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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-26
(54)【発明の名称】筋萎縮を治療するためのペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20221019BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20221019BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20221019BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20221019BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20221019BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221019BHJP
A61K 38/04 20060101ALI20221019BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00
C07K7/06 ZNA
C07K7/08
A23L33/17
A61P21/00
A61P29/00
A61K38/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022511277
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-04-06
(86)【国際出願番号】 EP2020072937
(87)【国際公開番号】W WO2021032650
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】19192689.8
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518017819
【氏名又は名称】ニューリタス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001243
【氏名又は名称】弁理士法人谷・阿部特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ノラ カルディ
(72)【発明者】
【氏名】シリル ロペス
(72)【発明者】
【氏名】アレッサンドロ アデルフィオ
【テーマコード（参考）】
4B018
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB07
4B018LB08
4B018LE03
4B018MD20
4B018ME14
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZB111
4C084ZB112
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA19
4H045EA20
4H045FA10
4H045FA74
(57)【要約】
出願人は、用量依存的にインビトロ細胞アッセイにおいて、ある範囲の濃度にわたってリボソームタンパク質S6（rpS6）をリン酸化できる多くのペプチドを発見した。RPS6はプロテインキナーゼの重要な基質であり、細胞増殖および細胞分裂の際に成長因子およびマイトジェンによってリン酸化される。これは、骨格筋組織での新しいタンパク質の合成における重要なステップである。また、本ペプチドは、タンパク質分解の増加に直接関連し、骨格筋の萎縮を進行させるmRNA転写産物（TRIM63およびFBXO32）の発現を減少させる能力を有する。さらに、筋萎縮の増加は、循環するTNFαの全身的な増加と関連している。本ペプチドは、循環免疫細胞におけるTNFαの発現の低下をもたらす。本ペプチドは、筋萎縮を示す対象、例えば、高齢者、身体的に不活発な人、および筋萎縮を特徴とする病気（すなわち、MSおよびポリオ）を有する対象における筋肉の成長および筋肉の健康を促進するために使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
最大で５０個のアミノ酸を有し配列番号２０の配列を含むペプチドを含有する組成物。
【請求項2】
前記ペプチドが６～２０個のアミノ酸を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記配列番号２０の配列を含むペプチドが、配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１９から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
最大で５０個のアミノ酸を有し配列番号８の配列を含むペプチドを含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記最大で５０個のアミノ酸を有し配列番号８の配列を含むペプチドが、配列番号８および配列番号７から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
配列番号３および配列番号８のペプチドを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物が、可食性粉末である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を健常者に経口投与する工程を含む、健常者の筋肉合成を促進する方法。
【請求項9】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を健常者に経口投与する工程を含む、健常者の筋肉減少を抑制する方法。
【請求項10】
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を健常者に経口投与する工程を含む、健常者における炎症反応を改善する方法。
【請求項11】
対象における筋萎縮を予防または治療する方法において使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
最大で５０個のアミノ酸を有し、配列番号２０を含む単離されたペプチド。
【請求項13】
６～２０個のアミノ酸を有する、請求項１２に記載の単離されたペプチド。
【請求項14】
配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１９から選択される、請求項１３に記載の単離されたペプチド。
【請求項15】
健常者における筋肉合成を促進するための、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単離されたペプチドまたは請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、いくつものペプチド、および１つ以上のペプチドを含む組成物に関する。また、対象の筋萎縮を治療または予防するためのペプチドまたは組成物の使用も企図されている。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮は、筋肉の消耗、タンパク質分解の増加、全身性炎症の増加、および影響を受けた筋肉タイプにおける新規合成タンパク質のダウンレギュレーションによって特徴付けられるヒトの状態である。この状態の症状には、1つ以上の手足に著しい脱力感があり、片方の腕または脚がもう一方の腕または脚よりも著しく小さくなることが含まれる。これは一般に、加齢（多くの場合、サルコペニアの一部として）、寝たきりの患者、宇宙飛行士、負傷したスポーツ選手などの長期間身体的に活動していない対象、摂食障害のある対象、代謝性疾患のある対象、および、ALS、MS、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、サルコペニア、変形性関節症、ポリオ、関節リウマチ、脊髄筋萎縮症、多発性筋炎などの神経、筋肉、または関節の変性によって特徴づけられる病気のある対象に関連している。
【0003】
リボソームタンパク質S6は、18SrRNAの1分子とともに、小さな40Sリボソームサブユニットを構成する33のタンパク質の1つである（4）。rpS6は、翻訳開始に必要なm7GpppG 5'-cap-binding複合体と直接相互作用し、細胞成長および細胞増殖の合図に応じて翻訳開始を制御するシグナル伝達経路の調節収束点を表す。rpS6は、マイトジェンおよび細胞増殖刺激に応答して誘導性リン酸化を受け、このリン酸化は脊椎動物、無脊椎動物、植物、および真菌で保存されている（5）。高等真核生物では、リン酸化はrpS6のカルボキシル末端にある5つのセリン残基：Ser-235、Ser-236、Ser-240、Ser-244、およびSer-247のクラスターで発生する（6）。ショウジョウバエrpS6には、5つのリン酸化部位の同様の構成が含まれているが、サッカロマイセス・セレビシエに見られるホモログには、哺乳類のSer-235およびSer-236に対応する2つのSer残基が含まれている（4）。rpS6のリン酸化は、Ser-236で始まり、続いてSer-235、Ser-240、Ser-244、Ser-247のリン酸化が順次行われる（7、8）。C末端残基でのrpS6のリン酸化は、m7GpppGキャップに対する親和性を高める。これは、rpS6のリン酸化がmRNAの翻訳開始を促進することを強く示唆している。
【0004】
rpS6のカルボキシル末端リン酸化は、少なくとも2つのシグナル伝達経路によって調節されている。p70リボソームS6キナーゼであるS6K1およびS6K2は、インスリン、血清、およびアミノ酸の刺激に応答したrpS6 C末端のリン酸化において主要な役割を果たす（4）。S6K1およびS6K2はSer-240およびSer-244をリン酸化するが、無傷の細胞でのSer-235およびSer-236のリン酸化には不要である（13）。S6K1とS6K2の活性は、成長とマイトジェンの合図に反応する哺乳類におけるラパマイシンの標的である、mTORによって直接制御される。ラパマイシンによるmTORの阻害は、哺乳類細胞におけるrpS6リン酸化の劇的な減少を引き起こす（14）。mTORはまた、翻訳リプレッサー4E-BP1をリン酸化し、m7GpppG 5'-cap-binding複合体からの解離を引き起こし、S6Kと4E-BP1のリン酸化を組み合わせることにより、mTORは好ましい成長条件に応じてタンパク質の翻訳を積極的に調節する。RAS/ERK経路は、p90リボソームS6KキナーゼであるRSK1およびRSK2の活性化を通じて、mTORとは無関係にrpS6リン酸化も調節する（12）。RSK1およびRSK2は、ホルボールエステル、血清、および発癌性RASに応答してrpS6のSer-235およびSer-236をリン酸化し、キャップ結合には両方の残基のリン酸化が必要である（13）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、上記の課題の少なくとも１つを克服することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
出願人は、インビトロ細胞アッセイにおいて、リボソームタンパク質S6（rpS6）をある範囲の濃度にわたって用量依存的にリン酸化することができるソラマメ(Vicia Faba)タンパク質に由来する多くのペプチドを発見した（図１～１０および１２）。RPS6はプロテインキナーゼの重要な基質であり、細胞増殖および細胞分裂の際に成長因子およびマイトジェンによってリン酸化される。これは、骨格筋組織での新しいタンパク質の合成における重要なステップである。記載されているペプチドは、進行性の骨格筋萎縮を引き起こすタンパク質分解の増加に直接関連しているmRNA転写産物（TRIM63およびFBXO32）の発現を減少させる能力も有している（図１４～１５）。さらに、筋萎縮の増加は、循環するTNFαの全身的な増加と関連している。本明細書に記載されているペプチドのいくつかはまた、循環免疫細胞におけるTNFαの発現の低下をもたらす。 ペプチドは、対象、特に筋萎縮を示す対象、例えば高齢者、身体的に不活発な人々、および筋萎縮（すなわち、MSとポリオ）を特徴とする兆候がある対象において、筋肉の成長と筋肉の健康を促進し、筋肉の喪失を減らし、免疫および/または炎症反応をサポートするために使用することができる。
【0007】
本発明の第１の態様によれば、
TIKLPAGT 配列番号１
IEDPGQFPT 配列番号２
HLPSYSPSPQ 配列番号３
KGDIIAIPSGIPY 配列番号４
LDWYKGPT 配列番号５
SRGPIYSN 配列番号６
LERGDTIKIPAGT 配列番号７
TIKIPAGT 配列番号８
SYSPSPQ 配列番号９
IGSSSSPDIYNPQAGRIKT 配列番号１０
IDPNGLHLPSYSPSPQL 配列番号１１
LVNRDDEEDLRVLDLVIP 配列番号１２
ITGQVLHPNGGTVVNA 配列番号１３
ALEPDNR 配列番号１４
LREQSQQNECQLER 配列番号１５
VAGKGIPWDKQDPGEEAIES 配列番号１６
VGRRGGQHQQEEESEEQKD 配列番号１７
YDEEKEQGEEEIRK 配列番号１８
HLPSYSPSP 配列番号１９
SYSPSP 配列番号２０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくは、それから本質的になるペプチドまたはそれらの機能的変異体（以下、「本発明のペプチド」という）が提供される。
TIKLPAGT 配列番号１
IEDPGQFPT 配列番号２
HLPSYSPSPQ 配列番号３
KGDIIAIPSGIPY 配列番号４
LDWYKGPT 配列番号５
SRGPIYSN 配列番号６
LERGDTIKIPAGT 配列番号７
TIKIPAGT 配列番号８
SYSPSPQ 配列番号９
IGSSSSPDIYNPQAGRIKT 配列番号１０
IDPNGLHLPSYSPSPQL 配列番号１１
LVNRDDEEDLRVLDLVIP 配列番号１２
ITGQVLHPNGGTVVNA 配列番号１３
ALEPDNR 配列番号１４
LREQSQQNECQLER 配列番号１５
VAGKGIPWDKQDPGEEAIES 配列番号１６
VGRRGGQHQQEEESEEQKD 配列番号１７
YDEEKEQGEEEIRK 配列番号１８
HLPSYSPSP 配列番号１９
SYSPSP 配列番号２０
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくは、それから本質的になるペプチドまたはそれらの機能的変異体（以下、「本発明のペプチド」という）が提供される。
【0008】
一実施形態では、ペプチドは配列番号２０を含む。そのようなペプチドの例には、配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１９が含まれる。
別の態様では、本発明は、本発明の修飾ペプチドを提供する。ペプチドは、本明細書に記載の任意の方法、例えば、N末端、C末端、またはアミノ酸側鎖修飾、PEG化、環化、または脂質化によって修飾することができる。
別の態様では、本発明は、本発明の修飾ペプチドを提供する。ペプチドは、本明細書に記載の任意の方法、例えば、N末端、C末端、またはアミノ酸側鎖修飾、PEG化、環化、または脂質化によって修飾することができる。
【0009】
別の態様では、本発明は、結合パートナーにコンジュゲートされた（一般に共有結合的にコンジュゲートされた）本発明のペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
【0010】
「本発明のペプチド」という用語は、修飾されたペプチドおよびコンジュゲートを含む。
【0011】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つについて、本発明のペプチドの１つまたは複数またはすべてを含む組成物を提供する。
【0012】
一実施形態では、組成物は、配列番号２０、例えば、配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１９のすべてのうちの１つ、２つ、３つを含むペプチドを含む。
【0013】
一実施形態では、組成物は、配列番号１または配列番号８を含むか、配列番号１または配列番号８から本質的になり、例えば配列番号７および配列番号８を含む。
【0014】
一実施形態では、組成物は、任意選択で追加のペプチドを含む粉末である。粉末は、ペプチドで補充され得るタンパク質加水分解物であり得、および／または食用粉末として提供され得る。一実施形態では、粉末は、本発明の１つ以上のペプチドの約０．０００１から約１．０％、約０．０００１から約０．２％、約０．００１から約０．１％、または約０．００１から約０．１％を含む（ｗ／ｗ）。一実施形態では、粉末は完全なタンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、組成物は、食品、飲料、または栄養サプリメントである。別の実施形態では、組成物は局所組成物である。
【0015】
一実施形態では、粉末は、典型的には約０．０１から０．２％（ｗ／ｗ）の量で、配列番号１および３のペプチドを含む。
一実施形態では、粉末は、典型的には約０．００１から０．２％（ｗ／ｗ）の量で、配列番号１、２、３および５のペプチドを含む。
一実施形態では、粉末は、典型的には約０．００１から０．２％（ｗ／ｗ）の量で、配列番号１、２、３、４および５のペプチドを含む。
一実施形態では、粉末は、典型的には約０．００１から０．２％（ｗ／ｗ）の量で、配列番号１、２、３および５のペプチドを含む。
一実施形態では、粉末は、典型的には約０．００１から０．２％（ｗ／ｗ）の量で、配列番号１、２、３、４および５のペプチドを含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドを、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【0017】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象の筋萎縮を治療または予防する方法を提供する。治療は、本発明のペプチドまたは組成物を含む、医薬組成物によって、栄養サプリメントによって、または食品または飲料によって投与することができる。一実施形態では、対象は、高齢の対象または身体的に不活発な対象、例えば、身体的損傷を有する対象である。
【0018】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、筋萎縮を特徴とする疾患または状態を有する対象の筋萎縮を治療または予防する方法を提供する。筋萎縮を特徴とする疾患または状態の例には、身体的損傷、摂食障害、代謝性疾患（I型およびII型糖尿病を含む）、並びにALS、MS、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、骨関節炎、ポリオ、関節リウマチ、脊髄筋萎縮、悪液質、サルコペニア、栄養失調および多発性筋炎などの神経、筋肉または関節の変性を特徴とする疾患が含まれる。
【0019】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象の筋肉合成を促進する方法を提供する。
【0020】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象の筋喪失を低減する方法を提供する。
【0021】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象における免疫または炎症反応をサポートまたは増強する方法を提供する。
【0022】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象の筋肉破壊の期間中（例えば、ウエイトエクササイズ中）に筋肉を保護する方法を提供する。
【0023】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明のペプチドまたは組成物を対象に投与するステップを含む、対象における筋線維（特にタイプＩまたはタイプＩＩの筋線維）の存在量を増加させる方法を提供する。
【0024】
任意の実施形態において、対象は、健常者、若年者または高齢者であり得る。
【0025】
任意の実施形態において、ペプチドまたは組成物は、経口的に（例えば、飲料、食品、または医薬組成物において）投与され得る。
【0026】
一実施形態では、ペプチドは配列番号２０を含む。そのようなペプチドの例には、配列番号３、配列番号９、配列番号１１および配列番号１９が含まれる。
【0027】
任意の実施形態において、ペプチドは、配列番号１または配列番号８を含むか、配列番号１または配列番号８から本質的になり、例えば配列番号７および配列番号８を含む。
【0028】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を提供する。
【0029】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供し、このベクターは、宿主細胞における本発明のペプチドの異種発現のために構成される（以下、「本発明の発現ベクター」という）。
【0030】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを異種発現するように操作された宿主細胞、特に細菌または哺乳動物プロデューサー細胞を提供する（以下、「本発明の形質転換細胞」という）。一実施形態では、形質転換された宿主細胞は、本発明の発現ベクターを含む。
【0031】
本発明はまた、本発明の形質転換細胞を提供するステップ、形質転換された宿主細胞を培養して宿主細胞による本発明の組換えペプチドの異種発現をもたらすステップ、および本発明の組換えペプチドを回収するステップを含む、本発明のペプチドを産生する方法を提供する。
【0032】
本発明はまた、本発明のペプチドの異種発現のために細胞を操作する方法を提供し、これは、本発明の発現ベクターで細胞を形質転換するステップを含み、それにより、形質転換細胞は、本発明のペプチドの異種発現が可能である。
【0033】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に記載される他の特許請求の範囲で定義および説明される。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図1】様々なペプチド濃度での配列番号１のrPS6リン酸化活性を示す図である。
【図2】様々なペプチド濃度での配列番号２のrPS6リン酸化活性を示す図である。
【図3】様々なペプチド濃度での配列番号３のrPS6リン酸化活性を示す図である。
【図4】様々なペプチド濃度での配列番号４のrPS6リン酸化活性を示す図である。
【図5】様々なペプチド濃度での配列番号５のrPS6リン酸化活性を示す図である。
【図6】０．５μg/mlでの配列番号1から5のペプチドのrpS6リン酸化活性を示す図である。
【図7】飢餓プロトコルに従った、０．０５μｇ／ｍｌでの２０分間の配列番号８；配列番号1；配列番号3；配列番号１０；配列番号１６；配列番号１１；配列番号１２；配列番号１７；配列番号１８のペプチドのrPS6リン酸化活性を示す図である。（一元配置分散分析;* p <0.05 ** p<0.01*** p<0.001;平均±SEM; N=4）：
【図8】S6リン酸化に対する配列番号6の効果を示す図である。C2C12細胞は、飢餓プロトコルに従って３０分間ペプチド（0.005 -0.5μg/ml）で処理された（スチューデントのt検定または一元配置分散分析；*p<0.05** p <0.01*** p <0.001;平均± SEM; N=4）。
【図9】モチーフSYSPSP（配列番号２０）を含む配列番号9のS6リン酸化に対する効果を示す図である。C2C12細胞は、飢餓プロトコルに従って３０分間ペプチド（5μg/ ml）で処理された（スチューデントのt検定または一元配置分散分析；*p <0.05 ** p <0.01 *** p <0.001;平均±SEM; N=4）。
【図10】モチーフSYSPSP（配列番号２０）を含む配列番号１１のS6リン酸化に対する効果を示す図である。C2C12細胞は、飢餓プロトコルに続いて、ペプチド(0.005-0.5 μg/ml)で３０分間処理した。（スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析；*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001; 平均± SEM; N=4).
【図11】TNF-α分泌に対するペプチド処理の効果を示す図である。THP-1マクロファージはニューリタスペプチド（0.5μg/ ml）で24時間処理された後、LPS（100ng/ ml）で24時間刺激された。配列番号１４; 配列番号８; 配列番号１３; 配列番号１５。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p <0.01 *** p <0.001;平均±SEM; N=4）。
【図12】S6リン酸化に対するペプチド処理の効果を示す図である。C2C12細胞は、飢餓プロトコルに従って３０分間、配列番号2（0.5 -5μg/ml）で処理された。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p<0.01 *** p<0.001;平均±SEM; N =3）。
【図13】TNF-α分泌に対するペプチド処理の効果を示す図である。THP-1マクロファージは配列番号2（0.05-5μg / ml）で24時間処理された後、LPS（100ng / ml）で24時間刺激された。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p<0.01 *** p<0.001;平均±SEM; N =3）。
【図14】萎縮関連遺伝子発現に対するニューリタスペプチドの効果を示す図である。PCR分析は、TRIM63（N = 6）遺伝子発現に対する配列番号１９（SYSPSPモチーフを含む）の効果を示す萎縮誘発C2C12細胞で実施された。細胞をデキサメタゾン（0.3μg/ml）で24時間処理し、デキサメタゾン処理の終了の３０分前に、pep_MU12PE（0.5-5μg/ml）を添加した。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p<0.01 *** p<0.001;平均±SEM）。
【図15】萎縮関連遺伝子発現に対するニューリタスペプチドの効果を示す図である。PCR分析は、FBXO（N=5）遺伝子発現に対する 配列番号１９（SYSPSPモチーフを含む）の効果を示す萎縮誘発C2C12細胞で実施された。細胞をデキサメタゾン（0.3μg/ml）で２４時間処理し、デキサメタゾン処理の終了の３０分前に、pep_MU12PE（0.5-5μg/ml）を添加した。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p<0.01 *** p<0.001;平均±SEM）。
【図16】NPN_1（配列番号3および8を含む粉末組成物）が、除負荷後のヒラメ筋の筋喪失を有意に防止したことを示す図である。C57BL/ 6マウスは、１８日間にわたってBBI（113.3 mg/kg/日）、カゼイン（650 mg/kg/日）、またはNPN_1（650 mg/kg/日）で処置された。（一元配置分散分析; * p <0.05 ** p<0.01 *** p<0.001; N =10）。
【図17】NPN_1が、結合組織と筋肉間脂肪の量を減らし、筋繊維密度を高めることを示す図である。（A）タイプＩ（赤）およびタイプＩＩａ（緑）の筋線維密度に対する骨格筋免疫染色、およびNPN_1の効果を示すヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色、タイプＩ（B）およびタイプＩＩａ（C）の繊維密度に対する処理の効果の定量化を示す（* p <0.05 ** p <0.01 *** p <0.001; N = 5）。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、その内容が完全に列挙されているかのように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0036】
定義と一般的な設定
【0037】
本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、以下の用語は、その用語が当技術分野で享受する可能性のあるより広い（またはより狭い）意味に加えて、以下の意味を有することを意図する：
【0038】
文脈上別段の必要がない限り、ここでの単数形の使用は複数形を含むように読まれ、その逆も同様である。物に関連して使用される「a」または「an」という用語は、その物の1つまたは複数を指すと解釈される。すなわち、「a」（または「an」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義的に使用される。
【0039】
本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などのその変形は、列挙されたインテジャー（例えば、特徴、要素、特性、プロパティ、方法／プロセスステップまたは限定）またはインテジャーのグループ（例えば、特徴、要素、特性、プロパティ、方法/プロセスステップまたは限定）の包含を示すために読まれるべきである。ただし、他のインテジャーまたはインテジャーのグループを除外しない。したがって、本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていないインテジャーまたは方法／プロセスステップを除外しない。
【0040】
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連する異常な状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質（または実際に疾患の病因的根拠が確立されているかどうか）に関係なく、生理学的機能が損なわれている障害、病気、異常、病状、病気、状態または症候群を包含するように広く使用される。したがって、感染、外傷、傷害、手術、放射線焼灼、中毒、または栄養不足から生じる状態が含まれる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「治療(treatment)」または「治療(treating)」という用語は、疾患の症状を治癒、改善または軽減するか、またはその原因を除去（または影響を軽減）する介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、この用語は「治療(therapy)」という用語と同義で使用される。
【0042】
さらに、「治療(treatment)」または「治療(treating)」という用語は、疾患の発症または進行を予防または遅延させるか、または治療された集団内でのその発生率を低減（または根絶）する介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は「予防」という用語と同義語として使用される。
【0043】
本明細書で使用される場合、本発明のペプチドの有効量または治療有効量は、合理的な利益／リスクの比率に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしに対象に投与できる量であるが、所望の効果、例えば、対象の状態の永続的または一時的な改善によって現れる治療または予防を提供するのに十分な量、と定義される。その量は、個人の年齢および一般的な状態、投与方法および他の要因に応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な有効量を指定することは不可能であるが、当業者は、日常的な実験および背景の一般知識を使用して、任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができる。この文脈での治療結果には、症状の根絶または軽減、痛みまたは不快感の軽減、生存期間の延長、可動性の改善、およびその他の臨床的改善のマーカーが含まれる。治療結果は完全な治療である必要はない。
【0044】
上記で定義された治療および有効量の文脈において、対象という用語（文脈が許す場合、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むと読まれるべきである）は、治療が必要な任意の対象、特に哺乳動物対象、と定義される。哺乳類の対象には、ヒト、家畜、農場の動物、動物園の動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、牛(cattle)、牛(cow)；類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類；犬やオオカミなどのイヌ科動物；猫、ライオン、トラなどのネコ科動物；馬、ロバ、シマウマなどの馬；牛、豚、羊などの食用動物；鹿やキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類；が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【0045】
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、典型的にはペプチド結合を介して５から５０個のアミノ酸モノマーから構成されるポリマーを指す。本発明のおよび本発明で使用するためのペプチド（その断片および変異体を含む）は、化学合成によって、または核酸からの発現によって、全体的または部分的に生成され得る。例えば、本発明のおよび本発明で使用するためのペプチドは、十分に確立された標準的な液体、または好ましくは、当技術分野で知られている固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができる（例えば、ＪＭスチュワートおよびＪＤヤング、固相ペプチド合成、第2版、ピアースケミカル社、イリノイ州ロックフォード（1984）、M ボダンツキーおよびA ボダンツキー、ペプチド合成の実践、スプリンガーベルラグ、ニューヨーク（1984）を参照）。必要に応じて、本発明で使用されるペプチドのいずれかを化学的に修飾して、それらの安定性を高めることができる。化学的に修飾されたペプチドまたはペプチド類似体は、本発明の実施に関してインビボまたはインビトロでのその増加した安定性および／または有効性を特徴とするペプチドの任意の機能的化学的同等物を含む。ペプチド類似体という用語はまた、本明細書に記載されるようなペプチドの任意のアミノ酸誘導体を指す。ペプチド類似体は、側鎖の修飾、ペプチド合成中の非天然アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、および架橋剤の使用、およびペプチドまたはそれらの類似体上にコンフォメーションの制約を課す他の方法を含むがこれらに限定されない手順によって生成することができる。側鎖の修飾の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とそれに続くNaBH4による還元；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアセチル化；シアネートによるアミノ基のカルバミル化；2, 4, 6 トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアルキル化；ピリドキサ-5'-ホスフェートによるリジンのピリドキシル化とそれに続くNaBH4による還元などによるアミノ基の修飾が含まれる。アルギニン残基のグアニジノ基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、グリオキサールなどの試薬との複素環式縮合生成物の形成によって修飾される場合がある。カルボキシル基は、o-アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、それに続く、例えば、対応するアミドへの誘導体化によって修飾することができる。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応； 4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノールおよび他の水銀を使用した水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでのシアネートによるカルバミル化などの方法によって修飾することができる。トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化などの方法によって修飾することができる。チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって3-ニトロチロシン誘導体を形成するよう変換されてもよい。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボナートによるN-カルベトキシル化によって達成することができる。ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン 、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド構造の修飾には、D-アミノ酸によってコードされる逆配列を含むレトロインベルソペプチドの生成が含まれる。
【0046】
「本発明のペプチド」という用語は、集合的に、配列番号１から２０から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれらから本質的になるペプチド、およびその治療上有効な変異体を指す。本発明のペプチドは、組換えペプチドであり得る。
【0047】
参照ペプチドに適用される「治療的に有効な変異体」という用語は、参照ペプチドと実質的に同一であり、以下に定義されるように治療的に有効であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。したがって、例えば、この用語は、１つ以上のアミノ酸残基に関して変更された変異体を含むと解釈されるべきである。好ましくは、そのような変更は、５以下、より好ましくは４以下、さらにより好ましくは３以下、最も好ましくは１または２アミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。天然および修飾アミノ酸の挿入、付加および置換が想定されている。変異体は保存的なアミノ酸変化を有する可能性があり、導入されるアミノ酸は、構造的、化学的、または機能的に、置換されるものと類似している。一般に、変異体は、参照抗菌フラグメントと、少なくとも70％のアミノ酸配列相同性、好ましくは少なくとも80％の配列相同性、より好ましくは少なくとも90％の配列相同性、理想的には少なくとも95％、96％、97％、98％または99％配列相同性を有するであろう。本明細書では、「配列同一性」という用語は、配列同一性と類似性の両方を含むと理解されるべきである。すなわち、参照配列と70％の配列同一性を共有する変異体（または相同体）は、配列の全長にわたって、変異体（または相同体）の整列した残基の任意の70％が、参照配列の対応する残基の同一または保存的置換である変異体（または相同体）である。配列同一性は、2つの異なる配列間で正確に一致する文字の量である。ここで、ギャップはカウントされず、測定は2つの配列のうち短い方に関係する。用語「配列相同性」に関して、この用語は、変異体（または相同体）の整列した残基のパーセンテージが参照配列の対応する残基と同一であるかまたはその保存的置換であり、かつ、変異体（または相同体）が参照配列と同じ機能を共有する場合に、参照配列と定義されたパーセント類似性または同一性を共有することを意味すると理解されるべきである。
【0048】
このアラインメントおよび相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用して決定することができ、例えば、1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するBLASTである。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見つけることができる：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。
【0049】
筋肉合成の文脈で本発明のペプチドに適用される「治療上有効な」とは、以下に記載されるホスホ-S6細胞アッセイにおいて、対照と比較して、rpS6リン酸化の有意な増加をもたらすことができるペプチドを意味する。これは、特に配列番号１～３、８～１２および１６～２０のペプチドに当てはまる。
【0050】
免疫または炎症反応をサポートするという文脈で本発明のペプチドに適用される「治療上有効な」とは、以下に記載されるTNF-α分泌細胞アッセイにおいて、対照と比較して、THP-1マクロファージにおけるTNF-α分泌を減少させることができるペプチドを意味する。これは、特に配列番号２、８および１３～１５のペプチドに当てはまる。
【0051】
「組成物」：本発明はまた、本発明のペプチドの１つ以上を含む組成物に関する。ペプチド、またはペプチドの一部もしくはすべては、修飾されるか、またはコンジュゲートとして提供され得る。組成物は、食品成分粉末、食品飲料、栄養サプリメント、医薬組成物、または局所組成物であり得る。一実施形態では、組成物は、スポーツ栄養製品、例えば、飲料、スナック、またはサプリメントである。一実施形態では、組成物は飲料である。一実施形態では、組成物はベーカリー製品である。一実施形態では、組成物は乳製品である。一実施形態では、組成物はスナック製品である。一実施形態では、組成物は、焼成された押し出し食品である。一実施形態では、組成物は粉乳である。一実施形態では、組成物は乳児用調製粉乳製品である。一実施形態では、組成物は菓子製品である。一実施形態では、組成物はヨーグルトである。一実施形態では、組成物はヨーグルト飲料である。一実施形態では、組成物はアイスクリーム製品である。一実施形態では、組成物は冷凍食品である。一実施形態では、組成物は朝食用シリアルである。一実施形態では、組成物はパンである。一実施形態では、組成物はフレーバーミルク飲料である。一実施形態では、組成物はコンフェクショナリー・バーである。一実施形態では、組成物は茶または茶製品である。一実施形態では、組成物は押し出しスナック製品のベースである。一実施形態では、組成物は揚げスナック製品である。一実施形態では、組成物は栄養サプリメントである。一実施形態では、組成物はスポーツ栄養製品である。一実施形態では、組成物はベビーフード製品である。一実施形態では、組成物は、免疫力が低下した個体のための特殊食品である。一実施形態では、組成物は老人患者のための食品である。一実施形態では、組成物は動物飼料である。一実施形態では、組成物は動物飼料サプリメントである。一実施形態では、組成物は医療用食品である。
【0052】
本組成物は局所組成物または薬学的組成物であり得る。本発明のペプチドは、所望の効果を達成するために、治療上有効な濃度で；組成物の総重量に関して、0.00000001％（重量）から20％（重量）の間の好ましい形態で；好ましくは0.000001％（重量）から15％（重量）、より好ましくは0.0001％（重量）から10％（重量）、さらにより好ましくは0.0001％（重量）から5％（重量）で、本発明の局所または医薬組成物に使用される。理想的には、本発明のペプチドは、好ましくは、組成物の約0.00001％ｗ／ｗから約0.5％ｗ／ｗ［0.1から5000ppm］、より好ましくは、0.00005ｗ／ｗから約0.05ｗ／ｗ［0.5から500ppm］、最も好ましくは、約0.0001ｗ／ｗから約0.01ｗ／ｗ［1から100ppm]で使用される。理想的には、本発明のペプチドは、好ましくは、組成物の約0.0001％ｗ／ｗから約0.004％ｗ／ｗで使用される。
【0053】
食品および食品または栄養サプリメントで使用するための本発明の組成物（すなわち、食用組成物）の投与量は、広く、０．２～１００ｇ／日の範囲である。一実施形態では、１日投与量は、１～１０ｇ／日、理想的には約３～８ｇ／日である。一実施形態では、１日投与量は１０～２０ｇ／日である。一実施形態では、１日投与量は、２０～３０ｇ／日である。一実施形態では、１日投与量は３０～４０ｇ／日である。一実施形態では、１日投与量は１０～２０ｇ／日である。一実施形態では、１日投与量は、約５ｇ／日、理想的には約３～８ｇ／日である。一実施形態では、投与量は、２～１０００ｍｇ／日／ｋｇ体重である。一実施形態では、投与量は１０～５００ｍｇ／日／ｋｇ体重である。一実施形態では、投与量は、１０～１００ｍｇ／日／ｋｇ体重である。一実施形態では、投与量は３０～７０ｍｇ／日／ｋｇ体重である。食品サプリメントのための本発明のペプチドの投与量は、１日あたり0.00001mg～0.01mgまたは用量であり得る。
【0054】
食品は、特定の薬用食品（FSMP）である場合があり、これは、医学的監督下で治療されている個人の疾患、障害、または病状の食事管理を目的として特別に配合、加工、および意図された食品として定義される。これらの食品は、通常の食品では栄養要件を満たすことができない人々の排他的または部分的な栄養補給を目的としている。投与量は、患者の年齢と状態に応じて、1日あたり50～500gとすることができる。特別な医療目的の食品または医療食品として投与される場合、1日の投与量は50～500gとすることができる。
【0055】
「局所組成物」：本発明はまた、本発明のペプチドまたは組成物を含む局所組成物に関する。局所組成物は、複数のペプチドを含み得ることが理解されよう。一実施形態では、局所組成物は、実質的にすべてのペプチドを含む。本発明の局所組成物は、クリーム、複数のエマルション、無水組成物、水性分散液、油、ミルク、バルサム、発泡体、ローション、ゲル、クリームゲル、水性アルコール溶液、水性グリコール溶液、化粧品、パーソナルケア製品、ハイドロゲル、リニメント、血清、石鹸、ダスティングパウダー、ペースト、半固形製剤、リニメント、血清、シャンプー、コンディショナー、軟膏、リンスオフ製剤、タルク、ムース、粉末、スプレー、エアロゾル、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル、多糖類フィルム、パッチ、ゲルパッチ、包帯、接着剤システム、油中水型エマルション、水中油型エマルション、およびシリコーンエマルションからなる群から選択される製剤で提示することができる。
【0056】
「医薬組成物」：本発明のさらなる態様は、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、賦形剤または担体と混合された、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドの組成物を含む医薬組成物に関する。本発明のペプチドおよび組成物は単独で投与することができるが、それらは一般に、特にヒトの治療のために、医薬担体、賦形剤または希釈剤と混合して投与されるであろう。医薬組成物は、ヒトおよび獣医学におけるヒトまたは動物の使用のためのものであり得る。本明細書に記載の様々な異なる形態の医薬組成物に対するそのような適切な賦形剤の例は、A WadeおよびP J Weller編集の「ハンドブック・オブ・ファーマシューティカル・エクシピエント、第２版」（１９９４）に見出すことができる。特に、局所送達のための製剤は、David OsborneおよびAntonio Aman編集のTopical drug delivery formulations, Taylor＆Francisに記載されており、その完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。治療的使用のための許容可能な担体または希釈剤は、製薬分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.に記載されている。（A.R.ジェンナーロ編集、1985）。適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、および水が含まれる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣行を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールが含まれる。適切な滑沢剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。防腐剤、安定剤、染料、さらには香味料さえも医薬組成物中に提供され得る。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびpヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁剤も使用され得る。
【0057】
本発明のペプチドまたは組成物は、局所、経口、直腸、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、膣、頬または舌下の投与経路に適合させることができる。経口投与の場合、圧縮錠剤、丸薬、錠剤、ゲルル(gellules)、ドロップ、およびカプセルが特に使用される。好ましくは、これらの組成物は、１回あたり１から２５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇの有効成分を含む。他の投与形態は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内に注射することができ、滅菌または滅菌可能な溶液から調製される溶液または乳濁液を含む。本発明の医薬組成物はまた、坐剤、膣リング、ペッサリー、懸濁液、乳濁液、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液またはダスティングパウダーの形態であり得る。本発明の組成物は、局所送達のために処方することができる。局所送達は、一般に、皮膚への送達を意味するが、上皮細胞、例えば、肺または気道、胃腸管、頬腔で裏打ちされた体腔への送達を意味することもある。特に、局所送達のための製剤は、David OsborneおよびAntonio Aman編集のTopical drug delivery formulations, Taylor＆Francisに記載されており、その完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。気道に送達するための組成物または製剤は、O'Riordanらによる（Respir Care, 2002, Nov.47）、EP2050437、WO2005023290、US2010098660、およびUS20070053845に記載されている。回腸、特に近位回腸に活性成分を送達するための組成物および製剤は、活性剤が、耐酸性であるが、よりアルカリ性の回腸の環境で溶解しやすいポリマーまたは乳タンパク質で形成された保護マトリックス内にカプセル化される微粒子およびマイクロカプセル化物を含む。このような送達システムの例は、EP1072600.2およびEP13171757.1に記載されている。経皮投与の代替手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、有効成分は、ポリエチレングリコールまたは流動パラフィンの水性エマルションからなるクリームに組み込むことができる。有効成分はまた、必要に応じてそのような安定剤および防腐剤とともに、白色ワックスまたは白色軟パラフィンベースからなる軟膏に、１から１０重量％の濃度で組み込むことができる。
【0058】
注射可能な形態は、1回あたり１０～１０００mg、好ましくは１０～２５０mgの有効成分を含み得る。
組成物は、単位剤形、すなわち、単位用量を含む別個の部分の形態、または単位用量の複数またはサブユニットの形態で処方することができる。
組成物は、単位剤形、すなわち、単位用量を含む別個の部分の形態、または単位用量の複数またはサブユニットの形態で処方することができる。
【0059】
当業者は、過度の実験なしに、対象に投与するための本組成物の１つの適切な用量を容易に決定することができる。通常、医師は個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、それは使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性と作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与のモードと時間、排泄率、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、および治療を受けている個人を含む種々の要因に依存するであろう。本明細書に開示される投薬量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高いまたはより低い投与量範囲がメリットとなる個々の例があり得、そのようなものは本発明の範囲内にある。必要に応じて、薬剤は、０．０１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。例示的な実施形態では、１０から３００ｍｇ／日またはより好ましくは１０から１５０ｍｇ／日の１回または複数の用量が、炎症性障害の治療のために患者に投与される。
【0060】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法および使用は、１つ以上の他の活性剤、例えば、市場で入手可能な既存の抗菌薬または薬理学的増強剤と組み合わせた本発明のペプチドまたは組成物の投与を含む。そのような場合、本発明の化合物は、１つまたは複数の他の活性剤と連続して、同時にまたは順次投与することができる。
【0061】
本発明の一実施形態において、本発明のペプチドは、インビボでのコンジュゲートの半減期を増加させることを目的とした、ペプチド、リンカー、および抗体分子を含むコンジュゲートの形態で投与され得る。
【0062】
修飾ペプチド
「修飾ペプチド」：一実施形態では、本発明のペプチド（ペプチド変異体を含む）は、修飾ペプチドであり得る。「修飾ペプチド」という用語は、ペプチドの誘導体という用語と交換可能に使用される。一実施形態では、「修飾ペプチド」という用語は、非修飾ペプチドと比較して以下の特性の１つまたは複数を示すように修飾されたペプチドを意味する：血漿半減期の延長；ペプチドの親油性の増加；修飾ペプチドの腎クリアランスの増加；通常、rpS6リン酸化活性を保持しながら、タンパク質分解に対する修飾ペプチドの耐性の向上。これらの特性を示すように本発明のペプチドを修飾する様々な方法が本明細書に開示され、ペプチドと結合パートナー（例えば、アルブミン結合小分子、大型高分子、長寿命血漿タンパク質、または抗体または抗体フラグメント）との結合、環化、N末端またはC末端、または側鎖の付加、保護基、L-アミノ酸のD-異性体への置換、アミノ酸修飾、血漿タンパク質結合の増加、アルブミン結合の増加を含む。修飾ペプチドは、本明細書で定義される１つ以上の基で置換されているか、結合パートナーと結合しているか、または環化されているペプチドを含むが、これに限定されない。一般に、ペプチドは、動物の生体内での半減期を延長するように修飾される。さまざまな変更方法を以下に示す。
「修飾ペプチド」：一実施形態では、本発明のペプチド（ペプチド変異体を含む）は、修飾ペプチドであり得る。「修飾ペプチド」という用語は、ペプチドの誘導体という用語と交換可能に使用される。一実施形態では、「修飾ペプチド」という用語は、非修飾ペプチドと比較して以下の特性の１つまたは複数を示すように修飾されたペプチドを意味する：血漿半減期の延長；ペプチドの親油性の増加；修飾ペプチドの腎クリアランスの増加；通常、rpS6リン酸化活性を保持しながら、タンパク質分解に対する修飾ペプチドの耐性の向上。これらの特性を示すように本発明のペプチドを修飾する様々な方法が本明細書に開示され、ペプチドと結合パートナー（例えば、アルブミン結合小分子、大型高分子、長寿命血漿タンパク質、または抗体または抗体フラグメント）との結合、環化、N末端またはC末端、または側鎖の付加、保護基、L-アミノ酸のD-異性体への置換、アミノ酸修飾、血漿タンパク質結合の増加、アルブミン結合の増加を含む。修飾ペプチドは、本明細書で定義される１つ以上の基で置換されているか、結合パートナーと結合しているか、または環化されているペプチドを含むが、これに限定されない。一般に、ペプチドは、動物の生体内での半減期を延長するように修飾される。さまざまな変更方法を以下に示す。
【0063】
一実施形態では、修飾は、細胞に浸透する能力が増加した本発明のペプチドおよび／または組成物を提供する任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの半減期を増加させる任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの活性を増加させる任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの選択性を増加させる任意の修飾であり得る。
一実施形態では、基は保護基である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であり得る。ペプチドは、これらの保護基の１つ以上を有し得る。
一実施形態では、基は保護基である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であり得る。ペプチドは、これらの保護基の１つ以上を有し得る。
【0064】
当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための適切な技術を知っている。これらは、当技術分野で知られている調製方法、例えば、US2014120141の段落[0104]から[0107]に概説されている方法によって加えることができる。その基はペプチド上に残っていてもよいし、除去されていてもよい。保護基は、合成中に付加されてもよい。
【0065】
本発明の実施形態において、ペプチドは、1から29個の炭素原子を有する、１つ以上の直鎖または分枝鎖、長鎖または短鎖、飽和または不飽和、ヒドロキシル、アミノ、アミノアシル、硫酸塩または硫化物基で置換されたまたは 非置換のものから選択される基で置換されていてもよい。Ｎ－アシル誘導体には、酢酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オクタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、イソステリン酸、エライド酸 、2-エチルヘキサン酸、ココナッツオイル脂肪酸、獣脂脂肪酸、硬化獣脂脂肪酸、パームカーネル脂肪酸、ラノリン脂肪酸または同様の酸に由来するアシル基が含まれる。これらは、置換または非置換であり得る。置換される場合、それらは、ヒドロキシル、またはＳＯ３Ｈ、ＳＨ、またはＳ－Ｓなどで置換されることが好ましいが、これらに限定されない。
【0066】
本発明の一実施形態では、ペプチドはＲ１－Ｘ－Ｒ２である。
Ｒ１および/またはＲ２基はペプチド配列のアミノ末端（N末端）およびカルボキシル末端（C末端）にそれぞれ結合している。
一実施形態では、ペプチドはＲ１－Ｘである。あるいは、ペプチドはＸ－Ｒ２である。
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルである。
Ｘは本発明のペプチドである。
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２である。
Ｒ１および/またはＲ２基はペプチド配列のアミノ末端（N末端）およびカルボキシル末端（C末端）にそれぞれ結合している。
一実施形態では、ペプチドはＲ１－Ｘである。あるいは、ペプチドはＸ－Ｒ２である。
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルである。
Ｘは本発明のペプチドである。
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２である。
【0067】
一実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、非環状の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換ヘテロシクリル、置換または非置換ヘテロアリールアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）およびＲ５－ＣＯ－により形成される群から選択され、ここで、Ｒ５は、Ｈ、非環状の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換ヘテロシクリルおよび置換または非置換ヘテロアリールアルキルにより形成される群から選択され；
Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３および－ＳＲ３によって形成される群から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、非環式の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換ヘテロシクリル、置換または非置換ヘテロアリールアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換アラルキルによって形成される群から独立して選択され；そして、Ｒ１とＲ２はα-アミノ酸ではない。
Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３および－ＳＲ３によって形成される群から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、非環式の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換ヘテロシクリル、置換または非置換ヘテロアリールアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換アラルキルによって形成される群から独立して選択され；そして、Ｒ１とＲ２はα-アミノ酸ではない。
【0068】
別の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３または－ＳＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換Ｃ１－Ｃ２４アルキル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルケニル、Tert-ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルキニル、置換または非置換Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル、置換または非置換Ｃ５－Ｃ２４シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ８－Ｃ２４シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ６－Ｃ３０アリール、置換または非置換Ｃ７－Ｃ２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換ヘテロシクリル環、および、２～２４個の炭素原子と１～３個の炭素以外の原子を有しアルキル鎖が1～6個の炭素原子である、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、によって形成される群から独立して選択される。任意選択で、Ｒ３およびＲ４は、飽和または不飽和の炭素－炭素結合によって結合され、窒素原子と共に環を形成してもよい。より好ましくは、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４または－ＯＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換Ｃ１－Ｃ２４アルキル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルケニル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルキニル、置換または非置換Ｃ３－Ｃ１０シクロアルキル、置換または非置換Ｃ６－Ｃ１５アリールおよび３～１０員の置換または非置換ヘテロシクリル、３～１０員の環および１～6炭素原子のアルキル鎖を有する置換または非置換ヘテロアリールアルキル、により形成される群から独立して選択される。より好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、またはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、またはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらにより好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＯＨおよび－ＮＨ２から選択される。
【0069】
本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、Ｈ、アセチル、ラウロイル、ミリストイルまたはパルミトイルによって形成される群から選択され、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４または－ＯＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシルおよびヘキサデシルから独立して選択され、好ましくは、Ｒ２は－ＯＨまたは－ＮＨ２である。より好ましくは、Ｒ１はアセチルまたはパルミトイルであり、Ｒ２は－ＮＨ２である。
好ましい実施形態において、アシル基は、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端に結合している。
好ましい実施形態において、アシル基は、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端に結合している。
【0070】
本発明の一実施形態では、ペプチドは、側鎖保護基を含むように修飾されている。側鎖保護基は、ベンジルまたはベンジルベースの基、t-ブチルベースの基、ベンジルオキシ-カルボニル（Z）基、およびアリルオキシカルボニル（alloc）保護基を含む基の1つ以上であり得る。側鎖保護基は、アキラルグリシンなどのアキラルアミノ酸に由来し得る。アキラルなアミノ酸の使用は、得られたペプチドを安定化するのに役立ち、また、本発明の簡便な合成経路を促進する。好ましくは、ペプチドは、修飾されたＣ末端、好ましくはアミド化されたＣ末端をさらに含む。アキラル残基は、α-アミノイソ酪酸（メチルアラニン）であり得る。使用される特定の側鎖保護基は、ペプチドの配列および使用されるＮ末端保護基のタイプに依存することが理解されよう。
【0071】
本発明の一実施形態において、ペプチドは、１つ以上のポリエチレングリコールポリマーまたは分子量増加化合物などの他の化合物にコンジュゲート、連結、または融合される。分子量増加化合物は、分子量を、典型的には、得られるコンジュゲートの１０％から９０％、または２０％から５０％増加させる任意の化合物であり、２００から２０，０００、好ましくは５００から１０，０００の間の分子量を有し得る。分子量増加化合物は、PEG、任意の水溶性（両親媒性または親水性）ポリマー部分、PEGのホモまたはコポリマー、PEGのモノメチル置換ポリマー（mPEG）およびポリオキシエチレングリセロール（POG）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸、特にそれらのLコンフォメーションのもの、アルブミン、ゼラチンなどの薬理学的に不活性なタンパク質、脂肪酸、オリゴ糖、脂質アミノ酸およびデキストランであってもよい。ポリマー部分は、直鎖または分枝状であってよく、５００から４００００Ｄａ、５０００から１００００Ｄａ、１００００から５０００Ｄａの分子量を有し得る。化合物は、tatペプチド、ペネトラチン、pep-1などの任意の適切な細胞透過性化合物であり得る。化合物は抗体分子であり得る。化合物は、親油性部分またはポリマー部分であり得る。
【0072】
親油性置換基および高分子置換基は当技術分野において公知である。親油性置換基には、アシル基、スルホニル基、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミドまたはスルホンアミドの一部を形成するＮ原子、Ｏ原子、またはＳ原子が含まれる。親油性部分は、４から３０個のＣ原子、好ましくは８から１２個のＣ原子を有する炭化水素鎖を含み得る。それは、線状または分枝状、飽和または不飽和であり得る。炭化水素鎖はさらに置換されていてもよい。それはシクロアルカンまたはヘテロシクロアルカンであり得る。
【0073】
ペプチドは、N末端、C末端、またはその両方で修飾されていてもよい。ポリマーまたは化合物は、好ましくは、アミノ、カルボキシル、またはチオ基に連結されていることが好ましく、任意のアミノ酸残基の側鎖のＮ末端またはＣ末端によって連結されていてもよい。ポリマーまたは化合物は、任意の適切な残基の側鎖にコンジュゲートされていてよい。
【0074】
ポリマーまたは化合物は、スペーサーを介してコンジュゲートすることができる。スペーサーは、天然または非天然アミノ酸、コハク酸、リシル、グルタミル、アスパラギル、グリシル、ベータアラニル、ガンマアミノブタノイルであり得る。
【0075】
ポリマーまたは化合物は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド、カルバメート、尿素、スルホンアミドを介してコンジュゲートすることができる。
当業者は、記載されたコンジュゲートを調製するための適切な手段を知っている。
当業者は、記載されたコンジュゲートを調製するための適切な手段を知っている。
【0076】
ペプチドは、例えば、ポリマーへの共有結合によって化学的に修飾して、循環半減期を延ばすことができる。例示的なポリマーおよびそのようなポリマーをペプチドに付着させる方法は、例えば、米国特許第4,766,106号；4,179,337号；4,495,285号；および4,609,546号に示されている。追加の例示的なポリマーには、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）部分が含まれる。
【0077】
本発明のペプチドは、貯蔵安定性、薬物動態、および／または例えば効力、選択性、および薬物相互作用などのペプチドの生物活性の任意の態様を操作するための１つ以上の修飾を受けることができる。ペプチドが受ける可能性のある化学修飾には、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ-（N-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体のうちの1つ以上のものの、ペプチドへのコンジュゲートが含まれるが、それに限定されない。Cys残基でのタンパク質のPEGコンジュゲーションは、例えば、Goodson, RJ＆Katre, N. V.（1990）Bio/Technology 8、343およびKogan, T. P.（1992）Synthetic Comm. 22, 2417に開示されている。
【0078】
修飾ペプチドはまた、1つ以上の残基が修飾されている配列（すなわち、リン酸化、硫酸化、アシル化、PEG化などによって）、および親配列に関して1つ以上の修飾残基を含む変異体を含み得る。アミノ酸配列はまた、放射性同位元素、蛍光、および酵素標識を含むがこれらに限定されない、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾され得る。蛍光標識には、例えば、Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、フルオレセイン（例えば、FluorX、DTAF、およびFITC）、ローダミン（例えば、TRITC）、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルー、およびルシファーイエローが含まれる。好ましい同位体標識には、3H、14C、32 P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および286Reが含まれる。好ましい酵素標識には、ペルオキシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる（例えば、米国特許第３，６５４，０９０号；３，８５０，７５２号；および４，０１６，０４３号を参照）。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によってコンジュゲートすることができる。酵素標識は、視覚的に検出することも、熱量測定、分光光度法、蛍光分光光度法、アンペロメトリー、またはガス測定法で測定することもできる。アビジン/ビオチン、チラミドシグナル増幅（TSA（登録商標））などの他の標識システムは当技術分野で知られており、市販されている（例えば、ABCキット、Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Calif.; NEN（登録商標）、Life Science Products, Inc., Boston, Mass.を参照）。）。
【0079】
一実施形態では、ペプチド、変異体、および／または組成物は、薬物性能能力を高めるように修飾される。一実施形態では、ペプチド、変異体および／または組成物は、安定性、透過性を増加させ、効力を維持し、毒性を回避し、および／または半減期を増加させるように修飾される。修飾は上記のとおりであり得る。例えば、修飾は、ＮおよびＣ末端を保護することであってよく、それは、修飾されたアミノ酸、環化、アミノ酸の置換、および／または高分子または大きなポリマーまたは長寿命血漿タンパク質への結合であり得る。半減期を延長するための戦略は、Strohlら（BioDrugs、2015）、Schlapschyら、（Protein Eng Des Sel. 2013）、Podust、VNら（Protein Eng Des Sel. 2013）、Zhang、Lら（Curr Med Chem. 2012）、Gaberc-Porekar、Vら（Curr Opin Drug Discov Devel. 2008）により開示されたものであってよい。例として、PEG化、脂質化（ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合）、Fcドメインおよびヒト血清アルブミンへの融合、親水性アミノ酸ポリマー（XTENまたはPASなど）との融合、および/または半減期延長タンパク質との融合が挙げられる。
【0080】
ペプチドのインビボ半減期を延長するためのペプチドの修飾は、例えば以下の文献に記載されている：
【0081】
Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs.（ペプチドおよびタンパク質薬物の血漿半減期を改善するための戦略） Werle M, Bernkop-Schnurch A. Amino Acids. 2006 Jun; 30(4): 351-67.
長時間作用型ペプチドおよびタンパク質薬物の明らかな利点のために、そのような化合物の血漿半減期を延長するための戦略が非常に求められている。血漿半減期が短いのは、一般に、腎クリアランスが速いことと、体循環中に起こる酵素分解が原因である。ペプチド/タンパク質の修飾は、血漿半減期の延長につながる可能性がある。ソマトスタチンの全体的なアミノ酸量を短縮し、L：-アナログアミノ酸をD：-アミノ酸に置き換えることにより、誘導体オクトレオチドの血漿半減期は、ソマトスタチンではわずか数分であるのに対して、1.5時間であった。INF-alpha-2bのPEG（2,40 K）コンジュゲートは、ネイティブタンパク質と比較して330倍延長された血漿半減期を示した。このレビューの目的は、N末端およびC末端の修飾やPEG化などの血漿半減期を延長するための可能な戦略の概要と、薬物修飾の有効性を評価する方法を提供することであった。さらに、体循環中のペプチドおよびタンパク質薬物の酵素的切断を予測するために、ヒトの血液、肝臓、および腎臓の最も重要なタンパク質分解酵素、ならびにそれらの切断特異性およびそれらの阻害剤に関する基本的なデータが提供される。
長時間作用型ペプチドおよびタンパク質薬物の明らかな利点のために、そのような化合物の血漿半減期を延長するための戦略が非常に求められている。血漿半減期が短いのは、一般に、腎クリアランスが速いことと、体循環中に起こる酵素分解が原因である。ペプチド/タンパク質の修飾は、血漿半減期の延長につながる可能性がある。ソマトスタチンの全体的なアミノ酸量を短縮し、L：-アナログアミノ酸をD：-アミノ酸に置き換えることにより、誘導体オクトレオチドの血漿半減期は、ソマトスタチンではわずか数分であるのに対して、1.5時間であった。INF-alpha-2bのPEG（2,40 K）コンジュゲートは、ネイティブタンパク質と比較して330倍延長された血漿半減期を示した。このレビューの目的は、N末端およびC末端の修飾やPEG化などの血漿半減期を延長するための可能な戦略の概要と、薬物修飾の有効性を評価する方法を提供することであった。さらに、体循環中のペプチドおよびタンパク質薬物の酵素的切断を予測するために、ヒトの血液、肝臓、および腎臓の最も重要なタンパク質分解酵素、ならびにそれらの切断特異性およびそれらの阻害剤に関する基本的なデータが提供される。
【0082】
Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties.（ペプチドADME特性を最適化するための戦略的アプローチ） Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17（1）：134-143.
タンパク質分解からペプチドを安定化するための戦略
構造修飾を通じてペプチドの安定性を高めるために、多くのアプローチが利用可能である。いくつかのアプローチは、安定性を向上させるだけでなく、他のADME特性を強化する。たとえば、環化は安定性と透過性を高めることができ、高分子へのコンジュゲートは、安定性を改善し、腎クリアランスを低下させることができる。ペプチドの安定性とADME特性を改善しながら、効力を維持し、毒性を回避することが重要である。
・N末端とC末端の保護
血液/血漿、肝臓または腎臓の多くのタンパク質分解酵素は、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼであり、N末端およびC末端からペプチド配列を分解する。N末端または/およびC末端の修飾により、ペプチドの安定性が向上することがよくある。多くの例で、N-アセチル化とC-アミド化がタンパク質分解に対する耐性を高めることが報告されている。
・L-アミノ酸からD-アミノ酸への置換
天然のL-アミノ酸を非天然のD-アミノ酸で置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識と結合親和性が低下し、安定性が向上する。一例として、バソプレッシンがある。これは、L-アルギニンを含み、ヒトでの半減期は10～35分である。D-Argアナログであるデスモプレッシンの半減期は健康なヒトのボランティアで3.7時間である。癌関連プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）の二環式ペプチド阻害剤の研究では、特定のグリシンをD-セリンに置き換えると、効力が1.8倍向上するだけでなく、マウス血漿での安定性も4倍向上する。
・アミノ酸の修飾
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入したり、酵素認識を妨害したりすることにより、ペプチドの安定性を向上させることができる。たとえば、ゴナドトロピン放出ホルモンの半減期は非常に短い（数分）のに対し、1つのGlyがt-ブチル-D-Serに置き換えられ、別のGlyがエチルアミドに置き換えられたブセレリンのヒトでの半減期ははるかに長い。
・環化
環化はコンフォメーションの制約をもたらし、ペプチドの柔軟性を低下させ、安定性と透過性を高める。官能基に応じて、ペプチドは頭から尾、頭/尾から側鎖、または側鎖から側鎖に環化することができる。環化は通常、ラクタム化、ラクトン化、および硫化物ベースのブリッジを介して行われる。ジスルフィド架橋は、折り畳みおよび立体配座の制約を形成し、効力、選択性、および安定性を向上させることができる。リナクロチド、レピルジン、およびジコノチドなど、多くのジスルフィド結合に富むペプチドが市場に出回っているか、前臨床または臨床開発中である。オンレジン環化、側鎖環化（ラクタムブリッジ）、直交カップリングによる環化、酵素触媒環化、ペプチドのサイズに特異的な環化、およびチアゾール/オキサゾール環を含む環状ペプチドを含む、ペプチドの環化の多くの方法が、Daviesら（J. Peptide Sci, 9: 471-501（2003））に記載されている。
・高分子へのコンジュゲート
高分子（例、ポリエチレングリコール（PEG）、アルブミン）へのコンジュゲートは、ペプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを低下させるための効果的な戦略である。
タンパク質分解からペプチドを安定化するための戦略
構造修飾を通じてペプチドの安定性を高めるために、多くのアプローチが利用可能である。いくつかのアプローチは、安定性を向上させるだけでなく、他のADME特性を強化する。たとえば、環化は安定性と透過性を高めることができ、高分子へのコンジュゲートは、安定性を改善し、腎クリアランスを低下させることができる。ペプチドの安定性とADME特性を改善しながら、効力を維持し、毒性を回避することが重要である。
・N末端とC末端の保護
血液/血漿、肝臓または腎臓の多くのタンパク質分解酵素は、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼであり、N末端およびC末端からペプチド配列を分解する。N末端または/およびC末端の修飾により、ペプチドの安定性が向上することがよくある。多くの例で、N-アセチル化とC-アミド化がタンパク質分解に対する耐性を高めることが報告されている。
・L-アミノ酸からD-アミノ酸への置換
天然のL-アミノ酸を非天然のD-アミノ酸で置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識と結合親和性が低下し、安定性が向上する。一例として、バソプレッシンがある。これは、L-アルギニンを含み、ヒトでの半減期は10～35分である。D-Argアナログであるデスモプレッシンの半減期は健康なヒトのボランティアで3.7時間である。癌関連プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）の二環式ペプチド阻害剤の研究では、特定のグリシンをD-セリンに置き換えると、効力が1.8倍向上するだけでなく、マウス血漿での安定性も4倍向上する。
・アミノ酸の修飾
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入したり、酵素認識を妨害したりすることにより、ペプチドの安定性を向上させることができる。たとえば、ゴナドトロピン放出ホルモンの半減期は非常に短い（数分）のに対し、1つのGlyがt-ブチル-D-Serに置き換えられ、別のGlyがエチルアミドに置き換えられたブセレリンのヒトでの半減期ははるかに長い。
・環化
環化はコンフォメーションの制約をもたらし、ペプチドの柔軟性を低下させ、安定性と透過性を高める。官能基に応じて、ペプチドは頭から尾、頭/尾から側鎖、または側鎖から側鎖に環化することができる。環化は通常、ラクタム化、ラクトン化、および硫化物ベースのブリッジを介して行われる。ジスルフィド架橋は、折り畳みおよび立体配座の制約を形成し、効力、選択性、および安定性を向上させることができる。リナクロチド、レピルジン、およびジコノチドなど、多くのジスルフィド結合に富むペプチドが市場に出回っているか、前臨床または臨床開発中である。オンレジン環化、側鎖環化（ラクタムブリッジ）、直交カップリングによる環化、酵素触媒環化、ペプチドのサイズに特異的な環化、およびチアゾール/オキサゾール環を含む環状ペプチドを含む、ペプチドの環化の多くの方法が、Daviesら（J. Peptide Sci, 9: 471-501（2003））に記載されている。
・高分子へのコンジュゲート
高分子（例、ポリエチレングリコール（PEG）、アルブミン）へのコンジュゲートは、ペプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを低下させるための効果的な戦略である。
【0083】
腎クリアランス
多くのペプチドは、インビトロでは有望な薬理活性を示すが、インビボでの半減期が非常に短い（数分）ため、インビボでの有効性を示すことができない。ペプチドのクリアランスが速いことと半減期が短いことが、薬剤開発の成功の妨げとなっている。体循環からペプチドが急速にクリアランスされる主な原因は、酵素によるタンパク質分解または/および腎クリアランスである。糸球体の孔径は約8nmでありMW <2 -25kDaの親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を介した急速なろ過の影響を受けやすくなっている。ペプチドは尿細管から容易に再吸収されないため、腎クリアランスが高く、半減期が短い場合が多い。ペプチドクリアランスの他のマイナーな経路は、エンドサイトーシスとプロテアソームおよび肝臓による分解である。動物モデルにおける全身クリアランスと腎クリアランスの比較は、腎クリアランスが主要な排泄経路である可能性が高いかどうかに関する有用な情報を提供する。
腎機能障害のある患者の場合、腎機能障害のある患者への不適切な投与は毒性または効果のない治療を引き起こす可能性があるため、ペプチド薬の投与量を調整して、薬物の蓄積と高濃度の薬剤への曝露を避けることが必要になる場合がある。ペプチド腎クリアランスを減らし、半減期を延長するために、いくつかの戦略が開発された。次にこれらについて概説する。
・血漿タンパク結合性の向上
ペプチドが膜タンパク質または血清タンパク質に結合すると、ペプチドの腎クリアランスが低下する。例として、内分泌腫瘍の治療薬である環状ペプチド薬オクトレオチドがある。これは、リポタンパク質に結合するため、ヒトでの半減期は約100分である（非結合画分0.65）。
・アルブミン結合小分子への共有結合
アルブミン結合小分子をペプチドに共有結合させると、高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体濾過が低下し、タンパク質分解の安定性が向上し、半減期を延長できる。
・大きなポリマーへのコンジュゲート
ペプチドを大きな合成または天然のポリマーまたは炭水化物にコンジュゲートさせると、分子量と流体力学的体積が増加し、腎クリアランスが低下する可能性がある。ペプチドコンジュゲーションに使用される一般的なポリマーは、PEG、ポリシアル酸（PSA）、およびヒドロキシエチルスターチ（HES）である。
・長寿命血漿タンパク質への融合
アルブミンや免疫グロブリン（IgG）フラグメントなどの血漿タンパク質は、ヒトで19～21日の長い半減期を持つ。MWが高い（67～150 kDa）ため、これらのタンパク質は腎クリアランスが低く、新生児Fc受容体（FcRn）に結合すると、血管上皮による飲作用による排泄が減少する。ペプチドのアルブミンまたはIgGフラグメントへの共有結合させることで、腎クリアランスを低下させ、半減期を延長させることができる。
多くのペプチドは、インビトロでは有望な薬理活性を示すが、インビボでの半減期が非常に短い（数分）ため、インビボでの有効性を示すことができない。ペプチドのクリアランスが速いことと半減期が短いことが、薬剤開発の成功の妨げとなっている。体循環からペプチドが急速にクリアランスされる主な原因は、酵素によるタンパク質分解または/および腎クリアランスである。糸球体の孔径は約8nmでありMW <2 -25kDaの親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を介した急速なろ過の影響を受けやすくなっている。ペプチドは尿細管から容易に再吸収されないため、腎クリアランスが高く、半減期が短い場合が多い。ペプチドクリアランスの他のマイナーな経路は、エンドサイトーシスとプロテアソームおよび肝臓による分解である。動物モデルにおける全身クリアランスと腎クリアランスの比較は、腎クリアランスが主要な排泄経路である可能性が高いかどうかに関する有用な情報を提供する。
腎機能障害のある患者の場合、腎機能障害のある患者への不適切な投与は毒性または効果のない治療を引き起こす可能性があるため、ペプチド薬の投与量を調整して、薬物の蓄積と高濃度の薬剤への曝露を避けることが必要になる場合がある。ペプチド腎クリアランスを減らし、半減期を延長するために、いくつかの戦略が開発された。次にこれらについて概説する。
・血漿タンパク結合性の向上
ペプチドが膜タンパク質または血清タンパク質に結合すると、ペプチドの腎クリアランスが低下する。例として、内分泌腫瘍の治療薬である環状ペプチド薬オクトレオチドがある。これは、リポタンパク質に結合するため、ヒトでの半減期は約100分である（非結合画分0.65）。
・アルブミン結合小分子への共有結合
アルブミン結合小分子をペプチドに共有結合させると、高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体濾過が低下し、タンパク質分解の安定性が向上し、半減期を延長できる。
・大きなポリマーへのコンジュゲート
ペプチドを大きな合成または天然のポリマーまたは炭水化物にコンジュゲートさせると、分子量と流体力学的体積が増加し、腎クリアランスが低下する可能性がある。ペプチドコンジュゲーションに使用される一般的なポリマーは、PEG、ポリシアル酸（PSA）、およびヒドロキシエチルスターチ（HES）である。
・長寿命血漿タンパク質への融合
アルブミンや免疫グロブリン（IgG）フラグメントなどの血漿タンパク質は、ヒトで19～21日の長い半減期を持つ。MWが高い（67～150 kDa）ため、これらのタンパク質は腎クリアランスが低く、新生児Fc受容体（FcRn）に結合すると、血管上皮による飲作用による排泄が減少する。ペプチドのアルブミンまたはIgGフラグメントへの共有結合させることで、腎クリアランスを低下させ、半減期を延長させることができる。
【0084】
Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy to Make Biobetters （バイオベターを作るための戦略としての生物製剤の半減期延長のための融合タンパク質）William R. Strohl BioDrugs. 2015; 29（4）：215-239.
【0085】
Schlapschy, M, Binder, U, Borger, C et al. PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins.（薬学的に活性なタンパク質の血漿半減期を延長するためのPEG化の生物学的代替法） Protein Eng Des Sel.2013; 26（8）：489-501.
【0086】
Podust, VN, Sim, BC, Kothari, D et al. Extension of in vivo half-life of biologically active peptides via chemical conjugation to XTEN protein polymer. （XTENタンパク質ポリマーへの化学的結合を介した生物学的に活性なペプチドのインビボ半減期の延長） Protein Eng Des Sel. 2013; 26（11）：743-53。
【0087】
Zhang, L, Bulaj, G. Converting Peptides into Drug Leads by Lipidation. （脂質化によるペプチドの薬物リードへの変換）Curr Med Chem. 2012; 19（11）：1602-18。
【0088】
Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B et al. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. （治療用タンパク質のPEG化における障害と落とし穴）Curr Opin Drug Discov Devel. 2008; 11（2）：242-50.
【0089】
ロナルドV.スワンソン博士による－ペプチド半減期延長技術の長寿命ペプチド進化と新たなハイブリッドアプローチ。オンラインのDrug Discovery World、2014年春、より。
【0090】
PEG化
親水性ポリマーであるポリエチレングリコールの長鎖を目的の分子に結合させることで、PEG化は元々、免疫系による外来タンパク質の認識を防ぎ、それによって治療薬としての有用性を可能にする修飾として考えられた。未修飾の薬物に対する抗体が一旦形成されると、タンパク質薬物は迅速に中和され、除去されてしまう。予期せぬことに、PEG化は抗薬物抗体がない場合でもタンパク質の薬物動態を改善した1。薬物分子を大きくするだけで、PEG化により、腎臓による薬物のろ過が遅くなった。サイズまたは流体力学的半径の増加が腎クリアランスの減少および半減期の増加につながるという経験的観察は、その後、タンパク質およびペプチド薬物のPEG化の主要な理論的根拠となった。PEG化は、タンパク質やペプチドをより水溶性にしたり、タンパク質分解酵素による分解から保護したりするなど、分子にさまざまな影響を与えることができる。PEG化は、治療用タンパク質の同族の細胞受容体への結合にも影響を及ぼし、通常は親和性を低下させる可能性がある。PEGポリマーのサイズ、構造、および結合様式の変化は、結合した薬物の生物活性に影響を与える可能性がある。
第一世代のPEG化法は課題に満ちていた。しかし、PEG化の化学は非常に単純である。このプロセスには、タンパク質またはペプチドの反応性側鎖へのポリエチレングリコール鎖の共有結合が含まれる。たとえば、PEGはタンパク質やペプチドの表面にあるリジンの-アミノ基に簡単に結合する2。反応はpHに依存する。高pH（8.0以上）では、リジン側鎖のアミノ基がN-ヒドロキシスクシンイミドを介してPEGに共有結合する。この方法では、通常、単一の個別の生成物ではなく、タンパク質のさまざまな部位にさまざまな数のPEG鎖が結合した生成物ファミリーが得られる3。最初に承認されたPEG化医薬品は、重症複合免疫不全症の酵素補充療法としてのPegademase bovine（PEG化ウシアデノシンデアミダーゼ）と急性リンパ芽球性白血病の治療のためのPegaspargase（PEG化アスパラギナーゼ）であった1。これらの薬剤は、さまざまなPEG化種の複雑な混合物であったが、血清半減期の延長やタンパク質の免疫原性の低下など、天然酵素よりも治療の特性が改善されていた。PEGに固有の多分散性のため、品質とバッチ間の再現性は困難であった。この制限にもかかわらず、多数のモノPEG化位置異性体の不均一な集団である2つのPEG化インターフェロン（ペグインターフェロンアルファ-2bおよびペグインターフェロンアルファ-2a）は、C型肝炎の治療のためにFDA承認されている。これらの薬剤はそれぞれ2001年と2002年に上市された。
基本的なPEG化技術には、さまざまな改良とバリエーションが加えられてきた。第２世代のPEG化プロセスでは、分岐構造の使用と、PEG付着のための代替化学物質が導入された。特に、マレイミドやヨードアセトアミドなどのシステイン反応性基を持つPEGは、ペプチドまたはタンパク質内の単一残基へのPEG化のターゲティングを可能にし、最終生成物の不均一性を低減するが、PEG自体の多分散性による不均一性を排除することはない。
PEG化の当初の理論的根拠は免疫原性を低下させることであったが、それにもかかわらず、免疫原性のPEG化タンパク質の例がいくつかある。一例は、痛風患者の血漿尿酸レベルを低下させる酵素であるPEG化尿酸オキシダーゼである。臨床試験では、痛風の患者の比較的高い割合が治療に反応せず、PEGに特異的であるがウリカーゼタンパク質には特異的ではない抗体を開発した2。PEG化リポソームは、一般的に非免疫原性であると考えられているが、いくつかの研究で免疫原性であることがわかっている。PEG化リポソームは強力な抗PEG免疫グロブリンM（IgM）応答を誘発する。さらに、PEG-グルクロニダーゼを複数回注射すると、特定の抗PEG IgM抗体の生成が誘発され、体からのPEG修飾タンパク質のクリアランスが促進されることが示された。
修飾剤としてPEGを使用することの主な潜在的な欠点は、それが非生分解性であるということである。米国食品医薬品局（FDA）は、注射用、局所用、直腸用、および鼻用の製剤を含む医薬品のビヒクルとして使用するためのPEGを承認した。PEGはほとんど毒性を示さず、腎臓（PEG <30 kDaの場合）または糞便（PEG> 20 kDaの場合）のいずれかによってそのまま体から排泄される1。動物へのいくつかのPEG化タンパク質の反復投与は、腎尿細管細胞空胞化の観察をもたらした。最近、脈絡叢上皮細胞の空胞化が、大きな（≧40kDa）PEGとコンジュゲートしたタンパク質を用いた毒性研究でも観察された。脈絡叢上皮細胞は脳脊髄液を産生し、血液CSFバリアを形成している。細胞空胞化の長期的な悪影響は不明であるが、それはいくつかの潜在的な治療法にとって望ましくない結果であることは確かである。考えられる代替案の1つは、PEGの代わりに生分解性ポリマーを使用することである。ヒドロキシエチルスターチ（HES）などのポリマーが代替案として考えられる。HESは無毒で生分解性であり、代用血漿として使用される。HES化のプロセスは、ペプチドの流体力学的半径を増加させることによって腎クリアランスを減少させるという点でPEG化と同様に機能しますが、生分解性のために蓄積の傾向が低くなる可能性がある。しかし、HESおよびその他の提案されている生分解性ポリマーPEGの代替品は、PEGと同様に多分散であり、最終生成物および代謝物の特性評価が困難である。両方の懸念を軽減する１つの新しい解決策は、ポリマー成分として定義されたポリペプチドを使用することである。このアプローチについては後述する。
親水性ポリマーであるポリエチレングリコールの長鎖を目的の分子に結合させることで、PEG化は元々、免疫系による外来タンパク質の認識を防ぎ、それによって治療薬としての有用性を可能にする修飾として考えられた。未修飾の薬物に対する抗体が一旦形成されると、タンパク質薬物は迅速に中和され、除去されてしまう。予期せぬことに、PEG化は抗薬物抗体がない場合でもタンパク質の薬物動態を改善した1。薬物分子を大きくするだけで、PEG化により、腎臓による薬物のろ過が遅くなった。サイズまたは流体力学的半径の増加が腎クリアランスの減少および半減期の増加につながるという経験的観察は、その後、タンパク質およびペプチド薬物のPEG化の主要な理論的根拠となった。PEG化は、タンパク質やペプチドをより水溶性にしたり、タンパク質分解酵素による分解から保護したりするなど、分子にさまざまな影響を与えることができる。PEG化は、治療用タンパク質の同族の細胞受容体への結合にも影響を及ぼし、通常は親和性を低下させる可能性がある。PEGポリマーのサイズ、構造、および結合様式の変化は、結合した薬物の生物活性に影響を与える可能性がある。
第一世代のPEG化法は課題に満ちていた。しかし、PEG化の化学は非常に単純である。このプロセスには、タンパク質またはペプチドの反応性側鎖へのポリエチレングリコール鎖の共有結合が含まれる。たとえば、PEGはタンパク質やペプチドの表面にあるリジンの-アミノ基に簡単に結合する2。反応はpHに依存する。高pH（8.0以上）では、リジン側鎖のアミノ基がN-ヒドロキシスクシンイミドを介してPEGに共有結合する。この方法では、通常、単一の個別の生成物ではなく、タンパク質のさまざまな部位にさまざまな数のPEG鎖が結合した生成物ファミリーが得られる3。最初に承認されたPEG化医薬品は、重症複合免疫不全症の酵素補充療法としてのPegademase bovine（PEG化ウシアデノシンデアミダーゼ）と急性リンパ芽球性白血病の治療のためのPegaspargase（PEG化アスパラギナーゼ）であった1。これらの薬剤は、さまざまなPEG化種の複雑な混合物であったが、血清半減期の延長やタンパク質の免疫原性の低下など、天然酵素よりも治療の特性が改善されていた。PEGに固有の多分散性のため、品質とバッチ間の再現性は困難であった。この制限にもかかわらず、多数のモノPEG化位置異性体の不均一な集団である2つのPEG化インターフェロン（ペグインターフェロンアルファ-2bおよびペグインターフェロンアルファ-2a）は、C型肝炎の治療のためにFDA承認されている。これらの薬剤はそれぞれ2001年と2002年に上市された。
基本的なPEG化技術には、さまざまな改良とバリエーションが加えられてきた。第２世代のPEG化プロセスでは、分岐構造の使用と、PEG付着のための代替化学物質が導入された。特に、マレイミドやヨードアセトアミドなどのシステイン反応性基を持つPEGは、ペプチドまたはタンパク質内の単一残基へのPEG化のターゲティングを可能にし、最終生成物の不均一性を低減するが、PEG自体の多分散性による不均一性を排除することはない。
PEG化の当初の理論的根拠は免疫原性を低下させることであったが、それにもかかわらず、免疫原性のPEG化タンパク質の例がいくつかある。一例は、痛風患者の血漿尿酸レベルを低下させる酵素であるPEG化尿酸オキシダーゼである。臨床試験では、痛風の患者の比較的高い割合が治療に反応せず、PEGに特異的であるがウリカーゼタンパク質には特異的ではない抗体を開発した2。PEG化リポソームは、一般的に非免疫原性であると考えられているが、いくつかの研究で免疫原性であることがわかっている。PEG化リポソームは強力な抗PEG免疫グロブリンM（IgM）応答を誘発する。さらに、PEG-グルクロニダーゼを複数回注射すると、特定の抗PEG IgM抗体の生成が誘発され、体からのPEG修飾タンパク質のクリアランスが促進されることが示された。
修飾剤としてPEGを使用することの主な潜在的な欠点は、それが非生分解性であるということである。米国食品医薬品局（FDA）は、注射用、局所用、直腸用、および鼻用の製剤を含む医薬品のビヒクルとして使用するためのPEGを承認した。PEGはほとんど毒性を示さず、腎臓（PEG <30 kDaの場合）または糞便（PEG> 20 kDaの場合）のいずれかによってそのまま体から排泄される1。動物へのいくつかのPEG化タンパク質の反復投与は、腎尿細管細胞空胞化の観察をもたらした。最近、脈絡叢上皮細胞の空胞化が、大きな（≧40kDa）PEGとコンジュゲートしたタンパク質を用いた毒性研究でも観察された。脈絡叢上皮細胞は脳脊髄液を産生し、血液CSFバリアを形成している。細胞空胞化の長期的な悪影響は不明であるが、それはいくつかの潜在的な治療法にとって望ましくない結果であることは確かである。考えられる代替案の1つは、PEGの代わりに生分解性ポリマーを使用することである。ヒドロキシエチルスターチ（HES）などのポリマーが代替案として考えられる。HESは無毒で生分解性であり、代用血漿として使用される。HES化のプロセスは、ペプチドの流体力学的半径を増加させることによって腎クリアランスを減少させるという点でPEG化と同様に機能しますが、生分解性のために蓄積の傾向が低くなる可能性がある。しかし、HESおよびその他の提案されている生分解性ポリマーPEGの代替品は、PEGと同様に多分散であり、最終生成物および代謝物の特性評価が困難である。両方の懸念を軽減する１つの新しい解決策は、ポリマー成分として定義されたポリペプチドを使用することである。このアプローチについては後述する。
【0091】
脂質化
ペプチドの半減期を延ばすための第２の主要な化学修飾法は、ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である4。元々インスリンの半減期を延長する方法として考案され、開発された脂質化は、PEG化と半減期延長の基本メカニズムは同じであり、つまり、流体力学的半径を大きくして腎濾過を減らすというものである。しかし、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環するアルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。アルブミンは、大きく（67 KDa）かつヒト血清中に非常に豊富に存在する（35-50g/L）タンパク質であり、脂質を含む分子を体全体に輸送する機能を自然に持っている。血漿タンパク質への結合はまた、PEG化で見られるものと同様に、立体障害によって、ペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護することができる。脂質化の結果、ペプチドの水溶性が低下するが、ペプチドと脂肪酸の間のリンカーの操作により、たとえばリンカー内でグルタミン酸またはミニPEGを使用することにより、これを調整できる。リンカー操作と脂質部分の変化は自己凝集に影響を与え、アルブミンとは無関係に生体内分布を遅くすることで半減期の延長に寄与する可能性がある5。
インスリンの先駆的な研究6に続いて、さまざまなペプチドの脂質化、特にヒトグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アナログ、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、とりわけGLP-1R/グルカゴン受容体共アゴニストなどの糖尿病領域のペプチドの脂質化が研究されている。2つの脂質化ペプチド薬は現在、ヒトでの使用がFDAに承認されている。これらは両方とも長時間作用型の抗糖尿病薬であり、GLP-1アナログのリラグルチドとインスリンデテミルである。
PEG化と脂質化の薬理学的に関連する違いは、治療的に活性なペプチドがはるかに大きなPEGと共有結合しているのに対し、小さな脂肪アシルペプチドコンジュゲートは、大きなアルブミンと非共役結合し、結合型および非結合型が平衡状態で存在していると考えられている。これは、生体内分布の違いを生じ、異なる組織に局在する受容体へのアクセスが異なる効果を誘発する可能性があるため、異なる薬理学をもたらす可能性がある。場合によっては、より制限された生体内分布が望ましいが、他の場合には、より大きな組織浸透が重要である。この問題に対処するPEGアプローチの興味深い変形は、Santiらによって開発され、予測可能な切断速度を有する放出性PEGコンジュゲートが利用されている７。
PEG化および脂質化は、立体障害を通じて遮蔽することにより、プロテアーゼおよびペプチダーゼに対する保護を付与するとともに、増大した流体力学半径を通じて、直接的または間接的に循環半減期を延長する。どちらの方法も、化学コンジュゲーションを利用し、生物学的または合成的に産生されるかに関わらず、それらが修飾されるペプチドを産生するために使用される手段に依存しないという点で柔軟である。合成ペプチドを使用する利点は、既知のタンパク質分解切断負荷による不安定性を含む、いくつかの特定の問題に対処するように設計された非天然アミノ酸を組み込むことができることである。これらはまた、活性または効力が遊離末端またはＣ末端アミド等の修飾残基に大きく依存する場合に重要となる結合部位の選択に関して、より柔軟であり得る。
ペプチドの半減期を延ばすための第２の主要な化学修飾法は、ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である4。元々インスリンの半減期を延長する方法として考案され、開発された脂質化は、PEG化と半減期延長の基本メカニズムは同じであり、つまり、流体力学的半径を大きくして腎濾過を減らすというものである。しかし、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環するアルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。アルブミンは、大きく（67 KDa）かつヒト血清中に非常に豊富に存在する（35-50g/L）タンパク質であり、脂質を含む分子を体全体に輸送する機能を自然に持っている。血漿タンパク質への結合はまた、PEG化で見られるものと同様に、立体障害によって、ペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護することができる。脂質化の結果、ペプチドの水溶性が低下するが、ペプチドと脂肪酸の間のリンカーの操作により、たとえばリンカー内でグルタミン酸またはミニPEGを使用することにより、これを調整できる。リンカー操作と脂質部分の変化は自己凝集に影響を与え、アルブミンとは無関係に生体内分布を遅くすることで半減期の延長に寄与する可能性がある5。
インスリンの先駆的な研究6に続いて、さまざまなペプチドの脂質化、特にヒトグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アナログ、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、とりわけGLP-1R/グルカゴン受容体共アゴニストなどの糖尿病領域のペプチドの脂質化が研究されている。2つの脂質化ペプチド薬は現在、ヒトでの使用がFDAに承認されている。これらは両方とも長時間作用型の抗糖尿病薬であり、GLP-1アナログのリラグルチドとインスリンデテミルである。
PEG化と脂質化の薬理学的に関連する違いは、治療的に活性なペプチドがはるかに大きなPEGと共有結合しているのに対し、小さな脂肪アシルペプチドコンジュゲートは、大きなアルブミンと非共役結合し、結合型および非結合型が平衡状態で存在していると考えられている。これは、生体内分布の違いを生じ、異なる組織に局在する受容体へのアクセスが異なる効果を誘発する可能性があるため、異なる薬理学をもたらす可能性がある。場合によっては、より制限された生体内分布が望ましいが、他の場合には、より大きな組織浸透が重要である。この問題に対処するPEGアプローチの興味深い変形は、Santiらによって開発され、予測可能な切断速度を有する放出性PEGコンジュゲートが利用されている７。
PEG化および脂質化は、立体障害を通じて遮蔽することにより、プロテアーゼおよびペプチダーゼに対する保護を付与するとともに、増大した流体力学半径を通じて、直接的または間接的に循環半減期を延長する。どちらの方法も、化学コンジュゲーションを利用し、生物学的または合成的に産生されるかに関わらず、それらが修飾されるペプチドを産生するために使用される手段に依存しないという点で柔軟である。合成ペプチドを使用する利点は、既知のタンパク質分解切断負荷による不安定性を含む、いくつかの特定の問題に対処するように設計された非天然アミノ酸を組み込むことができることである。これらはまた、活性または効力が遊離末端またはＣ末端アミド等の修飾残基に大きく依存する場合に重要となる結合部位の選択に関して、より柔軟であり得る。
【0092】
古典的遺伝子融合： FcおよびHSA
長寿命血清タンパク質への古典的な遺伝子融合は、PEGまたは脂質への化学コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替方法を提供する。２つの主要なタンパク質：抗体Ｆｃドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）は、伝統的に融合パートナーとして使用されてきた。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ部分へのペプチド、タンパク質、または受容体エキソドメインの融合を伴う。Ｆｃ融合とアルブミン融合はどちらも、ペプチド薬物のサイズを増加させるだけでなく、新生児のＦｃ受容体であるＦｃＲｎという身体の自然なリサイクルメカニズムを利用することによって、半減期の延長を達成する。これらのタンパク質のＦｃＲｎへのｐＨ依存的な結合は、エンドソーム内の融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合物は３～１６日の範囲の半減期を有することができ、これは典型的なPEG化または脂質化ペプチドよりもはるかに長い。抗体Ｆｃへの融合は、ペプチドまたはタンパク質薬物の溶解性および安定性を向上させることができる。ペプチドＦｃ融合の例は、現在後期臨床試験中のGLP-1受容体アゴニストであるデュラグルチドである。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化ペプチドによって利用されるのと同じタンパク質であり、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくGLP-1受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンとの間の主な違いは、Ｆｃが二量体性質であるのに対しＨＡＳが単量体構造であることであり、融合パートナーの選択に応じて、融合ペプチドは二量体または単量体として提示される。ペプチドＦｃ融合物の二量体性質は、標的受容体が十分に密接に接近しているか、またはそれ自体が二量体である場合、アビディティ効果をもたらすことがある。これは、標的に応じて望ましい場合もあれば、望ましくない場合もある。
長寿命血清タンパク質への古典的な遺伝子融合は、PEGまたは脂質への化学コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替方法を提供する。２つの主要なタンパク質：抗体Ｆｃドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）は、伝統的に融合パートナーとして使用されてきた。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ部分へのペプチド、タンパク質、または受容体エキソドメインの融合を伴う。Ｆｃ融合とアルブミン融合はどちらも、ペプチド薬物のサイズを増加させるだけでなく、新生児のＦｃ受容体であるＦｃＲｎという身体の自然なリサイクルメカニズムを利用することによって、半減期の延長を達成する。これらのタンパク質のＦｃＲｎへのｐＨ依存的な結合は、エンドソーム内の融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合物は３～１６日の範囲の半減期を有することができ、これは典型的なPEG化または脂質化ペプチドよりもはるかに長い。抗体Ｆｃへの融合は、ペプチドまたはタンパク質薬物の溶解性および安定性を向上させることができる。ペプチドＦｃ融合の例は、現在後期臨床試験中のGLP-1受容体アゴニストであるデュラグルチドである。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化ペプチドによって利用されるのと同じタンパク質であり、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくGLP-1受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンとの間の主な違いは、Ｆｃが二量体性質であるのに対しＨＡＳが単量体構造であることであり、融合パートナーの選択に応じて、融合ペプチドは二量体または単量体として提示される。ペプチドＦｃ融合物の二量体性質は、標的受容体が十分に密接に接近しているか、またはそれ自体が二量体である場合、アビディティ効果をもたらすことがある。これは、標的に応じて望ましい場合もあれば、望ましくない場合もある。
【0093】
設計されたポリペプチド融合体： XTENおよびPAS
組換え融合コンセプトの興味深い変形は、PEGの機能的類似体である、基本的に非構造化親水性アミノ酸ポリマーの融合パートナーとして設計された低複雑性配列の開発である。ポリペプチドプラットフォームの固有の生分解性は、PEGの潜在的により良性の代替物としてそれを魅力的にする。別の利点は、PEGの多分散性とは対照的に、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングを維持する必要があるＨＳＡおよびＦｃペプチド融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、より高い温度またはＨＰＬＣ精製等の過酷な条件にさらされることができる。
このクラスのポリペプチドの中で最も進歩的なものは、XTEN（Amunix）と呼ばれ、８６４個のアミノ酸長であり、６個のアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴ）からなる。ポリマーの生分解性により、通常使用される４０ＫＤａのPEGよりもはるかに大きく、同時により大きな半減期の延長をもたらす。XTENとペプチド薬物との融合により、半減期が天然分子の６０～１３０倍延長する。完全に組み換えて作製された２つのXTEN化生成物、すなわちVRS-859（Exenatide-XTEN）およびVRS-317（ヒト成長ホルモン－XTEN）が臨床に入った。第Ｉａ相試験では、VRS-859は、２型糖尿病患者において良好な忍容性および有効性であることが見出された。VRS -317は、以前に研究されたrhGH製品と比較して優れた薬物動態学的および薬力学的特性を報告しており、月1回投与の可能性がある。
同様のコンセプトの考察に基づく第２のポリマーは、PAS（XL-Protein GmbH）である9。３つの小さな非荷電アミノ酸、プロリン、アラニン、およびセリンのみからなるさらに制限されたセットからなるランダムコイルポリマーである。PASの生物物理学的特性と、負電荷の高いXTENとの違いが、生体内分布および／またはインビボ活性の違いに寄与し得るかどうかは未知であるが、これらのポリペプチドがより多くの治療薬に組み込まれ、融合物の挙動が特徴付けられることによって、明らかになるであろう。
パートナーがFc、HSA、XTEN、またはPASであるかどうかに関わらず、すべてのペプチドタンパク質融合物は、遺伝的にコードされており、結果として同様の制約に悩まされる。１つの制限は、非天然アミノ酸を組み込んだ合成ペプチドの使用を可能にする化学コンジュゲーションを用いる方法とは異なり、天然に存在するアミノ酸のみが組み込まれることである。遺伝子コードを拡張することでこれを克服する方法は、AmbrxやSutroなどの企業によって開発されているが、まだ広く使用されていない。第２の制限は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかが、パートナーに融合する必要があることである。多くの場合、ペプチド末端は受容体相互作用に関与し、一方または両方の末端への遺伝子融合は、活性を大きく損なう可能性がある。PEGまたは脂質コンジュゲーションの部位は、ペプチド上の任意の場所でよいので、得られる治療薬の生物学的活性を最大化するように最適化することができる。
組換え融合コンセプトの興味深い変形は、PEGの機能的類似体である、基本的に非構造化親水性アミノ酸ポリマーの融合パートナーとして設計された低複雑性配列の開発である。ポリペプチドプラットフォームの固有の生分解性は、PEGの潜在的により良性の代替物としてそれを魅力的にする。別の利点は、PEGの多分散性とは対照的に、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングを維持する必要があるＨＳＡおよびＦｃペプチド融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、より高い温度またはＨＰＬＣ精製等の過酷な条件にさらされることができる。
このクラスのポリペプチドの中で最も進歩的なものは、XTEN（Amunix）と呼ばれ、８６４個のアミノ酸長であり、６個のアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴ）からなる。ポリマーの生分解性により、通常使用される４０ＫＤａのPEGよりもはるかに大きく、同時により大きな半減期の延長をもたらす。XTENとペプチド薬物との融合により、半減期が天然分子の６０～１３０倍延長する。完全に組み換えて作製された２つのXTEN化生成物、すなわちVRS-859（Exenatide-XTEN）およびVRS-317（ヒト成長ホルモン－XTEN）が臨床に入った。第Ｉａ相試験では、VRS-859は、２型糖尿病患者において良好な忍容性および有効性であることが見出された。VRS -317は、以前に研究されたrhGH製品と比較して優れた薬物動態学的および薬力学的特性を報告しており、月1回投与の可能性がある。
同様のコンセプトの考察に基づく第２のポリマーは、PAS（XL-Protein GmbH）である9。３つの小さな非荷電アミノ酸、プロリン、アラニン、およびセリンのみからなるさらに制限されたセットからなるランダムコイルポリマーである。PASの生物物理学的特性と、負電荷の高いXTENとの違いが、生体内分布および／またはインビボ活性の違いに寄与し得るかどうかは未知であるが、これらのポリペプチドがより多くの治療薬に組み込まれ、融合物の挙動が特徴付けられることによって、明らかになるであろう。
パートナーがFc、HSA、XTEN、またはPASであるかどうかに関わらず、すべてのペプチドタンパク質融合物は、遺伝的にコードされており、結果として同様の制約に悩まされる。１つの制限は、非天然アミノ酸を組み込んだ合成ペプチドの使用を可能にする化学コンジュゲーションを用いる方法とは異なり、天然に存在するアミノ酸のみが組み込まれることである。遺伝子コードを拡張することでこれを克服する方法は、AmbrxやSutroなどの企業によって開発されているが、まだ広く使用されていない。第２の制限は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかが、パートナーに融合する必要があることである。多くの場合、ペプチド末端は受容体相互作用に関与し、一方または両方の末端への遺伝子融合は、活性を大きく損なう可能性がある。PEGまたは脂質コンジュゲーションの部位は、ペプチド上の任意の場所でよいので、得られる治療薬の生物学的活性を最大化するように最適化することができる。
【0094】
合成ペプチドと半減期延長タンパク質を融合させるハイブリッド法
遺伝子融合は、これまで、より長い半減期の延長の可能性を提供してきたが、結合部位の柔軟性および非天然アミノ酸の組み込み、またはペプチド骨格への修飾の点で、化学的コンジュゲーション、PEG化および脂質化を利用する方法によってもたらされる利点を欠いている。半減期延長のために、遺伝子融合と化学的コンジュゲーションの利点を融合させる最初の取り組みの1つは、ラホヤのScripps Research Instituteの研究者によって行われ、その技術は後にバイオテクノロジー企業CovXの基礎となった10,11。これらの研究者は、触媒アルドラーゼ抗体を用いて、抗体の活性部位リジンが、ペプチドまたは小分子に組み込まれたβ-ジケトンと可逆的共有エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。得られた複合体は、CovXBody（登録商標）と呼ばれる。このアプローチは、ペプチド薬物または小分子の機能的特性と抗体の長い血清半減期とを、遺伝子融合を介さず、むしろ化学結合を介して組み合わせるものである。この技術の最初のデモンストレーションに続いて、研究者は、ペプチド模倣ファーマコフォアを標的とするインテグリンに基づくCovX-Body（登録商標）プロトタイプの使用を拡大した。この構成に基づく少なくとも３つの分子が臨床開発に入っている：GLp-1RアゴニストであるCVX-096；アンジオポエチン－２結合ペプチドであるCVX-060；およびトロンボスポンジン模倣物であるCVX-045の３つである。
最近では、XTENポリペプチドも化学コンジュゲーションモードで使用されており12、PEGにさらに直接的に類似している。この方法を用いて作製したXTEN化ペプチドの第１の例は、GLP2-2G-XTENであり、このペプチドは、マレイミド－チオール化学を用いてXTENタンパク質ポリマーに化学的にコンジュゲートされる。化学的にコンジュゲートされたGLP2-2G-XTEN分子は、組換え融合GLP2-2G-XTENと同等の、インビトロ活性、インビトロ血漿安定性、およびラットでの薬物動態を示した。
XTENまたはPASポリペプチドの完全に設計された配列におけるリジンまたはシステイン側鎖等の反応性基の数および間隔は、それらが構成される制限されたアミノ酸セットにより、部位特異的変化を通じて正確に制御することができる。これは、配列が自然に多くの反応性基を含んでおり、非常に特殊化した活性部位における反応性残基に依存するCovx技術とは対照的な立場にある、Ｆｃまたはアルブミンを利用し得る方法に対して、より高程度の柔軟性を提供する。加えて、XTENまたはPASの三次構造の欠如は、カップリングおよびコンジュゲートの精製に使用される条件および化学物質に対してより柔軟性を提供するはずである。
要約すると、化学コンジュゲーションおよび遺伝子融合法の利点を組み合わせ、個々の限界を克服したハイブリッドペプチドの半減期延長法が出現しつつある。これらの方法は、より長い半減期を付与するが、治療用ペプチド部分を、天然のＬ－アミノ酸のみから構成されるか、またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで融合した直鎖、一方向性ポリペプチドのみとして構成されるという制限から解放させる、組換えポリペプチドベースのパートナーに基づく分子の作製を可能にし、したがって、広範囲の長時間作用型ペプチドベース薬物への扉を開く。
遺伝子融合は、これまで、より長い半減期の延長の可能性を提供してきたが、結合部位の柔軟性および非天然アミノ酸の組み込み、またはペプチド骨格への修飾の点で、化学的コンジュゲーション、PEG化および脂質化を利用する方法によってもたらされる利点を欠いている。半減期延長のために、遺伝子融合と化学的コンジュゲーションの利点を融合させる最初の取り組みの1つは、ラホヤのScripps Research Instituteの研究者によって行われ、その技術は後にバイオテクノロジー企業CovXの基礎となった10,11。これらの研究者は、触媒アルドラーゼ抗体を用いて、抗体の活性部位リジンが、ペプチドまたは小分子に組み込まれたβ-ジケトンと可逆的共有エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。得られた複合体は、CovXBody（登録商標）と呼ばれる。このアプローチは、ペプチド薬物または小分子の機能的特性と抗体の長い血清半減期とを、遺伝子融合を介さず、むしろ化学結合を介して組み合わせるものである。この技術の最初のデモンストレーションに続いて、研究者は、ペプチド模倣ファーマコフォアを標的とするインテグリンに基づくCovX-Body（登録商標）プロトタイプの使用を拡大した。この構成に基づく少なくとも３つの分子が臨床開発に入っている：GLp-1RアゴニストであるCVX-096；アンジオポエチン－２結合ペプチドであるCVX-060；およびトロンボスポンジン模倣物であるCVX-045の３つである。
最近では、XTENポリペプチドも化学コンジュゲーションモードで使用されており12、PEGにさらに直接的に類似している。この方法を用いて作製したXTEN化ペプチドの第１の例は、GLP2-2G-XTENであり、このペプチドは、マレイミド－チオール化学を用いてXTENタンパク質ポリマーに化学的にコンジュゲートされる。化学的にコンジュゲートされたGLP2-2G-XTEN分子は、組換え融合GLP2-2G-XTENと同等の、インビトロ活性、インビトロ血漿安定性、およびラットでの薬物動態を示した。
XTENまたはPASポリペプチドの完全に設計された配列におけるリジンまたはシステイン側鎖等の反応性基の数および間隔は、それらが構成される制限されたアミノ酸セットにより、部位特異的変化を通じて正確に制御することができる。これは、配列が自然に多くの反応性基を含んでおり、非常に特殊化した活性部位における反応性残基に依存するCovx技術とは対照的な立場にある、Ｆｃまたはアルブミンを利用し得る方法に対して、より高程度の柔軟性を提供する。加えて、XTENまたはPASの三次構造の欠如は、カップリングおよびコンジュゲートの精製に使用される条件および化学物質に対してより柔軟性を提供するはずである。
要約すると、化学コンジュゲーションおよび遺伝子融合法の利点を組み合わせ、個々の限界を克服したハイブリッドペプチドの半減期延長法が出現しつつある。これらの方法は、より長い半減期を付与するが、治療用ペプチド部分を、天然のＬ－アミノ酸のみから構成されるか、またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで融合した直鎖、一方向性ポリペプチドのみとして構成されるという制限から解放させる、組換えポリペプチドベースのパートナーに基づく分子の作製を可能にし、したがって、広範囲の長時間作用型ペプチドベース薬物への扉を開く。
【0095】
「筋萎縮」は、筋肉量の減少として定義され、筋肉の完全または部分的な衰え、および結果として生じる筋力低下で特徴づけられる。それは、一般的に、適切な運動をしていない人、適切な食事をしていない人、またはその両方で発生する。それは、ミオパチー（すなわち、筋ジストロフィー）などの筋疾患を有する対象にも存在し、摂食障害、がん、エイズ、ＣＯＰＤ、ＡＬＳ、運動を制限する身体的損傷、変性状態を含むいくつかの疾患／状態の併存疾患である。通常の加齢過程の一部として高齢者にも多く見られる。
【0096】
「高齢対象」とは、少なくとも６５歳である対象を指す。
【0097】
「筋萎縮を特徴とする疾患または状態」は、症状としての筋萎縮を含む疾患または状態を指す。例としては、身体的損傷（すなわち、対象を物理的に不活発にするような損傷、例えば、筋肉、神経、骨、軟骨、靭帯、椎間板、頭部または関節の損傷）、対象をベッドまたは家庭に限定する疾患（すなわち、がん、感染性疾患等）、摂食障害、悪液質、サルコペニア、栄養不良、代謝性疾患（Ｉ型およびＩＩ型糖尿病を含む）、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、変形性関節症、ポリオ、関節リウマチ、脊椎萎縮症および多発性筋炎等の神経、筋肉または関節変性疾患が挙げられる。神経変性疾患としては、ＡＬＳ、ＭＳ、パーキンソン病、およびハンチントン病が挙げられる。筋変性疾患としては、ミオパチー（多発性筋炎を含む）、筋ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、脊髄性筋萎縮症が挙げられる。関節変性疾患としては、関節炎、関節リウマチ、変形性関節症が挙げられる。
【0098】
本明細書で使用される場合、「本発明の発現ベクター」という用語は、細胞における本発明のペプチドの発現に好適な染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御要素の好適なセットを含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。このようなベクターの例としては、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、ペプチドをコードする核酸分子は、例えば、線状発現エレメント（例えば、Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)に記載されているようなもの）、コンパクト化核酸ベクター（例えば、米国特許第第6,077,835号および／またはWO00/70087）、またはpBR322、pUC19/18、もしくはpUC118/119等のプラスミドベクターを含む。このような核酸ベクターおよびその使用は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第5,589,466号および米国特許第5,973,972号参照）。一実施形態では、ＤＮＡは、発現制御配列を含む。
【0099】
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における本発明のペプチドの発現に好適である。このようなベクターの例としては、BlueScript（Stratagene）、pIN vectors（Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509）、pET vectors（Novagen, Madison, Wis.）等の発現ベクターが挙げられる。一実施形態では、発現ベクターはまた、または代替的に、酵母系での発現に好適なベクターであってもよい。酵母系での発現に好適な任意のベクターを用いることができる。好適なベクターとしては、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGH（F. Ausubel et al., ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York; およびGrant et al., 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544に概説されている）等の構成的または誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる。他の実施形態において、発現ベクターは、バキュロウイルス感染昆虫細胞における発現に好適である（Kost, T; an Condreay, JP, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10(5): 428-33）。
【0100】
発現制御配列は、目的の遺伝子の転写、および種々の細胞系におけるタンパク質のその後の発現を制御および駆動するように操作される。プラスミドは、目的の発現可能な遺伝子を、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター等の所望のエレメントを含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）と組み合わせる。本発明の発現ベクターにおいて、ペプチドをコードする核酸分子は、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ポリＡ終結配列、および他の発現促進要素を含んでもよく、またはそれらと関連付けられてもよい。
【0101】
本明細書で使用される「プロモーター」は、適切なシグナルが存在するときに、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を可能にするような方法で、それが作用可能に連結されている、すなわち連結されているＤＮＡ配列の転写を指示するのに十分なＤＮＡ配列を示す。ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、当該技術分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサー要素の制御下に置かれ得る。このような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトCMV IEプロモーター／エンハンサーまたはCMV主要IE（CMV-MIE）プロモーター、ならびにRSV、SV40後期プロモーター、SL3-3、MMTV、ユビキチン（Ubi）、ユビキチンＣ（UbC）、およびHIV LTRプロモーター）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、SV40、CMV、CMV -IE、CMV- MIE、RSV、SL3 -3、MMTV、Ubi、UbC、およびHIV LTRからなる群から選択されるプロモーターを含む。
【0102】
本発明の核酸分子はまた、効果的なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌におけるプラスミド産物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または都合のよいクローニング部位（例えば、ポリリンカー）に作動可能に連結されてもよい。核酸はまた、CMV IE等の構成的プロモーターとは対照的に、調節可能な誘導性プロモーター（誘導性、抑制可能、発達的に調節可能）を含んでもよい（当業者は、そのような用語が、ある特定の条件下で遺伝子発現の程度の記述子であることを実際に認識するであろう）。
【0103】
選択可能なマーカーは、当該技術分野において周知の要素である。選択条件下では、適切な選択可能なマーカーを発現する細胞のみが生存することができる。一般に、選択可能なマーカー遺伝子は、細胞培養において種々の抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質、通常は酵素を発現する。他の選択的条件では、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞は可視化され、したがって選択可能である。実施形態は、β－ラクタマーゼ（bla）（β－ラクタム抗生物質耐性またはアンピシリン耐性遺伝子またはampR）、bls（ブラスチジン耐性アセチル転移酵素遺伝子）、bsd（ブラスチジン－Ｓデアミナーゼ耐性遺伝子）、bsr（ブラスチジン－Ｓ耐性遺伝子）、Sh ble（Zeocin（登録商標）耐性遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、tetM（テトラサイクリン耐性遺伝子またはtetR）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（npt）（ネオマイシン耐性遺伝子またはneoR）、kanR（カナマイシン耐性遺伝子）、およびpac（ピュロマイシン耐性遺伝子）を含む。
【0104】
ある特定の実施形態において、ベクターは、bla、bls、BSD、bsr、Shble、hpt、tetR、tetM、npt、kanRおよびpacからなる群から選択される１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。他の実施形態において、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）、シアノ蛍光タンパク質（CFP）、強化シアノ蛍光タンパク質（eCFP）、または黄色蛍光タンパク質（YFP）をコードする１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【0105】
本発明の目的のために、真核細胞における遺伝子発現は、組み換え「調節融合タンパク質」（RFP）であり得る調節タンパク質によって順番に調節されるオペレーターによって制御される強力なプロモーターを使用して厳密に調節されてもよい。RFPは、本質的に、転写ブロックドメインと、その活性を調節するリガンド結合ドメインとからなる。かかる発現系の例は、US20090162901 A1に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0106】
本明細書で使用される場合、「オペレーター」は、遺伝子内またはその付近に導入されるＤＮＡ配列を示し、その結果、遺伝子は、RFPのオペレーターへの結合によって調節され得、その結果、目的の遺伝子、すなわち、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドの転写を防止または可能にする。原核細胞およびバクテリオファージにおける多数のオペレーターは、十分に特徴付けられている(Neidhardt, ed. Escherichia, coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2 d.Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996)。これらには、LexAペプチドに結合する大腸菌のLexA遺伝子のオペレーター領域、ならびに大腸菌のLadおよびtrpR遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合するラクトースおよびトリプトファンオペレーターが含まれるが、これらに限定されない。これらには、ラムダcIおよびP22 arcによってコードされるリプレッサータンパク質に結合する、ラムダPRおよびファージP22 ant/mnt遺伝子由来のバクテリオファージオペレーターも含まれる。いくつかの実施形態では、RFPの転写遮断ドメインが、NotI等の制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、プロモーターによる転写を制御することができるように、オペレーターがプロモーターに隣接して、またはプロモーターに対して3'側に位置しなければならないことを認識するであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第第5,972,650号は、tetO配列がTATAボックスから特定の距離内にあることを指定する。特定の実施形態では、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に配置される。他の実施形態において、オペレーターは、プロモーターの１０塩基対内に配置される。
【0107】
例示的な細胞発現系では、細胞は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）を発現するように操作され、目的のタンパク質は、TetRによって活性が調節されるプロモーターの転写制御下に置かれる。２つのタンデムTetRオペレーター（tetO）は、ベクター内のCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置される。そのようなベクター内のCMV-MIEプロモーターによって指向される目的のタンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の好適な誘導因子（例えば、ドキシサイクリン）の不存在下でTetRによってブロックされ得る。誘導因子の存在下では、TetRタンパク質はtetOに結合することができないため、目的のタンパク質の転写、次いで翻訳（発現）が生じる。（例えば、米国特許第7,435,553号参照。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。）
【0108】
本発明のベクターはまた、目的の遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みを促進するためにCre - lox組換えツールを用いてもよい。Cre-lox戦略には、少なくとも２つの構成要素が必要である：１）２つのloxP部位間の組換えを触媒する酵素であるCreリコンビナーゼ；および２）loxP部位（例えば、組換えが行われる8-bpコア配列と、２つの隣接する13-bp反転反復とからなる配列による特異的な３４塩基対）または変異型lox部位、である。（例えば、Arakiet al., 1995, PNAS 92: 160-4; Nagy, A.et al., 2000, Genesis 26: 99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19): e103; およびUS20100291626A1を参照されたい。これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。別の組換え戦略において、酵母由来FLPリコンビナーゼは、コンセンサス配列FRTと共に利用され得る(例えば、Dymecki, S.M., 1996, PNAS 93 (12): 6191 -6196も参照されたい)。
【0109】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するのに好適な任意の細胞を含む。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌の株、バチルス属、ストレプトマイセス属等）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ．セレビシア、Ｓ．ポンベ、Ｐ．パートリス、Ｐ．メタノリカ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えばSF-9、SF-21、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Tricoplusia ni）等）、非ヒト動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または細胞融合物（例えばハイブリドーマまたはクアドローマ等の細胞が含まれる。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は真核生物であり、以下の細胞から選択される： CHO (例えば、CHO K 1、DXB -11 CHO、Veggie-CHO)、COS (例えば、COS-7)、網膜細胞、Vero、CV 1、腎臓（例えば、HEK 293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK 21）、HeLa、HepG2、WI 38、MRC 5、Colo 25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、PER.C6（登録商標）細胞）を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、CHO細胞である。他の実施形態では、細胞は、CHO K1細胞である。
【0110】
本明細書で使用される場合、「本発明の形質転換細胞」という用語は、本発明のペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列を含む細胞ゲノムに安定的に組み込まれた核酸を含む宿主細胞を指す。別の実施形態において、本発明は、本発明のペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または直鎖発現エレメントなどの非組み込み（すなわち、エピソーマル）核酸を含む細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、宿主細胞を、本発明の発現ベクターを含むプラスミドで安定的にトランスフェクトすることによって産生される細胞株を提供する。
【0111】
本明細書で使用される場合、細胞に適用される「操作された」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操作されることを意味し、概して、好適な発現ベクターの合成（上記を参照）、次いで、発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップ（概して安定したトランスフェクション）を含む。
【0112】
本明細書で使用される場合、「異種発現」という用語は、核酸を天然に有しない宿主細胞における核酸の発現を指す。核酸の異種宿主への挿入は、組換えＤＮＡ技術によって行われる。
【実施例】
【0113】
実施例
次に、本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり、説明のみを目的としている。これらは、主張されている独占権の範囲または記載されている発明に限定することをなんら意図するものではない。これらの例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の態様を構成するものである。
次に、本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり、説明のみを目的としている。これらは、主張されている独占権の範囲または記載されている発明に限定することをなんら意図するものではない。これらの例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の態様を構成するものである。
【0114】
材料および方法
細胞培養アッセイ調製： C2C12の調製
増殖培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMEM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）、ペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）および予め５５℃で３０分間加熱した滅菌濾過されたウシ胎児血清５０ｍＬを添加する（最終濃度：１０％）。
分化培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMDM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）、ペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）および熱不活化ウマ血清１０ｍＬ（最終濃度：２％）を添加する。
飢餓培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMEM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）およびペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）を添加する。
細胞培養アッセイ調製： C2C12の調製
増殖培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMEM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）、ペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）および予め５５℃で３０分間加熱した滅菌濾過されたウシ胎児血清５０ｍＬを添加する（最終濃度：１０％）。
分化培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMDM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）、ペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）および熱不活化ウマ血清１０ｍＬ（最終濃度：２％）を添加する。
飢餓培地の調製：
４．５ｇ/ＬグルコースDMEM ５００ｍＬに、Ｌ－グルタミン溶液５ｍＬ（最終濃度：１％）およびペニシリン－ストレプトマイシン５ｍＬ（最終濃度：１％）を添加する。
【0115】
S6リン酸化アッセイワークフロー
１日目：９６ウェルプレートにおいて、成長培地１００μｌ／ウェル中に２４００細胞／ウェル（８，０００細胞／ｃｍ2）を播種する。それらを固着させ、３７℃、５% CO2で48時間増殖させる。（詳細は解凍サブカルチャーC2C12 SOP 58を参照）。
3日目：増殖培地を除去し、分化培地100μl/ウェルを添加する。可能であれば、毎日新鮮な分化培地を添加して、３７℃、５%CO2で7日間分化させる。（詳細はC2C12 SOP 60の分化を参照）。
８日目：分化培地を除去し、１００μｌ／ウェルの飢餓培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ2で３時間細胞を飢餓させ、その後、飢餓培地を除去し、１００μｌ／ウェルのHBSSを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートして、細胞のアミノ酸を除去する。
2mlの試験管にペプチドおよび加水分解処理物を入れ、HBSSでペプチド/加水分解物を希釈して所望の濃度（典型的には0.5μg/mlおよび5μg/ml）とする。3つのウェル（100 μl/ウェル）を処理するには、最低300μlの量が必要である。0.1μMのインスリン処理物を陽性対照として使用する。すべての処理は3重に完了する必要がある。処理時間は３０分が推奨される。
１日目：９６ウェルプレートにおいて、成長培地１００μｌ／ウェル中に２４００細胞／ウェル（８，０００細胞／ｃｍ2）を播種する。それらを固着させ、３７℃、５% CO2で48時間増殖させる。（詳細は解凍サブカルチャーC2C12 SOP 58を参照）。
3日目：増殖培地を除去し、分化培地100μl/ウェルを添加する。可能であれば、毎日新鮮な分化培地を添加して、３７℃、５%CO2で7日間分化させる。（詳細はC2C12 SOP 60の分化を参照）。
８日目：分化培地を除去し、１００μｌ／ウェルの飢餓培地を添加して、３７℃、５％ＣＯ2で３時間細胞を飢餓させ、その後、飢餓培地を除去し、１００μｌ／ウェルのHBSSを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートして、細胞のアミノ酸を除去する。
2mlの試験管にペプチドおよび加水分解処理物を入れ、HBSSでペプチド/加水分解物を希釈して所望の濃度（典型的には0.5μg/mlおよび5μg/ml）とする。3つのウェル（100 μl/ウェル）を処理するには、最低300μlの量が必要である。0.1μMのインスリン処理物を陽性対照として使用する。すべての処理は3重に完了する必要がある。処理時間は３０分が推奨される。
【0116】
細胞培養アッセイ調製：THP -1細胞培養
ヒト単球性白血病（THP-1）細胞（ECACCコレクション； Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）を、１％Ｌ－グルタミン、１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および予め５５℃で30分間加熱された滅菌濾過された１０％ウシ胎児血清を加えたRoswell Park Memorial Institute培地（RPMI 1640，Lonza, Basel, Switzerland）において培養維持した。
ヒト単球性白血病（THP-1）細胞（ECACCコレクション； Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）を、１％Ｌ－グルタミン、１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、および予め５５℃で30分間加熱された滅菌濾過された１０％ウシ胎児血清を加えたRoswell Park Memorial Institute培地（RPMI 1640，Lonza, Basel, Switzerland）において培養維持した。
【0117】
TNF-Ａ分泌アッセイワークフロー
上清に放出されたTHP-1由来TNFを、TNF-α ELISAキット（BioLegend、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って評価した。マクロファージに分化させるために、THP-1細胞を６ウェルプレートに播種し（２×１０6ウェル-1）、１００ｎＭのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（PMA；Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA）で７２時間、３７℃、５％ＣＯ2で処理した。インキュベーション後、非付着細胞を吸引し、接着細胞をNPN_1（０．５～５μｇ／ｍＬ）で二重または三重に処理した。２４時間インキュベーションした後、大腸菌O127: B8（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）のリポ多糖（LPS）を、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間、１００ｎｇ／ｍＬに添加した。上清を集め、上清に放出されたTHP-1由来TNFを、TNF-α ELISAキット（BioLegend, San Diego, Californa, USA）を使用して、製造業者の説明書に従って評価した。
上清に放出されたTHP-1由来TNFを、TNF-α ELISAキット（BioLegend、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って評価した。マクロファージに分化させるために、THP-1細胞を６ウェルプレートに播種し（２×１０6ウェル-1）、１００ｎＭのホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（PMA；Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA）で７２時間、３７℃、５％ＣＯ2で処理した。インキュベーション後、非付着細胞を吸引し、接着細胞をNPN_1（０．５～５μｇ／ｍＬ）で二重または三重に処理した。２４時間インキュベーションした後、大腸菌O127: B8（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）のリポ多糖（LPS）を、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間、１００ｎｇ／ｍＬに添加した。上清を集め、上清に放出されたTHP-1由来TNFを、TNF-α ELISAキット（BioLegend, San Diego, Californa, USA）を使用して、製造業者の説明書に従って評価した。
【0118】
C2C12細胞からのＲＮＡ単離およびリアルタイムQPCR
C2C12細胞を６ウェルプレートに播種し、放置して３７℃、５％ＣＯ2で増殖および分化させた。続いて、細胞を、３７℃、５% CO2の飢餓培地中で24時間飢餓させた。Menconiら(2008)に従って、萎縮を誘発するために、細胞を、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM - LM (30030, BIOSCIENCES)に可溶化した100μMのデキサメタゾンで、３７℃、５% CO2で24時間処理した [33]。萎縮誘導の終了の３０分前に、細胞をデキサメタゾン処理の上に添加したＮＰＮで処理し、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間インキュベートした。希釈物は、最終体積２ｍＬ／ウェルとなる所望の濃度となるように計算された。まず、各ウェルに添加された処理液の等量が、細胞を乱すことなくデキサメタゾン処理液から除去された。C2C12細胞をTRIzol（Invitrogen, Carlsbad, USA）で溶解し、Purelink RNAミニキット（Thermo Fisher ScientificによるInvitrogen）を使用してメーカーの説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。大容量cDNA逆転写キット（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）を使用して、全RNA（１μｇ）をcDNAに逆転写した。定量的PCRは、TagManプローブベースの方法を使用して実施され、C2C12を使用した実験については、Trim63（Mm 01185221_m1）およびFbxo32（Mm 00499518_m1）に対するTagMan蛍光遺伝子発現プローブ（ABI Biosystems, CA, USA）を使用してｍＲＮＡ発現を検出した。プライマー／プローブおよびTagMan（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（ABI Biosystems, CA, USA）を含有するマスターミックスを、１μＬのcDNAテンプレートに添加した。９μＬの最終容量を、Roche光学９６ウェル反応プレート上で二重にピペッティングし、Rocheライトサイクラー480リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行った。各ウェルの閾値サイクル（Ct）は、装置ソフトウェアを使用して計算された。プレートに含まれるB2Mハウスキーピング遺伝子（Mm 00437762_m1）によって正規化された生データを用いて、ΔΔCt法に基づいてデータ分析を行った。C2C12細胞において萎縮を誘発するためにデキサメタゾンを使用したため、全ての遺伝子発現はデキサメタゾンと比較された。続いて、デキサメタゾンによって引き起こされる萎縮効果を減弱させることができるかどうかを調べるために、NPN_1を添加した。結果は、対照に対する倍率で表した。
C2C12細胞を６ウェルプレートに播種し、放置して３７℃、５％ＣＯ2で増殖および分化させた。続いて、細胞を、３７℃、５% CO2の飢餓培地中で24時間飢餓させた。Menconiら(2008)に従って、萎縮を誘発するために、細胞を、1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補充したDMEM - LM (30030, BIOSCIENCES)に可溶化した100μMのデキサメタゾンで、３７℃、５% CO2で24時間処理した [33]。萎縮誘導の終了の３０分前に、細胞をデキサメタゾン処理の上に添加したＮＰＮで処理し、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間インキュベートした。希釈物は、最終体積２ｍＬ／ウェルとなる所望の濃度となるように計算された。まず、各ウェルに添加された処理液の等量が、細胞を乱すことなくデキサメタゾン処理液から除去された。C2C12細胞をTRIzol（Invitrogen, Carlsbad, USA）で溶解し、Purelink RNAミニキット（Thermo Fisher ScientificによるInvitrogen）を使用してメーカーの説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。大容量cDNA逆転写キット（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）を使用して、全RNA（１μｇ）をcDNAに逆転写した。定量的PCRは、TagManプローブベースの方法を使用して実施され、C2C12を使用した実験については、Trim63（Mm 01185221_m1）およびFbxo32（Mm 00499518_m1）に対するTagMan蛍光遺伝子発現プローブ（ABI Biosystems, CA, USA）を使用してｍＲＮＡ発現を検出した。プライマー／プローブおよびTagMan（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（ABI Biosystems, CA, USA）を含有するマスターミックスを、１μＬのcDNAテンプレートに添加した。９μＬの最終容量を、Roche光学９６ウェル反応プレート上で二重にピペッティングし、Rocheライトサイクラー480リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行った。各ウェルの閾値サイクル（Ct）は、装置ソフトウェアを使用して計算された。プレートに含まれるB2Mハウスキーピング遺伝子（Mm 00437762_m1）によって正規化された生データを用いて、ΔΔCt法に基づいてデータ分析を行った。C2C12細胞において萎縮を誘発するためにデキサメタゾンを使用したため、全ての遺伝子発現はデキサメタゾンと比較された。続いて、デキサメタゾンによって引き起こされる萎縮効果を減弱させることができるかどうかを調べるために、NPN_1を添加した。結果は、対照に対する倍率で表した。
【0119】
廃用性マウス萎縮試験プロトコル
この研究は、Melior Discovery社（米国）と共に実施した。１２週齢の雄C57b1/6Jマウス（Ｎ＝１０／群）を、体重（リング移植後１ ０日）に基づいて処置群に無作為に割り当てた。倫理的承認は、国際宗教自由協会（IARF ＃: MLR-I15）によって与えられ、したがって、施設内動物飼育および使用委員会（IACUC）によって定められた倫理基準に従って実施された。
本試験は、５つの処置群（１）健常対照（体重負荷対照）、（２）後肢無負荷（HU）対照ビヒクル（萎縮）、（３）Bowman-Birk阻害剤（BBI；１１３．３ｍｇ／ｋｇ陽性対照）、（４）カゼイン（６５０ｍｇ／ｋｇ；陽性対照）、（５）NPN_1（６５０ｍｇ／ｋｇ）から構成された。簡潔に述べると、後肢を降ろす前に、２－０の無菌外科用鋼線を用いて尾輪を形成し、これを第５、６、または７の椎間板腔を通して輪の形にし、そこからマウスを吊り下げた。尾輪の椎骨の位置は、排便を妨げることなく動物の体重を適切にバランスさせるために選択された。動物は、ケージの上部に取り付けられた旋回ハーネスによって吊り下げられた。動物の体は、前肢のみがケージ床との接触を維持するように、30°の仰角で維持された。この処置の間、動物はケージ内で動き、食料と水に自由にアクセスすることができる。動物の高さを毎日チェックし、必要に応じて調整した[34]。IACUCガイドラインに基づいて、マウスに馴化およびコンディショニングのために７日間が与えられ、続いて、尾輪移植後１０～１３日間の回復時間が与えられた。本研究の主要評価項目は、１９日間の後肢懸垂の後に直接、対照および試験マウスの後肢内に含まれるヒラメ筋の湿潤重量を評価することであった。さらに、固定筋肉試料（５／群）を、タイプＩおよびタイプＩＩａ筋繊維マーカーの免疫蛍光（IF）染色および画像解析のためにCaresBio Laboratory LLCに送った。また、ヒラメ筋組織試料（１０／群）も、遺伝子発現分析のためにCellomatics Biosciences LTDに送った。
この研究は、Melior Discovery社（米国）と共に実施した。１２週齢の雄C57b1/6Jマウス（Ｎ＝１０／群）を、体重（リング移植後１ ０日）に基づいて処置群に無作為に割り当てた。倫理的承認は、国際宗教自由協会（IARF ＃: MLR-I15）によって与えられ、したがって、施設内動物飼育および使用委員会（IACUC）によって定められた倫理基準に従って実施された。
本試験は、５つの処置群（１）健常対照（体重負荷対照）、（２）後肢無負荷（HU）対照ビヒクル（萎縮）、（３）Bowman-Birk阻害剤（BBI；１１３．３ｍｇ／ｋｇ陽性対照）、（４）カゼイン（６５０ｍｇ／ｋｇ；陽性対照）、（５）NPN_1（６５０ｍｇ／ｋｇ）から構成された。簡潔に述べると、後肢を降ろす前に、２－０の無菌外科用鋼線を用いて尾輪を形成し、これを第５、６、または７の椎間板腔を通して輪の形にし、そこからマウスを吊り下げた。尾輪の椎骨の位置は、排便を妨げることなく動物の体重を適切にバランスさせるために選択された。動物は、ケージの上部に取り付けられた旋回ハーネスによって吊り下げられた。動物の体は、前肢のみがケージ床との接触を維持するように、30°の仰角で維持された。この処置の間、動物はケージ内で動き、食料と水に自由にアクセスすることができる。動物の高さを毎日チェックし、必要に応じて調整した[34]。IACUCガイドラインに基づいて、マウスに馴化およびコンディショニングのために７日間が与えられ、続いて、尾輪移植後１０～１３日間の回復時間が与えられた。本研究の主要評価項目は、１９日間の後肢懸垂の後に直接、対照および試験マウスの後肢内に含まれるヒラメ筋の湿潤重量を評価することであった。さらに、固定筋肉試料（５／群）を、タイプＩおよびタイプＩＩａ筋繊維マーカーの免疫蛍光（IF）染色および画像解析のためにCaresBio Laboratory LLCに送った。また、ヒラメ筋組織試料（１０／群）も、遺伝子発現分析のためにCellomatics Biosciences LTDに送った。
【0120】
投薬と筋肉の湿潤質量
全てのマウスに、１日目から１８日目まで、NPN_1、BBI、またはカゼインのいずれかを投与した。１９日目に、動物を頸部脱臼によって屠殺し、血液／血漿試料を採取し、ヒラメ筋を単離し、デジタルプラットフォーム天秤を使用して計量した。湿潤筋肉重量を体重（ｍｇ／ｇ）に正規化した。片側のヒラメ筋をスナップ凍結し、もう片側のヒラメ筋を4%新鮮なPBS緩衝ホルムアルデヒドで固定した。
全てのマウスに、１日目から１８日目まで、NPN_1、BBI、またはカゼインのいずれかを投与した。１９日目に、動物を頸部脱臼によって屠殺し、血液／血漿試料を採取し、ヒラメ筋を単離し、デジタルプラットフォーム天秤を使用して計量した。湿潤筋肉重量を体重（ｍｇ／ｇ）に正規化した。片側のヒラメ筋をスナップ凍結し、もう片側のヒラメ筋を4%新鮮なPBS緩衝ホルムアルデヒドで固定した。
【0121】
ヒラメ筋の免疫蛍光分析
収集したヒラメ筋を4%新鮮なPBS緩衝ホルムアルデヒドに後固定した。免疫蛍光分析のために、各処理群から５つの試料を無作為に選択した。筋肉はパラフィン包埋され、切片化された。免疫蛍光標識を使用して、タイプＩおよびタイプＩＩａ筋繊維を染色した。両方の染色標識について、各試料の代表的な領域に対して画像解析を行った。試料を処理する際、切片（厚さ、８μＭ）を切断し、免疫蛍光染色を以前に記載されたように行った［３５］。簡潔に述べると、スライドをクエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で熱誘導抗原回収に供し、非特異的抗原性ブロッカーでブロックした後、一次抗体ab11083（希釈）およびab91506（希釈１：２００）と共に一晩インキュベートした。一次抗体濃度は両方とも、試験スライドにおける最適化後に決定された。対応する蛍光結合二次抗体（Alexa 594およびAlexa 488）を室温で１時間適用した。核を可視化するために、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（DAPI）が二次抗体に添加された。
収集したヒラメ筋を4%新鮮なPBS緩衝ホルムアルデヒドに後固定した。免疫蛍光分析のために、各処理群から５つの試料を無作為に選択した。筋肉はパラフィン包埋され、切片化された。免疫蛍光標識を使用して、タイプＩおよびタイプＩＩａ筋繊維を染色した。両方の染色標識について、各試料の代表的な領域に対して画像解析を行った。試料を処理する際、切片（厚さ、８μＭ）を切断し、免疫蛍光染色を以前に記載されたように行った［３５］。簡潔に述べると、スライドをクエン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）中で熱誘導抗原回収に供し、非特異的抗原性ブロッカーでブロックした後、一次抗体ab11083（希釈）およびab91506（希釈１：２００）と共に一晩インキュベートした。一次抗体濃度は両方とも、試験スライドにおける最適化後に決定された。対応する蛍光結合二次抗体（Alexa 594およびAlexa 488）を室温で１時間適用した。核を可視化するために、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（DAPI）が二次抗体に添加された。
【0122】
画像の取得と解析
スライドは、カスタマイズされたコンピュータ制御顕微鏡（xyステージおよびzコントローラ、ツァイス顕微鏡、Carl Zeiss GMBh, Jena, Germany）を使用して、X4およびX10対物レンズを用いてスキャンされた。画像は、MATLAB（R2011b, MathWorks）に基づく画像解析ソフトウェアを用いて解析した。スキャン設定のベースラインは、HU対照群を使用して行った。画像解析アルゴリズムを、二次抗体対照で染色した組織の顕微鏡スライドから生成された画像に適用して、バックグラウンドスコアを生成した。対照／ベースラインを使用して、信号と、すべての画像に適用されたシグナル対ノイズ比とを区別するためのアルゴリズムを生成した。各マーカーを、単一チャネルベースの分析によって定量化した。自動バックグラウンド減算を実施した。次いで、すべてのマーカーの強度スコアを計算し、平均シグナル強度をロケール領域で割った値に対応させた。マウス筋組織中の異なる群の染色の相対染色面積および平均比強度の有意差を計算した。生データを提示し、正規化は行わなかった。
スライドは、カスタマイズされたコンピュータ制御顕微鏡（xyステージおよびzコントローラ、ツァイス顕微鏡、Carl Zeiss GMBh, Jena, Germany）を使用して、X4およびX10対物レンズを用いてスキャンされた。画像は、MATLAB（R2011b, MathWorks）に基づく画像解析ソフトウェアを用いて解析した。スキャン設定のベースラインは、HU対照群を使用して行った。画像解析アルゴリズムを、二次抗体対照で染色した組織の顕微鏡スライドから生成された画像に適用して、バックグラウンドスコアを生成した。対照／ベースラインを使用して、信号と、すべての画像に適用されたシグナル対ノイズ比とを区別するためのアルゴリズムを生成した。各マーカーを、単一チャネルベースの分析によって定量化した。自動バックグラウンド減算を実施した。次いで、すべてのマーカーの強度スコアを計算し、平均シグナル強度をロケール領域で割った値に対応させた。マウス筋組織中の異なる群の染色の相対染色面積および平均比強度の有意差を計算した。生データを提示し、正規化は行わなかった。
【0123】
マウスヒラメ組織からのＲＮＡ単離および遺伝子アレイ
遺伝子発現解析を、ヒラメ筋組織試料を用いて行った。３μＬのプロテイナーゼＫ（Quantigene Plex Assay, Invitrogen）を有する３００μＬの均質化溶液を１０ｍｇの凍結組織に添加し、濃縮溶解物を調製した。１つの５ ｍｍステンレス鋼ビーズをチューブに添加し、Bullet Blender（登録商標）ホモジナイザーに入れた。次いで、組織を速度１０で２分間均質化した。チューブを室温で冷却し、可視粒子がなくなるまでこのプロセスを繰り返した。次いで、組織溶解物を６５℃で３０分間インキュベートし、続いて１６，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を（製造業者のガイドラインに従って）アッセイキットに直ちに使用した。全ての遺伝子について、正味平均蛍光強度（MFI）をLuminexから得た。
遺伝子発現解析を、ヒラメ筋組織試料を用いて行った。３μＬのプロテイナーゼＫ（Quantigene Plex Assay, Invitrogen）を有する３００μＬの均質化溶液を１０ｍｇの凍結組織に添加し、濃縮溶解物を調製した。１つの５ ｍｍステンレス鋼ビーズをチューブに添加し、Bullet Blender（登録商標）ホモジナイザーに入れた。次いで、組織を速度１０で２分間均質化した。チューブを室温で冷却し、可視粒子がなくなるまでこのプロセスを繰り返した。次いで、組織溶解物を６５℃で３０分間インキュベートし、続いて１６，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を（製造業者のガイドラインに従って）アッセイキットに直ちに使用した。全ての遺伝子について、正味平均蛍光強度（MFI）をLuminexから得た。
【0124】
表１ NPN_1処置後の倍率調節遺伝子発現。
対照ビヒクルおよびNPN_1処置動物（Ｎ＝１０／群）から採取したヒラメ筋組織試料からRNAを抽出した。筋新生およびミトコンドリア生合成に関連する遺伝子が上方制御された。
対照ビヒクルおよびNPN_1処置動物（Ｎ＝１０／群）から採取したヒラメ筋組織試料からRNAを抽出した。筋新生およびミトコンドリア生合成に関連する遺伝子が上方制御された。
【0125】
【表1】
【0126】
組成物
【0127】
【表2】
【0128】
【表3】
【0129】
【表4】
【0130】
【表5】
【0131】
【表6】
【0132】
【表7】
【0133】
【表8】
【0134】
【表9】
【0135】
局所用組成物は、筋萎縮を患っている対象、または激しい身体活動の後に健康な人に局所的に適用されてもよい。
【0136】
パーセンテージは例にすぎず、使用に応じて任意の好適なパーセンテージを使用することができることが理解されるであろう。
【0137】
乳剤は、以下の方法で調製する：Ａ相：ウルトレス１０（カルボマー）を水中に分散させ、２０分間膨潤させた後、Ｂ相を加え、７５℃に加熱する。Ｃ相を別々に７５℃に加熱する。２つの相を攪拌下で混合し、均質化し、Ｄ相を添加し、Ｅ相で中和し、３０℃に達するまで冷却し、次いでＦ相およびＧ相を添加し、～ＮａＯＨでｐＨを６に調整する。これは例にすぎず、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用してもよいことが理解されるであろう。
【0138】
等価物
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すると、当業者には、その実際における多数の修正および変形が生じることが予想される。これらの修正および変形は、本明細書に添付された特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すると、当業者には、その実際における多数の修正および変形が生じることが予想される。これらの修正および変形は、本明細書に添付された特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】