示のいくつかの態様では、核酸分子、すなわち、操作された受容体をコードするポリヌクレオチドが対象に送達される。いくつかの事例では、操作された受容体をコードする核酸分子は、ベクターによって対象に送達される。様々な実施形態では、ベクターは、本明細書で企図される一つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む。用語「ベクター」は、本明細書において、別の核酸分子を移送または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。移送されたポリヌクレオチドは、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内の自律的複製を指示する配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。ベクターは、標的ポリヌクレオチドを生物、細胞、または細胞成分に送達することができる。いくつかの事例では、ベクターは発現ベクターである。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、発現を促進することができるベクター、例えばプラスミド、ならびにその中に組み込まれたポリヌクレオチドの複製を指す。典型的には、発現される核酸配列は、シス作用調節配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサー配列に動作可能に連結され、プロモーターおよび／またはエンハンサーによる転写調節制御に依存する。特定の事例では、ベクターを使用して、本開示の操作された受容体をコードする核酸分子を対象に送達する。

【0173】

特定の実施形態では、操作された受容体をコードする発現カセットまたはポリヌクレオチドを神経細胞に導入するのに好適な任意のベクターを用いることができる。好適なベクターの実例には、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが含まれる。いくつかの事例では、ベクターは、例えば、プラスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、コスミド、ホスミドなどのための環状核酸である。いくつかの事例では、環状核酸分子を利用して、操作された受容体をコードする核酸分子を対象に送達することができる。例えば、操作された受容体をコードするプラスミドＤＮＡ分子を対象の細胞内に導入することができ、それにより、操作された受容体をコードするＤＮＡ配列がｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡの「メッセージ」がタンパク質産物に翻訳される。環状核酸ベクターは、概して、標的タンパク質の発現を調節する調節要素を含む。例えば、環状核酸ベクターは、任意の数のプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、スプライスシグナル、複製起点、開始シグナルなどを含んでもよい。

【0174】

いくつかの事例では、ベクターは、レプリコンを含み得る。レプリコンは、自己複製が可能な任意の核酸分子であってもよい。いくつかの事例では、レプリコンは、ウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである。限定されないが、アルファウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、ペスチウイルス、ルビウイルス、カルシウイルス、およびヘパシウイルスを含む、様々な適切なウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス）が利用可能である。

【0175】

いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターである。「非ウイルスベクター」とは、ウイルスキャプシドまたはエンベロープを含まない任意の送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子（陰イオン性（負電荷）、中性、または陽イオン性（正電荷））、重金属ナノ粒子、ポリマー系粒子、プラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ミニベクターＤＮＡ、ｃｃＤＮＡ、合成ＲＮＡ、エキソソームなどを意味する。非ウイルスベクターは、例えば、ナノ粒子送達、粒子衝撃、電気穿孔、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む、当技術分野でよく理解される任意の適切な方法によって送達され得る。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１６ Ｊａｎ；Ｖｏｌ ３，ｉｓｓｕｅ １；ａｎｄ Ｈａｒｄｙ，ＣＥ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１７ Ｆｅｂ；８（２）：６５を参照のこと。

【0176】

他の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。「ウイルスベクター」とは、対象のＲＮＡまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを囲むウイルスキャプシドまたはエンベロープを含む送達ビヒクルを意味する。いくつかの事例では、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスに由来する。本開示の核酸分子を対象に送達するのに好適なウイルスベクターの非限定的な例としては、アデノウイルス、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および単純ヘルペス－１（ＨＳＶ－１）に由来するものが挙げられる。好適なウイルスベクターの実例には、限定されないが、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、ヘルペスウイルスベースのベクター、およびパルボウイルスベースのベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ－アデノウイルスキメラベクター、およびアデノウイルスベースのベクター）が含まれる。

【0177】

本明細書で使用される場合、用語「パルボウイルス」は、自律的に複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、全てのパルボウイルスを包含する。自律型パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーが含まれる。例示的な自律型パルボウイルスとしては、以下に限定されないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスが挙げられる。他の自律型パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ６９（３ｄ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。

【0178】

ディペンドウイルス属は、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプｒｈ１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含むが、これらに限定されない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含有している。

【0179】

好ましい実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。特定の事例では、ウイルスベクターはＡＡＶ－６またはＡＡＶ－９ベクターである。

【0180】

すべての公知のＡＡＶ血清型のゲノム構造は類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さ約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質および構造（ＶＰ）タンパク質に対して固有のコードヌクレオチド配列に隣接している。ＶＰタンパク質（ＶＰｌ、－２および－３）はキャプシドを形成し、ウイルスの向性に寄与する。末端１４５ｎｔのＩＴＲは、自己相補的であり、Ｔ字型ヘアピンを形成する、エネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように構成される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして機能する。哺乳類細胞における野生型（ｗｔ）ＡＡＶ感染に続いて、Ｒｅｐ遺伝子が発現され、ウイルスゲノムの複製において機能する。

【0181】

いくつかの事例では、ウイルスベクターの外側タンパク質「キャプシド」は、自然界で発生し、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０である。特定の事例では、キャプシドは、（例えば、定向進化または合理的設計によって）合成的に操作され、指向性の変化、形質導入効率の増加、または免疫回避など、自然界には存在しない特定の固有の特徴を有する。合理的に設計されたキャプシドの例は、ＶＰ３ウイルスキャプシドタンパク質上の一つまたは複数の表面に露出したチロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびリジン（Ｋ）残基の変異である。そのＶＰ３キャプシドタンパク質が合成的に操作され、本明細書に提供される組成物および方法での使用に適しているウイルスベクターの非限定的な例には、ＡＡＶ１（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ３（Ｙ７０５＋７３１Ｆ）、ＡＡＶ５（Ｙ４３６＋６９３＋７１９Ｆ）、ＡＡＶ６（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９（Ｙ７３１Ｆ）、およびＡＡＶ１０（Ｙ７３３Ｆ）が挙げられる。定向進化を通して操作され、本明細書に提供される組成物および方法での使用に適しているウイルスベクターの非限定的な例には、ＡＡＶ－７ｍ８およびＡＡＶ－ＳｈＨ１０が含まれる。

【0182】

本明細書の「組換えパルボウイルスまたはＡＡＶベクター」（または「ｒＡＡＶベクター」）は、一つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、本明細書に企図される一つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターを指す。かかるポリヌクレオチドは、そのような組み合わせが、通常、自然界では発生しないため、ＩＴＲに対して「異種」であると言われる。かかるｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現する昆虫宿主細胞中に存在するとき、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きな核酸構築物（例えば、染色体内、またはクローニングまたはトランスフェクションに使用されるプラスミドもしくはバキュロウイルスなどの別のベクター内）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、典型的には、「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶパッケージング機能および必要なヘルパー機能の存在下で、複製およびキャプシド形成によって「救済」することができる。

【0183】

特定の実施形態では、任意のＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６からのＩＴＲを含む、ＡＡＶベクターで使用され得る。好ましい一実施形態では、本明細書で企図されるＡＡＶベクターは、一つまたは複数のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。

【0184】

二つのＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、約４．４ｋＢのペイロード容量を有する。自己相補的ｒＡＡＶベクターは、第三のＩＴＲを含有し、ベクターの組換え部分の二本鎖をパッケージ化し、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに対して約２．１ｋＢのみを残す。一実施形態では、ＡＡＶベクターはｓｃＡＡＶベクターである。

【0185】

ｒＡＡＶのパッケージング容量（約９ｋＢ）の約２倍である拡張パッケージング容量は、二重ｒＡＡＶベクター戦略を使用して達成された。本明細書で企図されるｒＡＡＶの生成に有用な二重ベクター戦略には、スプライシング（トランススプライシング）、相同組換え（オーバーラップ）、または二つの組み合わせ（ハイブリッド）が含まれるが、これらに限定されない。二重ＡＡＶトランススプライシング戦略では、スプライスドナー（ＳＤ）シグナルが、５’ハーフベクターの３’末端に配置され、スプライスアクセプター（ＳＡ）シグナルが、３’ハーフベクターの５’末端に配置される。二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染、および二つのハーフの逆方向末端反復（ＩＴＲ）媒介頭尾コンカテマー化の際、トランススプライシングは成熟ｍＲＮＡおよびフルサイズのタンパク質の産生をもたらす（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。トランススプライシングは、筋肉および網膜における大きな遺伝子を発現するために首尾よく使用されている（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。あるいは、二重ＡＡＶベクター内に含有される大型導入遺伝子発現カセットの二つのハーフは、相同組換えによる単一の大型ゲノムの再構成を媒介する、相同重複配列（５’ハーフベクターの３’末端および３’ハーフベクターの５’末端での二重ＡＡＶ重複）を含有してもよい（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。この戦略は、導入遺伝子重複配列の組換え特性に依存する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）。第三の二重ＡＡＶ戦略（ハイブリッド）は、外因性遺伝子（すなわち、アルカリホスファターゼ；Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．、２００８、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．、２０１１）からトランススプライシングベクターに高度な組換え誘導性領域を付加することに基づく。付加された領域は、二重ＡＡＶ間の組換えを増加させるために、５’ハーフベクターのＳＤシグナルの下流、および３’ハーフベクターのＳＡシグナルの上流に配置される。

【0186】

「ハイブリッドＡＡＶ」または「ハイブリッドｒＡＡＶ」は、異なるＡＡＶ血清型（および好ましくは、一つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲとは異なる血清型）のキャプシドと共にパッケージされたｒＡＡＶゲノムを指し、そうでなければシュードタイプｒＡＡＶと呼んでもよい。例えば、ＡＡＶキャプシドおよびゲノム（および好ましくは一つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲ）が異なる血清型であることを条件として、ｒＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６型のゲノムは、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６型のキャプシドまたはそのバリアント内にキャプシド形成され得る。特定の実施形態では、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、「ｘ／ｙ」型と呼んでもよく、「ｘ」はＩＴＲの供給源を示し、「ｙ」はキャプシドの血清型を示し、例えば、２／５ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２由来のＩＴＲおよびＡＡＶ６由来のキャプシドを有する。

【0187】

「宿主細胞」は、本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、インビボ、エクスビボ、またはインビトロでトランスフェクト、感染、または形質導入された細胞を含む。宿主細胞には、ウイルス産生細胞およびウイルスベクターに感染した細胞が含まれ得る。特定の実施形態では、インビボでの宿主細胞は、本明細書で企図されるウイルスベクターに感染している。特定の実施形態では、用語「標的細胞」は、宿主細胞と互換的に使用され、所望の細胞型の感染細胞を指す。

【0188】

高力価ＡＡＶ調製物は、例えば、米国特許第５，６５８，７７６号、第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号、および第６，９９５，００６号、Ｕ．Ｓ．２００６／０１８８４８４号、ＷＯ９８／２２６０７号、ＷＯ２００５／０７２３６４号、およびＷＯ／１９９９／０１１７６４号、ならびにＶｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．Ｍａｃｈｉｄａ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３，３８２２ ；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２２２４；ｌｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，７０２４に記載されているような、当技術分野において公知の技法を用いて産生することができる。インビボ投与時にそれらの免疫原性を低下させるために、シュードタイプＡＡＶベクターの作製方法（例えば、ＷＯ００／２８００４）、ならびにＡＡＶベクターの様々な改変または製剤化も報告されている（例えば、ＷＯ０１／２３００１、ＷＯ００／７３３１６、ＷＯ０４／１１２７２７、ＷＯ０５／００５６１０、ＷＯ９９／０６５６２を参照）。

【0189】

医薬組成物
また、ベクターの医薬調製物および結合剤の医薬調製物を含む、医薬調製物も提供される。医薬調製物には、操作された受容体をコードする主題のポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、主題の操作された受容体をコードするポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を担持するベクター、または薬学的に許容可能なビヒクル中に存在する結合剤が含まれる。「薬学的に許容可能なビヒクル」は、ヒトなどの哺乳類での使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に列挙されたビヒクルであり得る。用語「ビヒクル」は、本開示の化合物が哺乳動物への投与のために製剤化される際の希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。こうした薬学的ビヒクルは、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水および油などの液体であり得る。薬学的ビヒクルは、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤および着色剤が使用され得る。哺乳動物に投与されるとき、本開示の化合物および組成物、ならびに薬学的に許容可能なビヒクル、賦形剤、または希釈剤は、滅菌されていてもよい。いくつかの実例では、本開示の化合物が静脈内に投与されるとき、水、生理食塩水溶液、および水性デキストロースおよびグリセロール溶液などの水性媒体が、ビヒクルとして用いられる。

【0190】

医薬組成物は、カプセル、錠剤、ピル、ペレット、トローチ、粉末、顆粒、シロップ、エリキシル、溶液、懸濁液、エマルション、座薬、もしくはその徐放性製剤、または哺乳動物への投与に適した任意の他の形態の形態を取ることができる。いくつかの実例では、医薬組成物は、ヒトへの経口投与または静脈内投与のために適合された医薬組成物として、日常的な手順に従って投与するために製剤化される。好適な薬学的ビヒクルの実施例およびその製剤方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８６，８７，８８，９１，および９２に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0191】

賦形剤の選択は、特定のベクターによって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本開示の医薬組成物の様々な適切な製剤がある。

【0192】

例えば、ベクターは、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、より高度の脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒中に、溶解、懸濁、または乳化させることによって、および所望により、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および防腐剤などの従来的な添加剤を用いて、注射用の調製物に製剤化され得る。

【0193】

別の例として、ベクターは、（ａ）水または生理食塩水などの希釈剤に溶解された有効量の化合物などの液体溶液、（ｂ）各々が固体または顆粒として所定量の活性成分を含有するカプセル、サシェまたは錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）適切なエマルションを含む、経口投与に適した調製物に製剤化され得る。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、および薬理学的に相溶性のある賦形剤のうちの一つまたは複数を含み得る。ロゼンジ形態は、香料、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカント中に活性成分、ならびに活性成分に加えて本明細書に記載されるような賦形剤を含むゼラチンとグリセリン、またはショ糖とアカシア、エマルション、ゲルなどの不活性基剤中に活性成分を含むパスティル、を含むことができる。

【0194】

別の例として、本開示の主題の製剤は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤に配置することができる。これらはまた、ネブライザーまたはアトマイザーで使用するためのような非加圧調製物の医薬品として製剤化されてもよい。

【0195】

いくつかの実施形態では、非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されたレシピエントの血液との等張性を製剤に付与する溶質を含有することができる水性および非水性の等張性滅菌注射溶液と、懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液とを含む。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器に提示することができ、使用直前に注射用の滅菌液体賦形剤、例えば、水の添加のみを必要とする凍結して乾燥した（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時の注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。

【0196】

局所投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切な担体などを含有するクリーム、ゲル、ペースト、またはフォームとして提示され得る。いくつかの実施形態では、局所製剤は、構造化剤、増粘剤またはゲル化剤、ならびに軟化剤または潤滑剤から選択される一つまたは複数の成分を含有する。頻繁に使用される構造化剤は、ステアリルアルコールなどの長鎖アルコール、ならびにそのグリセリルエーテルもしくはエステル、およびオリゴ（エチレンオキシド）エーテルもしくはエステルを含む。増粘剤およびゲル化剤には、例えば、アクリルもしくはメタクリル酸のポリマーおよびそのエステル、ポリアクリルアミド、ならびに寒天、カラギーナン、ゼラチン、およびグアーガムなどの天然由来の増粘剤が含まれる。軟化剤の例としては、トリグリセリドエステル、脂肪酸エステルおよびアミド、ミツロウ、鯨ろう、またはカルナウバワックスなどのワックス、レシチンなどのリン脂質、ならびにそれらのステロールおよび脂肪酸エステルが挙げられる。局所製剤は、他の成分、例えば、収斂剤、芳香剤、色素、皮膚浸透促進剤、日焼け止め剤（すなわち、サンブロック剤）などをさらに含みうる。

【0197】

本開示の化合物は、局所投与のために製剤化されてもよい。局所適用のためのビヒクルは、様々な形態、例えば、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、スティック、スプレー、またはペーストのうちの一つであってもよい。これらは、様々なタイプの担体を含有してもよく、例えば、溶液、エアロゾル、エマルション、ゲル、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。担体は、例えば、油中水または油中水の基材を有するエマルションとして製剤化されてもよい。エマルションに使用される適切な疎水性（油性）成分としては、例えば、植物油、動物脂肪および油、合成炭化水素、ならびにポリエステルを含むそのエステルおよびアルコール、ならびに有機ポリシロキサン油が挙げられる。こうしたエマルションはまた、乳化剤および／または界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤を含み、連続相内に不連続相を分散および懸濁させる。

【0198】

座薬製剤はまた、乳化基剤または水溶性基剤などの様々な基剤と混合することによっても提供される。膣投与に適した製剤は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームとして提示され得る。

【0199】

シロップ、エリキシル、および懸濁液などの経口投与または直腸投与のための単位剤形が提供されてもよく、各投与単位、例えば、小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤または座薬は、一つまたは複数の阻害剤を含有する所定量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、または別の薬学的に許容可能な担体中の溶液としての組成物中に阻害剤を含み得る。

【0200】

本明細書で使用される場合、「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位用量として好適な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体またはビヒクルに関連して所望の効果を生じさせるのに十分な量で計算された、本開示の化合物の所定量を含有する。本開示の新規単位剤形の仕様は、用いられる特定の化合物、および達成されるべき効果、ならびに宿主内の各化合物に関連する薬力学に依存する。

【0201】

用量レベルは、特定の化合物、送達ビヒクルの性質などの関数として変化し得る。所与の化合物に対する所望の用量は、様々な手段によって容易に決定可能である。

【0202】

本開示の文脈で、動物、特にヒトに投与される用量は、例えば、以下でより詳細に記載されるように、合理的な時間枠にわたって動物において予防または治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、使用される特定の化合物の強度、動物の状態、および動物の体重、ならびに疾患の重症度および疾患の段階を含む、様々な要因に依存する。用量のサイズはまた、特定の化合物の投与に付随し得る、任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。

【0203】

薬学的剤形では、ＡＳＣ誘導剤化合物は、遊離塩基、その薬学的に許容可能な塩の形態で投与されてもよく、または単独で、もしくは適切な会合で、ならびに他の薬学的に活性な化合物との組み合わせで使用されてもよい。

【0204】

Ｇ．臨床適用および治療方法
本明細書に開示される組成物および方法を利用して、神経学的疾患または障害を治療することができる。本開示のいくつかの態様では、対象の神経学的疾患または障害を治療する方法が提供され、方法は、操作された受容体を神経細胞に導入することと、操作された受容体を活性化して細胞の活性を制御するリガンドを有効量で提供することと、それによって対象の疼痛を緩和することと、を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示されるベクターまたは組成物は、神経学的疾患または障害を治療するための医薬品の製造に使用される。

【0205】

いくつかの事例では、本開示の方法および組成物が、てんかんを治療するために利用される。本明細書に記載される組成物は、てんかん発作を予防または制御するために使用され得る。てんかん発作は、強直間代発作、強直発作、間代発作、ミオクローヌス発作、欠神発作、または脱力発作として分類され得る。いくつかの事例では、本明細書の組成物および方法は、対象が経験するてんかん発作の数を、約５％、約１０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または１００％予防または低減することができる。

【0206】

いくつかの事例では、本開示の方法および組成物が、摂食障害を治療するために利用される。摂食障害は、対象の肉体的または精神的健康に悪影響を及ぼす異常な摂食行動によって定義される精神障害であり得る。場合によっては、摂食障害は神経性食欲不振症である。他の事例では、摂食障害は神経過食症である。場合によっては、摂食障害は、異食症、反芻障害、回避性／制限性食物摂取障害、過食性障害（ＢＥＤ）、他の特定される食行動障害および摂食障害（ＯＳＦＥＤ）、強制過食症、糖尿病の摂食障害（ｄｉａｂｕｌｉｍｉａ）、オルトレキシア、選択的摂食障害、ドランクオレキシア、妊娠中の食欲不振、またはグルマン症候群である。いくつかの事例では、組成物は、摂食障害に関連する一つまたは複数の分子の産生を増加または減少させるＧタンパク質共役受容体を含む。他の場合では、組成物は、摂食障害に関連する一つまたは複数の分子の産生を変化させるリガンド依存性イオンチャネルを含む。摂食障害に関連する一つまたは複数の分子には、限定されないが、バソプレシン、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、コルチゾール、エピネフリン、またはノルエピネフリンを含む、視床下部－下垂体－副腎（ＨＰＡ）軸の分子、ならびにセロトニン、ドパミン、ニューロペプチドＹ、レプチン、またはグレリンが含まれ得る。

【0207】

いくつかの事例では、組成物および方法は、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、依存症（例えば、アルコール、薬物）、不安症、うつ病、記憶喪失、認知症、睡眠時無呼吸、脳卒中、尿失禁、ナルコレプシー、本態性振戦、運動障害、心房細動、癌（例えば、脳腫瘍）、パーキンソン病、またはアルツハイマー病を治療するために利用される。本明細書の組成物および方法によって治療され得る神経学的疾患または障害のその他の非限定的な例には、無為症、失書症、アルコール中毒、失読症、動脈瘤、一過性黒内障、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アンジェルマン症候群、失語症、失行症、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、アスペルガー症候群、運動失調、毛細血管拡張性運動失調症、注意欠陥多動障害、聴知覚障害、自閉症スペクトラム、双極性障害、顔面麻痺、腕神経叢損傷、脳損傷、脳傷害、脳腫瘍、カナバン病、カプグラ症候群、手根管症候群、灼熱痛、中枢性疼痛症候群、橋中心髄鞘崩壊症、中心核ミオパチー、セファリック障害、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、大脳萎縮症、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、脳性巨人症、脳性小児麻痺、脳血管炎、頸椎脊椎管狭窄症、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、コレア、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性疼痛、コフィン・ローリー症候群、昏睡、複合性局所疼痛症候群、圧迫性神経障害、先天性眼筋麻痺、皮質基底核変性症、頭蓋動脈炎、頭蓋縫合早期癒合症、クロイツフェルトヤコブ病、累積外傷性障害、クッシング症候群、気分循環性障害、巨細胞性封入体病（ＣＩＢＤ）、サイトメガロウイルス感染、ダンディ・ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジェリーヌ－クルンプケ麻痺、デジュリーヌ・ソッタス病、睡眠相後退症候群、認知症、皮膚筋炎、発達性協調運動障害、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、複視、ダウン症候群、ドラベ症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、構音障害、自律神経失調、計算障害、書字障害、ジスキネジア、失読症、ジストニア、トルコ鞍空洞症候群、脳炎、脳ヘルニア、脳三叉神経領域血管腫、遺糞症、夜尿症、てんかん、女性におけるてんかん知的障害、エルブ麻痺、紅痛症、頭内爆発音症候群、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性痙性対麻痺、熱性痙攣、フィッシャー症候群、フリードライヒ運動失調症、線維筋痛症、フォヴィーユ症候群、胎児アルコール症候群、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ関連振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、ゴーシェ病、全般てんかん熱性痙攣プラス、ゲルストマン症候群、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、異所性灰白質、ギランバレー症候群、全般性不安障害、ＨＴＬＶ－１関連ミエロパチー、ハラーホルデン・スパッツ症候群、頭部損傷、頭痛、片側顔面痙攣、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、耳帯状疱疹、帯状疱疹、ヒラヤマ症候群、ヒルシュスプルング病、ホルムズ－アーディー症候群、全前脳症、ハンチントン病、水頭性無脳症、水頭症、副腎皮質ホルモン過剰症、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児レフサム病、点頭てんかん、炎症性ミオパチー、頭蓋内嚢腫、頭蓋内圧亢進症、二動原体染色体（Ｉｓｏｄｉｃｅｎｔｒｉｃ）１５、ジュベール症候群、カラク症候群、ケアーンズ・セイヤー症候群、キンスボーン症候群、クライネ・レヴィン症候群、クリッペル・ファイル症候群、クラッベ病、ラフォラ病、ランバート・イートン筋無力症症候群、ランドウ・クレフナー症候群、延髄外側（ワレンベルク）症候群、学習障害、リー病、レノックス・ガストー症候群、レッシュ・ナイハン症候群、白質ジストロフィー、白質の消失を伴う白質脳症、レビー小体型認知症、脳回欠損、閉じこめ症候群、腰部椎間板症、腰部脊柱管狭窄症、ライム病－神経学的後遺症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、大脳症、大視症、上陸後症候群（Ｍａｌ ｄｅ ｄｅｂａｒｑｕｅｍｅｎｔ）、皮質下嚢腫を伴う大頭型白質脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、髄膜炎、メンケス病、異染性白質ジストロフィー、小頭症、小視症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、小発作（一過性脳虚血発作）、ミソフォニア、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側上肢筋萎縮症、運動能力障害、モヤモヤ病、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、筋痛性脳脊髄炎、重症筋無力症、ミエリン破壊性びまん性硬化症、乳児のミオクローヌス脳障害、ミオクローヌス、ミオパチー、筋細管ミオパチー、先天性筋強直症、ナルコレプシー、神経ベーチェット病、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経症状、狼瘡の神経学的後遺症、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、神経障害、神経症、ニーマン・ピック病、非２４時間性睡眠覚醒障害、非言語的学習障害、オーサリバン・マクラウド症候群、後頭部神経痛、潜在性脊椎神経管閉鎖異常後遺症、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、視神経炎、起立性低血圧、耳硬化症、濫用症候群、反復視、異常知覚、パーキンソン病、先天性パラミオトニア、傍腫瘍性疾患、発作性発作、パリー・ロンバーグ症候群、ＰＡＮＤＡＳ、ペリツェウス・メルツバッヘル病、周期性麻痺、末梢神経障害、広汎性発達障害、光くしゃみ反射、フィタン酸蓄積症、ピック病、縮まった神経、脳下垂体腫瘍、ＰＭＧ、多発神経障害、ポリオ、多小脳回、多発性筋炎、脳孔症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛（ＰＨＮ）、体位性低血圧、プラダー・ウィリー症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮、進行性多巣性白質脳症、進行性核上性麻痺、顔貌失認、偽脳腫瘍、四分盲、四肢麻痺、狂犬病、神経根麻痺、ラムゼイハント症候群Ｉ型、ラムゼイハント症候群ＩＩ型、ラムゼイハント症候群ＩＩＩ型、ラスムッセン脳炎、反射性神経血管性ジストロフィー、レフサム病、ＲＥＭ睡眠行動障害、反復性ストレス損傷、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連ミエロパチー、レット症候群、ライエ症候群、リズム運動障害、ロンベルグ症候群、舞踏病、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、知覚処理障害、中隔視神経異形成症、乳児揺さぶり症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、食後のくしゃみ（Ｓｎａｔｉａｔｉｏｎ）、ソトス症候群、痙縮、脊椎破裂、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、分離脳、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、全身硬直症候群、発作、スタージ・ウェーバー症候群、どもり、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、表在性鉄沈着、シドナム舞踏病、卒倒、共感覚、脊髄空洞症、足根管症候群、遅発性ジスキネジア、遅発性ディスフレニア、ターロフ嚢腫、ティサックス病、側頭動脈炎、側頭葉てんかん、破傷風、繋索脊髄症候群、トムセン病、胸郭出口症候群、三叉神経痛、トッド麻痺、トゥレット症候群、中毒性脳症、一過性脳虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、抜毛症、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、トリパノソーマ症、結節性硬化症、ウンフェルリヒト・ルントボルク病、フォンヒッペル・リンダウ病（ＶＨＬ）、ビリウス脳脊髄炎（ＶＥ）、ワレンベルク症状群、ウェスト症候群、むち打ち、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、またはツェルウェーガー症候群が挙げられる。

【0208】

いくつかの事例では、本明細書に開示される組成物および方法は、脳癌または脳腫瘍を治療するために使用することができる。本明細書に記載されるベクターおよび組成物を用いた治療に適している場合がある脳癌または腫瘍の非限定的な例には、悪性星状細胞腫（グレードＩＩＩのグリオーマ）、星状細胞腫（グレードＩＩのグリオーマ）、脳幹グリオーマ、上衣腫、神経節膠腫、神経節神経腫、神経膠芽腫（グレードＩＶのグリオーマ）、グリオーマ、若年性毛様星状細胞腫（ＪＰＡ）、低グレードの星状細胞腫（ＬＧＡ）、髄芽細胞腫、混合型グリオーマ、乏突起神経膠腫、視神経グリオーマ、毛様細胞性星状細胞腫（グレードＩのグリオーマ）、および原始神経外胚葉性（ＰＮＥＴ）を含む、グリオーマ；聴神経腫瘍（前庭神経鞘腫）、先端巨大症、アデノーマ、軟骨肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、類表皮腫瘍、頸静脈小体腫瘍、テント下髄膜腫、髄膜腫、脳下垂体アデノーマ、脳下垂体腫瘍、ラトケ裂溝嚢胞を含む、頭蓋底腫瘍；脳転移、転移性脳腫瘍を含む、転移性癌；脳嚢腫、脈絡叢乳頭腫、ＣＮＳリンパ腫、コロイド嚢腫、嚢腫性腫瘍、類皮腫瘍、胚細胞腫、リンパ腫、鼻癌腫、鼻咽腔腫瘍、松果腺腫瘍、松果体芽腫、松果体細胞腫、テント上髄膜腫、および血管腫瘍を含む、他の脳腫瘍；星状細胞腫、上衣腫、髄膜腫、およびシュワン細胞腫を含む、脊髄腫瘍が挙げられる。

【0209】

本開示は、部分的に、対象における疼痛を制御、管理、予防、または治療するための組成物および方法を企図する。「疼痛」は、対象の体内の不快感および／または不快な感覚を意味する。疼痛の感覚は、軽度および時折のものから重度および絶えず続くものまであり得る。疼痛は、急性疼痛または慢性疼痛に分類することができる。疼痛は、侵害受容性疼痛（すなわち、組織損傷によって引き起こされる疼痛）、神経障害性疼痛、または心因性疼痛であり得る。場合により、疼痛は疾患（例えば、癌、関節炎、糖尿病）によって引き起こされるか、またはそれに関連する。他の場合では、疼痛は、傷害（例えば、スポーツ傷害、外傷）によって引き起こされる。本明細書の組成物および方法を用いた治療に適している疼痛の非限定的な例には、末梢神経障害、糖尿病性神経症、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、腰痛、癌に関連する神経症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する神経症、幻肢痛、腕管症候群、中枢性脳卒中後痛、慢性アルコール依存症に関連する疼痛、甲状腺機能低下症、尿毒症、多発性硬化症に関連する疼痛、脊髄損傷に関連する疼痛、パーキンソン病に関連する疼痛、てんかん、変形性関節痛、関節リウマチ疼痛、内臓痛、およびビタミン欠乏に関連する疼痛を含む神経障害性疼痛；ならびに中枢神経系外傷、株／捻挫、およびやけどに関連する疼痛を含む侵害受容性疼痛；心筋梗塞、急性膵臓炎、術後疼痛、外傷後疼痛、腎疝痛、癌に関連する疼痛、線維筋痛に関連する疼痛、毛根管症候群に関連する疼痛、および腰痛が挙げられる。

【0210】

本明細書の組成物および方法は、対象における疼痛のレベルを改善するために利用され得る。いくつかの事例では、対象における疼痛のレベルは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％改善される。対象における疼痛のレベルは、様々な方法によって評価することができる。いくつかの事例では、疼痛のレベルは、自己報告によって評価される（すなわち、ヒト対象は、自身が経験している疼痛のレベルについて口頭で報告する）。いくつかの事例では、疼痛のレベルは、疼痛の行動指標、例えば、表情、四肢の動き、発声、落ち着きのなさ、および警戒行動によって評価される。これらのタイプの評価は、例えば、対象が自己報告できない場合（例えば、幼児、意識不明の対象、非ヒト対象）に有用であり得る。疼痛のレベルは、組成物を用いた治療の前に対象が経験していた疼痛のレベルと比較して、本開示の組成物を用いた治療後に評価され得る。

【0211】

様々な実施形態では、対象における疼痛を制御、管理、予防、または治療するための方法は、有効量の本明細書で企図される操作された受容体を対象に投与することを含む。任意の特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、本開示は、本明細書に開示されるベクターを使用して、ニューロンの活性を調節して、対象における疼痛を緩和することを企図する。

【0212】

様々な実施形態では、神経細胞を活性化または脱分極させる操作された受容体をコードするベクターは、疼痛感覚を減少させる一つまたは複数の神経細胞、例えば、抑制性介在ニューロンに投与される（または導入される）。リガンドの存在下では、操作された受容体を発現する神経細胞は活性化され、これらの神経細胞を刺激する鎮痛効果を増強する疼痛に対する感受性を低下させる。

【0213】

様々な実施形態では、神経細胞を不活性化または過分極化させる操作された受容体をコードするベクターは、疼痛感覚または疼痛に対する感受性を増加させる一つまたは複数の神経細胞、例えば、侵害受容器、末梢感覚ニューロン、Ｃ線維、Ａδ線維、Ａδ線維、ＤＲＧニューロン、ＴＧＧニューロンなどに投与される（または導入される）。リガンドの存在下では、操作された受容体を発現する神経細胞は不活性化され、疼痛に対する感受性を低下させ、鎮痛効果を増強する。

【0214】

操作された受容体の発現を侵害受容器のサブ集団に標的化することは、ベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ２（Ｙ４４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ）、ＡＡＶ３（Ｙ７０５＋７３１Ｆ）、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５（Ｙ４３６＋６９３＋７１９Ｆ）、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６（ＶＰ３バリアントＹ７０５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ／Ｔ４９２Ｖ）、ＡＡＶ－７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９（ＶＰ３バリアントＹ７３１Ｆ）、ＡＡＶ１０（Ｙ７３３Ｆ）、およびＡＡＶ－ＳｈＨ１０）の選択、プロモーターの選択、および送達手段のうちの一つまたは複数によって達成され得る。

【0215】

特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、疼痛の低減に有効である。本明細書で企図されるベクター、組成物、および方法を用いた治療に適している疼痛の実例としては、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、異痛症、炎症性疼痛、炎症性痛覚過敏、神経障害、神経痛、糖尿病性神経症、ヒト免疫不全ウイルス関連神経症、神経損傷、関節リウマチ性疼痛、骨関節炎疼痛、やけど、腰痛、眼痛、内臓痛、癌性疼痛（例えば、骨癌性疼痛）、歯痛、頭痛、偏頭痛、手根管症候群、線維筋痛、神経炎、坐骨神経痛、骨盤過敏症、骨盤痛、ヘルペス後神経痛、術後疼痛、脳卒中後疼痛、および月経痛が挙げられるが、これらに限定されない。

【0216】

疼痛は、急性または慢性に分類することができる。「急性疼痛」は、突然始まり、通常、鋭い質の疼痛を指す。急性疼痛は、軽度でほんの一瞬持続するか、または重度で数週間または数か月持続する場合がある。ほとんどの場合、急性疼痛は三か月以上持続せず、疼痛の根本原因が治療または治癒された時点で消失する。しかしながら、緩和されない急性疼痛は、慢性疼痛につながる可能性がある。「慢性疼痛」とは、通常の急性疾患または傷害の経過を超えて持続するか、または三～六か月以上持続し、個人の健康に悪影響を及ぼす、継続的または再発的な疼痛を指す。特定の実施形態では、用語「慢性疼痛」は、続くべきでない時に続く疼痛を指す。慢性疼痛は、侵害受容性疼痛または神経障害性疼痛であり得る。

【0217】

いくつかの実施形態では、疼痛は、傷害、感染、または医学的介入に関連して、またはその結果として生じると予想されるか、または予測される。いくつかの実施形態では、感染は神経損傷を引き起こす。いくつかの実施形態では、医学的介入は、身体の中心核に対する手術などの外科手術である。いくつかの実施形態では、医学的介入は、体内の一つまたは複数の組織、腫瘍、または器官の部分または全体を除去するための外科手術である。いくつかの実施形態では、医学的介入は切断である。特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、急性疼痛の軽減に有効である。特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、慢性疼痛の軽減に有効である。

【0218】

患者の症状の中に不快感および異常感受性の特徴がある場合、臨床的疼痛が存在する。個体は様々な疼痛症状を呈することがある。このような症状には、１）鈍い、灼熱感、または刺すような自発痛、２）有害な刺激に対する誇張された疼痛応答（痛覚過敏）、および３）通常無害な刺激によって生じる疼痛（ａｌｌｏｄｙｎｉａ－Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｉｎ，１３－４４）が含まれる。様々な形態の急性疼痛および慢性疼痛を患らっている患者は類似の症状を有し得るが、根底にある機序は異なる場合があり、したがって異なる治療戦略を必要とする場合がある。したがって、疼痛はまた、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、および神経障害性疼痛を含む、異なる病態生理学に従って、多数の異なるサブタイプに分けることができる。

【0219】

特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、侵害受容性疼痛の軽減に有効である。特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、炎症性疼痛の軽減に有効である。特定の実施形態では、本明細書で企図される組成物および方法は、神経障害性疼痛の軽減に有効である。

【0220】

侵害受容性疼痛は、組織損傷によって、または損傷を引き起こす可能性のある強い刺激によって誘発される。中等度から重度の急性侵害受容性疼痛は、中枢神経系外傷、筋違え／捻挫、やけど、心筋梗塞および急性膵炎、術後疼痛（任意の種類の手術処置後の疼痛）、外傷後疼痛、腎疝痛、癌疼痛および腰痛からの疼痛の顕著な特徴である。癌疼痛は、腫瘍関連疼痛（例えば、骨痛、頭痛、顔面痛、または内臓痛）、または癌療法に関連する疼痛（例えば、化学療法後症候群、慢性術後疼痛症候群、または放射線後症候群）などの慢性疼痛であり得る。癌疼痛は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、または放射線療法に応答しても生じ得る。腰痛は、椎間板のヘルニアもしくは破裂、または腰椎間関節、仙腸骨関節、傍脊柱筋、もしくは後縦靱帯の異常による場合がある。腰痛は自然に解消する場合もあるが、１２週間以上持続する患者では、特に衰弱しやすい慢性的な状態になる。

【0221】

神経障害性疼痛は、神経系の原発性病変または機能障害によって開始または引き起こされる疼痛として定義され得る。神経障害性疼痛の病因としては、例えば、末梢神経障害、糖尿病性神経障害、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、腰痛、癌神経障害、ＨＩＶ神経障害、幻肢痛、手根管症候群、脳卒中後中枢性疼痛、および慢性アルコール中毒に関連する疼痛、甲状腺機能低下症、尿毒症、多発性硬化症、脊髄損傷、パーキンソン病、てんかん、およびビタミン欠乏症が挙げられる。

【0222】

神経障害性疼痛は、疼痛に関連するか、または疼痛によって引き起こされる疾患、障害、または状態を指す用語である、疼痛障害と関連し得る。疼痛障害の実例には、関節炎、異痛症、典型的な三叉神経痛、三叉神経痛、身体表現性障害、知覚鈍麻、知覚過敏、神経痛、神経炎、神経原性疼痛、無痛覚症、無知覚性疼痛症、灼熱痛（ｃａｕｓｌａｇｉａ）、坐骨神経痛障害、変性関節障害、線維筋痛、内臓疾患、慢性疼痛障害、偏頭痛／頭痛、慢性疲労症候群、複合性局所疼痛症候群、神経ジストロフィー、足底筋膜炎または癌に関連する疼痛が挙げられる。

【0223】

炎症過程は、組織損傷または異物の存在に応答して活性化され、腫れおよび疼痛をもたらす、複雑な一連の生化学的および細胞的事象である。関節痛は、一般的な炎症性疼痛である。

【0224】

本明細書で企図されるベクター、組成物、および方法を用いた治療に適しているその他の種類の疼痛には、筋肉痛、線維筋痛、脊椎炎、血清陰性（非リウマチ）関節障害、非関節リウマチ、ジストロフィン異常症、糖原分解、多発性筋炎、および化膿性筋炎を含む筋骨格障害に起因する疼痛；扁桃炎、心筋梗塞、僧帽弁狭窄症、心膜炎、レイノー現象、強皮症（ｓｃｌｅｒｅｄｏｍａ）および骨格筋虚血を含む心臓および血管疼痛；頭痛、例えば、偏頭痛（前兆ありの偏頭痛および前兆なしの偏頭痛を含む）、群発頭痛、緊張型頭痛と混合した頭痛、血管障害に関連する頭痛；ならびに歯痛、耳痛、口腔灼熱症候群、および顎関節筋膜痛を含む口腔顔面疼痛が挙げられるが、これらに限定されない。

【0225】

ヒト対象が経験する疼痛の量を減少させるための本明細書で企図される組成物および方法の有効量は、様々な疼痛スケールを使用して決定することができる。患者の自己報告を使用して、疼痛が軽減するかどうかを評価することができる。例えば、Ｋａｔｚ ａｎｄ Ｍｅｌｚａｃｋ（１９９９）Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．７９：２３１を参照のこと。あるいは、観察的疼痛スケールを使用してもよい。ＬＡＮＳＳ疼痛スケールを使用して、疼痛が軽減されるかどうかを評価することができる。例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ（２００１）Ｐａｉｎ９２：１４７を参照のこと。視覚的アナログ疼痛スケールを使用してもよい。例えば、Ｓｃｈｍａｄｅｒ（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｐａｉｎ １８：３５０を参照のこと。Ｌｉｋｅｒｔ疼痛スケールを使用してもよい。例えば、０は疼痛なし、５は中等度の疼痛、１０は起こり得る最悪の疼痛である。小児のための自己報告疼痛スケールには、例えば、顔面疼痛スケール、Ｗｏｎｇ－Ｂａｋｅｒ 顔面疼痛評価スケール、およびカラーアナログスケールが含まれる。成人のための自己報告疼痛スケールには、例えば、視覚的アナログスケール、口頭数値評価スケール、口頭記述子スケール、および簡易疼痛調査票が含まれる。疼痛測定スケールには、例えば、Ａｌｄｅｒ Ｈｅｙ トリアージ疼痛スコア（Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．８９：６２５）；行動疼痛スケール（Ｐａｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２９：２２５８）；簡易疼痛調査票（Ｃｌｅｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｙａｎ（１９９４）Ａｎｎ．Ａｃａｄ．Ｍｅｄ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ２３：１２９）；非言語的疼痛指標のチェックリスト（Ｆｅｌｄｔ（２０００）Ｐａｉｎ Ｍａｎａｇ．Ｎｕｒｓ．１ ：１３）；救命救急疼痛観察ツール（Ｇｅｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ １５：４２０）；コンフォートスケール（Ａｍｂｕｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐｓｙｃｈｏｌ．１７：９５）；ダラス疼痛アンケート （Ｏｚｇｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｐｉｎｅ ２７：１７８３）；痛覚計疼痛指標（Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９５２）Ｐａｉｎ Ｓｅｎｓａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．）；顔面疼痛スケール改訂版（Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐａｉｎ ９３：１７３）；顔の脚の活動の叫び慰めのスケール（Ｆａｃｅ Ｌｅｇｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｒｙ Ｃｏｎｓｏｌａｂｉｌｉｔｙ Ｓｃａｌｅ）；マクギル疼痛アンケート（Ｍｅｌｚａｃｋ（１９７５）Ｐａｉｎ １ ：２７７）；記述子差分スケール（Ｇｒａｃｅｌｙ ａｎｄ Ｋｗｉｌｏｓｚ（１９８８）Ｐａｉｎ ３５：２７９）；数字１１ポイントボックス（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｌｉｎ．Ｊ．Ｐａｉｎ ５：１５３）；数字評価スケール（Ｈａｒｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐａｉｎ Ｐｒａｃｔ．３：３１０）；Ｗｏｎｇ－Ｂａｋｅｒ顔面疼痛評価スケール；および視覚アナログスケール（Ｈｕｓｋｉｓｓｏｎ（１９８２）Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．９：７６８）が挙げられる。

【0226】

特定の実施形態では、対象の疼痛を緩和する方法が提供され、方法は、操作された受容体を神経細胞に導入することと、操作された受容体を活性化するリガンドを有効量で提供することによって細胞の活性を制御することと、それによって対象の疼痛を緩和することと、を含む。この方法は、一般的な中枢神経系のうつ病など、オフターゲット効果を伴うことなく、疼痛に対する有意な鎮痛をもたらす。特定の実施形態では、本方法は、治療されていない対象と比較して、対象における神経障害性疼痛の１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、本方法は、結合剤の投与の前後に対象における疼痛を測定する工程を含み、対象における疼痛は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上低減される。このような場合、測定は、結合剤の投与の４時間以上後、例えば、結合剤の投与の８時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、または４日以上後に行われてもよい。

【0227】

特定の実施形態では、本明細書に企図されるベクターは、一つまたは複数の神経細胞に投与または導入される。神経細胞は、同じタイプの神経細胞であってもよく、または異なるタイプの神経細胞の混合集団であってもよい。一実施形態では、神経細胞は、侵害受容器または末梢感覚ニューロンである。感覚ニューロンの実例には、限定されないが、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロンおよび三叉神経節（ＴＧＧ）ニューロンが含まれる。一実施形態では、神経細胞は、ニューロンの疼痛回路に関与する抑制性介在ニューロンである。

【0228】

いくつかの事例では、操作された受容体をコードするベクターは、それを必要とする対象に投与される。投与方法の非限定的な例としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮膚内投与、腹腔内投与、経口投与、注入、頭蓋内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、神経節内投与、脊髄内投与、大槽投与、および神経内投与が挙げられる。いくつかの事例では、投与は、ベクターの液体製剤の注射を含むことができる。他の事例では、投与は、ベクターの固体製剤の経口送達を含むことができる。いくつかの事例では、経口製剤は、食品と共に投与することができる。特定の実施形態では、ベクターは、ベクターを一つまたは複数の神経細胞に導入するために、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、髄腔内に、神経内に、神経節内に、脊髄内に、または脳室内に投与される。様々な実施形態では、ベクターはｒＡＡＶである。

【0229】

一実施形態では、ＡＡＶは、感覚ニューロンまたは侵害受容器、例えば、ＤＲＧニューロン、ＴＧＧニューロンなどに、髄腔内（ＩＴ）または神経節内（ＩＧ）投与によって投与される。ＩＴ経路は、ＡＡＶを脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達する。この投与経路は、例えば、慢性疼痛または他の末梢神経系（ＰＮＳ）または中枢神経系（ＣＮＳ）の適応症の治療に適し得る。動物では、ＩＴ投与は、大槽を通してＩＴカテーテルを挿入し、それを腰椎レベルまで尾側に前進させることによって達成されてきた。ヒトでは、優れた安全性プロファイルを用いる日常的な臨床処置である腰椎穿刺（ＬＰ）によって、ＩＴ送達を容易に行うことができる。

【0230】

特定の事例では、ベクターは、神経節内投与によって対象に投与されてもよい。神経節内投与は、一つまたは複数の神経節への直接の注射を伴い得る。ＩＧ経路は、ＡＡＶを直接ＤＲＧまたはＴＧＧ実質に送達し得る。動物では、ＤＲＧへのＩＧ投与は、それが複雑かつ侵襲的な処置を必要とするため、ヒトでは望ましくない開放的な神経外科処置によって行われる。ヒトでは、ＤＲＧを安全に標的化するための低侵襲のＣＴ撮像誘導技術が使用され得る。対流増加送達（ＣＥＤ）用のカスタマイズされた針アセンブリを使用して、ＡＡＶをＤＲＧ実質内に送達することができる。非限定的な実施例では、本開示のベクターは、慢性疼痛の治療のために、一つまたは複数の背根神経節および／または三叉神経節に送達されてもよい。別の非限定的な例では、本開示のベクターは、てんかんを治療するために、節上神経節（迷走神経）に送達されてもよい。

【0231】

さらに別の特定の事例では、ベクターは、頭蓋内投与（すなわち、脳内に直接）によって対象に投与されてもよい。頭蓋内投与の非限定的な例では、本開示のベクターは、例えば、てんかん発作の焦点を治療するために脳の皮質に、例えば、満腹障害を治療するために視床下部室傍に、または、例えば、満腹障害を治療するために扁桃体中心核に送達されてもよい。別の特定の事例では、ベクターは、神経内注射（すなわち、神経内に直接）によって対象に投与されてもよい。神経は、治療される適応症に基づいて選択されてもよく、例えば、慢性的疼痛を治療するために座骨神経への注射、またはてんかんもしくは満腹障害を治療するために迷走神経への注射が挙げられる。さらに別の特定の事例では、ベクターは、例えば、慢性疼痛を治療するために感覚神経末端に皮下注射によって対象に投与されてもよい。

【0232】

ベクター用量は、対象に送達されるベクターゲノムユニットの数として表され得る。本明細書で使用される場合、「ベクターゲノムユニット」は、用量で投与される個々のベクターゲノムの数を指す。個々のベクターゲノムのサイズは、一般的に使用されるウイルスベクターのタイプに依存する。本開示のベクターゲノムは、約１．０キロ塩基から、１．５キロ塩基、２．０キロ塩基、２．５キロ塩基、３．０キロ塩基、３．５キロ塩基、４．０キロ塩基、４．５キロ塩基、５．０キロ塩基、５．５キロ塩基、６．０キロ塩基、６．５キロ塩基、７．０キロ塩基、７．５キロ塩基、８．０キロ塩基、８．５キロ塩基、９．０キロ塩基、９．５キロ塩基、１０．０キロ塩基、１０．０キロ塩基超であり得る。したがって、単一のベクターゲノムは、最大１０，０００塩基対のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。場合によっては、ベクター用量は、約１ｘ１０^６、２ｘ１０^６、３ｘ１０^６、４ｘ１０^６、５ｘ１０^６、６ｘ１０^６、７ｘ１０^６、８ｘ１０^６、９ｘ１０^６、１ｘ１０^７、２ｘ１０^７、３ｘ１０^７、４ｘ１０^７、５ｘ１０^７、６ｘ１０^７、７ｘ１０^７、８ｘ１０^７、９ｘ１０^７、１ｘ１０^８、２ｘ１０^８、３ｘ１０^８、４ｘ１０^８、５ｘ１０^８、６ｘ１０^８、７ｘ１０^８、８ｘ１０^８、９ｘ１０^８、１ｘ１０^９、２ｘ１０^９、３ｘ１０^９、４ｘ１０^９、５ｘ１０^９、６ｘ１０^９、７ｘ１０^９、８ｘ１０^９、９ｘ１０^９、１ｘ１０^１０、２ｘ１０^１０、３ｘ１０^１０、４ｘ１０^１０、５ｘ１０^１０、６ｘ１０^１０、７ｘ１０^１０、８ｘ１０^１０、９ｘ１０^１０、１ｘ１０^１１、２ｘ１０^１１、３ｘ１０^１１、４ｘ１０^１１、５ｘ１０^１１、６ｘ１０^１１、７ｘ１０^１１、８ｘ１０^１１、９ｘ１０^１１、１ｘ１０^１２、２ｘ１０^１２、３ｘ１０^１２、４ｘ１０^１２、５ｘ１０^１２、６ｘ１０^１２、７ｘ１０^１２、８ｘ１０^１２、９ｘ１０^１２、１ｘ１０^１３、２ｘ１０^１３、３ｘ１０^１３、４ｘ１０^１３、５ｘ１０^１３、６ｘ１０^１３、７ｘ１０^１３、８ｘ１０^１３、９ｘ１０^１３、１ｘ１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、１ｘ１０^１５、２ｘ１０^１５、３ｘ１０^１５、４ｘ１０^１５、５ｘ１０^１５、６ｘ１０^１５、７ｘ１０^１５、８ｘ１０^１５、９ｘ１０^１５、１ｘ１０^１６、２ｘ１０^１６、３ｘ１０^１６、４ｘ１０^１６、５ｘ１０^１６、６ｘ１０^１６、７ｘ１０^１６、８ｘ１０^１６、９ｘ１０^１６、１ｘ１０^１７、２ｘ１０^１７、３ｘ１０^１７、４ｘ１０^１７、５ｘ１０^１７、６ｘ１０^１７、７ｘ１０^１７、８ｘ１０^１７、９ｘ１０^１７、１ｘ１０^１８、２ｘ１０^１８、３ｘ１０^１８、４ｘ１０^１８、５ｘ１０^１８、６ｘ１０^１８、７ｘ１０^１８、８ｘ１０^１８、９ｘ１０^１８、１ｘ１０^１９、２ｘ１０^１９、３ｘ１０^１９、４ｘ１０^１９、５ｘ１０^１９、６ｘ１０^１９、７ｘ１０^１９、８ｘ１０^１９、９ｘ１０^１９、１ｘ１０^２０、２ｘ１０^２０、３ｘ１０^２０、４ｘ１０^２０、５ｘ１０^２０、６ｘ１０^２０、７ｘ１０^２０、８ｘ１０^２０、９ｘ１０^２０またはそれ以上のベクターゲノムユニットであり得る。

【0233】

特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、少なくとも約１ｘ１０^９ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１０ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１０ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１１ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１１ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約６ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約７ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約８ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約９ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約１０ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約１５ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約２０ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約２５ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、少なくとも約５０ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬ、または少なくとも約１００ｘ１０^１２ゲノム粒子／ｍＬの力価で対象に投与される。ウイルス力価に関連して使用される場合、用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」または「ゲノム当量」または「ゲノムコピー」（ｇｃ）は、感染性または機能性にかかわらず、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物中のゲノム粒子の数は、当技術分野でよく理解されている方法、例えばゲノムＤＮＡの定量的ＰＣＲ、または例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２－２７８に記載されているものにより測定することができる。

【0234】

本開示のベクターは、流体容積中で投与されてもよい。場合によっては、ベクターは、約０．１ｍＬ、０．２ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、０．６ｍＬ、０．７ｍＬ、０．８ｍＬ、０．９ｍＬ、１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、３．０ｍＬ、４．０ｍＬ、５．０ｍＬ、６．０ｍＬ、７．０ｍＬ、８．０ｍＬ、９．０ｍＬ、１０．０ｍＬ、１１．０ｍＬ、１２．０ｍＬ、１３．０ｍＬ、１４．０ｍＬ、１５．０ｍＬ、１６．０ｍＬ、１７．０ｍＬ、１８．０ｍＬ、１９．０ｍＬ、２０．０ｍＬ、または２０．０ｍＬ超の容積で投与されてもよい。いくつかの事例では、ベクター用量は、対象に投与されるベクターの濃度または力価として表されてもよい。この場合、ベクター用量は、容積当たりのベクターゲノムユニット数（すなわち、ゲノム単位／容積）として表されてもよい。

【0235】

特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、少なくとも約５ｘ１０^９感染単位／ｍＬ、少なくとも約６ｘ１０^９感染単位／ｍＬ、少なくとも約７ｘ１０^９感染単位／ｍＬ、少なくとも約８ｘ１０^９感染単位／ｍＬ、少なくとも約９ｘ１０^９感染単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１０感染単位／ｍＬ、少なくとも約１．５ｘ１０^１０感染単位／ｍＬ、少なくとも約２ｘ１０^１０感染単位／ｍＬ、少なくとも約２．５ｘ１０^１０感染単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１０感染単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１１感染単位／ｍＬ、少なくとも約２．５ｘ１０^１１感染単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１１感染単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１２感染単位／ｍＬ、少なくとも約２．５ｘ１０^１２感染単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１２感染単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１３感染単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１３感染単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１４感染単位／ｍＬの力価で対象に投与される。ウイルス力価に関して使用される場合、用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３－１９７３に記載されるように、複製センターアッセイとしても知られる、感染性センターアッセイによって測定されるような、感染性および複製能力のある組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0236】

特定の実施形態では、本明細書で企図されるベクターは、少なくとも約５ｘ１０^１０形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１１形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約２．５ｘ１０^１１形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１１形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１２形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約２．５ｘ１０^１２形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１２形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１３形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約５ｘ１０^１３形質導入単位／ｍＬ、少なくとも約１ｘ１０^１４形質導入単位／ｍＬの力価で対象に投与される。ウイルス力価に関連して使用される場合、用語「形質導入単位」（ｔｕ）は、例えば、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３－１２４；またはＦｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（ＬＦＵアッセイ）に記載されているような機能的アッセイにおいて測定されるような、機能的導入遺伝子産物の産生をもたらす、感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0237】

ベクター用量は、概して投与経路によって決定される。特定の実施例では、神経節内注射は、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。別の事例では、髄腔内注射は、約１．０ｍＬ～約１２．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^１０～約１ｘ１０^１５ベクターゲノムを含み得る。さらに別の特定の事例では、頭蓋内注射は、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。別の特定の事例では、神経内注射は、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。別の特定の実施例では、脊髄内注射は、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。さらに別の特定の事例では、大槽注入は、約０．５ｍＬ～約５．０ｍＬの容積中に、約５ｘ１０^９～約５ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。さらに別の特定の事例では、皮下注射は、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬの容積中に、約１ｘ１０^９～約１ｘ１０^１３ベクターゲノムを含み得る。

【0238】

いくつかの事例では、ベクターは、注入によって対象に送達される。注入によって対象に送達されるベクター用量は、ベクター注入速度として測定され得る。ベクター注入速度の非限定的な例には、以下が含まれる：神経節内投与、脊髄内投与、頭蓋内投与、または神経内投与については１～１０μＬ／分、髄腔内投与または大槽内投与については１０～１０００μＬ／分。いくつかの事例では、ベクターは、ＭＲＩ誘導対流増加送達（ＣＥＤ）によって対象に送達される。この技術により、脳の大部分に分布するウイルス拡散および形質導入の増加が可能になり、針経路に沿ったベクターの逆流を減少させる。

【0239】

様々な実施形態では、神経細胞を不活性化または過分極化する操作された受容体をコードするベクターを、疼痛感覚または疼痛に対する感受性を増加させる一つまたは複数の神経細胞に投与することと、操作された受容体を発現する神経細胞に特異的に結合するリガンドを対象に投与することと、それによって細胞を不活性化し、疼痛に対する感受性を低下させ、鎮痛効果を増強することと、を含む方法が提供される。

【0240】

様々な実施形態では、神経細胞を活性化または分極化する操作された受容体をコードするベクターを、疼痛感覚または疼痛に対する感受性を減少させる一つまたは複数の神経細胞に投与することと、操作された受容体を発現する神経細胞に特異的に結合するリガンドを対象に投与することと、それによって細胞を活性化し、疼痛に対する感受性を低下させ、鎮痛効果を増強することと、を含む方法が提供される。

【0241】

リガンドの製剤は、様々な経路によって対象に投与されてもよい。投与方法の非限定的な例としては、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、皮膚内投与、腹腔内投与、経口投与、注入、頭蓋内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、神経節内投与、および神経内投与が挙げられる。いくつかの事例では、投与は、リガンドの液体製剤の注射を含むことができる。他の事例では、投与は、リガンドの固体製剤の経口送達を含むことができる。特定の事例では、リガンドは、経口投与（例えば、ピル、錠剤、カプセルなど）によって投与される。いくつかの事例では、経口組成物は、食品と共に投与することができる。別の特定の事例では、リガンドは、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達のために、髄腔内注射（すなわち脊髄の髄腔内）により投与される。別の特定の事例では、リガンドは局所的に投与される（例えば、皮膚パッチ、クリーム、ローション、軟膏など）。

【0242】

対象に投与されるリガンドの用量は、絶対的な制限の対象ではないが、組成物およびその活性成分の性質、ならびにその望ましくない副作用（例えば、抗体に対する免疫反応）、治療される対象、および治療される状態のタイプおよび投与方法に依存する。概して、用量は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量、例えば、対象が経験する疼痛のレベルを低減または軽減するのに有効な量などの治療有効量である。特定の実施形態では、用量はまた、予防量または有効量であってもよい。治療有効量のリガンドは、投与経路、治療される適応症、および／または使用のために選択されるリガンドに依存し得る。

【0243】

一実施形態では、リガンドは、ベクターの投与前に最初に対象に投与される。治療有効量のリガンドは、ベクターの送達後のある時点で対象に投与されてもよい。概して、ベクターの送達後、対象の一つまたは複数の細胞が、ベクターによってコードされるタンパク質（すなわち、操作された受容体）を生成するのに必要とされる期間がある。この期間中、対象へのリガンドの投与は、対象に有益ではない場合がある。この状況では、対象の一つまたは複数の細胞によって一定量の操作された受容体が産生された後、リガンドを投与するのが適切であり得る。

【0244】

一実施形態では、リガンドが最初に投与されるのは、ベクターが対象に投与されるのとほぼ同時である。

【0245】

一実施形態では、リガンドが最初に投与されるのは、対象にベクターを投与した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、または１２時間後、日後、週間後、か月後、または年後である。いくつかの事例では、治療有効量のリガンドが、対象に投与されるのは、ベクターの送達の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日または３０日超後であってもよい。特定の実施例では、治療有効量のリガンドは、ベクターの送達の少なくとも一週間後に対象に投与される。さらなる実施例では、治療有効量のリガンドは、少なくとも三日間連続で毎日対象に投与される。

【0246】

本開示のリガンドの治療有効量または用量は、対象の体重ｋｇ当たりのリガンドのｍｇまたはμｇとして表され得る。いくつかの事例では、リガンドの治療有効量は、約０．００１μｇ／ｋｇ、約０．００５μｇ／ｋｇ、約０．０１μｇ／ｋｇ、約０．０５μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約４μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約６μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ、約９μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約７０μｇ／ｋｇ、約８０μｇ／ｋｇ、約９０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約１２０μｇ／ｋｇ、約１４０μｇ／ｋｇ、約１６０μｇ／ｋｇ、約１８０μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約２２０μｇ／ｋｇ、約２４０μｇ／ｋｇ、約２６０μｇ／ｋｇ、約２８０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約３２０μｇ／ｋｇ、約３４０μｇ／ｋｇ、約３６０μｇ／ｋｇ、約３８０μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約４２０μｇ／ｋｇ、約４４０μｇ／ｋｇ、約４６０μｇ／ｋｇ、約４８０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約５２０μｇ／ｋｇ、約５４０μｇ／ｋｇ、約５６０μｇ／ｋｇ、約５８０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約６２０μｇ／ｋｇ、約６４０μｇ／ｋｇ、約６６０μｇ／ｋｇ、約６８０μｇ／ｋｇ、約７００μｇ／ｋｇ、約７２０μｇ／ｋｇ、約７４０μｇ／ｋｇ、約７６０μｇ／ｋｇ、約７８０μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約８２０μｇ／ｋｇ、約８４０μｇ／ｋｇ、約８６０μｇ／ｋｇ、約８８０μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、約９２０μｇ／ｋｇ、約９４０μｇ／ｋｇ、約９６０μｇ／ｋｇ、約９８０μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ超とすることができる。

【0247】

特定の実施形態では、対象に投与されるリガンドの用量は、少なくとも約０．００１マイクログラム／キログラム（μｇ／ｋｇ）、少なくとも約０．００５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ、０．００１ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ以上である。

【0248】

特定の実施形態では、対象に投与されるリガンドの用量は、少なくとも約０．００１μｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ／少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、またはそれらの任意の介在範囲である。

【0249】

いくつかの態様では、治療有効量のリガンドは、モル濃度（すなわち、Ｍまたはｍｏｌ／Ｌ）として表され得る。いくつかの事例では、治療有効量のリガンドは、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭまたはそれ以上であり得る。

【0250】

治療有効量のリガンドは、一日一回以上投与することができる。いくつかの事例では、治療有効量のリガンドが、必要に応じて投与される（例えば、疼痛緩和が必要とされる場合）。リガンドは、連続的に投与されてもよい（例えば、治療レジメンの間、中断することなく毎日）。いくつかの事例では、治療レジメンは、一週間未満、一週間、二週間、三週間、一か月、または一か月超であり得る。いくつかの事例では、治療有効量のリガンドは、一日、少なくとも二日連続、少なくとも三日連続、少なくとも四日連続、少なくとも五日連続、少なくとも六日連続、少なくとも七日連続、少なくとも八日連続、少なくとも九日連続、少なくとも十日連続、または少なくとも十日連続を超えて投与される。特定の事例では、治療有効量のリガンドが三日連続で投与される。場合によっては、治療有効量のリガンドを、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、週に７回、週に８回、週に９回、週に１０回、週に１１回、週に１２回、週に１３回、週に１４回、週に１５回、週に１６回、週に１７回、週に１８回、週に１９回、週に２０回、週に２５回、週に３０回、週に３５回、週４０回、または週に４０回超投与することができる。いくつかの事例では、治療有効量のリガンドは、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、または１日１０回超の投与が可能である。場合によっては、治療有効量のリガンドは、少なくとも１時間ごと、少なくとも２時間ごと、少なくとも３時間ごと、少なくとも４時間ごと、少なくとも５時間ごと、少なくとも６時間ごと、少なくとも７時間ごと、少なくとも８時間ごと、少なくとも９時間ごと、少なくとも１０時間ごと、少なくとも１１時間ごと、少なくとも１２時間ごと、少なくとも１３時間ごと、少なくとも１４時間ごと、少なくとも１５時間ごと、少なくとも１６時間ごと、少なくとも１７時間ごと、少なくとも１８時間ごと、少なくとも１９時間ごと、少なくとも２０時間ごと、少なくとも２１時間ごと、少なくとも２２時間ごと、少なくとも２３時間ごと、または少なくとも毎日投与される。リガンドの用量は、対象に連続的に、または１日に１、２、３、４、もしくは５回、週に１、２、３、４、５、６、もしくは７回、月に１、２、３、もしくは４回、２、３、４、５、もしくは６か月に１回、または年１回、またはさらにより長い間隔で投与されてもよい。治療期間は、１日、１、２、もしくは３週間、１、２、３、４、５、７、８、９、１０、もしくは１１か月、１、２、３、４、５年以上、またはより長く継続し得る。

【0251】

本明細書に開示される方法および組成物によって治療される対象は、ヒトであってもよく、または非ヒト動物であってもよい。本明細書で使用される用語「治療する」およびその文法的等価物は、概して、疾患の症状を低減、除去、または予防するための組成物または方法の使用を指し、治療的利益および／または予防的利益を達成することを含む。治療的利益とは、治療される障害または状態の症状の進行を遅らせること、進行を停止すること、進行を逆転させること、または根絶もしくは向上させることを意味する。治療の予防的利益は、状態のリスクの低減、状態の進行の遅延、または状態の発生の可能性の低減を含む。

【0252】

非ヒト動物の非限定的な例としては、非ヒト霊長類、家畜動物、家庭用ペット、および実験動物が挙げられる。例えば、非ヒト動物は、類人類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、ゴリラ、またはオランウータン）、旧世界のサル（例えば、アカゲザル）、新世界のサル、イヌ、ネコ、バイソン、ラクダ、ウシ、シカ、ブタ、ロバ、ウマ、ラバ、ラマ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、トナカイ、ヤク、マウス、ラット、ウサギ、または任意の他の非ヒト動物であり得る。本明細書に記載される組成物および方法は、獣医学的動物の治療に適している。獣医学的動物は、限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヘビ、カメ、およびトカゲを含み得る。いくつかの態様では、組織または細胞集団を組成物と接触させることは、組成物を細胞集団または対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、組成物を細胞培養系に添加することによって、インビトロで行われる。いくつかの態様では、投与は、例えば、特定の経路を介した投与によって、インビボで行われる。二つ以上の組成物が投与される場合、組成物は、同じ経路を介して、同時に（例えば、同じ日に）、または同じ経路を介して、異なる時間に投与され得る。あるいは、組成物は、異なる経路を介して、同時に（例えば、同じ日に）、または異なる経路を介して、異なる時間に投与され得る。

【0253】

組成物がそれを必要とする対象に投与される回数は、医療専門家の裁量、障害、障害の重症度、および製剤に対する対象の応答に依存する。いくつかの態様では、組成物の投与は少なくとも１回行われる。さらなる態様では、投与は、所与の期間中に、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回以上行われる。各投与の用量および／または投与頻度は、患者の状態および生理学的応答に基づいて必要に応じて調節され得る。

【0254】

いくつかの実施形態では、組成物は、対象の状態において所望の生理学的効果または改善を達成するのに十分な回数投与されてもよい。対象の状態が改善しない場合、医師の裁量により、組成物は、慢性的に、すなわち、対象の疾患または状態の症状を改善するか、または他の方法で制御もしくは制限するために、対象の生涯全体を含む、長期にわたって投与され得る。対象の状態が改善する場合、医師の裁量により、組成物は連続的に投与されてもよく、あるいは、投与される薬物の用量は、一定の期間、一時的に減少または一時的に中断されてもよい（すなわち、「休薬」）。休薬期間は、例としてのみであるが、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、および３６５日を含む、２日～１年の間で変動する。休薬中の用量減少は、例としてのみであるが、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％を含む、１０％～１００％であってもよい。

【0255】

組成物が複数回投与される場合、各投与は、同じ実施者によって、および／または同じ地理的位置で行われてもよい。あるいは、各投与は、異なる実施者によって、および／または異なる地理的位置で行われてもよい。

【0256】

ヒトおよび獣医学的治療に関して、投与される特定の薬剤の量は、治療される障害および障害の重症度；使用される特定の薬剤の活性；患者の年齢、体重、健康全般、性別および食事；使用される特定の薬剤の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；使用される特定の薬剤と組み合わせて、または偶然に使用される薬物；処方医師または獣医師の判断；ならびに医学や獣医学の分野で公知の要因を含む、様々な要因に依存し得る。同様に、所与の組成物の有効濃度は、患者または対象の年齢、性別、体重、遺伝子状態、および全体的な健康状態を含む様々な要因に依存し得る。

【0257】

以下の表２～８は、様々な用量のアセチルコリンまたは非天然リガンドのいずれかによる、示された操作された受容体の刺激後のＹＦＰ蛍光の消光率を列挙する。

【表10】

【表11】

【表12】

【表13】

【表14】

【表15】

【表16】

【0258】

以下の表９～１１は、示されるように異なる技術によって計算された、示される操作された受容体のＥＣ５０を列挙する。

【表17】

【表18】

【表19】

以下の表Ａは、本明細書に開示される二重変異体を列挙する。

【表20】

【0259】

本明細書において引用される全ての論文、刊行物、および特許は、個々の論文、刊行物、または特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に込みこまれ、刊行物が引用されることに関連する方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公開、および特許出願についての言及は、有効な先行技術を構成する、または世界のいかなる国でも共通の一般知識の一部を形成することを承認するものではなく、またはいかなる形態の示唆としても解釈されるべきではない。

【0260】

文脈が別段の示唆をしない限り、本明細書に記載される様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることが特に意図される。

【0261】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0262】

当然のことながら、上記の説明ならびに以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定するものではない。本発明の範囲内の他の態様、利点および修正は、本発明が関連する当業者には明らかであろう。

【実施例】

【0263】

実施例１．リガンド結合ドメインにおける変異を含む操作された受容体の発見
ヒトα７－ｎＡＣｈＲの非天然小分子アゴニストへの曝露後に陰イオン電流を伝導するＬＧＩＣを生成するために、ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）由来のリガンド結合ドメイン、およびヒトＧｌｙＲ１α由来の塩化物導電性イオン孔ドメインを含む、キメラリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）受容体を遺伝子操作した。配列番号３３のアミノ酸配列を有する操作された受容体が識別され、これは、野生型のα７－ｎＡＣｈＲとほぼ同様にアセチルコリン、ＡＢＴ－１２６、およびＴＣ－６９８７に対して感受性であり、ＴＣ－６９８７は、野生型と同様に配列番号３３に対する部分アゴニスト活性を示した。配列番号３３は、野生型と比較して、ニコチンに対して約２倍感受性が低く、ＡＺＤ－０３２８およびファシニクリン／ＲＧ３４８７に対してそれぞれ約３倍および１０倍感受性が高かった。

【0264】

アミノ酸置換を、配列番号３３のアミノ酸配列を有する操作された受容体のリガンド結合ドメインに導入した。α７－ｎＡＣｈＲの各リガンドの結合ポケットをモデル化し、結合ポケットを形成するアミノ酸残基をマッピングした。次いで、単一、二重、および三重の変異キメラＬＧＩＣのライブラリが生成され、各変異キメラＬＧＩＣは、配列番号３３のリガンド結合ポケットの一つまたは複数のアミノ酸に置換を含む。親キメラ受容体（配列番号３３）を、標準的な分子生物学技術によってＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発により導入された。

【0265】

得られた全ての操作された受容体を、それらの天然リガンドであるアセチルコリン（Ａｃｈ）、およびＡＺＤ－０３２８（ａｄｉｓｉｎｓｉｇｈｔ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｄｒｕｇｓ／８０００１８５０３）、ＴＣ－６９８７（ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１４８５４）、ＡＢＴ－１２６（ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／Ｎｅｌｏｎｉｃｌｉｎｅ．ｈｔｍｌ）、ＡＰＮ－１１２５（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２７２４９１７）、ＴＣ－５６１９（ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂｒａｄａｎｉｃｌｉｎｅ）、およびＦａｃｉｎｉｃｌｉｎｅ／ＲＧ３４８７（ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｆｉｇｕｒｅ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｏｆ－ＲＧ３４８７＿ｆｉｇ１＿４７４９９９３４）などの非天然リガンドに対するそれらの効力について分析した。

【0266】

実施例２：ハイスループット蛍光ベースのプレートスクリーニングを使用した操作された受容体の特性評価
リガンドに対する新規の応答プロファイルを有するものについてこれらの変異型ＬＧＩＣをスクリーニングするために、陰イオンレポーターアッセイを開発し、ハイスループットフォーマットでチャネルの機能を評価した。このアッセイでは、陰イオンの存在下で蛍光が消光するＹＦＰレポーターを発現する細胞は、目的のチャネルをコードするＤＮＡでトランスフェクトされる。リガンドに曝露すると、活性化されたチャネルは陰イオンを流束させ、プレートリーダー上で検出可能なＹＦＰの用量依存性消光をもたらす。

【0267】

Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（ＬＸ２９３Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＤＭＥＭ中で維持した。プレートリーダーアッセイの場合、ＬＸ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスに感染させて、陰イオンに対する感受性の強化を示す変異型ＹＦＰ（Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌ）レポーターを安定的に発現する細胞を作製した。アッセイの二日前に、ポリ－ｄリジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で被覆された９６ウェル組織培養プレート中で、細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で分割した。翌日、標準的なＦｕｇｅｎｅプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ウェル当たり０．１μｇのＤＮＡを細胞に一過性にトランスフェクトした。アッセイ当日、細胞を１Ｘ細胞外溶液（１Ｘ ＥＣＳ：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．２、ｍＯｓｍｓ３００）中で２回洗浄した。最後の洗浄後、１００μＬの１Ｘ ＥＣＳをウェルに加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。プレートをインキュベートしながら、薬物を１Ｘ ＥＣＳ－ＮａＩ（１４０ｍＭのＮａＣｌを１４０ｍＭのＮａＩで置き換えた以外は１Ｘ ＥＣＳと同じ成分）中で２倍濃度に希釈した。次いで、プレートをＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（分子デバイス）で読み取った。プレートの各ウェル、一度に８ウェルを、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（分子デバイス）を使用して、以下のように２分間読み取る：１）ベースラインＹＦＰ蛍光を１７秒間読み取り、２）１００μＬのリガンドを添加し、３）次いで、残りの時間、１．３秒ごとにＹＦＰ蛍光の変化を測定する。

【0268】

図１は、図に示すように、様々な用量のアセチルコリンまたは非天然リガンドのいずれかによる、刺激後のＹＦＰ蛍光の消光率のヒートマップを提供する。青く塗りつぶされたセルで示すように、正の蛍光シグナルは、操作された受容体が、その濃度で非天然リガンドによって活性化されることを示す。結果は、操作された受容体が、試験された非天然リガンドに対して様々な効力を有することを示す。表１２は、ＹＦＰ蛍光プレートリーダー実験から決定された、アセチルコリン（Ａｃｈ）およびＴＣ－５６１９に対する示された二重変異体のＥＣ５０値を列挙する。

【表21】

【0269】

実施例３：ハイスループット電気生理学を使用した操作された受容体の特性評価
プレートリーダーによって決定されたＥＣ_５０を確認するとともに、最大電流の流れをより良く理解するために、以下に記載するように、操作された受容体を、ハイスループット電気生理学システムにかけた。ＨＥＫ２９３Ｔ試験では、イオンチャネルをコードするｃＤＮＡを、標準的な組換え技術を使用してｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）２９３Ｔ細胞株）を、標準的な細胞培養プロトコルを使用して、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを４０～５０％のコンフルエンスまで補充したＤＭＥＭ中で培養し、Ｆｕｇｅｎｅ ６を使用して１５ｃｍのディッシュ当たり１８μｇの濃度でイオンチャネルプラスミドでトランスフェクトし、さらに２４時間にわたって増殖させた。次いで、細胞を電気生理学的システム（ＩｏｎＦｌｕｘＨＴおよび／またはＭｅｒｃｕｒｙ，Ｆｌｕｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でアッセイし、全細胞構成を確立するためのマイクロフルイディクスに基づくプラットフォームを介して用量反応関係を評価してもよい。アンサンブルプレートに、ＬｙｎａｇｈおよびＬｙｎｃｈから適応されるような、細胞外緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ グルコース、ＮａＯＨでｐＨ７．２、ｍＯｓｍ ３１０）、細胞内緩衝液（１４５ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭ ＥＧＴＡ、ＣｓＯＨでｐＨ ７．２、ｍＯｓｍ ３０５）をプライミングし、試験化合物（新鮮に調製されたストック）を細胞外緩衝液中で希釈した。次いで、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅを用いてプレートから解放し、遠心分離して、細胞外緩衝液中に再懸濁し、アンサンブルプレートに充填した。次いで、細胞をプライミング、トラップ、破壊、および全細胞構成を確立するための標準プロトコルに供し、細胞が記録全体を通して－６０ｍＶで保持された。ベースラインを記録した後、ＩｏｎＦｌｕｘソフトウェアを使用して、進行用量の試験化合物を適用し、用量反応関係を評価した。次いで、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用してオフラインでデータを分析して、データを．ｃｓｖ形式に変換し、トレースを再プロットし、ＱＣ測定値を適用して不安定な記録を拒否した（すなわち、ベースラインのアクセス抵抗および／または標準偏差に基づく閾値処理、ならびにアーチファクト拒否）。次いで、ピーク電流を計算し、ヒル方程式によって記述される４パラメータロジスティック方程式を使用して、集団データを適合させた。薬物を１秒間添加した後、自動パッチクランプシステム（Ｆｌｕｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で電流を測定し、計算されたＥＣ５０値を以下の表１３に集計する。

【表22】

【0270】

これらの結果は、全ての操作された受容体が、野生型ｎＡｃｈＲａ７と比較して、アセチルコリンに対する効力を低下させたことを示す。例えば、いくつかの操作された受容体は、野生型ｎＡｃｈＲａ７のＥＣ５０よりも数桁高いＥＣ５０値を有する。さらに、結果は、野生型受容体と比較して、操作された受容体のいくつかが、特定の非天然リガンドに対する効力を増大させたことを示す。例えば、配列番号３３のＬ１３１Ｄ、Ｓ１７２Ｄのアミノ酸配列を含む操作された受容体は、野生型対照受容体と比較して、ＡＺＤ－０３２８およびＲＧ－３４８７に対して少なくとも１０倍増加した効力を示す。これらの結果は、操作された受容体が、アセチルコリンに対する効力を低下させるために使用され得る一方で、ヒトにおいて安全で忍容性良好であると認識されている合成小分子ｎＡＣｈα７受容体アゴニストに対する効力を保持または増加させ得ることを示す。

【0271】

電気生理学的方法からのこれらの結果は、プレートリーダーからのＥＣ５０値の確認を提供し、さらに、本明細書に開示される操作された受容体のアセチルコリンおよび非天然リガンド応答のデカップリングを確認する。

【0272】

実施例４：手動パッチクランプ電気生理学を使用した操作された受容体の特性評価
ＨＥＫ２９３細胞およびラットＤＲＧニューロンにおける全細胞手動パッチクランプ電気生理学を使用して、Ａｃｈリガンドおよび非天然リガンドに対する本明細書に開示される様々な操作された受容体のＥＣ５０を測定した。基電流シフトは、受容体の有効性を反映するラットＤＲＧニューロンでも測定された。基電流を計算するために、まず、活動電位を生成できる電流の量を決定した。次いでリガンドを添加し、続いて７００ｐＡまで注入された電流を段階的に増加させた。リガンドの添加後に注入された電流を、活動電位を得るために注入された元の電流で割って、基電流を計算した。ＥＣ５０は、リガンドの漸増用量からのピーク電流を測定し、ヒル方程式を使用して計算した。

【0273】

結果を以下の表１４に集計する。これらの結果は、本明細書に開示される操作された受容体が、Ａｃｈに対する効力は極めて低いが、ＲＧ３４８７およびＴＣ５６１９などの非天然リガンドに対する効力および有効性は高いことを確証する。実施例６も参照されたい。

【表23】

【0274】

実施例５：操作された受容体の局在化
本明細書に開示される操作された受容体が細胞表面に局在する効率を、二つの方法を用いて評価した。まず、ＨＡタグ付き操作された受容体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、その表面発現を、蛍光タグ付きＨＡ抗体を使用してモニタリングした。第二に、操作された受容体（ＣＨＮＲＡ７）上のアミノ酸に特異的に結合する蛍光標識されたα－ブンガロトキシンを使用して、操作された受容体に結合した。これら両方の方法、続いてフローサイトメトリーの使用により、操作された受容体の表面局在化の裏付けが可能となった。

【0275】

モノクローナル抗体の抗－ＨＡ－ＰｅＣｙ７（１６Ｂ１２）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。モノクローナル抗体のクローン名は括弧内に記載されている。ビオチンにコンジュゲートされたアルファ－ブンガロトキシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７は、すべてＴｈｅｒｍｏ／Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）から購入した。簡潔に述べると、ＨＥＫ－２９３Ｔをウェル当たり２００，００細胞でプレーティングし、翌日、ＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅの比率１：３でＦｕｇｅｎｅ ６をトランスフェクトした。細胞を、フローサイトメトリーを使用してトランスフェクションの翌日に分析した。フローサイトメトリー分析のために、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して持ち上げ、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＢＳＡ、Ｃａ＋およびＭｇ＋を含まない１Ｘ ＰＢＳ、および１Ｘペニシリンストレプトマイシン）中で抗体（３０分、１：１００）またはα－ブンガロトキシン（１時間 １：１０００）でインキュベートした。次いで細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、次いでＳｏｎｙ ＳＨ８００ ＦＡＣＳソーター（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、後続の分析を行った。提示されるデータは、ＨＡ－タグ蛍光またはα－ブンガロトキシン染色に対して陽性の細胞の割合、および配列番号 ３３のアミノ酸配列を含む親キメラ受容体の蛍光強度の中央値に正規化されている。表１を参照されたい。

【0276】

図５および表１は、配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化した、操作された受容体を発現するＨＡタグ陽性細胞の割合（「平均ＨＡタグ％」）、および配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化した、操作された受容体を発現するα－ブンガロトキシン陽性細胞の割合（「正規化ＡＢ ％」）を示す。

【0277】

図５および表１５はまた、抗ＨＡ抗体（「平均ＨＡ ＭＦＩ」）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた蛍光標識されたα－ブンガロトキシン（「正規化ＡＢ ＭＦＩ」）を使用して評価した、配列番号３３のアミノ酸配列を発現する対照細胞に対して正規化した、操作された受容体を発現する細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を示す。異なる点変異は、フローサイトメトリーによるＨＡおよびアルファ－ブンガロトキシンの両方の検出に影響を与える可能性がある。

【表24】

【0278】

結果は、本明細書に開示される操作された受容体の変異が、細胞表面への局在化に影響を及ぼすことを示す。いくつかの二重変異体の局在は親キメラ（配列番号３３）の局在と同等であるが、その他は親キメラ（配列番号３３）と比較して細胞表面局在を減少させた。例えば、Ｌ１３１Ｔ、Ｓ１７２Ｄ変異を有する操作された受容体は、ＨＡタグによって評価されるように、親キメラと同程度の局在性を示す。さらに、Ｙ１１５Ｄ、Ｌ１３１Ｅ変異を有する操作された受容体は、両方の手法、すなわち、ＨＡタグおよびα－ブンガロトキシンによって評価されるように、親キメラと同程度の局在性を示す。

【0279】

実施例６：ＣＲ－１１操作された受容体の特性評価
ハイスループット電気生理学プラットフォームにより、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体のアセチルコリンに対する効力は、野生型受容体と比較して５００倍超低下し、ＲＧ－３４８７に対するその効力は１０倍超増加することを示した。

【0280】

全細胞手動パッチクランプ電気生理学を使用して、ＨＥＫ２９３細胞および培養ラット背根神経節（ＤＲＧ）感覚ニューロンの両方で、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体が、野生型ｎＡｃｈＲα７受容体と比較して、アセチルコリンに対して本質的に非感受性であるが、ＲＧ－３４８７に対してはるかに感受性が高いことを確認した。図２を参照のこと。

【0281】

ＨＥＫ２９３細胞では、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体のＡＣｈに対するＥＣ_５０は、最大１００ｍＭのＡｃｈ濃度でさえも、ほとんど電流を生成できなかったため、決定できなかった。対照的に、野生型ｎＡｃｈＲα７受容体のＡＣｈに対するＥＣ_５０は、４２．４μＭである（図２Ａ）。ハイスループットデータをさらに確認すると、手動パッチクランプ電気生理学結果は、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体が、野生型ｎＡｃｈα７受容体（ＥＣ_５０＝２．９μＭ）と比較して、ＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）（ＥＣ_５０＝０．３μＭの場合）に対してより感受性が高いことも示している（図２Ｂ）。

【0282】

配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体を発現する培養された成体ラットＤＲＧニューロンでは、ＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）の適用により、用量依存的に塩化物電流が発生したが（図３）、非形質導入細胞ではこのような電流は観察されない。

【0283】

さらに、形質導入されたラットＤＲＧニューロンにおいて、配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体を、ＲＧ－３４８７（ＳＡ－２）で、３μＭの濃度で活性化すると、電流注入によって誘発される活動電位を可逆的に阻害し（図４Ａ）、活性電位の誘発に必要な電流を約３倍増加させた（ｎ＝７）。３．０ｍＭのアセチルコリンは、形質導入されたニューロンにおける誘発された活動電位に影響を及ぼさなかった（ｎ＝４）（図４Ｂ）。これらの結果は、ＤＲＧニューロンにおける配列番号３３のＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む操作された受容体の発現が、誘発された活動電位を阻害することができることを示す。

【0284】

実施例７．ＩＰＳＣ由来ニューロンにおける操作された受容体の特性評価（予測的）
ＩＰＳＣ由来のＡβニューロンを生成するための分化プロトコルが開発されている。以下のマーカーは、Ａβニューロンとして細胞を定義するために使用される。有髄一次求心性ニューロンを描写する神経フィラメント２００（ＮＦ２００）の発現（Ｂａｓｂａｕｍ ｅｔ ａｌ，２００９）、低閾値機械的受容器感覚ニューロン（ＬＴＭＲ）のマーカーであるピエゾ２（Ｒａｎａｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、およびＡβ線維もマークすると報告されているトール様受容体であるＴＬＲ５（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。特性評価にはまた、多くのＣおよびＡβ線維で発現する侵害受容器特異的マーカーＴｒｐＶ１（Ｃａｔｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、非ペプチド作動性の無髄求心性神経を描写する前立腺酸性ホスファターゼ（Ｚｙｌｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、およびＡβ侵害受容ニューロンのマーカーであるＮａＶ１．１の不在に関する評価も含まれる。上記の基準を満たすＩＰＳＣ由来ニューロンは、ｃ－ＲｅｔおよびＭａｆＡ／Ｃ－Ｍａｆの発現に基づいて急速に適応するＬＴＭＲ、またはｃ－Ｒｅｔ発現の非存在下で、ＴｒｋＢおよびＳｈｏｘ２の発現に基づいて徐々に適応するＬＴＭＲのいずれかとしてさらに特徴付けられるであろう（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。

【0285】

（１）Ａβニューロンの上記発現マーカー基準を満たす細胞が、非侵害受容性感覚ニューロンに特徴的な電気生理学的特性を有することを確認する。これらの特性には、リガンドに応答して電流を生成すること、および直流注入が活動電位を誘発することが含まれる。

【0286】

（２）選択的な化学発生受容体（操作された受容体）で形質導入されたニューロン内の塩化物電流の存在を確認する。細胞を、ＩＲＥＳ ＧＦＰを有するＨＡタグ付き化学発生受容体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＧＦＰ蛍光を介して形質導入細胞を特定する。合成アゴニストに応答する塩化物電流は、内外の流体陽イオンとしてＮＭＧＤ＋を用いた電圧クランプモードで検出される。ＮＭＤＧ＋は陽イオンチャネルに対して不浸透性であるため、その含有が、研究された合成アゴニストに応答して任意の内因性ｎＡｃｈＲα７陽イオン電流を除去する。次いで、化学発生受容体－合成アゴニスト対のＥＣ５０を決定する。記録後、受容体の発現および細胞表面局在化を、ＨＡタグに向けられた抗体を使用して、透過化および非透過化細胞における蛍光顕微鏡によって評価する。

【0287】

（３）電流注入誘発活動電位を阻害する能力を評価する。細胞を、ＩＲＥＳ ＧＦＰを有するＨＡタグ付き化学発生受容体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＧＦＰ蛍光を介して形質導入細胞を特定する。電流クランプモードでは、細胞膜が脱分極するまで電流を印加し続けることによって、合成アゴニストの存在下および非存在下での基電流が決定される。結果は、ＧＦＰのみで形質導入される細胞と比較される。

【0288】

（４）入力抵抗への影響を評価する。細胞を、ＩＲＥＳ ＧＦＰを有するＨＡタグ付き化学発生受容体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＧＦＰ蛍光を介して細胞を特定する。電流クランプモードでは、入力抵抗を計算するために、サブ閾値電流が注入され、膜電圧の変化が決定される。結果は、ＧＦＰのみで形質導入される細胞と比較される。

【0289】

（５）合成アゴニストの存在下および非存在下での静止膜電位への影響を評価する。細胞を、ＩＲＥＳ ＧＦＰを有するＨＡタグ付き化学発生受容体をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ＧＦＰ蛍光を介して形質導入細胞を特定する。電圧クランプモードでは、静止膜電位は、合成アゴニストの存在下および非存在下で決定される。結果は、ＧＦＰのみで形質導入される細胞と比較される。

【0290】

ＩＰＳＣ由来のＡβニューロンにおける上記の電気生理学的特性を、ＩＰＳＣ由来のＣ線維ニューロンならびに成体ラットＤＲＧニューロンにおける電気生理学的特性と比較する。さらに、損傷を受けたＡβ線維求心性神経の生化学的変化が、神経障害状態の自発的疼痛に寄与する可能性があるため、インビトロでの損傷後にＩＰＳＣ由来のＡβニューロンの電気生理学的特性が調査される。インビトロで損傷を生じさせるために、培養でプロセスを延長した後、細胞を採取し、再播種する。再播種プロセスは、軸索損傷を模倣して、プロセスを切断する。損傷後の様々な時点で、細胞は、自発的活動電位の生成、静止膜電位の変化、および基電流の変化を含む様々な電気生理学的特性について評価される。化学発生受容体の効果は、損傷状態でも評価される。

【0291】

実施例８．動物モデルにおける疾患を治療するための操作された受容体の有効性の評価
本明細書に開示される操作された受容体は、小分子リガンドの投与後の神経障害性疼痛のラットモデルにおいて、鎮痛を提供する能力について評価される。野生型のα７－ｎＡＣｈＲ、または本明細書に開示される操作されたキメラ受容体のいずれかをコードするポリヌクレオチドに連結されたヒトシナプシン－１（ｈＳＹＮ）プロモーターを含有するＡＡＶ発現カセットは、標準的な分子生物学技術を使用して構築される。

【0292】

これらのＡＡＶ発現カセットは、ＡＡＶバクミドにサブクローニングし、精製し、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトして、組換えバキュロウイルスを産生し、次いで増幅する。Ｓｆ９細胞は、野生型のα７－ｎＡＣｈＲ、または上述の操作されたキメラ受容体カセットのいずれか一つを含む増幅された組換えバキュロウイルス、ならびにＲｅｐおよびＡＡＶ６（Ｙ７０５＋７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）キャップ遺伝子を含有する別の組換えバキュロウイルスで二重感染させ、組換えＡＡＶベクターを産生する。ウイルスベクターを精製し、ｑＰＣＲを使用してウイルス力価を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用してＡＡＶベクターの純度を検証する。

【0293】

行動実験および疼痛モデル：神経障害性疼痛状態を模倣するモデルにおいて機械的過敏症を引き起こすために、神経部分損傷（ＳＮＩ）モデル（機械的異痛症の検証モデル）が使用される（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｉｎ，４，４６５－４７０）。このモデルは、総腓骨神経および腓腹神経の切断、ならびに脛骨分岐の分離によって作製される。機械的離脱閾値は、高いワイヤメッシュグリッド上にラットを置き、後肢の足底表面をフォンフレイフィラメントで刺激することによって評価される。

【0294】

ラットの脊髄へのＡＡＶ注射：背側半側椎弓切除術は、腰髄の二つのセグメント（約１．５～２ｍｍ）を露出させるために、腰膨大のレベルで行われ、その後硬膜を切開して反射させる。ウイルス溶液を、（鉱油で予め充填された）ガラスマイクロピペットに装填する。マイクロピペットは、定位装置に取り付けられた手動マイクロ注入器に接続される。ウイルス溶液は、背角（左側）を標的とする。露出領域内の吻側－尾側軸に沿って、それぞれ２４０ｎｌの６回の注入を等距離線直線的に実施する。各注入後、１分間の休息時間が観察され、次いで筋層が縫合され、皮膚をステープルで閉じ、動物は、加熱パッドで回復させてから自宅のケージに戻した。動物は、最後の行動試験後に、組織学的分析のために灌流される。

【0295】

ラットの背根神経節（ＤＲＧ）へのＡＡＶの神経節内注射：注入は、マイクロインジェクションポンプに取り付けられたシリンジにポリエチレン管（内径／外径０．４／０．８ｍｍ）によって取り付けられた、微細な先端まで引き込まれたホウケイ酸ガラスキャピラリー（内径／外径０．７８／１ｍｍ）を用いて行われる。針は、外側に振られた定位固定フレームの延長アーム上に取り付けられる（針を保持し、操作するためにのみ使用される）。チュービング、シリンジ、および針はすべて水で満たされている。１マイクロリットルの空気を針に取り込み、その後、３μＬのウイルスベクター溶液を取り込む。注射ごとに、この容量で別々に針を充填する。動物は、手術前に麻酔される。背側正中線に沿った切開の後、Ｌ４およびＬ５ ＤＲＧは、椎骨の外側突起の除去によって露出される。ＤＲＧの上に横たわる神経上膜が開かれ、ガラス針が、露出した神経節の表面から４００μｍの深さまで神経節に挿入される。ガラスキャピラリー先端の周りの組織の封着を可能にするために３分間遅滞させた後、１．１μＬのウイルス溶液を０．２μＬ／分の速度で注入した。さらに２分間遅滞させた後、針が除去される。Ｌ４神経節を最初に注射し、続いてＬ５神経節を注射する。脊髄を覆う筋肉を５－０縫合糸で緩く縫合し、創傷を閉鎖する。動物は、３７℃で回復させ、術後鎮痛剤を受ける。

【0296】

ラットにおけるＡＡＶ髄腔内注射：ラットを最初に麻酔し、その後、頭を定位フレームに固定して垂直に配置する。首の付け根に切開を行い、項部稜の溝を露出させる。脳脊髄液が漏出する深さまで、槽膜に切開（１～２ｍｍ）を行う。次いで、４ｃｍの３２Ｇ髄腔内カテーテルを腰髄の方向にゆっくりと挿入し、カテーテルの周りの縫合により皮膚を閉じる。次いで、ラットを回復させる。次いで、ラットを麻酔し、ベクター（６μＬ）を投与する。カテーテルを６μＬのＰＢＳでフラッシュし、次いで除去し、ラットを回復させる。

【0297】

投与の効果：このＳＮＩモデルは、ラットの総腓骨神経と腓腹神経の切断、および脛骨分枝の分離によって作製される。Ｃｈａｐｌａｎ ＆ Ｙａｋｓｈのアップダウン法を使用して、ＡＡＶ．ｈＳＹＮ－α７－ｎＡＣｈＲ／ＧｌｙＲα１を脊髄、ＤＲＧ、または髄腔内空間へ注入する前に機械的閾値を決定する。片側ベクター注射の３週間後、動物を再び試験し、その機械的離脱閾値が変わらないことを確認する。運動協調性も、最高速度３３ｒｐｍの加速ロータロッド（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、ＵＳＡ）を使用して、注入の前後に試験される。ラットがロータロッドに費やした時間を記録し、３００秒でカットオフする。各ラットは、三回の訓練試験を経て、二時間後に試験される。

【0298】

その後、各キメラコホートのラットの半分に、ＡＺＤ－０３２８またはファシニクリンの単回ＩＰ注射を投与し、ＩＰ注射の１、２、５、７、および１３日後に、アップダウン法を用いて機械的閾値を試験した。三日目に、閾値が損傷後のベースラインに戻った時、ＡＺＤ－０３２８を再びＩＰ注射し、再び、損傷のないベースライン閾値への回復が観察される。これらの動物を４８時間追跡する。次いで、動物を組織学のために灌流する。

【0299】

実施例９：慢性疼痛を患う患者の治療
非限定的な例では、慢性神経根性疼痛を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、一つまたは複数の背根神経節に直接送達される（すなわち、腰部、頸部、または胸部ＤＲＧへの神経節内対流増加送達）、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ．ｈＳＹＮの１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトシナプシン－１（ＳＹＮ１）プロモーターの制御下で、本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、必要に応じて（すなわち、疼痛エピソードの間）、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを経口的に自己投与する。

【0300】

実施例１０．慢性疼痛を患う患者の治療
非限定的な例では、慢性頭蓋顔面痛（例えば、三叉神経痛または顎関節機能障害）を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、三叉神経節に直接送達される（すなわち、神経節内対流増加送達）、０．１５０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ．ｈＳＹＮの１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトシナプシン－１（ＳＹＮ１）プロモーターの制御下で、本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、必要に応じて（すなわち、疼痛エピソードの間）、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを経口的に自己投与する。

【0301】

実施例１１．肥満を患う患者の治療
非限定的な例では、肥満を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目にＡＡＶの１０^１３のベクターゲノムで治療される。グレリンは、迷走神経の胃枝（すなわち、神経内）に直接送達される１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結する。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトグレリンプロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、過剰な体重減少のため（すなわち、食欲抑制のため）に、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0302】

実施例１２．肥満を患う患者の治療
非限定的な例では、肥満を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、膵臓を神経支配する背根神経節（すなわち、神経節内）に直接送達される、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ＴＲＰＶ１の１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、侵害受容器における選択的ニューロン発現のためのヒトＴＲＰＶ１プロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、過剰な体重減少のために、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0303】

実施例１３．肥満を患う患者の治療
非限定的な例では、肥満を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、視床下部の室傍核（ＰＶＨ）に直接送達される（すなわち、頭蓋内対流増加送達）、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ＳＩＭ１の１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）ニューロンにおける選択的ニューロン発現、および最終的には食欲抑制経路の刺激のためのヒトシングルマインドファミリーＢＨＬＨ転写因子１（ＳＩＭ１）プロモーターの制御下で操作されたチャネルをコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、過剰な体重減少のため（すなわち、食欲抑制のため）に、０．１５ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0304】

実施例１４．ＰＴＳＤを患う患者の治療
非限定的な例では、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、Ｃ６星状神経節（すなわち、神経節内）に直接送達される、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ｈＳＹＮ１の１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトシナプシン－１（ｈＳＹＮ１）プロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、ＰＴＳＤ症状（すなわち、不安）のために、０．１５ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0305】

実施例１５．うつ病を患う患者の治療
非限定的な例では、治療抵抗性うつ病（ＴＲＤ）を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、迷走神経（すなわち、神経内）に直接送達される、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ｈＳＹＮ１の１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトシナプシン－１（ｈＳＹＮ１）プロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、うつ病症状のために、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0306】

実施例１６．ＧＥＲＤを患う患者の治療
非限定的な例では、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、それぞれ下食道括約筋（ＬＥＳ）迷走神経および腸筋神経叢（すなわち、神経内）または平滑筋（筋内）に直接送達される１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ｈＳＹＮ１、または本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ＣＡＧの１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、選択的ニューロン発現のためのヒトシナプシン－１（ｈＳＹＮ１）プロモーターまたはＬＥＳ筋細胞における発現のためのＣＡＧプロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８または別の非天然リガンドの処方のためにクリニックに戻る。患者は、ＧＥＲＤの症状（すなわち、呑酸）のために、０．１５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－０３２８または別の非天然リガンドを毎日経口的に自己投与する。

【0307】

実施例１７．てんかんを患う患者の治療
非限定的な例では、てんかんに関連する発作を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、運動皮質などの所定の発作焦点（すなわち、頭蓋内）に直接送達される、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ＣａｍＫＩＩαの１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、興奮性ニューロンにおける選択的ニューロン発現のためのヒトカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａｍＫＩＩα）プロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８の処方のためにクリニックに戻る。患者は、てんかん症状（すなわち発作）のために、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８を毎日経口的に自己投与する。

【0308】

実施例１８．運動障害を患う患者の治療
非限定的な例では、運動障害（例えば、パーキンソン病の振戦）を患う患者は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して治療される。患者は、一日目に、視床下核（すなわち、頭蓋内ＳＴＮ）に直接送達される、１．０ｍＬの容積の本明細書に開示される操作された受容体のいずれか一つをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたＡＡＶ－ＣａｍＫＩＩαの１０^１３ベクターゲノムで治療される。この実施例では、ＡＡＶベクターは、興奮性ニューロンにおける選択的ニューロン発現のためのヒトカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩα（ＣａｍＫＩＩα）プロモーターの制御下で、操作された受容体をコードする。注射の二週間後、患者は、ＡＺＤ－０３２８の処方のためにクリニックに戻る。患者は、運動障害の症状（すなわち振戦）のために、０．１ｍｇ／ｋｇのＡＺＤ－０３２８を毎日経口的に自己投与する。

【0309】

さらなる番号付けされた実施形態
本発明のさらなる実施形態は、以下の番号付けされた実施形態に提供される。
実施形態１
操作された受容体であって、
ヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）に由来し、ヒトグリシン受容体α１サブユニットからのＣｙｓ－ループドメインを含むリガンド結合ドメインと、
ヒトグリシン受容体α１サブユニットに由来するイオン孔ドメインと、を含み、
リガンド結合ドメインが、（ｉ）Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換、または（ｉｉ）Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含み、アミノ酸残基は、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸残基に対応し、
操作された受容体が、キメラリガンド依存性イオンチャネル（ＬＧＩＣ）受容体である、操作された受容体。
実施形態１．１
操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列が、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換、またはＬ１３１Ｅのアミノ酸置換をさらに含み、アミノ酸残基が、α７－ｎＡＣｈＲのアミノ酸残基に対応する、実施形態１に記載の操作された受容体。
実施形態２
リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１およびＳ１７２、Ｙ１１５およびＳ１７０、ならびにＹ１１５およびＬ１３１からなる群から選択される一対のアミノ酸残基に二つのアミノ酸置換を含む、実施形態１または１．１に記載の操作された受容体。
実施形態３
リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換を含む、実施形態１、１．１、または２のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態３．１
操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列が、Ｌ１３１ＳおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＴおよびＳ１７２Ｄ、Ｌ１３１ＤおよびＳ１７２Ｄ、Ｙ１１５ＤおよびＳ１７０Ｔ、Ｙ１１５ＤおよびＬ１３１Ｑ、ならびにＹ１１５ＤおよびＬ１３１Ｅからなる群から選択される一対のアミノ酸置換をさらに含む、実施形態１～３のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態４
リガンド結合ドメインが、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換を含む、実施形態１または１．１に記載の操作された受容体。
実施形態４．１
操作された受容体が、配列番号３３のアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列が、Ｌ１３１Ｅのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１～４のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態５
Ｃｙｓ－ループドメインが、配列番号２のアミノ酸１６６～１７２を含む、実施形態１～４．１のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態６
Ｃｙｓ－ループドメインが、配列番号２のアミノ酸１６６～１８０を含む、実施形態１～４．１のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態７
受容体が、ヒトグリシン受容体α１サブユニットからのβ１～２ループドメインを含む、実施形態１～６のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態８
β１～２ループドメインが、配列番号２のアミノ酸８１～８４を含む、実施形態７に記載の操作された受容体。
実施形態８．１
操作された受容体が、配列番号５８～６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～８のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態９
アセチルコリンに対する操作された受容体の効力が、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも低い、実施形態１～８のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１０
アセチルコリンに対する操作された受容体の効力が、アセチルコリンに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも２倍低い、実施形態９に記載の操作された受容体。
実施形態１１
非天然リガンドに対する操作された受容体の効力が、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力とほぼ同じである、実施形態１～１０のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１２
非天然リガンドに対する操作された受容体の効力が、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも高い、実施形態１～１１のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１３
非天然リガンドに対する操作された受容体の効力が、非天然リガンドに対するヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の効力よりも少なくとも２倍高い、実施形態１２に記載の操作された受容体。
実施形態１４
効力を決定することが、ＥＣ５０を決定することを含む、実施形態９～１３のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１５
非天然リガンドの存在下での操作された受容体の有効性が、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも高い、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１６
非天然リガンドの存在下での操作された受容体の有効性が、非天然リガンドの存在下でのヒトα７ニコチン性アセチルコリン受容体（α７－ｎＡＣｈＲ）の有効性よりも少なくとも２倍高い、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１７
有効性を決定することが、非天然リガンドの存在下でインビトロで操作された受容体を通過する電流の量を決定することを含む、実施形態１５～１６のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１８
非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＴＣ－６９８７、ＡＢＴ－１２６、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、実施形態１１～１７のいずれか一つに記載の操作された受容体。
実施形態１９
非天然リガンドが、ＡＢＴ－１２６、ＲＧ３４８７、およびＡＰＮ－１１２５からなる群から選択される、実施形態１８に記載の操作された受容体。
実施形態２０
非天然リガンドがＴＣ－５６１９である、実施形態１８に記載の操作された受容体。
実施形態２１
実施形態１～２０のいずれか一つの操作された受容体をコードする核酸を含む、ポリヌクレオチド。
実施形態２２
ポリヌクレオチドが、操作された受容体をコードする核酸に動作可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態２１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態２３
プロモーターが、調節可能なプロモーターである、実施形態２２に記載のポリヌクレオチド。
実施形態２４
調節可能なプロモーターが、興奮性細胞中で活性である、実施形態２３に記載のポリヌクレオチド。
実施形態２５
興奮性細胞が、ニューロンまたは筋細胞である、実施形態２４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態２６
興奮性細胞が、ニューロンである、実施形態２５に記載のポリヌクレオチド。
実施形態２７
実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態２８
ベクターがプラスミド、またはウイルスベクターである、実施形態２７に記載のベクター。
実施形態２９
ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および単純ヘルペスウイルスベクター１（ＨＳＶ－１）からなる群から選択されるウイルスベクターである、実施形態２８に記載のベクター。
実施形態３０
ウイルスベクターが、ＡＶＶベクターであり、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ５もしくはそのバリアント、ＡＡＶ６もしくはそのバリアント、またはＡＡＶ９もしくはそのバリアントである、実施形態２９に記載のベクター。
実施形態３１
実施形態１～２０のいずれか一つに記載の操作された受容体、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、または実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクターを含む、組成物。
実施形態３２
実施形態１～２０のいずれか一つに記載の操作された受容体、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、または実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクター、および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
実施形態３３
ニューロンにおいて操作された受容体を作製する方法であって、ニューロンを、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクター、実施形態３１に記載の組成物、または実施形態３２に記載の医薬組成物と接触させることを含む、方法。
実施形態３４
ニューロンが、末梢神経系のニューロンである、実施形態３３に記載の方法または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態３５
ニューロンが、中枢神経系のニューロンである、実施形態３３もしくは３４に記載の方法または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態３６
ニューロンが、侵害受容性ニューロンである、実施形態３３～３５のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態３７
ニューロンが、非侵害受容性ニューロンである、実施形態３３～３６のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態３８
ニューロンが、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである、実施形態３３～３７のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態３９
ニューロンが、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である、実施形態３３～３８のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４０
ニューロンが、Ａδ求心性線維である、実施形態３９に記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４１
Ａβ求心性線維が、損傷Ａβ求心性線維である、実施形態４０に記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４２
Ａβ求心性線維が、非損傷Ａβ求心性線維である、実施形態４０に記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４３
ニューロンが、神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する、実施形態３３～４２のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４４
ニューロンが、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１．１を発現しない、実施形態３３～４３のいずれか一つに記載の方法、または実施形態２６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４５
接触工程が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、実施形態３３～４４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４６
接触工程が、対象においてインビボで実施される、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７
接触工程が、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物を対象に投与することを含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８
接触工程が、インビトロまたはエクスビボで実施される、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４９
接触工程が、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、電気穿孔、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０
操作された受容体が、ニューロンの細胞表面に局在化することができる、実施形態３３～４９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５１
（ａ）ニューロンを実施形態１～２０のいずれか一つに記載の操作された受容体、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクター、実施形態３１に記載の組成物、または実施形態３２に記載の医薬組成物と接触させることと、（ｂ）ニューロンを操作された受容体の非天然リガンドと接触させることと、を含む、ニューロンの活性を阻害する方法。
実施形態５１．１
ニューロンが、末梢神経系のニューロンである、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５１．２
ニューロンが、中枢神経系のニューロンである、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５２
ニューロンが、侵害受容性ニューロンである、実施形態５１～５１
２のいずれかに記載の方法。
実施形態５３
ニューロンが、非侵害受容性ニューロンである、実施形態５１～５１
２のいずれかに記載の方法。
実施形態５４
ニューロンが、背根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、三叉神経節（ＴＧ）ニューロン、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、または感覚ニューロンである、実施形態５１～５３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５５
ニューロンが、Ａδ求心性線維、Ｃ線維、またはＡβ求心性線維である、実施形態５１～５４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５６
ニューロンが、Ａδ求心性線維である、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７
Ａβ求心性線維が、損傷Ａβ求心性線維である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８
Ａβ求心性線維が、非損傷Ａβ求心性線維である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５９
ニューロンが、神経フィラメント２００（ＮＦ２００）、ピエゾ２、およびＴＬＲ－５を発現する、実施形態５１～５８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６０
ニューロンが、ＴｒｐＶ１、前立腺酸性ホスファターゼ、ＮａＶ１
１を発現しない、実施形態５１～５９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６１
接触工程（ａ）が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、実施形態５１～６０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６２
接触工程（ｂ）が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施される、実施形態５１～６１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６３
接触工程（ａ）および／または（ｂ）が、対象においてインビボで実施される、実施形態５１～６２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６４
接触工程（ａ）が、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含み、および／または接触工程（ｂ）が、非天然リガンドを対象に投与することを含む、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５
接触工程（ａ）および／または（ｂ）が、リポフェクション、ナノ粒子送達、粒子衝撃、電気穿孔、超音波処理、またはマイクロインジェクションを含む、実施形態５１～６４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６６
操作された受容体が、ニューロンの細胞表面に局在化することができる、実施形態５１～６５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６７
それを必要とする対象における神経学的障害の発症を治療および／または遅延する方法であって、
対象に、治療有効量の実施形態１～２０のいずれか一つに記載の操作された受容体、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクター、実施形態３１に記載の組成物、または実施形態３２に記載の医薬組成物を投与することと、
操作された受容体の非天然リガンドを対象に投与することと、を含む、方法。
実施形態６８
対象が、工程（ａ）の後に非天然リガンドを投与される、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９
対象が、工程（ａ）と同時に非天然リガンドを投与される、実施形態６７に記載の方法。
実施形態７０
神経学的障害が、発作障害、運動障害、摂食障害、脊髄損傷、神経因性膀胱、異痛症、痙縮性障害、そう痒症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、依存症、不安症、うつ病、記憶損失、認知症、睡眠時無呼吸、脳卒中、ナルコレプシー、尿失禁、本態性振戦、三叉神経痛、口腔灼熱症候群、または心房細動である、実施形態６７～６９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７１
神経学的障害が、異痛症である、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２
非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、実施形態６７～７１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７３
非天然リガンドが、経口、皮下、局所的、または静脈内に投与される、実施形態６７～７２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７４
非天然リガンドが経口投与される、実施形態７３に記載の方法。
実施形態７５
操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、皮下、経口、髄腔内、局所的、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される、実施形態６７～７４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７６
操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される、実施形態６７～７５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７７
対象が三叉神経痛を患い、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される、実施形態６７～７６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７８
対象が神経障害性疼痛を患い、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される、実施形態６７～７６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７９
対象がヒトである、実施形態６７～７８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８０
治療有効量が、神経学的障害の徴候および／または症状の重症度を軽減させる、実施形態６７～７９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８１
治療有効量が、神経学的障害の徴候および／または症状の発症を遅延させる、実施形態６７～８０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８２
治療有効量が、神経学的障害の徴候および／または症状を除去する、実施形態６７～８１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８３
神経学的障害の徴候が、神経損傷、神経萎縮、および／または発作である、実施形態８０～８２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８４
神経損傷が、末梢神経損傷である、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８５
神経学的障害の症状が、疼痛である、実施形態８０～８４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８６
それを必要とする対象における疼痛の発症を治療および／または遅延させる方法であって、
対象に、治療有効量の実施形態１～２０のいずれか一つに記載の操作された受容体、実施形態２１～２６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、実施形態２７～３０のいずれか一つに記載のベクター、実施形態３１に記載の組成物、または実施形態３２に記載の医薬組成物を投与することと、
操作された受容体の非天然リガンドを対象に投与することと、を含む、方法。
実施形態８７
対象が、工程（ａ）の後に非天然リガンドを投与される、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８８
対象が、工程（ａ）と同時に非天然リガンドを投与される、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８９
非天然リガンドが、ＡＺＤ－０３２８、ＡＢＴ－１２６、ＴＣ６９８７、ＡＰＮ－１１２５、ＴＣ－５６１９、およびファシニクリン／ＲＧ３４８７からなる群から選択される、実施形態８６～８８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９０
非天然リガンドが、経口、皮下、局所的、または静脈内に投与される、実施形態８６～８９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９１
非天然リガンドが経口投与される、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２
操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、皮下、経口、髄腔内、局所的、静脈内、神経節内、神経内、頭蓋内、脊髄内、または大槽に投与される、実施形態８６～９１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９３
操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、経椎間孔注射によって、または髄腔内に投与される、実施形態８６～９２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９４
対象が三叉神経痛を患い、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、対象の三叉神経節（ＴＧ）に投与される、実施形態８６～９３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９５
対象が神経障害性疼痛を患い、操作された受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または医薬組成物が、対象の背根神経節（ＤＲＧ）に投与される、実施形態８６～９４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９６
対象がヒトである、実施形態８６～９５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９７
疼痛が、神経障害性疼痛である、実施形態８５～９６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９８
疼痛が、化学療法に関連する、化学療法によって引き起こされる、または化学療法から生じる、実施形態８５～９７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態９９
疼痛が、外傷に関連する、外傷によって引き起こされる、または外傷から生じる、実施形態８５～９８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１００
対象が異痛症を患う、実施形態８５～９９のいずれかに記載の方法。
実施形態１０１
疼痛が、医療処置後に現れる、実施形態８５～１００のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１０２
疼痛が、出産もしくは帝王切開に関連する、出産もしくは帝王切開によって引き起こされる、または出産もしくは帝王切開から生じる、実施形態８５～１０１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１０３
疼痛が、偏頭痛に関連する、偏頭痛によって引き起こされる、または偏頭痛から生じる、実施形態８５～１０２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１０４
治療有効量は、対象の疼痛を一過性に軽減し、対象の疼痛を永久に軽減し、対象の疼痛の発症を予防し、および／または対象の疼痛を除去する、実施形態８５～１０３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１０５
工程（ａ）および（ｂ）が、対象の疼痛が現れる前に実施される、実施形態８５～１０４のいずれか一つに記載の方法。

【0310】

前述は、本開示の原理を単に例示するに過ぎない。当然のことながら、当業者は、本明細書に明示的に説明または示されていないが、本開示の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な配置を考案することができる。さらに、本明細書に列挙されるすべての実施例および条件付き文言は、主に、本開示の原理および発明者によって当技術分野を促進するために貢献された概念を理解する際に、読者を助けることを意図しており、そのような具体的に列挙された実施例および条件に限定されるものではないと解釈されるべきである。さらに、本開示の原理、態様、および実施形態ならびにその具体的な実施例を列挙する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することが意図されている。さらに、かかる等価物は、現在公知の等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実行するように開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本開示の範囲は、本明細書に示され、説明される例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本開示の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。

【図1A-B】

【図1C-D】

【図1E-F】

【図1G】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【配列表】

2022545226000001.app

【国際調査報告】