特表 2022-546046 修飾された環状ＲＮＡ及びその使用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-02

(54)【発明の名称】修飾された環状ＲＮＡ及びその使用法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20221026BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20221026BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20221026BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20221026BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20221026BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20221026BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 39/002 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20221026BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20221026BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20221026BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20221026BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20221026BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20221026BHJP

   A61P 33/14 20060101ALI20221026BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20221026BHJP

   C12N 15/30 20060101ALN20221026BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20221026BHJP

   C12N 15/33 20060101ALN20221026BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

C12N15/63 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12P19/34 A

A61K48/00

A61K31/7088

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K39/12

A61K39/02

A61K39/002

A61K39/00 K

A61K39/00 Z

A61K9/51

A61K47/59

A61K35/76

A61K35/761

A61K47/61

A61K38/02

A61P35/00

A61P31/12

A61P31/04

A61P33/14

C12N15/12 ZNA

C12N15/30

C12N15/31

C12N15/33

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022513181

(86)(22)【出願日】2020-08-26

(85)【翻訳文提出日】2022-04-20

(86)【国際出願番号】 US2020047995

(87)【国際公開番号】W WO2021041541

(87)【国際公開日】2021-03-04

(31)【優先権主張番号】62/892,776

(32)【優先日】2019-08-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ハワード・ワイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ロバート

(72)【発明者】

【氏名】アマヤ，ローラ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チュン－カン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AF27

4B064BJ10

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA01

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC32

4C076CC34

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE30

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZB33

4C084ZB35

4C084ZB37

4C084ZC75

4C085AA03

4C085BA02

4C085BA07

4C085BA49

4C085BA51

4C085BB11

4C085EE01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB33

4C086ZB35

4C086ZB37

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZB37

4C087ZC75

(57)【要約】

本明細書において、少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出する方法が提示される。ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡは、物質を、細胞へと送達し、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離するのに使用されうる。環状ＲＮＡの免疫原性をモジュレートするための方法もまた、提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない環状ＲＮＡ分子を含むワクチン組成物。

【請求項2】

環状ＲＮＡが、ＲＲＡＣＨモチーフを欠く、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

少なくとも１つの抗原をさらに含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

環状ＲＮＡ分子が、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

ポリペプチドをコードする配列が、少なくとも１つの抗原をコードする、請求項４に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

少なくとも１つの抗原が、ウイルス由来、細菌由来、寄生虫由来、真菌由来、原虫由来、プリオン由来、細胞由来、又は細胞外由来の抗原である、請求項３又は５に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

少なくとも１つの抗原が、腫瘍抗原である、請求項３又は５に記載のワクチン組成物。

【請求項8】

環状ＲＮＡ分子が、インビトロ転写を使用して作製される、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項9】

環状ＲＮＡが、組成物中に、ネイキッドＲＮＡとして存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

環状ＲＮＡが、ナノ粒子と複合体を形成している、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

ナノ粒子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子である、請求項１０に記載のワクチン組成物。

【請求項12】

自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発する方法であって、対象へと、有効量の、請求項１～１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む方法。

【請求項13】

環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組成物であって、環状ＲＮＡが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない組成物。

【請求項14】

ＤＮＡ配列が、ＲＲＡＣＨモチーフを一切含まない、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

ウイルスベクター又は非ウイルスベクターが、ＤＮＡ配列を含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【請求項16】

ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はヘルペスウイルスベクターである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

非ウイルスベクターが、プラスミドである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項18】

自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発する方法であって、対象へと、有効量の、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。

【請求項19】

インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法であって、
（ａ）環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；
（ｃ）ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び
（ｄ）直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップ
を含み；
リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を一切含まず；
環状ＲＮＡが、対象において、自然免疫応答をもたらすことが可能である、
方法。

【請求項20】

環状ＲＮＡが、ｍ^６Ａを一切含まない、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法であって、
（ａ）環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；
（ｃ）ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び
（ｄ）直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップ
を含み；
リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を含み；
環状ＲＮＡが、同じ方法を使用するが、ｍ^６ＡＴＰの非存在下で使用して作製される環状ＲＮＡと比較して免疫原性が小さい、
方法。

【請求項22】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を低減する方法であって、
（ａ）対象において自然免疫応答を誘導する環状ＲＮＡ分子を用意するステップ；及び
（ｂ）Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）、シュードウリジン及びイノシンから選択される少なくとも１つのヌクレオシドを、環状ＲＮＡ分子へと導入して、自然免疫原性が低減された修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップ、
を含む方法。

【請求項26】

修飾環状ＲＮＡを、対象へと投与するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１％が、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１０％が、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する、請求項２１に記載の方法。

【請求項29】

環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を増大させる方法であって、
（ａ）ＲＲＡＣＨモチーフを欠く環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び
（ｂ）１つ以上のアデノシンを、別の塩基により置きかえて、自然免疫原性が増大させられた修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップ、
を含む方法。

【請求項30】

修飾環状ＲＮＡを、対象へと投与するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、ウラシルにより置きかえられる、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、ウラシルにより置きかえられる、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、ウラシルにより置きかえられる、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

物質を、細胞へと送達する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；
（ｂ）物質を、組換え環状ＲＮＡ分子へと接合させて、物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体を作製するステップ；及び
（ｃ）細胞を、複合体と接触させるステップであって、これにより、物質が、細胞へと送達されるステップ、
を含む方法。

【請求項35】

物質が、タンパク質又はペプチドである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

物質が、抗原又はエピトープである、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

物質が、低分子である、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

物質が、組換え環状ＲＮＡ分子へと共有結合的に連結される、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）及び１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインを含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び
（ｂ）ＲＮＡ結合性タンパク質を含む細胞を、組換え環状ＲＮＡ分子と接触させるステップであって、これにより、ＲＮＡ結合性タンパク質が、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインに結合し、細胞内に隔離されるステップ、
を含む方法。

【請求項40】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、細胞内において異常に発現されている、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列によりコードされる、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、疾患と関連する、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

組換えＲＮＡ分子が、ファージＴ４チミジル酸シンターゼ（ｔｄ）遺伝子の自己スプライシングＩ群イントロン及び少なくとも１つのエクソンを含む、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

組換え環状ＲＮＡ分子が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

組換え環状ＲＮＡ分子が、２００ヌクレオチド～６，０００ヌクレオチドの間のヌクレオチドを含む、請求項３９～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

組換え環状ＲＮＡ分子が、約１，５００ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１９年８月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／８９２，７７６号に対する優先権を主張する。

【0002】

配列表に関する言明
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキストフォーマットで提示され、本明細書への参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＳＴＤＵ２＿３７８３３＿１０１＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。ファイルは、約４ｋｂであり、２０２０年８月２４日に作成され、電子的に提出されている。
分野
本出願は、環状ＲＮＡを修飾して、その免疫原性を低減する、又は増大させる方法の他、修飾環状ＲＮＡを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

真核生物において、何万もの環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）が同定されている。肝炎デルタウイルス及び植物ウィロイドなどのウイルスは、ｃｉｒｃＲＮＡゲノムを有し、多くのウイルスは、環状ＲＮＡを、それらの複製周期の通常部分として産生する。近年の研究は、部分的に、ｃｉｒｃＲＮＡに基づく、自然免疫系像についての新たな描像を示唆する。ある特定の外因性ｃｉｒｃＲＮＡの導入が、抗ウイルスプログラム及び免疫遺伝子発現プログラムを活性化させうるのに対し、内因性ｃｉｒｃＲＮＡは、総体として、タンパク質キナーゼＲを阻害し、ウイルス感染時に、自然免疫に対する閾値を設定しうる。

【0004】

哺乳動物の自然免疫系は、ウイルス及び細菌の間で一般的な、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ）に依存する。ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５は、外来核酸を感知する、細胞質ゾル内において見出されるＰＲＲである。ＭＤＡ５は、長いｄｓＲＮＡを検出することが公知であるのに対し、ＲＩＧ－Ｉは、短いｄｓＲＮＡ上の５’三リン酸を認識することが示されている。ＲＩＧ－Ｉの活性化のための直鎖状ＲＮＡリガンドは、広範に特徴づけられているが、とりわけ、外来ｃｉｒｃＲＮＡ検出の文脈において、ＲＩＧ－Ｉの、ｃｉｒｃＲＮＡとの相互作用は、調べられていない。

【0005】

Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）は、最も豊富なＲＮＡ修飾のうちの１つである。ｍＲＮＡ上において、ｍ^６Ａは、スプライシング、翻訳及び分解を含む、細胞規模の作用及び組織規模の作用を及ぼしうる様々な機能を調節することが裏付けられている。既存の研究は、ｍ^６Ａがまた、ｃｉｒｃＲＮＡ上にも存在し、キャップ非依存性翻訳を誘発する潜在的可能性を有することを示唆している。しかし、ｍ^６Ａの、ｃｉｒｃＲＮＡ機能に対する作用及びＲＩＧ－Ｉによる、ｃｉｒｃＲＮＡの検出におけるその役割は、知られていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

環状ＲＮＡプラットフォームを、バイオテクノロジーにおいて使用するために、環状ＲＮＡの免疫原性を操作する組成物及び方法が、依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

（発明の要旨）
本明細書において、環状ＲＮＡの免疫原性を操作するための組成物及び方法並びにこれらの使用が提示される。

【0008】

一部の実施形態において、本開示は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない環状ＲＮＡ分子を含むワクチン組成物を提示する。

【0009】

一部の実施形態において、本開示は、環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組成物であって、環状ＲＮＡが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない組成物を提示する。

【0010】

本開示はまた、自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発するための方法であって、対象へと、有効量の、本明細書において記載される環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組成物を投与するステップを含む方法も提示する。

【0011】

本開示はまた、自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発するための方法であって、対象へと、有効量の、ｍ^６Ａ残基を含有しない環状ＲＮＡ分子を含むワクチン組成物を投与するステップを含む方法も提示する。

【0012】

本明細書においてまた、インビトロ転写により、環状ＲＮＡを作製するための方法であって、環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップを含み；リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を一切含まず；環状ＲＮＡが、対象において、自然免疫応答をもたらすことが可能である方法も提示される。

【0013】

本明細書においてまた、インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製するための方法であって、環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップを含み；リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を含み；環状ＲＮＡが、同じ方法を使用するが、ｍ^６ＡＴＰの非存在下で使用して作製される環状ＲＮＡと比較して免疫原性が小さい方法も提示される。

【0014】

本開示は、物質を、細胞へと送達する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；（ｂ）物質を、組換え環状ＲＮＡ分子へと接合させて、物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体を作製するステップ；及び（ｃ）細胞を、複合体と接触させるステップであって、これにより、物質が、細胞へと送達されるステップを含む方法を提示する。

【0015】

本開示はまた、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）及び１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインを含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び（ｂ）ＲＮＡ結合性タンパク質を含む細胞を、組換え環状ＲＮＡ分子と接触させるステップであって、これにより、ＲＮＡ結合性タンパク質が、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインに結合し、細胞内に隔離されるステップを含む方法も提示する。

【0016】

本開示は、環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を低減する方法であって、（ａ）対象において自然免疫応答を誘導する環状ＲＮＡ分子を用意するステップ；及び（ｂ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を、環状ＲＮＡ分子へと導入して、自然免疫原性が低減された修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法をさらに提示する。

【0017】

また、対象における環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を増大させる方法であって、（ａ）ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）を欠く環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び（ｂ）環状ＲＮＡ配列内の１つ以上のアデノシンを、別の塩基（例えば、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はイノシン）により置きかえて、自然免疫原性が増大させられた修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1-1】図１Ａは、ゲル精製の前における、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮについてのアガロースゲル電気泳動（左）及び結果として得られる精製ＲＮＡについてのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ解析（右）を描示する画像を含む図である。図１Ｂは、ＨｅＬａ細胞への、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。^＊ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションを、ゲル精製ＲＮＡトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０５である。

【図1-2】図１Ｃは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ精製についてのＨＰＬＣクロマトグラムである。出力波形上に指し示された回収画分（左）及び精製ＲＮＡについてのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ解析（右）である。図１Ｄは、ＨｅＬａ細胞への、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。^＊ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションを、表示のＲＮＡのトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０５である。

【図2-1】図２Ａは、ＯＶＡを伴う、アゴニストＲＮＡの皮下注射を描示する概略図である。Ｔ細胞についてのＩＣＳ及び抗体力価を、一次免疫化及び二次免疫化後の表示の時点において測定した。図２Ｂは、一次ワクチン接種の後において、ｃｉｒｃＲＮＡが、トランスフェクション剤に依存しない抗ＯＶＡ Ｔ細胞応答を刺激することを例示するグラフである。平均値を示す（ｎ＝５）が、^＊クルスカル－ワリス検定によるｐ＜０．０５である。図２Ｃは、二次ワクチン接種の後において、ｃｉｒｃＲＮＡが、トランスフェクション剤に依存しない抗ＯＶＡ抗体力価を刺激することを例示するグラフである。平均値を示す（ｎ＝５）が、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。

【図2-2】図２Ｄは、皮下注射により送達されるＯＶＡを伴う、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによるワクチン接種を描示する概略図である。１４日後、左右の脇腹において、ＯＶＡ発現Ｂ１６黒色腫細胞を確立した。腫瘍を、測定及びイメージングした。図２Ｅは、腫瘍確立の前にＰＢＳ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをワクチン接種されたマウスについての左右の腫瘍における生物発光測定の定量を示す画像を含む図である。ウィルコクソン符合順位検定により計算されたｐ値である。各群内のマウスのｎ＝５である。図２Ｆは、腫瘍確立の前にＰＢＳ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをワクチン接種されたマウスについての左右の腫瘍における生物発光測定の定量を示すグラフを含む図である。ウィルコクソン符合順位検定により計算されたｐ値である。各群内のマウスのｎ＝５である。図２Ｇは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをワクチン接種されたマウスが、陰性対照マウスの２倍長く生存することを示すグラフである。グラフは、腫瘍確立の前にＰＢＳ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをワクチン接種されたマウスについての生存曲線を示す。ログランク検定により計算されたｐ値である。各群内のマウスのｎ＝５である。

【図3-1】図３Ａは、ＩＦＮγ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞についてのＦＡＣＳ解析のためのゲーティング戦略を示すグラフを含む図である。図３Ｂは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、二次免疫化の後において、ＰＥＩに依存しない抗ＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答を刺激することを示すグラフである。平均値を示すが（ｎ＝５）、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。図３Ｃは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、二次免疫化の後において、ＰＥＩに依存しない抗ＯＶＡ抗体力価を刺激することを示すグラフである。平均値を示す（ｎ＝５）が、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。

【図3-2】図３Ｄは、ｃＤＣ１細胞及びｃＤＣ２細胞についてのＦＡＣＳ解析のためのゲーティング戦略を示すグラフを含む図である。図３Ｅは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる免疫化が、マウスにおける樹状細胞（ＤＣ）を活性化させることを例示するグラフを含む図である。

【図3-3】図３Ｆは、ＰＢＳ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをワクチン接種されたマウスにおける左右の腫瘍の体積の測定についてのグラフを含む図である。ウィルコクソン符合順位検定により計算されたｐ値である。図３Ｇは、ＰＢＳ又は陽性対照であるｐｏｌｙＩ：Ｃをワクチン接種されたマウスについての生存曲線についてのグラフを含む図である。ログランク検定により計算されたｐ値である。

【図4-1】図４Ａは、ｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１、ｃｉｒｃＳＥＬＦ及びｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮについてのＣｈＩＲＰ－ＭＳによるペプチドカウントについてのヒートマップである。酵素を、ｍ^６Ａライター、ｍ^６Ａリーダー及びｍ^６Ａイレーサーとして分類する。図４Ｂは、ＣｈＩＲＰ－ＭＳにより指し示される通り、ｍ^６Ａ機構が、ｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１及びｃｉｒｃＳＥＬＦと会合するが、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと会合しないことを示すグラフである。ＲＮアーゼ処理対照に対するエンリッチメント倍数を示す。

【図4-2】図４Ｃは、タンパク質支援型スプライシングを方向付けて、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＳＥＬＦをもたらすＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び自己触媒性スプライシングを方向付けて、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを形成するファージｔｄイントロンを示す概略モデルである。図４Ｄは、ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰが、ｃｉｒｃＲＮＡスプライス接合部に近位の高信頼性ｍ^６Ａ位置を同定することを示すグラフである。ＺＫＳＣＡＮ１イントロンは、ｔｄイントロン指向ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと比較して、ｃｉｒｃＳＥＬＦ上のｍ^６Ａ修飾を方向付けるのに十分である。ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰリードの密度は、１００万当たりのリード数（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）に対して正規化した。図４Ｅは、ＨｅＬａ細胞内の内因性ヒトｃｉｒｃＲＮＡのｃｉｒｃＲＮＡスプライス接合部の近傍におけるｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰのリード密度を示すグラフである。ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰリードの密度は、ｃｉｒｃＲＮＡスプライス接合部に近位のリードについての１００万当たりのリード数（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）に対して正規化した。

【図5】図５Ａは、ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰが、ｃｉｒｃＳＥＬＦ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの高信頼性ｍ^６Ａ位置を同定することを示すグラフである。ｃｉｒｃＳＥＬＦ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮにおいてエンリッチされるＲＴ ｓｔｏｐｓについてのフィッシャーの正確検定を示す。ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰリードの密度は、１００万当たりのリード数（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）に対して正規化した。図５Ｂは、内因性直鎖状ＲＮＡにおけるｍ^６Ａの頻度を示すグラフである。図５Ｃは、ＲＮアーゼＲ処理を伴う、又は伴わない、表示レベルのｍ^６Ａ修飾が組み込まれた、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのインビトロ転写についてのＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ解析を示す画像である。図５Ｄは、インビトロ転写時における、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡ及びｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡの形成を確認する、スプライス接合部にわたるｑＲＴ－ＰＣＲについての画像である。図は、表示の「逆位」プライマーを使用するｑＲＴ－ＰＣＲの後における、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡ及びｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡのアガロースゲルを示す。

【図6】図６Ａは、野生型ＨｅＬａ細胞への、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションは、免疫応答を刺激するが、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、これを刺激しないことを例示するグラフである。グラフは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフを示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）が、^＊直鎖状ＲＮＡによる遺伝子刺激を、表示のＲＮＡと比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０５である。図６Ｂは、ＲＲＡＣＨ ｍ^６Ａコンセンサスモチーフ（配列番号１７）を欠くｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮプラスミドのトランスフェクションが、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮより高レベルにおいて、免疫応答を刺激することを例示するグラフである。エクソン配列の全体にわたり、ＲＲＡＣＨモチーフ（部位のｎ＝１２）を、ＲＲＵＣＨ（配列番号１９）へと突然変異させた。スプライス接合部に後続する、最初の２００塩基（部位のｎ＝３７）内における、あらゆるアデノシンの、ウラシルへの突然変異は、免疫原性を、さらに増大させる。グラフは、ＤＮＡプラスミドのトランスフェクションの後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションを、表示のＲＮＡのトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定において^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１である。図６Ｃは、全てのアデノシンがウラシルにより置きかえられた、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮプラスミドのトランスフェクションが、免疫原性の上昇を結果としてもたらすことを例示するグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）が、^＊ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションを、表示のＲＮＡのトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０１である。図６Ｄは、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、一次ワクチン接種の後における抗ＯＶＡ Ｔ細胞応答を緩和することを示すグラフである。平均値を示す（ｎ＝１０）が、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。図６Ｅは、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡが、二次ワクチン接種の後における抗ＯＶＡ抗体力価を緩和することを示すグラフである。平均値を示す（ｎ＝１０）が、^＊ＡＮＯＶＡ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。

【図7】図７Ａは、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、免疫原性に対する効果についての概略モデルである。図７Ｂは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、抗ＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答を刺激し、１％のｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、二次免疫化の後における免疫を緩和することを示すグラフである。平均値を示す（ｎ＝１０）が、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。図７Ｃは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、抗ＯＶＡ抗体力価を刺激し、１％のｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡが、二次免疫化の後における免疫を緩和することを示すグラフである。平均値を示す（ｎ＝５）が、^＊Ａｎｏｖａ－チューキー検定によるｐ＜０．０５である。

【図8-1】図８Ａは、野生型ＨｅＬａ細胞及び２つのＹＴＨＤＦ２ノックアウト（ＫＯ）クローンについてのウェスタンブロット画像である。図８Ｂは、ＨｅＬａ ＹＴＨＤＦ２^－／－クローン＃２への、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。図８Ｃは、使用されたＹＴＨＤＦ１／２構築物についての概略図である。図８Ｄは、ＹＴＨＤＦ２－λ、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ２Ｎ、ＹＴＨＤＦ２Ｎ－λ、ＹＴＨＤＦ１Ｎ及びＹＴＨＤＦ１Ｎ－λについてのウェスタンブロット画像である。

【図8-2】図８Ｅは、ＲＩＰ－ｑＰＣＲによる、表示のＹＴＨタンパク質のエンリッチメントに続く、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＢｏｘＢ又は対照であるアクチンＲＮＡに対するｑＲＴ－ＰＣＲを示すグラフである。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。^＊スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５である。図８Ｆは、ＹＴＨＤＦ２ ＫＯ細胞への、ＹＴＨＤＦ２のＣ末端ＹＴＨドメインへとテザリングされた非修飾ｃｉｒｃＢｏｘＢのトランスフェクションが、免疫応答を緩和するのに不十分であることを示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。^＊ＹＴＨＤＦ２を伴う／ＹＴＨＤＦ２を伴わないトランスフェクションを受ける細胞を比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０５である。図８Ｇは、ＹＴＨＤＦ２ ＫＯ細胞への、ＲＦＰ－ＹＴＨドメインタンパク質融合体へとテザリングされた非修飾ｃｉｒｃＢｏｘＢのトランスフェクションが、免疫応答を緩和するのに不十分であることを示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。^＊ＹＴＨＤＦ２を伴う／ＹＴＨＤＦ２を伴わないトランスフェクションを受ける細胞を比較する、スチューデントのｔ検定におけるｐ＜０．０５である。図８Ｈは、ＹＴＨＤＦ１へとテザリングされた非修飾ｃｉｒｃＢｏｘＢのトランスフェクションが、免疫応答を緩和するのに不十分であることを示すグラフである。グラフは、野生型ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞への、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフを示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、ＹＴＨＤＦ１Ｎ－λＮを発現させるプラスミドのトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。

【図9-1】図９Ａは、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又はｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対する応答を示す概略モデルを含む図である。ＹＴＨＤＦ２^－／－ ＨｅＬａ細胞への、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又はｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションは、免疫応答を刺激した。図９Ａの右パネルは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。０％のｍ^６Ａを伴うｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクションを、表示のＲＮＡのトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定を使用した。図９Ｂは、ＹＴＨＤＦ２の異所性発現が、ＹＴＨＤＦ２ ＫＯ ＨｅＬａ細胞内の、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対する応答を、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと対比してレスキューすることを示す図である。図９Ｂの左パネルは、レスキューの後における、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対する応答を示す概略モデルである。図９Ｂの右パネルは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。０％のｍ^６Ａを伴うｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、１％のｍ^６Ａを伴うｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと比較する、スチューデントのｔ検定を使用して、^＊ｐ＜０．０５である。

【図9-2】図９Ｃは、ＹＴＨＤＦ２の、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへのテザリングが、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を遮蔽することを例示する図である。図９Ｃの左パネルは、免疫原性の緩和をもたらす、インビボにおける、ラムダＮ及びＢｏｘＢを介する、タンパク質の、ＲＮＡへのテザリングを示す概略モデルである。図９Ｃの右上パネルは、ラムダＮテザリングタグを伴う全長野生型ＹＴＨＤＦ２及びこれを伴わない全長野生型ＹＴＨＤＦ２並びにラムダＮテザリングタグを伴うＹＴＨＤＦ２のＮ末端ドメイン及びこれを伴わないＹＴＨＤＦ２のＮ末端ドメインのタンパク質ドメインアーキテクチャーを示す概略図である。図９Ｃの右下パネルは、ＲＩＰ－ｑＰＣＲによる、表示のＹＴＨタンパク質のエンリッチメントに続く、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＢｏｘＢ又は対照であるアクチンＲＮＡに対するｑＲＴ－ＰＣＲを示すグラフである。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。ラムダＮテザリングを伴うＹＴＨＤＦ２のＮ末端を、テザリングを伴わないＹＴＨＤＦ２のＮ末端と比較する、スチューデントのｔ検定を使用して、^＊ｐ＜０．０５である。図９Ｄは、野生型ＨｅＬａ細胞への、全長野生型ＹＴＨＤＦ２へとテザリングされた非修飾ｃｉｒｃＢｏｘＢのトランスフェクションが、免疫応答を緩和したことを示すグラフである。グラフは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフを示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションに対して正規化した。野生型ＹＴＨＤＦ２－ラムダＮ（グレー）を、免疫原性についての陰性対照として、異所性発現させた。ｃｉｒｃＢｏｘＢのみのトランスフェクションを、免疫原性についての陽性対照として用いられた。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。ラムダＮテザリングを伴う野生型ＹＴＨＤＦ２を伴うｃｉｒｃＢｏｘＢを、ラムダＮテザリングを伴わない野生型ＹＴＨＤＦ２を伴うｃｉｒｃＢｏｘＢと比較する、スチューデントのｔ検定を使用して、^＊ｐ＜０．０５である。図９Ｅは、ＹＴＨＤＦ２ ＫＯ細胞への、ＹＴＨＤＦ２のＮ末端ドメインへとテザリングされた非修飾ｃｉｒｃＢｏｘＢのトランスフェクションが、免疫応答を緩和するのに不十分であることを示すグラフである。グラフは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフを示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果は、モックトランスフェクションに対して正規化した。ＹＴＨＤＦ２－ラムダＮのＮ末端ドメイン（黒）を、免疫原性についての陰性対照として、異所性発現させた。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。スチューデントのｔ検定を使用して、ラムダＮテザリングを伴うＹＴＨＤＦ２のＮ末端を伴うｃｉｒｃＢｏｘＢを、テザリングを伴わないＹＴＨＤＦ２のＮ末端を伴うｃｉｒｃＢｏｘＢと比較した。

【図10】図１０Ａは、ＲＩＧ－ＩのＫＯが、ｍ^６ＡライターＭＥＴＴＬ３の枯渇により誘導される細胞死をレスキューすることを示すグラフである。グラフは、表示のＲＮＡのトランスフェクション後の、野生型ＨｅＬａ細胞又はＲＩＧ－Ｉ ＫＯ ＨｅＬａ細胞における、細胞死の倍数変化を示す。平均値±ＳＥＭを示す（解析された細胞のｎ＝約５０，０００個である）。モックトランスフェクションを、表示のＲＮＡのトランスフェクションと比較する、スチューデントのｔ検定を使用して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１である。図１０Ｂは、図１０Ａにおいて描示されたＦＡＣＳ解析による、生の細胞カウントを示す表である。図１０Ｃは、ＭＥＴＴＬ３ ｓｉＲＮＡ又は非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた、野生型ＨｅＬａ細胞及びＲＩＧ－Ｉ ＫＯ ＨｅＬａ細胞において、ウェスタンブロットにより、ＭＥＴＴＬ３のノックダウン効率を検証する画像である。図１０Ｄは、野生型ＨｅＬａ細胞及びＲＩＧ－Ｉ ＫＯ ＨｅＬａ細胞において、ウェスタンブロットにより、ＲＩＧ－Ｉタンパク質の発現を検証する画像である。ＦＡＣＳ実験と同等な条件下において、細胞に、ＭＥＴＴＬ３ ｓｉＲＮＡ又は非ターゲティングｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。

【図11】図１１Ａは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＲＩＧ－ＩのＡＴＰアーゼ活性を誘導しないことを示すグラフである。ＲＩＧ－Ｉ及びＲＮＡをインキュベートし、ＡＴＰを添加した。表示の時点において、反応をクエンチングし、Ｐｉ濃度を測定した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝２）。図１１Ｂは、ＲＩＧ－Ｉを、表示のＲＮＡと共にインキュベートした後における、ＲＩＧ－Ｉフィラメントについての代表的電子顕微鏡画像を含む図である。図１１Ｃは、精製ＲＩＧ－Ｉ、Ｋ６３結合型ポリユビキチン及び表示のＲＮＡリガンドを伴う、インビトロにおけるＲＩＧ－Ｉ結合アッセイの結果を描示する画像である。描示されるＮａｔｉｖｅゲル電気泳動シフトアッセイは、ＲＩＧ－Ｉへの結合が、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮとを識別しないことを示す。図１１Ｄは、インビトロにおける、精製ＲＩＧ－Ｉ、ＭＡＶＳ、表示のＲＮＡリガンド及びＫ６３結合型ポリユビキチンの非存在又は存在を伴う再構成の結果を描示する画像である。描示される、蛍光標識化ＭＡＶＳ ２ＣＡＲＤドメインについてのＮａｔｉｖｅゲルは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ誘発性ＭＡＶＳフィラメント形成が、Ｋ６３結合型ポリユビキチンに依存することを示す。図１１Ｅは、インビトロにおける、ＩＲＦ３二量体化の、ｃｉｒｃＲＮＡ媒介性誘導の再構成を示す画像である。ＲＩＧ－Ｉ、ＩＲＦ３及び表示のＲＮＡリガンドをインキュベートした。表示のＲＮＡリガンドによる放射性標識化ＩＲＦ３についてのＮａｔｉｖｅゲルを示す。細胞質ＲＮＡ（ｃｙｔｏＲＮＡ）及び表示のＲＮＡは、各々、０．５ｎｇ／ｍＬにおいて添加した。

【図12】図１２Ａは、インビトロにおける、精製ＲＩＧ－Ｉ、ＭＡＶＳ、Ｋ６３－Ｕｂｎ及び表示のＲＮＡリガンドを伴う再構成を描示する画像である。蛍光標識化ＭＡＶＳ ２ＣＡＲＤドメインについてのＮａｔｉｖｅゲルを示す。図１２Ｂは、表示のＲＮＡによるＭＡＶＳ重合アッセイの後における、ＭＡＶＳフィラメントについての、代表的な電子顕微鏡画像を含む図である。スケールバーは、６００ｎｍを指し示す。図１２Ｃは、各アゴニストＲＮＡについて、５つの電子顕微鏡画像において観察された、ＭＡＶＳフィラメントの総数の定量を示すグラフである。^＊スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５である。図１２Ｄは、インビトロにおける、ＩＲＦ３二量体化の、ｃｉｒｃＲＮＡ媒介性誘導の再構成を描示する画像である。表示のＲＮＡリガンドによる放射性標識化ＩＲＦ３についてのＮａｔｉｖｅゲルを示す。Ｓ１は、細胞抽出物である。

【図13】図１３Ａは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３結合型ポリユビキチン鎖と共局在することを示す免疫蛍光画像を含む図である。代表的な視野を示す。図１３Ｂは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３－Ｕｂｎとの共局在の定量（ｎ＝１５２）を示すグラフである。生物学的反復にわたる、１０の視野にわたり、反復実験を代表するフォーサイを収集した。図１３Ｃは、１０％のｍ^６Ａ ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＹＴＨＤＦ２との共局在を増大させたことを示す免疫蛍光画像を含む図である。代表的な視野を示す。＞１０の視野にわたり、反復実験を代表するフォーサイを収集した。図１３Ｄは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及び１０％のｍ^６Ａ ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、ＹＴＨＤＦ２及びＲＩＧ－Ｉとの共局在の定量を示すグラフである。^＊ピアソンのχ^２検定によるｐ＜０．０５である。

【図14】Ｋ６３結合型ポリユビキチンに依存する、ＲＩＧ－Ｉによる、外来ｃｉｒｃＲＮＡの認識についての仮説的機構を例示する概略図である。

【図15】野生型ＨｅＬａ細胞への、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡ（すなわち、ｍ^６Ａ修飾を欠く）のトランスフェクションが、免疫応答を刺激することを示すグラフである。グラフは、ＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後における、自然免疫遺伝子の遺伝子発現を示すグラフを示す。表示のｍＲＮＡと、トランスフェクトされたＲＮＡとの相対発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定し、結果モックトランスフェクションの後における発現に対して正規化した。平均値±ＳＥＭを示す（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本開示は、少なくとも部分的に、ヒト環状ＲＮＡ分子（ｃｉｒｃＲＮＡ）のＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ＲＮＡ修飾が、ｃｉｒｃＲＮＡの免疫原性を低減するという発見を前提とする。外来ｃｉｒｃＲＮＡは、インビボにおいて、抗原特異的Ｔ細胞活性化、抗体産生及び抗腫瘍免疫を誘導する、強力なアジュバントであり、そのｍ^６Ａ修飾は、免疫遺伝子の活性化及びアジュバント活性を消失させることが見出されている。ｍ^６Ａリーダータンパク質であるＹＴＨＤＦ２は、ｍ^６Ａ－ｃｉｒｃＲＮＡを隔離し、自然免疫の抑制に重要である。

【0020】

定義
本技術についての理解を容易とするために、下記において、多数の用語及び語句が規定される。さらなる定義は、「発明を実施するための形態」全体にわたり明示される。

【0021】

本明細書において使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、ピリミジン塩基及び／又はプリン塩基、好ましくは、それぞれ、シトシン、チミン及びウラシル並びにアデニン及びグアニンのポリマー又はオリゴマーを指す。用語は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸の構成要素及びこれらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル化形態又はグリコシル化形態など、これらの任意の化学的変異体を包含する。ポリマー又はオリゴマーは、組成物中において異種の場合もあり、同種の場合もあり、天然に存在する供給源から単離される場合もあり、人工的に、又は合成的に作製される場合もある。加えて、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの混合物であることが可能であり、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖及びこれらのハイブリッド状態を含む、一本鎖形態又は二本鎖形態において、恒常的に存在する場合もあり、一過性に存在する場合もある。一部の実施形態において、核酸又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリックス、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ及びＣｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１（１４）：４５０３～４５１０（２００２）並びに米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい。）、ロックト核酸（ＬＮＡ；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７：５６３３～５６３８（２０００）を参照されたい。）、シクロヘキシニル核酸（Ｗａｎｇ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２：８５９５～８６０２（２０００）を参照されたい。）及び／又はリボザイムなど、他の種類の核酸構造を含む。「核酸」及び「核酸配列」という用語はまた、天然ヌクレオチド（例えば、「ヌクレオチド類似体」）と同じ機能を呈しうる、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチド構成要素を含む鎖も包含しうる。

【0022】

本明細書において使用される「ヌクレオシド」という用語は、リボース糖又はデオキシリボース糖へと接合された、プリン塩基又はピリミジン塩基を指す。ＤＮＡ内又はＲＮＡ内に一般に見出されるヌクレオシドは、シチジン、シトシン、デオキシリボシド、チミジン、ウリジン、アデノシン、アデニンデオキシリボシド、グアノシン及びグアニンデオキシリボシドを含む。本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡポリマー又はＲＮＡポリマーが構築される、単量体単位のうちの１つであって、プリン塩基又はピリミジン塩基、五炭糖及びリン酸基を含む単量体単位を指す。ＤＮＡのヌクレオチドは、デオキシアデニル酸、チミジル酸、デオキシグアニル酸及びデオキシシチジル酸である。対応するＲＮＡのヌクレオチドは、アデニル酸、ウリジル酸、グアニル酸及びシチジル酸である。

【0023】

本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学修飾アミノ酸若しくは生化学修飾アミノ酸又は誘導体化アミノ酸並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含みうる、少なくとも２つ以上の連続アミノ酸を含むアミノ酸のポリマー形態を指す。

【0024】

本明細書において使用される、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド及びアミノ酸についての命名法は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）基準に準拠する（例えば、ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｉｕｐａｃ．ｈｔｍｌを参照されたい。）。

【0025】

本明細書において使用された、「ＲＲＡＣＨモチーフ」という用語は、５ヌクレオチドのＤＮＡモチーフ又はＲＮＡモチーフを指し、この場合、Ｒは、Ａ又はＧであることが可能であり、Ｈは、Ａ、Ｃ又はＴ／Ｕでありうる。ＲＲＡＣＨモチーフは、ＤＮＡ内のコンセンサス配列である５’－（Ａ又はＧ）－（Ａ又はＧ）－Ａ－Ｃ－（Ａ又はＣ又はＴ）－３’（配列番号１７）又はＲＮＡ内のコンセンサス配列である５’－（Ａ又はＧ）－（Ａ又はＧ）－Ａ－Ｃ－（Ａ又はＣ又はＵ）－３’（配列番号１８）を有する。ｍ^６Ａ修飾は、典型的に、真核細胞内のＲＲＡＣＨモチーフ内において生じる。多くの細胞型において、ｍ^６Ａの付加は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４及びＷＴＡＰを含む、多重構成要素型メチルトランスフェラーゼ複合体により触媒される。一部の実施形態において、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１７～１８）は、ｍ^６Ａ修飾を低減する、又は消失させるように修飾されうる。例えば、ＲＲＡＣＨモチーフは、ＲＲＵＣＨモチーフ（配列番号１９～２０）へと修飾されうる。

【0026】

「抗原」とは、哺乳動物において、免疫応答を誘発する分子である。「免疫応答」は、例えば、抗体の産生及び／又は免疫エフェクター細胞の活性化を伴いうる。本開示の文脈における抗原は、哺乳動物において、免疫応答を惹起する、任意のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子（例えば、炭水化物又は脂質）の、任意のサブユニット、断片又はエピトープを含みうる。「エピトープ」とは、抗体又は抗原受容体により認識される抗原の配列を意味する。当技術分野において、エピトープはまた、「抗原決定基」とも称される。抗原は、哺乳動物において、免疫応答を惹起する、好ましくは、防御免疫をもたらす、ウイルス由来、細菌由来、寄生虫由来、真菌由来、原虫由来、プリオン由来、細胞由来、又は細胞外由来のタンパク質又はペプチドでありうる。

【0027】

本明細書において使用される「組換え」という用語は、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、天然系において見出される内因性核酸から識別可能な、構造的コード配列又は構造的非コード配列を有する構築物を結果としてもたらす、クローニングステップ、制限ステップ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ステップ及び／又はライゲーションステップの多様な組合せの生成物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片からアセンブルされる場合もあり、細胞内又は無細胞転写系内及び無細胞翻訳系内に含有される組換え転写単位からの発現が可能な合成核酸をもたらす、一連の合成オリゴヌクレオチドからアセンブルされる場合もある。対象とする配列を含むゲノムＤＮＡもまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成において使用されうる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側に存在する場合もあり、３’側に存在する場合もあるが、これらの場合に、このような配列は、コード領域の操作又は発現に干渉せず、多様な機構による、所望の生成物の作製をモジュレートするように作用しうる。代替的に、翻訳されないＲＮＡをコードするＤＮＡ配列もまた、組換えであると考えられうる。したがって、「組換え」核酸という用語はまた、天然に存在しない核酸、例えば、ヒト介入を介して、天然に存在しない形で隔てられた、２つの配列セグメントの人工的組合せにより作製された核酸も指す場合がある。この人工的組合せは、単離核酸セグメントの化学合成手段又は人工的操作により、例えば、遺伝子操作法により達せられることが多い。このような人工的組合せは、通例、コドンを、同じアミノ酸、保存的アミノ酸又は非保存的アミノ酸をコードするコドンにより置きかえることによりなされる。代替的に、人工的組合せは、所望の機能を有する核酸セグメントを、一体に接続して、所望の機能の組合せを作出するように実施されうる。この人工的組合せは、単離核酸セグメントの化学合成手段又は人工的操作により、例えば、遺伝子操作法により達せられることが多い。組換えポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然に存在する（「野生型」）配列の場合もあり、天然に存在する配列の変異体（例えば、突然変異体）の場合もある。したがって、「組換え」ポリペプチドという用語は、その配列が、天然において生じないポリペプチドを、必ずしも指さない場合がある。そうではなく、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によりコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然に存在する（「野生型」）配列の場合もあり、又は天然に存在しない（例えば、変異体、突然変異体など）配列の場合もある。したがって、「組換え」ポリペプチドは、ヒト介入を有するが、天然に存在するアミノ酸配列を含みうる。

【0028】

「結合性ドメイン」という用語は、別の分子に非共有結合的に結合することが可能なタンパク質ドメインを指す。結合性ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合しうる。タンパク質に結合するタンパク質ドメインの場合、タンパク質は、それ自身（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成するように）に結合する場合もあり、かつ／又は１つ以上の異なるタンパク質による、１つ以上の分子に結合する場合もある。

【0029】

環状ＲＮＡ
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）とは、ヘッドからテールへと接続され、当初、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）及び植物ウィロイドなど、病原性ゲノム内において発見された一本鎖ＲＮＡである。ｃｉｒｃＲＮＡは、真核細胞内に遍在する非コードＲＮＡのクラスとして認識されている。バックスプライシングを介して作出されるｃｉｒｃＲＮＡは、それらの驚くべき安定性のために、細胞間の情報伝達又は記憶において機能すると仮定されている。

【0030】

内因性ｃｉｒｃＲＮＡの機能は、知られていないが、それらの数の多さ及びウイルスｃｉｒｃＲＮＡゲノムの存在から、ヒトｃｉｒｃＲＮＡによる、ＮＦ９０／ＮＦ１１０の調節を介するウイルス抵抗性のモジュレーション（Ｌｉら、２０１７）及びＰＫＲの調節を介する自己免疫のモジュレーション（Ｌｉｕら、２０１９）についての、近年の発見により証拠立てられる通り、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫系があるのは必然である。本明細書において裏付けられる通り、ｃｉｒｃＲＮＡは、特異的なＴ細胞応答及びＢ細胞応答を誘導する、強力なアジュバントとして作用しうる。加えて、ｃｉｒｃＲＮＡは、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方を誘導することが可能であり、腫瘍の確立及び増殖を阻害する能力を有する。

【0031】

イントロンの識別が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を決定する（Ｃｈｅｎら、前出）が、最終的なｃｉｒｃＲＮＡ産物の一部ではないため、イントロンは、１つ以上の共有結合的化学的マーキングの、ｃｉｒｃＲＮＡへの付与を方向付けうることが仮定される。１００を超える公知のＲＮＡ化学修飾のうち、ｍ^６Ａは、哺乳動物ポリＡテール転写物内の、全てのアデノシンのうちの、０．２％～０．６％において存在する、直鎖状ｍＲＮＡ上及び長鎖非コードＲＮＡ上における、最も豊富な修飾（Ｒｏｕｎｄｔｒｅｅら、Ｃｅｌｌ、１６９：１１８７～１２００（２０１７））である。ｍ^６Ａは、近年、哺乳動物のｃｉｒｃＲＮＡ上において検出されている（Ｚｈｏｕら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０：２２６２～２２７６（２０１７））。本明細書において記載される通り、ヒトｃｉｒｃＲＮＡは、生誕時に、それらのバックスプライシングをプログラムするイントロンに基づき、１つ以上の共有結合的ｍ^６Ａ修飾によりマーキングされると考えられる。

【0032】

一部の実施形態において、本明細書において記載される方法は、少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップを伴う。組換えｃｉｒｃＲＮＡは、常套的な分子生物学法を使用して作出又は操作されうる。上記において開示された通り、組換えｃｉｒｃＲＮＡ分子は、典型的に、直鎖状ＲＮＡのバックスプライシングにより作出される。一実施形態において、環状ＲＮＡは、５’側スプライシング部位の下流（スプライシングドナー）から、３’側スプライシング部位の上流（スプライシングアクセプター）へのバックスプライシングにより、直鎖状ＲＮＡから作製される。環状ＲＮＡは、任意の非哺乳動物スプライシング法により、このようにして作出されうる。例えば、自己スプライシングＩ群イントロン、自己スプライシングＩＩ群イントロン、スプライセオソームイントロン及びｔＲＮＡイントロンを含む、多様な種類のイントロンを含有する直鎖状ＲＮＡが環状化されうる。特に、Ｉ群イントロン及びＩＩ群イントロンは、それらの自己触媒性リボザイム活性に起因する、自己スプライシングを経るそれらの能力により、インビトロ並びにインビボにおいて、環状ＲＮＡの作製のために、たやすく使用されうることの利点を有する。

【0033】

代替的に、環状ＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端と３’末端との化学的ライゲーション又は酵素的ライゲーションにより、インビトロにおいて、直鎖状ＲＮＡからも作製されうる。化学的ライゲーションは、例えば、ホスホジエステル結合の形成を可能とするように、臭化シアン（ＢｒＣＮ）又はエチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を、ヌクレオチドのホスホモノエステル基の活性化のために使用して実施されうる（Ｓｏｋｏｌｏｖａ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、２３２：１５３～１５５（１９８８）；Ｄｏｌｉｎｎａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：３０６７～３０７２（１９９１）；Ｆｅｄｏｒｏｖａ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、１５：１１３７～１１４７（１９９６））。代替的に、酵素的ライゲーションは、ＲＮＡを環状化するのに使用されうる。使用されうる、例示的なリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ Ｄｎｌ）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（Ｔ４ Ｒｎｌ １）及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（Ｔ４ Ｒｎｌ ２）を含む。

【0034】

他の実施形態において、スプリントライゲーションは、ＲＮＡを環状化するのに使用されうる。スプリントライゲーションは、ライゲーションのために、直鎖状ＲＮＡの末端を一体とする、直鎖状ＲＮＡの２つの末端とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドスプリントの使用を伴う。デオキシリボオリゴヌクレオチドの場合もあり、リボオリゴヌクレオチドの場合もある、スプリントのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ末端の５’－リン酸及び３’－ＯＨを、ライゲーションの向きに合わせる。後続のライゲーションは、上記において記載された化学法又は酵素法を使用して実施されうる。酵素的ライゲーションは、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡスプリントが要求される）、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１（ＲＮＡスプリントが要求される）又はＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（ＤＮＡスプリント又はＲＮＡスプリント）により実施されうる。ハイブリダイズされたスプリント－ＲＮＡ複合体の構造が、酵素活性に干渉する場合、ＢｒＣＮ又はＥＤＣなどによる化学的ライゲーションは、場合によって、酵素的ライゲーションより効率的である（例えば、Ｄｏｌｉｎｎａｙａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２１（２３）：５４０３～５４０７（１９９３）；Ｐｅｔｋｏｖｉｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４３（４）：２４５４～２４６５（２０１５）を参照されたい。）。

【0035】

１つ以上のｍ^６Ａ修飾を含む環状ＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオチドを、核酸配列へと導入するための、当技術分野で公知である、任意の適する方法を使用して作出されうる。一部の実施形態において、ｍ^６Ａは、例えば、Ｃｈｅｎら、前出において、記載されているインビトロ転写法などのインビトロ転写法を使用して、ＲＮＡ配列へと導入されうる。例示的なインビトロ転写反応は、プロモーターを含有する、精製直鎖状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴ及びマグネシウム並びに適切なファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＳＰ６、Ｔ７又はＴ３）を含む緩衝液系を要求する。当業者により理解される通り、転写反応において使用される正確な条件は、具体的適用に必要とされるＲＮＡの量に依存する。

【0036】

本明細書において記載される通りに作出される、特定のｃｉｒｃＲＮＡ分子内の、任意の数のアデノシンは、対応する数のｍ^６Ａにより修飾されうる（例えば、置きかえられうる）。理想的に、ｃｉｒｃＲＮＡ分子内の、少なくとも１つのアデノシンは、ｍ^６Ａにより置きかえられる。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの、少なくとも１％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％以上）は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）により置きかえられる。他の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの、少なくとも１０％（例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）は、Ｎ６－メチルアデノシンにより置きかえられる。例えば、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全て（すなわち、１００％）は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）により置きかえられうる。組換え環状ＲＮＡ分子へと導入されるｍ^６Ａ修飾の数は、本明細書においてさらに記載されるｃｉｒｃＲＮＡの特定の使用に依存することが理解される。

【0037】

一部の実施形態において、インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法は、環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップを含む。一部の実施形態において、リボヌクレオチド三リン酸は、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を一切含まない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、対象において、自然免疫応答をもたらすことが可能である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、対象において、自然免疫応答をもたらすことが可能である。

【0038】

一部の実施形態において、インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法は、環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップを含む。一部の実施形態において、リボヌクレオチド三リン酸は、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、同じ方法を使用するが、ｍ^６ＡＴＰの非存在下で使用して作製される環状ＲＮＡと比較して免疫原性が小さい。環状ＲＮＡの免疫原性は、環状ＲＮＡによる処置の後において、炎症応答を測定することにより決定されうる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡの免疫原性は、環状ＲＮＡによる処置の後においてもたらされる、Ｉ型インターフェロン応答若しくはＩＩ型インターフェロン応答又は１つ以上の炎症促進性サイトカインレベルを測定することにより決定されうる。例えば、環状ＲＮＡの免疫原性は、環状ＲＮＡによる処置の後において、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンオメガ（ＩＦＮω）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）又はインターロイキン１７（ＩＬ－１７）のレベルを測定することにより決定されうる。一部の実施形態において、免疫原性は、レチノイン酸誘導的遺伝子１（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ）、ＯＡＳ様タンパク質（ＯＡＳＬ）及び二本鎖ＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）のうちの１つ又は複数の発現又は活性を測定することにより決定されうる。免疫原性は、インビトロにおいて評価される場合もあり、インビボにおいて評価される場合もある。第１の環状ＲＮＡによる処置の後における炎症応答が、第２の環状ＲＮＡによる処置の後における炎症応答と比較して低減される場合、第１の環状ＲＮＡは、第２の環状ＲＮＡより免疫原性が小さい。

【0039】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、所望のレベルの免疫原性を有するように設計される。例えば、環状ＲＮＡは、高度に免疫原性となるように設計される場合もあり、低度に免疫原性となるように設計される場合もあり、実質的に非免疫原性である、又は非免疫原性となるように設計される場合もある。環状ＲＮＡの免疫原性は、環状ＲＮＡ内に存在するＲＲＡＣＨモチーフの数を修飾することにより制御される場合があり、この場合、ＲＲＡＣＨモチーフの数の増大は、免疫原性の低減をもたらし、ＲＲＡＣＨモチーフの減少は、免疫原性の増大をもたらす。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ又はこれをコードするＤＮＡ配列は、１～５、５～１０、１０～２５、２５～１００、１００～２５０、２５０～５００又は５００を超えるＲＲＡＣＨモチーフを含む。

【0040】

一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全ては、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である。

【0041】

一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの１％未満は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である。例えば、組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満又は０．１％未満は、ｍ^６Ａでありうる。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡは、１～５、５～１０、１０～２５、２５～１００、１００～２５０、２５０～５００又は５００を超えるｍ^６Ａ残基を含む。

【0042】

環状ＲＮＡは、一般に、主に、エクソヌクレアーゼ媒介性分解に必要な遊離末端が存在しないために、それらの直鎖状対応物より安定であるが、安定性をさらに改善するように、本明細書において記載されるｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡへと、さらなる修飾が施されうる。さらに他の種類の修飾は、環状化効率、ｃｉｒｃＲＮＡの精製及び／又はｃｉｒｃＲＮＡからのタンパク質の発現を改善しうる。例えば、組換えｃｉｒｃＲＮＡは、「相同性アーム」（すなわち、５’側スプライシング部位と３’側スプライシング部位とを、互いに近接させることを目的として、前駆体ＲＮＡの５’末端及び３’末端に配置される、９～１９ヌクレオチドの長さのアーム）、スペーサー配列及び／又はホスホロチオエート（ＰＳ）キャップを含むようにも操作されうる（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．、９：２６２９（２０１８））。組換えｃｉｒｃＲＮＡはまた、その安定性を増大させるのに、２’－Ｏ－メチルコンジュゲート、－フルオロコンジュゲート若しくは－Ｏ－メトキシエチルコンジュゲート、ホスホロチオエート骨格又は２’，４’－サイクリック２’－Ｏ－エチル修飾を含むようにも操作されうる（Ｈｏｌｄｔら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９：１２６２（２０１８）；Ｋｒｕｅｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４３８（７０６８）：６８５～９（２００５）並びにＣｒｏｏｋｅら、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．、２７（４）：７１４～７３９（２０１８））。

【0043】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのイントロン及び少なくとも１つのエクソンを含む。本明細書において使用される「エクソン」という用語は、遺伝子内に存在する核酸配列であって、転写時のイントロンの切出しの後において、ＲＮＡ分子の成熟形態により表される核酸配列を指す。エクソンは、タンパク質へと翻訳されうる（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の場合）。本明細書において使用される「イントロン」という用語は、所与の遺伝子内に存在する核酸配列であって、最終ＲＮＡ生成物の成熟時に、ＲＮＡスプライシングにより除去される核酸配列を指す。イントロンは、一般に、エクソンの間に見出される。転写時に、イントロンは、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）から除去され、エクソンは、ＲＮＡスプライシングを介して接続される。

【0044】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、１つ以上のエクソン及び１つ以上のイントロンを含む核酸配列を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、１つ以上のエクソンを含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、イントロンを一切含まない。

【0045】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、人工配列を含みうる。人工配列は、所望の結合特性など、好適な特性を付与しうる。例えば、人工配列は、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質に結合する場合もあり、１つ以上のマイクロＲＮＡと相補性の場合もある。一部の実施形態において、人工配列は、遺伝子配列又は天然に存在する環状ＲＮＡに由来する配列のスクランブル形でありうる。スクランブル配列は、典型的に、それが由来する配列と同じヌクレオチド組成物を有する。当業者に、スクランブル核酸を作出するための方法は公知である。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、人工配列を含むが、エクソンを含まない。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、人工配列を含むが、また、少なくとも１つのエクソンも含む。

【0046】

したがって、環状ＲＮＡは、ＷＯ２０１７／２２２９１１において記載されている、内因性イントロン又は外因性イントロンにより作出されうる。多種多様な生物及びウイルスに由来する、多数のイントロン配列が公知であり、タンパク質、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又は転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードする遺伝子に由来する配列を含む。代表的なイントロン配列は、Ｇｒｏｕｐ Ｉ Ｉｎｔｒｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｒｎａ．ｗｈｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｇｉｓｓｄ／）、Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｒｏｕｐ ＩＩ Ｉｎｔｒｏｎｓ（ｗｅｂａｐｐｓ２．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／^～ｇｒｏｕｐｉｉ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｍｏｂｉｌｅ Ｇｒｏｕｐ ＩＩ Ｉｎｔｒｏｎｓ（ｆｐ．ｕｃａｌｇａｒｙ．ｃａ／ｇｒｏｕｐ２ｉｎｔｒｏｎｓ）、Ｙｅａｓｔ Ｉｎｔｒｏｎ ＤａｔａＢａｓｅ（ｅｍｂｌＳ１６ ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＥｘｔｅｒｎａｌＩｎｆｏ／ｓｅｒａｐｈｉｎ／ｙｉｄｂ．ｈｔｍｌ）、Ａｒｅｓ Ｌａｂ Ｙｅａｓｔ Ｉｎｔｒｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｃｏｍｐｂｉｏ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｙｅａｓｔ＿ｉｎｔｒｏｎｓ．ｈｔｍｌ）、Ｕ１２ Ｉｎｔｒｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｇｅｎｏｍｅ．ｃｒｇ．ｅｓ／ｃｇｉｂｉｎ／ｕ１２ｄｂ／ｕ１２ｄｂ．ｃｇｉ）及びＥｘｏｎ－Ｉｎｔｒｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｂｐｇ．ｕｔｏｌｅｄｏ．ｅｄｕ／^～ａｆｅｄｏｒｏｖ／ｌａｂ／ｅｉｄ．ｈｔｍｌ）を含む多様なデータベースにおいて利用可能である。

【0047】

ある特定の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子は、自己スプライシングＩ群イントロンを含む核酸によりコードされる。Ｉ群イントロンは、広範にわたる生物における、ｍＲＮＡ前駆体、ｔＲＮＡ前駆体及びｒＲＮＡ前駆体からの、それら固有の切出しを触媒する、ＲＮＡ自己スプライシングイントロンの、顕著に異なるクラスである。真核細胞核内に存在する、全ての公知のＩ群イントロンはリボソームＤＮＡ遺伝子座内に配置された、機能的リボソームＲＮＡ遺伝子を中断する。真核微生物及び変形体粘菌（変形菌）の間で広範に存在すると考えられる、核内Ｉ群イントロンは、豊富な自己スプライシングイントロンを含有する。環状ＲＮＡ分子内に含まれる自己スプライシングＩ群イントロンは、例えば、細菌、バクテリオファージ及び真核生物のウイルスなど、任意の適切な生物から得られる場合もあり、これらに由来する場合もある。自己スプライシングＩ群イントロンまた、ミトコンドリア及び葉緑体など、ある特定の細胞小器官内においても見出される場合があり、このような自己スプライシングイントロンは、環状ＲＮＡ分子をコードする核酸へと組み込まれうる。

【0048】

ある特定の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子は、ファージＴ４チミジル酸シンターゼ（ｔｄ）遺伝子の自己スプライシングＩ群イントロンを含む核酸によりコードされる。ファージＴ４チミジル酸シンターゼ（ｔｄ）遺伝子のＩ群イントロンは、環状化することが十分に特徴づけられているのに対し、エクソンは、直鎖状のまま、併せてスプライシングを行う（Ｃｈａｎｄｒｙ及びＢｅｌｆｏｒｔ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１：１０２８～１０３７（１９８７）；Ｆｏｒｄ及びＡｒｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３１１７～３１２１（１９９４）並びにＰｅｒｒｉｍａｎ及びＡｒｅｓ、ＲＮＡ、４：１０４７～１０５４（１９９８））。任意のエクソン配列を挟む、ｔｄイントロンの順序が入れ替えられる（すなわち、５’側の半分が、３’位に配置され、この逆もなされる）場合、エクソンは、２つの自己触媒性エステル交換反応を介して環状化される（Ｆｏｒｄ及びＡｒｅｓ、前出；Ｐｕｔｔａｒａｊｕ及びＢｅｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、３３：４９～５１（１９９５））。

【0049】

一部の実施形態において、本明細書において記載された組換え環状ＲＮＡは、ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結されうる、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含みうる。ＩＲＥＳの組入れは、環状ＲＮＡに由来する、１つ以上のオープンリーディングフレームの翻訳を可能とする。ＩＲＥＳエレメントは、真核リボソーム翻訳開始複合体を誘引し、翻訳開始を促進する（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４４８５～４４９０（１９９１）；Ｇｕｒｔｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ、２２９：２９５～２９８（１９９６）；Ｒｅｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１０２～１１０（１９９６）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２１：３９９～４０２（１９９６）並びにＭｏｓｓｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２２：１５０～１６１（１９９７）を参照されたい。）。

【0050】

当技術分野において、多数のＩＲＥＳ配列は公知であり、環状ＲＮＡ分子内に組み入れられうる。例えば、ＩＲＥＳ配列は、ピコルナウイルスのリーダー配列（例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＵＴＲ）（Ｊａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３：１６５１～１６６０（１９８９））、ポリオリーダー配列、Ａ型肝炎ウイルスリーダー、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ヒト鼻炎ウイルス２型ＩＲＥＳ（Ｄｏｂｒｉｋｏｖａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１００（２５）：１５１２５～１５１３０（２００３））、口蹄疫ウイルスに由来するＩＲＥＳエレメント（Ｒａｍｅｓｈら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、２４：２６９７～２７００（１９９６））及びジアルジアウイルスＩＲＥＳ（Ｇａｒｌａｐａｔｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（５）：３３８９～３３９７（２００４））など、多種多様なウイルスに由来しうる。酵母由来のＩＲＥＳ配列、ヒトアンジオテンシンＩＩ １型受容体ＩＲＥＳ（Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２１２：５１～６１（２００３））、線維芽細胞増殖因子ＩＲＥＳ（例えば、ＦＧＦ－１ＩＲＥＳ及びＦＧＦ－２ＩＲＥＳ；Ｍａｒｔｉｎｅａｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２４（１７）：７６２２～７６３５（２００４））、血管内皮増殖因子ＩＲＥＳ（Ｂａｒａｎｉｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５（１２）：４７３３～４７３８（２００８）；Ｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１８（６）：３１１２～３１１９（１９９８）；Ｂｅｒｔら、ＲＮＡ、１２（６）：１０７４～１０８３（２００６））及びインスリン様増殖因子２ＩＲＥＳ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３６３（１号）：３７～４４（２００２））を含むがこれらに限定されない、様々な非ウイルスＩＲＥＳ配列もまた、環状ＲＮＡ分子内に組み入れられうる。

【0051】

場合によって、組換え環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳに作動可能に連結されたタンパク質又はポリペプチドをコードする配列を含む。ＩＲＥＳを含む組換え環状ＲＮＡは、適切なサイズの、任意の目的のポリペプチドを作製するように設計されうる。例えば、環状ＲＮＡは、細菌、ウイルス、真菌、原生生物又は寄生生物に由来する抗原など、免疫原性ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結されたＩＲＥＳを含みうる。代替的に、環状ＲＮＡは、遺伝性障害、がん又は他の疾患を処置するための、酵素、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、抗体、腫瘍抑制因子又は細胞傷害剤などの治療用ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結されたＩＲＥＳを含みうる。

【0052】

当技術分野において、ＩＲＥＳエレメントは公知であり、ＩＲＥＳエレメントをコードするヌクレオチド配列及びベクターは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）及びＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）及びＩＲＥＳｉｔｅ：実験により検証されたＩＲＥＳ構造についてのデータベース（ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇ）など、様々な供給元から市販されている。

【0053】

本開示における使用のために所望のＲＮＡ、ポリペプチド、イントロン及びＩＲＥＳをコードするポリヌクレオチドは、標準的な分子生物学法を使用して作製されうる。例えば、ポリヌクレオチド配列は、細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーをスクリーニングすること又はポリヌクレオチドを含むことが既知のベクターからポリヌクレオチドを切り出すことによるなど、組換え法を使用して作製されうる。ポリヌクレオチドはまた、クローニングではなく、公知の配列に基づき、合成により作製される場合もある。完全配列は、標準法により調製された、重複オリゴヌクレオチドからアセンブルされ、次いで、完全配列へとアセンブルされ、ライゲーションされうる（例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９（１９８４）並びにＪａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５９：６３１１（１９８４）を参照されたい。）。核酸配列を得る、又は合成する他の方法は、部位指向突然変異誘発法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｍ．Ｒ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、４版（２０１２年６月１５日）において開示されている）、自動式ポリヌクレオチド合成器（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４０８４～４０８８（１９９１）を参照されたい。）、オリゴヌクレオチド指向合成（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、５４：７５～８２（１９８６））、既存のヌクレオチド領域に対するオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３～３２７（１９８８）並びにＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４～１５３６（１９８８））及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用する、酵素によるオリゴヌクレオチドギャップへの充填（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９～１００３３（１９８９））を含むがこれらに限定されない。

【0054】

組換え環状ＲＮＡ分子は、任意の適切な長さ又はサイズの組換え環状ＲＮＡ分子でありうる。例えば、組換え環状ＲＮＡ分子は、約２００ヌクレオチド～約６，０００ヌクレオチドの間（例えば、約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００ヌクレオチド又は前出の値のうちのいずれか２つにより規定される範囲）のヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子は、約５００～約３，０００ヌクレオチドの間（約５５０、６５０、７５０、８５０、９５０、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００ヌクレオチド又は前出の値のうちのいずれか２つにより規定される範囲）のヌクレオチドを含む。一実施形態において、組換え環状ＲＮＡ分子は、約１，５００ヌクレオチドを含む。

【0055】

アジュバントとしてのｃｉｒｃＲＮＡ
ｍ^６Ａを含有しないｃｉｒｃＲＮＡ分子は、対象において、免疫応答を惹起するのに使用されうる。したがって、一部の実施形態において、ｍ^６Ａを欠くｃｉｒｃＲＮＡは、アジュバントとして、例えば、ワクチン組成物の一部として使用されうる。

【0056】

一部の実施形態において、免疫原性の環状ＲＮＡは、それを必要とする対象へと投与される。一部の実施形態において、免疫原性の環状ＲＮＡは、ｍ^６Ａ残基を含有しない。

【0057】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含む。ポリペプチドは、例えば、抗原性ポリペプチドでありうる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、複数の（すなわち、少なくとも２つの）抗原を含む。抗原は、ウイルス由来、細菌由来、寄生虫由来、真菌由来、原虫由来、プリオン由来、細胞由来、又は細胞外由来の抗原でありうる。一部の実施形態において、少なくとも１つの抗原は、腫瘍抗原である。一部の実施形態において、ワクチン組成物の環状ＲＮＡは、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

【0058】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、対象への投与の前に、エクスビボにおいて合成される。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、インビトロ転写を使用して作製される。

【0059】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、対象へと、ネイキッドＲＮＡとして投与される。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子などのナノ粒子と複合体を形成している。

【0060】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むベクターは、対象へと投与される。一部の実施形態において、環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、環状ＲＮＡのｍ^６ａ修飾を防止する特徴を含む。例えば、ＤＮＡ配列は、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１７）を含まない場合がある。ベクターは、例えば、プラスミドなど、非ウイルスベクターでありうる。一部の実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターである。

【0061】

一部の実施形態において、ベクターは、１つ以上の特異的細胞型へとターゲティングされる。例えば、ベクターは、１つの細胞型に特異的に、又は優先的に結合しうるが、別の細胞型に特異的に、又は優先的に結合しえない。一部の実施形態において、ベクターは、がん細胞へとターゲティングされる。

【0062】

一部の実施形態において、ワクチン組成物は、環状ＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ワクチン組成物は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない環状ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）を欠く。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、１つ以上のＲＲＵＣＨモチーフ（配列番号２０）を含む。

【0063】

一部の実施形態において、ワクチン組成物は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない環状ＲＮＡ分子を含み、また、少なくとも１つの抗原も含む。

【0064】

一部の実施形態において、ワクチン組成物の環状ＲＮＡは、インビトロ転写を使用して作製される。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、組成物中に、ネイキッドＲＮＡとして存在する。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子などのナノ粒子と複合体を形成している。

【0065】

ワクチン組成物は、疾患、障害又は状態を処置又は防止するように、それを必要とする対象へと投与されうる。したがって、一部の実施形態において、自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発する方法は、対象へと、有効量の、ワクチン組成物を投与するステップを含む。

【0066】

送達媒体としてのｃｉｒｃＲＮＡ
非天然ｃｉｒｃＲＮＡの、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）修飾は、誘導された自然免疫応答を阻害するので、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主免疫系により除去されずに、多様な物質を、細胞へと送達するのに使用されうる。したがって、本開示はまた、物質を、細胞へと送達する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）を含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；（ｂ）物質を、組換え環状ＲＮＡ分子へと接合させて、物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体を作製するステップ；及び（ｃ）細胞を、複合体と接触させるステップであって、これにより、物質が、細胞へと送達されるステップを含む方法も提示する。上記において記載された、組換え環状ＲＮＡ分子、ｍ^６Ａ修飾、組換え環状ＲＮＡ分子及びその構成要素を作出する方法についての記載はまた、物質を、細胞へと送達する方法についての、同じ態様へも適用される。

【0067】

開示される環状ＲＮＡ分子を使用して、任意の適する物質、化合物又は材料が、細胞へと送達されうる。物質は、生物学的物質の場合もあり、かつ／又は化学的物質の場合もある。例えば、物質は、タンパク質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質断片、タンパク質複合体、融合タンパク質、組換えタンパク質、リンタンパク質、糖タンパク質又はリポタンパク質）、脂質、核酸又は炭水化物などの生体分子でありうる。開示される環状ＲＮＡ分子を使用して細胞へと送達されうる他の物質は、ホルモン、抗体、増殖因子、サイトカイン、酵素、受容体（例えば、神経受容体、ホルモン受容体、栄養物質受容体及び細胞表面受容体）又はこれらのリガンド、がんマーカー（例えば、ＰＳＡ、ＴＮＦ－アルファ）、心筋梗塞のマーカー（例えば、トロポニン又はクレアチンキナーゼ）、毒素、薬物（例えば、中毒薬物）及び代謝剤（例えば、ビタミンを含む）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態において、物質は、抗原、エピトープ、サイトカイン、毒素、腫瘍抑制因子タンパク質、増殖因子、ホルモン、受容体、マイトジェン、免疫グロブリン、神経ペプチド、神経伝達物質又は酵素などのタンパク質又はペプチドである。物質が、抗原又はエピトープである場合、抗原又はエピトープは、病原体（例えば、ウイルス又は細菌）又はがん細胞（すなわち、「がん抗原」又は「腫瘍抗原」）から得られる場合もあり、これらに由来する場合もある。

【0068】

他の実施形態において、物質は、低分子でありうる。本明細書において使用される「低分子」という用語は、典型的に、１ｎｍのオーダーのサイズを伴い、生物学的過程を調節しうる、低分子量（＜９００ダルトン）の有機化合物を指す。低分子は、様々な生物学的機能を呈し、細胞内シグナル伝達において用いられ、医薬として用いられ、殺虫剤として用いられるなど、多種多様な適用に用いられる。低分子の例は、アミノ酸、脂肪酸、フェノール化合物、アルカロイド、ステロイド、ビリン、レチノイドなどを含む。

【0069】

物質を、組換え環状ＲＮＡ分子へと接合させて、物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体を形成するのに、生体分子のコンジュゲーションのための、任意の適切な方法が使用されうる。理想的に、物質は、組換え環状ＲＮＡ分子へと共有結合的に連結される。共有結合的連結は、環状ＲＮＡ分子上又は物質上に存在する連結部分により生じうる。連結部分は、は、特定の細胞内部の物質の放出を可能としうる化学結合を含有することが所望される。当技術分野において、適切な化学的結合が周知であり、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合及びエステラーゼ不安定性結合を含む。典型的な共有結合的コンジュゲーション法は、システイン及びリシンなど、特異的アミノ酸の側鎖をターゲティングする。システイン側鎖及びリシン側鎖は、それぞれ、これらが多種多様な試薬（例えば、連結用試薬）による修飾を経ることを可能とする、チオール基及びアミノ基を含有する。バイオコンジュゲーション法は、例えば、Ｎ．Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ及びＭ．Ｂ．Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｃｈａｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、７：８７６～８８４（２０１１）；Ｊａｉｎら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、３２（１１）：３５２６～４０（２０１５）並びにＫａｌｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１４（２）：１３８～１４７（２０１０）において、さらに記載されている。

【0070】

組換え環状ＲＮＡ分子へと接合された物質を含む複合体の形成の後、方法は、細胞を、複合体と接触させるステップであって、これにより、物質が、細胞へと送達されるステップを含む。任意の適切な原核細胞又は真核細胞が、複合体と接触させられうる。適切な原核細胞の例は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）など）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ．コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）など）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びエルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）に由来する細胞を含むがこれらに限定されない。特に有用な原核細胞は、エシェリキア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の多様な株（例えば、Ｋ１２、ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ受託番号：３３６９４）、ＤＨ５α、ＤＨ１０、ＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ受託番号：５３３３８）及びＣＣ１０２）を含む。

【0071】

当技術分野において、適切な真核細胞が公知であり、例えば、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む。適切な酵母細胞の例は、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びスキゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する酵母細胞を含む。適切な昆虫細胞は、Ｓｆ－９細胞及びＨＩＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）を含み、例えば、Ｋｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０～８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４：５６４～５７２（１９９３）並びにＬｕｃｋｌｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６７：４５６６～４５７９（１９９３）において記載されている。

【0072】

ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。当技術分野において、多数の適切な哺乳動物細胞が公知であり、これらのうちの多くは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である。適切な哺乳動物細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＣＬ６１）、ＣＨＯＤＨＦＲ－細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６～４２２０（１９８０））、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１５７３）及び３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＣＬ９２）を含むがこれらに限定されない。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ－１細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ－７細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ１６５１）の他、ＣＶ－１細胞系（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞は、形質転換細胞系を含む、霊長動物細胞系及び齧歯動物細胞系を含む。正常二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する細胞株の他、初代外植片もまた適する。他の適切な哺乳動物細胞系は、それらの全てが、ＡＴＣＣから入手可能である、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ－９２９細胞及びＢＨＫハムスター細胞系又はＨａＫハムスター細胞系を含むがこれらに限定されない。当技術分野において、適切な哺乳動物宿主細胞を選択するための方法及びこのような細胞の形質転換、培養、増幅、スクリーニング、精製のための方法は、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、５版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．（２００２）を参照されたい。）。

【0073】

好ましくは、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。例えば、哺乳動物細胞は、ヒト免疫細胞、特に、細胞抗原又はエピトープを免疫系へと提示しうる細胞でありうる。ヒト免疫細胞の例は、リンパ球（例えば、Ｂリンパ球又はＴリンパ球）、単球、マクロファージ、好中球及び樹状細胞を含む。一実施形態において、細胞は、マクロファージである。

【0074】

物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体は、例えば、トランスフェクション、形質転換又は形質導入による方法を含む、任意の適切な方法により、細胞へと導入されうる。本明細書において、「トランスフェクション」、「形質転換」及び「形質導入」という用語は、互換的に使用され、物理的方法又は化学的方法の使用による、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野において、多くのトランスフェクション技法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿；ＤＥＡＥデキストラン；電気穿孔；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション；タングステン粒子促進型微粒子銃及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿を含む。

【0075】

一部の実施形態において、複合体は、物質へとコンジュゲートされた、ネイキッドＲＮＡの形態において、細胞へと送達されうる。一部の実施形態において、複合体は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子など、細胞への送達のためのナノ粒子と複合体を形成していてもよい。

【0076】

一部の実施形態において、組成物は、物質へとコンジュゲートされたＲＮＡを含み、任意に、薬学的に許容される担体を含みうる。担体の選出は、部分的に、特定の環状ＲＮＡ分子及び環状ＲＮＡ分子が導入される細胞（１つ以上の細胞）の種類により決定される。したがって、様々な適切な組成物の製剤が可能である。例えば、組成物は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム及び塩化ベンザルコニウムなどの保存剤を含有しうる。任意に、２つ以上の保存剤の混合物が使用されうる。加えて、組成物中に、緩衝剤も使用されうる。適切な緩衝剤は、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム並びに他の多様な酸及び塩を含む。任意に２つ以上の緩衝剤の混合物が使用されうる。当業者に、医薬的使用のための組成物を調製するための方法が公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、２１版（２００５年５月１日）において、より詳細に記載されている。

【0077】

他の実施形態において、物質へと接合された組換え環状ＲＮＡ分子を含む複合体を含有する組成物は、シクロデキストリン封入複合体などの封入複合体として製剤化される場合もあり、リポソームとして製剤化される場合もある。リポソームは、宿主細胞をターゲティングするのに使用される場合もあり、環状ＲＮＡ分子の半減期を延長するのに使用される場合もある。リポソーム送達システムを調製するための方法は、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９：４６７（１９８０）及び米国特許第４，２３５，８７１；同第４，５０１，７２８；同第４，８３７，０２８及び同第５，０１９，３６９号において記載されている。複合体はまた、ナノ粒子としても製剤化されうる。

【0078】

ＲＮＡ結合性タンパク質を隔離するためのｃｉｒｃＲＮＡ
本開示はまた、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）及び１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性モチーフを含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び（ｂ）ＲＮＡ結合性タンパク質を含む細胞を、組換え環状ＲＮＡ分子と接触させるステップであって、これにより、ＲＮＡ結合性タンパク質が、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性モチーフに結合し、細胞内に隔離されるステップを含む方法も提示する。上記において記載された、組換え環状ＲＮＡ分子、ｍ^６Ａ修飾、組換え環状ＲＮＡ分子を作出する方法、細胞を、ｃｉｒｃＲＮＡ及びその構成要素と接触させる方法についての記載はまた、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離する方法についての、同じ態様へも適用される。

【0079】

ＲＮＡ結合性タンパク質は、ＲＮＡの代謝、ＲＮＡ－タンパク質間相互作用及びタンパク質－タンパク質間相互作用の協調並びにＲＮＡのスプライシング、成熟、翻訳、輸送及び代謝回転の調節において、主要な役割を果たす。神経障害、筋萎縮症及びがんを含む、ヒト疾患のいくつかの主要なクラスにおいて、ＲＮＡ結合性タンパク質の発現異常、機能不全及び凝集が同定されている。したがって、特に、細胞内において異常に発現される場合のＲＮＡ結合性タンパク質は、疾患と関連しうる。

【0080】

ＲＮＡ結合性タンパク質は、典型的に、１つ以上のＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）（また、「ＲＮＡ結合性モチーフ」とも称される）を含有する。様々な異なるＲＮＡ結合性タンパク質について、多数のＲＲＭが公知である。リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）ドメイン（また、「ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）」及び「ＲＮＡ結合性ドメイン（ＲＢＤ）」としても公知である）は、真核生物において、最も豊富なタンパク質ドメインのうちの１つである。ＲＮＰドメインは、２つのコンセンサス配列：ＲＮＰ－１及びＲＮＰ－２を含む、約９０アミノ酸のＲＮＡ結合性ドメインを含有する。ＲＮＰ－１が、主に、芳香族であり、正に帯電した、８つの保存的残基を含むのに対し、ＲＮＰ－２は、６つのアミノ酸残基から構成される、保存性の小さな配列である。ＲＮＰドメインは、広範にわたる特異性及びアフィニティーにより、ＲＮＡ分子への結合に必要かつ十分であることが示されている。他のＲＮＡ結合性ドメインは、亜鉛フィンガードメイン、ｈｎＲＮＰＫ相同性（ＫＨ）ドメイン及び二本鎖ＲＮＡ結合性モチーフ（ｄｓＲＢＭ）（例えば、Ｃｌｅｒｙ Ａ，Ｈ．－Ｔ．Ａｌｌａｉｎ Ｆ．、「Ｆｒｏｍ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ」、「Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」、Ａｕｓｔｉｎ（ＴＸ）：Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２０００～２０１３）を参照されたい。）を含むがこれらに限定されない。組換え環状ＲＮＡ分子は、ＲＲＭ又はＲＮＡ結合性モチーフ（すなわち、「ＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメイン」）により認識される、１つ以上のドメインを含有するように作出される。組換えｃｉｒｃＲＮＡ分子内に組み入れる、ＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインの選出しは、細胞内への隔離のためにターゲティングされる、特異的ＲＮＡ結合性タンパク質に依存する。組換え環状ＲＮＡ分子は、常套的な分子生物学法及び／又は組換えＤＮＡ法を使用して、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインを含むように作出されうる。

【0081】

ある特定の実施形態において、ＲＮＡ結合性タンパク質は、組換えｃｉｒｃＲＮＡ分子と接触させられる細胞内において異常に発現されている。上記において言及された通り、ＲＮＡ結合性タンパク質の異常な発現は、神経障害、筋萎縮症及びがんなどの疾患と関連している。ＲＮＡ結合性タンパク質の発現は、非正常であるという意味において「異常」である。この点において、ＲＮＡ結合性タンパク質をコードする遺伝子は、細胞内において、非正常に発現される結果として、非正常量のＲＮＡ結合性タンパク質もたらしうる。代替的に、遺伝子発現は、正常であるが、ＲＮＡ－タンパク質の産生が調節異常である、又は機能不全であるために、細胞内において、非正常量のタンパク質を結果としてもたらす場合もある。発現の異常は、過剰発現、過小発現、発現の完全な欠如又は発現の一時的調節異常（例えば、遺伝子が、細胞内の、不適切な時点において、発現される）を含むがこれらに限定されない。細胞内の、突然変異体又は変異体ＲＮＡ結合性タンパク質の、正常レベルにおける発現もまた、ＲＮＡ結合性タンパク質の発現の異常であると考えられうる。したがって、一部の実施形態において、ＲＮＡ結合性タンパク質は、少なくとも１つの突然変異（例えば、欠失、挿入又は置換）を含む核酸配列によりコードされる。

【0082】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡの形態において、細胞へと送達されうる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子など、細胞への送達のためのナノ粒子と複合体を形成していてもよい。

【0083】

ｃｉｒｃＲＮＡの自然免疫原性に対するモジュレーション
その最終的適用に応じて、環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性をモジュレートすることが所望されうる。本明細書において、「自然免疫原性」及び「自然免疫」という用語は、互換的に使用され、抗原への曝露後速やかに、又は曝露から数時間以内に生じる、非特異的防御機構を指す。これらの機構は、皮膚などの物理的障壁、血液中の化学物質及び生物における外来細胞を攻撃する免疫系細胞を含む。例えば、ｃｉｒｃＲＮＡ分子が、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離するのに使用される場合、ｃｉｒｃＲＮＡ分子により誘導される自然免疫原性は、その除去を低減し、タンパク質隔離効果を最大化するように低減されうる。この点において、本開示は、対象において環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を低減する方法であって、（ａ）対象において自然免疫応答を誘導する環状ＲＮＡ分子を用意するステップ；及び（ｂ）Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）、シュードウリジン及びイノシンから選択される少なくとも１つのヌクレオシドを、環状ＲＮＡ分子へと導入して、自然免疫原性が低減された修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法を提示する。上記において記載された環状ＲＮＡ分子、ｍ^６Ａ修飾、組換え環状ＲＮＡ分子及びその構成要素を作出する方法についての記載はまた、対象において環状ＲＮＡの自然免疫原性を低減する方法についての、同じ態様へも適用される。

【0084】

ＲＮＡ内において見出される、最も豊富な修飾ヌクレオシドのうちの１つである、シュードウリジン（また、「ｐｓｉ」又は「Ｙ」とも称される）は、広範な細胞内ＲＮＡ内に存在し、種間において高度に保存的である。シュードウリジンは、Ψシンターゼにより触媒される塩基特異的異性体化を介して、ウリジン（Ｕ）から導出される。イノシンは、ヒポキサンチンが、β－Ｎ９－グリコシド結合を介して、リボース環（また、リボフラノースとしても公知である）へと接合される場合に形成されるヌクレオシドである。イノシンは、一般に、ｔＲＮＡ内において見出され、揺らぎ塩基対内の遺伝子コードの適正な翻訳に不可欠である。図１５は、イノシン又はシュードウリジンの、環状ＲＮＡへの導入が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫に影響を与えることを裏付ける。いかなる理論にも束縛されずに述べると、イノシン又はシュードウリジンの、環状ＲＮＡへの導入は、そのｍ^６Ａ修飾を防止することが考えられる。理想的に、環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％以上）は、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する。他の実施形態において、環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１０％（例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）は、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する。

【0085】

代替的に、ｃｉｒｃＲＮＡが、抗原性タンパク質（例えば、腫瘍抗原又はがん抗原）を、細胞へと送達するのに使用される実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡ分子の自然免疫原性は増大させられうる。この目的で、本開示はまた、対象における環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を増大させる方法であって、（ａ）ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）を欠く環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び／又は（ｂ）少なくとも１つのエクソン内の、１つ以上のアデノシンを、別の塩基（例えば、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はイノシン）により置きかえて、自然免疫原性が増大させられた修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップを含む方法も提示する。上記において記載された、環状ＲＮＡ分子、組換え環状ＲＮＡ分子及びその構成要素を作出する方法についての記載はまた、対象において環状ＲＮＡの自然免疫原性を増大させる方法についての、同じ態様へも適用される。

【0086】

下記の実施例において論じられる通り、ＲＲＡＣＨ（配列番号１７～１８）は、ｍ^６Ａ修飾についてのコンセンサスモチーフである。したがって、一部の実施形態において、環状ＲＮＡ分子は、モチーフ内の「Ａ」を、ウラシル（「Ｕ」）、グアニン（「Ｇ」）又はシトシン（「Ｃ」）など、別の塩基又は塩基の組合せにより置きかえることにより、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）を欠くように操作されうるが、ＲＲＡＣＨモチーフ内の、任意のヌクレオチドは、別の塩基又は塩基の組合せにより置きかえられうる。理想的に、環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの、少なくとも１％（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％以上）は、別の塩基（例えば、ウラシル）又は塩基の組合せにより置きかえられる。他の実施形態において、環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの、少なくとも１０％（例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）は、別の塩基（例えば、ウラシル）又は塩基の組合せにより置きかえられる。例えば、環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全て（すなわち、１００％）は、別の塩基（例えば、ウラシル）又は塩基の組合せにより置きかえられる。

【0087】

環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を低減する、又は増大させる方法は、修飾環状ＲＮＡを、対象へと投与するステップをさらに含みうる。修飾環状ＲＮＡ又は修飾環状ＲＮＡを含む組成物は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺内投与、経皮投与、筋内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、舌下投与、膣内投与又は坐剤投与を含む、標準的な投与法を使用して、対象（例えば、哺乳動物）へと投与されうる。

【0088】

一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ネイキッドＲＮＡの形態において、細胞へと送達されうる。一部の実施形態において、環状ＲＮＡは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子など、細胞への送達のためのナノ粒子と複合体を形成していてもよい。

【0089】

以下の例は、本発明をさらに例示するが、当然ながら、いかなる形であれ、その範囲を限定するものとして見なされるべきではない。

【実施例】

【0090】

実施例において記載される実験において、以下の材料及び方法を使用した。

【0091】

プラスミド
自己触媒性スプライシングを介して、ｃｉｒｃＲＮＡを発現させるファージイントロンをコードするプラスミドは、Ｃｈｅｎら、前出において記載されている。ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＨＤアセンブリー（タカラバイオ株式会社、６３８９１０）を使用して、ファージイントロンをコードするプラスミドであって、ＢｏｘＢモチーフを組み込んだ、外来ｃｉｒｃＧＦＰを発現させるプラスミドを構築した。λＮを伴う、及びこれを伴わないＹＴＨＤＦ１Ｎ及びＹＴＨＤＦ２Ｎを発現させるプラスミドは、Ｃｈｕａｎ Ｈｅ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ）により恵与された。ＹＴＨＤＦ２タンパク質ドメインの切断型を発現させるプラスミドは、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＨＤにより構築した。全てのプラスミドは、ＬＢ培地中において増殖させた、ＮＥＢ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃｅｌｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃ２９８４Ｈ）内において繁殖させ、ＺＹＭＯＰＵＲＥ ＩＩ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４２００）を使用して精製した。

【0092】

ＲＮＡの合成及び精製
製造元の指示書に従い、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ１３３４）を使用するインビトロ転写及び３７℃において、一晩又は少なくとも８時間にわたるインキュベーションによりＲＮＡを合成した。ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ１３３４）を使用し、ｍ^６ＡＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｎ－１０１３）を、転写キットのＡＴＰにより指定される比において添加するインビトロ転写により、同じ方式において、ｍ^６Ａ標識化ＲＮＡを合成した。転写されたｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍｉｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）により精製し、次いで、ＲＮアーゼＲ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、ＲＮＲ０７２５０）により、以下の方式において処理した：ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの二次構造を、７２℃における５分間に続く、氷上における２分間にわたり変性させ；ＲＮアーゼＲを、１Ｕ：ＲＮＡ １μｇの比において添加し、３７℃において、２～３時間にわたりインキュベートした。ＣｉｒｃＲＮＡＬｉｎｅａｒ ＲＮＡは、ＲＮアーゼＲにより処理しなかった。次いで、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）カラムにより精製した。次いで、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又は直鎖状ＲＮＡを、ＦＡＳＴＡＰ（商標）により、以下の方式においてホスファターゼ処理した：ＦＡＳＴＡＰ（商標）を、１Ｕ：ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ １μｇの比において添加し、３７℃において、２時間にわたりインキュベートし、次いで、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）カラムにより精製した。ＲＮＡの品質は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ解析（Ａｇｉｌｅｎｔ、５０６７－５５７６）により評価した。

【0093】

Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ８５４７）により、７２℃における３分間に続く、氷上における２分間にわたり、ＲＮＡを変性させることにより、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをゲル精製し、次いで、１％の低融点アガロースへとロードした。青色光トランスイルミネーター（Ｃｌａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）上においてゲル抽出を行うのに続き、室温において、１０分間にわたり回転させながら行った融解を除き、製造元の指示書に従い、ＺＹＭＯＣＬＥＡＮ（商標）Ｇｅｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙキット（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ１０１１）による精製を行った。

【0094】

粒子サイズを５μｍとし、小孔サイズを２０００Åとする、４．６×３００ｍｍサイズ除外カラム（Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１５９８０Ｐ－４６３０）により、ＨＰＬＣ分画を実施した。ヌクレアーゼ非含有ＴＥ緩衝液を、流量を０．３ｍｌ／分とする移動相として使用した。手作業により、ＲＮＡ画分を回収し、凍結乾燥させ、次いで、後続の品質管理及び実験使用の前に、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ１０１３）により清浄化した。

【0095】

ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰ
Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ＭＡＧキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ１９２２）を使用して、ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ^－）を除去し、ＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（商標）Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１５０２６）を使用して、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏ^－）を除去することにより、１０μｇの全ＲＮＡを、ｃｉｒｃＲＮＡについてエンリッチした。次いで、ＲＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＮＡ）を、７５℃において、１２分間にわたり使用して、結果として得られるｐｏｌｙＡ^－／ｒｉｂｏ^－ＲＮＡを、３５～１００ｎｔのサイズへと断片化させた。断片化されたＲＮＡを変性させ、次いで、ＩＰＰ緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のＮＰ－４０；５ｍＭのＥＤＴＡ）中、４℃において、２時間にわたり、抗ｍ^６Ａ抗体（ＳｙｎａｐｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ、２０２００３）と共にインキュベートした。次いで、ＵＶ光（２５４ｎｍ）を使用し、２ラウンドにわたる、０．１５Ｊにおける架橋を使用して、ＲＮＡと抗体とを架橋した（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００）。次いで、架橋されたＲＮＡ及び抗体を、４℃において、２時間にわたり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０００２Ｄ）と共にインキュベートした。次いで、ビーズを、回転させながら、４℃において、１０分間にわたり、ＩＰＰ緩衝液により、１回、回転させながら、４℃において、１０分間にわたり、低塩濃度緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４；５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％のＮＰ－４０）により、１回、回転させながら、４℃において、１０分間にわたり、高塩濃度緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ－４０、０．１％のＳＤＳ）により、１回洗浄し、未使用の１．５ｍＬチューブへと移し、ＰＮＫ緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；０．２％のＴｗｅｅｎ ２０）により、２回にわたり洗浄した。次いで、ｉｒＣＬＩＰ法（Ｚａｒｎｅｇａｒら、２０１６）を使用して、ライブラリーを調製した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより、ライブラリーを、品質について点検し、ｉｒＣＬＩＰ法において記載されている通りに、カスタムのシーケンシングプライマーであるＰ６＿ｓｅｑによる、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上のシーケンシングにかけた。リードを、ｈｇ３８配列に対してマッピングし、その後、カスタムアセンブリーのｃｉｒｃＧＦＰ配列に対してマッピングし、ＵＭＩツール（Ｓｍｉｔｈら、２０１７）を使用して、ＰＣＲ重複を除去した。ＦＡＳＴ－ｉＣＬＩＰパイプライン（Ｆｌｙｎｎら、２０１５）を使用して、再現可能なＲＴ ｓｔｏｐｓを同定した。

【0096】

ｍ^６Ａ－ＲＩＰ－ｓｅｑ
Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ＭＡＧキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ１９２２）を使用して、ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ^－）を除去し、ＲＩＢＯＭＩＮＵＳ（商標）Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１５０２６）を使用して、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏ^－）を除去することにより、１０μｇの全ＲＮＡを、ｃｉｒｃＲＮＡについてエンリッチした。次いで、残りのＲＮＡを、ＲＮアーゼＲにより処理して、残留直鎖状ＲＮＡを除去した。次いで、ｐｏｌｙＡ^－／ｒｉｂｏ^－ＲＮアーゼＲ^＋ＲＮＡを、７５℃において、１２分間にわたり、ＲＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＭ８７４０）により断片化した。３μｇの抗ｍ^６Ａ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０２００３）を、室温において、２時間にわたり、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合させた。次いで、抗体を結合させたビーズを、ＩＰＰ緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のＮＰ－４０；５ｍＭのＥＤＴＡ）により洗浄し、１μＬのＲＩＢＯＬＯＣＫ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＯ０３８２）を伴うＩＰＰ中に再懸濁させた。ＩＰＰ緩衝液中において断片化されたＲＮＡを、回転させながら、４℃において、２時間にわたり、抗体及びビーズと共にインキュベートした。次いで、ＲＮＡを結合させたビーズを、回転させながら、４℃において、１０分間にわたり、ＩＰＰ緩衝液により、１回、回転させながら、４℃において、５分間にわたり、低塩濃度緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４；５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１％のＮＰ－４０）により、１回、回転させながら、４℃において、５分間にわたり、高塩濃度緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ－４０、０．１％のＳＤＳ）により、１回洗浄した。次いで、ビーズを、３００μＬの高塩濃度緩衝液中に再懸濁させ、未使用の１．５ｍＬチューブへと移した。ビーズを、ＰＮＫ緩衝液（２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；０．２％のＴｗｅｅｎ ２０）により洗浄し、次いで、５００μＬのＴｒｉｚｏｌ中に再懸濁させ、２５℃において、５分間にわたりインキュベートした。１５０μＬのクロロホルム：イソアミルアルコールを添加し、インキュベートの前に、２５℃において、２分間にわたり混合した。４℃、１３，０００×ｇにおいて、１０分間にわたりスピンした後、水性層を、未使用の１．５ｍＬチューブへと移し、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ１０１３）により清浄化した。ＲＮＡを、１０μＬのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。溶出したＲＮＡ及び１０％のインプットＲＮＡへと、１０μＬの末端修復ミックス（５倍濃度のＰＮＫ緩衝液４μＬ；１μＬのＲＩＢＯＬＯＣＫ（商標）、１μＬのＦＡＳＴＡＰ（商標）；２μＬのＴ４ ＰＮＫ、２μＬのヌクレアーゼ非含有水）を添加した。反応を、３７℃において、１時間にわたりインキュベートした。２０μＬのリンカーライゲーションミックス（１０倍濃度のＲＮＡライゲーション緩衝液２μＬ；２μＬの１００ｍＭのＤＴＴ；２μＬのＬ３リンカー（Ｚａｒｎｅｇａｒら、２０１６）；２μＬのＴ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液；５０％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００ １２μＬ）を添加した。反応物を、２５℃において、３時間にわたりインキュベートし、次いで、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５カラムにより清浄化した。加工されたＲＮＡを、１０μＬのヌクレアーゼ非含有水中に溶出させた。ｉｒＣＬＩＰ法（Ｚａｒｎｅｇａｒら、２０１６）を使用して、ライブラリーを調製し、カスタムのシーケンシングプライマー（Ｐ６＿ｓｅｑ（Ｚａｒｎｅｇａｒら、２０１６））を使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上においてシーケンシングした。リードは、ｈｇ３８配列及びｃｉｒｃＧＦＰ配列に対してアライメントした。Ｂａｍファイルは、ゲノムへとマッピングされたリードに対して正規化した。

【0097】

逆転写及びリアルタイムＰＣＲ解析（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
製造元の指示書に従い、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０１８）及びコラム上のＤＮアーゼＩによる消化を伴う、ＤＩＲＥＣＴ－ＺＯＬ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｒ２０５２）を使用して、全ＲＮＡを、細胞から単離した。ＲＴ－ｑＰＣＲ解析は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ、６００８２５）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、三連において実施した。使用されたプライマーを、表１に示す。ｍＲＮＡレベルは、アクチン値又はＧＡＰＤＨ値に対して正規化した。ｃｉｒｃＲＮＡのトランスフェクションについての、表示のｍＲＮＡ遺伝子の相対発現は、トランスフェクトされたＲＮＡのレベルにより正規化し、モックトランスフェクション又は直鎖状ＲＮＡのトランスフェクションがなされた細胞の発現レベルに対する倍数変化としてプロットした。

【0098】

【表1】

【0099】

細胞系及び維持
ヒトＨｅＬａ（子宮頸部腺癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ（胎児性腎臓、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）細胞を、１ｍｌ当たり１００単位のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１６３）及び１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２６７６－０１１）を補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１９９５－０７３）中において増殖させた。細胞の増殖は、５％のＣＯ_２雰囲気中、３７℃において維持した。

【0100】

細胞の培養及び一過性トランスフェクション
細胞は、トランスフェクションの２４時間前に播種した。細胞を、７０～８０％のコンフルエンシーとし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３０００００８）を使用して、これらに、ＲＮＡをトランスフェクトした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３０００００８）を使用して、２４ウェルプレートの１つのウェルに、５００ｎｇの直鎖状ＲＮＡ又はｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをトランスフェクトした。製造元の指示書に従い、Ｐ３０００及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を伴う核酸を希釈し、室温、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５－０８８）中において、５分間にわたりインキュベートした。次いで、核酸とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００とを、併せて混合し、室温において、１５分間にわたりインキュベートし、次いで、核酸－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００複合体を、単層培養物へと滴下した。異所性タンパク質を発現させる場合、製造元の指示書に従い、細胞を、ＮＥＯＮ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＭＰＫ５０００Ｓ）により電気穿孔した。大半の場合、細胞を、緩衝液Ｒ中に、１ｍＬ当たりの細胞２×１０^７個において再懸濁させ、１００μＬのＮＥＯＮ（商標）チップにより、これらに、５μｇのＤＮＡプラスミドを電気穿孔した。１２時間後、細胞を継代培養し、２４時間後、それらが、７０～８０％コンフルエントとなるように播種した。２４時間後、次いで、上記において記載された通りに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅにより、細胞に、ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＰＢＳにより、１回洗浄し、２４ウェルごとに、３００μＬずつのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を添加した。ＤＩＲＥＣＴ－ＺＯＬ（登録商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐにより、ＲＮＡを採取した。

【0101】

ウェスタンブロット解析
ＨｅＬａ細胞を回収し、トランスフェクションの２４時間後に溶解させて、全タンパク質を抽出した。ＲＩＰＡ 緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）を使用して、細胞を溶解させた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により、タンパク質を分画し、ニトロセルロース膜へと転写し、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の無脂肪乳を含有するリン酸緩衝生理食塩液中、室温において、１時間にわたりブロッキングし、次いで、４℃において、一晩にわたり、表２に表示の一次抗体と共にインキュベートした。製造元の指示書に従い、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、９２６－３２２１１）二次抗体又はＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｌｉ－Ｃｏｒ、９２６－６８０７４）二次抗体を使用した。Ｏｄｙｓｓｅｙ遠赤外イメージング系（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用して、ウェスタンブロットによる検出及び定量を行った。

【0102】

【表2】

【0103】

ＹＴＨＤＦ２によるレスキュー及びＹＴＨＤＦ１／２の、ＣｉｒｃＢｏｘＢへのテザリング
上記において記載された通り、ＮＥＯＮ（商標）トランスフェクションシステムを介して、細胞に、ラムダペプチド（λＮ）（すなわち、ＢｏｘＢ結合性タンパク質）を伴う、及びこれを伴わないＹＴＨＤＦ１Ｎ又はＹＴＨＤＦ２Ｎを発現させるプラスミドを電気穿孔した。１２時間後、細胞を継代培養し、２４時間後、それらが、７０～８０％コンフルエントとなるように播種した。この２４時間後に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００により、５００ｎｇのｃｉｒｃＢｏｘＢ（５ＢｏｘＢ部位を伴うｃｉｒｃＲＮＡ）をトランスフェクトした。ＲＮＡを採取し、上記において記載された通りに、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０によりにより、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。タンパク質溶解物回収のために、追加の二連を確保し、ウェスタンブロットにより、これらの条件下における異所性タンパク質発現を、同時に確認した。

【0104】

ＲＮＡ免疫沈降－ｑＰＣＲ
ＮＥＯＮ（商標）トランスフェクションシステムにより、細胞に、λＮを伴う、及びこれを伴わない、Ｆｌａｇタグ付けＹＴＨＤＦ１Ｎ又はＹＴＨＤＦ２Ｎを発現させるプラスミドを電気穿孔し、次いで、その後、上記において記載された時間経過において、６ウェルフォーマットへと継代培養した。０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２５２０００５６）により、細胞約３００万個を採取し、次いで、ＰＢＳにより洗浄した。次いで、以下の設定値：Ｆｉｌｌ Ｌｅｖｅｌ：１０、Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ：５％、Ｐｅａｋ Ｉｎｃｉｄｅｎｔ Ｐｏｗｅｒ：１４０ Ｗ、Ｃｙｃｌｅｓ／Ｂｕｒｓｔ：２００、ｔｉｍｅ ｐｅｒ ｔｕｂｅ：３００秒間を伴うＣｏｖａｒｉｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒにより、細胞を、細胞溶解緩衝液（プロテイナーゼ阻害剤を伴う、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ－４０）中に溶解させた。１６，０００ｒｃｆにおいて、１５分間にわたり、細胞溶解物をペレット化させた。上清を回収し、１００μＬの抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２磁気ビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共に、室温において、回転させながら、２時間にわたりインキュベートして、ＹＴＨＤＦ１Ｎ又はＹＴＨＤＦ２Ｎをプルダウンした。ビーズを、細胞溶解緩衝液により、３回にわたり洗浄し、１回は、ＰＢＳにより洗浄した。ビーズを、５００μＬのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）中に再懸濁させ、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０６）を使用して、全ＲＮＡを抽出した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、上記において記載された通りに、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０により実施した。ＲＮＡレベルは、各生物学的反復内のインプットに対するパーセントとして正規化した。結果は、ｃｉｒｃＲＮＡのエンリッチメントの、アクチンを上回る倍数変化として提示した。

【0105】

ＦＡＣＳ解析
細胞を、抗生剤を伴わないＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中、ウェル１つ当たりの細胞６０，０００個において、２４ウェルフォーマットへと播種した。２４時間後に、製造元の推奨に従い、細胞に、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ（登録商標）ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ ＭＥＴＴＬ３ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌ－００５１７０－０２－０００５）を、ノックダウンｓｉＲＮＡとして使用し、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ Ｎｏｎ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｄ－００１８１０－０１－０５）を、非ターゲティングｓｉＲＮＡとして使用した。トランスフェクションの１２及び３６時間後に、培地を交換した。トランスフェクションの４８時間後に、０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを介して、細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２３２０４）により、１５分間にわたり染色した。次いで、細胞をスピンダウンし、５分間にわたり、Ａｎｎｅｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５６４５４）中のＤＡＰＩへと再懸濁させた。細胞を、染料を伴わないＡｎｎｅｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁させ、セルストレーナーキャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５２２３５）付き丸底チューブに通した。特注のＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上において、フロー解析を行った。上記と同じトランスフェクションにかけた細胞を回収し、タンパク質溶解物を回収した。抗ＭＥＴＴＬ３抗体を使用するウェスタンブロットを介して、ＭＥＴＴＬ３のノックダウンを確認した。

【0106】

マウスの免疫化
２５μｇの高分子量ワクチングレードＰｏｌｙＩ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｖａｃ－ｐｉｃ）、単独における、又はインビボｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、２０１－１０Ｇ）を伴う、２５μｇの環状ＲＮＡ、単独における、又はインビボｊｅｔＰＥＩを伴う、２５μｇの修飾ＲＮＡによりアジュバント処理された、マウス１匹当たり１００μｇのＯＶＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｖａｃ－ｐｏｖａ）により、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入された、８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、尾の基部において皮下免疫化した。製造元の指示書に従い、ＰＥＩ／ＲＮＡ複合体を製剤化した。図に表示の通り、ワクチン接種の後において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及び抗体応答を解析するために、定期的間隔において、側方尾静脈又は顔面静脈を介して、マウスから採血した。適応の場合、一次ワクチン接種の５週間後に、追加ワクチン接種を施した。腫瘍確立及び増殖研究のために、単回のＲＮＡワクチン接種の１４日後に、マトリゲルを伴う、ＯＶＡ発現Ｂ１６黒色腫細胞５０万個を、マウスの左右の脇腹に送達した。腫瘍を、毎週２回測定し、生物発光を、毎週１回測定した。生物発光は、２０ｇのマウス１匹当たり３ｍｇのＤ－ルシフェリンを、腹腔内注射することにより測定し、Ａｍｉ ＨＴ Ｉｍａｇｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、曝露から２０秒間～１分間の範囲においてイメージングした。全ての動物手順は、スタンフォード大学施設内の動物愛護／使用委員会によるガイドラインにより確立されたガイドラインに従い実施した。

【0107】

ＣＤ８＋ Ｔ細胞アッセイ
一次免疫化及び二次免疫化の７日後に、一次ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答及び記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を査定した。略述すると、スクロース密度勾配分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、１０８３；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ １０８３１）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエンリッチし、ＢＤ Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（商標）の存在下における、５時間にわたるエクスビボでの再刺激のために、１μｇ／ｍＬのＯＶＡ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｖａｃ－ｓｉｎ）と共に培養した。刺激された細胞を、まず、表面マーカーである、抗マウスＣＤ８α（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン５３－６．７）、抗マウスＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン１７Ａ２）、抗マウスＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＲＭ４－５）について染色するのに続き、ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ中の固定及びＢＤ ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液中の抗マウスＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＸＭＧ１．２）による細胞内染色にかけた。ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ａｑｕａ ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、死細胞を除外した。ＦＡＣＳ ＬＳＲ－ＩＩ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ上において、標識化細胞を収集し、Ｆｌｏｗ ＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して、データを解析した。

【0108】

抗体ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレート（ＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐ、４４２４０４－２１）を、４℃において、一晩にわたり、２０μｇ／ｍＬのＯＶＡタンパク質（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１００μｌによりコーティングした。Ｂｉｏ－Ｒａｄ自動式プレート洗浄機を使用して、プレートを、ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０により、３回にわたり洗浄し、４％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μｌにより、室温において、２時間にわたりブロッキングした。表示の時点における免疫化マウスに由来する血清試料を、ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０中に０．１％のＢＳＡ中において系列希釈し、ブロッキングされたプレート上、室温において、２時間にわたりインキュベートした。ウェルを洗浄し、ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０中の抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５０００）、抗マウスＩｇＧ１－ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００）及び抗マウスＩｇＧ２ｃ－ＨＲＰコンジュゲート（１：２０００）と共に、室温において、２時間にわたりインキュベートした。検出用抗体は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから得た。プレートを洗浄し、ウェル１つ当たり１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３４０２８）を使用して発色させるのに続き、停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎ６００）を使用して、反応を停止させた。Ｂｉｏ－Ｒａｄプレート読取り用分光光度計を、５９５ｎｍにおける補正を伴う４５０ｎｍにおいて使用して、プレートを解析した。抗体力価を、血清希釈率の逆数として表すことから、４５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）値と＞０．３をもたらした。

【0109】

ＲＩＧ－Ｉ ＡＴＰアーゼアッセイ
０．１μＭのＲＩＧ－Ｉを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）中において、指定の環状ＲＮＡ又は５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡ ５１２ｂｐ（０．４ｎｇ／μｌ）と共にプレインキュベートした。３７℃において、２ｍＭのＡＴＰを添加することにより、反応を誘発した。ＡＴＰ添加の２、４又は８分間後に、アリコート（１０μｌ）を採取し、１００ｍＭのＥＤＴＡにより、速やかにクエンチングした。ＧＲＥＥＮ（商標）試薬（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＡＴＰ加水分解活性を測定した。ＧＲＥＥＮ（商標）試薬（９０μｌ）を、クエンチングされた反応物へと、９：１の比において添加し、ＳＹＮＥＲＧＹ（商標）２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ＯＤ_６５０を測定した。

【0110】

ＲＩＧ－Ｉ Ｎａｔｉｖｅゲルシフトアッセイ
ＲＮＡ（１ｎｇ／ｍＬ）を、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ及び５ｍＭのＤＴＴ）中のＲＩＧ－Ｉ（５００ｎＭ）と共に、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、ポリユビキチンを、表示の濃度において添加し、室温において、５分間にわたりにおいてインキュベートした。複合体を、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上において解析し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色した。ＦＬＡ９０００スキャナー（富士フイルム株式会社）を使用して、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄによる蛍光を記録し、Ｍｕｌｔｉｇａｕｇｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により解析した。

【0111】

ＲＩＧ－Ｉ重合アッセイ
０．４μＭのＲＩＧ－Ｉを、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ及び５ｍＭのＤＴＴ）中の指定の環状ＲＮＡ（１ｎｇ／μｌ）と共に、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。調製された試料を、カーボンコーティンググリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）へと吸着させ、０．７５％のギ酸ウラニルにより染色した。ＴＥＣＮＡＩ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ透過電子顕微鏡を、３０，０００倍又は４９，０００倍の拡大率において使用して、画像を回収した。

【0112】

タンパク質の調製
ヒトＲＩＧ－Ｉは、既に報告されている（Ｐｅｉｓｌｅｙ ら、２０１３）通りに発現させた。略述すると、０．５ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の後、ＢＬ２１（ＤＥ３）中、２０℃において、１６～２０時間にわたりタンパク質を発現させた。Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して、細胞をホモジナイズし、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む３ステッププロトコールを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＤＴＴ中において使用して、タンパク質を精製した。

【0113】

Ｋ６３－Ｕｂｎは、既に報告されている（Ｄｏｎｇら、２０１１）通りに合成した。略述すると、マウスＥ１、ヒトＵｂｃ１３、Ｕｅｖ１ａ及びユビキチンを、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から精製し、緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰ、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．６ｍＭのＤＴＴ）中に０．４ｍＭのユビキチン、４μＭのｍＥ１、２０μＭのＵｂｃ１３及び２０μＭのＵｅｖ１ａを含有する反応物中において混合した。反応物を、３７℃において、一晩にわたりインキュベートした後に、合成されたＫ６３－Ｕｂｎ鎖を、５０ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ４．５、０．１ＭのＮａＣｌへと、５倍に希釈し、Ｈｉ－Ｔｒａｐ ＳＰ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、５０ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ４．５中に、０．１～０．６ＭのＮａＣｌ ４５ｍＬの勾配にわたり分離した。高分子量画分を、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．１５ＭのＮａＣｌ中において平衡化されたＳ２００ １０／３００カラムへと適用した。

【0114】

ＭＡＶＳ ＣＡＲＤは、０．４ｍＭのＩＰＴＧによる誘導の後、２０℃において、１６～２０時間にわたり、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内のＳＮＡＰタグ（ＣＡＲＤ－Ｓ）との融合構築物として発現させた。ＳＮＡＰタグは、ＭＡＶＳ ＣＡＲＤの蛍光標識化を可能とする。ＣＨＡＰＳではなく、０．０５％のＮＰ－４０を使用することを除き、記載されている（Ｗｕら、２０１６）Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ＭＡＶＳ ＣＡＲＤ－Ｓ融合体を精製した。精製ＣＡＲＤ－Ｓを、一定の振盪を伴い、６Ｍの塩化グアニジウム中、３７℃において、３０分間にわたり変性させるのに続き、４℃において、１時間にわたり、リフォールディング緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ及び２０ｍＭのＢＭＥ）に対する透析にかけた。リフォールディングされたＣＡＲＤ－Ｓを、０．１μのフィルターに通し、その後、製造元の指示書に従い、Ａｌｅｘａ６４７－ベンジルグアニン（ＮＥＢ）により、氷上において、１５分間にわたり蛍光標識化した。標識化ＭＡＶＳ ＣＡＲＤ－Ｓは、重合アッセイ（下記において記載される）に、速やかに使用した。

【0115】

ＭＡＶＳ重合アッセイ
ＭＡＶＳフィラメント形成アッセイは、既に報告されている（Ｗｕら、２０１３）通りに実施した。ＳＮＡＰ（ＣＡＲＤ－Ｓ）へと融合させたＭＡＶＳ ＣＡＲＤを、ＢＧ－Ａｌｅｘａ ６４７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）により、氷上において、１５分間にわたり標識化した。ＲＩＧ－Ｉ（１μＭ）を、６μＭのＫ６３－Ｕｂｎ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ中に）の存在下、又は非存在において、多様な濃度のＲＮＡ及び２ｍＭのＡＴＰと共に、室温において、１５分間にわたりプレインキュベートした。その後、標識化された単量体ＭＡＶＳ ＣＡＲＤ－Ｓ（１０μＭ）を、混合物へと添加し、室温において、１時間にわたり、さらにインキュベートした。ＭＡＶＳフィラメント形成は、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ解析又はネガティブ染料であるＥＭにより検出した。Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）上において泳動させる前に、ドライアイス上において、５分間にわたりインキュベートするのに続、室温において、５分間にわたりにおけるインキュベーションにより、全ての試料を、１ラウンドの凍結－融解サイクルにかけた。ＦＬＡ９０００スキャナー（富士フイルム株式会社）を使用して、蛍光ゲル画像を走査した。既に記載されている（Ｏｈｉら、２００４）通り、ＭＡＶＳ重合アッセイからの試料を、カーボンコーティンググリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）へと吸着させ、０．７５％のギ酸ウラニルにより染色した。ＴＥＣＮＡＩ（商標）Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ ＢｉｏＴＷＩＮ透過電子顕微鏡を、９，３００倍の拡大率において使用して、画像を回収した。

【0116】

免疫蛍光及び定量
インビトロ転写反応ミックス中に５％のフルオレセイン１２ ＵＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１４２７８５７９１０）により、１００％のＵＴＰを代替することを除き、ＦＩＴＣ標識化ＲＮＡは、上記において記載された通りに合成した。ＦＩＴＣ標識化１０％ｍ^６Ａ ＲＮＡは、インビトロ転写反応ミックス中に１０％のｍ^６Ａによる、１００％のＡＴＰの、さらなる代替により合成した。ＲＮアーゼＲ処理及びＦＡＳＴＡＰ（商標）処理は、記載されている通りに行った。ＲＮＡの品質は、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎにより評価した。

【0117】

ＨｅＬａ細胞を、６ウェルフォーマット、厚さ＃１．５の、２２×２２ｍｍカバースリップ上に播種した。１２時間後、ＦＩＴＣ標識化ｃｉｒｃＲＮＡによる一過性トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ３００００１５）により実施した。１２時間後、細胞を、ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２８９０８）中に１％のホルムアルデヒドにより、室温において、１０分間にわたり固定した。ホルムアルデヒド固定スライドを、ＰＢＳ中においてすすぎ、ＰＢＳ中に０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中、室温において、１０分間にわたり透過化した。透過化の後、溶液をすすぎ、スライドを、抗体希釈剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、００３１１８）により、室温において、１時間にわたりブロッキングした。抗ＲＩＧ－Ｉウサギポリクローナル一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７４３Ｓ）及び抗Ｕｂ－Ｋ６３マウスモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４－６０７７－８２）を、抗体希釈剤中、１：２００において希釈し、４℃において、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＳによる洗浄の後、スライドを、抗体希釈剤中、１：１０００において希釈された、ヤギ抗ウサギＩｇＧ高度交差吸着処理Ａｌｅｘａ５９４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ－１１０３７）及びヤギ抗マウスＩｇＧ高度交差吸着処理Ａｌｅｘａ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ－２１２３６）と共に、室温において、２時間にわたりインキュベートした。スライドを、ＰＢＳにより洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）を、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ、Ｈ－１２００）と共に使用してマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によりイメージングした。フォーサイが、ＦＩＴＣ－ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又は互いと直接重なる場合に、共ＲＩＧ－ＩとＫ６３－ｐｏｌｙＵｂとの局在をカウントした。

【0118】

抗ＲＩＧ－Ｉウサギポリクローナル一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７４３Ｓ）及び抗ＹＴＨＤＦ２マウスポリクローナル抗体（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１３５４８６）を、各々、抗体希釈剤中、１：２００において希釈した。二次染色、マウンティング及びイメージングを含む、残りの免疫蛍光ステップは、上記において詳述された通りに実施した。フォーサイが、ＦＩＴＣ－ｃｉｒｃＲＮＡ及び／又は互いと直接重なる場合に、共ＲＩＧ－ＩとＹＴＨＤＦ２との局在をカウントした。

【0119】

ＩＲＦ３二量体化アッセイ
二量体化アッセイは、既に記載されている（Ａｈｍａｄら、Ｃｅｌｌ、１７２：７９７～８１０、ｅ７１３（２０１８））通りに実施した。略述すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、低張性緩衝液（１０ｍＭのトリス ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１倍濃度の哺乳動物Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ａｒｒｅｓｔ（ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））中においてホモジナイズし、１０００ｇにおいて、５分間にわたりにおいて遠心分離して、核をペレット化させた。細胞質ゾル画分及びミトコンドリア画分を含有する上清（Ｓ１）を、インビトロＩＲＦ３二量体化アッセイのために使用した。１０ｎｇ／μｌのＲＩＧ－Ｉ及び２．５ｎｇ／μｌのＫ６３－Ｕｂｎを、表示量のＲＮＡと共に含有する刺激ミックスを、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、４ｍＭのＭｇＣｌ２及び２ｍＭのＡＴＰ中、４℃において、３０分間にわたりプレインキュベートした。製造元の指示書に従い、Ｔ７ ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用するインビトロ翻訳により、３５Ｓ－ＩＲＦ３を調製した。プレインキュベートされた刺激ミックス１．５μｌを、１０μｇ／μｌのＳ１、０．５μｌの３５Ｓ－ＩＲＦ３（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、４ｍＭのＭｇＣｌ２及び２ｍＭのＡＴＰ中に）を含有する反応物１５μｌへと添加することにより、ＩＲＦ３活性化反応を誘発し、３０℃において、１時間にわたりインキュベートした。その後、試料を、１８，０００ｇにおいて、５分間にわたり遠心分離し、上清を、Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ解析にかけた。ＩＲＦ３の二量体化は、オートラジオグラフィー及びリン光イメージング（富士フイルム株式会社、ＦＬＡ９０００）により可視化した。

【0120】

樹状細胞の活性化
マウスを、尾の基部において、ＰＢＳ（対照）又は環状ＲＮＡ（マウス１匹当たり２５μｇ）により、皮下免疫化した。免疫化の２４時間後、マウスを安楽死させ、皮膚流入領域鼠径リンパ節を切り出した。皮膚流入領域鼠径リンパ節を、３ｍＬシリンジプランジャーのサムレストにより、静かに押しつぶし、１ｍｇ／ｍＬの４型コラゲナーゼにより、３７℃において、２０～２５分間にわたり消化した。

【0121】

反応は、２ｍＭのＥＤＴＡにより停止させ、単一細胞懸濁液は、４０μｍのセルストレーナーに通すことにより調製した。

【0122】

統計学的解析
全ての統計学的解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）により実施した。適切な場合、スチューデントのｔ検定、クルスカル－ワリス検定又はＡｎｏｖａ－チューキー検定を使用した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意であると考えた。

【0123】

［実施例１］
本実施例は、免疫原性ｃｉｒｃＲＮＡの、インビトロにおける作製及び特徴付けを裏付ける。

【0124】

本明細書の以下において、「ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ」と称される、Ｔ４バクテリオファージに由来する、順序が入れ替えられたｔｄイントロンを含有する、環状化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡは、培養哺乳動物細胞内において、高度に免疫原性（Ｃｈｅｎら、前出）である。ＴＤイントロンは、インビトロ転写時に自己触媒性スプライシングをプログラムして、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを形成する。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、エクソヌクレアーゼである、ＲＮアーゼＲによる、長時間（＞２時間）にわたる処理は、直鎖状ＲＮＡ副産物を分解し、ｃｉｒｃＲＮＡのエンリッチをもたらす（Ｃｈｅｎら、前出）。後続のアルカリホスファターゼ処理は、遊離末端から、５’リン酸を除去する。外来ｃｉｒｃＲＮＡの、哺乳動物細胞への送達は、免疫遺伝子の発現を強力に刺激し、後続のウイルス感染に対して防御した（Ｃｈｅｎら、前出）。近年の報告は、外因性ｃｉｒｃＲＮＡは、免疫刺激性ではなく、不完全なＲＮアーゼＲ消化に起因する、５’三リン酸化直鎖状ＲＮＡ夾雑物が、免疫応答を誘発することを示唆する（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．、７４（３）：５０８～５２０（２０１９））。Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔらは、短い（３０分間）ＲＮアーゼＲ処理を使用し、次いで、ＨＰＬＣを実施して、ｃｉｒｃＲＮＡから、直鎖状ＲＮＡを除去した。あらかじめ、インビトロにおいて合成され、ＲＮアーゼＲにより、２時間にわたり処理されたｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる免疫刺激が、夾雑直鎖状ＲＮＡ上の三リン酸を除去する、第２ラウンドのホスファターゼにより処理されたｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと同等であるのに対し、ホスファターゼ処理を伴う直鎖状ＲＮＡは、免疫活性化を、大幅に低減することが示された（Ｃｈｅｎら、前出）。したがって、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる刺激は、試料中の異常な５’三リン酸の存在に依存しない。しかし、５’三リン酸が、免疫遺伝子の発現を刺激していないことを確認するために、本明細書において記載される、全てのｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ分子を、ホスファターゼの存在下で合成した。

【0125】

ＲＮアーゼＲにより処理されたｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのゲル精製が、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる免疫刺激を変更するのか否かを調べた。夾雑直鎖状ＲＮＡ構成要素が、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫原性に寄与している場合、ゲル抽出は、異なる分子量を有するこれらの夾雑物を消失させると仮定した。ゲル内のニックｃｉｒｃＲＮＡ生成物は、直鎖状となるので、免疫刺激性ではない。この目的で、ＲＮアーゼＲ及びアルカリホスファターゼにより処理されたゲル精製ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、ゲル精製を経た、同じｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ調製物と比較した。ＨｅＬａ細胞に、各ＲＮＡ調製物をトランスフェクトするのに続き、２４時間後に、自然免疫遺伝子についてのｑＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。ゲル精製ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、ＲＮアーゼＲのみによるｃｉｒｃＲＮＡと比較して、ほぼ同じ効力（約８０～９０％の活性）により、自然免疫遺伝子を刺激した（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0126】

ＲＮアーゼＲにより処理された合成ｃｉｒｃＲＮＡはまた、ＨＰＬＣによる分画にもかけた。サイズ除外クロマトグラフィーは、ＲＮアーゼＲ処理ｃｉｒｃＲＮＡを、２つの画分へと分解した（図１Ｃ）。各画分の濃縮及びＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ解析は、ＨＰＬＣによるピーク１が、ＲＮアーゼＲ処理ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対するゲル電気泳動からの結果を正確に再現する（図１Ｃ）のに対し、ピーク２は、分解ＲＮＡであることを反映した。結果として得られるＨＰＬＣ精製によるクロマトグラム及び画分は、測定装置の差違のために、既に報告されている（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔら、前出）分離と異なった。ＨｅＬａ細胞への、各画分のトランスフェクションに続くｑＲＴ－ＰＣＲは、ｃｉｒｃＲＮＡを伴う画分が、免疫応答を保持するが、活性が低度であることを明らかにした（図１Ｄ）。ピーク２は、小型の分解ＲＮＡ及び未消化のイントロンを含んだが、この画分は、免疫原性ではなかった。この結果は、試料調製の全体にわたるホスファターゼ処理が、免疫原性の直鎖状ＲＮＡを不活化させたという解釈と符合する。したがって、ゲル精製ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮにおける刺激のわずかな低下（図１Ｂ）は、これらのＲＮＡ分子種の喪失に起因しなかった。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの完全性は、ゲル精製において、ＨＰＬＣ精製より良好に保存され、前者における小型のＲＮＡ断片への分解は低度であり、これは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫原性の良好な保存と相関した。

【0127】

不完全なＲＮアーゼＲ消化から生じる、小型の直鎖状ＲＮＡは、上記において記載された調製物中のｃｉｒｃＲＮＡによる免疫原性の一因とならなかった。上記において記載された、酵素による精製過程は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの完全性を最良な形で保存すると考えられた。

【0128】

［実施例２］
本実施例は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、インビボにおいて、ワクチンアジュバントとして作用することを裏付ける。

【0129】

ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、インビトロにおいて、免疫遺伝子の発現を強力に刺激することが既に示されている（Ｃｈｅｎら、前出）が、インビボにおけるその挙動は知られていない。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、自然免疫を活性化させる潜在的可能性を有するので、ワクチンの効果を増大させる、ワクチンアジュバントとして作用すると仮定した。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、インビトロにおいて転写し、精製し、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）と組み合わせて、皮下注射により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスへと送達した。ＰｏｌｙＩ：Ｃを、ＲＮＡアジュバントに対する陽性対照として用いられた。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、ネイキッドＲＮＡとして、又はトランスフェクション剤であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）中のパッケージングの後で送達した。Ｔ細胞を回収し、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、一次ワクチン接種又は二次ワクチン接種の７日後に実施した。血清もまた回収し、抗体応答を、ワクチン接種の５週間後に測定した（図２Ａ）。測定された抗体を、表３に示す。

【0130】

【表3】

【0131】

ＯＶＡ特異的であり、インターフェロンガンマ陽性（Ｉｆｎγ＋）である活性化ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導は、予測される通り、ｐｏｌｙＩ：Ｃなどのアジュバントを要求した（図２Ｂ及び図３Ａ～３Ｃ）。とりわけ、ネイキッドｃｉｒｃＲＮＡ（モックと比較したｐ＝０．００８８、Ａｎｏｖａ－チューキー検定）又はＰＥＩナノ粒子（モックと比較したｐ＝０．００３９、Ａｎｏｖａ－チューキー検定、図２Ｂ）による、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの共注射は、ｐｏｌｙＩ：Ｃにより誘導されるレベルと同等の、強力な抗ＯＶＡ Ｔ細胞を誘導した。ＯＶＡ特異的抗体の測定は、単独におけるｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、抗体の産生を、陽性対照であるｐｏｌｙＩ：Ｃと同等なレベルまで刺激することを明らかにした（図２Ｃ及び３Ｂ）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＯＶＡ特異的抗体の刺激のために、トランスフェクション試薬を要求しなかった。実際、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、ＰＥＩを伴わない注射において、より高度であり、後続の実験において、ＰＥＩを省略した。

【0132】

ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又は対照によるマウスの免疫化の後、樹状細胞（ＤＣ）を、流入領域リンパ節から単離した。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮアジュバントは、共刺激分子であるＣＤ８６の細胞表面発現の、対照を上回る増大により判定される通り、ｃＤＣ１サブセット及びｃＤＣ２サブセットの両方を活性化させた（図３Ｄ及び３Ｅ）。

【0133】

これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡの接種が、ＤＣを活性化させたことの、インビボにおける直接的な証拠を提示する。ＤＣの活性化は、原理的に、ＣＤ４＋濾胞性ヘルパー（ｆｈ）Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞による抗原の交差提示及びこれらの活性化を容易としうる。しかし、ｃｉｒｃＲＮＡはまた、Ｔ細胞及び他の免疫細胞型にも直接影響を及ぼしうる。

【0134】

［実施例３］
本実施例は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、抗腫瘍免疫を誘導しうることを裏付ける。

【0135】

ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの送達は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導するため、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びＯＶＡへと曝露されたマウスは、ＯＶＡ発現腫瘍に対する獲得免疫を有すると仮定した。したがって、マウスに、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びＯＶＡをワクチン接種し、２週間後、ＯＶＡ発現Ｂ１６黒色腫細胞を、マウスの左右の脇腹へと植え込んだ（図２Ｄ）。ＯＶＡ－Ｂ１６黒色腫モデルは、主にＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を介して免疫による制限を受けている（Ｂｕｄｈｕら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．、２０７（１）：２２３～３５（２０１０））。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを施されるマウスは、ＰＢＳを施される陰性対照マウスと比較して、低度の腫瘍増殖を呈した（図２Ｅ、２Ｆ及び３Ｆ）。各マウスにおける左右の腫瘍が互いと相関したことは、ワクチン接種により、全身規模の効果がもたらされたことを裏付ける。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、１回のみワクチン接種されたマウスは、全生存の、陰性対照マウスと比較してほぼ２倍の延長を呈し（ｐ＝０．０１７３、ログランク検定、図２Ｇ）、陽性対照である高分子量ｐｏｌｙＩ：Ｃを施されるマウスと同等であった（図３Ｇ）。

【0136】

本実施例の結果は、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫が、潜在的治療目的へと生かされうることを指し示す。

【0137】

［実施例４］
本実施例は、内因性ｃｉｒｃＲＮＡが、ｍ^６Ａ機構と会合することを裏付ける。

【0138】

哺乳動物細胞が、内因性ｃｉｒｃＲＮＡを有することを踏まえると、それらの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対する免疫応答は、それらが、自己ｃｉｒｃＲＮＡと非自己ｃｉｒｃＲＮＡとを識別することを示唆する。上記において論じた通り、ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＮＡエクソンの３’末端と５’末端とを、共有結合的に接続するバックスプライシングを介して作製される。イントロンの識別が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を決定する（Ｃｈｅｎら、前出）が、最終的なｃｉｒｃＲＮＡ産物の一部ではないため、イントロンは、１つ以上の共有結合的化学的マーキングの、ｃｉｒｃＲＮＡへの付与を方向付けうると仮定した。

【0139】

ｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１は、その内因性イントロンにより作製されるヒトｃｉｒｃＲＮＡであり、ヒト細胞内において発現される場合、免疫原性ではない。ＺＫＳＣＡＮ１イントロンを使用して、「ｃｉｒｃＳＥＬＦ」と称する、ｃｉｒｃＧＦＰの作製をプログラムした。ＨｅＬａ細胞に、タンパク質支援型スプライシング（ｃｉｒｃＳＥＬＦ）又は自己触媒性スプライシング（ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ）により作出された、ｃｉｒｃＲＮＡをコードするＤＮＡプラスミドをトランスフェクトし、質量分析（ＣｈＩＲＰ－ＭＳ）により、ＲＮＡ結合性タンパク質の包括的同定を実施した（Ｃｈｅｎら、前出）。共有結合的ｍ^６Ａ修飾（Ｒｏｕｎｄｔｒｅｅら、前出）のライター、リーダー及びイレーサーを、ｃｉｒｃＲＮＡとの会合において解析した（図４Ａ）。ｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１は、ＷＴＡＰ及びＶＩＲＭＡ（Ｖｉｒｉｌｉｚｅｒ相同体又はＫＩＡＡ１４２９としてもまた公知である）など、ｍ^６Ａライター複合体の構成要素並びにｍ^６Ａリーダータンパク質である、ＹＴＨＤＦ２、ＨＮＲＮＰＣ及びＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１と会合するが、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、これらと会合しないことが見出された（図４Ａ）。いずれのｃｉｒｃＲＮＡも、ＦＴＯ及びＡＬＫＢＨ５などの推定ｍ^６Ａ脱メチル化酵素（「イレーサー」）と会合しなかった。重要なことは、ｃｉｒｃＳＥＬＦは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと同じｃｉｒｃＲＮＡ配列を含むが、もはや免疫原性ではなく（Ｃｈｅｎら、前出）、ｍ^６Ａライタータンパク質及びｍ^６Ａリーダータンパク質と会合することである（図４Ａ）。ヒトイントロンによりプログラムされる、２つの異なるｃｉｒｃＲＮＡ（ｃｉｒｃＳＥＬＦ及びｃｉｒｃＺＫＳＣＡＮ１）は、ＷＴＡＰ、ＶＩＲＭＡ及びＹＴＨＤＦ２を含む、ｍ^６Ａライタータンパク質及びｍ^６Ａリーダータンパク質と、同等レベルの会合を達成する（図４Ｂ）。

【0140】

本実施例の結果は、ｍ^６Ａ修飾機構が、ｃｉｒｃＲＮＡ配列に依存せずに生じる、それらの生合成を媒介するイントロンの記憶として、エクソンであるｃｉｒｃＲＮＡへと伝達されることを示唆する。

【0141】

［実施例５］
本実施例は、自己と外来ｃｉｒｃＲＮＡとが、異なるｍ^６Ａ修飾パターンを有し、ｍ^６Ａ修飾が、ｃｉｒｃＲＮＡを、「自己」としてマーキングすることを裏付ける。

【0142】

ヒトｃｉｒｃＲＮＡ及び外来ｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾パターンを規定した。適切なｃｉｒｃＲＮＡを発現するようにプログラムされたヒト細胞において、ＲＮアーゼＲ処理を使用して、ｃｉｒｃＲＮＡについてエンリッチし、次いで、ｍ^６Ａ－ＵＶ－Ｃ架橋及びｍ^６Ａ免疫沈降（ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰ）を実施して（Ｚａｒｎｅｇａｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．、１３：４８９～４９２（２０１６））、ｍ^６Ａ修飾部位へと、高感度によりマッピングした（図４Ｃ）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと対比した、ｃｉｒｃＳＥＬＦについてのｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰは、ｃｉｒｃＳＥＬＦが、環状化接合部の３’側の、５０～１００ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲内に、ｍ^６Ａ修飾を獲得したことを明らかにした（図４Ｄ）。転写物の残りの部分を通して、修飾の有意差は観察されなかった（図５Ａ）。ｃｉｒｃＳＥＬＦと、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮとは、ヒト（自己）イントロン又はファージ（外来）イントロンにより環状化された、同じエクソン配列であるため、この結果は、ヒトイントロンが、ｍ^６Ａ修飾を、結果として得られるｃｉｒｃＲＮＡ上に配置するのに十分であることを指し示した。さらに、ｍ^６Ａ－ｉｒＣＬＩＰにかけられた内因性ｃｉｒｃＲＮＡの、モデルである、ヒトプログラム化ｃｉｒｃＲＮＡとの比較は、いずれもが、同様のｍ^６Ａ修飾パターンを有することを指し示した（図４Ｅ）。ｍ^６Ａは、内因性ｃｉｒｃＲＮＡ上、バックスプライス接合部の３’側の、＋４０～１００ｎｔの帯域内において、トランスクリプトームワイドにおいてエンリッチされる（図４Ｅ）。ｍ^６Ａは、直鎖状ｍＲＮＡ及び非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の最後のエクソンにおいてエンリッチされることが公知である（図５Ｂ）（Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４８５：２０１～２０６（２０１２）；Ｋｅら、Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２９：２０３７～２０５３（２０１５）；Ｍｅｙｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４９：１６３５～１６４６（２０１２））。バックスプライス接合部の３’側におけるｍ^６Ａ修飾が見出されたことは、このパターンと符合する。スプライシングは、５’側から３’側へと、転写時に生じ、３’側から５’側へのバックスプライシングは、ｃｉｒｃＲＮＡ上において予測される最後のスプライシングイベントである（すなわち、スプライシングにより切り出されたままのイントロンは存在しない）。

【0143】

次いで、化学修飾自体又はＲＮＡ結合性タンパク質によるｍ^６Ａの認識と組み合わせた化学修飾は、「自己」ｃｉｒｃＲＮＡのマーキングを可能とすると仮定した。ｍ^６Ａの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへの組込みが、「非自己」の識別を遮蔽し、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫原性を低下させるのか否かを検討することにより、これについて調べた。この目的で、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又はｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、インビトロ転写（Ｃｈｅｎら、前出）により合成し、ＲＮアーゼＲ処理により、ｃｉｒｃＲＮＡを精製した。ｍ^６Ａ修飾の、ｃｉｒｃＲＮＡへの組込みは、ｃｉｒｃＲＮＡを形成するスプライシングに影響を及ぼさず、ＲＮアーゼＲ処理は、ｃｉｒｃＲＮＡについてエンリッチした（図５Ｃ及び５Ｄ）。次いで、レシピエント細胞に、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをトランスフェクトし、抗ウイルス遺伝子の発現について測定した。細胞内におけるｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾が、転写物に沿って、特異的位置に集中したのに対し、インビトロ転写時におけるｍ^６Ａの組込みは、ランダムであった。こうして、全てのアデノシンが、ｍ^６Ａにより置きかえられる（１００％のｍ^６Ａ）、又はｍ^６Ａのうちの１％のみが、ｃｉｒｃＲＮＡへと組み込まれて、各ｃｉｒｃＲＮＡについて、平均３つずつのｍ^６Ａ修飾をもたらした。１００％のｍ^６Ａは、超生理学的である可能性が高いが、インビボにおいて観察されるｍ^６Ａの連続的生起をモデル化する。１％のｍ^６Ａは、内因性ＲＮＡ上のｍ^６Ａの比の総レベルをモデル化するが、修飾パターンをモデル化しない。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、ＲＩＧ－Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲを含む、抗ウイルス遺伝子のパネルを強力に誘導したが、アデノシンの全てが、ｍ^６Ａ修飾により置きかえられると、抗ウイルス遺伝子の誘導は、完全に消失させられた（図６Ａ、１００％のｍ^６Ａ）。１％のｍ^６Ａの組込みは、抗ウイルス遺伝子の誘導を、有意に低減したが、これを消失させなかった（図６Ａ）。こうして、ｍ^６Ａ修飾は、培養細胞内の外来ｃｉｒｃＲＮＡの免疫原性を低減するのに十分であった。

【0144】

次いで、ＧＦＰエクソン内の配列であるＲＲＡＣＨ（配列番号１７）及びＲＲＵＣＨ（配列番号１９）の全ての場合（ｎ＝１２）を突然変異させることにより、ｍ^６Ａコンセンサスモチーフ（Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉら、前出）を消失させるように、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮプラスミドを修飾した。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ヒト細胞の核内において転写されると、ＭＥＴＴＬ３／１４が、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、低レベルにおいて修飾しうるが、これは、ΔＲＲＡＣＨ突然変異体内において消失させられると仮定した。ＨｅＬａ細胞に、野生型ｃｉｒｃＲＮＡ又は突然変異体ｃｉｒｃＲＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトし、ｃｉｒｃＲＮＡレベル及び自然免疫遺伝子の誘導を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。次いで、遺伝子誘導を、測定されたｃｉｒｃＲＮＡのレベルに対して正規化した。

【0145】

ＲＲＡＣＨ部位の突然変異は、ｃｉｒｃＲＮＡによる、抗ウイルス遺伝子の誘導を、有意に、約２倍に増大させた（図６Ｂ）。ｍ^６Ａは、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）上においてエンリッチされるが、ＲＲＡＣＨモチーフ上にのみ存在するわけではないため、ＧＦＰエクソン内の全てのアデノシンを、ウラシルへと突然変異させた修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮプラスミドを構築した（Ａを欠くｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ、図６Ｃ）。Ａを欠くｃｉｒｃＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションは、抗ウイルス遺伝子の誘導の、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを上回る約１００倍の増大をもたらした。

【0146】

本実施例の結果は、特異的ｃｉｒｃＲＮＡエクソン配列が、免疫に影響を与えることの最初の証拠を提示し、内因性ｍ^６Ａ修飾が、自然免疫を弱めることを具体的に示唆する。

【0147】

［実施例６］
本実施例は、ｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾が、インビボにおけるワクチン接種応答を鈍らせ、ｍ^６Ａリーダータンパク質であるＹＴＨＤＦ２が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を遮蔽するのに必要であることを裏付ける。

【0148】

ｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾はまた、インビボにおけるアジュバントとしてのｃｉｒｃＲＮＡの免疫原性も低下させた。１％ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと同じアジュバントレジメにおいて使用したところ、１％のｍ^６Ａ修飾は、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞応答（図２Ｂと対比した図６Ｄ）及び抗体力価（図２Ｃと対比した図６Ｅ）の両方を実質的に低減することが見出された。１％ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる反復免疫化は、減弱させられるが、皆無ではない免疫応答を誘導した（図７）。これらの結果は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、インビボにおいて、強力な免疫刺激剤であり、１％のｍ^６Ａ修飾が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を鈍らせるのに十分であることを示す。

【0149】

次いで、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫の、ｍ^６Ａによる抑制の機構について検討した。ｍ^６Ａは、リーダータンパク質のファミリーにより認識され、これらのうちで最も主要なタンパク質は、ＹＴＨドメインを含有するＲＮＡ結合性タンパク質である（Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉら、前出及びＥｄｕｐｕｇａｎｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４：８７０（２０１７））。ＹＴＨＤＦ２は、（ｉ）内因性ｃｉｒｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＳＥＬＦとの会合において検出された、主要なｍ^６Ａリーダーであり（図４Ａ及び４Ｂ）、（ｉｉ）内因性ｃｉｒｃＲＮＡ及びトランスフェクトされたｃｉｒｃＲＮＡと同様に、細胞質性タンパク質である（Ｃｈｅｎら、前出；Ｒｙｂａｋ－Ｗｏｌｆら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、５８：８７０～８８５（２０１５）；Ｓａｌｚｍａｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、７：ｅ３０７３３（２０１２））ため、これに焦点を当てた。ＹＴＨＤＦ２^－／－ＨｅＬａ細胞への、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのトランスフェクション（図８Ａ）は、抗ウイルス遺伝子の強力な誘導をもたらした（図９Ａ）。さらに、１％ｍ^６Ａ又は１０％ｍ^６Ａの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへの組込みも、ＹＴＨＤＦ２^－／－細胞内の、抗ウイルス遺伝子の誘導を、もはや抑制しなかった（図９Ａ）。独立のＹＴＨＤＦ２^－／－クローンも、酷似する結果をもたらした（図８Ｂ）。さらに、ＹＴＨＤＦ２^－／－細胞内の、ＹＴＨＤＦ２の異所性発現が、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに応答して、免疫遺伝子の誘導の抑制をレスキューした（図９Ｂ）ことは、ＹＴＨＤＦ２が、ｍ^６ＡによりマーキングされたｃｉｒｃＲＮＡの「自己」識別を媒介するために要求されることを指し示す。

【0150】

次に、ＹＴＨＤＦ２の、どのドメインが、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる免疫刺激を抑制するために必要であるのかについて調べた。全長ＹＴＨＤＦ２（図９Ｃ）を、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへと、人工的にテザリングし、ｍ^６Ａリーダータンパク質の近接が、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を抑制するための、ｍ^６Ａ修飾の必要を回避しうるのか否かを決定した。５つの連続ＢｏｘＢ ＲＮＡエレメントを、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、スプライス接合部の直後へと導入し、これを、「ｃｉｒｃＢｏｘＢ」と称した。加えて、Ｃ末端のラムダＮペプチドタグを、タンパク質へとクローニングし、ウェスタンブロットを介して、発現を確認した（図８Ｃ及び８Ｄ）。これは、ＲＩＰ－ｑＰＣＲにより確認される通り、λＮペプチドへと融合させた、ＹＴＨタンパク質の動員を可能とした（図９Ｃ及び８Ｅ）。ＲＮＡ分子種であるｃｉｒｃＢｏｘＢをコードするプラスミドのトランスフェクションは、単独において、抗ウイルス遺伝子を強力に刺激し、全長ＹＴＨＤＦ２のテザリングは、抗ウイルス遺伝子の誘導を、有意に減弱させた（図９Ｄ）。

【0151】

ＹＴＨＤＦ２のＮ末端ドメイン（ＹＴＨＤＦ２Ｎ）が、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫回避に十分であるのか否かを確立するために、ＹＴＨＤＦ２のＮ末端を、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ－ＢｏｘＢへとテザリングした。Ｎ末端は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに対する免疫応答を抑制するのに十分ではなかった（図９Ｅ）。Ｎ末端ドメインは、ＹＴＨＤＦ２－ＲＮＡ複合体の細胞内局在の一因となり、Ｃ末端ドメインは、ｍ^６Ａ修飾ＲＮＡに選択的に結合する（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、５０５：１１７～１２０（２０１４））ので、Ｃ末端ドメインは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮによる抗ウイルス遺伝子の誘導を減弱させるために要求される可能性が高い。

【0152】

次いで、ＹＴＨドメインは、ＹＴＨを、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡへと接続することにより、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、自己としてマーキングすることが可能であるのか否かについて検討した（図８Ｆ）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＹＴＨドメインへとテザリングされた場合であれ、そうでない場合であれ、ＲＩＧ－Ｉ遺伝子の発現に著明な変化は見られなかった。しかし、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと、ＹＴＨとの接続は、ＭＤＡ５及びＯＡＳ１の発現を著明に増大させた。全長ＹＴＨＤＦ２タンパク質は、個別のドメインの各々より大型であるので、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）へのテザリングの、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡによる細胞認識に対する影響（図８Ｇ）について調べた。ＲＩＧ－Ｉ遺伝子発現刺激のわずかな低下が見られたが、他の被験免疫センサーのいずれも、発現の変化を呈さなかった。これは、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫原性の完全な抑制が、ＹＴＨＤＦ２ドメインの全てを要求し、別のタンパク質とｃｉｒｃＲＮＡとの相互作用は十分ではないことを示唆する。

【0153】

ＹＴＨファミリーの他のメンバーも、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの免疫抑制に関与するのか否かについて調べるために、ＢｏｘＢモチーフを使用して、別の細胞質ｍ^６Ａリーダータンパク質である、ＹＴＨＤＦ１の、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへのテザリングの効果について検討した。ＹＴＨＤＦ１のＮ末端もまた、ＹＴＨＤＦ２と同様に、抗ウイルス遺伝子の誘導を減弱させなかった（図８Ｈ）。まとめると、これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫を遮蔽するのに、全長ｍ^６Ａリーダータンパク質が必要であり、ｃｉｒｃＲＮＡは、「自己」ｃｉｒｃＲＮＡと「外来」ｃｉｒｃＲＮＡとを識別するのに、ｍ^６Ａによる化学修飾又はｍ^６Ａリーダータンパク質を要求することを裏付ける。

【0154】

［実施例７］
本実施例は、ｍ^６Ａライタータンパク質であるＭＥＴＴＬ３が、ｃｉｒｃＲＮＡの自己／非自己認識に要求されることを裏付ける。

【0155】

ｃｉｒｃＲＮＡ上の「自己」マーキングの伝送における、ｍ^６Ａの必要性について精査するために、ｍ^６Ａ修飾の導入のための、ライター複合体の触媒性サブユニットであるＭＥＴＴＬ３の役割について調べた。Ｍｅｔｔｌ３は、ＲＮＡの適時の代謝回転における、ｍ^６Ａの極めて重要な役割のために、胚の発生に不可欠である（Ｂａｔｉｓｔａら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１５：７０７～７１９（２０１４））。多くのヒトがん細胞系におけるＭＥＴＴＬ３の枯渇は、細胞死をもたらす。ＭＥＴＴＬ３枯渇の１つ可能な帰結は、内因性ｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾の欠損であり、免疫活性化をもたらす。ＲＩＧ－Ｉは、免疫遺伝子活性化のために、ウイルスＲＮＡを感知するＲＮＡ結合性タンパク質であり、シグナル伝達タンパク質である（Ｗｕ及びＨｕｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２：９１～９８ （２０１５））。外来ｃｉｒｃＲＮＡは、ヒト細胞内のＲＩＧ－Ｉと共局在することが示されており、ＲＩＧ－Ｉは、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫に必要かつ十分である（Ｃｈｅｎら、前出）。したがって、ｍ^６Ａが、細胞が、それら自身のｃｉｒｃＲＮＡを、外来として認識し、免疫応答を誘発することを防止するのに要求されるのだとすると、同時に起こるＲＩＧ－Ｉの不活性化は、応答を改善するはずである。実際、野生型ＨｅＬａ細胞内のＭＥＴＴＬ３の枯渇は、広範な細胞死をもたらしたが、ＨｅＬａ細胞内のＲＩＧ－Ｉの不活化（Ｃｈｅｎら、前出）は、細胞死をレスキューした（図１０）。

【0156】

本実施例の結果は、ｍ^６Ａが、自己ＲＮＡによるＲＩＧ－Ｉの活性化を妨げることを示唆するが、ＭＥＴＴＬ３の、他のＲＮＡ標的に起因する間接的効果は除外することはできない。

【0157】

［実施例８］
本実施例は、ＲＩＧ－ＩによるｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ認識が、直鎖状ＲＮＡ認識と顕著に異なり、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３結合型ポリユビキチン鎖に直接結合し、ｍ^６Ａを区別することを裏付ける。

【0158】

ｃｉｒｃＲＮＡが、自然免疫応答をどのようにして刺激するのかの機構について精査するために、精製構成要素による生化学的再構成を用いた。まず、ＲＩＧ－ＩによるＡＴＰの加水分解を誘導する、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの能力を評価した。ＲＩＧ－Ｉが、５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡアゴニストを認識すると、タンパク質のヘリカーゼドメインは、ＡＴＰを加水分解する（Ｈｏｒｎｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４：９９４～９９７（２００６）；Ｓｃｈｌｅｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３１：２５～３４（２００９））。ＲＩＧ－Ｉの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又は５’ヒドロキシル直鎖状ＲＮＡへの曝露が、そのＡＴＰアーゼ活性を刺激しなかったのに対し、５１２塩基対の５’三リン酸ｄｓＲＮＡは、ＲＩＧ－ＩによるＡＴＰ加水分解を誘導した（図１１Ａ）。次に、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ上において、フィラメントを直接形成することにより、精製ＲＩＧ－Ｉを活性化させるｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの能力について調べた。ＲＩＧ－Ｉ、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びＡＴＰについての電子顕微鏡イメージングが、フィラメントの明白な形成を明らかにしなかったのに対し、陽性対照である５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉの重合を誘導した（図１１Ｂ）。したがって、予測された通り、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、５’ｐｐｐ ＲＮＡリガンドと同じ形で、ＲＩＧ－Ｉと相互作用したり、これを活性化させたりしない。

【0159】

ＲＩＧ－Ｉ活性化の代替的機構は、ＲＩＧ－Ｉ ２ＣＡＲＤドメインオリゴマーと相互作用し、これを安定化させるリシン６３（Ｋ６３）結合型ポリユビキチン鎖（Ｋ６３－Ｕｂｎ）を伴う（Ｊｉａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３６：９５９～９７３（２０１２）；Ｐｅｉｓｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、５０９：１１０（２０１４）；Ｚｅｎｇら、Ｃｅｌｌ、１４１：３１５～３３０（２０１０））。非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮに結合するＲＩＧ－Ｉの能力及び相互作用の、Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖に対する依存性について評価した。Ｎａｔｉｖｅゲルシフト結合アッセイを、精製ＲＩＧ－Ｉ及びｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮと共に使用したところ、ＲＩＧ－Ｉは、Ｋ６３結合型ポリユビキチンの非存在下（図１１Ｃ、レーン２）及び存在下（図１１Ｃ、レーン３～４）のいずれにおいても、陽性対照である、１６２ｂｐの５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡに結合することが見出された。ＲＩＧ－Ｉはまた、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ及びｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのいずれにも結合した（図１１Ｃ、レーン５～１６）。Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖は、ＲＩＧ－Ｉの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへの結合に必要であると考えられないが、Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖の濃度が高濃度である場合、ＲＩＧ－Ｉの、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへの結合の増大が見られた（図１１Ｃ、レーン８と対比したレーン７、レーン１２と対比したレーン１１、レーン１６と対比したレーン１５）。これらの結果は、ＲＩＧ－Ｉが、結合レベルの変化ではなく、コンフォメーション変化のレベルにおいて、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡと、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡとを区別することを示唆する。これらの結果はまた、ＲＩＧ－Ｉの、ｃｉｒｃＲＮＡへの結合が、５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡリガンドと異なることも裏付けている。

【0160】

ＲＩＧ－Ｉ及びＭＤＡ５などのＰＲＲは、多くのＲＮＡを精査するが、免疫原性のＲＮＡリガンドとの相互作用時に、オリゴマー化のためのコンフォメーション変化を、選択的にのみ経る（Ａｈｍａｄら、Ｃｅｌｌ、１７２（４）：７９７～８１０．ｅ１３（２０１８））。同様に、ＲＩＧ－Ｉの、５’三リン酸（ウイルスＲＮＡ上に存在する）に対する、ｍ７Ｇｐｐｐキャップ（全てのｍＲＮＡ上に存在する）を上回る選択性は、リガンドへの結合ではなく、コンフォメーション変化に起因する（Ｄｅｖａｒｋａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１１３（３）：５９６～６０１（２０１６））。したがって、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡを、コンフォメーション変化と対比した、結合レベルにおいて区別するＲＩＧ－Ｉの能力を査定した。

【0161】

ＲＩＧ－Ｉが活性化されると、オリゴマー化ＲＩＧ－Ｉは、ＭＡＶＳ（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＰＳ－１、Ｃａｒｄｉｆ及びＶＩＳＡとしてもまた公知である）の、フィラメントへの重合の鋳型となり、ＩＲＦ３転写因子の活性化及び二量体化に至る、後続のシグナル伝達のためのプラットフォームを創出する。精製ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ、精製ＲＩＧ－Ｉ、精製Ｋ６３結合型ポリユビキチン及び精製ＭＡＶＳを、インビトロにおいて再構成し、ＭＡＶＳの、単量体から、フィラメントへの移行を、ゲルシフト（図１２Ａ）又は電子顕微鏡（図１２Ｂ）によりモニタリングした。非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、Ｋ６３結合型ポリユビキチンの存在下において、ＭＡＶＳの重合を、濃度依存的に強力に刺激した（図１２Ｂ）。重要なことは、ｍ^６Ａ修飾を、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへと、１％又は１００％において組み込んだところ、ＭＡＶＳフィラメントの形成が、それぞれ、実質的に低下させられる、又は完全に消失させられたことである（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。Ｋ６３結合型ポリユビキチンの非存在下において、ｃｉｒｃＲＮＡ基質のうちのいずれもが、ＭＡＶＳの重合を誘導しなかったことは、後続するＭＡＶＳの重合及びシグナル伝達が生じるために、活性化ＲＩＧ－Ｉコンフォメーションを安定化させるのに、ポリユビキチンが必要であることを指し示す（図１１Ｄ）。ＭＡＶＳフィラメントの、電子顕微鏡による定量は、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＭＡＶＳフィラメントの形成を強力に誘導するのに対し、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのｍ^６Ａ修飾は、オリゴマー化するＭＡＶＳの能力を抑制することを確認した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。

【0162】

精製構成要素による、これらのインビトロ結果は、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、Ｋ６３結合型ポリユビキチンの存在下において、ＲＩＧ－Ｉを直接活性化させ、他の任意の酵素又はＲＮＡ結合性タンパク質の非存在下において、ＭＡＶＳを活性化させることを裏付ける。ＲＩＧ－Ｉへの結合は、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡと、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡとを識別できず（図１１Ｃ）、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮのみが、Ｋ６３結合型ポリユビキチンの存在下において、ＭＡＶＳフィラメントの形成を誘発した（図１２Ａ～１２Ｃ）。これらの結果は、ｍ^６Ａの区別が、ＭＡＶＳの、単量体から、フィラメントへの移行において生じ、ＲＩＧ－Ｉへの結合ではなく、ＲＩＧ－Ｉコンフォメーション変化に依存することを示唆する。

【0163】

［実施例９］
本実施例は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＩＲＦ３の二量体化を活性化させることを裏付ける。

【0164】

ＭＡＶＳのフィラメント形成の後、下流における転写因子であるＩＲＦ３の二量体化は、ゲノムへの自然免疫シグナル伝達を完了する。ＩＲＦ３を活性化させるｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの能力について調べるために、無細胞アッセイを、まず、ＲＩＧ－Ｉ、ＲＮＡ、Ｋ６３結合型ポリユビキチン複合体を形成し、次いで、細胞質ゾル画分及びミトコンドリア画分の両方を含有する細胞抽出物（Ｓ１）の存在下において、放射性標識化ＩＲＦ３と共にインキュベートすることにより実施した。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、ＩＲＦ３の二量体化を、濃度依存的に強力に誘導したのに対し、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮは、ＩＲＦ３二量体化の実質的な低下をもたらした（図１２Ｄ、レーン８～１０と対比した、レーン５～７）。公知のアゴニストである、１６２ｂｐの５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡは、化学当量未満の量において存在する場合に、ＲＩＧ－Ｉ媒介性ＩＲＦ３二量体化を良好に刺激し、ｄｓＲＮＡの増大は、ＲＮＡ上における、ＲＩＧ－Ｉの効果的なオリゴマー化を妨げた（図１１Ｄ）。５’－ヒドロキシル直鎖状ＲＮＡは、陰性対照について予測される通り、ＩＲＦ３の二量体化を刺激しなかった（図１２Ｄ、レーン２～４）。

【0165】

［実施例１０］
本実施例は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮが、活性化の前に、適正な複合体の形成を要求することを裏付ける。

【0166】

ＲＩＧ－Ｉのオリゴマー化及び活性化の要件を理解するために、インビトロアッセイのための、特異的構成要素の添加の順序について検討した。５’ｐｐｐ ＲＮＡは、Ｓ１溶解物の補充の前に、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３結合型ポリユビキチンと共にプレインキュベートされる場合に、より強力な応答を示した。しかし、Ｓ１溶解物の導入の後における、５’ｐｐｐ ｄｓＲＮＡの添加は、有意であるが、低減された刺激活性を結果としてもたらした（図１１Ｅ、レーン８及び９と対比したレーン２及び５）。ポリユビキチンの存在又は非存在の間に差違が見られなかったので、Ｓ１期におけるＫ６３結合型ポリユビキチンの添加は、有効でなかった（図１１Ｅ、レーン１０及び１１と対比したレーン２及び５）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮを、Ｓ１細胞溶解物へと添加し、次いで、ＲＩＧ－Ｉ及びポリユビキチンと混合したところ、ＩＲＦ３二量体化活性は得られなかった（図１２Ｄ、レーン１１～１３）。この結果は、おそらく、細胞溶解物中の遊離Ｋ６３結合型ポリユビキチン鎖の急速な分解又は不安定化のために、ポリユビキチンが、まず、アゴニストであるｃｉｒｃＲＮＡの存在下において、ＲＩＧ－Ｉと相互作用し、これを安定化させる必要があることを示唆する。したがって、シグナル伝達複合体は、Ｓ１細胞溶解物の添加の前に形成される必要がある。さらなる実験は、ＩＲＦ３のｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ媒介性活性化における、内因性ＲＮＡの役割を除外した（図１１Ｆ）。

【0167】

まとめると、上記において記載された、生化学的再構成実験は、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３－Ｕｂｎが、免疫シグナル伝達のための、３構成要素型のシグナル伝達コンピテント複合体を形成することを裏付けた。

【0168】

［実施例１１］
本実施例は、細胞内における、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡの、ｍ^６ＡマーキングｃｉｒｃＲＮＡと対比して、顕著に異なる局在について記載する。

【0169】

ＲＩＧ－Ｉによる、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの直接的なセンシングについてのインビトロアッセイを検証するために、免疫蛍光顕微鏡法を実施した。ＨｅＬａ細胞に、ＦＩＴＣ標識化ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮをトランスフェクトし、ホルムアルデヒドにより固定し、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３結合型ポリユビキチンを標識付けした（図１３Ａ）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ－ＦＩＴＣの大部分は、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３結合型ポリユビキチンのいずれとも共局在した（図１３Ｂ、８５．５％）。Ｋ６３結合型ポリユビキチンが、複合体内に存在する場合、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮとの相互作用は、ＲＩＧ－Ｉを活性化させ、これは、ＭＡＶＳのフィラメント形成に対する後続の刺激を可能とした。

【0170】

ＲＩＧ－Ｉの活性化は、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡと、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡとを区別するので、ＹＴＨＤＦ２が、ＲＩＧ－Ｉの活性化を阻害する、又はＲＩＧ－Ｉへの結合を減少させる複合体に参与すると仮定した。かつて、ｃｉｒｃＲＮＡ上において、１％のｍ^６Ａ修飾を使用したが、ｍ^６Ａは、ランダムに組み込まれるため、ＲＲＡＣＨコンセンサスモチーフ（配列番号１８）におけるｍ^６Ａレベルは、１％をはるかに下回ることが予期された。ＹＴＨＤＦ２は、ＲＲＡＣＨモチーフ（配列番号１８）において、ｍ^６Ａに結合する（Ｄｏｍｉｎｉｓｓｉｎｉら、前出；Ｍｅｙｅｒら、前出）。したがって、コンセンサス配列におけるｍ^６Ａの配置の良好なモデル化のために、１０％のｍ^６Ａを、ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮへと組み込んだ。免疫蛍光顕微鏡法を、非修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ又は１０％のｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ、ＲＩＧ－Ｉ及びＹＴＨＤＦ２について実施した（図１３Ｃ）。ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮ上にｍ^６Ａ修飾が存在する場合に、ｃｉｒｃＲＮＡの、ＲＩＧ－Ｉ及びＹＴＨＤＦ２との共局在の百分率が、倍増を超えた（３３．８％～６５．３％）のに対し、単独におけるＲＩＧ－Ｉと相互作用するｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮの百分率は低下した（図１３Ｄ、６１．９％～２９．３％）。これらの結果は、ｍ^６Ａ修飾が、ＹＴＨＤＦ２を、ＲＩＧ－Ｉと同じ複合体へと動員することを裏付け、免疫蛍光研究は、細胞内における、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡと対比した、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡの顕著に異なる運命について、直交的かつ空間的な情報をもたらす。

【0171】

まとめると、データは、ＲＩＧ－Ｉが、Ｋ６３結合型ポリユビキチンに依存する機構を介して、外来ｃｉｒｃＲＮＡを認識することを示唆する（図１４）。ＲＩＧ－Ｉ、非修飾ＲＮＡ及びＫ６３結合型ポリユビキチンの複合体の形成は、ＭＡＶＳフィラメントの形成及びＩＲＦ３の二量体化を誘発して、下流におけるインターフェロンの産生を刺激する。ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＦＯＲＥＩＧＮもまた、ＲＩＧ－Ｉに結合するが、ＲＩＧ－Ｉの活性化を抑制するので、ｍ^６Ａ修飾を有する自己ｃｉｒｃＲＮＡは、安全に無視される。細胞内において、ＹＴＨＤＦ２は、ｍ^６Ａと共に作用して、免疫シグナル伝達を阻害する。

【0172】

上記の例は、ｃｉｒｃＲＮＡが、特異的なＴ細胞応答及びＢ細胞応答を誘導する、強力なアジュバントとして作用することの、インビボにおける証拠を提示する。ｃｉｒｃＲＮＡは、自然免疫応答及び獲得免疫応答の両方を誘導することが可能であり、腫瘍の確立及び増殖を阻害する能力を有する。結果は、ヒトｃｉｒｃＲＮＡが、生誕時に、それらのバックスプライシングをプログラムするイントロンに基づき、共有結合的ｍ^６Ａ修飾によりマーキングされることを示唆する。ＲＩＧ－Ｉは、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡと、ｍ^６Ａ修飾ｃｉｒｃＲＮＡとを区別し、前者のみにより活性化される。ＲＩＧ－Ｉが、外来ｃｉｒｃＲＮＡによる自然免疫に必要かつ十分であるのに対し（Ｃｈｅｎら、前出）、ｔｏｌｌ様受容体は、ｃｉｒｃＲＮＡに対して応答性ではない（Ｗｅｓｓｌｈｏｅｆｔら、前出）。これに対し、ＲＮＡ修飾を欠く外来ｃｉｒｃＲＮＡは、ＲＩＧ－Ｉ及びＫ６３－Ｕｂｎにより認識され、外来ｃｉｒｃＲＮＡのｍ^６Ａ修飾は、それらを、「自己」としてマーキングして、免疫活性化を防止するのに十分である。モデルｃｉｒｃＲＮＡ内の全てのアデノシンの修飾又はカノニカルのｍ^６ＡモチーフであるＲＲＡＣＨ（配列番号１８）内のアデノシンのみの修飾は、ｃｉｒｃＲＮＡによる、抗ウイルス遺伝子の誘導を、実質的に増大させた。

【0173】

これらの結果は、特異的ｃｉｒｃＲＮＡエクソン配列が、免疫に影響を与えることの最初の証拠を提示し、内因性ｍ^６Ａ修飾が、自然免疫を弱めることを裏付ける。５’三リン酸直鎖状ＲＮＡリガンドのｍ^６Ａ修飾はまた、ＲＩＧ－Ｉへの結合及びＲＩＧ－Ｉの活性化も消失させる（Ｄｕｒｂｉｎら、ｍＢｉｏ、７：ｅ００８３３－００８１６（２０１６）；Ｐｅｉｓｌｅｙ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、５１：５７３～５８３（２０１３））。よって、ＲＩＧ－Ｉは、ｃｉｒｃＲＮＡの一般的リーダーであると考えられ、その活性化は、真核ＲＮＡの主要な特色である、ＲＮＡ修飾により抑制される。非修飾ｃｉｒｃＲＮＡ及びｍ^６ＡｃｉｒｃＲＮＡのいずれも、ＲＩＧ－Ｉに結合しうるが、非修飾ｃｉｒｃＲＮＡのみが、ＲＩＧ－Ｉを活性化させて、ＭＡＶＳフィラメントの形成を誘発しうる。これらの結果は、ＲＩＧ－Ｉコンフォメーション変化が、ＭＡＶＳフィラメントの形成を誘導するのに必要であることを示唆する。この観察は、リガンドへの結合ではなく、コンフォメーション変化に起因する、ＲＩＧ－Ｉの、５’三リン酸（ウイルスＲＮＡ上に存在する）に対する、ｍ７Ｇｐｐｐキャップ（全てのｍＲＮＡ上に存在する）を上回る選択性（Ｄｅｖａｒｋａｒら、前出）と同様である。共結晶構造解析及び生化学解析は、５’三リン酸及びｍ７Ｇｐｐｐのいずれもが、ＲＩＧ－Ｉに、同じアフィニティーにより結合するが、後者が、顕著に異なるコンフォメーション変化を誘発し、ＲＩＧ－Ｉに、内因性ｍＲＮＡに対してフィルターをかけるように仕向け、ＡＴＰアーゼ活性を低下させることを示す（Ｄｅｖａｒｋａｒら、前出）。生細胞において、ＹＴＨＤＦ２は、免疫遺伝子の下流におけるシグナル伝達に必要なＲＩＧ－Ｉのコンフォメーション転換を阻害する（図１３）。

【0174】

上記の例は、ｃｉｒｃＲＮＡによる免疫に対する、ＹＴＨＤＦ２媒介性抑制の必要性、十分性及びドメイン要件について、体系的に対処している。全長ＹＴＨＤＦ２の要件は、ＹＴＨタンパク質が、ｍ^６Ａ修飾ＲＮＡを、それらのＮ末端変性ドメインを介して、相分離凝縮物へと動員する、すなわち、いずれのドメインも、高次のＲＮＡ－タンパク質間相互作用に必要とされるという近年のモデルと符合する（Ｌｕｏ、２０１８）。これらの結果は、ＹＴＨＤＦの機能についての既存の知見を拡大する。ＲＮＡの分解又は翻訳を誘導するのに、エフェクタードメインのみのテザリングで十分である（Ｗａｎｇら、２０１５；Ｗａｎｇら、２０１６）が、ｃｉｒｃＲＮＡの自己／外来の区別に、全長タンパク質が必要とされる。これらの結果は、ｍ^６Ａについて、ＲＩＧ－Ｉ抗ウイルス経路を活性化しないように、内因性ｃｉｒｃＲＮＡを隔離及び遮断する二層からなる系を示唆する。ＹＴＨＤＦ２に加えて、内因性ｃｉｒｃＲＮＡの自己としての同定に関与する、他のセンサー及び受容体もまた存在する。

【0175】

本明細書において引用される、刊行物、特許出願及び特許を含む、全ての参考文献は、各参考文献が、参照により組み込まれることが、個別に、かつ、具体的に指し示され、本明細書において、その全体において明示された場合と同じ程度に、参照により組み込まれる。

【0176】

本明細書において別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが明確に指示されない限り、本発明についての記載の文脈における（とりわけ、以下の特許請求の範囲の文脈における）、「ある（ａ）」指示対象及び「ある（ａｎ）」指示対象及び「その」指示対象並びに「少なくとも１つの」指示対象並びに同様の指示対象という用語の使用は、単数の指示対象及び複数の指示対象の両方を対象とする。本明細書において別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが明確に指示されない限り、リストの１つ以上の項目に続く、「少なくとも１つの」という用語（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）の使用は、列挙された項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味するように理解されるものとする。「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を有すること」、「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「～を含有すること」という用語は、別途注記されない限り、オープンエンドの（すなわち、「～を含むがこれらに限定されない」を意味する）用語であると理解されるものとする。本明細書において別途指示がない限り、本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に収まる各個別の値に、個別に言及する縮約法として用いられることのみが意図され、各個別の値は、本明細書において個別に列挙された場合と同様に、本明細書へと組み込まれる。本明細書において別途指示がない限り又は文脈により反対のことが別途明確に指示されない限り、本明細書において記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実施されうる。本明細書において提示される、任意の例及び全ての例又は例示的表現（例えば、「～など」）の使用は、本発明をよりよく例示することのみが意図されるものであり、別途特許請求されない限り、本発明の範囲に対する限定を提起するものではない。本明細書におけるいかなる表現も、特許請求されていない任意の要素を、本発明の実施に不可欠なものとして指し示すものとして理解されるべきではない。

【0177】

本明細書において、本発明を実施するために、本発明者らに既知である、最良の方式を含む、本発明の好ましい実施形態が記載される。これらの好ましい実施形態の変動は、前出の記載を読めば、当業者に明らかとなりうる。本発明者らは、当業者が、適宜、このような変動を用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書において具体的に記載された形とは別の形で実施されることを意図する。したがって、本発明は、該当する法規により許容される限りにおいて、本明細書に付属の特許請求の範囲において列挙される主題の、全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書において別途指示がない限り、又は文脈により反対のことが別途明確に指示されない限り、上記において記載された要素の、その全ての可能な変動における、任意の組合せも、本発明により包含される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2022-05-18

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない環状ＲＮＡ分子を含むワクチン組成物。

【請求項2】

環状ＲＮＡが、ＲＲＡＣＨモチーフを欠く、請求項１に記載のワクチン組成物。

【請求項3】

少なくとも１つの抗原をさらに含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項4】

環状ＲＮＡ分子が、ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項5】

ポリペプチドをコードする配列が、少なくとも１つの抗原をコードする、請求項４に記載のワクチン組成物。

【請求項6】

少なくとも１つの抗原が、ウイルス由来、細菌由来、寄生虫由来、真菌由来、原虫由来、プリオン由来、細胞由来、又は細胞外由来の抗原である、請求項３又は５に記載のワクチン組成物。

【請求項7】

少なくとも１つの抗原が、腫瘍抗原である、請求項３又は５に記載のワクチン組成物。

【請求項8】

環状ＲＮＡ分子が、インビトロ転写を使用して作製される、請求項１～７のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項9】

環状ＲＮＡが、組成物中に、ネイキッドＲＮＡとして存在する、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項10】

環状ＲＮＡが、ナノ粒子と複合体を形成している、請求項１～８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項11】

ナノ粒子が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ナノ粒子である、請求項１０に記載のワクチン組成物。

【請求項12】

自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発するための、請求項１～１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

【請求項13】

環状ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む組成物であって、環状ＲＮＡが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）残基を、一切、含有しない組成物。

【請求項14】

ＤＮＡ配列が、ＲＲＡＣＨモチーフを一切含まない、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

ウイルスベクター又は非ウイルスベクターが、ＤＮＡ配列を含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。

【請求項16】

ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はヘルペスウイルスベクターである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

非ウイルスベクターが、プラスミドである、請求項１５に記載の組成物。

【請求項18】

有効量の、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物を含む、自然免疫応答を誘発することを必要とする対象における自然免疫応答を誘発するための組成物。

【請求項19】

インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法であって、
（ａ）環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；
（ｃ）ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び
（ｄ）直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップ
を含み；
リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を一切含まず；
環状ＲＮＡが、対象において、自然免疫応答をもたらすことが可能である、
方法。

【請求項20】

環状ＲＮＡが、ｍ^６Ａを一切含まない、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

インビトロ転写により、環状ＲＮＡ分子を作製する方法であって、
（ａ）環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸及びＲＮＡポリメラーゼを用意するステップ；
（ｃ）ＤＮＡ鋳型から、直鎖状ＲＮＡを転写するステップ；及び
（ｄ）直鎖状ＤＮＡを環状化して、環状ＲＮＡを形成するステップ
を含み；
リボヌクレオチド三リン酸が、Ｎ６－メチルアデノシン－５’三リン酸（ｍ^６ＡＴＰ）を含み；
環状ＲＮＡが、同じ方法を使用するがｍ^６ＡＴＰの非存在下で使用して作製される環状ＲＮＡと比較して免疫原性が小さい、
方法。

【請求項22】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を低減する方法であって、
（ａ）対象において自然免疫応答を誘導する環状ＲＮＡ分子を用意するステップ；及び
（ｂ）Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）、シュードウリジン及びイノシンから選択される少なくとも１つのヌクレオシドを、環状ＲＮＡ分子へと導入して、自然免疫原性が低減された修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップ、
を含む方法。

【請求項26】

環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１％が、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

環状ＲＮＡ分子のうちの、少なくとも１０％が、ｍ^６Ａ、シュードウリジン及び／又はイノシンを含有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

環状ＲＮＡ分子の自然免疫原性を増大させる方法であって、
（ａ）ＲＲＡＣＨモチーフを欠く環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び
（ｂ）１つ以上のアデノシンを、別の塩基により置きかえて、自然免疫原性が増大させられた修飾環状ＲＮＡ分子をもたらすステップ、
を含む方法。

【請求項29】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、ウラシルにより置きかえられる、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、ウラシルにより置きかえられる、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、ウラシルにより置きかえられる、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ ^６ Ａ）化学修飾を含む組換え環状ＲＮＡ分子を含む、細胞へ物質を送達するための組成物。

【請求項33】

物質が、タンパク質又はペプチドである、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

物質が、抗原又はエピトープである、請求項３２又は３３に記載の組成物。

【請求項35】

物質が、低分子である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項36】

物質が、組換え環状ＲＮＡ分子へと共有結合的に連結される、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

インビトロにおいて、細胞内にＲＮＡ結合性タンパク質を隔離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＮ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）及び１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインを含む組換え環状ＲＮＡ分子を作出するステップ；及び
（ｂ）ＲＮＡ結合性タンパク質を含む細胞を、組換え環状ＲＮＡ分子と接触させるステップであって、これにより、ＲＮＡ結合性タンパク質が、１つ以上のＲＮＡ結合性タンパク質結合性ドメインに結合し、細胞内に隔離されるステップ、
を含む方法。

【請求項38】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、細胞内において異常に発現されている、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列によりコードされる、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

ＲＮＡ結合性タンパク質が、疾患と関連する、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンのうちの少なくとも１０％が、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

組換え環状ＲＮＡ分子内のアデノシンの全てが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

組換えＲＮＡ分子が、ファージＴ４チミジル酸シンターゼ（ｔｄ）遺伝子の自己スプライシングＩ群イントロン及び少なくとも１つのエクソンを含む、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

組換え環状ＲＮＡ分子が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

組換え環状ＲＮＡ分子が、２００ヌクレオチド～６，０００ヌクレオチドの間のヌクレオチドを含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

組換え環状ＲＮＡ分子が、約１，５００ヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。

【国際調査報告】