▶ センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】キメラ抑制性受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221027BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221027BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221027BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221027BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20221027BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221027BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20221027BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N5/078
A61K35/17
A61P37/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022511283
(86)(22)【出願日】2020-08-20
(85)【翻訳文提出日】2022-04-21
(86)【国際出願番号】 US2020047274
(87)【国際公開番号】W WO2021035093
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/889,324
(32)【優先日】2019-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519028678
【氏名又は名称】センティ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】フランケル，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ゴードリー，ラッセル，モリソン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、キメラ抑制性受容体コンストラクト及び組成物、ならびにコンストラクトを含む細胞を提供する。キメラ抑制性受容体コンストラクト及び組成物、ならびにコンストラクトを含む細胞を使用する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む、キメラ抑制性受容体。
【請求項2】
前記酵素的抑制性ドメインが酵素触媒ドメインを含み、前記酵素触媒ドメインが、ＣＳＫ、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＺＡＰ７０、及びＲａｓＧＡＰからなる群から選択される酵素に由来する、請求項１に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項3】
前記酵素的抑制性ドメインが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む、請求項１または２に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項4】
前記細胞外リガンド結合ドメインが抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、場合により、前記抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項5】
前記細胞外リガンド結合ドメインが、腫瘍細胞で発現されないリガンドに結合し、及び／または前記リガンドが健康な組織の細胞で発現される、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項6】
前記細胞外リガンド結合ドメインが二量体化ドメインを含み、場合により、前記リガンドが同種の二量体化ドメインをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項7】
前記膜局在化ドメインが、細胞外ドメインの少なくともの一部及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含み、場合により、前記膜貫通ドメインが、ＬＡＸ膜貫通ドメイン、ＣＤ２５膜貫通ドメイン、ＣＤ７膜貫通ドメイン、ＬＡＴ膜貫通ドメイン、ＬＡＴ変異体由来の膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－ＩＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＴＩＭ３膜貫通ドメイン、ＬＩＲ１膜貫通ドメイン、ＮＫＧ２Ａ膜貫通ドメイン、ＴＩＧＩＴ膜貫通ドメイン、及びＬＡＧ３膜貫通ドメイン、ＬＡＩＲ１膜貫通ドメイン、ＧＲＢ－２膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－１膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－２膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ１膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメイン、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン、ＨＡＶＲ膜貫通ドメイン、ＧＩＴＲ膜貫通ドメイン、ＰＤ－Ｌ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＣＤ９４膜貫通ドメイン、ＫＬＲＧ－１膜貫通ドメイン、ＰＡＧ膜貫通ドメイン、ＣＤ４５膜貫通ドメイン、及びＣＥＡＣＡＭ１膜貫通ドメインからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項8】
前記キメラ抑制性受容体が１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインをさらに含み、場合により前記１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１からなる群から選択される１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質、もしくはそのフラグメントを含み、ならびに／または前記１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ１、ＳＬＡＰ２、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、もしくはそのフラグメントを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項9】
前記細胞外リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して前記膜局在化ドメインに連結され、場合により、前記細胞外リンカー領域が、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜局在化ドメインとの間に位置して前記細胞外リガンド結合ドメイン及び前記膜局在化ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結され、場合により、前記細胞外リンカー領域が、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＦｃγＲＩＩＩα、ＬＮＧＦＲ、及びＰＤＧＦＲからなる群から選択されるタンパク質に由来するか、またはＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項10】
前記キメラ抑制性受容体が、前記膜局在化ドメインと前記酵素的抑制性ドメインとの間に位置して前記膜局在化ドメイン及び前記酵素的抑制性ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結された細胞内スペーサー領域をさらに含み、場合により、前記細胞内スペーサー領域が、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項11】
前記免疫受容体がキメラ免疫受容体であり、場合により、前記免疫受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、天然の抗原受容体であり、場合により、前記免疫受容体が、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体をコードする、核酸。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項14】
請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載のベクターを含むか、または請求項１～１１のいずれか１項に記載のキメラ抑制性受容体を発現する、遺伝子操作された細胞。
【請求項15】
キメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞であって、前記キメラ抑制性受容体が、細胞外リガンド結合ドメインと、
膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含み、
場合により、前記細胞が免疫受容体をさらに含み、場合により、前記免疫受容体がキメラ抗原受容体または天然の抗原受容体であり、場合により、前記免疫受容体が、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体からなる群から選択され、場合により、前記キメラ抑制性受容体がリガンド結合時の免疫受容体の活性化を阻害する、前記操作された細胞。
【請求項16】
前記細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ＥＳＣ由来細胞、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の操作された細胞。
【請求項17】
請求項１４～１６のいずれか１項に記載の操作された細胞と、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの組み合わせと、を含む、医薬組成物。
【請求項18】
免疫受容体の活性化を阻害する方法であって、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の操作された細胞または請求項１７に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記キメラ抑制性受容体が、前記操作された細胞の細胞膜上で発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合に免疫受容体の活性化を阻害する、前記方法。
【請求項19】
免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または阻害する方法であって、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の操作された細胞または請求項１７に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項20】
免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する方法であって、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の操作された細胞または請求項１７に記載の医薬組成物または請求項１７に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記キメラ抑制性受容体の前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記リガンドの前記キメラ抑制性受容体との結合時に前記酵素的抑制性ドメインが前記腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０１９年８月２０日出願の米国特許仮出願第６２／８８９，３２４号の利益を主張する。
関連出願の相互参照
本出願は、その全容を参照により本明細書に援用するところの２０１９年８月２０日出願の米国特許仮出願第６２／８８９，３２４号の利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名前が付けられており、そのサイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出され、その全容を参照によって本明細書に援用する配列表を含む。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名前が付けられており、そのサイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【0003】
〔背景技術〕
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞などの免疫調節細胞の標的化されたインビボ活性化を可能とする。これらの組換え膜受容体は、抗原結合ドメインと、１つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化ドメイン）を有している。これらの特殊な受容体は、Ｔ細胞が腫瘍細胞上の特定のタンパク質抗原を認識することを可能とし、Ｔ細胞の活性化及びシグナル伝達経路を誘導する。キメラ受容体を発現するＴ細胞を用いた臨床試験の最近の結果は、がん免疫療法用の薬剤としてのその有用性の説得力ある支持を与えるものである。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞治療に関連する多くの副作用が特定されており、重大な安全上の懸念が生じている。１つの副作用は、ＴＣＲ及びＣＡＲ操作されたＴ細胞による「オンターゲット・バット・オフティシュー」（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｂｕｔ ｏｆｆ－ｔｉｓｓｕｅ）（本来の標的ではあるものの標的組織外のリガンドに結合する）有害事象であり、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的腫瘍組織の外側でそのリガンドに結合して免疫応答を誘導するというものである。したがって、適切なＣＡＲ標的を特定できることは、同じ標的抗原を発現する正常細胞に損傷を与えることなく、腫瘍を効果的に標的化して治療するうえで重要である。標的に対する適当な応答を調節してオフターゲットの副作用を低減できることは、ＴＣＲ、操作されたＴＣＲ、キメラＴＣＲなどの他の免疫受容体システムにおいても重要である。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞などの免疫調節細胞の標的化されたインビボ活性化を可能とする。これらの組換え膜受容体は、抗原結合ドメインと、１つ以上のシグナル伝達ドメイン（例えば、Ｔ細胞活性化ドメイン）を有している。これらの特殊な受容体は、Ｔ細胞が腫瘍細胞上の特定のタンパク質抗原を認識することを可能とし、Ｔ細胞の活性化及びシグナル伝達経路を誘導する。キメラ受容体を発現するＴ細胞を用いた臨床試験の最近の結果は、がん免疫療法用の薬剤としてのその有用性の説得力ある支持を与えるものである。しかし、これらの有望な結果にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞治療に関連する多くの副作用が特定されており、重大な安全上の懸念が生じている。１つの副作用は、ＴＣＲ及びＣＡＲ操作されたＴ細胞による「オンターゲット・バット・オフティシュー」（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｂｕｔ ｏｆｆ－ｔｉｓｓｕｅ）（本来の標的ではあるものの標的組織外のリガンドに結合する）有害事象であり、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的腫瘍組織の外側でそのリガンドに結合して免疫応答を誘導するというものである。したがって、適切なＣＡＲ標的を特定できることは、同じ標的抗原を発現する正常細胞に損傷を与えることなく、腫瘍を効果的に標的化して治療するうえで重要である。標的に対する適当な応答を調節してオフターゲットの副作用を低減できることは、ＴＣＲ、操作されたＴＣＲ、キメラＴＣＲなどの他の免疫受容体システムにおいても重要である。
【0004】
抑制性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲとしても知られる）は、標的細胞上の同種リガンドに結合した後、免疫調節細胞の活性を阻害または低下させるタンパク質構造である。現在のｉＣＡＲ設計では、ＰＤ－１細胞内ドメインを阻害に利用しているが、再現が困難であることが示されている。したがって、ｉＣＡＲで使用するための上記に代わる抑制性ドメインが必要とされている。免疫受容体システムのための適当な抑制性ドメイン、手法、及びコンストラクトも必要とされている。
【0005】
〔発明の概要〕
本明細書では、いくつかの態様において、細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、免疫受容体に近接する場合に免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含むキメラ抑制性受容体が提供される。
本明細書では、いくつかの態様において、細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、免疫受容体に近接する場合に免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含むキメラ抑制性受容体が提供される。
【0006】
本明細書では、他の態様において、本開示の少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸は、ベクターである。
【0007】
他の態様では、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードするか、または本開示のキメラ抑制性受容体を発現する、ベクターなどの核酸を含む遺伝子操作された細胞が提供される。いくつかの態様では、キメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞が提供され、キメラ抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、免疫受容体に近接する場合に免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む。
【0008】
さらに他の態様では、本開示の遺伝子操作された細胞における免疫受容体の活性化を阻害するための方法が提供される。
【0009】
さらに他の態様では、免疫応答を低減し、及び／または自己免疫疾患を治療するために、本開示の遺伝子操作された細胞または医薬組成物を利用するための方法が提供される。
【0010】
他の態様では、本明細書の組成物のいずれか１つの操作された細胞と、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの組み合わせとを含む医薬組成物が提供される。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、受容体結合ドメイン、核酸、小分子、及び化学物質から選択されるリガンドに結合する。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
【0013】
これらの実施形態のいくつかでは、リガンドは腫瘍関連抗原である。これらの実施形態のいくつかでは、リガンドは腫瘍細胞で発現されない。これらの実施形態のいくつかでは、リガンドは非腫瘍細胞で発現される。これらの実施形態のいくつかでは、リガンドは、健康な組織の細胞で発現される。
【0014】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、二量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、同種の二量体化ドメインをさらに含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、リガンドは細胞表面リガンドである。いくつかの実施形態では、細胞表面リガンドは、免疫受容体の同種リガンドをさらに発現する細胞で発現される。
【0016】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ受容体の膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部と細胞内ドメインの少なくとも一部とをさらに含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、ＬＡＸ膜貫通ドメイン、ＣＤ２５膜貫通ドメイン、ＣＤ７膜貫通ドメイン、ＬＡＴ膜貫通ドメイン、ＬＡＴ変異体由来の膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－ＩＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＴＩＭ３膜貫通ドメイン、ＬＩＲ１膜貫通ドメイン、ＮＫＧ２Ａ膜貫通ドメイン、ＴＩＧＩＴ膜貫通ドメイン、及びＬＡＧ３膜貫通ドメイン、ＬＡＩＲ１膜貫通ドメイン、ＧＲＢ－２膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－１膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－２膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ１膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメイン、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン、ＨＡＶＲ膜貫通ドメイン、ＧＩＴＲ膜貫通ドメイン、ＰＤ－Ｌ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＣＤ９４膜貫通ドメイン、ＫＬＲＧ－１膜貫通ドメイン、ＰＡＧ膜貫通ドメイン、ＣＤ４５膜貫通ドメイン、及びＣＥＡＣＡＭ１膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部及び／または対応する内ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＴ変異体は、ＬＡＴ（ＣＡ）変異体である。
【0018】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、キメラ抑制性受容体を細胞膜のドメインに誘導、及び／または隔離する。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、キメラ抑制性受容体を脂質ラフトまたは重脂質ラフトに局在化させる。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞膜のドメインに局在化された１つ以上の細胞膜成分と相互作用する。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの同種リガンドへの結合がない状態で酵素的抑制性ドメインによる免疫受容体活性化の構成的阻害を軽減するのに十分である。
【0019】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの同種リガンドへの結合がない状態で免疫受容体の１つ以上の成分によって占められる細胞膜のドメインとは異なる細胞膜のドメインへのキメラ抑制性受容体の局在化を媒介する。
【0020】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、近接タンパク質フラグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質の１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質、またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質、またはそのフラグメントは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、またはそのフラグメントは、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ１、ＳＬＡＰ２、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１から選択される。
【0021】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、細胞外リンカー領域を介して膜局在化ドメインと連結される。
【0022】
いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域は、細胞外リガンド結合ドメインと膜局在化ドメインとの間に位置し、細胞外リガンド結合ドメイン及び膜局在化ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結される。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域は、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＦｃγＲＩＩＩα、ＬＮＧＦＲ、及びＰＤＧＦＲからなる群から選択されるタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域は、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域は、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、膜局在化ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間に位置して膜局在化ドメイン及び酵素的抑制性ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結された細胞内スペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体の酵素的抑制性ドメインは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、酵素触媒ドメインを含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、酵素の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、酵素の部分は、酵素ドメインまたは酵素フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、酵素の部分は、酵素の触媒ドメインである。
【0026】
いくつかの実施形態では、酵素は、ＣＳＫ、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＺＡＰ７０、及びＲａｓＧＡＰからなる群から選択される。
【0027】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＳＫに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性３（ＳＨ３）欠失を有するＣＳＫタンパク質を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＰ－１に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＰ－２に由来する。
【0030】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＥＮに由来する。
【0031】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＤ４５に由来する。
【0032】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＤ１４８に由来する。
【0033】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰ－ＭＥＧ１に由来する。
【0034】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰ－ＰＥＳＴに由来する。
【0035】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはｃ－ＣＢＬに由来する。
【0036】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＢＬ－ｂに由来する。
【0037】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰＮ２２に由来する。
【0038】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＬＡＲに由来する。
【0039】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰＨ１に由来する。
【0040】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＩＰ－１に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＺＡＰ７０に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性１（ＳＨ１）ドメイン、ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、またはＳＨ１ドメインとＳＨ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、キナーゼドメイン欠失を有するＺＡＰ７０タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、Ｔｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換、Ｔｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換、またはＴｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換とＴｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換を有する変異体ＺＡＰ７０タンパク質を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＲａｓＧＡＰに由来する。
【0043】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、基礎阻害を調節する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は基礎阻害を低下させる。他の実施形態では、１つ以上の改変は基礎阻害を増加させる。
【0044】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、キメラ抑制性受容体が免疫受容体に近接するように動員される際に免疫受容体の活性化を阻害する。
【0045】
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、キメラ免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、キメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然の免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、非天然の抗原受容体である。
【0046】
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体から選択される。
【0047】
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体である。
【0048】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、少なくとも１つの免疫受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫受容体は、キメラ免疫受容体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫受容体は、キメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫受容体は、天然の免疫受容体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫受容体は、非天然の抗原受容体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫受容体は、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体から選択される。
【0049】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体は、免疫受容体に近接している場合、リガンド結合時の免疫受容体の活性化を阻害する。
【0050】
いくつかの実施形態では、リガンドは細胞表面リガンドである。いくつかの実施形態では、細胞表面リガンドは、同種免疫受容体リガンドをさらに発現する細胞で発現される。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体に対するリガンド結合及び免疫受容体に対する同種免疫受容体リガンド結合は、キメラ抑制性受容体を免疫受容体に近接するように局在化させる。いくつかの実施形態では、免疫受容体に近接するようなキメラ抑制性受容体の局在化は、免疫受容体の活性化を抑制する。
【0051】
いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体の活性化はＴ細胞の活性化である。
【0052】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、免疫調節細胞である。いくつかの実施形態では、免疫調節細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ＥＳＣ由来細胞、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される。
【0053】
いくつかの実施形態では、細胞は自家である。いくつかの実施形態では、細胞は同種である。
【0054】
本明細書では、免疫細胞の活性化を阻害する方法も提供される。方法は、本明細書に開示される遺伝子操作された細胞または医薬組成物を、キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で接触させることを含み、キメラ抑制性受容体は、操作された細胞の細胞膜で発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合に免疫受容体の活性化を阻害する。
【0055】
本明細書では、免疫応答を低下させるための方法も提供される。方法は、本明細書に開示される遺伝子操作された細胞または医薬組成物をかかる治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0056】
本明細書では、免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または阻害するための方法も提供される。方法は、本明細書に開示される遺伝子操作された細胞または医薬組成物をかかる治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0057】
本明細書では、免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または阻害も提供される方法も提供される。方法は、本明細書に開示される遺伝子操作された細胞または医薬組成物を、キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下でキメラ抑制性受容体の同種リガンドと接触させることを含み、リガンドのキメラ抑制性受容体との結合時に酵素的抑制性ドメインが腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する。
【0058】
本明細書では、自己免疫疾患または免疫応答を低下させることによって治療可能な疾患を治療する方法も提供される。方法は、本明細書に開示される遺伝子操作された細胞または医薬組成物をかかる治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0059】
これら及びその他の態様については、下記に詳細に説明する。
【0060】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれるものであるが、本開示の特定の態様は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによりより深い理解を得ることができる。図面に示されるデータは、いかなる意味でも本開示の範囲を限定するものではない点を理解されたい。
【0061】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本開示のキメラ抑制性受容体がＴ細胞活性化を遮断する機構を示す概略図である。
〔図１〕本開示のキメラ抑制性受容体がＴ細胞活性化を遮断する機構を示す概略図である。
【0062】
〔図２〕キメラ抑制性受容体の特定の実施形態の組成を示す概略図である。ＥＬＢＤ：細胞外リガンド結合ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）。例としては、これらに限定されるものではないが、ｓｃＦｖ（例えば、腫瘍抗原に対する）、天然の受容体／リガンドドメイン、及び直交二量体化ドメイン（例えば、可溶性標的化分子と結合することができるロイシンジッパー）が挙げられる。ＭＬＤ：膜局在化ドメイン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）（場合により、細胞膜のサブドメインへの局在化に関与する近位の細胞内及び細胞外セグメント（例えば、脂質ラフト）を含む）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＬＡＸ、ＣＤ２５、ＣＤ７（Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、及びＬＡＴの変異体（例えば、ＬＡＴ（ＣＡ）、例えば、本明細書にその全体を援用する、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）：６６９－８０を参照）の膜貫通ドメインが挙げられる。ＥＩＤ：酵素的抑制性ドメイン（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｄｏｍａｉｎ）（例えば、有効性を最大化し、基礎阻害を最小化するように選択された、酵素のドメイン、フラグメント、または変異体を含む、天然のＴ細胞活性化カスケードを阻害する酵素）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＳＫ（Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、ＳＨＰ－１（例えば、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）：６６９－８０を参照）、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＬＹＰ／Ｐｅｐ／ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＲａｓＧＡＰ（例えば、本明細書にその全体を援用する、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２ Ｓｅｐ；１３７（１）：１－１９を参照）が挙げられる。
【0063】
〔図３〕キメラ抑制性受容体（例えば、「拡張型」キメラ抑制性受容体）の特定の実施形態の組成を示す概略図である。図２で述べたような、ＥＬＢＤ、ＭＬＤ、及びＥＩＤ。ＳＩＤ：足場抑制性ドメイン（Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｄｏｍａｉｎ）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＩＴＩＭを含むタンパク質ドメイン（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及び／またはＬＡＩＲ１の細胞質尾部など、またはそれらのフラグメント（複数可））ならびに、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１を含む、Ｔ細胞の活性化を阻害する非ＩＴＩＭ足場タンパク質ドメイン、またはそれらのフラグメント（複数可）が挙げられる。
【0064】
〔図４〕ＮＯＴゲートａＣＡＲ／ｉＣＡＲシステムを示す概略図である。Ｔ細胞を、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む共発現されるａＣＡＲのシグナル伝達を阻害するＥＩＤドメインとしてＣＳＫドメインを含む抗ＣＤ１９ ｉＣＡＲを発現するように操作した。標的ｋ５６２細胞を、ａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）を発現するように操作するか、またはａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）及びｉＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ１９）の両方を発現するように操作した。
【0065】
〔図５〕ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入した後、その後の濃縮を行うことなく、非改変細胞よりも高い検出可能なレベルでのｉＣＡＲコンストラクト抗ＣＤ１９＿ｓｃＦｖ－Ｃｓｋ融合体の発現を示す代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【0066】
〔図６〕ａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトのフローサイトメトリーによって評価された発現プロファイルである。図は、ａＣＡＲ＋＝ａＣＡＲを発現する細胞（ｉＣＡＲ有り及び無し）［１番目の柱］、ｉＣＡＲ＋＝ｉＣＡＲを発現する細胞（ａＣＡＲ有り及び無し）［２番目の柱］、及び二重＋＝ ａＣＡＲ及びｉＣＡＲの両方を発現する細胞［３番目の柱］を示している。
【0067】
〔図７〕ＣＤ１９／ＣＤ２０標的細胞とＣＤ２０のみの標的細胞の殺傷比として表される、殺傷効率によって評価したａＣＡＲシグナル伝達のｉＣＡＲ阻害の有効性を示す。図は、ａＣＡＲコンストラクトのみによる形質導入（左の柱）、ＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ３１）とａＣＡＲによるＴ細胞の同時形質導入（中央の柱）、ＳＨ３欠失を含むＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ２６）とａＣＡＲによるＴ細胞の同時形質導入（右の柱）を示している。
【0068】
〔発明を実施するための形態〕
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に断らない限り、以下に記載されるように定義される。
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に断らない限り、以下に記載されるように定義される。
【0069】
本明細書で使用される「キメラ抑制性受容体」または「抑制性キメラ抗原受容体」または「抑制性キメラ受容体」という用語は、免疫エフェクター細胞などの細胞で発現される場合にその細胞に、標的細胞に対する特異性及び細胞内シグナル伝達を負に調節する能力を与えるポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。キメラ抑制性受容体は「ｉＣＡＲ」と呼ばれることもある。
【0070】
「腫瘍標的化キメラ受容体」または「活性化キメラ受容体」という用語は、免疫応答の開始をもたらすシグナル伝達またはタンパク質発現の変化を活性化キメラ受容体発現細胞に誘導することができる構造を有する活性化キメラ受容体、腫瘍標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または操作されたＴ細胞受容体を指す。腫瘍標的化キメラ受容体は、「ａＣＡＲ」と呼ばれる場合もある。
【0071】
本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜にまたがるドメインを指す。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、疎水性のαヘリックスを含む。
【0072】
「腫瘍」という用語は、腫瘍細胞及び関連する腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍とは、腫瘍細胞または腫瘍塊を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍とは、腫瘍微小環境を指す。
【0073】
「発現されない」という用語は、腫瘍標的化キメラ抗原受容体の活性化をもたらす非腫瘍細胞における発現のレベルよりも少なくとも２倍低い発現を指す。いくつかの実施形態では、発現は、腫瘍標的化キメラ抗原受容体の活性化をもたらす非腫瘍細胞における発現のレベルよりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍以上低い。
【0074】
「改善する」という用語は、がん疾患状態の予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、または治癒を含む、疾患状態、例えば、がん疾患状態の治療におけるあらゆる治療上の有益な結果を指す。
【0075】
「インサイチュ」という用語は、例えば組織培養で増殖するなど、生物とは別に増殖する生細胞内で生じるプロセスを指す。
【0076】
「インビボ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。
【0077】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、これらに限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含む。
【0078】
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列との関連での同一率」（％）という用語は、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査により測定される、最大の一致について比較及び整列させた場合に、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の比率（％）を有する２つ以上の配列または部分配列のことを指す。用途に応じて、「同一率」（％）は、比較される配列の領域にわたって、例えば、機能ドメインにわたって存在するか、あるいは、比較される２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【0079】
配列比較では、一般的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合には部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一率（％）を算出する。
【0080】
比較を行うための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の探索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって（一般的には、下記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照）実施することができる。
【0081】
配列同一率（％）及び配列類似率（％）を決定するのに適したアルゴリズムの１つの例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手可能である。
【0082】
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するのに十分な量を意味する。
【0083】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防措置は治療とみなすことができるため、治療有効量とは「予防有効量」でもありうる。
【0084】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によってそうでない旨が明示されない限り、複数の指示対象を含む点に留意されなければならない。
【0085】
キメラ抑制性受容体
本明細書では、免疫細胞活性を制御するためのＮＯＴ論理ゲートとして特に有用であるキメラ抑制性受容体が提供される。キメラ抑制性受容体には、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメイン、及び酵素的抑制性ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、本開示のキメラ抑制性受容体が免疫受容体に近接するように動員される際に免疫受容体の活性化を阻害する。理論に拘束されることを望むものではないが、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとの結合は、一般的に、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体及び／または下流のシグナル伝達複合体に近接するような空間的動員を媒介し、それにより、酵素的抑制性ドメインが細胞内シグナル伝達カスケードの調節を行うことができる。近接とは、物理的に相互作用する２つの分子（例えば、タンパク質またはタンパク質ドメイン）を含みうる。近接とは、互いに機能的に相互作用するうえで物理的に十分に近い２つの分子を含みうる。近接とは、例えば足場タンパク質などの共有された中間分子と物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、例えばシグナル伝達カスケードなどの共有された複合体と物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、一定時間にわたって物理的に相互作用することで互いに相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、互いに機能的に相互作用するうえで一定時間にわたって物理的に十分に近くにある２つの分子を含みうる。近接とは、例えば足場タンパク質などの共有された中間分子と一定時間にわたって物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、例えばシグナル伝達カスケードなどの共有された複合体と一定時間にわたって物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。機能的相互作用を媒介する時間の長さとは、確率的相互作用よりも長い相互作用を一般的に指し、持続的な物理的近接、例えば、細胞膜の個別のドメイン（例えば、免疫シナプス）への持続的なリガンド媒介性の局在化を含みうる。免疫受容体に対する近位には、免疫受容体のシグナル伝達活性の直接阻害を可能とする細胞環境への局在化が含まれうる。免疫受容体に対する近位には、免疫受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達カスケードの阻害を可能とする細胞環境への局在化が含まれうる。したがって、開示されるキメラ抑制性受容体は、同種リガンドの存在下で免疫応答などの細胞内シグナル伝達を低下させる適切な細胞外リガンド結合ドメインを含むように操作することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは細胞表面に位置している。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞表面上にない物質、例えば、小分子、分泌因子、環境シグナル、または酵素的抑制性ドメインが免疫受容体に近接するような空間的動員を媒介する他の可溶性及び／または分泌物質、例えば、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体に近接するような空間的動員をそれぞれが媒介することができる架橋試薬、タンパク質ドメインのヘテロ二量体化を媒介する小分子、または抗体である。キメラ抑制性受容体の用途としては、これらに限定されるものではないが、免疫応答を低下させること、Ｔ細胞活性化を制御すること、ＣＡＲ－Ｔ応答を制御すること、及び自己免疫疾患または免疫応答を低下させることによって治療可能な任意の疾患を治療すること、が挙げられる。
本明細書では、免疫細胞活性を制御するためのＮＯＴ論理ゲートとして特に有用であるキメラ抑制性受容体が提供される。キメラ抑制性受容体には、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメイン、及び酵素的抑制性ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、本開示のキメラ抑制性受容体が免疫受容体に近接するように動員される際に免疫受容体の活性化を阻害する。理論に拘束されることを望むものではないが、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとの結合は、一般的に、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体及び／または下流のシグナル伝達複合体に近接するような空間的動員を媒介し、それにより、酵素的抑制性ドメインが細胞内シグナル伝達カスケードの調節を行うことができる。近接とは、物理的に相互作用する２つの分子（例えば、タンパク質またはタンパク質ドメイン）を含みうる。近接とは、互いに機能的に相互作用するうえで物理的に十分に近い２つの分子を含みうる。近接とは、例えば足場タンパク質などの共有された中間分子と物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、例えばシグナル伝達カスケードなどの共有された複合体と物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、一定時間にわたって物理的に相互作用することで互いに相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、互いに機能的に相互作用するうえで一定時間にわたって物理的に十分に近くにある２つの分子を含みうる。近接とは、例えば足場タンパク質などの共有された中間分子と一定時間にわたって物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。近接とは、例えばシグナル伝達カスケードなどの共有された複合体と一定時間にわたって物理的または機能的に相互作用する２つの分子を含みうる。機能的相互作用を媒介する時間の長さとは、確率的相互作用よりも長い相互作用を一般的に指し、持続的な物理的近接、例えば、細胞膜の個別のドメイン（例えば、免疫シナプス）への持続的なリガンド媒介性の局在化を含みうる。免疫受容体に対する近位には、免疫受容体のシグナル伝達活性の直接阻害を可能とする細胞環境への局在化が含まれうる。免疫受容体に対する近位には、免疫受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達カスケードの阻害を可能とする細胞環境への局在化が含まれうる。したがって、開示されるキメラ抑制性受容体は、同種リガンドの存在下で免疫応答などの細胞内シグナル伝達を低下させる適切な細胞外リガンド結合ドメインを含むように操作することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは細胞表面に位置している。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞表面上にない物質、例えば、小分子、分泌因子、環境シグナル、または酵素的抑制性ドメインが免疫受容体に近接するような空間的動員を媒介する他の可溶性及び／または分泌物質、例えば、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体に近接するような空間的動員をそれぞれが媒介することができる架橋試薬、タンパク質ドメインのヘテロ二量体化を媒介する小分子、または抗体である。キメラ抑制性受容体の用途としては、これらに限定されるものではないが、免疫応答を低下させること、Ｔ細胞活性化を制御すること、ＣＡＲ－Ｔ応答を制御すること、及び自己免疫疾患または免疫応答を低下させることによって治療可能な任意の疾患を治療すること、が挙げられる。
【0086】
本明細書では、いくつかの態様において、細胞外リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、免疫受容体に近接する場合に免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含むキメラ抑制性受容体が提供される。
【0087】
酵素的抑制性ドメイン
本明細書で使用される場合、「酵素的抑制性ドメイン」という用語は、細胞内シグナル伝達カスケード、例えば、天然のＴ細胞活性化カスケードを阻害する酵素機能を有するタンパク質ドメインを指す。例えば、酵素的抑制性ドメインは、酵素、またはその酵素活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介する酵素の触媒ドメインであってよい。細胞内シグナル伝達を負に調節することができる酵素及び酵素機能の非限定的な例としては、（１）その酵素的リン酸化活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するキナーゼまたはキナーゼドメイン、（２）その酵素ホスファターゼ活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するホスファターゼまたはホスファターゼドメイン、及び／または（３）その酵素的ユビキチン化活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するユビキチンリガーゼが挙げられる。シグナル伝達の酵素的調節（例えば、細胞内シグナル伝達カスケードの阻害）は、それぞれをあらゆる目的で参照によって本明細書に援用するところの、Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）： ６６９－８０）、及びＳｔａｎｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２ Ｓｅｐ；１３７（１）： １－１９）に詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「酵素的抑制性ドメイン」という用語は、細胞内シグナル伝達カスケード、例えば、天然のＴ細胞活性化カスケードを阻害する酵素機能を有するタンパク質ドメインを指す。例えば、酵素的抑制性ドメインは、酵素、またはその酵素活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介する酵素の触媒ドメインであってよい。細胞内シグナル伝達を負に調節することができる酵素及び酵素機能の非限定的な例としては、（１）その酵素的リン酸化活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するキナーゼまたはキナーゼドメイン、（２）その酵素ホスファターゼ活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するホスファターゼまたはホスファターゼドメイン、及び／または（３）その酵素的ユビキチン化活性が細胞内シグナル伝達の負の調節を媒介するユビキチンリガーゼが挙げられる。シグナル伝達の酵素的調節（例えば、細胞内シグナル伝達カスケードの阻害）は、それぞれをあらゆる目的で参照によって本明細書に援用するところの、Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）： ６６９－８０）、及びＳｔａｎｆｏｒｄ，ｅｔ ａｌ．（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２ Ｓｅｐ；１３７（１）： １－１９）に詳細に記載されている。
【0088】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体の酵素的抑制性ドメインは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、酵素の生物学的活性部分などの酵素の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、酵素の部分は、酵素ドメイン（複数可）、酵素フラグメント（複数可）、またはそれらの変異体（複数可）、例えば、キナーゼドメインまたはホスファターゼドメイン及びそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、酵素の部分は、キナーゼまたはホスファターゼの触媒活性を有する酵素の部分などの、酵素の触媒ドメインである。いくつかの実施形態では、酵素ドメイン（複数可）、酵素フラグメント（複数可）、またはそれらの変異体（複数可）は、有効性を最大化し、基礎阻害を最小化するように選択される。
【0089】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、基礎阻害を調節する１つ以上の改変を含む。改変の例としては、これらに限定されるものではないが、トランケーション変異（複数可）、アミノ酸置換（複数可）、翻訳後修飾のための位置の導入（その例は当業者には周知のものである）、及び新しい官能基の付加が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素ドメイン（複数可）、酵素フラグメント（複数可）、またはそれらの変異体（複数可）は、有効性を最大化し、基礎阻害を最小化するように選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は基礎阻害を低下させる。他の実施形態では、１つ以上の改変は基礎阻害を増加させる。非限定的な例示的な例では、理論に拘束されることを望まずに言えば、ＳＨ３ドメインの欠失（例えば、ＣＳＫ酵素の）は、構成的クラスター化／シグナル伝達を最小限に抑えることができ（すなわち、リガンド結合がない場合）、それによりキメラ抑制性受容体の基礎レベルの酵素阻害活性を下げることができる。
【0090】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとのリガンド結合は、酵素的抑制性ドメインが細胞内シグナル伝達ドメインまたは免疫受容体に近接して免疫受容体のシグナル伝達活性の直接阻害を可能にするような細胞環境へのキメラ抑制性受容体の局在化を媒介することができる。非限定的な例示的な例において、Ｔ細胞上に発現されたキメラ抑制性受容体とその同種リガンドとの結合は、酵素的抑制性ドメインをＴＣＲまたはＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに近接させるような局在化を引き起こし（例えば、免疫シナプスに局在化させる）、それにより、酵素的抑制性ドメインがＴ細胞シグナル伝達及び／または活性化を負に調節することができるようになる。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとのリガンド結合は、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体に近接することで免疫受容体によって媒介される細胞内シグナル伝達カスケードの阻害を可能とするような細胞環境へのキメラ抑制性受容体の局在化を媒介することができる。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとのリガンド結合は、免疫受容体に近接した複数のキメラ抑制性受容体の空間的クラスター化を媒介することができ、それにより、酵素的抑制性ドメインのクラスター化が免疫受容体に対するそれらの阻害活性を促進する。
【0091】
いくつかの実施形態では、酵素は、ＣＳＫ、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＺＡＰ７０、及びＲａｓＧＡＰから選択される。
【0092】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性３（ＳＨ３）ドメインを有する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性３（ＳＨ３）欠失を有するタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを有する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性１（ＳＨ１）ドメイン、ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、またはＳＨ１ドメインとＳＨ２ドメインを含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、キナーゼドメインの欠失またはキナーゼ活性を低下させる変異（複数可）を有するタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ドミナントネガティブ型のキナーゼ変異体を生成するキナーゼドメインの欠失またはキナーゼ活性を低下させる変異（複数可）を有するタンパク質に由来する。非限定的な例示的な例において、理論に拘束されることを望まずに言えば、キナーゼドメイン（例えば、ＺＡＰ７０酵素における）の欠失または変異を有する酵素的抑制性ドメインを含むキメラ抑制性受容体は、ドミナントネガティブ型キナーゼデッドタンパク質として作用して、酵素的抑制性ドメインの由来源である対応する天然の野生型タンパク質と競合することによって細胞内シグナル伝達カスケードを低減または排除することができる。
【0094】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＳＫに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性３（ＳＨ３）欠失を有するＣＳＫタンパク質であるＣＳＫに由来する。
【0095】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＰ－１に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＨＰ－１に由来する酵素的抑制性ドメインは、チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを有する。
【0096】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＰ－２に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＥＮに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＤ４５に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＤ１４８に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰ－ＭＥＧ１に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰ－ＰＥＳＴに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはｃ－ＣＢＬに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＣＢＬ－ｂに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰＮ２２に由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＬＡＲに由来する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＰＴＰＨ１に由来する。
【0097】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＳＨＩＰ－１に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＨＩＰ－１に由来する酵素的抑制性ドメインは、プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを有する。
【0098】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＺＡＰ７０に由来する。いくつかの実施形態では、ＺＡＰ７０に由来する酵素的抑制性ドメインは、ＳＲＣ相同性１（ＳＨ１）ドメイン、ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、またはＳＨ１ドメインとＳＨ２ドメインを有する。いくつかの実施形態では、ＺＡＰ７０に由来する酵素的抑制性ドメインは、キナーゼドメインの欠失を有する。いくつかの実施形態では、ＺＡＰ７０に由来する酵素的抑制性ドメインは、Ｔｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換、Ｔｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換、またはＴｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換とＴｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換を有する。
【0099】
いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインはＲａｓＧＡＰに由来する。
【0100】
酵素的抑制性ドメインの例示的な配列を、表１Ａ及び 表１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、表１Ａに記載されるアミノ酸配列のいずれかである。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、表１Ａに記載されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、表１Ｂに記載される核酸配列のいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインは、表１Ｂに記載される核酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされる。
【0101】
【表1】
【0102】
【表2】
【0103】
【表3】
【0104】
【表4】
【0105】
【表5】
【0106】
【表6】
【0107】
【表7】
【0108】
【表8】
【0109】
【表9】
【0110】
【表10】
【0111】
【表11】
【0112】
【表12】
【0113】
【表13】
【0114】
【表14】
【0115】
【表15】
【0116】
【表16】
【0117】
細胞外リガンド結合ドメイン
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、特定の細胞外リガンドに結合する本開示のキメラ抑制性タンパク質のドメインを指す。リガンド結合ドメインの例は、当業者には周知のものであり、これらに限定されるものではないが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、天然の受容体／リガンドドメイン、及び可溶性標的化分子と結合するロイシンジッパーなどの直交二量体化ドメインが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、特定の細胞外リガンドに結合する本開示のキメラ抑制性タンパク質のドメインを指す。リガンド結合ドメインの例は、当業者には周知のものであり、これらに限定されるものではないが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、天然の受容体／リガンドドメイン、及び可溶性標的化分子と結合するロイシンジッパーなどの直交二量体化ドメインが挙げられる。
【0118】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗原結合ドメインを含む。本開示の抗原結合ドメインとしては、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、コンジュゲート抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびに、これらに限定されるものではないが、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科動物由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）などのシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むそれらの機能的断片などの、抗原に結合する任意のドメイン、ならびに、組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、親和性を高めた組換えＴＣＲ、またはそれらのフラグメント、例えば、一本鎖ＴＣＲなど、抗原結合ドメインとして機能することが当該技術分野で知られている代替的な足場に結合する任意のドメインを挙げることができる。
【0119】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
【0120】
「単鎖」という用語は、ペプチド結合によって直鎖状に連結されたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施形態では、アミノ酸モノマーは、これらに限定されるものではないが、表２に示されるアミノ酸配列のいずれかを含むペプチドリンカーによって直鎖状に連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0121】
【表17】
【0122】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、一本のポリペプチド鎖中に存在する。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＳｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。本明細書でより詳細に説明するように、ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖によってそのＣ末端が重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのＮ末端に接続された軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを有する。あるいは、ｓｃＦｖは、ＶＨのＣ末端がポリペプチド鎖によってＶＬのＮ末端に接続されているポリペプチド鎖からなる。特定の実施形態では、ＶＨとＶＬとは、ペプチドリンカーによって分離されている。特定の実施形態では、ｓｃＦｖペプチドリンカーは、表２に示されるアミノ酸配列のいずれかを含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ただし、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、Ｌはペプチドリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖのそれぞれは、構造ＶＨ－Ｌ－ＶＬまたはＶＬ－Ｌ－ＶＨを含み、ただし、ＶＨは重鎖可変ドメインであり、Ｌはペプチドリンカーであり、ＶＬは軽鎖可変ドメインである。２つ以上のｓｃＦｖが互いに連結されている場合、各ｓｃＦｖは、ペプチドが連結された次のｓｃＦｖに連結することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｓｃＦｖのそれぞれは、ペプチドリンカーによって分離されている。
【0123】
「Ｆａｂフラグメント」（ｆｒａｇｍｅｎｔ， ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇとも呼ばれる）は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を、軽鎖及び重鎖のそれぞれの可変ドメインＶＬ及びＶＨとともに含むものである。各可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含んでいる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数個の残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に付加されていることにより、Ｆａｂフラグメントとは異なる。特定のそのような実施形態では、単鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端はＦａｂ重鎖のＮ末端に接続される。
【0124】
「Ｆ（ａｂ ’）２」フラグメントには、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ’フラグメントが含まれる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、組換え法によって、またはインタクトな抗体のペプシン消化によって生成することができる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、例えば、β－メルカプトエタノールで処理することによって解離させることができる。
【0125】
「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの非共有結合により結合された二量体を含む。
【0126】
「シングルドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、抗体の一方の可変ドメインが、他方の可変ドメインの存在なしで抗原に特異的に結合する分子を指す。シングルドメイン抗体、及びそのフラグメントについては、Ａｒａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１－５２６、及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０－２４５に記載されている。シングルドメイン抗体は、ｓｄＡｂまたはナノボディとしても知られている。ｓｄＡｂは比較的安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして容易に発現させることができる（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ” Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）： １３－２２）。
【0127】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域など、インタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントには、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）フラグメント、及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメントが含まれる。
【0128】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、受容体由来のドメインを含み、受容体は、ＴＣＲ、ＢＣＲ、サイトカイン受容体、ＲＴＫ受容体、セリン／スレオニンキナーゼ受容体、ホルモン受容体、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体、及び受容体のＴＮＦＲ－スーパーファミリーからなる群から選択される。
【0129】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、二量体化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞リガンド結合ドメインは、同種の二量体化ドメインをさらに含む。
【0130】
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体などの同種タンパク質上の部位（すなわち、同種タンパク質のリガンド結合ドメイン）に結合し、それによって細胞応答／シグナル、細胞間認識、及び／または細胞間相互作用を生じる分子を指す。リガンドは、例えば、１つ以上の二原子原子（例えば、ＮＯ、ＣＯなど）、小分子（例えば、薬物、医薬品、単糖、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、アミノ酸、アミノ酸誘導体、小分子）であり得る。分子ホルモン、小分子神経伝達物質など）、及び／または巨大分子（例えば、脂質、多糖類、ペプチド、可溶性タンパク質、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素など）であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、天然に存在する生物学的リガンドである（すなわち、リガンドは、細胞によって天然に産生されるものなど、天然に生じるものである）。他の実施形態では、リガンドは、非天然または合成リガンドである（すなわち、リガンドは、化学合成などによって合成されるか、または、通常はそのリガンドを発現しない細胞で発現するように操作されるなど、天然のリガンドとは特定の点で異なるように操作される）。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性タンパク質は、非天然または合成リガンドの結合によってのみ活性化させることができる。合成リガンドの例としては、これらに限定されるものではないが、薬物、医薬品、及び操作された巨大分子（例えば、合成タンパク質）が含まれる。
【0131】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、受容体結合ドメイン、核酸、小分子、及び化学物質から選択されるリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、または酵素である。
【0132】
いくつかの実施形態では、リガンドは細胞表面リガンドである。例えば、キメラ抑制性受容体のリガンドは、非標的細胞表面に存在するか、または発現される。細胞表面リガンドとしては、これらに限定されるものではないが、細胞分化（ＣＤ）マーカーなどの細胞表面マーカー、受容体、タンパク質、タンパク質複合体、細胞膜成分（例えば、内在性膜タンパク質、細胞骨格構造、多糖類、脂質、及びそれらの組み合わせなど）、及び膜関連構造に結合する分子（例えば、１つ以上の細胞表面リガンドに結合する可溶性抗体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞表面リガンドは、免疫受容体の同種リガンドをさらに発現する細胞で発現される。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体のリガンドは、腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体のリガンドは、腫瘍細胞で発現されない。例えば、キメラ抑制性受容体のリガンドは、非腫瘍細胞で発現される。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体のリガンドは、健康な、または一般に健康であると考えられる組織の細胞上に発現される。
【0133】
例示的な例では、キメラ抑制性受容体は、免疫細胞活性などの細胞活性を制御するためのＮＯＴ論理ゲートとして有用である。本明細書に記載されるもののような、活性化キメラ受容体とキメラ抑制性受容体との組み合わせを同じ細胞で使用することでオンターゲット・オフターゲット毒性を低減することができる。例えば、非標的細胞が、活性化キメラ受容体によって認識されるリガンドとキメラ抑制性受容体によって認識されるリガンドの両方を発現する場合、活性化キメラ受容体を発現する操作された細胞は、非標的細胞に結合してオフターゲットのシグナル伝達応答を生じる可能性がある。しかしながら、そのような場合、同じ操作された細胞は、非標的細胞上のその同種リガンドに結合することができるキメラ抑制性受容体も発現し、キメラ抑制性受容体の阻害機能が、活性化キメラ受容体によって媒介されるシグナル伝達を低下、現象、防止、または阻害しうる（「ＮＯＴ論理ゲーティング」）。
【0134】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体は、正常細胞（例えば、一般的に健康であると考えられる細胞）で発現されるが腫瘍細胞では発現されない１つ以上のリガンドに特異的に結合する。例示的な非限定的な例では、腫瘍標的化活性化キメラ受容体とキメラ抑制性受容体との組み合わせを同じ免疫応答性細胞で使用することでオンターゲット・オフ腫瘍毒性を低減することができる。例えば、健康な細胞が、腫瘍標的化キメラ受容体によって認識される腫瘍関連抗原とキメラ抑制性受容体によって認識される健康な細胞に関連する抗原の両方を発現する場合、腫瘍標的化キメラ受容体（複数可）を発現する操作された免疫応答性細胞は健康な細胞に結合して、オフ腫瘍細胞応答を引き起こす可能性がある。そのような場合、同じ操作された免疫応答性細胞は、健康な細胞上のその同種リガンドに結合できる抑制性キメラ抗原も発現し、キメラ抑制性受容体の阻害機能が、腫瘍標的化キメラ受容体によって媒介される免疫応答性細胞の活性化を低下、減少、防止、または阻害することができる。
【0135】
本明細書で使用される場合、「免疫受容体」という用語は、リガンドに結合し、免疫系の応答を引き起こす受容体を指す。リガンドへの結合は一般的に免疫受容体の活性化を引き起こす。Ｔ細胞活性化は、免疫受容体の活性化の一例である。免疫受容体の例は当業者には周知のものであり、これらに限定されるものではないが、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ；ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）など）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、ＮＫ細胞受容体、及びサイトカイン受容体が挙げられる。
【0136】
膜局在化ドメイン
キメラ抑制性受容体には、膜局在化ドメインが含まれる。本明細書で使用される場合、「膜局在化ドメイン」という用語は、受容体を細胞膜に局在化し、少なくとも膜貫通ドメインを含む本開示のキメラ抑制性受容体の領域を指す。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の膜局在化ドメインは、細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部と細胞内ドメインの少なくとも一部とをさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、キメラ抑制性受容体を脂質ラフトまたは重脂質ラフトなどの膜の特定のドメインに誘導する、または隔離するのに十分な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの部分を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に示されるペプチドリンカーなどの細胞外リンカー領域を介して膜局在化ドメインに連結される。
キメラ抑制性受容体には、膜局在化ドメインが含まれる。本明細書で使用される場合、「膜局在化ドメイン」という用語は、受容体を細胞膜に局在化し、少なくとも膜貫通ドメインを含む本開示のキメラ抑制性受容体の領域を指す。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の膜局在化ドメインは、細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞外ドメインの少なくとも一部と細胞内ドメインの少なくとも一部とをさらに含む。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、キメラ抑制性受容体を脂質ラフトまたは重脂質ラフトなどの膜の特定のドメインに誘導する、または隔離するのに十分な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの部分を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、表２に示されるペプチドリンカーなどの細胞外リンカー領域を介して膜局在化ドメインに連結される。
【0137】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、ＬＡＸ膜貫通ドメイン、ＣＤ２５膜貫通ドメイン、ＣＤ７膜貫通ドメイン、ＬＡＴ膜貫通ドメイン、ＬＡＴ変異体由来の膜貫通ドメイン（例えば、Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６を参照）、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－ＩＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＴＩＭ３膜貫通ドメイン、ＬＩＲ１膜貫通ドメイン、ＮＫＧ２Ａ膜貫通ドメイン、ＴＩＧＩＴ膜貫通ドメイン、及びＬＡＧ３膜貫通ドメイン、ＬＡＩＲ１膜貫通ドメイン、ＧＲＢ－２膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－１膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－２膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ１膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメイン、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン、ＨＡＶＲ膜貫通ドメイン、ＧＩＴＲ膜貫通ドメイン、ＰＤ－Ｌ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＣＤ９４膜貫通ドメイン、ＫＬＲＧ－１膜貫通ドメイン、ＰＡＧ膜貫通ドメイン、ＣＤ４５膜貫通ドメイン、及びＣＥＡＣＡＭ１膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＣＤ８ポリペプチドを使用することができる。例示的なＣＤ８ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１３９３４５及びＡＡＡ９２５３３．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＣＤ２８ポリペプチドを使用することができる。例示的なＣＤ２８ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００６１３０．１及びＮＰ＿０３１６６８．３が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＣＤ３ζポリペプチドを使用することができる。例示的なＣＤ３ζポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿９３２１７０．１及びＮＰ＿００１１０６８６２．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＣＤ４ポリペプチドを使用することができる。例示的なＣＤ４ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０００６０７．１及びＮＰ＿０３８５１６．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、４－１ＢＢポリペプチド由来のものである。あらゆる適当な４－１ＢＢポリペプチドを使用することができる。例示的な４－１ＢＢポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１５５２．２及びＮＰ＿００１０７０９７７．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＯＸ４０ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＯＸ４０ポリペプチドを使用することができる。例示的なＯＸ４０ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００３３１８．１及びＮＰ＿０３５７８９．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＩＣＯＳポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＩＣＯＳポリペプチドを使用することができる。例示的なＩＣＯＳポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３６２２４及びＮＰ＿０５９５０８が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＣＴＬＡ－４ポリペプチドを使用することができる。例示的なＣＴＬＡ－４ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５２０５．２及びＮＰ＿０３３９７３．２が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤ－１ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＰＤ－１ポリペプチドを使用することができる。例示的なＰＤ－１ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５００９及びＮＰ＿０３２８２４が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＬＡＧ－３ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＬＡＧ－３ポリペプチドを使用することができる。例示的なＬＡＧ－３ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２２７７．４及びＮＰ＿０３２５０５．１が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、２Ｂ４ポリペプチド由来のものである。あらゆる適当な２Ｂ４ポリペプチドを使用することができる。例示的な２Ｂ４ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０５７４６６．１及びＮＰ＿０６１１９９．２が挙げられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＢＴＬＡポリペプチド由来のものである。あらゆる適当なＢＴＬＡポリペプチドを使用することができる。例示的なＢＴＬＡポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿８６１４４５．４及びＮＰ＿００１０３２８０８．２が挙げられる。あらゆる適当なＬＩＲ－１（ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドを使用することができる。例示的なＬＩＲ－１（ＬＩＬＲＢ１）ポリペプチドとしては、これらに限定されるものではないが、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１０７５１０６．２及びＮＰ＿００１０７５１０７．２が挙げられる。
【0139】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１３９３４５、ＡＡＡ９２５３３．１、ＮＰ＿００６１３０．１、ＮＰ＿０３１６６８．３、ＮＰ＿９３２１７０．１、ＮＰ＿００１１０６８６２．１、ＮＰ＿０００６０７．１、ＮＰ＿０３８５１６．１、ＮＰ＿００１５５２．２、ＮＰ＿００１０７０９７７．１、ＮＰ＿００３３１８．１、ＮＰ＿０３５７８９．１、ＮＰ＿０３６２２４、ＮＰ＿０５９５０８、ＮＰ＿００５２０５．２、ＮＰ＿０３３９７３．２、ＮＰ＿００５００９、ＮＰ＿０３２８２４、ＮＰ＿００２２７７．４、ＮＰ＿０３２５０５．１、ＮＰ＿０５７４６６．１、ＮＰ＿０６１１９９．２、ＮＰ＿８６１４４５．４、またはＮＰ＿００１０３２８０８．２、またはこれらのフラグメントと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１個の保存的アミノ酸置換、２個以下の保存的アミノ酸置換、または３個以下の保存的アミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１３９３４５、ＡＡＡ９２５３３．１、ＮＰ＿００６１３０．１、ＮＰ＿０３１６６８．３、ＮＰ＿９３２１７０．１、ＮＰ＿００１１０６８６２．１、ＮＰ＿０００６０７．１、ＮＰ＿０３８５１６．１、ＮＰ＿００１５５２．２、ＮＰ＿００１０７０９７７．１、ＮＰ＿００３３１８．１、ＮＰ＿０３５７８９．１、ＮＰ＿０３６２２４、ＮＰ＿０５９５０８、ＮＰ＿００５２０５．２、ＮＰ＿０３３９７３．２、ＮＰ＿００５００９、ＮＰ＿０３２８２４、ＮＰ＿００２２７７．４、ＮＰ＿０３２５０５．１、ＮＰ＿０５７４６６．１、ＮＰ＿０６１１９９．２、ＮＰ＿８６１４４５．４、またはＮＰ＿００１０３２８０８．２のアミノ酸少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１１０個、少なくとも１２０個、少なくとも１３０個、少なくとも１４０個、少なくとも１５０個、少なくとも１６０個、少なくとも１７０個、少なくとも１８０個、少なくとも１９０個、少なくとも２００個、少なくとも２１０個、少なくとも２２０個、少なくとも２３０個、または少なくとも２４０個の長さの連続的部分であるアミノ酸配列を有することができる。
【0140】
膜貫通ドメインが由来しうる適当なポリペプチドのさらなる例としては、これらに限定されるものではないが、Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ２７、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＧ２Ｃの膜貫通領域（複数可）が挙げられる。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＬＡＴ変異体に由来する膜貫通ドメインは、ＬＡＴ（ＣＡ）変異体由来のものである。例えば、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）：６６９－８０を参照されたい。
【0142】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、表３に示されるアミノ酸配列から選択される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、表３に示される配列のいずれかと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相同であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なソフトウェアを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、１個の保存的アミノ酸置換、２個以下の保存的アミノ酸置換、または３個以下の保存的アミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、表３に記載される核酸配列のいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％同一である核酸配列である。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、表３に記載される核酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列である。
【0143】
【表18】
【0144】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、対応する細胞外ドメインの少なくとも一部及び／または対応する細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む（例えば、本明細書に記載の膜局在化ドメインに由来する本明細書に記載のスペーサー及びヒンジを参照）。
【0145】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、近接タンパク質フラグメントをさらに含む。近接タンパク質フラグメントとは、それらの天然状態で膜貫通ドメインに直接隣接するタンパク質セグメントを指す。例えば、近接タンパク質フラグメントは、タンパク質の膜貫通ドメインの外側にあるか、またはタンパク質の膜貫通ドメインと考えられる従来の配列の境界の外側にあるタンパク質セグメントでありうる。いくつかの実施形態では、近接タンパク質フラグメントは、スペーサーまたはヒンジ配列でありうる。いくつかの実施形態では、近接タンパク質フラグメントは、スペーサーまたはヒンジ配列とは異なりうる。
【0146】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、キメラ抑制性受容体を細胞膜のドメインに誘導するかまたは隔離する。本明細書で使用される場合、「細胞膜のドメイン」という用語は、脂質組成の横方向の不均一性及び細胞膜の物理的特性を指す。細胞膜ドメインの形成は、水素結合、疎水性エントロピー力、電荷対合、及びファンデルワールス力などの複数の力によって引き起こされる場合がある。細胞膜ドメインは、膜内のタンパク質－タンパク質相互作用、膜内のタンパク質－脂質相互作用、または膜内の脂質－脂質相互作用を介して形成されうる。細胞膜ドメインの例は当業者には周知のものであり、これらに限定されるものではないが、脂質ラフト、重脂質ラフト、軽脂質ラフト、カベオラ、パッチ、ポスト、フェンス、格子、ラフト、及び足場が挙げられる。例えば、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ Ｇ．Ｌ．，Ｔｈｅ Ｆｌｕｉｄ－Ｍｏｓａｉｃ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｓｔｉｌｌ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｆｔｅｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４０ ｙｅａｒｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０１４ Ｊｕｎ；１８３８（６）：１４５１－６６を参照されたい。
【0147】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、本開示のキメラ抑制性受容体を脂質ラフトに局在化させる。いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、細胞膜のドメインに局在化された１つ以上の細胞膜成分と相互作用する。細胞膜成分の例は当業者には周知のものであり、これらに限定されるものではないが、様々な内在性膜タンパク質、細胞骨格構造、多糖類、脂質、及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、Ｎｉｃｏｌｓｏｎ Ｇ．Ｌ．，Ｔｈｅ Ｆｌｕｉｄ－Ｍｏｓａｉｃ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｓｔｉｌｌ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ａｆｔｅｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４０ ｙｅａｒｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０１４ Ｊｕｎ；１８３８（６）：１４５１－６６を参照されたい。
【0148】
いくつかの実施形態では、膜局在化ドメインは、免疫受容体によって占められる脂質ラフトとは異なる膜部分など、免疫受容体の１つ以上の成分によって占められる細胞膜のドメインとは異なる細胞膜のドメインへのキメラ抑制性受容体の基礎局在化（すなわち、同種リガンドの非存在下での局在化）を媒介する。いくつかの実施形態では、基礎となる膜局在化ドメインは、酵素的抑制性ドメインによる免疫受容体活性化の構成的阻害を軽減するうえで十分である。
【0149】
本明細書で使用される場合、「免疫受容体活性化」という用語は、最終的に免疫応答をもたらすシグナル伝達カスケードを開始する事象を指す。Ｔ細胞活性化は、免疫受容体の活性化の一例である。一般的に、また、理論に拘束されることを望むまずに言えば、膜局在化ドメインが免疫受容体の構成的阻害を軽減することができるのに対して、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとの結合は、一般的に、酵素的抑制性ドメインが免疫受容体及び／または下流のシグナル伝達複合体に近接するような空間的動員を媒介し、それにより、酵素的抑制性ドメインが細胞内シグナル伝達カスケードの調節を行うことができる。非限定的な例示的な例において、キメラ抑制性受容体とその同種リガンドとの結合は、受容体及び酵素的抑制性ドメインを免疫シナプスに局在化して、免疫受容体及び／または細胞内シグナル伝達カスケードに関与する別のシグナル伝達成分に直接作用することにより、免疫受容体のシグナル伝達及び／またはＴ細胞活性化などの活性化を阻害する（例えば、その同種リガンドに結合したＴＣＲのような、免疫シナプスに存在するＴＣＲを阻害する）ことができる。
【0150】
いくつかの実施形態では、非特異的な膜貫通ドメインが、酵素的抑制性ドメインがＴ細胞活性化を構成的に阻害することを防ぐうえで十分である。他の実施形態では、例えば、免疫シナプス以外の細胞膜の領域のような、Ｔ細胞受容体の成分によって占められる領域とは物理的に異なる細胞膜の領域への局在化を媒介する膜貫通ドメイン（近接タンパク質フラグメントを含む）を選択することができる（例えば、「古典的な」脂質ラフトの代わりに「重い」脂質ラフトへの隔離；例えば、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２ Ｓｅｐ；１３７（１）：１－１９を参照）。
【0151】
スペーサー及びヒンジドメイン
キメラ抑制性受容体はまた、スペーサーまたはヒンジドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジドメインは、キメラ抑制性受容体の細胞外ドメイン（例えば、細胞外リガンド結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間、またはキメラ抑制性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサーまたはヒンジドメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインに連結する機能を有するあらゆるオリゴペプチドまたはポリペプチドである。スペーサーまたはヒンジドメインは、キメラ抑制性受容体またはそのドメインに柔軟性を与えるか、またはキメラ抑制性受容体またはそのドメインの立体障害を防ぐことができる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジドメインは、３００個以下のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、または５～２０個のアミノ酸）を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペーサードメインが、キメラ抑制性受容体の他の領域に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、膜局在化ドメインと同じ由来源に由来する細胞外ドメインの少なくとも一部及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む。
キメラ抑制性受容体はまた、スペーサーまたはヒンジドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジドメインは、キメラ抑制性受容体の細胞外ドメイン（例えば、細胞外リガンド結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間、またはキメラ抑制性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサーまたはヒンジドメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖内の細胞外ドメイン及び／または細胞内シグナル伝達ドメインに連結する機能を有するあらゆるオリゴペプチドまたはポリペプチドである。スペーサーまたはヒンジドメインは、キメラ抑制性受容体またはそのドメインに柔軟性を与えるか、またはキメラ抑制性受容体またはそのドメインの立体障害を防ぐことができる。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジドメインは、３００個以下のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、または５～２０個のアミノ酸）を含むことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペーサードメインが、キメラ抑制性受容体の他の領域に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、膜局在化ドメインと同じ由来源に由来する細胞外ドメインの少なくとも一部及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む。
【0152】
例示的なスペーサーまたはヒンジドメインのタンパク質配列を表４に示す。例示的なスペーサーまたはヒンジドメインのヌクレオチド配列を表５に示す。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、表４に記載されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、表５に記載される核酸配列のいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％同一である核酸配列である。いくつかの実施形態では、スペーサーまたはヒンジドメインは、表５に記載される核酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列である。
【0153】
【表19】
【0154】
【表20】
【0155】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、細胞外リガンド結合ドメインと膜局在化ドメインとの間に細胞外リンカーとも呼ばれるスペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域は、細胞外リガンド結合ドメインと膜局在化ドメインとの間に位置し、細胞外リガンド結合ドメイン及び膜局在化ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結される。
【0156】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、膜局在化ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間に細胞内スペーサー領域とも呼ばれるスペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、膜局在化ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間に位置して膜局在化ドメイン及び酵素的抑制性ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結された細胞内スペーサー領域をさらに含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＦｃγＲＩＩＩα、ＬＮＧＦＲ、及びＰＤＧＦＲからなる群から選択されるタンパク質由来のものである。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号４６と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号４７と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％。、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号４８と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号４９と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５０と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５１と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５２と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、配列番号５５と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、表２に示されるアミノ酸配列のいずれかのようなペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーを含む。
【0160】
いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、キメラ抑制性受容体の感受性を調節する。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較してキメラ抑制性受容体の感受性を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較してキメラ抑制性受容体の感受性を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較してキメラ抑制性受容体の効力を調節する。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較してキメラ抑制性受容体の効力を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較してキメラ抑制性受容体の効力を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、操作された細胞で発現される腫瘍標的化キメラ受容体の活性化の基礎防止、減弱、または阻害を調節する。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、基礎防止、減弱、または阻害を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域は、細胞外リンカー領域及び／または細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、基礎防止、減弱、または阻害を増加させる。
【0161】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれと機能的に連結されている細胞内スペーサー領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれと物理的に連結されている細胞内スペーサー領域をさらに含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の感受性を調節する。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の感受性を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の感受性を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の効力を調節する。
【0163】
いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の効力を増加させる。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、キメラ抑制性受容体の効力を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、操作された細胞で発現される場合に操作された細胞で発現される腫瘍標的化キメラ受容体の活性化の基礎防止、減弱、または阻害を調節する。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、基礎防止、減弱、または阻害を低下させる。いくつかの実施形態では、細胞内スペーサー領域は、細胞内スペーサー領域を欠く以外の点では同じキメラ抑制性受容体と比較して、基礎防止、減弱、または阻害を増加させる。
【0164】
細胞内抑制性共シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、膜局在化ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、酵素的抑制性ドメインのＣ末端である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、ペプチドリンカー（例えば、表２を参照）またはスペーサーもしくはヒンジ配列（例えば、表４を参照）を介して他のドメイン（例えば、膜局在化、膜貫通ドメイン、または酵素的抑制性ドメイン）と連結される。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが存在する場合、２つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインをペプチドリンカー（例えば、表２を参照）またはスペーサーもしくはヒンジ配列（例えば、表４を参照）を介して連結することができる。
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、膜局在化ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと酵素的抑制性ドメインとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、酵素的抑制性ドメインのＣ末端である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、ペプチドリンカー（例えば、表２を参照）またはスペーサーもしくはヒンジ配列（例えば、表４を参照）を介して他のドメイン（例えば、膜局在化、膜貫通ドメイン、または酵素的抑制性ドメイン）と連結される。いくつかの実施形態では、２つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが存在する場合、２つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインをペプチドリンカー（例えば、表２を参照）またはスペーサーもしくはヒンジ配列（例えば、表４を参照）を介して連結することができる。
【0165】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質の１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質、またはそのフラグメントを含む。ＩＴＩＭは、多くの抑制性免疫受容体の細胞質尾部に見られる保存されたアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質、またはそのフラグメントは、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインは、１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、またはそのフラグメント（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、またはそのフラグメントは、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１から選択される。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインとＩＴＩＭ及び／または非ＩＴＩＭ足場の抑制メカニズムは重複しており、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質は、ＳＨＰ－１などの酵素的抑制性ドメインが由来する酵素の内因性形態を動員する。いくつかの実施形態では、酵素的抑制性ドメインとＩＴＩＭ及び／または非ＩＴＩＭ足場の抑制メカニズムは異なり、例えば、ＩＴＩＭ含有タンパク質とＣｓｋまたはＣＢＬ－ｂ由来の酵素的抑制性ドメインの活性は、相補的／相乗的であってよい。
【0166】
免疫受容体
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然の免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、非天然の抗原受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、ＮＫ細胞受容体、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体から選択される。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＴＣＲである。
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然の免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、非天然の抗原受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、ＮＫ細胞受容体、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体から選択される。いくつかの実施形態では、免疫受容体はＴＣＲである。
【0167】
いくつかの実施形態では、免疫受容体は、キメラ免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一般的に、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、ＣＡＲフォーマットの免疫受容体とは、一般的には、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、以下に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む組換えポリペプチドコンストラクトである活性化ＣＡＲのことを指す。
【0168】
本開示のＣＡＲは、第１、第２、または第３世代のＣＡＲであり得る。「第１世代」のＣＡＲは、一般的にＴ細胞受容体鎖に由来する単一の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「第１世代」のＣＡＲは一般的に、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖由来の細胞内シグナル伝達ドメインを有している。「第１世代」のＣＡＲはデノボ抗原認識を与え、ＨＬＡを介した抗原提示とは無関係に、単一の融合分子内のＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こす。「第２世代」のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞質尾部にさまざまな共刺激分子（ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０など）の１つに由来する第２の細胞内シグナル伝達ドメインを付加することによってＴ細胞にさらなるシグナルを与えている。「第２世代」のＣＡＲは、共刺激（ＣＤ２８または４－１ＢＢなど）と活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供する。前臨床試験において、「第２世代」のＣＡＲがＴ細胞などの免疫応答性細胞の抗腫瘍活性を高めることができることが示されている。「第３世代」のＣＡＲは、複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８及び４－１ＢＢなど）と細胞内活性化シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）を有する。
【0169】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドコンストラクト中の各ドメインは同じポリペプチド鎖内にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を構成する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲポリペプチドコンストラクト中の各ドメインは互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義されるような少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、及び／またはＣＤ２８から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激分子（複数可）に由来する機能的シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子（複数可）に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメインと刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ－ｔｅｒ）に任意のリーダー配列（シグナル配列とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、リーダー配列は、ＣＡＲの細胞プロセシング及び細胞膜への局在化の際に抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から場合により切断される。
【0170】
様々なキメラ抗原受容体が当該技術分野では周知であり、これらに限定されるものではないが、ＳｃＦｖ－ＦｃεＲＩγＣＡＩＸ、ＳｃＦｖ－ＦｃεＲＩγ、ＳｃＦｖ－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ４－ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ／ＣＤ１３７／ＣＤ２８、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ８－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＦｃｅＲＩγ、ＣＤ２８／４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８ｍｕｔ－ＣＤ３ζ、ヘレグリン－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８、ＳｃＦｖ－ＣＤ２８－ＯＸ４０－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＣＤ３ξ、ＩＬ－１３－ＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＩＬ－１３－ＣＤ３ζ、ＩＬ－１３－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ＦｃεＲＩγ、ＳｃＦＶ－ＣＤ４－ＦｃεＲＩγ、ＳｃＦＶ－ＣＤ２８－ＦｃεＲＩγ、Ｌｙ４９Ｈ－ＣＤ３ζ、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζ、ＳｃＦｖ－ｂ２ｃ－ＣＤ３ζ、及びＦｃｅＲＩ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζが挙げられる。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、調節エレメントを含むように改変されている。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、分割キメラ抗原受容体である（例えば、ＷＯ２０１７／０９１５４６を参照）。
【0171】
いくつかの実施形態では、免疫受容体はキメラＴＣＲである。キメラＴＣＲは、一般的に、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖の１つ以上の定常ドメインにグラフトされた細胞外リガンド結合ドメインを含むことで、腫瘍関連抗原などの目的の抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを形成する。理論に拘束されることを望まずに言えば、キメラＴＣＲは、抗原結合時にＴＣＲ複合体を介してシグナルを伝達することができると考えられる。例えば、抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を、ＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖などのＴＣＲ鎖の定常ドメイン（例えば、細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインの少なくとも一部）にグラフトすることができる。別の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲをＴＣＲα鎖及び／またはβ鎖にグラフトして、抗原に特異的に結合するキメラＴＣＲを形成することもできる。そのようなキメラＴＣＲは、当該技術分野では周知の方法によって作製することができる（例えば、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ＲＡ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０００；７：１３６９－１３７７；Ｚｈａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００４ １１：４８７－４９６；及びＡｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ａｐｒ；１９（４）：３６５－７４）。
【0172】
キメラ抗原受容体などの免疫受容体の抗原は、腫瘍関連抗原であってよい。
【0173】
免疫受容体は一般的に、免疫受容体発現細胞におけるシグナル伝達またはタンパク質発現の変化を誘導することができ、これにより、同種のリガンドに結合する際の免疫応答が調節される（例えば、免疫応答を調節、活性化、開始、刺激、増加、防止、減弱、阻害、低下、減少、阻害、または抑制する）。例えば、ＴＣＲ／ＣＡＲに存在するＣＤ３鎖がリガンド結合に応答してクラスター化する際、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介したシグナル伝達カスケードが生じる。具体的には、特定の実施形態において、内因性ＴＣＲ、外因性ＴＣＲ、キメラＴＣＲ、またはＣＡＲ（具体的には活性化ＣＡＲ）がそれぞれの抗原に結合すると、結合受容体の近くの多くの分子（例：ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）のクラスター化を含む免疫シナプスの形成が起こる。膜結合シグナル伝達分子のこのようなクラスター化により、ＣＤ３鎖内に含まれるＩＴＡＭモチーフがリン酸化され、これにより、Ｔ細胞活性化経路が開始され、最終的にＮＦ－κＢ及びＡＰ－１などの転写因子が活性化される。これらの転写因子は、Ｔ細胞のグローバルな遺伝子発現を誘導して、マスターレギュレーターＴ細胞タンパク質の増殖及び発現のためのＩＬ－２産生を増加させることにより、サイトカイン産生及び／またはＴ細胞媒介傷害などのＴ細胞媒介免疫応答を開始させることができる。
【0174】
キメラ抑制性受容体をコードする核酸
本明細書では、他の態様において、上記に述べたような少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸は、ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはファージベクターから選択される。
本明細書では、他の態様において、上記に述べたような少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸は、ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはファージベクターから選択される。
【0175】
キメラ抑制性受容体が多鎖受容体である場合、ポリヌクレオチドのセットが使用される。この場合、ポリヌクレオチドのセットを、単一のベクターまたは複数のベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラ抑制性受容体をコードする配列を含み、細胞外リガンド結合ドメインをコードする配列が、細胞内シグナル伝達ドメイン及び膜局在化ドメインをコードする配列と隣接し、かつ同じリーディングフレーム内にある。
【0176】
ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞で発現させるためにコドン最適化することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの全配列は、哺乳動物細胞で発現させるためにコドン最適化される。コドン最適化とは、コーディングＤＮＡ内の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。そのようなコドン縮重のため、同一のポリペプチドが様々なヌクレオチド配列によってコードされる。様々なコドン最適化の方法が当該技術分野で知られており、例えば、あらゆる目的で参照によって本明細書に援用する、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号及び同第６，１１４，１４８号に開示される方法が挙げられる。
【0177】
キメラ抑制性受容体をコードするポリヌクレオチドは、標準的な方法を使用して、例えば、ポリヌクレオチドを発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、ポリヌクレオチドを含むことが知られているベクターから誘導すること、またはポリヌクレオチドを含む細胞及び組織から直接単離することなどにより、当該技術分野では周知の組換え法を使用して得ることができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、クローニングするのではなく、合成的に生成することもできる。
【0178】
ポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態では、当該技術分野では周知の発現ベクターを使用する。したがって、本開示は、細胞に直接形質導入することができる、キメラ抑制性受容体を発現するレトロウイルス及びレンチウイルスベクターコンストラクトを含む。
【0179】
本開示には、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡコンストラクトも含まれる。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成する方法では、特別に設計されたプライマーを使用したテンプレートのインビトロ転写（ＩＶＴ）と、それに続くｐｏｌｙＡの付加を行って、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書に記載される３’及び／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書に記載される５’キャップ）及び／または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書に記載のＩＲＥＳ）、発現させようとする核酸、及びｐｏｌｙＡテールを含むコンストラクトを作製する。そのように生成されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトできる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡキメラ抑制性受容体ベクターは、エレクトロポレーションによって、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞に形質導入される。
【0180】
いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター、エピソーム複製を可能にする因子、及び／または選択を可能にする因子をさらに含むことができる。
【0181】
操作された細胞
本明細書では、本開示の少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸を含むか、または本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞も提供される。核酸／ベクターを導入する（すなわち、遺伝子操作する）様々な方法が当業者に知られており、これらに限定されるものではないが、形質導入（すなわち、ウイルス感染）、形質転換、及びトランスフェクションが挙げられる。トランスフェクションの機構としては、化学物質を用いたトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム媒介、リポフェクション／リポソーム媒介など）、化学物質を用いないトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、ハイドロダイナミックデリバリーなど）、及び粒子を用いたトランスフェクション（例えば、遺伝子銃、マグネトフェクション、パーティクルボンバードメントなど）が挙げられる。
本明細書では、本開示の少なくとも１つのキメラ抑制性受容体をコードする核酸を含むか、または本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞も提供される。核酸／ベクターを導入する（すなわち、遺伝子操作する）様々な方法が当業者に知られており、これらに限定されるものではないが、形質導入（すなわち、ウイルス感染）、形質転換、及びトランスフェクションが挙げられる。トランスフェクションの機構としては、化学物質を用いたトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム媒介、リポフェクション／リポソーム媒介など）、化学物質を用いないトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、ハイドロダイナミックデリバリーなど）、及び粒子を用いたトランスフェクション（例えば、遺伝子銃、マグネトフェクション、パーティクルボンバードメントなど）が挙げられる。
【0182】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、免疫調節細胞である。免疫調節細胞としては、これらに限定されるものではないが、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ＥＳＣ由来細胞、及びｉＰＳＣ由来細胞が挙げられる。
【0183】
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞の例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクター細胞、ヘルパー細胞（ＴＨ細胞）、細胞傷害性細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、キラーＴ細胞）、メモリー細胞（セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、組織常在型メモリーＴ細胞、バーチャルメモリーＴ細胞など）、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＦＯＸＰ３＋、ＣＤ２５＋）、天然キラーＴ細胞、粘膜関連不変細胞、及びγδＴ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞などの幹細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯幹細胞、または他の幹細胞などの幹細胞である。
【0184】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、自家である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、同種である。
【0185】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、免疫受容体をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、天然の免疫受容体である（例えば、遺伝子操作された細胞が内因性免疫受容体を発現する免疫細胞である）。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、非天然の抗原受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体から選択される。
【0186】
いくつかの実施形態では、細胞の免疫受容体は、キメラ免疫受容体である。いくつかの実施形態では、免疫受容体は、キメラ抗原受容体である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、リガンド結合時の免疫受容体の活性化を抑制する。
【0187】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、外因性免疫受容体を発現するようにさらに操作される。例えば、遺伝子操作された細胞は、ＣＡＲなどのキメラ免疫受容体を発現するように操作することができる。別の例では、遺伝子操作された細胞は、操作された細胞に対して外因性の天然の免疫受容体を発現するように操作することができる。
【0188】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、キメラ抑制性受容体及び外因性免疫受容体を発現するように操作される。遺伝子操作された細胞は、キメラ抑制性受容体と外因性免疫受容体の両方を同時に発現するように操作することができる（例えば、各受容体をコードするポリヌクレオチドを同時に導入する）。遺伝子操作された細胞は、キメラ抑制性受容体と外因性免疫受容体の両方を順次発現するように操作することができる（例えば、最初にキメラ抑制性受容体と外因性免疫受容体のどちらかを発現するように操作し、その後、他の受容体を発現するように操作する）。
【0189】
いくつかの実施形態では、本開示のキメラ抑制性受容体に対するリガンド結合及び免疫受容体に対する同種免疫受容体リガンド結合は、キメラ抑制性受容体を免疫受容体に近接するように局在化させる。いくつかの実施形態では、免疫受容体に近接するようなキメラ抑制性受容体の局在化は、免疫受容体の活性化を抑制する。いくつかの実施形態では、免疫受容体の活性化はＴ細胞の活性化である。例えば、Ｔ細胞のシグナル伝達及び／または活性化の場合、キメラ抑制性受容体及び免疫受容体に結合するそれぞれのリガンドは、免疫シナプス内で免疫受容体に近接するようにキメラ抑制性受容体を局在化させる。
【0190】
製造方法及び使用
別の態様では、本開示は、実験的または治療的使用のためにキメラ抑制性受容体を発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された免疫調節細胞）を調製する方法を提供する。別の態様では、本開示は、実験的または治療的使用のためにキメラ抑制性受容体及び免疫受容体を発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された免疫調節細胞）を調製する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、実験的または治療的使用のためにキメラ抑制性受容体を発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された免疫調節細胞）を調製する方法を提供する。別の態様では、本開示は、実験的または治療的使用のためにキメラ抑制性受容体及び免疫受容体を発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞（例えば、遺伝子操作された免疫調節細胞）を調製する方法を提供する。
【0191】
治療用キメラ抑制性受容体が操作された細胞を作製するためのエクスビボ手順は、当該技術分野では周知のものである。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）から細胞を単離し、本明細書に開示されるキメラ抑制性受容体を発現するベクターを用いて遺伝子操作する（すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。キメラ抑制性受容体が操作された細胞は、哺乳動物レシピエントに投与することで治療効果を与えることができる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、キメラ抑制性受容体修飾細胞は、レシピエントに関して自家であってよい。あるいは、細胞は、レシピエントに関して同種異系、同系または異種であってもよい。造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖の手順は、参照により本明細書に援用するところの米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、本開示の細胞に適用することができる。他の適当な方法が当該技術分野で周知であり、したがって、本開示は、細胞のエクスビボ増殖のいずれの特定の方法にも限定されない。簡単に言えば、エクスビボ培養及び免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の増殖は、（１）末梢採血または骨髄体外培養物から哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を採取することと、（２）そのような細胞をエクスビボで増殖させることと、を含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載される細胞増殖因子以外に、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３及びｃ－ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び増殖に使用することができる。
【0192】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞の集団（例えば、細胞培地中の）を、所望の細胞密度（例えば、特定の細胞ベースの治療に十分な細胞密度）にまで培養することを含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、抑制可能なプロテアーゼの活性を抑制する物質の非存在下、または抑制可能なプロテアーゼの活性を抑制する薬剤の存在下で培養する。
【0193】
いくつかの実施形態では、細胞の集団を、出発集団の細胞の少なくとも２倍の数を含む増殖された細胞集団が産生される期間にわたって培養する。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、出発集団の細胞の少なくとも４倍の数を含む増殖された細胞集団が産生される期間にわたって培養する。いくつかの実施形態では、細胞の集団を、出発集団の細胞の少なくとも１６倍の数を含む増殖された細胞集団が産生される期間にわたって培養する。
【0194】
本明細書では、免疫細胞の活性化を抑制する方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードする核酸を含む遺伝子操作された細胞、本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞、または遺伝子を含む医薬組成物を、キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で同種リガンドと接触させることを含み、キメラ抑制性受容体は、操作された細胞の細胞膜上に発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合、免疫受容体活性化を抑制する。
【0195】
本明細書では、免疫応答を低下させる方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードする核酸を含む遺伝子操作された細胞、本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞、または遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0196】
本明細書では、免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または抑制する方法であって、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードする核酸を含む遺伝子操作された免疫調節細胞、本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された免疫調節細胞、または遺伝子操作された免疫調節細胞を含む医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、方法も提供される。
【0197】
本明細書では、免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または抑制する方法であって、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードする核酸を含む遺伝子操作された免疫調節細胞、本開示のキメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された免疫調節細胞、または遺伝子操作された免疫調節細胞を含む医薬組成物を、キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で同種リガンドと接触させることを含み、キメラ抑制性受容体は、操作された細胞の細胞膜上に発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合、免疫受容体活性化を抑制する、方法も提供される。
【0198】
本明細書では、自己免疫疾患または免疫応答を低下させることによって治療可能な疾患を治療する方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本開示の少なくとも１つのキメラ受容体をコードする核酸を含む遺伝子操作された細胞、キメラ抑制性受容体を発現する本開示の遺伝子操作された細胞、または遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む。
【0199】
いくつかの実施形態では、方法は、免疫受容体をさらに発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、免疫受容体を発現するようにさらに操作された遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、キメラ免疫受容体をさらに発現するかまたは発現可能な遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、キメラ免疫受容体を発現するようにさらに操作された遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲをさらに発現するかまたは発現することが可能な遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現するようにさらに操作された遺伝子操作された細胞を投与または接触させることを含む。
【0200】
免疫受容体（例えば、腫瘍標的化キメラ受容体）によって開始される免疫応答の減弱は、免疫受容体の活性化の減少または低下、免疫受容体のシグナル伝達の減少または低下、または操作された細胞の活性化の減少または低下でありうる。抑制性キメラ受容体は、免疫受容体の活性化、免疫受容体によるシグナル伝達、または免疫受容体による操作された細胞の活性化を、抑制性キメラ受容体を欠く操作された細胞と比較した免疫受容体の活性化、シグナル伝達、または操作された細胞の活性化と比較して１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、減弱することができる。いくつかの実施形態では、減弱は、免疫受容体が活性化された後の免疫受容体の活性の減少または低下を指す。
【0201】
免疫受容体（例えば、腫瘍標的化キメラ受容体）によって開始される免疫応答の防止は、免疫受容体の活性化の阻害または低下、免疫受容体のシグナル伝達の阻害または低下、または操作された細胞の活性化の阻害または低下でありうる。抑制性キメラ受容体は、免疫受容体の活性化、免疫受容体によるシグナル伝達、または免疫受容体による操作された細胞の活性化を、抑制性キメラ受容体を欠く操作された細胞と比較した免疫受容体の活性化、シグナル伝達、または操作された細胞の活性化と比較して約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、防止することができる。いくつかの実施形態では、防止は、免疫受容体が活性化される前の免疫受容体の活性の遮断を指す。
【0202】
免疫受容体（例えば、腫瘍標的化キメラ受容体）によって開始される免疫応答の阻害は、免疫受容体の活性化の阻害または低下、免疫受容体のシグナル伝達の阻害または低下、または操作された細胞の活性化の阻害または低下でありうる。抑制性キメラ受容体は、免疫受容体の活性化、免疫受容体によるシグナル伝達、または免疫受容体による操作された細胞の活性化を、抑制性キメラ受容体を欠く操作された細胞と比較した免疫受容体の活性化、シグナル伝達、または操作された細胞の活性化と比較して約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、阻害することができる。いくつかの実施形態では、阻害は、免疫受容体が活性化される前または後の免疫受容体の活性の減少または低下を指す。
【0203】
免疫受容体（例えば、腫瘍標的化キメラ受容体）によって開始される免疫応答の抑制は、免疫受容体の活性化の阻害または低下、免疫受容体のシグナル伝達の阻害または低下、または操作された細胞の活性化の阻害または低下でありうる。抑制性キメラ受容体は、免疫受容体の活性化、免疫受容体によるシグナル伝達、または免疫受容体による操作された細胞の活性化を、抑制性キメラ受容体を欠く操作された細胞と比較した免疫受容体の活性化、シグナル伝達、または操作された細胞の活性化と比較して約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上、抑制することができる。いくつかの実施形態では、抑制は、免疫受容体が活性化される前または後の免疫受容体の活性の減少または低下を指す。
【0204】
免疫応答は、活性化された免疫調節細胞からのサイトカインまたはケモカインの産生及び分泌でありうる。免疫応答は、細胞媒介性殺傷など、標的細胞に対する細胞媒介性免疫応答でありうる。
【0205】
いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、免疫調節細胞などの活性化された操作された細胞からのサイトカイン産生を抑制することができる。いくつかの実施形態では、キメラ抑制性受容体は、標的細胞に対する細胞媒介性免疫応答を抑制することができ、免疫応答は、操作された細胞の活性化によって誘導される。
【0206】
一態様では、本開示は、免疫細胞などの細胞が本明細書で提供されるキメラ抑制性受容体を発現するように遺伝子操作され、遺伝子操作された細胞がそれを必要とする対象に投与されるタイプの細胞療法を提供する。
【0207】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、増殖された細胞の集団の細胞を、状態または疾患を治療するための細胞ベースの療法を必要とする対象に送達することを含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、状態または疾患は、自己免疫状態である。いくつかの実施形態では、状態または疾患は、免疫関連免疫状態である。いくつかの実施形態では、状態または疾患は、がん（例えば、原発性がんまたは転移性がん）である。いくつかの実施形態では、がんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、がんは、液体がんである。
【0208】
医薬組成物
キメラ抑制性受容体または遺伝子操作された細胞は、医薬組成物に配合することができる。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラ抑制性受容体（例えば、ｉＣＡＲ）または遺伝子操作された細胞（例えば、複数のキメラ抑制性受容体発現細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含むことができる。かかる材料は無毒性でなければならず、有効成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻内、筋肉内、腹腔内経路に依存しうる。特定の実施形態では、組成物は、目的の臓器（例えば、障害に冒された臓器）に直接注射される。あるいは、組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の器官に間接的に与えることもできる。インビトロまたはインビボでのＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させるために増殖物質及び分化物質を、組成物の投与前、投与中、または投与後に与えることができる。
キメラ抑制性受容体または遺伝子操作された細胞は、医薬組成物に配合することができる。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載されるキメラ抑制性受容体（例えば、ｉＣＡＲ）または遺伝子操作された細胞（例えば、複数のキメラ抑制性受容体発現細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含むことができる。かかる材料は無毒性でなければならず、有効成分の有効性を妨げるものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻内、筋肉内、腹腔内経路に依存しうる。特定の実施形態では、組成物は、目的の臓器（例えば、障害に冒された臓器）に直接注射される。あるいは、組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の器官に間接的に与えることもできる。インビトロまたはインビボでのＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させるために増殖物質及び分化物質を、組成物の投与前、投与中、または投与後に与えることができる。
【0209】
特定の実施形態では、組成物は、免疫調節細胞または免疫細胞などの遺伝子操作された細胞、またはそれらの前駆細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。投与は、自家または異種とすることができる。例えば、免疫調節細胞または免疫細胞、または前駆細胞を１人の対象から得て、同じ対象または適合性を有する異なる対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、免疫調節細胞または免疫細胞などの遺伝子操作された細胞、またはそれらの子孫は、末梢血細胞に由来（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ由来）するものとすることができ、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射によって投与することができる。本開示の治療用組成物（例えば、本開示の遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、組成物は一般に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液）として製剤化される。
【0210】
本開示の特定の態様は、本開示のキメラ受容体、またはかかるキメラ受容体を発現する遺伝子操作された細胞（例えば、本開示の免疫調節細胞または免疫細胞）を含む組成物の製剤に関する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞を含む本開示の組成物は、これらに限定されるものではないが、選択されたｐＨに緩衝することができる等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、及び粘性組成物を含む滅菌液体製剤として提供することができる。液体製剤は、通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与により都合がよい場合がある。いくつかの実施形態では、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触時間を与えるような適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性の組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）及びそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってよい担体を含むことができる。
【0211】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態とすることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含むことができる。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類が含まれてもよい。
【0212】
静脈内、皮膚または皮下注射、または患部における注射の場合、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適当なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを使用して適当な溶液を容易に調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／または他の添加剤が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、等張性、すなわち、血液及び涙液と同じ浸透圧を有するものとすることができる。いくつかの実施形態では、例えば、塩化ナトリウム、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、または他の無機もしくは有機溶質を使用して所望の等張性を得ることができる。
【0213】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、組成物の安定性及び無菌性を高めることができる様々な添加剤をさらに含むことができる。かかる添加剤の例としては、これらに限定されるものではないが、抗細菌菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝液が挙げられる。いくつかの実施形態では、これらに限定されるものではないが、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含む様々な抗細菌剤及び抗真菌剤のいずれかを添加することによって微生物汚染を防止することができる。モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる適切な薬剤の使用によって本開示の注射可能な製剤の長期吸収をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞を、必要に応じて異なる量の他の成分と共に十分な量の適切な溶媒に添加することによって滅菌注射溶液を調製することができる。かかる組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適当な担体、希釈剤、または賦形剤と混合することができる。いくつかの実施形態では、組成物は凍結乾燥されてもよい。組成物は、投与経路及び所望の製剤に応じて、湿潤剤、分散剤、ｐＨ緩衝剤、及び抗細菌剤などの補助的物質を含むことができる。
【0214】
いくつかの実施形態では、本開示の製剤の成分は、化学的に不活性であり、かつ本開示の遺伝子改変細胞の生存率または有効性に影響を及ぼさないように選択される。
【0215】
本開示の遺伝子操作された細胞の治療的使用に関する１つの考慮事項は、最適な有効性を得るうえで必要とされる細胞の量である。いくつかの実施形態では、投与される細胞の量は、治療される対象によって異なる。特定の実施形態において、それを必要とする対象に投与される遺伝子操作された細胞の量は、１×１０４細胞～１×１０１０細胞の範囲とすることができる。いくつかの実施形態では、有効用量とみなされる細胞の正確な量は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、及び状態を含む、各対象に固有の要因に基づいたものとすることができる。用量は、本開示及び当該技術分野における知識に基づいて当業者によって容易に決定することができる。
【0216】
個人に投与されるものが本発明によるポリペプチド、抗体、核酸、小分子または他の薬学的に有用な化合物のいずれであるかによらず、投与は、「治療有効量」または「予防有効量」（この場合のように予防は治療とみなすことができるが）であることが好ましく、これは個人に利益を示すのに十分である。実際に投与される量、ならびに投与の速度及び時間経過は、治療されるタンパク質凝集疾患の性質及び重症度によって異なる。治療の処方、例えば用量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療される疾患、個々の患者の状態、投与部位、投与方法、及び医師にとっては周知の他の因子を考慮したものである。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に記載されている。
【0217】
組成物は、単独で、または他の治療と併用して、治療される状態に応じて同時または順次に投与することができる。
【0218】
キット
本開示の特定の態様は、がんまたは他の疾患（例えば、免疫関連または自己免疫疾患）の治療及び／または予防のためのキットに関する。特定の実施形態において、キットは、有効量の本開示の１つ以上のキメラ受容体、本開示の単離された核酸、本開示のベクター、及び／または本開示の細胞（例えば、免疫調節細胞または免疫細胞などの遺伝子操作された細胞）を含む治療的または予防的組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは滅菌容器を含む。いくつかの実施形態では、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当該技術分野では周知の他の適当な容器の形態とすることができる。容器は、プラスチック、ガラス、合紙、金属箔、または薬剤を保持するのに適した他の材料で形成することができる。
本開示の特定の態様は、がんまたは他の疾患（例えば、免疫関連または自己免疫疾患）の治療及び／または予防のためのキットに関する。特定の実施形態において、キットは、有効量の本開示の１つ以上のキメラ受容体、本開示の単離された核酸、本開示のベクター、及び／または本開示の細胞（例えば、免疫調節細胞または免疫細胞などの遺伝子操作された細胞）を含む治療的または予防的組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは滅菌容器を含む。いくつかの実施形態では、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または当該技術分野では周知の他の適当な容器の形態とすることができる。容器は、プラスチック、ガラス、合紙、金属箔、または薬剤を保持するのに適した他の材料で形成することができる。
【0219】
いくつかの実施形態では、治療的または予防的組成物は、がんまたは免疫関連疾患を有するかまたは発症するリスクを有する対象に治療的または予防的組成物を投与するための説明書と共に提供される。いくつかの実施形態では、説明書は、疾患の治療及び／または予防のための組成物の使用に関する情報を含むことができる。いくつかの実施形態では、説明書は、これらに限定されるものではないが、治療的または予防的組成物の説明、投薬スケジュール、疾患またはその症状の治療または予防のための投与スケジュール、予防措置、警告、適応症、禁忌、過剰投与情報、有害反応、動物薬理学、臨床試験、及び／または参考文献を含む。いくつかの実施形態では、説明書は、容器に直接印刷することができ（存在する場合）、または容器に貼付されるラベルとして、または容器内または容器と共に提供される別個のシート、パンフレット、カード、またはフォルダーとして印刷することができる。
【0220】
さらなる実施形態
以下に、本発明の特定の非限定的な実施形態を記載する、番号付けされた実施形態を示す。
以下に、本発明の特定の非限定的な実施形態を記載する、番号付けされた実施形態を示す。
【0221】
実施形態１細胞外リガンド結合ドメインと、
膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む、キメラ抑制性受容体。
膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む、キメラ抑制性受容体。
【0222】
実施形態２前記細胞外リガンド結合ドメインが、タンパク質複合体、タンパク質、ペプチド、受容体結合ドメイン、核酸、小分子、及び化学物質からなる群から選択されるリガンドに結合する、実施形態１に記載のキメラ抑制性受容体。
【0223】
実施形態３前記細胞外リガンド結合ドメインが、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、実施形態１または実施形態２に記載のキメラ抑制性受容体。
【0224】
実施形態４前記細胞外リガンド結合ドメインが、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む、実施形態１または実施形態２に記載のキメラ抑制性受容体。
【0225】
実施形態５前記リガンドが腫瘍関連抗原である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0226】
実施形態６前記リガンドが腫瘍細胞で発現されない、実施形態１～４のいずれか１つに 記載のキメラ抑制性受容体。
【0227】
実施形態７前記リガンドが非腫瘍細胞で発現される、実施形態１～４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0228】
実施形態８前記リガンドが健康な組織の細胞で発現される、実施形態１～４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0229】
実施形態９前記細胞外リガンド結合ドメインが二量体化ドメインを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0230】
実施形態１０前記リガンドが同種の二量体化ドメインをさらに含む、実施形態９に記載のキメラ抑制性受容体。
【0231】
実施形態１１前記リガンドが細胞表面リガンドである、実施形態２～１０のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0232】
実施形態１２前記細胞表面リガンドが、前記免疫受容体の同種リガンドをさらに発現する細胞で発現される、実施形態１１に記載のキメラ抑制性受容体。
【0233】
実施形態１３前記膜局在化ドメインが細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0234】
実施形態１４前記膜局在化ドメインが細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0235】
実施形態１５前記膜局在化ドメインが細胞外ドメインの少なくとも一部と細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0236】
実施形態１６前記膜局在化ドメインが、ＬＡＸ膜貫通ドメイン、ＣＤ２５膜貫通ドメイン、ＣＤ７膜貫通ドメイン、ＬＡＴ膜貫通ドメイン、ＬＡＴ変異体由来の膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－ＩＢＢ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０膜貫通ドメイン、ＩＣＯＳ膜貫通ドメイン、２Ｂ４膜貫通ドメイン、ＰＤ－１膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ４膜貫通ドメイン、ＢＴＬＡ膜貫通ドメイン、ＴＩＭ３膜貫通ドメイン、ＬＩＲ１膜貫通ドメイン、ＮＫＧ２Ａ膜貫通ドメイン、ＴＩＧＩＴ膜貫通ドメイン、及びＬＡＧ３膜貫通ドメイン、ＬＡＩＲ１膜貫通ドメイン、ＧＲＢ－２膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－１膜貫通ドメイン、Ｄｏｋ－２膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ１膜貫通ドメイン、ＳＬＡＰ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２００Ｒ膜貫通ドメイン、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン、ＨＡＶＲ膜貫通ドメイン、ＧＩＴＲ膜貫通ドメイン、ＰＤ－Ｌ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＫＩＲ２ＤＬ３膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ１膜貫通ドメイン、ＫＩＲ３ＤＬ２膜貫通ドメイン、ＣＤ９４膜貫通ドメイン、ＫＬＲＧ－１膜貫通ドメイン、ＰＡＧ膜貫通ドメイン、ＣＤ４５膜貫通ドメイン、及びＣＥＡＣＡＭ１膜貫通ドメインからなる群から選択される膜貫通ドメインを含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0237】
実施形態１７前記膜局在化ドメインが、対応する細胞外ドメインの少なくとも一部及び／または対応する細胞内ドメインの少なくとも一部をさらに含む、実施形態１６に記載のキメラ抑制性受容体。
【0238】
実施形態１８前記ＬＡＴ変異体がＬＡＴ（ＣＡ）変異体である、実施形態１６または実施形態１７に記載のキメラ抑制性受容体。
【0239】
実施形態１９前記膜局在化ドメインが前記キメラ抑制性受容体を細胞膜のドメインに誘導、または隔離する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0240】
実施形態２０前記膜局在化ドメインが、前記キメラ抑制性受容体を脂質ラフトまたは重脂質ラフトに局在化させる、実施形態１～１９のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0241】
実施形態２１前記膜局在化ドメインが、細胞膜のドメインに局在化された１つ以上の細胞膜成分と相互作用する、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0242】
実施形態２２前記膜局在化ドメインが、前記細胞外リガンド結合ドメインの同種リガンドへの結合がない状態で前記酵素的抑制性ドメインによる免疫受容体活性化の構成的阻害を軽減するのに十分である、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0243】
実施形態２３前記膜局在化ドメインが、前記細胞外リガンド結合ドメインの同種リガンドへの結合がない状態で免疫受容体の１つ以上の成分によって占められる細胞膜のドメインとは異なる細胞膜のドメインへの前記キメラ抑制性受容体の局在化を媒介する、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0244】
実施形態２４前記膜局在化ドメインが近接タンパク質フラグメントをさらに含む、実施形態２３に記載のキメラ抑制性受容体。
【0245】
実施形態２５前記１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0246】
実施形態２６前記１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質またはそのフラグメントを含む、実施形態２５に記載のキメラ抑制性受容体。
【0247】
実施形態２７前記１つ以上のＩＴＩＭ含有タンパク質またはそのフラグメントが、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及びＬＡＩＲ１からなる群から選択される、実施形態２６に記載のキメラ抑制性受容体。
【0248】
実施形態２８前記１つ以上の細胞内抑制性共シグナル伝達ドメインが、１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質、またはそのフラグメントを含む、実施形態２５に記載のキメラ抑制性受容体。
【0249】
実施形態２９前記１つ以上の非ＩＴＩＭ足場タンパク質またはそのフラグメントが、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ１、ＳＬＡＰ２、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される、実施形態２８のキメラ抑制性受容体。
【0250】
実施形態３０前記細胞外リガンド結合ドメインが細胞外リンカー領域を介して膜局在化ドメインに連結されている、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0251】
実施形態３１前記細胞外リンカー領域が、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜局在化ドメインとの間に位置し、前記細胞外リガンド結合ドメイン及び前記膜局在化ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結されている、実施形態３０に記載のキメラ抑制性受容体。
【0252】
実施形態３２前記細胞外リンカー領域が、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＦｃγＲＩＩＩα、ＬＮＧＦＲ、及びＰＤＧＦＲからなる群から選択されるタンパク質に由来する、実施形態３０または実施形態３１に記載のキメラ抑制性受容体。
【0253】
実施形態３３前記細胞外リンカー領域が、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０または実施形態３１に記載のキメラ抑制性受容体。
【0254】
実施形態３４前記細胞外リンカー領域が、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０または実施形態３１に記載のキメラ抑制性受容体。
【0255】
実施形態３５前記キメラ抑制性受容体が、前記膜局在化ドメインと前記酵素的抑制性ドメインとの間に位置して前記膜局在化ドメイン及び前記酵素的抑制性ドメインのそれぞれと機能的及び／または物理的に連結された細胞内スペーサー領域をさらに含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0256】
実施形態３６前記細胞内スペーサー領域が、ＧＧＳ（配列番号２９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３８）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号４４）、及びＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４に記載のキメラ抑制性受容体。
【0257】
実施形態３７前記細胞内スペーサー領域が、ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号４６）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４７）、ＥＳＫＹＧＰＰＡＰＳＡＰ（配列番号４８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号５０）、ＡＡＡＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮ（配列番号５１）、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＬＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号５２）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣＥＰＣＬＤＳＶＴＦＳＤＶＶＳＡＴＥＰＣＫＰＣＴＥＣＶＧＬＱＳＭＳＡＰＣＶＥＡＤＤＡＶＣＲＣＡＹＧＹＹＱＤＥＴＴＧＲＣＥＡＣＲＶＣＥＡＧＳＧＬＶＦＳＣＱＤＫＱＮＴＶＣＥＥＣＰＤＧＴＹＳＤＥＡＤＡＥＣ（配列番号５３）、ＡＣＰＴＧＬＹＴＨＳＧＥＣＣＫＡＣＮＬＧＥＧＶＡＱＰＣＧＡＮＱＴＶＣ（配列番号５４）、及びＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶ（配列番号５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態３４に記載のキメラ抑制性受容体。
【0258】
実施形態３８前記酵素的抑制性ドメインが、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメインの少なくとも一部を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0259】
実施形態３９前記酵素的抑制性ドメインが酵素触媒ドメインを含む、実施形態３８に記載のキメラ抑制性受容体。
【0260】
実施形態４０前記酵素的抑制性ドメインが酵素の少なくとも一部を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0261】
実施形態４１前記酵素の一部が酵素ドメインまたは酵素フラグメントを含む、実施形態４０に記載のキメラ抑制性受容体。
【0262】
実施形態４２前記酵素の一部が酵素の触媒ドメインである、実施形態４０に記載のキメラ抑制性受容体。
【0263】
実施形態４３前記酵素が、ＣＳＫ、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＺＡＰ７０、及びＲａｓＧＡＰからなる群から選択される、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0264】
実施形態４４前記酵素的抑制性ドメインがＣＳＫに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0265】
実施形態４５前記酵素的抑制性ドメインが、ＳＲＣ相同性３（ＳＨ３）欠失を有するＣＳＫタンパク質を含む、実施形態４４に記載のキメラ抑制性受容体。
【0266】
実施形態４６前記酵素的抑制性ドメインがＳＨＰ－１に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0267】
実施形態４７前記酵素的抑制性ドメインがプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを含む、実施形態４７のキメラ抑制性受容体。
【0268】
実施形態４８前記酵素的抑制性ドメインがＳＨＰ－２に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0269】
実施形態４９前記酵素的抑制性ドメインがＰＴＥＮに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0270】
実施形態５０前記酵素的抑制性ドメインがＣＤ４５に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0271】
実施形態５１前記酵素的抑制性ドメインがＣＤ１４８に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0272】
実施形態５２前記酵素的抑制性ドメインがＰＴＰ－ＭＥＧ１に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0273】
実施形態５３前記酵素的抑制性ドメインがＰＴＰ－ＰＥＳＴに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0274】
実施形態５４前記酵素的抑制性ドメインがｃ－ＣＢＬに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0275】
実施形態５５前記酵素的抑制性ドメインがＣＢＬ－ｂに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0276】
実施形態５６前記酵素的抑制性ドメインがＰＴＰＮ２２に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0277】
実施形態５７前記酵素的抑制性ドメインがＬＡＲに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0278】
実施形態５８前記酵素的抑制性ドメインがＰＴＰＨ１に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0279】
実施形態５９前記酵素的抑制性ドメインがＳＨＩＰ－１に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0280】
実施形態６０前記酵素的抑制性ドメインがプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインを含む、実施形態６０に記載のキメラ抑制性受容体。
【0281】
実施形態６１前記酵素的抑制性ドメインがＺＡＰ７０に由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0282】
実施形態６２前記酵素的抑制性ドメインが、ＳＲＣ相同性１（ＳＨ１）ドメイン、ＳＲＣ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、またはＳＨ１ドメインとＳＨ２ドメインを含む、実施形態５８に記載のキメラ抑制性受容体。
【0283】
実施形態６３前記酵素的抑制性ドメインが、キナーゼドメイン欠失を有するＺＡＰ７０タンパク質を含む、実施形態５８に記載のキメラ抑制性受容体。
【0284】
実施形態６４前記酵素的抑制性ドメインが、Ｔｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換、Ｔｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換、またはＴｙｒ４９２Ｐｈｅアミノ酸置換とＴｙｒ４９３Ｐｈｅアミノ酸置換を有する変異体ＺＡＰ７０タンパク質を含む、実施形態５８に記載のキメラ抑制性受容体。
【0285】
実施形態６５前記酵素的抑制性ドメインがＲａｓＧＡＰに由来する、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0286】
実施形態６６前記酵素的抑制性ドメインが、基礎阻害を調節する１つ以上の改変を含む、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0287】
実施形態６７前記１つ以上の改変が基礎阻害を低下させる、実施形態６５に記載のキメラ抑制性受容体。
【0288】
実施形態６８前記１つ以上の改変が基礎阻害を増加させる、実施形態６５に記載のキメラ抑制性受容体。
【0289】
実施形態６９前記酵素的阻害ドメインが、免疫受容体に近接するようなキメラ抑制性受容体の動員時に免疫受容体の活性化を阻害する、実施形態１～６８のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0290】
実施形態７０前記免疫受容体がキメラ免疫受容体である、実施形態１～６９のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0291】
実施形態７１前記免疫受容体がキメラ抗原受容体である、実施形態７０に記載のキメラ抑制性受容体。
【0292】
実施形態７２前記免疫受容体が天然の免疫受容体である、実施形態１～６９のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0293】
実施形態７３前記免疫受容体が天然の抗原受容体である、実施形態７２に記載のキメラ抑制性受容体。
【0294】
実施形態７４前記免疫受容体が、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体からなる群から選択される、実施形態１～６９のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0295】
実施形態７５前記免疫受容体がＴ細胞受容体である、実施形態１～７３のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0296】
実施形態７６実施形態１～７５のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体をコードする、核酸。
【0297】
実施形態７７実施形態７６に記載の核酸を含む、ベクター。
【0298】
実施形態７８実施形態７６に記載の核酸を含む、遺伝子操作された細胞。
【0299】
実施形態７９実施形態７７に記載のベクターを含む、遺伝子操作された細胞。
【0300】
実施形態８０実施形態１～７５のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体を発現する、遺伝子操作された細胞。
【0301】
実施形態８１キメラ抑制性受容体を発現する遺伝子操作された細胞であって、前記キメラ抑制性受容体が、
細胞外リガンド結合ドメインと、
膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む、前記操作された細胞。
細胞外リガンド結合ドメインと、
膜貫通ドメインを含む膜局在化ドメインと、
免疫受容体に近接する場合に前記免疫受容体の活性化を阻害する酵素的抑制性ドメインと、を含む、前記操作された細胞。
【0302】
実施形態８２前記細胞が免疫受容体をさらに含む、実施形態７８～８１のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0303】
実施形態８３前記免疫受容体がキメラ免疫受容体である、実施形態８２に記載の操作された細胞。
【0304】
実施形態８４前記免疫受容体がキメラ抗原受容体である、実施形態８３に記載の操作された細胞。
【0305】
実施形態８５前記免疫受容体が天然の免疫受容体である、実施形態８２に記載の操作された細胞。
【0306】
実施形態８６前記免疫受容体が天然の抗原受容体である、実施形態８５に記載の操作された細胞性受容体。
【0307】
実施形態８７前記免疫受容体が、Ｔ細胞受容体、パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）、補体受容体、Ｆｃ受容体、Ｂ細胞受容体、及びサイトカイン受容体からなる群から選択される、実施形態８２のいずれか１つに記載のキメラ抑制性受容体。
【0308】
実施形態８８前記キメラ抑制性受容体が、リガンド結合時に免疫受容体の活性化を阻害する、実施形態８２～８７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0309】
実施形態８９前記リガンドが細胞表面リガンドである、実施形態８２～８８のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0310】
実施形態９０前記細胞表面リガンドが、同種の免疫受容体リガンドをさらに発現する細胞で発現される、実施形態８９に記載の操作された細胞。
【0311】
実施形態９１前記キメラ抑制性受容体に対するリガンド結合及び前記免疫受容体に対する同種免疫受容体リガンド結合が、前記キメラ抑制性受容体を前記免疫受容体に近接するように局在化させる、実施形態９０に記載の操作された細胞。
【0312】
実施形態９２前記免疫受容体に近接するような前記キメラ抑制性受容体の局在化が免疫受容体の活性化を阻害する、実施形態９１に記載の操作された細胞。
【0313】
実施形態９３前記細胞がＴ細胞である、実施形態８８～９３のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0314】
実施形態９４前記免疫受容体がＴ細胞受容体である、実施形態９３に記載の操作された細胞。
【0315】
実施形態９５前記免疫受容体の活性化が、Ｔ細胞の活性化である、実施形態９４に記載の操作された細胞。
【0316】
実施形態９６前記細胞が免疫調節細胞である、実施形態７８～９２のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0317】
実施形態９７前記免疫調節細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ウイルス特異的Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、自然リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、好中球、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ＥＳＣ由来細胞、及びｉＰＳＣ由来細胞からなる群から選択される、実施形態９６に記載の操作された細胞。
【0318】
実施形態９８前記細胞が自家である、実施形態７８～９７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0319】
実施形態９９前記細胞が同種である、実施形態７８～９７のいずれか１つに記載の操作された細胞。
【0320】
実施形態１００実施形態７８～９９に記載のいずれか１つの操作された細胞と、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される賦形剤、またはそれらの組み合わせとを含む医薬組成物。
【0321】
実施形態１０１免疫受容体の活性化を阻害する方法であって、
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記キメラ抑制性受容体が、前記操作された細胞の細胞膜上で発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合に免疫受容体の活性化を阻害する、前記方法。
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記キメラ抑制性受容体が、前記操作された細胞の細胞膜上で発現される免疫受容体に近接するように局在化される場合に免疫受容体の活性化を阻害する、前記方法。
【0322】
実施形態１０２免疫応答を低下させるための方法であって、
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【0323】
実施形態１０３免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体によって誘導される細胞媒介性免疫応答を防止、減弱、または阻害する方法であって、
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【0324】
実施形態１０４免疫調節細胞の表面に発現される腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する方法であって、
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記キメラ抑制性受容体の前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記リガンドの前記キメラ抑制性受容体との結合時に前記酵素的抑制性ドメインが前記腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する、前記方法。
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、前記キメラ抑制性受容体が同種リガンドに結合するのに適した条件下で前記キメラ抑制性受容体の前記同種リガンドと接触させることを含み、
前記リガンドの前記キメラ抑制性受容体との結合時に前記酵素的抑制性ドメインが前記腫瘍標的化キメラ受容体の活性化を防止、減弱、または阻害する、前記方法。
【0325】
実施形態１０５自己免疫疾患または免疫応答を低下させることによって治療可能な疾患を治療するための方法であって、
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
実施形態７８～９９のいずれか１つに記載の操作された細胞または実施形態１００に記載の医薬組成物を、かかる治療を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【0326】
〔実施例〕
以下は、本開示の方法及び組成物の例である。本明細書に示される一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態を実施可能であることが理解されよう。
以下は、本開示の方法及び組成物の例である。本明細書に示される一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態を実施可能であることが理解されよう。
【0327】
以下は、本開示の特許請求される主題を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本開示の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保しようと努めてはいるが、ある程度の実験誤差及びばらつきが許容されるべきである点はいうまでもない。
【0328】
実施例１：酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲによる阻害
ＣＡＲ－ＴとＫ５６２の共培養法
レンチウイルスの生産：
以下を使用してレンチウイルスを生産した。すなわち、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８０）；抗生物質を含まないＬＸ２９３Ｔ完全培地；ＤＭＥＭ（高グルコース）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０％ＦＢＳ（熱不活化したもの）；Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ Ｉ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５）；ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）；エンベロープ、パッケージング、及びトランスファーベクタープラスミド；ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）；第２世代及び第３世代のトランスファーベクター（ｐｓＭＡＸ２）で使用できるＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔを含むパッケージングベクター。９０％コンフルエンスにある１０ｃｍディッシュから２９３Ｔ（ＦＴ）細胞を取り上げ、トランスフェクションの前日の午後遅くに希釈率１：３で分注し、細胞を通常の一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした（細胞は翌日のトランスフェクション時に６０～８５％コンフルエンスに達している必要がある）。
ＣＡＲ－ＴとＫ５６２の共培養法
レンチウイルスの生産：
以下を使用してレンチウイルスを生産した。すなわち、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８０）；抗生物質を含まないＬＸ２９３Ｔ完全培地；ＤＭＥＭ（高グルコース）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０％ＦＢＳ（熱不活化したもの）；Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ Ｉ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５）；ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）；エンベロープ、パッケージング、及びトランスファーベクタープラスミド；ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）；第２世代及び第３世代のトランスファーベクター（ｐｓＭＡＸ２）で使用できるＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔを含むパッケージングベクター。９０％コンフルエンスにある１０ｃｍディッシュから２９３Ｔ（ＦＴ）細胞を取り上げ、トランスフェクションの前日の午後遅くに希釈率１：３で分注し、細胞を通常の一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした（細胞は翌日のトランスフェクション時に６０～８５％コンフルエンスに達している必要がある）。
【0329】
以下のプロトコルに従って、１０ｃｍディッシュごとにトランスフェクション反応液を調製した。
【0330】
１．別々の１．７ｍＬチューブ中で各１０ｃｍディッシュのトランスフェクション反応液を調製する。
【0331】
２．ＲＴで９００ｕＬＯｐｔｉ－ＭｅｍＩを加える。
【0332】
３．反応液ごとに９ｕｇのベクターバックボーン（目的の遺伝子を含む）を加える。
【0333】
４．反応液ごとに８ｕｇのパッケージングベクターを加える。
【0334】
５．反応ごとに１ｕｇのエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）を加える。
【0335】
６．３秒間、高速でボルテックスして、完全に混合する。
【0336】
７．反応ごとに５５ｕＬのＦｕｇｅｎｅＨＤを加える。
【0337】
８．２０～３０回すばやく上下にピペッティングして混合する。
【0338】
９．ＲＴで１０分間放置する（ＤＮＡ複合体を形成させる）。
【0339】
１０．ディッシュの周りにゆっくりと混合物を滴下して加えた後、５～１０秒間、静かに前後上下に揺り動かして混合する（回転させないようにする）。
【0340】
１１．ディッシュをウイルスインキュベーターに入れる。
【0341】
血清学的ピペットを使用して、２日目と３日目にウイルス上清を採取した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ ０．４５ｕｍフィルターを使用して、細胞破片を除去した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーター（カタログ番号６３１２３１及び６３１２３２）をプロトコルに従って使用した。１）１体積のＬｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターを３体積の清澄化した上清と加え合わせる。穏やかに反転させて混合する。２）混合物を氷上または４℃で３０分～一晩インキュベートする。（３）試料を１５００×ｇで４５分間、４℃で遠心分離する。（４）ペレットを壊さないように注意しながら、上澄みを注意深く取り除いて捨てる。（５）滅菌ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを使用して、ペレットを最初の体積の１／１０～１／１００に静かに再懸濁する。
【0342】
形質導入と増殖
初代Ｔ細胞をヒトドナーＰＢＭＣから単離して凍結した。１日目に、１×１０６個の精製ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍して３×１０６個のＨｕｍａｎＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで刺激し、０．２μｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む１ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＴＳ Ｔ細胞増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。２日目に細胞を活性化ＣＡＲ（ａＣＡＲ）をコードするレンチウイルス（上記の生産方法を参照）及び／または抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）をコードするレンチウイルスで同時形質導入して、ａＣＡＲ＋、ｉＣＡＲ＋、及びａＣＡＲ＋／ｉＣＡＲ＋（二重＋）Ｔ細胞を生産した（ＧｏＳｔｉｘ（Ｔｅｋａｒａ）によって定量化した各コンストラクト１００Ｋ）。各ＣＡＲは構成的ＳＦＦＶプロモーターの制御下にあった。異なるａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトならびに関連するＣＡＲドメインを下記表Ａに、完全なコード配列を表Ｃに示す。３日目に、ダイナビーズを磁石で除去した。Ｔ細胞をカウントして継代した（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。その後の増殖の間、細胞を２日ごとに継代した（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。
初代Ｔ細胞をヒトドナーＰＢＭＣから単離して凍結した。１日目に、１×１０６個の精製ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍して３×１０６個のＨｕｍａｎＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで刺激し、０．２μｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む１ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＴＳ Ｔ細胞増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。２日目に細胞を活性化ＣＡＲ（ａＣＡＲ）をコードするレンチウイルス（上記の生産方法を参照）及び／または抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）をコードするレンチウイルスで同時形質導入して、ａＣＡＲ＋、ｉＣＡＲ＋、及びａＣＡＲ＋／ｉＣＡＲ＋（二重＋）Ｔ細胞を生産した（ＧｏＳｔｉｘ（Ｔｅｋａｒａ）によって定量化した各コンストラクト１００Ｋ）。各ＣＡＲは構成的ＳＦＦＶプロモーターの制御下にあった。異なるａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトならびに関連するＣＡＲドメインを下記表Ａに、完全なコード配列を表Ｃに示す。３日目に、ダイナビーズを磁石で除去した。Ｔ細胞をカウントして継代した（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。その後の増殖の間、細胞を２日ごとに継代した（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。
【0343】
【表21】
【0344】
共培養アッセイ
７日目に、各細胞集団のアリコートをＰＥ結合抗ＭＹＣ及びＢＶ４２１結合抗ＦＬＡＧ抗体（それぞれａＣＡＲ及びｉＣＡＲに対応）で染色し、ＬＸ ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリー装置を使用してそれらの導入遺伝子発現を定量化した。８日目にＴ細胞をカウントし、共培養アッセイ用に９６ウェルプレートに分配した。各ウェルには、ａＣＡＲ標的ＣＤ２０とｉＣＡＲ標的ＣＤ１９を共発現するように操作されるか、またはＣＤ２０単独を発現するように操作され、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した５×１０５個のＫ５６２標的細胞と、５×１０５個のａＣＡＲ＋または二重＋Ｔ細胞とを含むようにした。共培養物（３７℃、５％ＣＯ２）を４０時間インキュベートした。１０日目に、共培養物中の細胞をＮＩＲ生存率色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸフローサイトメーターを使用して生きた標的細胞の数を定量化した。それぞれの操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団の殺傷効率を、ＣＤ２０を発現するＫ５６２標的細胞株のそれぞれに対する生存した野生型Ｋ５６２の比として計算した。正規化した殺傷効率を、単一（ＣＤ２０＋のみ）抗原標的細胞に対する二重（ＣＤ２０＋ＣＤ１９＋）抗原標的細胞のＣＡＲ－Ｔ殺傷効率の比として計算した。
７日目に、各細胞集団のアリコートをＰＥ結合抗ＭＹＣ及びＢＶ４２１結合抗ＦＬＡＧ抗体（それぞれａＣＡＲ及びｉＣＡＲに対応）で染色し、ＬＸ ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリー装置を使用してそれらの導入遺伝子発現を定量化した。８日目にＴ細胞をカウントし、共培養アッセイ用に９６ウェルプレートに分配した。各ウェルには、ａＣＡＲ標的ＣＤ２０とｉＣＡＲ標的ＣＤ１９を共発現するように操作されるか、またはＣＤ２０単独を発現するように操作され、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した５×１０５個のＫ５６２標的細胞と、５×１０５個のａＣＡＲ＋または二重＋Ｔ細胞とを含むようにした。共培養物（３７℃、５％ＣＯ２）を４０時間インキュベートした。１０日目に、共培養物中の細胞をＮＩＲ生存率色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸフローサイトメーターを使用して生きた標的細胞の数を定量化した。それぞれの操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団の殺傷効率を、ＣＤ２０を発現するＫ５６２標的細胞株のそれぞれに対する生存した野生型Ｋ５６２の比として計算した。正規化した殺傷効率を、単一（ＣＤ２０＋のみ）抗原標的細胞に対する二重（ＣＤ２０＋ＣＤ１９＋）抗原標的細胞のＣＡＲ－Ｔ殺傷効率の比として計算した。
【0345】
酵素的抑制性ドメインを含むＣＡＲの結果
酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を評価した。一般的な手法を、受容体が標的細胞上に発現された同種リガンドと結合する際に、ＥＩＤを含むキメラ受容体によって媒介されるシグナル伝達の阻害を示す図１～３に概略的に示す。
酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を評価した。一般的な手法を、受容体が標的細胞上に発現された同種リガンドと結合する際に、ＥＩＤを含むキメラ受容体によって媒介されるシグナル伝達の阻害を示す図１～３に概略的に示す。
【0346】
ＥＩＤを含むキメラ受容体による阻害を評価するためのシステムを確立した。図４は、ｋ５６２標的細胞を、ａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）を発現するように操作するか、またはａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）及びｉＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ１９）の両方を発現するように操作したシステムを概略的に示す。調べたシステムは、ＣＳＫドメインを含む抗ＣＤ１９ｉＣＡＲが、ＥＩＤドメインとして、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含むａＣＡＲのシグナル伝達を阻害する能力を評価するものである。図５は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入した後、その後の濃縮を行うことなく、ｉＣＡＲコンストラクト抗ＣＤ１９＿ｓｃＦｖ－Ｃｓｋ融合体が、非改変細胞よりも高い検出可能なレベルで発現されたことを示す代表的なフローサイトメトリーのプロットを示す重要な点として、Ｔ細胞は、レンチウイルスによる同時形質導入後にｉＣＡＲ及びａＣＡＲコンストラクトの両方の共発現を示した（図５、右下）。調べた異なるコンストラクトの発現プロファイルをフローサイトメトリーによって評価し、ａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトの発現を示す図６に示した。図は、ａＣＡＲ＋＝ａＣＡＲを発現する細胞（ｉＣＡＲ有り及び無し）［１番目の柱］、ｉＣＡＲ＋＝ｉＣＡＲを発現する細胞（ａＣＡＲ有り及び無し）［２番目の柱］、及び二重＋＝ ａＣＡＲ及びｉＣＡＲの両方を発現する細胞［３番目の柱］を示している。重要な点として、ａＣＡＲ＋集団（１番目の柱）と二重＋集団（３番目の柱）の比較によって、ａＣＡＲを発現する細胞の大部分が二重＋（すなわち、ｉＣＡＲも発現している）であることが示され、機能的なｉＣＡＲによって阻害されない残存するａＣＡＲのみの細胞（すなわち、ａＣＡＲのみを発現する）の存在量が最小であることを示している。
【0347】
次に、ｉＣＡＲコンストラクトを、シグナル伝達を阻害するそれらの能力について評価した。図７に示されるように、ａＣＡＲコンストラクトによる形質導入は効率的な標的細胞の殺傷のみをもたらした（図７、左の柱、ＣＤ２０のみの標的細胞に対するＣＤ１９／ＣＤ２０標的細胞の殺傷の比として表される）のに対して、ＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ３１）によるＴ細胞の同時形質導入によって殺傷効率は約５０％低下した（図７、中央の柱）。ＣＳＫのＳＨ３ドメインに欠失を有するＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ２６）によるＴ細胞の同時形質導入は、阻害を示さなかった（図７、右の柱）。したがって、これらのデータは、酵素的抑制性ドメインを含むＣＡＲが、活性化ＣＡＲによって媒介される細胞シグナル伝達をリガンド特異的な形で阻害することができたことを示している。
【0348】
実施例２：酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲの評価
ＣＡＲ－ＴとＫ５６２の共培養法
レンチウイルスの生産：
以下を使用してレンチウイルスを生産する。すなわち、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８０）；抗生物質を含まないＬＸ２９３Ｔ完全培地；ＤＭＥＭ（高グルコース）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０％ＦＢＳ（熱不活化したもの）；Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ Ｉ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ ／ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５）；ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）；エンベロープ、パッケージング、及びトランスファーベクタープラスミド；ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）；第２世代及び第３世代のトランスファーベクター（ｐｓＭＡＸ２）で使用できるＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔを含むパッケージングベクター。９０％コンフルエンスにある１０ｃｍディッシュから２９３Ｔ（ＦＴ）細胞を取り上げ、トランスフェクションの前日の午後遅くに希釈率１：３で分注し、細胞を通常の一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする（細胞は翌日のトランスフェクション時に６０～８５％コンフルエンスに達している必要がある）。
ＣＡＲ－ＴとＫ５６２の共培養法
レンチウイルスの生産：
以下を使用してレンチウイルスを生産する。すなわち、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ２９３Ｔパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３２１８０）；抗生物質を含まないＬＸ２９３Ｔ完全培地；ＤＭＥＭ（高グルコース）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；１０％ＦＢＳ（熱不活化したもの）；Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍ Ｉ低血清培地（Ｇｉｂｃｏ ／ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５）；ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２３１１）；エンベロープ、パッケージング、及びトランスファーベクタープラスミド；ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）；第２世代及び第３世代のトランスファーベクター（ｐｓＭＡＸ２）で使用できるＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、及びＴａｔを含むパッケージングベクター。９０％コンフルエンスにある１０ｃｍディッシュから２９３Ｔ（ＦＴ）細胞を取り上げ、トランスフェクションの前日の午後遅くに希釈率１：３で分注し、細胞を通常の一晩、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする（細胞は翌日のトランスフェクション時に６０～８５％コンフルエンスに達している必要がある）。
【0349】
以下のプロトコルに従って、１０ｃｍディッシュごとにトランスフェクション反応液を調製する。
【0350】
１．別々の１．７ｍＬチューブ中で各１０ｃｍディッシュのトランスフェクション反応液を調製する。
【0351】
２．ＲＴで９００ｕＬＯｐｔｉ－ＭｅｍＩを加える。
【0352】
３．反応液ごとに９ｕｇのベクターバックボーン（目的の遺伝子を含む）を加える。
【0353】
４．反応液ごとに８ｕｇのパッケージングベクターを加える。
【0354】
５．反応ごとに１ｕｇのエンベロープベクター（ｐＭＤ２．Ｇ）を加える。
【0355】
６．３秒間、高速でボルテックスして、完全に混合する。
【0356】
７．反応ごとに５５ｕＬのＦｕｇｅｎｅＨＤを加える。
【0357】
８．２０～３０回すばやく上下にピペッティングして混合する。
【0358】
９．ＲＴで１０分間放置する（ＤＮＡ複合体を形成させる）。
【0359】
１０．ディッシュの周りにゆっくりと混合物を滴下して加えた後、５～１０秒間、静かに前後上下に揺り動かして混合する（回転させないようにする）。
【0360】
１１．ディッシュをウイルスインキュベーターに入れる。
【0361】
血清学的ピペットを使用して、２日目と３日目にウイルス上清を採取する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ ０．４５ｕｍフィルターを使用して、細胞破片を除去する。Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーター（カタログ番号６３１２３１及び６３１２３２）をプロトコルに従って使用する。１）１体積のＬｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーターを３体積の清澄化した上清と加え合わせる。穏やかに反転させて混合する。２）混合物を氷上または４℃で３０分～一晩インキュベートする。（３）試料を１５００×ｇで４５分間、４℃で遠心分離する。（４）ペレットを壊さないように注意しながら、上澄みを注意深く取り除いて捨てる。（５）滅菌ＰＢＳ ＋ ０．１％ＢＳＡを使用して、ペレットを最初の体積の１／１０～１／１００に静かに再懸濁する。
【0362】
形質導入と増殖
初代Ｔ細胞をヒトドナーＰＢＭＣから単離して凍結する。１日目に、１×１０６個の精製ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍して３×１０６個のＨｕｍａｎＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで刺激し、０．２μｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む１ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＴＳ Ｔ細胞増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養する。２日目に、細胞を活性化ＣＡＲ（ａＣＡＲ）をコードするレンチウイルス（上記の生産方法を参照）及び／または抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）をコードするレンチウイルスで同時形質導入して、ａＣＡＲ＋、ｉＣＡＲ＋、及びａＣＡＲ＋／ｉＣＡＲ＋（二重＋）Ｔ細胞 を生産する（ＧｏＳｔｉｘ（Ｔｅｋａｒａ）によって定量化した各コンストラクト１００Ｋ）。各ＣＡＲは構成的ＳＦＦＶプロモーターの制御下にある。異なるａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトならびに関連するＣＡＲドメインを下記表Ｂに示す。３日目に、ダイナビーズを磁石で除去する。Ｔ細胞をカウントして継代する（０．５×１０６細胞／ ｍＬ）。その後の増殖の間、細胞を２日ごとに継代する（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。
初代Ｔ細胞をヒトドナーＰＢＭＣから単離して凍結する。１日目に、１×１０６個の精製ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍して３×１０６個のＨｕｍａｎＴ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズで刺激し、０．２μｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む１ｍＬのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ ＣＴＳ Ｔ細胞増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養する。２日目に、細胞を活性化ＣＡＲ（ａＣＡＲ）をコードするレンチウイルス（上記の生産方法を参照）及び／または抑制性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）をコードするレンチウイルスで同時形質導入して、ａＣＡＲ＋、ｉＣＡＲ＋、及びａＣＡＲ＋／ｉＣＡＲ＋（二重＋）Ｔ細胞 を生産する（ＧｏＳｔｉｘ（Ｔｅｋａｒａ）によって定量化した各コンストラクト１００Ｋ）。各ＣＡＲは構成的ＳＦＦＶプロモーターの制御下にある。異なるａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトならびに関連するＣＡＲドメインを下記表Ｂに示す。３日目に、ダイナビーズを磁石で除去する。Ｔ細胞をカウントして継代する（０．５×１０６細胞／ ｍＬ）。その後の増殖の間、細胞を２日ごとに継代する（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。
【0363】
共培養アッセイ
７日目に、各細胞集団のアリコートをＰＥ結合抗ＭＹＣ及びＢＶ４２１結合抗ＦＬＡＧ抗体（それぞれａＣＡＲ及びｉＣＡＲに対応）で染色し、ＬＸ ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリー装置を使用してそれらの導入遺伝子発現を定量化する。８日目にＴ細胞をカウントし、共培養アッセイ用に９６ウェルプレートに分配した。各ウェルには、ａＣＡＲ標的ＣＤ２０とｉＣＡＲ標的ＣＤ１９を共発現するように操作されるか、またはＣＤ２０単独を発現するように操作され、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した５×１０５個のＫ５６２標的細胞と、５×１０５個のａＣＡＲ＋または二重＋Ｔ細胞とを含むようにする。共培養物（３７℃、５％ＣＯ２）を４０時間インキュベートする。１０日目に、共培養物中の細胞をＮＩＲ生存率色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸフローサイトメーターを使用して生きた標的細胞の数を定量化する。それぞれの操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団の殺傷効率を、ＣＤ２０を発現するＫ５６２標的細胞株のそれぞれに対する生存した野生型Ｋ５６２の比として計算する。正規化した殺傷効率を、単一（ＣＤ２０＋のみ）抗原標的細胞に対する二重（ＣＤ２０＋ＣＤ１９ ＋）抗原標的細胞のＣＡＲ－Ｔ殺傷効率の比として計算する。
７日目に、各細胞集団のアリコートをＰＥ結合抗ＭＹＣ及びＢＶ４２１結合抗ＦＬＡＧ抗体（それぞれａＣＡＲ及びｉＣＡＲに対応）で染色し、ＬＸ ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリー装置を使用してそれらの導入遺伝子発現を定量化する。８日目にＴ細胞をカウントし、共培養アッセイ用に９６ウェルプレートに分配した。各ウェルには、ａＣＡＲ標的ＣＤ２０とｉＣＡＲ標的ＣＤ１９を共発現するように操作されるか、またはＣＤ２０単独を発現するように操作され、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した５×１０５個のＫ５６２標的細胞と、５×１０５個のａＣＡＲ＋または二重＋Ｔ細胞とを含むようにする。共培養物（３７℃、５％ＣＯ２）を４０時間インキュベートする。１０日目に、共培養物中の細胞をＮＩＲ生存率色素（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸフローサイトメーターを使用して生きた標的細胞の数を定量化する。それぞれの操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団の殺傷効率を、ＣＤ２０を発現するＫ５６２標的細胞株のそれぞれに対する生存した野生型Ｋ５６２の比として計算する。正規化した殺傷効率を、単一（ＣＤ２０＋のみ）抗原標的細胞に対する二重（ＣＤ２０＋ＣＤ１９ ＋）抗原標的細胞のＣＡＲ－Ｔ殺傷効率の比として計算する。
【0364】
酵素的抑制性ドメインを含むＣＡＲの評価結果
酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を評価する。評価手法は、実施例１に記載されたものに従う。ａＣＡＲを単独で発現するか、またはａＣＡＲ及びｉＣＡＲを共発現する操作されたＴ細胞を、ｉＣＡＲ、ａＣＡＲ、または両方により認識されるか、またはどちらにも認識されない同種抗原を発現する操作された標的細胞と共培養した場合の細胞毒性、サイトカイン放出、活性化関連マーカーの発現について評価する。評価した例示的なコンストラクトを表Ｂに示す。また、腫瘍関連抗原を標的とするａＣＡＲと、健康な組織及び／または細胞で一般的に発現される抗原を標的とするｉＣＡＲとの組み合わせについても評価する。
酵素的抑制性ドメイン（ＥＩＤ）を含むＣＡＲによるＴ細胞シグナル伝達の阻害を評価する。評価手法は、実施例１に記載されたものに従う。ａＣＡＲを単独で発現するか、またはａＣＡＲ及びｉＣＡＲを共発現する操作されたＴ細胞を、ｉＣＡＲ、ａＣＡＲ、または両方により認識されるか、またはどちらにも認識されない同種抗原を発現する操作された標的細胞と共培養した場合の細胞毒性、サイトカイン放出、活性化関連マーカーの発現について評価する。評価した例示的なコンストラクトを表Ｂに示す。また、腫瘍関連抗原を標的とするａＣＡＲと、健康な組織及び／または細胞で一般的に発現される抗原を標的とするｉＣＡＲとの組み合わせについても評価する。
【0365】
操作されたＴ細胞のフローサイトメトリー分析は、ａＣＡＲとｉＣＡＲコンストラクトの共発現を示している。次に、異なるｉＣＡＲコンストラクトを、シグナル伝達を阻害するそれらの能力について評価する。結果は、酵素的抑制性ドメインを含むＣＡＲが、活性化ＣＡＲの細胞シグナル伝達をリガンド特異的な形で阻害できることを示している。これには、例えば、最も強力なシグナル伝達阻害及び／またはリガンド特異性を示すｉＣＡＲ機能（ＥＩＤ、追加的ドメイン、ドメイン変性など）を決定することが含まれる。
【0366】
【表22】
【0367】
他の実施形態
本明細書に開示される要素のすべては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの要素は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替的な要素に置き換えることができる。したがって、そうでない旨が明確に示されない限り、開示されるそれぞれの要素は、一般的な一連の同等または同様の要素の一例にすぎない。
本明細書に開示される要素のすべては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの要素は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替的な要素に置き換えることができる。したがって、そうでない旨が明確に示されない限り、開示されるそれぞれの要素は、一般的な一連の同等または同様の要素の一例にすぎない。
【0368】
上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神及び範囲から逸脱することなく、開示を様々な変更及び修正を行って様々な用途及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲内にある。
【0369】
均等物
いくつかの発明の実施形態が本明細書で説明及び図示してきたが、当業者であれば、機能を実行する、及び／または本明細書に記載される結果及び／または１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／または構造が容易に想定されるであろうし、また、そのような変形及び／または改変のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成は例示であることを意味するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は本発明の教示が使用される特定の用途に依存する点は直ちに認識されよう。当業者であれば、通常の実験以上のことを行うことなく、本明細書に記載される特定の発明の実施形態の多くの均等物が認識されるか、または確認できるであろう。したがって、上記の実施形態はあくまで例として示されるものであり、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載及び特許請求される以外の形で実施できる点を理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法のそれぞれを対象としている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
いくつかの発明の実施形態が本明細書で説明及び図示してきたが、当業者であれば、機能を実行する、及び／または本明細書に記載される結果及び／または１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／または構造が容易に想定されるであろうし、また、そのような変形及び／または改変のそれぞれは、本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるものとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、及び構成は例示であることを意味するものであり、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は本発明の教示が使用される特定の用途に依存する点は直ちに認識されよう。当業者であれば、通常の実験以上のことを行うことなく、本明細書に記載される特定の発明の実施形態の多くの均等物が認識されるか、または確認できるであろう。したがって、上記の実施形態はあくまで例として示されるものであり、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に記載及び特許請求される以外の形で実施できる点を理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法のそれぞれを対象としている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【0370】
本明細書で定義及び使用されるすべての定義は、辞書における定義、参照により援用される文書における定義、及び／または定義された用語の通常の意味に優先するものとして理解されるべきである。
【0371】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許及び特許出願は、それについて各文献が引用され、場合によっては文書全体を包含しうる主題に関して参照により援用される。
【0372】
本明細書において明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでない旨が明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものとして理解されるべきである。
【0373】
本明細書において明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味するものとして理解されるべきである。「及び／または」を用いて列記される複数の要素は、同様にして、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」として解釈されるべきである。「及び／または」の節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、具体的に特定される要素に関連するかまたは関連していないかにかかわらず、必要に応じて存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）のようなオープンエンドの文言と組み合わせて使用される場合に「Ａ及び／またはＢ」と言う場合には、一実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（場合により他の要素を含む）を指す場合がある。
【0374】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「及び／または」と同じ意味を有するものとして理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「及び／または」は包括的なものとして、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも１つを含むだけでなく、複数のものも含み、場合により、追加の列記されていない項目も含むものと解釈されるものとする。「ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ」（～の１つのみ）または「ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ」（～のうちの正確に１つ）、または特許請求の範囲で使用される場合には「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」（～からなる）など、そうでない旨が明確に示される用語のみが、所定の数または１群の要素のうちの正確に１つの要素を包含することを指す。一般的に、本明細書で使用される「または」という用語は、「ｅｉｔｈｅｒ」（～のどちらか）、「ｏｎｅ ｏｆ」（～のうちの１つ）、「ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ」（～のうちの１つのみ）、または「ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ」（～のうちの正確に１つ）のような排他的な用語が先行する場合にのみ、排他的選択肢（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとして解釈される。「～から本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【0375】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連して「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト内の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するものとして理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列記されているすべての要素の少なくとも１つを必ずしも含むものではなく、また、要素のリスト内の要素のいずれかの組み合わせを必ずしも除外するものでもない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が言及する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、場合により存在しうることを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも一方」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも一方」、または同等に「Ａ及び／またはＢの少なくとも一方」）とは、一実施形態では、少なくとも１つ、場合により複数のＡを含み、Ｂが存在しない（及び場合によりＢ以外の要素を含む）こと、別の実施形態では、少なくとも１つ、場合により複数のＢを含み、Ａが存在しない（及び場合によりＡ以外の要素を含む）こと、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、場合により複数のＡを含み、かつ少なくとも１つ、場合により複数のＢを含む（及び場合により他の要素を含む）こと、を指すことができるといった要領である。
【0376】
また、そうでない旨が明確に示されていない限り、複数の工程または行為を含む本明細書において特許請求されるいずれの方法においても、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されない点も理解されなければならない。
【0377】
特許請求の範囲、また、上記の明細書において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（～を備える）、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（～を含む）、「ｃａｒｒｙｉｎｇ」（～を保有する）、「ｈａｖｉｎｇ」（～を有する）、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（～を含有する）、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ」（～を行う）、「ｈｏｌｄｉｎｇ」（～を保持する）、「ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ」「～で構成される」、及びこれらに類する表現などのすべての移行句は、オープンエンド、すなわち、「それらに限定されるものではないが、含む」ことを意味するものとして理解されるべきである。米国特許庁特許審査手続マニュアルのセクション２１１１．０３に記載されているように、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」（～からなる）及び「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」（～本質的にからなる）という移行句のみが、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（～を含む））を使用して本文書に記載される実施形態は、代替の実施形態において、オープンエンドの移行句によって記載される要素「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）及び「本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）ものとしても想到される点は理解なければならない。例えば、本開示が「Ａ及びＢを含む組成物」（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ａｎｄ Ｂ）を記載している場合、本開示は、代替の実施形態である「Ａ及びＢからなる組成物」（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）及び「本質的にＡ及びＢからなる組成物」（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ Ａ ａｎｄ Ｂ）も想到している。
【0378】
さらなる配列
本明細書で参照されるベクター、カセット、及びタンパク質ドメインの特定のさらなる配列を以下に記載し、配列番号で参照する。
本明細書で参照されるベクター、カセット、及びタンパク質ドメインの特定のさらなる配列を以下に記載し、配列番号で参照する。
【0379】
【表23】
【0380】
【表24】
【0381】
【表25】
【0382】
【表26】
【0383】
【表27】
【0384】
【表28】
【図面の簡単な説明】
【0385】
【図1】本開示のキメラ抑制性受容体がＴ細胞活性化を遮断する機構を示す概略図である。
【図2】キメラ抑制性受容体の特定の実施形態の組成を示す概略図である。ＥＬＢＤ：細胞外リガンド結合ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ）。例としては、これらに限定されるものではないが、ｓｃＦｖ（例えば、腫瘍抗原に対する）、天然の受容体／リガンドドメイン、及び直交二量体化ドメイン（例えば、可溶性標的化分子と結合することができるロイシンジッパー）が挙げられる。ＭＬＤ：膜局在化ドメイン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）（場合により、細胞膜のサブドメインへの局在化に関与する近位の細胞内及び細胞外セグメント（例えば、脂質ラフト）を含む）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＬＡＸ、ＣＤ２５、ＣＤ７（Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、及びＬＡＴの変異体（例えば、ＬＡＴ（ＣＡ）、例えば、本明細書にその全体を援用する、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）：６６９－８０を参照）の膜貫通ドメインが挙げられる。ＥＩＤ：酵素的抑制性ドメイン（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｄｏｍａｉｎ）（例えば、有効性を最大化し、基礎阻害を最小化するように選択された、酵素のドメイン、フラグメント、または変異体を含む、天然のＴ細胞活性化カスケードを阻害する酵素）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＣＳＫ（Ｐａｖｅｌ Ｏｔａｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ２０１１ Ｆｅｂ；１８１３（２）：３６７－７６）、ＳＨＰ－１（例えば、Ｋｏｓｕｇｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＳＨＰ－１ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎ ＴＣＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１ Ｊｕｎ；１４（６）：６６９－８０を参照）、ＰＴＥＮ、ＣＤ４５、ＣＤ１４８、ＰＴＰ－ＭＥＧ１、ＰＴＰ－ＰＥＳＴ、ｃ－ＣＢＬ、ＣＢＬ－ｂ、ＬＹＰ／Ｐｅｐ／ＰＴＰＮ２２、ＬＡＲ、ＰＴＰＨ１、ＳＨＩＰ－１、ＲａｓＧＡＰ（例えば、本明細書にその全体を援用する、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ：ｆｒｏｍ ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２ Ｓｅｐ；１３７（１）：１－１９を参照）が挙げられる。
【図3】キメラ抑制性受容体（例えば、「拡張型」キメラ抑制性受容体）の特定の実施形態の組成を示す概略図である。図２で述べたような、ＥＬＢＤ、ＭＬＤ、及びＥＩＤ。ＳＩＤ：足場抑制性ドメイン（Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｄｏｍａｉｎ）。例としては、これらに限定されるものではないが、ＩＴＩＭを含むタンパク質ドメイン（例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、及び／またはＬＡＩＲ１の細胞質尾部など、またはそれらのフラグメント（複数可））ならびに、ＧＲＢ－２、Ｄｏｋ－１、Ｄｏｋ－２、ＳＬＡＰ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＲ、ＧＩＴＲ、及びＰＤ－Ｌ１を含む、Ｔ細胞の活性化を阻害する非ＩＴＩＭ足場タンパク質ドメイン、またはそれらのフラグメント（複数可）が挙げられる。
【図4】ＮＯＴゲートａＣＡＲ／ｉＣＡＲシステムを示す概略図である。Ｔ細胞を、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む共発現されるａＣＡＲのシグナル伝達を阻害するＥＩＤドメインとしてＣＳＫドメインを含む抗ＣＤ１９ ｉＣＡＲを発現するように操作した。標的ｋ５６２細胞を、ａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）を発現するように操作するか、またはａＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ２０）及びｉＣＡＲに対する同種抗原（ＣＤ１９）の両方を発現するように操作した。
【図5】ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入した後、その後の濃縮を行うことなく、非改変細胞よりも高い検出可能なレベルでのｉＣＡＲコンストラクト抗ＣＤ１９＿ｓｃＦｖ－Ｃｓｋ融合体の発現を示す代表的なフローサイトメトリーのプロットである。
【図6】ａＣＡＲ及びｉＣＡＲコンストラクトのフローサイトメトリーによって評価された発現プロファイルである。図は、ａＣＡＲ＋＝ａＣＡＲを発現する細胞（ｉＣＡＲ有り及び無し）［１番目の柱］、ｉＣＡＲ＋＝ｉＣＡＲを発現する細胞（ａＣＡＲ有り及び無し）［２番目の柱］、及び二重＋＝ ａＣＡＲ及びｉＣＡＲの両方を発現する細胞［３番目の柱］を示している。
【図7】ＣＤ１９／ＣＤ２０標的細胞とＣＤ２０のみの標的細胞の殺傷比として表される、殺傷効率によって評価したａＣＡＲシグナル伝達のｉＣＡＲ阻害の有効性を示す。図は、ａＣＡＲコンストラクトのみによる形質導入（左の柱）、ＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ３１）とａＣＡＲによるＴ細胞の同時形質導入（中央の柱）、ＳＨ３欠失を含むＣＳＫ酵素的抑制性ドメインを有するｉＣＡＲ（ｉＣＡＲ２６）とａＣＡＲによるＴ細胞の同時形質導入（右の柱）を示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】