特表2022-545234ＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-26
(54)【発明の名称】ＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20221019BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20221019BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20221019BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20221019BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221019BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221019BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20221019BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K16/46 ZNA
C12N15/13
C12P21/08
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61P35/02
A61K47/65
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022511021
(86)(22)【出願日】2020-07-23
(85)【翻訳文提出日】2022-02-22
(86)【国際出願番号】 CN2020103731
(87)【国際公開番号】W WO2021031784
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】201910764107.6
(32)【優先日】2019-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522064395
【氏名又は名称】ヤン ヤン
(71)【出願人】
【識別番号】522064409
【氏名又は名称】イン ウェイ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ヤン
(72)【発明者】
【氏名】イン ウェイ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF63
4C076FF70
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB41
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子、抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子、及び二重特異性抗体の製造におけるそれらの使用を提供する。本発明はＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体、及びＢ細胞関連疾患を治療するための薬物の製造におけるその使用をさらに提供する。
【選択図】図４
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含む抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子であって、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続される抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項2】
前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である請求項１に記載の抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項3】
前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む請求項１又は２に記載の抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項4】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は９に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項5】
Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含む抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子であって、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続される抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項6】
前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である請求項５に記載の抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項7】
前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む請求項５又は６に記載の抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項8】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項５～７のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子。
【請求項9】
請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子又は請求項５～８のいずれか一項に記載の抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子の二重特異性抗体を製造するための使用。
【請求項10】
ＣＤ３に結合した第一部分とＣＤ２０に結合した第二部分を含む二重特異性抗体であって、前記第一部分は抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子であり、前記抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含み、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続され、前記第二部分は抗ＣＤ２０抗体の軽鎖及び重鎖を含む二重特異性抗体。
【請求項11】
前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である請求項１０に記載の二重特異性抗体。
【請求項12】
前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む請求項１０又は１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
ＣＤ３に結合した前記第一部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は９に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１０～１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項14】
前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１０～１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項15】
前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖のＣ末端は前記リンカーペプチドを介して前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖のＮ末端に接続される請求項１０～１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項16】
ＣＤ２０に結合した前記第二部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項１０～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項17】
Ｂ細胞関連疾患を治療する薬物の製造における請求項１０～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項18】
前記Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞白血病又はＢ細胞リンパ腫である請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
請求項１０～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項20】
患者においてＢ細胞関連疾患を治療する方法であって、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項１９に記載の医薬組成物を治療有効量で前記患者に投与することを含む方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＣＤ３と抗ＣＤ２０の一本鎖Ｆａｂ分子に関し、さらにＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ細胞リンパ腫は一般的な血液系疾患であり、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫に分けられ、その病因が明らかではないが、免疫不全及び環境要因は可能な発症要因と考えられる。Ｂ細胞リンパ腫の治療及び予後はリンパ腫の具体的なタイプ及び病期・グレードに依存する。臨床の進展によって、Ｂ細胞リンパ腫は不活性リンパ腫及び侵襲性リンパ腫に分けられる。不活性リンパ腫は、一般的に発展が遅く、長年の疾患の安定性及び長期生存を保持することができるが、治癒することができない一方、侵襲性リンパ腫は、一般的に直ちに緊急治療を行う必要がある。有効な治療薬物が欠乏するため、現在、Ｂリンパ球腫瘍の治療効果は理想的ではない。
【0003】
ＣＤ３はＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）に接続されたＴ細胞表面のみに発現された分化抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要な分子である。ＣＤ３はε、ζ、δ及びγの四本鎖を含み、機能性ＣＤ３はそのうちの二本鎖から形成された二量体である。抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞表面のＣＤ３と結合することができ、ＴＣＲ－ＣＤ３分子と類似する効果を奏することによって、Ｔリンパ球を活性化する。
【0004】
ＣＤ２０はＢ細胞マーカーであり、成熟し活性化されたＢリンパ球に発現され、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫及び他のＢ－細胞悪性腫瘍において広く発現されるが、前駆体Ｂリンパ球、形質細胞及びリンパ性幹細胞等の細胞において発現されない。また、ＣＤ２０抗原は明らかであり、識別しやすく体内の血清に遊離しないＣＤ２０が存在する。したがって、ＣＤ２０は良好なＢリンパ球腫瘍の治療標的である。
【0005】
ＣＤ３及びＣＤ２０はＴリンパ球及びＢリンパ球の特異性標的であるため、良好な成薬ポテンシャルを有するので、多くの研究グループがＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体を既に構築しているか、又は構築中であり、一部について特許（例えばＣＮ１０４６４０８８１Ａ及びＣＮ１０４５５８１９１Ａ）を出願したが、分子構造及び開発技術の制限のため、二重特異性抗体は一般的に発現量が低く、重鎖がミスマッチし、抗体と抗原との結合力が低下し、精製プロセスが煩雑であるなどの面の問題がある。
【発明の概要】
【0006】
一態様において、本発明はＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含む抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子であって、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続される抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である。
【0008】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む。
【0009】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は９に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0010】
一方、本発明はＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含む抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子であって、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続される抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子を提供する。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0014】
一方、本発明は前記抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子又は前記抗ＣＤ２０一本鎖Ｆａｂ分子の二重特異性抗体を製造するための使用を提供する。
【0015】
一方、本発明は、ＣＤ３に結合した第一部分とＣＤ２０に結合した第二部分を含む二重特異性抗体であって、前記第一部分は抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子であり、前記抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖を含み、前記Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、長さが４５～８０個のアミノ酸であるリンカーペプチドを介して前記Ｆａｂ重鎖のＮ末端に接続され、前記第二部分は抗ＣＤ２０抗体の軽鎖及び重鎖を含む二重特異性抗体を提供する。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドの長さは６０個のアミノ酸である。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記リンカーペプチドはタンデムに繰り返されるＧＧＧＧＳ配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する前記第一部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は９に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、前記抗ＣＤ２０抗体の軽鎖のＣ末端は前記リンカーペプチドを介して前記抗ＣＤ２０抗体の重鎖のＮ末端に接続される。
【0021】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２０に結合する前記第二部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0022】
一方、本発明はＢ細胞関連疾患を治療する薬物の製造における前記二重特異性抗体の使用を提供する。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞関連疾患は、Ｂ細胞白血病又はＢ細胞リンパ腫である。
【0024】
一方、本発明は請求項に記載の二重特異性抗体及び薬学上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0025】
一方、本発明は患者においてＢ細胞関連疾患を治療する方法であって、前記二重特異性抗体又は前記医薬組成物を治療有効量で前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】実施例１で製造されたリンカーペプチドの一本鎖Ｆａｂ分子特性への影響を評価するための候補分子の構造概略図である。
【図2】異なる長さのリンカーペプチドを有する上記候補分子が細胞において発現されて精製された後にＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析を行った結果を示す。
【図3】異なる長さのリンカーペプチドを有する上記候補分子のＣＤ３結合能力に対する検出結果を示す。
【図4】本発明の二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２の構造概略図である。α－ＣＤ３はＣＤ３結合部分を指し、α－ＣＤ２０はＣＤ２０結合部分を指す。
【図6】本発明の二重特異性抗体及び対照としての二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９とＲａｊｉ細胞との結合能力の検出結果を示す。
【図7】本発明の二重特異性抗体及び対照としての二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９とＪｕｒｋａｔ細胞との結合能力の検出結果を示す。
【図9】本発明の二重特異性抗体及び対照としての二重特異性抗体ＲＥＧＮ１９７９がヒトＤａｕｄｉ細胞に誘導されたヌードマウス皮下腫瘍本体の成長を抑制する結果を示す。横軸は日数を表し、縦軸は腫瘍体積（立方ミリメートル）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学的用語は当業者が一般的に理解する意味を有する。
【0028】
「抗体」とは、形質細胞（エフェクターＢ細胞）から分泌され、生体免疫系によって外来物質（ポリペプチド、ウイルス、細菌等）の中和に用いられる免疫グロブリンをいう。この外来物質は、対応して抗原と呼ばれる。クラシック抗体分子の基本構造は２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖から構成された４量体である。アミノ酸配列の保存性の差異によって、重鎖はアミノ末端に位置する可変領域（ＶＨ）とカルボキシル末端に位置する定常領域（ＣＨ）とに分けられる。軽鎖も同様に、アミノ末端に位置する可変領域（ＶＬ）と、カルボキシル末端に位置する定常領域（ＣＬ）とに分けられる。１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域が互いに作用して抗原結合部位（Ｆｖ）を形成する。軽鎖の定常領域は、１つのＩｇドメインのみを含み、重鎖の定常領域は抗体種類（Ｉｓｏｔｙｐｅ）によって異なる数のＩｇドメインを含み、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤは、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのＩｇドメインを含み、ＩｇＭ及びＩｇＥは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の４つのＩｇドメインを含む。
【0029】
「Ｆａｂ」とは、抗原結合断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）を指し、抗体の１本の完全な軽鎖及び重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態において、短いリンカーペプチドによりＦａｂにおける軽鎖のＣ末端を重鎖のＮ末端に接続し、「一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）分子」を形成する。説明を容易にするために、Ｆａｂに関するコンテキストにおいて、該一本鎖Ｆａｂ分子において軽鎖部分を「Ｆａｂ軽鎖」と呼び、重鎖部分を「Ｆａｂ重鎖」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ重鎖はＣ末端に接続されたＦｃセグメントを含んでもよい。
【0030】
「リンカーペプチド」について、本明細書は実施例においてより詳細に説明し、それは４０～８０個（例えば５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、７０、７５又は７８個）のアミノ酸の長さを有してもよい。リンカーペプチドの使用は、分子構造の安定化と、二重特異性抗体における軽鎖ミスマッチの防止とに寄与する。
【0031】
「Ｆｃセグメント」はフラグメント結晶化領域（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、ＩｇＧ抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに対応する。ＩｇＧは、そのＦｃセグメントが表面に対応する受容体を有する細胞と結合することにより、異なる生物学的作用、例えばオプソニン作用（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を生成することができる。タンパク質加水分解酵素（例えばパパイン）により抗体分子を加水分解して抗体Ｆｃセグメントを得ることができる。いくつかの実施形態において、「Ｆｃセグメント」は抗体の重鎖のヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、「Ｆｃセグメント」はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ抗体に由来する。
【0032】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合した一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ３結合部分として他方の抗原結合部分に結合し、ＣＤ３と該他方の抗原を標的とする二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態において、該一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ３結合部分としてＣＤ２０結合部分に結合し、ＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態において、該一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ３結合部分として複数種の別の抗原結合部分に結合し、多重特異性抗体を形成する。
【0033】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２０に結合した一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ２０結合部分として他方の抗原結合部分に結合し、ＣＤ２０と該他方の抗原を標的とする二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態において、該一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ２０結合部分としてＣＤ３結合部分に結合し、ＣＤ３とＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体を形成する。いくつかの実施形態において、該一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＤ２０結合部分として複数種の別の抗原結合部分に結合し、多重特異性抗体を形成する。
【0034】
本発明の二重特異性抗体におけるＣＤ２０結合部分とＣＤ３結合部分との結合は、共有結合（例えばＦｃセグメントの間にジスルフィド結合が形成されることにより）又は非共有結合であってもよい。
【0035】
いくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ３結合部分の軽鎖及び重鎖可変ドメインはＯＫＴ３モノクローナル抗体又はＬ２Ｋモノクローナル抗体（ＷＯ ２００４１０６３８０）に由来する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ２０結合部分の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）又はオファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）に由来する。
【0036】
抗体が抗原に「結合」すると言及する場合に、該抗体は該抗原を識別して検出可能に結合することを指す。抗体と抗原との結合は、公知の抗原抗体結合測定方法、例えばＥＬＩＳＡにより測定されてもよい。なお、抗体抗原結合の解離平衡定数ＫＤは、抗体と対応する抗原との結合親和性を示すために用いてもよい。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態において、Ｆｃセグメントの「ノブインホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」を利用して二重特異性抗体における重鎖ミスマッチを防止する。この技術はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社によって開発された（米国特許５，７３１，１６８を参照）。具体的な方法としては、そのうちの１つの抗体の重鎖ＣＨ３領域の３６６位の体積が小さいトレオニン（Ｔ）を、体積の大きいチロシン（Ｙ）に突然変異し、突出した「Ｋｎｏｂｓ（ノブ状）」構造（Ｔ３６６Ｙ、（Ｋａｂａｔ番号システム））を形成するとともに、別の抗体重鎖ＣＨ３領域の４０７位の大きいチロシン（Ｙ）残基を小さいトレオニン（Ｔ）に突然変異し、凹んだ「ｈｏｌｅｓ（穴状）」構造（Ｙ４０７Ｔ）を形成する。「Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」構造の立体障害効果により二種類の異なる抗体重鎖間の正確な組み立てを実現する。突然変異後、製品の正確な組立率が明らかに向上し、量産の要求を満たすことができる。しかし、重鎖ＣＨ３のこのような再編方式は、抗体構造の安定性を低下させ、この欠点を克服するために、研究者はファージディスプレイ技術によりランダム突然変異選別を行い、より安定した「３＋１」モードであるＴ３６６Ｗ突然変異を構築して突出した「Ｋｎｏｂｓ」型を形成し、３つのアミノ酸が突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）して凹んだ「ｈｏｌｅｓ」型を形成する。Ｋｎｏｂｓ－ｈｏｌｅｓ構造設計は、２種類の異種抗体重鎖の組み立てに役立つ。
【0038】
「配列相同性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間の類似度を指し、一般的に相同性の百分率で表し、目視検査又はコンピュータプログラム（例えばＢＬＡＳＴ）により決定されてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合した一本鎖Ｆａｂ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ３結合部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ２０結合部分の軽鎖はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、二重特異性抗体においてＣＤ２０結合部分の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ３結合部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体においてＣＤ２０結合部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すアミノ酸配列を含み、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％や１００％）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0041】
当業者であれば理解されるように、本明細書が提供する具体的な配列を基に、少数のアミノ酸に対して置換、削除、添加を行って得られた生成物と対応する抗原との結合能力又は生物学的活性を検証し又はスクリーニングすることにより、本発明の提供するＣＤ３又はＣＤ２０に結合した一本鎖Ｆａｂ分子又は二重特異性抗体の対応する変異体を取得することができ、これらの変異体も本発明の範囲に含まれるべきである。
言及された医薬組成物について、使用された「薬学上許容される担体」は安全に投与可能な固体又は液体希釈剤、充填剤、酸化防止剤、安定剤などの物質を指し、これらの物質は過度の有害な副反応を引き起こすことなくヒト及び／又は動物の投与に適しており、また、それにおける薬物又は活性剤の活性を維持することに適している。
言及された医薬組成物について、使用された「薬学上許容される担体」は安全に投与可能な固体又は液体希釈剤、充填剤、酸化防止剤、安定剤などの物質を指し、これらの物質は過度の有害な副反応を引き起こすことなくヒト及び／又は動物の投与に適しており、また、それにおける薬物又は活性剤の活性を維持することに適している。
【0042】
「治療有効量」とは、被験者体内で臨床医師の所望する生物学的又は医学的な反応を引き起こすのに十分な活性化合物の量を指す。本発明の二重特異性抗体の「治療有効量」は当業者により投与経路、被験者の体重、年齢、病状などの要因に基づいて決定されてもよい。例えば、典型的な日用量範囲は体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ～１００ｍｇの活性成分であってもよい。
【0043】
以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【0044】
実施例１．抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子を構築するために採用された可撓性リンカーペプチドの長さのスクリーニング
Ｆａｂ分子の空間構造特徴から、本発明者らはＣＤ３を標的とする一本鎖Ｆａｂ分子を設計し、すなわち可撓性リンカーペプチドにより軽鎖と、それに対応する重鎖可変領域、及びＣＨ１セグメントと「ノブ状」Ｆｃセグメントとを接続し、軽鎖及び重鎖可変領域配列はＬ２Ｋ抗体に由来する。形成された一本鎖Ｆａｂ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する。
Ｆａｂ分子の空間構造特徴から、本発明者らはＣＤ３を標的とする一本鎖Ｆａｂ分子を設計し、すなわち可撓性リンカーペプチドにより軽鎖と、それに対応する重鎖可変領域、及びＣＨ１セグメントと「ノブ状」Ｆｃセグメントとを接続し、軽鎖及び重鎖可変領域配列はＬ２Ｋ抗体に由来する。形成された一本鎖Ｆａｂ分子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する。
【0045】
可撓性リンカーペプチドの長さが３．５ｎｍ以上であり、アミノ酸の隣接するペプチド結合の距離が０．３８ｎｍであることを考慮するとともに、ｓｃＦａｂの空間構造に一定の可撓性を保持する必要があることを考慮すると、本発明者らは長さが２６～８０個のアミノ酸である複数の可撓性リンカーペプチドを設計し、そのうちの５つの代表的なリンカーペプチドの長さ及び配列を表１に示す。
【0046】
【表1】
【0047】
１．１ 各長さの可撓性リンカーペプチドの発現レベルへの影響
オーバーラップＰＣＲ技術により上記一本鎖Ｆａｂ分子のコード核酸配列及び「穴状」Ｆｃセグメントのコード核酸配列をそれぞれ合成し、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）にそれぞれクローニングした。次に、該一本鎖Ｆａｂ分子のコード核酸配列を含む発現ベクターと「穴状」Ｆｃセグメントのコード配列を含む発現ベクターを１．５：１の割合で総量２００μｇの混合物として混合し、質量体積比１：２．５でトランスフェクション試薬ＰＥＩと混合してＤＮＡ－トランスフェクション試薬複合体として製造し、対数増殖期にある２９３Ｆ細胞２００ｍＬに一滴ずつ添加した。トランスフェクション後の５～７日に、細胞上澄液を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後、結合緩衝液（１２．１５ｇのＴｒｉｓに適量の滅菌水を加えて溶解し、ｐＨを７．０に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを添加して１Ｌまで定容したもの）で洗浄されたアフィニティークロマトグラフィーゲルカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）に上澄液を添加してから、溶出液（７．５ｇのグリシンに適量の再蒸留水を添加して溶解し、ｐＨを３．５に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを加えて、１Ｌまで定容したもの）により溶出した。溶出成分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、各長さの可撓性リンカーペプチドを介して接続された候補分子（構造概略図を図１に示す）を得た。
オーバーラップＰＣＲ技術により上記一本鎖Ｆａｂ分子のコード核酸配列及び「穴状」Ｆｃセグメントのコード核酸配列をそれぞれ合成し、真核発現ベクターｐｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）にそれぞれクローニングした。次に、該一本鎖Ｆａｂ分子のコード核酸配列を含む発現ベクターと「穴状」Ｆｃセグメントのコード配列を含む発現ベクターを１．５：１の割合で総量２００μｇの混合物として混合し、質量体積比１：２．５でトランスフェクション試薬ＰＥＩと混合してＤＮＡ－トランスフェクション試薬複合体として製造し、対数増殖期にある２９３Ｆ細胞２００ｍＬに一滴ずつ添加した。トランスフェクション後の５～７日に、細胞上澄液を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後、結合緩衝液（１２．１５ｇのＴｒｉｓに適量の滅菌水を加えて溶解し、ｐＨを７．０に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを添加して１Ｌまで定容したもの）で洗浄されたアフィニティークロマトグラフィーゲルカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）に上澄液を添加してから、溶出液（７．５ｇのグリシンに適量の再蒸留水を添加して溶解し、ｐＨを３．５に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを加えて、１Ｌまで定容したもの）により溶出した。溶出成分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和し、各長さの可撓性リンカーペプチドを介して接続された候補分子（構造概略図を図１に示す）を得た。
【0048】
２０μＬの溶出液を取り、ローディング緩衝液を加えた後、９５℃で１０分間変性し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動でタンパク質を分離し、クマシーブリリアントブルー染色でバンドを表示した。染色結果を図２に示す。レーン１～５は２６、３２、４５、６０及び８０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドを含む候補分子にそれぞれ対応する。図面から分かるように、６０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドを用いて構築された候補分子（図中の黒色のブロックに付されたバンドであって、Ｆｃセグメントを含むＦａｂ一本鎖分子である）の発現量が僅かに高く、不純物のバンドが少なかった。
【0049】
１．２ 各長さの可撓性リンカーペプチドの熱安定性への影響
上記１．１部分で精製されたタンパク質（候補分子）に対して３７℃、２４時間の熱処理及び５０℃、２時間の熱処理をそれぞれ行い、４℃処理と同じ時間で放置された抗体とともにＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出を行った。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出操作としては、ＴＳＫ－ＧＥＬＧ３０００ＳＷＸＬゲルクロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ社）を選択し、移動相（５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いてクロマトグラフィーカラムを平衡化した後にＵＶで検出する。異なる温度で処理した５０μＬのタンパク質をそれぞれ１ｍＬ／ｍｉｎの流速でクロマトグラフィーカラムに通し、各サンプルごとに２０分間運行した後に結果図をフィッティングし、目的とするタンパク質の純度を算出した。
上記１．１部分で精製されたタンパク質（候補分子）に対して３７℃、２４時間の熱処理及び５０℃、２時間の熱処理をそれぞれ行い、４℃処理と同じ時間で放置された抗体とともにＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出を行った。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出操作としては、ＴＳＫ－ＧＥＬＧ３０００ＳＷＸＬゲルクロマトグラフィーカラム（ＴＯＳＯＨ社）を選択し、移動相（５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いてクロマトグラフィーカラムを平衡化した後にＵＶで検出する。異なる温度で処理した５０μＬのタンパク質をそれぞれ１ｍＬ／ｍｉｎの流速でクロマトグラフィーカラムに通し、各サンプルごとに２０分間運行した後に結果図をフィッティングし、目的とするタンパク質の純度を算出した。
【0050】
結果を表２に示す。全体的には、可撓性リンカーペプチドの長さの延長に伴い、抗体の熱安定性もよくなり、すなわち、４℃の状態でのタンパク質との差が小さくなる。５０℃で処理する時に、６０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドから構築された候補分子は最適な熱安定性を示す。
【0051】
【表2】
【0052】
１．３ 各長さの可撓性リンカーペプチドの抗原結合能力への影響
上記１．１部分で精製された抗体（すなわち候補分子）とＣＤ３抗原との結合能力をＥＬＩＳＡにより検出した。概略ステップは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡプレートに濃度０．５μｇ／ｍＬのＣＤ３抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、ＳＥＫ１０９８１）を１００μＬコーティングし、４℃で一夜放置した。２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした後に３回洗浄した。次に、勾配希釈された抗体１００μＬを添加して室温で１時間インキュベートしてから３回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの二次抗体（Ｂｒｔｈｙｌ社、１：５０００希釈）を１００μＬ加えて室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１００μＬ添加して発色させ、マイクロプレートリーダーから４５０ｎｍ波長での吸光度値を読み取った。
上記１．１部分で精製された抗体（すなわち候補分子）とＣＤ３抗原との結合能力をＥＬＩＳＡにより検出した。概略ステップは以下のとおりである。ＥＬＩＳＡプレートに濃度０．５μｇ／ｍＬのＣＤ３抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、ＳＥＫ１０９８１）を１００μＬコーティングし、４℃で一夜放置した。２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、２％のＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした後に３回洗浄した。次に、勾配希釈された抗体１００μＬを添加して室温で１時間インキュベートしてから３回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの二次抗体（Ｂｒｔｈｙｌ社、１：５０００希釈）を１００μＬ加えて室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１００μＬ添加して発色させ、マイクロプレートリーダーから４５０ｎｍ波長での吸光度値を読み取った。
【0053】
図３に示す結果から、大体に可撓性リンカーペプチドの長さの増加に伴い、ＥＣ５０値が減少し、すなわち結合能力が向上する。これらのうち、６０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドから構築された候補分子は、最適な抗原結合能力（ＥＣ５０値が最小である）を示す。
各長さの可撓性リンカーペプチドの発現レベル、熱安定性及び抗原結合能力への影響を総合的に考慮すると、本発明者らは６０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドを後続の二重特異性抗体の構築に用いるようにした。
各長さの可撓性リンカーペプチドの発現レベル、熱安定性及び抗原結合能力への影響を総合的に考慮すると、本発明者らは６０個のアミノ酸の長さの可撓性リンカーペプチドを後続の二重特異性抗体の構築に用いるようにした。
【0054】
実施例２．二重特異性抗体の製造
ＣＤ３結合部分（アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子）のコードＤＮＡ断片及び抗ＣＤ２０抗体の軽鎖及び重鎖（アミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である）のコードＤＮＡ断片をそれぞれ合成し、組換ＤＮＡ、例えばオーバーラップＰＣＲ技術を利用してそれらを真核発現ベクターｐｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）にそれぞれクローニングしてから、得られたＣＤ３結合部分のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクター、抗ＣＤ２０抗体軽鎖のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクター、及び抗ＣＤ２０抗体重鎖のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクターを質量比１．５：２：１の割合で均一に混合した。総量２００μｇの上記発現ベクターの混合物とトランスフェクション試薬ＰＥＩを質量体積比１：２．５で均一に混合してＤＮＡ－トランスフェクション試薬複合体として製造し、対数増殖期にある２９３Ｆ細胞２００ｍＬに一滴ずつ添加した。トランスフェクション後の５～７日に、細胞上澄液を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後、結合緩衝液（１２．１５ｇのＴｒｉｓに適量の滅菌水を加えて溶解し、ｐＨを７．０に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを添加して１Ｌまで定容したもの）で洗浄されたアフィニティークロマトグラフィーゲルカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）に上澄液を添加してから、溶出液（７．５ｇのグリシンに適量の再蒸留水を添加して溶解し、ｐＨを３．５に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを加えて、１Ｌまで定容したもの）により溶出した。溶出成分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０で中和し、本発明の二重特異性抗体ＹＹ０４２１を得た。同様な方式で本発明の二重特異性抗体ＹＹ０４２２を製造し、ここでＣＤ２０結合部分の軽鎖及び重鎖はリンカーペプチドを介して接続される（そのＣＤ３結合部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すとおりであり、ＣＤ２０結合部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すとおりである）。二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２の構造概略図を図４に示す。
ＣＤ３結合部分（アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６である抗ＣＤ３一本鎖Ｆａｂ分子）のコードＤＮＡ断片及び抗ＣＤ２０抗体の軽鎖及び重鎖（アミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である）のコードＤＮＡ断片をそれぞれ合成し、組換ＤＮＡ、例えばオーバーラップＰＣＲ技術を利用してそれらを真核発現ベクターｐｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）にそれぞれクローニングしてから、得られたＣＤ３結合部分のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクター、抗ＣＤ２０抗体軽鎖のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクター、及び抗ＣＤ２０抗体重鎖のコードＤＮＡ配列を含む発現ベクターを質量比１．５：２：１の割合で均一に混合した。総量２００μｇの上記発現ベクターの混合物とトランスフェクション試薬ＰＥＩを質量体積比１：２．５で均一に混合してＤＮＡ－トランスフェクション試薬複合体として製造し、対数増殖期にある２９３Ｆ細胞２００ｍＬに一滴ずつ添加した。トランスフェクション後の５～７日に、細胞上澄液を収集し、０．４５μｍの濾過膜で濾過した後、結合緩衝液（１２．１５ｇのＴｒｉｓに適量の滅菌水を加えて溶解し、ｐＨを７．０に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを添加して１Ｌまで定容したもの）で洗浄されたアフィニティークロマトグラフィーゲルカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）に上澄液を添加してから、溶出液（７．５ｇのグリシンに適量の再蒸留水を添加して溶解し、ｐＨを３．５に調整し、８．７８ｇのＮａＣｌを加えて、１Ｌまで定容したもの）により溶出した。溶出成分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０で中和し、本発明の二重特異性抗体ＹＹ０４２１を得た。同様な方式で本発明の二重特異性抗体ＹＹ０４２２を製造し、ここでＣＤ２０結合部分の軽鎖及び重鎖はリンカーペプチドを介して接続される（そのＣＤ３結合部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すとおりであり、ＣＤ２０結合部分のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示すとおりである）。二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２の構造概略図を図４に示す。
【0055】
実施例３ ウエスタンブロット検出
３．１ 本発明の二重特異性抗体によるＣＤ３識別能力の検出
細胞形態が健康で、コンフルエンシーが８０％に達するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、遠心分離して上澄みを捨てた。細胞溶解液を添加し、９５℃で１０分間変性し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動で細胞タンパク質を分離した。セミドライ法でタンパク質をニトロセルロース膜（ＮＣ膜）に転移し、５％の脱脂乳を用いて室温で１時間ブロックした。本発明の抗体ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（ＣＤ３及びＣＤ２０二重特異性抗体、ＷＯ２０１４０４７２３１及びＵＳ２０１７０３５５７６７を参照）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、化学発光試薬を利用して発色させ、暗室で現像した。
３．１ 本発明の二重特異性抗体によるＣＤ３識別能力の検出
細胞形態が健康で、コンフルエンシーが８０％に達するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、遠心分離して上澄みを捨てた。細胞溶解液を添加し、９５℃で１０分間変性し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動で細胞タンパク質を分離した。セミドライ法でタンパク質をニトロセルロース膜（ＮＣ膜）に転移し、５％の脱脂乳を用いて室温で１時間ブロックした。本発明の抗体ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（ＣＤ３及びＣＤ２０二重特異性抗体、ＷＯ２０１４０４７２３１及びＵＳ２０１７０３５５７６７を参照）を添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、化学発光試薬を利用して発色させ、暗室で現像した。
【0056】
ウエスタンブロットの検出結果を図５ａに示す。結果から明らかなように、ヒトＣＤ３及びＣＤ２０の両方を標的とする二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２は、タンパク質レベルでＣＤ３抗原を効果的に識別することができる。
【0057】
３．２ 本発明の二重特異性抗体によるＣＤ２０識別能力の検出
細胞形態が健康で、コンフルエンシーが８０％に達するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、遠心分離して上澄みを捨てた。細胞溶解液を添加し、９５℃で１０分間変性し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動で細胞タンパク質を分離した。セミドライ法でタンパク質をニトロセルロース膜（ＮＣ膜）に転移し、５％の脱脂乳を用いて室温で１時間ブロックし、本発明の抗体ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９を添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、化学発光試薬を利用して発色させ、暗室で現像した。
細胞形態が健康で、コンフルエンシーが８０％に達するＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、遠心分離して上澄みを捨てた。細胞溶解液を添加し、９５℃で１０分間変性し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動で細胞タンパク質を分離した。セミドライ法でタンパク質をニトロセルロース膜（ＮＣ膜）に転移し、５％の脱脂乳を用いて室温で１時間ブロックし、本発明の抗体ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９を添加し、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、化学発光試薬を利用して発色させ、暗室で現像した。
【0058】
ウエスタンブロットの検出結果を図５ｂに示す。結果から明らかなように、ヒトＣＤ３及びＣＤ２０の両方を標的とする二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２は、タンパク質レベルでＣＤ２０抗原を効果的に識別することができる。
【0059】
実施例４．フローサイトメトリーによる本発明の二重特異性抗体と細胞表面ＣＤ３及びＣＤ２０との結合の検出
ヒトＲａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を６ウェルプレートに接種し、２０時間培養してからパンクレリパーゼ（ＥＤＴＡを含まない）で消化して細胞を収集し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離しＰＢＳで２回洗浄し、ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９とともに氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄してから氷上でＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）とともに１時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより検出した。
ヒトＲａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を６ウェルプレートに接種し、２０時間培養してからパンクレリパーゼ（ＥＤＴＡを含まない）で消化して細胞を収集し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離しＰＢＳで２回洗浄し、ＹＹ０４２１、ＹＹ０４２２又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９とともに氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄してから氷上でＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）とともに１時間インキュベートし、フローサイトメトリーにより検出した。
【0060】
フローサイトメトリーの検出結果を図６及び図７に示す。結果から明らかなように、本発明のヒトＣＤ３及びＣＤ２０を標的とする二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２は細胞表面のヒトＣＤ３（図６）及びＣＤ２０（図７）と高親和性を有する。
【0061】
実施例６．本発明の二重特異性抗体によるＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍細胞への殺傷の媒介
形態が健康で、終濃度５μＭのＣＦＳＥで染色されたヒトＤａｕｄｉ細胞を５×１０３で９６ウェルプレートに接種した。０．５％のウシ胎児血清を含有する培地で一夜飢餓した後、Ｅ／Ｔ比５：１でＣＤ８＋Ｔ細胞を添加した。実験を２ロットに分けて行い、ロットごとに細胞を３群に分けた（群ごとに３ウェル）。第１ロットにおいて培地（図８ａではＢｌａｎｋ）、対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（図８ａではＣｏｎｔｒｏｌ）、本発明の抗体ＹＹ０４２１をそれぞれ加えた。第２ロットにおいて培地（図８ｂではＢｌａｎｋ）、対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（図８ｂではＣｏｎｔｒｏｌ）及び本発明の抗体ＹＹ０４２２をそれぞれ加えた。その後、セルインキュベータにて４時間培養し続けた。上澄みと細胞懸濁液を収集し、遠心分離した後に上澄みを捨ててＰＢＳで再懸濁し、次に１μｇ／ｍＬのＰＩを添加し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ陽性細胞に占めるＣＦＳＥ、ＰＩ両陽性細胞の割合を検出することにより、ＣＤ８＋Ｔの腫瘍細胞への殺傷を媒介する二重特異性抗体の能力を検出した。
形態が健康で、終濃度５μＭのＣＦＳＥで染色されたヒトＤａｕｄｉ細胞を５×１０３で９６ウェルプレートに接種した。０．５％のウシ胎児血清を含有する培地で一夜飢餓した後、Ｅ／Ｔ比５：１でＣＤ８＋Ｔ細胞を添加した。実験を２ロットに分けて行い、ロットごとに細胞を３群に分けた（群ごとに３ウェル）。第１ロットにおいて培地（図８ａではＢｌａｎｋ）、対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（図８ａではＣｏｎｔｒｏｌ）、本発明の抗体ＹＹ０４２１をそれぞれ加えた。第２ロットにおいて培地（図８ｂではＢｌａｎｋ）、対照抗体ＲＥＧＮ１９７９（図８ｂではＣｏｎｔｒｏｌ）及び本発明の抗体ＹＹ０４２２をそれぞれ加えた。その後、セルインキュベータにて４時間培養し続けた。上澄みと細胞懸濁液を収集し、遠心分離した後に上澄みを捨ててＰＢＳで再懸濁し、次に１μｇ／ｍＬのＰＩを添加し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ陽性細胞に占めるＣＦＳＥ、ＰＩ両陽性細胞の割合を検出することにより、ＣＤ８＋Ｔの腫瘍細胞への殺傷を媒介する二重特異性抗体の能力を検出した。
【0062】
殺傷結果を図８に示す。結果から分かるように、本発明のヒトＣＤ３及びＣＤ２０の両方を標的とする二重特異性抗体ＹＹ０４２１及びＹＹ０４２２は、Ｔ細胞のＤａｕｄｉ細胞への殺傷を効果的に媒介することができる。
【0063】
実施例７．ヌードラットにおける移植腫瘍の検出
対数増殖期で形態が良好である５×１０７個のヒトＤａｕｄｉ細胞をＳＰＦグレードＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの前腋窩皮膚に注射し、注射した後の６日目にＰＢＭＣ細胞（２．５×１０８、ＡＴＣＣから購入）及び本発明の二重特異性抗体又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９をそれぞれ１０μｇ注射した。皮下腫瘍の最大長径と最大横径を毎日測定し、腫瘍体積を計算し、ヌードマウスの食事や体重等の状況を観察、記録した。２８日目に頸椎脱臼法で全てのマウスを殺した直後、腫瘍を分離し、撮影して秤量した。
対数増殖期で形態が良好である５×１０７個のヒトＤａｕｄｉ細胞をＳＰＦグレードＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの前腋窩皮膚に注射し、注射した後の６日目にＰＢＭＣ細胞（２．５×１０８、ＡＴＣＣから購入）及び本発明の二重特異性抗体又は対照抗体ＲＥＧＮ１９７９をそれぞれ１０μｇ注射した。皮下腫瘍の最大長径と最大横径を毎日測定し、腫瘍体積を計算し、ヌードマウスの食事や体重等の状況を観察、記録した。２８日目に頸椎脱臼法で全てのマウスを殺した直後、腫瘍を分離し、撮影して秤量した。
【0064】
ヌードマウスにおける移植腫瘍の検出結果を図９に示す。結果から明らかなように、本発明のヒトＣＤ３及びＣＤ２０の両方を標的とする二重特異性抗体は良好な生物学的活性を有し、ヒトＤａｕｄｉ細胞に誘導されたヌードマウス皮下腫瘍本体の増殖を顕著に抑制することができる。
【0065】
本明細書に言及されたいくつかのアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＹＹ０４２１ ＣＤ３結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２１ ＣＤ２０結合部分の軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＹＹ０４２１ ＣＤ２０結合部分の重鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２２ ＣＤ３結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２２ ＣＤ２０結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２１ ＣＤ３結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２１ ＣＤ２０結合部分の軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ＹＹ０４２１ ＣＤ２０結合部分の重鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２２ ＣＤ３結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
ＹＹ０４２２ ＣＤ２０結合部分のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQAPGKGLEWVSTISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDIQYGNYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】