(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-01
(54)【発明の名称】活性ベースプローブ
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20221025BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221025BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20221025BHJP
C12Q 1/48 20060101ALI20221025BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20221025BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20221025BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221025BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
C07K19/00
C12N9/10
C12Q1/48
C12Q1/37
C12N15/10 200Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022513369
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(85)【翻訳文提出日】2022-04-11
(86)【国際出願番号】 EP2020074069
(87)【国際公開番号】W WO2021038034
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】1912339.7
(32)【優先日】2019-08-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1916504.2
(32)【優先日】2019-11-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510279918
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ダンディー
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＤＵＮＤＥＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100173473
【弁理士】
【氏名又は名称】高井良 克己
(72)【発明者】
【氏名】サトパル バーディー
(72)【発明者】
【氏名】スニール マートゥル
(72)【発明者】
【氏名】アダム フレッチャー
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD11
4B050EE10
4B050LL03
4B063QQ13
4B063QQ26
4B063QQ36
4B063QQ79
4B063QR06
4B063QR16
4B063QR48
4B063QR80
4B063QS02
4B063QS03
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA55
4H045FA50
4H045FA52
4H045FA53
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は新規な光架橋活性ベースプローブ（ＡＢＰｓ）の開発およびそれらの使用に向けられる。具体的には、ユビキチンチャージドＥ２コンジュゲーティング酵素は工学的に作り出され、およびＲＩＮＧユビキチンＥ１およびＥ３リガーゼならびに脱ユビキチン化酵素の有効なＡＢＰｓであることが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユビキチンの位置３１でのグルタミン残基および／または位置３２でのアスパラギン酸残基の代わりに光架橋剤モイエティを含む、活性化ユビキチン分子。
【請求項2】
ユビキチンはヒトユビキチンである、請求項１に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項3】
光架橋剤モイエティは、アスパラギン酸／グルタミン残基の代わりに非自然アミノ酸、例えば、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニンなどのようなものの組込みによって得られた、請求項１または２のいずれかに記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項4】
レポータータグをさらに含む、いずれかの先行する請求項に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項5】
レポータータグは、ビオチンモイエティ、または分析的検出を可能にする他のレポーター、例は、エピトープタグ、フルオロフォアである、請求項４に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項6】
ビオチンモイエティ／レポータータグは、ユビキチンのＮ末端に付着したリンカー分子を通してユビキチン分子に共有結合的に付着している、請求項４または請求項５に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項7】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーションした、いずれかの先行する請求項に記載の活性化分子を含む、コンジュゲート分子。
【請求項8】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素は、Ｃ８５ＫもしくはＣ８７Ｋ変異および／またはＳ２２ＲもしくはＫ９２Ａ変異を含む変異酵素である、請求項７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項9】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｄ３またはＵＢＥ２Ｎである、請求項７または８に記載のコンジュゲート分子。
【請求項10】
Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ基、例えば、ヘキサヒスチジンタグなどのようなものをさらに含む、請求項７－９のいずれかに記載のコンジュゲート分子。
【請求項11】
ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングの方法における、請求項７－１０のいずれかに記載のコンジュゲート分子の使用。
【請求項12】
活性プロファイリングはＲＩＮＧ Ｅ３酵素のものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
（ｉ）ＲＩＮＧ Ｅ３酵素調節の研究、（ｉｉ）新規ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の発見、（ｉｉｉ）インヒビタースクリーニング、（ｉｖ）インヒビター選択性プロファイリング；および／または（ｖ）構造研究用の酵素中間体の安定化のための、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
請求項７－１０のいずれかに記載のコンジュゲート分子とＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素との間の相互作用を検出する方法であって、コンジュゲート分子を前記ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素と接触させること、および任意の新しいコンジュゲートの形成を検出することを含む、方法。
【請求項15】
ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、ＲＣＲ（１）ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せであり、および脱ユビキチン化酵素はＤＵＢｓ（３１）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
相互作用はＲＩＮＧ Ｅ３酵素とのものである、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（本発明の分野）
本発明は新規な光架橋活性ベースプローブ（ＡＢＰｓ）の開発およびそれらの使用に向けられる。具体的には、ユビキチンチャージドＥ２コンジュゲーティング酵素は工学的に作り出され、およびＲＩＮＧユビキチンＥ１およびＥ３リガーゼならびに脱ユビキチン化酵素の有効なＡＢＰｓであることが示される。
本発明は新規な光架橋活性ベースプローブ（ＡＢＰｓ）の開発およびそれらの使用に向けられる。具体的には、ユビキチンチャージドＥ２コンジュゲーティング酵素は工学的に作り出され、およびＲＩＮＧユビキチンＥ１およびＥ３リガーゼならびに脱ユビキチン化酵素の有効なＡＢＰｓであることが示される。
【背景技術】
【0002】
（本発明の背景）
活性ベースのタンパク質プロファイリングは、酵素生物学を研究し、および治療用物質の開発を促進するための非常に貴重な技術である。ユビキチンＥ３リガーゼ（Ｅ３ｓ）は、最大の酵素ファミリーの１つであり、および多数の（病理）生理学的プロセスを調節する。最大のサブタイプはＲＩＮＧ Ｅ３ｓであり、それには＞６００メンバーがある。ＲＩＮＧ Ｅ３ｓは、アダプター様活性を持ち、それは多様な調節機構が得られることを条件とすることができ、および魅力的な薬物ターゲットとなった。我々の知識の及ぶ限りでは、ＲＩＮＧ Ｅ３活性を測定するための活性ベースのプローブ（ＡＢＰｓ）は、存在しない。
活性ベースのタンパク質プロファイリングは、酵素生物学を研究し、および治療用物質の開発を促進するための非常に貴重な技術である。ユビキチンＥ３リガーゼ（Ｅ３ｓ）は、最大の酵素ファミリーの１つであり、および多数の（病理）生理学的プロセスを調節する。最大のサブタイプはＲＩＮＧ Ｅ３ｓであり、それには＞６００メンバーがある。ＲＩＮＧ Ｅ３ｓは、アダプター様活性を持ち、それは多様な調節機構が得られることを条件とすることができ、および魅力的な薬物ターゲットとなった。我々の知識の及ぶ限りでは、ＲＩＮＧ Ｅ３活性を測定するための活性ベースのプローブ（ＡＢＰｓ）は、存在しない。
【0003】
ユビキチン化は正常な細胞生理を調節する基本的な翻訳後修飾であり、およびその機能不全は疾患の発症につながることがある（Ｒａｐｅ（ラペ）， Ｍ．（２０１８）． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー）１９， ５９－７０）。ユビキチン化はユビキチンＥ１活性化（Ｅ１）、ユビキチンＥ２コンジュゲーティング（Ｅ２）およびユビキチンＥ３リガーゼ（Ｅ３ｓ）の順次活性を含む酵素カスケードによって行われる（Ｈｅｒｓｈｋｏ（ハーシュコ），Ａ．およびＣｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ（チカノヴァー），Ａ．（１９９８）． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ（アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー） ６７， ４２５－４７９．）。ユビキチン（Ｕｂ）はＥ１での触媒に関するシステインからＥ２での触媒に関するシステイン上へ共有結合的に移され、チオエステル連結したＥ２中間体（Ｅ２～Ｕｂ）が形成される。Ｅ２～Ｕｂを補充し、および特定の基質をユビキチン化するＥ３ｓは数百種類存在することが知られている。Ｅ３機構の分岐は２つの全般的クラスに大別される。「Ｃｙｓ Ｅ３ｓ」はその～５０が存在し、基質修飾に先立ちＵｂと共有結合チオエステル連結中間体を形成するために触媒に関するシステインを利用する（Ｋ． Ｃ． Ｐａｏ（パオ）ら， Ｎａｔｕｒｅ（ネイチャー）， ２０１８， ５５６， ３８１－３８５；Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ（シェフナー）， Ｍ．， Ｎｕｂｅｒ（ヌバー）， Ｕ．， およびＨｕｉｂｒｅｇｔｓｅ（ハイブレグツェ）， Ｊ．Ｍ．（１９９５）． Ｎａｔｕｒｅ ３７３， ８１－８３； Ｗｅｎｚｅｌ（ヴェンツェル）， Ｄ．Ｍ．，ら（２０１１）， Ｎａｔｕｒｅ ４７４， １０５－１０８）。
【0004】
しかしながら、Ｅ３ｓの最大のクラスは＞６００の別個の形態が存在するアダプター様Ｅ３ｓである（Ｄｅｓｈａｉｅｓ（デシャイエス）， Ｒ．Ｊ．， およびＪｏａｚｅｉｒｏ（ジョアゼイロ）， Ｃ．Ａ．（２００９）． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７８， ３９９－４３４）。アダプター様Ｅ３ｓは触媒作用の求核剤を欠き、およびＥ２～Ｕｂから基質へのＵｂの直接移動を触媒する。このアダプター様活性はマルチサブユニットのＣｕｌｌｉｎ（カリン）－ＲＩＮＧ Ｅ３ｓおよび～３５０の単一ポリペプチドＲＩＮＧ Ｅ３ｓ（以下、単にＲＩＮＧ Ｅ３ｓと称する）によって利用される。後半は、単量体、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして存在することができる（Ｍｅｔｚｇｅｒ（メッツガー）， Ｍ．Ｂ．らＢｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（ビオチミカ・エト・ビオフィシカ・アクタ）１８４３， ４７－６０）。活性調節は細胞の恒常性および適応的なシグナル伝達を確実にするＥ３生物学の特に重要な態様である。調節不全は疾患の発症につながることがあり、およびそれゆえＲＩＮＧ Ｅ３ｓは魅力的な治療標的となった（Ｂｕｒｇｅｓｓ（バージェス），Ａ．ら（２０１６）．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ（フロンティアズ・イン・オンコロジー）６， ７）。しかしながら、非常に多数のＲＩＮＧ Ｅ３ｓについての細胞の役割および調節機構はまだ不十分にしか理解されていないままである。さらに、ＲＩＮＧ Ｅ３ｓは最近、標的化されたタンパク質分解戦略（例は、ＰＲＯＴＡＣ方法論）に適合することが示された（Ｎａｉｔｏ（ナイト）， Ｍ．， Ｏｈｏｋａ（オホカ）， Ｎ．， およびＳｈｉｂａｔａ（シバタ）， Ｎ．（２０１９）． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ（ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ：テクノロジーズ）， ３１， ３５－４２；Ｓｐｒａｄｌｉｎ（スプラドリン）， Ｊ．Ｎ．ら（２０１９）． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（ネイチャー・ケミカル・バイオロジー）１５， ７４７－７５５；Ｗａｒｄ（ウォード）， Ｃ．Ｃ．ら（２０１９）． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（ＡＣＳケミカル・バイオロジー））。臨床的情況においてどのＲＩＮＧ Ｅ３ｓが活性であるかを決定するためのツールは、この潜在能力をさらに強化するために必要である。
【0005】
アダプター様Ｅ３ｓの特質は、活性状態にあるとき、それらが動力学的なＥ２～Ｕｂ立体構造アンサンブルを明確な集団に向かってシフトし、そこではＥ２～Ｕｂコンジュゲートが折り返しまたは「閉じた」立体構造を採用することである（Ｄｏｕ（ドウ）， Ｈ．ら（２０１２ｂ）． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（ネイチャー・ストラクチュラル＆モレキュラー・バイオロジー）， １９， ８７６－８８３；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａ（プレハノヴォワ）， Ａ．ら（２０１２）． Ｎａｔｕｒｅ ４８９， １１５－１２０．；Ｐｒｕｎｅｄａ（プルネダ），Ｊ．Ｎ．ら（２０１２）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（モレキュラー・セル）， ４７， ９３３－９４２；Ｐｒｕｎｅｄａ，Ｊ．Ｎ．ら（２０１１）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（バイオケミストリー）５０， １６２４－１６３３；図１ａを参照）。この立体構造は、Ｅ２～Ｕｂ内のチオエステル結合を求核攻撃に対して活性化し、および効率的なアミノリシス活性のための要件である。ＲＩＮＧ Ｅ３活性は調節されることができ、および活性化状態への切り替えは、Ｕｂ成分とかみ合う構造的特長を獲得し、それによって閉じた立体構造の誘導を促進するＥ３によって達成される。例えば、ＲＩＮＧ Ｅ３ｓ、例えば、ＲＮＦ４およびＢＩＲＣ７などのようなものは、ＲＩＮＧドメインの二量化によって活性化され、そこでは第二のＲＩＮＧプロトマーの尾部領域がＵｂ成分とかみ合う（Ｄｏｕ， Ｈ．ら， ２０１２ｂ；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａ， Ａ．ら， ２０１２， ｓｕｐｒａ（前掲））。二量化は細胞シグナルによって調節することができ、およびＲＮＦ４の場合、これはポリＳＵＭＯ鎖への結合によってもたらされる（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ（ロハス・フェルナンデス）， Ａ．らＭｏｌ Ｃｅｌｌ， ５３， ８８０－８９２）。
【0006】
単量体ＲＩＮＧ Ｅ３ｓの活性化について、いわゆる非ＲＩＮＧ要素がＵｂ成分を結合することでの役割を果たすことが示されており、ならびにＣｂｌ－ｂおよびｃ－Ｃｂｌの場合には、これはリン酸化チロシン残基である（Ｄｏｕ， Ｈ．らＮａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２０， ９８２－９８６）。リン酸化は増殖因子刺激に応答してキナーゼｃ－Ｓｒｃによって行われ、およびＣｂｌの活性化は受容体および非受容体チロシンキナーゼのユビキチン化および分解を誘発する。二量化を必要とするＲＩＮＧ Ｅ３ｓおよび非ＲＩＮＧ要素の存在もまた報告されている（Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓ（コリオプロス）， Ｍ．Ｇ．らＥＭＢＯ Ｊ（ザＥＭＢＯジャーナル）， ３５， １２０４－１２１８）。追加のＲＩＮＧ Ｅ３活性化機構は、アクセサリタンパク質またはリガンドのアロステリック結合を含め、存在する（ＤａＲｏｓａ（ダ・ローザ）， Ｐ．Ａ．らＮａｔｕｒｅ， ５１７， ２２３－２２６；Ｄｉｃｋｓｏｎ（ディクソン）， Ｃ．ら（２０１８）． Ｅｌｉｆｅ（イーライフ）， ７；Ｄｕｄａ（ドゥダ）， Ｄ．Ｍ．ら（２０１２）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ４７， ３７１－３８２；Ｗｒｉｇｈｔ（ライト）， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｃｅ（メース）， Ｐ．Ｄ．，およびＤａｙ（デイ）， Ｃ．Ｌ．（２０１６）． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２３， ４５－５２）。活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓに結合したＥ２～Ｕｂの非常に多くの結晶構造が解かれ、高度に保存された結合様式が明らかになった（Ｄｏｕ， Ｈ．ら２０１２ｂおよび２０１３；Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓ， Ｍ．Ｇ．ら２０１６；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａ， Ａ．ら２０１２；Ｗｒｉｇｈｔ， Ｊ．Ｄ．， Ｍａｃｅ， Ｐ．Ｄ．，およびＤａｙ， Ｃ．Ｌ．， ２０１６， 前掲）。重要なことに、閉じたＥ２～ＵｂコンジュゲートにおけるＵｂ成分のコンセンサス領域は活性化ＲＩＮＧの近傍となる。さらに、生物物理学的分析は、これまでに研究された活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓがそれらの不活性型よりもＥ２～Ｕｂについてより一層高い自由エネルギーの結合を有することができると実証する（Ｂｅｒｎｄｓｅｎ（ベルンセン），Ｃ．Ｅ．ら（２０１３）． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ９， １５４－１５６．；Ｂｕｅｔｏｗ（ビュータウ）， Ｌ．ら（２０１６）． ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．（ＢＭＣバイオロジー）１４， ７６）。
【0007】
活性ベースプローブ（ＡＢＰｓ）は、酵素ファミリーメンバーの活性依存的な共有結合標識化を受ける強力な化学的ツールである（Ｈｅｗｉｎｇｓ（ヘウィングス）， Ｄ．Ｓ．らＦＥＢＳ Ｊ．， ２８４， １５５５－１５７６；Ｎｉｐｈａｋｉｓ（ニファキス）， Ｍ．Ｊ．およびＣｒａｖａｔｔ（クラヴァット）， Ｂ．Ｆ．（２０１４）． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８３， ３４１－３７７）。これにより、以下のことが可能になる：（ｉ）酵素調節の研究、（ｉｉ）新規酵素クラスの発見、（ｉｉｉ）インヒビタースクリーニング、（ｉｖ）インヒビター選択性プロファイリング（ｖ）構造研究のための酵素中間体の安定化（Ｈｕ， Ｍ．らＣｅｌｌ（セル）， １１１， １０４１－１０５４）。我々および他の者はＣｙｓ Ｅ３ｓ用のＡＢＰｓを開発し、それはＥ３活性化機構を解明し、およびまったくの新規なＥ３クラスを発見するために展開されてきた（Ｌｏｖｅ（ラブ）， Ｋ．Ｒ．らＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ４， ２７５－２８７；Ｍｕｌｄｅｒ（ムルダー）， Ｍ．Ｐ．ら（２０１６）． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， １２， ５２３－５３０；Ｐａｏ， Ｋ．Ｃ．ら（２０１６）． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．， １２， ３２４－３３１；Ｘｕ（スー）， Ｌ．ら（２０１９）． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． （Ｃａｍｂ）（ケミカル・コミュニケーションズ（ケンブリッジ））， ５５， ７１０９－７１１２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らの知る限り、ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ活性を評価するＡＢＰｓは目下存在しない。本発明は、ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼを評価するＡＢＰｓを提供することによってこれに対処することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
（本発明の概略）
理論に縛られることなく、本発明者らは、閉じたＥ２～Ｕｂ内のＵｂ成分の保存された（および活性に依存した）コンセンサス相互作用が活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓについての結合の自由エネルギーの向上と相まって、ＡＢＰｓの開発のために利用することができたと考える。
理論に縛られることなく、本発明者らは、閉じたＥ２～Ｕｂ内のＵｂ成分の保存された（および活性に依存した）コンセンサス相互作用が活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓについての結合の自由エネルギーの向上と相まって、ＡＢＰｓの開発のために利用することができたと考える。
【0010】
工学的に作り出されたユビキチン分子に基づくＡＢＰｓをここに開示する。ユビキチンの３１位でのグルタミン残基および／または３２位でのアスパラギン酸残基の代わりに光架橋剤モイエティを含む活性化ユビキチン分子が、Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーションされたときにＡＢＰｓとして驚くほど有効であることが見出された。そのようなＡＢＰｓは、多様なサンプルタイプにおけるＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの活性プロファイリングに有効であり、および例えば、ＲＩＮＧ Ｅ３調節の研究、標的発見、バイオマーカー応用、モジュレーター発見および構造研究のために有用であり得る。
【0011】
したがって、第一の態様において、本発明は、ユビキチンの位置３１でのグルタミン残基および／または位置３２でのアスパラギン酸残基の代わりに光架橋剤モイエティを含む、活性化ユビキチン分子を提供する。
【0012】
第二の態様において、本発明はＥ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーションした第一の態様の活性化分子を含む、コンジュゲート分子を提供する。
【0013】
第三の態様において、本発明は、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングの方法における、第二の態様のコンジュゲーテッド分子の使用を提供する。
【0014】
第四の態様において、本発明は、第二の態様のコンジュゲート分子とＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素との間の相互作用を検出する方法を提供し、本方法は、第二の態様のコンジュゲート分子を前記ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素と接触させること、および任意の新しいコンジュゲートの形成を検出することが含まれる。例えば、コンジュゲートに濃縮可能なレポーター基、例えば、ビオチンなどのようなものを付加することによって、活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓを自然な細胞から濃縮し、および質量分析によって識別することができる。
【0015】
熟練した人は、本発明の一態様へのいかなる言及も、その態様のあらゆる実施態様を含むことを認識している。例えば、本発明の第一の態様への任意の言及は第一の態様および第一の態様のすべての実施態様を含む。
（図のリスト）
（図のリスト）
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1-1】図１：ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼについての光架橋ＡＢＰｓの生産のための戦略および合成スキーム。ａ）活性化ＲＩＮＧ Ｅ３の結合は、それ以外の立体構造的に動力学的なＥ２～Ｕｂコンジュゲートの閉じた立体構造を誘導する。活性化はＲＩＮＧの二量化によって達成されることができるが、単量体のＲＩＮＧ Ｅ３ｓは非ＲＩＮＧ要素（ＮＲＥ）の存在によって活性化することができる。Ｅ２～ＵｂのＵｂ成分はＲＩＮＧ／ＮＲＥ領域と相互作用する。ｂ）安定化Ｅ２～Ｕｂコンジュゲート内のｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）架橋アミノ酸の賢明な（ｊｕｄｉｃｉｏｕｓ）組込みは、ＲＩＮＧ Ｅ３活性のためのＡＢＰとして機能する。ｃ）活性化した、二量体ＲＩＮＧ Ｅ３（ＲＮＦ４）との複合体でのＥ２～Ｕｂの結晶構造である。活性化Ｅ３に近接近するＵｂ内の１０のアミノ酸部位をＢｐａ組込みについてテストした。Ｑ３１は最適であることが見出された。ｄ）ＡＢＰを光架橋するための合成スキームである。
【図2-1】図２：光ＡＢＰｓおよびビオチンタグ付き光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１プローブの組み立ておよび特徴付け。ａ）ＵｂＢｐａ３１のＥ２（ＵＢＥ２Ｄ３ Ｃ８５Ｋ Ｓ２２Ｋ二重変異体）へのユビキチンＥ１活性化酵素による代表的酵素のコンジュゲーションのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。アスタリスクは推定されるジユビキチン種に対応する。ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後のプローブ生産物の代表的な精製画分である。ｃ）精製した光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１についてのＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムである。ｄ）光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の絡まりを解いた（Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ、デコンボリューションした）質量スペクトラムである。観察した質量＝２７９０１Ｄａ、観察した質量（－Ｍｅｔ）＝２７７７１ Ｄａ。期待した質量＝２７９０８．８７ Ｄａ、期待した質量（－Ｍｅｔ）＝２７７７．６７ Ｄａ。
【図3-1】図３：ＲＮＦ４ Ｅ３リガーゼ活性の活性依存的プロファイリング。ａ）構成的に活性なＲＮＦ－ＲＩＮＧ融合タンパク質は２つのＥ２～Ｕｂコンジュゲートを生産的にかみ合わせることができる。ｂ）プローブ光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１（４０μＭ）はＲＮＦ４－ＲＩＮＧ（１０μＭ）により二つの架橋反応を受ける。ｃ）一方または両方のＥ２～Ｕｂコンジュゲートのかみ合わせはＲＮＦ－ＲＩＮＧでの片方または両方のＲＩＮＧドメイン中に導入されたＭ１４０Ａ Ｒ１８１Ａ二重変異により妨害することができる。ｄ）プローブの光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１（４０μＭ）の架橋は一方または両方のＲＩＮＧドメインが変異しているかどうかによって減衰または消失する。ｅ）Ｅ２成分中へのＦ６２Ａ変異の導入はＥ３結合を失わせるべきである。ｆ）架橋は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａ（プローブ濃度５μＭ）により消失される。ｇ）二量化についてＫｄ未満の濃度では、ＲＮＦ４は不活性である。ポリＳＵＭＯ鎖の結合は二量化およびＥ３リガーゼ活性を誘導する。ｈ）光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１（５μＭ）は自然なＲＮＦ４（１００ｎＭ）のポリＳＵＭＯ鎖（１０μＭ）依存架橋を受けるが、ＲＩＮＦ４－ＲＩＮＧ（５０ｎＭ）はポリＳＵＭＯ鎖に依存せず架橋する。
【図4-1】図４：ＥＧＦ刺激対非刺激のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｃ－Ｃｂｌ Ｅ３リガーゼ活性の活性依存的なプロファイリングおよび活性に基づくプロテオーム解析。ａ）ｃ－Ｓｒｃ（１．５μＭ）によりプレインキュベーションしたｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）だけが光ＡＢＰ Ｂｐａ３１（５μＭ）の架橋を受ける。架橋は、Ｃｂｌ Ｙ３７１（３μＭ）（それは活性化部位でリン酸化することができない）をＳｒｃと共にインキュベートするとき、観察されない。Ｃｂｌのリン酸化は電気泳動移動度での低下をもたらす。ｂ）哺乳類ＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ－Ｃｂｌおよびｃ－Ｓｒｃの一過性過剰発現である。抽出物を光ＡＢＰ３１ Ｂｐａ３１またはＦ６２Ａコントロールプローブ（５μＭ）により処理した。ＩＢは免疫ブロットを示し、および検出に使用した一次抗体は隣接する（即ち、抗Ｃｂｌ）。ｃ）光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１または光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブ（１０μＭ）のいずれかによるＨＥＫ２９３Ｔ抽出物の免疫ブロット分析である。ブロッティングはＡＢＰｓ内に存在するヘキサヒスチジンレポータータグに対して行った。サンプルは６０分間照射し、または照射を控えた。ｄ）ビオチン化光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１を用いた活性ベースプロテオミクスワークフローを描く模式図である。ｅ）ＡＢＰプロファイルされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られたスペクトルカウント値である。検索結果はＰＦＡＭドメイン用語「ＲＩＮＧ」に対してフィルタリングされ、および任意の複製実験において＞２スペクトルカウント値を有するＲＩＮＧ Ｅ３ｓだけをプロットした。細胞は血清飢餓状態にし、およびＥＧＦを伴うか、または伴わないでか、およびＵＶ照射を伴うか、または伴わないでかのいずれかで処理した。エラーバーは二回の技術的な反復ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析からの標準誤差に対応する。
【図5】活性化ＲＩＮＧ：Ｅ２～Ｕｂ複合体の構造的な重ね合わせ。活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓはＥ２～Ｕｂを結合し、およびアミノリシスについてチオエステルを活性化する「閉じた」Ｅ２～Ｕｂ立体構造を誘導する（ＮＢ（注）、提示した結晶構造では、Ｅ２触媒システインのセリンまたはリジンそれぞれへの変異によって、不安定なチオエステルがエステルまたはイソペプチド連結に置き換えられた）。閉じた立体構造はＲＩＮＧが混成物Ｅ２～Ｕｂの界面に結合することによって誘導される。特に重要なことに、ＲＮＦ４およびＢＩＲＣ７の場合、Ｕｂ成分はＲＩＮＧプロトマー２との相互作用によって閉じた立体構造において保持される。Ｃｂｌ－ｂについて、リン酸化チロシンモイエティ（ｐＴｙｒ）は非ＲＩＮＧ要素として機能し、および閉じた立体構造を促進する。ＴＲＩＭ２５の場合、二量化および非ＲＩＮＧのグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基の存在は閉じた立体構造を促進する。
【図6】光架橋アミノ酸ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）のユビキチンのＲＩＮＧ近位部位への組込みである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびクーマシー染色による視覚化である。陽性コントロールとして、参照アミノ酸であるｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ）を位置６にてＵｂ中に組み込んだ。精製を促進するために、Ｃ末端のＨｉｓタグをＵｂに付加し、それはその後、脱ユビキチン化酵素ＵＣＨ－Ｌ３で処理することによって除去した。各変異について、ＵＣＨ－Ｌ３処理前後のサンプルを分析した。
【図7-1】図７：ユビキチンＢｐａ変異についてのエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル。スペクトルはＣ末端Ｈｉｓ－ｔａｇの開裂後のＵｂに対応する。位置６についてのアンバー変異クローンを除き、ＵｂはＮ末端ＭＧＳモチーフと共に発現する。この促進したクローニングについてのＤＮＡコード配列の導入である。これらの後半部のクローンについて、Ｎ－末端のメチオニンは細胞のメチオニルアミノペプチダーゼによって様々な程度に開裂される。Ａ）ＵｂＢｐａ６、観察質量＝８６８６ Ｄａ；期待＝８７８７．９５ Ｄａ。Ｂ）ＵｂＢｐａ９（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８５７ Ｄａ；期待＝８８５９．１５ Ｄａ。ＵｂＢｐａ９、観察質量＝８９８８Ｄａ、期待＝８９９０．３５Ｄａ。Ｃ）ＵｂＢｐａ１１（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８３０Ｄａ；期待＝８８３２．０８Ｄａ。ＵｂＢｐａ１１、観察質量＝８９６１Ｄａ、期待＝８９６３．２８Ｄａ。Ｄ）ＵｂＢｐａ１３（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８４５Ｄａ；期待＝８８４７．１Ｄａ。Ｅ）ＵｂＢｐａ１４（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８５７ Ｄａ；期待＝８８５９．１５ Ｄａ。ＵｂＢｐａ１４、観察質量＝８９８８Ｄａ、期待＝８９９０．３５Ｄａ。Ｆ）ＵｂＢｐａ３１（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８３０Ｄａ；期待＝８８３２．１２Ｄａ。ＵｂＢｐａ３１、観察質量＝８９６１Ｄａ、期待＝８９６３．３２Ｄａ。Ｇ）ＵｂＢｐａ３２（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８４５Ｄａ；期待＝８８４５．１７Ｄａ。ＵｂＢｐａ３２、観察質量＝８９７６Ｄａ、期待＝８９７６．３７Ｄａ。Ｈ）ＵｂＢｐａ３４（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８３０Ｄａ；期待＝８８３１．１４Ｄａ。ＵｂＢｐａ３４、観察質量＝８９６１ Ｄａ；期待＝８９６２．３４ Ｄａ。Ｉ）ＵｂＢｐａ４０（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８３１ Ｄａ；期待＝８８３２．１２ Ｄａ。ＵｂＢｐａ４０、観察質量＝８９６２Ｄａ、期待＝８９６３．３２Ｄａ。Ｊ）ＵｂＢｐａ６４（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８３０ Ｄａ；期待＝８８３１．１４ Ｄａ。ＵｂＢｐａ６４、観察質量＝８９６１Ｄａ、期待＝８９６２．３４Ｄａ。Ｋ）ＵｂＢｐａ７２（－Ｍｅｔ）、観察質量＝８８０３ Ｄａ；期待＝８８０４．０７ Ｄａ。８８３６ Ｄａにて観察されたピークは未識別の付加物に相当する。
【図8】光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１を与えるための安定化イソペプチド連結を介したＵｂＢｐａ３１のＥ２への代表的な酵素的コンジュゲーション。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびクーマシー染色による視覚化（上部）である。プローブ産物はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（下部）。
【図9】光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１についての代表的なＬＣ－ＭＳ分析である。２１４ｎｍにて測定したＨＰＬＣクロマトグラムである。光ＡＢＰ Ｂｐａ３１（－Ｍｅｔ）、観察質量＝２７７６９Ｄａ；期待質量＝２７７７７．６７Ｄａ。光ＡＢＰ Ｂｐａ３１（－Ｍｅｔ）、観察質量＝２７９０１Ｄａ；期待質量＝２７９０８．８７Ｄａ。
【図10】イソペプチド連結Ｅ２～Ｕｂコンジュゲート内の１０の異なるＵｂ位置にＢｐａを組み込んだ場合のＲＮＦ４－ＲＩＮＧ光架橋効率の評価である。Ｂｐａを位置３１に組み込んだ場合だけ有意な組込みが達成され、プローブ光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１が与えられた。参照アミノ酸のｔ－ブチルオキシカルボニル－Ｌ－リジン（ＢｏｃＫ）およびＢｐａはこの部位が非自然アミノ酸の組込みに非常に寛容であるため、位置６に組込まれ、およびコントロールとして働いた。
【図11】ＲＮＦ４－ＲＩＮＧの用量反応性光架橋である。ＲＮＦ４－ＲＩＮＧの光架橋効率は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の上昇する濃度に反応した。
【図12】リン酸化ｃ－Ｃｂｌと光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１および光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブとの光架橋である。精製ｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）をｃ－Ｓｒｃ（１．５μＭ）と共にＡＴＰ（５ｍＭ）存在下で３７℃にて４５分間プレインキュベートした。反応混合物を次に指定されたプローブ（５μＭ）でプロファイリングした。プローブ光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１はｃ－Ｃｂｌ架橋を受けるが、光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１Ｆ６２Ａはそうでない。
【図13】ユビキチン内の複数の位置でのＢｐａ組込についての光架橋効率の比較である。プローブ分析に先立ちｃ－Ｓｒｃ（１．５ ３μＭ）とのインキュベーションによってｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）をリン酸化した。位置３１および位置３２でのＢｐａの組込みだけが機能的なプローブを与える。
【図14】Ｃｂｌ架橋の用量反応分析である。Ｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）はプローブ分析に先立ちｃ－Ｓｒｃ（１．５μＭ）とインキュベーションすることでリン酸化した。５μＭを超えて増加する光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の濃度の結果として、Ｃｂｌ標識効率での増加は観察されなかった。
【図15】ｃ－Ｓｒｃ処理したｃ－ＣｂｌのＰｈｏｓｔａｇ（フォスタグ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。ｃ－Ｃｂｌの低下した電気泳動移動度はＡＴＰ存在下でだけ観察される。ゲルシフトが定量的であることから、これはリン酸化も定量的でなければならないことを指し示す。しかし、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１による架橋効率は５μＭを超えると用量反応性でなかった。このことは、ｃ－Ｃｂｌが複数の部位でリン酸化されることになるが、Ｙ３７１では準化学量論的であることと矛盾しない。
【図16】細胞Ｃｂｌの光架橋はＹ３７１の存在に厳密に依存したままである。Ｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）はプローブ分析に先立ちｃ－Ｓｒｃ（１．５μＭ）とインキュベートすることによってリン酸化した。Ｃｂｌ標識効率は５μＭを超えて増加する光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の結果として観察された。これは、Ｙ３７１での準化学量論的なリン酸化に起因するかもしれない。
【図17-1】図１７：Ｃｙｓタグ付きＵｂＢｐａ３１のビオチン標識化およびＥ２への酵素コンジュゲーション。Ｎ末端ＭＧＣＳＳＧ標識モチーフと共に発現したＵｂＢｐａ３１のＬＣ－ＭＳ特性である（観察質量＝８９４７ Ｄａ；期待質量＝８９４８．２ Ｄａ）（左上）。システイン標識モチーフはＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ－ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ－連結ヨードアセチル－ＰＥＧ２－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））によりアルキル化した。生成物は分取ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、およびＬＣ－ＭＳによって特徴付けた（観察質量＝９３６０ Ｄａ；期待質量＝９３６２．７２ Ｄａ）（右上）。リフォールドしたビオチンタグＵｂＢｐａ３１をＥ２上に酵素的にコンジュゲートさせ、およびプローブをサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（下部）。
【図18】ビオチン－光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１のＬＣ－ＭＳ分析である。２１４ｎｍにて測定したＨＰＬＣクロマトグラムである。光ＡＢＰ Ｂｐａ３１（－Ｍｅｔ）、観察質量＝２８３０１ Ｄａ；期待質量＝２８３０８．２７ Ｄａ。
【図19-1】図１９：受容体チロシンキナーゼ活性化の確認および非ＲＩＮＧ Ｅ３光架橋の評価。ａ）ＥＧＦ依存性受容体活性化はＥＲＫ１／２リン酸化についての免疫ブロッティングによって確認する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を血清飢餓状態にし、および組換えＥＧＦにより刺激した。細胞は刺激に先立ちプロテアソームインヒビターＭＧ１３２により処理した。Ｎ． Ｂ．（注意）、プロテオミクス実験のために、細胞はＭＧ１３２およびバフィロマイシンにより処理した。ｂ）ビオチン化光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１を用いた活性ベースのプロテオミクスによる他のユビキチンシステム構成要素の検出である。ＡＢＰプロファイルされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から得られたスペクトルカウント値である。検索結果はＰＦＡＭドメイン用語「ＨＥＣＴ、ＩＢＲおよびｚｆ－ＵＢＲ」に対してフィルタリングし、および任意の複製実験における＞２のスペクトルカウント値を有するＲＩＮＧ Ｅ３ｓだけをプロットした。細胞は血清飢餓状態であり、およびＥＧＦを伴うか、または伴わないか、およびＵＶ照射を伴うか、または伴わないかのどちらかでも処理した。エラーバーは二回の技術的な反復からの標準誤差に対応する。ｃ）上記のようであるが、ＤＵＢｓはＰＦＡＭドメイン用語およびマニュアルキュレーションの組合せを用いてフィルタリングした。
【図20】ＵＢＥ２Ｎ／Ｕｂｃ１３光架橋活性ベースのプローブがＵＶ依存的マナーにおいてその同族Ｅ３ ＴＲＡＦ６の共有結合標識化を受けることの確認である。実験はまたＵＢＥ２Ｎ基質受容体（Ｕｂｅ２Ｖ２）存在下においても行った。その存在はＴＲＡＦ６に対する活性に影響を与えないようであった。
【発明を実施するための形態】
【0017】
（本発明の詳細な記載）
不安定なシステインチオエステルがより一層安定な連結化学、例えば、リジンイソペプチド（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａ， Ａ．ら、２０１２、前掲）などのようなもので置換されている工学的に作り出されたＥ２～Ｕｂコンジュゲートに基づくＡＢＰｓはここに開示されている。
不安定なシステインチオエステルがより一層安定な連結化学、例えば、リジンイソペプチド（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａ， Ａ．ら、２０１２、前掲）などのようなもので置換されている工学的に作り出されたＥ２～Ｕｂコンジュゲートに基づくＡＢＰｓはここに開示されている。
【0018】
本発明の活性化ユビキチン分子は、Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーティングされるとき、ＡＢＰｓとして驚くほど有効である。本発明のＡＢＰｓは多様なサンプルタイプにおけるＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングにおいて有効である。次に、本発明の活性化ユビキチン分子、コンジュゲート、使用および方法を詳細に説明する。
【0019】
以下の議論において、多くの用語が参照され、それらは文脈が反対のことを示さない限り、以下に規定される意味を有する。化合物、特に本発明による分子を規定するためにここで使用される命名法は、一般に、化学物質の化合物に関するＩＵＰＡＣの規則、特に「ＩＵＰＡＣ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ（化学用語法のＩＵＰＡＣ摘要）（Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ（ゴールド・ブック））」に基づく。
【0020】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」またはその変形は、述べられた要素、完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）またはステップ、または要素、完全体またはステップの群の包含を意味し、および任意の他の要素、完全体またはステップ、または要素、完全体またはステップの群を除外するものではないと理解されるであろう。
【0021】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ（からなること）」またはその変形は、述べられた要素、完全体またはステップ、または要素、完全体またはステップの群の包含、および任意の他の要素、完全体またはステップ、または要素、完全体またはステップの群の除外を意味すると理解されるであろう。
【0022】
用語「アリール」は当技術においてよく知られ、およびアレーン環状炭素から水素原子を除去することによって形成されるすべての１価の基を規定する。用語「アレーン」は単環式および多環式芳香族炭化水素を規定する。
【0023】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族系に特徴的な連続的π－電子系を維持するような方法で、１またはそれらよりも多くの（１以上の）メチン（－Ｃ＝）および／またはビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）基がそれぞれ３価または２価のヘテロ原子によって置き換えられたアリールを規定する。
【0024】
「アルキル」という用語は当技術においてよく知られ、および任意の炭素原子から水素原子を除去することによってアルカンから誘導される１価の基を規定し、そこで「アルカン」という用語は一般式ＣｎＨ２ｎ＋２を有する環状または非環状の分枝または非分枝の炭化水素を規定することを意図し、式中ｎは整数≧１である。
【0025】
「ヒドロカルビル」という用語は当技術でよく知られ、および炭化水素から水素原子を除去することによって形成されるすべての１価の基を規定する。用語「炭化水素」は等しくよく知られ、およびここでは、分枝、非分枝、非環状および環状のアルカン、アルケンおよびアルキンを含めて、炭素および水素だけからなるすべての脂肪族および芳香族化合物を意味する。疑問を回避するために、シクロアルカンおよびシクロアルケンはこの炭化水素の規定の範囲内にある。
【0026】
「ハロ」という用語は当技術でよく知られ、および炭素ラジカルに結合するとき、フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物化合物を作るハロゲンラジカルを規定する。
【0027】
本発明の活性化ユビキチン分子は、ユビキチンの位置３１にてのグルタミン残基および／または位置３２にてのアスパラギン酸残基に代えて光架橋剤モイエティを含む。ユビキチンは、次の配列を有する７６個のアミノ酸からなる（配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ：１））。
【化1】
【0028】
位置３１にてのグルタミン残基および／または位置３２にてのアスパラギン酸残基（上記配列において下線が付され、および太字にされる）を光架橋剤モイエティに置換すると、活性化ユビキチン分子およびＥ２コンジュゲーティング酵素（下記参照）間の驚くほど効果的な光架橋がもたらされる。
【0029】
いくらかの実施形態において、光架橋剤モイエティはユビキチンの３１位でのグルタミン残基または３２位でのアスパラギン酸残基の代わりに存在する。ある実施形態では、光架橋剤モイエティはユビキチンの３１位でのグルタミン残基の代わりにある。
【0030】
光架橋剤モイエティはユビキチンの３１位でのグルタミン残基および／または３２位でのアスパラギン酸残基を置換すること、および光子での照射により、ユビキチン分子およびＥ２コンジュゲーティング酵素間にリンカーを形成することでの能力がある任意のモイエティであり得る。なるべくなら、活性化ユビキチン分子は光子の不存在下で安定であり、それは使用前に適切な条件下で貯蔵することが許される。いくらかの実施形態では、活性化ユビキチン分子は自然光の存在下で安定であり、および更なる実施形態では、視感度を高めるために使用される自然照明および室内人工照明（即ち、主に可視光線を含む典型的な家庭用照明）の存在下で安定である。
【0031】
ここにおいて、「安定」は経時的に生じる材料または物質の化学的分解の量が材料または物質を実用上使用不能にするほど深刻でないことを意味するのに使用する。このことは、材料または物質のある程度の化学的分解が許容され、無視できる化学的分解から分解していない材料または物質の量が実用的用途に耐え得るレベルの化学的分解にまで及ぶ。
【0032】
熟練した人（当業者とも言う）は、活性化ユビキチン分子の貯蔵についてどのような条件が適しているかを評価することが可能である。例えば、活性化ユビキチン分子が光子の不存在下では安定であるが自然光の存在下ではそうでない場合、熟練した人は分子を暗所において貯蔵すべきであること；および活性化ユビキチン分子が室温にて不安定である場合、分子が冷蔵庫において貯蔵されるべきであることを認める。
【0033】
一定の実施形態では、光架橋剤モイエティは、非自然アミノ酸、即ち、全体的または部分的に合成であり得る修飾された自然アミノ酸である。典型的には、非自然アミノ酸は、光子による照射によりユビキチン分子およびＥ２コンジュゲーティング酵素間にリンカーを形成する能力がある官能基を有する自然アミノ酸の修飾から導き出される。
【0034】
いくらかの実施形態では、非自然アミノ酸は、ジアリールケトン、ジアジリン、アリールアジド、ジアリール／ヘテロアリールケトン、ジヘテロアリールケトン、ヘテロアリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールからなる群より選ばれる任意の一またはそれよりも多くの組合せを含む。一定の実施形態では、非自然アミノ酸は、ジアリールケトン、ジアジリン、アリールアジド、ジアリール／ヘテロアリールケトン、ジヘテロアリールケトン、ヘテロアリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールからなる群より選ばれる１種の官能基を含む。非自然アミノ酸がジアリールケトン、アリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールを含むとき、アリールは随意に置換され、およびフェニルまたはナフタレニルからなる群より選ばれてもよい。非自然アミノ酸がジアリール／ヘテロアリールケトン、ジヘテロアリールケトンおよびヘテロアリールアジドを含むとき、ヘテロアリールは随意に置換され、およびインドリル、イミダゾリル、ピリジル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選ばれてもよい。
【0035】
アリールまたはヘテロアリールは、Ｃ１－４ヒドロカルビル、Ｃ１－４アルキルオキシ、Ｃ１－４ハロアルキル、ヒドロキシおよびハロからなる群より選ばれる任意の１または組合せにより１以上の炭素原子にて置換されていてもよい。いくらかの実施形態では、ハロはフルオロである。一定の実施形態では、アリールまたはヘテロアリールは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシおよびフルオロからなる群より選ばれる任意の１つまたは組合せにより随意に置換される。
【0036】
いくらかの実施形態では、非自然アミノ酸は、ジアリールケトン、ジアジリンおよびアリールアジドからなる群より選ばれる官能基の任意の１つまたは組合せを含む（Ｐｈａｍ（ファム）Ｎ． Ｄ．， Ｐａｒｋｅｒ（パーカー）Ｒ． Ｂ．， Ｋｏｈｌｅｒ（ケーラー）Ｊ． Ｊ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．（カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー），（２０１３）， １７， １， ９０－１０１；Ｋａｕｅｒ（カウアー）， Ｊ． Ｃ．， Ｅｒｉｃｋｓｏｎ－Ｖｉｉｔａｎｅｎ（エリクソン－ビタネン）Ｓ．， Ｗｏｌｆｅ（ウルフ）Ｈ． Ｒ．， ＤｅＧｒａｄｏ（デ・グラード）Ｗ． Ｆ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー），（１９８６）， ２６１， ２３， １０６９５－１０７００）。
【0037】
特定の実施形態において、非自然アミノ酸はジアリールケトンを含む。しばしば、ジアリールケトンは、ベンゾフェノン、メチルベンゾフェノン、ジメチルベンゾフェノン、メトキシベンゾフェノン、ジメトキシベンゾフェノン、ｔｅｒｔブトキシベンゾフェノン（ｔｅｒｔｂｕｔｏｘｙｂｅｎｚｏｐｈｅｎｏｎｅ）、ジｔｅｒｔブトキシベンゾフェノン、トリフルオロメチルベンゾフェノン、ジ（トリフルオロメチル）ベンゾフェノン、テトラキス（トリフルオロメチル）ベンゾフェノン、ヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、トリヒドロキシベンゾフェノン、フルオロベンゾフェノン、ジフルオロベンゾフェノンおよびトリフルオロベンゾフェノンからなる群より選ばれる任意の１つである。
【0038】
一定の実施形態では、非自然アミノ酸はベンゾフェノンを含む。多くの場合、非自然アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジンからなる群のうちの任意の１つから導き出される。具体的な実施形態では、非自然アミノ酸はフェニルアラニンから誘導される。
【0039】
具体的な実施形態では、光架橋剤モイエティはｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニンである。
【0040】
本発明の活性化ユビキチン分子は任意の真核生物からのユビキチンに由来し得る。しかしながら、典型的には、本発明でのユビキチンは、動物、例えば、哺乳類に由来する。いくらかの実施形態において、本発明の活性化ユビキチン分子はヒトに由来する。
【0041】
本発明の活性化ユビキチン分子はレポータータグを含み得る。レポータータグの目的は活性化ユビキチンの分析的検出を可能にすることである。したがって、検出、例えば、蛍光によってのために、ユビキチンに結合するのに適した任意のタグを採用し得る。
【0042】
いくらかの実施形態では、レポータータグは、ビオチン、エピトープおよびフルオロフォアからなる群より選ばれる任意の１つ、または組合せを含む。エピトープは、特定のエピトープに結合する普通の抗体によって認識される。レポータータグがエピトープを含むとき、それは抗体と結合することが可能であり、および活性化されたユビキチン分子の局在化、精製および分子的な特徴付けが許容される。エピトープには、Ｍｙｃ－ｔａｇ（タグ）、ＨＡ－ｔａｇ、ＦＬＡＧ－ｔａｇ、ＧＳＴ－ｔａｇ、６ｘＨｉｓ、Ｖ５－ｔａｇおよびＯＬＬＡＳが含まれる。
【0043】
フルオロフォアは蛍光性タグである。レポータータグがフルオロフォアを含むとき、本発明の活性化ユビキチン分子は蛍光顕微鏡または肉眼で検出され得る。フルオロフォアには、フルオレセイン；緑色蛍光タンパク質、例えば、最適化Ｓ６５Ｔ変異、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、モノマーＡ２０６Ｋ変異、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ（エメラルド）、Ｔａｇ（タグ）ＢＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３（ｍセルーリアン３）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ／ｍＶｅｎｕｓ（ｍシトリーン／ｍビーナス）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄトマト）、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍチェリー）、ｍＡｐｐｌｅ（ｍアップル）、ｍＫａｔｅ２（ｍケート２）およびｍＮｅｐｔｕｎｅ（ｍネプチューン）；ＦＬＡｓＨ－ＥＤＴ２およびＲｅＡｓＨ－ＥＤＴ２が含まれる。
【0044】
レポータータグがビオチンを含むとき、それは、活性化ユビキチン分子の局在化、精製および分子的特徴付けを許容するためにその自然リガンド、即ち、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラビジンに結合することが可能である。自然リガンドは、それら自体、上に挙げたフルオロフォアのどれかを含む蛍光プローブ；酵素レポーター、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどのようなもの；または抗ビオチン抗体に結合していてもよい。
【0045】
レポータータグを含む活性化ユビキチン分子の検出は、蛍光顕微鏡（または肉眼）、電子顕微鏡、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、および／またはウェスタンブロットを介し得る。
【0046】
一定の実施形態では、レポータータグはビオチンモイエティである。これは、本発明のユビキチンまたは活性化ユビキチン分子に共有結合的に連結されてもよい。いくらかの実施形態では、ビオチンモイエティは、末端システイン－、セリン－、スレオニン－またはチロシン－含有モチーフを介してユビキチンまたは活性化ユビキチン分子に共有結合的に連結される。末端モチーフは、Ｃ末端またはＮ末端であってもよいが、典型的にはＮ末端である。一定の実施形態において、末端モチーフはＮ末端システイン含有モチーフである。より一層具体的な実施形態では、末端モチーフは配列ＭＧＣＳＳＧ（配列番号２）を有する。ビオチンおよびエピトープタグは、架橋され、活性化されたＲＩＮＧ Ｅ３ｓの濃縮を許容し、それらの識別、および質量分析によって活性の定量が可能にされる。
【0047】
本発明の第二の態様のコンジュゲート分子は、Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲートされた第一の態様の活性化分子を含む。ユビキチン化の間、ユビキチンは、Ｅ２において触媒システイン上に移され、標的タンパク質上のリジン残基へのその後のユビキチンの移動の前に、不安定なチオエステル連結Ｅ２中間体（Ｅ２～Ｕｂ）が形成される。
【0048】
本発明の活性化ユビキチン分子のＥ２コンジュゲーティング酵素からの解離を防ぐために、Ｅ２酵素の触媒システイン残基は、より一層安定なリンカーを形成する残基、例えば、リジン残基などのようなもので置換され得る。したがって、いくらかの実施形態では、Ｅ２コンジュゲーティング酵素は触媒システイン残基の代わりにリジン残基を含む。一定の実施形態では、Ｅ２コンジュゲーティング酵素の触媒システイン残基は位置８５にあり、即ち、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＣ８５Ｋ変異を含む。いくらかの実施形態では、Ｅ２コンジュゲーティング酵素の触媒システイン残基は位置８７にあり、即ち、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＣ８７Ｋ変異を含む。Ｅ２からのユビキチンの解離を防止する代替方法は、累進的により一層短い脂肪族側鎖を有する非自然リジン誘導体（即ち、ジアミノプロピオン酸、ジアミノ酪酸およびオルニチン）の組込みを含むかもしれない。
【0049】
いくらかのＥ２コンジュゲーティング酵素、例えば、ＵＢＥ２Ｄ３などのようなものは、ユビキチンと非共有結合を形成する能力があるセリン残基を追加的に含む。これらの相互作用は、あるコンジュゲート分子のユビキチンと別のコンジュゲート分子のＥ２コンジュゲーティング酵素との会合（自己会合）を増進する。コンジュゲート分子の自己会合を抑制するために、セリン残基はユビキチンと会合しない残基、例えば、アルギニン残基などのようなもので置換されていてもよい。一定の実施形態では、ユビキチンと非共有結合を形成する能力があるセリン残基は位置２２にあり、即ち、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＳ２２Ｒ変異を含む。
【0050】
いくらかのＥ２共役酵素、例えば、ＵＢＥ２Ｎなどのようなものは、ユビキチンにコンジュゲーティングする能力がある自然なリジン残基を追加的に含み、それゆえに、触媒システイン残基の位置または触媒システイン残基の前の位置ではなく、自然な残基にてユビキチンのコンジュゲーションが増進される（例は、そこでシステインがより一層安定なリンカー、例えば、リジンなどのようなもので置換されている）。自己会合はまた増進され得る。自然なリジン残基にてユビキチンのコンジュゲーションを抑制するために、自然なリジン残基はユビキチンと関係しない残基、例えば、アルギニン残基などのようなもので置換されてもよい。一定の実施形態では、自然なリジン残基は位置９２にあり、即ち、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＫ９２Ａ変異を含む。
【0051】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素は、ユビキチンと結合する能力がある任意のＥ２酵素であり得る。しかし、典型的に、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｄ３である。いくらかの実施形態では、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｄ３またはＵＢＥ２Ｎである。
【0052】
いくらかの実施形態では、Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＮ末端ヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグなどのようなものをもつ。これらのタグは、本発明のコンジュゲート分子の精製を容易にし、ならびにウェスタンブロット（別名、免疫ブロット）分析を介してコンジュゲート分子の検出が促進される。
【0053】
閉じたＥ２－Ｕｂ内のＵｂ成分の保存された（および活性依存性の）コンセンサス相互作用は、活性化ＲＩＮＧ Ｅ３ｓについての結合の自由エネルギーの向上と相まって、ＡＢＰｓの開発のために利用される。本発明のＡＢＰｓは、多様なサンプルタイプにおけるＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ、ＲＩＮＧ Ｅ１リガーゼおよび脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングにおいて有効である。
【0054】
したがって、第三の態様において、本発明は、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングの方法における第二の態様のコンジュゲーテッド分子の使用を提供する。一実施形態では、第二の態様のコンジュゲーテッド分子の使用は、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の活性プロファイリングの方法におけるものである。さらなる実施形態において、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２（プラジャ２）、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）およびＲＣＲ（１）の任意の一つまたは組合せである。例えば、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＮＦ４またはｃ－ＣＢＩであり得る。いくらかの実施形態では、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、およびＲＣＲ（１）、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せである。例えば、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＮＦ４、ｃ－ＣＢＩまたはＴＲＡＦ６であり得る。
【0055】
ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は単量体状態では不活性で、内因性濃度にて優勢である。ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の活性化は、ＲＩＮＧ二量化によって達成され得、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素のリガーゼ活性が導かれる（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ａ．ら， ２０１４、前掲）。あるいはまた、単量体ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は非ＲＩＮＧ要素（ＮＲＥｓ）によって活性化され得、例えば、Ｄｏｕ Ｈ．ら、２０１３、前掲を参照。Ｅ３酵素の活性化はユビキチン化を導き（図１ａ参照）、即ち、活性ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＥ２－Ｕｂに結合し（Ｅ２コンジュゲーティング酵素およびユビキチンを含むコンジュゲート）、閉じたＥ２－Ｕｂ立体構造が誘導される。
【0056】
活性なＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＩＮＧ Ｅ３またはＮＲＥを介して本発明のコンジュゲーテッド分子に結合し得る。結果として得られた複合体に照射すると、コンジュゲーテッド分子の光架橋剤モイエティはＲＩＮＧ Ｅ３またはＮＲＥに共有結合し得る（図１ｂを参照）。それゆえ、本発明のコンジュゲーテッド分子はＲＩＮＧ Ｅ３ ＡＢＰとして作用し得、そこで活性なＲＩＮＧ Ｅ３酵素が検出され、およびさらに特徴付けられ得る。
【0057】
第四の態様において、本発明は、第二の態様のコンジュゲート分子とＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素との間の相互作用を検出する方法を提供し、本方法は、第二の態様のコンジュゲート分子を前記ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素と接触させること、および任意の新しいコンジュゲートの形成を検出することが含まれる。
【0058】
ここで使用するとき、「接触すること」は本発明のコンジュゲート分子がＲＩＮＧ Ｅ３／ＲＩＮＧ Ｅ１／脱ユビキチン化酵素と相互作用することを許容する任意の手段に言及する。典型的には、接触させることは本発明のコンジュゲート分子およびＲＩＮＧ Ｅ３酵素を含む水溶液において起こる。
【0059】
照射により、コンジュゲーテッド分子の光架橋剤モイエティはＲＩＮＧ Ｅ３／ＲＩＮＧ Ｅ１／脱ユビキチン化酵素に共有結合し得る。本発明のコンジュゲーテッド分子が光子の存在下で不安定である場合、そのときコンジュゲーテッド分子の光架橋剤モイエティは任意の周波数の光子による照射によりその酵素に共有結合し得る。しかし、コンジュゲーテッド分子が自然光の存在下で安定である場合、共有結合について活性化ユビキチン分子と酵素との間に形成するために、自然光よりも高い周波数が必要な場合がある。典型的には、ＵＶ光、即ち、１０より４００ｎｍまでの範囲内の波長を有する光は光架橋剤モイエティを酵素に共有結合的に連結させるために使用される。
【0060】
熟練した人は、酵素とコンジュゲーテッド分子との間での共有結合の形成に必要な照射時間が様々な要因に依存することを認める。例えば、照射時間は、照射されるサンプルの濃度（より一層高濃度のサンプルはより一層長い照射時間を必要とすると考えられる）；サンプルを照射するために用いられる光の周波数（光架橋剤モイエティによって吸収される周波数に一致するものはより一層短い照射時間しか要しないと考えられる）；および照射源の出力（より一層大きな出力はより一層短い照射時間をもたらすと考えられる）によって影響を受け得る。本発明のコンジュゲーテッド分子および酵素は１より５０分までの間照射してもよい。いくらかの実施形態では、本発明のコンジュゲーテッド分子および酵素は１より４０分までの間照射される。典型的には、照射は１より３０分までの間である。
【0061】
酵素がＲＩＮＧ Ｅ３酵素であるとき、本発明のコンジュゲーテッド分子はＲＩＮＧ Ｅ３酵素の検出が有用であるあらゆる研究において使用し得る。これには、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素調節（ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の研究；新規ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の発見；インヒビター（抑制物質）のスクリーニング；インヒビターの選択性プロファイリングおよび／または構造研究のための酵素中間体の安定化が含まれる。
【0062】
本発明の方法の新しいコンジュゲートは、蛍光顕微鏡法（または肉眼）、電子顕微鏡法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ゲル電気泳動および／またはウェスタンブロットを含め、様々な方法を用いて検出し得る。多くの場合、分析方法の組合せが本発明の新しいコンジュゲートを検出するために使用される。熟練した人は本発明の新しいコンジュゲートの検出に適した方法がレポータータグを採用したか否か、および任意のレポータータグの同一性に応じて異なることを認める。例えば、ゲル電気泳動はサイズおよび電荷に従ってサンプル混合物から新しいコンジュゲートを分けるために使用され得、およびレポータータグが採用されるか否かに関係なく有用であり得る。しかしながら、蛍光顕微鏡は本発明のコンジュゲーテッド分子が蛍光レポータータグを含む場合にだけ、新しいコンジュゲートを識別するために使用され得る。
【0063】
本発明のコンジュゲート分子は任意の活性ＲＩＮＧ Ｅ３酵素と相互作用し得、即ち、本発明の使用および方法は、任意の特定のタイプのＲＩＮＧ Ｅ３酵素に制限されない。しかしながら、いくらかの実施形態では、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）およびＲＣＲ（１）酵素である。具体的な実施形態では、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はｃ－ＣｂＩ酵素である。いくらかの実施形態では、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、およびＲＣＲ（１）、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せである。例えば、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、ｃ－ＣＢＩまたはＴＲＡＦ６であり得る。
【0064】
ここにおける文書、法令、材料、装置、物品およびその他同種類のものなどに関するいかなる議論も、これらの事項のどれかまたはすべてが決して、先行技術基礎の一部を形成したり、または本出願の各クレームの優先日前に存在したかのように本開示に関連する分野における共通の一般知識であったりしたことの承認と解釈されることはない。
【0065】
本発明の範囲から離れることなくここに記載される本発明に対して多数の変形および／または修飾が説明したようになされ得ることは、本技術において熟練する者（当業者とも言う）には認識されるであろう。したがって、本実施形態類は、説明目的のために考慮されるべきであり、および制限的なものではなく、および実施形態に記載された範囲のものに制限されるものでもない。本技術において熟練する人は、本実施形態類が単独で、または組み合わせられて読まれてもよく、およびここに記載された特色の任意の一つまたは組合せと組み合わされてもよいことを理解すべきである。
【0066】
ここで引用した各特許および非特許文献の主題は、その全体が参照によりここに組み込まれる。
【0067】
本発明は以下の非制限的な項目に関してさらに理解され得る：
【0068】
１．ユビキチンの位置３１でのグルタミン残基および／または位置３２でのアスパラギン酸残基の代わりに光架橋剤モイエティを含む、活性化ユビキチン分子。
【0069】
２．光架橋剤モイエティはユビキチンの位置３１でのグルタミン残基または位置３２でのアスパラギン酸残基の代わりにある、項１の活性化ユビキチン分子。
【0070】
３．光架橋剤モイエティはユビキチンの位置３１でのグルタミン残基の代わりにある、項１の活性化ユビキチン分子。
【0071】
４．光架橋剤モイエティは非自然アミノ酸である、項１より３までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0072】
５．非自然アミノ酸はジアリールケトン、ジアジリン、アリールアジド、ジアリール／ヘテロアリールケトン、ジヘテロアリールケトン、ヘテロアリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールからなる群より選ばれる任意の一つまたは組合せを含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0073】
６．非自然アミノ酸はジアリールケトン、ジアジリン、アリールアジド、ジアリール／ヘテロアリールケトン、ジヘテロアリールケトン、ヘテロアリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールからなる群より選ばれる一種の官能基を含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0074】
７．非自然アミノ酸はジアリールケトン、ジアジリン、アリールアジドおよび２－アリール－５－カルボキシテトラゾールからなる群より選ばれる任意の一つの官能基を含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0075】
８．非自然アミノ酸はジアリールケトンを含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0076】
９．アリールは随意に置換され、およびフェニルまたはナフタレニルからなる群より選ばれ得；ヘテロアリールは随意に置換され、およびインドリル、イミダゾリル、ピリジル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選ばれ得る、項５より８までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0077】
１０．アリールまたはヘテロアリールはＣ１－４ヒドロカルビル、Ｃ１－４アルキルオキシ、Ｃ１－４ハロアルキル、ヒドロキシおよびハロからなる群より選ばれる任意の一つまたは組合せにより一またはそれよりも多くの炭素原子にて置換され得る、項５より９までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0078】
１１．ハロはフルオロである、項１０の活性化ユビキチン分子。
【0079】
１２．アリールまたはヘテロアリールはメチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、トリフルオロメチル、ヒドロキシおよびフルオロからなる群より選ばれる任意の一つまたは組合せにより随意に置換される、項５より９までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0080】
１３．非自然アミノ酸はベンゾフェノン、メチルベンゾフェノン、ジメチルベンゾフェノン、メトキシベンゾフェノン、ジメトキシベンゾフェノン、ｔｅｒｔブトキシベンゾフェノン、ジｔｅｒｔブトキシベンゾフェノン、トリフルオロメチルベンゾフェノン、ジ（トリフルオロメチル）ベンゾフェノン、テトラキス（トリフルオロメチル）ベンゾフェノン、ヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、トリヒドロキシベンゾフェノン、フルオロベンゾフェノン、ジフルオロベンゾフェノンおよびトリフルオロベンゾフェノンからなる群より選ばれるジアリールケトンを含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0081】
１４．非自然アミノ酸はベンゾフェノンを含む、項４の活性化ユビキチン分子。
【0082】
１５．非自然アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジンからなる群の任意の一つから導き出される、項４より１４までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0083】
１６．非自然アミノ酸はフェニルアラニンから導き出される、項４より１４までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0084】
１７．光架橋剤モイエティはｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニンである、項１より３までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0085】
１８．ユビキチンは動物からのものである、項１より１７までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0086】
１９．ユビキチンは哺乳類からのものである、項１より１７までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0087】
２０．ユビキチンはヒトからのものである、項１より１７までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0088】
２１．レポータータグをさらに含む、項１より２０までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0089】
２２．レポータータグはビオチン、エピトープおよびフルオロフォアからなる群より選ばれる任意の一つまたは組合せを含む、項２１の活性化ユビキチン分子。
【0090】
２３．項２２の活性化ユビキチン分子であって：
（ｉ）エピトープは、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＧＳＴ－タグ、６ｘＨｉｓ、Ｖ５－タグおよびＯＬＬＡＳから選ばれる任意の一つまたは組合せであり；および
（ｉｉ）フルオロフォアは、フルオレセイン、最適化Ｓ６５Ｔ変異、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、モノマーＡ２０６Ｋ変異、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｍＣｉｔｒｉｎｅ／ｍＶｅｎｕｓ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＫａｔｅ２およびｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＦＬＡｓＨ－ＥＤＴ２およびＲｅＡｓＨ－ＥＤＴ２から選ばれる任意の一つまたは組合せである。
（ｉ）エピトープは、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＧＳＴ－タグ、６ｘＨｉｓ、Ｖ５－タグおよびＯＬＬＡＳから選ばれる任意の一つまたは組合せであり；および
（ｉｉ）フルオロフォアは、フルオレセイン、最適化Ｓ６５Ｔ変異、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、モノマーＡ２０６Ｋ変異、スーパーフォルダーＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＴａｇＢＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ３、ｍＣｉｔｒｉｎｅ／ｍＶｅｎｕｓ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＫａｔｅ２およびｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＦＬＡｓＨ－ＥＤＴ２およびＲｅＡｓＨ－ＥＤＴ２から選ばれる任意の一つまたは組合せである。
【0091】
２４．レポータータグはビオチンモイエティである、項２１の活性化ユビキチン分子。
【0092】
２５．ビオチンモイエティは末端システイン－、セリン－、スレオニン－またはチロシン－含有モチーフを介してユビキチンまたは活性化ユビキチン分子に共有結合的に連結されている、項２４の活性化ユビキチン分子。
【0093】
２６．末端モチーフはＮ末端である、項２５の活性化ユビキチン分子。
【0094】
２７．末端モチーフはＮ末端システイン含有モチーフである、項２５の活性化ユビキチン分子。
【0095】
２８．末端モチーフは配列ＭＧＣＳＳＧを有する、項２５より２７までの任意の一つの活性化ユビキチン分子。
【0096】
２９．Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーティングされた、任意の一つの先行する項に従う活性化ユビキチン分子を含む、コンジュゲート分子。
【0097】
３０．Ｅ２コンジュゲーティング酵素は触媒に関するシステイン残基の代わりにリジン残基を含む、項２９のコンジュゲート分子。
【0098】
３１．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＣ８５ＫまたはＣ８７Ｋ変異を含む、項２９のコンジュゲート分子。
【0099】
３２．ユビキチンと非共有結合を形成する能力があるセリンまたはリジン残基はアルギニン残基により置換されている、項２９より３１までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0100】
３３．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＣ８５ＫおよびＳ２２Ｒ変異を含む、項２９より３０までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0101】
３４．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｄ３である、項２９より３３までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0102】
３５．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＣ８７ＫおよびＫ９２Ａ変異を含む、項２９より３０までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0103】
３６．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｎである、項２９より３２および３５までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0104】
３７．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＮ末端ヒスチジンタグをもつ、項２９より３６までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0105】
３８．Ｅ２コンジュゲーティング酵素はヘキサヒスチジンタグをもつ、項２９より３６までの任意の一つのコンジュゲート分子。
【0106】
３９．ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングの方法における項２９より３８までの任意の一つのコンジュゲーテッド分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ、コンジュゲーションした分子とも言う）の使用。
【0107】
４０．ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、ＲＣＲ（１）、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せであり、および脱ユビキチン化酵素はＤＵＢｓ（３１）である、項３９の使用。
【0108】
４１．活性プロファイリングはＲＩＮＧ Ｅ３酵素のものである、項３９または項４０に従う使用。
【0109】
４２．次のもののための項４１の使用：
（ｉ）ＲＩＮＧ Ｅ３酵素調節の研究；
（ｉｉ）新規ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の発見；
（ｉｉｉ）インヒビタースクリーニング；
（ｉｖ）インヒビター選択性プロファイリング；および／または
（ｖ）構造研究のための酵素中間体の安定化。
（ｉ）ＲＩＮＧ Ｅ３酵素調節の研究；
（ｉｉ）新規ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の発見；
（ｉｉｉ）インヒビタースクリーニング；
（ｉｖ）インヒビター選択性プロファイリング；および／または
（ｖ）構造研究のための酵素中間体の安定化。
【0110】
４３．項２９より３８までの任意の一つのコンジュゲート分子と、ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素との間の相互作用を検出する方法であって、方法は、コンジュゲート分子を前記ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素に接触させること、および任意の新しいコンジュゲートの形成を検出することを含む。
【0111】
４４．ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、ＲＣＲ（１）、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せであり、および脱ユビキチン化酵素はＤＵＢｓ（３１）である、項４３の方法。
【0112】
４５．相互作用はＲＩＮＧ Ｅ３酵素とのものである、項４３または４４の方法。
【0113】
４６．コンジュゲート分子の光架橋剤モイエティが前記ＲＩＮＧ Ｅ３／ＲＩＮＧ Ｅ１／脱ユビキチン化酵素に共有結合するように、コンジュゲート分子およびＲＩＮＧ Ｅ３／ＲＩＮＧ Ｅ１／脱ユビキチン化酵素に照射することをさらに含む、項４３より４５までの任意の一つの方法。
【0114】
４７．照射はＵＶ光によるものである、項４６の方法。
【0115】
４８．ＵＶ光は２００より４００ｎｍまでの範囲内の波長を有する、項４７の方法。
【0116】
４９．ＲＩＮＧ Ｅ３酵素はＲＮＦ４、ＣｂＩまたはＴＲＡＦ６酵素である、項４５より４８までの任意の一つの方法。
【0117】
５０．ＣｂＩ酵素はｃ－ＣｂＩ酵素である、項４９の方法。
【0118】
本発明は以下の非制限的な例によってさらに説明される。
【実施例】
【0119】
二つのガン関連ＲＩＮＧ Ｅ３ｓ、ＲＮＦ４およびｃ－Ｃｂｌの活性依存性プロファイリングをそれらの自然な活性化シグナルに応じて実証する。ＲＮＦ４はポリＳＵＭＯ鎖誘導二量化によって活性化され、その一方でｃ－Ｃｂｌはチロシンリン酸化によって活性化される。ビオチンレポータータグ付きコンジュゲートと質量分析を組み合わせることにより、細胞の自然なＲＩＮＧ Ｅ３活性の並行した測定を行うことができることが実証される。さらに、細胞摂動（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）（例は、増殖因子刺激）により別個のＲＩＮＧ Ｅ３ｓの細胞活性化を識別することができる。本発明のコンジュゲート分子は、Ｅ３リガーゼ研究およびこの酵素クラスに対する選択的モジュレーターの開発を前進させる潜在能力を有する。
【0120】
（材料および方法）
（実験モデルおよび対象の詳細）
Ｈ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから取得した。２９３Ｔはヒト細胞系であり、ＨＥＫ２９３細胞株から導き出され、それはＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型（ｍｕｔａｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ）（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００６３）を発現する。細胞は５％ＣＯ２雰囲気下に加湿インキュベーター内で３７℃にて培養した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、およびウシ胎仔血清とＬ－グルタミンとを補った。
（実験モデルおよび対象の詳細）
Ｈ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから取得した。２９３Ｔはヒト細胞系であり、ＨＥＫ２９３細胞株から導き出され、それはＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型（ｍｕｔａｎｔ ｖｅｒｓｉｏｎ）（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００６３）を発現する。細胞は５％ＣＯ２雰囲気下に加湿インキュベーター内で３７℃にて培養した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用い、およびウシ胎仔血清とＬ－グルタミンとを補った。
【0121】
本研究においてタンパク質発現に用いたＢＬ２１（ＤＥ３）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリキア・コリ、大腸菌）ＢＬ２１ Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）（ロゼッタ（商標））（ＤＥ３）細胞はそれぞれ１００ｍＬ－１のアンピシリンと３４ｍＬ－１クロラムフェニコールとを補った１ＬのＬＢ培地を含む１Ｌフラスコにおいて培養した（詳細についてはＳＴＡＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ － Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（スターメソッヅ－組換えタンパク質の発現）を参照）。
【0122】
（方法の詳細）
（ユビキチンへのｐＢｐａ非自然アミノ酸の部位特異的組込み）
ｐＥｖｏｌ－ＢｐａプラスミドはｐＥＶＯＬ－ｐＢｏＦ（Ｐ． Ｓｃｈｕｌｔｚ（シュルツ）、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スクリプス・リサーチ研究所）によって好意により提供された）から導き出した。プラスミドｐＥＶＯＬ－Ｂｐａを作成するためにＢｐａの組込み用の変異をＭｊＹＲＳ遺伝子の両方のコピー中に導入した（Ｙｏｕｎｇ（ヤング）ら、２０１０；Ｃｈｉｎ（チン）ら、２００２）。ＢＬ２１細胞（５０μＬ）をｐＥＴ－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ｐＥＴ－ユビキチン）－６Ｈｉｓ－ＴＡＧｘ（そこでｘはＢｐａ組込み部位である）とｐＥｖｏｌ－Ｂｐａプラスミドとにより熱ショックを用いて共形質転換し、および２００μＬ ＳＯＣ培地において３７℃、１時間回収し、および１００μｇ ｍＬ－１アンピシリンと３４μｇ ｍＬ－１クロラムフェニコールとを含む５０ｍＬ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ルリア－ベルターニ）（ＬＢ）に接種するために使用した。次いで、１０ｍＬの夜通しの培養物を同じ濃度の抗生物質が含まれる１ＬのＬＢブロスに接種するために使用した。ＯＤ６００が～０．６になるまで細胞を増殖させ、および培養物を二つの５００ｍＬ部分に分けた。一方の部分は１ｍＭ ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ；Ｂａｃｈｅｍ（バッケム））により補い、および他方はＢｐａを与えないコントロールとして取り扱った。培養物は２０分間（３７℃、２００ｒｐｍ）、またはＯＤ６００が０．６－０．７に達するまでインキュベーションし、およびタンパク質発現は０．０２％アラビノースと１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とを加えることによって誘導した。培養物は５時間インキュベーションした（３７℃、２００ｒｐｍ）。細胞を収穫し、および５０ｍＬファルコンチューブに移す前に１０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（バグ・バスター・タンパク質抽出）（（Ｒ）は米国等での登録商標表示を示す）（Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルク・ミリポア））試薬において懸濁させた。溶解物を２０分間インキュベーションし、および次いで１ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズを含む５０ｍＬファルコンチューブに移す前に遠心分離により清澄化し、および穏やかに振盪しながら１時間インキュベーションした。樹脂を遠心分離し（４℃、１０００ｒｐｍ）、および洗浄緩衝剤（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、２５ｍＭイミダゾール）により洗浄した。最後に、タンパク質を２００μＬの溶出緩衝剤（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、３００ｍＭイミダゾール）により溶出させた。溶出画分からの２０μＬアリコートを等量の４Ｘ ＳＤＳ添加液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、および４－１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上にロードした。タンパク質はＭＥＳ緩衝剤を用いて２００Ｖで３０分間分け、およびクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色を用いて検出した。別々の２０μＬのタンパク質はＬＣ－ＭＳによって分析した。ＬＣ－ＭＳは、６１３０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ（四重極）スペクトロメーターにカップリングしたＭａｘ－Ｌｉｇｈｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（マックス－ライト・カートリッジ）フローセルを備えたＡｇｉｌｅｎｔ（アジレント）１２００ ＬＣ－ＭＳシステムにより行った。別なふうに述べない限り、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（アジレント・ゾルバックス）３００ＳＢ－Ｃ３ ５μｍ、２．１×１５０ｍｍカラムを採用した。溶媒系は、緩衝剤ＡとしてＨ２Ｏにおける０．０５％トリフルオロ酢酸、および緩衝剤Ｂとしてアセトニトリルにおける０．０４％ＴＦＡ酸から構成された。タンパク質ＵＶ吸収は２１４および２８０ｎｍにてモニターした。ＭＳ取得はポジティブイオンモードにおいて行い、および合計タンパク質質量はＭＳ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（ＭＳケムステーション）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アジレント・テクノロジーズ））内のデコンボリューションによって計算した。ｐＢｐａ組込み－Ｕｂを含む画分は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（アミコン・ウルトラ）－１５ ３ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））を用いてプール濃縮した（ｐｏｏｌｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）。サンプルはＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥライフ・サイエンシーズ））を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス－ＨＣｌ）ｐＨ７．５中に脱塩した。ＤＴＴ（１ｍＭ）をサンプルに添加し、次いで終濃度の１５μｇ ｍＬ－１にてＵＣＨ－Ｌ３（Ｖｉｒｄｅｅ（バーディー）ら、２０１０）によるヘキサヒスチジンタグ開裂を続けた。サンプルはＮ末端のＨｉｓタグを除去するために３７℃で２時間インキュベーションした。Ｂｐａ組込み－Ｕｂは半調製ＨＰＬＣによってさらに精製し、および画分は凍結乾燥し、およそ８－１０ｍｇのＵｂ－ｐＢｐａが産生された。
（ユビキチンへのｐＢｐａ非自然アミノ酸の部位特異的組込み）
ｐＥｖｏｌ－ＢｐａプラスミドはｐＥＶＯＬ－ｐＢｏＦ（Ｐ． Ｓｃｈｕｌｔｚ（シュルツ）、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（スクリプス・リサーチ研究所）によって好意により提供された）から導き出した。プラスミドｐＥＶＯＬ－Ｂｐａを作成するためにＢｐａの組込み用の変異をＭｊＹＲＳ遺伝子の両方のコピー中に導入した（Ｙｏｕｎｇ（ヤング）ら、２０１０；Ｃｈｉｎ（チン）ら、２００２）。ＢＬ２１細胞（５０μＬ）をｐＥＴ－Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ（ｐＥＴ－ユビキチン）－６Ｈｉｓ－ＴＡＧｘ（そこでｘはＢｐａ組込み部位である）とｐＥｖｏｌ－Ｂｐａプラスミドとにより熱ショックを用いて共形質転換し、および２００μＬ ＳＯＣ培地において３７℃、１時間回収し、および１００μｇ ｍＬ－１アンピシリンと３４μｇ ｍＬ－１クロラムフェニコールとを含む５０ｍＬ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ルリア－ベルターニ）（ＬＢ）に接種するために使用した。次いで、１０ｍＬの夜通しの培養物を同じ濃度の抗生物質が含まれる１ＬのＬＢブロスに接種するために使用した。ＯＤ６００が～０．６になるまで細胞を増殖させ、および培養物を二つの５００ｍＬ部分に分けた。一方の部分は１ｍＭ ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン（Ｂｐａ；Ｂａｃｈｅｍ（バッケム））により補い、および他方はＢｐａを与えないコントロールとして取り扱った。培養物は２０分間（３７℃、２００ｒｐｍ）、またはＯＤ６００が０．６－０．７に達するまでインキュベーションし、およびタンパク質発現は０．０２％アラビノースと１ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とを加えることによって誘導した。培養物は５時間インキュベーションした（３７℃、２００ｒｐｍ）。細胞を収穫し、および５０ｍＬファルコンチューブに移す前に１０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｒ） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（バグ・バスター・タンパク質抽出）（（Ｒ）は米国等での登録商標表示を示す）（Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルク・ミリポア））試薬において懸濁させた。溶解物を２０分間インキュベーションし、および次いで１ｍＬ Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズを含む５０ｍＬファルコンチューブに移す前に遠心分離により清澄化し、および穏やかに振盪しながら１時間インキュベーションした。樹脂を遠心分離し（４℃、１０００ｒｐｍ）、および洗浄緩衝剤（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、２５ｍＭイミダゾール）により洗浄した。最後に、タンパク質を２００μＬの溶出緩衝剤（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、３００ｍＭイミダゾール）により溶出させた。溶出画分からの２０μＬアリコートを等量の４Ｘ ＳＤＳ添加液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、および４－１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上にロードした。タンパク質はＭＥＳ緩衝剤を用いて２００Ｖで３０分間分け、およびクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）染色を用いて検出した。別々の２０μＬのタンパク質はＬＣ－ＭＳによって分析した。ＬＣ－ＭＳは、６１３０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ（四重極）スペクトロメーターにカップリングしたＭａｘ－Ｌｉｇｈｔ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（マックス－ライト・カートリッジ）フローセルを備えたＡｇｉｌｅｎｔ（アジレント）１２００ ＬＣ－ＭＳシステムにより行った。別なふうに述べない限り、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（アジレント・ゾルバックス）３００ＳＢ－Ｃ３ ５μｍ、２．１×１５０ｍｍカラムを採用した。溶媒系は、緩衝剤ＡとしてＨ２Ｏにおける０．０５％トリフルオロ酢酸、および緩衝剤Ｂとしてアセトニトリルにおける０．０４％ＴＦＡ酸から構成された。タンパク質ＵＶ吸収は２１４および２８０ｎｍにてモニターした。ＭＳ取得はポジティブイオンモードにおいて行い、および合計タンパク質質量はＭＳ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（ＭＳケムステーション）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（アジレント・テクノロジーズ））内のデコンボリューションによって計算した。ｐＢｐａ組込み－Ｕｂを含む画分は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（アミコン・ウルトラ）－１５ ３ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア））を用いてプール濃縮した（ｐｏｏｌｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）。サンプルはＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＧＥライフ・サイエンシーズ））を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス－ＨＣｌ）ｐＨ７．５中に脱塩した。ＤＴＴ（１ｍＭ）をサンプルに添加し、次いで終濃度の１５μｇ ｍＬ－１にてＵＣＨ－Ｌ３（Ｖｉｒｄｅｅ（バーディー）ら、２０１０）によるヘキサヒスチジンタグ開裂を続けた。サンプルはＮ末端のＨｉｓタグを除去するために３７℃で２時間インキュベーションした。Ｂｐａ組込み－Ｕｂは半調製ＨＰＬＣによってさらに精製し、および画分は凍結乾燥し、およそ８－１０ｍｇのＵｂ－ｐＢｐａが産生された。
【0123】
（ＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）組換えタンパク質の発現）
Ｓ２２ＲおよびＣ８５Ｋは部位特異的変異誘発を用いることによってＵＢＥ２Ｄ３中に導入した。細胞は３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６－０．７になるまで増殖させた。タンパク質発現は、ＯＤ６００が０．６～０．７に達したら、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することによって誘導し、および３７℃にて３時間インキュベートした。細胞を収穫し、および緩衝剤（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（コンプリート・プロテアーゼ・インヒビター・カクテル）（ＥＤＴＡ－フリー、Ｒｏｃｈｅ（ロシュ）））に再懸濁させた。リゾチームを添加し（０．５ｍｇ ｍＬ－１）、および細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで超音波処理を続けた。Ｈｉｓ６タグ付きＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）を含む清澄化溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂上にロードし、および緩衝剤（２０ｍＭ ｐＨ７．５、Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、２５ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により洗浄し、次いで溶出緩衝剤（２０ｍＭ ｐＨ７．５、Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、３００ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により溶出を続けた。サンプルは、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ハイ・ロード・スーパーデックス）－７５ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥヘルスケア））を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、ランニング緩衝剤（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）を用いてさらに精製した。
Ｓ２２ＲおよびＣ８５Ｋは部位特異的変異誘発を用いることによってＵＢＥ２Ｄ３中に導入した。細胞は３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６－０．７になるまで増殖させた。タンパク質発現は、ＯＤ６００が０．６～０．７に達したら、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することによって誘導し、および３７℃にて３時間インキュベートした。細胞を収穫し、および緩衝剤（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（コンプリート・プロテアーゼ・インヒビター・カクテル）（ＥＤＴＡ－フリー、Ｒｏｃｈｅ（ロシュ）））に再懸濁させた。リゾチームを添加し（０．５ｍｇ ｍＬ－１）、および細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで超音波処理を続けた。Ｈｉｓ６タグ付きＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）を含む清澄化溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂上にロードし、および緩衝剤（２０ｍＭ ｐＨ７．５、Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、２５ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により洗浄し、次いで溶出緩衝剤（２０ｍＭ ｐＨ７．５、Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、３００ｍＭイミダゾール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により溶出を続けた。サンプルは、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ハイ・ロード・スーパーデックス）－７５ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥヘルスケア））を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、ランニング緩衝剤（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）を用いてさらに精製した。
【0124】
（ビオチン－ＵｂＢｐａ３１の調製）
Ｎ末端ＭＧＣＳＳＧシステイン含有モチーフを有する凍結乾燥ＵｂＢｐａ３１（１０ｍｇ）を１ｍＬ １０％ＤＭＳＯ／９０％ ０．５ｍＭ ＴＣＥＰ（水溶液）において再構成し、および穏やかに混合しながら２３℃にて４５分間インキュベートし、次いで反応緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）において５モル等量のＥＺ－ｌｉｎｋ ｉｏｄｏ－ａｃｅｔｙｌ ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ－リンク・ヨード－アセチルＰＥＧ２－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の添加を続けた。反応を２３℃にて穏やかに振盪しながら１時間インキュベートし、およびＬＣ－ＭＳによって完了を監視した。次いで生成物を分取ＨＰＬＣによって流速にて精製し、および凍結乾燥し、ビオチン－ＵｂＢｐａ３１（６－８ｍｇ）が産生された。
Ｎ末端ＭＧＣＳＳＧシステイン含有モチーフを有する凍結乾燥ＵｂＢｐａ３１（１０ｍｇ）を１ｍＬ １０％ＤＭＳＯ／９０％ ０．５ｍＭ ＴＣＥＰ（水溶液）において再構成し、および穏やかに混合しながら２３℃にて４５分間インキュベートし、次いで反応緩衝液（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ）において５モル等量のＥＺ－ｌｉｎｋ ｉｏｄｏ－ａｃｅｔｙｌ ＰＥＧ２－Ｂｉｏｔｉｎ（ＥＺ－リンク・ヨード－アセチルＰＥＧ２－ビオチン）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の添加を続けた。反応を２３℃にて穏やかに振盪しながら１時間インキュベートし、およびＬＣ－ＭＳによって完了を監視した。次いで生成物を分取ＨＰＬＣによって流速にて精製し、および凍結乾燥し、ビオチン－ＵｂＢｐａ３１（６－８ｍｇ）が産生された。
【0125】
（イソペプチド連結した光ＡＢＰｓの調製）
ＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）－ＵｂＢｐａを生成するために、ＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）（２００μＭ）をＵｂＢｐａ（２００μＭ）およびＨｉｓ６－Ｕｂａ１（１μＭ）と共に３５℃の２６ｈの間コンジュゲーション緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ）にてインキュベートした。Ｅ２－ ＵｂＢｐａコンジュゲートをＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ヘペス）、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）上に適用した。精製したＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）－ＵｂＢｐａコンジュゲートは２ｍｇ ｍｌ－１に濃縮し、および－８０℃にて貯蔵した。ビオチン－光ＡＢＰプローブは同じ手順を用いて調製した。
ＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）－ＵｂＢｐａを生成するために、ＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）（２００μＭ）をＵｂＢｐａ（２００μＭ）およびＨｉｓ６－Ｕｂａ１（１μＭ）と共に３５℃の２６ｈの間コンジュゲーション緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ）にてインキュベートした。Ｅ２－ ＵｂＢｐａコンジュゲートをＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ヘペス）、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）上に適用した。精製したＵＢＥ２Ｄ３（Ｓ２２Ｒ／Ｃ８５Ｋ）－ＵｂＢｐａコンジュゲートは２ｍｇ ｍｌ－１に濃縮し、および－８０℃にて貯蔵した。ビオチン－光ＡＢＰプローブは同じ手順を用いて調製した。
【0126】
（組換えＲＮＦ４タンパク質の発現。）
二つのＲＮＦ４ ＲＩＮＧドメインの線形融合体、および関連する変異体のクローニング、発現および精製は、以前に記載されていた（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１１）。ＲＮＦ４の二つのＲＩＮＧドメインの融合体はＥ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバジェン））において発現させた。３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６～０．７に達するまで細胞を増殖させた。ＯＤ６００が０．６－０．７に達したら、タンパク質発現はＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することによって誘導し、および１６℃、２００ｒｐｍにて夜通しインキュベートした。
二つのＲＮＦ４ ＲＩＮＧドメインの線形融合体、および関連する変異体のクローニング、発現および精製は、以前に記載されていた（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１１）。ＲＮＦ４の二つのＲＩＮＧドメインの融合体はＥ． ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ（ノバジェン））において発現させた。３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６～０．７に達するまで細胞を増殖させた。ＯＤ６００が０．６－０．７に達したら、タンパク質発現はＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加することによって誘導し、および１６℃、２００ｒｐｍにて夜通しインキュベートした。
【0127】
細胞は収集し、および溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭベンズアミジン、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ））に再懸濁し、および細胞は超音波処理によって溶解させた。Ｈｉｓ６－ＭＢＰ融合タンパク質はＮｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン））クロマトグラフィーによって精製し、次いでＴＥＶプロテアーゼにより４℃、夜通し開裂を続けた。任意の未開裂融合タンパク質、Ｈｉｓ６タグ付きＭＢＰ、ならびにＨｉｓ６タグ付きＴＥＶプロテアーゼを除去するために、材料を新鮮なＮｉ－ＮＴＡ樹脂に対して減少させ、次いでＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）によりサイズ排除クロマトグラフィーを続けた。
【0128】
（ｃ－Ｃｂｌおよびｃ－Ｃｂｌ（Ｙ３７１Ｆ）組換えタンパク質の発現）
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（５０μＬ）はｐＧＥＸ６Ｐ－１－Ｃｂｌプラスミドにより形質転換し、および２００μＬ ＳＯＣ培地において３７℃、１時間で回収し、および１００μｇ ｍＬ－１アンピシリンを含む５０ｍＬ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）に接種するために使用した。次いで１０ｍＬの夜通しの培養物は、同じ濃度の抗生物質および０．２ｍＭ塩化亜鉛を含むＬＢブロスに接種するために使用した。細胞は、３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６－０．７に達するまで培養した。ＯＤ６００が０．６～０．７に達したら、タンパク質発現は１ｍＭ ＩＰＴＧを添加によって誘導し、および１６℃、２００ｒｐｍにて夜通し放置した。細胞は収集し、および緩衝剤（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ヘペス）、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）において再懸濁し、および超音波処理によって溶解した。溶解物をグルタチオンセファロースビーズと共に穏やかに振盪しながら１時間インキュベートした。樹脂を遠心分離し（４℃、１０００ｒｐｍ）、および緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により洗浄し、次いでＲｈｉｎｏｖｉｒｕｓ（ライノウイルス）３Ｃプロテアーゼによる４℃夜通しにての開裂を続けた。開裂したタンパク質はＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（５０μＬ）はｐＧＥＸ６Ｐ－１－Ｃｂｌプラスミドにより形質転換し、および２００μＬ ＳＯＣ培地において３７℃、１時間で回収し、および１００μｇ ｍＬ－１アンピシリンを含む５０ｍＬ Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）に接種するために使用した。次いで１０ｍＬの夜通しの培養物は、同じ濃度の抗生物質および０．２ｍＭ塩化亜鉛を含むＬＢブロスに接種するために使用した。細胞は、３７℃、２００ｒｐｍにてＯＤ６００が０．６－０．７に達するまで培養した。ＯＤ６００が０．６～０．７に達したら、タンパク質発現は１ｍＭ ＩＰＴＧを添加によって誘導し、および１６℃、２００ｒｐｍにて夜通し放置した。細胞は収集し、および緩衝剤（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ヘペス）、ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）において再懸濁し、および超音波処理によって溶解した。溶解物をグルタチオンセファロースビーズと共に穏やかに振盪しながら１時間インキュベートした。樹脂を遠心分離し（４℃、１０００ｒｐｍ）、および緩衝剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）により洗浄し、次いでＲｈｉｎｏｖｉｒｕｓ（ライノウイルス）３Ｃプロテアーゼによる４℃夜通しにての開裂を続けた。開裂したタンパク質はＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５）によるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
【0129】
（ｃ－Ｃｂｌリン酸化）
精製したｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）はＳｒｃキナーゼ（１．５μＭ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰにより３７℃にて４５分間インキュベートすることによってリン酸化した。サンプル（１５μｌ）は集め、および４×ＬＤＳ添加液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモ・フィッシャー））とよく混合し、次いで７．５％ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｈｏｓ－ｔａｇ ｇｅｌ（アクリルアミド・ホス－タグ・ゲル）上にロードする前に煮沸を続けた。タンパク質はＭＯＰＳ緩衝剤を用いて１６０Ｖにて６０分間分け、およびクーマシー染色とウェスタンブロットとを用いて分析した。
精製したｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）はＳｒｃキナーゼ（１．５μＭ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＡＴＰにより３７℃にて４５分間インキュベートすることによってリン酸化した。サンプル（１５μｌ）は集め、および４×ＬＤＳ添加液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモ・フィッシャー））とよく混合し、次いで７．５％ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｐｈｏｓ－ｔａｇ ｇｅｌ（アクリルアミド・ホス－タグ・ゲル）上にロードする前に煮沸を続けた。タンパク質はＭＯＰＳ緩衝剤を用いて１６０Ｖにて６０分間分け、およびクーマシー染色とウェスタンブロットとを用いて分析した。
【0130】
さらに、ＡＴＰ依存性リン酸化および光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１（５μＭ）とのｃ－Ｃｂｌの光架橋はクーマシー染色を用いて分析した。サンプル（１５μｌ）を集め、および４×ＬＤＳ添加液とよく混合し、次いでＭＯＰＳランニング緩衝剤を用いて４－１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上にロードする前に９５℃にて５分間煮沸を続け、およびクーマシー染色を用いて分析した。さらに、ゲルをブロッティングし、および一次として抗Ｃｂｌ（１：５０００希釈）、および二次抗体として抗マウス（１：１００００希釈）によるウェスタンブロットを用いて分析した。
【0131】
（光架橋のためのＵＶ照射条件）
光架橋反応（４５μＬ）は２４ウェルプレート（Ｃｒｙｓｈｅｍ（クリスヘム）ＨＲ３－１５８、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ハンプトン・リサーチ））において反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）にて実行した。サンプルは二つの部分に分かたれた。一方の部分は氷上で、ｈａｎｄｌｅｄ ＵＶ ｌａｍｐ（柄付きＵＶランプ）（ＢＬＥ－８Ｔ３６５、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ（スペクトロライン））から２ｃｍの距離にて３６５ｎｍを１０－３０分間照射し、および他の部分は暗所で保存した。精製タンパク質、例えば、ＲＮＦ４－ＲＩＮＧ（５－５０μＭ）、ｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）およびｃ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ（３μＭ）などのようなものについては、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１プローブ（５－５０μＭ）により光架橋反応を実行し、およびＵＶにより照射した。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分割し、およびクーマシー染色または免疫ブロッティングによって視覚化した。コントロール実験は同じ条件下で実行した。
光架橋反応（４５μＬ）は２４ウェルプレート（Ｃｒｙｓｈｅｍ（クリスヘム）ＨＲ３－１５８、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ハンプトン・リサーチ））において反応緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ）にて実行した。サンプルは二つの部分に分かたれた。一方の部分は氷上で、ｈａｎｄｌｅｄ ＵＶ ｌａｍｐ（柄付きＵＶランプ）（ＢＬＥ－８Ｔ３６５、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ（スペクトロライン））から２ｃｍの距離にて３６５ｎｍを１０－３０分間照射し、および他の部分は暗所で保存した。精製タンパク質、例えば、ＲＮＦ４－ＲＩＮＧ（５－５０μＭ）、ｃ－Ｃｂｌ（３μＭ）およびｃ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ（３μＭ）などのようなものについては、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１プローブ（５－５０μＭ）により光架橋反応を実行し、およびＵＶにより照射した。サンプルはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分割し、およびクーマシー染色または免疫ブロッティングによって視覚化した。コントロール実験は同じ条件下で実行した。
【0132】
（細胞抽出物における光架橋）
ＨＥＫ２９３細胞はＧＦＰ－Ｃｂｌ、ＧＳＴ－ＳｒｃおよびＧＦＰ－Ｃｂｌを発現するプラスミドによりトランスフェクションした。細胞は溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（グリセロリン酸）、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（フッ化ナトリウム）、５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ピロリン酸ナトリウム）、１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｖａｎａｄａｔｅ（バナジン酸ナトリウム）、０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ（スクロース）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ（ベンズアミジン）、１０μＭ ＴＣＥＰ、１％ ＮＰ－４０）において溶解させた。プローブ光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１（２５μＭ）は細胞溶解物と混合し、および一般的な方法において記載されている光架橋手順を用いてＵＶ照射（１０分）した。サンプルはＭＯＰＳランニング緩衝剤を用いて４－１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し（１６０Ｖ、６０分）、および一次として抗Ｃｂｌ（１：５０００希釈）、および二次抗体として抗マウス（１：１００００希釈）による免疫ブロッティングによって視覚化した。
ＨＥＫ２９３細胞はＧＦＰ－Ｃｂｌ、ＧＳＴ－ＳｒｃおよびＧＦＰ－Ｃｂｌを発現するプラスミドによりトランスフェクションした。細胞は溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（グリセロリン酸）、５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ（フッ化ナトリウム）、５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ピロリン酸ナトリウム）、１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｖａｎａｄａｔｅ（バナジン酸ナトリウム）、０．２５Ｍ Ｓｕｃｒｏｓｅ（スクロース）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ（ベンズアミジン）、１０μＭ ＴＣＥＰ、１％ ＮＰ－４０）において溶解させた。プローブ光ＡＢＰ－Ｂｐａ３１（２５μＭ）は細胞溶解物と混合し、および一般的な方法において記載されている光架橋手順を用いてＵＶ照射（１０分）した。サンプルはＭＯＰＳランニング緩衝剤を用いて４－１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによって分析し（１６０Ｖ、６０分）、および一次として抗Ｃｂｌ（１：５０００希釈）、および二次抗体として抗マウス（１：１００００希釈）による免疫ブロッティングによって視覚化した。
【0133】
（Ｐｈｏｓ－ｔａｇ（商標）ゲル電気泳動）
Ｓｒｃ媒介ｃ－Ｃｂｌリン酸化を評価するために、我々は分解ゲル（７．５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．８、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｐｈｏｓ－ｔａｇ（商標）、０．０５％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、０．０６２５％（ｖ／ｖ）テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））および濃縮用ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌｓ）（４％アクリルアミド／ビス－アクリルアミド、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．６、０．１％ ＳＤＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ）を注ぎ、アルゴンでガスを抜き、次いで室温にて三時間重合させた。細胞抽出物（５０μｇ）はＬＤＳ－サンプル緩衝剤において煮沸し、およびローディング前に１０ｍＭ ＭｎＣｌ２を補った。電気泳動は、クーマシー色素による染色、またはマンガンをキレートするために１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ ＳＤＳを補われた転写緩衝剤（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ）における３×２０分の洗浄の前に、濃縮用ゲルを通して７０Ｖ、およびランニング緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ（グリシン）、０．１％ ＳＤＳ）を用いる分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｅｌ）を通して１３０Ｖにて実行し、次いで０．０５％ ＳＤＳを補った転写緩衝剤において１×２０分続けた。その後、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写緩衝剤において１００Ｖ、３ｈｒ、４℃にて転写した。
Ｓｒｃ媒介ｃ－Ｃｂｌリン酸化を評価するために、我々は分解ゲル（７．５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、３７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．８、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００μＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｐｈｏｓ－ｔａｇ（商標）、０．０５％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、０．０６２５％（ｖ／ｖ）テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））および濃縮用ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌｓ）（４％アクリルアミド／ビス－アクリルアミド、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．６、０．１％ ＳＤＳ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＥＭＥＤ）を注ぎ、アルゴンでガスを抜き、次いで室温にて三時間重合させた。細胞抽出物（５０μｇ）はＬＤＳ－サンプル緩衝剤において煮沸し、およびローディング前に１０ｍＭ ＭｎＣｌ２を補った。電気泳動は、クーマシー色素による染色、またはマンガンをキレートするために１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ ＳＤＳを補われた転写緩衝剤（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ）における３×２０分の洗浄の前に、濃縮用ゲルを通して７０Ｖ、およびランニング緩衝剤（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ（グリシン）、０．１％ ＳＤＳ）を用いる分離ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｅｌ）を通して１３０Ｖにて実行し、次いで０．０５％ ＳＤＳを補った転写緩衝剤において１×２０分続けた。その後、タンパク質を０．４５μｍのニトロセルロース膜に転写緩衝剤において１００Ｖ、３ｈｒ、４℃にて転写した。
【0134】
（細胞培養、トランスフェクションおよび溶解）
２９３Ｔ細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび抗生物質（１００単位ｍＬ－１ペニシリン、０．１ｍｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグルズ培地）（ＤＭＥＭ）において培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞は１００ｍｍディッシュにおいて４×１０６の密度にて播種した。播種後１８時間、細胞トランスフェクション（２μｇ ＤＮＡ、空ベクター（ｐｃＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（サーモ・フィッシャー））、ｐｃＤＮＡおよびＧＳＴ－Ｓｒｃ、ｐｃＤＮＡおよびＧＦＰ－ｃ－Ｃｂｌ、またはＧＳＴ－ＳｒｃおよびＧＦＰ－ｃ－Ｃｂｌ）は、２００μＬ Ｅａｇｌｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（イーグル最小必須培地）（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）における５μＬ Ｆｕｇｅｎｅ－６（フーゲン－６）（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ））を用いて実行した。収穫の９０分前にＭＧ１３２（２５μＭ）を細胞に加えた。細胞を氷冷したＰＢＳによりリンスし、および集め、および氷冷した溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２－グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１．０ｍＭベンザミジン、１０μＭ ＴＣＥＰ、１％ ＮＰ－４０）により氷上で３０分間抽出した。溶解物は４℃、２１，１００ｇにて２０分間遠心分離することによって清澄化した。上清を集め、およびタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（ブラッドフォードアッセイ）によって定めた。
２９３Ｔ細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび抗生物質（１００単位ｍＬ－１ペニシリン、０．１ｍｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ改変イーグルズ培地）（ＤＭＥＭ）において培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。細胞は１００ｍｍディッシュにおいて４×１０６の密度にて播種した。播種後１８時間、細胞トランスフェクション（２μｇ ＤＮＡ、空ベクター（ｐｃＤＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）（サーモ・フィッシャー））、ｐｃＤＮＡおよびＧＳＴ－Ｓｒｃ、ｐｃＤＮＡおよびＧＦＰ－ｃ－Ｃｂｌ、またはＧＳＴ－ＳｒｃおよびＧＦＰ－ｃ－Ｃｂｌ）は、２００μＬ Ｅａｇｌｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（イーグル最小必須培地）（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ）における５μＬ Ｆｕｇｅｎｅ－６（フーゲン－６）（Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ））を用いて実行した。収穫の９０分前にＭＧ１３２（２５μＭ）を細胞に加えた。細胞を氷冷したＰＢＳによりリンスし、および集め、および氷冷した溶解緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２－グリセロリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５．０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．２７Ｍスクロース、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１．０ｍＭベンザミジン、１０μＭ ＴＣＥＰ、１％ ＮＰ－４０）により氷上で３０分間抽出した。溶解物は４℃、２１，１００ｇにて２０分間遠心分離することによって清澄化した。上清を集め、およびタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ（ブラッドフォードアッセイ）によって定めた。
【0135】
（ＥＧＦ刺激ＨＥＫ２９３細胞の活性に基づくプロテオミクスプロファイリング）
２９３Ｔ細胞は１５０ｍＭディッシュにおいて５×１０６の密度にて播種し、および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび抗生物質（１００単位ｍＬ－１ペニシリン、０．１ｍｇ ｍＬ－１ストレプトマイシ）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）において培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、培地はＦＢＳを欠くＤＭＥＭに交換した。次の日、細胞を２０μＭ ＭＧ１３２および２００ｎＭ Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ（バフィロマイシン）により６時間３７℃にて、次いで組換えＥＧＦ １００ｎｇ ｍＬ－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、ＰＨＧ０３１１）と共に、またはなしで１５分間３７℃にて処理した。ディッシュを氷上に移し、洗浄し、氷冷ＰＢＳにおいて再懸濁し、および４℃で二回洗浄し、および溶解物を氷冷溶解緩衝剤において抽出した。２９３Ｔ細胞をビオチン化プローブ（ビオチン－光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１）（２０μＭ）により処理した。サンプルは分割し、およびＵＶを用いて１時間照射したか、またはＵＶを控えた。次いで、ストレプトアビジン樹脂に対してビオチン濃縮を行い、その後、以前に記載したように（Ｐａｏら、２０１８、前掲）オンレジントリプシン消化（ｏｎ－ｒｅｓｉｎ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析およびデータ処理を続けた。
２９３Ｔ細胞は１５０ｍＭディッシュにおいて５×１０６の密度にて播種し、および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２．０ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび抗生物質（１００単位ｍＬ－１ペニシリン、０．１ｍｇ ｍＬ－１ストレプトマイシ）を補ったＤｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ´ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）において培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、培地はＦＢＳを欠くＤＭＥＭに交換した。次の日、細胞を２０μＭ ＭＧ１３２および２００ｎＭ Ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ（バフィロマイシン）により６時間３７℃にて、次いで組換えＥＧＦ １００ｎｇ ｍＬ－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック）、ＰＨＧ０３１１）と共に、またはなしで１５分間３７℃にて処理した。ディッシュを氷上に移し、洗浄し、氷冷ＰＢＳにおいて再懸濁し、および４℃で二回洗浄し、および溶解物を氷冷溶解緩衝剤において抽出した。２９３Ｔ細胞をビオチン化プローブ（ビオチン－光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１）（２０μＭ）により処理した。サンプルは分割し、およびＵＶを用いて１時間照射したか、またはＵＶを控えた。次いで、ストレプトアビジン樹脂に対してビオチン濃縮を行い、その後、以前に記載したように（Ｐａｏら、２０１８、前掲）オンレジントリプシン消化（ｏｎ－ｒｅｓｉｎ ｔｒｙｐｔｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析およびデータ処理を続けた。
【0136】
（結果）
（光架橋ＲＩＮＧ ＡＢＰｓの設計および組立て）
光架橋剤の組込みのための潜在的位置を確立するために、我々は解かれたＲＩＮＧ Ｅ３：Ｅ２～Ｕｂ共結晶構造（図５）についての構造的重ね合わせを生成した（Ｄｏｕら、２０１２ｂ、２０１３；Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓら、２０１６；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２、前掲）。結合様式における顕著な保存は明らかであったし、およびＵｂとＥ２の両方内の複数の残基がＲＩＮＧドメイン（複数）の近傍に存在する。プローブに活性依存性をもたせるために、我々は光架橋モイエティをＵｂ中に組み込み、それはこの成分が活性なＲＩＮＧ Ｅ３ｓの近傍にしか結合しないためである。我々は活性化したＲＩＮＧｓに近接しているＵｂ内の１０のコンセンサス部位を選び（図１ｃ）、および進化したＭｅｔｈａｎｏｃｏｌｄｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎａｓｈｉ（メタノカルドコックス・ヤンナスキイ）のｔｙｒｏｓｙｌ－Ｔｒｎａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（チロシルｔＲＮＡシンセターゼ）－ＴｒｎａＣＵＡペア（図１ｂ、ｃ）を用いて光架橋アミノ酸ｐ－ベンゾイルＬ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）を組み込んだ（Ｃｈｉｎら、２００２、前掲）。効率的な組込みはすべての部位にて達成され、培養基１リットルあたり～４－６ｍｇのタンパク質が産生された。Ｕｂ変異体は均質になるように精製し、およびＬＣ－ＭＳによって特徴付けた（図６および７）。次に、変異Ｕｂ変種（ｍｕｔａｎｔ Ｕｂ ｖａｒｉａｎｔｓ）のすべてを乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｅ２ ＵＢＥ２Ｄ３に酵素的にコンジュゲートさせ（Ｂｒｚｏｖｉｃ（ブルゾビッチ）， Ｐ．Ｓ．ら（２００６）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２１， ８７３－８８０）、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグが伴われた（図１ｄ）。精製を容易にすることに加えて、後半部は免疫ブロット分析のための便利なレポーターとして機能する。Ｅ２へのコンジュゲーションはＥ１活性化酵素により行われ、およびＵｂとＥ２間のより一層安定な連結を形成するために、触媒に関するシステイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）をリジンに変異させ、安定なイソペプチドコンジュゲーションが可能にされる（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２、前掲）（図２ａ）。重要なことに、構造分析はイソペプチドが自然なチオエステルの許容可能な構造的ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）であることを示した（Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓら、２０１６；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２；Ｗｒｉｇｈｔら、２０１６、前掲）。また、我々はＡＢＰの自己会合をもたらすことができた非共有結合Ｕｂ結合部位を破壊するＳ２２Ｒ変異をＥ２成分中に導入した（Ｂｒｚｏｖｉｃ， Ｐ．Ｓ．、およびＫｌｅｖｉｔ（クレビト）， Ｒ．Ｅ． （２００６）． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（セル・サイクル）， ５， ２８６７－２８７３）。すべてのＥ２～Ｕｂ変種はＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳ分析によって決定されるようにサイズ排除クロマトグラフィーによって均質性にまで精製した（図２ｂ－ｄおよび８）。
（光架橋ＲＩＮＧ ＡＢＰｓの設計および組立て）
光架橋剤の組込みのための潜在的位置を確立するために、我々は解かれたＲＩＮＧ Ｅ３：Ｅ２～Ｕｂ共結晶構造（図５）についての構造的重ね合わせを生成した（Ｄｏｕら、２０１２ｂ、２０１３；Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓら、２０１６；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２、前掲）。結合様式における顕著な保存は明らかであったし、およびＵｂとＥ２の両方内の複数の残基がＲＩＮＧドメイン（複数）の近傍に存在する。プローブに活性依存性をもたせるために、我々は光架橋モイエティをＵｂ中に組み込み、それはこの成分が活性なＲＩＮＧ Ｅ３ｓの近傍にしか結合しないためである。我々は活性化したＲＩＮＧｓに近接しているＵｂ内の１０のコンセンサス部位を選び（図１ｃ）、および進化したＭｅｔｈａｎｏｃｏｌｄｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎａｓｈｉ（メタノカルドコックス・ヤンナスキイ）のｔｙｒｏｓｙｌ－Ｔｒｎａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（チロシルｔＲＮＡシンセターゼ）－ＴｒｎａＣＵＡペア（図１ｂ、ｃ）を用いて光架橋アミノ酸ｐ－ベンゾイルＬ－フェニルアラニン（Ｂｐａ）を組み込んだ（Ｃｈｉｎら、２００２、前掲）。効率的な組込みはすべての部位にて達成され、培養基１リットルあたり～４－６ｍｇのタンパク質が産生された。Ｕｂ変異体は均質になるように精製し、およびＬＣ－ＭＳによって特徴付けた（図６および７）。次に、変異Ｕｂ変種（ｍｕｔａｎｔ Ｕｂ ｖａｒｉａｎｔｓ）のすべてを乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｅ２ ＵＢＥ２Ｄ３に酵素的にコンジュゲートさせ（Ｂｒｚｏｖｉｃ（ブルゾビッチ）， Ｐ．Ｓ．ら（２００６）． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２１， ８７３－８８０）、Ｎ末端ヘキサヒスチジンタグが伴われた（図１ｄ）。精製を容易にすることに加えて、後半部は免疫ブロット分析のための便利なレポーターとして機能する。Ｅ２へのコンジュゲーションはＥ１活性化酵素により行われ、およびＵｂとＥ２間のより一層安定な連結を形成するために、触媒に関するシステイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｙｓｔｅｉｎｅ）をリジンに変異させ、安定なイソペプチドコンジュゲーションが可能にされる（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２、前掲）（図２ａ）。重要なことに、構造分析はイソペプチドが自然なチオエステルの許容可能な構造的ミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）であることを示した（Ｋｏｌｉｏｐｏｕｌｏｓら、２０１６；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２；Ｗｒｉｇｈｔら、２０１６、前掲）。また、我々はＡＢＰの自己会合をもたらすことができた非共有結合Ｕｂ結合部位を破壊するＳ２２Ｒ変異をＥ２成分中に導入した（Ｂｒｚｏｖｉｃ， Ｐ．Ｓ．、およびＫｌｅｖｉｔ（クレビト）， Ｒ．Ｅ． （２００６）． Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（セル・サイクル）， ５， ２８６７－２８７３）。すべてのＥ２～Ｕｂ変種はＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＬＣ－ＭＳ分析によって決定されるようにサイズ排除クロマトグラフィーによって均質性にまで精製した（図２ｂ－ｄおよび８）。
【0137】
（二量体ＲＩＮＧ Ｅ３ ＲＮＦ４の活性依存性プロファイリング）
ＲＩＮＧ Ｅ３ ＲＮＦ４は単量体状態では不活性であり、それは内因性濃度にて優勢である。ＲＮＦ４内のＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＵＭＯ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｍｏｔｉｆｓ）（ＳＩＭｓ）へのポリＳＵＭＯ鎖の結合は、ＲＮＦ４の局所濃度を高め、それによってＲＩＮＧドメインのホモ二量化およびＥ３リガーゼ活性の活性化が増進される（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）。このことは、ＳＵＭＯ修飾前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）のユビキチン化および分解を導く（Ｔａｔｈａｍ（タタム）， Ｍ．Ｈ．ら（２００８）． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（ネイチャー・セル・バイオロジー）， １０， ５３８－５４６）。著しいことに、このプロセスの治療上の誘導は、＞９０％のケースでの急性前骨髄球性白血病の寛解を導く（Ｍａｓｓａｒｏ（マッサーロ）， Ｆ．， Ｍｏｌｉｃａ（モリカ）， Ｍ．、およびＢｒｅｃｃｉａ（ブレッチャ）， Ｍ． （２０１６）． Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ヘマトロジック・オンコロジー）， ５， １０５－１１８）。ＲＮＦ４の工学的に作り出されたバージョンはそれが構成的に活性であり、設計されており、それはフレキシブルなリンカーを介して自然なＣ末端に融合した追加のＲＩＮＧドメインを有する全長タンパク質からなる（ＲＮＦ４－ＲＩＮＧ）（図３ａ）（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１１、前掲）。最適な光架橋剤の位置を決定するために、我々はすべての１０個のＢｐａ変異体Ｅ２～ＵｂコンジュゲートをＲＮＦ４－ＲＩＮＧとインキュベートし（図９）、およびＵＶ照射（１０分）による架橋効率を評価した。著しいおよび用量に応じた架橋は、位置３１にてのＢｐａ組込みにより（光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１）観察されるだけであった（図３ｂおよび１０）。重要なことに、ＲＮＦ４－ＲＩＮＧをインキュベートし、およびＵｂＢｐａ３１をコンジュゲートしていない状態でＵＶ照射するとき架橋が観察されず、光架橋がＥ２駆動のＵｂ接近に依存したことが指し示され、自然な機構と一致した。特に、二つの光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１分子を加えた場合の分子量に相当する追加の架橋産物が観察された（図３ｂ）。二量体ＲＩＮＧ：Ｅ２～Ｕｂ複合体での構造研究により、活性ＲＩＮＧ二量体の両方の面が別々のＥ２～Ｕｂコンジュゲートに関与し、および活性化することが明らかにされた（図３ｃ）。融合したＲＮＦ４－ＲＩＮＧ構築物の力で、ＲＩＮＧドメインの一方または両方（それぞれＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧまたはＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧｘ）中にＭ１４０Ａ Ｒ１８１Ａ二重変異を導入することによって、単一のＥ２～Ｕｂ分子または両方への結合を中断することが可能である（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）。光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１プロファイリングのこの構造的に解明された二部に分かれた機構（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と一致して、第二のＥ２～ＵｂＢｐａ３１分子の架橋はＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧにより失われ、およびＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧｘにより完全に消失した（図３ｄ）。活性依存的な光架橋をさらに確認するために、我々は変異体の光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１コントロールプローブを用意した。保存されたＥ２－ＲＩＮＧ相互作用の一部分は、Ｅ２ Ｆ６２残基（いくらかのモデルＥ２ｓではＦ６３）に関与し、およびアラニンへの変異は典型的にＥ３結合を損ない／消失させる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ワイズマン）， Ａ．Ｍ． （２００１）． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２， １６９－１７８）。このコントロールプローブは、観察された標識化が自然なＥ２－ＲＩＮＧ相互作用と矛盾しないかどうかについてさらに情報を提供するであろうし、それゆえに、自然な相互作用を破壊するインヒビターのスクリーニングに適する（図３ｅ）。プローブが自然なマナーでかみ合うことと矛盾せず、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２ＡプローブはＲＩＮＧの架橋を受けなかった。これはまた、ＲＩＮＧ Ｅ３ｓを不可知論的に（ａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ、アグノスティックに）プロファイリングするとき貴重なコントロールプローブとしても機能するはずである（図３ｆ）。
ＲＩＮＧ Ｅ３ ＲＮＦ４は単量体状態では不活性であり、それは内因性濃度にて優勢である。ＲＮＦ４内のＳＵＭＯ相互作用モチーフ（ＳＵＭＯ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｍｏｔｉｆｓ）（ＳＩＭｓ）へのポリＳＵＭＯ鎖の結合は、ＲＮＦ４の局所濃度を高め、それによってＲＩＮＧドメインのホモ二量化およびＥ３リガーゼ活性の活性化が増進される（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）。このことは、ＳＵＭＯ修飾前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）のユビキチン化および分解を導く（Ｔａｔｈａｍ（タタム）， Ｍ．Ｈ．ら（２００８）． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（ネイチャー・セル・バイオロジー）， １０， ５３８－５４６）。著しいことに、このプロセスの治療上の誘導は、＞９０％のケースでの急性前骨髄球性白血病の寛解を導く（Ｍａｓｓａｒｏ（マッサーロ）， Ｆ．， Ｍｏｌｉｃａ（モリカ）， Ｍ．、およびＢｒｅｃｃｉａ（ブレッチャ）， Ｍ． （２０１６）． Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ（インターナショナル・ジャーナル・オブ・ヘマトロジック・オンコロジー）， ５， １０５－１１８）。ＲＮＦ４の工学的に作り出されたバージョンはそれが構成的に活性であり、設計されており、それはフレキシブルなリンカーを介して自然なＣ末端に融合した追加のＲＩＮＧドメインを有する全長タンパク質からなる（ＲＮＦ４－ＲＩＮＧ）（図３ａ）（Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１１、前掲）。最適な光架橋剤の位置を決定するために、我々はすべての１０個のＢｐａ変異体Ｅ２～ＵｂコンジュゲートをＲＮＦ４－ＲＩＮＧとインキュベートし（図９）、およびＵＶ照射（１０分）による架橋効率を評価した。著しいおよび用量に応じた架橋は、位置３１にてのＢｐａ組込みにより（光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１）観察されるだけであった（図３ｂおよび１０）。重要なことに、ＲＮＦ４－ＲＩＮＧをインキュベートし、およびＵｂＢｐａ３１をコンジュゲートしていない状態でＵＶ照射するとき架橋が観察されず、光架橋がＥ２駆動のＵｂ接近に依存したことが指し示され、自然な機構と一致した。特に、二つの光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１分子を加えた場合の分子量に相当する追加の架橋産物が観察された（図３ｂ）。二量体ＲＩＮＧ：Ｅ２～Ｕｂ複合体での構造研究により、活性ＲＩＮＧ二量体の両方の面が別々のＥ２～Ｕｂコンジュゲートに関与し、および活性化することが明らかにされた（図３ｃ）。融合したＲＮＦ４－ＲＩＮＧ構築物の力で、ＲＩＮＧドメインの一方または両方（それぞれＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧまたはＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧｘ）中にＭ１４０Ａ Ｒ１８１Ａ二重変異を導入することによって、単一のＥ２～Ｕｂ分子または両方への結合を中断することが可能である（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）。光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１プロファイリングのこの構造的に解明された二部に分かれた機構（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と一致して、第二のＥ２～ＵｂＢｐａ３１分子の架橋はＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧにより失われ、およびＲＮＦ４ｘ－ＲＩＮＧｘにより完全に消失した（図３ｄ）。活性依存的な光架橋をさらに確認するために、我々は変異体の光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１コントロールプローブを用意した。保存されたＥ２－ＲＩＮＧ相互作用の一部分は、Ｅ２ Ｆ６２残基（いくらかのモデルＥ２ｓではＦ６３）に関与し、およびアラニンへの変異は典型的にＥ３結合を損ない／消失させる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ（ワイズマン）， Ａ．Ｍ． （２００１）． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２， １６９－１７８）。このコントロールプローブは、観察された標識化が自然なＥ２－ＲＩＮＧ相互作用と矛盾しないかどうかについてさらに情報を提供するであろうし、それゆえに、自然な相互作用を破壊するインヒビターのスクリーニングに適する（図３ｅ）。プローブが自然なマナーでかみ合うことと矛盾せず、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２ＡプローブはＲＩＮＧの架橋を受けなかった。これはまた、ＲＩＮＧ Ｅ３ｓを不可知論的に（ａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ、アグノスティックに）プロファイリングするとき貴重なコントロールプローブとしても機能するはずである（図３ｆ）。
【0138】
（ポリＳＵＭＯ鎖誘発ＲＮＦ４活性化のＡＢＰプロファイリング）
細胞性ＲＮＦ４は、ポリＳＵＭＯ鎖へのそのＳＩＭドメインを介する補充によって活性化され、それによって二量化が誘導される。二量化のＫｄは～１８０Ｎｍであり（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）、それゆえに、この値未満の濃度にて作用することによって、我々は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１が自然なＲＮＦ４のポリＳＵＭＯ鎖誘導活性化をプロファイルできたかどうかを評価する生化学アッセイを確立した（図３ｇ）。予想されるように、構成的に活性なＲＮＦ４－ＲＩＮＧは希釈に鈍感であり、および光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の架橋を受けたが、自然なＲＮＦ４はそうでなかった（図３ｈ）。しかし、線状アミド連結テトラＳＵＭＯ（ＳＵＭＯｘ４）融合タンパク質（１０μＭ）の存在下では、それは自然なイソペプチド連結ポリＳＵＭＯ鎖の活性化特性を再現し（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ）（Ｔａｔｈａｍら、２００８、前掲）、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１架橋はＲＮＦ４－ＲＩＮＧの効率と同等のもので観察された。洞察に満ちたことに、架橋されたバンドは第二の光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１分子の添加について観察された（図３ｇ）。このことは、自然に活性化された野生型ＲＮＦ４がその二部に分かれた活性を保持し、およびその関連する処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が細胞において推定上利用されることを示唆する。一緒に考えると、データはこれまでで、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１が自然に活性化されたＲＩＮＧ Ｅ３の活性依存的な架橋を受けることを実証し、それは触媒に関する求核剤を欠いている。
細胞性ＲＮＦ４は、ポリＳＵＭＯ鎖へのそのＳＩＭドメインを介する補充によって活性化され、それによって二量化が誘導される。二量化のＫｄは～１８０Ｎｍであり（Ｒｏｊａｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、前掲）、それゆえに、この値未満の濃度にて作用することによって、我々は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１が自然なＲＮＦ４のポリＳＵＭＯ鎖誘導活性化をプロファイルできたかどうかを評価する生化学アッセイを確立した（図３ｇ）。予想されるように、構成的に活性なＲＮＦ４－ＲＩＮＧは希釈に鈍感であり、および光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の架橋を受けたが、自然なＲＮＦ４はそうでなかった（図３ｈ）。しかし、線状アミド連結テトラＳＵＭＯ（ＳＵＭＯｘ４）融合タンパク質（１０μＭ）の存在下では、それは自然なイソペプチド連結ポリＳＵＭＯ鎖の活性化特性を再現し（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｓ）（Ｔａｔｈａｍら、２００８、前掲）、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１架橋はＲＮＦ４－ＲＩＮＧの効率と同等のもので観察された。洞察に満ちたことに、架橋されたバンドは第二の光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１分子の添加について観察された（図３ｇ）。このことは、自然に活性化された野生型ＲＮＦ４がその二部に分かれた活性を保持し、およびその関連する処理能力（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が細胞において推定上利用されることを示唆する。一緒に考えると、データはこれまでで、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１が自然に活性化されたＲＩＮＧ Ｅ３の活性依存的な架橋を受けることを実証し、それは触媒に関する求核剤を欠いている。
【0139】
（活性依存的なプロファイリングのリン酸化誘発ＲＩＮＧ Ｅ３活性化）
光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１はＲＩＮＧ Ｅ３によりテストし、それは別個の機構を介して活性化する。Ｃｂｌタンパク質は、３つのホモログ：ｃ－Ｃｂｌ、Ｃｂｌ－ｂおよびＣｂｌ－ｃからなるマルチドメインおよび多機能性のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼである（Ｌｙｌｅ（ライル）， Ｃ．Ｌ．， Ｂｅｌｇｈａｓｅｍ（ベルガセム）， Ｍ．， およびＣｈｉｔａｌｉａ（チタリア）， Ｖ．Ｃ． （２０１９）． Ｃｅｌｌｓ（セルズ）， ８）。Ｃｂｌ機能の大半はＲＩＮＧ Ｅ３活性に関連し、および脈管新生の調節に関与する。Ｃｂｌ活性での異常は多数のガンと関係があった。Ｃｂｌは多くの胸部ガン細胞および組織において過剰発現し、およびまた骨髄増殖性新生物（ＭＤＳ／ＭＰＮ）および非小細胞肺ガンでも下方制御されることが見出される（Ｋａｌｅｓ（ケイルズ）， Ｓ．Ｃ．ら、（２０１０）． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（キャンサー・リサーチ）， ７０， ４７８９－４７９４；Ｔａｎ（タン）， Ｙ．Ｈ．ら， （２０１０）． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（ＰＬｏＳワン）， ５， ｅ８９７２）。それで、Ｃｂｌ Ｅ３活性の調整は魅力的な治療上の戦略であり、および製薬会社から大きな関心を寄せられている。臨床において最も多く見られる普通の変異は残基Ｙ３７１にある。Ｙ３７１はｃ－Ｓｒｃキナーゼによってリン酸化を受け、およびこれは構造変化を導き、それは非ＲＩＮＧ要素を提示し、Ｅ２～Ｕｂに対する親和性を高め、およびＣｂｌ Ｅ３活性を刺激する（Ｂｕｅｔｏｗら、２０１６；Ｄｏｕら、２０１３、前掲）。実際、Ｙ３７１にてリン酸化されたＣｂｌ（ｃ－Ｃｂｌ ｐＴｙｒ３７１）に対する親和性はＥ２～Ｕｂ親和性を～３０倍高める（Ｂｕｅｔｏｗら、２０１６、前掲）。
光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１はＲＩＮＧ Ｅ３によりテストし、それは別個の機構を介して活性化する。Ｃｂｌタンパク質は、３つのホモログ：ｃ－Ｃｂｌ、Ｃｂｌ－ｂおよびＣｂｌ－ｃからなるマルチドメインおよび多機能性のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼである（Ｌｙｌｅ（ライル）， Ｃ．Ｌ．， Ｂｅｌｇｈａｓｅｍ（ベルガセム）， Ｍ．， およびＣｈｉｔａｌｉａ（チタリア）， Ｖ．Ｃ． （２０１９）． Ｃｅｌｌｓ（セルズ）， ８）。Ｃｂｌ機能の大半はＲＩＮＧ Ｅ３活性に関連し、および脈管新生の調節に関与する。Ｃｂｌ活性での異常は多数のガンと関係があった。Ｃｂｌは多くの胸部ガン細胞および組織において過剰発現し、およびまた骨髄増殖性新生物（ＭＤＳ／ＭＰＮ）および非小細胞肺ガンでも下方制御されることが見出される（Ｋａｌｅｓ（ケイルズ）， Ｓ．Ｃ．ら、（２０１０）． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（キャンサー・リサーチ）， ７０， ４７８９－４７９４；Ｔａｎ（タン）， Ｙ．Ｈ．ら， （２０１０）． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（ＰＬｏＳワン）， ５， ｅ８９７２）。それで、Ｃｂｌ Ｅ３活性の調整は魅力的な治療上の戦略であり、および製薬会社から大きな関心を寄せられている。臨床において最も多く見られる普通の変異は残基Ｙ３７１にある。Ｙ３７１はｃ－Ｓｒｃキナーゼによってリン酸化を受け、およびこれは構造変化を導き、それは非ＲＩＮＧ要素を提示し、Ｅ２～Ｕｂに対する親和性を高め、およびＣｂｌ Ｅ３活性を刺激する（Ｂｕｅｔｏｗら、２０１６；Ｄｏｕら、２０１３、前掲）。実際、Ｙ３７１にてリン酸化されたＣｂｌ（ｃ－Ｃｂｌ ｐＴｙｒ３７１）に対する親和性はＥ２～Ｕｂ親和性を～３０倍高める（Ｂｕｅｔｏｗら、２０１６、前掲）。
【0140】
光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１がｃ－Ｃｂｌ Ｅ３活性のＳｒｃ依存性活性化をプロファイルできるかどうかを評価するために、我々は組換えＳｒｃをＣｂｌおよびＣｂｌ Ｙ３７１Ｆとインキュベーションさせ、後半部はリン酸化誘導された活性化に不応であると予想された。光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１架橋はｃ－Ｓｒｃ存在下においてｃ－Ｃｂｌについて観察されたが、ｃ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆについてはそうでなく、ｃ－Ｓｒｃを与えないときも観察されなかった（図４ａ）。標識化は、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブにより再び消失し（図１１）、およびまたＡＴＰ依存性であった（図１２）。したがって、以前の研究と一致して、Ｙ３７１でのリン酸化はＥ３活性の活性化について明確に必要である（Ｄｏｕら、２０１３、前掲）。我々はまた、ｃ－Ｓｒｃ活性化ｃ－Ｃｂｌに対して異なる位置にてＢｐａ組込みを有する工学的に作成したＥ２～Ｕｂコンジュゲートのパネルをテストし、およびＲＮＦ４についての生産的部位との部分的な重複のものを見出した（図１３）。最適なＢｐａの位置は３１であったが、ＲＮＦ４とは異なり、位置３２（光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１）でもまた同様の効率で架橋された。これはおそらく、これら２つのＲＩＮＧ Ｅ３ｓによって示される単量体および二量体活性化機構間のニュアンスの反映による（Ｄｏｕら、２０１３；Ｐｌｅｃｈａｎｏｖｏｖａら、２０１２、前掲）。興味深いことに、光架橋効率は、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１の濃度にかかわらず、準化学量論的なままであり、組換えタンパク質調製物のサブ集団が活性化していることの示唆に富んだ（図１４）。Ｐｈｏｓｔａｇ（フォスタグ）ゲル分析はＣｂｌが定量的にリン酸化されたことを指し示したが（図１５）、ＳｒｃはＣｂｌ内の複数の部位をリン酸化することが知られ、およびプローブ標識化の程度は位置Ｙ３７１での準化学量論的リン酸化を反映し得る（Ｄｏｕ， Ｈ．ら（２０１２ａ）． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９， １８４－１９２）。我々は高められた濃度のＳｒｃとインキュベートすることで光架橋の効率が向上するかどうかをテストしたが、濃度が化学量論に近づくと光架橋が抑制されることが見出され；おそらく、ＳｒｃがＣｂｌの結合について光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１に対して競合するためである（データは示していない）。
【0141】
（ヒト細胞系におけるｃ－Ｃｂｌ活性化のプロファイリング）
ヒト細胞系におけるｃ－Ｃｂｌ活性化をプロファイリングできるかどうかを確立するために、我々はヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）細胞をＧＳＴタグ付きｃ－Ｓｒｃ（ＧＳＴ－Ｓｒｃ）と共にＧＦＰタグ付きｃ－Ｃｂｌ（ＧＦＰ－Ｃｂｌ）またはＧＦＰタグ付きｃ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ（ＧＦＰ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ）と一緒に一過性にトランスフェクトさせた。自己ユビキチン化による活性化Ｃｂｌの分解の可能性を防ぐため、我々は細胞を溶解に先立ちプロテアソームインヒビターＭＧ１３２により９０分間処理した。活性依存的な架橋は、Ｓｒｃ共発現およびＹ３７１の存在に厳密に依存したが、光Ｅ２～ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブでは見られなかった（図４ｂおよび１６）。内因性ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの並列化プロテオミクスプロファイリング（ｐａｒａｌｌｅｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）における将来的使用のための潜在能力を与えるために、我々は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１のビオチン化変異体を用意した。ＢｐａはＮ末端のシステインタグ付きＵｂ中に組み込み、およびイドドアセチル（ｉｄｏｄｏａｃｅｔｙｌ）－ＰＥＧ２－ビオチンにより標識した。ビオチン標識化ＵｂＢｐａ３１は次いでタグなしＵｂについての手順を使用してイソペプチドを介してＥ２と酵素的にコンジュゲートさせた（図１７）。
ヒト細胞系におけるｃ－Ｃｂｌ活性化をプロファイリングできるかどうかを確立するために、我々はヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）細胞をＧＳＴタグ付きｃ－Ｓｒｃ（ＧＳＴ－Ｓｒｃ）と共にＧＦＰタグ付きｃ－Ｃｂｌ（ＧＦＰ－Ｃｂｌ）またはＧＦＰタグ付きｃ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ（ＧＦＰ－Ｃｂｌ Ｙ３７１Ｆ）と一緒に一過性にトランスフェクトさせた。自己ユビキチン化による活性化Ｃｂｌの分解の可能性を防ぐため、我々は細胞を溶解に先立ちプロテアソームインヒビターＭＧ１３２により９０分間処理した。活性依存的な架橋は、Ｓｒｃ共発現およびＹ３７１の存在に厳密に依存したが、光Ｅ２～ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブでは見られなかった（図４ｂおよび１６）。内因性ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの並列化プロテオミクスプロファイリング（ｐａｒａｌｌｅｌｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）における将来的使用のための潜在能力を与えるために、我々は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１のビオチン化変異体を用意した。ＢｐａはＮ末端のシステインタグ付きＵｂ中に組み込み、およびイドドアセチル（ｉｄｏｄｏａｃｅｔｙｌ）－ＰＥＧ２－ビオチンにより標識した。ビオチン標識化ＵｂＢｐａ３１は次いでタグなしＵｂについての手順を使用してイソペプチドを介してＥ２と酵素的にコンジュゲートさせた（図１７）。
【0142】
（増殖因子刺激に応答した内因性ＲＩＮＧ Ｅ３活性化のプロファイリング）
我々は次に、生理的刺激に応答する内在性ＲＩＮＧ Ｅ３活性化の並列化プロファイリングを行う能力を評価した。そのような実験により、不十分にしか理解されていないＲＩＮＧ Ｅ３ｓが生理学的および病態生理学的プロセスの双方のスペクトルにわたって調節機能によるものとすることができるようになる可能性があるであろう。乱雑な架橋によるＡＢＰの欠失はＲＩＮＧ Ｅ３の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を弱めるかもしれず、およびヘキサヒスチジンレポータータグに対する免疫ブロットによって初めにテストした（図４ｃ）。さらに、架橋は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブにより実質減少し、それによって、架橋されたタンパク質の多くがＥ３ｓである可能性が高いことが暗示された（図４ｃ）。
我々は次に、生理的刺激に応答する内在性ＲＩＮＧ Ｅ３活性化の並列化プロファイリングを行う能力を評価した。そのような実験により、不十分にしか理解されていないＲＩＮＧ Ｅ３ｓが生理学的および病態生理学的プロセスの双方のスペクトルにわたって調節機能によるものとすることができるようになる可能性があるであろう。乱雑な架橋によるＡＢＰの欠失はＲＩＮＧ Ｅ３の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を弱めるかもしれず、およびヘキサヒスチジンレポータータグに対する免疫ブロットによって初めにテストした（図４ｃ）。さらに、架橋は光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１ Ｆ６２Ａコントロールプローブにより実質減少し、それによって、架橋されたタンパク質の多くがＥ３ｓである可能性が高いことが暗示された（図４ｃ）。
【0143】
我々は、複雑な細胞サンプルからの架橋タンパク質の選択的濃縮を許容するように、光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１のビオチン化した変種を用意した。ＢｐａはＮ末端システインタグ付きＵｂに組み込み、およびヨードアセチル－ＰＥＧ２－ビオチンにより標識化した（Ｐａｏら、２０１８、前掲）。次いでビオチン標識ＵｂＢｐａ３１はタグなしＵｂについての手順を使用してイソペプチドを介してＥ２に酵素的にコンジュゲートした（図１７および１８）。次に、我々はＥＧＦ刺激に応答して内因性Ｃｂｌ活性化が検出されることができたかどうかをテストしたが、それはＣｂｌリン酸化を誘導する（Ｌｅｖｋｏｗｉｔｚ（レフコウィッツ）ら、１９９９；Ｌｅｖｋｏｗｉｔｚら、１９９８）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＥＧＦにより刺激し、および活性化されたＲＩＮＧ Ｅ３ｓの潜在的な分解を防ぐために、我々はプロテアソームおよびリソソームインヒビターＭＧ１３２およびバフィロマイシンによりそれぞれ事前処理した。並行実験により、下流マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性化について免疫ブロットすることによってＥＧＦ応答性を確かめ、それはＥＧＦ受容体活性化のローバスト（ｒｏｂｕｓｔ、堅牢な）マーカーである（Ｔｒａｖｅｒｓｅ（トラバース）， Ｓ．ら、（１９９２）． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．（バイオケミカル・ジャーナル）， ２８８（Ｐｔ ２）， ３５１－３５５、図１９ａ）。
【0144】
抽出したプロテオームはビオチン化した光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１と共にインキュベートし、およびストレプトアビジン樹脂に対して濃縮した（Ｐａｏら、２０１８、前掲、図４ｄ）。架橋タンパク質の識別およびそれらのプローブ反応性は、ストレプトアビジン濃縮に続いて、データ依存性の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）およびスペクトルカウントによって推論した（Ｐａｏら、２０１８、前掲）。２５のＲＩＮＧ Ｅ３ｓがＣｂｌを含めて検出された。ＣｂｌペプチドはＥＧＦ－およびＵＶ－処理されたサンプルにおいてだけ検出された（図４ｅ）。これは、光架橋プローブが内因性レベルにて自然なＲＩＮＧ Ｅ３活性化を検出することができることを示唆する。興味深いことに、他の２つのＲＩＮＧ Ｅ３ｓ、Ｐｒａｊａ２およびＴＲＩＭ１１についてスペクトルカウントにおける顕著な増加があり、それはＥＧＦ－およびＵＶ－依存性であった（図４ｅ）。これらのＥ３ｓの両方は増殖因子シグナル伝達と関係していたため、それらの検出はまた、ＥＧＦ刺激に応答したそれらの活性化またはアップレギュレーションを反映し得る（Ｄｉ（ダイ）， Ｋ．らＯｎｃｏｇｅｎｅ（オンコジーン）， ３２， ５０３８－５０４７； Ｒｉｎａｌｄｉ（リナルディ）， Ｌ．ら（２０１６）． Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．（セル・デス＆ディジーズ）７， ｅ２２３０．）。
【0145】
我々はＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）およびＲＣＲ（１）Ｅ３ｓ、ならびに脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢｓ）（３１）およびＥ１活性化酵素のＵＶ依存性濃縮を予想外に取得した（図１９ａおよび１９ｂ）。結果として、これらの追加のユビキチンシステム構成要素のプローブ修飾は、それらの活性をモジュレートし、および研究中のＲＩＮＧ Ｅ３ｓの活性化状態、または安定性を変えることができた。しかしながら、このことは、細胞抽出物の採用に関連する制限を超える任意の制限を提示するとはありそうになく、そこで細胞プロセスの大部分が停止するであろう。
【0146】
（代替Ｅ２に基づく光架橋ＡＢＰの生産）
また、異なるＥ２酵素に基づくＡＢＰも合成した。酵素ＵＢＥ２Ｎ（またＵｂｃ１３としても知られる）を採用した。Ｂｐａ３１変異Ｕｂ分子を活性部位位置にコンジュゲートさせるために、上述と同様の戦略を採用した。触媒に関するシステイン（Ｃｙｓ８７）をリジンに変異させ、安定なＥ１媒介イソペプチドコンジュゲーションが可能にされた。野生型ユビキチンを採用した他の研究では、活性部位に近接する自然なリジン残基（Ｌｙｓ９２）へのコンジュゲーションが観察されたことに注目すべきである（Ｂｒａｎｉｇａｎ（ブラニガン）、らＮａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２， ５９７－６０２）。このように、均質な修飾を確実にするために、ＵＢＥ２Ｎ Ｃ８７Ｋ Ｋ９２Ａ二重変異をＢｒａｎｉｇａｎらの研究において例証されるように採用した。ＵＢＥ２Ｎプローブは、ＵＢＥ２Ｎ Ｅ２酵素の生理学的パートナーであることが知られるＥ３リガーゼ（ＴＲＡＦ６）と機能した（図２０）。ＵＢＥ２Ｎを基にしたプローブは、そこでＵＢＥ２Ｄ３について上述したように、ユビキチン分子がビオチン化され、また調製され（Ｕｂｃ１３－ビオチン－ＵｂＢｐａ３）、および細胞抽出物においてのＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの活性ベースのプロテオームプロファイリングが可能であることが示された。
また、異なるＥ２酵素に基づくＡＢＰも合成した。酵素ＵＢＥ２Ｎ（またＵｂｃ１３としても知られる）を採用した。Ｂｐａ３１変異Ｕｂ分子を活性部位位置にコンジュゲートさせるために、上述と同様の戦略を採用した。触媒に関するシステイン（Ｃｙｓ８７）をリジンに変異させ、安定なＥ１媒介イソペプチドコンジュゲーションが可能にされた。野生型ユビキチンを採用した他の研究では、活性部位に近接する自然なリジン残基（Ｌｙｓ９２）へのコンジュゲーションが観察されたことに注目すべきである（Ｂｒａｎｉｇａｎ（ブラニガン）、らＮａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２， ５９７－６０２）。このように、均質な修飾を確実にするために、ＵＢＥ２Ｎ Ｃ８７Ｋ Ｋ９２Ａ二重変異をＢｒａｎｉｇａｎらの研究において例証されるように採用した。ＵＢＥ２Ｎプローブは、ＵＢＥ２Ｎ Ｅ２酵素の生理学的パートナーであることが知られるＥ３リガーゼ（ＴＲＡＦ６）と機能した（図２０）。ＵＢＥ２Ｎを基にしたプローブは、そこでＵＢＥ２Ｄ３について上述したように、ユビキチン分子がビオチン化され、また調製され（Ｕｂｃ１３－ビオチン－ＵｂＢｐａ３）、および細胞抽出物においてのＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの活性ベースのプロテオームプロファイリングが可能であることが示された。
【0147】
（考察）
簡潔には、我々はＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼのアダプター様活性についての活性ベースのプローブを開発した。我々は、ＲＮＦ４、ｃ－ＣｂｌおよびＴＲＡＦ６についてのそれらの本来の活性化の合図に応じた活性依存的シグナルおよびＡＢＰベースの読み出しがさらなる機構的洞察をどのようにしてもたらすことができるかを実証する。これらのツールは、多様なサンプルタイプにおいてＲＩＮＧ Ｅ３活性（Ｅ１、Ｅ２、または基質への依存性がない）の直接的なアセスメントを可能にする。我々はまた、抽出したプロテオームにおける内在性ＲＩＮＧ Ｅ３ｓのサブセットの並列化プロファイリングを実証し、および増殖因子刺激に応答したＣｂｌの活性化を検出する。そういうものとして、この技術は、ＲＩＮＧ Ｅ３調節生物学、標的発見、バイオマーカー応用およびモジュレーター発見の研究において有用性が見出されるべきである。我々のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験でのＲＩＮＧ Ｅ３ｓのサブセットだけでの検出は、多くが不活性であるか、または我々の目下の実験条件の検出限界を超えていることの反映によるかもしれない。別の可能性は、多くのＥ３ｓが使用したＥ２酵素と機能しないことである（光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１は（ＵＢＥ２Ｄ３）に基づく）。しかしながら、工学的に作り出されたイソペプチドコンジュゲーション戦略は、不安定なチオエステルの安定化について、ＵＢＥ２Ｄ３、例えば、ＵＢＥ２Ｎなどのようなものから分岐するＥ２ｓにより実証した（Ｂｒａｎｉｇａｎら、２０１５；Ｏｒｄｕｒｅａｕ（オルドゥロー）ら、２０１５）。それゆえに、我々の高度なモジュールによるプローブ生産戦略は、単純に別個の組換えＥ２基礎的構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）を使用することによって他のＥ２ｓにも難なく適用可能なはずである。これは潜在的に、より一層広範囲なＲＩＮＧ Ｅ３適用範囲を与え、およびまた細胞のＥ２－Ｅ３相互作用ネットワーク中に洞察を提供するであろう。
簡潔には、我々はＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼのアダプター様活性についての活性ベースのプローブを開発した。我々は、ＲＮＦ４、ｃ－ＣｂｌおよびＴＲＡＦ６についてのそれらの本来の活性化の合図に応じた活性依存的シグナルおよびＡＢＰベースの読み出しがさらなる機構的洞察をどのようにしてもたらすことができるかを実証する。これらのツールは、多様なサンプルタイプにおいてＲＩＮＧ Ｅ３活性（Ｅ１、Ｅ２、または基質への依存性がない）の直接的なアセスメントを可能にする。我々はまた、抽出したプロテオームにおける内在性ＲＩＮＧ Ｅ３ｓのサブセットの並列化プロファイリングを実証し、および増殖因子刺激に応答したＣｂｌの活性化を検出する。そういうものとして、この技術は、ＲＩＮＧ Ｅ３調節生物学、標的発見、バイオマーカー応用およびモジュレーター発見の研究において有用性が見出されるべきである。我々のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験でのＲＩＮＧ Ｅ３ｓのサブセットだけでの検出は、多くが不活性であるか、または我々の目下の実験条件の検出限界を超えていることの反映によるかもしれない。別の可能性は、多くのＥ３ｓが使用したＥ２酵素と機能しないことである（光ＡＢＰ－ＵｂＢｐａ３１は（ＵＢＥ２Ｄ３）に基づく）。しかしながら、工学的に作り出されたイソペプチドコンジュゲーション戦略は、不安定なチオエステルの安定化について、ＵＢＥ２Ｄ３、例えば、ＵＢＥ２Ｎなどのようなものから分岐するＥ２ｓにより実証した（Ｂｒａｎｉｇａｎら、２０１５；Ｏｒｄｕｒｅａｕ（オルドゥロー）ら、２０１５）。それゆえに、我々の高度なモジュールによるプローブ生産戦略は、単純に別個の組換えＥ２基礎的構成要素（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）を使用することによって他のＥ２ｓにも難なく適用可能なはずである。これは潜在的に、より一層広範囲なＲＩＮＧ Ｅ３適用範囲を与え、およびまた細胞のＥ２－Ｅ３相互作用ネットワーク中に洞察を提供するであろう。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図7-6】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-09-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ユビキチンの位置３１でのグルタミン残基および／または位置３２でのアスパラギン酸残基の代わりに光架橋剤モイエティを含む、活性化ユビキチン分子。
【請求項2】
ユビキチンはヒトユビキチンである、請求項１に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項3】
光架橋剤モイエティは、アスパラギン酸／グルタミン残基の代わりに非自然アミノ酸、例えば、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニンなどのようなものの組込みによって得られた、請求項１または２のいずれかに記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項4】
レポータータグをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項5】
レポータータグは、ビオチンモイエティ、または分析的検出を可能にする他のレポーター、例は、エピトープタグ、フルオロフォアである、請求項４に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項6】
ビオチンモイエティ／レポータータグは、ユビキチンのＮ末端に付着したリンカー分子を通してユビキチン分子に共有結合的に付着している、請求項４または５に記載の活性化ユビキチン分子。
【請求項7】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーションした、請求項１～６のいずれか一項に記載の活性化ユビキチン分子を含む、コンジュゲート分子。
【請求項8】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素は、Ｃ８５ＫもしくはＣ８７Ｋ変異および／またはＳ２２ＲもしくはＫ９２Ａ変異を含む変異酵素である、請求項７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項9】
Ｅ２コンジュゲーティング酵素はＵＢＥ２Ｄ３またはＵＢＥ２Ｎである、請求項７または８に記載のコンジュゲート分子。
【請求項10】
Ｎ末端Ｈｉｓ－タグ基、例えば、ヘキサヒスチジンタグなどのようなものをさらに含む、請求項７－９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項11】
ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素の活性プロファイリングの方法における、請求項７－１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子の使用。
【請求項12】
活性プロファイリングはＲＩＮＧ Ｅ３酵素のものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
（ｉ）ＲＩＮＧ Ｅ３酵素調節の研究、（ｉｉ）新規ＲＩＮＧ Ｅ３酵素の発見、（ｉｉｉ）インヒビタースクリーニング、（ｉｖ）インヒビター選択性プロファイリング；および／または（ｖ）構造研究用の酵素中間体の安定化のための、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
請求項７－１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子とＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素との間の相互作用を検出する方法であって、コンジュゲート分子を前記ＲＩＮＧ Ｅ３酵素、ＲＩＮＧ Ｅ１酵素および／または脱ユビキチン化酵素と接触させること、および任意の新しいコンジュゲートの形成を検出することを含む、方法。
【請求項15】
ＲＩＮＧ Ｅ３酵素は、ＲＮＦ４、Ｃｂｌ、例えば、ｃ－Ｃｂｌなどのようなもの、Ｐｒａｊａ２、ＴＲＩＭ１１、ＨＥＣＴ（１１）、ＲＢＲ（１）、ＲＣＲ（１）ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ２およびＨＬＴＦの任意の一つまたは組合せであり、および脱ユビキチン化酵素はＤＵＢｓ（３１）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
相互作用はＲＩＮＧ Ｅ３酵素とのものである、請求項１４または１５に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0012】
第二の態様において、本発明はＥ２コンジュゲーティング酵素にコンジュゲーションした第一の態様の活性化ユビキチン分子を含む、コンジュゲート分子を提供する。
【国際調査報告】