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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-27
(54)【発明の名称】初代ヒトＴ細胞へのＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの実施方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/90 20060101AFI20221020BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221020BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20221020BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221020BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221020BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221020BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20221020BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221020BHJP
【ＦＩ】
C12N15/90 Z ZNA
C12Q1/02
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6844 Z
C12Q1/686 Z
C12N15/11 Z
C12Q1/68
C12N15/09 100
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513268
(86)(22)【出願日】2020-08-26
(85)【翻訳文提出日】2022-04-04
(86)【国際出願番号】 US2020047964
(87)【国際公開番号】W WO2021041519
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】62/891,741
(32)【優先日】2019-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520032608
【氏名又は名称】パクト ファーマ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＣＴ ＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】パオ， シアオイェン ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ジャコビー， カイル
(72)【発明者】
【氏名】ルー， ウィリアム
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA17
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR77
4B063QS25
(57)【要約】
ここに開示されるのは、初代細胞のゲノム改変のオフターゲット効果を含む効果を識別するための方法である。これらの方法は、治療用Ｔ細胞の工学的アプローチを検証するのに適している高精度で実施される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
初代細胞のゲノムＤＮＡにおける二重鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、ａ． 初代細胞のゲノムＤＮＡにおいて二重鎖切断を誘導することができるヌクレアーゼ組成物を提供する工程；
ｂ． 二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含むヌクレオチド組成物を提供する工程であって、ｄｓＯＤＮが、約１ｐｍｏｌから約１０ｎｍｏｌの範囲の量で提供される工程；
ｃ． 細胞のゲノムＤＮＡにＤＳＢを誘導し、ＤＳＢを修復し、一又は複数のＤＳＢにｄｓＯＤＮを組込むのに十分な時間、初代細胞をインキュベートする工程；
ｄ． 組込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程；及び
ｅ． ゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンシングする工程
を含み、それによって初代細胞のゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを検出する、方法。
【請求項2】
ｄｓＯＤＮが、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｄｓＯＤＮの両方の鎖が、細胞のゲノムに直交している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されている、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端にホスホロチオエート結合を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端及び両方の５’末端にホスホロチオエート結合を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
ｄｓＯＤＮが、約１５から約５０ヌクレオチド長である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
ゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程が、ａ． ゲノムＤＮＡを断片化する工程；
ｂ． 断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲートする工程；
ｃ． 組込まれたｄｓＯＤＮに相補的な第一プライマーとユニバーサルアダプターに相補的な第二プライマーを用いて、ライゲートされたＤＮＡに対して第一ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程；及び
ｄ． ３’ネステッドプライマーであり、第一プライマーに相補的である第三プライマー、３’ネステッドプライマーであり、第二プライマーに相補的である第四プライマー、及び第四プライマーに相補的である第五プライマーを使用して第二ラウンドのＰＣＲを実施する工程
を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
第五プライマーが、精製配列、結合配列、識別配列、又はそれらの組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ヌクレアーゼ組成物が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
ヌクレアーゼ組成物が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＲＮＰ複合体が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：４から約１：７である、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：６である、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１５μｇから約３０μｇの範囲の量である、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項16】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１６μｇの量である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約５００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌの範囲の量である、請求項１２から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項18】
ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約６００ｐｍｏｌの量である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする、請求項１から１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項20】
ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項21】
ガイドＲＮＡが、ＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、請求項１１から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項22】
ＤＳＢがオフターゲットＤＳＢである、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項23】
ｄｓＯＤＮが、ＤＮＡバーコードを含む、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項24】
ＤＮＡバーコードがランダム化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ｄｓＯＤＮが、配列番号：１及び配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１から２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項26】
ヌクレアーゼ組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、請求項１から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項27】
ヌクレアーゼ組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ヌクレオチド組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項29】
ヌクレオチド組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
初代細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項31】
初代細胞がヒト細胞である、請求項１から３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項32】
ヒト細胞が造血幹細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ヒト細胞がＴ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項36】
ヒト細胞がＮＫ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項37】
初代細胞が対象から得られる、請求項１から３６の何れか一項に記載の方法。
【請求項38】
対象がヒトである、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願との相互参照］
この出願は、内容がその全体において援用され、優先権が主張される、２０１９年８月２６日に出願された米国仮出願第６２／８９１７４１号の優先権を主張する。
この出願は、内容がその全体において援用され、優先権が主張される、２０１９年８月２６日に出願された米国仮出願第６２／８９１７４１号の優先権を主張する。
【0002】
［配列表］
本明細書では、（「０８７５２００１５０．ｔｘｔ」との名称のｔｘｔファイルとして電子的に提出された）配列表が参照される。ｔｘｔファイルは２０２０年８月１８日に作成され、サイズは２９３７バイトである。配列表の全内容が出典明示によりここに援用される。
本明細書では、（「０８７５２００１５０．ｔｘｔ」との名称のｔｘｔファイルとして電子的に提出された）配列表が参照される。ｔｘｔファイルは２０２０年８月１８日に作成され、サイズは２９３７バイトである。配列表の全内容が出典明示によりここに援用される。
【背景技術】
【0003】
遺伝子ターゲティングは、ゲノムを直接編集して、細胞産物を改変し、遺伝性障害を引き起こす変異を修復し、又は遺伝子を研究する変異を作製するための道筋を提供する方法である。新規な特異性を持つＴ細胞を作製するための初代ヒトＴ細胞における遺伝子ターゲティングの使用により、標的抗原に対する免疫応答を開始し、増幅し、又は減弱する臨床的に有益な免疫療法（例えば、ＴＣＲ遺伝子導入及びワクチン）が可能になる。遺伝子ターゲティングは、特異的な標的ゲノム切断及び配列送達のための強いゲノム編集試薬及び方法に依存している。しかし、遺伝子ターゲティングの治療的使用には、臨床的使用前にその安全性を評価するために、オフターゲットゲノム位置での切断及び／又は挿入活性など、対象におけるゲノム編集試薬のオフターゲット効果の詳細な理解が必要になる。
【0004】
遺伝子編集（例えば、Ｃａｓ９によるガイドＲＮＡを利用した切断）の結果として生じる潜在的なオフターゲット挿入部位を識別する既存の方法には、計算シミュレーション、例えばミスマッチ、挿入、及び欠失を伴うＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位（CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions, and Deletions）（ＣＯＳＭＩＤ）（Ｃｒａｄｉｃｋ等，２０１４）と、シークエンシングによって可能になる二重鎖切断のゲノムワイドな偏りのない識別（Genome-wide, Unbiased Identification of Doublestranded breaks Enabled by Sequencing）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）（Ｔｓａｉ等，２０１５）と呼ばれる細胞ベースの実験方法が含まれる。
【0005】
計算シミュレーションでは、インビトロ法で見出されたオフターゲット部位を識別できず（例えば、Ｔｓａｉ等，２０１５を参照）、よって遺伝子ターゲティング試薬の治療的使用を試験するために必要な信頼性がない。
【0006】
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、Ｕ２ＯＳ又はＨＥＫ２９３細胞株など、二重鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＯＤＮ）のトランスフェクションに許容される幾らかの特定の細胞株におけるオフターゲットゲノム編集の高度に特異的で高感度な識別に有望である。しかし、Ｔｓａｉ等において提供されたアプローチは、初代ヒト細胞におけるオフターゲット挿入部位を識別するために使用することはできない。（例えば、Ｋｉｍ等（２０１８）を参照：「広く使用されている細胞ベースの方法であるＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、細胞への二重鎖オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを必要とする。ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、トランスフェクションに不応である所定の細胞では使用できない。更に、二重鎖オリゴヌクレオチドは多くの初代細胞に対して細胞傷害性である。」）更に、患者固有のゲノム配列バリアントから生じるオフターゲット切断部位の可能性は、細胞株での実験では対処できない。
【0007】
従って、必要とされるものは、患者固有のバリアントを含む初代細胞、例えば初代ヒトＴ細胞において使用できるオフターゲット切断／遺伝子編集部位を識別するための高感度で偏りのないゲノムワイドな方法である。
【発明の概要】
【0008】
所定の実施態様では、本開示は、初代細胞のゲノムＤＮＡにおける二重鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、初代細胞のゲノムＤＮＡにおいて二重鎖切断を誘導することができるヌクレアーゼ組成物を提供する工程；平滑末端二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含むヌクレオチド組成物を提供する工程であって、ｄｓＯＤＮが、約１ｐｍｏｌから約１０ｎｍｏｌの範囲の量で提供される工程；細胞のゲノムＤＮＡにＤＳＢを誘導し、ＤＳＢを修復し、一又は複数のＤＳＢにｄｓＯＤＮを組込むのに十分な時間、初代細胞をインキュベートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程；及びゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンシングする工程を含み、それによって初代細胞のゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを検出する、方法を提供する。
【0009】
所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮの両方の鎖は、細胞のゲノムに直交している。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮの５’末端はリン酸化されている。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、両方の３’末端にホスホロチオエート結合を含む。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、両方の３’末端及び両方の５’末端にホスホロチオエート結合を含む。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、約１５から約５０ヌクレオチド長である。
【0010】
所定の実施態様では、ゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程は、ゲノムＤＮＡを断片化する工程；断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮに相補的な第一プライマーとユニバーサルアダプターに相補的な第二プライマーを用いて、ライゲートされたＤＮＡに対して第一ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程；及び３’ネステッドプライマーであり、第一プライマーに相補的である第三プライマー、３’ネステッドプライマーであり、第二プライマーに相補的である第四プライマー、及び第四プライマーに相補的である第五プライマーを使用して第二ラウンドのＰＣＲを実施する工程を含む。所定の実施態様では、第五プライマーは、精製配列、結合配列、識別配列、又はそれらの組み合わせである。
【0011】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、又はＣａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。所定の実施態様では、Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比は、約１：４から約１：７である。所定の実施態様では、Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比は、約１：６である。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲＮＰ複合体当たり約１５μｇから約３０μｇの範囲の量である。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲＮＰ複合体当たり約１６μｇの量である。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、ＲＮＰ複合体当たり約５００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌの範囲の量である。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、ＲＮＰ複合体当たり約６００ｐｍｏｌの量である。
【0012】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、ＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする。
【0013】
所定の実施態様では、ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする。所定の実施態様では、ＤＳＢはオフターゲットＤＳＢである。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、ＤＮＡバーコードを含む。所定の実施態様では、ＤＮＡバーコードはランダム化される。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、配列番号：１及び配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0014】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、非ウイルス送達系によって送達される。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、エレクトロポレーションによって送達される。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、非ウイルス送達系によって送達される。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、エレクトロポレーションによって送達される。
【0015】
所定の実施態様では、初代細胞は哺乳動物細胞である。所定の実施態様では、初代細胞はヒト細胞である。所定の実施態様では、ヒト細胞は、造血幹細胞である。所定の実施態様では、ヒト細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞である。所定の実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞である。所定の実施態様では、ヒト細胞はＮＫ細胞である。所定の実施態様では、初代細胞は対象から得られる。所定の実施態様では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0016】
前述及び他の目的、特徴、並びに利点は、同様の参照符号が異なる図全体にわたって同じ部分を指す添付図に示されているように、本発明の特定の実施態様の次の説明から明らかであろう。図面は必ずしも原寸に比例しておらず、代わりに本発明の様々な実施態様の原理を例証することに重点が置かれている。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本開示は、遺伝子編集を受けた初代細胞、例えば、Ｔ細胞における二重鎖切断（ＤＢＳ）の検出に関連して有用な組成物及び方法に関する。
【0018】
ここに記載されるのは、オフターゲット効果を含む、初代細胞におけるゲノム編集の効果を識別する改善された方法である。所定の実施態様では、これらの方法は、遺伝子編集メカニズムによって挿入され、ついで効果、例えば、オフターゲット効果の識別のために偏りのない増幅を受ける、特別にデザインされた二重鎖オリゴヌクレオチドを使用することによって、そのような効果、例えば、オフターゲット効果の高度に正確な識別をもたらす。ゲノム工学及び初代細胞への二重鎖オリゴヌクレオチドの挿入に関連する既知の課題のため、オフターゲット識別法を含む同様の識別法はまだ達成されていない。
【0019】
非ウイルス媒介送達を用いる初代細胞のヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は以前に開示されている（例えば、ここにその全体が援用されるＰＣＴ公開第２０１９／０８９６１０号、「初代細胞遺伝子編集」を参照のこと）。その刊行物に記載されているように、Ｃａｓ９によるガイドＲＮＡを利用した切断は、Ｔ細胞受容体遺伝子を改変するために成功裡に実施されており、これは、幾つかの免疫療法用途でＴ細胞特異性を改変するのに役立つ。しかし、Ｃａｓ９によるガイドＲＮＡを利用した切断は、プロトスペーサー配列と完全に一致していないゲノム部位で発生する可能性があり、その結果、オフターゲット切断が生じる。
【0020】
ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、オンターゲットとオフターゲットの両方のＣａｓ９切断部位での二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の組込みを検出することにより、潜在的なオフターゲット部位を識別するために使用される細胞ベースの方法である（Ｔｓａｉ等，２０１５）。しかし、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ｄｓＯＤＮトランスフェクションに許容される細胞型に制限されている（Ｋｉｍ及びＫｉｍ，２０１８）。特に、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは初代ヒトＴ細胞を使用して実施されていない。初代ヒトＴ細胞におけるオフターゲット効果をシミュレートするための非初代細胞許容細胞株の使用にも、細胞型間のエピジェネティックな差異又は倍数性の潜在的な差異による欠点がある。更に、患者固有のゲノム配列バリアントから生じるオフターゲット切断部位の可能性は、細胞株での実験では対処できない。
【0021】
ここに記載されるように、所定の実施態様によれば、初代ヒトＴ細胞におけるオフターゲット効果を含む遺伝子編集効果は、ｉ）ＴＲＡＣ又はＴＲＢＣガイドＲＮＡと複合体を形成したリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、及びｉｉ）ｄｓＯＤＮ（患者固有のＴＣＲプラスミドの代わりに）と共にＴ細胞を同時にエレクトロポレーションし、続いて特定のオフターゲット効果を識別するための偏りのない増幅法によって成功裡にモニターされた。
【0022】
本開示の様々な実施態様の詳細は、以下の説明に記載される。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、明細書及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0023】
限定ではなく、開示を明確化する目的で、詳細な説明を次のサブセクションに分ける。
１． 定義；
２． Ｇｕｉｄｅ－Ｓｅｑ；
３． 遺伝子編集システム；
４． 組成物とベクター；
５． キット；及び
６． 例示的な実施態様。
１． 定義；
２． Ｇｕｉｄｅ－Ｓｅｑ；
３． 遺伝子編集システム；
４． 組成物とベクター；
５． キット；及び
６． 例示的な実施態様。
【0024】
１． 定義
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。
別段の定義がない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。次の参考文献は、本開示の主題で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２版 １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；並びにＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。ここで使用される場合、次の用語は、特に明記しない限り、以下の定義に帰する意味を有している。
【0025】
ここに記載の本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを含むことが理解される。「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」という用語は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することを意図しており、「含む（includes）」、「含む（including）」などを意味しうる。
【0026】
ここで使用される場合、「抗原」には、患者特異的ネオ抗原を含む任意の抗原が含まれる。抗原には、免疫応答を誘導しうる任意の物質が含まれる。「インビトロ」という用語は、生体とは別個に成長する、例えば組織培養で成長する、生細胞において起こるプロセスを指す。
「インビボ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。
「インビボ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。
【0027】
「宿主細胞」とは、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入されている細胞を意味する。宿主細胞には、継代数に関係なく、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全には同一ではない場合があるが、変異を含む場合もある。元の形質転換された細胞においてスクリーニングされ又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫がここに含まれる。
「個体」又は「ドナー」又は「対象」は哺乳動物である。所定の態様では、個体又はドナー又は対象はヒトである。
「個体」又は「ドナー」又は「対象」は哺乳動物である。所定の態様では、個体又はドナー又は対象はヒトである。
【0028】
ここで使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「核酸は交換可能に使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリン又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基から構成される。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記述され、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は典型的には５’から３’まで表される。ポリヌクレオチドとは、任意のＤＮＡ（限定されないがｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、及びｄｓＤＮＡを含む）及び任意のＲＮＡ（限定されないがｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む）を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡの合成形態、並びにこれら分子の二以上を含む混合ポリマーを更に含む。当業者は、例えば、ポリヌクレオチドが使用されている状況に基づいて、どの形態が参照されているかを理解することができる。ポリヌクレオチドは、線状又は環状でありうる。加えて、ポリヌクレオチドという用語には、センス鎖とアンチセンス鎖の両方、並びに単鎖及び二重鎖の形態が含まれる。ポリヌクレオチドは、天然に生じるヌクレオチド又は天然には生じないヌクレオチドを含みうる。非天然ヌクレオチドの例には、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を含む修飾ヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドは、インビトロ及び／又はインビボで本発明のポリペプチドを直接発現するためのベクターとして適切なＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包含する。
【0029】
特に述べられていない限り又は文脈から明らかでない限り、ここで使用される「約」又は「およそ」という用語は、当該技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差内であると理解される。約は記載されている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解されうる。あるいは、該用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味しうる。
【0030】
「実質的に含まない」という用語は、関連する全組成物において成分が検出不可能なレベルにある（つまり、「含まない」）場合を含む、関連する全組成物に存在する成分が統計的に有意な量未満であることを意味すると理解される。統計的に有意な量未満とは、０．１、０．０５、又は０．０１を超えるｐ値など、関連する組成物に成分が存在するという統計的信頼性を有しているとは見なされない検出レベルを指す。組成物が質量／体積パーセント濃度で１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％、又は０．０００１％未満の成分を含む場合、組成物は成分を実質的に含まないと言える。
【0031】
「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」は、カノニカルＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）と、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、単鎖アニーリング（ＳＳＡ）、及び合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）を含むオルタナティブＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）とを含む、ライゲーション媒介修復及び／又は非鋳型媒介修復を指す。
【0032】
「ベクター」、「発現ベクター」及び「発現コンストラクト」は、交換可能に使用することができ、その発現又は複製の何れかのために異種ＤＮＡを細胞に導入するために使用される別個のエレメントを意味する。ここで使用される場合、ベクターは、ベクター内に挿入されたコード配列によってコードされるポリペプチド遺伝子産物のインビボ又はインビトロ発現のために改変されて使用されうる。
【0033】
ここで使用される場合、「バーコード」という用語は、サンプルを識別するために使用されるヌクレオチド、生体分子成分及び／又はサブユニット、又はポリマー成分及び／又はサブユニットの配列を指す。所定の非限定的な実施態様では、例えば、バーコードは、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの配列でありうる。
【0034】
「キット」とは、特定の目的のために用いることができる機能ユニットを一緒に構成する二以上の構成要素の任意のコレクションを指す。例示として（限定ではない）、本開示に係る一キットは、ここに開示される方法を実施するためのｄｓＯＤＮ、他の試薬、及び消耗品を含みうる。キットの構成要素は、一緒にパッケージ化することができ、又は別々にパッケージ化してもよい。本開示に係るキットはまた、例えば、本開示の方法による、キットの使用を説明する使用説明書を場合によっては含む。説明書はキットに物理的にパッケージ化することも、例えばインターネットアクセスによってキットのユーザーが利用できるようにすることもできる。
【0035】
１．１ 他の解釈上の慣例
ここに記載されている範囲は、記載されている終点を含む、範囲内の全ての値の省略形であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、その任意の数又は分数、その数又は分数の組み合わせ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からのサブ範囲（群からの任意の数の分数を含む）を含むと理解される。
ここに記載されている範囲は、記載されている終点を含む、範囲内の全ての値の省略形であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、その任意の数又は分数、その数又は分数の組み合わせ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からのサブ範囲（群からの任意の数の分数を含む）を含むと理解される。
【0036】
２． Ｇｕｉｄｅ－Ｓｅｑ
ここに記載のシークエンシングによって評価されるＤＳＢのゲノムワイドな偏りのない識別（Genomewide Unbiased Identification of DSBs Evaluated by Sequencing）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路が活性である初代ヒト細胞における操作されたヌクレアーゼ切断部位の位置を識別するための高感度で偏りのないゲノムワイド法を提供する。幾つかの実施態様では、該方法は、短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮｓ）のヌクレアーゼ誘導性切断への組込み（ＮＨＥＪ経路によって媒介されると推定されるプロセス）と、ついでゲノム挿入部位を特定するための挿入されたｄｓＯＤＮ配列の使用に依存する。幾つかの実施態様では、挿入されたｄｓＯＤＮ配列が、ハイスループットシークエンシングのためにゲノム挿入部位を選択的に増幅するために使用される、偏りのないＰＣＲベースのディープシークエンシングアプローチを使用することができる。幾つかの実施態様では、挿入されたｄｓＯＤＮｓを含むゲノム断片を、例えば、溶液ハイブリッド捕捉を使用して、ビオチンなどの付着タグを使用して選択的にプルダウンすることができる。
ここに記載のシークエンシングによって評価されるＤＳＢのゲノムワイドな偏りのない識別（Genomewide Unbiased Identification of DSBs Evaluated by Sequencing）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路が活性である初代ヒト細胞における操作されたヌクレアーゼ切断部位の位置を識別するための高感度で偏りのないゲノムワイド法を提供する。幾つかの実施態様では、該方法は、短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮｓ）のヌクレアーゼ誘導性切断への組込み（ＮＨＥＪ経路によって媒介されると推定されるプロセス）と、ついでゲノム挿入部位を特定するための挿入されたｄｓＯＤＮ配列の使用に依存する。幾つかの実施態様では、挿入されたｄｓＯＤＮ配列が、ハイスループットシークエンシングのためにゲノム挿入部位を選択的に増幅するために使用される、偏りのないＰＣＲベースのディープシークエンシングアプローチを使用することができる。幾つかの実施態様では、挿入されたｄｓＯＤＮｓを含むゲノム断片を、例えば、溶液ハイブリッド捕捉を使用して、ビオチンなどの付着タグを使用して選択的にプルダウンすることができる。
【0037】
ここに記載するのは、初代ヒト細胞におけるＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ法の開発と検証である。
この最初のシークエンシング法によって識別される潜在的なオフターゲット部位は、ヌクレアーゼ成分のみが発現される細胞におけるＮＨＥＪ修復に特徴的なインデル変異についてまた分析されるかもしれない。これらの実験は、増幅とそれに続くディープシークエンシングを使用して実施でき、各ヌクレアーゼによって誘導されるオフターゲット変異の追加の確認と頻度の定量化をもたらす。
この最初のシークエンシング法によって識別される潜在的なオフターゲット部位は、ヌクレアーゼ成分のみが発現される細胞におけるＮＨＥＪ修復に特徴的なインデル変異についてまた分析されるかもしれない。これらの実験は、増幅とそれに続くディープシークエンシングを使用して実施でき、各ヌクレアーゼによって誘導されるオフターゲット変異の追加の確認と頻度の定量化をもたらす。
【0038】
２．１． 二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド及び二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮｓ）
ここに記載の方法では、天然には生じないｄｓＯＤＮが、遺伝子編集試薬と共に初代ヒト細胞に送達され又は発現される。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮの両方の鎖は、細胞のゲノムに対してオルソロガスである（すなわち、細胞のゲノムに存在しないか、又は存在する配列に相補的ではない、すなわち、存在する配列に対して１０％以下、２０％以下、３０％＞、４０％＞、又は５０％＞の同一性を有する）。ｄｓＯＤＮｓは、好ましくは、約１５から約７５ヌクレオチド長、例えば、約１５～約５０ヌクレオチド長、約５０～約７５ヌクレオチド長、約３０～約３５ヌクレオチド長、約６０～約６５ヌクレオチド長、又は約５０～約６５ヌクレオチド長、又は約１５から約５０ヌクレオチド長、例えば、約２０～約４０ヌクレオチド長、約３０～約３５ヌクレオチド長、例えば、約３２～約３４ヌクレオチド長でありうる。ｄｓＯＤＮの各ストランドは、偏りのない増幅と識別を容易にするために固有のＰＣＲプライミング配列を含む必要がある（つまり、ｄｓＯＤＮは各ストランドに一つの、二つのＰＣＲプライマー結合部位を含む）。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮは、例えば、ｄｓＯＤＮの挿入を検証するために、制限酵素認識部位、好ましくは、細胞のゲノムに比較的稀である部位を含む。
ここに記載の方法では、天然には生じないｄｓＯＤＮが、遺伝子編集試薬と共に初代ヒト細胞に送達され又は発現される。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮの両方の鎖は、細胞のゲノムに対してオルソロガスである（すなわち、細胞のゲノムに存在しないか、又は存在する配列に相補的ではない、すなわち、存在する配列に対して１０％以下、２０％以下、３０％＞、４０％＞、又は５０％＞の同一性を有する）。ｄｓＯＤＮｓは、好ましくは、約１５から約７５ヌクレオチド長、例えば、約１５～約５０ヌクレオチド長、約５０～約７５ヌクレオチド長、約３０～約３５ヌクレオチド長、約６０～約６５ヌクレオチド長、又は約５０～約６５ヌクレオチド長、又は約１５から約５０ヌクレオチド長、例えば、約２０～約４０ヌクレオチド長、約３０～約３５ヌクレオチド長、例えば、約３２～約３４ヌクレオチド長でありうる。ｄｓＯＤＮの各ストランドは、偏りのない増幅と識別を容易にするために固有のＰＣＲプライミング配列を含む必要がある（つまり、ｄｓＯＤＮは各ストランドに一つの、二つのＰＣＲプライマー結合部位を含む）。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮは、例えば、ｄｓＯＤＮの挿入を検証するために、制限酵素認識部位、好ましくは、細胞のゲノムに比較的稀である部位を含む。
【0039】
幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮｓは改変される。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮｓは化学修飾を含む。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化される。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮの５’末端はホスホロチオレートである。幾つかの実施態様では、二つのホスホロチオエート結合が、両方の３’末端及び両方の５’末端に存在する。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮは平滑末端である。幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮｓは、５’又は３’末端に無作為な種類の１、２、３、４又はそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含む。
【0040】
ｄｓＯＤＮはまた、例えば、当該技術分野で知られているか、又は出典明示によりその全体がここに援用されるＰＣＴ特許公開第２０１２／０６５１４３号「ポリコーム関連非コードＲＮＡ」に記載されるような、一又は複数の追加の改変を含みうる。例えば、幾つかの実施態様では、ｄｓＯＤＮはビオチン化される。ｄｓＯＤＮタグのビオチン化型は、ゲノムＤＳＢの部位に組込むための基質として使用できる。ビオチンは、ｄｓＯＤＮの内部のどこにあってもよい（例えば、修飾チミジン残基（Ｂｉｏｔｉｎ－ｄＴ）又はビオチンアジドの使用）が、５’又は３’末端にはない。幾つかの実施態様では、そのようなビオチンタグは、ｄｓＯＤＮタグを含むオリゴヌクレオチド断片を回収するために使用されうる。幾つかの実施態様では、これらの配列はネステッドＰＣＲによって検索され識別されるが、このアプローチでは、それらは、ビオチンを使用することによって、例えば、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズへの結合によって、又は溶液ハイブリッド捕捉を使用することによって、物理的にプルダウンされる；例えば、Ｇｎｉｒｋｅ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７，１８２－１８９（２００９）を参照のこと。主な利点は、両方のフランキング配列の検索であり、これにより、参照ゲノムへのマッピング配列への依存性が低下し、オフターゲット切断部位が識別される。
【0041】
２．２． 増幅とシークエンシング
本開示は、初代細胞のゲノムＤＮＡの増幅を含む方法を提供する。所定の実施態様では、限定されないが、ゲノムＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施されうる。
本開示は、初代細胞のゲノムＤＮＡの増幅を含む方法を提供する。所定の実施態様では、限定されないが、ゲノムＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施されうる。
【0042】
ここで使用される場合、「シークエンシング」は、核酸の配列を決定する任意の方法を含む。チェーンターミネーター（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシング及びダイターミネーターシークエンシングを含む、任意のシークエンシング方法を本発明の方法において使用することができる。所定の実施態様では、何千又は何百万のシークエンシング反応を並行して実施するハイスループットシークエンシング技術である次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が使用される。異なるＮＧＳプラットフォームは様々なアッセイケミストリーを使用するが、それらは全て多数の鋳型で同時に実行される多数のシークエンシング反応から配列データを生成する。典型的には、配列データはスキャナーを使用して収集され、ついで集合され、生物情報学的に分析される。従って、シークエンシング反応は並行して実施され、読み取られ、集合され、かつ分析される；例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１６２８９７号、並びにＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ等，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１－６５８，２００９；及びＭａｃＬｅａｎ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７－２９６（２００９）を参照のこと。
【0043】
一部のＮＧＳ法は鋳型増幅を必要とし、一部は必要としない。増幅を必要とする方法には、パイロシークエンシング（例えば、米国特許第６２１０８９号及び第６２５８５６８号を参照；ロシュによって商品化）；Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（例えば、米国特許第６８３３２４６号、第７１１５４００号、及び第６９６９４８８号を参照）；及びサポーテッドオリゴヌクレオチドライゲーション及び検出（ＳＯＬｉＤ）プラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；例えば、米国特許第５９１２１４８号及び第６１３００７３号を参照）が含まれる。増幅を必要としない方法、例えば、単一分子シークエンシング法には、ナノポアシークエンシング、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（米国特許第７１６９５６０号；第７２８２３３７号；第７４８２１２０号；第７５０１２４５号；第６８１８３９５号；第６９１１３４５号；及び第７５０１２４５号）；合成によるリアルタイムシークエンシング（例えば、米国特許第７３２９４９２号を参照）；ゼロモード導波（ＺＭＷ）を使用する単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシークエンシング法；及び米国特許第７１７００５０号；第７３０２１４６号；第７３１３３０８号；及び第７４７６５０３号に記載されているものを含む他の方法が含まれる。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２７４１４７号；米国特許出願公開第２０１４／００３８８３１号；Ｍｅｔｚｋｅｒ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１（１）：３１－４６（２０１０）を参照のこと。
【0044】
あるいは、ハイブリダイゼーションベースのシークエンス法又は他のハイスループット法、例えば、マイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ、ＩＬＬＵＭＩＮＡ、又は他のシークエンシングプラットフォームを使用することもできる。
【0045】
３． 遺伝子編集システム
ここに記載のオフターゲットゲノム編集識別法は、初代細胞への改変に基づいている。一般に、改変細胞は、ヌクレアーゼ媒介編集を使用して、それらがゲノム的に編集されるように改変されるか、又はゲノム的に編集されうる。
幾つかの実施態様では、ヌクレアーゼは、特定の核酸配列（すなわち、ヌクレアーゼによって切断される「定まったヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列での切断を最初に方向付けることによって編集を促進し、その後の編集は、非鋳型ベースのＤＮＡ修復、例えば、ヌクレアーゼ切断により誘導される非相同な末端結合ＤＮＡ修復メカニズムから生じるか、又は鋳型ベースの修復、例えば、相同組換えＤＮＡ修復メカニズムから生じる。
ここに記載のオフターゲットゲノム編集識別法は、初代細胞への改変に基づいている。一般に、改変細胞は、ヌクレアーゼ媒介編集を使用して、それらがゲノム的に編集されるように改変されるか、又はゲノム的に編集されうる。
幾つかの実施態様では、ヌクレアーゼは、特定の核酸配列（すなわち、ヌクレアーゼによって切断される「定まったヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列での切断を最初に方向付けることによって編集を促進し、その後の編集は、非鋳型ベースのＤＮＡ修復、例えば、ヌクレアーゼ切断により誘導される非相同な末端結合ＤＮＡ修復メカニズムから生じるか、又は鋳型ベースの修復、例えば、相同組換えＤＮＡ修復メカニズムから生じる。
【0046】
配列特異的切断を促進するように改変できる様々なヌクレアーゼが当業者に知られており、限定されないが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ファミリーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はその誘導体、及びホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）又はその誘導体が含まれる。特に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集システムなどのＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムを使用できる。ヌクレアーゼ媒介編集、特にＣＲＩＳＰＲ媒介編集については、それが教示する全てについてここに出典明示により援用されるＡｄｌｉ Ｍ（Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｔｏｏｌ ｋｉｔ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８ Ｍａｙ １５；９（１）：１９１１）に更に詳しく検討されている。
【0047】
３．１． 細胞と細胞サンプル
ここに記載の方法は、ゲノムＤＮＡ中のＤＳＢを修復することができる任意の初代細胞において使用することができる。真核細胞における二つの主要ＤＳＢ修復経路は、相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。好ましくは、本方法は、ＮＨＥＪが可能な初代細胞において実施される。ＮＨＥＪ活性を検出するための方法は当該技術分野で知られている；ＮＨＥＪカノニカル及びオルタナティブ経路の概説については、Ｌｉｕ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊｕｎ １，２０１４；４２（１０）：６１０６－６１２７を参照のこと。
ここに記載の方法は、ゲノムＤＮＡ中のＤＳＢを修復することができる任意の初代細胞において使用することができる。真核細胞における二つの主要ＤＳＢ修復経路は、相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。好ましくは、本方法は、ＮＨＥＪが可能な初代細胞において実施される。ＮＨＥＪ活性を検出するための方法は当該技術分野で知られている；ＮＨＥＪカノニカル及びオルタナティブ経路の概説については、Ｌｉｕ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｊｕｎ １，２０１４；４２（１０）：６１０６－６１２７を参照のこと。
【0048】
幾つかの実施態様では、ここに記載の方法は、初代ヒト細胞で使用される。幾つかの実施態様では、初代ヒト細胞は、ウイルス送達系を使用しないで遺伝要素を付加し及び／又は除去するように改変されている。幾つかの実施態様では、改変された細胞は、ウイルス媒介送達成分を実質的に含まない。幾つかの実施態様では、初代ヒト細胞は、改変されたＴ細胞である。幾つかの実施態様では、改変は、外因性ヌクレオチド配列、例えば、ｄｓＯＤＮを含むポリヌクレオチドの初代細胞への送達を含む。
【0049】
幾つかの実施態様では、ここに記載の方法は、限定されないが、血液、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル、骨髄、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）サンプル、組織、固形腫瘍、血液がん、及び液性腫瘍、又はそれらの任意の組み合わせを含む免疫細胞を含む任意の適切な患者由来サンプルからの免疫細胞、例えばＴ細胞及びＢ細胞に対して実施される。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞は、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光抗体を使用してＰＢＭＣ又はＴＩＬから単離でき、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋単一陽性細胞の生細胞集団が、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して選別され、その後の改変／オフターゲット試験のために、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ 細胞のみが単離される。幾つかの実施態様では、ＣＤ４及びＣＤ８の両方に対して陽性であるＴ細胞が、抗ＣＤ３蛍光抗体とそれに続くＦＡＣＳを使用して、その後の改変／オフターゲット試験のために、単離されうる。幾つかの実施態様では、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｐｒｏｄｉｇｙ機器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ）を使用して単離されうる。幾つかの実施態様では、ＣＤ４及びＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８ビーズを備えたＭＡＣカラムを使用して単離されうる。幾つかの実施態様では、サンプルは血液サンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルはＰＢＭＣサンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルは固形腫瘍サンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルは血液腫瘍サンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルは骨髄サンプルである。幾つかの実施態様では、サンプルは、腫瘍浸潤リンパ球を含む腫瘍サンプルである。Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞でありうる。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。幾つかの実施態様では、Ｔ細胞は、ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0050】
所定の実施態様では、ここに開示される方法は、初代細胞で実施される。所定の実施態様では、初代細胞は、細胞であり、不死になるように改変された細胞株ではない細胞である。所定の実施態様では、初代細胞は、生体組織（例えば、血液）から直接単離される。所定の実施態様では、初代細胞は、それらの元の細胞及び分子の特徴を保持しうる。所定の実施態様では、初代細胞は、遺伝子改変された細胞の作製のために使用されうる。例えば、限定されないが、初代細胞は組換えタンパク質を発現するように改変され、細胞治療製品として使用される。所定の実施態様では、初代細胞は幹細胞である。所定の実施態様では、初代細胞は多能性幹細胞である。所定の実施態様では、初代細胞は造血幹細胞である。所定の実施態様では、初代細胞は、末梢ドナーリンパ球である。所定の実施態様では、初代細胞はＴ細胞である。所定の実施態様では、初代細胞はＮＫ細胞である。
【0051】
３．２． 初代細胞改変
ここに記載の改変細胞は、非ウイルス法を使用して改変することができ、例えば、ここに記載のヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、非ウイルス法を使用して細胞に送達されうる。ウイルス媒介送達（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスベースの送達方法）がヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムを送達するために使用されてきたが、ウイルス媒介系はまた免疫原性につながる成分を導入するウイルス系から悪影響を受ける場合がある。例えば、ウイルス媒介送達成分は、ゲノムに組込むことができるウイルス又はウイルス由来のヌクレオチド配列を含みうる。従って、ここに記載の改変細胞は、ウイルス媒介送達成分を実質的に含まない場合がある。「ウイルス媒介送達成分を実質的に含まない」という用語は、関連する全組成物中のウイルス媒介送達成分が検出不可能なレベルにある場合を含む（すなわち、「ここに記載の改変細胞は、ウイルス媒介送達成分を含まない可能性がある」）、関連する全組成物（例えば、細胞又は細胞の集団）中に存在する一又は複数のウイルス媒介送達成分が統計的に有意な量未満であることを意味すると理解される。統計的に有意な量未満とは、ウイルス媒介送達成分が、０．１、０．０５、又は０．０１を超えるｐ値など、関連する組成物中に存在している統計的信頼性を有しているとはみなされない検出レベルを意味しうる。ウイルス媒介送達成分は、ウイルス構造タンパク質（例えば、カプシド、エンベロープ、及び／又は膜融合タンパク質）などのウイルスタンパク質を含みうる。一般に、組込まれたウイルス配列又は導入されたウイルスタンパク質に由来する全てのペプチドは、細胞表面のＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ対立遺伝子によって提示される可能性があり、その後免疫原性につながる場合がある。養子細胞療法などの治療の文脈では、免疫原性は治療効果に悪影響を与える可能性がある。従って、非ウイルス送達法は、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法で使用される細胞を改変し編集するのに有利である場合がある。従って、特定の態様では、改変細胞の表面上のＭＨＣクラスＩは、ウイルス媒介送達成分又は組込みウイルスに由来するペプチドを含まない場合があり、組込みウイルスは、ウイルス媒介送達成分と作用可能に関連している。
ここに記載の改変細胞は、非ウイルス法を使用して改変することができ、例えば、ここに記載のヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、非ウイルス法を使用して細胞に送達されうる。ウイルス媒介送達（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスベースの送達方法）がヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムを送達するために使用されてきたが、ウイルス媒介系はまた免疫原性につながる成分を導入するウイルス系から悪影響を受ける場合がある。例えば、ウイルス媒介送達成分は、ゲノムに組込むことができるウイルス又はウイルス由来のヌクレオチド配列を含みうる。従って、ここに記載の改変細胞は、ウイルス媒介送達成分を実質的に含まない場合がある。「ウイルス媒介送達成分を実質的に含まない」という用語は、関連する全組成物中のウイルス媒介送達成分が検出不可能なレベルにある場合を含む（すなわち、「ここに記載の改変細胞は、ウイルス媒介送達成分を含まない可能性がある」）、関連する全組成物（例えば、細胞又は細胞の集団）中に存在する一又は複数のウイルス媒介送達成分が統計的に有意な量未満であることを意味すると理解される。統計的に有意な量未満とは、ウイルス媒介送達成分が、０．１、０．０５、又は０．０１を超えるｐ値など、関連する組成物中に存在している統計的信頼性を有しているとはみなされない検出レベルを意味しうる。ウイルス媒介送達成分は、ウイルス構造タンパク質（例えば、カプシド、エンベロープ、及び／又は膜融合タンパク質）などのウイルスタンパク質を含みうる。一般に、組込まれたウイルス配列又は導入されたウイルスタンパク質に由来する全てのペプチドは、細胞表面のＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ対立遺伝子によって提示される可能性があり、その後免疫原性につながる場合がある。養子細胞療法などの治療の文脈では、免疫原性は治療効果に悪影響を与える可能性がある。従って、非ウイルス送達法は、養子Ｔ細胞療法などの養子細胞療法で使用される細胞を改変し編集するのに有利である場合がある。従って、特定の態様では、改変細胞の表面上のＭＨＣクラスＩは、ウイルス媒介送達成分又は組込みウイルスに由来するペプチドを含まない場合があり、組込みウイルスは、ウイルス媒介送達成分と作用可能に関連している。
【0052】
一部のＣＲＩＳＰＲ系では、それぞれが一を超える定まったヌクレオチド配列で同じ遺伝子又は一般的ゲノム遺伝子座を個別に標的とするように、一を超えるＣＲＩＳＰＲ組成物が提供されうる。例えば、二つの別個のＣＲＩＳＰＲ組成物を提供して、例えば１０塩基対以下、２０塩基対以下、３０塩基対以下、４０塩基対以下、５０塩基対以下、１００塩基対以下、２００塩基対以下、３００塩基対以下、４００塩基対以下、５００塩基対以下、１０００塩基対以下、２０００塩基対以下、５０００塩基対以下、又は１００００塩基対以下など、互いに所定の距離内にある二つの異なる定まったヌクレオチド配列で切断を方向付けることができる。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、それぞれが同じ遺伝子又は一般的ゲノム遺伝子座の逆ストランドを別個に標的とするように、一を超えるＣＲＩＳＰＲ組成物を提供することができる。例えば、二つの別個のＣＲＩＳＰＲ「ニッカーゼ」組成物を提供して、同じ遺伝子又は一般的ゲノム遺伝子座の逆ストランドでの切断を方向付けることができる。
【0053】
３．２． ヌクレアーゼとリボヌクレアーゼ
本開示は、ヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼの切断プロファイルを評価するための方法を提供する。遺伝子編集は、限定されないが、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）を含む、細胞内で発現されるか又は細胞に送達等される幾つかの異なるヌクレアーゼによって媒介されうる。例えば、Ｇａｊ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｊｕｌ；３１（７）：３９７－４０５を参照のこと。ヌクレアーゼは、当該技術分野で知られている方法を使用して、細胞内で一過性に又は安定して発現されうる；典型的には、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローン化される。適切な真核生物発現系は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４版 ２０１３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ等編，２０１０）に記載されている。真核生物及び原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、上記の参考文献並びにＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９－３５１；Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ及びＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ等編，１９８３）を参照のこと）。
本開示は、ヌクレアーゼ及びリボヌクレアーゼの切断プロファイルを評価するための方法を提供する。遺伝子編集は、限定されないが、１）メガヌクレアーゼ、２）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、３）転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び４）クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）を含む、細胞内で発現されるか又は細胞に送達等される幾つかの異なるヌクレアーゼによって媒介されうる。例えば、Ｇａｊ等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｊｕｌ；３１（７）：３９７－４０５を参照のこと。ヌクレアーゼは、当該技術分野で知られている方法を使用して、細胞内で一過性に又は安定して発現されうる；典型的には、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローン化される。適切な真核生物発現系は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４版 ２０１３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２００６）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ等編，２０１０）に記載されている。真核生物及び原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、上記の参考文献並びにＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９－３５１；Ｃｌａｒｋ－Ｃｕｒｔｉｓｓ及びＣｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７－３６２（Ｗｕ等編，１９８３）を参照のこと）。
【0054】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼなど）である。
【0055】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ＺＦＮヌクレアーゼである。ＺＦＮヌクレアーゼは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって作製される。ジンクフィンガードメインは、特定のＤＮＡ配列を標的とするように改変できる。これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノム内の所望の配列を標的にすることができる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、複数の個別のジンクフィンガーリピートを含み、それぞれが複数の塩基対を認識できる。新しいジンクフィンガードメインを作製する一般的な方法は、既知の特異性のより小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成することによりタンパク質の発現を調節し、これは、相同鋳型がない場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される。このような修復は、塩基対の欠失又は挿入をもたらし、フレームシフトを引き起こし、有害なタンパク質の産生を防止しうる。
【0056】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡの特定の配列を切断するように改変できる制限酵素である。ＴＡＬＥＮ系はＺＦＮと同様の原理で作用する。ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定のヌクレオチドに対して強い認識性を有する二つの可変位置を持つ３３～３４アミノ酸の繰り返しモチーフで構成されている。これらＴＡＬＥのアレイを組み立てることにより、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを、所望のＤＮＡ配列に結合するように改変し、それによってヌクレアーゼをゲノム内の特定の位置で切断するように誘導できる（Ｂｏｃｈ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２９（２）：１３５－６（２０１１））。
【0057】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは１５～４０塩基対の切断部位を認識する。メガヌクレアーゼは、染色体に二重鎖切断を生じさせることにより、宿主ゲノムの特定の位置での相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、これが細胞のＤＮＡ修復機構を補充する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５）。
【0058】
所定の実施態様では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムにおいてゲノム編集ツールとして使用される。ＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）と複合体化されると、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は宿主ＤＮＡの特定の領域を標的にして、単鎖又は二重鎖切断を生成する。ｇＲＮＡは、単分子（単一ＲＮＡ分子を含み、キメラとも呼ばれる）又はモジュラー（一を超え、典型的には二つの別個のＲＮＡ分子、例えばｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み、これは例えば二重鎖によって通常は互いに関連している）でありうる。所定の実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びｇＲＮＡは、細胞への送達のためにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に複合体化され、例えば、エレクトロポレーションによって送達されうる（例えば、ＲＮＰを細胞に送達する追加の方法について、ＤｅＷｉｔｔ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１－１２２：９－１５（２０１７）を参照のこと）。
【0059】
幾つかの実施態様では、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムが使用され、オフターゲット効果が識別される。ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼと、切断を特定の標的配列に方向付けるＲＮＡを含む。例示的なＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集システムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ドメイン及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）ドメインを有するＲＮＡで構成されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。ｃｒＲＮＡは、典型的には、二つのＲＮＡドメイン：塩基対ハイブリダイゼーションを介して標的配列（「定まったヌクレオチド配列」）、例えば、ゲノム配列に特異性を方向付けるガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）；及びｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡドメインを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と相互作用し、それによってゲノム遺伝子座への補充を促進しうる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドでありうる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡポリヌクレオチドは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる単一ポリヌクレオチドでありうる。ここではＣａｓ９システムを例証しているが、Ｃｐｆｌシステムなどの他のＣＲＩＳＰＲシステムを使用することもできる。
【0060】
ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９機能的変異体、例えば、Ｃａｓ９酵素によって典型的に産生される完全な二重鎖切断とは対照的に、定まったヌクレオチド配列の一本鎖のみの切断を一般に媒介するＣａｓ９「ニッカーゼ」変異体などのその誘導体を含みうる。幾つかの実施態様では、ガイドＲＮＡは、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、又はＴＲＢＣ２などのＴ細胞受容体遺伝子を標的とする。
【0061】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ系の成分は互いに相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し、配列特異的な切断を媒介する。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分は別個に産生され、ＲＮＰ複合体を形成するために使用されうる。一部のＣＲＩＳＰＲ系では、各成分はインビトロで別個に産生され、インビトロで相互に接触させて（つまり、「複合体化」されて）ＲＮＰ複合体を形成しうる。次に、インビトロで産生されるＲＮＰは、細胞の細胞質ゾル及び／又は核、例えば、Ｔ細胞の細胞質ゾル及び／又は核内に導入（すなわち、「送達」）されうる。
【0062】
３．２．１． ＲＮＰ複合体
所定の実施態様では、本開示は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を初代細胞に送達する方法を含む。所定の実施態様では、限定されないが、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）をＣａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせることによって得られる。インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、ヌクレアーゼとｇＲＮＡの様々な比率で複合体化されうる。例えば、インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、１：１～１：９の間のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、又は１：９のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比でＣａｓ９タンパク質と複合体化されたｓｇＲＮＡで形成されうる。インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、又は約１：９のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比でＣａｓ９タンパク質と複合体化されたｓｇＲＮＡで形成されうる。
所定の実施態様では、本開示は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を初代細胞に送達する方法を含む。所定の実施態様では、限定されないが、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）をＣａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせることによって得られる。インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、ヌクレアーゼとｇＲＮＡの様々な比率で複合体化されうる。例えば、インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、１：１～１：９の間のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、又は１：９のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比でＣａｓ９タンパク質と複合体化されたｓｇＲＮＡで形成されうる。インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、又は約１：９のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比でＣａｓ９タンパク質と複合体化されたｓｇＲＮＡで形成されうる。
【0063】
インビトロで産生されるＲＮＰ複合体は、またＣＲＩＳＰＲを介した編集システムにおいて様々な量で使用することができる。例えば、編集が望まれる細胞の数に応じて、加えられる全ＲＮＰ量を調整することができ、例えば反応において多数（例えば、５×１０７）の細胞を編集する場合に加えられるＲＮＰ複合体の量を増加させることができる。
【0064】
幾つかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分（例えば、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ）は、ポリヌクレオチドによって別個にコードされ得、各ポリヌクレオチドが細胞に導入される。幾つかのＣＲＩＳＰＲ系では、各成分は単一のポリヌクレオチドによってコードされ（すなわち、マルチプロモーター又はマルチシストロンベクター、以下の例示的なマルチシストロン系の説明を参照）、細胞に導入されうる。細胞内での各ポリヌクレオチドコード化ＣＲＩＳＰＲ成分の発現（例えば、ヌクレアーゼの翻訳及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの転写）に続いて、ＲＮＰ複合体が細胞内で形成され得、その後、部位特異的切断を方向付けうる。一部のＲＮＰは、核内へのＲＮＰの送達を促進する部分を有するように改変されうる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体が細胞の細胞質ゾル内に送達されるならば、又はＣａｓ９の翻訳とそれに続くＲＮＰ形成に続いて、ＮＬＳがＣａｓ９ ＲＮＰの核内への更なる輸送を促進できるように、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを持ちうる。
【0065】
所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、ｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、二以上のｇＲＮＡを含む。例えば、限定しないが、ＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、ＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡとを含む。
【0066】
３．２．２． リボ核タンパク質複合体及びｄｓＯＤＮｓの送達
細胞（限定されないが、例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、ゲノムＤＮＡに二重鎖切断を作製し、そこにＤＮＡコンストラクトを挿入することができるヌクレアーゼを使用することによって達成することができる。しかし、これらのプロセスは、改変された細胞の臨床的使用を損なう場合があるオフターゲット二重鎖切断の生成につながる場合がある。更に、これらのプロセスは、トランスフェクションに不応性であり、ヌクレオチド関連細胞傷害性のため、初代細胞で検出するのは困難である。
細胞（限定されないが、例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変は、ゲノムＤＮＡに二重鎖切断を作製し、そこにＤＮＡコンストラクトを挿入することができるヌクレアーゼを使用することによって達成することができる。しかし、これらのプロセスは、改変された細胞の臨床的使用を損なう場合があるオフターゲット二重鎖切断の生成につながる場合がある。更に、これらのプロセスは、トランスフェクションに不応性であり、ヌクレオチド関連細胞傷害性のため、初代細胞で検出するのは困難である。
【0067】
本開示は、ヌクレアーゼ組成物（例えば、リボ核タンパク質複合体）とヌクレオチド組成物（例えば、ｄｓＯＤＮｓ）を初代細胞に送達することを含む方法を提供する。
遺伝子編集試薬又はコード化ポリヌクレオチド、例えばインビトロで産生されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ｄｓＯＤＮ分子、又はこれらをコードするベクターは、限定されないが、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、リポフェクション、ソノポレーション（超音波処理）、機械的破壊、又はウイルスベクターを含む、既知の適切な方法によって宿主細胞中に挿入されうる。例示的なトランスフェクション試薬には、限定されないが、ＦｅｃｔｏｒＰｒｏ、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、Ｆｕｇｅｎｅ、又は細胞型、トランスフェクション系、トランスフェクション型、トランスフェクション条件、及びトランスフェクトされるコンストラクトに基づいて最適なトランスフェクション速度を提供するその他のトランスフェクション試薬が含まれる。幾つかの例では、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。幾つかの例では、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。幾つかの例では、ＦｅｃｔｏｒＰｒｏを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。
遺伝子編集試薬又はコード化ポリヌクレオチド、例えばインビトロで産生されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ｄｓＯＤＮ分子、又はこれらをコードするベクターは、限定されないが、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、リポフェクション、ソノポレーション（超音波処理）、機械的破壊、又はウイルスベクターを含む、既知の適切な方法によって宿主細胞中に挿入されうる。例示的なトランスフェクション試薬には、限定されないが、ＦｅｃｔｏｒＰｒｏ、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、Ｆｕｇｅｎｅ、又は細胞型、トランスフェクション系、トランスフェクション型、トランスフェクション条件、及びトランスフェクトされるコンストラクトに基づいて最適なトランスフェクション速度を提供するその他のトランスフェクション試薬が含まれる。幾つかの例では、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。幾つかの例では、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。幾つかの例では、ＦｅｃｔｏｒＰｒｏを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする。
【0068】
特定の例では、遺伝子編集試薬は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ／ヌクレオフェクション（Nucleofection）（登録商標）エレクトロポレーションベースの送達系（Ｌｏｎｚａ（登録商標））を使用して細胞に送達することができる。他のエレクトロポレーション系には、限定されないが、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーション系、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳエレクトロポレーション系、Ｎｅｏｎエレクトロポレーション系、及びＢＴＸエレクトロポレーション系が含まれる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、当業者に知られている様々なタンパク質産生技術を使用して、インビトロで産生（すなわち、合成及び精製）することができる。ＣＲＩＳＰＲ系ＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡは、インビトロ転写又は化学合成などの当業者に知られている様々なＲＮＡ産生技術を使用して、インビトロで産生（すなわち、合成及び精製）することができる。
【0069】
ｄｓＯＤＮ又はＲＮＰ複合体成分をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞において一過性に又は安定して発現されうる。幾つかの実施態様では、そのようなポリヌクレオチドは、宿主ゲノムに組み込まれる。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは染色体外に残る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はＴＡＬＥＮヌクレアーゼを含む、ポリヌクレオチドで宿主細胞を改変するために、当該技術分野で知られている任意の適切な遺伝子編集技術をまた用いることができる。
【0070】
所定の実施態様では、ここに開示されるＲＮＰ複合体及び／又はｄｓＯＤＮｓの送達は、ウイルス送達系を使用することによって実施される。所定の実施態様では、ウイルス送達系は、標的化された及び／又は無作為の組込みを含む。所定の実施態様では、ウイルス送達系は、Ｌｅｎｔｉｆｌａｓｈ（登録商標）又は他の同様の送達系でありうる。
【0071】
所定の実施態様では、ここに開示されるＲＮＰ複合体及び／又はｄｓＯＤＮｓの送達は、非ウイルス送達系を使用することによって実施される。例えば、核酸分子は、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって、又はポリリジン結合によって細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス性手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロでのトランスフェクションが含まれる。リポソームはまた、細胞内への核酸の送達のために潜在的に有益でありうる。
【0072】
所定の実施態様では、限定されないが、送達は、エレクトロポレーションを介して起こり、細胞をここに開示されるＲＮＰ複合体及び／又はｄｓＯＤＮｓとキュベット内で混合し、定まった持続時間及び振幅の一又は複数の電気インパルスを加えることを含む。
所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体及び／又はｄｓＯＤＮｓは、ベクター及び非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。
所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体及び／又はｄｓＯＤＮｓは、ベクター及び非ベクターベースの方法の組み合わせによって送達される。
【0073】
所定の実施態様では、本開示は、リボヌクレオチド（ＲＮＰ）複合体を提供する方法を含む。所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲＮＰ複合体中に、約０．５μｇから約１０００μｇ、約５μｇから約１００μｇ、約１０μｇから約１００μｇ、約２５μｇから約１００μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約７５μｇから約１００μｇ、約１μｇから約７５μｇ、約１μｇから約５０μｇ、約１μｇから約２５μｇ、約１μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２０μｇ、約１５μｇから約２０μｇ、約．５μｇから約１０μｇ、約．５μｇから約１μｇ、約１００μｇから約２００μｇ、約２００μｇから約３００μｇ、約３００μｇから約４００μｇ、約４００μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約６００μｇ、約６００μｇから約７００μｇ、約７００μｇから約８００μｇ、約８００μｇから約９００μｇ、又は約９００μｇから約１０００μｇ及びその間の値の量で存在する。
【0074】
所定の実施態様では、ＲＮＰ複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。所定の実施態様では、ｇＲＮＡは、ＲＮＰ複合体中に、約１ｐｍｏｌから約５００００ｐｍｏｌまで、約１ｐｍｏｌから約１００ｐｍｏｌ、約１００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約１０００、約７５０ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約１００ｐｍｏｌから約２５０ｐｍｏｌ、約１００ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌ、約１００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌ、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌ、約２５０ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌ、約２５０ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約６００ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約６５０ｐｍｏｌ、約５５０ｐｍｏｌから約６００ｐｍｏｌ、約５５０ｐｍｏｌから約６５０ｐｍｏｌ、又は約１０００ｐｍｏｌから約５００００ｐｍｏｌ、及びその間の値の量で存在する。
【0075】
所定の実施態様では、本開示は、ｄｓＯＤＮを提供する方法を含む。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、約２００ｐＭから約１０００ｐＭ、約３００ｐＭから約１０００ｐＭ、約４００ｐＭから約１０００ｐＭ、約５００ｐＭから約１０００ｐＭ、約６００ｐＭから約１０００ｐＭ、約８００ｐＭから約１０００ｐＭ、約２００ｐＭから約３００ｐＭ、約２００ｐＭから約４００ｐＭ、約２００ｐＭから約５００ｐＭ、約２００ｐＭから約６００ｐＭ、約２００ｐＭから約８００ｐＭ、約３００ｐＭから約５００ｐＭ、約３００ｐＭから約６００ｐＭ、約３００ｐＭから約８００ｐＭ、約３００ｐＭから約１０００ｐＭ、約４００ｐＭから約５００ｐＭ、約４００ｐＭから約６００ｐＭ、又は約４００ｐＭから約８００ｐＭ、及びその間の値の濃度で提供される。
【0076】
所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、約１ｐｍｏｌから約１０ｎｍｏｌ、約１ｐｍｏｌから約１００ｐｍｏｌ、約１００ｐｍｏｌから約２００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約４００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約５００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約６００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約８００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約３００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約４００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約６００ｐｍｏｌ、約２００ｐｍｏｌから約８００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約６００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約８００ｐｍｏｌ、約３００ｐｍｏｌから約１０００ｐｍｏｌ、約４００ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌ、約４００ｐｍｏｌから約６００ｐｍｏｌ、約４００ｐｍｏｌから約８００ｐｍｏｌ、約１ｎｍｏｌから約２ｎｍｏｌ、約２ｎｍｏｌから約３ｎｍｏｌ、約３ｎｍｏｌから約５ｎｍｏｌ、又は約５ｎｍｏｌから約１０ｎｍｏｌ、及びその間の値の量で提供される。
【0077】
所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、約１μｇから約１００μｇ、約５μｇから約１００μｇ、約１０μｇから約１００μｇ、約２０μｇから約１００μｇ、約３０μｇから約１００μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約７５μｇから約１００μｇ、約１μｇから約７５μｇ、約１μｇから約５０μｇ、約１μｇから約３０μｇ、約１μｇから約２０μｇ、約１μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２０μｇ、約１５μｇから約２０μｇ、又は約１５μｇから約３０μｇ、及びその間の値の量で提供される。
【0078】
所定の非限定的な実施態様では、本開示は、リボヌクレオチド（ＲＮＰ）複合体及びｄｓＯＤＮを、ここに開示される量及び濃度の何れかで初代細胞に提供する方法を含む。例えば、限定されないが、ここに開示される方法は、約１：５から１：７の比率のＲＮＰ複合体を提供し、ここで、ＲＮＰ複合体は、約１０μｇから約２０μｇの量のＣａｓ９ヌクレアーゼ及び約５００ｐｍｏｌから約６５０ｐｍｏｌの量のｇＲＮＡ；並びに約４００ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの濃度のｄｓＯＤＮを含む。所定の非限定的な実施態様では、ここに開示される方法は、約１：５から１：７の比率のＲＮＰ複合体を提供し、ここで、ＲＮＰ複合体は、約１０μｇから約２０μｇの量のＣａｓ９ヌクレアーゼ及び約５００ｐｍｏｌから約６５０ｐｍｏｌの量のｇＲＮＡ；並びに約１５μｇから約３０μｇの量のｄｓＯＤＮを含む。
【0079】
４． 組成物とベクター
所定の実施態様では、本開示は、ここに開示される方法を実施するために使用される組成物を提供する。
所定の実施態様では、本開示は、「ヌクレオチド組成物」を提供する。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、ここに開示されるｄｓＯＤＮを含む。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、配列番号：１－２に示されるヌクレオチド配列を含む配列を有する。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド及び遺伝子座の遺伝子破壊のためのｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、遺伝子座はＴＲＡＣである。所定の実施態様では、遺伝子座はＴＲＢＣである。また提供されるのは、そのようなヌクレオチド組成物を含む細胞である。
所定の実施態様では、本開示は、ここに開示される方法を実施するために使用される組成物を提供する。
所定の実施態様では、本開示は、「ヌクレオチド組成物」を提供する。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、ここに開示されるｄｓＯＤＮを含む。所定の実施態様では、ｄｓＯＤＮは、配列番号：１－２に示されるヌクレオチド配列を含む配列を有する。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。所定の実施態様では、ヌクレオチド組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド及び遺伝子座の遺伝子破壊のためのｇＲＮＡを含む。所定の実施態様では、遺伝子座はＴＲＡＣである。所定の実施態様では、遺伝子座はＴＲＢＣである。また提供されるのは、そのようなヌクレオチド組成物を含む細胞である。
【0080】
所定の実施態様では、本開示は、ヌクレアーゼ組成物を提供する。「ヌクレアーゼ組成物」は、ヌクレアーゼタンパク質又はポリヌクレオチドを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、天然に生じるヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、組換えヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、ヌクレアーゼ組成物は、アクセサリー分子を含む。例えば、限定されないが、ヌクレアーゼ組成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びゲノム遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを含む。ヌクレアーゼ組成物に包含されるヌクレアーゼに関する追加情報は、本開示のセクション３．２に開示されている。
【0081】
ヌクレアーゼ組成物及びヌクレオチド組成物は、ここに記載の方法によって細胞に送達することができる。ヌクレアーゼ組成物及び／又はヌクレオチド組成物を送達するために使用される方法の例は、本開示のセクション３．２．２に記載されている。
【0082】
５． キット
本開示の主題は、ここに開示される方法を実施するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットはｄｓＯＤＮを含む。所定の実施態様では、キットはヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、キットはヌクレアーゼ組成物を含む。所定の実施態様では、キットは、ここに開示される核酸を含む。所定の実施態様では、キットはヌクレオチド組成物を含む。所定の実施態様では、キットは、アダプター；末端修復及び／又はライゲーション用の試薬及び／又は酵素；エキソヌクレアーゼ；エンドヌクレアーゼ；及び／又はここに記載の方法で使用するための説明書を含む。
本開示の主題は、ここに開示される方法を実施するためのキットを提供する。所定の実施態様では、キットはｄｓＯＤＮを含む。所定の実施態様では、キットはヌクレアーゼを含む。所定の実施態様では、キットはヌクレアーゼ組成物を含む。所定の実施態様では、キットは、ここに開示される核酸を含む。所定の実施態様では、キットはヌクレオチド組成物を含む。所定の実施態様では、キットは、アダプター；末端修復及び／又はライゲーション用の試薬及び／又は酵素；エキソヌクレアーゼ；エンドヌクレアーゼ；及び／又はここに記載の方法で使用するための説明書を含む。
【0083】
所望される場合、キットは、ここに開示された方法を実施するための説明書と共に提供される。所定の実施態様では、説明書は、次のうちの少なくとも一つを含む：ｄｓＯＤＮの説明書；使用マニュアル；技術プロトコル；及び／又はリファレンス。説明書は別個のシートとして印刷してもよく、又は電子的手段で利用可能とすることもできる。
【0084】
６． 例示的な実施態様
Ａ． 所定の非限定的な実施態様では、本開示は、初代細胞のゲノムＤＮＡにおける二重鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、初代細胞のゲノムＤＮＡにおいて二重鎖切断を誘導することができるヌクレアーゼ組成物を提供する工程；平滑末端二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含むヌクレオチド組成物を提供する工程であって、ｄｓＯＤＮが、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される工程；細胞のゲノムＤＮＡにＤＳＢを誘導し、ＤＳＢを修復し、一又は複数のＤＳＢにｄｓＯＤＮを組込むのに十分な時間、初代細胞をインキュベートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程；及びゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンシングする工程を含み、それによって初代細胞のゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを検出する、方法を提供する。
Ａ１． ｄｓＯＤＮが、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される、Ａの前述の方法。
Ａ２． ｄｓＯＤＮの両方の鎖が、細胞のゲノムに直交している、Ａ又はＡ１の前述の方法。
Ａ３． ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されている、Ａ－Ａ２の前述の方法。
Ａ４． ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端にホスホロチオエート結合を含む、Ａ－Ａ３の前述の方法。
Ａ５． ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端及び両方の５’末端にホスホロチオエート結合を含む、Ａ－Ａ４の前述の方法。
Ａ６． ｄｓＯＤＮが、約１５から約５０ヌクレオチド長である、Ａ－Ａ７の前述の方法。
Ａ７． ゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程が、ゲノムＤＮＡを断片化する工程；断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮに相補的な第一プライマーとユニバーサルアダプターに相補的な第二プライマーを用いて、ライゲートされたＤＮＡに対して第一ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程；及び３’ネステッドプライマーであり、第一プライマーに相補的である第三プライマー、３’ネステッドプライマーであり、第二プライマーに相補的である第四プライマー、及び第四プライマーに相補的である第五プライマーを使用して第二ラウンドのＰＣＲを実施する工程を含む、Ａ－Ａ６の前述の方法。
Ａ８． 第五プライマーが、精製配列、結合配列、識別配列、又はそれらの組み合わせである、Ａ７の前述の方法。
Ａ９． ヌクレアーゼ組成物が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、Ａ－Ａ８の前述の方法。
Ａ１０． ヌクレアーゼ組成物が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、Ａ－Ａ９の前述の方法。
Ａ１１． ＲＮＰ複合体が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、Ａ１０の前述の方法。
Ａ１２． Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：４から約１：７である、Ａ１１の前述の方法。
Ａ１３． Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：６である、Ａ１２の前述の方法。
Ａ１４． Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１５μｇから約３０μｇの範囲の量である、Ａ１０－Ａ１３の前述の方法。
Ａ１５． Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１６μｇの量である、Ａ１４の前述の方法。
Ａ１６． ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約５００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌの範囲の量である、Ａ１１－Ａ１５の前述の方法。
Ａ１７． ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約６００ｐｍｏｌの量である、Ａ１６の前述の方法。
Ａ１８． ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１７の前述の方法。
Ａ１９． ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１８の前述の方法。
Ａ２０． ガイドＲＮＡが、ＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１９の前述の方法。
Ａ２１． ＤＳＢがオフターゲットＤＳＢである、Ａ－Ａ２０の前述の方法。
Ａ２２． ｄｓＯＤＮが、ＤＮＡバーコードを含む、Ａ－Ａ２１の前述の方法。
Ａ２３． ＤＮＡバーコードがランダム化される、Ａ２２の前述の方法。
Ａ２４． ｄｓＯＤＮが、配列番号：１及び配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含む、Ａ－Ａ２３の前述の方法。
Ａ２５． ヌクレアーゼ組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、Ａ－Ａ２４の前述の方法。
Ａ２６． ヌクレアーゼ組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、Ａ２５の前述の方法。
Ａ２７． ヌクレオチド組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、Ａ－Ａ２６の前述の方法。
Ａ２８． ヌクレオチド組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、Ａ２７の前述の方法。
Ａ２９． 初代細胞が哺乳動物細胞である、Ａ－Ａ２８の前述の方法。
Ａ３０． 初代細胞がヒト細胞である、Ａ－Ａ２９の前述の方法。
Ａ３１． ヒト細胞が造血幹細胞である、Ａ３０の前述の方法。
Ａ３２． ヒト細胞がＴ細胞である、Ａ３１の前述の方法。
Ａ３３． Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞である、Ａ３２の前述の方法。
Ａ３４． Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞である、Ａ３２又はＡ３３の前述の方法。
Ａ３５． ヒト細胞がＮＫ細胞である、Ａ３０の前述の方法。
Ａ３６． 初代細胞が対象から得られる、Ａ－Ａ３５の前述の方法。
Ａ３７． 対象がヒトである、Ａ３６の前述の方法。
Ａ． 所定の非限定的な実施態様では、本開示は、初代細胞のゲノムＤＮＡにおける二重鎖切断（ＤＳＢ）を検出するための方法であって、初代細胞のゲノムＤＮＡにおいて二重鎖切断を誘導することができるヌクレアーゼ組成物を提供する工程；平滑末端二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含むヌクレオチド組成物を提供する工程であって、ｄｓＯＤＮが、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される工程；細胞のゲノムＤＮＡにＤＳＢを誘導し、ＤＳＢを修復し、一又は複数のＤＳＢにｄｓＯＤＮを組込むのに十分な時間、初代細胞をインキュベートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮを含むゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程；及びゲノムＤＮＡの増幅された部分をシークエンシングする工程を含み、それによって初代細胞のゲノムＤＮＡにおけるＤＳＢを検出する、方法を提供する。
Ａ１． ｄｓＯＤＮが、約２５０ｐｍｏｌから約５００ｐｍｏｌの範囲の量で提供される、Ａの前述の方法。
Ａ２． ｄｓＯＤＮの両方の鎖が、細胞のゲノムに直交している、Ａ又はＡ１の前述の方法。
Ａ３． ｄｓＯＤＮの５’末端がリン酸化されている、Ａ－Ａ２の前述の方法。
Ａ４． ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端にホスホロチオエート結合を含む、Ａ－Ａ３の前述の方法。
Ａ５． ｄｓＯＤＮが、両方の３’末端及び両方の５’末端にホスホロチオエート結合を含む、Ａ－Ａ４の前述の方法。
Ａ６． ｄｓＯＤＮが、約１５から約５０ヌクレオチド長である、Ａ－Ａ７の前述の方法。
Ａ７． ゲノムＤＮＡの一部を増幅する工程が、ゲノムＤＮＡを断片化する工程；断片化されたゲノムＤＮＡの末端をユニバーサルアダプターでライゲートする工程；組込まれたｄｓＯＤＮに相補的な第一プライマーとユニバーサルアダプターに相補的な第二プライマーを用いて、ライゲートされたＤＮＡに対して第一ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する工程；及び３’ネステッドプライマーであり、第一プライマーに相補的である第三プライマー、３’ネステッドプライマーであり、第二プライマーに相補的である第四プライマー、及び第四プライマーに相補的である第五プライマーを使用して第二ラウンドのＰＣＲを実施する工程を含む、Ａ－Ａ６の前述の方法。
Ａ８． 第五プライマーが、精製配列、結合配列、識別配列、又はそれらの組み合わせである、Ａ７の前述の方法。
Ａ９． ヌクレアーゼ組成物が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼを含む、Ａ－Ａ８の前述の方法。
Ａ１０． ヌクレアーゼ組成物が、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、Ａ－Ａ９の前述の方法。
Ａ１１． ＲＮＰ複合体が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、Ａ１０の前述の方法。
Ａ１２． Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：４から約１：７である、Ａ１１の前述の方法。
Ａ１３． Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡのモル比が、約１：６である、Ａ１２の前述の方法。
Ａ１４． Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１５μｇから約３０μｇの範囲の量である、Ａ１０－Ａ１３の前述の方法。
Ａ１５． Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ＲＮＰ複合体当たり約１６μｇの量である、Ａ１４の前述の方法。
Ａ１６． ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約５００ｐｍｏｌから約７５０ｐｍｏｌの範囲の量である、Ａ１１－Ａ１５の前述の方法。
Ａ１７． ｇＲＮＡが、ＲＮＰ複合体当たり約６００ｐｍｏｌの量である、Ａ１６の前述の方法。
Ａ１８． ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１７の前述の方法。
Ａ１９． ヌクレアーゼ組成物が、ＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１８の前述の方法。
Ａ２０． ガイドＲＮＡが、ＴＲＡＣ遺伝子座及び／又はＴＲＢＣ遺伝子座を標的とする、Ａ－Ａ１９の前述の方法。
Ａ２１． ＤＳＢがオフターゲットＤＳＢである、Ａ－Ａ２０の前述の方法。
Ａ２２． ｄｓＯＤＮが、ＤＮＡバーコードを含む、Ａ－Ａ２１の前述の方法。
Ａ２３． ＤＮＡバーコードがランダム化される、Ａ２２の前述の方法。
Ａ２４． ｄｓＯＤＮが、配列番号：１及び配列番号：２に示されるヌクレオチド配列を含む、Ａ－Ａ２３の前述の方法。
Ａ２５． ヌクレアーゼ組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、Ａ－Ａ２４の前述の方法。
Ａ２６． ヌクレアーゼ組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、Ａ２５の前述の方法。
Ａ２７． ヌクレオチド組成物が、非ウイルス送達系によって送達される、Ａ－Ａ２６の前述の方法。
Ａ２８． ヌクレオチド組成物が、エレクトロポレーションによって送達される、Ａ２７の前述の方法。
Ａ２９． 初代細胞が哺乳動物細胞である、Ａ－Ａ２８の前述の方法。
Ａ３０． 初代細胞がヒト細胞である、Ａ－Ａ２９の前述の方法。
Ａ３１． ヒト細胞が造血幹細胞である、Ａ３０の前述の方法。
Ａ３２． ヒト細胞がＴ細胞である、Ａ３１の前述の方法。
Ａ３３． Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞である、Ａ３２の前述の方法。
Ａ３４． Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞である、Ａ３２又はＡ３３の前述の方法。
Ａ３５． ヒト細胞がＮＫ細胞である、Ａ３０の前述の方法。
Ａ３６． 初代細胞が対象から得られる、Ａ－Ａ３５の前述の方法。
Ａ３７． 対象がヒトである、Ａ３６の前述の方法。
【実施例】
【0085】
次は、本開示の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様を実施できることが理解される。
【0086】
実施例１ 初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ
初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、以下に説明するように、初代Ｔ細胞用に変更された培養及びヌクレオフェクション条件で、公開されているプロトコル（例えば、出典明示によりその全体が援用されるＴｓａｉ等，２０１５及びＰＣＴ公開第２０１５／２００３７８号、「シークエンシングによって評価されるＤＳＢＳのゲノムワイドな偏りのない識別（Genome-wide, Unbiased Identification of Doublestranded breaks Enabled by Sequencing）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）」を参照のこと）に従ってＴＲＡＣ及びＴＲＢＣガイドＲＮＡを使用して単離ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について実施した。
初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、以下に説明するように、初代Ｔ細胞用に変更された培養及びヌクレオフェクション条件で、公開されているプロトコル（例えば、出典明示によりその全体が援用されるＴｓａｉ等，２０１５及びＰＣＴ公開第２０１５／２００３７８号、「シークエンシングによって評価されるＤＳＢＳのゲノムワイドな偏りのない識別（Genome-wide, Unbiased Identification of Doublestranded breaks Enabled by Sequencing）（ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ）」を参照のこと）に従ってＴＲＡＣ及びＴＲＢＣガイドＲＮＡを使用して単離ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について実施した。
【0087】
［細胞培養とヌクレオフェクション］
健康なドナーのｌｅｕｋｏｐａｋから元々得られたＣＤ４及びＣＤ８に富むＴ細胞を、製造元の説明書に従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ分離カラムで単離した。
二重鎖切断（ＤＳＢ）部位をマークするために使用した二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）は、特注合成されアニーリングされた鎖として購入した。次のｄｓＯＤＮ配列を使用したが、ここで、Ｐは５’リン酸化を表し、＊はホスホロチオエート結合を示す：
５’ Ｐ－Ｇ＊Ｔ＊ＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴ＊Ａ＊Ｔ ３’（配列番号：１）
３’ Ｃ＊Ａ＊ＡＡＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡ＊Ｔ＊Ａ－Ｐ ５’（配列番号：２）
健康なドナーのｌｅｕｋｏｐａｋから元々得られたＣＤ４及びＣＤ８に富むＴ細胞を、製造元の説明書に従って、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙ又はＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ分離カラムで単離した。
二重鎖切断（ＤＳＢ）部位をマークするために使用した二重鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）は、特注合成されアニーリングされた鎖として購入した。次のｄｓＯＤＮ配列を使用したが、ここで、Ｐは５’リン酸化を表し、＊はホスホロチオエート結合を示す：
５’ Ｐ－Ｇ＊Ｔ＊ＴＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡＣＧＧＴ＊Ａ＊Ｔ ３’（配列番号：１）
３’ Ｃ＊Ａ＊ＡＡＴＴＡＡＣＴＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＣＡ＊Ｔ＊Ａ－Ｐ ５’（配列番号：２）
【0088】
エレクトロポレーションを、１００μＬのキュベット中、Ｌｏｎｚａ ４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ－ユニットで実施した。各エレクトロポレーションでは、５Ｅ６ Ｔ細胞、１０μｇのｄｓＯＤＮ、及び１：６のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比で複合体を形成したＣａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を使用した。ついで、細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含む培養培地で増殖させた。ヌクレオフェクションの７２時間後に細胞を収集し、製造元の標準プロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を使用してゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。単離したゲノムＤＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して定量した。
【0089】
［ｄｓＯＤＮ組込みの制限断片長多型（ＲＦＬＰ）確認］
単離されたゲノムＤＮＡにおけるＴＲＡＣ（Ｔ細胞受容体アルファ定常）、ＴＲＢＣ１（Ｔ細胞受容体ベータ定常１）、及びＴＲＢＣ２（Ｔ細胞受容体アルファ定常２）部位を、以下の表のプライマーと共にＰＣＲを使用して増幅させた。
単離されたゲノムＤＮＡにおけるＴＲＡＣ（Ｔ細胞受容体アルファ定常）、ＴＲＢＣ１（Ｔ細胞受容体ベータ定常１）、及びＴＲＢＣ２（Ｔ細胞受容体アルファ定常２）部位を、以下の表のプライマーと共にＰＣＲを使用して増幅させた。
【0090】
次の温度サイクリング条件：９５℃で１２０秒間、７サイクル（９５℃で２０秒間、６８℃で１０秒間（－１℃／サイクル）；７０℃で１５秒間）、２６サイクル（９５℃で２０秒間、６０℃で１０秒間、７０℃で１５秒間）７０℃で５分間、４℃でサンプルが除去されるまでで、ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔマスターミックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）と共に１００ｎｇのｇＤＮＡを使用して、各部位を増幅させた。
【0091】
アンプリコンのサイズを２％のアガロースゲルで確認し、正しいサイズのアンプリコンを、ＺＲ－９６ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。２００ｎｇの各アンプリコンを５Ｕ ＮｄｅＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で２０μｌの反応において３７℃で＞２時間消化し、消化産物を２％のアガロースゲルで分析した（例えば、図１を参照）。モックのエレクトロポレーションＴ細胞ＤＮＡを使用して作製したアンプリコンを陰性対照として使用した。ＮｄｅＩ制限部位を自然に含むアンプリコンを、ＮｄｅＩ切断の陽性対照として使用した。
【0092】
［ＤＮＡプロセシングとシークエンシング］
各ＤＮＡサンプルの３つのアリコート（１アリコート当たり９００ｎｇ）をＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０で剪断し、一部をゲルで分析した。平均断片サイズが５００ｂｐに近い各サンプルのアリコートをプールし、末端を修復し、Ａテールを付け、Ｙアダプターをライゲートした。ｄｓＯＤＮ組込み部位ＰＣＲの第一ラウンドを、トランスフェクション中に使用したｄｓＯＤＮタグに特異的なプライマー（＋及び－ストランドＧＳＰ１）とＰ５プライマーを使用して、センス及びアンチセンス鎖について実施した。ｄｓＯＤＮ組込み部位ＰＣＲの第二ラウンドを、ｄｓＯＤＮのためのネステッドプライマー（＋及び－ストランドＧＳＰ２）とＰ５プライマーを用いて実施した。サンプルを、１×ビーズ（ＧＥ，Ｓｅｒａ－Ｍａｇ Ｓｅｌｅｃｔ）を使用して精製し濃縮した。最終ライブラリーの定量化を、Ｑｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。ＴＲＡＣ＋タグセンス／アンチセンス及びＴＲＢＣ＋タグセンス／アンチセンスの両方の複製物のライブラリーを等モル濃度で混合し、５００サイクルバージョン２ Ｉｌｌｕｍｉｎａキットにロードし、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実行した。ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣサンプルを、別々のＭｉＳｅｑランでシークエンシングした。
各ＤＮＡサンプルの３つのアリコート（１アリコート当たり９００ｎｇ）をＣｏｖａｒｉｓ Ｍ２２０で剪断し、一部をゲルで分析した。平均断片サイズが５００ｂｐに近い各サンプルのアリコートをプールし、末端を修復し、Ａテールを付け、Ｙアダプターをライゲートした。ｄｓＯＤＮ組込み部位ＰＣＲの第一ラウンドを、トランスフェクション中に使用したｄｓＯＤＮタグに特異的なプライマー（＋及び－ストランドＧＳＰ１）とＰ５プライマーを使用して、センス及びアンチセンス鎖について実施した。ｄｓＯＤＮ組込み部位ＰＣＲの第二ラウンドを、ｄｓＯＤＮのためのネステッドプライマー（＋及び－ストランドＧＳＰ２）とＰ５プライマーを用いて実施した。サンプルを、１×ビーズ（ＧＥ，Ｓｅｒａ－Ｍａｇ Ｓｅｌｅｃｔ）を使用して精製し濃縮した。最終ライブラリーの定量化を、Ｑｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。ＴＲＡＣ＋タグセンス／アンチセンス及びＴＲＢＣ＋タグセンス／アンチセンスの両方の複製物のライブラリーを等モル濃度で混合し、５００サイクルバージョン２ Ｉｌｌｕｍｉｎａキットにロードし、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実行した。ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣサンプルを、別々のＭｉＳｅｑランでシークエンシングした。
【0093】
［データ解析］
ＭｉＳｅｑリードを、公開されたスクリプト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｒｙｅｅｌａｂ／ｇｕｉｄｅｓｅｑ）を使用して解析した。このスクリプトは、ＦＡＳＴＱファイルからリードを取り、Ｐ５プライマーの固有の分子識別子（ＵＭＩ）を使用してＰＣＲ複製物を除去する。次に、リードをゲノムにアラインし、リードパイルアップを使用して潜在的なオフターゲット部位を呼び出す。潜在的な部位を、ペナルティ関数を使用して更にフィルタリングして擬陽性を除去し、フィルタリング後に残った部位を、ゲノムアノテーションと共に出力する。スクリプトは標準オプションを使用して実行したが、但し、ガイド鎖配列と比較してミスマッチがある部位にＣＲＩＳＰＲオフターゲット切断が観察されたため、ミスマッチのペナルティを通常の１００ではなく１０に設定した（Ｌｉｎ等 ２０１４）。
ＭｉＳｅｑリードを、公開されたスクリプト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ａｒｙｅｅｌａｂ／ｇｕｉｄｅｓｅｑ）を使用して解析した。このスクリプトは、ＦＡＳＴＱファイルからリードを取り、Ｐ５プライマーの固有の分子識別子（ＵＭＩ）を使用してＰＣＲ複製物を除去する。次に、リードをゲノムにアラインし、リードパイルアップを使用して潜在的なオフターゲット部位を呼び出す。潜在的な部位を、ペナルティ関数を使用して更にフィルタリングして擬陽性を除去し、フィルタリング後に残った部位を、ゲノムアノテーションと共に出力する。スクリプトは標準オプションを使用して実行したが、但し、ガイド鎖配列と比較してミスマッチがある部位にＣＲＩＳＰＲオフターゲット切断が観察されたため、ミスマッチのペナルティを通常の１００ではなく１０に設定した（Ｌｉｎ等 ２０１４）。
【0094】
［結果］
エレクトロポレーション混合物において使用されるｄｓＯＤＮの濃度を、次のように最適化した：最初にＴ細胞を、ｄｓＯＤＮの３通りの量（反応当たり５、１０、及び２０μｇ）を使用してエレクトロポレーションした。ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ Ｃａｓ９ＲＮＰのエレクトロポレーションを別々に実施した。ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、及びＴＲＢＣ２部位は、上に「ｄｓＯＤＮ組込みのＲＦＬＰ確認」で記載したようにして増幅した。アンプリコンを、５ＵのＮｄｅＩ制限酵素を使用して消化し、消化産物を２％のアガロースゲルで分析した。モックでエレクトロポレーションしたＴ細胞ＤＮＡを陰性対照として使用した。ＮｄｅＩ制限部位を含む陽性対照をまた使用した。図１と表２は、この初期最適化の結果を示している。
エレクトロポレーション混合物において使用されるｄｓＯＤＮの濃度を、次のように最適化した：最初にＴ細胞を、ｄｓＯＤＮの３通りの量（反応当たり５、１０、及び２０μｇ）を使用してエレクトロポレーションした。ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ Ｃａｓ９ＲＮＰのエレクトロポレーションを別々に実施した。ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、及びＴＲＢＣ２部位は、上に「ｄｓＯＤＮ組込みのＲＦＬＰ確認」で記載したようにして増幅した。アンプリコンを、５ＵのＮｄｅＩ制限酵素を使用して消化し、消化産物を２％のアガロースゲルで分析した。モックでエレクトロポレーションしたＴ細胞ＤＮＡを陰性対照として使用した。ＮｄｅＩ制限部位を含む陽性対照をまた使用した。図１と表２は、この初期最適化の結果を示している。
【0095】
表２と図１に示されるように、より多量のｄｓＯＤＮを使用すると切断効率が劇的に低下し（１０μｇのｄｓＯＤＮから２０μｇのｄｓＯＤＮへの減少を参照）、１０μｇのｄｓＯＤＮと５μｇのｄｓＯＤＮの間の平均切断効率に殆ど差異はない。従って、ｄｓＯＤＮ組込みシグナルの大部分をキャプチャするために、以降の全ての実験では、エレクトロポレーション当たり１０μｇの単一量でｄｓＯＤＮを使用した。
【0096】
潜在的に細胞型に関連するＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位を識別するために、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、改変Ｔ細胞の製造に使用されるｓｇＲＮＡで作製されたＣａｓ９ ＲＮＰでエレクトロポレーションした初代ヒトＴ細胞を使用して、実施した。二つのヒトドナーサンプルからのＴ細胞に、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９ＲＮＰとＴＲＢＣ ｓｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９ＲＮＰの両方で同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションと分析を、両方の研究で反復エレクトロポレーション実験のために実施した；生物学的複製物の使用により、測定感度とノイズの更なる評価が可能になった。
【0097】
予想された通り、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑのリードカウントが最も多い部位は、オンターゲットＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ部位であった（例えば、表３を参照）。各オンターゲット遺伝子座でのｄｓＯＤＮタグの組込みは、制限断片長多型分析（ＲＦＬＰ）によって直交性であることがまた確認された。従って、初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ手順は、Ｔ細胞ゲノム内の二重鎖切断部位の部位にｄｓＯＤＮｓを成功裏に組込む。Ｕ２ＯＳ細胞を使用したＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑの結果と同様に、初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑは、ＴＲＡＣガイドＲＮＡに由来する如何なるオフターゲット部位も識別しなかった（表３）。
【0098】
実施例２ 初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ細胞培養及びトランスフェクション
初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、表４に示した「新ＰＡＣＴ法」という表題の方法を示して、単離ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について実施した。
初代Ｔ細胞ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを、表４に示した「新ＰＡＣＴ法」という表題の方法を示して、単離ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について実施した。
【0099】
表４に示されるように、初代細胞に使用される新トランスフェクション条件と比較して、非初代細胞株で使用される既知のＧｕｉｄｅ－Ｓｅｑ法に使用されるｄｓＯＤＮとガイドＲＮＡには顕著な違いがある。更に、Ｃａｓ９の発現は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を使用して初代細胞で達成されたが、プラスミドの発現は非初代細胞株では十分であった。これらの差異は、初代細胞でＧｕｉｄｅ－Ｓｅｑ法を如何に使用するかを発見するための鍵であることが証明された。
表４に示された実験では例示的な目的のために特定の培地を使用したが、初代細胞の培養のための任意の培地を、当業者によって知られているものに基づいて使用することができる。
表４に示された実験では例示的な目的のために特定の培地を使用したが、初代細胞の培養のための任意の培地を、当業者によって知られているものに基づいて使用することができる。
【0100】
更に、表５に示されるように、ヌクレオフェクションを使用して初代細胞をトランスフェクトしたところ、前述のように、ヌクレオフェクションを使用したときに初代細胞に使用された新トランスフェクション条件と比較して、非初代細胞株で使用された既知のＧｕｉｄｅ－Ｓｅｑ法に使用されたｄｓＯＤＮとＧｕｉｄｅＲＮＡには顕著な違いがあった。
表５に示された実験では例示的な目的のために特定の培地を使用したが、初代Ｔ細胞の培養のための任意の培地を、当業者によって知られているものに基づいて使用することができる。
従って、Ｇｕｉｄｅ－Ｓｅｑのために細胞をトランスフェクトするためのＰＡＣＴ法は初代Ｔ細胞に対して成功することが示された。
従って、Ｇｕｉｄｅ－Ｓｅｑのために細胞をトランスフェクトするためのＰＡＣＴ法は初代Ｔ細胞に対して成功することが示された。
【0101】
［参考文献］
Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．等（２０１４）‘ＣＯＳＭＩＤ：Ａ Ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ．’，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ ＆ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，３（１２），ｐ．ｅ２１４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．６４。
Ｋｉｍ，Ｄ．及びＫｉｍ，Ｊ．－Ｓ．（２０１８）‘ＤＩＧ－ｓｅｑ：ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ＤＮＡ．’，Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２８（１２），ｐｐ．１８９４－１９００．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２３６６２０．１１８。
Ｌｉｎ，Ｙ．等（２０１４）‘ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，４２（１１），ｐ．７４７３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ＮＡＲ／ＧＫＵ４０２。
Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．等（２０１５）‘ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ’，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ．Ａｌｌ Ｒｉｇｈｔｓ Ｒｅｓｅｒｖｅｄ．，３３（２），ｐｐ．１８７－１９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１１７。
Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．等（２０１４）‘ＣＯＳＭＩＤ：Ａ Ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ．’，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ ＆ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，３（１２），ｐ．ｅ２１４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．６４。
Ｋｉｍ，Ｄ．及びＫｉｍ，Ｊ．－Ｓ．（２０１８）‘ＤＩＧ－ｓｅｑ：ａ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ＤＮＡ．’，Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２８（１２），ｐｐ．１８９４－１９００．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２３６６２０．１１８。
Ｌｉｎ，Ｙ．等（２０１４）‘ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ’，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，４２（１１），ｐ．７４７３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ＮＡＲ／ＧＫＵ４０２。
Ｔｓａｉ，Ｓ．Ｑ．等（２０１５）‘ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ’，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，ａ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ．Ａｌｌ Ｒｉｇｈｔｓ Ｒｅｓｅｒｖｅｄ．，３３（２），ｐｐ．１８７－１９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１１７。
【0102】
［他の実施態様］
本発明は、好ましい実施態様と様々な代替の実施態様を参照して特に示され、説明されたが、関連技術の当業者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その中で形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。
本発明は、好ましい実施態様と様々な代替の実施態様を参照して特に示され、説明されたが、関連技術の当業者には、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、その中で形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。
【0103】
本明細書の本文内に引用された全ての参考文献、発行された特許及び特許出願は、あらゆる目的のために、出典明示によりその全体がここに援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】