▶ アエグリア バイオセラピューティクス， インク．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-28
(54)【発明の名称】ヒト組換えアルギナーゼ１の製造方法およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/78 20060101AFI20221021BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20221021BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20221021BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20221021BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20221021BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20221021BHJP
C12N 15/55 20060101ALN20221021BHJP
【ＦＩ】
C12N9/78 ZNA
A61K47/60
A61K47/04
A61K47/10
A61P3/00
A61K38/48
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513535
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(85)【翻訳文提出日】2022-04-20
(86)【国際出願番号】 US2020048536
(87)【国際公開番号】W WO2021041904
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】62/894,319
(32)【優先日】2019-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522074534
【氏名又は名称】アエグリア バイオセラピューティクス， インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ローリンソン， スコット ダブリュ．
【テーマコード（参考）】
4B050
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD11
4B050EE10
4B050FF01C
4B050FF11C
4B050GG03
4B050KK01
4B050LL01
4C076AA95
4C076BB13
4C076BB16
4C076CC21
4C076CC29
4C076DD23
4C076DD26
4C076DD38
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084DC02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZC021
4C084ZC022
4C084ZC211
4C084ZC212
(57)【要約】
ＰＥＧ化されたコバルト置換組換えヒトアルギナーゼ１などの組換えアルギナーゼを産生するための方法が記載される。また、そのような組換えアルギナーゼを含む医薬組成物、ならびに治療方法およびそのような組換えアルギナーゼの使用方法も記載されている。
【選択図】図１５
【選択図】図１５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
精製された組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼを産生するための方法であって、前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、
ａ．バイオリアクター内で、ｒｈＡＲＧを産生するＥ．Ｃｏｌｉ細胞を培養することと、
ｂ．前記Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を溶解することと、
ｃ．溶解物から細胞破片を除去することと、
ｄ．前記細胞溶解物を陽イオン交換カラムに装填することと、
ｅ．高塩濃度溶液で前記ｒｈＡＲＧを溶出させることと、
ｆ．前記溶出されたｒｈＡＲＧを、コバルト塩とインキュベートしてコバルト置換ｒｈＡＲＧ（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成することと、
ｇ．前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを陰イオン交換カラムに適用して、フロースルーを収集することと、
ｈ．前記フロースルーを第３のクロマトグラフィーカラムに適用することと、
ｉ．高塩濃度溶液で前記第３のクロマトグラフィーカラムから前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを溶出させることと、を含む、方法。
【請求項2】
陽イオン交換樹脂１リットル当たり最大６０グラムのｒｈＡＲＧが、前記陽イオン交換カラムに装填される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記陽イオン交換カラムから前記ｒｈＡＲＧを溶出させることが、最大約０．５Ｍの塩濃度の高塩濃度溶液を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記陽イオン交換カラムから前記ｒｈＡＲＧを溶出させることが、約０．１Ｍの塩濃度の高塩濃度溶液を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記陽イオン交換カラムから前記ｒｈＡＲＧを溶出させることが、約０．０～約０．５Ｍの塩濃度のグラジエントを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
前記陽イオン交換カラムから前記ｒｈＡＲＧを溶出させることが、約０．０～約０．２Ｍの塩濃度のグラジエントを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
前記コバルト塩が、Ｃｏ２＋塩を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記コバルト塩が、ＣｏＣｌ２を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記第３のクロマトグラフィーカラムが、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ｒｈＡＲＧまたはＣｏ－ｒｈＡＲＧをＰＥＧ化反応物と反応させてＰＥＧ化タンパク質を提供することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２およびＫ３２１にＰＥＧ化アミノ酸残基のうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ１６の約１５％～約６０％、Ｋ３２の約３５％～約８０％、Ｋ３８の約２０％～約８５％、Ｋ４０の約１０％～約６０％、Ｋ４７の約１０％～約６０％、Ｋ６７の約４０％～約９０％、Ｋ７４の約３０％～約９５％、Ｋ８２の約３０％～約９８％、Ｋ８７の約１５％～約６５％、Ｋ８８の約２５％～約７０％、Ｋ１５２の約２５％～約８５％、Ｋ１５４の約１５％～約６５％、Ｋ１７１の約２０％～約７５％、Ｋ２２２の０％～約３０％、Ｋ２２３の０％～約３５％、Ｋ３１２の０％～約４５％、およびＫ３２１の０％～約４５％のうちの１つ以上が、ＰＥＧ化されてことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＰＥＧ化タンパク質が、少なくともＫ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ３１２およびＫ３２１にＰＥＧ化アミノ酸残基を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ３、Ｋ１４９、Ｋ１９０、Ｋ１９５、Ｋ２９、Ｋ２６５およびＫ２８３にＰＥＧ化アミノ酸残基を有さない、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
精製されたＰＥＧ化組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼを産生するための方法であって、前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、
ａ．バイオリアクター内で、ｒｈＡＲＧを産生するＥ．Ｃｏｌｉを培養することと、
ｂ．前記Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞を溶解することと、
ｃ．溶解物から細胞破片を除去することと、
ｄ．陽イオン交換カラムに前記細胞溶解物を装填することと、
ｅ．高塩濃度溶液で前記ｒｈＡＲＧを溶出させることと、
ｆ．前記溶出されたｒｈＡＲＧを、１０ｍＭのＣｏＣｌ２とインキュベートしてコバルト置換ｒｈＡＲＧ（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成することと、
ｇ．前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを陰イオン交換カラムに適用して、フロースルーを収集することと、
ｈ．前記フロースルーをマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムに適用することと、
ｉ．高塩濃度溶液で前記ＭＭＣカラムから前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを溶出させることと、
ｊ．モル過剰のメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステルを加えることと、
ｋ．過剰のＰＥＧを除去することと、を含む、方法。
【請求項16】
精製された組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼを産生するための方法であって、前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、
ａ．バイオリアクター内で、約３６℃～約３８℃、ｐＨ約７．０～約７．４でｒｈＡＲＧを産生するＥ．ｃｏｌｉ細胞を撹拌および通気しながら培養することであって、
ｉ．前記バイオリアクターの温度を約２９℃に調整し、
ｉｉ．ｒｈＡＲＧを産生するようにＥ．Ｃｏｌｉ細胞を誘導し、
ｉｉｉ．前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を約１８時間培養し、
ｉｖ．遠心分離により前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を収獲する、培養することと、
ｂ．約７．２～約７．６の間のｐＨ、および約１５℃以下で、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中での高圧均質化によって前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を溶解することと、
ｃ．１５℃以下で遠心分離して溶解物から細胞破片を除去し、前記溶解物を０．８ミクロンフィルターで濾過し、次に０．５ミクロンフィルターで濾過することと、
ｄ．前記細胞溶解物を陽イオン交換カラムに装填し、次にカラムを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２～７．６で洗浄することと、
ｅ．２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．６を含む高塩濃度溶液で、室温で前記ｒｈＡＲＧを溶出させることと、
ｆ．前記溶出されたｒｈＡＲＧを１０ｍＭのＣｏＣｌ２と室温で約２～約８時間インキュベートして、コバルト置換ｒｈＡＲＧ（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成することと、
ｉ．Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．１～８．５と交換することと、
ｇ．前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを陰イオン交換カラムに適用し、フロースルーを収集することと、
ｈ．前記フロースルーをＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムに適用することと、
ｉ．５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．１～８．５を含む高塩濃度溶液で前記ＭＭＣカラムから前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを溶出させることと、を含む、方法。
【請求項17】
精製された組換えＰＥＧ化組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼを製造するための方法であって、前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、
ａ．バイオリアクター内で約３６℃および約３８℃、ｐＨ約７．０～約７．４でｒｈＡＲＧを産生するＥ．ｃｏｌｉを撹拌および通気しながら培養することであって、
ｉ．前記バイオリアクターの温度を約２９℃に調整し、
ｉｉ．ｒｈＡＲＧを産生するようにＥ．Ｃｏｌｉを誘導し、
ｉｉｉ．前記Ｅ．ｃｏｌｉを約１８時間培養し、
ｉｖ．遠心分離により前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を収獲する、培養することと、
ｂ．約７．２～約７．６の間のｐＨ、および約１５℃以下で、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ中での高圧均質化によって前記Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を
溶解することと、
ｃ．１５℃以下で遠心分離して溶解物から細胞破片を除去し、前記溶解物を０．８ミクロンフィルターで濾過し、次に０．５ミクロンフィルターで濾過することと、
ｄ．前記細胞溶解物を陽イオン交換カラムに装填し、次にカラムを
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２～７．６で洗浄することと、
ｅ．２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．６を含む高塩濃度溶液で、室温で前記ｒｈＡＲＧを溶出させることと、
ｆ．前記溶出されたｒｈＡＲＧを１０ｍＭのＣｏＣｌ２と室温で約２～約８時間インキュベートして、コバルト置換ｒｈＡＲＧ（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成することと、
ｉ．Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．１～８．５と交換することと、
ｇ．前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを陰イオン交換カラムに適用して、フロースルーを収集することと、
ｈ．前記フロースルーをＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムに適用することと、
ｉ．５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．１～８．５を含む高塩濃度溶液（ＭＭＣ緩衝液）で前記ＭＭＣカラムから前記Ｃｏ－ｒｈＡＲＧを溶出させることであって、
ｉ．ＭＭＣ緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５％グリセロール、ｐＨ７．４（緩衝液１）と交換して、タンパク質の濃度を約５．０ｍｇ／ｍＬに調整し、
ｉｉ．緩衝液１を０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．１～８．５（緩衝液２）と交換して、前記タンパク質濃度を約１０．０ｍｇ／ｍＬに濃縮する、溶出させることと、
ｊ．モル過剰のメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル５，０００Ｄａの概算分子量を添加して（タンパク質１モル当たり約１９モルのメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステルを添加する）、この混合物を約３０分～約４時間およそ
ｐＨ８．４でインキュベートすることと、
ｋ．緩衝液２を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５％グリセロール、ｐＨ７．４と交換して過剰のＰＥＧを除去することと、を含む、方法。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法によって産生されたＣｏ－ｒｈＡＲＧまたはＣｏ－ｒｈＡＲＧ－ＰＥＧを含む組成物。
【請求項19】
タンパク質が、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２およびＫ３２１のうちの１つ以上でポリエチレングリコールに共有結合している、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）タンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質は、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、タンパク質は、非天然金属補因子と複合体を形成しており、前記非天然金属補因子はコバルトであり、前記タンパク質は、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２およびＫ３２１の１つ以上でポリエチレングリコールに共有結合している、組成物。
【請求項21】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、Ｈ１００、Ｄ１２３、Ｈ１２５、Ｄ１２７、Ｄ２３１、Ｄ２３３、Ｗ１２１、Ｄ１８０、Ｓ２２９、Ｃ３０２、およびＥ２５５からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、Ｄ１８０Ｓ、Ｓ２２９Ｃ、Ｓ２２９Ｇ、Ｃ３０２Ｆ、Ｃ３０２Ｉ、Ｅ２５５Ｑ、Ｄ１８０ＥおよびＳ２２９Ａからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、Ｃ３０２である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、トランケートアルギナーゼＩタンパク質である、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
前記組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）が、外因性タンパク質断片をさらに含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記外因性タンパク質断片が、免疫グロブリンのＦｃ領域または免疫グロブリンのＦｃ領域の一部を含んでいる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ－ＰＥＧの比活性が、約４００Ｕ／ｍｇ～約７００Ｕ／ｍｇの範囲にある、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記タンパク質が、インビトロでアッセイした場合、ｐＨ７．４で約２００ｍＭ－１ｓ－１～約４，０００ｍＭ－１ｓ－１の範囲でアルギニンの加水分解に対するｋｃａｔ／Ｋｍを呈示する、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
前記タンパク質が、インビトロでアッセイした場合、ｐＨ７．４で約４００ｍＭ－１ ｓ－１～約２，５００ｍＭ－１ｓ－１の範囲でアルギニンの加水分解に対するｋｃａｔ／ＫＭを呈示する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
ＰＥＧ：Ｃｏ－ｒｈＡＲＧのモル比が、約７モル／モル～約１５モル／モルの範囲にある、請求項１８～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
遊離ＰＥＧ濃度が、１００μｇ／ｍＬ以下である、請求項１８～３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項33】
前記組成物の総コバルト含有量が、約９μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬの範囲にある、請求項１８～３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
前記組成物が、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）にロードされた場合に、少なくとも９つのピークを生成し、ピーク１が２０％未満であり、ピーク２が３０％未満であり、ピーク３＋４が１０～３０％の範囲にあり、ピーク５が１５～３０％の範囲にあり、ピーク６が１０～２５％の範囲にあり、ピーク７が２５％未満であり、ピーク８が１５％未満であり、ピーク９が８％未満である、請求項１８～３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項35】
前記組成物が、ｉｃＩＥＦにロードされた場合に、少なくとも９つのピークを生成し、ピーク１が５～７％の範囲にあり、ピーク２が８～１１％の範囲にあり、ピーク３＋４が１６～２０％の範囲、ピーク５が２１～２４％の範囲、ピーク６が２１～２２％の範囲、ピーク７が１４～１５％の範囲、ピーク８が５～８％の範囲、ピーク９が２～３％の範囲にある、請求項１８～３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
請求項１８～３５のいずれか一項に記載のＣｏ－ｒｈＡＲＧまたはＣｏ－ｒｈＡＲＧ－ＰＥＧと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項37】
前記組成物が、静脈内または皮下内投与用に製剤化される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項38】
前記組成物が、リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよびグリセロールを含む、請求項３６または３７に記載の医薬組成物。
【請求項39】
前記組成物が、約５０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、約４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および約１．５％ｗ／ｖのグリセロールを含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項40】
アルギナーゼ１欠損症を治療する方法であって、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項41】
前記医薬組成物が、静脈内投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記医薬組成物が、皮下投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記医薬組成物の投与が、非ペグ化酵素の重量に基づいて０．１ｍｇ／ｋｇの用量で開始される、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記患者の血漿アルギニンレベルを監視することをさらに含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記用量が、以下のアルゴリズムに従って調製され、
ａ．前記血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、この試料の前の２回の用量がａ）ｍｇ／ｋｇでの同じ用量レベルであり、ｂ）連続している場合（投与し忘れなし）、単一の１６８時間試料を使用して、下の表の２用量レベルだけ用量を増やし（０．２０ｍｇ／ｋｇを超えない）。
ｂ．２つの連続する１６８時間試料（投与し忘れた場合でも）からの前記血漿アルギニンレベルが両方とも＜５０μＭである場合、前記用量は下の表の１用量レベルだけ減少させるが、０．０５ｍｇ／ｋｇを下回らないようにする、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
【表1】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、酵素補充療法およびアルギナーゼ１欠損症または高アルギニン血症の治療に関する。本開示はまた、ヒト組換えアルギナーゼ１を産生するための方法を包含する。アルギナーゼ１は癌の治療にも使用できる。
【背景技術】
【0002】
アルギナーゼ１欠損症または高アルギニン血症は、酵素アルギナーゼ１の欠損によって引き起こされるまれなアミノ酸代謝障害である。アルギナーゼ１は、尿素サイクルの正常な機能に重要な６つの酵素のうちの１つであり、サイクルの最後のステップで、Ｌ－アルギニンから尿素およびオルニチンへの変換を触媒する。その後、オルニチンはミトコンドリアに再び入り、サイクルを継続する。
【0003】
アルギナーゼ１は、主に赤血球（ＲＢＣ）と肝臓に見られる。ＡＲＧ１は、変異がアルギナーゼ１欠損症を引き起こすことが現在知られている唯一の遺伝子である。臨床的には、アルギナーゼ１欠損症は、進行性認知症、精神運動遅滞、痙直型両麻痺、発作、および成長阻害につながる大脳皮質および錐体路のゆっくりとした悪化を特徴としている。治療せずに放置すると、病気は重度の痙性、歩行の喪失、排便と膀胱の制御の喪失、および重度の知的障害に進行する。アルギナーゼ１欠損症の患者は、通常、血中アルギニンレベルの上昇（正常［ＵＬＮ］の上限の３～４倍）、軽度の高アンモニア血症、および尿中オロト酸の軽度の増加を示す。ほとんどの患者は、ＲＢＣで検出可能なアルギナーゼ１酵素活性を有していない（正常の＜１％）。
【0004】
アルギナーゼ１欠損症の現在の治療は、生涯にわたる食事性タンパク質制限を通じて、血漿アルギニン濃度を可能な限り正常に近いレベルに維持することに焦点を合わせている。タンパク質の摂取量は、タンパク質の生合成と成長を維持するために必要な最小限に制限されている。食物タンパク質の半分以上は、アルギニンを含まない必須アミノ酸混合物の形で与えられる。このような食事の変更は、ほとんどの患者の血漿アルギニンレベルを低下させ得るが、この食事は味が悪く、高価であり、特に成長期の子供では維持および管理が困難である。
【0005】
アルギナーゼ１欠損症患者の治療選択肢の少なさは、アルギニンレベルを正常範囲内に下げ、生涯にわたる正常なアルギニンレベルの維持を促進する治療の重要な満たされていないニーズを浮き彫りにする。このような治療法の開発は、アルギニンとその代謝物の神経毒性作用への曝露を最小限に抑え、これらの患者の正常な神経認知発達の可能性を提供する試みに役立つ可能性がある。
【0006】
アルギナーゼ１欠損症または高アルギニン血症の治療に加えて、これらの方法で産生されたアルギナーゼは、他の疾患の治療に使用できる。アルギナーゼ１は、癌治療での使用を調査する臨床試験で使用されており、ペムブロリズマブなどの免疫腫瘍学薬と組み合わせて使用されている。
【発明の概要】
【0007】
アルギナーゼの産生
本発明の一態様は、組換えヒトアルギナーゼタンパク質を産生および／または精製するための方法に関する。１つ以上の実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質は、組換えヒトアルギナーゼ１（ｒｈＡＲＧ１）（配列番号１、図１（ａ）に示される）である。他の実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質は、組換えヒトアルギナーゼ２（ｒｈＡＲＧ２）（配列番号３、図１（ｃ）を参照）である。本明細書では、ｒｈＡＲＧ１について具体的に言及するが、本明細書に記載の方法、製剤化および使用は、ｒｈＡＲＧ２にも適用することができる。
本発明の一態様は、組換えヒトアルギナーゼタンパク質を産生および／または精製するための方法に関する。１つ以上の実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質は、組換えヒトアルギナーゼ１（ｒｈＡＲＧ１）（配列番号１、図１（ａ）に示される）である。他の実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質は、組換えヒトアルギナーゼ２（ｒｈＡＲＧ２）（配列番号３、図１（ｃ）を参照）である。本明細書では、ｒｈＡＲＧ１について具体的に言及するが、本明細書に記載の方法、製剤化および使用は、ｒｈＡＲＧ２にも適用することができる。
【0008】
本発明の方法に供されるヒトアルギナーゼ１および２タンパク質は、２つのＭｎ２＋部位を有し、いずれかまたは両方の部位を置換して、非天然金属補因子で修飾アルギナーゼ１または２タンパク質を生成することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４で２００ｍＭ－１ ｓ－１を超えるｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４で約２００ｍＭ－１ｓ－１～約４，０００ｍＭ－１ｓ－１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭを示す。別の実施形態では、タンパク質は、３７℃でｐＨ７．４で約４００ｍＭ－１ｓ－１～約２，５００ｍＭ－１ｓ－１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の実施形態では、本発明は、ヒトアルギナーゼ１または２のアミノ酸配列および非天然金属補因子を含むタンパク質を企図し、ここで、当該タンパク質は、３７℃でｐＨ７．４で４００ｍＭ－１ ｓ－１を超えるｋｃａｔ／ＫＭを呈示する。例示的なｋｃａｔ／ＫＭ値は、３７℃でｐＨ７．４で約２００，約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約８００、約９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，５００、約２，０００、約３，０００、約３，５００および約４，０００ｍＭ－１ｓ－１を含む。
【0009】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生するための方法が提供される。１つ以上の実施形態では、方法は、以下を含む：ｒｈＡＲＧ１を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞の菌株発酵すること、ｒｈＡＲＧ１においてマンガンの代わりにコバルトを使用してＣｏ－アルギナーゼ１中間体（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１）を提供すること、このＣｏ－アルギナーゼ１中間体を精製してＣｏ－アルギナーゼ１中間体をＰＥＧ化して原薬（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）を形成すること。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧはペグジラルギナーゼ（Ｐｅｇｚｉｌａｒｇｉｎａｓｅ）を含む。
【0010】
１つ以上の実施形態では、方法は、いくつかのステップ：組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）を産生するバイオリアクター内でＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養すること、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を溶解すること、溶解物から細胞破片を除去すること、細胞溶解物を陽イオン交換カラムに装填すること、高塩濃度溶液で組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）を溶出させること、溶出された組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）をコバルト塩とインキュベートしてコバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成すること、コバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を陰イオン交換カラムに適用し、フロースルーを収集すること、フロースルーを第３のクロマトグラフィーカラムに添加すること、高塩濃度で第３のクロマトグラフィーカラムからコバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を溶出すること、を含む。
【0011】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生するための方法は、陽イオン交換樹脂１リットル当たり最大６０グラムの組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）が陽イオン交換カラムに装填されることを含む。
【0012】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生するための方法は、最大約０．５Ｍの塩濃度の高塩濃度溶液を使用して陽イオン交換カラムから組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）が溶出させることを含む。いくつかの実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）は、０．１Ｍ濃度の高塩濃度溶液を使用して陽イオン交換カラムから溶出される。いくつかの実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）は、約０．０～約０．５Ｍの塩濃度のグラジエントを使用して、陽イオン交換カラムから溶出される。．いくつかの実施形態では、組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）は、約０．０～約０．２Ｍの塩濃度のグラジエントを使用して、陽イオン交換カラムから溶出される。
【0013】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生するための方法は、陽イオン交換カラムから溶出された組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）を、Ｃｏ２＋を含むコバルト塩と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、コバルト塩はＣｏＣｌ２を含む。
【0014】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生する方法は、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムを含む第３のクロマトグラフィーカラムに、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）フロースルーを添加することを含む。
【0015】
１つ以上の実施形態では、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生する方法は、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）または組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）をＰＥＧ化反応物と反応させてＰＥＧ化タンパク質を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ１６，Ｋ３２，Ｋ３８，Ｋ４０，Ｋ４７，Ｋ６７，Ｋ７４，Ｋ８２，Ｌ８７，Ｋ８８，Ｋ１５２，Ｋ１５４，Ｋ１７１，Ｋ２２２，Ｋ２２３，Ｋ３１２およびＫ３２１に、ＰＥＧ化アミノ酸残基の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ１６の約１５％～約６０％、Ｋ３２の約３５％～約８０％、Ｋ３８の約２０％～約８５％、Ｋ４０の約１０％～約６０％、Ｋ４７の約１０％～約６０％、Ｋ６７の約４０％～約９０％、Ｋ７４の約３０％～約９５％、Ｋ８２の約３０％～約９８％、Ｋ８７の約１５％～約６５％、Ｋ８８の約２５％～約７０％、Ｋ１５２の約２５％～約８５％、Ｋ１５４の約１５％～約６５％、Ｋ１７１の約２０％～約７５％、Ｋ２２２の０％～約３０％、Ｋ２２３の０％～約３５％、Ｋ３１２の０％～約４５％、Ｋ３２１の０％～約４５％のうちの１つ以上が、ＰＥＧ化されていることを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化タンパク質が、少なくともＫ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ３１２およびＫ３２１にＰＥＧ化アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化タンパク質が、Ｋ３、Ｋ１４９、Ｋ１９０、Ｋ１９５、Ｋ２９、Ｋ２６５およびＫ２８３にＰＥＧ化アミノ酸残基を有さない。
【0016】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態は、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与用に製剤化されたＥ．ｃｏｌｉで発現されるコバルト置換されたＰＥＧ化ヒト組換えアルギナーゼ１酵素に関する。アルギナーゼ１の活性部位で天然マンガン（Ｍｎ２＋）をコバルト（Ｃｏ２＋）に置き換えると、生理的ｐＨでの安定性と触媒活性が向上する。ＰＥＧ化は、組換えアルギナーゼ１の循環半減期（ｔ１／２）も延長する。
【0017】
様々な実施形態では、方法は、バイオリアクター内でＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養して組換えヒトアルギナーゼ１を産生し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を溶解し、組換えヒトアルギナーゼ１を精製することを含む（図２および３を参照）。Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体の精製は、以下の１つ以上のステップを含む精製手順によって実行できる：高圧均質化による細胞破壊、ホモジネートの清澄化、ＳＰセファロースＦＦ陽イオン交換捕捉クロマトグラフィー、コバルト交換、限外濾過／ダイアフィルトレーション、ＱセファロースＦＦ陰イオン交換フロースルークロマトグラフィー、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣマルチモーダルクロマトグラフィー、および限外濾過／ダイアフィルトレーション。精製されたＣｏ－アルギナーゼ１中間体は、ＰＥＧ化された原薬を形成するために処理されるか、後で原薬に変換するために凍結および保存される。
【0018】
この方法の好ましい実施形態では、ｒｈＡＲＧ１を含むＥ．ｃｏｌｉ溶解物を陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーカラム（「カラム１」とも呼ばれる）に装填してｒｈＡＲＧ１を捕捉し、次にこれを高塩濃度溶液で溶出して第１のタンパク質産物（「第１のタンパク質産物」）を提供する。
【0019】
一つ以上の実施形態では、この方法は、第１のタンパク質産物を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーカラム（「カラム２」とも呼ばれる）に装填し、フロースルーを収集して第２のタンパク質産物（「第２のタンパク質産物」）を提供することをさらに含む。この方法の別の態様では、この方法は、第２のタンパク質産物を、アルギナーゼ１を捕捉し、次いで溶出されて第３のタンパク質産物を提供するマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムに装填することをさらに含む（「第３のタンパク質産物」）。いくつかの実施形態では、この第３のクロマトグラフィーカラム（「カラム３」とも呼ばれる）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムであり得る。
【0020】
様々な実施形態は、コバルト補酵素のためにアルギナーゼの天然マンガン補酵素を変更することを含む。コバルト置換（コバルト担持とも呼ばれる）は、製造プロセスのどの段階でも実行できる。たとえば、アルギナーゼ１コバルト担持は、Ｅ．Ｃｏｌｉ溶解物、第１のタンパク質産物、第２のタンパク質産物、第３のタンパク質産物のいずれか、またはＰＥＧ化アルギナーゼ１の任意のステップで実行できる。他の実施形態では、コバルト担持は、カラム１から溶出されたアルギナーゼ１、カラム２から溶出されたアルギナーゼ１、またはカラム３から溶出されたアルギナーゼ１で実行できる。コバルト担持は、ＣＥＸカラムから溶出されたアルギナーゼ１、ＡＥＸカラムから溶出されたアルギナーゼ１、ＭＭＣカラムから溶出されたアルギナーゼ１、またはＳＥＣカラムから溶出されたアルギナーゼ１で実行できる。
【0021】
アルギナーゼ１のコバルト担持は、コバルトを含む様々な溶液を使用して、様々な温度で行うことができる。１つ以上の実施形態では、コバルト塩は、ＣｏＣｌ２などのＣｏ２＋を含む。好ましい実施形態において、アルギナーゼ１のコバルト担持は、約１５～約２５℃または約２０～約２５℃などの室温またはほぼ室温でＣｏＣｌ２を用いて実行される。コバルト担持率は、反応温度を上げたり下げたりすることで操作できる。コバルト担持は、様々なｐＨ値で実行することもできる。
【0022】
本開示の一態様は、ＣＥＸクロマトグラフィー（カラム１）に関連する条件を変えることに関する。カラム１に装填されるタンパク質の量は、様々なアルギナーゼ１電荷バリアントを選択するために増減できる。装填係数を操作して、より望ましいＣＥＸ電荷種プロファイルへのシフトを引き起こすことができる。最大約６０ｇ／Ｌの装填係数（グラムでのタンパク質量／リットルでのＣＥＸカラム樹脂の体積）により、高い比活性を有するアルギナーゼ１を産生できる。様々な実施形態では、装填係数は、最大約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌまたは約６０ｇ／Ｌである。
【0023】
好ましい実施形態では、アルギナーゼ１は最初にカラム１で捕捉され、続いてカラム２で連続的に精製され、次にカラム３で捕捉される。別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物をＡＥＸカラム（例えば、カラム２）に装填し、フロースルーをＣＥＸカラムに適用して、アルギナーゼ１を捕捉することができる。別の実施形態では、アルギナーゼ１のコバルト担持は、ＰＥＧ化反応の後に起こり得る。また、ＳＥＣカラムなど、他のクロマトグラフィーカラムを使用してＭＭＣカラムを置き換えることもできる。
【0024】
本発明の一態様は、組換えコバルト置換ヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を産生するための方法に関する。１つ以上の実施形態において、組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）は、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。方法はいくつかのステップで構成される：組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）を産生するバイオリアクター内でＥ．ｃｏｌｉ細胞を培養し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を溶解し、溶解物から細胞破片を除去し、細胞溶解物を陽イオン交換カラムに装填し、組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）を高塩濃度溶液で溶出させ、溶出された組換えヒトアルギナーゼタンパク質（ｒｈＡＲＧ）をコバルト塩とインキュベートして、コバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を形成し、コバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を陰イオン交換カラムに適用してフロースルーを収集し、フロースルーを第３のクロマトグラフィーカラムに添加し、高塩濃度溶液でＭＭＣカラムからコバルト置換組換えヒトアルギナーゼタンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ）を溶出させ、モル過剰のメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステルを反応させ、過剰のＰＥＧを除去する。
【0025】
組換えヒトアルギナーゼ１、医薬組成物および製剤
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって製造されたｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１および／またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ、またはそれを含む組成物に関する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法によって製造されたｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１および／またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ、またはそれを含む組成物に関する。
【0026】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２およびＫ３２１のうちの１つ以上でポリエチレングリコールに共有結合している。
【0027】
本発明の別の態様は、組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡＲＧ）タンパク質を含む組成物に関し、タンパク質は、配列番号１と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、タンパク質は、非天然金属補因子との複合体であり、非天然金属補因子はコバルトであり、タンパク質は、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２およびＫ３２１の１つ以上でポリエチレングリコールに共有結合している。
【0028】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、以下からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を含む：Ｈ１００、Ｄ１２３、Ｈ１２５、Ｄ１２７、Ｄ２３１、Ｄ２３３、Ｗ１２１、Ｄ１８０、Ｓ２２９、Ｃ３０２、ａｎｄ Ｅ２５５。
【0029】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｄ１８０Ｓ、Ｓ２２９Ｃ、Ｓ２２９Ｇ、Ｃ３０２Ｆ、Ｃ３０２Ｉ、Ｅ２５５Ｑ、Ｄ１８０ＥおよびＳ２２９Ａ。
【0030】
１つ以上の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸置換はＣ３０２である。
【0031】
１つ以上の実施形態において、タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【0032】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、トランケートアルギナーゼＩタンパク質である。
【0033】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、外因性タンパク質断片をさらに含む。
【0034】
１つ以上の実施形態では、外因性タンパク質断片は、免疫グロブリンのＦｃ領域または免疫グロブリンのＦｃ領域の一部を含む。
【0035】
１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ－ＰＥＧの比活性は、約４００Ｕ／ｍｇ～約７００Ｕ／ｍｇの範囲にある。
【0036】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、インビトロでアッセイされた場合、ｐＨ７．４で約２００ｍＭ－１ｓ－１～約４，０００ｍＭ－１ｓ－１の範囲でアルギニンの加水分解についてｋｃａｔ／Ｋｍを呈示する。
【0037】
１つ以上の実施形態では、タンパク質は、インビトロでアッセイされた場合、ｐＨ７．４で約４００ｍＭ－１ ｓ－１～約２，５００ｍＭ－１ ｓ－１の範囲でアルギニンの加水分解についてｋｃａｔ／ＫＭを呈示する。
【0038】
１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ：Ｃｏ－ｒｈＡＲＧのモル比は、約７モル／モル～約１５モル／モルの範囲である。
【0039】
１つ以上の実施形態では、遊離ＰＥＧ濃度は、１００μｇ／ｍＬ以下である。
【0040】
１つ以上の実施形態では、組成物の総コバルト含有量は、約９μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬの範囲にある。
【0041】
１つ以上の実施形態では、組成物は、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）にロードされた場合に少なくとも９つのピークを生成し、ピーク１は２０％未満であり、ピーク２は３０％未満であり、ピーク３＋４は１０～３０％の範囲にあり、ピーク５は１５～３０％の範囲にあり、ピーク６は１０～２５％の範囲にあり、ピーク７は２５％未満であり、ピーク８は１５％未満であり、ピーク９は８％未満である。
【0042】
１つ以上の実施形態では、組成物は、ｉｃＩＥＦにロードされた場合に少なくとも９つのピークを生成し、ピーク１は５～７％の範囲にあり、ピーク２は８～１１％の範囲にあり、ピーク３＋４は１６～２０％の範囲にあり、ピーク５は２１～２４％の範囲にあり、ピーク６は２１～２２％の範囲にあり、ピーク７は１４～１５％の範囲にあり、ピーク８は５～８％の範囲にあり、ピーク９は２～３％の範囲にある。
【0043】
本発明の別の態様は、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１および／またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。１つ以上の実施形態では、組成物は、静脈内または皮下投与用に処方される。１つ以上の実施形態では、組成物は、リン酸カリウム、塩化ナトリウムおよびグリセロールを含む。１つ以上の実施形態では、組成物は、約５０ｍＭのＮａＣｌ、約１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、約４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および約１．５％ｗ／ｖのグリセロールを含む。
【0044】
アルギナーゼ１欠損症の治療法
本発明の別の態様は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧなどの組換えヒトアルギナーゼ１の投与に関する。そのような投与は、ＩＶまたはＳＣ投与を含む任意の適切な方法によることができる。この態様の１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量は、特定のアルゴリズムによって決定される：
このアルゴリズムの１つ以上の実施形態では、患者は、０．１０ｍｇ／ｋｇで治療を開始する。血漿アルギニンレベルが監視される。血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、用量は０．２０ｍｇ／ｋｇに増加される。血漿アルギニンレベルが＜５０μＭの場合、用量は０．０５ｍｇ／ｋｇに減少される。それ以外の場合、患者は０．１０ｍｇ／ｋｇの用量を維持する。
本発明の別の態様は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧなどの組換えヒトアルギナーゼ１の投与に関する。そのような投与は、ＩＶまたはＳＣ投与を含む任意の適切な方法によることができる。この態様の１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量は、特定のアルゴリズムによって決定される：
このアルゴリズムの１つ以上の実施形態では、患者は、０．１０ｍｇ／ｋｇで治療を開始する。血漿アルギニンレベルが監視される。血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、用量は０．２０ｍｇ／ｋｇに増加される。血漿アルギニンレベルが＜５０μＭの場合、用量は０．０５ｍｇ／ｋｇに減少される。それ以外の場合、患者は０．１０ｍｇ／ｋｇの用量を維持する。
【0045】
このアルゴリズムの１つ以上の実施形態では、用量の変更は以下の通りである：
・血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、この試料の前の２用量がａ）ｍｇ／ｋｇで同じ用量レベルであり、
ｂ）連続している場合（投与し忘れなし）、単一の１６８時間試料を使用して下の表の２用量レベルだけ用量を増加させる（０．２０ｍｇ／ｋｇを超えない）。
・２つの連続する１６８時間試料（投与し忘れた場合でも）からの血漿アルギニンレベルが両方とも＜５０μＭである場合、用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇを下回らないようにして、下の表の１用量レベルだけ減少させる。
・血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、この試料の前の２用量がａ）ｍｇ／ｋｇで同じ用量レベルであり、
ｂ）連続している場合（投与し忘れなし）、単一の１６８時間試料を使用して下の表の２用量レベルだけ用量を増加させる（０．２０ｍｇ／ｋｇを超えない）。
・２つの連続する１６８時間試料（投与し忘れた場合でも）からの血漿アルギニンレベルが両方とも＜５０μＭである場合、用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇを下回らないようにして、下の表の１用量レベルだけ減少させる。
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0046】
本発明のさらなる特徴は、以下の書面による説明および付随する図から明らかになるであろう。
【0047】
【図1】アルギナーゼ１のアミノ酸とＤＮＡ配列、およびアルギナーゼ２のアミノ酸配列を示す。図１（ａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトアルギナーゼ１のアミノ酸配列（配列番号１）１）を示し、図１（ｂ）は、組換えヒトアルギナーゼ１のコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。このアルギナーゼ１の発現されたモノマーは、天然のヒトアルギナーゼ１モノマーに見られるＮ末端メチオニンを欠損している。図１（ｃ）は、天然のヒトアルギナーゼ２モノマーに見られるＮ末端メチオニンが欠損しているアルギナーゼ２のアミノ酸配列を示す。
【図2】Ｅ．ｃｏｌｉの発酵およびアルギナーゼ１の発現のための例示的なプロセスの概略図である。
【図3】組換えヒトアルギナーゼ１、コバルト置換組換えヒトアルギナーゼ１およびＰＥＧ化コバルト置換組換えヒトアルギナーゼ１の精製のための例示的なプロセスの概略図である。図３（ａ）は、陽イオン交換カラム（カラム１）、陰イオン交換カラム（カラム２）、およびＣａｐｔｏマルチモーダルカラム（カラム３）、ならびにコバルト担持ステップを含む例示的なプロセスを示す。図３（ｂ）は、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体のＰＥＧ化と、それに続く最終的な濾過と製剤化による原薬の提供を示す。
【図4】アルギナーゼ１のカラムクロマトグラフィー精製を示す。図４（ａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞溶解物を陽イオン交換カラム（カラム１）への装填、カラムの洗浄、次いで高塩濃度溶液での溶出（第１のタンパク質産物を提供する）を示す。タンパク質の装填と溶出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することによって評価した。約３リットル（Ｌ）の細胞溶解物をカラムに適用し、次にカラムを約１．５Ｌの緩衝液で洗浄し、約１Ｌ未満で溶出を行った。図４（ｂ）は、陰イオン交換カラム（カラム２）へのカラム１溶出アルギナーゼ１（第１のタンパク質産物）の装填を示し、タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を使用して測定した。このカラム２からのフロースルーでアルギナーゼ１を収集し、第２のタンパク質産物を提供した。図４（ｃ）は、Ｃａｐｔｏマルチモーダル陽イオン交換カラム（カラム３）へのアルギナーゼ１の捕捉と、高塩濃度溶液で溶出して第３のタンパク質産物を提供することを示す。
【図5】カラム１から溶出されたＣｏ－アルギナーゼ１中間体試料（第１のタンパク質産物とも呼ばれる）の電荷不均一性プロファイルを決定するために使用された解析的陽イオン交換ＨＰＬＣ法の結果を示す。アルギナーゼ１の１ｍｇ／ｍ試料を、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０緩衝液の移動相を用いて陽イオン交換カラムに流速１．０ｍＬ／分で装填した。０～５００ｍＭのＮａＣｌのグラジエントを４０分かけて導入し、このカラムから溶出したタンパク質の量を２８０ｎｍでの吸光度から推定した。図５（ａ）は、アルギナーゼ１の電荷不均一性種の代表的なクロマトグラムを示す。アルギナーゼ１電荷バリアントは、１０～２０分後にこの分析用ＨＰＬＣカラムから溶出された。図５（ｂ）は、図５（ａ）と同じクロマトグラムを示すが、ピークが大きく拡大されている。図５（ｃ）は、アルギナーゼ１陽イオン交換電荷バリアントへのピーク番号の割り当てを示す。図５（ｄ）は、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）法によって分離された原薬の典型的な電荷不均一性プロファイルを示す。
【図6】Ｅ．ｃｏｌｉでのｒｈＡＲＧの発現によって生成されるアルギナーゼ１グルコニル化バリアントを測定するためのＬＣ／ＭＳ法の結果を示す。ＬＣ／ＭＳ解析により、未修飾のアルギナーゼ１（モノマー）、グルコニル化アルギナーゼ１、ホスホグルコニル化アルギナーゼ１、および２倍（２Ｘ）のグルコニル化アルギナーゼ１が同定される。トレースは、薬物中間体の２つの別々の産生実行由来のものである。質量スペクトルのオーバーレイは、３５℃のＲＰ ＬＣＭＳで３３～３５分にわたって合計され、スペクトルは、未修飾のアルギナーゼ１によるシグナルのピーク強度に正規化されている。バリアントのピーク強度は、相対的な存在量に比例する。
【図7】カラム１に適用された０．０～０．２ＭのＮａＣｌのグラジエントの結果を示す。画分は、グラジエントを介して０．２５ＣＶ（カラム体積）ごとに収集された。データは、２つの異なるロットの収獲した細胞スラリーを供給材料として使用した２つのカラム１の実行を表す。評価に使用した装填係数は３０ｇ／Ｌであった。グラジエントは、産物の回収率を維持しながら、様々なグルコノイル化種をうまく分離した。
【図8】Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体とＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の酵素活性を示す。図８（ａ）は、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体の代表的な酵素反応速度論解析を示す（３７℃で０～２ｍＭの範囲にわたる基質濃度でのアルギニンからオルニチンへの変換）。図８（ｂ）は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の代表的な酵素反応速度論解析を示す。
【図9】Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の薬物動態解析を示す。図９（ａ）および（ｂ）は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ：第１部の単回静脈内投与後の患者の平均（±ＳＤ）アルギナーゼ１濃度対時間プロファイルを示す。線形（ａ）および片対数（ｂ）プロットが示される。最初の平均ＢＱＬ濃度は、ＬＬＯＱの半分（０．１２５μｇ／ｍＬ）でプロットされていることに注意されたい。すべての患者の平均循環薬物濃度は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量を増やすにつれて増加した。図９（ｃ）～（ｆ）は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ：第２部のＱＷ（毎週）ＩＶ用量投与後の患者の平均（±ＳＤ）Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ濃度対時間プロファイルを示す。１週目（ｃ）と８週目（ｄ）の線形プロット、１週目（ｅ）と８週目（ｆ）の片対数プロット。
【図10】アルギナーゼ１欠損症患者へのＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの投与を評価するための、第１／２相非盲検研究における薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の３つの代表的な統合プロット（ａ、ｂ、ｃ）を示す。漸増停止基準を使用すると、第２部で決定された用量は、患者１で０．０９ｍｇ／ｋｇ、患者３で０．１２ｍｇ／ｋｇ、および０．０４ｍｇ／ｋｇであった（第２部の期間中）。用量漸増停止基準を適用することにより、試験の他の患者は、様々な第２部投与レベルに落ち着いた。これらの同じ基準を適用して、好ましい（健康な）範囲外に移動するアルギニンレベルに応じて、すでにＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを使用している患者の用量を調整（増加または減少）することができる。
【図11】Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの静脈内投与と皮下投与の比較を示す。患者にとって好ましい血漿アルギニン濃度は、４０μＭ～１１５μＭの間である（点線）。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与は、ＩＶ投与よりも長くこの好ましい範囲内のアルギニン濃度をもたらす。図１１には、（ａ）第２部の終了後の最初の週のデータが含まれ、図１１（ｂ）には、この継続投与１週目からのＩＶデータが含まれていない。プロットは患者の値の平均として示され、データは各患者に対して停止基準が決定した用量から抽出される。
【図12】Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ投与後の血漿アルギニンおよび血漿グアニジノ化合物レベルを示す。図１２（ａ）は、ベースライン時投与１後、投与８後、および非盲検継続投与（ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＯＬＥ）中の血漿アルギニンレベルを示す。図１２（ｂ）は、ベースライン時およびＯＬＥ中のグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）、Ｎ－α－アセチル－Ｌ－アルギニン（ＮＡＡ）、α－ケト－δ－グアニジノ酢酸（ＧＶＡ）およびアルギニン酸（ＡＲＧＡ）の血漿レベルを示す。
【図13】ベースライン欠損と臨床転帰の応答を示す。図１３（ａ）は、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）パートＤおよびＥ、および適応行動評価システム（ＡＢＡＳ）のアルギナーゼ１欠損患者のベースライン欠損を示す。図１３（ｂ）は、６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、およびＧＭＦＭ－Ｅの臨床応答を示す。
【図14】６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、およびＧＭＦＭ－Ｅの時間依存性改善を示す。図１４（ａ）は、投与８および投与２０における、すべての患者と６ＭＷＴのベースライン欠損のある患者における６ＭＷＴの臨床応答者のパーセンテージを示す。図１４（ｂ）は、投与８および投与２０における、すべての患者と６ＭＷＴのベースライン欠損のある患者におけるＧＭＦＭ－Ｄの臨床応答者のパーセンテージを示す。図１４（ｃ）は、用量８および用量２０における、すべての患者と６ＭＷＴにベースライン欠損のある患者におけるＧＭＦＭ－Ｅの臨床応答者のパーセンテージを示す。
【図15】Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの様々なバッチの部位特異的ＰＥＧ化解析を示す。
【発明の詳細な説明】
【0048】
組換えヒトアルギナーゼ１
ｈＡｒｇ１として識別されるヒトアルギナーゼ１は、Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇ）の加水分解を触媒してＬ－オルニチンと尿素を生成する二核マンガン金属酵素である。アルギナーゼ１は、３つの非共有結合した同一のモノマーユニットの三量体である。モノマーアルギナーゼ１は酵素的に活性であるが、安定性は低い。アルギナーゼ１の活性部位で天然マンガン（Ｍｎ２＋）をコバルト（Ｃｏ２＋）に置換すると、生理的ｐＨでの触媒活性が向上する。本明細書に記載のコバルト置換アルギナーゼ１酵素を産生する方法は、高純度で高活性の酵素を提供する。この方法はまた、原薬の製造における単離された中間体としてＣｏ－アルギナーゼ１（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１）を提供することができる。１つ以上の実施形態では、原薬は、ＰＥＧ化されたＣｏ－アルギナーゼ１（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）である。Ｃｏ－アルギナーゼ１のＰＥＧ化は、循環半減期を大幅に延長する。この場合も、本明細書ではｒｈＡＲＧ１を具体的に言及しているが、本明細書に記載の方法、製剤化および使用は、ｒｈＡＲＧ２にも適用することができる。
ｈＡｒｇ１として識別されるヒトアルギナーゼ１は、Ｌ－アルギニン（Ｌ－Ａｒｇ）の加水分解を触媒してＬ－オルニチンと尿素を生成する二核マンガン金属酵素である。アルギナーゼ１は、３つの非共有結合した同一のモノマーユニットの三量体である。モノマーアルギナーゼ１は酵素的に活性であるが、安定性は低い。アルギナーゼ１の活性部位で天然マンガン（Ｍｎ２＋）をコバルト（Ｃｏ２＋）に置換すると、生理的ｐＨでの触媒活性が向上する。本明細書に記載のコバルト置換アルギナーゼ１酵素を産生する方法は、高純度で高活性の酵素を提供する。この方法はまた、原薬の製造における単離された中間体としてＣｏ－アルギナーゼ１（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１）を提供することができる。１つ以上の実施形態では、原薬は、ＰＥＧ化されたＣｏ－アルギナーゼ１（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）である。Ｃｏ－アルギナーゼ１のＰＥＧ化は、循環半減期を大幅に延長する。この場合も、本明細書ではｒｈＡＲＧ１を具体的に言及しているが、本明細書に記載の方法、製剤化および使用は、ｒｈＡＲＧ２にも適用することができる。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ｒｈＡＲＧ１」という用語は、配列番号１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する組換え酵素などの組換えヒトアルギナーゼ１酵素を指す。
【0050】
本明細書で使用される場合、「Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１」、「Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体」などの用語は、天然マンガン補因子の少なくとも一部がコバルトで置き換えられたｒｈＡＲＧ１を指す。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの産生および／または精製プロセスにおける単離可能な中間体である。
【0051】
本明細書で使用される場合、「Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ」、「ＰＥＧ化Ｃｏ－アルギナーゼ１」などの用語は、Ｎ末端アミノ酸および／または１つ以上のリジン残基の遊離アミン（複数可）など、酵素に共有結合した１つ以上のＰＥＧユニットを有するＣｏ－ｒｈＡＲＧ１を指す。
【0052】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の量は、非ＰＥＧ化酵素の集合の量として表すことができる。この方法の一実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の各ｍｇ（酵素ベース）はまた、約１ｍｇのＰＥＧなどのおよそ１～２ｍｇのＰＥＧを１．４ｍｇを含有する。
【0053】
図１（ａ）はＥ．ｃｏｌｉで発現したアミノ酸配列を示す。ｈＡｒｇ１タンパク質配列はＮＣＢＩデータベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：遺伝子座ＡＲＧＩ１＿ＨＵＭＡＮ、アクセッションＰ０５０８９）から取得された。重複するオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応で使用して、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンであるアルギナーゼ１ ＤＮＡを生成した（図１（ｂ））。アルギナーゼ１の３２１個のアミノ酸のＥ．ｃｏｌｉ発現モノマーは、天然のヒトアルギナーゼ１モノマーに見られるＮ末端メチオニンを欠損している。Ｃｏ－アルギナーゼ１の計算された分子量は３４７２１．６ダルトンである（表１）。ホモ三量体Ｃｏ－アルギナーゼ１の計算された分子量は１０４１６４．８ダルトンである。アルギナーゼ１にはジスルフィド結合を有さない。
【表2】
【0054】
１つ以上の実施形態では、モノマーＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの計算された分子量は、約７５～１１５ｋＤａである。１つ以上の実施形態では、ホモ三量体Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの計算された分子量は、約２２４～３４４ｋＤａである。１つ以上の実施形態では、平均ＰＥＧ数は、約８～約２５モルのＰＥＧ／モルのＣｏ－アルギナーゼ１モノマー、例えば、約８～約１６モルのＰＥＧ／モルのＣｏ－アルギナーゼ１モノマーである。例示的なＰＥＧの量には、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、および約１６モルのＰＥＧ／モルのＣｏ－アルギナーゼ１モノマーが含まれる。各ＰＥＧの平均分子量は約１，０００～約１０，０００ダルトンであり、例えば、約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９，０００、または約１０，０００ダルトンである。特定の実施形態では、ＰＥＧの平均ＭＷは、約５，０００ダルトンである。
【0055】
１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧはペグジラルギナーゼを含む。ペグジラルギナーゼには、次の２つの化学名があり：
ａ．ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル）、α－（カルボキシメチル）－ω－メトキシ－、アルギナーゼ１［コバルト補因子］（合成ヒト）（１：１０）とのアミド、三量体
ｂ．マンガンがコバルトに置き換えられ、（Ｎ末端セリンおよびＮ６－リジンの）平均１０個の第一級アミンが［メトキシポリ（エチレンオキシ）］アセチルでアミド化されている、Ｄｅｓ－Ｍｅｔ１－アルギナーゼ－１（肝臓型アルギナーゼ、ＥＣ ３．５．３．１）（ホモサピエンス）、非共有結合性ホモ三量体、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ で産生。ペグジラルギナーゼの分子式は、Ｃ１５５４Ｈ２４９２Ｎ４１６Ｏ４５３Ｓ６ ［Ｃ３Ｈ４Ｏ２（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］ａモノマーである。ペグジラルギナーゼの平均分子量は、三量体で２８４ｋＤａである。ペグジラルギナーゼのＣＡＳ登録番号は１６５９３１０－９５－８である。
ａ．ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル）、α－（カルボキシメチル）－ω－メトキシ－、アルギナーゼ１［コバルト補因子］（合成ヒト）（１：１０）とのアミド、三量体
ｂ．マンガンがコバルトに置き換えられ、（Ｎ末端セリンおよびＮ６－リジンの）平均１０個の第一級アミンが［メトキシポリ（エチレンオキシ）］アセチルでアミド化されている、Ｄｅｓ－Ｍｅｔ１－アルギナーゼ－１（肝臓型アルギナーゼ、ＥＣ ３．５．３．１）（ホモサピエンス）、非共有結合性ホモ三量体、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ で産生。ペグジラルギナーゼの分子式は、Ｃ１５５４Ｈ２４９２Ｎ４１６Ｏ４５３Ｓ６ ［Ｃ３Ｈ４Ｏ２（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ］ａモノマーである。ペグジラルギナーゼの平均分子量は、三量体で２８４ｋＤａである。ペグジラルギナーゼのＣＡＳ登録番号は１６５９３１０－９５－８である。
【0056】
ペグジラルギナーゼのＰＥＧ化の可能性のある部位を以下に示す。
【化1】
【0057】
通常、ＰＥＧ化反応はＣｏ－ｒｈＡＲＧ１で行われる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化反応は、ｒｈＡＲＧ１に対して行われ得る。１つ以上の実施形態では、反応物の量、時間、温度、および溶液および反応物の取り扱い（混合、添加速度、ＰＥＧの取り扱いなど）は、一貫したＰＥＧ化産物を産生するために重要である。通常、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１でのＰＥＧ化反応は、ｐＨ８．４の反応緩衝液中で行われる。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ｐＨ８．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でＰＥＧ化される。１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ化反応は、ＰＥＧ（ｇ）対Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１（ｇ）の範囲が４：１～１：１である、反応物比を含む。１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ化反応は、ＰＥＧ（ｇ）対Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１（ｇ）が約２．７７：１である、反応物比を含む。１つ以上の実施形態では、ＰＥＧ化反応は、ＰＥＧとＣｏ－ｒｈＡＲＧ１を、約５分～約３００分、約１０分～約３００分、約２０分～約３００分、約３０分～約３００分、約５分～約２８０分、約１０分～約２８０分、約２０分～約２８０分、約３０分～約２８０分、約５分～約２６０分、約１０分～約２６０分、約２０分～約２６０分、約３０分～約２６０分、約５分～約２４０分、約１０分～約２４０分、約２０分～約２４０分、約３０分～約２４０分、ミストすることによって行われる。１つ以上の実施形態では、過剰なＰＥＧを除去し、反応緩衝液のｐＨを低下させることにより、ＰＥＧ化反応を停止させる。いくつかの実施形態では、過剰なＰＥＧは濾過技術によって除去される。１つ以上の実施形態では、反応緩衝液を保存緩衝液と交換することにより、ｐＨを低下させる。いくつかの実施形態では、保存緩衝液は、５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５％ｗ／ｖグリセロール、およびｐＨ７．４で構成されている。
【0058】
１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ２２２、Ｋ２２３、Ｋ３１２、およびＫ３２１アミノ酸残基のうちの１つ以上でＰＥＧ化されている。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、少なくともＫ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ３１２、およびＫ３２１アミノ酸残基でＰＥＧ化されている。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｋ２２２および／またはＫ２２３アミノ酸残基でＰＥＧ化されている。いくつかの実施形態では、ｔｈｅ Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｋ２２２および／またはＫ２２３アミノ酸残基でＰＥＧ化されていない。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｋ３、Ｋ１４９、Ｋ１９０、Ｋ１９５、Ｋ２９、Ｋ２６５、およびＫ２８３アミノ酸残基のうちの１つ以上でＰＥＧ化されていない。いくつかの実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｋ３、Ｋ１４９、Ｋ１９０、Ｋ１９５、Ｋ２９、Ｋ２６５、およびＫ２８３アミノ酸残基でＰＥＧ化されていない。
【0059】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ１６は、約１５％～約６０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ３２は、約３５％～約８０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ３８は、約２０％～約８５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ４０は、約１０％～約６０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ４７は、約１０％～約６０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ６７は、約４０％～約９０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ７４は、約３０％～約９５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ８２は、約３０％～約９８％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ８７は、約１５％～約６５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ８８は、約２５％～約７０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ１５２は、約２５％～約８５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ１５４は、約１５％～約６５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ１７１は、約２０％～約７５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ２２２は、０％～約３０％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ２２３は、０％～約３５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ３１２は、０％～約４５％の範囲でＰＥＧ化されている。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの１つ以上の実施形態では、Ｋ３２１は、０％～約４５％の範囲でＰＥＧ化されている。
【0060】
ＰＥＧ－タンパク質モル比は、ＰＥＧ化の程度を示す特質である。１つ以上の実施形態では、約１～約２０モルのＰＥＧが、１モルのＣｏ－ｒｈＡＲＧ１をＰＥＧ化した。ＰＥＧ：Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１のモル比の例示的な範囲には、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１および２０：１が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ：Ｃｏ－ｒｈＡＲＧのモル比は、約７モル／モル～約１５モル／モルの範囲にある。
【0061】
遊離ＰＥＧは、ＰＥＧクリアランスと安定性を実証するために測定される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１（ｍＬ）における遊離ＰＥＧ濃度（μｇ）は、５００μｇ／ｍＬ以下、４００μｇ／ｍＬ以下、３００μｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、および５０μｇ／ｍＬ以下である。
【0062】
ヒトアルギナーゼ１は、Ｌ－アルギニンからＬ－オルニチンと尿素への変換である尿素回路の５番目の最後のステップを触媒する。ＰＥＧ化された原薬であるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、同じ反応を触媒する。酵素活性を評価するためのアッセイは、ｐＨ７．４および３７℃での一定の反応時間中のＬ－アルギニンからＬ－オルニチンへの変換を測定する。生成物の変換量は反応速度に変換され、ミカエリスメンテン式に適合させてＫｍとｋｃａｔを決定する。
【数1】
【0063】
Ｖｍａｘは、飽和基質濃度で達成される最大反応速度であり、Ｋｍは、Ｖｍａｘの半分の速度をもたらす基質濃度を測定するためのミカエリスメンテン結合定数である。酵素代謝回転数、ｋｃａｔは、Ｖｍａｘ／［Ｅ］によって計算される。
【0064】
比活性は、μモル／分で表される２ｍＭのアルギニンでの反応速度をｍｇで表される酵素濃度で割ることによって決定される。
【0065】
酵素活性アッセイで測定されたＫＭおよびｋｃａｔのＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の値は、通常、それぞれ０．１５～０．２２ｍＭおよび約２００～３００／秒の範囲である。Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体をＰＥＧ化して原薬を形成すると、ＰＥＧ化されていない中間体と比較して、酵素活性は大きく変化しない。ただし、ＰＥＧ化は、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体と比較して、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ製剤の循環半減期を大幅に延長する。
【0066】
１つ以上の実施形態では、タンパク質（例えば、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）は、ｐＨ７．４で２００ｍＭ－１ｓ－１を超えるｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の実施形態では、タンパク質は、ｐＨ７．４で約２００ｍＭ－１ｓ－１～約４，０００ｍＭ－１ｓ－１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭを示す。別の実施形態では、タンパク質は、３７℃でｐＨ７．４で約４００ｍＭ－１ｓ－１～約２５００ｍＭ－１ｓ－１の範囲のｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の実施形態では、本発明は、ヒトアルギナーゼ１のアミノ酸配列および非天然金属補因子を含むタンパク質を企図し、このタンパク質は、３７℃でｐＨ７．４で４００ｍＭ－１ｓ－１を超えるｋｃａｔ／ＫＭを示す。例示的なｋｃａｔ／ＫＭ値は、３７℃でｐＨ７．４で、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約８００、約
９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００および約４，０００ｍＭ－１ｓ－１またはこれらの値の間の任意の範囲が含まれる。
９００、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００および約４，０００ｍＭ－１ｓ－１またはこれらの値の間の任意の範囲が含まれる。
【0067】
比活性は、タンパク質（例えば、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）の効力の指標である。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ－ＰＥＧの比活性は、約２００Ｕ／ｍｇから約１０００Ｕ／ｍｇの範囲にある。比活性の例示的な範囲には、約２００Ｕ／ｍｇ～約１０００Ｕ／ｍｇ、約３００Ｕ／ｍｇ～約１０００Ｕ／ｍｇ、約４００Ｕ／ｍｇ～約１０００Ｕ／ｍｇ、約２００Ｕ／ｍｇ～約９００Ｕ／ｍｇ、約３００Ｕ／ｍｇ～約９００Ｕ／ｍｇ、約４００Ｕ／ｍｇ～約９００Ｕ／ｍｇ、約２００Ｕ／ｍｇ～約８００Ｕ／ｍｇ、約３００Ｕ／ｍｇ～約８００Ｕ／ｍｇ、約４００Ｕ／ｍｇ～約８００Ｕ／ｍｇ、約２００Ｕ／ｍｇ～約７００Ｕ／ｍｇ、約３００Ｕ／ｍｇ～約７００Ｕ／ｍｇ、および約４００Ｕ／ｍｇ～約７００Ｕ／ｍｇが含まれる。
【0068】
１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１、またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、配列番号１に対して少なくとも９８％、９８．５％、９９％、または９９．５％の同一性を有することができる。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、配列番号１によって記載されるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の欠失、置換、および／または挿入を有することができる。様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用して、２つの配列間の同一性を計算でき、それらには米国国立バイオテクノロジー情報センターのＷｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）
【0069】
１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、Ｈ１００、Ｄ１２３、Ｈ１２５、Ｄ１２７、Ｄ２３１、Ｄ２３３、Ｄ１８０、Ｓ２２９、およびＣ３０２から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｄ１８０Ｓ、Ｓ２２９Ｃ、Ｓ２２９Ｇ、Ｃ３０２Ｆ、Ｃ３０２Ｉ、Ｅ２５５Ｑ、Ｄ１８０ＥおよびＳ２２９Ａ。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、少なくともＣ３０２にアミノ酸置換を含む。
【0070】
本明細書で説明する方法を使用すると、アルギナーゼ１のほとんどすべてのマンガン補因子をコバルトで置き換えることができる。コバルト補因子への変更により、アルギニンのＫｍがｐＨ７．４で２．８ｍＭから約０．１８ｍＭに変化する。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、約０．１～約２μｇのＣｏ／ｍｇタンパク質を含む。例示的なコバルト担持には、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９および約２μｇのＣｏ／ｍｇタンパク質が含まれる。
【0071】
遊離コバルトは、コバルトのクリアランスと安定性を実証するための尺度である。いくつかの実施形態では、遊離コバルトは０．１０μｇ／ｍＬ以下、０．０９μｇ／ｍＬ以下、０．０８μｇ／ｍＬ以下、０．０７μｇ／ｍＬ以下、０．０６μｇ／ｍＬ以下、０．０５μｇ／ｍＬ以下、および０．０４μｇ／ｍＬ以下である。
【0072】
総コバルトはタンパク質の効力に影響を与え、遊離コバルトの量が比較的少ないため、結合コバルトの指標となる。いくつかの実施形態では、総コバルト濃度は、約５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１９μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１７μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ～約１６μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、および約９μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬの範囲である。
【0073】
様々な実施形態において、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、約１μｇ未満のＭｎ／ｍｇタンパク質、例えば、約１、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１５、約０．１、約０．０９、約０．０８、約０．０７、約０．０６、約０．０５、約０．０４、約０．０３、約０．０２または約０．０１μｇ未満のＭｎ／ｍｇタンパク質を含む。特定の実施形態では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬は、約２μｇのＣｏ／ｍｇタンパク質および約０．０５μｇのＭｎ／ｍｇタンパク質を含む。
【0074】
様々な実施形態において、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧは、約１μｇ未満のＦｅ／ｍｇタンパク質、例えば、約１、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５，約０．４、約０．３、約０．２、約０．１５、約０．１、約０．０９、約０．０８、約０．０７、約０．０６、約０．０５、約０．０４、約０．０３、約０．０２または約０．０１μｇ未満のＦｅ／ｍｇタンパク質を含む。
【0075】
ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＰＥＧｒｈＡＲＧ１の産生と精製
例示的な上流および下流の産生方法の概要を図２および３に見ることができる。
例示的な上流および下流の産生方法の概要を図２および３に見ることができる。
【0076】
振とうフラスコでの拡大
振とうフラスコでの拡大／発酵の目的は、産生発酵槽に播種するための接種材料を生成することである。振とうフラスコでの拡大により、生産リアクターに接種するための細胞集団と、分析目的のための余分な細胞集団が作成される。アルギナーゼ１発酵プロセスの代表的な概要を図２に示す。
振とうフラスコでの拡大／発酵の目的は、産生発酵槽に播種するための接種材料を生成することである。振とうフラスコでの拡大により、生産リアクターに接種するための細胞集団と、分析目的のための余分な細胞集団が作成される。アルギナーゼ１発酵プロセスの代表的な概要を図２に示す。
【0077】
接種培地のアリコートを１つの５００ｍＬフラスコ（一次フラスコ）と６つの３ Ｌ使い捨てフラスコ（二次フラスコ）に導入する。フラスコはオートクレーブにかけられ、滅菌後の添加物が各フラスコに移される。接種前に、一次培地は３７℃の処理温度に予熱される。二次接種の前に、二次フラスコは３７℃の処理温度に予熱される。
【0078】
アルギナーゼ１を発現するＥ．ｃｏｌｉワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）のうちの１つのバイアルを冷蔵から取り出し、解凍する。解凍した細胞の目標量（約１．１ｍＬ）を無菌的に一次フラスコに加え、フラスコを３７℃で攪拌しながらインキュベートする。接種後数時間から開始して１時間ごとにフラスコから試料を取り出し、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度で細胞増殖を追跡する。一次フラスコで≧１．０の目標ＯＤ６００に達したら、一次培養の目標容量（１５ｍＬ）を各二次フラスコに無菌的に移す。二次フラスコを３７℃で撹拌しながらインキュベートする。試料を、接種後４時間から開始して１時間ごとに１つの二次フラスコから取り出し、ＯＤ６００が１．５以上に達したら、３０分ごとに増やす。測定値が、≧２．０のＯＤ６００の指定された密度に達したら、残りの二次フラスコをサンプリングする。すべての二次フラスコの平均ＯＤ６００が指定された移送基準を満たしている場合、フラスコはプールされ、接種材料は産生発酵槽に移送される。アルギナーゼ１の発酵プロセスの代表的な概要を図２に示す。
【0079】
産生発酵
産生発酵の目的は、振とうフラスコ培養を拡大し、アルギナーゼ１の産生を誘導することである。産生発酵は、大量のアルギナーゼ１を生成することができる。細胞集団を構築するための振とうフラスコでの拡大段階に続いて、発酵プロセスは、可溶性タンパク質としてアルギナーゼ１（Ｅ．ｃｏｌｉ中）を産生する。一実施形態では、１５００ Ｌの発酵槽は、接種前の滅菌添加物を含む最初のバッチ培地を含有する。接種後、発酵槽への投入には、栄養供給物（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｆｅｅｄ）、消泡剤溶液、培養液のｐＨを維持するための酸または塩基の添加が含まれる。二次容器は栄養供給培地を保持する。自動制御戦略は、溶存酸素、スパージ速度、撹拌速度、ｐＨ、圧力、温度など、一貫した細胞増殖のための重要なパラメータを維持する。アルギナーゼ１の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルベタ－Ｄ－１－チオガラクトフラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂｅｔｔａ－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｈｒａｎｏｓｉｄｅ））の添加によって誘導され、収獲は約１８時間後に行われる。発酵槽の性能は、産生の最後に、細胞密度、固形分パーセント、および可溶性アルギナーゼ１の割合を監視することによって評価される。
産生発酵の目的は、振とうフラスコ培養を拡大し、アルギナーゼ１の産生を誘導することである。産生発酵は、大量のアルギナーゼ１を生成することができる。細胞集団を構築するための振とうフラスコでの拡大段階に続いて、発酵プロセスは、可溶性タンパク質としてアルギナーゼ１（Ｅ．ｃｏｌｉ中）を産生する。一実施形態では、１５００ Ｌの発酵槽は、接種前の滅菌添加物を含む最初のバッチ培地を含有する。接種後、発酵槽への投入には、栄養供給物（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｆｅｅｄ）、消泡剤溶液、培養液のｐＨを維持するための酸または塩基の添加が含まれる。二次容器は栄養供給培地を保持する。自動制御戦略は、溶存酸素、スパージ速度、撹拌速度、ｐＨ、圧力、温度など、一貫した細胞増殖のための重要なパラメータを維持する。アルギナーゼ１の発現は、ＩＰＴＧ（イソプロピルベタ－Ｄ－１－チオガラクトフラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂｅｔｔａ－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｈｒａｎｏｓｉｄｅ））の添加によって誘導され、収獲は約１８時間後に行われる。発酵槽の性能は、産生の最後に、細胞密度、固形分パーセント、および可溶性アルギナーゼ１の割合を監視することによって評価される。
【0080】
好ましい実施形態では、発酵培地は、産生発酵槽で直接調製される。定置滅菌（ＳＩＰ）の前に、精製水を必要な重量になるまで発酵培地に添加する。カナマイシン、グルコース、およびリン酸カリウムの滅菌後の添加物は、培地が冷却された後、産生発酵槽にフィルター滅菌される。必要に応じて、０．２μｍの滅菌フィルターを使用して、滅菌培地を精製水で指定の接種前重量にする。発酵培地は、制御されたｐＨ値まで塩基（水酸化アンモニウム）で滴定される。
【0081】
３７℃の産生発酵槽は、圧力支援移送を介してプールされた接種材料を使用して無菌的に接種される。接種時から発酵がクールダウンするまで発酵ブロス試料は定期的に収集され、ＯＤ６００分析のために測定される。グルコース試料は、接種後３時間から始まり、接種後９時間後には頻度を増加させて一定の間隔で採取される。培養物の過度の発泡を避けるために、発酵プロセス中に必要に応じて消泡剤溶液が添加される。溶存酸素は、必要に応じて酸素スパージを含む撹拌カスケードによって制御される。培養ｐＨは、酸と塩基の投入を使用して維持される。増殖培地は、撹拌および通気により、３６～３８℃およびｐＨ７．０～７．４に維持することが好ましい。
【0082】
栄養供給物は、酵母エキス、Ｍａｒｔｏｎｅ Ｂ－１、Ｌ－システインＨＣｌ、およびグリセロールで構成される。グルコース濃度が１０ｇ／Ｌ未満（接種後１２～１４時間）になると供給が開始され、生産が終了するまで一定の速度で継続される。ＩＰＴＧの添加により発現が起こる。誘導は１８時間継続する。発酵プロセスの完了に続いて、収穫操作の準備のためにクールダウンが行われる。産生発酵槽は、約６ｇ／Ｌの可溶性アルギナーゼ１の力価をもたらす。産生発酵の概要を図３に示す。
【0083】
収穫操作
収穫操作は、可溶性アルギナーゼ１を含む細胞を捕捉し、細胞を破壊して開け／細胞を溶解し、遠心分離および／または濾過を使用して細胞破片の溶解物を取り除く。取り戻した細胞スラリーは、長期保存のために凍結または低温で保存することができる。収穫操作は、遠心分離によって細胞を収集し、ホモジナイザーまたは圧力下での細胞破壊（フレンチプレス）を２回通過させて溶解し、２回目の遠心分離を行い、最初のクロマトグラフィーステップの前に膜濾過することができる。
収穫操作は、可溶性アルギナーゼ１を含む細胞を捕捉し、細胞を破壊して開け／細胞を溶解し、遠心分離および／または濾過を使用して細胞破片の溶解物を取り除く。取り戻した細胞スラリーは、長期保存のために凍結または低温で保存することができる。収穫操作は、遠心分離によって細胞を収集し、ホモジナイザーまたは圧力下での細胞破壊（フレンチプレス）を２回通過させて溶解し、２回目の遠心分離を行い、最初のクロマトグラフィーステップの前に膜濾過することができる。
【0084】
好ましい実施形態では、全細胞は、ディスクスタック遠心分離機を使用して発酵培地から分離される。得られた細胞スラリーを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６に再懸濁し、ホモジナイザーを２回通過させた。２５ｍＭのＨＥＰＥＳのｐＨは、ｐＨ７．２～７．６の範囲でも使用できる。溶解した物質を細胞の破片を除去するため遠心分離機を使用して清澄化してから、０．２μｍグレードのフィルターで膜濾過する。好ましい実施形態では、収穫ステップは、≦１５℃の目標温度で実行される。
【0085】
代替の実施形態では、細胞破壊は、高圧を使用して実行される。細胞スラリーは制御された速度でホモジナイザーに移され、均質化された流出物は熱交換器を通過して、圧力均質化中に見られる温度上昇を低減する。冷却された細胞は２回の均質化通過を受ける。最初の通過の溶解プールは、収集容器から供給容器に戻される。通過間の保持期間は、潜在的な微生物の増殖を減らすために最小限に抑えられる。
【0086】
溶解後の材料は、溶解物の可溶性成分から細胞破片を除去するための遠心分離によって清澄化される。ライセートは制御された速度でディスクスタック、断続的な排出、遠心分離機に移送される。清澄化された溶解物は、さらなる処理のために収集される。
【0087】
清澄化した溶解物を約０．２μｍフィルターなどで濾過する。プロセス遷移フィルター（Ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ）は、プロセス操作中の微生物制御にも使用できる。この目的のために、フィルターは０．５μｍまたは０．２μｍのフィルターにすることができる。このステップでは、清澄化操作中に分離しなかった可能性のある小さな微粒子も清澄化された物質から除去する。使用前に、フィルターを精製水で十分に洗い流し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６緩衝液で平衡化する。下流の各プロセスステップの前に、バイオバーデン担持の可能性を軽減するためのプレフィルターを付けることができる。
【0088】
ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの精製
ｒｈＡＲＧ１を発現する細胞を培養するために使用される方法（例えば、上記の発酵プロセス）に関係なく、本明細書に記載の精製方法を使用して、ｒｈＡＲＧ１を捕捉し、酵素をさらに精製することができる。精製方法には、コバルトを担持してＣｏ－ｒｈＡＲＧ１を産生する、および／またはＰＥＧ化反応物と反応してＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを産生するなどのオプションのステップを含めることができる。
ｒｈＡＲＧ１を発現する細胞を培養するために使用される方法（例えば、上記の発酵プロセス）に関係なく、本明細書に記載の精製方法を使用して、ｒｈＡＲＧ１を捕捉し、酵素をさらに精製することができる。精製方法には、コバルトを担持してＣｏ－ｒｈＡＲＧ１を産生する、および／またはＰＥＧ化反応物と反応してＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを産生するなどのオプションのステップを含めることができる。
【0089】
精製プロセスの様々な実施形態は、ｒｈＡＲＧ１を捕捉するための陽イオン交換（ＣＥＸ）カラムの使用に関する。１つ以上の実施形態では、ＣＥＸカラムは、複数のクロマトグラフィーカラムを備えたシステムの第１のカラム（「カラム１」）である。このカラム１から溶出されたタンパク質産物は「第１のタンパク質産物」である。
【0090】
１つ以上の実施形態では、カラム１は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、約７．６のｐＨなど、約７から約８の範囲のｐＨでｒｈＡＲＧ１を結合する。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１は、塩の非存在下または低塩濃度で結合する。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１は、最大約０．５ＭのＮａＣｌなどの高塩濃度（ＮａＣｌなど）のバッファーで溶出される。例示的な塩濃度には、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、０．１、約０．２、約０．３、約０．４および約０．５ＭのＮａＣｌが含まれる。
【0091】
様々な実施形態において、塩グラジエントは、ｒｈＡＲＧ１の異なる電荷バリアントを分離するために使用される。例示的な塩例示的な塩グラジエントは、約０～約０．５ＭのＮａＣｌ、約０～約０．４ＭのＮａＣｌ、約０～約０．３ＭのＮａＣｌ、約０～約０．２ＭのＮａＣｌ、または約０～約０．１ＭのＮａＣｌである。
【0092】
１つ以上の実施形態では、方法は、第１のタンパク質産物（任意選択にはコバルト置換後）を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーカラム（「カラム２」）に装填し、フロースルーを収集して第２のタンパク質生成物（「第２のタンパク質産物」）を提供することをさらに含む。別の実施形態では、この方法はさらに、アルギナーゼ１を捕捉し、次いで溶出させて第３のタンパク質産物（「第３のタンパク質産物」）を提供する第３のカラムに第２のタンパク質産物を装填することを含む。いくつかの実施形態では、この第３のクロマトグラフィーカラム（「カラム３」）は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムまたはマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラムであり得る。
【0093】
様々な実施形態は、ｒｈＡＲＧ１には、Ｍｎ補因子を置き換えるためＣｏが担持されることを提供する。１つ以上の実施形態では、Ｃｏ担持は、Ｃｏ２＋塩、例えばＣｏＣｌ２を使用して実行される。インキュベーション時間は温度に依存するため、コバルト置換温度が低いほどインキュベーション時間は長くなり、コバルト置換温度が高いほど長いインキュベーション時間は必要ない。コバルト担持温度は１℃程度に低くまたは５０℃を超える場合があり、対応するインキュベーション時間は８時間以上または１０分未満の場合がある。
【0094】
様々な実施形態は、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１が、メトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＭＷ５０００）などのＰＥＧ化反応物と反応することを提供する。ＰＥＧ化反応物は通常、酵素と比較して１０～４０モル過剰で提供される。インキュベーション時間は０．５～４時間の範囲であり得る。ＰＥＧ化中のｐＨは、約８．４のｐＨなど、約８～約９であり得る。
【0095】
１つ以上の実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、アルギナーゼＩモノマー、グルコノイル化アルギナーゼＩ、ホスホグルコノイル化アルギナーゼＩ、２×グルコノイル化アルギナーゼＩ、グルコノイル化＋ホスホグルコノイル化アルギナーゼＩおよび２×ホスホグルコノイル化アルギナーゼＩを含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質であるｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、少なくとも７０％のアルギナーゼＩモノマーを含む。例示的な量には、少なくとも７０％、少なくとも７５、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％のアルギナーゼＩモノマーが含まれる。いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、１０％未満のグルコノイル化アルギナーゼＩを含む。例示的な量には、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％または約９％のグルコノイル化アルギナーゼＩ、またはこれらの値の間の任意の範囲が含まれるいくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、１０％未満のホスホグルコノイル化アルギナーゼＩを含む。例示的な量には、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％または約９％のホスホグルコノイル化アルギナーゼＩが含まれる、いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、少なくとも７０％のアルギナーゼＩモノマー、１０％未満のグルコノイル化アルギナーゼＩ、および１０％未満のホスホグルコノイル化アルギナーゼＩを含む。
【0097】
画像化されたキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）は、ＰＥＧ化三量体の不均一性のレベルによるｐｅｇ化タンパク質の一貫性の測定を提供する。１つ以上の実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１のｉｃＩＥＦ解析は、それぞれが９つの別個に帯電した種である、種－１、種－２、種－３、種－４、種－５、種－６、種－７、種－８、種－９に対応する９つの別個のピークである、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク５、ピーク６、ピーク－７、ピーク－８およびピーク－９を含む。各ピークの曲線下面積は、その特定の種の割合に対応する。１つ以上の実施形態では、特定のピークは、ピーク１＋２またはピーク３＋４などの関連種に対して一緒に組み合わせることができる。
【0098】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質であるｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク１の曲線下面積を、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、および約１０％未満の割合で含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク２の曲線下面積を、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、および約１０％未満の割合で含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、結合されたピーク１＋２の曲線下面積を、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、および約１０％未満の割合で含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク３＋４の曲線下面積を、約２％～約４０％、約２％～約３５％、約２％～約３０％、約２％～約２５％、約４％～約４０％、約４％～約３５％、約４％～約３０％、約４％～約２５％、約６％～約４０％、約６％～約３５％、約６％～約３０％、約６％～約２５％、約８％～約４０％、約８％～約３５％、約８％～約３０％、約８％～約２５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、および約１０％～約２５％の比率範囲で含む。
【0102】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク５の曲線下面積を、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％，１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、および約１５％～約２５％の比率範囲で含む。
【0103】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク６の曲線下面積を、約２％～約３５％、約２％～約３０％、約２％～約２５％、約２％～約２０％、約４％～約３５％、約４％～約３０％、約４％～約２５％、約４％～約２０％、約６％～約３５％、約６％～約３０％、約６％～約２５％、約６％～約２０％、約８％～約３５％、約８％～約３０％、約８％～約２５％、約８％～約２０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、および約１０％～約２０％の比率範囲で含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク７の曲線下面積を、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、および約１０％未満の比率で含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク８の曲線下面積を、約２５％未満未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、および約５％未満の比率で含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、精製されたＰＥＧ化タンパク質である、ｒｈＡＲＧ１またはＣｏ－ｒｈＡＲＧ１は、ピーク９の曲線下面積を、約１８％未満、約１６％未満、約１４％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、および約４％未満の比率で含む。
【0107】
ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの投与
本明細書に記載のｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ（およびそれらを含む組成物）は、静脈内、髄腔内、皮下、筋肉内、腫瘍内、および／または腹腔内を含む任意の適切な経路を介して投与することができる。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ（またはそれらを含む組成物）は、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）に投与される。ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを含む組成物は、生理学的に許容される液体、ゲルまたは固体の担体、希釈剤、および賦形剤と共に製剤で提供することができる。このような組成物は、典型的には、注射剤としての液体溶液または懸濁液として調製される。好適な希釈剤および賦形剤とは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールなど、およびこれらの組合せである。さらに、所望であれば、組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、安定化剤またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
本明細書に記載のｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ（およびそれらを含む組成物）は、静脈内、髄腔内、皮下、筋肉内、腫瘍内、および／または腹腔内を含む任意の適切な経路を介して投与することができる。１つ以上の実施形態では、ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ（またはそれらを含む組成物）は、静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）に投与される。ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを含む組成物は、生理学的に許容される液体、ゲルまたは固体の担体、希釈剤、および賦形剤と共に製剤で提供することができる。このような組成物は、典型的には、注射剤としての液体溶液または懸濁液として調製される。好適な希釈剤および賦形剤とは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールなど、およびこれらの組合せである。さらに、所望であれば、組成物は少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、安定化剤またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【0108】
ｒｈＡＲＧ１、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ（例えば、ペグジラルギナーゼ）の投与に関する例示的な方法および説明を以下に提供する。以下の記述はペグジラルギナーゼに固有のものであるが、方法および説明は他の組換えアルギナーゼ１および２酵素にも適用できる。
【0109】
推奨される静脈内投与レジメン：
治療を開始する前に、ベースラインの血漿アルギニン濃度を取得する。単回静脈内注入として週に１回投与されるＡＲＧ１－Ｄ患者に対するペグジラルギナーゼの最初の推奨投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇである。０．１０ｍｇ／ｋｇの初期用量で血漿アルギニンが≦１５０マイクロモル／Ｌのレベルに低下しない場合、用量は週に１回最大０．２０ｍｇ／ｋｇまで調整できる。治療中に血漿アルギニンレベルが５０マイクロモル／Ｌを下回った場合は、投与量を減らすことを検討する。ペグジラルギナーゼを５回以上静脈内投与したら、ＡＲＧ１－Ｄ患者にペグジラルギナーゼの皮下投与を使用することを検討し、血漿アルギニンレベルを定期的に監視し続ける。
治療を開始する前に、ベースラインの血漿アルギニン濃度を取得する。単回静脈内注入として週に１回投与されるＡＲＧ１－Ｄ患者に対するペグジラルギナーゼの最初の推奨投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇである。０．１０ｍｇ／ｋｇの初期用量で血漿アルギニンが≦１５０マイクロモル／Ｌのレベルに低下しない場合、用量は週に１回最大０．２０ｍｇ／ｋｇまで調整できる。治療中に血漿アルギニンレベルが５０マイクロモル／Ｌを下回った場合は、投与量を減らすことを検討する。ペグジラルギナーゼを５回以上静脈内投与したら、ＡＲＧ１－Ｄ患者にペグジラルギナーゼの皮下投与を使用することを検討し、血漿アルギニンレベルを定期的に監視し続ける。
【0110】
推奨される皮下投与レジメン：
ペグジラルギナーゼ静脈内投与から皮下投与に移行する場合、次に予定されている静脈内投与の代わりに、最初の皮下投与を行う。最初の皮下投与量は、最後に投与されたＩＶ投与量と同じｍｇ／ｋｇ投与量である必要がある。皮下投与量は、血漿アルギニンレベルが５０～１５０マイクロモル／Ｌの範囲にとどまるように、臨床的に示されるように変更することができる。
ペグジラルギナーゼ静脈内投与から皮下投与に移行する場合、次に予定されている静脈内投与の代わりに、最初の皮下投与を行う。最初の皮下投与量は、最後に投与されたＩＶ投与量と同じｍｇ／ｋｇ投与量である必要がある。皮下投与量は、血漿アルギニンレベルが５０～１５０マイクロモル／Ｌの範囲にとどまるように、臨床的に示されるように変更することができる。
【0111】
血中アルギニン監視：
ペグジラルギナーゼによる治療を開始した後、患者の血漿アルギニンレベルが５０～１５０μｍｏｌ／Ｌの目標範囲内になるまで、血漿アルギニン監視を実施する必要がある。その後、血中アルギニン制御を評価するために、定期的な血漿アルギニン監視が推奨される。皮下投与に変更する場合、または食事を変更する場合は、追加の血漿アルギニンモニタリングが必要になる場合がある。
ペグジラルギナーゼによる治療を開始した後、患者の血漿アルギニンレベルが５０～１５０μｍｏｌ／Ｌの目標範囲内になるまで、血漿アルギニン監視を実施する必要がある。その後、血中アルギニン制御を評価するために、定期的な血漿アルギニン監視が推奨される。皮下投与に変更する場合、または食事を変更する場合は、追加の血漿アルギニンモニタリングが必要になる場合がある。
【0112】
調製と投与の説明
ペグジラルギナーゼは、１ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬのペジラルギナーゼを含む１０ｍＬの使い捨てガラスバイアルに入った凍結液体製剤として供給される。ペグジラルギナーゼの各使い捨てガラスバイアルは、単回静脈内注射または皮下注射として使用することを目的としている。投与前に、粒子状物質と変色がないかペジラルギナーゼを視覚的に検査する。ペグジラルギナーゼは、無色からわずかに黄色またはわずかにピンク色の溶液である。変色、曇り、または粒子状物質がバイアルに存在する場合は廃棄する。バイアルからフリップトップを取り外す。バイアルのゴム栓をアルコール綿棒で拭いて消毒する。１８Ｇ針付きの滅菌シリンジを使用して、バイアルから適切な量の薬剤を取り出す。複数のバイアルが必要な場合は、別々の針を使用して各バイアルから溶液を引き出されたい。シリンジポンプで使用するためにバイアルから引き出す溶液を計算する。適切な量の薬剤が注射器に引き込まれたら、別の針を使用して通常の生理食塩水を引き込み、総量が４０ｍＬになるようにする。使用する薬剤の必要量を次のように計算する。１．０ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼの量＝患者の体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）５．０ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼの量＝患者の体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）
ペグジラルギナーゼは、１ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬのペジラルギナーゼを含む１０ｍＬの使い捨てガラスバイアルに入った凍結液体製剤として供給される。ペグジラルギナーゼの各使い捨てガラスバイアルは、単回静脈内注射または皮下注射として使用することを目的としている。投与前に、粒子状物質と変色がないかペジラルギナーゼを視覚的に検査する。ペグジラルギナーゼは、無色からわずかに黄色またはわずかにピンク色の溶液である。変色、曇り、または粒子状物質がバイアルに存在する場合は廃棄する。バイアルからフリップトップを取り外す。バイアルのゴム栓をアルコール綿棒で拭いて消毒する。１８Ｇ針付きの滅菌シリンジを使用して、バイアルから適切な量の薬剤を取り出す。複数のバイアルが必要な場合は、別々の針を使用して各バイアルから溶液を引き出されたい。シリンジポンプで使用するためにバイアルから引き出す溶液を計算する。適切な量の薬剤が注射器に引き込まれたら、別の針を使用して通常の生理食塩水を引き込み、総量が４０ｍＬになるようにする。使用する薬剤の必要量を次のように計算する。１．０ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼの量＝患者の体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）５．０ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼの量＝患者の体重（ｋｇ）×用量レベル（ｍｇ／ｋｇ）
【0113】
シリンジポンプを使用して、３０分以上にわたる静脈内注入によりペグジラルギナーゼを投与する。
【表3】
【0114】
１つ以上の実施形態では、皮下注射の体積は、最大体積を有し、例えば、成人患者の場合は最大２ｍＬ／注射、および／または小児患者の場合は最大体積１ｍＬ／注射である。皮下投与の計算された体積が最大体積よりも大きい場合は、より高いバイアル濃度を使用する（例えば、１ｍｇ／ｍＬではなく５ｍｇ／ｍＬ）か、体積を複数の小さな注射に分割することができる（例えば、４ｍＬの注射はそれぞれ２ｍＬの２つの注射に分割される）。
【0115】
剤型と強度
ペグジラルギナーゼ注射液は無色からわずかに黄色またはわずかにピンク色の溶液で１０ｍＬバイアルで次のように利用可能である：
１０ｍＬバイアルで次のように利用可能：
ａ．注射用溶液：１．０ｍｇ／ｍＬの５ｍＬ
ｂ．注射用溶液：５．０ｍｇ／ｍＬの５ｍＬ
ペグジラルギナーゼ注射液は無色からわずかに黄色またはわずかにピンク色の溶液で１０ｍＬバイアルで次のように利用可能である：
１０ｍＬバイアルで次のように利用可能：
ａ．注射用溶液：１．０ｍｇ／ｍＬの５ｍＬ
ｂ．注射用溶液：５．０ｍｇ／ｍＬの５ｍＬ
【0116】
警告と注意事項
ペグジラルギナーゼの投与により過敏反応が起こることがある。ペグジラルギナーゼ注入中および注入後の急性アレルギー反応（蕁麻疹、そう痒症、紅斑、低血圧、頻脈など）の兆候と症状についてすべての患者を監視する。重度の過敏反応の場合は、ペグジラルギナーゼの投与を直ちに遅らせるか中止し、適切な医療を行う。投薬前に、鎮静作用少ない抗ヒスタミン薬による患者の前投薬を検討されたい。コルチコステロイドが必要な場合は、高アンモニア血症を引き起こす可能性があるため、注意して使用する必要がある。
ペグジラルギナーゼの投与により過敏反応が起こることがある。ペグジラルギナーゼ注入中および注入後の急性アレルギー反応（蕁麻疹、そう痒症、紅斑、低血圧、頻脈など）の兆候と症状についてすべての患者を監視する。重度の過敏反応の場合は、ペグジラルギナーゼの投与を直ちに遅らせるか中止し、適切な医療を行う。投薬前に、鎮静作用少ない抗ヒスタミン薬による患者の前投薬を検討されたい。コルチコステロイドが必要な場合は、高アンモニア血症を引き起こす可能性があるため、注意して使用する必要がある。
【0117】
妊娠：妊娠カテゴリーＢ
生殖試験は、１００ｍｇ／ｋｇまでの用量でマウスおよびラットで実施された。ペグジラルギナーゼによる胎児への害の証拠はなかった。しかし、妊婦を対象とした適切で十分に管理された研究はない。動物の生殖研究は、必ずしも人間の反応を予測するものではないため、妊娠中はペグジラルギナーゼは明らかに必要な場合にのみ使用する必要がある。
生殖試験は、１００ｍｇ／ｋｇまでの用量でマウスおよびラットで実施された。ペグジラルギナーゼによる胎児への害の証拠はなかった。しかし、妊婦を対象とした適切で十分に管理された研究はない。動物の生殖研究は、必ずしも人間の反応を予測するものではないため、妊娠中はペグジラルギナーゼは明らかに必要な場合にのみ使用する必要がある。
【0118】
授乳中の母親
ペグジラルギナーゼが母乳に存在するかどうかは不明である。母乳育児の発達上および健康上の利点は、ペグジラルギナーゼに対する母親の臨床的必要性、および母乳育児中の子供に対する薬物による潜在的な悪影響とともに考慮する必要がある。
ペグジラルギナーゼが母乳に存在するかどうかは不明である。母乳育児の発達上および健康上の利点は、ペグジラルギナーゼに対する母親の臨床的必要性、および母乳育児中の子供に対する薬物による潜在的な悪影響とともに考慮する必要がある。
【0119】
説明
ペグジラルギナーゼは、コバルト置換された組換えヒトアルギナーゼＩ酵素であり、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）に共有結合的にコンジュゲートし、アルギナーゼ１と同じ反応を触媒して、アルギニンをオルニチンと尿素に変換する作用をする。ヒトアルギナーゼ１は二核マンガン金属酵素である。ペグジラルギナーゼを産生するには、マンガン補因子をコバルトに置き換えて、Ｃｏ－アルギナーゼＩを生成する。アルギナーゼＩの活性部位での天然マンガン（Ｍｎ＋２）をコバルト（Ｃｏ＋２）に置換すると、生理的ｐＨでの安定性と触媒活性が向上する。ペグ化は循環半減期を延長する。ペグジラルギナーゼの平均分子量はおよそ２８４ｋＤａである。ペグジラルギナーゼは、タンパク質含有量１ｍｇ当たりおよそ３２０～６００単位の範囲の比活性を有する。１活性単位は、３７℃で１分当たり１マイクロモルのアルギニンをオルニチンに変換するために必要な酵素の量として定義される。
ペグジラルギナーゼは、コバルト置換された組換えヒトアルギナーゼＩ酵素であり、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）に共有結合的にコンジュゲートし、アルギナーゼ１と同じ反応を触媒して、アルギニンをオルニチンと尿素に変換する作用をする。ヒトアルギナーゼ１は二核マンガン金属酵素である。ペグジラルギナーゼを産生するには、マンガン補因子をコバルトに置き換えて、Ｃｏ－アルギナーゼＩを生成する。アルギナーゼＩの活性部位での天然マンガン（Ｍｎ＋２）をコバルト（Ｃｏ＋２）に置換すると、生理的ｐＨでの安定性と触媒活性が向上する。ペグ化は循環半減期を延長する。ペグジラルギナーゼの平均分子量はおよそ２８４ｋＤａである。ペグジラルギナーゼは、タンパク質含有量１ｍｇ当たりおよそ３２０～６００単位の範囲の比活性を有する。１活性単位は、３７℃で１分当たり１マイクロモルのアルギニンをオルニチンに変換するために必要な酵素の量として定義される。
【0120】
ペグジラルギナーゼは、静脈内または皮下注入を目的としており、５０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭのリン酸カリウム、および１．５％ｗ／ｖグリセロールを含み、ｐＨ７．４である、１ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬの濃度の緩衝液で製剤化された、無菌の透明な無色からわずかに黄色またはわずかにピンク色の溶液として供給される。透明な使い捨てのガラスバイアルに防腐剤を含まない滅菌溶液として提供される。１ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼ製剤の各バイアルには、５ｍＬの製剤が含まれている（バイアル当たり５ｍｇペグジラルギナーゼ）。５ｍｇ／ｍＬペグジラルギナーゼ製剤の各バイアルには、５ｍＬの製剤が含まれる（バイアル当たり２５ｍｇペグジラルギナーゼ）。バイアルはコーティングされたゴム製ストッパーで栓をされ、アルミニウム製のフリップオフシールで密封され、≦－６０℃で凍結保存され、使用前に解凍される。
【0121】
薬力学
アルギナーゼ１欠損症の成人および小児患者のペグジラルギナーゼ治療により、血中アルギニン濃度が治療前のベースライン値から通常の血中アルギニン範囲である４０～１１５マイクロモル／Ｌに減少した。Ｌ－アルギニンの最大抑制は、投与後およそ８時間で観察され、用量依存的に減少し、投与後１６８時間までに投与前レベルまで回復した。ペグジラルギナーゼとアルギニンの間に強い相関が観察され、ＩＶ投与後のアルギニンに対する即時の抑制効果、および投与後２４時間以内にアルギニン濃度の最大の減少に達した。
アルギナーゼ１欠損症の成人および小児患者のペグジラルギナーゼ治療により、血中アルギニン濃度が治療前のベースライン値から通常の血中アルギニン範囲である４０～１１５マイクロモル／Ｌに減少した。Ｌ－アルギニンの最大抑制は、投与後およそ８時間で観察され、用量依存的に減少し、投与後１６８時間までに投与前レベルまで回復した。ペグジラルギナーゼとアルギニンの間に強い相関が観察され、ＩＶ投与後のアルギニンに対する即時の抑制効果、および投与後２４時間以内にアルギニン濃度の最大の減少に達した。
【0122】
薬物動態：
１４人の被験者にＩＶ投与した後、ペグジラルギナーゼの薬物動態とアルギニンの関係を特性評価するために、０～１６８時間の投与間隔全体を通して薬物動態試料を収集した。用量範囲（０．０１５ｍｇ／ｋｇ～０．２ｍｇ／ｋｇ）全体で、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０～１６８で測定したペグジラルギナーゼ曝露は、用量にほぼ比例して増加し、用量が１３倍に増加すると、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０～１６８が１４倍に増加した。週１回のＩＶ投与レジメンの後にペグジラルギナーゼの蓄積は、観察されず、用量範囲全体でＴ１／２は約３０時間であり、曝露測定基準の被験者間変動は低から中程度（１３～４６％ＣＶ）であった。
１４人の被験者にＩＶ投与した後、ペグジラルギナーゼの薬物動態とアルギニンの関係を特性評価するために、０～１６８時間の投与間隔全体を通して薬物動態試料を収集した。用量範囲（０．０１５ｍｇ／ｋｇ～０．２ｍｇ／ｋｇ）全体で、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０～１６８で測定したペグジラルギナーゼ曝露は、用量にほぼ比例して増加し、用量が１３倍に増加すると、ＣｍａｘおよびＡＵＣ０～１６８が１４倍に増加した。週１回のＩＶ投与レジメンの後にペグジラルギナーゼの蓄積は、観察されず、用量範囲全体でＴ１／２は約３０時間であり、曝露測定基準の被験者間変動は低から中程度（１３～４６％ＣＶ）であった。
【0123】
動物毒性学および／または薬理学
アルギニンレベルに対するペグジラルギナーゼの薬理学的効果は、アルギナーゼＩの新生児トランスジェニックマウスモデルおよび成体マウスのタモキシフェン誘発アルギナーゼ欠損モデルで評価された。これらのモデルは、循環するアルギニンとアルギニンのカタボライトがかなり過剰に存在するという点で、人間の病気を模倣しているが、ただし、アルギナーゼＩ欠損症のヒトとは異なり、これらの動物は重度で一般的に致命的な高アンモニア血症を発症する。薬理学的効果はまた、高アルギニン血症のラットアルギニン誘発モデルで評価された。ペグジラルギナーゼは、用量依存的に血漿アルギニンレベルを低下させた。
アルギニンレベルに対するペグジラルギナーゼの薬理学的効果は、アルギナーゼＩの新生児トランスジェニックマウスモデルおよび成体マウスのタモキシフェン誘発アルギナーゼ欠損モデルで評価された。これらのモデルは、循環するアルギニンとアルギニンのカタボライトがかなり過剰に存在するという点で、人間の病気を模倣しているが、ただし、アルギナーゼＩ欠損症のヒトとは異なり、これらの動物は重度で一般的に致命的な高アンモニア血症を発症する。薬理学的効果はまた、高アルギニン血症のラットアルギニン誘発モデルで評価された。ペグジラルギナーゼは、用量依存的に血漿アルギニンレベルを低下させた。
【0124】
ペグジラルギナーゼの潜在的毒性およびＴＫは、生後（ＰＮＤ）２１日目の幼若ラット（２歳のヒトに相当）に、０．１、０．３、および１．０ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス注射を週１回、６か月間投与し、その後６週間の回復期間を設けて評価した。ペグジラルギナーゼは忍容性が高く、被験物質に関連する死亡率はなく、摂食量、凝固、検尿、検眼鏡検査、性的成熟、成長ホルモン分析、骨髄分析、機能観察バッテリ評価（ＦＯＢ）、神経行動試験（聴覚驚愕馴化、運動活動、またはモリス水泳迷路）に有意な被験物質の影響は観察されなかった。６ヶ月の終末および６週間の回復間隔の終わりにペグジラルギナーゼ関連の肉眼的所見はなかった。不利な微視的変化は精巣と精巣上体に限定され、雄生殖器の重量の減少と０．３および１．０ｍｇ／ｋｇでの不利な精子分析所見と相関していた。１．０ｍｇ／ｋｇでは、精子の運動性の低下、尾側精巣上体の精子数の減少、精子濃度の低下、異常な精子の割合の増加など、精子分析に悪影響が見られた。これらの観察結果は、直接的な治療関連の影響とみなされ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの精巣における微妙な尿細管変性の顕微鏡的変化と相関していた。対照群と１．０ｍｇ／ｋｇ群の６週間の回復期間後、これらの変化は、異常な精子と精子数の割合の増加を除いて、全体的に可逆的であった。正常な精子の発達サイクルは約９週間であるか、６週間の回復期間よりも長いため、６週間後の部分的な可逆性は予想外ではなかった。
【0125】
重要なことに、組織病理学によって観察された明らかなＰＥＧ化効果はなかった。毒物動態学データは、ペグジラルギナーゼ曝露が研究を通して維持されたことを示した。結論として、雌のＮＯＡＥＬは１．０ｍｇ／ｋｇであった。雄では、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇでの精巣の微視的変化に基づいて、ＮＯＡＥＬは０．１ｍｇ／ｋｇであった。
【0126】
ペグジラルギナーゼの潜在的毒性とＴＫは、カニクイザルに０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｋｇの用量で１３週間、週１回の静脈内ボーラス注射を行い、その後４週間の回復期間を経て評価した。１．０ｍｇ／ｋｇで観察された臨床症状には、体重の減少、まばらな毛の発生率の増加（全身）、皮膚の乾燥／変色（全身）、振戦、食欲不振、水様便、活動性低下、運動失調、筋消耗、および／またはボサボサの／円背の外観が含まれていた。臨床病理パラメータ（凝固、成長ホルモン、および検尿）、ＥＣＧおよび眼科検査、呼吸数、および血圧評価では、治療に関連する影響は認められなかった。
【0127】
供給方法／保管および取り扱い
ペグジラルギナーゼは注射用溶液として提供されている。
ペグジラルギナーゼは注射用溶液として提供されている。
【0128】
ペグジラルギナーゼは凍結状態で供給される（≦－６０℃）。希釈したペグジラルギナーゼはすぐに使用する必要がある。すぐに使用できない場合は、希釈したペジラルギナーゼを投与中に２℃～８℃（３６°Ｆ～４６°Ｆ）で最大８時間保存できる。
【実施例】
【0129】
本開示のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本開示は、以下の説明で後述する構築またはプロセスステップの詳細に限定されないことを理解されたい。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践または実施することができる。
【0130】
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される：ｅｑ（当量）、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロモル）、ｍＭ（ミリモル）、Ｎ（規定）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ
（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＭＷ（分子量）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ｍｉｎ（分）。
（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＭＷ（分子量）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ｍｉｎ（分）。
【0131】
実施例１：陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（カラム１）
好ましい実施形態では、アルギナーゼ１は、カチオン交換カラム（ＣＥＸ）に捕捉されて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、およびエンドトキシンなどの産物関連の不純物およびプロセス関連の不純物を低減する（精製プロセスの概要については、図３を参照されたい）。特定の実施形態では、アルギナーゼ１精製プロセスの第１のカラム（カラム１）クロマトグラフィーステップは、ＳＰセファロースＦＦ樹脂および入口熱交換器を使用する。カラム１は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ｐＨ７．６の塩の非存在下でアルギナーゼ１に結合し、塩濃度を上げた緩衝液で溶出する（図４（ａ））。一実施形態では、塩はＮａＣｌであり、カラム１からの溶出は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．６を使用して室温で行う。しかしながら、カラム１へのＮａＣｌグラジエントの適用などの代替の実施形態が可能である。
好ましい実施形態では、アルギナーゼ１は、カチオン交換カラム（ＣＥＸ）に捕捉されて、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、およびエンドトキシンなどの産物関連の不純物およびプロセス関連の不純物を低減する（精製プロセスの概要については、図３を参照されたい）。特定の実施形態では、アルギナーゼ１精製プロセスの第１のカラム（カラム１）クロマトグラフィーステップは、ＳＰセファロースＦＦ樹脂および入口熱交換器を使用する。カラム１は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ｐＨ７．６の塩の非存在下でアルギナーゼ１に結合し、塩濃度を上げた緩衝液で溶出する（図４（ａ））。一実施形態では、塩はＮａＣｌであり、カラム１からの溶出は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．６を使用して室温で行う。しかしながら、カラム１へのＮａＣｌグラジエントの適用などの代替の実施形態が可能である。
【0132】
図４（ａ）は、カラム１でのアルギナーゼ１の代表的な精製を示す。およそ３リットルの清澄化Ｅ．Ｃｏｌｉ溶解物を陽イオン交換カラムに装填した。２８０ｎｍでの高レベルの吸光度からわかるように、大量のタンパク質がカラムに結合せず、フロースルーで検出される。次に、カラムをおよそ２リットルのカラム洗浄液で洗浄した。２８０ｎｍでの吸光度で検出されたように、アルギナーゼ１が濃縮された画分は、０．１Ｍ のＮａＣｌで溶出された（最終ピーク）。
【0133】
実施例２：コバルト置換
好ましい実施形態では、アルギナーゼ１天然マンガン補酵素は、コバルトによって置き換えられる。コバルト置換（コバルト担持とも呼ばれる）中に、アルギナーゼ１に通常存在する２つのマンガンイオンの一方または両方がコバルトイオンに置き換えられる。コバルトの置換ステップには様々な温度を使用でき、コバルトの濃度も幅広く使用できる（表２を参照されたい）。コバルト置換のインキュベーション時間は１０分と短く、５０℃以上で実行できる。逆に、コバルトの担持温度は１℃または５℃と低く、８時間を超えて実行できる。また、アルギナーゼ１に担持されるコバルトの割合が高いほど、比活性が高くなる。
好ましい実施形態では、アルギナーゼ１天然マンガン補酵素は、コバルトによって置き換えられる。コバルト置換（コバルト担持とも呼ばれる）中に、アルギナーゼ１に通常存在する２つのマンガンイオンの一方または両方がコバルトイオンに置き換えられる。コバルトの置換ステップには様々な温度を使用でき、コバルトの濃度も幅広く使用できる（表２を参照されたい）。コバルト置換のインキュベーション時間は１０分と短く、５０℃以上で実行できる。逆に、コバルトの担持温度は１℃または５℃と低く、８時間を超えて実行できる。また、アルギナーゼ１に担持されるコバルトの割合が高いほど、比活性が高くなる。
【0134】
カラム１（カラム１プールとも呼ばれる）から溶出されたアルギナーゼ１は、コバルト置換ステップのために室温で保持できる。一実施形態では、塩化コバルト原液（０．５ＭのＣｏＣｌ２）は、それをカラム１プールに規定の速度で添加することによって５０倍に希釈され、最終塩化コバルト濃度は１０ｍＭである。次にコバルト置換を２０℃で２時間混合する。別の実施形態では、アルギナーゼ１コバルト担持は、１０ｍＭ ＣｏＣｌ２ の溶液中で、室温で約２時間～約８時間行われる。
【0135】
コバルト担持ステップの概要を表３に示す。
【表4】
【0136】
実施例３：限外濾過／ダイアフィルトレーション１（ＵＦ／ＤＦ１）
ＵＦ／ＤＦ１は、遊離コバルトイオンを除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーの準備としてＣｏ－アルギナーゼ１を溶液に交換する。ＵＦ／ＤＦ１ステップでは、分子量カットオフが３０ｋＤａの膜を使用する。このステップの重要な機能の１つは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、遊離コバルトのレベルを下げ、Ｃｏ－アルギナーゼ１プールを緩衝液交換することである。膜を洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。規準化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）透水性試験（ＮＷＰ）が実行され、その後、産生で使用する前に平衡化される。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化したら、Ｃｏ－アルギナーゼ１プールを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６に対して３ダイアボリューム、続いて４ダイアボリュームの５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．４に対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後、プールは再循環され、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．４でシステムのホールドアップ体積の２倍を使用してシステムから回収される。
ＵＦ／ＤＦ１は、遊離コバルトイオンを除去し、陰イオン交換クロマトグラフィーの準備としてＣｏ－アルギナーゼ１を溶液に交換する。ＵＦ／ＤＦ１ステップでは、分子量カットオフが３０ｋＤａの膜を使用する。このステップの重要な機能の１つは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、遊離コバルトのレベルを下げ、Ｃｏ－アルギナーゼ１プールを緩衝液交換することである。膜を洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。規準化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）透水性試験（ＮＷＰ）が実行され、その後、産生で使用する前に平衡化される。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化したら、Ｃｏ－アルギナーゼ１プールを２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６に対して３ダイアボリューム、続いて４ダイアボリュームの５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．４に対してダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後、プールは再循環され、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．４でシステムのホールドアップ体積の２倍を使用してシステムから回収される。
【0137】
ＵＦ／ＤＦ１膜は、２ＭのＮａＣｌフラッシュを実行した後、０．５ＮのＮａＯＨを使用して３０分間再循環させた変性洗浄ステップを実行することにより、洗浄される。システムを精製水で洗い流し、ＮＷＰを試験して洗浄手順の有効性を評価する。膜は０．１ＮのＮａＯＨで保存できる。
【0138】
代替の実施形態において、緩衝液の第１の交換は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２～７．６への交換であり、第２の交換は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．１～８．５への交換である。
【0139】
実施例４：陰イオンカラムクロマトグラフィー（カラム２）
アルギナーゼ１精製の好ましい実施形態は、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーである別のカラム（「カラム２」）を使用する。カラム２の一実施形態は、ＱセファロースＦＦ樹脂である。このカラム２ステップの１つの機能は、ＵＦ／ＤＦ１プールからの宿主細胞ＤＮＡやエンドトキシンなどのプロセス関連不純物を低減することである。カラム２は、Ｃｏ－アルギナーゼ１が流れる間にこれらの不純物を結合し、装填および洗浄ステップ中にカラム流出液に収集される。一実施形態では、カラム２の陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーは、ＱセファロースＦＦを用いて実行され、最大４０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂が、緩衝液５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．１～８．５を有するカラムに装填される。
アルギナーゼ１精製の好ましい実施形態は、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーである別のカラム（「カラム２」）を使用する。カラム２の一実施形態は、ＱセファロースＦＦ樹脂である。このカラム２ステップの１つの機能は、ＵＦ／ＤＦ１プールからの宿主細胞ＤＮＡやエンドトキシンなどのプロセス関連不純物を低減することである。カラム２は、Ｃｏ－アルギナーゼ１が流れる間にこれらの不純物を結合し、装填および洗浄ステップ中にカラム流出液に収集される。一実施形態では、カラム２の陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーは、ＱセファロースＦＦを用いて実行され、最大４０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂が、緩衝液５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．１～８．５を有するカラムに装填される。
【0140】
方法の別の実施形態では、アルギナーゼ１がフロースルーで回収されている間、第１のタンパク質産物が陰イオン交換カラムに装填されて不純物を捕捉する。図４（ｂ）は、陰イオン交換カラム（カラム２）でのアルギナーゼ１精製の代表的なクロマトグラムである。２８０ｎｍでの吸光度からわかるように、フロースルーで大量のタンパク質が検出される。不純物はカラム２に捕捉され、カラム２プール（第２のタンパク質産物とも呼ばれる）に溶出されず、アルギナーゼ１がさらに濃縮される。
【0141】
実施例５：Ｃａｐｔｏマルチモーダルカラムクロマトグラフィー（カラム３）
好ましい実施形態では、アルギナーゼ精製プロセスは、第３のカラムクロマトグラフィーカラム（カラム３）を使用する。一実施形態では、カラム３はＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、またはサイズ排除カラムである。ＭＭＣを使用する実施形態は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、およびエンドトキシンなどのプロセス関連不純物がフロースルーで洗い流されている間に、カラム上のアルギナーゼ１を捕捉する。この実施形態において、Ｃｏ－アルギナーゼ１は、ｐＨ８．４の塩の非存在下でカラムによって捕捉され得、次いで、Ｃｏ－アルギナーゼ１は、増加させた塩濃度の緩衝液で溶出され得る。Ｃａｐｔｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ Ｃａｔｉｏｎ交換クロマトグラフィーカラムの代表的な例を図４（ｃ）に示す。
好ましい実施形態では、アルギナーゼ精製プロセスは、第３のカラムクロマトグラフィーカラム（カラム３）を使用する。一実施形態では、カラム３はＣａｐｔｏマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム、またはサイズ排除カラムである。ＭＭＣを使用する実施形態は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、およびエンドトキシンなどのプロセス関連不純物がフロースルーで洗い流されている間に、カラム上のアルギナーゼ１を捕捉する。この実施形態において、Ｃｏ－アルギナーゼ１は、ｐＨ８．４の塩の非存在下でカラムによって捕捉され得、次いで、Ｃｏ－アルギナーゼ１は、増加させた塩濃度の緩衝液で溶出され得る。Ｃａｐｔｏ Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ Ｃａｔｉｏｎ交換クロマトグラフィーカラムの代表的な例を図４（ｃ）に示す。
【0142】
一実施形態では、ＭＭＣクロマトグラフィー（カラム３）は、およそ１５カラム体積を使用して、最大３０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂を装填し、高塩濃度ステップ溶出は、５０ｍＭのトリス、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．１～８．５で実行される。いくつかの実施形態では、陰イオン交換カラム（カラム２）からのフロースルーをｐＨ８．４のＣａｐｔｏ ＭＭＣカラムに装填し、洗浄し、次に結合したＣｏ－アルギナーゼ１を５０ｍＭのトロメタミン、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを使用して溶出する。
【0143】
実施例６：限外濾過／ダイアフィルトレーション２（ＵＦ／ＤＦ２）
ＵＦ／ＤＦ２はアルギナーゼ１を濃縮し、タンパク質をプレＰＥＧ化中間体に交換する。ＵＦ／ＤＦ２ステップでは、分子量カットオフが３０ｋＤａの膜を使用する。このステップの重要な機能は、ＰＥＧ化前（または追加の濾過と保存前）に、非ＰＥＧ化Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体のカラム３プールを緩衝液交換することである。膜を洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化したら、カラム３プール（第３のタンパク質産物とも呼ばれる）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４に対して、５つのダイアボリュームでダイアフィルトレーションする。カラム３のプール濃度が＜８ｇ／ｌの場合、プールはさらに８ｇ／Ｌに濃縮される。ダイアフィルトレーション（および必要に応じて濃縮）後、プールは再循環され、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４でシステムのホールドアップ体積の２倍を使用して、システムから回収される。回収後、ダイアフィルトレーション溶液による２段階希釈を使用できる。第１の希釈の濃度目標は６ｇ／Ｌで、第２のステップの濃度目標は５ｇ／Ｌである。目標に到達するために２つのステップを使用できる。第１の希釈後の濃度が目標範囲内にある場合は、第２のステップは必要ない場合がある。
ＵＦ／ＤＦ２はアルギナーゼ１を濃縮し、タンパク質をプレＰＥＧ化中間体に交換する。ＵＦ／ＤＦ２ステップでは、分子量カットオフが３０ｋＤａの膜を使用する。このステップの重要な機能は、ＰＥＧ化前（または追加の濾過と保存前）に、非ＰＥＧ化Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体のカラム３プールを緩衝液交換することである。膜を洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化したら、カラム３プール（第３のタンパク質産物とも呼ばれる）を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４に対して、５つのダイアボリュームでダイアフィルトレーションする。カラム３のプール濃度が＜８ｇ／ｌの場合、プールはさらに８ｇ／Ｌに濃縮される。ダイアフィルトレーション（および必要に応じて濃縮）後、プールは再循環され、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ７．４でシステムのホールドアップ体積の２倍を使用して、システムから回収される。回収後、ダイアフィルトレーション溶液による２段階希釈を使用できる。第１の希釈の濃度目標は６ｇ／Ｌで、第２のステップの濃度目標は５ｇ／Ｌである。目標に到達するために２つのステップを使用できる。第１の希釈後の濃度が目標範囲内にある場合は、第２のステップは必要ない場合がある。
【0144】
実施例７：中間体濾過およびＵＦ／ＤＦ３
ＰＥＧ化反応の前に、コバルト含有アルギナーゼ１は、長期凍結を含む長期保存が可能である。中間体のＣｏ－アルギナーゼは、０．２μｍフィルターで濾過することができ、長期保存のために凍結することができる。
ＰＥＧ化反応の前に、コバルト含有アルギナーゼ１は、長期凍結を含む長期保存が可能である。中間体のＣｏ－アルギナーゼは、０．２μｍフィルターで濾過することができ、長期保存のために凍結することができる。
【0145】
ＵＦ／ＤＦ３ステップでは、分子量カットオフが３０ｋＤａの膜を使用する。このステップの１つの機能は、緩衝液交換とフィルター処理されたＵＦ／ＤＦ２プール（新鮮または解凍）を濃縮して、ＰＥＧ化に最適な条件を提供することである。凍結したＣｏ－アルギナーゼ１中間体を出発物質として使用する場合、解凍は室温で最大３６時間行われる。膜を洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。規準化された透水性試験（ＮＷＰ）が実行され、その後、産生で使用する前に平衡化される。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化されると、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体は、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．４）に対して５つのダイアボリュームでダイアフィルトレーションされる。ダイアフィルトレーション後、プールは濃縮され、再循環され、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．４でシステムのホールドアップ体積の２倍を使用してシステムから回収される。回収後、ダイアフィルトレーション液で２段階希釈する。第１の希釈の濃度目標は１１ｇ／Ｌで、第２のステップの濃度目標は１０ｇ／Ｌである。目標がレベルであることを容易にするために２つのステップが利用される。第１の希釈後の濃度が目標範囲内にある場合は、第２のステップは必要ない場合がある。
【0146】
ＵＦ／ＤＦ２およびＵＦ／ＤＦ３のステップに関して、第１の緩衝液交換は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５％のグリセロール、ｐＨ７．４、≧５ＤＶ、およびタンパク質をおよそ５．０ｍｇ／ｍＬに濃縮することができる。第２のバッファー交換は、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．１～８．５にでき、タンパク質はおよそ１０．０ｍｇ／ｍＬに濃縮される（原薬のＰＥＧ化のための調製において）。
【0147】
実施例８：アルギナーゼ１のＰＥＧ化
ＰＥＧ化は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）をＣｏ－アルギナーゼ１（原薬）分子に共有結合させる（ＰＥＧ化ステップの代表的な実施形態については、表４を参照されたい）。一実施形態では、ＰＥＧ化反応は、５０００ＤａのＰＥＧ分子をＣｏ－アルギナーゼ１に共有結合させる。代替の実施形態では、ＰＥＧ化は、アルギナーゼ１のコバルト置換の前に、または産生プロセスの他の時点で実行することができる。一実施形態では、ＰＥＧコンジュゲーション反応では、Ｃｏ－アルギナーゼ１上の立体的に利用可能なリジンと反応する固体または液体のメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステルを使用できる。得られたＰＥＧ化タンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）の分子量は約２８０ｋＤａである。ＰＥＧ化されたプールは濾過され、ＵＦ／ＤＦ４操作まで２～８℃で保存できる。
ＰＥＧ化は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）をＣｏ－アルギナーゼ１（原薬）分子に共有結合させる（ＰＥＧ化ステップの代表的な実施形態については、表４を参照されたい）。一実施形態では、ＰＥＧ化反応は、５０００ＤａのＰＥＧ分子をＣｏ－アルギナーゼ１に共有結合させる。代替の実施形態では、ＰＥＧ化は、アルギナーゼ１のコバルト置換の前に、または産生プロセスの他の時点で実行することができる。一実施形態では、ＰＥＧコンジュゲーション反応では、Ｃｏ－アルギナーゼ１上の立体的に利用可能なリジンと反応する固体または液体のメトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステルを使用できる。得られたＰＥＧ化タンパク質（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）の分子量は約２８０ｋＤａである。ＰＥＧ化されたプールは濾過され、ＵＦ／ＤＦ４操作まで２～８℃で保存できる。
【表5】
【0148】
一実施形態では、固体メトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＭＷ ５０００）を、１９．３倍モル過剰でアルギナーゼ１含有溶液に添加し、０．５～４．０時間、ｐＨ８．４でインキュベートすることができる。
【0149】
ＰＥＧ化に続いて、限外濾過／ダイアフィルトレーションにより、結合していないＰＥＧを除去し、アルギナーゼ１を製剤緩衝液に交換し、製剤ステップのためにアルギナーゼ１を濃縮する。このＵＦ／ＤＦ４ステップでは、分子量カットオフが１００ｋＤａの膜を使用する。このステップの１つの機能は、遊離ＰＥＧを除去しながら、ＰＥＧプールを最終製剤に緩衝液交換することである。この目的で使用される膜を、洗浄液（０．５ＮのＮａＯＨ）で消毒し、水ですすぐ。ＵＦ／ＤＦシステムが平衡化したら、ＰＥＧ。プールを５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．４に対して１０ダイアボリュームでダイアフィルトレーションする。ダイアフィルトレーション後、プールは圧力をかけてシステムから回収される。回収されたＵＦ／ＤＦ４プールは、最終的な濾過および充填ステップの前に、５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％（ｗ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７．４で５ｇ／Ｌに希釈される。代替の実施形態では、アルギナーゼ１を２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５％のグリセロール、ｐＨ７．４に交換し、約５．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に調整する。
【0150】
いくつかの実施形態では、製剤緩衝液、５ｍＭのリン酸カリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５％のグリセロール、ｐＨ７．４は、リン酸ナトリウム緩衝液などの他の緩衝液と比較して、アルギナーゼ１の貯蔵時の安定性を増強することが見出された。１つ以上の実施形態では、緩衝液５ｍＭのリン酸カリウムは、１ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４および４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む。
【0151】
原薬（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ）は、活性化されたＰＥＧ分子をリジンのε－アミノ基およびＮ末端アミノ酸のアミン基とコンジュゲートさせることによって作られたＰＥＧ化コバルト置換ヒトアルギナーゼ１である。オルトフタルジアルデヒドを使用して、タンパク質当たりのＰＥＧ分子のモル比を決定するために色素ベースの蛍光アッセイが使用される。オルトフタルジアルデヒドは、チオールの存在下で、特に第一級アミンと反応して、蛍光誘導体を形成する。蛍光シグナルの測定により、タンパク質分子に存在する反応性遊離アミンの定量が可能になる。定量は、Ｎ－アセチルリジンを使用した標準曲線に基づく。タンパク質当たりのＰＥＧ化アミンの数は、非コンジュゲートＣｏ－アルギナーゼ１に存在する遊離アミンの理論上の数から、ＰＥＧ化原薬の蛍光アッセイによって測定された遊離アミンの数を差し引くことによって決定できる。リシン残基とＮ末端アミノ酸からの遊離アミンの理論上の数は２５である。原薬中の遊離非コンジュゲートＰＥＧは、屈折率による検出を備えたＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定される。結果は、遊離ＰＥＧのμｇ／ｍＬとして表すことができる（表５を参照されたい）。
【表6】
【0152】
実施例９：薬物中間体のＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ特性評価
Ｅ．ｃｏｌｉの発酵中に、様々なアルギナーゼ１電荷バリアントが産生され得る。電荷バリアントは、ＴＳＫゲル陽イオン交換カラムを使用する陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ）法で分析できる。このタイプの分析では、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ ６．０の移動相（Ａ）と２０ｍＭのＭＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ６．０の移動相Ｂ、１．０ｍＬ／分の流量、４０．０分の実行時間、２２℃のカラム温度、表６による移動相グラジエントを使用する。
Ｅ．ｃｏｌｉの発酵中に、様々なアルギナーゼ１電荷バリアントが産生され得る。電荷バリアントは、ＴＳＫゲル陽イオン交換カラムを使用する陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ）法で分析できる。このタイプの分析では、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ ６．０の移動相（Ａ）と２０ｍＭのＭＥＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ６．０の移動相Ｂ、１．０ｍＬ／分の流量、４０．０分の実行時間、２２℃のカラム温度、表６による移動相グラジエントを使用する。
【表7】
【0153】
分析前に、試料を製剤緩衝液で希釈する。結果は、パーセント電荷バリアント分布として記述される。代表的なクロマトグラムを図５（ａ）に示し、通常、Ｃｏアルギナーゼ１中間体で６つの主要なピークが観察される。
【0154】
実施例１０：原薬のｉＣＩＥＦ特性評価
薬物中間体はＰＥＧ化されて原薬を形成する。薬物中間体のＰＥＧ化は、薬物中間体ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ法の使用を、本発明の一部として開発された他の実施形態よりも不適切にする。陰イオンＩＥＸ－ＨＰＬＣを評価したが、十分な分離が得られなかった。その代わり、原薬の電荷バリアントを分析するために、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）法が開発された。
薬物中間体はＰＥＧ化されて原薬を形成する。薬物中間体のＰＥＧ化は、薬物中間体ＣＩＥＸ－ＨＰＬＣ法の使用を、本発明の一部として開発された他の実施形態よりも不適切にする。陰イオンＩＥＸ－ＨＰＬＣを評価したが、十分な分離が得られなかった。その代わり、原薬の電荷バリアントを分析するために、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）法が開発された。
【0155】
イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）の分析対象物は、電界の存在下でヒドロニウムイオン（陽極液）とヒドロキシルイオン（陰極液）の逆移動によってキャピラリー内を移動する。試料は、キャリア両性電解質とｐＩマーカーを含有するマトリックスで希釈される。タンパク質の分離は、２つのフォーカシング（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）ステップで行われる。最初のプレフォーカシング（ｐｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）ステップは、ｐＨグラジエントを確立する。電荷バリアントは、第２のより高い電圧のフォーカシングステップ中に、より鋭く集束され、分離される。キャピラリー全体のＵＶ光吸収の画像は、３０秒ごとに、およびフォーカシングステップの完了後にデジタルで捕らえられる。
【0156】
結果は、パーセント電荷バリアント分布として表すことができる。代表的な電気泳動図を図５（ｂ）に示し、原薬について９つの主要なピークが観察されている。ピーク３と４は、これらのピーク間の分解能が可変であることが示されているため、一緒に統合されている。これらのピークの相対面積を表７に示す。
【表8】
【0157】
実施例１１：Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体および原薬の酵素活性
活性を測定し、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の同一性を確立するために使用される酵素アッセイは、アルギニンからオルニチンへの変換を監視する。反応混合物は、０～２ｍＭの範囲で７つの異なるアルギニン基質濃度で試験された１つの酵素濃度を有する。反応は３７℃で一定時間行う。反応時間は、任意の基質濃度で基質の消費が１０％未満になるように設定されている。反応がクエンチされ、産物であるオルニチンが誘導体化され、逆相ＵＰＬＣによって定量化される。［００１８３］ 反応速度対基質濃度のプロットの例を、代表的なＫｃａｔ、Ｋｍ、およびＫｃａｔ／Ｋｍ 値とともに図８（ａ）（Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体）および図８（ｂ）（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬）に示す。
活性を測定し、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体およびＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬の同一性を確立するために使用される酵素アッセイは、アルギニンからオルニチンへの変換を監視する。反応混合物は、０～２ｍＭの範囲で７つの異なるアルギニン基質濃度で試験された１つの酵素濃度を有する。反応は３７℃で一定時間行う。反応時間は、任意の基質濃度で基質の消費が１０％未満になるように設定されている。反応がクエンチされ、産物であるオルニチンが誘導体化され、逆相ＵＰＬＣによって定量化される。［００１８３］ 反応速度対基質濃度のプロットの例を、代表的なＫｃａｔ、Ｋｍ、およびＫｃａｔ／Ｋｍ 値とともに図８（ａ）（Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体）および図８（ｂ）（Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬）に示す。
【0158】
実施例１２：コバルトとマンガンの分析
コバルト、残留マンガン、および遊離コバルトは、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して測定された。サンプルをマイクロ波で分解し、１％硝酸と６％過酸化水素を使用して、マトリックスからすべての金属を放出した。得られた消化物をＩＣＰ－ＭＳで分析した。コバルトと残留マンガンの試料は、試料処理なしで分解された。酵素と結合していないコバルトを測定するために、酵素を透過液から分離するために限外濾過を行った透過液試料について遊離コバルトを測定した。遊離コバルトを測定した。表８に、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体の特性の一部をまとめた。
コバルト、残留マンガン、および遊離コバルトは、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）を使用して測定された。サンプルをマイクロ波で分解し、１％硝酸と６％過酸化水素を使用して、マトリックスからすべての金属を放出した。得られた消化物をＩＣＰ－ＭＳで分析した。コバルトと残留マンガンの試料は、試料処理なしで分解された。酵素と結合していないコバルトを測定するために、酵素を透過液から分離するために限外濾過を行った透過液試料について遊離コバルトを測定した。遊離コバルトを測定した。表８に、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体の特性の一部をまとめた。
【表9】
【表10】
【0159】
実施例１３：Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体翻訳後修飾
Ｃｏ－アルギナーゼ１の中間体翻訳後修飾は、ペプチドマッピング、ＬＣ－ＭＳインタクト質量分析、逆相ＬＣ／ＭＳなどの様々な技術を使用して検出された。同定されたすべての修飾の要約を表１０に示す。
Ｃｏ－アルギナーゼ１の中間体翻訳後修飾は、ペプチドマッピング、ＬＣ－ＭＳインタクト質量分析、逆相ＬＣ／ＭＳなどの様々な技術を使用して検出された。同定されたすべての修飾の要約を表１０に示す。
【表11】
【0160】
特性評価により、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体
修飾が存在する場合、主な修飾はＮ末端グルコノイル化であることが判明した（ペプチドマッピングによって確認された）。アルギナーゼ１修飾種の追加の特性評価は、３つの時点（発酵、ポストカラム１、およびカラム３からの薬物中間体）で採取した試料を試験することによって実行された。分析方法では、通常、アルギナーゼを分離してモノマーとして分析する必要がある。アルギナーゼ１のＮ末端グルコノイル化（モノマーとして分析）は、通常１０．８～１３．９％であった。その他の修飾は、３つの時点の試料にわたるＮ末端ホスホグルコノイル化モノマー（４．３～６．５％）、およびジグルコノイル化モノマー（０．７～１．２％）であった。標準参照産生の実行から使用された試料では、未修飾のＣｏ－アルギナーゼ１（モノマー）とＣｏ－アルギナーゼ１中間体のレベルはそれぞれ８０．６％～８３．６％で同等であった。精製プロセスに使用される標準条件（すなわち、カラム１に塩グラジエントが適用されていない）は、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体まで持続する未修飾モノマーの相対レベルを適度に変化させた（８１．１～８３．６％）。
修飾が存在する場合、主な修飾はＮ末端グルコノイル化であることが判明した（ペプチドマッピングによって確認された）。アルギナーゼ１修飾種の追加の特性評価は、３つの時点（発酵、ポストカラム１、およびカラム３からの薬物中間体）で採取した試料を試験することによって実行された。分析方法では、通常、アルギナーゼを分離してモノマーとして分析する必要がある。アルギナーゼ１のＮ末端グルコノイル化（モノマーとして分析）は、通常１０．８～１３．９％であった。その他の修飾は、３つの時点の試料にわたるＮ末端ホスホグルコノイル化モノマー（４．３～６．５％）、およびジグルコノイル化モノマー（０．７～１．２％）であった。標準参照産生の実行から使用された試料では、未修飾のＣｏ－アルギナーゼ１（モノマー）とＣｏ－アルギナーゼ１中間体のレベルはそれぞれ８０．６％～８３．６％で同等であった。精製プロセスに使用される標準条件（すなわち、カラム１に塩グラジエントが適用されていない）は、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体まで持続する未修飾モノマーの相対レベルを適度に変化させた（８１．１～８３．６％）。
【表12】
【0161】
実施例１４：カラム１の条件の変化
代替の実施形態では、ＮａＣｌグラジエントをカラム１に適用することができる。カラム１でＮａＣｌグラジエントを使用すると、様々なアルギナーゼ１バリアントを分離して、好ましい実施形態を選択できる。図７は、カラム１に適用された０．０～０．２ ＭＮａＣｌのグラジエントを示す。カラム１の溶出液から収集した個々の画分を、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ、およびＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。
代替の実施形態では、ＮａＣｌグラジエントをカラム１に適用することができる。カラム１でＮａＣｌグラジエントを使用すると、様々なアルギナーゼ１バリアントを分離して、好ましい実施形態を選択できる。図７は、カラム１に適用された０．０～０．２ ＭＮａＣｌのグラジエントを示す。カラム１の溶出液から収集した個々の画分を、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ、およびＲＰ－ＨＰＬＣで分析した。
【0162】
アルギナーゼ１の電荷バリアントのピーク数を１から６に割り当てる分析ＣＥＸ－ＨＰＬＣ法を使用した（図５（ｃ）を参照されたい）。ピーク数は、様々なグルコノイル化状態および非グルコノイル化アルギナーゼ１と一致する。この分析は、ＮａＣｌグラジエントから溶出されたアルギナーゼ１の６つのピークを示した。ピーク番号１、２、および３が割り当てられたアルギナーゼ１バリアントは、カラム１の溶出ピークの初期に溶出した。ピーク４は溶出されたアルギナーゼ１とピーク５（未修飾アルギナーゼ１）の最高濃度部分から溶出し、ピーク６は溶出ピークの後半で溶出した。したがって、０．０～０．２ＭのＮａＣｌは、アルギナーゼ１の様々な電荷バリアントをうまく分離した。
【0163】
０～０．５ＭのＮａＣｌなどの代替ＮａＣｌグラジエントをカラム１の溶出に使用できる。ＮａＣｌグラジエントを使用すると、アルギナーゼ１が６つの異なるピークに再現性よく分離され、原薬または製剤の製造でさらに処理するための特定のアルギナーゼ１バリアントの選択が可能になることがわかった。
【0164】
第１のタンパク質産物（およびアルギナーゼ１バリアント）のさらなる分析もＬＣ／ＭＳによって分析された（図６を参照されたい）。ＬＣ／ＭＳ分析は、Ｅ．ｃｏｌｉでのアルギナーゼ１の産生によって生成される特定のタイプのグルコニル化を同定する。ＬＣ／ＭＳ分析により、未修飾アルギナーゼ１、グルコニル化アルギナーゼ１、ホスホグルコニル化アルギナーゼ１、および２倍（２Ｘ）のグルコニル化アルギナーゼ１が同定される。
【0165】
表１２は、０～０．２ＭのＮａＣｌグラジエント（および対応する分画されたＣＥＸピーク１～６）を適用すると、グルコニル化のレベルが異なる画分が生成されることを示している。ピーク番号１～６のそれぞれをＬＣ／ＭＳで分析した。データは、ドミナントピーク（ピーク５）が非グルコニル化アルギナーゼ１の割合が高く、比活性が高いことを示す。目的の特性に応じて、様々な画分（ピーク１～６に対応）を収集してさらに処理することができる。
【表13】
【0166】
カラム１のＮａＣｌ濃度を変化させることに加えて、異なる量のタンパク質をカラム１に装填して、非グルコニル化アルギナーゼ１種の精製を強化することができる。
【0167】
カラム１の装填係数を変化させ、カラム１でＮａＣｌグラジエントを使用すると、グルコニル化アルギナーゼ１種を産生するＥ．ｃｏｌｉ発酵中に発生する予期しない摂動を補償できる。
【0168】
実施例１５：発酵条件の変化
アルギナーゼ１を生産するための発酵条件の頑健性を決定するために実験を行った。表１３は、最適以下のｐＨ７．６でのＥ．ｃｏｌｉの発酵が、好ましいｐＨ７．２の発酵よりも多くのグルコニル化を産生することを示している。容器Ｂ１、Ｂ８、およびＢ１２は、発酵の最適条件を使用した：ｐＨ ７．２、溶存酸素３０％、培地の供給速度０．０６ｍＬ／分。容器Ｂ３は、ｐＨ ７．６（最適条件よりも高いｐＨ）でアルギナーゼ１発現Ｅ．ｃｏｌｉを発酵させるのに使用した。ｐＨの上昇により、ホスホグルコニル化付加物の割合が高くなった（対照実験では２３％対１０～１２％）
アルギナーゼ１を生産するための発酵条件の頑健性を決定するために実験を行った。表１３は、最適以下のｐＨ７．６でのＥ．ｃｏｌｉの発酵が、好ましいｐＨ７．２の発酵よりも多くのグルコニル化を産生することを示している。容器Ｂ１、Ｂ８、およびＢ１２は、発酵の最適条件を使用した：ｐＨ ７．２、溶存酸素３０％、培地の供給速度０．０６ｍＬ／分。容器Ｂ３は、ｐＨ ７．６（最適条件よりも高いｐＨ）でアルギナーゼ１発現Ｅ．ｃｏｌｉを発酵させるのに使用した。ｐＨの上昇により、ホスホグルコニル化付加物の割合が高くなった（対照実験では２３％対１０～１２％）
【表14】
【0169】
実施例１６：カラム１の装填係数の変動
様々な量のＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物をカラム１に適用して、アルギナーゼ１電荷バリアントの精製への影響、および収量と純度を測定した。１５～６０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂の装填係数を様々な条件下で使用したところ、ＣＩＥＸ電荷種プロファイルのシフトが示された（表１４）。より高い装填係数は、グルコニル化バリアントのより良い分離をもたらした（ただし、収集された画分によっては、収量のトレードオフが生じる場合がある）。例えば、装填係数が２０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の場合、ピーク５は４５．８％であったが、装填係数が４０ｍｇ／ｍＬの場合、これは５０．０％に増加した。
様々な量のＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物をカラム１に適用して、アルギナーゼ１電荷バリアントの精製への影響、および収量と純度を測定した。１５～６０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂の装填係数を様々な条件下で使用したところ、ＣＩＥＸ電荷種プロファイルのシフトが示された（表１４）。より高い装填係数は、グルコニル化バリアントのより良い分離をもたらした（ただし、収集された画分によっては、収量のトレードオフが生じる場合がある）。例えば、装填係数が２０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の場合、ピーク５は４５．８％であったが、装填係数が４０ｍｇ／ｍＬの場合、これは５０．０％に増加した。
【表15】
【0170】
実施例１７：第１／２相臨床試験
本発明の方法によって産生された製剤は、アルギナーゼ１欠損症および高アルギニン血症におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの投与を評価するための第１／２相非盲検研究で使用された。この研究の主要評価項目は、高アルギナーゼ／アルギナーゼ１欠損症の被験者におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの静脈内（ＩＶ）投与の安全性と忍容性を評価することであった。副次的評価項目は次のとおりであった：血漿アルギニン濃度に対するＩＶ投与された治験薬の効果を決定すること、血漿グアニジノ化合物（ＧＣ）に対するＩＶ投与された治験薬の効果を決定すること、ＩＶ投与された治験薬の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを特性評価すること。その他の評価項目には、次のような臨床的利益を獲得する際の臨床転帰評価の評価が含まれる：６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）パートＤおよびＥ、および適応行動評価システム（ＡＢＡＳ）。
本発明の方法によって産生された製剤は、アルギナーゼ１欠損症および高アルギニン血症におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの投与を評価するための第１／２相非盲検研究で使用された。この研究の主要評価項目は、高アルギナーゼ／アルギナーゼ１欠損症の被験者におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの静脈内（ＩＶ）投与の安全性と忍容性を評価することであった。副次的評価項目は次のとおりであった：血漿アルギニン濃度に対するＩＶ投与された治験薬の効果を決定すること、血漿グアニジノ化合物（ＧＣ）に対するＩＶ投与された治験薬の効果を決定すること、ＩＶ投与された治験薬の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを特性評価すること。その他の評価項目には、次のような臨床的利益を獲得する際の臨床転帰評価の評価が含まれる：６分間歩行試験（６ＭＷＴ）、粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）パートＤおよびＥ、および適応行動評価システム（ＡＢＡＳ）。
【0171】
第１／２相のデータは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧが血漿アルギニンを持続的に低下させるのに非常に効果的であることを示した。さらに、患者の血漿アルギニンレベルの制御は、可動性および適応行動における臨床的に意味のある応答を伴っていた。治療では一般的に忍容性が良好であった。過敏反応はまれであり、標準的な手段で管理可能であった。
【0172】
研究のために供給されたＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ製剤は、１ｍｇ／ｍＬの濃度で５ｍＬの製剤化された製剤を含む１０ｍＬの使い捨てのガラスバイアル内の液体製剤としてのものであった。この薬剤は、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、４ｍＭの ＫＨ２ＰＯ４、および１．５％ｗ／ｖのグリセロールで処方された。
【0173】
第１／２相研究、次の２つの部で実施された：第１部（単回漸増用量増加）および第２部（反復投与）。この第１／２相試験１０１Ａおよび１０２Ａ非盲検継続投与の試験デザインを下の図に示す：
【化2】
【0174】
第１部では、患者に薬を紹介し、安全性に焦点を当てた。第２部では、患者を一定の用量で安定させ、臨床的効果のマーカーを探すように設計された。各部の前に、アルギニンレベルのベースライン評価を行なった。第１部に参加したすべての患者は、継続投与の資格があれば、第２部でアルギナーゼ１の投与を継続できる。
【0175】
この研究では、各患者は、第１部で漸増する可能性のある開始用量の投与を受け、各連続する用量レベルの間に２週間のウォッシュアウト／観察期間が設けられた。第１部の各患者の可能な用量は、血漿アルギニンを最適化するために必要に応じて２週間間隔で０．０１５、０．０３、０．０６、０．１０、０．１５、０．２０、および０．３０ｍｇ／ｋｇであった。以前の用量レベルからの新たなデータが特定の基準を満たした場合、特定の用量を繰り返すか、指定された用量レベルの間で用量を増加／減少させることができる。例えば、次の用量漸増停止基準の１つ以上が満たされた場合、用量漸増は停止する可能性がある：患者の血漿アルギニンレベルが、その期間中に収集されたすべての試料について、投与後少なくとも４０（±２）時間連続して＜４０μＭであったか、または患者の血漿アルギニンレベルが、その期間中に収集されたすべての試料について、投与後少なくとも１１２（±２）時間連続して平均＜１１５μＭであった。
【0176】
これらの事象のいずれも発生しなかった場合、用量漸増停止基準に達するか、このプロトコルで０．３０ｍｇ／ｋｇの最高用量を投与されるまで、患者は２週間ごとに次に高い用量レベルのアルギナーゼ１に漸増する可能性がある。最終的には、治療目的で、投与量が０．３０ｍｇ／ｋｇを超えて増加する可能性もある。
【0177】
第２部は、第１部を完了した患者の反復投与期間であった。第２部では、反復投与中に血漿アルギニンを約４０μＭ～約１１５μＭの範囲で安全に最適化し、投与前のレベルを１５０～２００μＭ未満に維持することに重点を置いて、各患者の用量とレジメンを見いだした。データが反復投与中の用量反応結果をよりよく調査する可能性を示していれば、第２部でいくつかの用量レベルを使用することも可能であった。治療中のアルギニンレベルも、治療前に測定されたアルギニンレベルと比較された。
【0178】
１０１Ａの第２部を完了した患者は、長期の非盲検継続投与（ＯＬＥ）試験（ＮＣＴ０３３７８５３１）に参加する資格があった。２４の週１回の静脈内投与で、残りの３年間のＯＬＥ期間中は皮下投与に切り替えるオプションがある。
【0179】
結果
平均Ｃｍａｘ および平均ＡＵＣ０－１６８の増加は、すべての患者で用量に比例しているように見えた。平均（±ＳＤ）Ｃｍａｘは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量レベルが０．０１５、０．０３、０．０６、０．１、および０．２ｍｇ／ｋｇの場合、それぞれ０．４２８±０．０９１５、０．７２３±０．２４７、１．７３±０．５３８、２．２７±０．２３８、および６．１３（Ｎ＝１）μｇ／ｍＬであった。ＡＤＡ陽性患者とＡＤＡ陰性患者の平均Ｃｍａｘには、わずかな抗薬物抗体（ＡＤＡ）の影響があった（図９）。
平均Ｃｍａｘ および平均ＡＵＣ０－１６８の増加は、すべての患者で用量に比例しているように見えた。平均（±ＳＤ）Ｃｍａｘは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量レベルが０．０１５、０．０３、０．０６、０．１、および０．２ｍｇ／ｋｇの場合、それぞれ０．４２８±０．０９１５、０．７２３±０．２４７、１．７３±０．５３８、２．２７±０．２３８、および６．１３（Ｎ＝１）μｇ／ｍＬであった。ＡＤＡ陽性患者とＡＤＡ陰性患者の平均Ｃｍａｘには、わずかな抗薬物抗体（ＡＤＡ）の影響があった（図９）。
【0180】
ＡＵＣの変化（ＡＵＣ０－１６８、ＡＵＣ０－∞）は、研究された用量範囲全体で用量に比例しているように見え、０．０６～０．１ｍｇ／ｋｇの間に顕著な変化は認められなかった（入手可能なデータを使用）。平均クリアランス（ＣＬ）の推定値は、すべての患者で０．７８９～１．５７ｍＬ／時間／ｋｇ、ＡＤＡ陰性患者で０．７７６～１．３３ｍＬ／時間／ｋｇの範囲であった。平均分布容積（Ｖｓｓ）の推定値は、すべての患者で３５．３～５２．１ｍＬ／ｋｇ、ＡＤＡ陰性患者で３２．８～５２．１ｍＬ／ｋｇの範囲であった。
【0181】
研究の第１部は、観察されたＰＤ（アルギニン）応答を使用して、第２部の各患者に最適な（個々の）開始用量を選択するのに役立った。第２部の１週目では、評価された用量範囲全体でＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量を漸増させたすべての患者で、平均循環薬物濃度が増加する傾向があった。第２部でＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの初回投与後、平均Ｃｍａｘの増加は、すべての患者で用量に比例するように見えた。平均（±ＳＤ）Ｃｍａｘは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量レベルが０．０１５、０．０３、０．０４、０．０６、０．０９、０．１および０．１２ｍｇ／ｋｇの場合、それぞれ０．２９２（Ｎ＝１）、０．３９５（Ｎ＝１）、１．０１±０．２２１、１．７５±０．３９１、１．９９（Ｎ＝１）、２．３４（Ｎ＝１）、および２．８７±０．６２６μｇ／ｍＬであった。
【0182】
第２部、８週目では、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量を増やすにつれて、すべての患者の平均循環薬物濃度は概ね増加した。８週目で利用可能なＰＫ濃度に顕著なＡＤＡの影響はなかった。データの結果、現時点ではほとんど（１３／１４）の患者で定常状態の達成が想定されていた。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの８回目のＱＷ投与後、平均Ｃｍａｘ およびＡＵＣ０－１６８ の増加は、すべての患者で投与量に比例するように見えた。
【0183】
薬物動態データに加えて、薬力学（アルギニン）データが収集された（図１０）。アルギナーゼ１欠損症の患者には、第２部でＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧのＱＷ ＩＶ用量を（毎週）投与し、第１部で観察されたＰＤ（アルギニン）応答に基づいて開始用量を選択した。Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの初回のＱＷ ＩＶ投与後、特に０．０４ｍｇ／ｋｇ以上のＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ投与では、循環アルギニンレベルの顕著な低下が見られた。いくつかの例では、個々のアルギニン濃度が４０μＭを下回った。さらに、≧０．０４ｍｇ／ｋｇの用量で、２回目のＱＷ（毎週）Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ用量の投与直前にほとんどの患者で開始アルギニンレベルへの回復は不完全であった。
【0184】
全体として、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧへの曝露は概して増加し、用量を増やすとアルギニン抑制も増加した。個別の用量最適化は第１部で実施され、第２部の１週目と８週目に、用量レベルごとに患者数の異なる範囲の用量が存在するようにした。
【0185】
実施例１８：皮下投与
実施例１７の第１／２相試験の第２部が完了した後、一部の患者はＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの静脈内投与から皮下投与に切り替えられた。驚くべきことに、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与は、ＩＶ投与よりも優れているように見える薬力学的プロファイルを与えた。また、予期せぬことに、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与には、静脈内投与と同じ製剤がうまく使用された。
実施例１７の第１／２相試験の第２部が完了した後、一部の患者はＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの静脈内投与から皮下投与に切り替えられた。驚くべきことに、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与は、ＩＶ投与よりも優れているように見える薬力学的プロファイルを与えた。また、予期せぬことに、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与には、静脈内投与と同じ製剤がうまく使用された。
【0186】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与は、ＩＶ投与よりも長い血漿アルギニン濃度の好ましい（健康な）目標範囲内に患者のアルギニンレベルを維持した（図１１）。患者における好ましい最適化された血漿アルギニン濃度は、約４０μＭ～約１１５μＭの範囲であり（反復投与中）、投与前の１５０～２００μＭ未満のレベルを維持することに重点を置いている。図１１に見られるように、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの皮下投与は、アルギニン濃度が４０μＭの下限レベルを上回り、１１５μＭの上限レベルを下回る結果になる。驚くべきことに、皮下投与は完全に好ましい範囲にあるアルギニン濃度を与えた。これは、別の毎週のＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ投与を受けるまで、患者がアルギニン濃度の適切な血漿範囲にとどまることを意味する。
【0187】
実施例１９：第１／２相臨床試験および非盲検継続投与からの薬力学的および臨床応答
１６人の患者（小児１１人と成人５人）が１０１Ａ第１部に登録され、１５人の患者が１０１Ａ第２部に進んだ。２人の患者が個人的な理由で試験を中止しました（第１部の投与３の後の１人の患者と第２部の投与３の後の１人の患者）。１０１Ａ第２部を完了した１４人の患者全員がＯＬＥ試験に進んだ。
１６人の患者（小児１１人と成人５人）が１０１Ａ第１部に登録され、１５人の患者が１０１Ａ第２部に進んだ。２人の患者が個人的な理由で試験を中止しました（第１部の投与３の後の１人の患者と第２部の投与３の後の１人の患者）。１０１Ａ第２部を完了した１４人の患者全員がＯＬＥ試験に進んだ。
【0188】
患者のベースライン特性を表１５に示す。
【表16】
【0189】
血漿アルギニンおよびグアニジノ化合物レベルの分析により、血漿アルギニンレベルの顕著な持続的な低下が見られた（図１２（ａ）は、ペグジラルギナーゼの２０回投与後のベースラインから中央値で２７４μＭ低下したことを示す。ベースラインから投与１、投与８、およびＯＬＥへの血漿アルギニンの低下は統計的に有意であった（ｐ＜０．００１）。血漿アルギニンの低下は、血漿グアニジノ化合物（ＧＣ）レベルの低下を伴った。図１２（ｂ）は、ベースラインでのグアニジノ酢酸（ＧＡＡ）、Ｎ－α－アセチル－Ｌ－アルギニン（ＮＡＡ）、α－ケト－δ－グアニジノ酢酸（ＧＶＡ）、アルギニン酸（ＡＲＧＡ）の血漿レベルと、ＯＬＥ中の血漿ＧＣレベルの低下を示している。
【0190】
１６人の患者のうち１５人がベースラインですべての可動性評価を完了した（患者１３は車椅子生活にあった）（図１３（ａ））。欠損は以下のように定義された：６ＭＷＴ：下位５パーセンタイル未満；ＧＭＦＭパートＤ：＜３５／３９；ＧＭＦＭパートＥ：＜６８／７２；ＡＢＡＳ－３：≦８５。患者の８８％（１４／１６）は、ベースラインで少なくとも１つの運動欠損があり、１６人の患者の８８％、５０％、５６％は、それぞれ６ＭＷＴ、ＧＭＦＭパートＤ、ＧＭＦＭパートＥでベースラインの欠損があると分類された。適応行動ＡＢＡＳ－３評価は、ベースラインで１０人の患者に利用可能であった。言語、年齢、認知障害による制約など、技術的な理由で６人の患者は試験を受けなかった１０人中８人（８０％）の患者は、ＡＢＡＳ－３によって評価された１つ以上のドメインでベースラインに欠損があった。
【0191】
全体的な臨床応答は、６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、またはＧＭＦＭ－Ｅ評価の少なくとも１つで≧１のＭＣＩＤ改善に基づいて、１４人の患者のうち１１人（７９％）が投与２０の応答者として定義されたことを示した（図１３（ｂ））。２０回投与データは、６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、およびＧＭＦＭ－Ｅが、ＡＲＧ１－Ｄ患者の臨床的利益を獲得するための変化に対して十分に敏感であることを示した。全体的な応答者の割合は、投与８から投与２０に大幅に増加した。投与４４に達した５人の患者全員（１００％）は、応答者として投与２０の全体的な臨床応答状態を維持した。
【0192】
個々の構成要素のすべての応答者で、≧１のＭＣＩＤが改善された（図１３（ｂ）および図１４）。６ＭＷＴの場合、１３人中７人（５４％）の患者がこの構成要素のみの応答者であった。６ＭＷＴの平均変化は、すべての患者で３２メートル、７人の応答者で６６メートルであった。ＧＭＦＭ－Ｄの場合：ベースライン欠損のある８人中５人（６３％）の患者は、この構成要素のみの応答者であった（平均ＭＣＩＤ １．８４、範囲１．２１～３．３３）。ＧＭＦＭ－Ｅの場合：ベースライン欠損のある８人中５人（６３％）の患者は、この構成要素のみの応答者であった（平均ＭＣＩＤ ４．７９、範囲１．６７～８．３３）。個々の可動性構成要素に対する応答者の割合は、投与８と比較して投与２０で実質的に大きかった。
【0193】
ペグジラルギナーゼの２０回投与後のすべての患者からのデータは、血漿アルギニンの顕著な持続的な低下、重要な疾患症状の改善、および７９％の臨床応答者率を示した。第１／２相およびＯＬＥ試験は、ペグジラルギナーゼの臨床的利点を獲得するためのツールとして６ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、またはＧＭＦＭ－Ｅを利用することの価値を示している。ペグジラルギナーゼは忍容性が高く、治療に関連する有害事象の発生率は時間の経過とともに減少した。アルギニン制御の改善とペジラルギナーゼ治療後の臨床的有益性の証拠は、重要な第３相ＰＥＡＣＥ試験（ＮＣＴ０３９２１５４１）の主要な評価項目とデザイン要素のさらなる検証を提供する。
【0194】
実施例２０：第３相臨床試験デザイン
アルギナーゼ１欠損症の小児および成人におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの有効性と安全性に関する無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験が、本発明の方法で産生されたＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを使用して実施される。この試験は現在、アルギナーゼ１欠損症の臨床評価項目に対するペジラルギナーゼ効果（Ｐｅｇｚｉｌａｒｇｉｎａｓｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ａｒｇｉｎａｓｅ １ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）、またはＰＥＡＣＥ（ＣＡＥＢ１１０２－３００Ａ、ＮＣＴ０３９２１５４１）として進行中である。
アルギナーゼ１欠損症の小児および成人におけるＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの有効性と安全性に関する無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験が、本発明の方法で産生されたＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを使用して実施される。この試験は現在、アルギナーゼ１欠損症の臨床評価項目に対するペジラルギナーゼ効果（Ｐｅｇｚｉｌａｒｇｉｎａｓｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ Ａｒｇｉｎａｓｅ １ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）、またはＰＥＡＣＥ（ＣＡＥＢ１１０２－３００Ａ、ＮＣＴ０３９２１５４１）として進行中である。
【0195】
この第３相試験の試験デザインを下の図に示す：２５
【化3】
【0196】
主要な選択基準
ａ．ＡＲＧ１－Ｄと診断され、血漿アルギニンレベルが≧２５０μｍｏｌ／Ｌであり、医療指導の下２００μｍｏｌ／Ｌの血漿アルギニンを達成した患者の割合の統計的検定が可能な２歳以上のもの
ｂ．盲検期間中、安定した一貫した食事を維持することができること
ｃ．盲検期間中、アンモニア捕捉剤、抗てんかん療法および／または痙縮治療薬の安定した投与が可能であること
ｄ．臨床評価を実施し、成功裏に完了することができ、表１６に示す副次的臨床応答評価項目の構成要素のうちの１つがベースラインで欠損していること。
ａ．ＡＲＧ１－Ｄと診断され、血漿アルギニンレベルが≧２５０μｍｏｌ／Ｌであり、医療指導の下２００μｍｏｌ／Ｌの血漿アルギニンを達成した患者の割合の統計的検定が可能な２歳以上のもの
ｂ．盲検期間中、安定した一貫した食事を維持することができること
ｃ．盲検期間中、アンモニア捕捉剤、抗てんかん療法および／または痙縮治療薬の安定した投与が可能であること
ｄ．臨床評価を実施し、成功裏に完了することができ、表１６に示す副次的臨床応答評価項目の構成要素のうちの１つがベースラインで欠損していること。
【0197】
主要な除外基準
ａ．治療開始前６週間以内に入院を必要とする高アンモニア血症が発症
ｂ．最初のペグジラルギナーゼ投与を受ける前３週間以内の活動性感染症
ｃ．ジレット機能評価質問票（ＧＦＡＱ）で評価できないまたはＧＦＡＱでスコア１と定義される、極端な運動欠損（全く歩けない）
ｄ．ペグジラルギナーゼによる以前の介入研究に参加した、または現在他の臨床試験に参加している
ｅ．ポリエチレングリコールに対する過敏症の病歴
ａ．治療開始前６週間以内に入院を必要とする高アンモニア血症が発症
ｂ．最初のペグジラルギナーゼ投与を受ける前３週間以内の活動性感染症
ｃ．ジレット機能評価質問票（ＧＦＡＱ）で評価できないまたはＧＦＡＱでスコア１と定義される、極端な運動欠損（全く歩けない）
ｄ．ペグジラルギナーゼによる以前の介入研究に参加した、または現在他の臨床試験に参加している
ｅ．ポリエチレングリコールに対する過敏症の病歴
【表17】
【0198】
この第３相試験の主要評価項目は、血漿アルギニンの低減である（活性群とプラセボ群の個々の患者のベースラインからの変化の治療手段に基づく、２４週目の血漿アルギニンレベルのベースラインからの変化）。
【0199】
副次的評価項目尺度には以下が含まれる：
ａ．臨床応答評価項目：臨床応答者は、表１７に定義されているように、２４週目に２ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、またはＧＭＦＭ－Ｅ臨床応答評価項目の少なくとも１つが改善した患者として定義される
ｂ．臨床反応評価項目の個々の構成要素の奏功率
ｃ．その他の臨床転帰評価
ｉ．機能的移動能力評価尺度 ５，５０，５００ ｍｅｔｅｒｓ
ｉｉ．ジレット機能評価質問票（ＧＦＡＱ）
ｉｉｉ．ヴァインランド適応行動尺度ＩＩ
ｄ．免疫原性を含む安全性の評価
ｅ．血漿アルギニンが＜２００μＭで正常範囲内（４０～１１５μＭ）の患者の割合
ｆ．ペグジラルギナーゼの薬物動態プロファイルの特性評価
ａ．臨床応答評価項目：臨床応答者は、表１７に定義されているように、２４週目に２ＭＷＴ、ＧＭＦＭ－Ｄ、またはＧＭＦＭ－Ｅ臨床応答評価項目の少なくとも１つが改善した患者として定義される
ｂ．臨床反応評価項目の個々の構成要素の奏功率
ｃ．その他の臨床転帰評価
ｉ．機能的移動能力評価尺度 ５，５０，５００ ｍｅｔｅｒｓ
ｉｉ．ジレット機能評価質問票（ＧＦＡＱ）
ｉｉｉ．ヴァインランド適応行動尺度ＩＩ
ｄ．免疫原性を含む安全性の評価
ｅ．血漿アルギニンが＜２００μＭで正常範囲内（４０～１１５μＭ）の患者の割合
ｆ．ペグジラルギナーゼの薬物動態プロファイルの特性評価
【表18】
【0200】
研究の合計期間は、長期の非盲検継続投与期間を含めて、被験者当たりおよそ１７８週間になると予想される（３～４週間のスクリーニング期間、２４週間の治療期間、その後最大１５０週間の非盲検継続投与期間）。被験者は、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧまたは容量調整プラセボを毎週１回ＩＶ注入（およそ３０分）を受ける。血漿アルギニン値のみに基づくＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧの用量変更は、投薬アルゴリズムに従って、非盲検の薬剤師および／または医師によって実施される。盲検化された長期継続投与期間の最初の８週間後、被験者は、治験責任医師および治験依頼者の承認を得て、皮下投与によりＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧを投与するオプションがある。初期ｍｇ／ｋｇ皮下投与量はＩＶ投与量と同じであり得る。
【0201】
Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧに割り当てられた被験者は、用量レベル２（以下の表１８を参照）、０．１０ｍｇ／ｋｇで開始する。来診５から、必要に応じて、血漿アルギニン値に基づく用量変更は、以下の投与アルゴリズムに従って、非盲検の医師によって実施される：
・血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、この試料の前の２用量が（ａ）ｍｇ／ｋｇで同じ用量レベルであり、（ｂ）連続している場合（投与忘れなし）、単一の１６８時間試料を使用して用量を２用量レベルだけ増加させる（０．２０ｍｇ／ｋｇを超えない）。
・２つの連続する１６８時間試料からの血漿アルギニンレベル（投与し忘れた場合でも）が両方とも＜５０μＭである場合、用量は１用量レベルだけ減少させ（表１７を参照）、０．０５ｍｇ／ｋｇを下回らないようにする。
・血漿アルギニンレベルが＞１５０μＭの場合、この試料の前の２用量が（ａ）ｍｇ／ｋｇで同じ用量レベルであり、（ｂ）連続している場合（投与忘れなし）、単一の１６８時間試料を使用して用量を２用量レベルだけ増加させる（０．２０ｍｇ／ｋｇを超えない）。
・２つの連続する１６８時間試料からの血漿アルギニンレベル（投与し忘れた場合でも）が両方とも＜５０μＭである場合、用量は１用量レベルだけ減少させ（表１７を参照）、０．０５ｍｇ／ｋｇを下回らないようにする。
【表19】
【0202】
統計的考察
一次分析では、厳密に事前に指定された基準を満たす最後の４つの血漿アルギニン測定結果の平均に基づいて、ペグジラルギナーゼとプラセボで治療された患者の血漿アルギニンレベルのベースラインからの平均減少を２４週毎週投与後に比較する。
一次分析では、厳密に事前に指定された基準を満たす最後の４つの血漿アルギニン測定結果の平均に基づいて、ペグジラルギナーゼとプラセボで治療された患者の血漿アルギニンレベルのベースラインからの平均減少を２４週毎週投与後に比較する。
【0203】
プラセボとペグジラルギナーゼにそれぞれランダム化された１０人と２０人の患者の標本サイズは、９８％の検出力を達成し、１２０μＭの一般的なＳＤを想定して、両側マンホイットニーウィルコクソン検定を使用して、０．０５の有意水準で２００μＭの平均血漿アルギニンレベルの差を示す。
【0204】
さらに、この数の被験者は、フィッシャーの直接確率検定を使用して、０．０５の有意水準で臨床応答エンドポイントのグループ比率間で４０％の統計的に有意な差を検出する８０％以上の検出力を提供する。
【0205】
実施例２１：部位特異的のＰＥＧ化解析
例示的な部位特異的ＰＥＧ化解析を図１５に示す。３つのＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧバッチを分析した。ペプチドマッピングは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体（非ＰＥＧ化）ロットおよび対応する参照標準をグアニジン－ＨＣＩで変性し、ＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化することによって実行された。これらの試料は、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０で希釈した。各試料をシーケンシンググレードのトリプシンで３７℃で約５時間消化した。得られたペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００Ｃ１８カラム、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ／Ｎ１８６００３６８７で、０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルグラジエントを使用して分離した。ペプチドのＬＣ－ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ断片化は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ ＭＳ／ＭＳで得られた。
例示的な部位特異的ＰＥＧ化解析を図１５に示す。３つのＣｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧバッチを分析した。ペプチドマッピングは、Ｃｏ－ｒｈＡＲＧ１－ＰＥＧ原薬、Ｃｏ－アルギナーゼ１中間体（非ＰＥＧ化）ロットおよび対応する参照標準をグアニジン－ＨＣＩで変性し、ＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化することによって実行された。これらの試料は、５０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０で希釈した。各試料をシーケンシンググレードのトリプシンで３７℃で約５時間消化した。得られたペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００Ｃ１８カラム、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ／Ｎ１８６００３６８７で、０．０５％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルグラジエントを使用して分離した。ペプチドのＬＣ－ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ断片化は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ ＭＳ／ＭＳで得られた。
【0206】
見てわかるように、３つのバッチのいずれも部位Ｋ３、Ｋ１４９、Ｋ１９０、Ｋ１９５、Ｋ２９、Ｋ２６５、またはＫ２８３でＰＥＧ化されていなかった。また、３つのバッチすべてで、部位Ｋ１６、Ｋ３２、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ４７、Ｋ６７、Ｋ７４、Ｋ８２、Ｌ８７、Ｋ８８、Ｋ１５２、Ｋ１５４、Ｋ１７１、Ｋ３１２、およびＫ３２１でＰＥＧ化が行われた。いくつかのバッチでは、部位Ｋ２２２およびＫ２２３でＰＥＧ化の頻度が低かった。
【0207】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「特定の実施形態」、「様々な実施形態」、「１つ以上の実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、材料、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所における「１つ以上の実施形態では」、「特定の実施形態では」、「様々な実施形態では」、「一実施形態では」または「実施形態では」などの句の出現は、必ずしも開示の同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、材料、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。
【0208】
本明細書の開示は、特定の実施形態を参照して説明を提供したが、これらの実施形態は、本開示の原理および適用の単なる例示であることが理解されるべきである。その趣旨および範囲から逸脱することなく、本開示に対して様々な修正および変形を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある修正および変形を含むことが意図されている。
【図1(a)】
【図1(b)】
【図1(c)】
【図2】
【図3(a)】
【図3(b)】
【図4(a)】
【図4(b)】
【図4(c)】
【図5(a)】
【図5(b)】
【図5(c)】
【図5(d)】
【図6】
【図7】
【図8(a)】
【図8(b)】
【図9(a)】
【図9(b)】
【図9(c)】
【図9(d)】
【図9(e)】
【図9(f)】
【図10(a)】
【図10(b)】
【図10(c)】
【図11(a)】
【図11(b)】
【図12(a)】
【図12(b)】
【図13(a)】
【図13(b)】
【図14(a)】
【図】
【図14(b)】
【図14(c)】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】