特表2022-546412治療的抗体発見のための効率的なハイブリドーマプラットフォームの開発
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-04
(54)【発明の名称】治療的抗体発見のための効率的なハイブリドーマプラットフォームの開発
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20221027BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20221027BHJP
C12N 15/06 20060101ALI20221027BHJP
C12N 5/20 20060101ALI20221027BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221027BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00
C40B40/10
C12N15/06 100
C12N5/20
A61K39/395 J
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022513161
(86)(22)【出願日】2020-08-28
(85)【翻訳文提出日】2022-03-08
(86)【国際出願番号】 US2020048440
(87)【国際公開番号】W WO2021041834
(87)【国際公開日】2021-03-04
(31)【優先権主張番号】62/894,660
(32)【優先日】2019-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ヘイゼン， メレディス キャロル
(72)【発明者】
【氏名】リン， ジョンフア
(72)【発明者】
【氏名】セシャサイー， ダヤ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AB05
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA08
4B065CA25
4B065CA46
4C085AA14
4C085BB36
4C085CC23
4C085DD22
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA50
4H045FA71
(57)【要約】
本技術は、一般に、抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ、ハイブリドーマライブラリなどを産生するための改良された方法に関する。例えば、これらの方法は、産生される抗原特異的Ｂ細胞の数を増加させ、ハイブリドーマの数を増加させ、及び／又は所与の産生サイクルで作製することができるモノクローナル抗体の数を増加させる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体ライブラリを産生するための方法であって、（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を含む流入領域リンパ節を採取すること；
（ｃ）各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）前記抗原に対する結合特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること
を含み、
以下の条件：
（ｉ）前記動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）前記動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）前記動物は２週間毎に注射される；
（ｉｖ）前記動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）異なる動物に異なるアジュバントを注射するように複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する
のうちの少なくとも２つが適用される、方法。
【請求項2】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの３つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの４つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの５つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの６つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの７つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの少なくとも２つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記動物がラットである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記動物が週に１回以下で注射される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記動物が２週間に１回以下で注射される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記動物が６週間～１５週間注射される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記複数のアジュバントが、完全フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記Ｂ細胞がネガティブ選択によって濃縮される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
抗体ライブラリを産生するための方法であって、（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって前記免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること
を含む、方法。
【請求項26】
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項28】
各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記動物が２週間に１回以下で注射される、請求項２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記動物が６週間～１０週間注射される、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、請求項２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、請求項２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、抗体ライブラリ。
【請求項39】
請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、ハイブリドーマライブラリ。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月３０日に出願の、米国仮特許出願第６２／８９４，６６０号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容全体を、全ての目的のために、参照により本明細書に援用する。
本出願は、２０１９年８月３０日に出願の、米国仮特許出願第６２／８９４，６６０号に対する優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容全体を、全ての目的のために、参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【0002】
背景
モノクローナル抗体は、臨床診断における重要な試薬として数十年にわたって使用されており、重要な新しいクラスの治療薬として出現している。ハイブリドーマ技術は、モノクローナル抗体を得るために最も一般的に使用される方法である。モノクローナル抗体は、正常な抗体産生脾臓Ｂ細胞を不死性骨髄腫細胞又は他の不死性細胞と融合することによって作製されたハイブリドーマ細胞から分泌される。
モノクローナル抗体は、臨床診断における重要な試薬として数十年にわたって使用されており、重要な新しいクラスの治療薬として出現している。ハイブリドーマ技術は、モノクローナル抗体を得るために最も一般的に使用される方法である。モノクローナル抗体は、正常な抗体産生脾臓Ｂ細胞を不死性骨髄腫細胞又は他の不死性細胞と融合することによって作製されたハイブリドーマ細胞から分泌される。
【0003】
ハイブリドーマ産生は数十年前のその開始以来ほとんど変化していない（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５））。ハイブリドーマを生成するための典型的なプロトコルは以下を含む：（ｉ）動物（例えば、マウス、ラット又はウサギ）に抗原を免疫すること；（ｉｉ）抗体産生Ｂ細胞を、典型的には脾臓から採取すること；（ｉｉｉ）Ｂ細胞を非分泌性骨髄腫細胞株と融合してハイブリドーマを形成すること；（ｉｖ）ハイブリドーマ細胞を選択培地中で増殖させること；（ｖ）所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングすること；（ｖｉ）所望のハイブリドーマ（単数又は複数）をクローニングして、抗体を分泌する均一な細胞株を得ること。
増加した数の抗原特異的抗体を生成し、モノクローナル抗体及び抗体ライブラリの産生を改善する必要がある。
増加した数の抗原特異的抗体を生成し、モノクローナル抗体及び抗体ライブラリの産生を改善する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
概要
本技術は、一般に、抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ、ハイブリドーマライブラリなどを産生するための改良された方法、並びに様々な方法工程からの組成物に関する。例えば、これらの方法は、産生される抗原特異的Ｂ細胞の数を増加させ、ハイブリドーマの数を増加させ、及び／又は所与の産生サイクルで作製することができるモノクローナル抗体の数を増加させることができる。本明細書に記載の方法は、様々な疾患の処置に使用するための抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ、ハイブリドーマライブラリなど、並びに様々な方法工程からの組成物の産生を有意に増加させるために使用することができる。例えば、本明細書中に記載される方法は、癌、免疫障害、炎症性疾患、及び抗体療法によって処置可能な任意の他の疾患を処置するための抗体及び／又はハイブリドーマの生成に適用され得る。本明細書中に記載される方法は、困難な標的に対する抗体及び／又はハイブリドーマの生成に適用され得る。困難な標的とは、例えば標的化可能領域のサイズが小さい、タンパク質の立体配座が重要である、及び／又は抗原が（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化及びメチル化などの翻訳後修飾によって）修飾されているために、抗体を生成することが困難な抗原である。複数の実施形態において、標的抗原は、マルチパス膜貫通タンパク質である。複数の実施形態において、マルチパス膜貫通タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。複数の実施形態において、マルチパス膜貫通タンパク質は、イオンポンプ、イオンチャネル又はトランスポーターである。
本技術は、一般に、抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ、ハイブリドーマライブラリなどを産生するための改良された方法、並びに様々な方法工程からの組成物に関する。例えば、これらの方法は、産生される抗原特異的Ｂ細胞の数を増加させ、ハイブリドーマの数を増加させ、及び／又は所与の産生サイクルで作製することができるモノクローナル抗体の数を増加させることができる。本明細書に記載の方法は、様々な疾患の処置に使用するための抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ、ハイブリドーマライブラリなど、並びに様々な方法工程からの組成物の産生を有意に増加させるために使用することができる。例えば、本明細書中に記載される方法は、癌、免疫障害、炎症性疾患、及び抗体療法によって処置可能な任意の他の疾患を処置するための抗体及び／又はハイブリドーマの生成に適用され得る。本明細書中に記載される方法は、困難な標的に対する抗体及び／又はハイブリドーマの生成に適用され得る。困難な標的とは、例えば標的化可能領域のサイズが小さい、タンパク質の立体配座が重要である、及び／又は抗原が（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化及びメチル化などの翻訳後修飾によって）修飾されているために、抗体を生成することが困難な抗原である。複数の実施形態において、標的抗原は、マルチパス膜貫通タンパク質である。複数の実施形態において、マルチパス膜貫通タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。複数の実施形態において、マルチパス膜貫通タンパク質は、イオンポンプ、イオンチャネル又はトランスポーターである。
【0006】
一態様では、抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ又はハイブリドーマライブラリを産生する方法が提供される。複数の実施形態において、本方法は、以下のうちの１つ又は複数を含んでよい：
（ａ）複数の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を採取すること；
（ｃ）Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上が適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、少なくとも一部の動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
（ａ）複数の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を採取すること；
（ｃ）Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上が適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、少なくとも一部の動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
【0007】
一態様では、抗体、抗体ライブラリ、ハイブリドーマ又はハイブリドーマライブラリを産生する方法が提供される。複数の実施形態において、本方法は、以下のうちの１つ又は複数を含んでよい：
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を採取すること；
（ｃ）Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上が適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、異なる動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を採取すること；
（ｃ）Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上が適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、異なる動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
【0008】
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、好ましくは２つ以上が適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、異なる動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；及び／又は
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する。
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、少なくとも毎週、少なくとも１０日毎、少なくとも２週間毎、又は、注射の間の期間がより長い他の頻度で注射される；
（ｉｖ）動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）各動物に単一のアジュバントを注射し、異なる動物に異なるアジュバントを注射するように、複数のアジュバントを使用する；及び／又は
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する。
【0009】
複数の実施形態において、Ｂ細胞は、流入領域リンパ節から採取され得る。
【0010】
複数の実施形態において、本方法は、２匹以上の動物に抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、３匹以上の動物に抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、４匹以上の動物に抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、５匹以上の動物に抗原を注射することを含んでいてもよい。
【0011】
複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの３つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの４つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの５つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの６つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの７つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの２つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの３つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの４つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの５つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの６つが適用され得る。
【0012】
複数の実施形態において、本方法は、以下を含んでよい：
（ａ）複数の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）抗原に対する特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
（ａ）複数の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）抗原に対する特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
【0013】
複数の実施形態において、本方法は、以下を含んでよい：
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）抗原に対する特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）抗原に対する特異性についてハイブリドーマをスクリーニングすること。
【0014】
複数の実施形態において、動物は、ラットであり得る。複数の実施形態において、動物は、非近交系ラットであり得る。非近交系ラットの例としては、限定されないが、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｌｏｎｇ－Ｅｖａｎｓ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ、Ｗｉｓｔａｒ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ及びＨｏｌｔｚｍａｎラットが挙げられる。複数の実施形態において、動物は、トランスジェニック動物であってよい。複数の実施形態において、動物は、トランスジェニックラットであってよい。
【0015】
複数の実施形態において、動物に複数の部位で注射することができる。複数の実施形態において、複数の部位は、流入領域リンパ節に近い部位であってよい。複数の実施形態において、複数の部位は、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含んでよい。
【0016】
複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～３００μｇであり得る。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～２００μｇであり得る。
【0017】
複数の実施形態において、本方法は、２匹以上の非近交系ラットに抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、３匹以上の非近交系ラットに抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、４匹以上の非近交系ラットに抗原を注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、５匹以上の非近交系ラットに抗原を注射することを含んでいてもよい。
【0018】
複数の実施形態において、動物は、２週間毎に注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、週に１回以下で注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、２週間に１回以下で注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日又はそれ以上毎に、６週～１９週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、６週～１５週の間、注射されてよい。注射の時間は、エンドポイントを含む、列挙された範囲によって包含される全ての値及び部分範囲を含む。
【0019】
複数の実施形態において、複数のアジュバントを使用することができ、各動物（又は動物のサブセット）に異なるアジュバントを注射することができる。例えば、動物は複数の群に分けることができ、群の各メンバーは単一のアジュバント又はアジュバントの組み合わせを受け、各アジュバント又は組み合わせは他の群の少なくとも一部によって受けられるものとは異なる。複数の実施形態において、複数のアジュバントとしては、限定されないが、完全フロイントアジュバント（ＣＦＲ）、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルを挙げることができる。複数の実施形態において、ＣＦＲは、機械混合することができる。
【0020】
複数の実施形態において、ハイブリドーマを形成する前にＢ細胞を濃縮することができる。複数の実施形態において、濃縮は、流入領域リンパ節から採取した細胞を結合剤と接触させることを含むことができる。複数の実施形態において、ネガティブ選択によりＢ細胞を濃縮することができる。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞ではない細胞に関連する分子に特異的であり得る。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞ではない細胞の表面に発現される分子に特異的であり得る。複数の実施形態において、ポジティブ選択によりＢ細胞を濃縮することができる。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞に関連する分子に特異的であり得る。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞の表面に発現される分子に特異的であり得る。複数の実施形態において、結合剤は、抗体であり得る。複数の実施形態において、磁気分離を使用することができる。
【0021】
複数の実施形態において、融合パートナーは、表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された細胞であり得る。複数の実施形態において、融合パートナーは、Ｓｐ２ａｂ融合パートナーであり得る。複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的な抗体を発現するハイブリドーマを同定することを含み得る。複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】抗原Ａ（標的Ａ）に対する抗体産生のためにＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）対Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した場合のＩｇＧ血清力価の差を示す。マウス対ラットにおける標的Ａの相同性は９８％である。＊マウスに対してｐ＜０．０５。
【0023】
【図1B】抗原Ｂ（標的Ｂ）に対する抗体産生のためにＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）対Ｃ５７ ｂｌａｃｋ６（Ｃ５７／ＢＬ６）マウスを使用した場合のＩｇＧ血清力価の差を示す。＊マウスに対してｐ＜０．０５。
【0024】
【図2A】免疫化のための抗原注射部位の例を示す、ラットの図である。
【0025】
【図2B】各動物の単一部位注射又は複数部位注射を用いた抗原Ｃ（標的Ｃ）及びＤ（標的Ｄ）に対する抗原特異的抗体力価を示す。＊単回注射に対してｐ＜０．０５。
【0026】
【0027】
【0028】
【図4A】注射部位付近の流入領域リンパ節の例を示すラットの図である。
【0029】
【図4B】脾臓と比較してリンパ節から細胞を採取した場合の抗原（標的Ｄ）特異的ハイブリドーマクローンの数の差を示す。ＬＮからのＩｇＧ＋ハイブリドーマの増加は、（マウスとは対照的に）ラットに当てはまる。
【0030】
【図5A】抗原Ｊに対する抗原特異的ＩｇＧ血清力価を示す。ＣＦＡアジュバントを使用し、機械又は手（「シリンジ混合」）で混合した。＊シリンジ混合に対してｐ＜０．０１。
【0031】
【0032】
【図6】全リンパ節（「未分離」）、リンパ採取細胞の非Ｂ細胞の枯渇後に残存する細胞（「Ｂ細胞」）、又は濃縮Ｂ細胞からのＩｇＭ陽性Ｂ細胞の枯渇後に残存する細胞に由来するＩｇＧ陽性ハイブリドーマクローンの数を示す。
【0033】
【0034】
【0035】
【発明を実施するための形態】
【0036】
詳細な説明
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態及び代替の適用において本開示を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。但し、本技術の様々な実施形態の全てについてここでは説明しない。ここに提示される実施形態は、一例としてのみ提示され限定でないことが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲又は幅を限定すると解釈されるべきではない。
この説明を読んだ後、様々な代替の実施形態及び代替の適用において本開示を実施する方法が当業者に明らかになるであろう。但し、本技術の様々な実施形態の全てについてここでは説明しない。ここに提示される実施形態は、一例としてのみ提示され限定でないことが理解されよう。したがって、様々な代替の実施形態のこの詳細な説明は、本明細書に記載の本開示の範囲又は幅を限定すると解釈されるべきではない。
【0037】
本技術を開示及び説明する前に、以下に記載される態様は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、又はその使用に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の態様を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【0038】
読者の便宜のためだけに様々なセクションに分けられた詳細な説明及び任意のセクションに見られる開示は、別のセクションのものと組み合わされてもよい。タイトル又はサブタイトルが、読者の便宜のために本明細書で使用され得、本開示の範囲に影響を及ぼすことを意図しない。
【0039】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書及び以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書及び以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されなければならないいくつかの用語が参照される。
【0040】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。ここで使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そのコンテキストがさもなければ明確に示さない限りは、複数形を同様に含むことが意図されている。
【0041】
「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、続いて記載される事象又は状況が起こり得るか、又は起こり得ないこと、及びその説明が、その事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
【0042】
「約」という用語は、例えば温度、時間、量、濃度など、範囲を含む数値指定の前に使用される場合、（＋）若しくは（－）１０％、５％、１％、又はそれらの間の任意の部分範囲若しくは部分値によって変化し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、用量に関して使用される場合、用量が＋／－１０％変化し得ることを意味する。
【0043】
本明細書で使用される「近く（ｎｅａｒ）」という用語は、空間内の物体若しくは点の短い物理的距離内の位置、又は短い距離内の配置を意味することを意図している。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約０ｍｍ～約５０ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約０ｍｍ～約４０ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約０ｍｍ～約３０ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約０ｍｍ～約２０ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約０ｍｍ～約１０ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約１ｍｍ未満であってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約５ｍｍ未満であってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約１ｃｍ未満であってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約２ｃｍ未満であってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約５ｃｍ未満であってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約１ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約２ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約３ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約４ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約５ｍｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約１ｃｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約２ｃｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約３ｃｍであってよい。複数の実施形態において、「近く（ｎｅａｒ）」は、約４ｃｍであってよい。距離は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0044】
「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物、及び方法が、記載された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、記載された目的のための組み合わせにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される技術の基本的かつ新規な特徴（単数又は複数）に実質的に影響を及ぼさない他の材料又は工程を排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分及び実質的な方法工程の微量よりも多い要素を除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内にある。
【0045】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【0046】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する突然変異又はモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能な変異体抗体を除き、かかる変異体は、一般的に、少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。
【0047】
本明細書で使用される「融合パートナー」という用語は、Ｂ細胞と組み合わせて（融合して）ハイブリドーマを形成することができる細胞を指す。一般に、融合パートナーは骨髄腫細胞である。
【0048】
本明細書で使用される「非近交系」という用語は、同一種の他の動物とは遺伝的に別種の動物を指す。対照的に「近交系」は、近親交配に起因して系統内の他のものと遺伝的に同一（又はほぼ同一）である動物を指す。
【0049】
本明細書で使用される「融合パートナー」という用語は、ハイブリドーマを作製するための融合パートナーを指す。様々な種からハイブリドーマを作製するための方法及び細胞は、当技術分野で周知である。一般に、融合パートナーは複数の骨髄腫細胞である。融合パートナーは、ハイブリドーマを作製するための任意の適切な細胞又は細胞株、例えば骨髄腫であってよい。融合パートナーは、哺乳動物由来であってよい。哺乳動物由来は、霊長類、ヒト、ラット、マウス、げっ歯類、又は任意の他の種であってよい。
【0050】
方法
一態様では、抗体を製造する方法が提供される。一態様では、抗体ライブラリを製造する方法が提供される。一態様では、ハイブリドーマを製造する方法が提供される。一態様では、ハイブリドーマライブラリを製造する方法が提供される。
一態様では、抗体を製造する方法が提供される。一態様では、抗体ライブラリを製造する方法が提供される。一態様では、ハイブリドーマを製造する方法が提供される。一態様では、ハイブリドーマライブラリを製造する方法が提供される。
【0051】
複数の実施形態において、本方法は、以下のうちの１つ又は複数を含むことができる：
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物から、例えばＢ細胞を含有する流入領域リンパ節から、Ｂ細胞を採取すること；
（ｃ）１つ又は複数の、又は各Ｂ細胞（単数又は複数）と融合パートナー（単数又は複数）との間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性について１つ又は複数のハイブリドーマをスクリーニングすること。
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物から、例えばＢ細胞を含有する流入領域リンパ節から、Ｂ細胞を採取すること；
（ｃ）１つ又は複数の、又は各Ｂ細胞（単数又は複数）と融合パートナー（単数又は複数）との間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）抗原に対する結合特異性について１つ又は複数のハイブリドーマをスクリーニングすること。
【0052】
複数の実施形態において、以下の条件の少なくとも１つ、又は好ましくは少なくとも２つが適用され得る：
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、本明細書に記載される頻度で１回以下、例えば、２週間に１回以上注射される；
（ｉｖ）動物は、本明細書中に記載される頻度で、約６週間～約１５週間の期間にわたって注射される；
（ｖ）異なる動物又は動物群に、他の動物又は他の動物群と比較して異なるアジュバントが注射されるように、複数のアジュバントが使用される；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
（ｉ）動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）動物は、本明細書に記載される頻度で１回以下、例えば、２週間に１回以上注射される；
（ｉｖ）動物は、本明細書中に記載される頻度で、約６週間～約１５週間の期間にわたって注射される；
（ｖ）異なる動物又は動物群に、他の動物又は他の動物群と比較して異なるアジュバントが注射されるように、複数のアジュバントが使用される；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する。
【0053】
複数の実施形態において、条件（ａ）～（ｄ）のうちの少なくとも２つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ａ）～（ｄ）のうちの少なくとも３つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ａ）～（ｄ）のうちの４つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ａ）～（ｄ）の１つ又は複数が明示的に除外され得る。
【0054】
複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの少なくとも３つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの少なくとも４つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの少なくとも５つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの少なくとも６つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの３つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの４つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの５つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの６つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの７つが適用され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）～（ｖｉｉ）の１つ又は複数が明示的に除外され得る。複数の実施形態において、条件（ｉ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｉｉ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｉｉｉ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｉｖ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｖ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｖｉ）は明示的に除外される。複数の実施形態において、条件（ｖｉｉ）は明示的に除外される。
【0055】
複数の実施形態において、本方法は、以下を含むことができる：
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること、を含む方法。
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること、を含む方法。
【0056】
複数の実施形態において、動物は、非近交系動物であってよい。複数の実施形態において、動物は、哺乳動物であってよい。複数の実施形態において、動物は、げっ歯類であってよい。複数の実施形態において、げっ歯類は、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、マウスなどであってよい。複数の実施形態において、動物は、ラットであってよい。複数の実施形態において、動物は、非近交系ラットであってよい。非近交系ラットの例としては、限定されないが、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｌｏｎｇ－Ｅｖａｎｓ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ、ＣＤ（登録商標）ＩＧＳ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、ＣＤ（登録商標）Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｗｉｓｔａｒ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ、及びＨｏｌｔｚｍａｎラットが挙げられる。
【0057】
複数の実施形態において、動物は、マウスであってよい。複数の実施形態において、動物は、非近交系マウスであってよい。非近交系マウスの例としては、限定されないが、Ｂｌａｃｋ Ｓｗｉｓｓ、ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳ（例えばＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ由来）、ＣＦ－１、ＣＦＷ、ＯＲＬ Ｓｅｎｃａｒ、ＳＫＨ１－Ｅｌｉｔｅ、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ、及びＤｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｕｔｂｒｅｄ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が挙げられる。
【0058】
複数の実施形態において、本方法は、２匹以上の非近交系ラットに、抗原を各ラットの複数の部位に注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、３匹以上の非近交系ラットに、抗原を各ラットの複数の部位に注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、４匹以上の非近交系ラットに、抗原を各ラットの複数の部位に注射することを含んでいてもよい。複数の実施形態において、本方法は、５匹以上の非近交系ラットに、抗原を各ラットの複数の部位に注射することを含んでいてもよい。
【0059】
複数の実施形態において、動物は、１つ又は複数の部位に注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、複数の部位に注射される。複数の実施形態において、１つ又は複数の部位は、流入領域リンパ節に近い部位であってよい。複数の実施形態において、１つ又は複数の部位は、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、踵関節、及び静脈内のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【0060】
複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、約０．１μｇ～約３００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～２００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～１００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～５０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～２５μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．１μｇ～１０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～２００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～１００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～５０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～２５μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、０．５μｇ～１０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～３００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～２００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～１００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～５０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～２５μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、１μｇ～１０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～３００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～２００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～１００μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～５０μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～２５μｇであってよい。複数の実施形態において、各部位に注射される抗原の量は、５μｇ～１０μｇであってよい。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であり得る。
【0061】
複数の実施形態において、動物は、１週間～４週間毎以上、好ましくは１週間毎以上、１０日毎以上、２週間毎以上、３週間毎以上、４週間毎以上などに生じる１日又は期間に１つの部位又は複数の部位に注射され得る。複数の実施形態において、１つ又は複数の部位を、異なる時間に注射することができるが、各部位は、１週間毎～４週間毎よりも頻繁には注射されず、好ましくは２週間毎よりも頻繁には注射されないなどである。いくつかの実施形態において、動物は、週に１回以下で注射される。いくつかの実施形態において、動物は、２週間に１回以下で注射される。
【0062】
複数の実施形態において、動物は、本明細書に記載の頻度で６週間～１５週間注射を受けてよい。複数の実施形態において、動物は、７週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、８週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、９週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、１０週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、１１週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、１２週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、１３週～１５週の間、注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、１４週～１５週の間、注射されてよい。
【0063】
複数の実施形態において、動物に、最初に抗原及びアジュバントを含む第１の組成物を少なくとも１つの部位に注射し、次いで２週間に１回、抗原を含む第２の組成物を同一又は異なる部位に注射してもよい。複数の実施形態において、動物は、２週間に１回以下で注射されてよい。複数の実施形態において、動物は、同一部位に２週間に１回以下で注射されてよい。いくつかの実施形態において、第２の組成物はアジュバントを含まない。いくつかの実施形態において、第２の組成物はアジュバントを含む。複数の実施形態において、リンパ節は、２回目、３回目、４回目、５回目又は６回目の注射後に動物から採取されてもよい。第２、第３、第４、第５又は第６の注射は、動物の同一部位（単数又は複数）への第２、第３、第４、第５、又は第６の注射、又は異なる部位への第２、第３、第４、第５又は第６の注射を意味することができる。
【0064】
複数の実施形態において、リンパ節は、例えば、最初の注射後６週間～１０週間の間に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射後６週間～８週間の間に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射の約６週間後に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射の約７週間後に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射の約８週間後に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射の約９週間後に動物から採取され得る。複数の実施形態において、リンパ節は、最初の注射の約１０週間後に動物から採取され得る。
【0065】
複数の実施形態において、複数のアジュバントを使用してよく、各動物（又は動物のサブセット）に異なるアジュバントを注射してよい。複数の実施形態において、複数のアジュバントとしては、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＲ）、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニストカクテルが挙げられ得る。複数の実施形態において、アジュバントはフロイント不完全アジュバントであってよい。複数の実施形態において、アジュバントは、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）（ブロック共重合体ＣＲＬ－８９４１、スクアレン及び微粒子安定剤を含有する油中水型エマルション）であってよい。
【0066】
いくつかのアジュバントを混合してエマルジョンを形成する。理論に束縛されるものではないが、アジュバントの機械混合は、（例えば、シリンジを用いる）手動混合と比較して、より調和した乳化及び改善された結果をもたらすと考えられる。複数の実施形態において、アジュバントは機械混合されてよい。複数の実施形態において、機械混合アジュバントはＣＦＲであってよい。
【0067】
複数の実施形態において、ハイブリドーマを形成する前にＢ細胞を濃縮してよい。複数の実施形態において、濃縮は、流入領域リンパ節から採取した細胞を結合剤と接触させることを含むことができる。複数の実施形態において、ネガティブ選択によりＢ細胞を濃縮してよい。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞ではない細胞に関連する分子に特異的であってよい。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞ではない細胞の表面に発現される分子に特異的であってよい。複数の実施形態において、ポジティブ選択によりＢ細胞を濃縮してよい。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞に関連する分子に特異的であってよい。複数の実施形態において、結合剤は、Ｂ細胞の表面上に発現される分子（例えば、Ｂ細胞特異的細胞表面受容体）に特異的であってよい。
【0068】
結合剤は、目的の分子に結合する任意の薬剤であり得る。複数の実施形態において、結合剤は、抗体又はその一部であってよい。複数の実施形態において、結合剤は、融合タンパク質、アプタマー、リガンド、又は受容体であってよい。
【0069】
複数の実施形態において、磁気分離を使用してよい。複数の実施形態において、磁気ビーズを使用してよい。磁気ビーズは、結合剤に結合され得るか、それ以外の方法で会合され得る。
【0070】
複数の実施形態において、表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナー。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１４８，０４０号を、その材料、方法、及び教示の全てについて参照されたい。複数の実施形態において、融合パートナーは、Ｓｐ２ａｂ融合パートナーである。Ｓｐ２ａｂ骨髄腫融合パートナーは、Ａｂｅｏｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ又はＥｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能である。
【0071】
複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的な抗体を発現するハイブリドーマを同定することを含んでよい。複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含んでよい。
【0072】
複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも５０％増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも２倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも３倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも４倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも５倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも６倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも７倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも８倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも９倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも１０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも２０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも３０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも４０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも５０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも６０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも７０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも８０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して少なくとも９０倍増加させ得る。複数の実施形態において、本方法は、抗体及び／又はハイブリドーマの産生を、（ｉ）～（ｖｉｉ）から選択される少なくとも２つの条件を用いない産生と比較して１００倍よりも多く増加させ得る。
【0073】
複数の実施形態において、本明細書に記載の方法に従ってハイブリドーマクローンを例えばリンパ節から得ることは、脾臓組織からハイブリドーマクローンを例えば他の点では類似又は同じ方法で得る場合よりも、最大約１５倍多いハイブリドーマクローンを産生する。例えば、実施例４で比較される方法を参照されたい。複数の実施形態において、本明細書に記載の方法に従ってハイブリドーマクローンを例えばリンパ節から得ることは、脾臓組織からハイブリドーマクローンを例えば他の点では類似又は同じ方法で得る場合よりも、約２倍～約１５倍多いハイブリドーマクローンを産生する。複数の実施形態において、本明細書に記載の方法に従ってハイブリドーマクローンを例えばリンパ節から得ることは、脾臓組織からハイブリドーマクローンを例えば他の点では類似又は同じ方法で得る場合よりも、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、又は約１５倍多いハイブリドーマクローンを産生する。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。いくつかの実施形態において、リンパ節はラット、例えば野生型ラット又はトランスジェニックラットに由来する。
【0074】
複数の実施形態において、アジュバントを機械混合することにより、アジュバントをシリンジ混合するよりも２～４倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価がもたらされ得る。複数の実施形態において、アジュバントを機械混合することにより、アジュバントをシリンジ混合するよりも２倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価がもたらされ得る。複数の実施形態において、アジュバントを機械混合することにより、アジュバントをシリンジ混合するよりも３倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価がもたらされ得る。複数の実施形態において、アジュバントを機械混合することにより、アジュバントをシリンジ混合するよりも４倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価がもたらされ得る。
【0075】
複数の実施形態において、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、異なるアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント又はＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合と比較して１０倍以上であり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＣＦＡを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２０倍高くあり得る。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0076】
複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、異なるアジュバント、例えばＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合と比較して１０倍以上高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２０倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１５倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１０倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、Ｒｉｂｉアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２０倍高くあり得る。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0077】
複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、異なるアジュバント、例えばＲｉｂｉアジュバント又はＣＦＡを使用した場合と比較して１０倍以上高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～２０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、２倍～１０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～５０倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２５倍高くあり得る。複数の実施形態において、ＴＬＲアゴニストカクテルのアジュバントを使用した場合の抗原特異的ＩｇＧ力価は、１０倍～２０倍高くあり得る。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0078】
複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、濃縮ＬＮ Ｂ細胞が使用される場合よりも約１０倍～約１００倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生し得る。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約１０倍～約７５倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約１０倍～約５０倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約１０倍～約２５倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約２５倍～約１００倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約５０倍～約１００倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。複数の実施形態において、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、約１０倍～約７５倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生する。量は、エンドポイントを含む、列挙された範囲内の任意の値又は部分範囲であってよい。
【0079】
一態様では、抗体ライブラリが本明細書で提供される。複数の実施形態において、抗体ライブラリは、本明細書に記載の方法を使用して調製される。
【0080】
一態様では、抗体が本明細書で提供される。複数の実施形態において、抗体は、本明細書に記載の方法を使用して調製される。
【0081】
一態様では、ハイブリドーマライブラリが本明細書で提供される。複数の実施形態において、ハイブリドーマライブラリは、本明細書に記載の方法を使用して調製される。
【0082】
一態様では、本明細書中に記載されるハイブリドーマライブラリ又は抗体ライブラリを調製するためのキットが本明細書中に提供される。複数の実施形態において、キットは、少なくとも１つのアジュバントを含む。複数の実施形態において、キットは、少なくとも２つの異なるアジュバントを含む。複数の実施形態において、キットは、Ｂ細胞を（例えばリンパ節中の他の細胞から）単離、分離、又は濃縮するための試薬を含む。複数の実施形態において、キットは、少なくとも１つの試薬と相互作用するビーズ（マイクロビーズ）を含む。複数の実施形態において、キットは、少なくとも１つの試薬と相互作用するカラムを含む。複数の実施形態において、キットは、ハイブリドーマを作製するための融合パートナーを含む。
【0083】
複数の実施形態において、アジュバントは、ＣＦＲ、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルである。複数の実施形態において、Ｂ細胞を単離、分離又は濃縮するための少なくとも１つの試薬は、Ｂ細胞（例えば、マウス又はラットＢ細胞）に特異的な抗体を含む。複数の実施形態において、Ｂ細胞を単離するための少なくとも１つの試薬は、Ｂ細胞以外の細胞を認識する抗体を含む。複数の実施形態において、抗体は、標識される。複数の実施形態において、標識は、第２の分子に結合する。複数の実施形態において、第２の分子は、ビーズ又はカラムに結合される。複数の実施形態において、標識は、ビオチンであり、第２の分子は、ストレプトアビジンである。複数の実施形態において、ビーズは磁性ビーズである。複数の実施形態において、カラムは磁性カラムである。複数の実施形態において、融合パートナーは、表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作される。
【0084】
いくつかの実施形態は、本明細書中に記載される方法又は方法の一部のいずれかを使用、産生又は実施することをもたらす、デバイス、装置、組成物、製剤、細胞、抗体、アジュバント、ハイブリドーマ、それらの任意のものの集団又は複数、及びそれらの任意のものの組み合わせに関する。
【0085】
本明細書に記載の実施例及び実施形態が例示のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な改変又は変化が当業者に提案され、本出願精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることは理解されよう。本明細書で引用される全ての公報、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0086】
当業者は、本明細書に記載の粒子の作製及び使用の説明が例示のみを目的としており、本開示がこの例示によって限定されないことを理解するであろう。
【0087】
実施例１．近交系動物対非近交系動物
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット又はＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、尾の付け根の皮下に完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＲｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１００μｇの標的Ａタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で免疫化後、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は滅菌ＰＢＳと混合した５０μｇのタンパク質によるブーストを、部位を交代させて行った（腹腔内、両踵関節又は尾の付け根）。血清を５回の投与後に採取し、免疫タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット又はＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、尾の付け根の皮下に完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＲｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１００μｇの標的Ａタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で免疫化後、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は滅菌ＰＢＳと混合した５０μｇのタンパク質によるブーストを、部位を交代させて行った（腹腔内、両踵関節又は尾の付け根）。血清を５回の投与後に採取し、免疫タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0088】
図１Ａは、ＳＤラットのＩｇＧ発現力価がＢａｌｂ／ｃマウスよりも高いことを示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分のシグナルをもたらす希釈倍率である。標的相同性は、力価の差が抗原寛容の差に基づいていない可能性が高いことを示すために含まれる。
【0089】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）又はＣ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、尾の付け根の皮下に、完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、又はＴＬＲアゴニストカクテル（図３Ｃにおいて説明）と混合した５０μｇの標的Ｂタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で免疫化後、２週間毎に、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は滅菌ＰＢＳと混合した２５μｇのタンパク質によるブーストを、部位を交代させて行った（腹腔内、両踵関節、又は尾の付け根）。血清を６回の投与後に採取し、免疫タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0090】
図１Ｂは、ＳＤラットのＩｇＧ発現力価がＣ５７ＢＬ／６マウスよりも高いことを示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分に達するシグナルをもたらす希釈倍率である。標的相同性は、力価の差が抗原寛容の差に基づいていない可能性が高いことを示すために含まれる。
【0091】
実施例２．単一の注射部位対複数の注射部位
図２Ａは、免疫化のための複数の注射部位の位置を示す。尾の付け根、肩及び踵関節注射剤を皮下（ｓ．ｃ．）投与し、抗原特異的Ｂ細胞は、それぞれ鼠径リンパ節及び腸骨リンパ節、腋窩リンパ節及び上腕リンパ節、並びに膝窩リンパ節に排出される可能性が高い。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射剤を腹膜腔に投与し、抗原特異的Ｂ細胞は、腸間膜リンパ節並びに脾臓に排出される可能性が高い。
図２Ａは、免疫化のための複数の注射部位の位置を示す。尾の付け根、肩及び踵関節注射剤を皮下（ｓ．ｃ．）投与し、抗原特異的Ｂ細胞は、それぞれ鼠径リンパ節及び腸骨リンパ節、腋窩リンパ節及び上腕リンパ節、並びに膝窩リンパ節に排出される可能性が高い。腹腔内（ｉ．ｐ．）注射剤を腹膜腔に投与し、抗原特異的Ｂ細胞は、腸間膜リンパ節並びに脾臓に排出される可能性が高い。
【0092】
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した２０μｇの標的Ｃタンパク質又は標的Ｄタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で週に１回、ｉ．ｐ．のみ又は図２Ａに示すように複数の部位に分けて２週間毎に交代させて免疫化した。５週間の注射後に血清を採取し、免疫タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0093】
図２Ｂは、単一部位の免疫化後の抗原特異的力価が複数部位の免疫化後よりも低いことを示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分に達するシグナルをもたらす希釈倍率である。
【0094】
実施例３．週２回投与対２週間に１回投与
図３Ａは、２週間に１回投与する戦略を示す。抗原による免疫化時の抗原特異的免疫応答の予想される変化の一般的な説明；実際のデータは示されていない。動物に、血清ＩｇＭレベルの増加によって示されるように一次免疫応答を刺激するアジュバント（実施例３に記載のフロイント、Ｒｉｂｉ又はＴＬＲアゴニストカクテル）と組み合わせたタンパク質を、０週目に複数の部位に注射する。次いで、動物を２週間に１回、典型的には、アジュバントを含まない滅菌ＰＢＳで希釈したより少量の抗原でブーストする。これは二次免疫応答を刺激し、血清ＩｇＧレベルの増加並びに標的に対するＢ細胞選択及び親和性成熟のための胚中心の発生をもたらす。抗原特異的免疫応答の進行を評価するために、複数の時点で血清を採取する。
図３Ａは、２週間に１回投与する戦略を示す。抗原による免疫化時の抗原特異的免疫応答の予想される変化の一般的な説明；実際のデータは示されていない。動物に、血清ＩｇＭレベルの増加によって示されるように一次免疫応答を刺激するアジュバント（実施例３に記載のフロイント、Ｒｉｂｉ又はＴＬＲアゴニストカクテル）と組み合わせたタンパク質を、０週目に複数の部位に注射する。次いで、動物を２週間に１回、典型的には、アジュバントを含まない滅菌ＰＢＳで希釈したより少量の抗原でブーストする。これは二次免疫応答を刺激し、血清ＩｇＧレベルの増加並びに標的に対するＢ細胞選択及び親和性成熟のための胚中心の発生をもたらす。抗原特異的免疫応答の進行を評価するために、複数の時点で血清を採取する。
【0095】
Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した２μｇの標的Ｅタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で週に２回（３～４日毎）ｉ．ｐ．により免疫化し、又は、Ｒｉｂｉアジュバントと混合した１００μｇの標的Ｅタンパク質をｉ．ｐ．により免疫化した後、Ｒｉｂｉアジュバントと混合又は滅菌ＰＢＳで希釈した５０μｇの標的Ｅタンパク質によるブーストをｉ．ｐ．で２週間毎に行なった。血清を８週間又は９週間の投与後に採取し、免疫化タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0096】
図３Ｂは、驚くべきことに、１週間に２回投与されたラットからの抗原特異的力価が、Ｒｉｂｉアジュバントを使用して２週間に１回投与されたものよりも低かったことを示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分に達するシグナルをもたらす希釈倍率である。
【0097】
Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、ＴＬＲアゴニストの組み合わせ：５０μｇのＭＰＬ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０μｇのＲ８４８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、１０μｇのＰｏｌｙＩ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び１０μｇのＣｐＧ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した２μｇの標的Ｅタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で週に２回（３～４日毎）ｉ．ｐ．により免疫化し、又はＴＬＲアゴニストカクテルアジュバントと混合した１００μｇの標的Ｅタンパク質でｉ．ｐ．により免疫化した後に、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合又は滅菌ＰＢＳで希釈した５０μｇの標的Ｅタンパク質でｉ．ｐ．により２週間毎にブーストした。血清を８週間又は９週間の投与後に採取し、免疫化タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0098】
図３Ｃは、１週間に２回投与されたラットからの抗原特異的力価が、ＴＬＲアゴニストアジュバント混合物を使用して２週間に１回投与されたものよりも低かったことを示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分に達するシグナルをもたらす希釈倍率である。
【0099】
実施例４．Ｂ細胞源としての、リンパ節対脾臓
図４Ａは、複数の部位注射位置の近くの流入領域リンパ節の位置を示す。鼠径リンパ節、腸骨リンパ節、腋窩リンパ節、上腕リンパ節、腸間膜リンパ節及び膝窩リンパ節を含む複数のリンパ節を採取し、図２Ａに記載のように複数の部位に抗原を注射した動物由来の潜在的な抗原特異的Ｂ細胞源としてプールする。
図４Ａは、複数の部位注射位置の近くの流入領域リンパ節の位置を示す。鼠径リンパ節、腸骨リンパ節、腋窩リンパ節、上腕リンパ節、腸間膜リンパ節及び膝窩リンパ節を含む複数のリンパ節を採取し、図２Ａに記載のように複数の部位に抗原を注射した動物由来の潜在的な抗原特異的Ｂ細胞源としてプールする。
【0100】
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、フロイント完全アジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した２００μｇの標的Ｄタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）でｓ．ｃ．によって尾の付け根において免疫化後、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した１００μｇの標的Ｄタンパク質で、図２Ａに示すように複数の部位に分けて２週間毎に交代させてブーストし、又は、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）若しくはＴＬＲアゴニストカクテル（実施例３に記載）と混合した１０μｇの標的Ｄタンパク質を１週間に２回（３～４日毎）ブーストした。最後の免疫化の３日後、免疫化の開始から約７週間後に脾臓又は複数のリンパ節を採取した。これらのラット由来のＢ細胞を、実施例６に記載されるように磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してリンパ球から精製し、得られたＢ細胞集団からの４５００万個の細胞を、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によってＰ３Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１マウス骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、抗ラットＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む半固体培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、Ｏｍｎｉｗｅｌｌトレイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。プレーティングの７日後、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む９６ウェル培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。上清を、コロニー・ピッキングの７日後に標的Ｄタンパク質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【0101】
図４Ｂは、リンパ節由来の抗原特異的ハイブリドーマクローンの数が脾臓由来よりも有意に多いことを示す。図４Ｂに示すように、脾臓からハイブリドーマクローンを得ると、リンパ節からハイブリドーマクローンを得る場合よりも最大約１０倍少ないハイブリドーマクローンが産生される。驚くべきことに、本明細書中に記載される方法を使用すると、脾臓ではなくリンパ節から得る場合、抗原特異的ＩｇＧ＋クローンの数の１０倍又はそれを超える数を得ることが可能である。
【0102】
実施例５．複数のアジュバントの並行使用
ＣＦＲの機械混合が、得られる力価に影響を及ぼすかどうかを決定するために、機械（Ｏｍｎｉ Ｍｉｘｅｒ，Ｏｍｎｉ Ｉｎｃ．）を使用して、又はシリンジを使用して手で、ＣＦＲを抗原と混合した。ラットに、アジュバント組成物を注射し、本明細書に記載のように抗原特異的抗体力価を決定した。結果を図５Ａに示す。図５Ａに見られるように、機械混合は、シリンジ混合よりも有意に多くの抗原特異的血清ＩｇＧ力価を産生する。機械混合試料は、シリンジ混合試料の約２倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価を示した。
ＣＦＲの機械混合が、得られる力価に影響を及ぼすかどうかを決定するために、機械（Ｏｍｎｉ Ｍｉｘｅｒ，Ｏｍｎｉ Ｉｎｃ．）を使用して、又はシリンジを使用して手で、ＣＦＲを抗原と混合した。ラットに、アジュバント組成物を注射し、本明細書に記載のように抗原特異的抗体力価を決定した。結果を図５Ａに示す。図５Ａに見られるように、機械混合は、シリンジ混合よりも有意に多くの抗原特異的血清ＩｇＧ力価を産生する。機械混合試料は、シリンジ混合試料の約２倍の抗原特異的血清ＩｇＧ力価を示した。
【0103】
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は実施例３に記載のＴＬＲアゴニストカクテルアジュバントと混合した２０μｇの標的Ｆタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で、図２Ａに示すように複数の部位に分けて、又は、完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した１５０μｇの標的Ｆタンパク質で、尾の付け根における注射により、週に２回免疫化した後に、不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は１０μｇのＣｐＧ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と混合した５０μｇの標的Ｆタンパク質で、図２Ａに示すように複数の部位に分けて２週間毎にブーストした。血清を１０週間の投与後に採取し、免疫化タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0104】
図５Ｂは、異なるアジュバントで免疫化した動物からの抗原特異的力価を示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分のシグナルをもたらす希釈倍率である。図５Ｂに示すように、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、Ｒｉｂｉアジュバント又はＴＬＲアゴニストカクテルアジュバントよりも、この抗原に関して１０乗超、有意に高い抗原特異的ＩｇＧ力価を有する。
【0105】
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、図２Ａに示すように複数の部位に分けて、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）又は実施例３に記載のＴＬＲアゴニストカクテルアジュバントと混合した２０μｇの標的Ｇタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で毎週免疫化した。血清を６週間の投与後に採取し、免疫化タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって試験した。
【0106】
図５Ｃは、異なるアジュバントで免疫化した動物からの抗原特異的力価を示す。抗原特異的ＩｇＧ力価は、最大シグナルの半分のシグナルをもたらす希釈倍率である。図５Ｃに示すように、Ｒｉｂｉアジュバントは、ＴＬＲアゴニストカクテルアジュバントよりも、この抗原に関しておよそ１０乗、有意に高い抗原特異的ＩｇＧ力価を有する。
【0107】
実施例６．ネガティブ選択によるＢ細胞濃縮及びＩｇＭ枯渇
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１０μｇの標的Ｄタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で、尾の付け根においてｓ．ｃ．により免疫化後、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１０μｇの標的Ｄタンパク質で、図２Ａに示すように複数の部位に分けて、１週間に２回（３～４日毎）ブーストした。最後の免疫化の３日後、免疫化の開始から約７週間後に複数のリンパ節を採取した。リンパ球を抗ラットＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ１１ｂ／ｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ１６１ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び抗ラット顆粒球（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ビオチンコンジュゲート抗体と共にインキュベートし、洗浄し、次いでストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートし、磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に流して非標識集団を捕捉した。次いで、得られた濃縮Ｂ細胞集団を融合のために採取するか、又はさらなる枯渇工程を行った。細胞を抗ラットＩｇＭ－ビオチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、洗浄した後、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートし、磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に流して非標識集団を捕捉した。各群からの細胞を、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によってＰ３Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１マウス骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、抗ラットＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む半固体培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、Ｏｍｎｉｗｅｌｌトレイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。プレーティングの７日後、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む９６ウェル培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。上清を、コロニー・ピッキングの７日後に標的Ｄタンパク質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。示されているＩｇＧ陽性クローン数は、４５００万個のＢ細胞の融合物に対して正規化されている。
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１０μｇの標的Ｄタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で、尾の付け根においてｓ．ｃ．により免疫化後、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合した１０μｇの標的Ｄタンパク質で、図２Ａに示すように複数の部位に分けて、１週間に２回（３～４日毎）ブーストした。最後の免疫化の３日後、免疫化の開始から約７週間後に複数のリンパ節を採取した。リンパ球を抗ラットＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ１１ｂ／ｃ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ラットＣＤ１６１ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び抗ラット顆粒球（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ビオチンコンジュゲート抗体と共にインキュベートし、洗浄し、次いでストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートし、磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に流して非標識集団を捕捉した。次いで、得られた濃縮Ｂ細胞集団を融合のために採取するか、又はさらなる枯渇工程を行った。細胞を抗ラットＩｇＭ－ビオチン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、洗浄した後、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とインキュベートし、磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に流して非標識集団を捕捉した。各群からの細胞を、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によってＰ３Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１マウス骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、抗ラットＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む半固体培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、Ｏｍｎｉｗｅｌｌトレイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。プレーティングの７日後、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む９６ウェル培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。上清を、コロニー・ピッキングの７日後に標的Ｄタンパク質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。示されているＩｇＧ陽性クローン数は、４５００万個のＢ細胞の融合物に対して正規化されている。
【0108】
図６は、全リンパ節、濃縮ＬＮ Ｂ細胞、及びＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞に由来するＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンの数を示す。図６に示すように、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞は、最も多数のＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生し、その次が濃縮ＬＮ Ｂ細胞及び分離されていない全リンパ節であった。驚くべきことに、本明細書に記載の方法を使用して、ＩｇＭ枯渇濃縮ＬＮ Ｂ細胞の使用は、濃縮ＬＮ Ｂ細胞よりも約１０倍～約１００倍多いＩｇＧ発現ハイブリドーマクローンを産生することができる。
【0109】
実施例７．ＳＰ２ａｂ対ＰＵ１抗原特異的ハイブリドーマの生成
図７Ａ対照ハイブリドーマ（左）を、フローサイトメトリを使用して、ＡＰＣ ＧＡＭ Ｉｇ（右）で標識した後にＩｇα及びＩｇβで形質転換した株と比較する。ヒストグラムは生細胞集団を示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）に記載されているようにハイブリドーマを産生し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培養培地で増殖させた。選別した細胞を、ヒポキサンチン及びチミジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した培養培地中で増殖させた。細胞を洗浄し、次いで、アロフィコシアニン・コンジュゲート・ヤギ抗マウスＩｇ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞を再度洗浄し、２０％ ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で再懸濁した。非生細胞を、ヨウ化プロピジウム又は７－アミノアクチノマイシンＤ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生細胞から分化させた。Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｍａｒｃｈ ３１；３４３（１）：２８－４１から修正。
図７Ａ対照ハイブリドーマ（左）を、フローサイトメトリを使用して、ＡＰＣ ＧＡＭ Ｉｇ（右）で標識した後にＩｇα及びＩｇβで形質転換した株と比較する。ヒストグラムは生細胞集団を示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）に記載されているようにハイブリドーマを産生し、ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培養培地で増殖させた。選別した細胞を、ヒポキサンチン及びチミジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で補充した培養培地中で増殖させた。細胞を洗浄し、次いで、アロフィコシアニン・コンジュゲート・ヤギ抗マウスＩｇ Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞を再度洗浄し、２０％ ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で再懸濁した。非生細胞を、ヨウ化プロピジウム又は７－アミノアクチノマイシンＤ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して生細胞から分化させた。Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｍａｒｃｈ ３１；３４３（１）：２８－４１から修正。
【0110】
図７Ｂは、ＳＰ２ａｂハイブリドーマのＦＡＣＳ選別プロファイルを示す。免疫化ラット由来のＩｇＭ陰性Ｂ細胞を、実施例６に記載のように磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してリンパ球から精製し、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を介してＳＰ２ａｂマウス骨髄腫細胞（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する６ウェルプレートにプレーティングして、３７℃、７％ＣＯ２で３日間インキュベートした。細胞を回収し、アロフィコシアニン標識抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びフィコエリトリン標識標的タンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で染色した。ハイブリドーマ細胞集団はＩｇＧを発現しており（左のヒストグラム）、ＩｇＧ＋Ａｇ＋細胞を同定して、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した（右のドットプロット）。
【0111】
トランスジェニックラット（Ｏｐｅｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した１００μｇの標的Ｈタンパク質（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で尾の付け根において免疫化し、引き続いて不完全フロイントアジュバント（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合した５０μｇの標的Ｈタンパク質で２週間毎にｉ．ｐによりブーストした。Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、ＴＬＲアゴニストカクテル（実施例３に記載）と混合した２μｇの標的Ｉタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で、複数の部位（腹腔内及び両踵関節）において、週に２回（３～４日毎）免疫化した。免疫化動物由来のＩｇＭ陰性Ｂ細胞を、磁気分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して（マウス用キットを使用して、又はラット用の実施例６に記載のキットを使用して）リンパ球から精製し、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を介してＰ３Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１マウス骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、抗種ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む半固体培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、Ｏｍｎｉｗｅｌｌトレイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプレーティングした。プレーティングの７日後、蛍光コロニーを選択し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む９６ウェルプレートに移した。上清を、ピッキングの７日後に免疫化タンパク質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【0112】
図７Ｃは、ＰＵ１融合パートナーを使用したＩｇＧに基づく選別による抗原特異的ハイブリドーマの割合を示す。抗原陽性率をＩｇＧ発現ウェルの関数として示す。
【0113】
上記と同じ細胞集団を、電気融合（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を介してＳＰ２ａｂマウス骨髄腫細胞（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と融合した。融合した細胞を３７℃、７％ＣＯ２で、培地Ｃ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で一晩インキュベートした後、１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した培地Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する６ウェルプレートにプレーティングして、３７℃、７％ＣＯ２で３日間インキュベートした。細胞を回収し、アロフィコシアニン標識抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及び必要に応じてフィコエリトリン標識標的Ｈ又はＩタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）で染色した。ＩｇＧ＋Ａｇ＋細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して９６ウェルプレートに選別した。プレーティングの７日後、上清を、免疫化タンパク質に対してＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
【0114】
図７Ｄは、Ｓｐ２ａｂ融合パートナーを使用した抗原に基づく選別による抗原特異的ハイブリドーマの割合を示す。抗原陽性率をＩｇＧ発現ウェルの関数として示す。
【0115】
参考文献
【0116】
Ｐｒｉｃｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｓ ａ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｍａｒｃｈ ３１；３４３（１）：２８－４１．
【0117】
Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．；Ｌａｎｅ，ＤＰ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：１９８８．
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体ライブラリを産生するための方法であって、（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を含む流入領域リンパ節を採取すること；
（ｃ）各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）前記抗原に対する結合特異性を有するＩｇＧについて前記ハイブリドーマをスクリーニングすること
を含み、
以下の条件：
（ｉ）前記動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）前記動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）前記動物は２週間毎に注射される；
（ｉｖ）前記動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）異なる動物に異なるアジュバントを注射するように複数のアジュバントを使用する；及び／又は
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する
のうちの少なくとも５つが適用される、方法であって、前記動物がヒトではない、方法。
【請求項2】
条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの５つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの６つが適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記融合パートナーが、表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記動物がラットである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記動物が週に１回以下で注射される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記動物が２週間に１回以下で注射される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記動物が６週間～１５週間注射される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記複数のアジュバントが、完全フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｂ細胞がネガティブ選択によって濃縮される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
抗体ライブラリを産生するための方法であって、（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって前記免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすることを含む、方法。
【請求項22】
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項24】
各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項25】
各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ラットが２週間に１回以下で注射される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項27】
前記ラットが６週間～１０週間注射される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項28】
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項29】
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項30】
工程（ａ）が、２匹以上のラットに抗原を注射することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項31】
工程（ａ）が、３匹以上のラットに抗原を注射することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項32】
工程（ａ）が、４匹以上のラットに抗原を注射することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項33】
工程（ａ）が、５匹以上のラットに抗原を注射することを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項34】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、抗体ライブラリ。
【請求項35】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、ハイブリドーマライブラリ。
【請求項36】
異なるラットに異なるアジュバントを注射するように複数のアジュバントを使用する、請求項３０に記載の方法。
【請求項37】
前記動物が、２週間毎に複数の部位に注射される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記動物が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のそれぞれに、２週間毎に注射される、請求項３７に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0021】
複数の実施形態において、融合パートナーは、表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された細胞であり得る。複数の実施形態において、融合パートナーは、Ｓｐ２ａｂ融合パートナーであり得る。複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的な抗体を発現するハイブリドーマを同定することを含み得る。複数の実施形態において、ハイブリドーマをスクリーニングすることは、抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含み得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
抗体ライブラリを産生するための方法であって、
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を含む流入領域リンパ節を採取すること；
（ｃ）各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）前記抗原に対する結合特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること
を含み、
以下の条件：
（ｉ）前記動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）前記動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）前記動物は２週間毎に注射される；
（ｉｖ）前記動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）異なる動物に異なるアジュバントを注射するように複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する
のうちの少なくとも２つが適用される、方法。
（項目２）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目３）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの３つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目４）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの４つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目５）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの５つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目６）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの６つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目７）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの７つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目８）
条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの少なくとも２つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目９）
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記動物がラットである、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記動物が週に１回以下で注射される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記動物が２週間に１回以下で注射される、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記動物が６週間～１５週間注射される、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記複数のアジュバントが、完全フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルを含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｂ細胞がネガティブ選択によって濃縮される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
抗体ライブラリを産生するための方法であって、
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって前記免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすることを含む、方法。
（項目２６）
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、項目２５又は２６に記載の方法。
（項目２８）
各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、項目２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記動物が２週間に１回以下で注射される、項目２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記動物が６週間～１０週間注射される、項目２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、項目２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、項目２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
項目１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、抗体ライブラリ。
（項目３９）
項目１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、ハイブリドーマライブラリ。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
抗体ライブラリを産生するための方法であって、
（ａ）１匹又は複数匹の動物に抗原を注射すること；
（ｂ）各動物からＢ細胞を含む流入領域リンパ節を採取すること；
（ｃ）各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｄ）前記抗原に対する結合特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすること
を含み、
以下の条件：
（ｉ）前記動物は非近交系動物である；
（ｉｉ）前記動物は複数の部位に注射される；
（ｉｉｉ）前記動物は２週間毎に注射される；
（ｉｖ）前記動物は６週間～１５週間注射される；
（ｖ）異なる動物に異なるアジュバントを注射するように複数のアジュバントを使用する；
（ｖｉ）Ｂ細胞を工程（ｃ）の前に濃縮する；及び／又は
（ｖｉｉ）表面ＩｇＧ及び分泌ＩｇＧの両方を発現するように操作された融合パートナーを使用する
のうちの少なくとも２つが適用される、方法。
（項目２）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの２つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目３）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの３つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目４）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの４つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目５）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの５つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目６）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの６つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目７）
条件（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの７つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目８）
条件（ｉ）～（ｖｉ）のうちの少なくとも２つが適用される、項目１に記載の方法。
（項目９）
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記動物がラットである、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記動物が複数の部位に注射され、各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記動物が週に１回以下で注射される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記動物が２週間に１回以下で注射される、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記動物が６週間～１５週間注射される、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記複数のアジュバントが、完全フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉ、及び／又はＴＬＲアゴニストカクテルを含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｂ細胞がネガティブ選択によって濃縮される、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
抗体ライブラリを産生するための方法であって、
（ａ）１匹又は複数匹の非近交系ラットに、各ラットの複数の部位で抗原を注射すること；
（ｂ）少なくとも６週間にわたって２週間毎に前記注射を繰り返すこと；
（ｃ）各ラットの１つ又は複数の流入領域リンパ節から免疫細胞を採取すること；
（ｄ）ネガティブ選択によって前記免疫細胞から非Ｂ細胞を枯渇させて、濃縮Ｂ細胞試料を形成すること；
（ｅ）前記濃縮Ｂ細胞試料を複数の融合パートナーと接触させて、各Ｂ細胞と融合パートナーとの間でハイブリドーマを形成すること；及び
（ｆ）前記抗原に対する特異性について前記ハイブリドーマをスクリーニングすることを含む、方法。
（項目２６）
前記複数の部位が、流入領域リンパ節の近くの部位である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記複数の部位が、背中、肩、腹腔内、尾の付け根、及び踵関節のうちの１つ又は複数を含む、項目２５又は２６に記載の方法。
（項目２８）
各部位に注射される抗原の量が０．１μｇ～３００μｇの間である、項目２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
各部位に注射される抗原の量が０．５μｇ～２００μｇの間である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記動物が２週間に１回以下で注射される、項目２５から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記動物が６週間～１０週間注射される、項目２５から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記融合パートナーがＳｐ２ａｂ融合パートナーである、項目２５から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記ハイブリドーマをスクリーニングすることが、前記抗原に特異的なＩｇＧ抗体の発現に関するＦＡＣＳ選別を含む、項目２５から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
工程（ａ）が、２匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
工程（ａ）が、３匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
工程（ａ）が、４匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
工程（ａ）が、５匹以上の動物に抗原を注射することを含む、項目２１から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
項目１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、抗体ライブラリ。
（項目３９）
項目１から３７のいずれか一項に記載の方法を用いて調製された、ハイブリドーマライブラリ。
【国際調査報告】