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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-27
(54)【発明の名称】抗血小板剤拮抗剤としてのトロンボソーム
(51)【国際特許分類】
A61K 35/19 20150101AFI20221020BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221020BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20221020BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20221020BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20221020BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20221020BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20221020BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/616 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/4365 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/4465 20060101ALI20221020BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20221020BHJP
A61K 31/195 20060101ALI20221020BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20221020BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20221020BHJP
【ＦＩ】
A61K35/19 Z
A61K45/00
A61P7/04
A61K9/19
A61K47/02
A61K47/42
A61K47/26
A61K47/36
A61K31/616
A61K31/675
A61K31/4365
A61K31/4465
A61K39/395 N
A61K31/197
A61K31/195
A61K38/12
A61K47/22
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022509583
(86)(22)【出願日】2020-08-14
(85)【翻訳文提出日】2022-03-28
(86)【国際出願番号】 US2020046525
(87)【国際公開番号】W WO2021034719
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/887,923
(32)【優先日】2019-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/065,337
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508180585
【氏名又は名称】セルフィアー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】モスコウィッツ キース アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】イシュラー ブレイデン カール
(72)【発明者】
【氏名】ディッカーソン ウィリアム マシュー
(72)【発明者】
【氏名】タンドン ナレンドラ ナス
(72)【発明者】
【氏名】リー アンバー ニコル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA30
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB40
4C076CC14
4C076DD25Z
4C076DD26
4C076DD60Z
4C076DD66
4C076EE30
4C076EE41A
4C076FF70
4C084AA19
4C084AA23
4C084BA20
4C084BA26
4C084DC11
4C084DC32
4C084MA17
4C084MA44
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA53
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC21
4C086CB26
4C086DA17
4C086DA38
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA44
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA53
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB38
4C087MA02
4C087MA17
4C087MA44
4C087MA55
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA53
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA44
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA05
4C206MA37
4C206MA64
4C206MA75
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA53
4C206ZC75
(57)【要約】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含み、この対象は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含み、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項2】
対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されており、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項3】
対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含み、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項4】
対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されており、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項5】
手術のために対象を準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含み、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項6】
手術のために対象を準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されており、前記対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、
方法。
【請求項7】
前記手術が、緊急手術である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
前記手術が、予定された手術である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項9】
前記対象が、抗血小板剤によって治療されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗血小板剤による治療が、停止される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記抗血小板剤による治療が、継続される、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
対象における抗血小板剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、前記組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とを含む、
方法。
【請求項13】
対象における抗血小板剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、血小板を、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、前記組成物を形成することを含むプロセスによって、前記組成物が調製されている、
方法。
【請求項14】
前記抗血小板剤の前記効果が、前記抗血小板剤の過剰摂取の結果である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記組成物が、抗線溶剤をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記抗線溶剤が、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、フィブリノゲン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記血小板または血小板誘導体に、前記抗線溶剤が充填される、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、シロスタゾール、プロスタグランジンＥ１、エポプロステノール、ジピリダモール、トレプロスチニルナトリウム、サルポグレラート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
投与が、局所投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
投与が、非経口投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
投与が、静脈内投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
投与が、筋肉内投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
投与が、髄腔内投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
投与が、皮下投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
投与が、腹腔内投与を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記組成物が、前記投与工程の前に乾燥される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記組成物が、前記乾燥工程の後に再水和される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記組成物が、前記投与工程の前に凍結乾燥される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記組成物が、前記凍結乾燥工程の後に再水和される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記インキュベーション剤が、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記インキュベーション剤が、担体タンパク質を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記組成物が、１種以上の糖を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
１種以上の糖が、トレハロースを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記１種以上の糖が、ポリスクロースを含む、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記１種以上の糖が、デキストロースを含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記組成物が、有機溶媒を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記血小板または血小板誘導体が、トロンボソームを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／８８７，９２３号および２０２０年８月１３日に出願された米国仮出願第６３／０６５，３３７号の優先権を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／８８７，９２３号および２０２０年８月１３日に出願された米国仮出願第６３／０６５，３３７号の優先権を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本開示は、薬物誘発性凝固障害の治療としてのトロンボソームの使用を説明する役割を果たす。アスピリンまたはクロピドグレルなどの抗血小板薬の使用は、出血する可能性を増加させ得る。ここで、トロンボソームが、この阻害を回避または克服して止血を回復させ得ることを実証する。
本開示は、薬物誘発性凝固障害の治療としてのトロンボソームの使用を説明する役割を果たす。アスピリンまたはクロピドグレルなどの抗血小板薬の使用は、出血する可能性を増加させ得る。ここで、トロンボソームが、この阻害を回避または克服して止血を回復させ得ることを実証する。
【背景技術】
【0003】
背景
抗血小板薬（本明細書では抗血小板剤とも称される）は、米国成人集団において一般的であり、血小板作用を阻害する複数の機序を用いる。抗血小板薬は、多数の脳血管疾患および心臓血管疾患を治療かつ／または予防するために使用される。
抗血小板薬（本明細書では抗血小板剤とも称される）は、米国成人集団において一般的であり、血小板作用を阻害する複数の機序を用いる。抗血小板薬は、多数の脳血管疾患および心臓血管疾患を治療かつ／または予防するために使用される。
【0004】
しかしながら、抗血小板薬は、多数の薬物関連有害事象（ＡＤＥ）に関与している。これらの薬物に関連する過剰摂取および有害事象は、患者集団に深刻な出血および関連する合併症のリスクをもたらす。加えて、抗血小板薬によって治療されている対象は、療法の停止が対象を心臓発作、脳卒中、または死亡のリスクの増加に曝す可能性があるが、手術の前に薬物を減らされる必要がある場合があるため、手術において追加の合併症に直面している。
【0005】
したがって、抗血小板剤誘発性凝固障害などの凝固障害の治療に対するニーズ、ならびに抗血小板薬を服用する対象を手術のために準備させるための解決策に対するニーズが当該技術分野において存在する。
【発明の概要】
【0006】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、対象における凝固障害を治療する方法が本明細書に提供され、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0008】
いくつかの実施形態では、対象における正常な止血を回復させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、対象における正常な止血を回復させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0010】
いくつかの実施形態では、対象を手術のために準備させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、対象を手術のために準備させる方法が本明細書に提供され、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。実装形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。手術は、緊急手術であり得る。手術は、予定された手術であり得る。
【0012】
上記の方法のいくつかの実施形態では、対象は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている。いくつかの実施形態では、抗血小板剤による治療は、停止され得る。いくつかの実施形態では、抗血小板剤による治療は、継続され得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法が本明細書に提供され、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0015】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤の効果は、抗血小板剤の過剰摂取の結果であり得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、およびサプリメントからなる群から選択され得る。
【0017】
本明細書の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。投与は、局所投与を含み得る。投与は、非経口投与を含み得る。投与は、静脈内投与を含み得る。投与は、筋肉内投与を含み得る。投与は、髄腔内投与を含み得る。投与は、皮下投与を含み得る。投与は、腹腔内投与を含み得る。組成物は、投与工程の前に乾燥され得る。組成物は、乾燥工程の後に再水和され得る。組成物は、投与工程の前に凍結乾燥され得る。組成物は、凍結乾燥工程の後に再水和され得る。インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含み得る。インキュベーション剤は、担体タンパク質を含み得る。緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含み得る。組成物は、１種以上の糖を含み得る。１種以上の糖は、トレハロースを含み得る。１種以上の糖は、ポリスクロースを含み得る。１種以上の糖は、デキストロースを含み得る。組成物は、有機溶媒を含み得る。血小板または血小板誘導体は、トロンボソームを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】増加濃度のカングレロールによる、またはよらない、１０μＭのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）活性化によって誘発された、積分凝集曲線として表される、多血小板血漿におけるカングレロール（「Ｃａｎｇ」）の光透過凝集測定を示す。
【図2】Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対するカングレロール、ＡＤＰ、またはそれらの組み合わせの効果を示す。
【図5】Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対する再水和の６０、９０、または１１５分後のＡＤＰおよびカングレロールの存在下および非存在下での多血小板血漿に補充されたトロンボソーム（「ｔｈｒｏｍｂ」；３００，０００／μＬ）の効果を示す。
【図8】コラーゲン（１０μｇ／ｍＬ）および様々な濃度のエプチフィバチド（「Ｅｐｔｉ」）で処理された血小板（１μＬ当たり２５０，０００個の血小板の濃度）の凝集実験からのＡＵＣの棒グラフである。
【図9】Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した全血に対する様々な濃度でのエプチフィバチドの効果を示す。
【図10】Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した様々な濃度のエプチフィバチドを含む、および含まない、全血に対するトロンボソーム（「Ｔｓｏｍｅ」）補充（約２００，０００／ｕＬ）の効果を示す。
【図13】トロンボソーム（様々なロット）が乏血小板血漿（ＰＰＰ）中のエプチフィバチドの存在下で閉塞することを示す。
【図16】様々な濃度のアスピリン（「ＡＳＡ」）を含む、および含まない、コラーゲン（１０μｇ／ｍＬ）またはアラキドン酸（「ＡＡ」；５００μｇ／ｍＬ）で処理された血小板の凝集実験からのＡＵＣの棒グラフである。
【図17】Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した剪断下でのコラーゲンでコーティングされたプラスチックに対する応答によって測定した、全血、様々な濃度のアスピリン（ＡＳＡ）で処理された全血、および様々な濃度のアスピリンで処理され、トロンボソーム（約２００，０００～４００，０００／μＬ）を補充された全血についての閉塞時間の棒グラフである。
【図18】トロンボプラスチンおよびコラーゲンでコーティングされたＴ－ＴＡＳ ＡＲチップにおける閉塞時間によって測定した、ＡＳＡ（２００マイクロモル）、カングレロール（１マイクロモル）、ＡＰ２ ６Ｆ１（４０マイクログラム）の存在下で全血中のトロンボソームによって促進される血栓形成の回復を示す。
【図19】閉塞（圧力）超過時間によって測定した、ＡＳＡ（２００マイクロモル）、カングレロール（１マイクロモル）、および６Ｆ１（４０マイクログラム／ｍＬ）の存在下で全血中のトロンボソームによって促進される血栓形成の回復を示す。
【図20】ＡＵＣによって測定した、高剪断下でのプラスチック固定化ブタコラーゲンとの相互作用に対するアスピリン（ＡＳＡ）阻害化全血（５００マイクロモル）へのトロンボソーム補充の効果を示す。
【図21】経時的な閉塞（圧力）によって測定した、高剪断下でのプラスチック固定化ブタコラージュとの相互作用に対するアスピリン（ＡＳＡ）阻害化全血（５００マイクロモル）へのトロンボソーム補充の効果を示す。
【図22】ＡＵＣによって測定した、高剪断下でのプラスチック固定化ブタコラージュとの相互作用に対するアスピリン（ＡＳＡ）阻害化全血（１００マイクロモル）へのトロンボソーム補充の効果を示す。
【図23】経時的な閉塞（圧力）によって測定した、高剪断下でのプラスチック固定化ブタコラージュとの相互作用に対するアスピリン（ＡＳＡ）阻害化全血（１００マイクロモル）へのトロンボソーム補充の効果を示す。
【図24】正常およびアスピリン阻害化血漿へのトロンボソーム補充のピークトロンビンに対する効果を示す。
【図25】図２５Ａは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対するカングレロール単独またはカングレロール＋トロンボソームの効果を示す。図２５Ｂは、図２５Ａからのデータセットについての閉塞時間の棒グラフである。
【図26】図２６Ａは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対するチロフィバン単独、またはチロフィバンとランダムドナーの血小板（ＲＤＰ）もしくはトロンボソームとの効果を示す。図２６Ｂは、図２６Ａからのデータセットについての閉塞時間の棒グラフである。
【図27】図２７Ａは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対するエプチフィバチド単独、またはエプチフィバチドとＲＤＰもしくはトロンボソームとの効果を示す。図２７Ｂは、図２７Ａからのデータセットについての閉塞時間の棒グラフである。
【図28】図２８Ａは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用した血小板閉塞に対するＡＰ２単独、またはＡＰ２とＲＤＰもしくはトロンボソームとの効果を示す。図２８Ｂは、図２８Ａからのデータセットについての閉塞時間の棒グラフである。
【図29】図２９Ａは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用したアスピリン療法の対象から採取されたＰＲＰに対するトロンボソームの効果を示す。図２９Ｂは、図２９Ａからのデータセットについての閉塞時間の棒グラフである。
【図30】図３０Ａは、トロンビン生成に対するアスピリン療法の対象から採取されたＰＲＰに対するトロンボソームの効果を示す。図３０Ｂは、トロンボソームを添加したか、または添加していないアスピリン療法の対象から採取されたＰＲＰについてのトロンビン生成パラメータの棒グラフである。
【図31】図３１Ａは、緩衝液、アラキドン酸、またはコラーゲンを添加したイブプロフェン療法の対象から採取されたＰＲＰの凝集測定を示す。図３１Ｂは、トロンボソームを含むか、または含まないイブプロフェン療法の対象から採取されたＰＲＰに対するＡＤＰの効果を示す。
【図32】超薬理学的用量のクロピドグレルによって処置されたマウスの出血時間に対するトロンボソームの投薬の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
本発明の実施形態を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、その用語が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等である任意の方法および材料が本発明の実践に使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される方法および／また材料と関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、あらゆる組み込まれた刊行物との矛盾を制御する。
本発明の実施形態を詳細に記載する前に、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、その用語が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等である任意の方法および材料が本発明の実践に使用され得るが、ここでは、好ましい方法および材料を記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される方法および／また材料と関連して方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、あらゆる組み込まれた刊行物との矛盾を制御する。
【0020】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示的に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「糖」への言及は、１種以上の糖、および当業者に既知のそれらの同等物への言及を含む。さらに、同等の用語を使用して記載され得る用語の使用は、それらの同等の用語の使用を含む。したがって、例えば、「対象」という用語の使用は、「患者」、「人」、「動物」、「ヒト」、および医学的処置を受ける対象を示すために当該技術分野で使用される他の用語を含むことを理解されたい。単一の概念を包含するために複数の用語を使用することは、使用されるそれらの用語のみに概念を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0021】
本明細書で使用される用語が、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。さらに、値の範囲が開示される場合、当業者は、開示される範囲内の他のすべての特定の値が、本明細書で各特定の値または範囲を開示する必要なしに、これらの値およびそれらが表す範囲によって本質的に開示されることを理解するであろう。例えば、開示される１～１０の範囲は、１～９、１～５、２～１０、３．１～６、１、２、３、４、５などを含む。さらに、開示される範囲の各々は、範囲のより低い値については最大５％低いこと、および範囲のより高い値については最大５％高いことを含む。例えば、開示される４～１０の範囲は、３．８～１０．５を含む。この概念は、本書では「約」という用語によって捉えられている。
【0022】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「血小板」という用語は、全血小板、断片化された血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームを含み得る。上記の定義内の「血小板」は、例えば、全血中の血小板、血漿中の血小板、選択された血漿タンパク質で任意選択的に補充された緩衝液中の血小板、低温貯蔵された血小板、乾燥された血小板、凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、解凍された凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、再水和された乾燥された血小板、再水和された凍結保存された（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、解凍された凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板、または再水和された凍結保存された（ｌｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ）血小板を含み得る。「血小板」は、ヒトなどの哺乳動物の「血小板」であり得るか、または非ヒト哺乳動物などの「血小板」であり得る。
【0023】
本明細書で使用される場合、「トロンボソーム」（本明細書では、特に実施例および図では、「Ｔｓｏｍｅ」または「Ｔｓ」とも称される場合がある）は、インキュベーション剤（例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれか）で処理され、凍結保存（例えば、凍結乾燥）されている、血小板誘導体である。いくつかの場合では、トロンボソームは、プールされた血小板から調製され得る。トロンボソームは、周囲温度で、乾燥形態で２～３年の貯蔵寿命を有し得、直ちに注入するために数分以内に滅菌水で再水和され得る。トロンボソームの１つの例は、血小板減少性患者における急性出血の治療のための臨床試験にある、ＴＨＲＯＭＢＯＳＯＭＥＳ（登録商標）である。典型的には、第ＩＩａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩ因子、組織因子、もしくは凝血因子（例えば、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、または第Ｘ因子）のビタミンＫ依存性合成を阻害する薬剤、または抗トロンビン（例えば、抗トロンビンＩＩＩ）を活性化する薬剤は、抗凝固剤であると見なされる。抗凝固剤の他の機序は、既知である。抗凝固剤としては、ダビガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、フォンダパリヌクス、ワルファリン、ヘパリン、および低分子量ヘパリンが挙げられる。
【0024】
本明細書で使用される場合、「抗血小板剤」は、抗血栓剤であり、かつ抗凝固剤を含まない。抗血小板剤の例としては、アスピリン（アセチルサリチル酸またはＡＳＡとも称される）、カングレロール（例えば、ＫＥＮＧＲＥＡＬ（登録商標））、チカグレロール（例えば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））、クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））、プラスグレル（例えば、ＥＦＦＩＥＮＴ（登録商標））、エプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ（登録商標））、チロフィバン（例えば、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標））、およびアブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））が挙げられる。本開示の目的のために、抗血小板剤は、Ｐ２Ｙ受容体（例えば、Ｐ２Ｙ１２）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａを阻害する薬剤、またはトロンボキサンシンターゼもしくはトロンボキサン受容体に拮抗する薬剤を含む。トロンボキサンＡ２アンタゴニストの非限定的な例は、アスピリン、テルトロバン、およびピコタミドである。Ｐ２Ｙ受容体アンタゴニストの非限定的な例としては、カングレロール、チカグレロール、エリノグレル、クロピドグレル、プラスグレル、およびチクロピジンが挙げられる。糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの非限定的な例としては、アブシキシマブ、エプチフィバチド、およびチロフィバンが挙げられる。ＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェン）もまた、本開示の目的のための抗血小板剤であると見なされる。抗血小板剤の他の機序は、既知である。抗血小板剤としては、ＰＡＲ１アンタゴニスト、ＰＡＲ４アンタゴニスト、ＧＰＶＩアンタゴニスト、およびａｌｐｈａ２ｂｅｔａｌコラーゲン受容体アンタゴニストも挙げられる。ＰＡＲ－１アンタゴニストの非限定的な例としては、ボラパキサールおよびアトパキサールが挙げられる。本明細書で使用される場合、アスピリンは、抗血小板剤であるが、抗凝固剤ではないと見なされる。抗血小板剤のさらなる非限定的な例としては、シロスタゾール、プロスタグランジンＥ１、エポプロステノール、ジピリダモール、トレプロスチニルナトリウム、およびサルポグレラートが挙げられる。
【0025】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、シロスタゾール、プロスタグランジンＥ１、エポプロステノール、ジピリダモール、トレプロスチニルナトリウム、サルポグレラート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、本明細書に記載の抗血小板剤のうちのいずれか２つ（またはそれ以上）などの、複数の抗血小板剤を含み得る。いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリンおよびクロピドグレルであり得る。
【0026】
カングレロールは、クロピドグレル、チカグレロール、およびプラスグレルと同様に、血小板上のＰ２Ｙ１２（ＡＤＰ）受容体を遮断する。カングレロールは、いくつかの場合では、このクラスの薬物の代表として使用され得る。カングレロールは、クロピドグレルおよびプラスグレルとは異なり、生物学的に活性となるために肝代謝を必要としない。
【0027】
エプチフィバチドは、血小板上のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ受容体のフィブリン結合の役割を遮断するペプチド治療薬である。薬物は、典型的には、１８０μｇ／ｋｇボーラスとしてＩＶを介して投与され、続いて２μｇ／ｋｇ／分の連続注入が行われる。エプチフィバチドの血中濃度は、典型的には、約１～２μＭである。出血時間は、一般に、薬物停止から約１時間以内に正常に戻る。
【0028】
アスピリンは、不可逆的なシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。血小板中のＣＯＸ酵素は、トロンボキサンＡ２、プロスタグランジンＥ２、およびプロスタシクリン（ＰＧＩ２）の合成に関与する。アスピリンは、血小板内のＣＯＸ酵素を永久的に不活性化し、かつ血小板は、新たな酵素を合成するための核物質を有しないため、アスピリン効果を克服するためには、新たな血小板を生成しなければならない。トロンボキサンＡ２、プロスタグランジンＥ２、およびプロスタシクリン（ＰＧＩ２）なしでは、血小板は、その凝集促進活性が制限される。多くの人は、望ましくない凝血事象を防止するために、低用量のアスピリンを維持される。アスピリンのバイオアベイラビリティは、投与経路によって大きく異なり、５００μＭのピークで単回５００ｍｇ用量のＩＶ、および４４μＭで、経口で同じ用量である。
【0029】
抗血小板クラスの薬物は、心不全、脳卒中などをもたらす望ましくない凝血エピソードを防止するために広く使用されている。多くの場合では、抗血小板薬は、拮抗または停止される必要があり得る。事前に計画された手術の状況のように、事前に通知されている場合には、抗血小板薬の用量が手術の前に停止され、手術中の望ましくない出血を防止し得る場合がある。抗血小板剤が迅速に拮抗する必要がある場合には、拮抗剤は、典型的には、容易には入手できないか、高価であるか、または患者に重大なリスクをもたらす。迅速な抗血小板拮抗が必要である場合には、血小板輸血が典型的には投与されるが、これに対する応答は、多くの場合、部分的な拮抗のみである。この拮抗過程の注意点は、新たに注入された血小板自体が循環薬物抗血小板活性に対して感受性であるのに対し、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、トロンボソームを含む）はそうではないことである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、トロンボソームを含む）は、活性拮抗剤である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、トロンボソームを含む）の止血活性は、抗血小板薬に屈しない。
【0030】
いくつかの例示的な抗血小板剤および潜在的な拮抗方法を以下に記載する。
【0031】
アセチルサリチル酸（ＡＳＡ；アスピリン）－アスピリンは、血小板においてＣＯＸ－１遮断剤として機能し、これは、血小板由来のトロンボキサン形成を不可逆的に阻害することによって、血小板を不活性にする。臨床的には、アスピリンは、緊急事態における血小板輸血によって、または今後手術が予定されている治療を停止することによって拮抗する場合がある。
【0032】
クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））－クロピドグレルは、ＡＤＰが血小板上でその受容体に結合することを防止するように作用する。ＡＤＰ結合は、血小板形状の変化および凝集をもたらす。クロピドグレルは、不可逆的である。臨床的には、クロピドグレルは、緊急事態における血小板輸血によって、または今後手術が予定されている治療を停止することによって拮抗する場合がある。
【0033】
カングレロール（例えば、ＫＥＮＧＲＥＡＬ（登録商標））－カングレロールは、ＡＤＰが血小板上でその受容体に結合することを防止するように作用する。ＡＤＰ結合は、血小板形状の変化および凝集をもたらす。クロピドグレルは、可逆的であり、血小板機能は、注入を停止してから約１時間後に戻る。臨床的には、これは、一般に、拮抗が手順の後に必要とされる場合に好ましい。
【0034】
チカグレロール（例えば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））－チカグレロールは、ＡＤＰがその受容体に結合することを防止し、かつ逆アゴニストとして作用する。チカグレロールは、可逆的であり、血小板機能は、最後の投与量の約７２時間後に戻り得る。チカグレロールの作用の拮抗は、最後の用量後の時間によって影響を受け得る。最後の用量が２４時間よりも前であった場合、血小板輸血は、結果に拮抗するための治療薬であり得る場合がある。
【0035】
エフィエント（例えば、ＰＲＡＳＵＧＲＥＬ（登録商標））－エフィエントは、ＡＤＰがその受容体に結合することを防止するように作用し、かつ不可逆的アンタゴニストとして作用する。不可逆的なアンタゴニストであるため、その効果を克服するためには、新しい血小板を形成しなければならない。臨床的には、エフィエントは、緊急事態における血小板輸血によって、または今後手術が予定されている治療を停止することによって拮抗する。
【0036】
エプチフィバチド（インテグリリン）－エプチフィバチドは、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａを遮断するように作用し、かつ可逆的なアンタゴニストとして作用する。臨床的には、インテグリリンは、緊急事態における血小板輸血によって、または今後手術が予定されている治療を停止することによって拮抗する。
【0037】
血小板注入は、抗血小板薬の治療法として現在使用されているが、血小板注入は、これらの薬物の効果を弱めるためにのみ作用する。いくつかの実施形態では、トロンボソームは、これらの薬物に対して反応性ではなく、凝血を助けるそれらの能力を維持する。これにより、トロンボソームを介した治療は完全に独自のものとなり、製品に新たな用途が導入される。
【0038】
血小板由来の製品は、抗凝固薬／抗血小板薬の治療法としては現在使用されておらず、現在承認されている抗血小板剤の拮抗剤は存在しない。したがって、緊急治療（手術前、外傷など）は、典型的には、出血を回避または緩和するための包括的な予防策である。非限定的な例としては、血漿、赤血球、および抗線溶剤の注入が挙げられる。血小板誘導体（例えば、凍結保存された血小板（例えば、トロンボソーム））は、これらの一般的な治療に対する有効な代替策または補完であり得る。
【0039】
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、トロンボソームは、抗凝固剤によって抑制されるものを超えてトロンビン生成を増強するために凝固促進性負荷電表面を提供することによって、少なくとも部分的に作用し得ると考えられている。同様に、いかなる特定の理論にも拘束されることなく、トロンボソームは、循環血小板に結合し、かつそれと共凝集することによって、少なくとも部分的に作用し得ると考えられている。
【0040】
出血を制御し、治癒を改善するための製品および方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の製品および方法はまた、抗血小板剤（例えば、アスピリン（アセチルサリチル酸またはＡＳＡとも称される）、カングレロール（例えば、ＫＥＮＧＲＥＡＬ（登録商標））、チカグレロール（例えば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））、クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））、プラスグレル（例えば、ＥＦＦＩＥＮＴ（登録商標））、エプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ（登録商標））、チロフィバン（例えば、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標））、またはアブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標）））の活性に対抗するために使用され得る。本明細書に記載の製品および方法は、創傷の閉鎖および治癒を助け得る実施形態を対象とする。
【0041】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、患者の表面上または患者の内部の創傷に送達され得る。様々な実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、接着包帯、圧縮包帯、液体溶液、エアロゾル、マトリックス組成物、およびコーティングされた縫合、または他の医療的閉鎖を含むがこれらに限定されない、選択された形態で適用され得る。実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、患者の表面上の罹患領域の全部または一部のみに投与され得る。他の実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、例えば、血流を介して、全身的に投与され得る。実施形態では、血小板誘導体の適用は、２日間または３日間、好ましくは５～１０日間、または最も好ましくは最大１４日間、止血効果をもたらし得る。
【0042】
いくつかの実施形態は、対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0043】
いくつかの実施形態は、対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0044】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、凝固障害は、抗血小板剤の結果である。
【0045】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0046】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象における凝固障害を治療する方法を提供し、この方法は、その治療を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0047】
いくつかの実施形態は、対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0048】
いくつかの実施形態は、対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0049】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0050】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象における正常な止血を回復させる方法を提供し、この方法は、その回復を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0051】
本明細書に記載の組成物はまた、いくつかの場合では、対象を手術のために準備させるために投与され得る。抗血小板剤を服用している一部の患者にとって、手術の前に抗血小板剤の投与量を低減させることは困難または不可能であり得る（例えば、外傷または他の緊急手術の場合）。抗血小板剤を服用している一部の患者にとって、手術の前に抗血小板剤の投与量を低減させることは不得策である場合がある（例えば、抗血小板剤の投与量が経時的に低減された場合に、患者が血栓性事象（例えば、深部静脈血栓症、肺塞栓症、または脳卒中）のリスクに曝されるであろう場合）。
【0052】
したがって、いくつかの実施形態は、対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0053】
いくつかの実施形態は、対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0054】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0055】
いくつかの実施形態は、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている対象を手術のために準備させる方法を提供し、この方法は、その準備を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0056】
いくつかの実施形態では、手術は、緊急手術（例えば、外傷の場合）または予定された手術であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、（例えば、手術の準備において）停止され得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤による治療は、継続し得る。
【0058】
いくつかの実施形態は、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法を提供し、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0059】
いくつかの実施形態は、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法を提供し、この方法は、その改善を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0060】
いくつかの場合では、抗血小板剤の投与量が不正確であるため、抗血小板剤の効果を改善する必要があり得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗血小板剤の効果は、抗血小板剤の過剰摂取後に改善され得る。いくつかの場合では、別の薬物（例えば、第２の抗血小板剤）との相互作用の可能性のため、抗血小板剤の効果を改善する必要があり得る。例えば、いくつかの実施形態では、抗血小板剤の効果は、そのうちの少なくとも１つが抗血小板剤である、２つ以上の薬物の誤った投薬後に改善され得る。
【0061】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、抗線溶剤などの活性剤をさらに含み得る。抗線溶剤の非限定的な例としては、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、およびフィブリノゲンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体に、抗線溶剤などの活性剤が充填され得る。
【0062】
血液（例えば、対象の血液）の凝血パラメータは、本明細書に記載の方法の間の任意の適切な時点で評価され得る。例えば、血液の１つ以上の凝血パラメータは、例えば、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の必要性を決定するために、本明細書に記載の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に評価され得る。別の例として、血液の１つ以上の凝血パラメータは、例えば、投与される組成物の有効性を決定するために、組成物の追加の投与が正当であるかどうかを決定するために、または外科的処置を実施することが安全であるかどうかを決定するために、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に評価され得る。
【0063】
したがって、本明細書に記載の方法のうちのいずれかは、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に、血液の１つ以上の凝血パラメータを評価する工程、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の後に、血液の１つ以上の凝血パラメータを評価する工程、またはその両方を含み得る。
【0064】
任意の適切な方法を使用して、血液の凝血パラメータを評価し得る。方法の非限定的な例としては、プロトロンビン時間アッセイ、国際標準化比（ＩＮＲ）、トロンビン生成（ＴＧＡ；例えば、ピークトロンビン、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、およびラグタイムなどのパラメータを生成するために使用され得る）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）、活性化凝血時間（ＡＣＴ）、および部分的トロンボプラスチン時間（ＰＴＴまたはａＰＴＴ）が挙げられる。
【0065】
トロンビン生成
トロンビン生成アッセイは、蛍光ペプチドのトロンビン酵素切断および蛍光分子の放出の結果として生じる凝固促進剤を介した試料活性化後のトロンビンの産生を測定した。ピークトロンビンは、産生される最大トロンビンの尺度、ラグタイムは、トロンビン産生開始までの時間、およびＥＴＰは、潜在的に産生される総トロンビンである。
トロンビン生成アッセイは、蛍光ペプチドのトロンビン酵素切断および蛍光分子の放出の結果として生じる凝固促進剤を介した試料活性化後のトロンビンの産生を測定した。ピークトロンビンは、産生される最大トロンビンの尺度、ラグタイムは、トロンビン産生開始までの時間、およびＥＴＰは、潜在的に産生される総トロンビンである。
【0066】
いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物の投与の前に、約６０ｎＭ～約１７０ｎＭ、例えば、約６５ｎＭ～約１７０ｎＭ、例えば、約６５ｎＭ～約１２０ｎＭ、例えば、約８０ｎＭのピークトロンビンを有し得る。
【0067】
ＴＥＧは、経時的な凝血塊強度のプロットを介して内因性止血を評価する。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は、典型的には、開始試薬として使用される。ＴＥＧ波形（例えば、図１６を参照）は、凝血についての情報を提供し得る複数のパラメータを有する。
Ｒ時間＝反応時間－試験の開始から初期フィブリン形成までの待ち時間。
Ｋ＝動態－初期フィブリン形成の速度、ある特定のレベルの凝血塊強度（例えば、２０ｍｍの振幅）を達成するのにかかる時間
アルファ角＝ＲとＫとの間の線の傾き－凝血魂形成の速度を測定する。
ＭＡ＝最大振幅（ｍｍ）－フィブリン凝血塊の最終的な強度を表す。
Ａ３０＝最大振幅に到達した３０分後の振幅－溶解相の速度を表す。
Ｒ時間＝反応時間－試験の開始から初期フィブリン形成までの待ち時間。
Ｋ＝動態－初期フィブリン形成の速度、ある特定のレベルの凝血塊強度（例えば、２０ｍｍの振幅）を達成するのにかかる時間
アルファ角＝ＲとＫとの間の線の傾き－凝血魂形成の速度を測定する。
ＭＡ＝最大振幅（ｍｍ）－フィブリン凝血塊の最終的な強度を表す。
Ａ３０＝最大振幅に到達した３０分後の振幅－溶解相の速度を表す。
【0068】
凝固性低下状態の血液では、Ｒ時間は増加し、ＭＡは減少する。Ｒ時間は、典型的には、ＭＡよりも広い応答範囲を提供する。
【0069】
総血栓形成分析システム（Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）、ＦＵＪＩＭＯＲＩ ＫＯＧＹＯ ＣＯ．，ＬＴＤ）では、試料は、鉱油を使用して、コラーゲンでコーティングされたマイクロチャネルを通される。圧力の変化は、血栓形成を評価するために使用される。閉塞開始時間は、１０ｋＰａに到達するのにかかる時間であり、閉塞時間は、ＡＲチップ（例えば、Ｚａｃｒｏｓ品目番号、ＴＣ０１０１）を使用して各Δ８０ｋＰａに到達するのにかかる時間である。メーカーによれば、ＡＲチップは、主にフィブリンおよび活性化された血小板からなる混合された白色血栓の形成を分析するために使用され得る。これは、コラーゲンおよび組織因子でコーティングされた流路（幅３００μｍ×高さ５０μｍ）を有し、凝血機能および血小板機能を分析するために使用され得る。比較して、ＰＬチップは、主に活性化された血小板からなる血小板血栓の形成を分析するために使用され得る。ＰＬチップは、コラーゲンのみでコーティングされた流路を有し、血小板機能を分析するために使用され得る。
【0070】
ＡＣＴアッセイは、凝血時間（ｔＡＣＴ）を測定するための最も基本的であるが、恐らく最も確かな方法であり、その周囲に凝血塊が形成されるときの磁石の重力に対する抵抗によって決定される。典型的なドナーの血液は、ＣａＣｌ２のみを使用して、約２００～３００秒のｔＡＣＴを有する。
【0071】
いくつかの実施形態は、対象におけるトロンビン生成を増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0072】
いくつかの実施形態は、対象におけるトロンビン生成を増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0073】
いくつかの実施形態は、対象におけるピークトロンビンを増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む。
【0074】
いくつかの実施形態は、対象におけるピークトロンビンを増加させる方法を提供し、この方法は、その増加を必要とする対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物は、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている。
【0075】
いくつかの実施形態では、投与の前に、対象のピークトロンビンは、６６ｎＭ未満（例えば、６４ｎＭ、６２ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭ未満）であった。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象のピークトロンビンは、６６ｎＭ超（例えば、６８ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、または１５０ｎＭ超）である。いくつかの実施形態では、投与の後に、対象のピークトロンビンは、６６～１６６ｎＭである。ピークトロンビンは、任意の適切な方法によって測定され得る。
【0076】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、対象を治療するのに有効な、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の量を含む、組成物の量である。そのような量の血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、任意の適切な投与量の、対象に投与され得る本明細書に記載の血小板または血小板誘導体を含む組成物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ある用量の血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物は、約１．０×１０７粒子～約１．０×１０１０粒子、例えば、約１．６×１０７粒子（例えば、トロンボソーム）／ｋｇ～約１．０×１０１０粒子／ｋｇ（例えば、約１．６×１０７～約５．１×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約３．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約１．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．６×１０７粒子～約５．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約１．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．６×１０７～約５．０×１０７粒子／ｋｇ、約５．０×１０７～約１．０×１０８粒子／ｋｇ、約１．０×１０８～約５．０×１０８粒子／ｋｇ、約５．０×１０８～約１．０×１０９粒子／ｋｇ、約１．０×１０９～約５．０×１０９粒子／ｋｇ、または約５．０×１０９～約１．０×１０１０粒子／ｋｇ）を含み得る。
【0077】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、局所投与される。いくつかの実施形態では、局所投与は、溶液、クリーム、ゲル、懸濁液、パテ、粒子、または粉末を介した投与を含み得る。いくつかの実施形態では、米国特許出願第１５／７７６，２５５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に対応するＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０４０２３８号（例えば、段落［０１３］～［０６９］）に記載のように、局所投与は、包帯（例えば、接着包帯または圧縮包帯）または医療的閉鎖（例えば、縫合、ステープル）を介した投与を含み得、例えば、血小板誘導体は、その中に埋め込まれ得る。
【0078】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、非経口投与される。
【0079】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、静脈内投与される。
【0080】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、筋肉内投与される。
【0081】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、髄腔内投与される。
【0082】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、皮下投与される。
【0083】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、腹腔内投与される。
【0084】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、組成物は、投与工程の前に乾燥される。本方法のいくつかの実施形態では、組成物は、投与工程の前に凍結乾燥される。本方法のいくつかの実施形態では、組成物は、乾燥工程または凍結乾燥工程の後に再水和される。
【0085】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリン（アセチルサリチル酸またはＡＳＡとも称される）；カングレロール（例えば、ＫＥＮＧＲＥＡＬ（登録商標））、チカグレロール（例えば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））、クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））、またはプラスグレル（例えば、ＥＦＦＩＥＮＴ（登録商標））などのＰ２Ｙ１２阻害剤；エプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ（登録商標））、チロフィバン（例えば、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標））、またはアブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））などの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤；ならびにハーブサプリメントなどのサプリメント；またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。サプリメントの例としては、生姜、チョウセンニンジン、イチョウ、緑茶、キャバ、ノコギリヤシ、ボルド（Ｐｅｕｍｕｓ ｂｏｌｄｕｓ）、タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、ドンクアイ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、魚油、およびビタミンＥが挙げられる。ハーブサプリメントの例としては、生姜、チョウセンニンジン、およびイチョウが挙げられる。
【0086】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アスピリンである。
【0087】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、カングレロール（例えば、ＫＥＮＧＲＥＡＬ（登録商標））である。
【0088】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、チカグレロール（例えば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（登録商標））である。
【0089】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、クロピドグレル（例えば、ＰＬＡＶＩＸ（登録商標））である。
【0090】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、プラスグレル（例えば、ＥＦＦＩＥＮＴ（登録商標））である。
【0091】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、エプチフィバチド（例えば、ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ（登録商標））である。
【0092】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、チロフィバン（例えば、ＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標））である。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アブシキシマブ（例えば、ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））である。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、テルトロバンである。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、ピコタミドである。
【0096】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、エリノグレルである。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、チクロピジンである。
【0098】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、イブプロフェンである。
【0099】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、ボラパキサールである。
【0100】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、アトパキサールである。
【0101】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、シロスタゾールである。
【0102】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、プロスタグランジンＥ１である。
【0103】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、エポプロステノールである。
【0104】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、ジピリダモールである。
【0105】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、トレプロスチニルナトリウムである。
【0106】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、サルポグレラートである。
【0107】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、サプリメントである。
【0108】
いくつかの実施形態では、抗血小板剤は、ハーブサプリメントである。
【0109】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体を含む組成物を再水和することは、血小板に水性液体を添加することを含む。いくつかの実施形態では、水性液体は、水である。いくつかの実施形態では、水性液体は、水溶液（例えば、緩衝液）である。いくつかの実施形態では、水性液体は、生理食塩水である。いくつかの実施形態では、水性液体は、懸濁液である。
【0110】
いくつかの実施形態では、再水和された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、４０国際単位（ＩＵ）以上での凝血に関連するすべての個々の因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子）を示す凝固因子レベルを有する。
【0111】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約１０％未満、例えば、約８％未満、例えば、約６％未満、例えば、約４％未満、例えば、約２％未満、例えば、約０．５％未満の血小板膜の架橋を、膜上に存在するタンパク質および／または脂質を介して有する。いくつかの実施形態では、再水和された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約１０％未満、例えば、約８％未満、例えば、約６％未満、例えば、約４％未満、例えば、約２％未満、例えば、約０．５％未満の血小板膜の架橋を、膜上に存在するタンパク質および／または脂質を介して有する。
【0112】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、少なくとも約０．２μｍ（例えば、少なくとも約０．３μｍ、少なくとも約０．４μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約０．６μｍ、少なくとも約０．７μｍ、少なくとも約０．８μｍ、少なくとも約０．９μｍ、少なくとも約１．０μｍ、少なくとも約１．２μｍ、少なくとも約１．５μｍ、少なくとも約２．０μｍ、少なくとも約２．５μｍ、または少なくとも約５．０μｍ）の粒径（例えば、直径、最大寸法）を有する。いくつかの実施形態では、粒径は、約５．０μｍ未満（例えば、約２．５μｍ未満、約２．０μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１．０μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．８μｍ未満、約０．７μｍ未満、約０．６μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、または約０．３μｍ未満）である。いくつかの実施形態では、粒径は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）である。
【0113】
いくつかの実施形態では、少なくとも５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の最大９９％（例えば、最大約９５％、最大約８０％、最大約７５％、最大約７０％、最大約６５％、最大約６０％、最大約５５％、または最大約５０％）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の約５０％～約９９％（例えば、約５５％～約９５％、約６０％～約９０％、約６５％～約８５％、約７０％～約８０％）は、約０．３μｍ～約５．０μｍ（例えば、約０．４μｍ～約４．０μｍ、約０．５μｍ～約２．５μｍ、約０．６μｍ～約２．０μｍ、約０．７μｍ～約１．０μｍ、約０．５μｍ～約０．９μｍ、または約０．６μｍ～約０．８μｍ）の範囲にある。
【0114】
いくつかの実施形態では、血小板は、対象を治療する前に、例えば液体培地中で、単離される。
【0115】
いくつかの実施形態では、血小板は、ドナー由来の血小板である。いくつかの実施形態では、血小板は、アフェレーシス工程を含むプロセスによって得られる。いくつかの実施形態では、血小板は、プールされた血小板である。
【0116】
いくつかの実施形態では、血小板は、複数のドナーからプールされる。複数のドナーからプールされたそのような血小板は、本明細書では、プールされた血小板とも称され得る。いくつかの実施形態では、ドナーは、５人より多い、例えば、１０人より多い、例えば、２０人より多い、例えば、５０人より多い、例えば、最大約１００人のドナーである。いくつかの実施形態では、ドナーは、約５～約１００人、例えば、約１０～約５０人、例えば、約２０～約４０人、例えば、約２５～約３５人である。プールされた血小板は、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを作製するために使用され得る。
【0117】
いくつかの実施形態では、血小板は、インビトロで誘導される。いくつかの実施形態では、血小板は、培養物中で誘導されるか、または調製される。いくつかの実施形態では、血小板の調製は、巨核球の培養物から血小板を誘導または増殖することを含む。いくつかの実施形態では、血小板の調製は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および／または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、ヒト多能性幹細胞（ＰＣＳ）の培養物から血小板（または巨核球）を誘導または増殖することを含む。
【0118】
したがって、いくつかの実施形態では、血小板は、本明細書に記載の対象を治療する前に調製される。いくつかの実施形態では、血小板は、凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、血小板は、凍結保存される。
【0119】
いくつかの実施形態では、血小板またはプールされた血小板は、インキュベーション剤とのインキュベーションの前に、約６．０～約７．４のｐＨに酸性化され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を約６．５～約６．９のｐＨに酸性化することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を約６．６～約６．８のｐＨに酸性化することを含む。いくつかの実施形態では、酸性化は、プールされた血小板にクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）を含む溶液を添加することを含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、血小板は、インキュベーション剤とのインキュベーションの前に単離される。いくつかの実施形態では、本方法は、遠心分離を使用することによって血小板を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１０００×ｇ～約２０００×ｇの相対的遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１３００×ｇ～約１８００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１５００×ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）で行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１分～約６０分間行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約１０分～約３０分間行われる。いくつかの実施形態では、遠心分離は、約３０分間行われる。
【0121】
インキュベーション剤は、任意の適切な成分を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、液体培地を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、および血液もしくは血液製剤中に見出され得るか、または血小板を乾燥させるのに有用であることが既知である任意の他の塩、あるいはこれらのうちの２つ以上の任意の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含み得る。
【0122】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、および血液または血液製剤中に見出され得る任意の他の塩などの１つ以上の塩を含む。例示的な塩としては、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約０．５ｍＭ～約１００ｍＭの１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約０．５ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば、約０．５～約２ｍＭ、約２ｍＭ～約９０ｍＭ、約２ｍＭ～約６ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約６０ｍＭ～約９０ｍＭ、約７０～約８５ｍＭ）の１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、または約８０ｍＭの１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびその２つの組み合わせから選択される１つ以上の塩を、約０．５ｍＭ～約２ｍＭの濃度で含む。
【0123】
好ましくは、これらの塩は、全血中に見出されるのとほぼ同じ量で、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物中に存在する。
【0124】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、担体タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、約０．０５％～約１．０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【0125】
インキュベーション剤は、血小板に対して非毒性であり、かつ本明細書に提供されるプロセス中に溶液が曝露される温度で溶液に適切な緩衝能力を提供する、任意の緩衝液であり得る。したがって、緩衝液は、リン酸緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、重炭酸塩／炭酸、例えば、重炭酸ナトリウム緩衝液、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、およびトリス系緩衝液、例えば、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などの、市販の既知の生体適合性緩衝液のうちのいずれかを含み得る。同様に、これは、以下の緩衝液：プロパン－１，２，３－トリカルボン酸（トリカルバリル酸）；ベンゼンペンタカルボン酸；マレイン酸；２，２－ジメチルコハク酸；ＥＤＴＡ；３，３－ジメチルグルタル酸；ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノ－トリス（ヒドロキシメチル）－メタン（ＢＩＳ－ＴＲＩＳ）；ベンゼンヘキサカルボン酸（メリト酸）；Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ－二酢酸（ＡＤＡ）；ブタン－１，２，３，４－テトラカルボン酸；ピロリン酸；１，１－シクロペンタン二酢酸（３，３－テトラメチレン－グルタル酸）；ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；１，１－シクロヘキサン二酢酸；３－６－エンドメチレン－１，２，３，６－テトラヒドロフタル酸（ＥＭＴＡ；ＥＮＤＣＡ）；イミダゾール；２－（アミノエチル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＣＨＯＬＡＭＩＮＥ）；Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；２－メチルプロパン－１，２，３－トリスカルボン酸（ベータ－メチルトリカルバリル酸）；２－（Ｎ－モルホリノ）プロパン－スルホン酸（ＭＯＰＳ）；リン酸；およびＮ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、１つ以上の緩衝液、例えば、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、または重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５～約１００ｍＭの１つ以上の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、１つ以上の緩衝液の約５～約５０ｍＭ（例えば、約５ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ）を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、または約３０ｍＭの１つ以上の緩衝液を含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース、マンノース、デキストロース、およびキシロースを含む、単糖および二糖などの１つ以上の糖を含む。いくつかの実施形態では、糖は、単糖である。いくつかの実施形態では、糖は、二糖である。いくつかの実施形態では、糖は、単糖、二糖、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、糖は、非還元性二糖である。いくつかの実施形態では、糖は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース（例えば、デキストロース）、マンノース、またはキシロースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、トレハロースを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、デンプンを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、スクロースおよびエピクロロヒドリンのポリマーであるポリスクロースを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約１０ｍＭ～約１，０００ｍＭの１つ以上の糖を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、約５０～約５００ｍＭの１つ以上の糖を含む。実施形態では、１つ以上の糖は、１０ｍＭ～５００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の糖は、５０ｍＭ～２００ｍＭの量で存在する。実施形態では、１つ以上の糖は、１００ｍＭ～１５０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、１つ以上の糖は、凍結乾燥剤であり、例えば、いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、トレハロース、ポリスクロース、またはそれらの組み合わせを含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物は、水または生理食塩水のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板などの血小板または血小板誘導体を含む組成物は、ＤＭＳＯを含み得る。
【0128】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、アルコール（例えば、エタノール）などの有機溶媒を含む。そのようなインキュベーション剤において、溶媒の量は、０．１％～５．０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５．０％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．３％（ｖ／ｖ）～約３．０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、好適な有機溶媒としては、アルコール、エステル、ケトン、エーテル、ハロゲン化溶媒、炭化水素、ニトリル、グリコール、硝酸アルキル、水、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、好適な有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、テトラヒドロフラン、イソプロピルエーテル（ＩＰＥ）、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、ジオキサン（例えば、１，４－ジオキサン）、アセトニトリル、プロピオニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、アニソール、シクロヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、エチレングリコール、ニトロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルアミド、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノール、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノール、ＤＭＳＯ、またはそれらの組み合わせを含む。エタノールなどの有機溶媒の存在は、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソーム（例えば、凍結乾燥された血小板誘導体）の処理において有益であり得る。
【0130】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、水性培地の存在下で血小板にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、インキュベーション剤は、ＤＭＳＯを含む培地の存在下でインキュベートされる。
【0131】
いくつかの実施形態では、１つ以上の他の成分は、血小板内でインキュベートされ得る。例示的な成分は、インキュベーションプロセス中の血小板凝集および活性化を防止するために、プロスタグランジンＥ１もしくはプロスタシクリン、および／またはＥＤＴＡ／ＥＧＴＡを含み得る。
【0132】
使用され得るインキュベーション剤組成物の非限定的な例を表１～５に示す。
【0133】
【表1】
【0134】
【表2】
【0135】
【表3】
【0136】
【表4】
【0137】
表４は、別の例示的なインキュベーション剤である。ｐＨは、ＮａＯＨで７．４に調節され得る。アルブミンは、緩衝液Ｂの任意選択的な成分である。
【0138】
【表5】
【0139】
表５は、別の例示的なインキュベーション剤である。
【0140】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、１５～４５℃の異なる温度、または約３７℃で、異なる持続時間、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0141】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、１０，０００血小板／μＬ～１０，０００，０００血小板／μＬ、例えば、５０，０００血小板／μＬ～２，０００，０００血小板／μＬ、例えば、１００，０００血小板／μＬ～５００，０００血小板／μＬ、例えば、１５０，０００血小板／μＬ～３００，０００血小板／μＬ、例えば、２００，０００血小板／μＬの濃度で液体培地を含むインキュベーション剤において懸濁液を形成する。
【0142】
血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、例えば、少なくとも約５分間（例えば、少なくとも約２０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、または少なくとも約４８時間）などの異なる持続時間、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板は、約４８時間以内（例えば、約２０分間以内、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、または約４２時間以内）、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板は、約１０分間～約４８時間（例えば、約２０分間～約３６時間、約３０分間～約２４時間、約１時間～約２０時間、約２時間～約１６時間、約１０分間～約２４時間、約２０分間～約１２時間、約３０分間～約１０時間、または約１時間～約６時間）、インキュベーション剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームは、５分間～４８時間、例えば、１０分間～２４時間、例えば、２０分間～１２時間、例えば、３０分間～６時間、例えば、１時間～３時間、例えば、約２時間という期間、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0143】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）は、異なる温度で、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４℃～４５℃、例えば、１５℃～４２℃で実施される。例えば、実施形態では、インキュベーションは、３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で、１１０～１３０（例えば、１２０）分間、および２４～４８時間もの長さにわたって実施される。いくつかの実施形態では、血小板は、本明細書に開示されるような異なる持続時間、かつ１５～４５℃、または約３７℃の温度で、インキュベーション剤とともにインキュベートされる。
【0144】
いくつかの実施形態では、血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）に、１つ以上の活性剤が充填される。いくつかの実施形態では、血小板に、抗線溶剤が充填され得る。抗線溶剤の非限定的な例としては、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、およびフィブリノゲンが挙げられる。
【0145】
血小板（例えば、アフェレーシス血小板、全血から単離された血小板、プールされた血小板、またはそれらの組み合わせ）に活性剤（例えば、抗線溶剤）を充填することは、任意の適切な方法によって実施され得る。例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０２０／１１３０９０（Ａ１）号、同第ＷＯ２０２０／１１３１０１（Ａ１）号、同第ＷＯ２０２０／１１３０３５（Ａ１）号、および同第ＷＯ２０２０／１１２９６３（Ａ１）号を参照されたい。一般に、充填は、血小板を抗線溶剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、充填は、活性剤をインキュベーション剤と組み合わせることによって実施され得る。いくつかの実施形態では、充填は、インキュベーション工程とは別個の工程で実施され得る。いくつかの実施形態では、充填は、インキュベーション工程の前工程で実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、活性剤は、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれかにおいて溶液または懸濁液として血小板に供給され得、これは、インキュベーション工程に使用されるインキュベーション剤と同一であり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態では、充填工程は、インキュベーション工程中に実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、活性剤は、（例えば、インキュベーション中に、固体として、または溶液もしくは懸濁液において）インキュベーション剤に添加され得る。いくつかの実施形態では、充填工程は、インキュベーション工程の後の工程において実施され得る。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載のインキュベーション剤のうちのいずれかにおいて溶液または懸濁液として血小板に供給され得、これは、インキュベーション工程に使用されるインキュベーション剤と同一であり得るか、または異なり得る。
【0146】
活性剤は、任意の適切な濃度で血小板に適用され得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、約１μＭ～約１００ｍＭ（例えば、約１μＭ～約１０μｍ、約１μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約１００μＭ、約１μＭ～約５００μＭ、約１μＭ～約１ｍＭ、約１μＭ～約１０ｍＭ、約１μＭ～約２５ｍＭ、約１μＭ～約５０ｍＭ、約１μＭ～約７５ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約５０μＭ～約１００ｍＭ、約１００μＭ～約１００ｍＭ、約５００μＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０μＭ～約１００ｍＭ、約２００μＭ～約１ｍＭ、約８００μＭ～約９００μＭ、約４００μＭ～約８００μＭ、約５００μＭ～約７００μＭ、約６００μＭ、約５ｍＭ～約８５ｍＭ、約２０ｍＭ～約９０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、約３０ｍＭ～約９０ｍＭ、約３５ｍＭ～約６５ｍＭ、約４０ｍＭ～約６０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約４０ｍＭ～約７０ｍＭ、約４５ｍＭ～約５５ｍＭ、または約５０ｍＭ）の濃度で（インキュベーション剤または別の溶液もしくは懸濁液の一部として）血小板に適用され得る。
【0147】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板を乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、血小板を凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）することを含む。いくつかの実施形態では、乾燥工程は、血小板を凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程から得られた血小板を再水和することをさらに含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、血小板は、療法または機能アッセイに使用する前に、（例えば、トロンボソームを生成するために）低温貯蔵されるか、凍結保存されるか、または凍結乾燥される。
【0149】
５％未満の最終残留水分含有量を達成し得る限り、血小板を乾燥させるための任意の既知の技術が、本開示に従って使用され得る。好ましくは、本技術は、２％未満、例えば、１％、０．５％、または０．１％の最終残留水分含有量を達成する。好適な技術の非限定的な例は、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））および噴霧乾燥である。好適な凍結乾燥法を、表Ａに提示する。追加の例示的な凍結乾燥法は、米国特許第７，８１１，５５８号、米国特許第８，４８６，６１７号、および米国特許第８，０９７，４０３号に見出され得る。例示的な噴霧乾燥法は、窒素を乾燥ガスとして、本開示によるインキュベーション剤と組み合わせること、次いで、二流体ノズル構成を有するＧＥＡ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ，ＵＳＡ）製のＧＥＡ Ｍｏｂｉｌｅ Ｍｉｎｏｒ噴霧乾燥機に混合物を導入すること、混合物を１５０℃～１９０℃の範囲の入口温度、６５℃～１００℃の範囲の出口温度、０．５～２．０バールの範囲の原子速度、５～１３ｋｇ／時の範囲の原子速度、６０～１００ｋｇ／時の範囲の窒素使用、および１０～３５分間の実行時間で噴霧することを含む。噴霧乾燥における最終工程は、乾燥混合物を優先的に収集することである。いくつかの実施形態における乾燥組成物は、－２０℃以下～９０℃以上の範囲である温度で、少なくとも６か月間安定である。
【0150】
（表Ａ）例示的な凍結乾燥プロトコル
【0151】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように得られる血小板を乾燥させる工程、例えば、本明細書に開示されるように得られる血小板を凍結乾燥させる工程は、血小板を凍結乾燥剤（例えば、非還元性二糖）とともにインキュベートすることを含む。したがって、いくつかの実施形態では、血小板を調製するための方法は、血小板を凍結乾燥剤とともにインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、糖である。いくつかの実施形態では、糖は、非還元性二糖などの二糖である。
【0152】
いくつかの実施形態では、血小板は、血小板を凍結乾燥剤とともにインキュベートするのに十分な時間、かつ好適な温度で、凍結乾燥剤とともにインキュベートされる。好適な凍結乾燥剤の非限定的な例は、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース（例えば、デキストロース）、マンノース、およびキシロースを含む、単糖および二糖などの糖である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤の非限定的な例としては、血清アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デンプン、およびヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例示的な凍結乾燥剤としては、高分子量ポリマーが挙げられ得る。「高分子量」とは、約７０ｋＤａ以上かつ最大１，０００，０００ｋＤａの平均分子量を有するポリマーを意味する。非限定的な例は、スクロースおよびエピクロロヒドリンのポリマー（例えば、ポリスクロース）である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、ポリスクロースである。任意の量の高分子量ポリマーが凍結乾燥剤として使用され得るが、約３％～１０％（ｗ／ｖ）、例えば、３～７％、例えば、６％の最終濃度を達成する量が使用されることが好ましい。
【0153】
本明細書に開示される組成物に使用するための例示的な糖は、トレハロースである。糖の同一性にかかわらず、糖は、任意の好適な量で組成物中に存在し得る。例えば、糖は、１ｍＭ～１Ｍの量で存在し得る。実施形態では、糖は、１０ｍＭ～５００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、糖は、２０ｍＭ～２００ｍＭの量で存在する。実施形態では、糖は、４０ｍＭ～１００ｍＭの量で存在する。様々な実施形態では、糖は、上に列挙された範囲内の異なる特定の濃度で存在し、当業者は、本明細書で各々を具体的に列挙する必要なしに、様々な濃度を即座に理解することができる。複数の糖が組成物中に存在する場合、各糖は、上に列挙された範囲および特定の濃度に応じた量で存在し得る。
【0154】
本明細書に提供される組成物を作製するための本明細書に提供されるプロセス内で、凍結乾燥剤の添加は、乾燥の前の最後の工程であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、または他の成分などの組成物の他の成分と同時に、またはその前に添加される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥剤は、インキュベーション剤に添加され、完全に混合されて乾燥溶液を形成し、乾燥容器（例えば、ガラスまたはプラスチックの血清バイアル、凍結乾燥バッグ）中に分配され、溶液を乾燥させて乾燥組成物を形成することを可能にする条件に供される。
【0155】
血小板を凍結保護剤とともにインキュベートする工程は、温度と併せて、凍結保護剤が血小板に接触するのに十分な、好ましくは、少なくともある程度まで血小板に組み込まれるのに十分な時間と同程度の長さである、充填に好適な時間、血小板をインキュベートすることを含み得る。実施形態では、インキュベーションは、約１分間～約１８０分間以上行われる。
【0156】
血小板を凍結保護剤とともにインキュベートする工程は、割り当てられた時間の量と併せて選択される場合、インキュベートに好適な温度で、血小板および凍結保護剤をインキュベートすることを含み得る。一般に、組成物は、凍結を上回る温度で、凍結保護剤が血小板に接触するのに少なくとも十分な時間、インキュベートされる。実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、２０℃～４２℃で実施される。例えば、実施形態では、インキュベーションは、１１０～１３０（例えば、１２０）分間、３５℃～４０℃（例えば、３７℃）で実施される。
【0157】
様々な実施形態では、凍結乾燥バッグは、ガスが、処理中にバッグの少なくとも一部または全部を通過することを可能にするように構成された、ガス透過性バッグである。ガス透過性バッグは、バッグの内部内のガスを、周囲環境に存在する大気ガスと交換することを可能にし得る。ガス透過性バッグは、酸素、窒素、水、空気、水素、および二酸化炭素などのガスに対して透過性であり得、本明細書に提供される組成物においてガス交換が生じることを可能にする。いくつかの実施形態では、ガス透過性バッグは、二酸化炭素がバッグの壁を通って透過することを可能にすることによって、バッグの内部内に存在する二酸化炭素の一部の除去を可能にする。いくつかの実施形態では、バッグからの二酸化炭素の放出は、バッグ内に収容される組成物の所望のｐＨレベルを維持するのに有利であり得る。
【0158】
いくつかの実施形態では、本明細書におけるプロセスの容器は、閉鎖または密封されたガス透過性容器である。いくつかの実施形態では、容器は、閉鎖または密封され、かつその一部がガス透過性である、容器である。いくつかの実施形態では、容器に収容される製品の体積に対する、閉鎖または密封された容器（例えば、バッグ）のガス透過性部分の表面積（以下、「ＳＡ／Ｖ比」と称される）は、本明細書に提供される組成物のｐＨ維持を改善するように調整され得る。例えば、いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、少なくとも約２．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、少なくとも約２．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約２．９ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．０ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約３．９ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．０ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．１ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．２ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．３ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．４ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．５ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．６ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．７ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．８ｃｍ２／ｍＬ、少なくとも約４．９ｃｍ２／ｍＬ、または少なくとも約５．０ｃｍ２／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、最大約１０．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、最大約９．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約９．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約８．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約７．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約６．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．１ｃｍ２／ｍＬ、最大約５．０ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．９ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．８ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．７ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．６ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．５ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．４ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．３ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．２ｃｍ２／ｍＬ、最大約４．１ｃｍ２／ｍＬ、または最大約４．０ｃｍ２／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、容器のＳＡ／Ｖ比は、約２．０～約１０．０ｃｍ２／ｍＬ（例えば、約２．１ｃｍ２／ｍＬ～約９．９ｃｍ２／ｍＬ、約２．２ｃｍ２／ｍＬ～約９．８ｃｍ２／ｍＬ、約２．３ｃｍ２／ｍＬ～約９．７ｃｍ２／ｍＬ、約２．４ｃｍ２／ｍＬ～約９．６ｃｍ２／ｍＬ、約２．５ｃｍ２／ｍＬ～約９．５ｃｍ２／ｍＬ、約２．６ｃｍ２／ｍＬ～約９．４ｃｍ２／ｍＬ、約２．７ｃｍ２／ｍＬ～約９．３ｃｍ２／ｍＬ、約２．８ｃｍ２／ｍＬ～約９．２ｃｍ２／ｍＬ、約２．９ｃｍ２／ｍＬ～約９．１ｃｍ２／ｍＬ、約３．０ｃｍ２／ｍＬ～約９．０ｃｍ２／ｍＬ、約３．１ｃｍ２／ｍＬ～約８．９ｃｍ２／ｍＬ、約３．２ｃｍ２／ｍＬ～約８．８ｃｍ２／ｍＬ、約３．３ｃｍ２／ｍＬ～約８．７ｃｍ２／ｍＬ、約３．４ｃｍ２／ｍＬ～約８．６ｃｍ２／ｍＬ、約３．５ｃｍ２／ｍＬ～約８．５ｃｍ２／ｍＬ、約３．６ｃｍ２／ｍＬ～約８．４ｃｍ２／ｍＬ、約３．７ｃｍ２／ｍＬ～約８．３ｃｍ２／ｍＬ、約３．８ｃｍ２／ｍＬ～約８．２ｃｍ２／ｍＬ、約３．９ｃｍ２／ｍＬ～約８．１ｃｍ２／ｍＬ、約４．０ｃｍ２／ｍＬ～約８．０ｃｍ２／ｍＬ、約４．１ｃｍ２／ｍＬ～約７．９ｃｍ２／ｍＬ、約４．２ｃｍ２／ｍＬ～約７．８ｃｍ２／ｍＬ、約４．３ｃｍ２／ｍＬ～約７．７ｃｍ２／ｍＬ、約４．４ｃｍ２／ｍＬ～約７．６ｃｍ２／ｍＬ、約４．５ｃｍ２／ｍＬ～約７．５ｃｍ２／ｍＬ、約４．６ｃｍ２／ｍＬ～約７．４ｃｍ２／ｍＬ、約４．７ｃｍ２／ｍＬ～約７．３ｃｍ２／ｍＬ、約４．８ｃｍ２／ｍＬ～約７．２ｃｍ２／ｍＬ、約４．９ｃｍ２／ｍＬ～約７．１ｃｍ２／ｍＬ、約５．０ｃｍ２／ｍＬ～約６．９ｃｍ２／ｍＬ、約５．１ｃｍ２／ｍＬ～約６．８ｃｍ２／ｍＬ、約５．２ｃｍ２／ｍＬ～約６．７ｃｍ２／ｍＬ、約５．３ｃｍ２／ｍＬ～約６．６ｃｍ２／ｍＬ、約５．４ｃｍ２／ｍＬ～約６．５ｃｍ２／ｍＬ、約５．５ｃｍ２／ｍＬ～約６．４ｃｍ２／ｍＬ、約５．６ｃｍ２／ｍＬ～約６．３ｃｍ２／ｍＬ、約５．７ｃｍ２／ｍＬ～約６．２ｃｍ２／ｍＬ、または約５．８ｃｍ２／ｍＬ～約６．１ｃｍ２／ｍＬの範囲であり得る。
【0159】
ガス透過性の閉鎖された容器（例えば、バッグ）またはその一部は、１つ以上の様々なガス透過性材料で作製され得る。いくつかの実施形態では、ガス透過性バッグは、フルオロポリマー（ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）ポリマーなど）、ポリオレフィン（低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）など）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、シリコーン、およびそれらの任意の組み合わせを含む、１つ以上のポリマーから作製され得る。
【0160】
いくつかの実施形態では、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、熱処理を受け得る。加熱は、約２５℃超（例えば、約４０℃超、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃以上）の温度で実施され得る。いくつかの実施形態では、加熱は、約７０℃～約８５℃（例えば、約７５℃～約８５℃、または約７５℃もしくは８０℃）で実行される。加熱の温度は、加熱が実施される時間の長さと併せて選択され得る。任意の好適な時間が使用され得るが、典型的には、凍結乾燥された血小板は、少なくとも１時間、ただし３６時間以下、加熱される。したがって、実施形態では、加熱は、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間実施される。例えば、凍結乾燥された血小板は、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、または３０時間加熱され得る。非限定的な例示的な組み合わせとしては、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を３０℃超の温度で少なくとも３０分間加熱すること、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を５０℃超の温度で少なくとも１０時間加熱すること、乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を７５℃超の温度で少なくとも１８時間加熱すること、および乾燥された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を８０℃で２４時間加熱することが挙げられる。いくつかの実施形態では、加熱は、キャップ付きバイアルなどの密封された容器内で実施され得る。いくつかの実施形態では、密封された容器は、加熱の前に真空に供される。特にアルブミンまたはポリスクロースなどの凍結保護剤の存在下での熱処理工程は、凍結乾燥された血小板の安定性および貯蔵寿命を改善させることが見出されている。実際に、熱処理工程なしの凍結乾燥保護剤と比較して、血清アルブミンまたはポリスクロースと、凍結乾燥後の熱処理工程との特定の組み合わせで、有利な結果が得られている。凍結保護剤（例えば、スクロース）は、任意の適切な量（例えば、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）の質量または体積で約３％～約１０％）で存在し得る。
【0161】
いくつかの実施形態では、インキュベーション剤とのインキュベーションを含むプロセスによって本明細書に開示されるように調製された血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）は、インキュベーションの前に血小板の貯蔵安定性と少なくともほぼ等しい貯蔵安定性を有する。
【0162】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体を投与する前に、血小板または血小板誘導体を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結保存することをさらに含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程の後に組成物を加熱することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程または加熱工程の後に組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0164】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結乾燥させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程の後に組成物を加熱することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、凍結乾燥工程または加熱工程の後に組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0165】
いくつかの実施形態では、本方法は、血小板、血小板誘導体、またはトロンボソームを投与する前に、血小板、血小板誘導体またはトロンボソームを（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）低温貯蔵することをさらに含む。
【0166】
貯蔵条件は、例えば、標準的な室温貯蔵（例えば、約２０～約３０℃の範囲の温度での貯蔵）または低温貯蔵（例えば、約１～約１０℃の範囲の温度での貯蔵）を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）凍結保存すること、凍結乾燥させること、解凍すること、再水和すること、およびそれらの組み合わせをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）を投与する前に、血小板または血小板誘導体を含む組成物を（例えば、インキュベーション剤、例えば、本明細書に記載のインキュベーション剤で）（例えば、トロンボソームを形成するために）乾燥させる（例えば、凍結乾燥させる）ことをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、乾燥工程から得られた組成物を再水和することをさらに含み得る。
【0167】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む組成物が本明細書に提供され、この組成物は、新鮮な血小板を得るプロセス、任意選択的に血小板をＤＭＳＯ中でインキュベートするプロセス、遠心分離によって血小板を単離するプロセス、血小板をトレハロースおよびエタノールを含むインキュベーション剤中に再懸濁させ、それによって第１の混合物を形成するプロセス、第１の混合物をインキュベートするプロセス、ポリスクロースを第１の混合物と混合し、それによって第２の混合物を形成するプロセス、ならびに第２の混合物を凍結乾燥させて、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む凍結乾燥された組成物を形成するプロセスによって作製されている。
【0168】
いくつかの実施形態では、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む、凍結乾燥された血小板組成物を作製する方法が本明細書に提供され、この方法は、新鮮な血小板を得ることと、任意選択的に血小板をＤＭＳＯ中でインキュベートすることと、遠心分離によって血小板を単離することと、血小板をトレハロースおよびエタノールを含むインキュベーション剤中に再懸濁させ、それによって第１の混合物を形成することと、第１の混合物をインキュベートすることと、ポリスクロースを第１の混合物と混合することと、それによって第２の混合物を形成することと、第２の混合物を凍結乾燥させて、血小板または血小板誘導体（例えば、トロンボソーム）、ポリスクロース、およびトレハロースを含む凍結乾燥された組成物を形成することと、を含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板を作製するためのプロセスが本明細書に提供され、このプロセスは、単離された血小板を、少なくとも１つの糖の存在下で、以下の条件：２０℃～４２℃の温度下で、約１０分間～約１８０分間インキュベートすることと、血小板に少なくとも１つの凍結保護剤を添加することと、血小板を凍結乾燥させることと、を含み、このプロセスは、任意選択的に、インキュベーション工程と添加工程との間に血小板を単離することを含まず、任意選択的に、このプロセスは、血小板を血小板活性化阻害剤に曝露することを含まない。凍結保護剤は、多糖（例えば、ポリスクロース）であり得る。このプロセスは、凍結乾燥された血小板を、７０℃～８０℃の温度で８～２４時間加熱することをさらに含み得る。血小板に少なくとも１つの凍結保護剤を添加する工程は、血小板をエタノールに曝露することをさらに含み得る。少なくとも１つの糖の存在下で単離された血小板をインキュベートする工程は、少なくとも１つの糖の存在下でインキュベートすることを含み得る。少なくとも１つの糖の存在下で単離された血小板をインキュベートする工程は、少なくとも１つの糖の存在下でインキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１００分間～約１５０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１１０分間～約１３０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、約１２０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、３５℃～４０℃インキュベートすることを含み得る。インキュベートのための条件は、３７℃でインキュベートすることを含み得る。インキュベートのための条件は、３５℃～４０℃で１１０分間～１３０分間インキュベートすることを含み得る。インキュベートするための条件は、３７℃で１２０分間インキュベートすることを含み得る。少なくとも１つの糖は、トレハロース、スクロース、またはトレハロースとスクロースの両方であり得る。少なくとも１つの糖は、トレハロースであり得る。少なくとも１つの糖は、スクロースであり得る。
【0170】
いくつかの実施形態では、凍結乾燥された血小板を調製する方法が本明細書に提供され、この方法は、血小板を提供することと、約１００ｍＭのトレハロースおよび約１％（ｖ／ｖ）のエタノールを含む塩緩衝液中に血小板を懸濁させて、第１の組成物を作製することと、第１の組成物を約３７℃で約２時間インキュベートすることと、ポリスクロース（例えば、ポリスクロース４００）を約６％（ｗ／ｖ）の最終濃縮物に添加して、第２の組成物を作製することと、第２の組成物を凍結乾燥させて、凍結乾燥された血小板を作製することと、凍結乾燥された血小板を８０℃で２４時間加熱することと、を含む。
【0171】
本明細書に開示される特定の実施形態は、「～からなる」または「～から本質的になる」という言語を使用して、特許請求の範囲にさらに限定され得る。
【0172】
例示的な実施形態
実施形態１は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む、方法である。
実施形態１は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む、方法である。
【0173】
実施形態２は、対象における凝固障害を治療する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている、方法である。
【0174】
実施形態３は、対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む、方法である。
【0175】
実施形態４は、対象における正常な止血を回復させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている、方法である。
【0176】
実施形態５は、手術のために対象を準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む、方法である。
【0177】
実施形態６は、手術のために対象を準備させる方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている、方法である。
【0178】
実施形態７は、手術が、緊急手術である、実施形態５または６に記載の方法である。
【0179】
実施形態８は、手術が、予定された手術である、実施形態５または６に記載の方法である。
【0180】
実施形態９は、対象が、抗血小板剤によって治療されていたか、または治療されている、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法である。
【0181】
実施形態１０は、抗血小板剤による治療が、停止される、実施形態９に記載の方法である。
【0182】
実施形態１１は、抗血小板剤による治療が、継続される、実施形態９に記載の方法である。
【0183】
実施形態１２は、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板または血小板誘導体と、１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤と、を含む、方法である。
【0184】
実施形態１３は、対象における抗血小板剤の効果を改善する方法であって、その必要がある対象に有効量の組成物を投与することを含み、この組成物が、血小板を１つ以上の塩、緩衝液、任意選択的に凍結保護剤、および任意選択的に有機溶媒を含むインキュベーション剤とともにインキュベートして、組成物を形成することを含むプロセスによって調製されている、方法である。
【0185】
実施形態１４は、抗血小板剤の効果が、抗血小板剤の過剰摂取の結果である、実施形態１２または実施形態１３に記載の方法である。
【0186】
実施形態１５は、組成物が、抗線溶剤をさらに含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法である。
【0187】
実施形態１６は、抗線溶剤が、ε－アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）、トラネキサム酸、アプロチニン、アミノメチル安息香酸、フィブリノゲン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１５に記載の方法である。
【0188】
実施形態１７は、血小板または血小板誘導体に、抗線溶剤が充填される、実施形態１５または実施形態１６に記載の方法である。
【0189】
実施形態１８は、抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、サプリメント、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の方法である。
【0190】
実施形態１９は、抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の方法である。
【0191】
実施形態２０は、抗血小板剤が、アスピリン、カングレロール、チカグレロール、クロピドグレル、プラスグレル、エプチフィバチド、チロフィバン、アブシキシマブ、テルトロバン、ピコタミド、エリノグレル、チクロピジン、イブプロフェン、ボラパキサール、アトパキサール、シロスタゾール、プロスタグランジンＥ１、エポプロステノール、ジピリダモール、トレプロスチニルナトリウム、サルポグレラート、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の方法である。
【0192】
実施形態２１は、投与が、局所投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0193】
実施形態２２は、投与が、非経口投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0194】
実施形態２３は、投与が、静脈内投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0195】
実施形態２４は、投与が、筋肉内投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0196】
実施形態２５は、投与が、髄腔内投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0197】
実施形態２６は、投与が、皮下投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0198】
実施形態２７は、投与が、腹腔内投与を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0199】
実施形態２８は、組成物が、投与工程の前に乾燥される、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法である。
【0200】
実施形態２９は、組成物が、乾燥工程の後に再水和される、実施形態２８に記載の方法である。
【0201】
実施形態３０は、組成物が、投与工程の前に凍結乾燥される、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法である。
【0202】
実施形態３１は、組成物が、凍結乾燥工程の後に再水和される、実施形態３０に記載の方法である。
【0203】
実施形態３２は、インキュベーション剤が、リン酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の塩を含む、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法である。
【0204】
実施形態３３は、インキュベーション剤が、担体タンパク質を含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法である。
【0205】
実施形態３４は、緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の方法である。
【0206】
実施形態３５は、組成物が、１種以上の糖を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法である。
【0207】
実施形態３６は、１種以上の糖が、トレハロースを含む、実施形態３５に記載の方法である。
【0208】
実施形態３７は、１種以上の糖が、ポリスクロースを含む、実施形態３５または実施形態３６に記載の方法である。
【0209】
実施形態３８は、１種以上の糖が、デキストロースを含む、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の方法である。
【0210】
実施形態３９は、組成物が、有機溶媒を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法である。
【0211】
実施形態４０は、血小板または血小板誘導体が、トロンボソームを含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法である。
【実施例】
【0212】
以下の結果は、抗血小板薬を服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソーム製品の影響を実証する。トロンボソームおよび他の凍結乾燥された血小板製品は、外傷または止血不全の診断の後に患者の血流に注入されるように設計されている。これらの薬物は、いくつかを挙げると、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸、フィブリノゲン、およびフォン・ウィルブランド因子結合に対する血小板応答を阻害する複数の形態の血小板阻害機序を利用する。これらには、アスピリン、クロピドグレル、チカグレロール、エフィエント、カングレロール、およびエプチフィバチドのような薬物が含まれる。
【0213】
実施例１－Ｐ２Ｙ１２阻害剤
カングレロールは、クロピドグレル、チカグレロール、およびプラスグレルと同様に、血小板上のＰ２Ｙ１２（ＡＤＰ）受容体を遮断する。カングレロールを、このクラスの薬物の代表として本実施例で使用する。
カングレロールは、クロピドグレル、チカグレロール、およびプラスグレルと同様に、血小板上のＰ２Ｙ１２（ＡＤＰ）受容体を遮断する。カングレロールを、このクラスの薬物の代表として本実施例で使用する。
【0214】
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。光透過凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）実験を、実施例４に従って行った。
【0215】
多血小板血漿（ＰＲＰ；全血としてヒトから採取し、白血球（ＷＢＣ）または赤血球（ｒｂｃ）を含まない血漿中の血小板を単離するように処理した）中の血小板の凝集に対するカングレロールの効果を、透過光凝集測定によって評価した。アゴニスト誘発性活性化に応答する血小板（多血小板血漿）の凝集は、０．５μＭ～３．５μＭの治療濃度でのカングレロールによる、１０μＭのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）誘発性凝集の完全な阻害を示した（図１）。調査したすべての用量のカングレロールは、ＰＲＰにおいてＡＤＰ誘発性血小板凝集を完全に排除した。
【0216】
剪断下での血小板閉塞に対するカングレロールの効果を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）によって評価した。１０μＭのＡＤＰによってインビトロで刺激された新鮮な多血小板血漿（血小板濃度２７８，０００／μＬ；ＰＲＰは、概して、約２００，０００／μＬ～約３００，０００／μＬの血小板濃度を有する）は、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術を使用してＡＲチップ（コラーゲンおよび組織トロンボプラスチン）によって決定されるように、高剪断下で非刺激血小板（ＰＲＰ）よりも早く閉塞された（図２）。カングレロール単独（１μＭ）は、閉塞に対する阻害を示さなかったが、ＡＤＰ（１０μＭ）と組み合わせた場合、血小板の接着および閉塞を本質的に排除した。これらの結果を、図３および４にさらに例示する。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、このパターンが観察されるのは、血小板が、ＡＤＰに応答し、かつＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１２の遮断がコラーゲン結合を阻害する形状変化および凝集を引き起こすカングレロールによって遮断されない他のＡＤＰ受容体を有し、したがって、血小板が、ＡＤＰ刺激に起因して互いに結合し得るが、コーティングされたチップ上のコラーゲン結合を防止し得るからであると考えられている。
【0217】
図３では、曲線下面積（ＡＵＣ）値（図２のデータに由来；複製は平均化され、１回プロットされる）は、血栓が時間的にどのくらい早く発生し、血栓が発生する場合、それがどのくらい実質的なものであるかの組み合わせた値を示す。ＰＲＰ ＡＵＣは、ＡＤＰ刺激によって増加した。カングレロールは、ＡＵＣ値に対してほとんど効果を有しなかったが、ＡＤＰ刺激と組み合わせた場合、ＡＵＣは、ほぼゼロにまで低下した。
【0218】
図４では、薬物処理を伴うＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップの閉塞までの時間を評価した。ＰＲＰは、約２０分でチップチャネルを閉塞し、その時間、ＡＤＰによる血小板の刺激は低下した。カングレロールは、閉塞時間に対してほとんど効果を有しなかったが、ＰＲＰ試料へのＡＤＰ刺激の添加により、本質的に完全に閉塞を阻害した。
【0219】
血小板の阻害であることが示されている濃度でのＡＤＰ刺激を有するカングレロールの存在下では、トロンボソーム（図５～７の「ｔｈｒｏｍｂ」）は阻害されず、治療レベルでのカングレロールの存在下であっても、トロンボソームが凝血形成を助け得ることを示す。
【0220】
剪断下でのトロンボソームに対するカングレロールの効果を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）によって評価した。図５は、トロンボソームが（示されるように、６０、９０、または１１５分間の再水和後に）、ＡＤＰ（１０ｕＭ）が存在する状態で、カングレロール（１ｕＭ）の非存在下または存在下で、止血機能を保持することを示す。血小板とは異なり、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップのトロンボソームの閉塞は、カングレロール＋ＡＤＰの抗血小板効果によって影響を受けない。これは、カングレロールおよび同様の薬剤を投与されている患者に注入した場合、トロンボソームが期待される機能を維持するであろうことを示唆する。これらの結果を、図６および７にさらに例示する。
【0221】
図６では、ＡＵＣ値（図５のデータに由来）は、血栓形成を示す。血漿中のＴ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップのトロンボソームの接着および閉塞に対するカングレロールおよびＡＤＰの効果はなく、トロンボソームは、カングレロールおよびＡＤＰにかかわらず、血栓形成を引き起こした。同じ用量のカングレロールおよびＡＤＰは、新たに採取された血小板を完全に阻害した。
【0222】
図７では、薬物処理を伴うＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップに対するトロンボソームの閉塞までの時間（図５のデータに由来）を評価した。血漿中のＴ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップを使用したトロンボソームの閉塞までの時間に対するカングレロール＋ＡＤＰからの効果はなかった。同じ用量のカングレロールおよびＡＤＰは、新たに採取された血小板を完全に阻害した。
【0223】
実施例２．ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ阻害剤。
以下の結果は、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ阻害剤を服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソームの影響を実証する。一般的な抗血小板薬であるエプチフィバチドは、フィブリノゲンおよびフォン・ウィルブランド因子と相互作用する血小板上のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ受容体を競合的に阻害する。
以下の結果は、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ阻害剤を服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソームの影響を実証する。一般的な抗血小板薬であるエプチフィバチドは、フィブリノゲンおよびフォン・ウィルブランド因子と相互作用する血小板上のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ受容体を競合的に阻害する。
【0224】
エプチフィバチドは、血小板上のＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ受容体のフィブリン結合の役割を遮断するペプチド治療薬である。薬物を、典型的には、１８０μｇ／ｋｇボーラスとしてＩＶを介して投与し、続いて２μｇ／ｋｇ／分の連続注入を行う。エプチフィバチドの血中濃度は、典型的には、約１～２μＭである。出血時間は、一般に、薬物停止から約１時間以内に正常に戻る。
【0225】
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。
光透過凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）実験を、実施例４に従って行った。
光透過凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）実験を、実施例４に従って行った。
【0226】
（多血小板血漿中の）血小板の凝集を、透過光凝集測定を使用して評価した。エプチフィバチドは、ＰＲＰにおける光透過凝集測定によって検出されるように、試験したすべての濃度で、ＰＲＰにおけるコラーゲン誘発性（１０μｇ／ｍＬ）血小板凝集を完全に阻害した。（図８）。
【0227】
エプチフィバチドの存在下での凝血時間の短縮に対するトロンボソームの効果も研究した。閉塞時間を回復させるトロンボソームの能力を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）システム上で研究した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）システムは、コラーゲンおよびトロンボプラスチン刺激による剪断力下での閉塞時間を測定する。ＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップ上の閉塞およびＡＵＣの全血プロファイルは、それぞれエプチフィバチドによって延長および減少した。エプチフィバチドは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップ上の全血の閉塞時間を、用量依存的様式で延長した。この実験では、全血は８分で閉塞し、６μＭのエプチフィバチドによって、閉塞時間が１６分に延長した（図９）。トロンボソームは、血栓形成に対するエプチチバチドの阻害作用に拮抗した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップ上の全血閉塞のエプチフィバチド阻害は、約２００，０００／μＬ（Ｎ＝３）のトロンボソームの添加によって拮抗した。エプチフィバチドによって阻害された全血の試料にトロンボソーム（約２００ｋ／μＬ）を添加した場合、閉塞までの時間は、９分で「正常」に減少した（図１０）。
【0228】
トロンボソーム処理での曲線下面積値もまた、正常な全血試料の値と比較して、トロンボソームによって増加した。図１１は、薬物処理を伴うＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップ上のトロンボソームの閉塞までの時間を実証し、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップ閉塞のエプチフィバチド阻害は、トロンボソーム（２００，０００／μＬ；Ｎ＝３）の添加によってほぼ完全に拮抗した。図１２では、曲線下面積値は、トロンボソームがエプチフィバチドによる阻害を正常レベルに戻した血栓形成を示し、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップへの血小板接着および閉塞のエプチフィバチド阻害は、トロンボソーム（２００，０００／μＬ；Ｎ＝３）の添加によって克服される。
【0229】
血小板とは異なり、トロンボソームは、エプチフィバチドの存在下で、剪断下で閉塞するその能力において阻害されない（図１３）。図１３は、ＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）システム上の様々なロットのトロンボソームの血栓形成のプロファイルが、エプチフィバチド処理によって変化しなかったことを示す。乏血小板血漿（ＰＰＰ）中のトロンボソームを、６ｕＭのエプチフィバチドありおよびなしで、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップを通して流した。トロンボソームの接着および閉塞に対するエプチフィバチドの効果はなかった。すべてのトロンボソーム濃度は、約３００，０００／μＬであった。
【0230】
血漿中のトロンボソーム（約３００，０００／μＬ）についてのＴ－ＴＡＳによるＡＵＣおよび閉塞値は、エプチフィバチドの有無にかかわらず同じであった（図１４～１５）。図１４は、曲線下面積値が、血栓形成を示し、乏血小板血漿中のエプチフィバチドによる変化は観察されなかったことを示す。トロンボソームＴ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップの閉塞のＡＵＣに対する６ｕＭのエプチフィバチドの効果はなかった。図１５は、ＡＲ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップ上のトロンボソームの閉塞までの時間が、エプチフィバチドによって変化しなかったことを示す。乏血小板血漿中のＴ－ＴＡＳ（登録商標）ＡＲチップのトロンボソーム閉塞時間に対する６μＭのエプチフィバチドからの有意な影響はなかった。
【0231】
実施例３．ＣＯＸ阻害剤。
以下の結果は、ＣＯＸ阻害剤を服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソームの影響を実証する。一般的な抗血小板薬であるアスピリンは、血小板中のＣＯＸ１酵素を遮断する。ＣＯＸ１は、アラキドン酸のプロスタグランジンへの変換に関与する。
以下の結果は、ＣＯＸ阻害剤を服用している患者のインビトロモデルにおけるトロンボソームの影響を実証する。一般的な抗血小板薬であるアスピリンは、血小板中のＣＯＸ１酵素を遮断する。ＣＯＸ１は、アラキドン酸のプロスタグランジンへの変換に関与する。
【0232】
アスピリンは、不可逆的なシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。血小板中のＣＯＸ酵素は、トロンボキサンＡ２、プロスタグランジンＥ２、およびプロスタシクリン（ＰＧＩ２）の合成に関与する。アスピリンは、血小板内のＣＯＸ酵素を永久的に不活性化し、かつ血小板は、新たな酵素を合成するための核物質を有しないため、アスピリン効果を克服するためには、新たな血小板を生成しなければならない。トロンボキサンＡ２、プロスタグランジンＥ２、およびプロスタシクリン（ＰＧＩ２）なしでは、血小板は、その凝集促進活性が制限される。多くの人は、望ましくない凝血事象を防止するために、低用量のアスピリンを維持される。アスピリンのバイオアベイラビリティは、投与経路によって大きく異なり、５００μＭのピークで単回５００ｍｇ用量のＩＶ、および４４μＭで、経口で同じ用量である。
【0233】
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。
光透過凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）実験を、実施例４に従って行った。
光透過凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）実験を、実施例４に従って行った。
【0234】
血小板は、コラーゲンおよびアラキドン酸刺激によって凝集する。
アラキドン酸による刺激は、完全に阻害され得るが、コラーゲンによる刺激の凝集は、１００～４００μＭのアスピリンの濃度で部分的にのみ阻害され得る（図１６）。図１６は、血小板凝集を誘発した、コラーゲン（１０ｕｇ／ｍＬ）およびアラキドン酸（ＡＡ；５００ｕｇ／ｍＬ）を含むＰＲＰにおける光透過凝集測定を示し、この凝集は、試験したすべての用量のアスピリン（ＡＳＡ）によって阻害された。アスピリンは、アラキドン酸誘発性血小板凝集を完全に排除した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）上のＰＬチップシステムを使用して、剪断条件下での脈管構造中のコラーゲンの曝露によるインビトロでの血小板結合および凝集を模倣した。血小板のこの作用は、１００および５００μＭのアスピリンの存在下で大きく制限されたが、トロンボソームの存在下では、少なくとも部分的に戻り得る（約２００，０００～４００，０００／μＬ；図１７）。図１７は、全血の曲線下面積測定を示し、ＰＬ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップ上の血栓形成がアスピリンによって阻害され、トロンボソームにより血栓形成が部分的に戻ったことを示す。
アラキドン酸による刺激は、完全に阻害され得るが、コラーゲンによる刺激の凝集は、１００～４００μＭのアスピリンの濃度で部分的にのみ阻害され得る（図１６）。図１６は、血小板凝集を誘発した、コラーゲン（１０ｕｇ／ｍＬ）およびアラキドン酸（ＡＡ；５００ｕｇ／ｍＬ）を含むＰＲＰにおける光透過凝集測定を示し、この凝集は、試験したすべての用量のアスピリン（ＡＳＡ）によって阻害された。アスピリンは、アラキドン酸誘発性血小板凝集を完全に排除した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）上のＰＬチップシステムを使用して、剪断条件下での脈管構造中のコラーゲンの曝露によるインビトロでの血小板結合および凝集を模倣した。血小板のこの作用は、１００および５００μＭのアスピリンの存在下で大きく制限されたが、トロンボソームの存在下では、少なくとも部分的に戻り得る（約２００，０００～４００，０００／μＬ；図１７）。図１７は、全血の曲線下面積測定を示し、ＰＬ Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）チップ上の血栓形成がアスピリンによって阻害され、トロンボソームにより血栓形成が部分的に戻ったことを示す。
【0235】
実施例４．プロトコル
トロンボソームの生成。トロンボソームを、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製した。
トロンボソームの生成。トロンボソームを、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４８６，６１７号（例えば、実施例１～５など）および同第８，０９７，４０３号（例えば、実施例１～３など）に記載の手順と一致して調製した。
【0236】
光透過凝集測定
血小板もしくはトロンボソームまたはその両方の組み合わせを含む血漿試料をキュベットに充填し、凝集測定チャンバに配置する。チャンバは、試料を加温し、一定の撹拌を提供する。凝集の開始は、トロンビン、ＡＤＰ、コラーゲン、および血小板凝集を刺激することが知られている任意の薬剤に限定されない複数の種類の阻害剤によって行い得る。試料はまた、エクスビボとして採取されているか、またはインビトロで阻害剤を補充されている場合がある。機器は、２分間の刺激に先立って、最初に光透過を記録することによって、アッセイを開始する。次いで、目的の刺激剤を技術者により導入し、光透過における変化を経時的に記録する。光透過における増加は、血小板凝集における増加に対応する。
血小板もしくはトロンボソームまたはその両方の組み合わせを含む血漿試料をキュベットに充填し、凝集測定チャンバに配置する。チャンバは、試料を加温し、一定の撹拌を提供する。凝集の開始は、トロンビン、ＡＤＰ、コラーゲン、および血小板凝集を刺激することが知られている任意の薬剤に限定されない複数の種類の阻害剤によって行い得る。試料はまた、エクスビボとして採取されているか、またはインビトロで阻害剤を補充されている場合がある。機器は、２分間の刺激に先立って、最初に光透過を記録することによって、アッセイを開始する。次いで、目的の刺激剤を技術者により導入し、光透過における変化を経時的に記録する。光透過における増加は、血小板凝集における増加に対応する。
【0237】
ＡＲチップを使用したＴ－ＴＡＳ（登録商標）による評価。ＡＲチップは、コラーゲンおよび組織因子を含有する単一のチャネルを特徴とし、それらを使用して、凝血および血小板機能を分析し得る。
【0238】
Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）機器は、製造業者の指示に従って使用するために準備した。ＡＲチップ（Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＣ０１０１）およびＡＲチップカルシウムトウモロコシトリプシン阻害剤（ＣａＣＴＩ；Ｄｉａｐｈａｒｍａカタログ番号ＴＲ０１０１）を、室温に加温した。３００ｕＬの再水和されたトロンボソームを、１．７ｍＬのマイクロ遠心チューブに移し、３９００ｇ×１０分間でペレットに遠心分離した。トロンボソームペレットを、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ（ＧＫ）プールされた正常なヒト血漿、または自己血小板を含むかもしくは含まない自己血漿中に、ＡｃＴ数（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡｃＴ Ｄｉｆｆ ２ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ）によって決定される約１００，０００～４５０，０００／ｕＬの濃度に再懸濁させた。２０ｕＬのＣａＣＴＩを、ＧＫ血漿中の４８０ｕＬのトロンボソーム試料と、ピペットで穏やかに混合した。試料を充填し、製造業者の指示に従ってＴ－ＴＡＳ（登録商標）上で実行した。
【0239】
ＰＬチップを使用したＴ－ＴＡＳ（登録商標）による評価
ＰＬチップは、ＡＲチップと同様に実行されるが、このチップは、コラーゲン単独でコーティングされている。
ＰＬチップは、ＡＲチップと同様に実行されるが、このチップは、コラーゲン単独でコーティングされている。
【0240】
トロンビン生成
試薬の調製。トロンビン生成のために、以下のとおり、製造業者からの以下の材料を使用した：ＦｌｕＣａキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９７）、トロンビンキャリブレータ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９７）、ＰＲＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９６）、ＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）、溶媒洗剤で処理されたヒトのプールされた血漿（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、カタログ番号８－６８２０９－９５２－０４）。すべての凍結試薬を、使用前に３７℃の水浴で解凍した。すべての試薬を、試薬ラベル上に印刷された体積を使用して、滅菌水で再水和した。
再水和の約２分後、試薬を、バイアルを５回反転することによって混合し、そのため塊や粉末は残っておらず、ボルテックスは使用しなかった。この手順を、再水和の約１０分後に繰り返した。すべての試薬を、室温でさらに約１０分間インキュベートした（再水和後、合計約２０分間）。３０％のＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）溶液を、４．６６ｍｌのトロンボソーム対照緩衝液（表Ｂ）を２ｍｌのＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）と混合することによって調製した。
試薬の調製。トロンビン生成のために、以下のとおり、製造業者からの以下の材料を使用した：ＦｌｕＣａキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９７）、トロンビンキャリブレータ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９７）、ＰＲＰ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、カタログ番号８６１９６）、ＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）、溶媒洗剤で処理されたヒトのプールされた血漿（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、カタログ番号８－６８２０９－９５２－０４）。すべての凍結試薬を、使用前に３７℃の水浴で解凍した。すべての試薬を、試薬ラベル上に印刷された体積を使用して、滅菌水で再水和した。
再水和の約２分後、試薬を、バイアルを５回反転することによって混合し、そのため塊や粉末は残っておらず、ボルテックスは使用しなかった。この手順を、再水和の約１０分後に繰り返した。すべての試薬を、室温でさらに約１０分間インキュベートした（再水和後、合計約２０分間）。３０％のＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）溶液を、４．６６ｍｌのトロンボソーム対照緩衝液（表Ｂ）を２ｍｌのＯＣＴＯＰＬＡＳ（登録商標）と混合することによって調製した。
【0241】
（表Ｂ）トロンボソーム対照緩衝液
【0242】
試料分析－プレートの調製および試験。トロンボソームを含有する実験のために、実験用トロンボソームおよび参照トロンボソームの各々について、トロンボソーム希釈シリーズを生成した（典型的には、１μＬ当たり１９４．４Ｋ、６４．８Ｋ、２１．６Ｋ、および７．２Ｋの希釈液を使用した；細胞数を、フローサイトメトリーによって決定する）。別途示されない限り、トロンボソームを再水和した。最高濃度の希釈液（例えば、１９４．４ｋトロンボソーム）を、トロンボソーム、ＯＣＴＡＰＬＡＳ（登録商標）、およびトロンボソーム対照緩衝液を組み合わせることによって調製した。残りの希釈液シリーズを、ＯＣＴＡＰＬＡＳ（登録商標）の連続１：３希釈によって調製した。各試験試料について、２０ｕＬのＰＲＰ試薬を、各試料ウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ Ｃｌｅａｒ、丸底９６ウェルプレート（ＶＷＲ、カタログ番号６２４０２－９５４））に添加し、２０ｕＬのトロンビンキャリブレータを、各キャリブレータウェルに添加した。各試料ウェルおよびキャリブレータウェルに、トロンボソーム希釈液シリーズの各々８０ｕＬを添加した。最後の希釈液まで継続する。次いで、プレートを、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ９６ウェル蛍光プレートリーダー（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で１０分間インキュベートした。このインキュベーション段階中、４０μＬのＦｌｕＣａ基質を、１．６ｍｌの解凍されたＦｌｕｏ－Ｂｕｆｆｅｒに添加し、ボルテックスし、かつ溶液を水浴に戻すことにより、ＦｌｕＣａ溶液を調製した。培養が完了したら、製造業者の指示に従って、ＦｌｕＣａ溶液をＦｌｕｒｏｓｋａｎ機器に添加した。プレートの蛍光を、２０秒間隔で、かつ４０～４１℃の温度で、７５分間モニタリングした。
【0243】
実施例５．
追加の実験を、カングレロールおよびアスピリンを用いて行った。
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。光透過凝集測定、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）、およびトロンビン生成実験を、実施例４に従って行った。
追加の実験を、カングレロールおよびアスピリンを用いて行った。
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。光透過凝集測定、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）、およびトロンビン生成実験を、実施例４に従って行った。
【0244】
血栓形成の回復に対するトロンボソームの効果を、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術およびＡＲチップを使用して評価した。図１８は、トロンボソーム（１μＬ当たり２５０，０００トロンボソームの濃度で）、アスピリン（２００μＭ）、カングレロール（１μＭ）、抗インテグリンアルファ－２（ＣＤ４９Ｂ）抗体６Ｆ１（４０μｇ；製品／製造業者情報については、ｄｓｈｂ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ａｌｐｈａ－２－ａｌｐｈａ２ｂｅｔａｌ？ｓｃ＝７＆ｃａｔｅｇｏｒｙ＝－１０７を参照されたい）、および抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体抗体ＡＰ２（２０ｕｇ／ｍＬ；製品／製造業者情報については、ｋｅｒａｆａｓｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／２０１０／ａｎｔｉ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｐｉｉｉａｇｐｉｉｂ－ｃｏｍｐｌｅｘ－ａｐ－２－ａｎｔｉｂｏｄｙを参照されたい）の様々な組み合わせで処理された全血の閉塞時間を示す。図１９は、未処理全血、およびトロンボソーム（１μＬ当たり２５０，０００個のトロンボソームの濃度で）、６Ｆ１（４０ｕｇ／ｍＬ；抗ＣＤ４９ｂ）、ＡＳＡ（アスピリン；２００ｕＭ）、およびカングレロール（１ｕＭ）を含有する混合物、またはそれらの組み合わせで処理された全血の経時的な閉塞を示す。
【0245】
血栓形成の回復に対するトロンボソームの効果も、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）技術およびＰＬチップを使用して評価した。図２０は、緩衝液、アスピリン（５００μＭ）、またはアスピリン（５００μＭ）およびトロンボソーム（１μＬ当たり２５０，０００個のトロンボソームの濃度で）でのみ処理された全血の閉塞時間を示す。図２１は、全血、アスピリン（５００μＭ）で処理された全血、またはアスピリン（５００μＭ）およびトロンボソーム（２５０，０００／μＬ）の経時的な閉塞を示す。図２２および２３は、５００μＭのアスピリンの代わりに１００μＭのアスピリンを使用した同様の実験データを示す。
【0246】
トロンビン生成に対するアスピリン処理（濃度）の効果を測定した。トロンボソームを、ベビーアスピリンを毎日服用している患者からのＰＰＰおよび標準血漿（ＩＮＲ＝１）の濃度１４５０、１１５０、８５０、６５０、４５０、１５０、５０、および０ｋ／ｕＬで評価した。図２４は、トロンボソームの非存在下でのアスピリン血漿のピークトロンビン値が、正常範囲（約４５ｎＭ、正常範囲は約６６～１６６ｎＭである）を下回ったが、トロンボソームの添加により、使用された最も低いトロンボソーム濃度（５０ｋ／μＬ）であっても、正常範囲内に戻ったことを示す。値を、約８００ｋのトロンボソームで再び飽和させ、トロンボソームの非存在下で、この血漿の値の５倍の２２０ｎＭまで上昇（４５～２２０ｎＭに増加）させた。
【0247】
実施例６．トロンボソームは、カングレロールによって誘発される長期ＰＲＰ閉塞時間に拮抗した
追加の実験を、カングレロールを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。
追加の実験を、カングレロールを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。
【0248】
図２５Ａおよび２５Ｂは、１００ｎｇ／ｍＬのカングレロールおよびＡＤＰで処理された多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞時間を１９分から２６分に延長したことを示す。１５０ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、時間が減少して１５．３分に戻った。
【0249】
実施例７．ランダムドナーの血小板（ＲＤＰ）ではないトロンボソームは、ＰＲＰにおいてチロフィバンによって誘発される延長閉塞時間に拮抗した
追加の実験を、チロフィバンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
追加の実験を、チロフィバンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
【0250】
図２６Ａおよび２６Ｂは、１００ｎｇ／ｍＬのチロフィバンで処理された多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞時間を１８．４３分から閉塞なしに延長したことを示す。１５０ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、時間が減少して１２．９４分に戻ったが、ＲＤＰは、同数では部分的にのみしか回復しなかった。
【0251】
実施例８．ランダムドナーの血小板ではないトロンボソームは、ＰＲＰにおいてエプチフィバチドによって誘発される延長閉塞時間に拮抗した
追加の実験を、エプチフィバチドを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
追加の実験を、エプチフィバチドを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
【0252】
図２７Ａおよび２７Ｂは、９μＭのエプチフィバチドで処理された多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞時間を１８．４３分から３０分超に延長したことを示す。１５０ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、時間が減少して１１．５６分に戻ったが、閉塞は、同数のＲＤＰでは見られなかった。
【0253】
実施例９．トロンボソームは、ＰＲＰにおいてＡＰ２（抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）によって誘発される延長閉塞時間に拮抗した
追加の実験を、ＡＰ２を用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
追加の実験を、ＡＰ２を用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。
【0254】
図２８Ａおよび２８Ｂは、１０μｇ／ｍＬのＡＰ－２で処理された多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞時間を１８．４３分から３０分超に延長したことを示す。１５０ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、時間が減少して１３．１４分に戻り、閉塞は、同数のＲＤＰでは１７．４３分で見られた。
【0255】
実施例１０．トロンボソームは、アスピリン療法の対象からのＰＲＰにおいて長期閉塞に拮抗した
追加の実験を、アスピリンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。対象は、標準用量の８１ｍｇ／日のアスピリンを服用していた。
追加の実験を、アスピリンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。ランダムドナーの血小板を、全血から調製した。対象は、標準用量の８１ｍｇ／日のアスピリンを服用していた。
【0256】
図２９Ａおよび２９Ｂは、アスピリン患者から採取した多血小板血漿が、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子でコーティングされたチャネル）上で、閉塞に失敗したことを示す。２００ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、正常な閉塞時間～１６分に戻った。
【0257】
実施例１１．トロンボソームは、エクスビボのアスピリン多血小板血漿中のトロンビン生成を回復させる
追加の実験を、アスピリンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。トロンビン生成を、実施例４に従って行った。
追加の実験を、アスピリンを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。トロンビン生成を、実施例４に従って行った。
【0258】
図３０Ａは、ＰＲＰ試薬で刺激された正常なものに対するアスピリン患者からの多血小板血漿のトロンビン生成が、５０ｋ／μＬのトロンボソームで拮抗したことを示す。図３０Ｂは、トロンボソーム（５０ｋ／μＬ）を含む３つの反復アスピリンエクスビボサンプリングにおける、正常なトロンビン産生からの変化および戻り、ピーク産生までの時間、ならびにラグタイムを示す。（ｎ＝３ トロンボソームロット、ｎ＝２ 個体）。
【0259】
実施例１２．トロンボソームは、ＮＳＡＩＤイブプロフェン療法の対象からのＰＲＰにおいて止血を回復させる。
追加の実験を、イブプロフェンであるＮＳＡＩＤを用いて行った。
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。
追加の実験を、イブプロフェンであるＮＳＡＩＤを用いて行った。
トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。凝集測定およびＴ－ＴＡＳ（登録商標）を、実施例４に従って行った。
【0260】
多血小板血漿を、８００ｍｇのイブプロフェンを服用している対象から採取した。図３１Ａは、アラキドン酸に対する応答における凝集の欠如が、ＰＲＰにおけるＮＳＡＩＤの存在を確認することを示す。図３１Ｂは、Ｔ－ＴＡＳ（登録商標）フローシステム（コラーゲンおよび組織因子コーティングチャネル）上の閉塞を示し、イブプロフェン患者からのＰＲＰは閉塞を実証し、一方、ＡＤＰの添加は閉塞を消滅させた。１５０ｋ／μＬのトロンボソームの添加により、閉塞が回復した。
【0261】
実施例１３．トロンボソーム（登録商標）は、超薬理学的クロピドグレルによって処置されたＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける出血時間を回復させる
追加の実験を、クロピドグレルを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。
追加の実験を、クロピドグレルを用いて行った。トロンボソームを、実施例４の手順と一致して調製した。
【0262】
マウスを、クロピドグレルにより５日間処置した。マウスに麻酔をかけ、尾の先端を切断した後、トロンボソームを直ちに投与した。断尾から尾の出血が止まるまでの時間を、目視検査により記録した。
【0263】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、臨床用量の約３倍のクロピドグレルにより５日間処置し、次いで、断尾出血モデルにおいて評価した。出血時間（分）を、未処置９分に対し、クロピドグレル処置では１７．８分に延長した（データ図示せず）。８μＬ／グラムのトロンボソーム（２００μＬで１．８×１０＾９粒子／ｍＬ）による処置により、出血が１２．３１分に減少した（図３２）。
【0264】
前述の説明は、本発明の好ましい実施形態を対象とするが、他の変形および修正が、当業者には明らかであり、かつ本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく行われ得ることに留意されたい。
さらに、本発明の１つの実施形態に関連して記載される特徴は、上記に明示的に記載されていない場合であっても、他の実施形態と併せて使用され得る。さらに、当業者は、上記で考察されるような発明が、異なる順序の工程で、および／または開示されるものとは異なる構成のハードウェア要素を用いて実践され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はこれらの好ましい実施形態に基づいて記載されているが、ある特定の修正、変形、および代替的な構成が、本発明の趣旨および範囲内に留まる一方で、明らかであることは、当業者には明らかであろう。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書に本質的にまたは明示的に記載され、有効である。したがって、本発明の範囲および境界を決定するために、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
さらに、本発明の１つの実施形態に関連して記載される特徴は、上記に明示的に記載されていない場合であっても、他の実施形態と併せて使用され得る。さらに、当業者は、上記で考察されるような発明が、異なる順序の工程で、および／または開示されるものとは異なる構成のハードウェア要素を用いて実践され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はこれらの好ましい実施形態に基づいて記載されているが、ある特定の修正、変形、および代替的な構成が、本発明の趣旨および範囲内に留まる一方で、明らかであることは、当業者には明らかであろう。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書に本質的にまたは明示的に記載され、有効である。したがって、本発明の範囲および境界を決定するために、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【国際調査報告】