(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-01
(54)【発明の名称】修飾ＴＦＦ２ポリペプチド
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20221025BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221025BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20221025BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20221025BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20221025BHJP
A61P 11/04 20060101ALI20221025BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20221025BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20221025BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20221025BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20221025BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20221025BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20221025BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20221025BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221025BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221025BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20221025BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20221025BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221025BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20221025BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221025BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20221025BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61P35/00
A61P1/00
A61P1/02
A61P1/04
A61P11/04
A61P1/16
A61P1/18
A61P35/04
A61K47/60
A61K47/61
A61K47/59
A61K47/64
A61K39/395 D
A61P29/00
A61P31/14
A61K45/00
C07K19/00 ZNA
C07K14/47
C12N15/12
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513154
(86)(22)【出願日】2020-08-27
(85)【翻訳文提出日】2022-04-05
(86)【国際出願番号】 IB2020000699
(87)【国際公開番号】W WO2021038296
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】62/943,803
(32)【優先日】2019-12-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/041,097
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/892,520
(32)【優先日】2019-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522003316
【氏名又は名称】トニックス ファーマ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】レーダーマン， セス
(72)【発明者】
【氏名】ドーアティ， ブルース
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076CC04
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC27
4C076CC35
4C076EE23
4C076EE24
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA23
4C084BA34
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4C084BA41
4C084DC50
4C084MA02
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4C084NA14
4C084ZA591
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4C084ZA811
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4C085AA13
4C085EE03
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチド、これらのポリペプチドを含む組成物、ならびにがんおよび炎症を処置するためのそれらの使用が本明細書に記載される。本開示は、増強された生物活性ならびに増加した安定性および／またはｉｎ ｖｉｖｏ効力などの薬物動態学的特性を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの組成物を提供する。一部の実施形態では、開示される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの改善された特性は、ＰＥＧ化もしくはポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、および／またはポリシアリル化（ＰＳＡ）、および／またはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ化）、ＸＴＥＮ化を用いる融合タンパク質を含む融合タンパク質、ならびにこれらの修飾の組合せを含む化学修飾を使用して達成される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを含む組成物であって、前記ＴＦＦ２ポリペプチドが、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）コンジュゲーション、および／またはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化、ＸＴＥＮ化、ＥＬＰ化もしくはＨＡＰ化を含む融合タンパク質のうちの１つまたは複数によって修飾されている、組成物。
【請求項2】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、配列番号１、配列番号３または配列番号６のポリペプチド配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、低分子量の直鎖状ＰＥＧでＰＥＧ化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、高分子量の分枝状ＰＥＧでＰＥＧ化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
医薬組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ＰＬＧＡコンジュゲート化、ならびにヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰ、ＰＡＳ化、ＸＴＥＮ化、ＥＬＰ化およびＨＡＰ化を用いる融合タンパク質、またはそれらの組合せからなる群から選択される均一な集団である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、未修飾ヒトＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、血中半減期が増加している、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、特定の１つまたは複数の部位でＰＥＧ化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
前記修飾ＴＦＦ２ペプチドが、そのＮ末端でＰＥＧ化されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、アルデヒド－ＰＥＧ化学を介したＮ末端のＰＥＧ化を使用して、ＰＥＧ化されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、そのＣ末端でＰＥＧ化されている、請求項１０に記載の組成物。
【請求項14】
ＰＥＧ化が、ＮＨＳ－ＰＥＧ化学を介した無溶媒で曝されたアミンを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項15】
前記修飾ＴＦＦ２のＰＥＧ化ポリペプチドが、均一な組成物である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項17】
前記がんが、消化器系のがんである、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記消化器がんが、口腔がん、咽頭がん、中咽頭がん、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記がんが、結腸がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記がんが、中咽頭がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記がんが、食道がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記がんが、胃がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
前記がんが、膵臓がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項24】
前記がんが、直腸がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項25】
前記がんが、肝臓がんである、請求項１８に記載の方法。
【請求項26】
前記がんが、転移性がんである、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記がんを、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置することをさらに含む、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に非応答性であり、前記対象が、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物で処置され、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチド組成物による処置後、前記対象のがんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に感受性になり、その後、前記対象が、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置後約１～約６０日以内に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置される、方法。
【請求項29】
融合タンパク質を含む、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項30】
前記融合タンパク質が、ＴＦＦ２－アルブミンタンパク質、ＴＦＦ２－ＩｇＧ１融合タンパク質およびＴＦＦ２－ポリヒスチジンタグからなる群のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２９に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項31】
前記融合タンパク質が、ポリヒスチジンタグである、請求項３０に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項32】
前記ヒスチジンタグが、アミノ酸切断部位を含有する、請求項３１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項33】
前記アミノ酸切断部位が、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択される、請求項３２に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項34】
切断後に、ネイティブＴＦＦ２ポリペプチドが形成される、請求項３２～３３のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項35】
前記ヒスチジンタグが、ＴＦＦ２のＮ末端またはＣ末端のいずれかにある、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項36】
１）前記ＴＦＦ２ペプチドを精製すること、ならびに２）前記精製された修飾ＴＦＦ２のＰＥＧ化、ポリシアリル化および／またはポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とのコンジュゲートを調製することをさらに含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項37】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項２９～３６のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つまたは複数を投与することを含む、方法。
【請求項38】
前記がんが、消化器系のがんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記消化器がんが、口腔がん、咽頭がん、中咽頭がん、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、大腸がん、結腸がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記がんが、結腸がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記がんが、中咽頭がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項42】
前記がんが、食道がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項43】
前記がんが、胃がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項44】
前記がんが、膵臓がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項45】
前記がんが、直腸がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項46】
処置される前記がんが、肝臓がんである、請求項３９に記載の方法。
【請求項47】
前記がんが、転移性がんである、請求項３７～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記がんを、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置することをさらに含む、請求項３７～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に非応答性であり、前記対象が、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで処置され、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置後、前記対象のがんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に感受性になり、その後、前記対象が、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置後約１～約６０日以内に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置される、方法。
【請求項50】
処置を必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための方法であって、前記対象が、請求項１～１５のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の組成物、または請求項２９～３６のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つもしくは複数で処置される、方法。
【請求項51】
前記ＩＢＤが、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記組成物または前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、経口、静脈内または筋肉内投与される、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項53】
１つまたは複数のドメインＩ結合ドメインを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチドであって、前記１つまたは複数のドメインＩ結合ドメインが、配列番号２４を含み、前記ポリペプチドが、ドメインＩＩ結合ドメインを含有しない、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項54】
１つまたは複数のドメインＩＩ結合ドメインを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチドであって、前記１つまたは複数のドメインＩＩ結合ドメインが、配列番号２５を含み、前記ポリペプチドが、ドメインＩ結合ドメインを含有しない、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項55】
配列番号２６に記述される２つのドメインＩ結合ドメインを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項56】
配列番号２７に記述される２つのドメインＩＩ結合ドメインを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項57】
互いに相互交換され、配列番号２８に記述される配列を含む、ドメインＩおよびドメインＩＩ結合ドメインを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項58】
受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号２９の配列を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項59】
受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３０の配列を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項60】
受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３１の配列を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項61】
前記ＴＦＦ２結合ドメインが、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とのコンジュゲーション、ならびに／もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化融合ポリペプチド、ＸＴＥＮ化融合ポリペプチド、ＥＬＰ化融合ポリペプチドおよびＨＡＰ化融合ポリペプチドからなる群から選択される融合ポリペプチドを含む融合タンパク質としての発現のうちの１つまたは複数によってさらに修飾されている、請求項５３～６０のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項62】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、低分子量の直鎖状ＰＥＧでＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項63】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、高分子量の分枝状ＰＥＧでＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項64】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、特定の１つまたは複数の部位でＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項65】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、そのＮ末端でＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項66】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、アルデヒド－ＰＥＧ化学を介したＮ末端のＰＥＧ化を使用して、ＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項67】
前記修飾ＴＦＦ２結合ドメインが、そのＣ末端でＰＥＧ化されている、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項68】
ＰＥＧ化が、ＮＨＳ－ＰＥＧ化学を介した無溶媒で曝されたアミンを含む、請求項６１に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項69】
均一な組成物の一部である、請求項５３～６８のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項70】
医薬組成物の一部である、請求項５３～６９のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項71】
配列番号６のヒト野生型ＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、血中半減期が増加している、請求項５３～７０のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項72】
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）が、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性を改善するために使用される、請求項５３～６８のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項73】
グリコシル化されている、請求項５３～７２のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチド。
【請求項74】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項５３～７３のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つまたは複数を投与することを含む、方法。
【請求項75】
前記がんが、消化器系のがんである、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記消化器がんが、口腔がん、咽頭がん、中咽頭がん、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、膵臓がんおよび胆嚢がんのうちの１つまたは複数から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項77】
前記がんが、結腸がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記がんが、中咽頭がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項79】
前記がんが、食道がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項80】
前記がんが、胃がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項81】
前記がんが、膵臓がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項82】
前記がんが、直腸がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項83】
処置される前記がんが、肝臓がんである、請求項７６に記載の方法。
【請求項84】
前記がんが、転移性がんである、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
前記がんを、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置することをさらに含む、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、前記がんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に非応答性であり、前記対象が、請求項５３～７３のいずれか一項に記載の１つまたは複数の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで処置され、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置後、前記対象のがんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に感受性になり、その後、前記対象が、前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置後約１～約６０日以内に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置される、方法。
【請求項87】
処置を必要とする対象における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置するための方法であって、前記対象が、請求項５３～７３のいずれか一項に記載の１つまたは複数の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで処置される、方法。
【請求項88】
前記ＩＢＤが、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、経口、静脈内または筋肉内投与される、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項90】
処置を必要とする対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を処置するための方法であって、前記対象に、請求項１～１５のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の組成物、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つもしくは複数、または請求項５３～７３のいずれか一項に記載の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つもしくは複数を投与することを含む、方法。
【請求項91】
前記修飾ＴＦＦ２ポリペプチドが、経口、静脈内または筋肉内投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害または低減する薬剤を投与することをさらに含む、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項93】
リバビリン、インターフェロン（アルファコン－１）、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ＥＩＤＤ－２８０１、ＥＩＤＤ－１９３１、ＧＳ－５７３４、ＧＳ－４４１５２４、イベルメクチン、ファビピラビル、インドメタシン、クロルプロマジン、ペンシクロビル、ナフォモスタット、カモスタット、ニタゾキサニド、レムデシビル、ファモチジンおよびデキサメタゾンからなる群から選択される抗ウイルス剤を投与することをさらに含む、請求項９０～９２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／８９２，５２０号、２０１９年１２月４日に出願された米国仮出願第６２／９４３，８０３号、および２０２０年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／０４１，０９７号に基づく優先権を主張し、それらの内容は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／８９２，５２０号、２０１９年１２月４日に出願された米国仮出願第６２／９４３，８０３号、および２０２０年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／０４１，０９７号に基づく優先権を主張し、それらの内容は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年８月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０４５４５－００４６－ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３７，５６６バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年８月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０４５４５－００４６－ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３７，５６６バイトのサイズである。
【0003】
本開示の分野
本開示は、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを使用して、がんおよび／または炎症状態を有する対象を処置する分野にある。
本開示は、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを使用して、がんおよび／または炎症状態を有する対象を処置する分野にある。
【背景技術】
【0004】
本開示の背景
トレフォイルファミリー因子２（ＴＦＦ２）（膵臓鎮痙薬ポリペプチド、ＰＳＰまたは鎮痙性ペプチド、ＳＰとしても公知）は、ペプチドのトレフォイル因子ファミリーのメンバーである。ヒトＴＦＦ２は、１０６アミノ酸の分泌タンパク質である。成熟ヒトＴＦＦ２は、ブタを含む他の種において非常に保存されている７つの残基によって分離された２つのトレフォイルドメインを含有する１２ｋＤａのタンパク質である。ブタＴＦＦ２の結晶構造は解明されている（De A et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(3):1084-8）。ブタＴＦＦ２の溶液構造はＮＭＲによって研究されている（Carr, MD et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(6):2206-10）。３ループ構造中に積み重なった３つのループをもたらす３つの分子内ジスルフィド結合を形成するトレフォイルドメイン中に６つの保存されたシステイン残基が存在する（May FEB, et al. (2000), Gut, 46:454-459）。胃液中でのヒトＴＦＦ２の一部は、Ａｓｎ（１５）において推定されるように、Ｎ連結を介してグルコシル化される（May FEB et al., Gut 2000 46(4):454-9）。
トレフォイルファミリー因子２（ＴＦＦ２）（膵臓鎮痙薬ポリペプチド、ＰＳＰまたは鎮痙性ペプチド、ＳＰとしても公知）は、ペプチドのトレフォイル因子ファミリーのメンバーである。ヒトＴＦＦ２は、１０６アミノ酸の分泌タンパク質である。成熟ヒトＴＦＦ２は、ブタを含む他の種において非常に保存されている７つの残基によって分離された２つのトレフォイルドメインを含有する１２ｋＤａのタンパク質である。ブタＴＦＦ２の結晶構造は解明されている（De A et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(3):1084-8）。ブタＴＦＦ２の溶液構造はＮＭＲによって研究されている（Carr, MD et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(6):2206-10）。３ループ構造中に積み重なった３つのループをもたらす３つの分子内ジスルフィド結合を形成するトレフォイルドメイン中に６つの保存されたシステイン残基が存在する（May FEB, et al. (2000), Gut, 46:454-459）。胃液中でのヒトＴＦＦ２の一部は、Ａｓｎ（１５）において推定されるように、Ｎ連結を介してグルコシル化される（May FEB et al., Gut 2000 46(4):454-9）。
【0005】
ＴＦＦ２は、十二指腸およびヒト胃幽門におけるブルンネル腺において主に発現され、胃および腸管腔において機能的役割を有することが示されている（Jorgenson, K. H., and Jacobsen H. E., (1982) Regul Pept., 3:207-219）。ガストリンは、ガストリン応答性シス作用性エレメントを介して、およびシグナル伝達経路を介して、ＴＦＦ２プロモーターを調節することが示されている（Tu, S. et al., (2007), Am J Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 292(6):G1726-37）。ＴＦＦ２はまた、粘膜潰瘍に隣接する細胞中で高濃度で見出されている（Wright N.A., Poulsom R., Stamp G.W. (1990) J Pathol.;162:279-284）。
【0006】
ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるＴＦＦ２欠損は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘導される大腸炎を悪化させる（Judd LM et al, Am J. Physiol Gatrointest Liver Physiol. (2015) 308(1):G12-24）。ＴＦＦ２は、安定化すること、ならびにムチンゲルを支持すること、炎症を低減させること、および上皮再建を刺激することによって、損傷から胃腸粘膜を保護すると考えられる。Ｃｏｏｋらは、ＴＦＦ２が、リンパ球によって発現され、リンパ球上で活性であることを示した（Cook et al., (1999), FEBS Lett., 456(1):155-9）。Ｄｕｂｅｙｋｏｖｓｋａｙａらは、ＴＦＦ２が、リンパ球を活性化するポリペプチドであり、ＣＸＣＲ４受容体（Ｃ－Ｘ－Ｃケモカイン受容体４型、フーシンまたはＣＤ１８４としても公知）に対する活性化リガンドとしての機能を果たすことを示した（Dubeykovskaya, Z. Dubeykovskaya, A., Wang, J., (2009), J Biol Chem., 284(6):3650-62）。ＴＦＦ２はまた、脾臓において発現され、循環ＴＦＦ２は、免疫調節性の役割を有すると思われる（Dubeykovskaya Z, et al. Nat Commun. (2016), 7:1-11）。
【0007】
外因性ＴＦＦ２は、薬物動態が劣り、血漿から迅速に排出される。修飾ＴＦＦ２は、ＴＦＦ２のＣ末端を、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）と遺伝子学的に融合し、Ｆｌａｇテイルをさらに融合することによって、作製された（ＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇ）。組換えＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇタンパク質は、結腸の腫瘍成長を抑制することが示されている（Dubeykovskaya, Z. A. et al., (2019), Cancer Gene Therapy, 26:48-57）。組換えＴＦＦ２はまた、膵臓がんに対して免疫抑制性であることが報告されている（Sung, Gi-Ho, et al., (2018), Animal Cells and Systems, 22:6, 368-381）。
ＴＦＦ２は、それが胃のような厳しいｐＨ環境中で安定であるので、がんのための魅力的な生物学的処置である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、低ｐＨであることが公知であり、これは、モノクローナル抗体などの他のがん薬剤の結合を低減させ得る。
ＴＦＦ２は、それが胃のような厳しいｐＨ環境中で安定であるので、がんのための魅力的な生物学的処置である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、低ｐＨであることが公知であり、これは、モノクローナル抗体などの他のがん薬剤の結合を低減させ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】De A et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(3):1084-8
【非特許文献2】Carr, MD et al, (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91(6):2206-10
【非特許文献3】May FEB, et al. (2000), Gut, 46:454-459
【非特許文献4】Jorgenson, K. H., and Jacobsen H. E., (1982) Regul Pept., 3:207-219
【非特許文献5】Tu, S. et al., (2007), Am J Physiol. Gastrointest Liver Physiol., 292(6):G1726-37
【非特許文献6】Wright N.A., Poulsom R., Stamp G.W. (1990) J Pathol.;162:279-284
【非特許文献7】Judd LM et al, Am J. Physiol Gatrointest Liver Physiol. (2015) 308(1):G12-24
【非特許文献8】Cook et al., (1999), FEBS Lett., 456(1):155-9
【非特許文献9】Dubeykovskaya, Z. Dubeykovskaya, A., Wang, J., (2009), J Biol Chem., 284(6):3650-62
【非特許文献10】Dubeykovskaya Z, et al. Nat Commun. (2016), 7:1-11
【非特許文献11】Dubeykovskaya, Z. A. et al., (2019), Cancer Gene Therapy, 26:48-57
【非特許文献12】Sung, Gi-Ho, et al., (2018), Animal Cells and Systems, 22:6, 368-381
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示の概要
本開示は、増強された生物活性ならびに増加した安定性および／またはｉｎ ｖｉｖｏ効力などの薬物動態学的特性を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの組成物を提供する。
本開示は、増強された生物活性ならびに増加した安定性および／またはｉｎ ｖｉｖｏ効力などの薬物動態学的特性を有する、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの組成物を提供する。
【0010】
一部の実施形態では、開示される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの改善された特性は、ＰＥＧ化もしくはポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、および／またはポリシアリル化（ＰＳＡ）、および／またはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ化）、ＸＴＥＮ化を用いる融合タンパク質を含む融合タンパク質、ならびにこれらの修飾の組合せを含む化学修飾を使用して達成される。
【0011】
本明細書で使用される場合、ＰＥＧ化、ＰＡＳ化、ＰＬＧＡコンジュゲーションおよび／もしくはＰＳＡコンジュゲーション、またはＨＡＰ、ＥＬＰ化、ＸＴＥＮ化もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰを用いる融合タンパク質、ならびにこれらの修飾の組合せによって修飾されたＴＦＦ２ポリペプチドは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドと呼ばれる。
【0012】
本開示は、ＰＥＧ化されたＴＦＦ２、ＰＡＳ化されたＴＦＦ２、ＰＬＧＡ修飾ＴＦＦ２および／もしくはＰＳＡ修飾ＴＦＦ２、またはＴＦＦ２融合タンパク質、例えば、ＣＴＰペプチドとの融合タンパク質、ＨＡＰとの融合タンパク質もしくはＥＬＰ化されたＴＦＦ２、ならびにこれらの修飾の組合せを含む修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの組成物、ならびにがん、過形成、異形成、炎症状態、消化器系の炎症および／またはＣＯＶＩＤ－１９において発生する任意の症状を処置するためのこれらの修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの使用を提供する。
【0013】
本明細書で定義される場合、「有効量」という用語は、所望の応答を少なくとも部分的に得るため、あるいは処置される特定の状態の開始を遅らせるため、またはその進行を阻害するため、またはその開始もしくは進行を完全に停止させるために必要な、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの量を意味する。
【0014】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、均一であり、未修飾またはネイティブのヒトＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、薬物動態学的特性が改善されている。
【0015】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有する。
【0016】
ある特定の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を有する。
【0017】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【0018】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、低分子量の直鎖状ＰＥＧでＰＥＧ化されている。
【0019】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、高分子量の分枝状ＰＥＧでＰＥＧ化されている。
【0020】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号６などの未修飾ヒトＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、血中半減期が増加している。
【0021】
一実施形態では、ＰＥＧ化されたＴＦＦ２ポリペプチドは、未ＰＥＧ化ヒトＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、血中半減期が増加している。
【0022】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、特定の１つまたは複数の部位でＰＥＧ化されている。
【0023】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、Ｎ末端でＰＥＧ化されている。
【0024】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、アルデヒド－ＰＥＧ化学を介してＮ末端でＰＥＧ化されている。
【0025】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＰＥＧ化されたＴＦＦ２ポリペプチドは、Ｃ末端でＰＥＧ化されている。
【0026】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化は、ＮＨＳ－ＰＥＧ化学を介した無溶媒で曝されたアミンを含む。
【0027】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）などの融合タンパク質を含む。
【0028】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＰＬＧＡのコンジュゲートなどのコンジュゲートポリペプチドである。
【0029】
一部の実施形態では、ＴＦＦ２アルブミン融合タンパク質、ＴＦＦ２－ＩｇＧ１融合タンパク質およびＴＦＦ２－アフィニティータグ融合タンパク質からなる群のうちの１つまたは複数から選択されるＴＦＦ２ポリペプチド融合ポリペプチドが本明細書に開示される。
【0030】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグとの融合タンパク質である。一部の実施形態では、ヒスチジンタグは、アミノ酸切断部位を含有する。一部の実施形態では、ヒスチジンタグ切断部位は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択される。
【0031】
一部の実施形態では、ネイティブＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグをＴＦＦ２の融合タンパク質から除去することによって形成される。
【0032】
一部の実施形態では、ヒスチジンタグは、ＴＦＦ２ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにある。
【0033】
他の実施形態では、ヒスチジンタグの切断後、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、１）ＴＦＦ２ペプチドを精製すること、ならびに２）精製された修飾ＴＦＦ２のＰＥＧ化、ポリシアリル化および／またはポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とのコンジュゲートを調製することによって形成される。
【0034】
本開示の別の態様では、配列番号２６～２８および図１によって表されるそれらの結合ドメインに対する変化を有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチドである。
【0035】
本開示の別の態様では、配列番号２９～３１および図２によって表される受容体結合部位残基に対する変化を有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチドである。
【0036】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドは、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ＰＬＧＡとのコンジュゲーション、ならびに／もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化融合ポリペプチド、ＸＴＥＮ化融合ポリペプチド、ＥＬＰ化融合ポリペプチドおよびＨＡＰ化融合ポリペプチドからなる群から選択される融合ポリペプチドを含む融合タンパク質としての発現のうちの１つまたは複数によってさらに修飾されている。
【0037】
一部の実施形態では、配列番号２９～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドは、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ＰＬＧＡとのコンジュゲーション、ならびに／もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＰＡＳ化融合ポリペプチド、ＸＴＥＮ化融合ポリペプチド、ＥＬＰ化融合ポリペプチドおよび／またはＨＡＰ化融合ポリペプチドからなる群から選択される融合ポリペプチドを含む融合タンパク質としての発現のうちの１つまたは複数によってさらに修飾されている。一部の実施形態では、これらの修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号６の未修飾ヒトＴＦＦ２と比較して、血中半減期が増加しているか、および／または薬力学特性が改善されている。
【0038】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、低分子量の直鎖状ＰＥＧでＰＥＧ化されている。
【0039】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、高分子量の分枝状ＰＥＧでＰＥＧ化されている。
【0040】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、特定の１つまたは複数の部位でＰＥＧ化されている。
【0041】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、そのＮ末端でＰＥＧ化されている。
【0042】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、アルデヒド－ＰＥＧ化学を介したＮ末端のＰＥＧ化を使用して、ＰＥＧ化されている。
【0043】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、修飾ＴＦＦ２結合ドメインポリペプチドは、そのＣ末端でＰＥＧ化されている。
【0044】
一部の実施形態では、配列番号２６～３１によって表される修飾ＴＦＦ２ペプチドがＰＥＧ化されている場合、ＰＥＧ化は、ＮＨＳ－ＰＥＧ化学を介した無溶媒で曝されたアミンを含む。
【0045】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ペプチドは、グリコシル化されている。
【0046】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、均一な組成物中にある。
【0047】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、１種または複数の賦形剤を含有していてもよい医薬組成物中にある。
【0048】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＰＥＧ化、ポリシアリル化、ＰＬＧＡとコンジュゲートされる、もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰ、ＰＡＳ化、ＸＴＥＮ化、ＥＬＰ化、ＨＡＰ化バージョンを用いる融合ポリペプチド、またはこれらの修飾の組合せである修飾ＴＦＦ２ポリペプチドからなる群から選択される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの均一な集団である。
【0049】
本開示の態様は、処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを投与し、それによりがんを処置することを含む、方法である。
【0050】
本開示の実施形態では、がんは、消化器系のがん、例えば、限定されないが、口腔がん、咽頭がん、中咽頭がん、食道がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓がん、膵臓がん、胆嚢がんまたは結腸がんである。
【0051】
一部の実施形態では、処置されるがんは、中咽頭がんである。
【0052】
一部の実施形態では、処置されるがんは、食道がんである。
【0053】
一部の実施形態では、処置されるがんは、胃がんである。
【0054】
一部の実施形態では、処置されるがんは、膵臓がんである。
【0055】
一部の実施形態では、処置されるがんは、結腸がんである。
【0056】
一部の実施形態では、処置されるがんは、直腸がんである。
【0057】
一部の実施形態では、処置されるがんは、肛門がんである。
【0058】
一部の実施形態では、処置されるがんは、肝臓がんである。
【0059】
一部の実施形態では、処置されるがんは、転移性がんである。
【0060】
一部の実施形態では、処置されるがんはまた、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１、ＣＤ２７９）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム死－リガンド１、ＣＤ２７４またはＢ７ホモログ１［Ｂ７－Ｈ１］）および／またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置される。
【0061】
さらに別の実施形態では、処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、がんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に非応答性であり、対象が、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つまたは複数で処置され、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド組成物による処置後、対象のがんが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体による処置に感受性になり、その後、対象が、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド組成物による処置後約１～約６０日以内に、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対する遮断抗体で処置される、方法が本明細書に開示される。
【0062】
一部の実施形態では、本明細書に開示される修飾ＴＦＦ２ペプチドは、消化器系のがんの処置のための標準治療と組み合わせることができる。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、標準治療処置の前、それと同時に、またはその後に、与えられる。
【0063】
本開示の別の態様では、処置を必要とする対象における消化器系の炎症などの炎症状態を処置するための方法であって、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを対象に投与することを含む、方法である。
【0064】
一実施形態では、消化器系の炎症は、限定されないが、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。
【0065】
炎症状態を処置するための一部の実施形態では、本明細書に開示される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、経口、静脈内または筋肉内投与される。
【0066】
本開示の別の態様は、処置を必要とする対象におけるＣＯＶＩＤ－１９または発生した合併症のいずれかを処置するための方法であって、対象に、本開示の組成物のうちの１つもしくは複数、または本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのうちの１つもしくは複数を投与することを含む、方法を提供する。
【0067】
本開示の方法のいずれかの一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、炎症性疾患を処置するための標準治療の前、それと同時に、またはその後に、与えられ得る。
【0068】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、好ましくは、個体に、「治療有効量」または「所望の量」で投与され、これは、個体への利益を示すのに十分である。
【0069】
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための方法の一部の実施形態では、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害または低減する薬剤を投与することをさらに含む。
【0070】
ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための方法の一部の実施形態では、方法は、リバビリン、インターフェロン（アルファコン－１）、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ＥＩＤＤ－２８０１、ＥＩＤＤ－１９３１、ＧＳ－５７３４、ＧＳ－４４１５２４、イベルメクチン、ファビピラビル、インドメタシン、クロルプロマジン、ペンシクロビル、ナフォモスタット、カモスタット、ニタゾキサニド、レムデシビル、ファモチジンおよびデキサメタゾンからなる群から選択される抗ウイルス剤を投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【0072】
【0073】
【図3A-B】図３Ａ：アゾキシメタン（ＡＯＭ；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）、続いて１週間後に飲料水中の２．５％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を７日間受けたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ）。（ＳＡＣ＝犠牲）。図３Ｂ～Ｄ：ＡＯＭ／ＤＳＳ処理マウスは、１０週間で腫瘍を形成し、ＡＯＭの１７週間後に腺癌を発生した。図３Ｂ：全体画像。スケールバー、５ｍｍ。腫瘍は、遠位結腸においてより頻繁に観察された。図３Ｃ：肉眼で見える腫瘍を計数し、腫瘍面積を、ＩｍａｇｅＪ Ｆｉｊｉを使用して測定した。図３Ｄ：ヘマトキシリン（Haemotoxylin）およびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。増加した粘膜内免疫細胞浸潤が、ＡＯＭの１０週間後に検出された。
【図3C-D】図３Ａ：アゾキシメタン（ＡＯＭ；１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）、続いて１週間後に飲料水中の２．５％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を７日間受けたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴ）。（ＳＡＣ＝犠牲）。図３Ｂ～Ｄ：ＡＯＭ／ＤＳＳ処理マウスは、１０週間で腫瘍を形成し、ＡＯＭの１７週間後に腺癌を発生した。図３Ｂ：全体画像。スケールバー、５ｍｍ。腫瘍は、遠位結腸においてより頻繁に観察された。図３Ｃ：肉眼で見える腫瘍を計数し、腫瘍面積を、ＩｍａｇｅＪ Ｆｉｊｉを使用して測定した。図３Ｄ：ヘマトキシリン（Haemotoxylin）およびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。増加した粘膜内免疫細胞浸潤が、ＡＯＭの１０週間後に検出された。
【0074】
【図4A】図４Ａ：ＡＯＭ／ＤＳＳ処理Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスからの結腸組織におけるＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＰＤ－Ｌ１についての免疫染色。ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞およびＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍が進行するにつれて増加した。図４Ｂおよび４Ｃ：フローサイトメトリーによる腫瘍内骨髄性細胞の免疫表現型検査（ＣＤ４５＋の％）。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣ、ならびに顆粒球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋）両方のＭＤＳＣサブセットは、腫瘍中で著しく増加した（図４Ｂを参照されたい）。マクロファージ（ＭＱ；ＣＤ１１ｂ Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋）および樹状細胞（ＤＣ；ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４／８０－）（図４Ｃを参照されたい）。
【図4B-C】図４Ａ：ＡＯＭ／ＤＳＳ処理Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスからの結腸組織におけるＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＰＤ－Ｌ１についての免疫染色。ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞およびＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍が進行するにつれて増加した。図４Ｂおよび４Ｃ：フローサイトメトリーによる腫瘍内骨髄性細胞の免疫表現型検査（ＣＤ４５＋の％）。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣ、ならびに顆粒球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋）両方のＭＤＳＣサブセットは、腫瘍中で著しく増加した（図４Ｂを参照されたい）。マクロファージ（ＭＱ；ＣＤ１１ｂ Ｌｙ６Ｃ－Ｆ４／８０＋）および樹状細胞（ＤＣ；ＣＤ１１ｃ＋Ｆ４／８０－）（図４Ｃを参照されたい）。
【0075】
【0076】
【図6A-C】図６Ａ～６Ｃ：Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＥＧＦＰマウスの作製。Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰの遺伝子構築物（図６Ａ）。Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウスにおける脾臓ＣＤ１１ｂ－およびＣＤ１１ｂ＋細胞におけるフローサイトメトリーによる内因性ＧＦＰ発現（図６Ｂ）およびｑＰＣＲによるＰｄｌ１遺伝子発現（図６Ｃ）。図６Ｄ：ＡＯＭ／ＤＳＳによるＣＲＣの誘導を示す実験スキーム。図６Ｅ：ＡＯＭの１０週間後の結腸直腸腫瘍の全体画像。スケールバー、５ｍｍ。図６Ｆ：腫瘍数を計数し、腫瘍面積を測定した。ＡＯＭ／ＤＳＳで処理されたＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウスが、著しく増強された早期の結腸直腸腫瘍発生を示したことに留意されたい。
【図6D-F】図６Ａ～６Ｃ：Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＥＧＦＰマウスの作製。Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰの遺伝子構築物（図６Ａ）。Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウスにおける脾臓ＣＤ１１ｂ－およびＣＤ１１ｂ＋細胞におけるフローサイトメトリーによる内因性ＧＦＰ発現（図６Ｂ）およびｑＰＣＲによるＰｄｌ１遺伝子発現（図６Ｃ）。図６Ｄ：ＡＯＭ／ＤＳＳによるＣＲＣの誘導を示す実験スキーム。図６Ｅ：ＡＯＭの１０週間後の結腸直腸腫瘍の全体画像。スケールバー、５ｍｍ。図６Ｆ：腫瘍数を計数し、腫瘍面積を測定した。ＡＯＭ／ＤＳＳで処理されたＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウスが、著しく増強された早期の結腸直腸腫瘍発生を示したことに留意されたい。
【0077】
【0078】
【図8】パネルＡ：Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウスにＡＯＭ／ＤＳＳを与え、融合組換えＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇ（３００μｇ ｉ．ｐ．）および／または抗ＰＤ－１（ＲＭＰ１－１４；２００μｇ ｉ．ｐ．）で、示された時点で開始して、週に３回、処置した。パネルＢ：腫瘍数を計数し、腫瘍面積を測定した。対照動物と比較して腫瘍面積の＞５０％低減を有するマウスを、レスポンダーと定義した。ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１マウス（５／５；１００％）は、対照動物（２／５；４０％）よりも、ＴＦＦ２－ＣＴＰおよび抗ＰＤ－１の組合せ処置に対するより高い応答比を示したことに留意されたい。
【0079】
【図9】パネルＡ：ＣＤ４５＋細胞中のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合、および腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対する比。レスポンダーが、より大量の腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇに対するより高い比を有していたことに留意されたい。パネルＢ：異なる処置後の腫瘍内骨髄性細胞の免疫表現型検査。ＭＤＳＣ、特にＭ－ＭＤＳＣにおける著しい低減が、レスポンダーにおいて観察された。レスポンダーは、単球のＭＱに対するより低い比も示した。
【0080】
【図10】異なるＴＦＦ２－ＨＳＡ融合タンパク質のプロテインＡ精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（非還元条件）。レーン１：マーカー；レーン２：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＷＴ］；レーン３：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［Ｄ Ｉ／Ｉ］；レーン４：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［Ｄ ＩＩ／Ｉ］；レーン５：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［Ｄ ＩＩ／ＩＩ］；レーン６：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤ Ｉ／Ｉ］；レーン７：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤ ＩＩ／Ｉ］；レーン８：ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤ ＩＩ／ＩＩ］。
【0081】
【発明を実施するための形態】
【0082】
実施形態の詳細な説明
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の指示対象を含む。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用する場合、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、これは、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは２つより多く（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数の指示対象を含む。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用する場合、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、これは、「１つまたは複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは２つより多く（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ）」の意味とも一致する。
【0083】
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、本明細書において、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）、およそ（ｒｏｕｇｈｌｙ）、およそ（ａｒｏｕｎｄ）またはその範囲内（ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ）を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲と併せて使用される場合、それは、記述される数値の上限および下限を拡張することによってその範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書において、２０パーセントの上下の変動（より高いまたはより低い）によって述べられた値の上および下の数値を修飾するために使用される。
【0084】
一実施形態では、ＰＥＧ化、ポリシアリル化（ＰＳＡ）またはＰＬＧＡとのコンジュゲーションのために使用される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、配列番号１、配列番号３もしくは配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。配列番号１は、ヒトＴＦＦ２ポリペプチドを表す。表示された配列は、成熟形態（配列番号６）にさらにプロセシングされる。配列番号２は、ＴＦＦ２をコードするヒトヌクレオチド配列を表し、ここで、下線および太字の「ＡＴＧ」は、開始コドンを表す。ＴＦＦ２に関する配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５４１４（タンパク質）およびＮＭ＿００５４２３（核酸）によって公開データベースにおいてアクセス可能である。
MGRRDAQLLA ALLVLGLCAL AGSEKPSPCQ CSRLSPHNRT NCGFPGITSD QCFDNGCCFD SSVTGVPWCF HPLPKQESDQ CVMEVSDRRN CGYPGISPEE CASRKCCFSN FIFEVPWCFF PKSVEDCHY(配列番号1)
MGRRDAQLLA ALLVLGLCAL AGSEKPSPCQ CSRLSPHNRT NCGFPGITSD QCFDNGCCFD SSVTGVPWCF HPLPKQESDQ CVMEVSDRRN CGYPGISPEE CASRKCCFSN FIFEVPWCFF PKSVEDCHY(配列番号1)
【0085】
除去されるシグナルペプチドにより、ヒトＴＦＦ２ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
ネイティブ－ヒトＴＦＦ２（１０６ＡＡ）
ＥＫＰＳＰＣＱＣＳＲＬＳＰＨＮＲＴＮＣＧＦＰＧＩＴＳＤＱＣＦＤＮＧＣＣＦＤＳＳＶＴＧＶＰＷＣＦＨＰＬＰＫＱＥＳＤＱＣＶＭＥＶＳＤＲＲＮＣＧＹＰＧＩＳＰＥＥＣＡＳＲＫＣＣＦＳＮＦＩＦＥＶＰＷＣＦＦＰＫＳＶＥＤＣＨＹ（配列番号６）
ネイティブ－ヒトＴＦＦ２（１０６ＡＡ）
ＥＫＰＳＰＣＱＣＳＲＬＳＰＨＮＲＴＮＣＧＦＰＧＩＴＳＤＱＣＦＤＮＧＣＣＦＤＳＳＶＴＧＶＰＷＣＦＨＰＬＰＫＱＥＳＤＱＣＶＭＥＶＳＤＲＲＮＣＧＹＰＧＩＳＰＥＥＣＡＳＲＫＣＣＦＳＮＦＩＦＥＶＰＷＣＦＦＰＫＳＶＥＤＣＨＹ（配列番号６）
【0086】
配列番号２は、ＴＦＦ２（ヌクレオチド１～７１７）に相当するヒト野生型ヌクレオチド配列であり、ここで、下線および太字の「ＡＴＧ」は、オープンリーディングフレームの開始を示す。
【化1】
【化2】
【0087】
本開示の異なる態様の文脈では、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって一緒に結合した単一の直鎖のアミノ酸を指し、好ましくは、少なくとも約２１アミノ酸を含む。ポリペプチドは、１つよりも多くの鎖で構成される１つの鎖のタンパク質であり得るか、またはそれは、タンパク質が１つの鎖で構成される場合、タンパク質それ自身であり得る。「ポリペプチド」という用語は、そのような直鎖のアミノ酸のグリコシル化（すなわち、糖タンパク質）および非グリコシル化形態、ならびにグリコシル化および非グリコシル化形態の混合物を含む。
【0088】
別の実施形態では、ＰＥＧ化、ポリシアリル化またはＰＬＧＡとのコンジュゲートのために使用される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、マウスＴＦＦ２ポリペプチド（受託番号ＮＰ＿０３３３８９）を表す配列番号３のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
【0089】
配列番号３は、シグナルペプチドを含むマウスＴＦＦ２のアミノ酸配列を示す：
MRPRGAPLLA VVLVLGLHAL VEGEKPSPCR CSRLTPHNRK NCGFPGITSE QCFDLGCCFD SSVAGVPWCF HPLPNQESEQ CVMEVSARKN CGYPGISPED CASRNCCFSN LIFEVPWCFF PQSVEDCHY。(配列番号3)
MRPRGAPLLA VVLVLGLHAL VEGEKPSPCR CSRLTPHNRK NCGFPGITSE QCFDLGCCFD SSVAGVPWCF HPLPNQESEQ CVMEVSARKN CGYPGISPED CASRNCCFSN LIFEVPWCFF PQSVEDCHY。(配列番号3)
【0090】
配列番号４は、受託番号ＮＭ＿００９３６３のＭｕｓ筋肉ＴＦＦ２核酸配列を表す。
ATTCTGCAGGCTGCCCAGGTCCAGTGGAGCAGACATGCGACCTCGAGGTGCCCCCCTGCT
GGCAGTGGTCCTGGTTTTGGGACTGCATGCTCTGGTAGAGGGCGAGAAACCTTCCCCCTG
TCGGTGCTCCAGGCTGACACCCCACAACAGAAAGAACTGTGGCTTCCCGGGCATCACCAG
TGAGCAGTGCTTTGATCTTGGATGCTGCTTTGACTCTAGCGTCGCTGGGGTCCCTTGGTG
TTTCCACCCACTTCCAAACCAAGAATCGGAGCAGTGTGTCATGGAAGTGTCAGCTCGCAA
GAATTGTGGGTACCCGGGCATCAGTCCCGAGGACTGTGCCAGTCGAAACTGCTGCTTTTC
CAACCTGATCTTTGAAGTGCCCTGGTGTTTCTTCCCACAGTCTGTGGAAGATTGTCACTA
CTGAGAGTTGCTACTGCCGAGCCACCCGTTCCCTGGGAGCTGCAAGCCAGAAGAAAGTTT
CAACCAGACTTCATCAATCTCTGGGGTTTCTAAAACCATCTTGACCCTTAGCAGTGGCTA
GACACAGCATTTTCCAAGTAAAGAAAAGTTG (配列番号4)
ATTCTGCAGGCTGCCCAGGTCCAGTGGAGCAGACATGCGACCTCGAGGTGCCCCCCTGCT
GGCAGTGGTCCTGGTTTTGGGACTGCATGCTCTGGTAGAGGGCGAGAAACCTTCCCCCTG
TCGGTGCTCCAGGCTGACACCCCACAACAGAAAGAACTGTGGCTTCCCGGGCATCACCAG
TGAGCAGTGCTTTGATCTTGGATGCTGCTTTGACTCTAGCGTCGCTGGGGTCCCTTGGTG
TTTCCACCCACTTCCAAACCAAGAATCGGAGCAGTGTGTCATGGAAGTGTCAGCTCGCAA
GAATTGTGGGTACCCGGGCATCAGTCCCGAGGACTGTGCCAGTCGAAACTGCTGCTTTTC
CAACCTGATCTTTGAAGTGCCCTGGTGTTTCTTCCCACAGTCTGTGGAAGATTGTCACTA
CTGAGAGTTGCTACTGCCGAGCCACCCGTTCCCTGGGAGCTGCAAGCCAGAAGAAAGTTT
CAACCAGACTTCATCAATCTCTGGGGTTTCTAAAACCATCTTGACCCTTAGCAGTGGCTA
GACACAGCATTTTCCAAGTAAAGAAAAGTTG (配列番号4)
【0091】
ヒトＴＦＦ２を収集、調製、単離および配列決定するための方法は、参照により本明細書に組み込まれるMay FEB et al. (2000), Gut, 46:454-459に記載されている。
【0092】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化、ポリシアリル化またはＰＬＧＡとコンジュゲート化されたタンパク質／ポリペプチドは、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約４６％～約５０％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約５０．１％～約５５％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約５５．１％～約６０％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約６０．１％～約６５％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と約６５．１％～約７０％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約７０．１％～約７５％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約７５．１％～約８０％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約８０．１％～約８５％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約８５．１％～約９０％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約９０．１％～約９５％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約９５．１％～約９７％の同一性を有するか、または、配列番号１、３もしくは１０と少なくとも約９７．１％～約９９％の同一性を有する、配列番号１、配列番号３あるいは配列番号６のバリアントを含み得る。
【0093】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、コドン最適化されたＤＮＡから生成される（実施例１～４を参照されたい）。
【0094】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化またはＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ハイブリッドペプチド、例えば、限定されないが、Ｈｉｓタグを有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチド；ＴＦＦ２－Ｃ－末端ＨＵＬＧ１ ＦＣタグ、ＴＦＦ２－ＨＳＡ、ＴＦＦ２－ＣＴＰ、ＴＦＦ２－ＣＴＰ－ＦＬＡＧ、ＴＦＦ２－ＦＬＡＧである。
【0095】
一部の実施形態では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性を改善するために使用される（Calo, et al., (2015), Precision Medicine, 2:e989）。
【0096】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化またはＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、切断されている。
【0097】
他の実施形態では、ＰＥＧ化またはＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、グリコシル化されている。
【0098】
一部の実施形態では、ヒトのＰＥＧ化またはＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、野生型と比較して、保存的アミノ酸変化を含有する。保存的アミノ酸突然変異または保存的アミノ置換は、アミノ酸を類似の生化学特性、例えば、電荷、疎水性およびサイズを有する異なるアミノ酸に変更するポリペプチド中のアミノ酸の置き換えである。例えば、脂肪族アミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸などによって置き換えられ得る（表１を参照されたい）。保存的アミノ酸変化はまた、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックスに基づくマトリックスを使用して決定することができ、例えば、Altschul, SF, (1991), Journal of Molecular Biology 219 (3):555-65を参照されたい。
【表1】
【0099】
交換されたドメイン（Ｄ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチド
ＴＦＦ２構造は、２つの比較的対称なドメイン（ＤＩおよびＤＩＩ）を含有し、それぞれのドメインは、２つの推定上のリガンド結合ドメイン（ＤＩにおけるＬＢＤＩおよびＤ２におけるＬＢＤＩＩ）を含有する（例えば、Carr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:2206-2210を参照されたい）。ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩについてのリガンドの特定は知られていないが、同じリガンドにそれぞれ結合すること、またはそれらが異なるリガンドに結合することは可能である。それらが同じリガンドに結合する場合、このリガンドに対する親和性が異なるであろうことが可能である。ＴＦＦ２のＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩのいずれかまたは両方についての１つの可能性のあるリガンドは、ＣＸＣＲ４受容体である。ＴＦＦ２が、ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩ両方のＣＸＣＲ４受容体に結合する場合、その結果、それは、２つのＣＸＣＲ４受容体の有効な二量体化を有する細胞表面における複合体をもたらすだろう。この種類の二量体化はまた、ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩが、ＣＸＣＲ４とは異なるが通常の受容体に結合する場合に予想されるだろう。ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩが異なるリガンドにそれぞれ結合する場合、その結果、その一方がＣＸＣＲ４であり得るそのような受容体の有効なヘテロ二量体化をもたらすと予想される。
ＴＦＦ２構造は、２つの比較的対称なドメイン（ＤＩおよびＤＩＩ）を含有し、それぞれのドメインは、２つの推定上のリガンド結合ドメイン（ＤＩにおけるＬＢＤＩおよびＤ２におけるＬＢＤＩＩ）を含有する（例えば、Carr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:2206-2210を参照されたい）。ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩについてのリガンドの特定は知られていないが、同じリガンドにそれぞれ結合すること、またはそれらが異なるリガンドに結合することは可能である。それらが同じリガンドに結合する場合、このリガンドに対する親和性が異なるであろうことが可能である。ＴＦＦ２のＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩのいずれかまたは両方についての１つの可能性のあるリガンドは、ＣＸＣＲ４受容体である。ＴＦＦ２が、ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩ両方のＣＸＣＲ４受容体に結合する場合、その結果、それは、２つのＣＸＣＲ４受容体の有効な二量体化を有する細胞表面における複合体をもたらすだろう。この種類の二量体化はまた、ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩが、ＣＸＣＲ４とは異なるが通常の受容体に結合する場合に予想されるだろう。ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩが異なるリガンドにそれぞれ結合する場合、その結果、その一方がＣＸＣＲ４であり得るそのような受容体の有効なヘテロ二量体化をもたらすと予想される。
【0100】
したがって、ＴＦＦ２のこれらの構造的特徴を利用すること、ならびに潜在的にＣＸＣＲ４、ＬＢＤおよびＤの交換を含む標的リガンドのより強力なまたは超強力な活性化因子を作製することは、ＴＦＦ２タンパク質の新たなバージョンを作製するために用いられ、これは、図１および２に示される。野生型ＴＦＦ２は、ＬＢＤＩ／ＩＩと称される。ＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩが同じカウンター受容体と相互作用するが、ＬＢＤＩまたはＬＢＤＩＩが、カウンター受容体に対してより大きな結合アビディティーを有する範囲まで、次いで、ＬＢＤは、野生型ＬＢＤＩ／ＩＩよりも高い親和性でカウンター受容体と相互作用するドメインタンパク質ＬＢＤＩ／ＩまたはＬＢＤＩＩ／ＩＩを交換し、野生型ＬＢＤＩ／ＩＩよりも改善された効果を誘発する。ＬＢＤＩまたはＬＢＤＩＩが他のＬＢＤ以外の受容体などの異なるカウンターリガンド（それぞれ、ＬＢＤＩＩまたはＬＢＤＩ）を有する範囲まで、かつＬＢＤＩ／ＩＩが、カウンター受容体のヘテロ複合体を誘導する範囲まで、次いで、ＬＢＤ交換バージョン（ＬＢＤＩ／ＩまたはＬＢＤＩＩ／ＩＩなど、下記ならびに図１および２を参照されたい）は、カウンター受容体のホモ二量体化を誘導し、野生型ＬＢＤＩ／ＩＩよりも異なる改善された効果を誘発する。二量体化およびオリゴマー化するＬＢＤＩおよびＬＢＤＩＩについての１つの可能性のあるカウンター受容体は、ＣＸＣＲ４であり（Ge B, et al., (2017) Sci Rep. 7(1):16873）、その結果、ＬＢＤＩ／ＩまたはＬＢＤＩＩ／ＩＩは、野生型ＴＦＦ２（ＬＢＤＩ／ＩＩ）よりも強力なＣＸＣＲ４の機能性リガンドである。ＣＸＣＲ４はまた、膜結合ケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＣＲ２とヘテロ二量体を形成する（Gahbauer, S et al. (2018) PLoS Comput Biol. 14(3):e1006062）。ＬＢＤ交換ｃＤＮＡ構築物、模倣体およびその他によってコードされるある特定の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＣＸＣＲ４を含むＴＦＦ２カウンター受容体の同族および非同族リガンドの機能を阻害する。ＣＸＣＲ４のリガンドの例としては、ストローマ由来因子－１アルファ（ＳＤＦ－１αまたはＣＸＣＬ１２）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）および細胞外ユビキチンが挙げられる。ＳＤＦ－１αは、ＣＸＣＲ４に結合し、活性化する、ＣＸＣＲ４の同族リガンドである。ＭＩＦは、ＣＸＣＲ４シグナル伝達を引き起こすＣＸＣＲ４の非同族リガンドである（Bernhagen, J et al. (2007) Nature Medicine 13(5): 587-96）。細胞外ユビキチンは、ＣＸＣＲ４のリガンドである（Saini, V et al. (2010) J Biol Chem 285(20) 15566；Scofield, SLC et al. (2018) Life Sci. 211:8）。
【0101】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒトＴＦＦ２の１つまたは複数のドメイン１（ＤＩ）領域を含有する。
【0102】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒトＴＦＦ２の１つまたは複数のＤＩＩ領域を含有する。
【0103】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒトＴＦＦ２のＤＩおよびＤＩＩ領域の両方を含有する。
【0104】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有するドメインを含有する。
ヒトＴＦＦ２ドメインＩ（残基８～４６）
ヒトＴＦＦ２ドメインＩ（残基８～４６）
【化3】
【0105】
【0106】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有する２つのＤＩ領域を含有する。
ヒトＴＦＦ２ドメインＩ／Ｉバリアント（ＤＩ／Ｉ、１０７ＡＡ）－２つのドメインＩ領域（図１を参照されたい）
ヒトＴＦＦ２ドメインＩ／Ｉバリアント（ＤＩ／Ｉ、１０７ＡＡ）－２つのドメインＩ領域（図１を参照されたい）
【化5】
【0107】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有する２つのＤＩＩ領域を含有する。
ヒトＴＦＦ２ドメインＩＩ／ＩＩバリアント（ＤＩＩ／ＩＩ、１０５ＡＡ）－２つのドメインＩＩ領域（図１を参照されたい）
ヒトＴＦＦ２ドメインＩＩ／ＩＩバリアント（ＤＩＩ／ＩＩ、１０５ＡＡ）－２つのドメインＩＩ領域（図１を参照されたい）
【化6】
【0108】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＤＩＩおよびＤＩバリアントを含有し、ここで、ＤＩおよびＤＩＩの順序は、以下の配列で相互交換される。
ヒトＴＦＦ２ドメインＩＩ／Ｉバリアント（ＤＩＩ／Ｉ、１０６ＡＡ）－相互交換されたドメインＩおよびＩＩ（図１を参照されたい）
ヒトＴＦＦ２ドメインＩＩ／Ｉバリアント（ＤＩＩ／Ｉ、１０６ＡＡ）－相互交換されたドメインＩおよびＩＩ（図１を参照されたい）
【化7】
【0109】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有するＬＢＤの推定上の受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有する（図２を参照されたい）。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ＤＩおよびＤＩＩ間で相互交換された推定上のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）部位残基（ＬＢＤ ＩＩ／Ｉ）（図２を参照されたい）。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ＤＩおよびＤＩＩ間で相互交換された推定上のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）部位残基（ＬＢＤ ＩＩ／Ｉ）（図２を参照されたい）。
【化8】
【0110】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号２９の配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号２９の配列を有する。
【0111】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有するＬＢＤの受容体結合部位残基におけるアミノ酸置換を含有する。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ＤＩのみからのＬＢＤの推定上の受容体結合部位残基を含有するバリアント（ＬＢＤ Ｉ／Ｉ）（図２を参照されたい）。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ＤＩのみからのＬＢＤの推定上の受容体結合部位残基を含有するバリアント（ＬＢＤ Ｉ／Ｉ）（図２を参照されたい）。
【化9】
【0112】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３０の配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３０の配列を有する。
【0113】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、以下の配列を有するＬＢＤの受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有する。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ドメインＩＩのみからのＬＢＤの推定上の受容体結合部位残基を含有するバリアント（ＬＢＤ ＩＩ／ＩＩ）（図２を参照されたい）。
ヒトＴＦＦ２－ＡＡ－置換（１０６ＡＡ）－ドメインＩＩのみからのＬＢＤの推定上の受容体結合部位残基を含有するバリアント（ＬＢＤ ＩＩ／ＩＩ）（図２を参照されたい）。
【化10】
【0114】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３１の配列を含む。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、受容体結合部位残基にアミノ酸置換を含有し、配列番号３１の配列を有する。
【0115】
一部の実施形態では、ＤＩおよびＤＩＩ領域を有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＣＸＣＲ４を含むカウンター受容体への異なる結合親和性、すなわち、より強い～より弱い結合親和性を有する。
【0116】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチド、例えば、配列番号２４～３１によって記載されるものは、ＰＥＧ化、ポリシアリル化（ＰＳＡ）、もしくはＰＬＧＡとのコンジュゲート化によって、またはＰＡＳ化、ＨＡＰ化、ＥＬＰ化、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰによって修飾された融合タンパク質として、および／または、あるいは、およびこれらの修飾の組合せによって修飾される。
【0117】
一部の実施形態では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチド、例えば、配列番号２４～３２によって記載されるものの薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）特性を改善するために使用される。
【0118】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド、例えば、配列番号２４～３２によって記載されるものは、グリコシル化されている。
【0119】
ＬＢＤおよび／またはＤ交換領域を有する修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの効力は、カルシウム流出、細胞遊走ならびに細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）のＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性化によって試験される。ＣＸＣＲ４についての効果の特異性は、ＣＸＣＲ４阻害剤のＡＭＤ３１００またはｍＡｂ １２Ｇ５を使用することによって研究される。ＬＢＤおよびＤ交換タンパク質の結合は、ｍＡｂ ２Ｂ１１の結合を遮断するそれらの能力によって評価される（Dubeykovskaya, Z. Dubeykovskaya, A., Wang, J., (2009), J Biol Chem., 284(6):3650-62）。
【0120】
ＥＲＫ１／２のリン酸化についてのアッセイ
一部の実施形態では、ＴＦＦ２の活性の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒによるＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ １／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキットを使用することによって、ジャーカットヒト急性Ｔ細胞白血病細胞におけるＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化によって行われる。ＡＴＣＣによって提供されたジャーカット細胞を解凍し、ＡＴＣＣによって提供された説明書に従って増殖させる。細胞を、遠心分離によって回収し、ＨＢＳＳ中に１０７個細胞／ｍＬで再懸濁させる。細胞を、３８４ウェルの白色の不透明な培養プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に４ｍＬの細胞／ウェルで播種し、３７℃で１～２時間インキュベートする。０．１％のＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中の１０～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で４μＬ中の組換えＴＦＦ２の野生型およびバリアントを、プレートに添加して、細胞を刺激し、３７℃で５～３０分間インキュベートする。細胞を、２μＬ／ウェルの溶解緩衝液で溶解し、続いて、５ｍＬのＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｍｉｘを添加する。次いで、プレートをＴｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、室温で１時間インキュベートする。次いで、５ｍＬのＤｏｎｏｒ Ｍｉｘを明るすぎない光の下でウェルに添加し、Ｔｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、ホイルで覆い、暗所で、室温で１時間インキュベートする。プレートを、標準的なＡｌｐｈａＰｌｅｘの設定を使用して、ＡｌｐｈａＰｌｅｘ適合プレートリーダーにおいて読み取る。ＣＸＣＲ４のＴＦＦ２刺激の阻害は、組換えＴＦＦ２の添加前に、ＣＸＣＲ４の低分子アンタゴニストのＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ １２Ｇ５および２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃で１～２時間行う。
一部の実施形態では、ＴＦＦ２の活性の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒによるＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ １／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキットを使用することによって、ジャーカットヒト急性Ｔ細胞白血病細胞におけるＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化によって行われる。ＡＴＣＣによって提供されたジャーカット細胞を解凍し、ＡＴＣＣによって提供された説明書に従って増殖させる。細胞を、遠心分離によって回収し、ＨＢＳＳ中に１０７個細胞／ｍＬで再懸濁させる。細胞を、３８４ウェルの白色の不透明な培養プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に４ｍＬの細胞／ウェルで播種し、３７℃で１～２時間インキュベートする。０．１％のＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中の１０～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で４μＬ中の組換えＴＦＦ２の野生型およびバリアントを、プレートに添加して、細胞を刺激し、３７℃で５～３０分間インキュベートする。細胞を、２μＬ／ウェルの溶解緩衝液で溶解し、続いて、５ｍＬのＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｍｉｘを添加する。次いで、プレートをＴｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、室温で１時間インキュベートする。次いで、５ｍＬのＤｏｎｏｒ Ｍｉｘを明るすぎない光の下でウェルに添加し、Ｔｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、ホイルで覆い、暗所で、室温で１時間インキュベートする。プレートを、標準的なＡｌｐｈａＰｌｅｘの設定を使用して、ＡｌｐｈａＰｌｅｘ適合プレートリーダーにおいて読み取る。ＣＸＣＲ４のＴＦＦ２刺激の阻害は、組換えＴＦＦ２の添加前に、ＣＸＣＲ４の低分子アンタゴニストのＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ １２Ｇ５および２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃で１～２時間行う。
【0121】
ＰＥＧ化
一部の場合では、タンパク質系薬物は、それらが迅速に分解され、患者から排出される場合があり、分子の免疫原性の可能性を増加させ得、治療の費用も増加させ得る頻回投与をもたらすので、治療薬として問題がある（Dozier, J. K., and Distefano M. D., (2015), Int, J. Mol. Sci., 16:25831-25864）。ＴＦＦ２タンパク質は、循環中でのその劣った半減期に起因して、劣った薬物動態を有することが示されている（Dubeykovskaya, Z. A. et al., (2019), Cancer Gene Therapy, 26:48-57）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾されたタンパク質は、増加した血清半減期、改善された溶解度、良好な物理的および熱的安定性、酵素分解に対する保護、増加した溶解度、低減された毒性ならびに減少した免疫原性を含む、改善された薬理学的特性を示す。
一部の場合では、タンパク質系薬物は、それらが迅速に分解され、患者から排出される場合があり、分子の免疫原性の可能性を増加させ得、治療の費用も増加させ得る頻回投与をもたらすので、治療薬として問題がある（Dozier, J. K., and Distefano M. D., (2015), Int, J. Mol. Sci., 16:25831-25864）。ＴＦＦ２タンパク質は、循環中でのその劣った半減期に起因して、劣った薬物動態を有することが示されている（Dubeykovskaya, Z. A. et al., (2019), Cancer Gene Therapy, 26:48-57）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学修飾されたタンパク質は、増加した血清半減期、改善された溶解度、良好な物理的および熱的安定性、酵素分解に対する保護、増加した溶解度、低減された毒性ならびに減少した免疫原性を含む、改善された薬理学的特性を示す。
【0122】
薬物動態パラメーターに対するＰＥＧ化の有益な効果に加えて、ＰＥＧ化それ自身が、活性を増強する場合がある。例えば、ＰＥＧ－ＩＬ－１０は、非ＰＥＧ化ＩＬ－１０よりもある特定のがんに対してより有効であることが示されている（例えば、ＥＰ２０６６３６Ａ２を参照されたい）。
【0123】
本開示は、他のポリマー、例えば、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンの使用を企図する。
【0124】
本開示の態様は、全長ＴＦＦ２ポリペプチドと比較して、ＰＥＧ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチド、例えば、配列番号１のポリペプチドまたはそのバリアントである。ＰＥＧ化の任意の好適な方法が使用され得る。ポリペプチドのＰＥＧ化は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，４２０，３３９号；同第７，６１０，１５６号；同第５，７６６，８９７号；同第７，０５２，６８６号および同第７，９４７，４７３号を参照されたい。また、例えば、Fee, C., and Damodaran V.B., Protein PEGylation: An overview of chemistry and process consideration, European Pharmaceutical Review, Issue 1 2010も参照されたい。
【0125】
本開示の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＰＥＧ化されて、その腎クリアランスを減少させることによる血漿中でのその循環を延長させるによって生じ得るそのｉｎ ｖｉｖｏの半減期を増加させ、および／またはその免疫原性を減少させる。ＰＥＧ化は、疎水性の薬物およびタンパク質の水溶解度も増加させることができる。
【0126】
タンパク質コンジュゲーションのためにこれまでに使用された全体的なＰＥＧ化プロセスは、大きくは２つの種類、すなわち、溶液相バッチプロセス、およびカラム上のフェドバッチプロセスに分類することができる（Fee, Conan J.; Van Alstine, James M. (2006), Chemical Engineering Science, 61 (3): 924）。これは、好適な緩衝液中、好ましくは、４～６℃の温度で試薬を一緒に混合すること、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および膜または水性の２相系を含む、その物理化学的特性に基づく好適な技法を使用する所望の生成物の分離および精製を含む（Veronese, edited by Francesco M. (2009). "Protein conjugates purification and characterization". PEGylated protein drugs basic science and clinical applications (Online-Ausg. ed.). Basel: Birkhauser. pp. 113-125；およびFee, Conan J. (2003), Biotechnology and Bioengineering, 82 (2): 200-6）。
【0127】
ＰＥＧ誘導体のための好適な官能基の選択は、ＰＥＧにカップリングされる分子上の利用可能な反応性基の種類に基づく。タンパク質のためには、典型的な反応性アミノ酸としては、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸も、アルデヒド機能性ポリマーとのコンジュゲーションによる部位特異的な部位として使用することができる（Fee, Conan J.; Damodaran, Vinod B. (2012), Biopharmaceutical Production Technology. p. 199）。
【0128】
一部の実施形態では、ＰＥＧ化は、ＴＦＦ２ポリペプチドの一方または両方の末端で起こる。同じ反応性部分によりそれぞれの末端で活性化されたＰＥＧは、「ホモ二官能性」として公知であるが、存在する官能基が異なる場合、その結果、ＰＥＧ誘導体は、「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と称される。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な誘導体または活性化誘導体は、ＰＥＧを所望の分子に結合するために調製される（Pasut, G.; Veronese, F. M. (2012), Journal of Controlled Release. 161 (2): 461-472）。
【0129】
第１世代のＰＥＧ誘導体を形成するために使用される技法は、一般に、ＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基と反応性の基、典型的には、無水物、酸塩化物、クロロホルメートおよびカーボネートと反応させることである。第２世代のＰＥＧ化化学では、より有効な官能基、例えば、アルデヒド、エステル、アミドなどが、コンジュゲーションのために利用可能になった。
【0130】
ヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性の柔軟で生体適合性のスペーサーが必要とされる場合に、２つの実体の連結において有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧのための好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮＨＳエステルである（国際公開第２０１１／００８４９５号を参照されたい）。
【0131】
第３世代のＰＥＧ化剤は、ポリマーが分岐している場合、Ｙ型またはくし型が利用可能であり、低減された粘度および臓器蓄積の欠如を示す（Ryan, Sinead M; Mantovani, Giuseppe; Wang, Xuexuan; Haddleton, David M; Brayden, David J (2008), Expert Opinion on Drug Delivery, 5 (4): 371-83）。
【0132】
一実施形態では、ＰＥＧは、共有結合的に連結される。別の実施形態では、ＰＥＧは、ＴＦＦ２ポリペプチドに、システインまたはリシン残基で連結される。ＰＥＧ化は、限定されるものではないが、Ｎ－ヒドロキシルスクシンイミド活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンまたはチオールを含む、いくつかのＰＥＧ結合部分を使用して達成することができる。ＰＥＧポリマーは、ＴＦＦ２ポリペプチドに、いずれかの所定の位置で連結され得るか、またはＴＦＦ２ポリペプチドに、無作為に連結され得る。ＰＥＧ化はまた、ＴＦＦ２ポリペプチドに結合するペプチドリンカーを通して媒介され得る。すなわち、ＰＥＧ部分は、ＴＦＦ２ポリペプチドに融合されたペプチドリンカーに結合され得、ここで、リンカーは、ＰＥＧ結合のための部位（例えば、遊離システインまたはリシン）を提供する。
【0133】
ＰＥＧ化は、最も頻繁には、ポリペプチドのＮ末端のアルファアミノ基、リシン残基の側鎖上のイプシロンアミノ酸、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で起こる。ほとんどの組換えポリペプチドは、単一のアルファ基ならびに多くのイプシロンアミノ基およびイミダゾール基を持つので、多数の可能性のある異性体が、リンカー化学に応じて生じ得る。当技術分野において公知の一般的なＰＥＧ化戦略を、本明細書において適用することができる。ＰＥＧは、ポリペプチド配列のうちの１つまたは複数の遊離のアミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの間の結合を媒介する末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のポリペプチドに結合し得る。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧとしては、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ－ヒドロキシヒドロキシスクシニルイミドで活性化することによって調製され得るＮ－ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールが挙げられる。遊離アミノ基に結合し得る別の活性化ポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルを塩化シアヌルと反応させることによって調製され得る２，４－ビス（Ｏ－メトキシポリエチレングリコール）－６－クロロ－ｓ－トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合する活性化ポリエチレングリコールとしては、ポリオキシエチレンジアミンが挙げられる。
【0134】
スペーサーを有するＰＥＧへの本開示のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数のコンジュゲーションは、さまざまな従来の方法によって行われ得る。例えば、コンジュゲーション反応は、４：１～３０：１の試薬のタンパク質に対するモル比を利用して、５～１０のｐＨの溶液中、４℃～室温の温度で、３０分～２０時間行うことができる。反応条件は、主に所望の置換度の生成の方に反応を向かわせるように選択され得る。一般に、低温、低ｐＨ（例えば、約ｐＨ５）および短い反応時間は、結合するＰＥＧの数を減少させる傾向があるが、高温、中性～高ｐＨ（例えば、約ｐＨ７）およびより長い反応時間は、結合するＰＥＧの数を増加させる傾向がある。当技術分野において公知のさまざまな手段を使用して、反応を終了させ得る。一部の実施形態では、反応は、反応混合物を酸性化すること、および例えば－２０℃で凍結することによって終了される。さまざまなポリペプチドのＰＥＧ化は、例えば、米国特許第５，２５２，７１４号；同第５，６４３，５７５号；同第５，９１９，４５５号；同第５，９３２，４６２号；および同第５，９８５，２６３号において議論されている。
【0135】
本開示は、ＰＥＧ模倣物の使用も企図する。ＰＥＧの特質（例えば、増強された血清半減期）を保持するが、いくつかの追加の有利な特性を付与する組換えＰＥＧ模倣物が開発されている。例として、ＰＥＧと類似の伸長した配置を形成することができる単純なポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含む）は、目的のペプチドまたはタンパク質薬物に既に融合されて、組換えで生成させることができる（例えば、Amunix’ XTEN technology; Mountain View, Calif.）。これは、製造プロセスの間の追加のコンジュゲーションステップについての必要性を未然に防ぐ。また、確立された分子生物学技法は、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御を可能にし、免疫原性および製造特性の最適化を可能にする。
【0136】
ある特定の実施形態では、親水性ポリマーが、ＴＦＦ２ポリペプチドに付加される。親水性ポリマーは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドに、（直接的または間接的に）連結され得る。具体的な実施形態では、リンカー（例えば、１～５、５～１０または１～１０アミノ酸リンカー、例えば、グリシンリンカー）を使用して、親水性ポリマーを修飾ＴＦＦ２ポリペプチドに連結させる。親水性ポリマーは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドに、共有結合的または非共有結合的に連結され得る。親水性ポリマーは、基本的に組織化されていない、ＰＥＧの機能性アナログである親水性アミノ酸ポリマー、ポリ（メタクリレート）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ジビニルエーテル－無水マレイン酸（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリオキサゾリン、ポリホスフェート、ポリホスファゼン、および従来のＰＥＧの誘導体（例えば、ヒドロキシ－ＰＥＧ）であり得る。ヒドロキシ－ＰＥＧは、米国特許第８，１２９，３００号；および米国特許出願公開第２０１２０１１４７４２号に開示されている。ある特定の実施形態では、２つ、３つまたはそれよりも多くの親水性ポリマーが、ＴＦＦ２ペプチドに連結される。親水性ポリマーは、ペプチドに、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端またはＣ末端およびＮ末端の両方で連結され得る。
【0137】
本開示の態様として、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、１）アルデヒド－ＰＥＧ化学を介したＮ末端のＰＥＧ化；および２）ＮＨＳ－ＰＥＧ化学を介した無溶媒で曝されたアミン（リシン）のＰＥＧ化を含む各種の方法を使用して、ＰＥＧ化することができる。アルデヒド化学を介したＰＥＧ化は、Tureck P. L., et al., (2016), Journal of Pharmaceutical Sciences, 105:460-475に記載されている。ＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体を使用するＰＥＧ化は、第１級アミン末端に対するＮＨＳ活性エステルの選択性に基づく（Fee, C. and Damodaran V. B., (2010), European Pharmaceutical Review, Issue 1を参照されたい）。
【0138】
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端修飾された」という用語は、タンパク質またはペプチドのそのアミノ（Ｎ）末端での修飾を指す。例えば、修飾がＰＥＧ化である場合、その結果、ＰＥＧ部分は、Ｎ末端で修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの最初の４分の１を形成する、１つまたは複数のアミノ酸残基で付加／連結／コンジュゲートされる。アミノ酸残基としては、限定されるものではないが、リシン、システイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはアルギニンが挙げられる。
【0139】
Ｎ末端修飾ＰＥＧ－修飾ＴＦＦ２ポリペプチドコンジュゲートは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＮ末端のアミンを、還元剤の存在下でＰＥＧのアルデヒド基と反応させることによって得られ得る。還元剤としては、ＮａＣＮＢＨ３およびＮａＢＨ４が挙げられ得る。
【0140】
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションのために好適なＰＥＧは、一般に、室温で水に可溶性であり、一般式Ｒ（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎＯ－Ｒ（式中、Ｒは、水素、またはアルキルもしくはアルカノール基などの保護基であり、ｎは、１～１０００の整数である）を有する。Ｒが保護基である場合、それは、一般に、１～８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされたＰＥＧは、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状ＰＥＧ誘導体の「ｓｔａｒ－ＰＥＧ」およびマルチアームＰＥＧは、本開示によって企図される。本開示において使用されるＰＥＧの分子量は、任意の特定の範囲に制限されず、例は、本明細書の他の箇所に記述され、例として、ある特定の実施形態は、５ｋＤａ～２０ｋＤａの分子量を有する一方、他の実施形態は、４ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を有する。
【0141】
本明細書で使用される場合、「分枝状」という用語は、ポリマー分子の構造を指し、ここで、ポリマー分子は、主鎖から伸びている同じ基本ポリマーもしくは別のポリマーの枝を有する骨格または主鎖としての機能を果たす直鎖状ポリマーである。この構造は、低分子の１つまたは複数の官能基の一端で接続されたポリマー分子の直鎖状ストレッチおよびその直鎖状ストレッチのうちの２つまたはそれよりも多くに重合されるモノマーによって表すことができ、ここで、低分子は、１０００ダルトン未満の分子量を有する。分枝状ポリマー分子、例えば、分枝状ＰＥＧの例は、Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476 (2002)に表されている。官能基を有する例示的な低分子としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、グリセリン、ペンタエリスリトールまたはヘキサグリセリンが挙げられる。
【0142】
本開示は、ＰＥＧが異なるｎ値を有し、したがって、さまざまな異なるＰＥＧが特異的な比で存在する、コンジュゲートの組成物も企図する。例えば、一部の組成物は、ｎ＝１、２、３および４のコンジュゲートの混合物を含む。一部の組成物では、ｎ＝１のコンジュゲートのパーセンテージは１８～２５％であり、ｎ＝２のコンジュゲートのパーセンテージは５０～６６％であり、ｎ＝３のコンジュゲートのパーセンテージは１２～１６％であり、ｎ＝４のコンジュゲートのパーセンテージは最高で５％である。そのような組成物は、当技術分野において公知の反応条件および精製方法によって生成することができる。例示的な反応条件を、本明細書全体にわたって記載する。カチオン交換クロマトグラフィーを使用して、コンジュゲートを分離してもよく、次いで、画分は、例えば、所望の数の結合したＰＥＧを有するコンジュゲートを含有するものが特定され、未修飾タンパク質配列および他の数の結合したＰＥＧを有するコンジュゲートを含まずに精製される。
【0143】
別の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）でＰＥＧ化される（例えば、Poovi G., and Damodharan, N. (2018) European Journal of Applied Sciences, 10(1):01-14を参照されたい）。
【0144】
別の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒドロキシＰＥＧ（ｈＰＥＧ）でＰＥＧ化される。ヒドロキシ－ＰＥＧは、米国特許第８，１２９，３００号；および米国特許出願公開第２０１２０１１４７４２号に記載されている。
【0145】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化、または親水性ポリマーの本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドへの付加は、ｉｎ ｖｉｖｏのペプチドの半減期を、当業者に公知の技法によって評価されるように、未修飾ＴＦＦポリペプチドと比較して、２～５倍、２～１０倍、２～２０倍、２～２５倍、２～５０倍、２～７５倍または２～１００倍増加させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化、または親水性ポリマーの本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドへの付加は、ｉｎ ｖｉｖｏのペプチドの半減期を、当業者に公知の技法によって評価されるように、未修飾ＴＦＦポリペプチドと比較して、５～１０倍、５～２０倍、５～２５倍、５～５０倍、５～７５倍または５～１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化、または親水性ポリマーの本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドへの付加は、ｉｎ ｖｉｖｏのペプチドの半減期を、当業者に公知の技法によって評価されるように、未修飾ＴＦＦポリペプチドと比較して、１０～２０倍、１０～２５倍、１０～５０倍、１０～７５倍または１０～１００倍増加させる。一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化、または親水性ポリマーの本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドへの付加は、ｉｎ ｖｉｖｏのペプチドの半減期を、当業者に公知の技法によって評価されるように、未修飾ＴＦＦポリペプチドと比較して、２５倍～５０倍、２５～７５倍または２５～１００倍増加させる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのＰＥＧ化、または親水性ポリマーの本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドへの付加は、ｉｎ ｖｉｖｏのペプチドの半減期を、当業者に公知の技法によって評価されるように、５０～７５倍または２～１００倍増加させる。
【0146】
治療用ポリペプチドの安定性および／または効力を増加させる他の方法は、当技術分野において公知であり、本開示の実施形態として含まれ、例えば、Strohl, W. R., (2015), BioDrugs, 29(4):215-239を参照されたい。
【0147】
ＣＴＰペプチド
一部の実施形態では、コンジュゲートする部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰペプチドである。ＣＴＰペプチドは、３１アミノ酸残基のペプチドＦＱＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１１）を含み、ここで、Ｓ＊は、Ｏ－グリコシル化部位を示す（例えば、Furuhashi et al., (1995) Mol Endocrinol., 9(1):54-63を参照されたい）。
一部の実施形態では、コンジュゲートする部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのＣＴＰペプチドである。ＣＴＰペプチドは、３１アミノ酸残基のペプチドＦＱＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号１１）を含み、ここで、Ｓ＊は、Ｏ－グリコシル化部位を示す（例えば、Furuhashi et al., (1995) Mol Endocrinol., 9(1):54-63を参照されたい）。
【0148】
ＰＡＳ化（登録商標）
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＰＡＳ化される（Aghaabdollahian, S. et al., (2019) Scientific Reports,9:2978、Payne et al. (2010) Pharm. Dev. Technol., 1-18；Pisal et al. (2010) J. Pharm. Sci. 99 (6), 2557-2575；Veronese. (2001) Biomaterials 22 (5), 405-417；Veronese (2009) Milestones in drug therapy (Parnham, M. J., and Bruinvels, J., Eds.) Birkhauser, Basel；米国特許第９，２２１，８８２号；米国特許第９，２６０，４９４号；同第９，９５７，３２３号；同第１０，０８１，６５７号；同第１０，１７４，３０２号；および同第９，５７４，０１４号を参照されたい）。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＡＳ化は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性を増加させることが報告されている（米国特許第９，２６０，４９４号）。ＰＡＳ化は、ポリペプチド、例えば、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする核酸のＰＡＳポリペプチドをコードする核酸との遺伝子融合である。ＰＡＳポリペプチドは、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ残基からなる親水性の非電荷ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、約４、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００もしくは約６００アミノ酸、またはその間の任意の範囲、例えば、４～６００、１０～５００アミノ酸などからなる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＰＡＳ化される（Aghaabdollahian, S. et al., (2019) Scientific Reports,9:2978、Payne et al. (2010) Pharm. Dev. Technol., 1-18；Pisal et al. (2010) J. Pharm. Sci. 99 (6), 2557-2575；Veronese. (2001) Biomaterials 22 (5), 405-417；Veronese (2009) Milestones in drug therapy (Parnham, M. J., and Bruinvels, J., Eds.) Birkhauser, Basel；米国特許第９，２２１，８８２号；米国特許第９，２６０，４９４号；同第９，９５７，３２３号；同第１０，０８１，６５７号；同第１０，１７４，３０２号；および同第９，５７４，０１４号を参照されたい）。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＡＳ化は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性を増加させることが報告されている（米国特許第９，２６０，４９４号）。ＰＡＳ化は、ポリペプチド、例えば、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする核酸のＰＡＳポリペプチドをコードする核酸との遺伝子融合である。ＰＡＳポリペプチドは、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ残基からなる親水性の非電荷ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＰＡＳ化された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、約４、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００もしくは約６００アミノ酸、またはその間の任意の範囲、例えば、４～６００、１０～５００アミノ酸などからなる。
【0149】
ＸＴＥＮ化
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＸＴＥＮ化されている。「ＸＴＥＮ（商標）」（Ａｍｕｎｉｘ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｃ．）および／または「ＸＴＥＮ化」という用語は、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴで構成される大きな組織化されていない組換えポリペプチドを指す。ＸＴＥＮは、約８６４アミノ酸の長さを有し得るが、より短くもあり得る（例えば、国際公開第２０１００９１１２２Ａ１号による８６４アミノ酸長のポリペプチドの断片）。ＸＴＥＮ化という用語は、ＸＴＥＮの標的の治療用タンパク質（「ペイロード」）との融合を指す。ＸＴＥＮ化は、治療用タンパク質（すなわち、本明細書では、本開示の融合タンパク質）の血清半減期を増加する働きをする。「ＸＴＥＮ」および／または「ＸＴＥＮ化」という用語は、少なくとも４０の連続したアミノ酸を含む組織化されていない組換えポリペプチド（ＵＲＰ）も指し、ここで、ＵＲＰに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の合計は、組織化されていない組換えポリペプチドの総アミノ酸の少なくとも８０％を構成し、残りは、存在する場合、アルギニンまたはリシンからなり、残りは、メチオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンを含有しない。
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＸＴＥＮ化されている。「ＸＴＥＮ（商標）」（Ａｍｕｎｉｘ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｉｎｃ．）および／または「ＸＴＥＮ化」という用語は、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴで構成される大きな組織化されていない組換えポリペプチドを指す。ＸＴＥＮは、約８６４アミノ酸の長さを有し得るが、より短くもあり得る（例えば、国際公開第２０１００９１１２２Ａ１号による８６４アミノ酸長のポリペプチドの断片）。ＸＴＥＮ化という用語は、ＸＴＥＮの標的の治療用タンパク質（「ペイロード」）との融合を指す。ＸＴＥＮ化は、治療用タンパク質（すなわち、本明細書では、本開示の融合タンパク質）の血清半減期を増加する働きをする。「ＸＴＥＮ」および／または「ＸＴＥＮ化」という用語は、少なくとも４０の連続したアミノ酸を含む組織化されていない組換えポリペプチド（ＵＲＰ）も指し、ここで、ＵＲＰに含有されるグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）残基の合計は、組織化されていない組換えポリペプチドの総アミノ酸の少なくとも８０％を構成し、残りは、存在する場合、アルギニンまたはリシンからなり、残りは、メチオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンを含有しない。
【0150】
ＥＬＰ化
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＥＬＰ化されている。コンジュゲートする部分は、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）である。ＥＬＰ化は、エラスチン中で一般に見出される配列を含有する反復するペプチド単位であるＥＬＰを使用する（Yeboah A, et al., (2016), Biotechnol Bioeng 113:1617-1627を参照されたい）。ＥＬＰ化は、目的のポリペプチドをコードする核酸のエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）をコードする核酸との遺伝子融合を含む。ＥＬＰは、ＶＰＧｘＧ反復モチーフＶａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｇｌｙ（配列番号１２）を含み、ここで、ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である（国際公開第２０１８／１３２７６８号を参照されたい）。
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＥＬＰ化されている。コンジュゲートする部分は、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）である。ＥＬＰ化は、エラスチン中で一般に見出される配列を含有する反復するペプチド単位であるＥＬＰを使用する（Yeboah A, et al., (2016), Biotechnol Bioeng 113:1617-1627を参照されたい）。ＥＬＰ化は、目的のポリペプチドをコードする核酸のエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）をコードする核酸との遺伝子融合を含む。ＥＬＰは、ＶＰＧｘＧ反復モチーフＶａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｇｌｙ（配列番号１２）を含み、ここで、ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である（国際公開第２０１８／１３２７６８号を参照されたい）。
【0151】
ＨＡＰ（ホモアミノ酸ポリマー）
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＨＡＰ化されている。ＨＡＰ化は、目的のポリペプチドをコードする核酸のグリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）をコードする核酸との遺伝子融合である。一部の例では、ＨＡＰポリマーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ反復モチーフ（配列番号１３）を含み、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００またはそれよりも多くの残基の長さを有する場合がある（Schlapschy, M. et al. Protein Eng Des Sel 20, 273-284）。
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＨＡＰ化されている。ＨＡＰ化は、目的のポリペプチドをコードする核酸のグリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）をコードする核酸との遺伝子融合である。一部の例では、ＨＡＰポリマーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ反復モチーフ（配列番号１３）を含み、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００またはそれよりも多くの残基の長さを有する場合がある（Schlapschy, M. et al. Protein Eng Des Sel 20, 273-284）。
【0152】
ＰＳＡ（ポリシアリル化）
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリシアリル化され得る。コロミン酸（ＣＡ）としても公知のポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然に存在する多糖である。これは、α（２→８）ケトシド連結もしくはα（２→９）連結または両方の混合物を有するＮ－アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端にビシナルのジオール基を含有する。これは、負に帯電しており、ヒト身体の天然の構成物質である。ＰＳＡは、細菌中で生成させることができる（米国特許第５，８４６，９５１号；米国特許第９，０１８，１６６号；米国特許第１０，４１４，７９３号；Zhang et al., (2014), Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 9(2):75-81）。ポリペプチドをポリシアリル化するための方法は、米国特許出願公開第２０１２／０３２９１２７号に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリシアリル化され得る。コロミン酸（ＣＡ）としても公知のポリシアル酸（ＰＳＡ）は、天然に存在する多糖である。これは、α（２→８）ケトシド連結もしくはα（２→９）連結または両方の混合物を有するＮ－アセチルノイラミン酸のホモポリマーであり、その非還元末端にビシナルのジオール基を含有する。これは、負に帯電しており、ヒト身体の天然の構成物質である。ＰＳＡは、細菌中で生成させることができる（米国特許第５，８４６，９５１号；米国特許第９，０１８，１６６号；米国特許第１０，４１４，７９３号；Zhang et al., (2014), Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 9(2):75-81）。ポリペプチドをポリシアリル化するための方法は、米国特許出願公開第２０１２／０３２９１２７号に記載されている。
【0153】
ＰＬＧＡ
ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とのコンジュゲーション。一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とコンジュゲートされ得る。ＰＬＧＡ（PGLA）は、帯電しており、ヒト身体の天然の構成物質である。ＰＬＧＡは、例えば、ジルコプラン（Ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む環状マクロライド薬物の血漿半減期を伸ばす。
ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とのコンジュゲーション。一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）とコンジュゲートされ得る。ＰＬＧＡ（PGLA）は、帯電しており、ヒト身体の天然の構成物質である。ＰＬＧＡは、例えば、ジルコプラン（Ｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む環状マクロライド薬物の血漿半減期を伸ばす。
【0154】
医薬組成物および投与の方法
本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、さまざまな方法で投与することができる。例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、静脈内注入、筋肉内投与、埋め込み可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または投与の他の様式を使用して投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Sefton (1987) Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507；Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；また、Levy et al. (1985) Science 228:190；During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351；Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105も参照されたい）。別の実施形態では、放出制御システムを、治療標的に近接して配置することができ、したがって全身用量のほんの一部だけが必要とされる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。他の放出制御システムは、Langer (Science (1990) 249:1527-1533)による概説において議論されている。タンパク質／ペプチドは、経口投与を介して不十分に吸収されるが、経口投与のための送達システムは、当技術分野において、例えば、Wu S. et al, (2019), Journal of Pharmaceutical Sciences, 108(6):2143-2152；およびRenukunita, J. et al., (2013), Int. J. Pharm., 447:75-93において公知である。
本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、さまざまな方法で投与することができる。例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、静脈内注入、筋肉内投与、埋め込み可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または投与の他の様式を使用して投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Sefton (1987) Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507；Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい；また、Levy et al. (1985) Science 228:190；During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351；Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105も参照されたい）。別の実施形態では、放出制御システムを、治療標的に近接して配置することができ、したがって全身用量のほんの一部だけが必要とされる（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。他の放出制御システムは、Langer (Science (1990) 249:1527-1533)による概説において議論されている。タンパク質／ペプチドは、経口投与を介して不十分に吸収されるが、経口投与のための送達システムは、当技術分野において、例えば、Wu S. et al, (2019), Journal of Pharmaceutical Sciences, 108(6):2143-2152；およびRenukunita, J. et al., (2013), Int. J. Pharm., 447:75-93において公知である。
【0155】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヒト投与のために十分に無菌条件下で調製された等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給され得る。賦形剤の選択およびＰＥＧ化されたＴＦＦ２を含む組成物の任意の添付要素は、投与のために使用される経路およびデバイスに従って適合される。一部の実施形態では、ＰＥＧ化されたＴＦＦ２ポリペプチドを含む組成物はまた、ＴＦＦ２ペプチドの送達または機能的移動を容易にする１種または複数の他の成分を含むことができ、またはそれに付随し得る。
【0156】
本明細書に記載されるこれらの方法は、包括的な手段によってではなく、特定の適用に適したさらなる方法が当業者によって理解される。また、組成物の有効量は、所望の効果を示すことが公知の化合物との類似性によりさらに概算することができる。
【0157】
本開示の一態様は、処置を必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、対象に、有効量の本開示の組成物のいずれか１つまたは本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのいずれか１つを投与することを含む、方法を提供する。
【0158】
本開示の別の態様は、処置を必要とする対象における炎症性腸疾患を処置する方法であって、対象に、有効量の本開示の組成物のいずれか１つまたは本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのいずれか１つを投与することを含む、方法を提供する。
【0159】
本開示の別の態様は、処置を必要とする対象におけるＣＯＶＩＤ－１９を処置する方法であって、対象に、有効量の本開示の組成物のいずれか１つまたは本開示の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのいずれか１つを投与することを含む、方法を提供する。
【0160】
一部の実施形態では、本開示の組成物もしくはポリペプチドによって処置されるＣＯＶＩＤ－１９の合併症または病状としては、限定されるものではないが、疲労、発熱、息切れ、筋肉痛、急性呼吸促迫症候群、急性呼吸不全、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤ）、肺炎、肝臓損傷、心臓血管系合併症、神経学的および神経精神学的合併症、腎臓損傷などが挙げられる。
【0161】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害または低減する薬剤と組み合わせて投与することができる。別の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、リバビリン、インターフェロン（アルファコン－１）、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ＥＩＤＤ－２８０１、ＥＩＤＤ－１９３１、ＧＳ－５７３４、ＧＳ－４４１５２４、イベルメクチン、ファビピラビル、インドメタシン、クロルプロマジン、ペンシクロビル、ナフォモスタット、カモスタット、ニタゾキサニド、レムデシビル、ファモチジンおよびデキサメタゾンからなる群から選択される抗ウイルス剤と組み合わせて投与することができる。
【0162】
一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害もしくは低減する薬剤または抗ウイルス剤の前、それと同時に、またはその後に与えることができる。
【0163】
本開示によれば、薬学的に許容される担体は、医薬品の投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むことができる。そのような媒体および薬学的に活性な物質のための作用物質の使用は、当技術分野において周知である。活性化合物に適合する任意の従来の媒体または作用物質を使用することができる。補足活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【0164】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、対象に、一度に（例えば、単回注射または析出物として）投与することができる。あるいは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、約２～約２８日、または約７～約１０日、または約７～約１５日の期間の間、処置を必要とする対象に、１日１回または２回投与することができる。それは、年に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２回またはそれらの組合せの期間の間、対象に、１日１回または２回投与することもできる。さらにまた、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、別の治療薬と共投与することができる。
【0165】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、化学療法薬と共投与することができる。従来の化学療法薬の一部の非限定的な例としては、アミノグルテチミド、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、アナストロゾール、ブレオマイシン、ブセレリン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カンプトテシン、クロラムブシル、シスプラチン、カルムスチン、クラドリビン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、シプロテロン、クロドロネート、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ジエンエストロール、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルオロウラシル、フルダラビン、フルドロコルチゾン、エピルビシン、エストラジオール、ゲムシタビン、ゲニステイン、エストラムスチン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゴセレリン、ロイプロリド、ヒドロキシウレア、イダルビシン、レバミゾール、イマチニブ、ロムスチン、イホスファミド、メゲストロール、メルファラン、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、イロノテカン、ミトキサントロン、ニルタミド、メドロキシプロゲステロン、メクロレタミン、メルカプトプリン、ミトタン、ノコダゾール、オクトレオチド、メトトレキサート、マイトマイシン、パクリタキセル、オキサリプラチン、テモゾロミド、ペントスタチン、プリカマイシン、スラミン、タモキシフェン、ポルフィマー、メスナ、パミドロネート、ストレプトゾシン、テニポシド、プロカルバジン、チタノセン二塩化物、ラルチトレキセド、リツキシマブ、テストステロン、チオグアニン、ビンクリスチン、ビンデシン、チオテパ、トポテカン、トレチノイン、ビンブラスチン、トラスツズマブおよびビノレルビンが挙げられる。
【0166】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４に対するモノクローナル抗体と共投与することができる。ＰＤ－１遮断抗体の例は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））およびセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））である。ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の例は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））である。ＣＴＬＡ－４遮断抗体の例は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））である。
【0167】
一実施形態では、がんは、遮断する抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体に応答性ではなく、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドによる処置は、遮断する抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体に対する応答性を誘導する。
【0168】
一実施形態では、化学療法薬は、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、コルチコステロイドホルモン、性ホルモンまたは標的化抗腫瘍化合物である。
【0169】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、抗炎症性薬と共投与することができる。抗炎症性薬の一部の非限定的な例としては、抗炎症性ステロイド（コルチコステロイド）（例えば、プレドニゾン）、アミノサリチル酸塩（例えば、メサラジン、Ａｓａｃｏｌ ＨＤ（登録商標）、Ｄｅｌｚｉｃｏｌ（登録商標）他）、バルサラジド（Ｃｏｌａｚａｌ（登録商標））およびオルサラジン（Ｄｉｐｅｎｔｕｍ）、ならびに／または非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン）および免疫選択性抗炎症誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）が挙げられる。抗炎症薬としては、限定されるものではないが、抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ２抗体（バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、アザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）、Ａｚａｓａｎ（登録商標））、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、シクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標））、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））、および抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体を含む、サイトカインおよびケモカインを標的にする抗体または分子も挙げられ得る。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ（登録商標））およびウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））と共投与することができる。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ヤヌスキナーゼ１～３の阻害剤、例えば、低分子トファシチニブと共投与される。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＩＢＤを処置するために使用される免疫系抑制剤、例えば、アザチオプリン（Ａｚａｓａｎ（登録商標）、Ｉｍｕｒａｎ（登録商標））、メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標）、Ｐｕｒｉｘａｎ（登録商標））、シクロスポリン（Ｇｅｎｇｒａｆ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））およびメトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ（登録商標））と投与することができる。
【0170】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、放射線療法と共投与することができる。従来の放射線療法の一部の非限定的な例としては、体外照射療法、密封線源照射療法、非密封源線照射療法、粒子療法および放射性同位元素療法が挙げられる。
【0171】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、がん免疫療法と共投与することができる。がん免疫療法は、がんを処置するために対象の免疫系を使用することを含む。例えば、対象の免疫系を刺激して、がん細胞を認識および排除することができる。がん免疫療法の一部の非限定的な例としては、がんワクチン、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体療法（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブおよびパニツムマブ）、細胞に基づく免疫療法および養子細胞に基づく免疫療法が挙げられる。
【0172】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドはまた、消化器系の疾患の処置のために使用される外科的または他の介入的処置レジメンと組み合わせて使用されてもよい。
【0173】
本開示の組成物は、製剤化および投与されて、活性成分とヒトまたは非ヒト対象の身体における薬剤の作用部位との接触を生じさせる任意の手段によって、消化器系の疾患に関連する症状を低減することができる。例えば、本開示の組成物は、製剤化および投与されて、消化器系の炎症性疾患、消化器系のがんもしくは消化器系の異形成に関連する症状を低減することができ、または細胞増殖の減少もしくは腫瘍成長の減少を引き起こすことができる。それらは、個々の治療活性成分または治療活性成分の組合せのいずれかとして、医薬との併用のために利用可能な任意の従来の手段によって投与することができる。それらは単独で投与することができるが、一般に、選択された投与の経路および標準的な薬務に基づいて選択される薬学的担体とともに投与される。
【0174】
本開示による使用のための医薬組成物は、１種もしくは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で製剤化することができる。本開示の治療用組成物は、全身および局所または局在投与を含む投与の各種の経路のために製剤化することができる。技法および製剤は、一般に、Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. (20th ed., 2000)において見ることができ、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。全身投与のために、筋肉内、静脈内、腹腔内および皮下を含む注射は有用である。注射のために、本開示の治療用組成物は、液体の溶液、例えば、ＰＢＳ、ハンクス液またはリンゲル液などの生理学的に適合性の緩衝液中で、製剤化することができる。加えて、治療用組成物は、固体形態に製剤化することができ、使用の直線に、再溶解または懸濁され得る。凍結乾燥形態も含まれる。本開示の医薬組成物は、少なくとも無菌でパイロジェンフリーであるとして特徴付けられる。これらの医薬製剤は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を含む。
【0175】
本明細書に記載される治療適用のいずれかは、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはヒトなどの哺乳動物を含む、そのような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【0176】
本開示の医薬組成物は、その意図される投与の経路に適合するように、製剤化される。投与の経路の例としては、非経口的、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内もしくは皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は、以下の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および等張性の調整のための作用物質、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入することができる。
【0177】
注射可能な使用に好適な医薬組成物としては、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および無菌の注射可能な液剤もしくは分散剤の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、好適な担体としては、生理的食塩水、静菌性の水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。組成物は、無菌でなければならず、かつ容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールのような薬学的に許容されるポリオール、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールによって達成することができる。多くの場合では、組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めることが有用であり得る。注射可能組成物の延長された吸収は、組成物に、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることによってもたらすことができる。
【0178】
無菌の注射可能液剤は、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを必要な量で適切な溶媒に、必要により本明細書に列挙された成分の１種または組合せとともに組み込むこと、続いて滅菌濾過することによって調製することができる。分散剤は、活性化合物を、基本の分散媒および本明細書に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌媒体に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能液剤の調製のための無菌粉末の場合では、有用な調製方法の例は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を、その予め滅菌濾過された溶液から生じさせる。
【0179】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によってであり得る。経粘膜または経皮投与のために、浸透するバリアに適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物は、当技術分野において公知の、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲルまたはクリームに製剤化される。
【0180】
本開示の組成物は、処置を必要とする対象に投与することができる。処置を必要とする対象としては、限定されるものではないが、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギまたはヒトなどの哺乳動物が挙げられ得る。
【0181】
本開示の組成物は、持続性および／または徐放性製剤として製剤化することもできる。そのような持続性および／または徐放性製剤は、当業者に周知である持続放出の手段または送達デバイス、例えば、それらの開示が参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、米国特許第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第４，００８，７１９号；同第４，７１０，３８４号；同第５，６７４，５３３号；同第５，０５９，５９５号；同第５，５９１，７６７号；同第５，１２０，５４８号；同第５，０７３，５４３号；同第５，６３９，４７６号；同第５，３５４，５５６号；および同第５，７３３，５６６号に記載されるものによって行うことができる。本開示の医薬組成物（例えば、治療効果を有する）を使用して、さまざまな特性の所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェアなど、またはそれらの組合せを使用して、活性成分のうちの１種または複数の遅延または持続放出を提供することができる。本明細書に記載されるものを含む、当業者に公知の好適な持続放出製剤は、本開示の医薬組成物による使用のために容易に選択することができる。限定されるものではないが、持続放出に適合する、錠剤、カプセル剤、ゲルキャップ、カプレットまたは散剤などの経口投与のために好適な単一単位剤形が、本開示に包含される。
【0182】
本明細書に記載される方法では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、対象に、送達試薬と併せてＲＮＡとして、または遺伝子産物を発現する配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで投与することができる。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの投与のための好適な送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂溶性試薬；ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ；もしくはポリカチオン（例えば、ポリリシン）、またはリポソームが挙げられる。
【0183】
投与される投薬量は、消化器系の炎症性疾患の処置、消化器系がんのいずれかの処置、細胞増殖の減少、腫瘍成長の減少、または消化器系の異形成の処置をもたらすのに十分な組成物の治療有効量であり得、公知の因子、例えば、活性成分の薬力学的特徴ならびにその投与の様式および経路；活性成分の投与の時間；レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重；症状の本質および程度；併用処置の種類、処置の頻度および所望の効果；ならびに排出の速度に応じて変わり得る。
【0184】
一部の実施形態では、投与される修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの有効量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約４５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約６５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約８５００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９０００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約９５００μｇ／ｋｇ体重または少なくとも約１００００μｇ／ｋｇ体重である。
【0185】
一実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、１日に少なくとも１回投与される。別の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、１日に少なくとも２回投与される。一部の実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、少なくとも１８週間、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間、少なくとも４８週間または少なくとも６０週間投与される。さらなる実施形態では、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、第２の治療剤と組み合わせて投与される。
【0186】
本開示の治療用組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比は、治療指標であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指標を示す治療剤が有用である。一部の毒性副作用を示す治療用組成物を使用することができる。
【0187】
実験動物を、ヒト疾患のためのモデルとして使用することができる。例えば、マウスを、哺乳動物モデル系として使用することができる。哺乳動物が持つ生理学的システムは、例えば、マウスにおいて、およびヒトにおいて見出すことができる。ある特定の疾患は、それらの環境、ゲノムまたは両方の組合せを操作することによって、マウスにおいて誘導することができる。例えば、ＡＯＭ／ＤＳＳマウスモデルは、ヒト結腸がんのためのモデルである。別の例では、ＤＳＳマウスモデルは、ヒト大腸炎のためのモデルである。癌発生の他のマウスモデルとしては、皮膚がんの２段階ＤＭＢＡ／ＴＰＡモデル、肝臓がんのＤＥＮ／ＣＣＬ４モデルおよび胃がんのＨ．ｆｅｌｉｓ／ＭＮＵモデルが挙げられる。加えて、がんの多数の遺伝子操作されたモデル、例えば、膵臓がんのＫＰＣモデルがある。
【0188】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの投与は、単一の経路に制限されないが、複数経路による投与を包含し得る。複数回投与は、逐次的または同時的であり得る。複数経路による適用の他の様式は、当業者に明らかであろう。
【0189】
組換えタンパク質および技法
本開示は、当業者に利用可能な、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を利用する。そのような技法は、当業者に周知であり、文献中に完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover, ed., 1985)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames& S. J. Higgins, eds., 1985)；"Transcription and Translation"(B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986): B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)およびSambrook, et al.,"Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (2001)を参照されたい。
本開示は、当業者に利用可能な、従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を利用する。そのような技法は、当業者に周知であり、文献中に完全に説明されている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover, ed., 1985)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames& S. J. Higgins, eds., 1985)；"Transcription and Translation"(B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986): B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)およびSambrook, et al.,"Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (2001)を参照されたい。
【0190】
当業者は、限定されないが、生化学的手段を介してタンパク質を単離すること、または遺伝子操作方法によって目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現させることを含むいくつかの方法で、ＴＦＦ２タンパク質を得ることができる。一部の実施形態では、ＴＦＦ２タンパク質、例えば、ヒトＴＦＦ２が発現される宿主細胞中のポリヌクレオチドン配列は、配列番号１または３のタンパク質を依然としてコードしながら、発現のために最適化され得る。一部の実施形態では、ＴＦＦ２をコードするＤＮＡはまた、タンパク質精製のために有用なアミノ酸、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ｈｉｓタグまたはＦｃタグとのハイブリッドタンパク質を、本明細書に記載の通り、コードすることができる。
【0191】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、ＴＦＦ２タンパク質の断片であり得、例えば、ＴＦＦ２タンパク質断片は、配列番号１、配列番号３または配列番号６の少なくとも約８の連続したアミノ酸の任意の部分を包含することができる。断片は、配列番号１、３または６の、少なくとも約１０の連続したアミノ酸、少なくとも約２０の連続したアミノ酸、少なくとも約３０の連続したアミノ酸、少なくとも約４０の連続したアミノ酸、少なくとも約５０の連続したアミノ酸、少なくとも約６０の連続したアミノ酸、少なくとも約７０の連続したアミノ酸、少なくとも約８０の連続したアミノ酸、少なくとも約９０の連続したアミノ酸、少なくとも約１００の連続したアミノ酸、少なくとも約１１０の連続したアミノ酸または少なくとも約１２０の連続したアミノ酸を含むことができる。断片は、約８～約８０アミノ酸のすべての可能なアミノ酸長、例えば、約１０～約８０アミノ酸、約１５～約８０アミノ酸、約２０～約８０アミノ酸、約３５～約８０アミノ酸、約４０～約８０アミノ酸、約５０～約８０アミノ酸または約７０～約８０アミノ酸の長さを含む。
【0192】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、いくつかの方法、例えば、限定されないが、遺伝子操作方法によって、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその断片を発現させることで得ることができる。
【0193】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、細胞における過剰発現を達成するために、発現カセットにおいて発現され得る。核酸は、発現可能な形態、例えば、発現カセット中の目的のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ様またはＤＮＡであり得、これは、天然プロモーターまたは完全に異種プロモーターから発現され得る。目的の核酸は、タンパク質をコードすることができ、イントロンを含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。限定されるものではないが、細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む、任意の組換え発現系を使用することができる。
【0194】
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞を、発現および細胞培養物からのタンパク質の回収のために好適な条件下で培養することができる。形質転換細胞によって産生したポリペプチドは、配列および／または使用されるベクターに応じて、分泌または細胞内に含有され得る。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターは、原核生物または真核細胞の膜を通って、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする可溶性ポリペプチド分子の分泌を指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。異種シグナルペプチドの例を、限定されないが、下記の表２に示す。
【表2】
【0195】
ポリペプチドをコードするＴＦＦ２を含む核酸配列は、全体にまた一部において、当技術分野において公知の化学方法を使用して合成することができる。あるいは、ＴＦＦ２タンパク質は、そのアミノ酸配列を合成する化学方法を使用して、例えば、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって、生成することができる。タンパク質合成は、手作業の技法を使用して、または自動でのいずれかで行うことができる。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成することができる。必要に応じて、ＴＦＦ２の断片を、別々に合成し、化学方法を使用して組み合わせて、全長ポリペプチドを生成することができる。
【0196】
合成ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して実質的に精製することができる。合成修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。加えて、ＴＦＦ２アミノ酸配列の任意の部分を、直接合成の間および／または他のタンパク質由来の配列と化学方法を組み合わせて使用する間に変更して、バリアント修飾ＴＦＦ２ポリペプチドまたは融合タンパク質を生成することができる。
【0197】
本開示は、ＴＦＦ２の核酸配列、例えば、配列番号２および３に示される配列によってコードされるタンパク質または修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを使用するための方法をさらに包含する。別の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応もしくはカップリングによって修飾することができ、１つもしくはいくつかの非天然または合成アミノ酸を含有することができる。ある特定の実施形態では、本開示は、ＴＦＦ２のバリアントを包含する。
【0198】
融合タンパク質
当業者は、所望のタンパク質産物の発現が融合タンパク質に基づき得ることを理解する。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの一実施形態は、融合タンパク質である。融合タンパク質の一実施形態は、ＴＦＦ２－アルブミンタンパク質である。別の実施形態は、修飾ＴＦＦ２－ＩｇＧ１融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、ネイティブまたは組換えＴＦＦ２と比べて、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの血清半減期を増加させる。別の種類の融合タンパク質は、組換えタンパク質の精製において有用なアフィニティータグと結合する。融合タンパク質は、ＴＦＦ２配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに新たな配列を含むことができる。融合タンパク質は、ＴＦＦ２アミノ酸配列の一部、全アミノ酸配列を含むことができ、またはＴＦＦ２配列を融合タンパク質に連結する新たな配列を含むことができる。
当業者は、所望のタンパク質産物の発現が融合タンパク質に基づき得ることを理解する。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの一実施形態は、融合タンパク質である。融合タンパク質の一実施形態は、ＴＦＦ２－アルブミンタンパク質である。別の実施形態は、修飾ＴＦＦ２－ＩｇＧ１融合タンパク質である。これらの融合タンパク質は、ネイティブまたは組換えＴＦＦ２と比べて、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの血清半減期を増加させる。別の種類の融合タンパク質は、組換えタンパク質の精製において有用なアフィニティータグと結合する。融合タンパク質は、ＴＦＦ２配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに新たな配列を含むことができる。融合タンパク質は、ＴＦＦ２アミノ酸配列の一部、全アミノ酸配列を含むことができ、またはＴＦＦ２配列を融合タンパク質に連結する新たな配列を含むことができる。
【0199】
アフィニティータグを有する一般的な融合タンパク質は、ポリヒスチジンタグを用いる。アフィニティータグは、多くの場合、適切なプロテアーゼで切断され得る標的プロテアーゼ切断部位配列によってＴＦＦ２配列に連結される（Waugh, DS. An Overview of Enzymatic Reagents for the Removal of Affinity Tags, Protein Expr Purif. 2011 Dec; 80(2): 283-293）。一般的な標的プロテアーゼ切断部位配列は、配列番号２０のアミノ酸配列（Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）後のトロンビン切断部位のための標的である。トロンビンは、切断部位のアルギニンおよびグリシン残基の間を選択的に切断する。他の場合では、アフィニティータグは、認識部位（Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ）（配列番号２１）で切断するエンテロキナーゼのための標的配列によって接続される。別の実施形態では、アフィニティータグは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のための標的プロテアーゼ切断部位配列によって接続される。ＴＥＶプロテアーゼは、アミノ酸配列：Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ（配列番号２２）またはＧｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ（配列番号２３）を認識し、ＧｌｎおよびＧｌｙ／Ｓｅｒ（Ｐ１’位）残基の間を切断する、非常に特異的なシステインプロテアーゼである。Ｐ１’残基はまたは、Ａｌａ、ＭｅｔまたはＣｙｓであり得る（Kapust, R.B. et al. (2002). Biochem. and Biophysical Research Comm. 294, 949-955）。
【0200】
他の実施形態では、アフィニティータグの切断後、得られるタンパク質は、切断部位由来の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。
【0201】
一部の実施形態では、アフィニティータグの切断後、得られるタンパク質は、ネイティブタンパク質である。例として、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）からのＴＡＧＺｙｍｅは、ｈｉｓタグおよびタグ除去を使用する組換えタンパク質のアフィニティー精製のための酵素系である。それは、Ｎ末端からの外部タンパク質分解切断のためのジペプチダーゼ（ＤＡＰａｓｅ、または組換えジペプチジルペプチダーゼＩ）、およびまたｈｉｓタグの完全な除去のための潜在的な２つのアクセサリーアミノペプチダーゼ（Ｑｃｙｃｌａｓｅ、または植物グルタミンシクロトランスフェラーゼ、およびｐＧＡＰａｓｅ、または細菌ピログルタミルアミノペプチダーゼ）を組み合わせる。ＴＡＧＺｙｍｅ中の３つの酵素のすべてが、除去のための切断可能ではないｈｉｓタグを示す。
【0202】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、アルブミンまたはＩｇＧ配列のような半減期を増強する配列、およびｈｉｓタグなどのアフィニティータグとして使用される配列、およびアフィニティータグのためまたは生成の他の態様のためのリンカー配列として使用された配列を有する融合タンパク質を含む医薬製品を作製するためにＰＥＧ化することができる。
【0203】
細菌発現系
当業者は、原核生物における所望のタンパク質産物の発現が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターを用いて最も頻繁に行われることを理解する。形質転換のための細菌細胞の一部の非限定的な例としては、細菌細胞系のＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αまたはＭＣ１０６１／ｐ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられ、これは、当技術分野において実行される標準手順を使用して、形質転換することができ、次いで、コロニーを、適切なプラスミド発現のためにスクリーニングすることができる。細菌系では、多くの発現ベクターを選択することができる。そのようなベクターの非限定的な例としては、多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニング、およびＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））などの発現ベクターが挙げられる。一部のＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（当技術分野において融合ベクターとしても公知）は、通常は発現される組換えタンパク質のＮ末端に、多くのアミノ酸残基を付加するように設計される。そのような融合ベクターは、１）所望の組換えタンパク質の溶解度を増加させる；２）目的の組換えタンパク質の発現を増加させる；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質精製を助けるという３つの機能を果たし得る。一部の例では、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターも使用され得る。融合発現ベクターの一部の非限定的な例としては、所望のタンパク質にグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＧＥＸ；目的の組換えタンパク質に６×Ｈｉｓ（配列番号８）を融合するｐｃＤＮＡ ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ Ａ Ｂ ＆ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）；標的組換えタンパク質にマルトースＥ結合タンパク質を融合するｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、ＭＡ）；Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., (1983) EMBO 12:1791）、ここで、コード配列は、融合タンパク質を生じさせるために、ｌａｃ Ｚコード領域を有するフレームにおいてベクターに個々にライゲートされ得る；およびｐＩＮベクター（Inouye et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke et al., (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509）が挙げられる。上記で述べたベクターと同様のものによって生じる融合タンパク質は、一般に可溶性であり、融合タンパク質のアフィニティーマトリックスへの吸着および結合を介して溶解した細胞から容易に精製することができる。例えば、融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズのマトリックスへの吸着および結合、その後、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出を介して溶解した細胞から精製することができる。例えば、ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
当業者は、原核生物における所望のタンパク質産物の発現が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含有するベクターを用いて最も頻繁に行われることを理解する。形質転換のための細菌細胞の一部の非限定的な例としては、細菌細胞系のＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αまたはＭＣ１０６１／ｐ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（登録商標）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられ、これは、当技術分野において実行される標準手順を使用して、形質転換することができ、次いで、コロニーを、適切なプラスミド発現のためにスクリーニングすることができる。細菌系では、多くの発現ベクターを選択することができる。そのようなベクターの非限定的な例としては、多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニング、およびＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））などの発現ベクターが挙げられる。一部のＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（当技術分野において融合ベクターとしても公知）は、通常は発現される組換えタンパク質のＮ末端に、多くのアミノ酸残基を付加するように設計される。そのような融合ベクターは、１）所望の組換えタンパク質の溶解度を増加させる；２）目的の組換えタンパク質の発現を増加させる；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質精製を助けるという３つの機能を果たし得る。一部の例では、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターも使用され得る。融合発現ベクターの一部の非限定的な例としては、所望のタンパク質にグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＧＥＸ；目的の組換えタンパク質に６×Ｈｉｓ（配列番号８）を融合するｐｃＤＮＡ ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ Ａ Ｂ ＆ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）；標的組換えタンパク質にマルトースＥ結合タンパク質を融合するｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、ＭＡ）；Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., (1983) EMBO 12:1791）、ここで、コード配列は、融合タンパク質を生じさせるために、ｌａｃ Ｚコード領域を有するフレームにおいてベクターに個々にライゲートされ得る；およびｐＩＮベクター（Inouye et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van Heeke et al., (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509）が挙げられる。上記で述べたベクターと同様のものによって生じる融合タンパク質は、一般に可溶性であり、融合タンパク質のアフィニティーマトリックスへの吸着および結合を介して溶解した細胞から容易に精製することができる。例えば、融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズのマトリックスへの吸着および結合、その後、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出を介して溶解した細胞から精製することができる。例えば、ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【0204】
植物、昆虫および酵母発現系
ＴＦＦ２ペプチドのためのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物に加えて、他の好適な細胞系を、代替的に使用して、目的の分子を産生させてもよい。非限定的な例としては、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのためのコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ；カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が挙げられる。植物発現ベクターが使用される場合、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを、単独で、またはタバコモザイクウイルスＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを使用することができる。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換によって、または病原体媒介トランスフェクションによって、植物細胞に導入することができる。
ＴＦＦ２ペプチドのためのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物に加えて、他の好適な細胞系を、代替的に使用して、目的の分子を産生させてもよい。非限定的な例としては、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのためのコード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ；カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ）に感染したか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が挙げられる。植物発現ベクターが使用される場合、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを、単独で、またはタバコモザイクウイルスＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用することができる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを使用することができる。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換によって、または病原体媒介トランスフェクションによって、植物細胞に導入することができる。
【0205】
昆虫系も、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫系を使用する組換えタンパク質を発現させるための多くの方法が、当技術分野において公知であり、例えば、Bleckmann, M. et al., (2016), Biotechnol Bioeng. 113(9): 1975-1983；Zitzmann, J. et al., Process Optimization for Recombinant Protein Expression in Insect Cells, New Insights into Cell Culture Technology；InTech; 2017；米国特許第５，１９４，３７６号；米国特許第５，８４３，７３３号；を参照されたい。例えば、１つのそのような系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａニュークレア多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅにおけるＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓにおいて、外来遺伝子を発現させる。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする配列を、ウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリン遺伝子にクローニングすることができ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの核酸配列の成功した挿入は、ポリヒドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いで、組換えウイルスを使用して、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、またはイネ科草本のｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞におけるＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａにおける）幼虫、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉｇｈｔ ｍｏｔｈ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫に感染させ、目的のポリペプチドがそれによって発現される（Engelhard, EK et al. (1994) in Proc.Natl.Acad.Sci. 3224を参照されたい）。
【0206】
別の実施形態では、酵母、例えば、ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えば、乳酸ｇ Ｌｕｒｖｙ酵母（Ｋ Ｉａｃｔｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６０４５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６５００）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏＩｅｒａｎｓ）およびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；Ｙａｒｒｏｗｉａ（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２２２６）；Ｐｉｃｈｉａ酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ（Ｃａｎｄｉｄａ）；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）（ＥＰ２４４２３４）；粗製Ｔａｎｇｍａｉｐｉｎｇ保持バクテリア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ株（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ，）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＮｉｇｅｒ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）である。酵母は、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのためのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換することができる。酵母は、組換えタンパク質をグリコシル化する能力を持ち、胃液中のヒトＴＦＦ２のかなりの割合が、推定のＡｓｎ（１５）上でＮ連結を介してグリコシル化され、これが、血管内ＴＦＦ２について機能的に重要であり得、かつ血漿半減期を増加し得る（May FE et al., Gut 2000 46(4):454-9）ので、好ましい実施形態は、Ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含む酵母における発現である。組換えヒトＴＦＦ２がＳ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現される場合、組換えタンパク質のかなりの割合が、Ａｓｎ（１５）上でＮ連結を介してグリコシル化される（Thim L et al. FEBS Lett 1993: 318:345-52）。
【0207】
哺乳動物発現系
哺乳動物細胞（例えば、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）は、所望の産物の発現のために、発現ベクター（例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保有するもの）を含有することもできる。宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で少なくとも１つの調節配列に連結されたそのような核酸配列を含有する発現ベクターは、当技術分野において公知の方法を介して導入することができる。多くのウイルス系発現系を使用して、哺乳動物宿主細胞において修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現させることができる。ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含む。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートされ得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入は、感染した宿主において修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現することができる生存ウイルスを得るために使用することができる。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることもできる。加えて、ウイルスベクターを、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築することができる。
哺乳動物細胞（例えば、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）は、所望の産物の発現のために、発現ベクター（例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保有するもの）を含有することもできる。宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で少なくとも１つの調節配列に連結されたそのような核酸配列を含有する発現ベクターは、当技術分野において公知の方法を介して導入することができる。多くのウイルス系発現系を使用して、哺乳動物宿主細胞において修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現させることができる。ベクターは、組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターを含む。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートされ得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入は、感染した宿主において修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現することができる生存ウイルスを得るために使用することができる。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることもできる。加えて、ウイルスベクターを、限定されるものではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスまたはアルファウイルスに基づいて構築することができる。
【0208】
調節配列は、当技術分野において周知であり、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されているように、適切な宿主細胞における目的のタンパク質またはポリペプチド（修飾ＴＦＦ２ポリペプチドなど）の発現を指示するように選択することができる。調節配列の非限定的な例としては、ポリアデニル化シグナル、プロモーター（ＣＭＶ、ＡＳＶ、ＳＶ４０または他のウイルスプロモーターなど、例えば、ウシ乳頭腫、ポリオーマおよびアデノウイルス２ウイルス（Fiers, et al., 1973, Nature 273:113; Hager G L, et al., Curr Opin Genet Dev, 2002, 12(2):137-41）エンハンサー、および他の発現制御エレメントに由来するもの）が挙げられる。当業者は、発現ベクターの設計が、トランスフェクトされる宿主細胞の選択、ならびに／または発現される所望のタンパク質の種類および／もしくは量などの因子に依存し得ることを理解する。
【0209】
非コードＤＮＡ領域中のプロモーター領域の上流または下流で見出されるこれらの配列であるエンハンサー領域も、発現の最適化において重要であることが当技術分野において公知である。必要により、ウイルス源由来の複製開始点を、例えば、原核生物宿主がプラスミドＤＮＡの導入のために利用される場合に、用いることができる。しかしながら、真核生物において、染色体の組み込みは、ＤＮＡ複製のための一般的な機構である。
【0210】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、ほんのわずかな細胞が、それらのゲノムに導入ＤＮＡを組み込むことができる。利用される発現ベクターおよびトランスフェクション方法は、成功した組み込み事象に寄与する因子であり得る。所望のタンパク質の安定な増幅および発現のために、目的のタンパク質（例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド）をコードするＤＮＡを含有するベクターは、真核細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞）のゲノムに安定に組み込まれ、トランスフェクトされた遺伝子の安定な発現をもたらす。外因性核酸配列は、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，６４１，６７０号に開示される相同組換えによって、細胞（例えば、哺乳動物細胞など、初代または二次細胞のいずれか）に導入することができる。
【0211】
選択マーカー（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、Ｇ４１８およびハイグロマイシンなどの抗生物質または薬物に耐性）をコードする遺伝子は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を安定に発現するクローンを特定および選択するために、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入することができる。選択マーカーをコードする遺伝子は、目的の遺伝子と同じプラスミドで宿主細胞に導入することができ、または別々のプラスミドで導入することができる。目的の遺伝子を含有する細胞は、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞が薬物の存在下で生存する薬物選択によって特定することができる。選択マーカーについての遺伝子が組み込まれなかった細胞は死亡する。次いで、生存細胞を、所望のタンパク質分子（例えば、修飾ＴＦＦ２ポリペプチド）の産生についてスクリーニングすることができる。
【0212】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現をモジュレートする、または所望の方法で発現された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドをプロセシングするその能力について選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられる。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングは、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進するために使用することもできる。特異的な細胞機構および翻訳後活性についての特徴的な機構を有する異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０－２２０９）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確保にするために選択することができる。
【0213】
外因性核酸は、リポフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストリン媒介トランスフェクションまたは電気穿孔などの当技術分野において公知の各種の技法を介して、細胞に導入することができる。電気穿孔は、適切な電圧およびキャパシタンスで行って、ＤＮＡ構築物の目的の細胞への移行をもたらす。細胞をトランスフェクトするために使用される他の方法としては、改変リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン沈殿、リポソーム融合および受容体媒介遺伝子送達も挙げられ得る。
【0214】
大量の目的のＴＦＦ２ペプチドを保有し、発現し、その後の単離および／または精製のための培養培地に分泌することができる動物または哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、ヒト胚腎臓２９３細胞（ＨＥＫ－２９３）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＧ４４（Chasin et al., (1986) Som. Cell Molec. Genet, 12:555-556；Kolkekar et al., (1997) Biochemistry, 36:10901-10909；および国際公開第０１／９２３３７Ａ２号）、ジヒドロ葉酸還元酵素陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－、Urlaub et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:4216）、およびｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）；ヒト胚腎細胞（例えば、２９３細胞、または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., (1977) J. Gen. Virol., 36:59）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）；サル腎細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４；Mather (1980) Biol. Reprod., 23:243-251）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）；ヒト肝細胞腫細胞（ＨＥＰ－Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－５１）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４４２）；ＴＲＩ細胞（Mather (1982) Annals NY Acad. Sci., 383:44-68）；ＭＣＲ ５細胞；ＦＳ４細胞が挙げられる。修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを産生するように形質転換された細胞系はまた、リンパ起源の不死化哺乳動物細胞系であり得、限定されるものではないが、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞系が挙げられる。細胞系は、Ｂ細胞などの正常なリンパ細胞を含むこともでき、これは、エプスタインバーウイルスなどのウイルスによる形質転換によって不死化されている（骨髄腫細胞系またはそれらの派生物など）。
【0215】
挿入された配列の発現をモジュレートするか、または所望の特異的な方法で核酸を修飾およびプロセシングする宿主細胞株も選択され得る。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化および他の翻訳後修飾）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要である場合がある。異なる宿主細胞株は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングならびに修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。そのため、適切な宿主系または細胞系を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドなどの発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確保するために選択することができる。したがって、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞が使用され得る。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＨＥＫ－２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＢＴ２Ｏ、Ｔ４７Ｄ、ＮＳＯ（任意の免疫グロブリン鎖を内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＭＤＣＫ、２９３、ＨＴＢ２およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。
【0216】
さまざまな培養パラメーターを、培養される宿主細胞に関して使用することができる。哺乳動物細胞のための適切な培養条件は、当技術分野において周知であり（Cleveland W L, et al., J Immunol Methods, 1983, 56(2): 221-234）、または当業者によって決定することができる（例えば、Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992)を参照されたい）。細胞を培養する条件は、選択された宿主細胞の種類に従って変わり得る。市販の培地を利用することができる。
【0217】
培養に好適な細胞は、プラスミドまたはウイルスなどの導入された発現ベクターを含有することができる。発現ベクター構築物は、形質転換、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔または感染を介して導入することができる。発現ベクターは、発現および産生のためのタンパク質をコードするコード配列またはその部分を含有することができる。産生されるタンパク質およびポリペプチド、ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントをコードする配列を含有する発現ベクターは、当業者に周知かつ当業者によって実行される方法を使用して、生じさせることができる。これらの方法としては、合成技法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、およびJ. Sambrook et al., 201, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびF. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.に記載されているｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。
【0218】
組換えタンパク質の精製
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現する発現構築物でトランスフェクトされたものを含む、ポリペプチドを発現する任意のヒトまたは非ヒト細胞から精製することができる。精製された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、ある特定のタンパク質、炭水化物または脂質などのＴＦＦ２に通常関連する他の化合物から分離することができる。タンパク質の回収、単離および／または精製のために、細胞培養培地または細胞溶解物を遠心分離して、粒子状の細胞および細胞デブリを除去する。所望の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、好適な精製技法によって、可溶性のタンパク質およびポリペプチドの混入から単離または精製される。タンパク質のための非限定的な精製法としては、サイズ排除クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂などの樹脂、例えば、ＤＥＡＥにおけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用するゲル濾過；免疫グロブリン混入物の除去のためのプロテインＡセファロースクロマトグラフィー；などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦまたはプロテイナーゼＫ）などの他の添加物を、精製の間のタンパク質分解を阻害するために使用することができる。炭水化物のために選択され得る精製手順は、例えば、イオン交換ソフトゲルクロマトグラフィー、またはカチオンもしくはアニオン交換樹脂を使用するＨＰＬＣを使用することもでき、ここで、より酸性の画分が収集される。
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドを発現する発現構築物でトランスフェクトされたものを含む、ポリペプチドを発現する任意のヒトまたは非ヒト細胞から精製することができる。精製された修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、ある特定のタンパク質、炭水化物または脂質などのＴＦＦ２に通常関連する他の化合物から分離することができる。タンパク質の回収、単離および／または精製のために、細胞培養培地または細胞溶解物を遠心分離して、粒子状の細胞および細胞デブリを除去する。所望の修飾ＴＦＦ２ポリペプチドは、好適な精製技法によって、可溶性のタンパク質およびポリペプチドの混入から単離または精製される。タンパク質のための非限定的な精製法としては、サイズ排除クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂などの樹脂、例えば、ＤＥＡＥにおけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を使用するゲル濾過；免疫グロブリン混入物の除去のためのプロテインＡセファロースクロマトグラフィー；などが挙げられる。プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦまたはプロテイナーゼＫ）などの他の添加物を、精製の間のタンパク質分解を阻害するために使用することができる。炭水化物のために選択され得る精製手順は、例えば、イオン交換ソフトゲルクロマトグラフィー、またはカチオンもしくはアニオン交換樹脂を使用するＨＰＬＣを使用することもでき、ここで、より酸性の画分が収集される。
【実施例】
【0219】
実施例を、本開示のより完全な理解を容易にするために下記に提供する。以下の実施例は、本発明の作製および実行の例示的な様式を説明する。しかしながら、代替の方法を利用して類似の結果を得ることができるので、本開示の範囲は、説明の目的のみのこれらの実施例に開示された詳細な実施形態に限定されない。
【0220】
（実施例１）
Ｈｉｓ＿Ｓｔｒｅｐタグを有するヒト修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのコドン最適化
Ｈｉｓ＿Ｓｔｒｅｐタグを有するヒト修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのコドン最適化を下記の配列番号３２に示す。
Ｈｉｓ＿Ｓｔｒｅｐタグを有するヒト修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのコドン最適化
Ｈｉｓ＿Ｓｔｒｅｐタグを有するヒト修飾ＴＦＦ２ポリペプチドのコドン最適化を下記の配列番号３２に示す。
【化11】
【0221】
最適化されたＤＮＡ配列から生成した推定アミノ酸配列を下記の配列番号３３に示す。
【化12】
【0222】
（実施例２）
ヒト修飾ＴＦＦ２－Ｃ末端ＨＵＬＧ１ Ｆｃタグポリペプチドのコドン最適化
コドン最適化されたＤＮＡ配列のＴＦＦ２－Ｃ末端ＨＵＬＧ１ ＦＣタグの配列番号３４を下記に示す。
ヒト修飾ＴＦＦ２－Ｃ末端ＨＵＬＧ１ Ｆｃタグポリペプチドのコドン最適化
コドン最適化されたＤＮＡ配列のＴＦＦ２－Ｃ末端ＨＵＬＧ１ ＦＣタグの配列番号３４を下記に示す。
【化13】
【化14】
【0223】
最適化されたＤＮＡ配列から生成した推定アミノ酸配列を下記の配列番号３５に示す。
【化15】
【0224】
（実施例３）
ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡのコドン最適化
ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡのコドン最適化されたＤＮＡを下記に示す（配列番号３６）。
＞ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡ＿コドン最適化されたＤＮＡ
ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡのコドン最適化
ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡのコドン最適化されたＤＮＡを下記に示す（配列番号３６）。
＞ヒトＴＦＦ２－ＨＳＡ＿コドン最適化されたＤＮＡ
【化16】
【化17】
【0225】
推定ＴＦＦ２－ＨＳＡアミノ酸配列を下記の配列番号３７に示す。
【化18】
【化19】
【0226】
（実施例４）
ヒトＴＦＦ２－ＣＴＰＸ２－ＦＬＡＧ Ｘ３のコドン最適化
ヒトＴＦＦ２－ＣＴＰＸ２－ＦＬＡＧ Ｘ３＿コドン最適化されたＤＮＡ（配列番号３８）
ヒトＴＦＦ２－ＣＴＰＸ２－ＦＬＡＧ Ｘ３のコドン最適化
ヒトＴＦＦ２－ＣＴＰＸ２－ＦＬＡＧ Ｘ３＿コドン最適化されたＤＮＡ（配列番号３８）
【化20】
【化21】
【0227】
推定ＴＦＦ２－ＨＳＡアミノ酸配列を下記に示す（配列番号３９）。
【化22】
【0228】
実施例１～４の構築物はすべて、ＣＨＯ－Ｓ一過性系において発現させる。３つのバリアントの発現を、ウエスタンブロットおよび抗ｈｕＴＦＦ２を使用して、発現について分析する。
【0229】
（実施例５）
カルシウム動員による修飾ＴＦＦ２ポリペプチド活性の測定
ジャーカット細胞、ＫＡＴＯ－ＩＩＩおよび／またはＡｓＰＣ－１細胞（２．５×１０６個細胞／ｍｌ）を、０．５％のＢＳＡを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁させ、撹拌しながら、暗所で、５ｍＭの最終濃度のＣａ２＋結合色素Ｉｎｄｏ－１ ＡＭとともに３７℃で１時間インキュベートする。ロードされた細胞を、洗浄し、２ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するハンクス平衡塩類溶液培地に再懸濁させ、室温で２０分間放置する。細胞を、蛍光活性化細胞ソーター管に等分し、これを、測定前にさらに５分間、３７℃の水浴に直ぐに移す。次いで、平衡化された細胞を、ＬＳＲＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＣａ２＋レベルのフローサイトメトリー分析のために使用する。ベースラインの細胞内Ｃａ２＋レベルを、最初の２５～３０秒間記録し、続いて、示された濃度のＳＤＦ－１ａ、ＴＦＦ２、ガストリン、イオノマイシンまたは希釈剤（リン酸緩衝食塩水）で刺激する。データ収集を、さらに４～１０分間、２０００事象／秒のスピードで継続する。サイトゾルのＣａ２＋のＩｎｄｏ－１への結合の増加は、５１０ｎｍ（遊離形態）から４２０ｎｍ（Ｃａ２＋結合形態）へのＩｎｄｏ－１の発光スペクトルの変化をもたらす。したがって、青色（４’，６－ジアミジノ－２－フェニル－インドールチャネル、４２０ｎｍ）および紫色（Ｉｎｄｏチャネル、５１０ｎｍ）の細胞の蛍光を測定し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン６．４；Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してプロットする。したがって、細胞を、ＡＭＤ３１００または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂｓ １２Ｇ５もしくは２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに３７℃で４０分間プレインキュベートした後、ＡＭＤ３１００または抗ＣＸＣＲ４抗体の存在下でのＳＤＦ－１ａまたはＴＦＦ２に対する応答における細胞内カルシウム動員を、測定する。
カルシウム動員による修飾ＴＦＦ２ポリペプチド活性の測定
ジャーカット細胞、ＫＡＴＯ－ＩＩＩおよび／またはＡｓＰＣ－１細胞（２．５×１０６個細胞／ｍｌ）を、０．５％のＢＳＡを含有するＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁させ、撹拌しながら、暗所で、５ｍＭの最終濃度のＣａ２＋結合色素Ｉｎｄｏ－１ ＡＭとともに３７℃で１時間インキュベートする。ロードされた細胞を、洗浄し、２ｍＭのＣａＣｌ２および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するハンクス平衡塩類溶液培地に再懸濁させ、室温で２０分間放置する。細胞を、蛍光活性化細胞ソーター管に等分し、これを、測定前にさらに５分間、３７℃の水浴に直ぐに移す。次いで、平衡化された細胞を、ＬＳＲＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するＣａ２＋レベルのフローサイトメトリー分析のために使用する。ベースラインの細胞内Ｃａ２＋レベルを、最初の２５～３０秒間記録し、続いて、示された濃度のＳＤＦ－１ａ、ＴＦＦ２、ガストリン、イオノマイシンまたは希釈剤（リン酸緩衝食塩水）で刺激する。データ収集を、さらに４～１０分間、２０００事象／秒のスピードで継続する。サイトゾルのＣａ２＋のＩｎｄｏ－１への結合の増加は、５１０ｎｍ（遊離形態）から４２０ｎｍ（Ｃａ２＋結合形態）へのＩｎｄｏ－１の発光スペクトルの変化をもたらす。したがって、青色（４’，６－ジアミジノ－２－フェニル－インドールチャネル、４２０ｎｍ）および紫色（Ｉｎｄｏチャネル、５１０ｎｍ）の細胞の蛍光を測定し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン６．４；Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してプロットする。したがって、細胞を、ＡＭＤ３１００または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂｓ １２Ｇ５もしくは２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに３７℃で４０分間プレインキュベートした後、ＡＭＤ３１００または抗ＣＸＣＲ４抗体の存在下でのＳＤＦ－１ａまたはＴＦＦ２に対する応答における細胞内カルシウム動員を、測定する。
【0230】
（実施例６）
ＥＲＫ１／２のリン酸化による修飾ＴＦＦ２ポリペプチド活性の測定
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの活性の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒによるＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキットを使用することによって、ジャーカットヒト急性Ｔ細胞白血病細胞、ＫＡＴＯ－ＩＩＩヒト胃がん細胞および／またはＡｓＰＣ－１ヒト膵臓細胞（すべての細胞系はＡＴＣＣによって提供された）におけるＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化によって行う。細胞系を解凍し、ＡＴＣＣによって提供された説明書に従って増殖させる。細胞を、遠心分離によって回収し、ＨＢＳＳ中に１０７個細胞／ｍＬで再懸濁させる。細胞を、３８４ウェルの白色の不透明な培養プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に４ｍＬの細胞／ウェルで播種し、３７℃で１～２時間インキュベートする。０．１％のＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中の１０～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ｍＬ中の組換えＴＦＦ２の野生型およびバリアントを、プレートに添加して、細胞を刺激し、３７℃で５～３０分間インキュベートする。細胞を、２ｍＬ／ウェルの溶解緩衝液で溶解し、続いて、５ｍＬのＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｍｉｘを添加する。次いで、プレートをＴｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、室温で１時間インキュベートする。次いで、５ｍＬのＤｏｎｏｒ Ｍｉｘを明るすぎない光の下でウェルに添加し、Ｔｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、ホイルで覆い、暗所で、室温で１時間インキュベートする。プレートを、標準的なＡｌｐｈａＰｌｅｘの設定を使用して、ＡｌｐｈａＰｌｅｘ適合プレートリーダーにおいて読み取る。ＣＸＣＲ４のＴＦＦ２刺激の阻害は、組換えＴＦＦ２の添加前に、ＣＸＣＲ４の低分子アンタゴニストのＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ １２Ｇ５および２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃で１～２時間行う。
ＥＲＫ１／２のリン酸化による修飾ＴＦＦ２ポリペプチド活性の測定
修飾ＴＦＦ２ポリペプチドの活性の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒによるＡｌｐｈａＬＩＳＡ ＳｕｒｅＦｉｒｅ Ｕｌｔｒａ ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）アッセイキットを使用することによって、ジャーカットヒト急性Ｔ細胞白血病細胞、ＫＡＴＯ－ＩＩＩヒト胃がん細胞および／またはＡｓＰＣ－１ヒト膵臓細胞（すべての細胞系はＡＴＣＣによって提供された）におけるＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化によって行う。細胞系を解凍し、ＡＴＣＣによって提供された説明書に従って増殖させる。細胞を、遠心分離によって回収し、ＨＢＳＳ中に１０７個細胞／ｍＬで再懸濁させる。細胞を、３８４ウェルの白色の不透明な培養プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に４ｍＬの細胞／ウェルで播種し、３７℃で１～２時間インキュベートする。０．１％のＢＳＡを含有するＨＢＳＳ中の１０～３０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ｍＬ中の組換えＴＦＦ２の野生型およびバリアントを、プレートに添加して、細胞を刺激し、３７℃で５～３０分間インキュベートする。細胞を、２ｍＬ／ウェルの溶解緩衝液で溶解し、続いて、５ｍＬのＡｃｃｅｐｔｏｒ Ｍｉｘを添加する。次いで、プレートをＴｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、室温で１時間インキュベートする。次いで、５ｍＬのＤｏｎｏｒ Ｍｉｘを明るすぎない光の下でウェルに添加し、Ｔｏｐｓｅａｌ－Ａ接着フィルムで密封し、ホイルで覆い、暗所で、室温で１時間インキュベートする。プレートを、標準的なＡｌｐｈａＰｌｅｘの設定を使用して、ＡｌｐｈａＰｌｅｘ適合プレートリーダーにおいて読み取る。ＣＸＣＲ４のＴＦＦ２刺激の阻害は、組換えＴＦＦ２の添加前に、ＣＸＣＲ４の低分子アンタゴニストのＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ）または抗ＣＸＣＲ４ ｍＡｂ １２Ｇ５および２Ｂ１１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３７℃で１～２時間行う。
【0231】
（実施例７）
結腸直腸腺癌
５１歳の男性は、リンチ症候群の家系と一致する可能性のある早発性結腸直腸がんまたは他の悪性腫瘍の家族歴なしを示し、患者は、患者が結腸内視鏡検査による最初のルーティンのスクリーニング評価を行うまで通常の健康状態にあり、横行結腸において部分的に閉塞性の腫瘤を有していることが見出される。生検は、リンパ管浸潤を伴う中分化型腺癌の存在を確認する。反射分子試験は、ＫＲＡＳエクソン２突然変異：（＋）、ＢＲＡＦ突然変異：（－）について注目に値する。しかしながら、患者は、転移性のマイクロサテライト不安定性－高（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）またはｄＭＭＲ／ＭＳＩ－Ｈ：（＋）として特定される。その後のステージ分類ＣＴスキャンは、腹部外の転位がない、小体積の肝臓および腹膜疾患の両方を特定した。患者は、無症候性のステージＩＶの結腸直腸がんを有するとして分類され、難なく、横行結腸切除術が成功裏に終了する。その６週間後、患者は、レボホリン酸（ＦＯＬまたはＦｕｓｉｌｅｖ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵまたはＦ）およびオキサリプラチン（ＯＸまたはＥｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）、ＤＮＡにおける鎖間および鎖内架橋の両方を形成する白金細胞傷害剤）、または「ＦＯＬＦＯＸ」とベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））のレジメンを開始する。ＦＯＬＦＯＸ－ベバシズマブのサイクル＃６後の再現は、ほぼ完全な寛解（ｎＣＲ）と一致する。十分な許容療法にもかかわらず、患者の健康状態は、「維持」ベバシズマブ／フルオロピリミジンを継続しながら、衰え、患者は、観察プログラムに入る。患者は、１４か月間健康が回復し、その時に、患者は、呼吸困難の開始に気付く。ＣＴスキャンは、新たな大きな右の胸水、腹水、有意な肝機能検査の異常を伴う進行性の肝転移について注目に値する。大きな体積の胸腔穿刺は、腺癌の細胞学的証拠を伴う悪性胸水の存在を確認する。患者は、胸腔の管の設置を受け、続いて、成功裏の胸膜癒着術を行う。患者は、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブによる二次治療を開始する。患者は、再び療法を十分に許容し、サイクル＃４後の再現ＣＴスキャンは、部分寛解（ＰＲ）と一致する。患者は、毒性によって許容される進行を処置するための計画により、レボホリン酸（ＦＯＬ）、５－ＦＵ（Ｆ）およびイリノテカン（ＩＲＩまたはＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）、トポイソメラーゼＩの阻害剤）、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブを継続する。ＦＯＬＦＩＲＩ－Ａｖａｓｔｉｎのサイクル＃１０後の再現は、進行性肝転移および腹水の再発を実証する。患者は、単剤のペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））による治療を開始するが、応答しない。その後の治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
結腸直腸腺癌
５１歳の男性は、リンチ症候群の家系と一致する可能性のある早発性結腸直腸がんまたは他の悪性腫瘍の家族歴なしを示し、患者は、患者が結腸内視鏡検査による最初のルーティンのスクリーニング評価を行うまで通常の健康状態にあり、横行結腸において部分的に閉塞性の腫瘤を有していることが見出される。生検は、リンパ管浸潤を伴う中分化型腺癌の存在を確認する。反射分子試験は、ＫＲＡＳエクソン２突然変異：（＋）、ＢＲＡＦ突然変異：（－）について注目に値する。しかしながら、患者は、転移性のマイクロサテライト不安定性－高（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）またはｄＭＭＲ／ＭＳＩ－Ｈ：（＋）として特定される。その後のステージ分類ＣＴスキャンは、腹部外の転位がない、小体積の肝臓および腹膜疾患の両方を特定した。患者は、無症候性のステージＩＶの結腸直腸がんを有するとして分類され、難なく、横行結腸切除術が成功裏に終了する。その６週間後、患者は、レボホリン酸（ＦＯＬまたはＦｕｓｉｌｅｖ（登録商標））、５－フルオロウラシル（５－ＦＵまたはＦ）およびオキサリプラチン（ＯＸまたはＥｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）、ＤＮＡにおける鎖間および鎖内架橋の両方を形成する白金細胞傷害剤）、または「ＦＯＬＦＯＸ」とベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））のレジメンを開始する。ＦＯＬＦＯＸ－ベバシズマブのサイクル＃６後の再現は、ほぼ完全な寛解（ｎＣＲ）と一致する。十分な許容療法にもかかわらず、患者の健康状態は、「維持」ベバシズマブ／フルオロピリミジンを継続しながら、衰え、患者は、観察プログラムに入る。患者は、１４か月間健康が回復し、その時に、患者は、呼吸困難の開始に気付く。ＣＴスキャンは、新たな大きな右の胸水、腹水、有意な肝機能検査の異常を伴う進行性の肝転移について注目に値する。大きな体積の胸腔穿刺は、腺癌の細胞学的証拠を伴う悪性胸水の存在を確認する。患者は、胸腔の管の設置を受け、続いて、成功裏の胸膜癒着術を行う。患者は、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブによる二次治療を開始する。患者は、再び療法を十分に許容し、サイクル＃４後の再現ＣＴスキャンは、部分寛解（ＰＲ）と一致する。患者は、毒性によって許容される進行を処置するための計画により、レボホリン酸（ＦＯＬ）、５－ＦＵ（Ｆ）およびイリノテカン（ＩＲＩまたはＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）、トポイソメラーゼＩの阻害剤）、ＦＯＬＦＩＲＩ－ベバシズマブを継続する。ＦＯＬＦＩＲＩ－Ａｖａｓｔｉｎのサイクル＃１０後の再現は、進行性肝転移および腹水の再発を実証する。患者は、単剤のペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））による治療を開始するが、応答しない。その後の治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
【0232】
（実施例９）
食道扁平上皮癌
患者は、患者が嚥下障害および断続的な剣状突起下の不快感を示すまで通常の健康状態にある、タバコ乱用歴を有する５８歳の男性である。ヒスタミン受容体２型（Ｈ２）ブロッカーおよびプロトンポンプブロッカーの両方を含む幾度かの対症的介入の失敗の後、患者は、正式な胃腸病学の診察を受け、上部内視鏡検査を受け、その時に、患者は、部分的に閉塞している３．２ｃｍの外方増殖性の食道中央部の腫瘤について知らされる。病理学の再検討は、中分化型扁平上皮癌を明らかにする。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：２０％。ステージ分類ＰＥＴ／ＣＴスキャンおよび超音波内視鏡検査は、Ｔ４ａＮ０疾患と一致し、腫瘍が切除に適していることを確認する。患者は、同時的な低用量の毎週のネオアジュバントのカルボプラチナム／パクリタキセル（チューブリン阻害剤、Ｔａｘｏｌ（登録商標））および放射線療法、続いて最終的な外科的切除を成功裏に終了する。外科病理学の再検討は、残った悪性腫瘍のいかなる証拠も明らかにしなかった。９か月後、患者は、食欲不振および体重減少を示す。ＣＴスキャンは、肝転移および肺転移の両方の存在を実証した。ＣＴガイドコア針生検は、転移性扁平上皮癌の存在を確認する。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：１６％。無増悪生存期間（ＰＦＳ）が、一次化学療法（この場合では、ネオアジュバント）後に＞６か月であるので、患者は、良好な一般状態を有し（ＥＣＯＧ＜１）、特に、患者が、状況を安定化するためだけに早期の有意義な応答を必要とする急速な進行性疾患または高度の症候性疾患のいずれかを示す場合、その結果、二次治療が開始される。患者は、６サイクルのＦＯＬＦＩＲＩを受け、分裂停止期の部分寛解（ＰＲ）を達成し、観察プログラムに入る。４か月後、ルーティンの監視ＣＴスキャンは、転移性疾患の進行を示す。患者は、ＥＣＯＧ １の一般状態を維持し、追加治療の続行を希望する。患者は、単剤のペムブロリズマブを開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
食道扁平上皮癌
患者は、患者が嚥下障害および断続的な剣状突起下の不快感を示すまで通常の健康状態にある、タバコ乱用歴を有する５８歳の男性である。ヒスタミン受容体２型（Ｈ２）ブロッカーおよびプロトンポンプブロッカーの両方を含む幾度かの対症的介入の失敗の後、患者は、正式な胃腸病学の診察を受け、上部内視鏡検査を受け、その時に、患者は、部分的に閉塞している３．２ｃｍの外方増殖性の食道中央部の腫瘤について知らされる。病理学の再検討は、中分化型扁平上皮癌を明らかにする。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：２０％。ステージ分類ＰＥＴ／ＣＴスキャンおよび超音波内視鏡検査は、Ｔ４ａＮ０疾患と一致し、腫瘍が切除に適していることを確認する。患者は、同時的な低用量の毎週のネオアジュバントのカルボプラチナム／パクリタキセル（チューブリン阻害剤、Ｔａｘｏｌ（登録商標））および放射線療法、続いて最終的な外科的切除を成功裏に終了する。外科病理学の再検討は、残った悪性腫瘍のいかなる証拠も明らかにしなかった。９か月後、患者は、食欲不振および体重減少を示す。ＣＴスキャンは、肝転移および肺転移の両方の存在を実証した。ＣＴガイドコア針生検は、転移性扁平上皮癌の存在を確認する。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：１６％。無増悪生存期間（ＰＦＳ）が、一次化学療法（この場合では、ネオアジュバント）後に＞６か月であるので、患者は、良好な一般状態を有し（ＥＣＯＧ＜１）、特に、患者が、状況を安定化するためだけに早期の有意義な応答を必要とする急速な進行性疾患または高度の症候性疾患のいずれかを示す場合、その結果、二次治療が開始される。患者は、６サイクルのＦＯＬＦＩＲＩを受け、分裂停止期の部分寛解（ＰＲ）を達成し、観察プログラムに入る。４か月後、ルーティンの監視ＣＴスキャンは、転移性疾患の進行を示す。患者は、ＥＣＯＧ １の一般状態を維持し、追加治療の続行を希望する。患者は、単剤のペムブロリズマブを開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
【0233】
（実施例１０）
胃／食道腺癌
患者は、患者が１８か月前に嚥下障害および断続的な剣状突起下の不快感を示すまで通常の健康状態にある、４７歳の女性である。Ｈ２およびプロトンポンプブロッカーの両方を含む幾度かの対症的介入の失敗の後、患者は、正式な胃腸病学の診察を受け、上部内視鏡検査を受け、その時に、患者は、（胃の噴門／食道下部の）２．２ｃｍの外方増殖性の腫瘤について知らされる。病理学の再検討は、分化の乏しい腺癌を明らかにする。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染の証拠はなく、Ｈｅｒ２免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色は０であった。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：１２％。ステージ分類ＣＴスキャンは、局所リンパ節腫脹および低体積の肝転移の両方の存在を実証する。患者は、切除不可能な低体積のステージＩＶの分化の乏しい胃／食道腺癌を有するとして分類される。最小限の症状を伴う低体積の疾患およびＣＰＳ＞１０に基づいて、患者は、ＣＰＳ＞１０の患者が、少数のすべてのグレードまたはグレード３／４の毒性を伴ってＯＳ（対ＣＤＤＰ／フルオロピリミジン）を改善した（１７．４か月対１０．８か月）ＫＥＹＮＯＴＥ－０６２治験の知見に基づいて、一次治療として、単剤のペムブロリズマブを開始する。しかしながら、患者の状態は進行し、患者は、大きく症候性の腫瘍（主に６．０ｃｍ、広範囲の肝転移）およびＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ＜１０を発生する。その後、患者は、５サイクルのＦＯＬＦＯＸを受け、分裂停止期の部分寛解（ＰＲ）を達成する。治療は、一般に、十分に許容されるが、患者は、グレード２の末梢神経障害を経験する。患者は、観察プログラムに置かれる。７か月後、ルーティンの監視ＣＴスキャンは、進行性の肝転移および新たな肺転移を明らかにする。患者は、ＥＣＯＧ １の一般状態を維持し、処置を、ラムシルマブ（ramucirmab）（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）、直接ＶＥＧＦＲ２アンタゴニスト）およびパクリタキセルで開始する。サイクル＃４後の再現ＣＴスキャンは、安定疾患と一致する。しかしながら、患者の末梢神経障害は悪化し、パクリタキセルを中止した。患者は、単剤のラムシルマブを維持するが、３か月後に進行する。ＫＥＹＮＯＴＥ－０５９研究（二次またはそれよりも多くの化学療法に失敗）の結果に基づいて、患者は、単剤のペムブロリズマブに変更する。患者は、単剤のペムブロリズマブを開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
胃／食道腺癌
患者は、患者が１８か月前に嚥下障害および断続的な剣状突起下の不快感を示すまで通常の健康状態にある、４７歳の女性である。Ｈ２およびプロトンポンプブロッカーの両方を含む幾度かの対症的介入の失敗の後、患者は、正式な胃腸病学の診察を受け、上部内視鏡検査を受け、その時に、患者は、（胃の噴門／食道下部の）２．２ｃｍの外方増殖性の腫瘤について知らされる。病理学の再検討は、分化の乏しい腺癌を明らかにする。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染の証拠はなく、Ｈｅｒ２免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色は０であった。ＰＤ－Ｌ１組合せ陽性スコア（ＣＰＳ）：１２％。ステージ分類ＣＴスキャンは、局所リンパ節腫脹および低体積の肝転移の両方の存在を実証する。患者は、切除不可能な低体積のステージＩＶの分化の乏しい胃／食道腺癌を有するとして分類される。最小限の症状を伴う低体積の疾患およびＣＰＳ＞１０に基づいて、患者は、ＣＰＳ＞１０の患者が、少数のすべてのグレードまたはグレード３／４の毒性を伴ってＯＳ（対ＣＤＤＰ／フルオロピリミジン）を改善した（１７．４か月対１０．８か月）ＫＥＹＮＯＴＥ－０６２治験の知見に基づいて、一次治療として、単剤のペムブロリズマブを開始する。しかしながら、患者の状態は進行し、患者は、大きく症候性の腫瘍（主に６．０ｃｍ、広範囲の肝転移）およびＰＤ－Ｌ１ ＣＰＳ＜１０を発生する。その後、患者は、５サイクルのＦＯＬＦＯＸを受け、分裂停止期の部分寛解（ＰＲ）を達成する。治療は、一般に、十分に許容されるが、患者は、グレード２の末梢神経障害を経験する。患者は、観察プログラムに置かれる。７か月後、ルーティンの監視ＣＴスキャンは、進行性の肝転移および新たな肺転移を明らかにする。患者は、ＥＣＯＧ １の一般状態を維持し、処置を、ラムシルマブ（ramucirmab）（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）、直接ＶＥＧＦＲ２アンタゴニスト）およびパクリタキセルで開始する。サイクル＃４後の再現ＣＴスキャンは、安定疾患と一致する。しかしながら、患者の末梢神経障害は悪化し、パクリタキセルを中止した。患者は、単剤のラムシルマブを維持するが、３か月後に進行する。ＫＥＹＮＯＴＥ－０５９研究（二次またはそれよりも多くの化学療法に失敗）の結果に基づいて、患者は、単剤のペムブロリズマブに変更する。患者は、単剤のペムブロリズマブを開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびペムブロリズマブで開始し、これは、完全奏効ならびに腫瘍および転移の退縮をもたらす。
【0234】
（実施例１１）
膵臓がん
患者は、患者が非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の不連続使用で制御されるぼんやりとした中背部痛の開始を報告するまで良好な、一般に優れた健康状態の３９歳の女性である。患者は、寝汗、および１週間の強膜黄疸、およびだんだん暗くなる尿を示す。臨床評価は、黄疸の存在を確認し、化学は、１２．２ｍｇ／ｄｌの総ビリルビンを伴う胆汁うっ滞性肝機能障害のパターンを特定する。ＣＴスキャンは、膵臓頭部の８．４ｃｍの腫瘤、ならびに肝門のリンパ節腫脹、散在性の小さな両側の肝腫瘤および総胆管の有意な膨張を明らかにする。肝ステント留置による内視鏡的逆行性胆道膵管造影法（ＥＲＣＰ）に成功し、ビリルビンは正常レベルに戻る。ＣＴガイド肝生検は、分化の乏しいＫＲＡＳ：（＋）ＴＰ５３：（＋）腺癌の存在を確認する。ＣＡ １９－９は、著しく上昇する（７１０）。症状は、切除不可能なステージＩＶの膵臓の腺癌と最も一致する。膵臓がん、乳がんまたは卵巣がんの家族歴、または既知のＢＲＣＡ２突然変異はない。患者は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を受ける。ＢＲＣＡ２またはＰＡＬＢ２のいずれかについての胚性突然変異の証拠はない。しかしながら、患者は、ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－Ｈである。患者は、修飾ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメン（ＦＯＬ＋Ｆ＋イリノテカンまたは「ＩＲＩＮ」＋ＯＸ）を開始し、一般に十分に許容される６サイクルの治療を成功裏に終了する。サイクル＃４およびサイクル＃６後の再ステージ分類ＣＴスキャンは、安定な分裂停止期の部分寛解と一致する。患者は、観察プログラムに入り、ルーティンの監視ＣＴスキャンが無症候性の低体積の肝転移の進行の存在を確認する４か月後まで良好なままである。患者は、単剤のニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））を開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびニボルマブで開始し、これは、完全奏効および腫瘍の退縮をもたらす。
膵臓がん
患者は、患者が非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の不連続使用で制御されるぼんやりとした中背部痛の開始を報告するまで良好な、一般に優れた健康状態の３９歳の女性である。患者は、寝汗、および１週間の強膜黄疸、およびだんだん暗くなる尿を示す。臨床評価は、黄疸の存在を確認し、化学は、１２．２ｍｇ／ｄｌの総ビリルビンを伴う胆汁うっ滞性肝機能障害のパターンを特定する。ＣＴスキャンは、膵臓頭部の８．４ｃｍの腫瘤、ならびに肝門のリンパ節腫脹、散在性の小さな両側の肝腫瘤および総胆管の有意な膨張を明らかにする。肝ステント留置による内視鏡的逆行性胆道膵管造影法（ＥＲＣＰ）に成功し、ビリルビンは正常レベルに戻る。ＣＴガイド肝生検は、分化の乏しいＫＲＡＳ：（＋）ＴＰ５３：（＋）腺癌の存在を確認する。ＣＡ １９－９は、著しく上昇する（７１０）。症状は、切除不可能なステージＩＶの膵臓の腺癌と最も一致する。膵臓がん、乳がんまたは卵巣がんの家族歴、または既知のＢＲＣＡ２突然変異はない。患者は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を受ける。ＢＲＣＡ２またはＰＡＬＢ２のいずれかについての胚性突然変異の証拠はない。しかしながら、患者は、ｄＭＭＲ／ＭＳＩ－Ｈである。患者は、修飾ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメン（ＦＯＬ＋Ｆ＋イリノテカンまたは「ＩＲＩＮ」＋ＯＸ）を開始し、一般に十分に許容される６サイクルの治療を成功裏に終了する。サイクル＃４およびサイクル＃６後の再ステージ分類ＣＴスキャンは、安定な分裂停止期の部分寛解と一致する。患者は、観察プログラムに入り、ルーティンの監視ＣＴスキャンが無症候性の低体積の肝転移の進行の存在を確認する４か月後まで良好なままである。患者は、単剤のニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））を開始するが、応答しない。その後、治療を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドで開始し、患者は、部分的な目的の応答を達成する。併用処置を、修飾ＴＦＦ２ポリペプチドおよびニボルマブで開始し、これは、完全奏効および腫瘍の退縮をもたらす。
【0235】
（実施例１２）
安定化組換えＴＦＦ２（ＴＦＦ２－ＣＴＰ）は結腸直腸がんのマウスモデルにおけるＰＤ－１遮断の抗腫瘍活性を増強する
複数の腫瘍型におよぶ免疫チェックポイント遮断に対する著しい応答にもかかわらず、結腸直腸がん（ＣＲＣ）における臨床的利点は、マイクロサテライト不安定性腫瘍に限定される。ＰＤ－Ｌ１発現は、ＣＲＣにおける陰性の予後マーカーであるが、ＰＤ－１遮断に対する良好な応答と相関する。この実施例では、結腸直腸腫瘍発生におけるＰＤ－Ｌ１の役割を研究し、ＰＤ－１遮断と組み合わせた骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的化する有用性を、結腸直腸がん（ＣＲＣ）のマウスモデルにおいて評価した。マウスＰｄｌ１遺伝子を条件付きで発現するノックインマウス（Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＥＧＦＰ）を作製し、骨髄細胞系列において特異的にＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅマウスと交配した。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理マウスは、１０週間で腫瘍を形成し、ＡＯＭの１７週間後に腺癌を発生した。図３Ａ～３Ｄを参照されたい。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理は、未処理マウスと比較して、骨髄性細胞、特に、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣの有意な発現をもたらした。図４Ａ～４Ｃを参照されたい。さらにまた、弱毒化した抗腫瘍免疫を示す腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞における有意な減少があった。図５Ａ～５Ｃを参照されたい。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理されたＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌマウスは、腫瘍の数およびサイズの有意な増加を伴う著しく増強された早期結腸直腸腫瘍発生を示した。図６Ａ～６Ｆを参照されたい。分泌された抗炎症ペプチドのＴＦＦ２は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣの発現を抑制することによって、結腸の腫瘍成長を阻害する。２つのカルボキシル末端ペプチドおよび３つのＦｌａｇモチーフと融合されたＴＦＦ２（ＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇ）は、血中での循環時間を延長したが、生物活性は保持した。図７Ａ～７Ｅを参照されたい。本発明者らは、Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－ＬマウスにおいてＡＯＭ／ＤＳＳで腫瘍を誘導し、融合組換えＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇおよび／または抗ＰＤ－１抗体を投与した。ＴＦＦ２－ＣＴＰと組み合わせた抗ＰＤ－１抗体は、腫瘍成長の著しい低減を示したが、抗ＰＤ－１単剤療法は、成長の抑制に失敗した。興味深いことに、併用処置は、対照動物よりも、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するマウスにおいて、より高い抗腫瘍活性を示した。図８を参照されたい。処置レスポンダーは、有意に増加した腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞、および付随して減少したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋骨髄性細胞を示した。図９を参照されたい。これらの早期の知見は、ＴＦＦ２が、おそらくＭＤＳＣの増殖を抑制することによって、ＣＲＣのＰＤ－１遮断に対する応答率を増大させることを示唆し、ＣＲＣためのＩ－Ｏ処置の組合せにおけるＴＦＦ２－ＣＴＰの可能性を裏付ける。
安定化組換えＴＦＦ２（ＴＦＦ２－ＣＴＰ）は結腸直腸がんのマウスモデルにおけるＰＤ－１遮断の抗腫瘍活性を増強する
複数の腫瘍型におよぶ免疫チェックポイント遮断に対する著しい応答にもかかわらず、結腸直腸がん（ＣＲＣ）における臨床的利点は、マイクロサテライト不安定性腫瘍に限定される。ＰＤ－Ｌ１発現は、ＣＲＣにおける陰性の予後マーカーであるが、ＰＤ－１遮断に対する良好な応答と相関する。この実施例では、結腸直腸腫瘍発生におけるＰＤ－Ｌ１の役割を研究し、ＰＤ－１遮断と組み合わせた骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を標的化する有用性を、結腸直腸がん（ＣＲＣ）のマウスモデルにおいて評価した。マウスＰｄｌ１遺伝子を条件付きで発現するノックインマウス（Ｒ２６－ＬＳＬ－Ｐｄｌ１－ＥＧＦＰ）を作製し、骨髄細胞系列において特異的にＰＤ－Ｌ１を過剰発現するように、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅマウスと交配した。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理マウスは、１０週間で腫瘍を形成し、ＡＯＭの１７週間後に腺癌を発生した。図３Ａ～３Ｄを参照されたい。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理は、未処理マウスと比較して、骨髄性細胞、特に、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣの有意な発現をもたらした。図４Ａ～４Ｃを参照されたい。さらにまた、弱毒化した抗腫瘍免疫を示す腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞における有意な減少があった。図５Ａ～５Ｃを参照されたい。ＡＯＭ／ＤＳＳ処理されたＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－Ｌマウスは、腫瘍の数およびサイズの有意な増加を伴う著しく増強された早期結腸直腸腫瘍発生を示した。図６Ａ～６Ｆを参照されたい。分泌された抗炎症ペプチドのＴＦＦ２は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋ＭＤＳＣの発現を抑制することによって、結腸の腫瘍成長を阻害する。２つのカルボキシル末端ペプチドおよび３つのＦｌａｇモチーフと融合されたＴＦＦ２（ＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇ）は、血中での循環時間を延長したが、生物活性は保持した。図７Ａ～７Ｅを参照されたい。本発明者らは、Ｒ２６－ＰＤ－Ｌ１およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ；Ｒ２６－ＰＤ－ＬマウスにおいてＡＯＭ／ＤＳＳで腫瘍を誘導し、融合組換えＴＦＦ２－ＣＴＰ－Ｆｌａｇおよび／または抗ＰＤ－１抗体を投与した。ＴＦＦ２－ＣＴＰと組み合わせた抗ＰＤ－１抗体は、腫瘍成長の著しい低減を示したが、抗ＰＤ－１単剤療法は、成長の抑制に失敗した。興味深いことに、併用処置は、対照動物よりも、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するマウスにおいて、より高い抗腫瘍活性を示した。図８を参照されたい。処置レスポンダーは、有意に増加した腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞、および付随して減少したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋骨髄性細胞を示した。図９を参照されたい。これらの早期の知見は、ＴＦＦ２が、おそらくＭＤＳＣの増殖を抑制することによって、ＣＲＣのＰＤ－１遮断に対する応答率を増大させることを示唆し、ＣＲＣためのＩ－Ｏ処置の組合せにおけるＴＦＦ２－ＣＴＰの可能性を裏付ける。
【0236】
したがって、抗ＰＤ－１単剤療法は、ＣＲＣにおいて抗腫瘍免疫を引き起こすことはできなかったが、ＴＦＦ２－ＣＴＰは、抗ＰＤ－１療法の有効性を増大させた。ＴＦＦ２－ＣＴＰと組み合わせた抗ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するマウスにおいて、より高い抗腫瘍活性を示した。ＴＦＦ２－ＣＴＰ単独、またはＰＤ－１遮断との組合せに対するレスポンダーは、減少したＭＤＳＣと一緒に、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させた。
【0237】
（実施例１３）
ＴＦＦ２－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合物の発現および精製
遺伝子合成
ＴＦＦ－２－ＨＳＡタンパク質を、コドン最適化し、Ｃｏｄｅｘ遺伝子合成を使用して合成した。合成されたＴＦＦ－２ ＨＳＡタンパク質は、ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＷＴ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩＩ／ＩＩ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩＩ／Ｉ］およびＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩＩ／ＩＩ］であった。オリゴヌクレオチドをＣｏｄｅｘによって合成し、遺伝子をＳＧＩ／Ｃｏｄｅｘ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒでアセンブルした。合成された遺伝子を、ＳＧＩを使用して、発現ベクターｐＡＢ２（ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化される）にサブクローニングした。重複する３０ｂｐの配列を、ｐＡＢ２への目的の遺伝子のギブソンアセンブルのために使用した。目的の遺伝子を有するベクターを、ＮＥＢ（登録商標）５－アルファＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ［（高効率）；ＮＥＢ；Ｃ２９８７Ｈ］に形質転換した。３つのコロニーを、集め、ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐを介したＤＮＡ単離のためにスケールアップした。次いで、３つのコロニーを、配列決定のために送った。配列確認の際に、陽性クローンをスケールアップし、プラスミドＤＮＡを単離した。
ＴＦＦ２－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合物の発現および精製
遺伝子合成
ＴＦＦ－２－ＨＳＡタンパク質を、コドン最適化し、Ｃｏｄｅｘ遺伝子合成を使用して合成した。合成されたＴＦＦ－２ ＨＳＡタンパク質は、ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＷＴ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＤＩＩ／ＩＩ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩ／Ｉ］；ＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩＩ／Ｉ］およびＴＦＦ２－ＨＳＡ［ＬＢＤＩＩ／ＩＩ］であった。オリゴヌクレオチドをＣｏｄｅｘによって合成し、遺伝子をＳＧＩ／Ｃｏｄｅｘ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒでアセンブルした。合成された遺伝子を、ＳＧＩを使用して、発現ベクターｐＡＢ２（ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化される）にサブクローニングした。重複する３０ｂｐの配列を、ｐＡＢ２への目的の遺伝子のギブソンアセンブルのために使用した。目的の遺伝子を有するベクターを、ＮＥＢ（登録商標）５－アルファＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ［（高効率）；ＮＥＢ；Ｃ２９８７Ｈ］に形質転換した。３つのコロニーを、集め、ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐを介したＤＮＡ単離のためにスケールアップした。次いで、３つのコロニーを、配列決定のために送った。配列確認の際に、陽性クローンをスケールアップし、プラスミドＤＮＡを単離した。
【0238】
トランスフェクション
トランスフェクションの前の日に、ＨＥＫ２９３細胞を、フラスコに播種した。トランスフェクションの日に、細胞カウントおよび細胞生存率を測定し、培養物が、＞９６％の生存率で１．８×１０６～２．２×１０６個細胞／ｍＬに達したら、トランスフェクションを進めた。次いで、ＤＮＡを、ＦｅｃｔｏＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）トランスフェクション試薬に再懸濁させ、無血清培地に希釈し、室温でインキュベートした。次いで、トランスフェクション複合体を、フラスコを回旋させながら、穏やかにＨＥＫ２９３細胞に添加し、その後、３７℃のインキュベーターに戻した。次いで、細胞培養物に、トランスフェクションの４～５時間後に、新鮮な培地を供給した。トランスフェクションの６日後、細胞上清を、回収し、遠心分離によって清澄化した。
トランスフェクションの前の日に、ＨＥＫ２９３細胞を、フラスコに播種した。トランスフェクションの日に、細胞カウントおよび細胞生存率を測定し、培養物が、＞９６％の生存率で１．８×１０６～２．２×１０６個細胞／ｍＬに達したら、トランスフェクションを進めた。次いで、ＤＮＡを、ＦｅｃｔｏＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）トランスフェクション試薬に再懸濁させ、無血清培地に希釈し、室温でインキュベートした。次いで、トランスフェクション複合体を、フラスコを回旋させながら、穏やかにＨＥＫ２９３細胞に添加し、その後、３７℃のインキュベーターに戻した。次いで、細胞培養物に、トランスフェクションの４～５時間後に、新鮮な培地を供給した。トランスフェクションの６日後、細胞上清を、回収し、遠心分離によって清澄化した。
【0239】
タンパク質精製
ＨＳＡタグ化ヒトＴＦＦ２タンパク質を、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）（製品コード３１５１、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（登録商標），Ｌｔｄ）選択的アフィニティークロマトグラフィー吸着カラムで精製した。カラムを、最初に５カラム体積（ＣＶ）の０．５ＮのＮａＯＨ、続いて５ＣＶのオートクレーブされたＥ純水で洗浄した。次いで、カラムを、１０ＣＶの５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）で平衡化した。次いで、タンパク質画分を、カラムにのせ、その後、１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、精製タンパク質を、５ＣＶの５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１０ｍＭのオクタン酸ナトリウム、ｐＨ７．０でカラムから溶出させた。
ＨＳＡタグ化ヒトＴＦＦ２タンパク質を、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）（製品コード３１５１、Ｐｒｏｍｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（登録商標），Ｌｔｄ）選択的アフィニティークロマトグラフィー吸着カラムで精製した。カラムを、最初に５カラム体積（ＣＶ）の０．５ＮのＮａＯＨ、続いて５ＣＶのオートクレーブされたＥ純水で洗浄した。次いで、カラムを、１０ＣＶの５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５（緩衝液Ａ）で平衡化した。次いで、タンパク質画分を、カラムにのせ、その後、１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、精製タンパク質を、５ＣＶの５０ｍＭの酢酸アンモニウム、１０ｍＭのオクタン酸ナトリウム、ｐＨ７．０でカラムから溶出させた。
【0240】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
試料を、ＮｕＰＡＧＥゲル４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ １．０ｍｍ、１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＮＰ０３０２ＢＯＸ）上で流した。試料（２μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（４×）中でロードし、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号００２－０２）中、２００Ｖで３０分間、流した。正確なＰｌｕｓ ＭＷ標準を、分子量標準として使用した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、カタログ番号１６１－０３７４）。ゲルを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＬＣ６０６０）で染色した。澄明化された回収物、フロースルー、洗浄物およびプロテインＡ溶出試料をゲルに流した。図１０を参照されたい。精製されたＴＦＦ２－ＨＡＳバリアントのそれぞれについて得られた収率を図１１に示す。
試料を、ＮｕＰＡＧＥゲル４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ １．０ｍｍ、１２ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＮＰ０３０２ＢＯＸ）上で流した。試料（２μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（４×）中でロードし、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号００２－０２）中、２００Ｖで３０分間、流した。正確なＰｌｕｓ ＭＷ標準を、分子量標準として使用した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）、カタログ番号１６１－０３７４）。ゲルを、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、カタログ番号ＬＣ６０６０）で染色した。澄明化された回収物、フロースルー、洗浄物およびプロテインＡ溶出試料をゲルに流した。図１０を参照されたい。精製されたＴＦＦ２－ＨＡＳバリアントのそれぞれについて得られた収率を図１１に示す。
【0241】
本明細書において引用されるすべての特許、特許出願および特許公開、ならびに非特許刊行物は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【0242】
本開示の多くの実施形態を記載した。それにもかかわらず、さまざまな改変を、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、行うことができることが理解される。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3A-B】
【図3C-D】
【図4A】
【図4B-C】
【図5A】
【図5B-C】
【図6A-C】
【図6D-F】
【図7A-B】
【図7C-E】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】