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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-27
(54)【発明の名称】硝子軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20221020BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20221020BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221020BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20221020BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20221020BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12N5/071
C12Q1/02
A61L27/38 112
A61L27/36 130
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509150
(86)(22)【出願日】2020-08-07
(85)【翻訳文提出日】2022-04-04
(86)【国際出願番号】 EP2020072237
(87)【国際公開番号】W WO2021028335
(87)【国際公開日】2021-02-18
(31)【優先権主張番号】19191756.6
(32)【優先日】2019-08-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522056057
【氏名又は名称】ヴァナリックス エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ティエング，ヴァンナリー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C081
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QR72
4B063QR77
4B065AA90X
4B065AA93X
4B065BB02
4B065BB19
4B065BB23
4B065BD22
4B065BD39
4B065CA44
4C081AB04
4C081BA12
4C081CD34
4C081DA12
(57)【要約】
本発明は、軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための新規の方法、ならびにこれにより産生された軟骨組織を使用する治療上の使用およびスクリーニング方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための方法であって、ｉ）Ｗｎｔシグナリング経路を活性化する脱分化培養培地の接着培養系で軟骨細胞を培養して線維芽細胞様細胞の形態の軟骨細胞を得るステップと、
ｉｉ）Ｗｎｔシグナリング経路を不活性化する再分化培養培地の接着培養系で前記線維芽細胞様軟骨細胞を培養して硝子質マトリックスを再合成する完全な特性を有する軟骨細胞を得るステップと、
ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナリング経路の不活性化を維持する誘導／成熟培養培地の３次元の培養系でステップｉｉ）で得た軟骨細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
前記脱分化培養培地が、ＦＧＦ－２を含み、再分化培養培地および誘導／成熟培養培地が、ＦＧＦ－２フリー培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記脱分化培養培地が、ＦＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦ－β、およびＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子、好ましくはＦＧＦ２を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記再分化培養培地および成熟培養培地が、ＴＧＦ－β、好ましくはＴＧＦ－β３、より好ましくはＴＧＦ－β３およびＦＧＦ７を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記再分化培養培地が、血小板のライセートを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記脱分化培養培地、再分化培養培地、および／または成熟培養培地が、血清を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記成熟培地が、インスリン、ＩＧＦ－１、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
ステップｉｉｉ）において、前記軟骨細胞を、１０（ｖ／ｖ）％未満のＯ２を含む低酸素の雰囲気で培養する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記軟骨細胞を、ステップｉ）において１０～１５日間、ステップｉｉ）において４～８日間、および／またはステップｉｉｉ）において１０～１５日間培養する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ステップｉ）の軟骨細胞を、対象、好ましくはヒトまたはウマの対象の軟骨組織から単離する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
少なくとも１５のＧＡＧ／二本鎖ＤＮＡの比率を提示するスフェロイドの形態の操作された軟骨組織。
【請求項12】
それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置に使用するため、好ましくは自家移植に使用するための、請求項１１に記載の操作された軟骨組織。
【請求項13】
軟骨変性プロセスを阻害する分子をスクリーニングする方法であって、ｉ）請求項１１に記載の軟骨組織を１つ以上の候補分子と接触させるステップと、
ｉｉ）軟骨変性プロセスを阻害する分子を選択するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、硝子軟骨組織（「Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ」）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための新規の方法、ならびにこれにより産生された軟骨組織を使用する治療上の使用およびスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
硝子軟骨は、細胞外マトリックスにより囲まれている、軟骨細胞と呼ばれる特化した細胞から構成されている。このマトリックスは、軟骨細胞により合成および分泌され、主にＩＩ型コラーゲン線維、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、および６０～８０％の水から構成されている。硝子軟骨は、軟骨下骨の上部に４つの層：表層、中間層、深層、および石灰化層を有する。関節の軟骨の生体力学的な特性は、主に、細胞外マトリックスの組成および完全性に依存している。
【0003】
軟骨は、自己修復能が非常に限定されており、損傷後、多くの場合、変形性関節症（ＯＡ）を発症させる。老化および反復性の外傷（たとえば集中的なスポーツの練習の間に起こる）は、膝軟骨の変性の主要なリスク因子である。ＯＡは、多くの人々が罹患しており、高齢者で最も多く発症する（６０歳超の人々で１０％超の有症率）が、一般に、より若い人々も、関節の損傷によりＯＡを罹患する。
【0004】
外科的な処置は、人工関節での関節置換術を含む。しかしながら、人工関節の寿命は、１５～２０年に限定されている。さらに、疼痛の軽減は、患者の大部分において完全に減弱されてはおらず：膝人工関節を有する患者の２０～３０％は、依然として不快感または疼痛を感じ続けている。処置は、大部分が対症療法的であり、疼痛の軽減を目的とする。間葉系幹細胞、ヒアルロン酸、または血小板を多く含む血漿のなどのいくつかの生物学的な作用物質の注入は、関節の悪化を遅らせることができるが、これらは組織の再生を促進するものではない。
【0005】
今のところ、この欠損を満たすための外部の合成のスキャフォールドを使用する戦略は十分なものではなく、関節の軟骨の生体力学的な特性を不完全に模倣している。従来の処置として、病変領域への幹細胞の遊走を刺激するためのマイクロフラクチャー手術、または軟骨細胞の直接的な移植が挙げられる。
【0006】
マイクロフラクチャーの手法は、新規の軟骨細胞を形成し、損傷した組織を置き換えるため血塊の中の骨の髄質からの間葉系幹細胞の遊走を刺激する目的で、軟骨下骨へ小さな孔を作製することから構成される（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｎ）。
【0007】
自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）では、軟骨細胞は、軟骨から抽出され、限定された数の継代で培養され、病変へ移植される。この方法を改善するために、軟骨細胞を培養するためのＩ／ＩＩＩ型ブタコラーゲンまたはヒアルロン酸などのマトリックスが使用され得る（Ｋｏｎ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｐｏｒｔｓ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７（１）：３３－４１； Ｈｅｔｔｒｉｃｈ ＣＭ， Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｄ， ＆ Ｒｏｄｅｏ ＳＡ， ２００８， １６（４）：２３０－２３５）。これらマトリックスは、マイクロフラクチャーの手法の後に病変に直接適用されるか、または再移植前に軟骨細胞を培養するためにｉｎ ｖｉｔｒｏで使用される（Ｅｋｋｅｒｓ ＪＥ， ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２１（７）：９５０－９５６）。
【0008】
自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）を使用する細胞ベースの治療は、２平方センチメートル超の軟骨病変に適応される（Ａｒｍｏｉｒｙ Ｘ． ｅｔ ａｌ． ２０１９， Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ ３７， ８７９－８８６）。軟骨細胞は、軟骨再生にとって合理的な細胞の供給源を表す。実際に、この種の軟骨細胞のみが、硝子軟骨マトリックスの維持に関与していた。
【0009】
主な課題は、軟骨細胞が培養において線維芽細胞様細胞へと脱分化する傾向があり、２次元の細胞培養系において、通常第２または第３の細胞継代で起こる機能の迅速な損失がもたらされることである（Ｍｕｎｉｒａｈ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． ２０１０． Ｔｉｓｓｕｅ ＆ ｃｅｌｌ ４２， ２８２－２９２）。脱分化した軟骨細胞は、硝子軟骨の主な構成要素である、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびＩＩ型コラーゲンの産生の喪失を特徴とし、これらは、線維軟骨に存在するＩ型コラーゲンに置き換わる（Ｗｕ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２０１４． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０， １６０－１６８； Ｂｅｎｙａ， Ｐ． Ｄ ｅｔ ａｌ． １９７８． Ｃｅｌｌ． １５， １３１３－１３２１）。実際に、増幅ステップの間、軟骨細胞は、元の表現型を失うことにより脱分化し、遺伝子発現（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を特徴づけるために使用されるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５などの細胞表面マーカーの発現）において幹細胞様の性質を有する線維芽細胞様細胞（伸長した細胞）となる傾向がある。たとえば、患者の関節軟骨から抽出した軟骨細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養において数回の継代の後に特異的な硝子質マトリックスの軟骨を合成するそれらの軟骨形成能を迅速に失う。線維軟骨は、硝子軟骨とは生体力学的に異なり、線維軟骨は機能不全の修復をもたらすため、有効な長期間持続する処置とはみなされていない。対照的に、軟骨細胞の硝子質の特性は、３次元の培養系で保存されることが知られており（Ｂｅｎｙａ， Ｐ． Ｄ． ＆ Ｓｈａｆｆｅｒ， Ｊ． Ｄ． １９８２． Ｃｅｌｌ ３０， ２１５－２２４）、ｉｎ ｖｉｖｏの環境を模倣している。
【0010】
培養における軟骨形成能の喪失は、特に老年の患者に当てはまる。よって、軟骨細胞ベースの細胞療法の別の課題は、高齢の患者由来の細胞を増殖および分化させることが困難であり、この集団でのそれらの使用が限定されていることである。結果として、大部分の臨床試験は、患者の包含を５５歳に限定している。
【0011】
軟骨を産生させるために軟骨細胞を使用するアイディアは、細胞増殖が元の表現型を維持しながら行うことができる場合に意味をなす。よって、全年齢の患者に固有の特性を模倣している、高品質の硝子質様軟骨組織（高いレベルのＧＡＧ検出を特徴とする）をもたらす軟骨の産生のための標準化された方法を開発することが、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0012】
本試験の主な成果は、増殖の間の軟骨細胞の表現型の喪失（軟骨細胞の脱分化）を反転できる方法である。これは、出発物質として軟骨細胞を使用する細胞療法が直面している重要な問題を解決する。本データは、新規の３ステップの方法が、患者の年齢および関節の関節炎の状態に関わらず、硝子質の特徴を有する高品質の軟骨をもたらし得ることを示している。
【0013】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄ法は、従来のヒト軟骨細胞ベースの細胞療法（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ， Ｍ． ２０１８． Ｉｎｊｕｒｙ ３９ Ｓｕｐｐｌ １， Ｓ４０－４９）における平均２６０ｍｇとは対照的に、非常に小量の軟骨サンプルの回収（本発明者らの前臨床のミニブタでの試験では約３０ｍｇ）からの細胞増殖を可能にし、ドナーの部位の病的状態を低減する。本方法は、以前に報告されている軟骨のマイクロ組織（これら軟骨のマイクロ組織が、硝子質が少なく、より多くの線維軟骨を含むことが示唆されている）（Ｂａｒｔｚ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １４， ３１７）よりも２０倍多いＧＡＧ／Ｃａｒｔｉｂｅａｄの比率を示した。これら結果と一致して、本発明者らは、他の公開されている方法（Ｍｕｍｍｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｌａｎｃｅｔ ３８８， １９８５－１９９４ ； Ｄａｎｇ， Ｐ． Ｎ ｅｔ ａｌ． ２０１４． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ａ ２０， ３１６３－３１７５）よりも平均して少なくとも３倍大きいＧＡＧ／ＤＮＡの比率を得た（図２Ｂ）。
【0014】
再分化は、ＦＧＦ－２の除去によるものであった。しかしながら、３Ｄ培養におけるこの除去は、２ステップの方法において硝子質マトリックスの合成を誘導するには十分ではなかった。軟骨細胞の再分化は、十中八九、２Ｄ培養において、マトリックスでコーティングされたフラスコへの細胞接着および特有の細胞シグナリング経路の誘導を必要とする。
【0015】
本発明者らは、培養において軟骨細胞を増幅するための新規の方法を開発し、患者の年齢とは無関係に軟骨の小片（約３０ｍｇ）からそれらの軟骨形成能を回復させた。第１のステップで、細胞を、２次元の培養においてＦＧＦ－２の支援を伴う細胞外マトリックスで増殖させ、次に第２のステップで、細胞増殖のために使用したＦＧＦ－２を除去することにより、元の表現型へと事前に再分化させた。最終的なステップでは、完全な再分化が、マイクロ組織を形成する自然発生的な細胞凝集を伴う３次元の（３Ｄ）培養において達成される。驚くべきことに、本発明者らは、２Ｄ培養において特に第２のステップでＦＧＦ－２増殖因子を除去することにより、軟骨細胞がＧＡＧと結合したタンパク質であるアグリカンを合成することを通してそれらの元の機能を回復し始めることを示し、また、３Ｄ培養において第３のステップでＦＧＦ－２を継続して除去することにより、コラーゲンＩＩがＧＡＧと併せて合成され、よって、関節軟骨特有の硝子質マトリックスが産生されることを示した。さらに本発明者らは、ＦＧＦ－２を除去することが、増幅ステップの後にＷｎｔシグナリング経路、好ましくはＷｎｔ７Ｂシグナリングの不活性化を誘導し、よって、ｉｎ ｖｉｖｏの軟骨を著しく代表する均一な硝子軟骨の産生を可能にすることを示した。本発明者らは、Ｗｎｔ７Ｂが、脱分化培地（ＭＥ）で活性化され、事前再分化培地（ｐｒｅ－ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＲ）において少なくとも１０倍および成熟培地（ＭＩ）において少なくとも４０倍減少することを示した。ネイティブな軟骨の特徴と可能な限り近い特徴を有する高品質の硝子質マイクロ組織の移植は、軟骨病変の処置の長期間の成功を予想するために重要である（Ｎｅｇｏｒｏ， Ｔ ｅｔ ａｌ． ２０１８．． ｎｐｊ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３， １７ ； Ｍａｄｅｉｒａ， Ｃ ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３， ３５－４２）。
【0016】
よって、操作された軟骨（「Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ」）は、移植の後に軟骨病変に完全に統合する可能性が高い。
【0017】
よって本発明は、軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための方法であって、好ましくは対象から、より好ましくはヒトまたはウマの対象の軟骨組織から単離された軟骨細胞を、好ましくは１０～１５日間、Ｗｎｔシグナリング経路を活性化する脱分化培養培地の接着培養系で培養して線維芽細胞様細胞を得る第１のステップと；好ましくは４～８日間、Ｗｎｔシグナリング経路を不活性化する再分化培養培地の接着培養系で前記線維芽細胞様細胞を培養して軟骨細胞を得る第２のステップと；好ましくは１０～１５日間、Ｗｎｔシグナリング経路を不活性化する成熟培養培地の３次元の培養系で第２のステップで得た軟骨細胞を培養する第３のステップとを含む、方法に関する。好ましい実施形態では、上記脱分化培養培地は、ＦＧＦ－２を含み、好ましくは再分化培養培地および／または成熟培養培地は、ＦＧＦ－２フリー培地である。上記脱分化培養培地は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦ－β、およびＥＧＦからなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子を含み得る。上記再分化培地および成熟培養培地は、ＴＧＦ－β、好ましくはＴＧＦ－β３、より好ましくはＴＧＦ－β３およびＦＧＦ－７を含み得る。別の実施形態では、上記再分化培地は、血小板のライセートを含み得る。特に、上述の全ての培養培地は、血清を含み得る。上記成熟培地は、インスリン、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ－２、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも１つの成分を含み得る。
【0018】
特定の実施形態では、第３のステップにおいて、上記軟骨細胞は、１０（ｖ／ｖ）％未満のＯ２を含む低酸素の雰囲気において培養される。
【0019】
別の態様では、本発明は、少なくとも１５のＧＡＧ／二本鎖ＤＮＡの比率（ｒａｔｉｏｎ）を提示するスフェロイド（Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ）の形態の操作された軟骨組織に関する。上記操作された軟骨組織は、それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置、好ましくは自家移植で使用され得る。
【0020】
最後に、本発明はまた、軟骨変性プロセスを阻害する分子をスクリーニングする方法であって、上述の操作された軟骨組織を１つ以上の候補分子と接触させるステップと、軟骨変性プロセスを阻害する分子を選択するステップとを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】３ステップの方法で操作されたＣａｒｔｉｂｅａｄｓの性質決定。ａ．脱分化した軟骨細胞由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓの作製のための３ステップの方法のスキーム：ステップ１（増殖）、ステップ２（再分化）は、酸素（２１％）の大気条件において２Ｄで行い、ステップ３（Ｃａｒｔｉｂｅａｄの形成）は、酸素（５％）の低酸素の条件において３Ｄ培養で行った。ｂ、前臨床試験の図面：ヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓのＳＣＩＤマウスでの安全性およびミニブタでの有効性を評価するためのヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓの使用。ｃ、固定したサンプル由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓの組織学的な分析。３つの独立したドナーから得たＣａｒｔｉｂｅａｄｓの、硝子軟骨を特徴づけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色（上部のパネル）およびＩＩ型コラーゲンの強力な免疫検出（ＤＡＢ染色、中央）、ならびに弱いＩ型コラーゲンの検出（下部パネル）の代表的な画像。スケールバー２００μｍ。ｄ、１５名のドナー（黒色のドット）および３つのネイティブな軟骨対照（四角）由来の、ジメチルメチレンブルーアッセイ（ＤＭＭＢ）で決定した、μｇ／ｍｇ組織で表されるＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の生化学的な定量化。ｅ、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの生体力学的な特性は、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの弾性を測定する圧縮試験（ヤング率）により決定される。応力－ひずみの曲線は、３名のドナーから表されており、大きなＣａｒｔｉｂｅａｄｓで制約の増大を示す。
【図2】全てのドナー由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧの量。ａ、ＤＭＭＢアッセイによるＣａｒｔｉｂｅａｄあたりのＧＡＧ含有量の生化学的な定量化。ｂ、ＧＡＧ／ＤＮＡの比率（μｇ／μｇ）で表される、ＤＮＡ含有量に対して正規化した、ＣａｒｔｉｂｅａｄのＧＡＧ含有量の生化学的な定量化。
【図3】高酸素および低酸素レベルならびに３ステップおよび２ステップの方法で作製したＣａｒｔｉｂｅａｄｓの比較。ａ、３名のドナーでの低酸素条件下にて３ステップの方法で作製されたＣａｒｔｉｂｅａｄｓの巨視的な図。ｂ、Ｃａｒｔｉｂｅａｄの切片におけるＧＡＧのサフラニンＯ染色を、１名のドナーにて４つの異なる条件下で作製した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓは、高酸素レベルおよび低酸素レベル（２１％および５％）を伴う培養条件下で、３ステップおよび２ステップの方法により作製した。写真は、３名のドナーを代表している。スケールバー２００μｍ。ｃ、３名のドナーでの４つの異なる条件下でのＧＡＧ／Ｃａｒｔｉｂｅａｄの量の評価。
【図4】Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの安定性。ａ、３ステップの方法が完了した後のＣａｒｔｉｂｅａｄｓ、ならびにクローズドなレシピエントにおいて、３７℃（５％のＯ２でのインキュベーター）ならびに４℃および室温（ＲＴ）にてさらに６日間放置されたＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧの生化学的な定量化。ｂ、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの中の死細胞の数を、赤色蛍光色素染色により定量的に評価した。死細胞の陽性対照は、蛍光染色前に１０％のトリトンで事前に処置したＣａｒｔｉｂｅａｄｓであった。スケールバー１００μｍ。
【図5】２ステップの方法と比較した３ステップの方法から操作したＣａｒｔｉｂｅａｄｓの硝子質の特徴の改善。ａ、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの作製のための２ステップの方法のスキーム。Ｃａｒｔｉｂｅａｄの作製のため、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｏｃｙｔｅ）を、ステップ１において培地Ｅで増殖させ、ステップ２において培地Ｉにて直接使用した。ｂ、３ステップ対２ステップの発現に基づく遺伝子セットのエンリッチメント解析の機能的な注釈のクラスター化。ヒストグラムは、有意なエンリッチメントが見出された遺伝子の各ファミリーにおける遺伝子の数を示している。薄灰色では、遺伝子は、３ステップの方法由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓの高いレベルの発現を伴い、濃灰色では、遺伝子は上記より低い発現を伴う。ｃ、統計的な有意性（ＦＤＲ＜０．００１）対変化の大きさ（２超の倍差）を示すＶｏｌｃａｎｏプロットを用いたＲＮＡｓｅｑの結果の可視化。Ｖｏｌｃａｎｏプロットは、２ステップと比較して３ステップの方法で増大しているＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１、ならびに減少しているＣＯＬ１Ａ１などの統計的に有意である倍差を有する遺伝子を強調している。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１ ｄ、ｅ、ｆ ３ステップおよび２ステップの方法でＡＣＡＮ（ｄ）、ＣＯＬ２Ａ１（ｅ）、およびＣＯＬ１Ａ１（ｆ）の遺伝子の（ＲＰＫＭにおける）ｍＲＮＡ発現レベルを比較したＲＮＡＳｅｑ解析からのデータ。ＮＡ（該当なし）は、ステップ自体の非存在による分析の非存在を表す。ｇ、３ステップの方法および２ステップの方法からもたらされたＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色。スケールバー１００μｍ。
【図6】ＭＳＣマーカー発現。ａ、左から右へそれぞれＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を表すフローサイトメトリー。ｂ、骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞を提供する脂肪組織幹細胞（ＡＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および軟骨細胞の可能性を比較した分化試験。アリザリンレッドＳは、成熟骨細胞の指標であるカルシウム沈着物を染色するために使用される色素であり（上部のパネル）、オイルレッドＯは、脂肪細胞の中性脂質の特徴を染色し（中央のパネル）、サフラニン－Ｏは、軟骨細胞のＧＡＧを染色した（下部のパネル）。スケールバー１００μｍ。
【図7】ＷＮＴシグナリングの阻害は、硝子質マトリックス成分の産生を高める。ａ、３ステップの方法における培地Ｒ対培地Ｅの差次的な発現レベルに基づく遺伝子セットのエンリッチメント解析および機能的なグループ化。グラフは、各遺伝子ファミリーのエンリッチメントを示す（差次的に発現される遺伝子の数）。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１ ｂ、３ステップの方法における培地Ｒ対培地Ｅの軟骨細胞からのＲＮＡｓｅｑの結果のＶｏｌｃａｎｏプロット。ｃ．ＲＮＡｓｅｑ分析由来のデータは、ｋｉ６７（増殖マーカー）（上部のパネル）；ＴＣＦ４（ｗｎｔ／βカテニン経路の下流に含まれている）（中央のパネル）、ＳＯＸ９（マトリックスの産生に関与する転写因子）（下部のパネル）に関するＲＰＫＭにおけるｍＲＮＡ発現を示している。ｄ、ｅ、ｆ ＲＮＡｓｅｑからのデータは、３ステップおよび２ステップの方法における培地Ｅ、Ｒ、およびＩの中の軟骨細胞のＷＮＴ５Ａ（ｄ）、ＷＮＴ５Ｂ（ｅ）、およびＷＮＴ７Ｂ（ｆ）のＲＰＫＭにおけるｍＲＮＡ発現を示す。ＮＡ（該当なし）は、ステップ自体の非存在による分析の非存在を表す。ｇ、イムノブロットは、軟骨細胞におけるＷＮＴシグナリング阻害剤ＸＡＶ－９３９（１０μＭ）の存在下での指定されたタンパク質の発現を示す。ヒストグラムは、対照と比較したβ－カテニンおよびアキシンのデンシトメトリー分析を示す。ｈ、ｉ、ＡＣＡＮおよびＣＯＬ２Ａ１のｍＲＮＡ発現を、培地Ｅ、培地Ｅ＋ＸＡＶ－９３９の培養における４日後の軟骨細胞、ならびに培地Ｅおよび培地＋ＸＡＶ－８３９で培養した軟骨細胞由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓ（２ステップの方法）において、ｑＰＣＲにより決定した。ｊ、培地Ｒ（３ステップの方法）および培地Ｅ＋ＸＡＶ－９３９（２ステップの方法）で培養した軟骨細胞から作製したＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色の代表的な画像。スケールバー１００μｍ。ｋ、スキームは、培地ＥにおけるＷＮＴシグナリング経路の分子の基盤、ならびに、軟骨細胞が、ＡＣＡＮおよびＩＩ型コラーゲンを含む硝子質マトリックスの産生を可能にする、培地Ｒまたは培地Ｅ＋ＸＡＶ９３９で培養される場合のＷＮＴ阻害をまとめている。
【図8】ヒトの膝のｅｘ ｖｉｖｏでのＣａｒｔｉｂｅａｄｓのグラフトの実現可能性。ａ、外科的な機器を用いて手動で作製した病変（左）、１日目にグラフトしたＣａｒｔｉｂｅａｄｓ（中央）、培地Ｉにおいて回転させながら培養した後のグラフトから１カ月後のビーズを伴う病変（右）を示す全人工膝関節置換術後の大腿骨遠位部の巨視的な図。スケールバー４ｍｍ。ｂ、ｅｘ ｖｉｖｏの標本の断面のサンプルのＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色は、共に融合したＣａｒｔｉｂｅａｄｓが、高い倍率により示されるように、硝子質を保持しており、ネイティブな軟骨と統合していることを示している（左および右のパネル）。データは、３つの独立した実験の代表である。スケールバー１ｍｍ。
【図9】免疫不全マウスにおけるグラフト後のヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓの腫瘍形成能の非存在。ａ、移植から２カ月後のＣａｒｔｉｂｅａｄ（０．２×１０６個の軟骨細胞／ｃａｒｔｉｂｅａｄ）（上部パネル）およびマウスの背中への皮下グラフト後のグラフトから６週間後の５つのＡ５４９のビーズ（０．２×１０６個のＡ５４９細胞／ビーズ）に由来する腫瘍（黒色の矢印、左のパネル）の代表的な写真。ｂ、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１名のＣａｒｔｉｂｅａｄドナーでは１０～１４匹のマウスおよび２×ｎ＝Ａ５４９ビーズあたり４匹のマウス）あたり１つのＣａｒｔｉｂｅａｄ、１または５つのビーズのＡ５４９細胞の皮下移植後の腫瘍の発達。ｃ、グラフト前（中央のパネル）および後（右のパネル）のＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色。スケールバー２００μｍ。
【図10】自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの移植の後のミニブタの膝における硝子質のグラフトの統合。ａ．スキームは、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの作製のために使用した生検の主要な部位、および５つの病変／膝の作製と自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの移植とを組み合わせた第二の外科手術を記載している。ｂ、６匹のミニブタのＧＡＧの生化学的な定量化（μｇ／Ｃａｒｔｉｂｅａｄ）。ｃ－ｄ、巨視的な図（左のパネル）およびミニブタの膝の切片のＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色（中央のパネル）、ここで拡大されたセグメントは、移植から３および６カ月後の組織のリモデリングを示している。移植部位は、黒色で丸が付されており、白色の丸は、対照としての空の病変を表す（右のパネル）。移植した病変（中央のパネル）および空の病変（右のパネル）の代表的な染色は、３カ月（ｃ）および６カ月（ｄ）で示されている。スケールバー２００μｍ。
【図11】ミニブタにおけるブタのＣａｒｔｉｂｅａｄの移植は、硝子質が統合したグラフトをもたらす。ａ、この試験で使用した６匹のミニブタに関する移植前のＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色（上部のパネル、スケールバー２００μｍ）および膝の巨視的な図（中央のパネル）およびグラフトした病変におけるＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色（下部のパネル、スケールバー２００μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明は、以下に記載の軟骨細胞の培養の３つのステップを含む、軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための方法に関する。
【0023】
軟骨細胞は、主にそれらが産生する細胞外マトリックスの種類に基づく特徴的な表現型を有する間葉系細胞から生じる。前駆体細胞はＩ型コラーゲンを産生するが、これらは軟骨細胞系列にコミットされるようになると、Ｉ型コラーゲンの産生を減らし、硝子質細胞外マトリックスの実質的なタンパク質を構成するＩＩ型コラーゲンの合成を開始する。さらに、コミットされた軟骨細胞は、プロテオグリカンを産生し、これは、著しく硫酸化されているグリコサミノグリカンに結合したアグリカンである。
【0024】
用語「軟骨細胞」は、本明細書中使用される場合、硝子質マトリックスを合成する完全な特性を有する軟骨から得た分化した細胞（コミットした軟骨細胞）を表す。用語軟骨細胞は、（生検から新鮮な状態で単離された）初代培養、および遺伝的に修飾、不死化、選択、保存されたものなどを含むｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した細胞を表す。
【0025】
対象の軟骨細胞の単離
本発明の方法では、第１のステップにおいて、軟骨細胞を、対象、好ましくは対象、より好ましくはヒトまたはウマの対象の膝、足首、尻、指、または肩から単離する。軟骨細胞は、従来の方法により、たとえばトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラスターゼ、およびヒアルロニダーゼなどの酵素による組織の消化を使用して、成熟軟骨組織の生検から単離する。軟骨組織は、好ましくは直径５ｍｍ未満（約３０ｍｇに相当する）の、非常に小さな小片であり得る。軟骨組織は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの軟骨またはウマの軟骨である。軟骨組織は、健常なドナーから、または患者、好ましくは患者の膝、足首、尻、指、肩、より好ましくは膝または足首から回収され得る。
本発明の方法では、第１のステップにおいて、軟骨細胞を、対象、好ましくは対象、より好ましくはヒトまたはウマの対象の膝、足首、尻、指、または肩から単離する。軟骨細胞は、従来の方法により、たとえばトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラスターゼ、およびヒアルロニダーゼなどの酵素による組織の消化を使用して、成熟軟骨組織の生検から単離する。軟骨組織は、好ましくは直径５ｍｍ未満（約３０ｍｇに相当する）の、非常に小さな小片であり得る。軟骨組織は、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの軟骨またはウマの軟骨である。軟骨組織は、健常なドナーから、または患者、好ましくは患者の膝、足首、尻、指、肩、より好ましくは膝または足首から回収され得る。
【0026】
第１のステップ：脱分化培地での接着培養
まず、単離した軟骨細胞を、脱分化培養培地の接着培養系で培養する。
まず、単離した軟骨細胞を、脱分化培養培地の接着培養系で培養する。
【0027】
本発明に係る方法での使用に適切な接着培養系は、接着性単層培養系またはフィーダー細胞上の培養系、好ましくは接着性単層培養系であり得る。培養系は、本発明に係る方法に適したいずれかの形態、特にフラスコ、複数のウェルプレート、またはディッシュの形態であり得る。
【0028】
好ましい実施形態では、接着培養系は、接着性単層培養系である。この系は、通常細胞の接着を促進するマトリックスまたは基質でコーティングされている、固体の担体、たとえばガラスまたはプラスティックを含む。基質は、接着因子からなり、担体への細胞の接着を促進するタンパク質の基質であり得る。これら接着因子は、特に、ポリ－Ｌ－リジン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、またはゼラチンから選択され得る。
【0029】
細胞外マトリックスを模倣し、本発明に係る方法での使用に適したマトリックスは、当業者によく知られており、多くの種類が市販されている。これらマトリックスは、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）のタイプ、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）のマトリックス、またはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、アミノグリカン、もしくはビトロネクチンなどの１つ以上のアンカータンパク質を含む他のマトリックスを含む。３次元のハイドロゲル型のマトリックスもまた使用され得る。好ましい実施形態では、マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のタイプまたはＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅである。
【0030】
軟骨細胞は、線維芽状態（線維芽細胞様形態）と称される前駆体／未分化状態の細胞を増幅および脱分化させることを可能にする培地の接着培養系で培養される。特に、脱分化培地は、線維芽細胞様細胞の形態を有する脱分化した軟骨細胞であり幹細胞の特徴を呈する、線維芽細胞様軟骨細胞とも称される、線維芽細胞様細胞への軟骨細胞の増殖および脱分化を可能にする培養培地である。好ましくは、脱分化培地は、軟骨細胞を、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、および／またはＣＤ７３などの間葉系幹細胞表面マーカーを発現する線維芽細胞様細胞へと脱分化することを可能にする。線維芽細胞様細胞は、硝子質マトリックス（コラーゲン２およびＧＡＧ）を合成する特性を失った脱分化した軟骨細胞である。脱分化培地は、軟骨細胞を未分化状態で増幅および脱分化させる少なくとも１種以上の成分を含む基本培地である。
【0031】
多くの基本培地が市販されており、当業者によく知られている。この培地は、特に細胞に重要な無機塩、アミノ酸、ビタミン、および炭素供給源、ならびにｐＨを調節するためのバッファー系を含む最小培地であり得る。本発明に係る方法で使用できる基本培地として、たとえば限定するものではないが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、およびＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
【0032】
使用される培地に応じて、グルタミン、ビタミンＣ、１つ以上の抗生剤、たとえばストレプトマイシン、ペニシリン、および／または抗真菌剤、たとえばファンギゾン（アンホテリシンＢ）を添加することが必要または望ましいとされ得る。
【0033】
本発明では、脱分化培地は、Ｗｎｔシグナリング経路を活性化する。
【0034】
活性状態では、Ｗｎｔリガンドはｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体およびそれらの共受容体、リポタンパク質－受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）５／６に結合する。これは、その後ＧＳＫ３βの活性およびβ－カテニンのリン酸化を阻害するＤＳＨ（ｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ）を活性化する。β－カテニンは、核に移動され、転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ（Ｔ細胞に特異的な転写因子／リンパ系エンハンサー結合因子）と相互作用する。不活性状態では、β－カテニンは、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３βによりリン酸化され、リン酸化したβ－カテニンは、その後ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）およびプロテアソームの分解を経る。
【0035】
好ましい実施形態では、脱分化培地は、Ｗｎｔシグナリング、好ましくはＷｎｔ７Ｂシグナリングを活性化する１つの化合物を含む基本培地である。
【0036】
Ｗｎｔシグナリング経路の活性化は、脱分化した軟骨細胞において、ｗｎｔ ＲＮＡ、特にｗｎｔ７Ｂ、ｗｎｔ５Ａまたはｗｎｔ５Ｂ、好ましくはｗｎｔ７Ｂ ＲＮＡおよびＷｎｔシグナリング経路の下流の標的遺伝子、たとえばＴＣＦ４の発現レベルを測定することにより決定され得る。細胞でのＷｎｔシグナリング経路の活性化は、標的遺伝子の発現レベルが上記化合物を伴わずに培養された細胞でよりも少なくとも１．５倍高い、または２、３、４、５倍高い場合に生じる。
【0037】
ｍＲＮＡの発現レベルは、当業者に知られているいずれかの適切な方法により決定され得る。通常、これら方法は、ｍＲＮＡの量を測定することを含む。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当該分野でよく知られている。たとえば、サンプルに含まれる核酸は、最初に標準的な方法により、たとえば溶解性の酵素もしくは化学的な溶液を使用して抽出されるか、または製造社の指示に従い核酸に結合する樹脂により抽出される。次に、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（たとえばノーザンブロット分析）、増幅（たとえばＲＴ－ＰＣＲ）、またはシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）により検出される。
【0038】
また標的遺伝子のタンパク質のレベルは、当業者に知られているいずれかの適切な方法により決定され得る。通常、これら方法は、細胞サンプル、好ましくは細胞のライセートを、サンプルに存在する標的遺伝子のタンパク質と選択的に相互作用できる結合パートナーと接触させることを含む。この結合パートナーは、全般的に、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。タンパク質の量は、たとえば、半定量的なウェスタンブロット、酵素標識イムノアッセイおよび酵素が介在するイムノアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ、ビオチン／アビジン型のアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、もしくは免疫沈降によるか、またはタンパク質もしくは抗体のアレイにより、測定され得る。
【0039】
特に、Ｗｎｔシグナリング経路を活性化できる化合物は、Ｗｎｔ受容体に結合するＷｎｔタンパク質または小分子ＧＳＫ－３βアンタゴニスト、好ましくはＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ５Ａ、またはＷＮＴ５Ｂ、より好ましくはＷＮＴ７Ｂであり得る。
【0040】
上記Ｗｎｔシグナリング経路を活性化できる化合物は、塩化リチウム（ＣＡＳ番号７４４７－４１－８）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号２５２９１７－０６－９）、ＳＢ－２１６７６３（ＣＡＳ番号２８０７４４－０９－４）、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）（ＣＡＳ番号６６７４６３－６２－９）からなる群から選択され得る。
【0041】
好ましい実施形態では、上記化合物は、ｂＦＧＦとしても知られているＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子－２）または線維芽細胞増殖因子の基本的な形態である。
【0042】
Ｗｎｔシグナリング経路の活性化は、軟骨細胞を線維芽細胞様細胞へと増幅および脱分化することを可能にする。好ましい実施形態では、脱分化培地は、少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含む。好ましくは、この培地は、５～１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２を含む。
【0043】
本発明では、少なくとも１つの態様において、好ましくは本発明の方法において軟骨細胞を増幅するための、ＦＧＦ２分子と同様の方法で軟骨細胞に作用するポリペプチドなどのいずれかの分子が、使用され得る。
【0044】
未分化状態の細胞を増幅および脱分化するように軟骨細胞を支援するさらなる成分は、特に制限されてはおらず、目的に応じて適宜選択され得る。この成分の例として、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）が挙げられる。上述の他の成分は、それぞれ、単独で使用されてもよく、またはそれらの複数が、Ｗｎｔシグナリング経路を活性化できる化合物と組み合わせて使用され得る。
【0045】
特定の実施形態では、脱分化培地は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、およびＰＤＧＦ－ＢＢ、ならびにそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の増殖因子をさらに含み得る。この実施形態では、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、およびＴＧＦ－βは、それぞれ、１～１００ｎｇ／ｍＬの範囲、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。より特定の実施形態では、上記ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β３である。
【0046】
特定の実施形態では、本発明に係る方法において、ヒト軟骨細胞は、ＦＧＦ－２、ＰＤＧＦ－ＢＢおよびＴＧＦ－β３、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、１～１００ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ－ＢＢおよび１～１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３、より好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、５～５０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ－ＢＢ、および５～５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３を含む脱分化培地で培養される。
【0047】
別の特定の実施形態では、本発明に係る方法において、ウマ軟骨細胞が、ＦＧＦ－２およびＥＧＦ、好ましくは５～１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２および１～１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、より好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２および５～５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む脱分化培地で培養される。
【0048】
好ましい実施形態では、脱分化培地は、動物起源の血清をさらに含む。好ましい実施形態では、自家血清が使用される。異種または同種異系間の血清を使用することも可能である。特に、ヒト軟骨細胞の培養では、ヒト患者由来または集められたヒト血清由来の自家血清が使用され得る。特定の実施形態では、ウマ軟骨細胞の培養では、ウシ胎仔血清が使用され得る。培地は、好ましくは２～２０％、好ましくは５～１５％、より好ましくは１０％の血清を含む。
【0049】
特定の実施形態では、軟骨細胞は、１０～２０日間、好ましくは１０～１５日間、脱分化培地と接触させる。
【0050】
細胞は、好ましくは、培養物がコンフルエンスを達成しないように、すなわち利用可能な表面全体を覆わないように定期的に継代培養される。実際に、コンフルエンスは、増殖の停止および望ましくない代謝上の変化を誘導する。細胞は、当業者によく知られている標準的な技術を使用して継代培養され得る。これらは特に、コラゲナーゼＩＶなどの酵素の作用によるか、またはＥＤＴＡを含むＰＢＳもしくは他のいずれかの酵素フリーの溶液（たとえばＲｅｌｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））での機械的な継代によるか、またはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販の細胞脱離培地の作用によりマトリックスまたは担体から脱離されてもよく、遠心により回収されてもよく、機械的に解離されてもよく、新規の培養系に再播種されてもよい。
【0051】
第２のステップ：再分化培地での接着培養
細胞増殖のための脱分化培地で使用されるＷｎｔシグナリング経路を、培養の第２の中間のステップにおいて不活性化することにより、驚くべきことに本発明者らは、３次元系の培養によって、軟骨細胞が完全な元の表現型および硝子質マトリックスを合成するための完全な特性を回復させたことを示した。
細胞増殖のための脱分化培地で使用されるＷｎｔシグナリング経路を、培養の第２の中間のステップにおいて不活性化することにより、驚くべきことに本発明者らは、３次元系の培養によって、軟骨細胞が完全な元の表現型および硝子質マトリックスを合成するための完全な特性を回復させたことを示した。
【0052】
よって、本発明に係る方法は、Ｗｎｔシグナリング経路、好ましくはＷｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ５Ａ、またはＷｎｔ５Ｂ、好ましくはＷｎｔ７Ｂシグナリング経路を不活性化する再分化培地を伴う上述の接着培養系において、第１のステップで得た線維芽細胞様細胞を培養する中間のステップをさらに含む。軟骨細胞は、この再分化培地と接触して、線維芽細胞の表現型を反転し、線維芽細胞様細胞を、硝子質マトリックスを合成する完全な特性を有する軟骨細胞へと再分化する。この第２のステップでは、細胞は自身の形態を変え、伸長は少なく、より大きくなり、光学顕微鏡下で細胞質に明らかな顆粒状の小胞体を伴うことにより、高レベルのタンパク質合成活性をシグナリングする。軟骨細胞は、ＧＡＧと結合したプロテオグリカンである、アグリカンを再発現し始める。コラーゲンＩＩは、第２のステップの終了時には再発現されない。
【0053】
好ましくは、接触は、単純に培養培地を変えることにより行われる。あるいは、これは、復帰培地を含む上述の接着培養系で継代培養することにより行われ得る。
【0054】
一実施形態では、接着培養系は、上述の接着性単層培養系である。好ましい実施形態では、マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のタイプ、またはＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅである。
【0055】
第１の実施形態では、再分化培地は、上述のＷｎｔシグナリング経路を活性化する化合物が除去されている基本培地を含む再分化培地であり得る。
【0056】
化合物を除去することにより、上記再分化培地は、Ｗｎｔシグナリング経路の活性化を可能にしない濃度で化合物を含むことが意図される。
【0057】
より好ましい実施形態では、上記再分化培地は、ＦＧＦ－２フリーの再分化培地である。上記ＦＧＦ－２フリーの再分化培地は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ－２、好ましくは０．４、０．３、０．２、０．１ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ－２を含む基本培地を含む。
【0058】
別の実施形態では、上記再分化培地は、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害剤を含む基本培地である。
【0059】
上記Ｗｎｔシグナリング経路の阻害剤は、Ｄｖｌタンパク質を標的とする化合物、たとえばＮＳＣ６６８０３６（ＣＡＳ番号１４４６７８－６３－７）、３２８９－８６２５（ＣＡＳ番号２９４８９１－８１－９）、Ｊ０１－０１７ａ、ＴＭＥＭ８８、ＫＹ－０２０６１、ＫＹ－０２３２７、ＢＭＤ４７０２（ＣＡＳ番号３３５２０６－５４－７）、ニクロサミド（ＣＡＳ番号５０－６５－７）、ＤＫ－５２０、スリンダク（ＣＡＳ番号３８１９４－５０－２）；β－カテニン破壊複合体を標的とする化合物、たとえばＰｙｒｖｉｎｉｕｍ（ＣＡＳ番号７１８７－６２－４）；天然の化合物、たとえばｄｅｒｒｉｃｉｎ（ＣＡＳ番号３４２１１－２５－１）、ｄｅｒｒｉｃｉｄｉｎ（ＣＡＳ番号３８９６５－７４－１）、カルノシン酸（ＣＡＳ番号３６５０－０９－７）；ＴＣＦ／ＬＥＦ転写レポーターを標的とする化合物、たとえばＩＣＧ－００１（ＣＡＳ番号８４７５９１－６２－２）、ＰＮＵ－７４６５４（ＣＡＳ番号１１３９０６－２７－７）、Ｗｉｎｄｏｒｐｈｅｎ（ＣＡＳ番号１９８８１－７０－０）；Ｐｒｅｎを標的とする化合物、たとえばＩＷＰ－Ｌ６（ＣＡＳ番号１４２７７８２－８９－５）、Ｗｎｔ－Ｃ５９（ＣＡＳ番号１２４３２４３－８９－１）、ＬＧＫ９７４（ＣＡＳ番号１２４３２４４－１４－５）、ＥＴＣ－１５９（ＣＡＳ番号１６３８２５０－９６－０）、ＴＮＫＳを標的とする化合物、たとえばＸＡＶ９３９（ＣＡＳ番号２８４０２８－８９－３）、Ｅ７４４９（ＣＡＳ番号１１４０９６４－９９－３）からなる群から選択される小分子、好ましくはＸＡＶ９３９であり得る。
【0060】
別の実施形態では、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）もまた、Ｗｎｔ経路のシグナリングに関与する少なくとも１つのタンパク質の遺伝子発現レベルを減らすために使用され得る。好ましい実施形態では、上記Ｗｎｔシグナリングタンパク質の遺伝子発現は、細胞に小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小さな二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくはコンストラクトを導入することによってＷｎｔシグナリング経路が不活性化されることにより、低減され得る（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。その配列が知られている遺伝子について適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当該分野でよく知られている（たとえばＴｕｓｃｈｌ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （２００１）； Ｈａｎｎｏｎ， ＧＪ． （２００２）； ＭｃＭａｎｕｓ， ＭＴ． ｅｔ ａｌ． （２００２）； Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， ＴＲ． ｅｔ ａｌ． （２００２）；米国特許第６，５７３，０９９号および同第６，５０６，５５９号；および国際特許公開公報第０１／３６６４６号、同第９９／３２６１９号、および同第０１／６８８３６を参照）。
【0061】
別の実施形態では、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）もまた、Ｗｎｔシグナリングタンパク質の遺伝子発現レベルを減少させるために使用され得る。小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用され得るタイトなヘアピンターンを形成するＲＮＡの配列である。細胞でのｓｈＲＮＡの発現は、通常、プラスミドの送達によるかまたはウイルスベクターもしくは細菌ベクターを介して達成される。プロモーターの選択は、強力なｓｈＲＮＡ発現を達成するために重要である。最初は、Ｕ６およびＨＩなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用された；しかしながら、これらプロモーターは、空間的および時間的な制御を欠いている。よって、ｓｈＲＮＡの発現を調節するためにポリメラーゼＩＩプロモーターの使用へとシフトしている。
【0062】
好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ５Ａ、またはβ－カテニン、好ましくはＷｎｔ７Ｂの遺伝子発現レベルを減らすために使用される。
【0063】
基本培養培地は、特に細胞に重要な無機塩、アミノ酸、ビタミン、および炭素供給源、ならびにｐＨを調節するためのバッファー系を含む最小培地であり得る。本発明に係る方法で使用することができる基本培地として、たとえば限定するものではないが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＩＭＤＭ培地、およびＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
【0064】
特定の実施形態では、再分化培地は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ－２を含む基本培地を含み、軟骨細胞へ再分化させるように線維芽細胞様細胞を促進する少なくとも１つ以上の成分を含むＦＧＦ－２フリーの再分化培地である。
【0065】
特定の実施形態では、再分化培地は、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、より好ましくはＴＧＦ－β３を含み、好ましくは、再分化培地は、１～１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３、より好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３を含む。
【0066】
より特定の実施形態では、再分化培地は、ケラチノサイト増殖因子としても知られているＦＧＦ－７をさらに含む。ＦＧＦ－７は、細胞増殖および細胞分化に関与する。好ましくは、再分化培地は、１～１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－７、より好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－７を含む。
【0067】
特定の実施形態では、使用される再分化培地は、上述の動物起源の血清をさらに含む。
【0068】
好ましい実施形態では、上記ＴＧＦ－β、ＦＧＦ－７、および／または血清は、血小板のライセートに置き換えられている。血小板のライセートは、凍結／融解サイクル後の血小板に由来する増殖因子を多く含む細胞培養サプリメントである。凍結／融解サイクルは、血小板を溶解させて、細胞増殖に必要な大量の増殖因子を放出する。好ましい実施形態では、再分化培地は、５～２０％、好ましくは１０％の血小板のライセートを含む。好ましい実施形態では、上記血小板のライセートは、集められたヒト血小板のライセートである。
【0069】
軟骨細胞の分化に影響し得る成分は、特に限定されてはおらず、目的に応じて適宜選択され得る。この成分の例として、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）、形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、セレニウム、トランスフェリン、エタノールアミン、血小板由来増殖因子が挙げられる。上述の他の成分はそれぞれ、単独で使用されてもよく、またはそれらのうちの複数を組み合わせて使用してもよい。
【0070】
特定の実施形態では、軟骨細胞は、２～１０日間、好ましくは３～７日間、より好ましくは７日間、再分化培地と接触させる。
【0071】
細胞は、培養物がコンフルエンスに達しないように、すなわち利用可能な表面全体を覆わないように、定期的に継代培養され得る。実際に、コンフルエンスは、増殖の停止および望ましくない代謝上の変化を誘導する。細胞は、上述の当業者によく知られている標準的な技術を使用して継代培養され得る。
【0072】
第３のステップ：誘導／成熟培地における３Ｄ培養系
軟骨組織の形成を可能にするために、次に、第２のステップで得た軟骨細胞を、誘導培地とも称される成熟培地において３次元の培養系で培養する。このステップで、軟骨細胞は、自身の細胞外マトリックスを産生して軟骨組織を形成し、特にＩＩ型のコラーゲンの合成を開始する。得られた軟骨組織は、様々な大きさの３次元の組織であり、スフェロイドと呼ばれ得る。上記スフェロイドは、スフェロイドに含まれる細胞およびこれら細胞により形成される硝子質マトリックスから構成される。
軟骨組織の形成を可能にするために、次に、第２のステップで得た軟骨細胞を、誘導培地とも称される成熟培地において３次元の培養系で培養する。このステップで、軟骨細胞は、自身の細胞外マトリックスを産生して軟骨組織を形成し、特にＩＩ型のコラーゲンの合成を開始する。得られた軟骨組織は、様々な大きさの３次元の組織であり、スフェロイドと呼ばれ得る。上記スフェロイドは、スフェロイドに含まれる細胞およびこれら細胞により形成される硝子質マトリックスから構成される。
【0073】
成熟培地は、軟骨細胞に硝子質マトリックスを産生させ軟骨組織を形成させる少なくとも１つ以上の成分を含む基本培地である。
【0074】
特に、成熟培地は、Ｗｎｔシグナリング経路を不活性化する。一実施形態では、成熟培地は、上述のＷｎｔシグナリング経路を活性化する化合物が除去されている基本培地を含む。別の実施形態では、上記成熟培地は、上述のＷｎｔシグナリング経路の阻害剤を含む基本培地である。
【0075】
好ましい実施形態では、上記成熟培地は、ＦＧＦ－２増殖因子が除去されている基本培地である。他の用語では、成熟培地は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ－２、好ましくは０．４、０．３、０．２、０．１ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ－２を含む基本培地である。
【0076】
軟骨細胞の成熟に影響し得る成分は、特には限定されておらず、目的に応じて適宜選択され得る。この成分の例として、ＴＧＦ－β増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ－１）、形質転換増殖因子β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、セレニウム、トランスフェリン、エタノールアミン、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子が挙げられる。上述の他の成分はそれぞれ、単独で使用されてもよく、またはそれらの複数が組み合わせて使用され得る。
【0077】
特定の実施形態では、成熟培地は、ＴＧＦ－β、好ましくはＴＧＦ－β３をさらに含む上述の基本培養培地である。
【0078】
好ましくは、成熟培地は、１～１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３、より好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３を含む。
【0079】
一実施形態では、軟骨細胞成熟培地は、ＴＧＦ－β３、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ－２、およびインスリンを含む基本培養培地である。好ましくは、軟骨細胞成熟培地は、ＴＧＦ－β３、インスリン、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ－２、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミン、より好ましくはＴＧＦ－β３、インスリン、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンを含む。
【0080】
好ましくは、成熟培地は、１～１００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β３、１～１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１、および／または１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２を含む。
【0081】
特定の実施形態では、軟骨細胞は、１０～２０日間、好ましくは１０～１５日間、成熟培地の３次元の培養系で培養される。
【0082】
３Ｄ培養は、軟骨細胞による細胞外マトリックスの合成を支援するように、細胞を互いに結合させることができる。３Ｄ培養系は、静的または動的であり得る。静的な方法は、静的な物理的な力により凝集体を形成するための様式を細胞に提供することを暗示する。静的な方法として、限定するものではないが、懸滴法、寒天またはアガロースの薄いコーティングなどの非接着性の基質上での液体培養、低接着表面プレート上での培養が挙げられる。動的な方法は、強制的な細胞の凝集を暗示する。動的な方法として、限定するものではないが、スピナーフラスコでの培養、回転壁の容器、およびペレットでの培養が挙げられる。好ましい実施形態では、３Ｄ培養系は、ペレットでの培養である。ペレットでの培養では、軟骨細胞は、プレートに分散され、遠心分離されることにより細胞を凝集し、ペレットを形成する。
【0083】
好ましい実施形態では、成熟培地における３Ｄ培養は、軟骨形成を向上させるために低酸素の雰囲気で行われる。好ましい実施形態では、軟骨細胞は、１０（ｖ／ｖ）％未満のＯ２、より好ましくは７％未満のＯ２、より好ましくは５％のＯ２の雰囲気にて、成熟培地における３Ｄ培養系で培養される。
【0084】
細胞は、軟骨組織を得るまで軟骨細胞成熟培地で維持される。本明細書中使用される場合、軟骨は、硝子軟骨を表す。この期間の間、従来の方法で、培養培地は、定期的に、好ましくは２または３日ごとに、変えられてよい。
【0085】
得られる軟骨組織の質は、操作された軟骨組織におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびコラーゲンＩＩの含有量を測定することにより試験され得る。また軟骨組織の質および量は、ＧＡＧ／マイクロ組織の量を測定するかまたはＧＡＧ／二本鎖ＤＮＡの比率により、決定され得る。ＧＡＧ、コラーゲン、または二本鎖ＤＮＡの存在は、当該分野で知られているいずれかの方法により評価され得る。たとえば、ＧＡＧは、サフラニン－Ｏの呈色によるかまたはジメチルメチレンブルーアッセイ（ＤＭＭＢ）を使用したＧＡＧの用量によってより定量的に、明らかにされ得る。コラーゲンＩＩは、イムノ染色によるかまたはＥＬＩＳＡなどのより定量的なアッセイにより評価され得る。
【0086】
よって、任意選択で、本発明に係る方法は、操作された軟骨組織におけるＧＡＧおよび／またはコラーゲンＩＩの存在を測定または評価することからなるさらなるステップを含み得る。
【0087】
操作された軟骨組織（Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ）
また本発明は、本発明に係る方法により入手可能な操作された軟骨組織に関する。
また本発明は、本発明に係る方法により入手可能な操作された軟骨組織に関する。
【0088】
本発明は、スフェロイドの形態の操作された軟骨組織であって、上記スフェロイドが、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０μｇ／スフェロイド、好ましくは１０～１００μｇ／スフェロイド、より好ましくは１５～６０μｇ／スフェロイドのスフェロイドあたりのＧＡＧ含有量を提示する、操作された軟骨組織に関する。
【0089】
本発明は、スフェロイドの形態の操作された軟骨組織であって、上記スフェロイドが、少なくとも１０、１５、または２０、好ましくは１０～１００、より好ましくは１０～８０のＧＡＧ／二本鎖ＤＮＡの比率を提示する、操作された軟骨組織に関する。
【0090】
上記軟骨組織のスフェロイドは、１～２ｍｍの直径を有し、５００００～２５００００個の細胞、好ましくは（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）２０００００個の細胞を含む。
【0091】
医薬組成物
別の態様では、本発明はまた、本発明の操作された軟骨組織と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明はまた、本発明の操作された軟骨組織と、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【0092】
薬学的に許容される賦形剤は、細胞と適合可能でなければならず、たとえば、培養培地、バッファー溶液、または生理食塩水であり得る。
【0093】
好ましい実施形態では、本医薬組成物は、好ましくは皮下経路による、非経口投与に適しており、特には軟骨または骨組織への直接投与に適している。本医薬組成物は、当業者に知られている標準的な薬学的な実務により製剤化され得る。
【0094】
特定の実施形態では、本医薬組成物は、生体適合性マトリックスにカプセル化されている、本発明の軟骨組織を含む。
【0095】
また本医薬組成物は、１つ以上のさらなる有効な化合物、たとえば細胞の生存もしくは増殖を向上させるかまたはコンタミネーションを防ぐことが知られている化合物を含み得る。
【0096】
治療上の適応
さらなる別の態様では、本発明は、それを必要とする対象の、特に軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置のための、本発明の操作された軟骨組織または上記操作された軟骨組織を含む医薬組成物の治療上の使用に関する。
さらなる別の態様では、本発明は、それを必要とする対象の、特に軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置のための、本発明の操作された軟骨組織または上記操作された軟骨組織を含む医薬組成物の治療上の使用に関する。
【0097】
よって、本発明は、それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置に使用するための本発明の操作された軟骨組織に関する。またこれは、それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置に使用するための本発明に係る医薬組成物に関する。
【0098】
本発明は、特に、それを必要とする対象の自家性軟骨組織移植に適している。本発明の自家性の操作された軟骨組織の移植では、最初に軟骨細胞が、上記対象から、好ましくは上記対象の成熟した軟骨組織の生検から単離される。次に、軟骨細胞が本発明の方法により培養されることにより、自家性の操作された軟骨組織を入手し、上記患者の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置に使用される。
【0099】
よって、好ましい実施形態では、本発明は、それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置のための本発明の自家性の操作された軟骨組織または上記自家性の操作された軟骨組織を含む医薬組成物の使用に関する。
【0100】
別の実施形態では、同種異系間移植が、それを必要とする対象で使用され得る。
【0101】
本明細書中使用される場合、用語「軟骨欠損および軟骨変性疾患」は、限定するものではないが、軟骨病変、関節症、リウマチ、または変形性関節症を含む。
【0102】
特定の実施形態では、本発明の操作された軟骨組織またはその医薬組成物は、人工関節の限定された寿命により６０歳以下の患者では一般に提案されていない全膝置換を遅延または回避するために、限局性関節軟骨病変または早期変形性関節症を罹患している患者に適応される。よって、好ましい実施形態では、軟骨欠損および軟骨変性疾患は、限局性関節軟骨病変または早期変形性関節症である。
【0103】
用語「処置」は、本文書で使用される場合、疼痛および可動性の減少などの症状の改善もしくは消失、疾患の進行の遅延、疾患の発展の停止、または疾患の消失を表す。またこの用語は、予防的処置および治癒的な処置の両方を含む。
【0104】
本明細書中使用される場合、本明細書中使用される用語「対象」または「患者」は、哺乳類を表す。開示される処置方法から利益を得ることができる哺乳類の種として、限定するものではないが、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどの非ヒトの霊長類、イヌおよびネコを含む飼い慣らされた動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定するものではないが、ラクダ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳類種が挙げられる。特定の実施形態では、上記対象は、ヒトまたはウマである。
【0105】
また本発明は、軟骨欠損および軟骨変性疾患の処置または予防を意図した薬物の調製のための、本発明の軟骨組織または医薬組成物の使用に関する。
【0106】
さらに本発明は、軟骨欠損および軟骨変性疾患を処置するための方法であって、本発明に係る操作された軟骨組織または医薬組成物の治療上有効量を処置される対象に投与するステップを含む、方法に関する。
【0107】
他の文言では、本発明はまた、それを必要とする対象の軟骨欠損および軟骨変性疾患を処置するための方法であって、
ｉ）前記対象から軟骨細胞を単離するステップと、
ｉｉ）上述のＷｎｔシグナリング経路を活性化する脱分化培養培地の接着培養系で前記軟骨細胞を培養して線維芽細胞様細胞を得るステップと、
ｉｉｉ）上述のＷｎｔシグナリング経路を不活性化する再分化培養培地の接着培養系で前記線維芽細胞様細胞を培養して軟骨細胞を得るステップと、
ｉｖ）上述のＷｎｔシグナリング経路を不活性化する成熟培地における３Ｄ培養系でステップｉｉｉ）の軟骨細胞を培養して軟骨組織を得るステップと、
ｖ）治療上有効量の軟骨組織を処置される対象へ投与するステップと
を含む、方法に関する。
ｉ）前記対象から軟骨細胞を単離するステップと、
ｉｉ）上述のＷｎｔシグナリング経路を活性化する脱分化培養培地の接着培養系で前記軟骨細胞を培養して線維芽細胞様細胞を得るステップと、
ｉｉｉ）上述のＷｎｔシグナリング経路を不活性化する再分化培養培地の接着培養系で前記線維芽細胞様細胞を培養して軟骨細胞を得るステップと、
ｉｖ）上述のＷｎｔシグナリング経路を不活性化する成熟培地における３Ｄ培養系でステップｉｉｉ）の軟骨細胞を培養して軟骨組織を得るステップと、
ｖ）治療上有効量の軟骨組織を処置される対象へ投与するステップと
を含む、方法に関する。
【0108】
用語「治療上有効量」は、本明細書中使用される場合、軟骨欠損および／または軟骨変性疾患を呈する対象の疼痛の症状を減らすかまたは可動性を増大させるために十分な量を表す。
【0109】
好ましい実施形態では、病変を完全にカバーするために、１ｃｍ２あたり１０～５０個の直径約１～２ｍｍの軟骨組織のスフェロイドが投与される。スフェロイドは、軟骨下骨および軟骨病変の内端に自己接着する。
【0110】
本発明の操作された軟骨組織または医薬組成物は、上記軟骨を軟骨の表面もしくは支持マトリックス上にかまたは対象の軟骨もしくは支持マトリックスの局所的な環境に直接グラフトすることにより投与され得る。
【0111】
本発明の操作された軟骨組織または医薬組成物は、ｏｐｅｎ－ｊｏｉｎｔ手術の手法によるかまたは関節鏡検査を介して、好ましくは患者のより早い回復を可能にするために関節鏡検査を介して対象に投与され得る。
【0112】
ｉｎ ｖｉｖｏで移植された後、軟骨組織の中の軟骨細胞は、均一な軟骨組織を形成するために損傷した組織の表面までの全層の欠陥を充填しｉｎ ｖｉｖｏで共に融合する可能性を有するように、マトリックスを産生しつづけることにより、機械的な荷重に応答する。
【0113】
キット
また本発明は、軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のためのキットに関する。このキットは、
上述の脱分化培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＦＧＦ－２、より好ましくはＦＧＦ－２ならびにＥＧＦ、ＴＧＦ－β３、およびＰＤＧＦ－ＢＢおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される増殖因子を含む第１の容器と、
上述の再分化培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＴＧＦβ３、より好ましくはＴＧＦβ３およびＦＧＦ－７を含む第２の容器であって、上記ＴＧＦ－β３および／またはＦＧＦ－７が血小板のライセートで置き換えられ得る、第２の容器と、
上述の成熟培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＴＧＦ－β３、より好ましくはＴＧＦ－β３ならびにＩＧＦ－１、ＢＭＰ－２、インスリン、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される１つの化合物、繰り返しになるが、より好ましくはＴＧＦ－β３およびインスリン、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンを含む第３の容器と
を含む。
また本発明は、軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のためのキットに関する。このキットは、
上述の脱分化培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＦＧＦ－２、より好ましくはＦＧＦ－２ならびにＥＧＦ、ＴＧＦ－β３、およびＰＤＧＦ－ＢＢおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される増殖因子を含む第１の容器と、
上述の再分化培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＴＧＦβ３、より好ましくはＴＧＦβ３およびＦＧＦ－７を含む第２の容器であって、上記ＴＧＦ－β３および／またはＦＧＦ－７が血小板のライセートで置き換えられ得る、第２の容器と、
上述の成熟培地に存在する１つ以上の化合物、好ましくはＴＧＦ－β３、より好ましくはＴＧＦ－β３ならびにＩＧＦ－１、ＢＭＰ－２、インスリン、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンおよびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される１つの化合物、繰り返しになるが、より好ましくはＴＧＦ－β３およびインスリン、セレニウム、トランスフェリン、およびエタノールアミンを含む第３の容器と
を含む。
【0114】
好ましくは、本キットは、それぞれが再構成ならびに／または分化および／もしくは成熟培地の使用ならびに本発明に係る方法の実施を促進する濃度または量の１つ以上の化合物を含む、複数の容器を含む。また本発明に係るキットは、上述の基本培地を含む容器を含み得る。
【0115】
また本発明に係るキットは、特にフラスコ、マルチウェルプレート、またはディッシュの形態の、接着培養系を含み得る。
【0116】
また本キットは、本発明の方法に係る軟骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための分化または成熟培地を調製および／または使用するための方法を表す説明書を含み得る。
【0117】
また本発明は、本発明の方法による軟骨細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生のための本発明に係るキットの使用に関する。
【0118】
治療上の目的の分子をスクリーニングするための方法
別の態様では、本発明は、治療上の目的の分子をスクリーニングするための本発明の軟骨組織の使用に関する。
別の態様では、本発明は、治療上の目的の分子をスクリーニングするための本発明の軟骨組織の使用に関する。
【0119】
治療上の目的の分子は、特に、軟骨変性疾患の変性プロセスを阻害する分子であり得る。これら分子は、特に、上述の軟骨欠損または軟骨変性疾患の処置または予防に使用可能であり得る。
【0120】
よって本発明は、目的の分子をスクリーニングするための方法であって、
ｉ）本発明の軟骨組織を候補分子と接触させるステップと、
ｉｉ）望ましい活性を有する分子を選択するステップと
を含む、方法に関する。
ｉ）本発明の軟骨組織を候補分子と接触させるステップと、
ｉｉ）望ましい活性を有する分子を選択するステップと
を含む、方法に関する。
【0121】
本発明は、特には軟骨変性プロセスを阻害する分子をスクリーニングするための方法であって、
ｉ）本発明の軟骨を１つ以上の候補分子と接触させるステップと、
ｉｉ）軟骨変性プロセスを阻害する分子を選択するステップと
を含む、方法に関する。
ｉ）本発明の軟骨を１つ以上の候補分子と接触させるステップと、
ｉｉ）軟骨変性プロセスを阻害する分子を選択するステップと
を含む、方法に関する。
【0122】
軟骨組織の産生は、たとえばＧＡＧまたはコラーゲンＩＩを測定することを含む方法などの、当業者によく知られている技術により評価され得る。
【0123】
探索される分子の性質に応じて、軟骨組織を産生させるために使用される軟骨細胞は、健常な対象または上記に定義した軟骨欠損もしくは軟骨変性疾患を有する対象から、入手され得る。
【0124】
この説明で引用されている全ての参照文献は、本出願において参照により組み込まれている。本発明の他の特性および利点は、非限定的な例示により提供される以下の実施例を読むことにより、より明らかとなるであろう。
【0125】
実施例
材料および方法
化学物質
ＸＡＶ９３９は、Ｓｉｇｍａにより入手し、培地Ｅにおいて２Ｄ培養で４日間１０μＭの濃度で使用した。
材料および方法
化学物質
ＸＡＶ９３９は、Ｓｉｇｍａにより入手し、培地Ｅにおいて２Ｄ培養で４日間１０μＭの濃度で使用した。
【0126】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの産生
表１に記載の以下の培地を、実施例で使用した。
表１：実施例で使用した培地の組成
表１に記載の以下の培地を、実施例で使用した。
【表1】
【0127】
サンプルの回収
ヒト軟骨サンプルを、様々な症状に対する整形外科的な手法の後に、生命に関して同意したドナー（ｌｉｆｅ ｃｏｎｓｅｎｔｉｎｇ ｄｏｎｏｒｓ）（１８～８０歳）から得た（表２）。
表２：性別、年齢、および病態を含むドナーの特徴
ヒト軟骨サンプルを、様々な症状に対する整形外科的な手法の後に、生命に関して同意したドナー（ｌｉｆｅ ｃｏｎｓｅｎｔｉｎｇ ｄｏｎｏｒｓ）（１８～８０歳）から得た（表２）。
【表2】
【0128】
回収した軟骨は、室温にて通常の生理食塩水（ＮａＣｌ ０．９％）において無菌性のレシピエントの試験室に移された。ヒト軟骨サンプルの回収は、スイス倫理委員会（Ｓｗｉｓｓ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＢＡＳＥＣ， ２０１６－００６５６）により承認された。
【0129】
ミニブタの軟骨は、外側滑車溝（ｌａｔｅｒａｌ ｔｒｏｃｈｌｅａｒ ｈｏｌｄｅｒ）（約３０ｍｇ）から入手し、ミニブタの右膝から回収した。
【0130】
軟骨（約３０ｍｇ）を、小片（１ｍｍ）にスライスして、酵素による消化により軟骨細胞の抽出を促進させ、次に、抗細菌剤（ゲンタマイシン、５０ｕｇ／ｍｌ）および抗真菌剤（アムホテリシン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎｅ）Ｂまたはファンギゾン（登録商標）、０．２５０ｕｇ／ｍｌ）を含む培地ＥにおいてＩＩ型のコラゲナーゼ（４００Ｕ／ｍｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、回転させながら３７℃で一晩おいた。
【0131】
細胞の培養およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの産生
細胞を洗浄し、細胞外マトリックス（ＭａｘＧｅｌ（商標）、Ｓｉｇｍａ）であらかじめコーティングしたＴ２５ｃｍ２のフラスコに置き（ｐ０）、次にゲンタマイシンおよびファンギゾン（登録商標）（５日間の細胞増殖の後にこれらを除去した）を伴う培地Ｅで１２～１６日間培養した。全ての２Ｄ細胞培養を、細胞外マトリックスをコーティングしたフラスコで行った。コンフルエンスに達した際に、細胞を、１ Ｔ７５（ｐ１）に継代し、その後２ｘ Ｔ７５（ｐ２）に分け、コンフルエンスに達成させた。この段階で細胞を、バックアップのため凍結することができる（ｐ３）。培地Ｅでの細胞増殖（ステップ１）の後に、ステップ２において、細胞を培地Ｒにおいて７日間培養し、ここではこれらの増殖の減少が、ステップ３での３Ｄ培養へ進む前に観察された。ステップ３において、軟骨細胞を回収し、培地Ｉにおいて凝集させて、コニカル９６ウェルプレートにおいて０．２×１０６個の細胞／ウェル（約２０×１０６個の細胞／プレート）を得た。９６ウェルプレートを、３００ｇで５分間遠心分離し、３Ｄ培養において１５日後に、細胞凝集およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの形成を可能にした。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを、最大８継代までの軟骨細胞から得た。これらビーズを、９６ウェルプレートから取り出し、まとめて集め、これらは高い安定性にて最大６日間４～２３℃（室温）にて培地Ｉにおいて維持することができる。
細胞を洗浄し、細胞外マトリックス（ＭａｘＧｅｌ（商標）、Ｓｉｇｍａ）であらかじめコーティングしたＴ２５ｃｍ２のフラスコに置き（ｐ０）、次にゲンタマイシンおよびファンギゾン（登録商標）（５日間の細胞増殖の後にこれらを除去した）を伴う培地Ｅで１２～１６日間培養した。全ての２Ｄ細胞培養を、細胞外マトリックスをコーティングしたフラスコで行った。コンフルエンスに達した際に、細胞を、１ Ｔ７５（ｐ１）に継代し、その後２ｘ Ｔ７５（ｐ２）に分け、コンフルエンスに達成させた。この段階で細胞を、バックアップのため凍結することができる（ｐ３）。培地Ｅでの細胞増殖（ステップ１）の後に、ステップ２において、細胞を培地Ｒにおいて７日間培養し、ここではこれらの増殖の減少が、ステップ３での３Ｄ培養へ進む前に観察された。ステップ３において、軟骨細胞を回収し、培地Ｉにおいて凝集させて、コニカル９６ウェルプレートにおいて０．２×１０６個の細胞／ウェル（約２０×１０６個の細胞／プレート）を得た。９６ウェルプレートを、３００ｇで５分間遠心分離し、３Ｄ培養において１５日後に、細胞凝集およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの形成を可能にした。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを、最大８継代までの軟骨細胞から得た。これらビーズを、９６ウェルプレートから取り出し、まとめて集め、これらは高い安定性にて最大６日間４～２３℃（室温）にて培地Ｉにおいて維持することができる。
【0132】
ＧＡＧの定量化
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を、ジメチルメチレンブルーアッセイ（ＤＭＭＢ）（Ｓｉｇｍａ， ３４１０８８）により評価した。コンドロイチン硫酸Ａ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ９８１９）を使用して、０～５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度の６つの標準物質を作製した。コンドロイチンＣ硫酸Ｃ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ４３８４）を使用して、それぞれ１５および３５μｇ／ｍＬの濃度の低いおよび高い内部品質管理（ＩＱＣ）（ｌｏｗ ａｎｄ ｈｉｇｈ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）をもたらした。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）（Ｓｉｇｍａ）においてプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｖ３０２１）で、５６℃で１５±２時間消化させた。この酵素を用いた消化を、９７℃で１５分間インキュベートすることにより停止させた。次に、得られたサンプルを、アッセイのためＴｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）で希釈（１／５～１／１０）した。１００μＬの標準物質、ＩＣＱ、およびサンプルを、１ｍＬのＤＭＭＢ溶液との５分間の反応の後に、分光光度計を用いて三連で読み取った（λ＝５２５ｎｍ）。次に、ＧＡＧ含有量を、ＤＮＡの量に対し正規化し、これはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ－Ｑｕｂｉｔアッセイで測定した。標準物質およびＩＣＱは、２つの別々の製剤におけるウシ胸腺ＤＮＡから調製した。標準物質およびＩＣＱＩは、２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５（ＴＥ）バッファーで調製し；これらサンプルは、プロテイナーゼＫによる消化由来のサンプルであり、次に、ＴＥバッファーで１／１５に希釈した。このアッセイでは、１００μＬの標準物質、ＩＱＣ、それからサンプルを採取し、三連に分けた。次に、１００μＬの１／２００に希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ｑｕａｎｔ－Ｉｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ， Ｐ１１４９６）を添加した。次に、サンプルを５分間インキュベートし、この時間の間、インターカラントはＤＮＡと複合体形成した。最後に、読み取りを、Ｑｕｂｉｔ ４ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ， Ｑ３３２３８）において４８５ｎｍの励起ピークで行った。
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を、ジメチルメチレンブルーアッセイ（ＤＭＭＢ）（Ｓｉｇｍａ， ３４１０８８）により評価した。コンドロイチン硫酸Ａ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ９８１９）を使用して、０～５０μｇ／ｍＬの範囲の濃度の６つの標準物質を作製した。コンドロイチンＣ硫酸Ｃ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ４３８４）を使用して、それぞれ１５および３５μｇ／ｍＬの濃度の低いおよび高い内部品質管理（ＩＱＣ）（ｌｏｗ ａｎｄ ｈｉｇｈ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）をもたらした。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）（Ｓｉｇｍａ）においてプロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｖ３０２１）で、５６℃で１５±２時間消化させた。この酵素を用いた消化を、９７℃で１５分間インキュベートすることにより停止させた。次に、得られたサンプルを、アッセイのためＴｒｉｓ－ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）で希釈（１／５～１／１０）した。１００μＬの標準物質、ＩＣＱ、およびサンプルを、１ｍＬのＤＭＭＢ溶液との５分間の反応の後に、分光光度計を用いて三連で読み取った（λ＝５２５ｎｍ）。次に、ＧＡＧ含有量を、ＤＮＡの量に対し正規化し、これはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ－Ｑｕｂｉｔアッセイで測定した。標準物質およびＩＣＱは、２つの別々の製剤におけるウシ胸腺ＤＮＡから調製した。標準物質およびＩＣＱＩは、２００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５（ＴＥ）バッファーで調製し；これらサンプルは、プロテイナーゼＫによる消化由来のサンプルであり、次に、ＴＥバッファーで１／１５に希釈した。このアッセイでは、１００μＬの標準物質、ＩＱＣ、それからサンプルを採取し、三連に分けた。次に、１００μＬの１／２００に希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ｑｕａｎｔ－Ｉｔ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ， Ｐ１１４９６）を添加した。次に、サンプルを５分間インキュベートし、この時間の間、インターカラントはＤＮＡと複合体形成した。最後に、読み取りを、Ｑｕｂｉｔ ４ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ， Ｑ３３２３８）において４８５ｎｍの励起ピークで行った。
【0133】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの細胞のバイアビリティ
サンプルを、生細胞に対し非浸透性であるが、欠陥のある膜を有する細胞に対して浸透性であることから、生細胞対死細胞を評価することを可能にするアミン反応性蛍光色素である、赤色蛍光色素のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ４２３１０１）を使用してアッセイを介してバイアビリティに関して試験した。３Ｄサンプルを、ステップ３の終了時までに回収し、次にＰＢＳで洗浄し、次に、ＰＢＳで希釈したＺｏｍｂｉｅ色素（１：１００）を２０分間添加し、サンプルを暗室に保存した。その後、サンプルを、クリオスタットミクロトームを介して３μｍの厚さに切断し、スーパーフロスト・プラススライドガラス上に乗せた。その後、これらを、４％のホルモルで固定し、次にＰＢＳで希釈したＨｏｅｓｃｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ， Ｈ３５７０Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）（１：２０００）で１０分間処置した。このアッセイの対照は、Ｚｏｍｂｉｅ色素ステップを開始する前にＰＢＳにおいて１０％のＴｒｉｔｏｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ， Ｘ１００－１００ＭＬ）を室温（ＲＴ）で１時間添加することにより達成した。
サンプルを、生細胞に対し非浸透性であるが、欠陥のある膜を有する細胞に対して浸透性であることから、生細胞対死細胞を評価することを可能にするアミン反応性蛍光色素である、赤色蛍光色素のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， ４２３１０１）を使用してアッセイを介してバイアビリティに関して試験した。３Ｄサンプルを、ステップ３の終了時までに回収し、次にＰＢＳで洗浄し、次に、ＰＢＳで希釈したＺｏｍｂｉｅ色素（１：１００）を２０分間添加し、サンプルを暗室に保存した。その後、サンプルを、クリオスタットミクロトームを介して３μｍの厚さに切断し、スーパーフロスト・プラススライドガラス上に乗せた。その後、これらを、４％のホルモルで固定し、次にＰＢＳで希釈したＨｏｅｓｃｈｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ， Ｈ３５７０Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）（１：２０００）で１０分間処置した。このアッセイの対照は、Ｚｏｍｂｉｅ色素ステップを開始する前にＰＢＳにおいて１０％のＴｒｉｔｏｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ， Ｘ１００－１００ＭＬ）を室温（ＲＴ）で１時間添加することにより達成した。
【0134】
免疫組織化学染色
ホルマリンで固定しパラフィン包埋した軟骨組織およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの免疫組織化学染色では、サンプルを含むパラフィンブロックを、ミクロトームを用いて５μｍで切断した。このスライドを、４７℃で一晩乾燥させた。スライドを、Ｘｙｌｏｌにより脱パラフィン処理し（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎａｔｅ）、連続的なアルコール槽（１００％、９５％、および７０％の濃度）により再水和した。アンマスキングの２つの技術を使用した。ミニブタ由来のネイティブな軟骨では、本発明者らは、０．１Ｍのリン酸塩バッファーにおいて２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼの溶液を使用し、３７℃で１時間スライドに載置した。スライドを、５分間ＰＢＳで２回すすいで、ヒアルロニダーゼを除去した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓのサンプルを、ｐＨ＝６、０．０１Ｍのクエン酸塩バッファー槽に浸漬し、それぞれを電子レンジにて６２０ｗで５分間、３回加熱し、次に、氷槽で２０分間冷却した。次に、スライドを、ＰＢＳで５分間すすいだ。次に、一次抗体を使用した（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ａｂｃａｍ， ａｂ６３０８；Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ Ａｂｃａｍ ａｂ８５２６６およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＭＡ５－１２７８９）。注目すべきことに、使用した２つのＩＩ型コラーゲン抗体は、同様の結果を示した。これら抗体は、異なるサンプルに置き、０．３％のトリトン：ＰＢＳにおいて１：１００に１時間希釈した。ＰＢＳで５分間すすいだ後、二次抗体の、ビオチンコンジュゲート抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ， ＢＡ－２０００）、抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ ＢＡ－１０００）、および３，３’－ジアミノベンジジン基質を伴うアビジン－ビオチンペルオキシダーゼ検出系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用した。サンプルを、ヘマトキシリンで対比染色した。脱水を、アルコール槽（９５％および１００％の濃度）、その後スライドがＥｕｋｉｔｔレジン（Ｂａｔｃｈ Ａ１１１３， ＫｉＮＤＯ１５００）とアセンブリするまでＸｙｌｏｌ槽において１０～２０回ラックを振とうすることにより勢いよく脱水することにより達成した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ１共焦点顕微鏡およびＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｅを、イメージングに使用した。
ホルマリンで固定しパラフィン包埋した軟骨組織およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの免疫組織化学染色では、サンプルを含むパラフィンブロックを、ミクロトームを用いて５μｍで切断した。このスライドを、４７℃で一晩乾燥させた。スライドを、Ｘｙｌｏｌにより脱パラフィン処理し（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎａｔｅ）、連続的なアルコール槽（１００％、９５％、および７０％の濃度）により再水和した。アンマスキングの２つの技術を使用した。ミニブタ由来のネイティブな軟骨では、本発明者らは、０．１Ｍのリン酸塩バッファーにおいて２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼの溶液を使用し、３７℃で１時間スライドに載置した。スライドを、５分間ＰＢＳで２回すすいで、ヒアルロニダーゼを除去した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓのサンプルを、ｐＨ＝６、０．０１Ｍのクエン酸塩バッファー槽に浸漬し、それぞれを電子レンジにて６２０ｗで５分間、３回加熱し、次に、氷槽で２０分間冷却した。次に、スライドを、ＰＢＳで５分間すすいだ。次に、一次抗体を使用した（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ Ａｂｃａｍ， ａｂ６３０８；Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ Ａｂｃａｍ ａｂ８５２６６およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＭＡ５－１２７８９）。注目すべきことに、使用した２つのＩＩ型コラーゲン抗体は、同様の結果を示した。これら抗体は、異なるサンプルに置き、０．３％のトリトン：ＰＢＳにおいて１：１００に１時間希釈した。ＰＢＳで５分間すすいだ後、二次抗体の、ビオチンコンジュゲート抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ， ＢＡ－２０００）、抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂ ＢＡ－１０００）、および３，３’－ジアミノベンジジン基質を伴うアビジン－ビオチンペルオキシダーゼ検出系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）を使用した。サンプルを、ヘマトキシリンで対比染色した。脱水を、アルコール槽（９５％および１００％の濃度）、その後スライドがＥｕｋｉｔｔレジン（Ｂａｔｃｈ Ａ１１１３， ＫｉＮＤＯ１５００）とアセンブリするまでＸｙｌｏｌ槽において１０～２０回ラックを振とうすることにより勢いよく脱水することにより達成した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｃ１共焦点顕微鏡およびＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｅを、イメージングに使用した。
【0135】
サフラニン－Ｏ染色
５μｍのパラフィンスライス上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を明らかにするために、軟骨のスフィアおよびネイティブな軟骨のホルマリンで固定しパラフィン包埋したサンプルのサフラニン－Ｏ染色を行った。スライドを、Ｘｙｌｏｌにより脱パラフィン処理し、連続的なアルコール槽（１００％、９５％、および７０％の濃度）により、最終的に５分間蒸留水槽を使用することにより、再水和した。次に、ヘマトキシリン染色を、核の対比染色に使用し、その後、熱水をかけて５分間洗浄した。Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ Ｆ７２５２）を使用して細胞質を染色し、次に酢酸を用いて洗い出した。スライドを、蒸留水を用いて即座に洗い出した。水槽において０．１％のサフラニン－Ｏ（Ｓｉｇｍａ Ｓ２２５５）を、２．５分間ＧＡＧの染色に適用し、その後、蒸留水で繰り返し洗浄した。脱水を、アルコール槽（９５％および１００％の濃度）、その後スライドがＥｕｋｉｔｔレジン（Ｂａｔｃｈ Ａ１１１３， ＫｉＮＤＯ１５００）とアセンブリするまでＸｙｌｏｌ槽においてラックを１０～２０回勢いよく振とうすることにより達成した。
５μｍのパラフィンスライス上のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を明らかにするために、軟骨のスフィアおよびネイティブな軟骨のホルマリンで固定しパラフィン包埋したサンプルのサフラニン－Ｏ染色を行った。スライドを、Ｘｙｌｏｌにより脱パラフィン処理し、連続的なアルコール槽（１００％、９５％、および７０％の濃度）により、最終的に５分間蒸留水槽を使用することにより、再水和した。次に、ヘマトキシリン染色を、核の対比染色に使用し、その後、熱水をかけて５分間洗浄した。Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ Ｆ７２５２）を使用して細胞質を染色し、次に酢酸を用いて洗い出した。スライドを、蒸留水を用いて即座に洗い出した。水槽において０．１％のサフラニン－Ｏ（Ｓｉｇｍａ Ｓ２２５５）を、２．５分間ＧＡＧの染色に適用し、その後、蒸留水で繰り返し洗浄した。脱水を、アルコール槽（９５％および１００％の濃度）、その後スライドがＥｕｋｉｔｔレジン（Ｂａｔｃｈ Ａ１１１３， ＫｉＮＤＯ１５００）とアセンブリするまでＸｙｌｏｌ槽においてラックを１０～２０回勢いよく振とうすることにより達成した。
【0136】
多分化能の評価
単層に増殖したヒトＭＳＣ／ＡＳＣ／軟骨細胞を、軟骨形成、脂肪生成、および骨原性の運命に分化して、それらの多分化能を評価した。骨原性の分化は、アリザリンレッドＳ（Ｍｅｒｃｋ， ＴＭＳ－００８－Ｃ）染色を使用して評価した。脂肪生成の分化は、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ， Ｏ１３９１）染色を使用して評価し、軟骨形成は、サフラニン－Ｏ（Ｓｉｇｍａ， Ｓ２２５５）／Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ染色（Ｓｉｇｍａ Ｆ７２５２）を使用して評価した。
単層に増殖したヒトＭＳＣ／ＡＳＣ／軟骨細胞を、軟骨形成、脂肪生成、および骨原性の運命に分化して、それらの多分化能を評価した。骨原性の分化は、アリザリンレッドＳ（Ｍｅｒｃｋ， ＴＭＳ－００８－Ｃ）染色を使用して評価した。脂肪生成の分化は、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ， Ｏ１３９１）染色を使用して評価し、軟骨形成は、サフラニン－Ｏ（Ｓｉｇｍａ， Ｓ２２５５）／Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ染色（Ｓｉｇｍａ Ｆ７２５２）を使用して評価した。
【0137】
生体力学の測定
圧縮試験を、直径０．６８ｍｍ～１．５４ｍｍの範囲の軟骨ビーズ上およびネイティブな軟骨において１Ｎのロードセルを備えたＭＴＳ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｐｕｌｌ－ｐｕｓｈ ｍａｃｈｉｎｅ（ｍｏｄｅｌ ４２）で行った。圧縮速度は、０．０１ｍｍ．ｓ－１に設定し、最大荷重圧縮は、０．２Ｎで課され；プロービングした表面積を増大させるために試験あたり最大１０個のビーズを使用した。元の保持システムは、試験中のビーズのスライドを回避し、等方性の圧縮を確保するように特注されていた。変位の関数としての圧縮力を、生のデータとして測定した。次に、応力－ひずみ曲線を計算して、正規化のためサンプルの表面積およびビーズの数で除算し、線形領域のデータセットの傾きを考慮した、軟骨のヤング率を推定した。ヤング率の計算は、後述のように行った。
Ｅ＝σ／ε（式中、σは、圧縮応力（ｋＰａ）であり、Ｅは、ヤング率（ｋＰａ）であり、εは、正規化した伸長に対応するひずみ（単位なし）である）。
圧縮試験を、直径０．６８ｍｍ～１．５４ｍｍの範囲の軟骨ビーズ上およびネイティブな軟骨において１Ｎのロードセルを備えたＭＴＳ ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ｐｕｌｌ－ｐｕｓｈ ｍａｃｈｉｎｅ（ｍｏｄｅｌ ４２）で行った。圧縮速度は、０．０１ｍｍ．ｓ－１に設定し、最大荷重圧縮は、０．２Ｎで課され；プロービングした表面積を増大させるために試験あたり最大１０個のビーズを使用した。元の保持システムは、試験中のビーズのスライドを回避し、等方性の圧縮を確保するように特注されていた。変位の関数としての圧縮力を、生のデータとして測定した。次に、応力－ひずみ曲線を計算して、正規化のためサンプルの表面積およびビーズの数で除算し、線形領域のデータセットの傾きを考慮した、軟骨のヤング率を推定した。ヤング率の計算は、後述のように行った。
Ｅ＝σ／ε（式中、σは、圧縮応力（ｋＰａ）であり、Ｅは、ヤング率（ｋＰａ）であり、εは、正規化した伸長に対応するひずみ（単位なし）である）。
【0138】
イムノブロッティング
細胞を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｒｏｃｈｅ）を補充した氷冷したＲＩＰＡバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において氷上で３０分間溶解した。タンパク質（１０μｇ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ブロットを、抗ホスホ－β－カテニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；５６５１Ｔ）、ＴＣＦ－４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ２５６９）、アキシン１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；２０８７）、β－アクチンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＧＡＤＰＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ２１１８）（１：１０００）、次にＨＲＰ－ウサギまたはマウスコンジュゲート抗体（１：５０００）でプロービングした。
細胞を、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ；Ｒｏｃｈｅ）を補充した氷冷したＲＩＰＡバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において氷上で３０分間溶解した。タンパク質（１０μｇ）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ブロットを、抗ホスホ－β－カテニン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；５６５１Ｔ）、ＴＣＦ－４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ２５６９）、アキシン１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；２０８７）、β－アクチンＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＧＡＤＰＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ； ２１１８）（１：１０００）、次にＨＲＰ－ウサギまたはマウスコンジュゲート抗体（１：５０００）でプロービングした。
【0139】
フローサイトメトリー
１００，０００個の細胞を、４％のＰＦＡで固定し、次に、ＦＡＣｓバッファー（ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ－ＰＢＳ）においてＲＴで１時間ＣＤ７３－ＣＦＳ、ＣＤ９０－ＡＰＣ、およびＣＤ１０５－ＰｅｒＣＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｍａ）に関して染色した。最小１０，０００個の生細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを用いて獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。結果は、ＣＤ７３およびＣＤ９０の３回の独立した実験の平均を表す。ＣＤ１０５では、２回の独立した実験を行った。ゲート戦略のため、最初に生細胞を選択し、次に、単一の細胞を、ＦＳＣ－ＷおよびＦＳＣ－Ａに基づき同定して、ダブレットを除去した。正の染色は、ＣＤ７３－ＣＦＳ、ＣＤ９０－ＡＰＣ、およびＣＤ１０５－ＰｅｒＣＰそれぞれの陰性対照ＩｇＧ－ＣＦＳ、ＩｇＧ－ＡＰＣ、およびＩｇＧ－ＰｅｒＣＰに基づき定義した。
１００，０００個の細胞を、４％のＰＦＡで固定し、次に、ＦＡＣｓバッファー（ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ－ＰＢＳ）においてＲＴで１時間ＣＤ７３－ＣＦＳ、ＣＤ９０－ＡＰＣ、およびＣＤ１０５－ＰｅｒＣＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｍａ）に関して染色した。最小１０，０００個の生細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを用いて獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析を行った。結果は、ＣＤ７３およびＣＤ９０の３回の独立した実験の平均を表す。ＣＤ１０５では、２回の独立した実験を行った。ゲート戦略のため、最初に生細胞を選択し、次に、単一の細胞を、ＦＳＣ－ＷおよびＦＳＣ－Ａに基づき同定して、ダブレットを除去した。正の染色は、ＣＤ７３－ＣＦＳ、ＣＤ９０－ＡＰＣ、およびＣＤ１０５－ＰｅｒＣＰそれぞれの陰性対照ＩｇＧ－ＣＦＳ、ＩｇＧ－ＡＰＣ、およびＩｇＧ－ＰｅｒＣＰに基づき定義した。
【0140】
ＲＮＡＳｅｑ
以前に記載されるように、ＳＲ１００－ライブラリーＴｒｕＳｅｑＨＴ ｓｔｒａｎｄｅｄ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００を使用し、シーケンシングのクオリティコントロールを、ＦａｓｔＱＣ ｖ．０．１１．５（Ｃｏｓｓｅｔ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １０７， ７４－８７）で行った。読み取りに沿ったクオリティの分布を、全てのサンプルで評価および検証した。ＵＣＳＣヒトｈｇ３８参照物質を使用し、参照ゲノムに対してＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ．２．５．３ａで読み取りをマッピングした。平均マッピング比率は、９３．５４％であった。トランスクリプトームの測定基準を、Ｐｉｃａｒｄ ｔｏｏｌｓ ｖ．１．１４１で評価し、差次的な発現分析を、統計分析Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｅｄｇｅＲ ｖ． ３．１８．１（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５， Ｒ８０， Ｈｕｂｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２， １１５－１２１）で行った。簡潔に述べると、カウントを、ライブラリーの大きさにより正規化し、フィルタリングした。少なくとも３つのサンプルにおいて１ｃｐｍ（ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）超の読み取りのカウントを有する遺伝子を、分析のため保存した。このセットの生の遺伝子の数は、２６，４８５であった。不十分に発現するかまたは発現しなかった遺伝子は、除外した。最終的なデータセットは、１３，８８４の遺伝子からなるものであった。差次的に発現した遺伝子の検定を、負の２項分布を使用する正確検定で行った。差次的に発現した遺伝子のｐ値は、５％のＦＤＲ（偽陽性率）を用いて多重検定誤差に関して補正した。使用した補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）であった。差次的に発現した遺伝子の検定は、負の２項分布を使用するｅｄｇｅＲで行った。差次的に発現した遺伝子のｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）偽陽性率（ＦＤＲ）を使用して多重検定誤差に関して補正した。
以前に記載されるように、ＳＲ１００－ライブラリーＴｒｕＳｅｑＨＴ ｓｔｒａｎｄｅｄ－Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００を使用し、シーケンシングのクオリティコントロールを、ＦａｓｔＱＣ ｖ．０．１１．５（Ｃｏｓｓｅｔ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １０７， ７４－８７）で行った。読み取りに沿ったクオリティの分布を、全てのサンプルで評価および検証した。ＵＣＳＣヒトｈｇ３８参照物質を使用し、参照ゲノムに対してＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ．２．５．３ａで読み取りをマッピングした。平均マッピング比率は、９３．５４％であった。トランスクリプトームの測定基準を、Ｐｉｃａｒｄ ｔｏｏｌｓ ｖ．１．１４１で評価し、差次的な発現分析を、統計分析Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｅｄｇｅＲ ｖ． ３．１８．１（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２００４． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ５， Ｒ８０， Ｈｕｂｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２， １１５－１２１）で行った。簡潔に述べると、カウントを、ライブラリーの大きさにより正規化し、フィルタリングした。少なくとも３つのサンプルにおいて１ｃｐｍ（ｃｏｕｎｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）超の読み取りのカウントを有する遺伝子を、分析のため保存した。このセットの生の遺伝子の数は、２６，４８５であった。不十分に発現するかまたは発現しなかった遺伝子は、除外した。最終的なデータセットは、１３，８８４の遺伝子からなるものであった。差次的に発現した遺伝子の検定を、負の２項分布を使用する正確検定で行った。差次的に発現した遺伝子のｐ値は、５％のＦＤＲ（偽陽性率）を用いて多重検定誤差に関して補正した。使用した補正は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）であった。差次的に発現した遺伝子の検定は、負の２項分布を使用するｅｄｇｅＲで行った。差次的に発現した遺伝子のｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）偽陽性率（ＦＤＲ）を使用して多重検定誤差に関して補正した。
【0141】
Ｐａｎｔｈｅｒ分析を、遺伝子のそれぞれのファミリーにおけるエンリッチメント（実体の数）を決定するために使用した（Ｍｉ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５， Ｄ１８３－Ｄ１８９）。
【0142】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡの単離を、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを製造社の指示により使用することにより行い、分光計を使用して測定した。５００ｎｇの総ＲＮＡを使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を製造社のプロトコルに従い使用してｃＤＮＡを合成した。
総ＲＮＡの単離を、Ｑｉａｇｅｎ製のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを製造社の指示により使用することにより行い、分光計を使用して測定した。５００ｎｇの総ＲＮＡを使用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を製造社のプロトコルに従い使用してｃＤＮＡを合成した。
【0143】
リアルタイムＰＣＲを、Ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ）にて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２Ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。最初に、有効性の試験を、事前の利用のバリデーションのため全てのプライマーで行った。各サンプルの相対的なレベルを、少なくとも２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＬＡＳ１）に対して正規化した。ＲＴ－ＰＣＲの反応を、少なくとも技術的および生物学的な三連で行い、平均サイクルの閾値（ＣＴ）を決定した。
【0144】
安全性試験のためのＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスにおけるヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓの移植
５６匹の雄性のＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスを使用して、本発明の標準化したＣａｒｔｉｂｅａｄｓの安全性を試験した。４４匹のマウスに、ヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓを皮下移植により投与した。１つの対照グループを使用し、ここでは８匹の動物に、ビーズ（ｂｅａｄｓ）と命名された凝集したＡ５４９腺癌細胞が投与された（グループあたりのマウスの数は、表３にまとめられている）。
表３．ＳＣＩＤマウスに移植したドナーＣａｒｔｉｂｅａｄｓのリスト。異なるドナーおよび細胞継代（３～６）由来のＣａｒｔｉｂｅａｄｓを、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウス（グループあたりｎ＝８～１４匹のマウス）に皮下注射した。腺癌細胞株Ａ５４９が、陽性細胞として使用され、これは１００％の腫瘍をもたらした。６カ月で動物を安楽死させた後、マウスは、Ｃａｒｔｉｂｅａｄの移植による体重の喪失、触診による異常、または苦痛の徴候を示さなかった。さらに、肺、心臓、肝臓、腎臓、および脾臓では、腫瘍の存在の異常またはエビデンスが観察されなかった。
５６匹の雄性のＳＣＩＤ／ＮＯＤマウスを使用して、本発明の標準化したＣａｒｔｉｂｅａｄｓの安全性を試験した。４４匹のマウスに、ヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓを皮下移植により投与した。１つの対照グループを使用し、ここでは８匹の動物に、ビーズ（ｂｅａｄｓ）と命名された凝集したＡ５４９腺癌細胞が投与された（グループあたりのマウスの数は、表３にまとめられている）。
【表3】
【0145】
全ての移植されたヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓを、標準化した３ステップの方法により培養し、同じ方法で移植した。全身麻酔を、５％の酸素で遮蔽しながら４％のイソフルラン、次に２％のイソフルランを用いて達成した。背中を剪毛した後の皮膚を、７０％のアルコールで局所殺菌する。後頭極から０．５ｃｍ尾側の皮膚の切開を行った。もたらされた組織（Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓおよび腺癌のビーズ）の２００，０００個の細胞を、それぞれ、無菌のピペットを用いて皮下移植した（１個のビーズ／動物）。次に、皮膚を、外科用の接着剤（Ｈｉｓｔｏａｃｒｙｌ， Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓ．Ａ．）を用いて閉鎖した。皮膚でのサンプルの部位および向きを示すために、本発明者らは、無菌の２６ゲージの針および緑色のタトゥー用のインクを用いて４つの主要点のタトゥーを行った。対照グループのマウスは、４～６週目で安楽死させ、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓグループのマウスは、最大６カ月まで経過観察した。皮膚および臓器を回収し、各段階での２つの試験メンバーにより試験した。サンプルは全て４％のホルモルにおいて１／３を保存し、２／３を－２０℃で乾燥させた。動物の手法は、Ｓｗｉｓｓ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ（ＧＥ／１２／１８）により承認されていた。
【0146】
比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ
またゲノムの安定性を、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して、６日間、１０％のＦＢＳまたは１０％のＰＲＰを用いて処置した正常なヒトの皮膚の線維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｔ）を比較することにより決定した。ＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ）を製造社のプロトコルに従い使用して抽出した。アレイＣＧＨは、全体のプローブ間距離中央値が４３ＫｂであるＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＣＧＨ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｋｉｔ ４＿４４Ｋ（ｄｅｓｉｇｎ ＩＤ ０１４９５０）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。実際の分解能は、約２００ｋｂであった。患者のＤＮＡおよび性別が一致した対照のＤＮＡ（それぞれ１μｇ）を、それぞれＣｙ３－ｄＵＴＰおよびＣｙ５－ｄＵＴＰで標識した（Ｓｕｒｅ Ｔａｇ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。標識した産物は、アミコンウルトラ３０ Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した。ハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔが提供したプロトコルにしたがい行った。患者および対照のＤＮＡを集め、２ｍｇのヒトＣｏｔ－Ｉ ＤＮＡと６５℃で回転させながら２４時間ハイブリダイゼーションを行った。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｃａｎマイクロアレイスキャナおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（ｖ１１．５）を使用して分析し、結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖ．７．０）により提示された。
またゲノムの安定性を、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して、６日間、１０％のＦＢＳまたは１０％のＰＲＰを用いて処置した正常なヒトの皮膚の線維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｔ）を比較することにより決定した。ＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ）を製造社のプロトコルに従い使用して抽出した。アレイＣＧＨは、全体のプローブ間距離中央値が４３ＫｂであるＡｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＣＧＨ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｋｉｔ ４＿４４Ｋ（ｄｅｓｉｇｎ ＩＤ ０１４９５０）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。実際の分解能は、約２００ｋｂであった。患者のＤＮＡおよび性別が一致した対照のＤＮＡ（それぞれ１μｇ）を、それぞれＣｙ３－ｄＵＴＰおよびＣｙ５－ｄＵＴＰで標識した（Ｓｕｒｅ Ｔａｇ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。標識した産物は、アミコンウルトラ３０ Ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により精製した。ハイブリダイゼーションは、Ａｇｉｌｅｎｔが提供したプロトコルにしたがい行った。患者および対照のＤＮＡを集め、２ｍｇのヒトＣｏｔ－Ｉ ＤＮＡと６５℃で回転させながら２４時間ハイブリダイゼーションを行った。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｃａｎマイクロアレイスキャナおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（ｖ１１．５）を使用して分析し、結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ｖ．７．０）により提示された。
【0147】
有効性試験のためのミニブタの自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの移植
６匹の成年の雌性のミニブタ（３７～４８ｋｇ）を、この試験に使用した。これら動物を、セボフルランで麻酔をかけ、切開の３０分前に防止用の抗生剤（セファゾリン：２ｇ／ｋｇ）を静脈内に投与した。これらを、完全な昏睡下で手術し、皮膚閉鎖から５分後に抜管した。皮膚の殺菌を３回反復し、無菌の覆布を、廃棄可能な外科手術用の掛け布を用いて行った。
６匹の成年の雌性のミニブタ（３７～４８ｋｇ）を、この試験に使用した。これら動物を、セボフルランで麻酔をかけ、切開の３０分前に防止用の抗生剤（セファゾリン：２ｇ／ｋｇ）を静脈内に投与した。これらを、完全な昏睡下で手術し、皮膚閉鎖から５分後に抜管した。皮膚の殺菌を３回反復し、無菌の覆布を、廃棄可能な外科手術用の掛け布を用いて行った。
【0148】
ステップ１ 外科手術
ｓｕｐｅｒ－ｌａｔｅｒａｌ ｐａｒａ－ｐａｔｅｌｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈを、第１の外科手術で選択した。軟骨の回収は、後の第２の外科的なステップの間の軟骨病変と重複する可能性を防ぐため、外側滑車溝（ｌａｔｅｒａｌ ｔｒｏｃｈｌｅａｒ ｆａｃｅｔｔｅ）の上外側の境界で行った。軟骨の生検は、さらなる処理のため培養培地Ｅ液の中に置いた。段階的な閉鎖を行った。包帯は適用しなかった。
ｓｕｐｅｒ－ｌａｔｅｒａｌ ｐａｒａ－ｐａｔｅｌｌａｒ ａｐｐｒｏａｃｈを、第１の外科手術で選択した。軟骨の回収は、後の第２の外科的なステップの間の軟骨病変と重複する可能性を防ぐため、外側滑車溝（ｌａｔｅｒａｌ ｔｒｏｃｈｌｅａｒ ｆａｃｅｔｔｅ）の上外側の境界で行った。軟骨の生検は、さらなる処理のため培養培地Ｅ液の中に置いた。段階的な閉鎖を行った。包帯は適用しなかった。
【0149】
ステップ２ 外科手術
軟骨回収から５～６週間後に、ミニブタに、ｍｅｄｉａｌ ｐａｒａ－ｐａｔｅｌｌａｒ ｔｅｎｄｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｏｎａｄｉｏ， Ｍ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｊ Ｅｘｐ Ｏｒｔｈｏｐ ４， １１）を介して第２の外科手術を行った。この手法により、内側および外側の大腿骨の滑車溝上の２つの病変それぞれを、ドナー部位の度合いにより１つを除き全てのミニブタで作製した。病変の大きさは、直径６ｍｍであり、小さい鋭匙により作製し、次に、４～５つのＣａｒｔｉｂｅａｄｓの単層により完全に充填した。より速い結合のため、Ｔｉｓｓｅｅｌ（Ｂａｘｔｅｒ）の薄層を各欠陥に添加した。次に、５番目の病変を、内側の大腿骨顆部で作製し、同一の方法でＣａｒｔｉｂｅａｄｓで充填した。各動物で、１つの病変を、陰性対照の病変として異なる位置で空のままにした。段階的な閉鎖を行った。包帯は適用しなかった。
軟骨回収から５～６週間後に、ミニブタに、ｍｅｄｉａｌ ｐａｒａ－ｐａｔｅｌｌａｒ ｔｅｎｄｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂｏｎａｄｉｏ， Ｍ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｊ Ｅｘｐ Ｏｒｔｈｏｐ ４， １１）を介して第２の外科手術を行った。この手法により、内側および外側の大腿骨の滑車溝上の２つの病変それぞれを、ドナー部位の度合いにより１つを除き全てのミニブタで作製した。病変の大きさは、直径６ｍｍであり、小さい鋭匙により作製し、次に、４～５つのＣａｒｔｉｂｅａｄｓの単層により完全に充填した。より速い結合のため、Ｔｉｓｓｅｅｌ（Ｂａｘｔｅｒ）の薄層を各欠陥に添加した。次に、５番目の病変を、内側の大腿骨顆部で作製し、同一の方法でＣａｒｔｉｂｅａｄｓで充填した。各動物で、１つの病変を、陰性対照の病変として異なる位置で空のままにした。段階的な閉鎖を行った。包帯は適用しなかった。
【0150】
リハビリテーション
昏睡が終了するとすぐに、活動を全く制限することなく完全な体重負荷が可能であった。
昏睡が終了するとすぐに、活動を全く制限することなく完全な体重負荷が可能であった。
【0151】
安楽死
３匹のミニブタを、第２の外科手術から３カ月後に安楽死させ、残りの３匹を６カ月目に安楽死させた。手術した膝を切断し、大腿骨遠位部を、さらなる分析のためホルミルアルデヒド溶液に置いた。
３匹のミニブタを、第２の外科手術から３カ月後に安楽死させ、残りの３匹を６カ月目に安楽死させた。手術した膝を切断し、大腿骨遠位部を、さらなる分析のためホルミルアルデヒド溶液に置いた。
【0152】
動物の手法は、Ｓｗｉｓｓ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ（ＧＥ／６０／１８）により承認されていた。
【0153】
結果
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの操作および性質決定
この試験では、本発明者らは、ＧＡＧ含有量およびコラーゲンＩＩの発現により定義される、改善された硝子軟骨の特徴を有するＣａｒｔｉｂｅａｄｓと命名された軟骨のマイクロ組織を作製した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ法は、（ステップ１）細胞の脱分化を特徴とする２次元の培養（２Ｄ）での軟骨細胞の増殖、次に（ステップ２）、軟骨形成のコミットメントとして定義される、２Ｄでの細胞の再分化、および最後に（ステップ３）軟骨細胞の凝集によるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの形成を可能にする３次元の培養（３Ｄ）を行うことからなる、革新的な３ステップのプロトコル（図１Ａ）である。よって、ヒト軟骨細胞を、外科的な廃棄物から酵素を用いて抽出し、ステップ１および２で大気の酸素条件（２１％）において２Ｄで培養した後、低酸素レベル（５％）で３Ｄ培養を行った。
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの操作および性質決定
この試験では、本発明者らは、ＧＡＧ含有量およびコラーゲンＩＩの発現により定義される、改善された硝子軟骨の特徴を有するＣａｒｔｉｂｅａｄｓと命名された軟骨のマイクロ組織を作製した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓ法は、（ステップ１）細胞の脱分化を特徴とする２次元の培養（２Ｄ）での軟骨細胞の増殖、次に（ステップ２）、軟骨形成のコミットメントとして定義される、２Ｄでの細胞の再分化、および最後に（ステップ３）軟骨細胞の凝集によるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの形成を可能にする３次元の培養（３Ｄ）を行うことからなる、革新的な３ステップのプロトコル（図１Ａ）である。よって、ヒト軟骨細胞を、外科的な廃棄物から酵素を用いて抽出し、ステップ１および２で大気の酸素条件（２１％）において２Ｄで培養した後、低酸素レベル（５％）で３Ｄ培養を行った。
【0154】
軟骨細胞は、遺伝子発現において幹細胞の特徴を有する「線維芽細胞」となり、間葉系幹細胞表面マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３）を発現する（図６）。３週間で、培地１（培地Ｅ）で培養した後、抽出された１０００００個の細胞から、６０００万～１億個の細胞を得ることが可能である。
【0155】
第２のステップは、大量の細胞の増幅ステップの後に軟骨細胞の表現型への線維芽細胞の表現型の「復帰」に対応する。細胞を、再分化（培地２）に、３～７日間置く。０日目に、２００万個の細胞を、Ｔ７５ｃｍ２フラスコにコンフルエンスに達するまで置き、細胞を、４～８日目までコンフルエントに保った後、これらを３Ｄ培養のため脱離した。Ｔ７５ｃｍ２フラスコから、６００万から１０００万個の細胞が、ステップ２で得られる。対して、脱分化培地における第１のステップでは、コンフルエンスに達する際に１２００万～１６００万個の細胞がＴ７５で得られる。再分化培地（培地Ｒ）におけるＦＧＦ－２増殖因子の除去は、細胞の増殖を減少させ、軟骨細胞の完全な分化に向かう表現型の復帰および再分化を可能にする。細胞は、培養の第２のステップでそれらの形態を変え、伸長が少なく、より大きくなり、光学顕微鏡下で細胞質に明らかな顆粒状の小胞体を伴い、よって高レベルのタンパク質合成活性をシグナリングする。軟骨細胞は、ＧＡＧと結合したプロテオグリカンである、アグリカンを再発現し始める（データ ＲＮＡｓｅｑ）。２Ｄ培養におけるこの第２のステップでは、コラーゲンＩＩは、まだ再発現されていない。
【0156】
第３のステップでは、細胞を、培地２（培地Ｒ）での培養から脱離し、３Ｄ培養に播種する。１０００００～２０００００個の細胞を、ポリプロピレンコニカル９６ウェルプレートにおいて再分化培養培地（培地３、培地Ｉとも称される）に分散する。９６ウェルプレートを、３００ｇで５分間遠心分離させて細胞を凝集し、ペレットを形成する。９６ウェルプレートは、ウェルの表面で細胞が固着するのを回避するために、ポリプロピレン物質で作製されている。培養物を、低酸素の雰囲気（５％のＯ２）でインキュベートして、マイクロ組織を使用する前に１５日間硝子軟骨の産生を増大させた。
【0157】
軟骨細胞から操作したＣａｒｔｉｂｅａｄｓは、軟骨病変を処置するためのＡＴＭＰとしての可能性を保持していた。よって、その安全性および有効性を評価するために、本発明者らは動物モデル（ＳＣＩＤマウスおよびミニブタ）を使用した（図１Ｂ）。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを良好に特徴づけるために、組織学的な定性的分析を行った。サフラニン－Ｏで染色したＧＡＧの均一な分布を伴う硝子質の特性の存在が示され、これはＩＩ型コラーゲンの強力な免疫検出と相関したが、Ｉ型コラーゲンはかすかであった（図１Ｃ）。
【0158】
本発明者らは、変形性関節症（ＯＡ）患者由来のものを含む、最大８０歳のドナー由来の同様の質の軟骨組織（ｃａｒｔｉｂｅａｄｓと称される）を操作することができた。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの定量的な分析は、高いＧＡＧ含有量を明らかにし、これは、患者の年齢および関節の骨関節炎の状態とは無関係であった（図１Ｄ、表２）。本発明者らは、平均４０μｇのＧＡＧ／ｃａｒｔｉｂｅａｄおよび平均５０（１０：１４０）のＧＡＧ／ＤＮＡを測定した（図２）。
【0159】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの生体力学的な特性を特徴づけるために、本発明者らは、圧縮試験によりＣａｒｔｉｂｅａｄｓの弾性を定量化するために適応した特注の型を有する装置を使用した。ヤング率を、曲線の弾性部のひずみ（正規化した伸長）で圧縮応力を除算することにより計算した（Ｌｅｅ， Ｊ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， １６：８６４－８７３）。この方法は、一般に、軟骨の弾性を試験するために使用され、その細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成を反映している。本発明者らは、より多くのＧＡＧを含むＣａｒｔｉｂｅａｄｓでの制約に対する耐性の増大を観察し、これはＧＡＧの量の増大の利点を示唆しており（図１Ｅ）、他の公開されている試験と一致している（Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ， Ｎ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． ２０１８， Ｃａｒｔｉｌａｇｅ， １９４７６０３５１８７９８８９０）。
【0160】
ＨＩＦ－１α（Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ １－ａｌｐｈａ）は、ＥＣＭの構成要素を誘導することが知られているため（Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３３：３５－４２）、本発明者らは、大気条件と比較してＣａｒｔｉｂｅａｄｓの質に及ぼす３Ｄ培養の間の低酸素レベル（５％の酸素）の効果を評価した。予測されるように、これら結果は、低酸素条件において軟骨ビーズの硝子質の質の改善を示した（図３Ａ～Ｃ）。注目すべきことに、大気条件での標準的な培養条件は、実際に、ネイティブな軟骨組織で記録される酸素のレベルが深度に応じて０．５～５％であるため、過酸素症に対応している（Ｌａｆｏｎｔ， Ｊ． Ｅ． ２０１０， Ｉｎｔ． Ｊ． ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． ９１（２）：９９－１０６）。
【0161】
細胞療法では、移植される物質の細胞性成分の安定性が重要である。よって、本発明者らは、異なる条件および生細胞の比率におけるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの安定性を評価した。本発明者らは、成熟ステップの終了後０日目のＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧの量を比較した。ここでＣａｒｔｉｂｅａｄｓは、さらに６日間、４℃および２３℃に保存した（図４Ａ）。これら結果は、ＧＡＧの濃度が、経時的および不感温度のバリエーションにおいて平均して５５μｇ／ｃａｒｔｉｂｅａｄで変化しないままであることを示し、安定性を示した。これら条件において死細胞がわずかな数のみ検出され（１３％）、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓにおける軟骨細胞の良好な生存を示唆した（図４Ｂ）。
【0162】
３ステップのＣａｒｔｉｂｅａｄ法のトランスクリプトーム分析は、硝子質マトリックスの質に関与する重要な経路としてＷＮＴ遺伝子の低レベルの発現を同定した。
硝子軟骨の産生の増大に関与する分子経路を同定する試みにおいて、３ステップのＣａｒｔｉｂｅａｄ法を、組織の操作で従来より使用されている２ステップの方法と比較した（図５Ａ）。形態の観点から、３ステップの方法は、２ステップの方法（直径０．５～１ｍｍ）より大きな白色に着色されたＣａｒｔｉｂｅａｄｓ（直径１～２ｍｍ）およびより多量のＧＡＧ／ビーズをもたらした（図２Ａ～Ｃ）。３ステップの方法におけるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの硝子質の質の改善は、主にＦＧＦ－２での大規模な細胞増殖の後のさらなるステップの導入によるものであった。このステップは、飢餓ステップに対応し、ＦＧＦ－２を含まない培地「Ｒ」を使用し、これにより軟骨細胞の再分化および硝子質マトリックスの産生を容易にする。両方の方法において、最終的なステップは、ＴＧＦ－β３の補足を含む成熟培地Ｉにおける２週間の３Ｄ培養を含む（ｃｏｎｓｉｓｔ ｉｎ）（図５Ａ）。
硝子軟骨の産生の増大に関与する分子経路を同定する試みにおいて、３ステップのＣａｒｔｉｂｅａｄ法を、組織の操作で従来より使用されている２ステップの方法と比較した（図５Ａ）。形態の観点から、３ステップの方法は、２ステップの方法（直径０．５～１ｍｍ）より大きな白色に着色されたＣａｒｔｉｂｅａｄｓ（直径１～２ｍｍ）およびより多量のＧＡＧ／ビーズをもたらした（図２Ａ～Ｃ）。３ステップの方法におけるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの硝子質の質の改善は、主にＦＧＦ－２での大規模な細胞増殖の後のさらなるステップの導入によるものであった。このステップは、飢餓ステップに対応し、ＦＧＦ－２を含まない培地「Ｒ」を使用し、これにより軟骨細胞の再分化および硝子質マトリックスの産生を容易にする。両方の方法において、最終的なステップは、ＴＧＦ－β３の補足を含む成熟培地Ｉにおける２週間の３Ｄ培養を含む（ｃｏｎｓｉｓｔ ｉｎ）（図５Ａ）。
【0163】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄの産生を可能にする分子機構を理解するために、本発明者らは、両方法のそれぞれの重要なステップで３つのドナーサンプルを使用してＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）分析を行った。ＲＮＡを、３ステップのＣａｒｔｉｂｅａｄ法の異なる時点：（ｉ）ステップ１の終了時（増幅した軟骨細胞、培地Ｅ）、（ｉｉ）培地Ｒでのステップ２の終了時、および（ｉｉｉ）ステップ３での１５日後（ビーズ、培地Ｉ）で、抽出した。２ステップの方法では、２つの時点を選択した：ステップ１（増幅した軟骨細胞、培地Ｅ）およびステップ２の終了時（ビーズ、培地Ｉ）。最初に本発明者らは、培地Ｉにおいて両方の方法により作製した軟骨のマイクロ組織を比較した（図５ＢおよびＣ）。
【0164】
本発明者らは、ＣａｒｔｉｂｅａｄｓでのＥＣＭの組織化と共に、コラーゲンおよびＥＣＭの分解／形成に関与する遺伝子の有意に高いレベルを観察した（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１）。差次的な遺伝子発現解析は、３ステップの方法が、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓにおいてより高いレベルのＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１）およびアグリカン（ＡＣＡＮ）を誘導し、対して線維軟骨に特有のＩ型コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）は、２ステップの方法で高かったことを示した（図５Ｃ～Ｆ）。ＧＡＧのレベルの増大により、３ステップのＣａｒｔｉｂｅａｄ法における軟骨の分化の改善が確認された（図５Ｇ；図２Ａ～Ｃ）。３ステップの方法（Ｍ１＋Ｍ２＋Ｍ３）では、ＳＯＸ９（マトリックスの産生に関与する転写因子）もまた増大している（図７Ｃ）。
【0165】
これらデータは、ＣＯＬ１Ａ１発現の検出を伴う培地Ｅ（ＦＧＦ－２を含む）における軟骨細胞の脱分化ならびにＣＯＬ２Ａ１およびＡＣＡＮ（ＧＡＧ結合タンパク質）などの硝子軟骨マーカーの非存在を確認した（図５Ｄ～Ｆ）。本発明者らは、フローサイトメトリーにより培地Ｅに脱分化した細胞が多く含まれることを確認し、これはＩＳＣＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）により定義および提案される、間葉系幹細胞マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する細胞の比率が増殖期の終了時に、細胞集団の合計の９０％超であったことを表している（図６Ａ、表４）。
【0166】
【表4】
【0167】
さらに、この脱分化した軟骨細胞集団の多分化能の特徴を、この集団が、他の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）派生細胞（骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞）へと分化する特性を、この可能性がＭＳＣと比較して依然として低くても有するという事実により確認した（図６Ｂ）。
【0168】
本発明者らは、培地Ｒ（再分化ステップ）から培地Ｅ（増殖ステップ）において培養した細胞の遺伝子発現を比較した際に、再分化の間に炎症プロセスに関与する遺伝子（インターフェロンのシグナリングと共にインターロイキンおよびサイトカインのシグナリング）のより高レベルの発現を見出した。並行して、本発明者らは、細胞周期に関与する遺伝子（ＭＩ６７、ＣＤＫ、ＣＣＮＢ１）の低レベルの発現を見出し、これは硝子質マトリックスの産生が、細胞の炎症と細胞周期の出口に関連する組織のリモデリングとの間で動的なバランスを必要とすることを表している（図７Ａ）。
【0169】
増殖期を再分化期と比較することにより、本発明者らは、増殖期（ステップ１、培地Ｅ、両方の方法）の間に、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、およびＷＮＴ７Ｂの遺伝子の高い発現レベルを観察した（図７Ｂ、Ｄ～Ｆ）。これら遺伝子は、３Ｄ培養（ステップ３、培地Ｉ）での中間の発現を示したＷＮＴ５Ｂを除き、再分化ステップ（培地Ｒ、３ステップの方法）の間および３Ｄ培養（培地Ｉ、両方の方法）の間にて強力にダウンレギュレートされた（図７Ｅ）。
【0170】
また、ＫＩ６７（増殖マーカー）およびＴＣＦ４（ｗｎｔ／βカテニン経路の下流に関与）の発現が、再分化ステップの間に減少している（図７Ｃ）。最も重要なことに、脱分化期および再分化期（Ｍ１＋Ｍ２）の後に、ＫＩ６７およびＷＮＴ７Ｂ／ＷＮＴ５Ｂは、成熟期（Ｍ３）でのスフィアの形成前に減少した。細胞が、脱分化期（Ｍ１）から直接スフェロイドを形成するために使用される場合、これらは、依然として、ＫＩ６７およびＷＮＴ７Ｂ／ＷＮＴ５Ｂを著しく発現し、硝子質マトリックスの産生は少なかった。
【0171】
これら結果は、ＦＧＦ－２処置後のＷＮＴのアップレギュレーションを報告した以前の試験（Ｂｕｃｈｔｏｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８５２， ８３９－８５０； Ｄｅｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． ２０１９． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １９２， ５６９－５７８）と一致していた。実際に、ＷＮＴシグナリングは、幹細胞様の表現型（ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に関与している（Ｂｕｃｈｔｏｖａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８５２， ８３９－８５０）。よって、培地ＲにおけるＦＧＦ－２の除去は、再分化期の間にＷＮＴシグナリングのダウンレギュレーションをもたらした。本発明者らは、３ステップの方法と比較して２ステップの方法において低いレベルのＣＯＬ２Ａ１およびＡＣＡＮの発現を検出した（図５Ｃ～Ｅ）。しかしながら、本発明者らは、培地Ｉにおける３Ｄ分化期の間、２ステップの方法において同等のＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、およびＷＮＴ７Ｂの遺伝子の減少を観察した（図７Ｂ）。
【0172】
再分化期（培地Ｒ）の間のＷＮＴ経路のダウンレギュレーションの役割を検証するために（図１Ａ）、本発明者らは、培地Ｒを、１０μＭのＷＮＴ経路の阻害剤であるＸＡＶ－９３９を補充した培地Ｅに、４日間置き換えた（図７Ｇ）。ＸＡＶ－９３９での処置の後、本発明者らは、ＷＮＴシグナリング阻害の既知の指標である、ホスホ－β－カテニンおよびアキシンの増大を観察した（図７Ｇ）（Ｈｕａｎｇ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２００９． Ｎａｔｕｒｅ ４６１， ６１４－６２０）。よって、培地Ｒと同様に、ＷＮＴの薬理学的な阻害は、２Ｄおよび３Ｄの培養の後、２ステップの方法においてＡＣＡＮおよびＣＯＬ２Ａ１の発現の増大を誘導した（図７Ｈ、Ｉ）。結果として、ＷＮＴの薬理学的な阻害は、ＧＡＧのサフラニン－Ｏ染色により確認されるように、ＸＡＶ－９３９の存在下で２ステップの方法にて得られたビーズの硝子質の特性の存在をもたらした（図７Ｊ）。
【0173】
まとめると、トランスクリプトーム分析は、この応答の潜在的な主要な介在物質として作用するＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、およびＷＮＴ７Ｂと共に、軟骨細胞の脱分化および再分化におけるＷＮＴシグナリング経路の関与およびその調節を同定した（図７Ｄ～Ｆ）。ＸＡＶ－９３９を補充した培地Ｅは、培地Ｒの効果を模倣する（図７Ｋ）が、３ステップの方法は、費用のかかる薬理学的な分子を使用することなく７日間でＷＮＴ遺伝子のダウンレギュレーションを自然に誘導した。
【0174】
ヒト軟骨欠損におけるｅｘ ｖｉｖｏでの実現可能性の試験
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの臨床適応の観点から、本発明者らは、ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトの膝関節において作製された病変内に共に融合し統合するＣａｒｔｉｂｅａｄｓの特性を評価した。病変は、８ｍｍの外科的なパンチ生検で作製し、乾燥条件にて２０～５０個のＣａｒｔｉｂｅａｄｓを充填した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓをこの条件にて２０分間そのままにし、病変部位および互いに対してＣａｒｔｉｂｅａｄｓの接着を促進させた後（図８Ａ、左および中央のパネル）、培地Ｉを添加した。次に、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを充填したその病変を伴う検体全体を、回転させながら１カ月間培養して、栄養素の大量の移動を促進させた。移植から１カ月後に、本発明者らは骨軟骨組織を分析し（図８Ａ、右のパネル）、充填した病変のレベルにてサフラニン－Ｏ染色を行った（図８Ｂ）。本発明者らは、病変の中での硝子質の特徴の維持およびいくらかのレベルのネイティブな周辺組織とＣａｒｔｉｂｅａｄｓの統合およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの互いの融合を観察した（図８Ｂ）。
Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの臨床適応の観点から、本発明者らは、ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトの膝関節において作製された病変内に共に融合し統合するＣａｒｔｉｂｅａｄｓの特性を評価した。病変は、８ｍｍの外科的なパンチ生検で作製し、乾燥条件にて２０～５０個のＣａｒｔｉｂｅａｄｓを充填した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓをこの条件にて２０分間そのままにし、病変部位および互いに対してＣａｒｔｉｂｅａｄｓの接着を促進させた後（図８Ａ、左および中央のパネル）、培地Ｉを添加した。次に、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを充填したその病変を伴う検体全体を、回転させながら１カ月間培養して、栄養素の大量の移動を促進させた。移植から１カ月後に、本発明者らは骨軟骨組織を分析し（図８Ａ、右のパネル）、充填した病変のレベルにてサフラニン－Ｏ染色を行った（図８Ｂ）。本発明者らは、病変の中での硝子質の特徴の維持およびいくらかのレベルのネイティブな周辺組織とＣａｒｔｉｂｅａｄｓの統合およびＣａｒｔｉｂｅａｄｓの互いの融合を観察した（図８Ｂ）。
【0175】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｒｔｉｂｅａｄｓの前臨床安全性試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖された細胞の移植は、潜在的な制御されていない増殖の問題を提起している。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの安全性を、前臨床試験を介して評価した。ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）アレイ解析は、最大１１継代まで細胞増幅の間の軟骨細胞の遺伝子の安定性を示した（表５）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖された細胞の移植は、潜在的な制御されていない増殖の問題を提起している。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓの安全性を、前臨床試験を介して評価した。ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）アレイ解析は、最大１１継代まで細胞増幅の間の軟骨細胞の遺伝子の安定性を示した（表５）。
【0176】
【表5】
【0177】
以前の試験と一致して、Ｙ染色体の喪失は、男性の通常の老化における一般的な後天的変異であり、高齢のドナーの一部（４３％）で観察された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ２０１９． Ｎａｔｕｒｅ ５７５， ６５２－６５７； Ｓｔｕｍｍ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１２． Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０， １０３９－１０４５）。
【0178】
ｉｎ ｖｉｖｏでの試験において、本発明者らは、ＳＣＩＤマウスに移植したヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓの潜在的な腫瘍形成作用を評価した。Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓは、増殖せず、ＳＣＩＤマウスにおいて移植から６カ月後にはほとんど検出されず、これにより６カ月のフォローアップにわたり潜在的な腫瘍形成能の非存在が確認された（図９Ａ～Ｃ、表５）。
【0179】
ｉｎ ｖｉｖｏでの前臨床での有効性試験
臨床適応へ向けて動くために、本発明者らは、軟骨の成熟性およびヒトと類似する膝組織のため選択された成年のＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおいて前臨床での有効性試験を行った（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｂ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ２， １３； Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｃ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ｃ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３， ７４５－７５３）。６匹の雌性をこの試験に使用した。第１の外科手術を行い、膝から軟骨生検（約３０ｍｇ）を回収して、自家性ミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓを作製した。第２の外科手術を行い、動物／右膝あたり４～５つの病変を誘導し、自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを移植した。ミニブタを、３～６カ月間経過観察した（図１０Ａ；図１１）。移植前に、ミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧの量を定量化し、これは平均して４０～５０μｇ／ビーズの範囲であった（図１０Ｂ）。移植から３カ月後に、本発明者らは、サフラニン－Ｏ染色によりミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓをグラフトした病変の硝子質の特性を確認した（図１０Ｃ）。同様の結果が、移植から６カ月後のグラフトした病変から得られた（図１０Ｄ）。まとめられたＣａｒｔｉｂｅａｄｓの完全な融合ならびに周辺のネイティブな軟骨および軟骨下骨の中のそれらの統合が、３および６カ月のフォローアップ期間に全てのミニブタで観察された（図１０Ｃ～Ｄ）。まとめると、自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓは、硝子質の質を保ちつつ、病変の生着の観点からそれらの有効性を証明した。これらはまた、関節の変性も（図１１、中央のパネル）異所的または肥大型の組織形成も２名の無関係な操作者による巨視的な検査で指摘されなかったため（データ不図示）、安全であることを証明した。
臨床適応へ向けて動くために、本発明者らは、軟骨の成熟性およびヒトと類似する膝組織のため選択された成年のＧｏｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおいて前臨床での有効性試験を行った（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｂ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ２， １３； Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｃ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ｃ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３， ７４５－７５３）。６匹の雌性をこの試験に使用した。第１の外科手術を行い、膝から軟骨生検（約３０ｍｇ）を回収して、自家性ミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓを作製した。第２の外科手術を行い、動物／右膝あたり４～５つの病変を誘導し、自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓを移植した。ミニブタを、３～６カ月間経過観察した（図１０Ａ；図１１）。移植前に、ミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓにおけるＧＡＧの量を定量化し、これは平均して４０～５０μｇ／ビーズの範囲であった（図１０Ｂ）。移植から３カ月後に、本発明者らは、サフラニン－Ｏ染色によりミニブタＣａｒｔｉｂｅａｄｓをグラフトした病変の硝子質の特性を確認した（図１０Ｃ）。同様の結果が、移植から６カ月後のグラフトした病変から得られた（図１０Ｄ）。まとめられたＣａｒｔｉｂｅａｄｓの完全な融合ならびに周辺のネイティブな軟骨および軟骨下骨の中のそれらの統合が、３および６カ月のフォローアップ期間に全てのミニブタで観察された（図１０Ｃ～Ｄ）。まとめると、自家性Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓは、硝子質の質を保ちつつ、病変の生着の観点からそれらの有効性を証明した。これらはまた、関節の変性も（図１１、中央のパネル）異所的または肥大型の組織形成も２名の無関係な操作者による巨視的な検査で指摘されなかったため（データ不図示）、安全であることを証明した。
【0180】
論述および結論
本試験の主な成果は、増殖の間の軟骨細胞の表現型の喪失（軟骨細胞の脱分化）を反転できる方法である。これは、出発物質として軟骨細胞を使用する細胞療法が直面している重要な問題を解決する。本データは、新規の３ステップの方法が、患者の年齢および関節の関節炎の状態に関わらず、硝子質の特徴を伴う高品質の軟骨をもたらし得ることを示している。
本試験の主な成果は、増殖の間の軟骨細胞の表現型の喪失（軟骨細胞の脱分化）を反転できる方法である。これは、出発物質として軟骨細胞を使用する細胞療法が直面している重要な問題を解決する。本データは、新規の３ステップの方法が、患者の年齢および関節の関節炎の状態に関わらず、硝子質の特徴を伴う高品質の軟骨をもたらし得ることを示している。
【0181】
Ｃａｒｔｉｂｅａｄ法は、従来のヒト軟骨細胞ベースの細胞療法（Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ， Ｍ． ２００８． Ｉｎｊｕｒｙ ３９ Ｓｕｐｐｌ １， Ｓ４０－４９）における平均２６０ｍｇとは対照的に、非常に小量の軟骨サンプルの回収（本発明者らの前臨床のミニブタでの試験では約３０ｍｇ）からの細胞増殖を可能にし、ドナーの部位の病的状態を低減する。本方法は、硝子質が少なくより多くの線維軟骨を含んでいることが示唆されている以前に報告された軟骨のマイクロ組織（Ｂａｒｔｚ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １４， ３１７）よりも２０倍多いＧＡＧ／Ｃａｒｔｉｂｅａｄの比率を示した。これら結果と一致して、本発明者らは、他の公開されている方法（Ｍｕｍｍｅ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１６． Ｌａｎｃｅｔ ３８８， １９８５－１９９４ ； Ｄａｎｇ， Ｐ． Ｎ．， Ｓｏｌｏｒｉｏ， Ｌ． Ｄ． ＆ Ａｌｓｂｅｒｇ， Ｅ． ２０１４． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｐａｒｔ Ａ ２０， ３１６３－３１７５）よりも平均して少なくとも３倍高いＧＡＧ／ＤＮＡの比率を得た（図２Ｂ）。
【0182】
再分化は、ＦＧＦ－２の除去によるものであった。しかしながら、３Ｄ培養におけるこの除去は、２ステップの方法で硝子質マトリックスの合成を誘導するには十分ではなかった。軟骨細胞の再分化は、十中八九、２Ｄ培養においてマトリックスでコーティングされたフラスコへの細胞接着および特有の細胞シグナリング経路の誘導を必要とする。ＦＧＦ－２の飢餓は、ＷＮＴシグナリング経路のいくつかの遺伝子を含む、多分化能および幹細胞性に関与する遺伝子を停止させる。ＷＮＴシグナリングは、成年の前駆体細胞の軟骨形成の分化の阻害および刺激の両方に関与している（Ｄａｙ， Ｔ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ８， ７３９－７５０； Ｈｉｌｌ， Ｔ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ８， ７２７－７３８； Ｈｕ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． ２００５． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １３２， ４９－６０）。胚において示されるように、高いレベルのＷＮＴ／β－カテニンのシグナリングは、幹細胞の軟骨形成の分化を阻害し、この経路のダウンレギュレーションは、軟骨形成を誘導する（Ｈａｒｔｍａｎｎ， Ｃ． ２００７． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ ２４， １７７－１８４； Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ． Ｌ． ＆ Ｒａｊａｍａｎｎａｎ， Ｎ． ２００６． Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ＆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ７， ４１－４９； Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｆ， Ｊ． Ｊ．， Ｋａｈｌｅｒ， Ｒ． Ａ． ＆ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ， Ｔ． Ｍ． ２００４． Ｇｅｎｅ ３４１， １９－３９）。
【0183】
本試験では、本発明者らは、この機構に関与する可能性の高いＷＮＴアイソフォームとしてＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、およびＷＮＴ７Ｂを同定した。ＷＮＴ経路のダウンレギュレーションと並行して、本発明者らは、炎症性経路に関与する遺伝子の発現（インターロイキン、サイトカイン）の増大を観察した。創傷治癒および組織修復において、炎症促進性因子および抗炎症性因子の間の動的なバランスが、効果的な治癒に重要である（Ｇｅｒｈａｒｄ Ｔ． Ｌａｓｃｈｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１． Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４， １１９－１３１； Ｂｏｓｕｒｇｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６， １０７２－１０７６）。よって、本データは、炎症が、硝子質マトリックスの生合成に関連する組織再生の必要条件であることを示唆している（Ｋａｒｉｎ， Ｍ． ＆ Ｃｌｅｖｅｒｓ， Ｈ．２０１６． Ｎａｔｕｒｅ ５２９， ３０７－３１５）。
【0184】
ヒトＣａｒｔｉｂｅａｄｓは、ＳＣＩＤマウスに移植した際に増殖せず、さらには６カ月後には消失した。これは、同様の試験（Ｚｓｃｈａｒｎａｃｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． ２０１５． Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １３， １６０）と一致している。さらに、ミニブタにおけるＣａｒｔｉｂｅａｄｓの自家移植は、移植から６カ月後に、安定した病変内への統合を示し、高レベルのＧＡＧを維持し、軟骨損傷の修復を成功させた。まとめると、本発明者らは、大型動物モデルにおける高レベルのＧＡＧを含むＣａｒｔｉｂｅａｄの移植の実現可能性を示しており、この長期間の軟骨修復の可能性を支援している。結果として、Ｃａｒｔｉｂｅａｄｓは、軟骨修復の分野でのブレイクスルーを表し、現在、軟骨損傷を有する患者における自家性軟骨移植に関するフェーズＩの臨床試験（ＦＩＨ：Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ）に入ることができる。
【図1A-B】
【図1C-E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A-B】
【図5C-G】
【図6】
【図7A-B】
【図7C】
【図7D-K】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】